CN101838622A - 一种希瓦氏菌及其在微生物燃料电池中的应用 - Google Patents

一种希瓦氏菌及其在微生物燃料电池中的应用 Download PDF

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Abstract

一种希瓦氏菌及其在微生物燃料电池中的应用，涉及生物技术领域。本发明的希瓦氏菌为厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis sp.nov.S4)，2009年1月保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号为CCTCC M 209017；其革兰氏染色阴性，菌体为杆状，菌体直，两端圆形，直径为0.3～1.2微米，长度为2.5～5.8微米，可单独存在或以成对、短链状排列，菌体具有单生鞭毛，能移动；从近海的海洋沉积物中分离得到，能在海水环境中产电，并具有较高的产电活性。

Description

一种希瓦氏菌及其在微生物燃料电池中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种新的希瓦氏菌即厦门希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis S4)及其在微生物燃料电池中的应用。
背景技术
我国能源短缺形势严峻，人均占有的能源资源水平远低于世界平均水平。据英国石油公司2006年的统计，我国石油和天然气的剩余可采储量仅为世界平均水平的7.69％和7.05％。此外，石油产品中的碳和硫经过燃烧以二氧化碳和二氧化硫的形式排放到大气中，对环境造成了严重的污染，严重威胁着全球的生态平衡。随着这些能源紧张、废物处理和全球变暖等问题受到越来越多的关注，迫切的需要开发出可再生性的具有最小环境负效应的新能源。储存在地表以下的无氧环境中的有机物蕴含着大量的能源，尽管作为其中一部分的石油以集聚的形式容易被开采利用，然而更大部分的有机物散布在地层中不能够被当前的技术所利用。新的技术解决方案也在不断的寻求当中，微生物燃料电池就是其中之一用来产生可替代能源的装置，它通过阳极室内微生物的催化把化合物里的化学能转化为电能。
早在上个世纪早期Potter就提出了利用微生物燃料电池的原始概念。然而由于微生物燃料电池缺乏产电效率和长期稳定性，使得这方面的研究受到的关注较少。直到几年前，由Tender等设计的利用水底沉积物产生电能的新的微生物燃料电池，用来驱动深海水下探测器，重新唤起了人们对开发这种新能源的热情，该项目获得美国军方极大的兴趣并得到大量的经费支持。此外，产电微生物由于具有独特的有机物降解能力和对重金属离子的还原能力，在环境生物修复方面也具有重大的应用价值。
在微生物燃料电池里，燃料是微生物可降解的有机化合物，因为不像氢，这些有机物是非电化学活性的，从而不能被目前所构想的非生物燃料电池所利用，。然而，微生物却能催化这些有机物释放出电子并传递给各种具有电化学活性的电子载体。理论上，任何微生物都能用来产生电能，然而，由于发酵生物的末端电子受体的氧还电位较低导致它们利用有机物的效率很低并且还需要传递电子的载体来与固体电极相互作用。非发酵的或是利用呼吸作用产电的微生物基本都是异化金属还原菌，这主要是由于它们利用的电子受体(固体金属氧化物)与固体电极具有相似性。这类微生物利用呼吸产能的效率要明显高于发酵微生物，并且不需要额外添加电子载体，目前大部分的燃料电池研究都是以异化金属还原菌作为催化剂来展开微生物燃料电池研究的。
我国在微生物燃料电池研究方面还处于起步阶段。尤其是在利用海洋微生物产电方面的研究还未见系统的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的可替代能源产生方式，提供从自然界中分离具有高活产电能力的希瓦氏菌菌株及其在微生物燃料电池中的应用，该菌具有产电能力强，属于希瓦氏菌属内新分离的新种，能够在海水环境中利用有机物产生电能。
本发明的厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis sp.nov.S4)为希瓦氏菌属(Shewanella)新种菌株，并且是该种内首次报道具有产电特性的菌株，在微生物燃料电池中有较高的产电活性，具有广阔的工业应用前景和理论研究价值。
本发明提供的希瓦氏菌，其中，该希瓦氏菌为Shewanella xiamenensis sp.nov.S4，2009年1月8日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M209017。
该菌株S4菌体为杆状，直径为0.3～1.2微米，长度为2.5~5.8微米，可单独存在或以成对、短链状排列，菌体具有单生鞭毛，能移动，革兰氏染色阴性。
该希瓦氏菌的16S rRNA基因序列见SEQ ID NO1。
下面详细介绍本发明：
本发明的希瓦氏菌是分离自我国厦门地区海洋沉积物样品，在微生物燃料电池中以乳酸盐作为电子供体富集培养，并在含有无机硫的厌氧平板上选择性培养分离纯化而得到，其生物学特征如下：
形态学特征
菌株S4菌体为杆状，菌体直，两端圆形，直径为0.3~1.2微米，长度为2.5~5.8微米，可单独存在或以成对、短链状排列，菌体具有单生鞭毛，能移动，革兰氏染色阴性。
培养特征
本菌株S4在葡萄糖天门冬素琼脂、营养琼脂、桑塔斯琼脂、土豆浸汁琼脂等五种培养基中培养，形成的菌落呈红褐色，菌落圆形、湿润、边缘整齐、中央突起，无气生菌丝。
生理生化特征
菌株S4的生长温度为4～37℃，生长pH值范围为6-9，最适pH值为7。细胞可以在0％-4％NaCl范围内生长，最适生长在1-2％的NaCl。细胞能产氧化酶，催化酶，N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，碱性磷酸酶，亮氨酸氨基肽酶，缬氨酸氨基肽酶，酸性磷酸酶，萘酚-AS-BI-磷酰胺酶；能够利用乳酸作为电子供体还原硝酸盐、亚硝酸盐、氧化三甲胺(TMAO)、亚硒酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸铁以及固态三价铁氧化物；能水解明胶和DNA，不能水解淀粉；能利用硫代硫酸钠厌氧产生硫化氢；能利用D-葡萄糖进行发酵；此外，在Biolog GN2平板上能利用的碳源如下：α-环糊精，糊精，吐温40，吐温80，
L-阿拉伯糖，α-D-葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，乙酸，甲酸，α-羟基丁酸，α-酮丁酸，D，L-乳酸，琥珀酸，溴丁二酸，氨基乙酰-L-天冬氨酸，氨基乙酰-L-谷氨酸，L-丝氨酸，次黄嘌呤，尿嘧啶和胸腺嘧啶。细胞基因组的GC含量为46mol％。
16S rRNA基因序列
本发明的菌株S4的16S rRNA基因序列如下(SEQ ID NO 1)：
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCACAAGGGAGTTTACTCCTGAGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGATTGGATGAACCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAGGGAGGAAAGGGTGAGTCTTAATACGGCTCATCTGTGACGTTACCTACAGAAGAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTCCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTAGGAATAGCATTTCGAACTGGCGAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTCGGAGTTTGGTGTCTTGAACACTGGGCTCTCAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACAGAAGAGACCAGAGATGGACTTGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTATTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGAGTACAGAGGGTTGCAAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAGCTCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGCTTAACCTTCGGGGGGGCGCTCACCACTTTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCCTAGGGGAACCTGGGGCTGGATCACCTCCTT
通过检索GenBank，本发明的菌株S4与其中相关菌株的16S rRNA基因的相似性如表2所示。
表2菌株S4与相关菌株的16S rRNA的相似性
Figure G200910305677520090817D000041
Figure G200910305677520090817D000051
Figure G200910305677520090817D000061
Figure G200910305677520090817D000071
Figure G200910305677520090817D000081
Figure G200910305677520090817D000091
Figure G200910305677520090817D000111
Figure G200910305677520090817D000121
表2显示，本发明S4新菌株的16S rRNA基因在GenBank中无完全相同的菌株，说明本菌株是首次被分离。该菌属于希瓦氏菌属进化分枝。形态特征：菌体为杆状，菌体直，两端圆形，直径为0.3～1.2微米，长度为2.5～5.8微米，可单独存在或以成对、短链状排列；无气生菌丝体。
本发明的S4菌株既可以在营养培养基中培养，也可以在以乳酸盐作为唯一碳源和能源的好氧培养基中生长，也可以在以乳酸盐作为唯一电子供体和三价铁作为电子受体的厌氧培养基中培养。在微生物燃料电池的阳极中生长的菌体具有高活性的产电能力。菌株在pH6-8均能良好地生长，生长温度25-37℃，兼性。
本发明的菌株S4的应用方法有：(1)能以乳酸作为电子供体直接用于微生物燃料电池中进行产电；(2)用冷冻干燥的菌体制成静息细胞进行产电；(3)能在海水环境中利用污染有机物成分进行产电；(4)该菌可用吸附或包埋在电极载体上的固定化细胞作微生物燃料电池的阳极催化剂。
本发明提供的厦门希瓦氏菌是从自然界筛选分离得到的；该希瓦氏菌无论是生长状态还是静止细胞，无论是游离细胞还是固定化细胞，无论是淡水培养基还是海水培养基均能表现出高活性的产电能力，特别是在含盐污水(海水)处理中既能够促进污染物的降解又能够利用污染物产生再利用的电能。该菌具有许多作为工业应用菌株的优良特性，产电活性高，具有广阔的工业应用潜力。
附图说明
附图1微生物燃料电池的构造示意图；
附图2S4菌株静息细胞在微生物燃料电池中的产电能力示意图；
附图3接种S4菌株细胞的微生物燃料电池的产电示意图；
具体实施方式
实施例1：S4菌株的筛选
从中国厦门附近海湾采集海洋沉积物作样品。取2克沉积物样品悬浮于250毫升的微生物燃料电池的阳极电极液中富集培养。阳极电极液培养基(RM)的组成为：去离子水1000毫升，19.0g NaCl，4.9g MgCl2，1.30g K2HPO4，0.45g KH2PO4，0.19g(NH4)2SO4，0.25gMgSO4，10ml Wolfe’s Minerals，0.05g CaCl2，0.02g L-精氨酸，0.02g谷氨酸，0.02g丝氨酸和0.10g酵母粉，其中加入10mmol/L的乳酸钠(DL-lactate)作为电子供体。电池阴极液的组成除了未加氨基酸和酵母粉外，其它与阳极液相同，阴极液还需添加相应的氯化钠来平衡与阳极液之间的渗透压。微生物燃料电池装置采用H型结构(图1)，由两个螺口旋盖玻璃瓶组成，之间用连接在玻璃瓶上的玻璃管对接并固定，玻璃管通道之间采用杜邦公司的Nafion 117质子半透膜作为燃料电池的阳离子交换膜，电极采用高纯石墨块，通过包埋入石墨的耐腐蚀导线连接到电池外，外电路连接一个1000欧姆的固定电阻，电阻两端的电势差采用Keithley 2000型高灵敏度万用表测量。电池阳极通入高纯氮气保证厌氧状态，阴极通入过滤无菌的空气。整个电池装置置于恒温(26~28℃)房间内运行，电极室内用磁棒搅拌混合。待外电路电压升高到稳定后，于厌氧工作站内用无菌刀片剐下附着在电极表面的微生物，重新接种到新鲜的阳极液中再次运行电池进行富集，重复三次富集都能达到相同或更高的电压的样品才能进入分离纯化。富集结束的样品经稀释后涂布于含无机硫的LB平板上，置于厌氧工作站内生长，克隆周围产生透明圈的被认为是阳性克隆，经多次划线分离得到一株纯化菌株，该菌株产电验证表明能达到最高210mV的外电路电压，具有较高的产电活性。该菌株被命名为S4，16S rDNA和DNA-DNA杂交等分子鉴定表明该菌属于Shewanella属的新种，命名为Shewanella xiamenensis sp.strain S4，中文名“厦门希瓦氏菌”，并已于2009年1月8日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号为CCTCC M 209017。
实施例2：S4产电接种细胞的获得与诱导
挑取LB平板培养的S4菌株菌落，接种到20毫升的RM培养基中，加入20mmol/L的乳酸钠作为电子供体和碳源，30℃，180转/分培养12小时后，再按0.1％接种量将其加入到100毫升厌氧RM培养基中，其中加入20mmol/L乳酸钠和20mmol/L富马酸钠分别作为电子供体和电子受体，30℃下静置培养12小时后，再按0.1％接种到以50mmol/L柠檬酸铁和20mmol/L乳酸钠作为电子受体和供体的厌氧RM培养基中，30？培养12小时后，厌氧环境下离心获得菌体。将菌体置于100毫升的厌氧RM培养基中，混合振荡1～2小时，离心再次取得菌体。
实施例3：利用S4菌株的静息细胞产电
按照实施例3表述的培养和接种方法，从1000ml的以柠檬酸铁和乳酸钠作为电子受体和供体的厌氧RM培养基中获得生长对数晚期的细胞，经厌氧条件下离心后用100ml的厌氧磷酸缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，pH＝7.0)重悬离心清洗细胞两次，最后再重悬于5ml的厌氧磷酸缓冲液中，以此作为接种体采用注射法接种到微生物燃料电池的阳极中。微生物燃料电池的阳极液和阴极液均采用50mM的磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)，阳极通入高纯氮气保证厌氧环境，阴极通入空气使得氧气作为最终电子受体。电池运行的其它设置和条件见实施例1所述，外电阻采用500欧姆，电阻两端电压用Keithley 2000型高精度万用表记录，每间隔5min记录一次电压值。该静息细胞产电情况见图2所示。
实例4：菌株S4生长细胞的产电
按实施例2获得产电接种细胞后悬浮于5ml厌氧的RM培养基中，注射接种到微生物燃料电池的阳极内。阳极液为厌氧的RM培养基，10mM乳酸钠作为电子供体，阴极液除了不加氨基酸外其它成分与RM一致，通入空气作为电子受体。微生物燃料电池置于26-28℃的恒温房间内运行，磁力棒混匀电极液，外电阻采用1000欧姆，端电压每隔半小时记录一次，产电数据见图3所示。
序列表
<110>国家海洋局第三海洋研究所
<120>一种希瓦氏菌及其在微生物燃料电池中的应用
<160>1
<210>1
<211>1535
<212>RNA
<213>厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis S4)
agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc  60
ggcagcacaa gggagtttac tcctgaggtg gcgagcggcg gacgggtgag taatgcctag 120
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accttcgggg gggcgctcac cactttgtgg ttcatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt 1500
agccctaggg gaacctgggg ctggatcacc tcctt                            1535

Claims (5)

1.一种希瓦氏菌，其特征在于：该希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis sp.nov.S4)在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 209017。
2.如权利要求1所述的一种希瓦氏菌，其特征在于：该希瓦氏菌的革兰氏染色阴性，菌体为杆状，菌体直，两端圆形，直径为0.3～1.2微米，长度为2.5～5.8微米，可单独存在或以成对、短链状排列，菌体具有单生菌毛，能移动。
3.如权利要求1所述的一种希瓦氏菌，其特征在于：该希瓦氏菌16SrRNA基因序列为SEQ ID NO 1中所述的序列。
4.如权利要求1所述的一种希瓦氏菌，在微生物燃料电池中产电的应用。
5.如权利要求4所述的一种希瓦氏菌在微生物燃料电池中产电的应用，其特征在于：(1)以乳酸作为电子供体直接用于微生物燃料电池中进行产电；或(2)用冷冻干燥的菌体制成静息细胞进行产电；或(3)以废水或淤泥中的营养成分进行产电；或(4)该菌吸附或包埋在电极载体上的固定化细胞作微生物燃料电池的阳极催化剂。
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