CN102660489A

CN102660489A - 一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN102660489A
Application number: CN2012101206816A
Authority: CN
Inventors: 赵华; 陈坤; 杨晶; 张同存
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2012-04-23
Filing date: 2012-04-23
Publication date: 2012-09-12

Abstract

本发明涉及一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用，含有铜绿假单胞杆菌PA01中苯酚羟化酶大亚基N的基因保守序，构建步骤包括(l)PCR扩增苯酚羟化酶基因；(2)重组质粒的构建；(3)转化，还包括其在降解苯酚中的应用。本发明从铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa PA01基因组中克隆到一个编码苯酚羟化酶基因，通过DNA重组技术在体外克隆表达构建得到苯酚降解菌，并进一步验证本重组菌降酚特性，获得了对苯酚的具有较强降解能力的遗传工程菌，这将对苯酚降解菌的工业化生产提供新的理论依据。

Description

一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于微生物菌种构建领域，尤其是一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

苯酚是一种有毒有机的化工原料，是工业废水废渣中的主要污染物，我国把苯酚列入严重污染环境和危害人体健康优先污染物的“黑名单”之中。目前，采用微生物降解含酚废水因耗能少、成本较低、二次污染少等优点成为了处理含酚废水的常用的方法之一。研究学者从自然界中筛选分离出来能够降解苯酚的高效微生物菌种，通过研究其降解特性、降解条件、对苯酚的耐受性以及降解效率，进而有针对性地将菌剂投入到污水处理系统中，得到较好的处理效果。杨彦希等从炼油厂附近严重污染的废水和土壤中通过富集分离筛选到12株丝孢酵母及假丝酵母，这12株菌都能够以苯酚为唯一碳源生长，24-28h内降解苯酚质量浓度可高达1200mg/L，其中一菌株降解苯酚质量浓度最高可达1700mg/L。袁丽娟等从一绝缘材料厂的污水中分离得到一株可高效降解苯酚的菌株Bacillus simplex JY01，在接种量为2％，pH为6.0-9.0，温度为18℃-36℃的条件下，在30h内，当苯酚浓度为1100mg/L和1300mg/L时，其降解率分别为99.16％和74.76％。显然，通过筛选菌株，引入高降解活性菌株能够提高含酚废水的降解率，其意义是重大的。

但是对于这些难降解的污染物，仅靠自然界中的微生物有时是不够的，如何使这些优良菌株长期地在生物处理系统中占优势，并保持其高降解活性是我们需要解决的主要问题，而且提高降解速率是生物处理含酚废水的一个关键问题，其中向微生物中引入编码相应酶的基因进行菌株改造，是解决这一问题的主要途径，也可以说工程菌的构建前景是肯定的。

微生物好氧降解苯酚的代谢过程是微生物利用苯酚羟化酶将苯酚氧化为邻苯二酚，邻苯二酚由邻位和间位途径经环裂解最终形成乙酰辅酶A、琥珀酸、丙酮酸等，这些产物进入三羧酸循环(TCA)，继续被微生物利用，一部分生成细胞物质，另一部分则被氧化分解为二氧化碳和水，提供微生物新陈代谢作需的能量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用，本发明从铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA01中克隆的苯酚羟化酶基因，通过克隆、表达苯酚羟化酶基因构建苯酚降解菌工程菌。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种降解苯酚的基因工程菌，含有苯酚羟化酶基因。

而且，所述苯酚羟化酶基因来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA01。

而且，所述基因工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DB1342。

一种降解苯酚的基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：

(1)PCR扩增苯酚羟化酶基因

从GenBank数据库中检索出铜绿假单胞杆菌PA01中苯酚羟化酶大亚基N的基因保守序列，利用DNAMAN软件设计引物进行扩增获得目的片段，正向引物见序列1，反向引物见序列2，PCR扩增获得苯酚羟化酶基因；

(2)重组质粒的构建

用BamHI和SalI进行双酶切PCR产物，与同样经过BamHI和SalI双酶切的克隆表达载体pWB980相连接；

(3)转化

将步骤(2)的连接产物转入E.coli DH5α感受态中，取150μL转化产物，涂布于包含卡那霉素的LB平板上，37℃，210-230rpm过夜培养，挑取单菌落，分装含有卡那霉素的LB培养基，37℃，210-230rpm培养8-15h，提取质粒，重组质粒经PCR及酶切鉴定目的片段已经插入了载体，将验证成功的重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis DB1342中，获得降解苯酚的基因工程菌。

一种降解苯酚的基因工程菌在降解苯酚中的应用。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明从铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosaPA01基因组中克隆到一个编码苯酚羟化酶基因，通过DNA重组技术在体外克隆表达构建得到苯酚降解菌，并进一步验证本重组菌降酚特性，获得了对苯酚的具有较强降解能力的遗传工程菌，这将对苯酚降解菌的工业化生产提供新的理论依据。

2、本发明中表达的苯酚羟化酶是苯酚降解过程中关键酶，通过克隆和表达苯酚羟化酶基因获得降解苯酚的工程菌，为酶法或生物法高效降解苯酚提供了很好的实现途径。

3、本发明构建的重组菌对各种浓度的苯酚皆有较好的降解能力，在35h内重组菌对浓度为300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L苯酚的降酚率分别为100％、100％、100％、98.87％、85.24％、78.11％。

附图说明

图1为本发明PCR扩增结果，其中M：100bp DNA Marker1，2，3，4，5PCR product；

图2为本发明枯草芽孢杆菌表达蛋白的SDS-PAGE分析，其中，M：Protein marker，1：空白菌发酵上清液，2：重组菌发酵上清液。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例中涉及的百分比如果无特殊标明，均为重量百分比。

一种降解苯酚的基因工程菌，构建方法如下：

1、PCR扩增苯酚羟化酶基因

从GenBank数据库中检索出铜绿假单胞杆菌PA01中苯酚羟化酶大亚基N的基因保守序列，利用DNAMAN软件设计引物进行扩增获得目的片段。

(1)设计如下引物：

正向引物：CGCGGATCCATGAAGCTGTACGCCATTTTTGATGCCTTC

该引物含有BamH I限制性内切酶识别位点；

反向引物：ACGCGTCGACGGTAGCCGCGCCAGAACCATTTGTC

该引物含有Sal I限制性内切酶识别位点；

(2)PCR反应体系均为50μl：

10×缓冲液buffer：5μL；上游引物：1μL；下游引物：1μL；dNTP：1μL；模板：1μL；Taq酶：0.5μL；ddH₂O：40.5μL

(3)PCR程序：

①94℃10min

②②5个循环：94℃1min，58℃1min，72℃1min；5个循环：94℃1min，57℃1min，72℃1min；25个循环：94℃1min，56℃1min，72℃1min

③72℃10min

(4)PCR产物确定：将上述得到的PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，同时加上100bpLadder对PCR产物进行初步鉴定测序，确定是否得到正确的目的片段。经电泳分析，在约600bp左右出现1条特异性条带，大小与预期值相符(图1)。切胶回收纯化目的片段并进行测序，测序结果与NCBI苯酚羟化酶基因(注册号GQ396163.1)进行比对。结果表明：目的基因全长为601bp，而且序列与所报道的序列一致，已经成功扩增出目的片段。

2、重组质粒的构建

用BamH I和Sal I进行双酶切PCR产物，与同样经过BamH I和Sal I双酶切的克隆表达载体pWB980相连接，连接反应体系(10μL)如下：无菌水5μL，10×缓冲液buffer：1μL pWB980载体(25ng/μL)：2μL，新鲜PCR产物：1μL，T₄DNA连接酶：1μL。此反应操作在冰上进行，将反应产物置于16℃，过夜。

3、转化

将步骤2的连接产物通过化学转化方法转入E.coli DH5α。

其具体步骤为：

①在冰上融化E.coli DH5α感受态细胞用移液器吸取10μl连接产物加入到感受态细胞中，用枪头轻柔搅拌混匀

②冰浴30min，42℃热激细胞90s，不要摇动，请移至冰浴

③每个反应中加入800μlLB培养基，在37℃摇床中，以220rpm的转速水平振荡1h

④取150μL转化产物，涂布于包含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养，

⑤挑取单菌落，分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养10h，提取质粒。重组质粒经PCR及双酶切鉴定目的片段已经成功插入了表达载体。将验证成功的重组质粒转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis DB1342)中。

其中枯草芽孢杆菌((Bacillus subtilis DB1342)感受态制备方法及所用培养基如下：

(1)枯草芽孢杆菌感受态制备用贮存液：10×Spizizen salts母液：15％K₂HPO₄·3H₂O，0.6％KH₂PO₄，2％(NH₄)₂SO₄，0.2％MgSO₄，1％柠檬酸钠，溶于蒸馏水中。115℃，6.6×10⁴Pa高压灭菌20min，室温贮存。

10％酵母粉、1％水解酪蛋白和25mmol/LMgCl₂，6.6×10⁴Pa高压灭菌；20％葡萄糖、025％组氨酸和0.1mol/LCaCl₂，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌待用。

(2)枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基：10mL GMI：1mL10×Spizizen salts，0.1mL10％酵母粉，0.25mL20％葡萄糖，0.2mL1％水解酪蛋白，0.2mL0.25％组基酸，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。

10mLGMII：1mL10×Spizizen salts，0/05mL10％酵母粉，0.25mL20％葡萄糖，0.04mL1％水解酪蛋白，0.2mL0.25％组氨酸，0.05mL0.1mol/LCaCl₂，1mL25mmol/LMgCl₂，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。

(3)枯草芽孢杆菌感受态细胞制备方法

挑取一新鲜培养的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis DB1342)单菌落接种于2.5mLGMI培养基中，30℃130-150r/min振荡培养过夜；将过夜培养物按10％接种量接种于2.5mL新鲜的GMI中，37℃200-230r/min振荡培养3.5h；再以10％接种量将培养物接种于5mLGMII中进行第二次传代，37℃，200-230r/min振荡培养90min；取1mL培养物，5000r/min室温离心5min，用1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。

(4)重组质粒转化

取验证成功重组质粒加至上述所制的枯草芽孢杆菌感受态细胞悬液中，至终浓度1g/mL，质粒体积不超过感受态细胞悬液体积的1/20，混匀。37℃水浴中静置30-60min，37℃200r/min振荡培养2-4h，取150μL转化产物，涂布于包含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养(李瑞芳，薛雯雯，黄亮等，枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究。生物技术通报[J]，2011(5)：227-230)。

4、重组质粒的高效表达及SDS-PAGE电泳分析

挑取含所需质粒的单菌落至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm振荡过夜培养，次日以3％接种量接种于200mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.7-1.0时，用浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导，未诱导菌作对照，25℃诱导表达14h，取1mL菌液于12000r/min离心2min收集上清液，同样的程序做空白菌(枯草芽孢杆菌DB1342)的对照，各取重组菌和空白菌上清10μl分别与10μl上样缓冲液混合，沸水浴10min，离心取上清进行SDS-PAGE(12％分离胶、5％浓缩胶)电泳检测蛋白表达情况(图2)。由图2的SDS-PAGE电泳分析表明，重组菌上清在22kDa处出现一条特异性条带，与预期苯酚羟化酶分子量大小相符，而空白菌在22kDa处无条带，说明了苯酚羟化酶基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达。

5、重组菌耐酚能力及降酚能力的测定

将含有苯酚羟化酶基因的重组枯草芽孢杆菌接种于20mL的LB培养液中，37℃、200r/min过夜摇培，再以2％的接种量接种到50mL分别含300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L苯酚的唯一碳源培养基中(培养基具体成分为：KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂0.1g，MnSO₄·H₂O0.03g，FeSO₄·7H₂O0.03g，NH₄NO₃1.0g加水到1L，根据所需添加不同苯酚量)同时以不加菌的相同培养基作为对照，37℃、200r/min摇培，每隔5h取5mL样品测定苯酚的含量，来考查重组菌对苯酚的降解能力及耐受力。

苯酚含量的测定方法采用4-氨基安替吡啉直接吸光光度法。

测定结果表明，重组菌对各种浓度的苯酚皆有较好的降解能力。在35h内重组菌对浓度为300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L苯酚的降酚率分别为100％、100％、100％、98.87％、85.24％、78.11％。同时也测定了枯草芽孢杆菌((Bacillussubtilis DB1342)对苯酚的降解率，发现该菌对苯酚的利用率特别低，在含有苯酚的唯一碳源培养基中几乎不能生长。

说明经过改造的菌株除了具有本身的一些特性外，还获得了降解苯酚能力的新性状，而且该菌株比一些通过富集、分离、筛选得到的降解苯酚优势菌具有更强的降酚能力及耐受性。

经过检测：本重组菌株对苯酚的耐受性高于2000mg/L，而且在35h内对2000mg/L苯酚的降解率高达78.11％。

与本发明相关的对比菌的苯酚降解情况：

1、刘惠、丛燕燕、叶瑶等利用梯度压力驯化筛选法从油田污泥中得到一株革兰氏阴性苯酚降解菌PHE-2，该菌株对苯酚浓度为400mg/L的苯酚降解率在26h后达到80％以上，38h后达99％以上，该菌能耐受的最高苯酚浓度为500mg/L，当苯酚浓度大于500mg/L时，该菌的生长受到抑制，但对苯酚的降解能力仍较强(刘惠、丛燕燕、叶瑶，赵孝保，顾中铸.油田污泥中苯酚降解率的筛选及降解苯酚研究.中国给水排水，2009，25(19)：88-90.)。

2、潘利华，姜绍通，刘鹏达等从某印染厂下水道的污泥中分离到一株能高效降解苯酚的菌株Ph16，经初步鉴定为微球菌属(Micrococcus sp.)。该菌株最高可耐受1.5g/L左右的苯酚，该菌降解苯酚最适条件为Ph7.0，温度35℃，苯酚浓度1.0g/L，时间36h，通气有利于苯酚的降解，降解率可达99.6％(潘利华，姜绍通，刘鹏达，李慧星.苯酚降解菌的筛选及其降解特性的初步研究[J].微生物学通报，2003，30(5)：78-81.)。

3、何晓丽，陈晨，傅盈盈等从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到一株能够利用并降解苯酚的菌株P2。通过苯酚降解实验证实，该菌能在30℃，192h内完全降解500mg/L的苯酚(何晓丽，陈晨，傅盈盈，陈璐等.一株苯酚降解菌的筛选及其降解特性的初步研究[J].生物学杂志，2010，1(27)：31-35.)。

通过以上数据对比可得该重组菌株在对苯酚的降解能力及耐受性方面具有优势，这将为采用生物方法处理含酚废水提供可靠的方法，对苯酚降解菌的工业化生产提供新的理论依据。

Claims

1.一种降解苯酚的基因工程菌，其特征在于：含有苯酚羟化酶基因。

2.根据权利要求1所述的降解苯酚的基因工程菌，其特征在于：所述苯酚羟化酶基因来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA01。

3.根据权利要求1所述的降解苯酚的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DB1342。

4.一种如权利要求1或2或3所述的降解苯酚的基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：

(1)PCR扩增苯酚羟化酶基因

(2)重组质粒的构建

用BamH I和Sal I进行双酶切PCR产物，与同样经过BamH I和Sal I双酶切的克隆表达载体pWB980相连接；

(3)转化

将步骤(2)的连接产物转入E.coli DH5α感受态中，取150μL转化产物，涂布于包含卡那霉素的LB平板上，30-45℃，210-230rpm过夜培养，挑取单菌落，分装含有卡那霉素的LB培养基，30-45℃，210-230rpm培养8-15h，提取质粒，重组质粒经PCR及酶切鉴定目的片段已经插入了载体，将验证成功的重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis DB1342中，获得降解苯酚的基因工程菌。

5.一种权利要求1所述的降解苯酚的基因工程菌在降解苯酚中的应用。