CN1500802A - 苯酚羟化酶基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苯酚羟化酶基因及其用途。本发明提供了可将苯酚转化为邻苯二酚的代谢编码基因；构建具有完全苯酚羟化酶基因的高频接合转移质粒；获得能够增强对苯酚的降解或扩大底物降解范围的遗传工程菌株。将苯酚羟化酶基因转入到醋酸钙不动杆菌PHEA－2后，提高了该菌株的苯酚降解能力，转入到甲苯降解菌中，还使菌株获得降解苯酚的能力，扩大底物降解范围。

Description

苯酚羟化酶基因及其用途

技术领域：

本发明涉及从醋酸钙不动杆菌PHEA-2中克隆的苯酚羟化酶基因，以及该基因在增添或增强受体菌降解苯酚能力方面的用途。

背景技术：

苯酚是我国列为严重污染环境和危害人体健康的优先控制污染物。利用环境生物技术是目前消除环境中这类化合物的主要方法。生物处理的核心是通过微生物的代谢活动将废水中的有机物氧化分解为无机物。处理的效果与处理系统中的微生物群落结构、数量、降解菌的降解能力有很大的关系。但是，现有的处理系统中的微生物群落结构不合理，降解菌的降解能力低、底物范围窄等。例如，已有的研究表明，在废水处理系统中，苯酚浓度达440mg/L以上时，微生物的降解速度很慢。当苯酚浓度过高时，活性污泥产生毒性抑制，导致处理效果不佳(如苯酚浓度为800mg/L，活性污泥解体)。因此，广泛存在于印染、制药、橡胶、石油化工等行业废水的芳香化合物尚没有切实可行的治理方法。

很多微生物都具有代谢苯酚等芳香化合物的能力。细菌对几种不同芳香化合物的主要代谢途径为：经酶催化将芳香化合物转化为几种中间代谢产物-双酚类化合物：原儿茶酚和儿茶酚(Chaudhry G R，Chakrabarty A M.Biodegradation of halogenated organiccompounds.Microbiol.Rev.1991.55：59-79，Gibson，D.T.，and V Subramanian.1984，Microbialdegradation of aromatic hydrocarbons，p.181-252.In D.T.Gibson(ed)，Microbial degradation oforganic compounds.Marcel Dekker，Inc.，New York.)，这些二羟基中间产物通过间位开环或邻位开环，最终进入三羧酸循环而完全降解。

一般情况下，经苯酚羟化酶催化，苯酚降解菌将苯酚转化为毒性较小的邻苯二酚，然后邻位或间位开环，经过一系列生化反应氧化为二氧化碳和水。苯酚羟化酶含量的增加可加快苯酚降解的速度。

通过对芳香化合物的代谢途径微生物生物降解的遗传机制的了解，人们提出了降解广底物范围的工程菌株的模式：即利用已有的下游降解基因，导入关键酶的基因使底物生成原儿茶酚或儿茶酚中心中间产物，进行降解。由于降解基因成簇排列，大部分由质粒携带，克隆的基因簇如果能在新寄主细胞中正常或高效表达，就可以构建能利用多种芳香化合物的工程菌株，如将bphABCD转入到氯代苯甲酸、氯代苯和2，4-D降解菌株中，就可能使它们降解一些多氯联苯。降解3-氯苯甲酸的Psudomonas sp.B13和降解甲苯的P.putida F1都不能降解氯苯，但当将B13的降解基因转入到F1时，转化后的菌株具有降解氯苯和1，4-二氯苯的能力(Van Der Meer J.R.，Willem M.De Vos，Harayama S.，andAlexander J.B.Zehnder，1992，Molecular mechanisms of genetic adaptation to xenobioticcompounds.Microbiological Reviews，677-694)。表1-2示A.eutrophus遗传工程菌所获得的降解几种氯代芳香化合物的能力。除了克隆单个的基因和基因簇之外，为了拓展微生物利用底物的范围，还可以将一些降解基因及它们的调控基因构建成易操作的基因单元，以便将它们转入到期望的菌株中用于降解有毒废物。

发明内容：

本发明要解决的技术问题如下：

1、提供可将苯酚转化为邻苯二酚的代谢编码基因；

2、构建具有完全苯酚羟化酶基因的高频接合转移质粒；

3、获得能够增强对苯酚的降解或扩大底物降解范围的遗传工程菌株。

本发明从自然界中筛选分离到一株具有高效降解苯酚能力的醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2，该菌株能以苯酚作为唯一的碳源生长，有效去除废水的苯酚。本发明构建了该菌株基因文库，克隆了苯酚降解途径的关键酶--苯酚羟化酶(phenol hydroxylase)基因。

将上述基因转入到原始菌株醋酸钙不动杆菌PHEA-2后，提高了PHEA-2菌株的苯酚降解能力；转入到无降解苯酚的能力的甲苯降解菌(假单胞菌)中，使该菌株获得降解苯酚的能力。

本发明具体是通过如下方式实现的：

1、PHEA-2菌株的筛选

本发明采用富集选择培养技术分离苯酚降解菌株。首先用多种芳香化合物作为碳源从含酚炼油废水中进行初筛，然后将细菌分离物从含苯酚的MS平板或上液体培养基中培养，使其在1d内显著生长。通过对一株苯酚降解能力强的菌株的16S rDNA序列分析和生理生化测定，鉴定为醋酸钙不动杆菌PHEA-2。研究表明该菌株具有氯霉素和氨苄，可在24小时内完全降解3mM苯酚。

2、PHEA-2菌株基因文库的构建

提取醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2的总DNA，部分酶切后连接到载体Lambda GEM-11上，转染大肠杆菌细菌，获得PHEA-2菌株基因文库。

3、苯酚羟化酶基因文库的克隆

从基因文库中筛选到6株阳性重组噬菌体，对阳性重组噬菌体P21的外源DNA进行了序列分析，表明该序列包含全部苯酚羟化酶基因4668bp，其多核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。该序列包含全部苯酚羟化酶基因4668bp，该插入片段含有6个完整的开放阅读框(ORF)，分别命名为ORF2～ORF7，其序列推导氨基酸分别与A.CalcoaceticusNCIB8250苯酚羟化酶的6个亚基MopK、L、M、N、O、P有58.5％、72.4％、80.9％、93.5％、60.8％、84.7％的同源性，表1中ORF2～ORF7被命名为mphK、L、M、N、O、P。

              表1苯酚羟化酶基因及其阅读框(ORFs)编码的产物

基因    大小            与菌株NCIB8250    氨基酸数目

Gene    Size(bp)        的氨基酸序列同源性    No.Of amino acid

ORF2    300             58.5％                99

ORF3    999             72.4％                332

ORF4    267             80.9％                88

ORF5    1527            93.5％                508

ORF6    363             60.8％                120

ORF7    1062            84.7％                353

4、苯酚羟化酶基因高频接合转移质粒的构建

将含有A.calcoaceticus PHEA-2的苯酚羟化酶完整基因的重组噬菌体P21DNA，SalI完全酶切后，用T4 DNA连接酶将酶切片段连接到具有广寄主范围的特性的自杀性质粒pSZ21中，构建含Tn5：苯酚羟化酶基因的重组质粒pAX7851。

5、工程菌株的构建及苯酚羟化酶基因的表达

将含Tn5：苯酚羟化酶基因的重组质粒pAX7851与野生型菌株PHEA-2或甲苯降解菌(Psudomonas sp.A5)进行接合，从限制性平板上选择具有km抗性的接合子，经过数次抗性转接筛选后，选取抗性稳定的具有苯酚羟化酶活性的接合子(PHEA-21及A51)。

具体实施方式：

实施例1：PHEA-2菌株的筛选

用多种芳香化合物作为碳源从含酚炼油废水中进行初筛(具体方法：取含酚废水1ml，加灭菌水至10ml，振荡摇匀，将100μl涂布含氯苯、苯酚、甲苯、邻苯二酚各200mg/l的LB平板上)，分别接种于含3mM苯酚的MS平板或上液体培养基中，培养物在30℃培养，挑选1天内显著生长的单菌落。对一株能以苯酚作为唯一碳源良好生长的微生物菌株进行16S rDNA序列分析和生理生化测定，研究表明该菌株具有氯霉素和氨苄抗性，接种于3mM苯酚为唯一碳源的MS培养基中，每隔2-3小时取样测定培养液中的苯酚含量(苯酚的含量测定按国家检测标准方法--4-氨基安替比林法)(国家环保局《水和废水监测分析方法》编委会，1997，水和废水监测分析方法，北京，中国环境科学出版社)，发现在24小时内苯酚被完全降解。该菌株被鉴定为醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticusPHEA-2。

MS无机培养基的配制如下：

NaNO₃，0.50g，K₂HPO₄，0.65g，MgSO₄，0.10g，

KH₂PO₄，0.17g，H₂O，1000mL，pH6.8

LB培养基的配制如下：

NaCl，5.0g，胰蛋白胨，10g，酵母膏，5g，H₂O，1000mL，pH6.8

实施例2：PHEA-2菌株基因文库的构建

采用细菌总DNA提取的常规方法(CTAB法，Wilson K.Preparation of genomic DNAfrom bacteria.Preparation of genomic from bacteria.1987.P.2.10-2.12.In F.M.Ausubul，R.Bent，et al.Current protocols in molecular biology.J.Wiley & Sons，New York，N.Y.)，提取醋酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2的总DNA，用适量的限制性内切酶Sau3A I在37℃、水浴条件下对50～100μg总DNA进行部分酶切，酶切片段于0.4％的琼脂糖胶上电泳，用溴化乙锭染色后，紫外线下切下含15～23kb片段的琼脂糖胶，放入1.5ml的离心管中，加入3～4倍体积的Binding Buffer，在55～65℃水浴条件下，反应约7min到胶彻底溶解，将DNA/琼脂糖溶解液置于回收柱中，室温离心1min，转速为10,000rpm。再加入用无水乙醇稀释的Wash Buffer 750μl，室温离心1min，转速10,000rpm，再加入30～50μl超纯水到离心柱，室温离心1min，转速10,000rpm，将DNA回收到新的灭菌Eppendorf离心管。将回收的15-23kb酶切片段(0.3-0.9μg)、T4连接酶(3U)、载体Lambda GEM-11(1.0μg)，在室温下连接3h，反应体积为10μl，将连接产物转染大肠杆菌，获得PHEA-2菌株基因文库。

实施例3：苯酚羟化酶基因文库的克隆

通过比较不同苯酚降解菌的苯酚羟化酶基因的核苷酸序列，设计出一对该基因的特异性引物Lphl(5′-AGG CAT CAA GAT CAC CGA CTG-3)和Lph2(5′-CGC CAG AAC CATTTA TCG ATC-3′)，得到684bp的PCR产物，以此产物为探针，通过杂交从基因文库中筛选到6株阳性重组噬菌体，对其中的阳性重组噬菌体P21的外源DNA进行了序列分析，该序列包含全部苯酚羟化酶基因4668bp，该插入片段含有6个完整的开放阅读框(ORF)，分别命名为ORF2～ORF7，其序列推导氨基酸分别与A.CalcoaceticusNCIB8250苯酚羟化酶的6个亚基MopK、L、M、N、O、P有58.5％、72.4％、80.9％、93.5％、60.8％、84.7％的同源性，ORF2～ORF7在表1中称为mphK、L、M、N、O、P。

实施例4：构建苯酚羟化酶基因高频接合转移质粒及羟化酶基因转移到受体菌中

分析发现重组噬菌体P21的SalI片段含有A.calcoaceticus PHEA-2的苯酚羟化酶完整基因，SalI完全酶切后，通过T4 DNA连接酶连接到具有广寄主范围的特性的自杀性质粒pSZ21的Tn5转座子的SalI位点中，构建含Tn5：苯酚羟化酶基因的重组质粒pAX7851。通过该质粒将苯酚羟化酶基因转移到醋酸钙不动杆菌、假单胞菌等土壤细菌中，使这些菌株获得了苯酚羟化酶的活性。

实施例5：工程菌株的构建及苯酚羟化酶基因的表达

将含有Tn5：苯酚羟化酶基因的重组质粒pAX7851供体菌和受体菌(野生型菌株PHEA-2或甲苯降解菌(Psudomonas sp.A5)分别少量培养在LB培养基中过夜，次日分别转接入5ml的LB培养基中培养2h，分别取出1.5ml菌液离心，去上清，再用生理盐水悬浮并离心，重复一次，将离心的菌体悬浮于100μl的生理盐水中，取出30μl按供体：受体为1∶1的比例混合，两两混合和不混合的做对照。然后分别滴在LB平板上，将平板置于一个潮湿的器皿中，30℃培养6～8hr，用牙签将它们分别挑起放入1ml LB液体中，悬浮并摇匀，以10^-3～10^-5的稀释度稀释后，铺于含有Km的A15平板上，30℃培养过夜后挑取单菌落，PCR检测接合子是否含有目的基因--苯酚羟化酶基因。

通过测试重组菌株对苯酚的降解和耐受能力，从几十株转有Tn5：苯酚羟化酶基因的A.calcoaceticus重组接合子中筛选到降解苯酚能力增强的PHEA-21，具体筛选方法及降解特性如下：从野生型A.calcoaceticus PHEA-2和重组接合子PHEA-21的平板上，挑取单菌落接种在20ml的LB培养液中，30℃ 200rpm过夜摇培，分别以2％的接种量接种到100ml含2mmol/L和4mmol/L苯酚的MS液体培养基中，同时以不加菌的相同培养基作为对照，30℃ 200rpm摇培，每隔3h取5ml样品测定苯酚的含量。测定结果表明，发现在2mmol/L苯酚的MS培养液中，重组接合子PHEA-21在9h内基本上将苯酚全部降解掉，野生型PHEA-2则需15h才能完全降解溶液中的苯酚；在4mmol/L苯酚的MS培养液中，24h后，重组接合子PHEA-21可以将溶液中的苯酚降解掉，而在接种野生型PHEA-2的培养液中，苯酚的浓度几乎没有下降。

同样，转有Tn5：苯酚羟化酶基因的甲苯降解菌(Psudomonas sp.A5)的重组接合子A51，接种到以苯酚或甲苯(2mmol/L)为唯一碳源的MS液体培养基上，显示出良好生长的能力。研究表明重组接合子除具有利用甲苯作为碳源生长的特性外，并获得降解苯酚能力的新性状。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院原子能利用研究所

<120>苯酚羟化酶基因及其应用

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<170>PatentIn version 3.1

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<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

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ttaggaattg cgcagtacat ctcacggatt ggcttagctt tagatggcaa cagcggcgac    540

tcactacagc aggcaaaaca ggcttggatg caacatcctg catggcaagg cttacgccgt    600

ctgtgtgaag aaagcctcac cgagcaagac tacttcaaac tctttttatt acaaaatctt    660

gtgattgacg gctttgtgac cgagcttgtt tatcaacagt ttgatcagtg gttagtgagt    720

caaaatgctc gtgacttagc catgctgact gaatttatga aagacacttt aggtgattta    780

cgtaagtggt cagacaccgt cattaaaact gccgcagcag aatccgatca taacaaacag    840

ctattaaatg aatggttcac tgagtctcta gctcaagtga aagcagcctt tacaccttgg    900

gcaacagcag ccttaacagt agatgcagtc gatcaagcag aacaagccgt tattgaacgt    960

gcaaaaaaac tcggcctaca accacttaca aatgcttaa                           999

<210>4

<211>267

<212>DNA

<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>4

atgtctaaag tctatctcgc actacaagac aacgatactt cacgctacat cattgaggcg    60

attgaagaag ataaccctga agcgtcaatt cagtatttac ccgccatgat tcgcattgaa    120

agtgaaactg atttggtgat taaagccgaa accgtatctg aaaaactagg ccaagattgg    180

gacatccaat cgttacaact caacatgatt acgctgggcg gcaacgtcga agaagatgac    240

gatactttcc gccttcactg gaattaa                                        267

<210>5

<211>1527

<212>DNA

<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>5

atgacaactc aaacgaaaga aaccagtaaa aaattaaatg cgaaagatcg ttaccgtgca    60

ttaacccgtg atctggactg ggacttttcc tatgctgacc gtaaagatgc tttcccttat    120

gaagagtttg aaggcatcaa aattacggac tggtctaaat gggaagatcc attccgttta    180

accatggatg cttactggaa atatcaggca gaaaaagaga aaaaactgta tgccattttt    240

gatgcctttg ctcaaaacaa tggtcagatg aatgtcagca atgaacgtta cttaaatgcg    300

atcaaactct ttttaacagc ggtgacccca cttgaatatc aggcttatca aggttatgca    360

catgtaggcc gccagtttag tggaattgga gcacgtattg cttctcagat gcagtcgatt    420

gatgagctgc gtcatgtaca gacccaaatt catgccatga gccattacaa caagttcttt    480

gatggttttc aggattgggc acacatgcat gaccgcgttt ggtatttgtc tgtacctaaa    540

tcatttttcg aagatgcccg ttctgctggc cctttcgagt ttttattagc gattagtttt    600

gcttttgaat atgtacttac caacttactg tttgttccgt ttatgtcggg tgcagcttat    660

aacggcgata tggcaaccgt gacctttggt tttagtgcac agtctgatga agcgcgtcac    720

atgacgcttg gtcttgaaat cgtaaaattc ttgctcgaac agcatgaaga caacgtgcca    780

attgtgcagg aatggattga taaatggttc tggcgcggaa ctcgtttgct ttcaattgta    840

ggcatgatga tggattacat gctgccaaac aaagtgatgt cttggaaaga agcttgggaa    900

gtttactttg aacaggcagg cggcgcacta tttaaagatt tgagccgtta tggcattcgt    960

atgccgaaat atagcgatgt cattgtgaaa gaaaaagagc atgtctcaca tcaggcatgg    1020

tggattttct ataactttgg tcatgcggct ggtttccata cttggattcc aaccgacgaa    1080

gaaatggatt ggttatcggc taaatatccg gacacttttg ataaatacta ccgtccaaaa    1140

tgggagttgg ctcgcaaaat ggaagccgaa ggtaaacgct tctatagcgc aggtttaccg    1200

cagctttgtc aggtttgtca gattccaatg acccctactg aaatgggtga tgacccgact    1260

cagtttagtt atcgccatag catctaccaa ggcgaacgct accacacctg ttcagatggc    1320

tgtcatgaca ttttcgaacg cgagcctgag aaatatatac aagcatggct acctgtaaat    1380

caaattttac aaggtaactg tggtagcggt gacctcgaaa ctatgctccg tgattattac    1440

cgcatgaatg tgggtgccga caatctggat attgaaggtt ctccagacca acagcgctgg    1500

aaaaaatgga aaggcaacgc agcttaa                                        1527

<210>6

<211>364

<212>DNA

<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>6

atgactgttc gcgcgataca caacaactat caatttgaac cgctcgatct gcaaaaaaat    60

tatggcgatc aattcttact ttacgtgggt tgggatcatc acaccctttt ttgctcggca    120

catgccatgc ttgcctcacc tcaacaaact ttgggacagt tgattgagca acaaattaca    180

ggtggttttg ctcaacatcc agattttgcc aaaattgatt ggtcaaaagt gcaatacacc    240

ttagatggtc aaacaattag tcctgagagt acaaaaactt tggcagagct tggttttggg    300

cataagtcat tacttcgttt cgttacgcca gagctaaatg gctataacga cagctacgtt    360

taat                                                                 364

<210>7

<211>1062

<212>DNA

<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>7

atgagttatc aagtcaccat tgaaccgatc ggaacaacga ttgaagtaga agaagaccaa    60

accattttag atgctgccct acgccaaggc gtttggttac cctttgcctg tggtcatggc    120

acttgcggga catgtaaggt tcaagtcacc gacggttttt acgatgttgg tgaagcctcg    180

ccatttgcgc tcatggatat tgaacgtgat gaaaataaag tgcttgcctg ttgctgtaaa    240

ccacagtccg atatggtcat tgaagccgat gttgatgaag acccagattt cttaggtcat    300

ttggttcaag actatcaagc gacagtcatt gaaataaaag acctgtcgcc aaccatcaaa    360

ggaatccgac tacaactaga tcggccaatc gaattccaag ctggccaata tatcaatgtc    420

cagttcccaa acattgaagg aactcgagcg ttttcaattg ccaattcacc aagtgaagtg    480

ggtattgttg agctccatat tcgtaaagtt gaaggcggtg cagcgactac ttatgtgcat    540

gaacaacttg ccacgggcga tcagcttgat atttcaggcc cttatggtca atttttcgta    600

cgcaagtcag atgatcaaaa tgccattttc attgcaggtg gttcaggtct ttcaagtcca    660

caatcgatga ttttagattt gcttgagtct ggagatagtc gcacgattta cctcttccaa    720

ggagcacgag acttggcaga gctatacaac cgagagttat ttgaacagct cgtaaaagac    780

tatccgaatt tccgctatat ccctgccctg aatgcaccaa aaccagaaga ccaatggact    840

ggatttaccg gattcgtgca cgaggccgtt gccgattact ttgaaaatcg atgtggtgga    900

cacaaagcgt atttgtgcgg cccaccaatc atgatcgact cggcaatttc aacgctcatg    960

caaagccgtc tatttgaacg ggacattcat actgaacggt tcttaagtgc agccgatggt    1020

gctgctggac aatcacgttc agctttattc aaacatattt aa                       1062

<210>8

<211>99

<212>PRT

<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>8

Met Glu Tyr Ser Met Thr Gln Pro Gln Val Glu Ala Leu Thr Lys Tyr

1               5                   10                  15

Ile Arg Val Thr Gly Asp Leu Asn Ala Glu Phe Ile Glu Phe Asp Phe

            20                  25                  30

Ala Ile His Asp Pro Ser Leu Phe Val Glu Leu Val Leu Pro Lys His

        35                  40                  45

Ala Phe Lys Asp Phe Cys Lys Thr Asn Gln Val Val Glu Met Thr Gln

    50                  55                  60

Glu Gln Gln Ala Phe Asn Asp Ala Gln Glu Glu Lys Trp Arg Tyr Gly

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ala Thr Leu Val Gly Thr Gln Arg Asn Ser Asn Asp Gln Asp

                85                  90                  95

Asp Gln Met

<210>9

<211>332

<212>PRT

<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>9

Met Thr Leu Glu Ile Lys Thr Ser Asn Val Glu Pro Ile Arg Gln Asn

1               5                   10                  15

Tyr Ala Tyr Ile Glu Arg Arg Phe Gly Ser Lys Pro Ala Thr Arg Tyr

            20                  25                  30

Gln Glu Val Ser Phe Asp Val Gln Ala Glu Thr Asn Phe His Tyr Arg

        35                  40                  45

Pro Leu Trp Lys Pro Glu Lys Thr Leu Asn Asp Lys Thr His Thr Ala

    50                  55                  60

Leu Gln Met Gln Asp Trp Tyr Ala Phe Lys Asp Pro Arg Gln Phe Tyr

65                  70                  75                  80

Tyr Gly Thr Tyr Val Gln His Arg Ala Arg Leu Gln Asp Thr Ala Glu

                85                  90                  95

Ser Asn Phe Ala Phe Phe Glu Lys Arg Gln Leu Ala Glu His Leu Ser

            100                 105                 110

Asn Glu Val Lys Ala Lys Val Ile Glu Cys Leu Leu Pro Phe Arg His

        115                 120                 125

Val Glu Gln Thr Ala Asn Leu His Met Met Ser Gly Ser Ala Tyr Gly

    130                 135                 140

Tyr Gly Thr Val Leu Thr Gln Ala Cys Ile Tyr Ala Ala Met Asp His

145                 150                 155                 160

Leu Gly Ile Ala Gln Tyr Ile Ser Arg Ile Gly Leu Ala Leu Asp Gly

                165                 170                 175

Asn Ser Gly Asp Ser Leu Gln Gln Ala Lys Gln Ala Trp Met Gln His

            180                 185                 190

Pro Ala Trp Gln Gly Leu Arg Arg Leu Cys Glu Glu Ser Leu Thr Glu

        195                 200                 205

Gln Asp Tyr Phe Lys Leu Phe Leu Leu Gln Asn Leu Val Ile Asp Gly

    210                 215                 220

Phe Val Thr Glu Leu Val Tyr Gln Gln Phe Asp Gln Trp Leu Val Ser

225                 230                 235                 240

Gln Asn Ala Arg Asp Leu Ala Met Leu Thr Glu Phe Met Lys Asp Thr

                245                 250                 255

Leu Gly Asp Leu Arg Lys Trp Ser Asp Thr Val Ile Lys Thr Ala Ala

            260                 265                 270

 Ala Glu Ser Asp His Asn Lys Gln Leu Leu Asn Glu Trp Phe Thr Glu

         275                 280                 285

 Ser Leu Ala Gln Val Lys Ala Ala Phe Thr Pro Trp Ala Thr Ala Ala

     290                 295                 300

 Leu Thr Val Asp Ala Val Asp Gln Ala Glu Gln Ala Val Ile Glu Arg

 305                 310                 315                 320

 Ala Lys Lys Leu Gly Leu Gln Pro Leu Thr Asn Ala

                 325                 330

 <210>10

 <211>88

 <212>PRT

 <213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

 <400>10

 Met Ser Lys Val Tyr Leu Ala Leu Gln Asp Asn Asp Thr Ser Arg Tyr

 1               5                   10                  15

 Ile Ile Glu Ala Ile Glu Glu Asp Asn Pro Glu Ala Ser Ile Gln Tyr

             20                  25                  30

 Leu Pro Ala Met Ile Arg Ile Glu Ser Glu Thr Asp Leu Val Ile Lys

         35                  40                  45

 Ala Glu Thr Val Ser Glu Lys Leu Gly Gln Asp Trp Asp Ile Gln Ser

     50                  55                  60

 Leu Gln Leu Asn Met Ile Thr Leu Gly Gly Asn Val Glu Glu Asp Asp

 65                  70                  75                  80

 Asp Thr Phe Arg Leu His Trp Asn

                 85

<210>11

<211>508

<212>PRT

<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>11

Met Thr Thr Gln Thr Lys Glu Thr Ser Lys Lys Leu Asn Ala Lys Asp

1               5                   10                  15

Arg Tyr Arg Ala Leu Thr Arg Asp Leu Asp Trp Asp Phe Ser Tyr Ala

            20                  25                  30

Asp Arg Lys Asp Ala Phe Pro Tyr Glu Glu Phe Glu Gly Ile Lys Ile

        35                  40                  45

Thr Asp Trp Ser Lys Trp Glu Asp Pro Phe Arg Leu Thr Met Asp Ala

    50                  55                  60

Tyr Trp Lys Tyr Gln Ala Glu Lys Glu Lys Lys Leu Tyr Ala Ile Phe

65                  70                  75                  80

Asp Ala Phe Ala Gln Asn Asn Gly Gln Met Asn Val Ser Asn Glu Arg

                85                  90                  95

Tyr Leu Asn Ala Ile Lys Leu Phe Leu Thr Ala Val Thr Pro Leu Glu

            100                 105                 110

Tyr Gln Ala Tyr Gln Gly Tyr Ala His Val Gly Arg Gln Phe Ser Gly

        115                 120                 125

Ile Gly Ala Arg Ile Ala Ser Gln Met Gln Ser Ile Asp Glu Leu Arg

    130                 135                 140

His Val Gln Thr Gln Ile His Ala Met Ser His Tyr Asn Lys Phe Phe

145                 150                 155                 160

Asp Gly Phe Gln Asp Trp Ala Hi s Met His Asp Arg Val Trp Tyr Leu

                165                 170                 175

Ser Val Pro Lys Ser Phe Phe Glu Asp Ala Arg Ser Ala Gly Pro Phe

            180                 185                 190

Glu Phe Leu Leu Ala Ile Ser Phe Ala Phe Glu Tyr Val Leu Thr Asn

        195                 200                 205

Leu Leu Phe Val Pro Phe Met Ser Gly Ala Ala Tyr Asn Gly Asp Met

    210                 215                 220

Ala Thr Val Thr Phe Gly Phe Ser Ala Gln Ser Asp Glu Ala Arg His

225                 230                 235                 240

Met Thr Leu Gly Leu Glu Ile Val Lys Phe Leu Leu Glu Gln His Glu

                245                 250                 255

Asp Asn Val Pro Ile Val Gln Glu Trp Ile Asp Lys Trp Phe Trp Arg

            260                 265                 270

Gly Thr Arg Leu Leu Ser Ile Val Gly Met Met Met Asp Tyr Met Leu

        275                 280                 285

Pro Asn Lys Val Met Ser Trp Lys Glu Ala Trp Glu Val Tyr Phe Glu

    290                 295                 300

Gln Ala Gly Gly Ala Leu Phe Lys Asp Leu Ser Arg Tyr Gly Ile Arg

305                 310                 315                 320

Met Pro Lys Tyr Ser Asp Val Ile Val Lys Glu Lys Glu His Val Ser

                325                 330                 335

His Gln Ala Trp Trp Ile Phe Tyr Asn Phe Gly His Ala Ala Gly Phe

            340                 345                 350

His Thr Trp Ile Pro Thr Asp Glu Glu Met Asp Trp Leu Ser Ala Lys

        355                 360                 365

Tyr Pro Asp Thr Phe Asp Lys Tyr Tyr Arg Pro Lys Trp Glu Leu Ala

    370                 375                 380

Arg Lys Met Glu Ala Glu Gly Lys Arg Phe Tyr Ser Ala Gly Leu Pro

385                 390                 395                 400

Gln Leu Cys Gln Val Cys Gln Ile Pro Met Thr Phe Thr Glu Met Gly

                405                 410                 415

Asp Asp Pro Thr Gln Phe Ser Tyr Arg His Ser Ile Tyr Gln Gly Glu

            420                 425                 430

Arg Tyr His Thr Cys Ser Asp Gly Cys His Asp Ile Phe Glu Arg Glu

        435                 440                 445

Pro Glu Lys Tyr Ile Gln Ala Trp Leu Pro Val Asn Gln Ile Leu Gln

    450                 455                 460

Gly Asn Cys Gly Ser Gly Asp Leu Glu Thr Met Leu Arg Asp Tyr Tyr

465                 470                 475                 480

Arg Met Asn Val Gly Ala Asp Asn Leu Asp Ile Glu Gly Ser Pro Asp

                485                 490                 495

Gln Gln Arg Trp Lys Lys Trp Lys Gly Asn Ala Ala

            500                 505

<210>12

<211>120

<212>PRT

<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>12

Met Thr Val Arg Ala Ile His Asn Asn Tyr Gln Phe Glu Pro Leu Asp

1               5                   10                  15

Leu Gln Lys Asn Tyr Gly Asp Gln Phe Leu Leu Tyr Val Gly Trp Asp

            20                  25                  30

His His Thr Leu Phe Cys Ser Ala His Ala Met Leu Ala Ser Pro Gln

        35                  40                  45

Gln Thr Leu Gly Gln Leu Ile Glu Gln Gln Ile Thr Gly Gly Phe Ala

    50                  55                  60

Gln His Pro Asp Phe Ala Lys Ile Asp Trp Ser Lys Val Gln Tyr Thr

65                  70                  75                  80

Leu Asp Gly Gln Thr Ile Ser Pro Glu Ser Thr Lys Thr Leu Ala Glu

                85                  90                  95

Leu Gly Phe Gly His Lys Ser Leu Leu Arg Phe Val Thr Pro Glu Leu

            100                 105                 110

Asn Gly Tyr Asn Asp Ser Tyr Val

        115                 120

<210>13

<211>353

<212>PRT

<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>13

Met Ser Tyr Gln Val Thr Ile Glu Pro Ile Gly Thr Thr Ile Glu Val

1               5                   10                  15

Glu Glu Asp Gln Thr Ile Leu Asp Ala Ala Leu Arg Gln Gly Val Trp

            20                  25                  30

Leu Pro Phe Ala Cys Gly His Gly Thr Cys Gly Thr Cys Lys Val Gln

        35                  40                  45

Val Thr Asp Gly Phe Tyr Asp Val Gly Glu Ala Ser Pro Phe Ala Leu

    50                  55                  60

Met Asp Ile Glu Arg Asp Glu Asn Lys Val Leu Ala Cys Cys Cys Lys

65                  70                  75                  80

Pro Gln Ser Asp Met Val Ile Glu Ala Asp Val Asp Glu Asp Pro Asp

                85                  90                  95

Phe Leu Gly His Leu Val Gln Asp Tyr Gln Ala Thr Val Ile Glu Ile

            100                 105                 110

Lys Asp Leu Ser Pro Thr Ile Lys Gly Ile Arg Leu Gln Leu Asp Arg

        115                 120                 125

Pro Ile Glu Phe Gln Ala Gly Gln Tyr Ile Asn Val Gln Phe Pro Asn

    130                 135                 140

Ile Glu Gly Thr Arg Ala Phe Ser Ile Ala Asn Ser Pro Ser Glu Val

145                 150                 155                 160

Gly Ile Val Glu Leu His Ile Arg Lys Val Glu Gly Gly Ala Ala Thr

                165                 170                 175

Thr Tyr Val His Glu Gln Leu Ala Thr Gly Asp Gln Leu Asp Ile Ser

            180                 185                 190

Gly Pro Tyr Gly Gln Phe Phe Val Arg Lys Ser Asp Asp Gln Asn Ala

        195                 200                 205

Ile Phe Ile Ala Gly Gly Ser Gly Leu Ser Ser Pro Gln Ser Met Ile

    210                 215                 220

Leu Asp Leu Leu Glu Ser Gly Asp Ser Arg Thr Ile Tyr Leu Phe Gln

225                 230                 235                 240

   Gly Ala Arg Asp Leu Ala Glu Leu Tyr Asn Arg Glu Leu Phe Glu Gln

                   245                 250                 255

   Leu Val Lys Asp Tyr Pro Asn Phe Arg Tyr Ile Pro Ala Leu Asn Ala

               260                 265                 270

   Pro Lys Pro Glu Asp Gln Trp Thr Gly Phe Thr Gly Phe Val His Glu

           275                 280                 285

   Ala Val Ala Asp Tyr Phe Glu Asn Arg Cys Gly Gly His Lys Ala Tyr

       290                 295                 300

   Leu Cys Gly Pro Pro Ile Met Ile Asp Ser Ala Ile Ser Thr Leu Met

   305                 310                 315                 320

   Gln Ser Arg Leu Phe Glu Arg Asp Ile His Thr Glu Arg Phe Leu Ser

                   325                 330                 335

   Ala Ala Asp Gly Ala Ala Gly Gln Ser Arg Ser Ala Leu Phe Lys His

               340                 345                 350

   Ile

Claims (3)

1.苯酚羟化酶基因，其多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的苯酚羟化酶基因在提高受体菌苯酚降解能力方面的用途，其特征是将所述苯酚羟化酶基因转入到醋酸钙不动杆菌PHEA-2中。

3.权利要求1所述的苯酚羟化酶基因在使受体菌获得降解苯酚的能力方面的用途，其特征是将所述苯酚羟化酶基因转入到甲苯降解菌中。