CN1500801A

CN1500801A - 可提高联合固氮菌固氮水平的基因及其应用

Info

Publication number: CN1500801A
Application number: CNA021488134A
Authority: CN
Inventors: 敏林; 林敏�; 阎春玲; 平淑珍; 徐玉泉
Original assignee: INSTITUTE FOR APPLICATION OF ATOMIC ENERGY CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE FOR APPLICATION OF ATOMIC ENERGY CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2002-11-18
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2004-06-02

Abstract

本发明涉及一种可提高联合固氮菌固氮水平的基因及其编码序列、该序列编码的多肽及该多肽在提高联合固氮菌固氮水平方面的应用。本发明克隆了含dct转运系统的DNA片段并进行了序列分析；鉴定了植物因子诱导启动子；构建了重组联合固氮工程菌。本发明提供的DNA片段所编码的多肽可用于生物固氮肥料的制备。

Description

可提高联合固氮菌固氮水平的基因及其应用

技术领域：

本发明涉及一种可提高联合固氮菌固氮水平的基因及其编码序列、该序列编码的多肽，及该多肽在提高联合固氮菌固氮水平方面的应用。

背景技术：

生物固氮肥料，如联合固氮菌剂可改良土壤及提高产量。然而，直接分离自土壤的联合固氮野00110生菌株在自然条件下固氮效率和田间接种效果很不稳定，难以发挥联合固氮作用。在分子水平和基因水平上研究联合固氮作用的碳-氮代谢的遗传控制关系，解决或改善联合固氮的能量限制具有重要意义。

联合固氮作用有三个重要的限制因子，即氧(失活)、铵(抑制)和能量(限制)。其中，能量限制是导致田间联合固氮效率低下最主要的因素，原因之一是生物固氮作用耗能大，每固定一分子的N₂需消耗16个ATP；另一原因是在根表联合固氮菌的碳源供应十分有限。

目前对控制四碳二羧酸运输的dct基因系统研究比较深入的是豌豆根瘤菌和苜蓿根瘤菌。在根瘤菌中，编码C₄-二羧酸运输系统的dct基因簇包括三个基因：结构基因dctA(或dctP)，调节基因dctB和dctD。苜蓿根瘤菌的dctA基因前有一个NtrA依赖型启动子和一个上游元件。上游序列TGT-N₁₀-GCA可能与NifA相互作用。

dctA(或dctP)编码C₄-二羧酸运输蛋白，有8个跨膜螺旋。dctBD编码的DctB和DctD属于NtrC家族的二元调控蛋白，可以对环境中的四碳二羧酸的浓度变化作出响应，激活dctA的转录。碳信号感应因子DctB既能自磷酸化(假定的磷酸化位点416位为组氨酸)，也能使DctD磷酸化。碳信号传递因子DctD的N末端(1-117)功能区与K.p的ntrC和E.coli的ntrC编码的蛋白同源，感应DctB传递的信号(Watson1990)。DctD的C末端(389-460)可以被磷酸化，可能是结合DNA的功能区，与RpoN(σ⁵⁴)一起激活dctA(或dctP)表达(参见Scupham Aj.，Bosworth AH.Inoculation with Sinorhizobium melilotiRMBPC-2 increases A.Falfa yield compared with inoculation with a non-engineered wild typestrain.Appl.Environm.Microbiol.1996.62：4260-4262；Cooperative binding of DctD to thedctA upstream activation sequence of rhizobium meliloti is enhanced in a constitutively activetruncated mutant.J.Biological Chemistry.1996.271：26435-26442；Mutational analysis ofthe phosphate-binding loop of rhizobium meliloti DctD，a σ⁵⁴-dependent activator.J.Bacteriol.1998，180：2792-2795)。在根瘤菌中，已证明dct基因簇编码四碳二羧酸转运过程中的关键酶系，转dctABD基因的工程苜蓿根瘤菌大大提高了四碳二羧酸类碳源如苹果酸、延胡索酸和丙酮酸等的利用率，在低碳条件下仍能保持高效的共生固氮效率。

以上研究结果表明，克隆和鉴定联合固氮菌中与碳代谢基因dct同源的基因位点，研究其结构和功能，可在基因调控水平上揭示联合固氮菌碳-氮代谢遗传控制分子机制。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是：克隆含dct转运系统的DNA片段并进行序列分析；鉴定植物因子诱导启动子：构建重组联合固氮工程菌。

以下是本发明的技术方案：

一、含dct转运系统的DNA片段的克隆、

1、土壤样品采集

从生长野稗及芦苇的沼泽区自然环境中采集土壤样品。这些环境缺少联合固氮作用的三个重要限制因子：氧(失活)、铵(抑制)和能量(限制)，土壤中富含与禾本科植物非共生联合固氮菌。

2、分离群落水平总DNA

采用免培养方法从土壤样品中分离群落水平总DNA。

3、群落水平总DNA粘粒文库的构建

用能够自主转移携带不同大小片段的粘粒pLA2917(四环素和卡那霉素抗性)作为载体，构建群落水平总DNA的粘粒文库。

4、筛选含dct转运系统的阳性克隆

根据苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti)的dctA、dctB、dctD的序列设计引物，通过PCR法筛选粘粒文库，获得一插入片段为9.4kb的阳性克隆。

二、所克隆dct转运系统的序列分析

对阳性克隆插入片段的序列分析表明该片段为9408bp，其多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，共有8个开放阅读框(open reading frame，ORF)，在大片段中的位置及物理图谱见图1，各ORF编码及功能见表1。其中ORF dctB、dctD、dctP、dctQ、dctM为四碳二羧酸的转运过程中的关键酶系，它们编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2～6所示。

表1 各ORF编码产物及功能

ORF 编码产物功能

rmlA 葡萄糖-1-磷酸胸苷酸转移酶

脱氧二磷酸胸腺嘧啶-4-脱氢鼠李糖3，5-差

rmlC 向异构酶

rmlD 脱氧二磷酸胸腺嘧啶-4-脱氢鼠李糖还原酶

dctB 四碳二羧酸运输感受蛋白调控基因，组成一个二元调控

系统，保持低水平的组成型表

dctD 四碳二羧酸运输反应调节蛋白达。

dctP 可能为四碳二羧酸结合蛋白结构基因

dctQ 可能为四碳二羧酸转运酶编码四碳二羧酸转运酶

dctM 可能为四碳二羧酸转运酶编码四碳二羧酸转运酶

三植物因子诱导启动子的鉴定

通过PCR扩增dctP基因的启动子序列(如SEQ ID NO：7所示)，XhoI酶切连入载体pVK100(Tc抗性、Km抗性)中并在其后连入lacZ基因，筛选具有唯一Tc抗性的转化子。通过接合实验转入Pseudomonas stutzeri A15中，Tc抗性筛选重组菌。重组菌在加入延胡索酸、苹果酸、琥珀酸等四碳二羧酸的培养基中，lacZ表达，菌落表现为蓝斑，说明该启动子为植物因子诱导表达启动子。

四联合固氮工程菌的构建

将含dctPQM基因簇的xhoI酶切片段连入穿梭载体pSZ21中构建重组质粒pSZ24，转化E.Coli DH5α，再通过三亲接合在帮助质粒pRK2013的帮助下转入Pseudomonasstutzeri A15中，通过卡那抗性筛选得到将dct基因簇整合入Pseudomonas stutzeri A15染色体的重组菌。质粒构建如图2所示。

工程菌大田释放表明重组菌能提高大田水稻产量，在土壤氮和有机质含量低的田块中，接种重组菌株的水稻产量比接种野生型高15.9％，比无菌对照提高20.9％。

本发明提供的可提高联合固氮菌固氮水平的基因簇和编码序列具有如下特性：1)提高联合固氮菌的碳代谢，从而提高固氮水平的功能明确；2)其启动子具有植物因子诱导表达的固氮调节基因的特性；3)所涉及的与四碳二羧酸转运的dctBDP基因簇为新基因，可用于构建联合固氮工程菌。

附图说明：

图1是dct基因排列及物理图谱

图2是广寄主范围转移重组质粒pSZ24的构建

其中Cm：氯霉素抗性；Nm；卡那霉素抗性；mob：移动基因；X：XhoI

具体实施方式：

实施例1含dct转运系统的DNA片段的克隆

1、采集富含与禾本科植物非共生联合固氮菌的土壤样品并分离群落水平总DNA

从生长野稗及芦苇的沼泽区自然环境中采集土壤样品。称取所采集的土壤样品2克，加入0.6g细玻璃珠(d＜0.11mm)，4000转/分振荡2次。加入300μl 2％SDS+12％Tris-buffered phenol(pH8.0)溶液冰上1小时，加入等量Tris-buffered phenol，pH8.0(约700ml)，充分混匀，经4℃，13,000rpm离心5分钟。上层溶液加入0.1倍体积的3M NaAc pH5.2，混匀后加入0.6倍体积异丙醇混匀。DNA沉淀溶于200μl 1×TE(粗DNA)。称100mg氯化铯置于一个新的1.5ml Eppendorf.离心管中，加入100μl粗DNA轻轻混匀，室温黑暗条件下静置1-3小时。室温，13,000rpm，离心20分钟。上清液中加入400μl无菌去离子水和300μl异丙醇，室温静置30分钟。室温，13,000rpm，离心20分钟。沉淀溶于100μ1 1×TE和40μl 8M醋酸钾(KAc)，室温静置15分钟。4℃，13,000rpm离心15分钟。上清液加入0.6倍体积异丙醇混匀。室温静置30分钟。室温，15,000rpm离心20分钟。DNA沉淀溶于100μl 1×TE。采用Wizard spin column clean-up分离试剂盒纯化DNA样品。纯化DNA溶于总体积为100μl的10mMTris-EDTA(pH8.0)缓冲液中。

2、群落水平总DNA粘粒文库的构建

本实验采用能够自主转移携带不同大小片段的粘粒pLA2917(四环素和卡那霉素抗性)作为载体，构建群落水平总DNA的粘粒文库。为了使插入Sau3A I酶切DNA片段大小范围在15-23kb之间，用0.006u/μg DNA的Sau3A I酶量大量酶切纯化的群落水平总DNA，采用冻融法回收的9-30kb部分酶切片段，与载体pLA2917/Bgl II片段(四环素抗性)连接。将群落水平总DNA片段与载体的连接产物用噬菌体包装蛋白包装后，转入大肠杆菌JM109中。将转染的大肠杆菌JM109涂布于四环素抗性LB固体培养基上，将长出的菌落分别点于四环素抗性和四环素加卡那霉素抗性的LB固体培养基上，在两种抗性培养基上生长的转化子为粘粒载体自连转化，减去背景菌落数，根据经验公式计算滴度(pfu/ml)为4×10⁶(大于10⁶)，表明文库构建符合要求。

3、筛选含dct转运系统的阳性克隆

根据苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti)的dctD的序列设计引物(P1：TGGTGCTGGACAACCGCTCG；P2：GTGGACGGCTCAGTTCAGC)，通过PCR法筛选粘粒文库，获得一插入片段为9.4kb的阳性克隆。

实施例2 植物因子诱导启动子的鉴定

通过PCR扩增dctP基因的启动子序列(如SEQ ID NO：7所示)，Xho I酶切连入载体pVK100(Tc抗性、Km抗性)中并在其后连入1acZ基因，筛选具有唯一Tc抗性的转化子。通过接合实验转入Pseudomonas stutzeri A15中，Tc抗性筛选重组菌。重组菌在加入延胡索酸、苹果酸、琥珀酸等四碳二羧酸的培养基中，1acZ表达，菌落表现为蓝斑，说明该启动子为植物因子诱导表达启动子。

实施例3 联合固氮工程菌的构建

工程菌在辽宁省盘锦市盐碱地研究所的盐碱地试验田中分别进行了大田释放的小区实验，小区面积10平方米，三个重复，设野生菌及无菌对照。处理方法为利用过夜培养菌液稀释100倍对水稻进行蘸根处理，试验结果表明重组菌能提高大田水稻产量，在土壤氮和有机质含量低的田块中，接种重组菌株的水稻产量比接种野生型高15.9％，比无菌对照提高20.9％。

固氮序列

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院原子能利用研究所

<120>可提高联合固氮菌固氮水平的基因

<130>02-01

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>9408

<212>DNA

<213>未知

<400>1

ggatccgcga cattctggtc atctcgacac cgcaggatct gccgcagtac cagaacctgc 60

tgggcgacgg cagccagttc ggggtcaact tcagttacgc cgaacaacct tcgccggacg 120

gcctggccca ggccttcctg atcggtgaag agttcatcgg cgacgattcg gtatgcctga 180

tcctcggcga caacatcttc cacggccagc acttcaccga gaagctgcag cgcgccgcgc 240

gtcaggagaa gggcgccacg gtgttcggct actgggtcaa ggatccggag cgcttcggcg 300

tgatcgactt cgacgagaac ggcaaggcgc tgtccatcga agagaagccg aagaagccca 360

agtccagcta cgcagtgacc ggcctgtact tctacgacaa cgacgtcatc gagatcgcca 420

agtcgatcaa gccctcgcca cgcggcgaac tggagatcac cgacgtcaac atggcctacc 480

tccagcgcgg cgatctcaat gtcgaacgct tcggccgtgg cttcgcctgg ctcgacaccg 540

gtacccacga cagcctgctg gaagcctcgc agtacgtgca gaccatcgag caccgccagg 600

ggctgaaggt ggcctgcctg gaggaaatcg cctaccagaa caagtggatc gaccgcgagc 660

agctgttgcg ccgcgccgac gccctgggca agaccggcta cggccagtac ctgttcaagc 720

tggcgggtga agacgcatga aggtcgtcga aaccagcatt cccgacgtac tgatcatcga 780

gcccaaggtc ttcggcgacg aacgcggttt cttctacgag agcttcaacg cggccgcttt 840

cgaagcggcc acggggctca agcgtcagtt cgtccaggac aaccactcca agtcccagcg 900

cggcgtgctg cgtggtctgc attaccagat ccagcagccg cagggaaaac tggtgcgggt 960

ggtcgccggc gaggtgtttg atgtcgccgt cgacctgcgc aagagttcgc cgagcttcgg 1020

ccgctggttc ggcacccacc tgagcgcgca gaaccagcgg caactgtgga ttcccgaagg 1080

cttcgcacac ggcttcgtgg tgctcagcga gagcgctgaa ttcctctaca agaccaccga 1140

ctactatgcg ccggagcacg agcgcagcct gctgtggaac gacccggaac tgggcatcga 1200

gtggccgctc gacgaggcgc cgcagctgtc ggccaaggac atcgccggca agctgctgcg 1260

cgacgcggag ctgtttgcat gaagatcctg atcaccggca gcaagggcca gctggcccgc 1320

gagctgcagt cggagttggc gggtaccggc aaactgctcg cgctcgggca caatgcgctg 1380

gacctcgccg tacctgagca gattcgcgag caggtacgcc tgttgcggcc ggacctgatc 1440

atcaacgcgg cggcctatac cgccgtcgac ccggcggaaa cccaccgcga gcaggccttc 1500

gcggtcaatg cccgcggccc gcaggtgctc gccgaagaag ccgcgcgcct cggcgtgccg 1560

ctgatccatt attccaccga ctacgtgttc gacggccgca agaccgaacc ctacgacgag 1620

cacgacacgc cgaacccgct gggcgtctat ggcgccagca agctggccgg cgagcaggcg 1680

atccaggccg tcggcggcga acacctgatc ctgcgcacca gctgggtcta ctcgcaacat 1740

ggcaagaact tcctgctgac catgcagcgc ctgctgcagg agcgcgatgc gctgtcggtg 1800

gtcagcgacg aggtcggtgc gccgacctgg gccgcgacca tcgcccgcgt caccgccgaa 1860

ctggtgcgca agcgcaacgc cgggcaggcc gggccgagcg ggctgtatca cctcaccgcc 1920

agcggcgaga cctcctggta cggctttgcc tgcagcatcg ccgagcggtt gcgccaggaa 1980

ggacgcctgc gtgccgagat caccccgatc ctgtccaagg actacccgac cgcggcgcag 2040

cggccgctga attcgcggct caactgcgca cggctgcagc aggactgggg cgtccagctg 2100

ccggactggg aaaccgccct gcacgagtgc tgcacccggg cccgcgacct cgaagccgac 2160

aacgcgcgcc agccggtcgc cgtcggccgc tgagccaact gcgcctgcag ctcgatccat 2220

cgggttgcca cgagccgcga cgctgaacgt cggctcgcgc agcgtgcata atgcgcccga 2280

catccaggcg cctcatgcat gaccgcactt ctcgctcccc gccgcccccg ctggcgcaat 2340

ctcgccctgc tggccctgtt gctggcgcca ttgctctggc cgctgcagca gctcgccgag 2400

cgttactacc gcaacgagct gaccgaacag aaccgtcaga ccctggacct gtacgtcgcc 2460

aacctgctcg gcacgctcaa ccgctacgag gtgctgccgc gcatccttgg tgacctgcct 2520

gcgctgcgcg ccgtgctgca gcaggactca ccccaggtcc gcgacaacgc caaccggctg 2580

ctcaagcgcc tgcgcaacca gaccggcgcc gacgtgatct acctgatggc gaccgacggc 2640

aacaccctgg ccgcttccaa ctgggacgag gaagacagct tcgtcgatcg caacttcgcc 2700

ttccgcccct acttccgcca ggccatggag gggcgccttg ggcgcttctt cggcctcggc 2760

accacctccg gcaagcgcgg ctactacttc ggcgcggcgg tgcgcgacgg cgaccaggtg 2820

ctcggcgtac tggtggtcaa ggtcgatctg gatcacaccg agacgctgtg gggcagcacc 2880

ccggagcagc tgctggtgac cgacaatttc ggcgtggtga tcctcacctc gcggcccgac 2940

tggcgtttcc gcgccacccg cgggctgggc gtggacgagc gcgagcagat cgccttcgat 3000

cagccctacc cgacgctcta cccgcaggac ctgacgctga acatcgacgc ctggctgatc 3060

cagagccgcg agctgaagga gaccggctgg acggtgcgca tcctcgcgcc ggtcagcctg 3120

gtcgagcgcc cggtgcgcac cgtggtcgcg atcggcgccg ccaccctgct ggcgctgctg 3180

ctctggctcg gcctgctgat gcagcgtcgc cgacatttcc tcgaacggct ggcgctggac 3240

agccaggcac gccaacagct ggagcagcgc gtgctcgagc gcacccgcga cctggaggcg 3300

ctgaacagcc ggctcaaggt cgaggtgctc gagcgcgaac aggcccagca ggaactggtg 3360

cgcgcccagg acgaactgct gcaggccggc aagctatcgg cgctgggcac gatgtcggcg 3420

agcatcagtc acgaactcaa ccagccgctg gcagcgatcc gcagctatgc cgacaacgcc 3480

cgcgtactgc tcgaccatga gcgtgtcgac gaggcgcgcg acaacctgcg gctgatcagc 3540

gagctgaccg cgcgcatggc ctcgatcatc gcccacctgc gcgccttcgc ccgtcgcgat 3600

cagcacgcac cggaacgggt cgcgctgcag ccggcgctgg acgatgcgct ggcactgctg 3660

gccaagcgcc gccaggccat gggcgtcgag ctgatccgcg acctgccgga ggcgacgctg 3720

tgggtgcagg ctggcgaaac gcggctgcgg cagatcctcg ccaatctcct ggccaacgct 3780

ctcgacgccc tcggcgaacg gccccagccg cgacgcatct ggctgcgcgc cgagctggag 3840

ggcgacggcg tgctgctgac cctgcgcgac aacggcccgg gcttctccgc cgaggcgctg 3900

cagcgcgccc gcgaaccctt cttcaccacc aagaccagca cccaggggct gggcctcggc 3960

ctggcgatct gcgataccct cacccgcgcc ctgggcggcg agctgcgcat gagcaatcat 4020

gccgagggcg gcgcccagct cggtctgttc ctgcgcagcg ccgaacccgg cgtggccttt 4080

cccaccgagg accatttcca atgagcagcg acaccccgat cagtacccag gcccaggtgg 4140

tgctgatcga cgacgatccg catctgcgcc aggcactgag ccagaccctc gacctggccg 4200

ggctcaaggt ggccagcctg ggcgacgccc gcgatctggc cgcacgtctg ccggcggact 4260

ggcagggggt ggtggtcagc gacatccgca tgcctggcat cgacggactg gagctgctgc 4320

aacagttacg ggcacgcgac agcgagctgc cggtgatcct catcaccggt cacggcgaca 4380

tccagctggc ggtgcaggcc atgcgcgccg gtgcctacga tttcctggaa aagcccttcc 4440

ccagcgaggc gctgctggac agcgtgcggc gtgccctggc gctgcgccag ctggtgctgg 4500

acaaccgctc gctgcgcctg gccctggccg accgccagca gctgtcggca cgcctgctcg 4560

gtcagtcccg ggcgatgctg cgcctgcgcg agcagatcgg cgcattggcc ggaacccagg 4620

ccgacgtgct gattcttggc gagaccgggg ccggcaagga ggtggtggcg cgcgcgctgc 4680

acgacctgtc gaaccgccgc aacggcccgt tcgtggcgat caatgccggt gccctggccg 4740

agtcggtggt ggagagcgag ctgttcggcc acgagcccgg cgcgttcacc ggcgcgcaga 4800

aacgccggat cggcaagttc gagttcgcca acggcggcac cctgttcctc gacgagatcg 4860

agagcatgag cctggatgtg caggtcaagc tgctgcgcct gctgcaggag cgcgtggtcg 4920

aacgcctcgg cggcaaccag tcgatcgccc tggatatccg tgtcatcgcc gcaaccaagg 4980

aagacctgcg cgtcgccgcc gaccagggcc gcttccgcgc cgacctctat taccggctaa 5040

acgtcgcacc cttgcgcatt ccttcgctgc gcgaacgcag cgaggacatc cttctgctgt 5100

ttcagcactt cgccgaggcc gccgcccagc gccacggcct gccggttcgc gaactgcagc 5160

ccgagcagcg tgccacgctg ctgcagcaca cctggccggg caacgtgcgc gagctgcaga 5220

acaccgcgga gcgcttcgcc ctcgggctcg gcctgggcct ggagcggcca ggcagcgagc 5280

cgagcgccgg cctggccggc ggcggcagcc tgggcgaaca ggtcgaagcc ttcgagcgcg 5340

cgctgatcgc cgctgaactg agccgtccac acggttcgct gcgcagcgtc gccgaagcgc 5400

tcggcctgcc gcgtaagaca ctgcatgaca agctgcgcaa gcatggcctg agctttaccg 5460

atgctggcgg aagctcgccc gacgaaaacg actagatggc ggaaatccgc catccttgac 5520

cgccgcatcg ggcctcgact gtcaatcccg tccctccctg caatgccaac cgcggatggc 5580

ctgctcaccc cgcgcaaagg tgcgacctag acgcgcttgt tggcaattgg ccattcaaac 5640

cttcatctat tgctgggtaa actcgctggc ttcaggtgcc tgtgccagcg gttggcacag 5700

gcattgctcc tgaaacccga tgaaccggat ggatcgagtc gcgatcgtgc atcgcatcca 5760

ggccattgcg cctagacttg cccagctggt tactgccggg atgccccgag gcctcccacc 5820

cacaacaaga ggaaacatca atgttcaaac tgactgccaa ggcgctggca tgcgccctgt 5880

cgctgagcat cgctggtctg gcccacgcgg ctgacccgat caccatcaag ttctctcacg 5940

tggtcgccga gaacacgccg aaaggccagg gcgccctgat gttcaagaaa ctggtggaag 6000

agcgtctggc cggcaaggtc gaggtacagg tttacccgaa ctcctcgctg ttcggcgatg 6060

gcaaggaaat ggaagccctg ctgctgggcg acgttcagct gatcgcgccg tcgctggcca 6120

agttcgaaca ctactccaag ggcgttcagg tcttcgacct gccgttcctg ttcgacgaca 6180

tcgcagcggt cgaccgcttc cagcaaggtg aagccggcca gagcctgctg cgctcgatgg 6240

aagacaagaa catcaccggc ctgggctact ggcacaacgg catgaagcag ctgtcggcca 6300

acaagccgct gcgcgagccg aaggacgccc gtggtctgaa gttccgcgta caggcttccg 6360

ccgtgctgga cgagcagttc aaggccgtgc gcgccaaccc gcgcaagatg agcttcgccg 6420

aggtctacca gggcctgcag actggcgtgg tcaacggtgc cgagaacccc tactcgaaca 6480

tctactcgca gaagatgcac gaagtgcaga agtacatcac cgagtccaac cacggtctgc 6540

tggactacat ggtgatcacc aacaccaagt tctggaacgg tctgccggct gacgtacgcg 6600

gcgagctgga aaagatcctg gacgaagtga ccgtcgcggt gaacaagcag gctgacgagc 6660

tgaaccaggc cgacaagcag cgcatcatcg acgccggcac caccgagatt atcgacctga 6720

ctccggagca gcgcgaaatg tggcgtgaag ccatgaagcc ggtctggaag aagttcgaag 6780

gcgaaatcgg tgccgacctg atcaaggccg ccgaagccgc caaccaggct aactaagcct 6840

ttgccgaggg gtggccaccc cgctcctcgg ctgtaccacc cagcgatacc cgacagctca 6900

gtgaaaaaac aaagccgcta gcgaagacca ggcccgcacc aagggcagga aggccatgcc 6960

gaggtgatcc cgggctgggc cgcttcactg gccacaacaa gagtttttca ttgctctgtc 7020

tcccagcctg ccccggctgg ttcacggcgc acctccgtgc tgcctttcga tacaaccgca 7080

gtccatcggg agatgtcatc catgaacgcc ctctggcgcg tctgggacca cttcgaggaa 7140

ggcttcatcg cctttctgct ggccgccatg acactggtga ccttcgtcta cgtgatcctc 7200

aacaacctct acacgctgtt ctacgacttg ggcgaccgct tcgaaggcac cgccgacttc 7260

tggttcgcca tcggtgactt catcatcggt ctggcccagt ccatgacctg gagcaccgcg 7320

ctgaccaagg cgctgttcgc ctggctgatc ttctccggcc tggcctatgg cgtgcgtacc 7380

gccggccata tcggcgtcga cgcgctggtc aagctggcgc cgcgtcatat ccagcgtgtc 7440

atcggcatca tcgcctgcct gttctgcctg ggctacgccg gtctgctgac cgtggccagc 7500

ttcgagtgga tccagaccct gttcatcgcc aacatcggcg ccgaggacct gggccacatc 7560

ggcgtcaagc agtggcacat cggcctgatc gtgccgttcg gtttcgccat ggtgttcatc 7620

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ccatgctgtt cgcccacgtg ctgaccaccg agcagatccc gcaggcgatt actgcctggg 8640

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ccatcccggt ccagctgggc atcgacccga ttcacctggg catcatcatg gttggtggga 8820

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cgggcatgcc ggtgacccag gtgatccgcg cggtgctgcc atggctggca ctgatgctga 8940

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gtccggcatg tgcatgcgca gttcgccggc atgggcgggc tgccagtccg gattcaggta 9300

cagcacggcg gtcaccgagc ggctgtcgtc atcgcgaaaa cggtccagat gggtctggta 9360

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<210>2

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<212>PRT

<213>未知

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<213>未知

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275 280 285

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<212>PRT

<213>未知

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<213>未知

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<212>PRT

<213>未知

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Ile Val Leu Leu Val Ala Gly Ala Phe Met Glu Pro Ser Ala Ile Ile

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<210>7

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<212>DNA

<213>未知

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cgagtcgcga tcgtgcatcg catccaggcc attgcgccta gacttgccca gctggttact 300

gccgggatgc cccgaggcct eccacccaca acaagaggaa acatcaatg 349

Claims

1、具有SEQ ID NO：1所示序列的DNA。

2、根据权利要求1所示的DNA序列编码的多肽，其序列如SEQ ID NO：2～6所示。

3、具有SEQ ID NO：7所示序列的DNA。

4、根据权利要求1所示的DNA序列编码的多肽在提高联合固氮菌固氮水平方面的应用。

5、根据权利要求2所示序列的植物因子诱导启动子在提高联合固氮菌固氮水平方面的应用。