CN1252270C - 红豆杉3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶a合成酶蛋白编码序列 - Google Patents

Abstract

一种涉及生物基因工程领域的红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白编码序列。所分离出的DNA分子包括：编码具有红豆杉tm-Hmgs蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第98-1528位的核苷酸序列有至少70%的同源性；所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第98-1528位的核苷酸序列杂交。本发明是一种催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶，有助于提高紫杉醇或其前体的含量，对于紫杉醇药源的严重匮乏问题的解决和保护人民的健康生长有所帮助。

Description

红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白编码序列

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在红豆杉中表达的tm-Hmgs蛋白(红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白，Taxusmedia 3-hydroxy-3-methylglutary1-CoA Synthase，TMHMGS)及其核酸序列。

背景技术

紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是一种存在于红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus spp.)植物树皮、针叶中的紫杉烷二萜类化合物。紫杉醇是经美国FDA(1992)认证的目前最好的天然抗癌药物之一，在临床上被广泛用于治疗晚期卵巢癌，乳腺癌及其它癌症。当前，紫杉醇药源的严重匮乏，已经成为制约紫杉醇相关产业发展的最大障碍。近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提高紫杉醇或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因(或转录因子)导入红豆杉中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高紫杉醇含量的最佳途径。

由于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶是MVA途径中的一个重要的代谢酶，能够催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，随后在HMG-CoA还原酶(HMGR)的作用下生成甲羟戊酸(MVA)，甲羟戊酸经焦磷酸化和脱羧作用形成C5的IPP，从而为紫杉醇合成提供通用前体。通过提高3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的活性或含量，可以间接的提高红豆杉中紫杉醇或其前体的含量。

在对现有文献的分析中，“The Plant Journal(植物期刊)，2000，22：415-426”和“Scinece Asia(亚洲科学)2002，28：29-36”等先后报道从油菜和橡胶树中克隆了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因，至今尚未发现有与本发明主题相同的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种红豆杉tm-Hmgs蛋白编码序列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高的紫杉醇含量。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有红豆杉tm-Hmgs蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第98-1528位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第98-1528位的核苷酸序列杂交。

所述的编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。

所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第98-1528位的核苷酸序列。

本发明分离出的红豆杉tm-Hmgs蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

所述的蛋白多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。

本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。该宿主细胞包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“红豆杉tm-Hmgs蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有红豆杉tm-Hmgs蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第98-1528位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第98-1528位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第98-1528位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第98-1528位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第98-1528位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的红豆杉tm-Hmgs蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“红豆杉tm-Hmgs蛋白或多肽”指具有红豆杉tm-Hmgs蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然红豆杉tm-Hmgs蛋白相同功能的SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括红豆杉tm-Hmgs蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的红豆杉tm-Hmgs蛋白多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与红豆杉tm-Hmgs蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用红豆杉tm-Hmgs蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“红豆杉tm-Hmgs蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

                     表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser

Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Il e	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

                     表2

86％identity in 1330nt over|ap

Query：119  gttggtattttggcgatggaggtttactttccgactacttgtgtccagcaggatgccctg 178

            ||||| |||||||| |||||| | |||||||| ||||| |||||||||||||| | | ||

Sbjct：112  gttgggattttggctatggagatctactttcctactacatgtgtccagcaggaggacttg 171

Query：179  gaaacatttgatggagtaagtaaaggaaaatatacaattggccttggacaagactgcatg 238

            ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||

Sbjct：172  gaaacttttgatggagtaagtaaaggaaaatatacaattggtcttggacaagactgcatg 231

Query：239  actttctgcacagatttggaagatgtgatttcaatgagcttgacagttgtaacgtctctt 298

            ||||||||||| || |||||||| || ||||| ||||| |||||||  |||||||| |||

Sbjct：232  actttctgcactgacttggaagacgttatttctatgagtttgacagcagtaacgtcactt 291

Query：299  ttggaaaaatatgctattgatccaaaacaaattggccgcttggaagttggtagcgaaact 358

            |||||||||||||  ||||||||||| |||||||| || ||||||||||| |||||||||

Sbjct：292  ttggaaaaatatgaaattgatccaaagcaaattggtcgtttggaagttggcagcgaaact 351

Query：359  gttattgacaagagcaagtcaataaagacttggttgatgtgcatttttgagaagtgtgga 418

            ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||   |||||||||||||||||

Sbjct：352  gttattgacaagagcaagtcaataaagacgtggttgatgcatatttttgagaagtgtggt 411

Query：419  aatactgaaattgaaggtgtggactcaacaaatgcatgctatggtggaactgcagctcta 478

            |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| ||

Sbjct：412  aatactgaaattgaaggtgtggactcaacaaatgcatgctatggaggaactgcagccctg 471

Query：479  tttaactgtgttaactgggttcaaagtagttcttgggatgggcgatatggtcttgttgtt 538

            ||||||||| | |||||| || |||| ||||||||||||||  ||||||||||||||||

Sbjct：472  tttaactgtatcaactggattgaaagcagttcttgggatggaagatatggtcttgttgta 531

Query：539  gctacagacagcgcagtctatgctgaagggccagctcggcctactgggggagcagctgcc 598

            ||||||||||| |||||||||||||||||| |||| || |||||||| |||||||||||

Sbjct：532  gctacagacagtgcagtctatgctgaaggggcagcacgacctactggaggagcagctgct 591

Query：599  attgctatgttgatagggcccaatgctccaatagcatttgagaacagatacaggggaacg 658

             |||| |||||||||||||| |||||||||||||||  ||||| || ||||||||||||

Sbjct：592  gttgcaatgctgatagggcctaatgctccaatagcaactgagagcaaatacaggggaaca 651

Query：659  cacatggctcacgcatatgacttttataagcccaatcttgctagcgagtacccggttgta 718

            || |||||||| |  ||||||||||||||||| ||||| ||||| || || |||||||||

Sbjct：652  catatggctcatgtctatgacttttataagcctaatctggctagtgaatatccggttgta 711

Query：719  gatggaaagctctcacaaacttgctatctaaaggcactggactcttgctacaaacggttt 778

            ||||| ||||| ||||||||||| ||||| | |||| |||| || |||||||||||||||

Sbjct：712  gatgggaagctttcacaaacttgttatctcatggcattggattcatgctacaaacggttt 771

Query：779  tgtaacaagtttgaaaagggagaaggacatcagttctctcttctagatgcagattatgta 838

            ||||| ||||||||||||| |||||||   ||||| |||||||||||| |||||||| ||

Sbjct：772  tgtaataagtttgaaaaggaagaaggaagacagttttctcttctagatacagattatata 831

Query：839  gcatttcactctccatacaataagcttgtgcagaagagctttgctcgactattgttcaat 898

            |||||||| |||||||||||||||||||| || |||||||||| ||| || |||||||||

Sbjct：832  gcatttcattctccatacaataagcttgtacaaaagagctttggtcgcctgttgttcaat 891

Query：899  gatttttcaagacatgccagttctgctggaaaggatgcacaagagaagctggaaccctat 958

            ||||| |||||||||||||| |||| |||||||||||||||||||||||| ||||||| |

Sbjct：892  gatttctcaagacatgccaggtctgttggaaaggatgcacaagagaagctagaacccttt 951

Query：959  gctggtttgtctgaagaagagagctatagcagccgtgatctagaaaaggtttctcagcag 1018

            ||||| ||||||||| |||| ||||| |  || ||||| |||||||||||||||||||||

Sbjct：952  gctggcttgtctgaacaagatagctacaatagtcgtgacctagaaaaggtttctcagcag 1011

Query：1019 gctgcgaagccattgtatgatgaaaaagtgcagccatcaactttattgccaaaaaaagaa 1078

              |||||||||||||||||||| |||| | || |||||||||||| |||||||  ||| |

Sbjct：1012 cttgcgaagccattgtatgatgcaaaaattcaaccatcaactttactgccaaagcaagta 1071

Query：1079 ggcaacatgtatacagcatctctttatgctgcacttgcctcgattatacataacaagtat 1138

            ||||||||||||||||||||||| ||||| ||| | ||||| ||||| || |||||  ||

Sbjct：1072 ggcaacatgtatacagcatctctctatgcagcattagcctccattattcacaacaaacat 1131

Query：1139 agcacgctggaaggtcaaagggtgctcatgttctcttatggaagtgggcttgcttcgaca 1198

            |  || ||||| |||||| ||||  | |||||||||||||| |||||||||||||| ||

Sbjct：1132 acgactctggatggtcaacgggtaatgatgttctcttatggcagtgggcttgcttctacg 1191

Query：1199 atgttctcacttaaaattcgtgaaggtcagcatccttttatcctgtcaaacattgctgaa 1258

             |||| ||  ||||||| || || |||||    |||||||  |||||||| ||| | |||

Sbjct：1192 ttgttttcttttaaaatccgggagggtcaattcccttttactctgtcaaatattacagaa 1251

Query：1259 gctatggatctccaaagcaaacttgaatcccaacatgagttttctcctgaagattttgtg 1318

            | ||||||  | |||| ||||||||| || |  |||||||||  |||||||||||| |||

Sbjct：1252 gttatggacgtacaaaacaaacttgattctcgtcatgagtttcttcctgaagatttcgtg 1311

Query：1319 gacaacttgaggctgatggagactctatatggagcaaaagacttcgtttcatgtgctcaa 1378

            || ||||||| || |||||| ||||| || |||||||| ||||||||||||  | ||||

Sbjct：1312 gaaaacttgaagcggatggaaactctgtacggagcaaaggacttcgtttcaacttctcag 1371

Query：1379 cataatttgctaaggcctgggactttttatttgactgaagtagattcaatgtaccggcgt 1438

            |  | ||||||  |||||||  |||| ||||||||| |||||||||| ||||||||||||

Sbjct：1372 ctcagtttgctgcggcctggcgctttctatttgactaaagtagattccatgtaccggcgt 1431

Query：1439 ttctattccc 1448

            ||||||||||

Sbjct：1432 ttctattccc 1441

Query：红豆杉tm-Hmgs的核酸序列

Sbjct：欧洲赤松ps-Hmgs的核酸序列(X96386.1)

表2为本发明的红豆杉tm-Hmgs与欧洲赤松(Pinus sylvestris)ps-Hmgs的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。

                                   表3

85％identity in 466 aa overlap，92％similarity in 466 aa overlap

Query：1   MASPQENVGILAMEVYFPTTCVQQDALETFDGVSKGKYTIGLGQDCMTFCTDLEDVISMS 60

           MAS  ENVGILAME+YFPTTCVQQ+ LETFDGVSKGKYTIGLGQDCMTFCTDLEDVISMS

Sbjct：1   MASRPENVGILAMEIYFPTTCVQQEDLETFDGVSKGKYTIGLGQDCMTFCTDLEDVISMS 60

Query：61  LTVVTSLLEKYAIDPKQIGRLEVGSETVIDKSKSIKTWLMCIFEKCGNTEIEGVDSTNAC 120

           LT VTSLLEKY IDPKQIGRLEVGSETVIDKSKSIKTWLM IFEKCGNTEIEGVDSTNAC

Sbjct：61  LTAVTSLLEKYEIDPKQIGRLEVGSETVIDKSKSIKTWLMHIFEKCGNTEIEGVDSTNAC 120

Query：121 YGGTAALFNCVNWVQSSSWDGRYGLVVATDSAVYAEGPARPTGGAAAIAMLIGPNAPIAF 180

           YGGTAALFNC+NW++SSSWDGRYGLVVATDSAVYAEG ARPTGGAAA+AMLIGPNAPIA

Sbjct：121 YGGTAALFNCINWIESSSWDGRYGLVVATDSAVYAEGAARPTGGAAAVAMLIGPNAPIAT 180

Query：181 ENRYRGTHMAHAYDFYKPNLASEYPVVDGKLSQTCYLKALDSCYKRFCNKFEKGEGHQFS 240

           E++YRGTHMAH YDFYKPNLASEYPVVDGKLSQTCYL ALDSCYKRFCNKFEK EG QFS

Sbjct：181 ESKYRGTHMAHVYDFYKPNLASEYPVVDGKLSQTCYLMALDSCYKRFCNKFEKEEGRQFS 240

Query：241 LLDADYVAFHSPYNKLVGKSFARLLFNDFSRHASSAGKDAQEKLEPYAGLSEEESYSSRD 300

           LLD DY+AFHSPYNKLVGKSF RLLFNDFSRHA S GKDAQEKLEP+AGLSE++SY+SRD

Sbjct：241 LLDTDYIAFHSPYNKLVQKSFGRLLFNDFSRHARSVGKDAQEKLEPFAGLSEQDSYNSRD 300

Query：301 LEKVSQQAAKPLYDEKVQPSTLLPKKEGNMYTASLYAALASIIHNKYSTLEGQRVLMFSY 360

           LEKVSQQ AKPLYD K+QPSTLLPK+ GNMYTASLYAALASIIHNK++TL+GQRV+MFSY

Sbjct：301 LEKVSGGLAKPLYDAKIQPSTLLPKQVGNMYTASLYAALASIIHNKHTTLDGQRVMMFSY 360

Query：361 GSGLASTMFSLKIREGQHPFILSNIAEAMDLQSKLESQHEFSPEDFVDNLRLMETLYGAK 420

           GSGLAST+FS KIREGQ PF LSNI E MD+G+KL+S+HEF PEDFV+NL+ METLYGAK

Sbjct：361 GSGLASTLFSFKIREGQFPFTLSNITEVMDVQNKLDSRHEFLPEDFVENLKRMETLYGAK 420

Query：421 DFVSCAQHNLLRPGTFYLTEVDSMYRRFYSQKLVSLDDNCRETKFANGT 469

           DFVS +Q +LLRPG FYLT+VDSMYRRFYS+K++S  DN  ++K ANGT

Sbjct：421 DFVSTSQLSLLRPGAFYLTKVDSMYRRFYSRKVISAGDNFEKSKLANGT 469

Query：红豆杉tm-Hmgs氨基酸序列

Sbjct：欧洲赤松ps-Hmgs氨基酸序列(GenBank Accession No.CAA65250.1)

表3为本发明的红豆杉tm-Hmgs蛋白的氨基酸序列与欧洲赤松ps-Hmgs的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

发明还包括红豆杉tm-Hmgs蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露子诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的红豆杉tm-Hmgs蛋白多肽时，可以将红豆杉tm-Hmgs蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成红豆杉tm-Hmgs蛋白表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析红豆杉tm-Hmgs蛋白基因产物的表达，即分析红豆杉tm-Hmgs蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有红豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码红豆杉tm-Hmgs蛋白的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在红豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于红豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的红豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选红豆杉tm-Hmgs蛋白同源基因或同源蛋白。

为了得到与红豆杉tm-Hmgs蛋白基因相关的红豆杉cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选红豆杉cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对红豆杉tm-Hmgs蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自红豆杉的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与红豆杉tm-Hmgs蛋白的基因家族的核苷酸序列。

本发明的红豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的红豆杉tm-Hmgs蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与红豆杉tm-Hmgs蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明的红豆杉tm-Hmgs蛋白基因可通过基因工程技术用来提高红豆杉中紫杉醇或其前体的含量，而紫杉醇在临床抗癌上具有巨大的应用价值，对保护人民的健康生长有所帮助。因而本发明具有很大的应用前景。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

曼地亚红豆杉tm-Hmgs蛋白基因的克隆

1.组织分离(isolation)

红豆杉(品种为“曼地亚”)幼嫩叶片来源于西南师范大学，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据一些植物Hmgs的氨基酸保守序列，设计兼并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)3’-RACE

PCR(UPM+F2)得到TMF2’(1580bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的木本植物如橡胶树(Heveabrasiliensis)等的Hmgs基因的同源性很高，故初步认为它是一个Hmgs基因。

(2)5’-RACE

根据3’RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR(UPM+R2)得到TMR2’(885bp)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。

(3)将5’RACE测序结果与3’RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增tm-Hmgs编码区(KF1+KR1)得到tm-Hmgs编码区(1431bp)(过程同(1))。

BLAST的结果证明从红豆杉中新得到的基因确为一个植物Hmgs基因。由于已知的拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶具有乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的功能(Montamat，et al.，1995)，故推测此新克隆的基因具有相同的功能。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的红豆杉TmHMGS的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物TmHMGSF1：5’-GGCAGAGAGCCATATTTGTTCTC-3’(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸TmHMGSR1：5’-CTTTTCAAAATGTATATTGATTGA-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，TmHMGSF1/TmHMGSR2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、58℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1776bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。

实施例2

红豆杉tm-Hmgs蛋白基因的序列信息与同源性分析

本发明新的红豆杉tm-Hmgs蛋白全长cDNA的长度为1776bp，详细序列见SEQID NO.3，其中开放读框位于98-1528位核苷酸。根据全长cDNA推导出红豆杉tm-Hmgs蛋白的氨基酸序列，共476个氨基酸残基，分子量52859.09，pI为5.23。详细序列见SEQ ID NO.4。

将曼地亚红豆杉tm-Hmgs蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与欧洲赤松3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(X96386.1)在核苷酸水平上具有86％的同源性(附表2)；在氨基酸水平上，它与欧洲赤松3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(GenBank Accession No.CAA65250.1)有85％的相同性和92％的相似性(见表3)。由此可见，曼地亚红豆杉tm-Hmgs蛋白与欧洲赤松3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为曼地亚红豆杉tm-Hmgs蛋白在功能上也相似。

实施例3

红豆杉tm-Hmgs蛋白在大肠杆菌中进行原核表达及提纯

在该实施例中，将全长的红豆杉tm-Hmgs蛋白编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

将红豆杉tm-Hmgs蛋白多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。

原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

根据红豆杉tm-Hmgs蛋白的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将红豆杉tm-Hmgs蛋白基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶。

表达Trx-tm-Hmgs重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-tm-Hmgs工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-3-tm-Hmgs融合蛋白的工程菌。

Trx-3-tm-Hmgs融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达Trx-tm-Hmgs融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-tm-Hmgs，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mMTris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗脱来收集Trx-tm-Hmgs融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获得tm-Hmgs的表达蛋白。

纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶的活力测定

按Suwanmanee等(Plant science，2004，166：531～537)的方法对表达纯化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白进行酶活力的测定，研究其对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成的影响。反应体系含有0.1M Tris-HCL(pH＝8.0)，0.2mM乙酰辅酶A，0.05mM乙酰乙酰辅酶A，0.1mM EDTA及10ul酶蛋白样品，总体积为100ul。反应流程如下：首先将¹⁴C标记的乙酰辅酶A加入到没有标记的酰基(67dpsnmol^-1)中稀释成混合物，30℃预培养2分钟。在加入乙酰辅酶A后的2和4分钟，取等量的40微升的混合物转移到玻璃小瓶中并加入100微升的6M HCL，然后在95℃干燥。在烘干的过程中，硫酯被羟化，未参与反应的¹⁴C标记的乙酰基被蒸发了，只有¹⁴C标记的HMG酸仍然保留在瓶子中，加入500微升的水，用液体闪烁记数器测定¹⁴C标记的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的含量。为了计算在上述程序没有去除干净的¹⁴C标记的乙酰辅酶A的残余量，实验中设计了一个平行对照。结果表明，表达的蛋白的确具有催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶活性。

实施例4

红豆杉tm-Hmgs蛋白在烟草中进行真核细胞表达

将含目的基因(红豆杉tm-Hmgs蛋白基因)的表达载体的构建，根据红豆杉tm-Hmgs蛋白的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将红豆杉tm-Hmgs蛋白基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。

利用叶盘法转化烟草

1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；

2.室温下4,000g离心10min；

3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；

4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；

7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；

9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

利用Northern blotting检测tm-Hmgs蛋白在转基因烟草植株中的表达

1.RNA的提取：待转基因烟草叶片长到2-3片叶时抽取烟草叶的RNA。以正常生长的植株作为对照(条件同上)，利用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。

2.RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD₂₆₀；RNA含量计算：1 OD₂₆₀＝40μg/ml。

3 总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：1)取6ml 25*(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10*上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。

4.RNA尼龙膜上转移：1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。

5.膜上杂交信号的检出：1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene Images^TMContents CDP-Star^TMlabelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIGlabeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明；转基因烟草的tm-HMGS转录水平比未转基因的对照材料的表达水平明显高得多。

含红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(tmhmgs)的转基因烟草植株中的tm-Hmgs蛋白活性测定

1.蛋白的提取：a)取500mg叶片，加入1000ul 1*PBS(KH₂PO₄ 0.2g/l，Na₂HPO₄1.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于50ml eppondorf管中研磨；b)13000，4℃离心10分钟；c)取上清，备用。注：以上过程于冰上进行。

2.蛋白的定量：参考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白样品，加入1ml Bradford试剂，混匀后，分光光度计测OD₅₉₅；蛋白含量计算：1 OD₅₉₅＝28.57μg。

3.tm-Hmgs蛋白活性测定参考Suwanmanee等(Plant science，2004，166：531～537)的方法(详细操作过程同实例3)。结果表明，转基因烟草植株的中的tm-Hmgs蛋白酶活性比没有转基因的对照明显高得多(P＜0.05)。从而再次证明所克隆的红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的确具有催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶活性，将可用于利用转基因技术来提高植物的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶表达量的研究和产业化中。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

   (i)序列特征：

      (A)长度：23bp

      (B)类型：核苷酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii).分子类型：寡核苷酸

   (iii).序列描述：SEQ ID NO.1

   GGCAGAGAGCCATATTTGTTCTC

(2)SEQ ID NO.2的信息

   (i)序列特征：

      (A)长度：24bp

      (B)类型：核苷酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：寡核苷酸

   (iii)序列描述：SEQ ID NO.2

   CTTTTCAAAATGTATATTGATTGA

(3)SEQ ID NO.3的信息

   (i)序列特征：

      (A)长度：1776bp

      (B)类型：核苷酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：核苷酸

   (iii)序列描述：SEQ ID NO.3

(4)SEQ ID NO.4的信息

   (i)序列特征：

      (A)长度：476

      (B)类型：氨基酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii).分子类型：多肽

   (iii).序列描述：SEQ ID NO.4

<110>上海交通大学

<120>红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白编码序列

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1776

<212>DNA

<213>红豆杉(Taxus media)

<220>

<221>CDS

<222>(98)..(1528)

<223>

<400>1

ggcagagagc catatttgtt ctctgtgttt ccagcggcaa aaactcggtg caaggtagag    60

gaactgtaaa ctatttttga atttttttca ataggga atg gcg tcc cct caa gaa    115

                                         Met Ala Ser Pro Gln Glu

                                         1               5

aac gtt ggt att ttg gcg atg gag gtt tac ttt ccg act act tgt gtc     163

Asn Val Gly Ile Leu Ala Met Glu Val Tyr Phe Pro Thr Thr Cys Val

            10                  15                  20

cag cag gat gcc ctg gaa aca ttt gat gga gta agt aaa gga aaa tat     211

Gln Gln Asp Ala Leu Glu Thr Phe Asp Gly Val Ser Lys Gly Lys Tyr

        25                  30                  35

aca att ggc ctt gga caa gac tgc atg act ttc tgc aca gat ttg gaa      259

Thr Ile Gly Leu Gly Gln Asp Cys Met Thr Phe Cys Thr Asp Leu Glu

    40                  45                  50

gat gtg att tca atg agc ttg aca gtt gta acg tct ctt ttg gaa aaa      307

Asp Val Ile Ser Met Ser Leu Thr Val Val Thr Ser Leu Leu Glu Lys

55                  60                  65                  70

tat gct att gat cca aaa caa att ggc cgc ttg gaa gtt ggt agc gaa      355

Tyr Ala Ile Asp Pro Lys Gln Ile Gly Arg Leu Glu Val Gly Ser Glu

                75                  80                  85

act gtt att gac aag agc aag tca ata aag act tgg ttg atg tgc att      403

Thr Val Ile Asp Lys Ser Lys Ser Ile Lys Thr Trp Leu Met Cys Ile

            90                  95                  100

ttt gag aag tgt gga aat act gaa att gaa ggt gtg gac tca aca aat      451

Phe Glu Lys Cys Gly Asn Thr Glu Ile Glu Gly Val Asp Ser Thr Asn

        105                 110                 115

gca tgc tat ggt gga act gca gct cta ttt aac tgt gtt aac tgg gtt      499

Ala Cys Tyr Gly Gly Thr Ala Ala Leu Phe Asn Cys Val Asn Trp Val

    120                 125                 130

caa agt agt tct tgg gat ggg cga tat ggt ctt gtt gtt gct aca gac      547

Gln Ser Ser Ser Trp Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Val Ala Thr Asp

135                 140                 145                 150

agc gca gtc tat gct gaa ggg cca gct cgg cct act ggg gga gca gct      595

Ser Ala Val Tyr Ala Glu Gly Pro Ala Arg Pro Thr Gly Gly Ala Ala

                155                 160                 165

gcc att gct atg ttg ata ggg ccc aat gct cca ata gca ttt gag aac      643

Ala Ile Ala Met Leu Ile Gly Pro Asn Ala Pro Ile Ala Phe Glu Asn

            170                 175                 180

aga tac agg gga acg cac atg gct cac gca tat gac ttt tat aag ccc      691

Arg Tyr Arg Gly Thr His Met Ala His Ala Tyr Asp Phe Tyr Lys Pro

        185                 190                 195

aat ctt gct agc gag tac ccg gtt gta gat gga aag ctc tca caa act      739

Asn Leu Ala Ser Glu Tyr Pro Val Val Asp Gly Lys Leu Ser Gln Thr

    200                 205                 210

tgc tat cta aag gca ctg gac tct tgc tac aaa cgg ttt tgt aac aag      787

Cys Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Ser Cys Tyr Lys Arg Phe Cys Asn Lys

215                 220                 225                 230

ttt gaa aag gga gaa gga cat cag ttc tct ctt cta gat gca gat tat      835

Phe Glu Lys Gly Glu Gly His Gln Phe Ser Leu Leu Asp Ala Asp Tyr

                235                 240                 245

gta gca ttt cac tct cca tac aat aag ctt gtg cag aag agc ttt gct      883

Val Ala Phe His Ser Pro Tyr Asn Lys Leu Val Gln Lys Ser Phe Ala

            250                 255                 260

cga cta ttg ttc aat gat ttt tca aga cat gcc agt tct gct gga aag      931

Arg Leu Leu Phe Asn Asp Phe Ser Arg His Ala Ser Ser Ala Gly Lys

        265                 270                 275

gat gca caa gag aag ctg gaa ccc tat gct ggt ttg tct gaa gaa gag      979

Asp Ala Gln Glu Lys Leu Glu Pro Tyr Ala Gly Leu Ser Glu Glu Glu

    280                 285                 290

agc tat agc agc cgt gat cta gaa aag gtt tct cag cag gct gcg aag     1027

Ser Tyr Ser Ser Arg Asp Leu Glu Lys Val Ser Gln Gln Ala Ala Lys

295                 300                 305                 310

cca ttg tat gat gaa aaa gtg cag cca tca act tta ttg cca aaa aaa      1075

Pro Leu Tyr Asp Glu Lys Val Gln Pro Ser Thr Leu Leu Pro Lys Lys

                315                 320                 325

gaa ggc aac atg tat aca gca tct ctt tat gct gca ctt gcc tcg att      1123

Glu Gly Asn Met Tyr Thr Ala Ser Leu Tyr Ala Ala Leu Ala Ser Ile

            330                 335                 340

ata cat aac aag tat agc acg ctg gaa ggt caa agg gtg ctc atg ttc      1171

Ile His Asn Lys Tyr Ser Thr Leu Glu Gly Gln Arg Val Leu Met Phe

        345                 350                 355

tct tat gga agt ggg ctt gct tcg aca atg ttc tca ctt aaa att cgt      1219

Ser Tyr Gly Ser Gly Leu Ala Ser Thr Met Phe Ser Leu Lys Ile Arg

    360                 365                 370

gaa ggt cag cat cct ttt atc ctg tca aac att gct gaa gct atg gat      1267

Glu Gly Gln His Pro Phe Ile Leu Ser Asn Ile Ala Glu Ala Met Asp

375                 380                 385                 390

ctc caa agc aaa ctt gaa tcc caa cat gag ttt tct cct gaa gat ttt      1315

Leu Gln Ser Lys Leu Glu Ser Gln His Glu Phe Ser Pro Glu Asp Phe

                395                 400                 405

gtg gac aac ttg agg ctg atg gag act cta tat gga gca aaa gac ttc      1363

Val Asp Asn Leu Arg Leu Met Glu Thr Leu Tyr Gly Ala Lys Asp Phe

            410                 415                 420

gtt tca tgt gct caa cat aat ttg cta agg cct ggg act ttt tat ttg      1411

Val Ser Cys Ala Gln His Asn Leu Leu Arg Pro Gly Thr Phe Tyr Leu

        425                 430                 435

act gaa gta gat tca atg tac cgg cgt ttc tat tcc cag aaa ttg gtt      1459

Thr Glu Val Asp Ser Met Tyr Arg Arg Phe Tyr Ser Gln Lys Leu Val

    440                 445                 450

agc ctt gat gat aac tgt agg gag acg aag ttt gca aat ggt act atc     1507

Ser Leu Asp Asp Asn Cys Arg Glu Thr Lys Phe Ala Asn Gly Thr Ile

455                 460                 465                 470

agt agc aat ggt gaa ttg tag tacattttac ttcgagatgg tcagactggt        1558

Ser Ser Asn Gly Glu Leu

                475

ctacatatca tttgtaagag gtcgaatatt tgttctaaaa tgtaaaatag catatttttg   1618

aggcccccct tttatttgtt atttattttt atttttatgt gatgtgaaag cattgagaag   1678

tgtgaaatgt gcatgagaac tgtaccagtt aacttggttt acttatcaat caatatacat   1738

tttgaaaaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                           1776

<210>2

<211>476

<212>PRT

<213>红豆杉(Taxus media)

<400>2

Met Ala Ser Pro Gln Glu Asn Val Gly Ile Leu Ala Met Glu Val Tyr

1               5                   10                  15

Phe Pro Thr Thr Cys Val Gln Gln Asp Ala Leu Glu Thr Phe Asp Gly

            20                  25                  30

Val Ser Lys Gly Lys Tyr Thr Ile Gly Leu Gly Gln Asp Cys Met Thr

        35                  40                  45

Phe Cys Thr Asp Leu Glu Asp Val Ile Ser Met Ser Leu Thr Val Val

    50                  55                  60

Thr Ser Leu Leu Glu Lys Tyr Ala Ile Asp Pro Lys Gln Ile Gly Arg

65                  70                  75                  80

Leu Glu Val Gly Ser Glu Thr Val Ile Asp Lys Ser Lys Ser Ile Lys

                85                  90                  95

Thr Trp Leu Met Cys Ile Phe Glu Lys Cys Gly Asn Thr Glu Ile Glu

            100                 105                 110

Gly Val Asp Ser Thr Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Thr Ala Ala Leu Phe

        115                 120                 125

Asn Cys Val Asn Trp Val Gln Ser Ser Ser Trp Asp Gly Arg Tyr Gly

    130                 135                 140

Leu Val Val Ala Thr Asp Ser Ala Val Tyr Ala Glu Gly Pro Ala Arg

145                 150                 155                 160

Pro Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ile Ala Met Leu Ile Gly Pro Asn Ala

                165                 170                 175

Pro Ile Ala Phe Glu Asn Arg Tyr Arg Gly Thr His Met Ala His Ala

            180                 185                 190

Tyr Asp Phe Tyr Lys Pro Asn Leu Ala Ser Glu Tyr Pro Val Val Asp

        195                 200                 205

Gly Lys Leu Ser Gln Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Ser Cys Tyr

    210                 215                 220

Lys Arg Phe Cys Asn Lys Phe Glu Lys Gly Glu Gly His Gln Phe Ser

225                 230                 235                 240

Leu Leu Asp Ala Asp Tyr Val Ala Phe His Ser Pro Tyr Asn Lys Leu

                245                 250                 255

Val Gln Lys Ser Phe Ala Arg Leu Leu Phe Asn Asp Phe Ser Arg His

            260                 265                 270

Ala Ser Ser Ala Gly Lys Asp Ala Gln Glu Lys Leu Glu Pro Tyr Ala

        275                 280                 285

Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ser Tyr Ser Ser Arg Asp Leu Glu Lys Val

    290                 295                 300

Ser Gln Gln Ala Ala Lys Pro Leu Tyr Asp Glu Lys Val Gln Pro Ser

305                 310                 315                 320

Thr Leu Leu Pro Lys Lys Glu Gly Asn Met Tyr Thr Ala Ser Leu Tyr

                325                 330                 335

Ala Ala Leu Ala Ser Ile Ile His Asn Lys Tyr Ser Thr Leu Glu Gly

            340                 345                 350

Gln Arg Val Leu Met Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Leu Ala Ser Thr Met

        355                 360                 365

Phe Ser Leu Lys Ile Arg Glu Gly Gln His Pro Phe Ile Leu Ser Asn

    370                 375                 380

Ile Ala Glu Ala Met Asp Leu Gln Ser Lys Leu Glu Ser Gln His Glu

385                 390                 395                 400

Phe Ser Pro Glu Asp Phe Val Asp Asn Leu Arg Leu Met Glu Thr Leu

                405                 410                 415

Tyr Gly Ala Lys Asp Phe Val Ser Cys Ala Gln His Asn Leu Leu Arg

            420                 425                 430

Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Thr Glu Val Asp Ser Met Tyr Arg Arg Phe

        435                 440                 445

Tyr Ser Gln Lys Leu Val Ser Leu Asp Asp Asn Cys Arg Glu Thr Lys

    450                 455                 460

Phe Ala Asn Gly Thr Ile Ser Ser Asn Gly Glu Leu

465                 470                 475

Claims (3)

1、一种红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白编码序列，其特征在于所述的核苷酸序列由SEQ ID NO.3中从核苷酸第98-1528位的核苷酸序列所构成。

2、根据权利要求1所述的红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白编码序列，其特征是，所述的蛋白是具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽。

3、根据权利要求1所述的红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白编码序列转化的宿主细胞，其特征是，所述的宿主细胞是真核细胞。