CN1563386A - 棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白编码序列 - Google Patents

Abstract

一种棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白编码序列，涉及生物和基因工程技术领域。所分离出的DNA分子包括：编码具有棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第19－786位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第19－786位的核苷酸序列杂交，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第19－786位的核苷酸序列。本发明在植物抗氧化方面具有明显的作用，具有很大的应用价值，能够明显减少农作物在干旱、盐碱、低温和病菌感染等环境胁迫条件下生物产量的损失。

Description

棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白编码序列

技术领域

本发明涉及生物和基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在棉花中表达的抗氧化因子蛋白编码序列及其核酸序列。

背景技术

植物在生长过程中受到各种各样环境胁迫(如极端温度、水分胁迫、辐射、臭氧及二氧化硫和病原菌感染等)的影响，体内产生了大量的活性氧(Reactive OxygenSpecies)，如超氧离子(O₂ ^*-)、羟自由基(OH)和过氧化氢(H₂O₂)。尽管氧对植物的生存是必需的，但它同时也使其面临氧化逆境(oxidative stress)。活性氧(ROS)使膜流动性降低、膜透性增加；抑制酶活性甚至引起蛋白质功能的丧失；且ROS对核酸的攻击可造成细胞死亡或异常蛋白如热激蛋白的形成。植物在进化过程中为保护自身免受ROS的伤害形成了内源保护系统，由非酶抗氧化剂和抗氧化酶类组成，如生物碱、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还原酶等。尽管植物体内存在抗氧化系统，一些高度氧化的副产物如过氧化氢(H₂O₂)、氢氧根离子(OH^-)和过氧化阴离子(O₂ ^-)，容易氧化某些氨基酸残基，特别是甲硫氨酸(Met)可以被氧化为甲硫氨酸亚砜(Met(O))，而当一些蛋白质中存在Met(O)则会导致其生物学活性的降低或丧失。进一步研究发现，经氧化形成的Met(O)可以被肽-甲硫氨酸亚砜还原酶(peptide methioninesulfoxide reductase，MsrA)催化逆转而使蛋白重新恢复活性。本发明中，我们首次从棉花(Gossypium barbadense)中克隆到甲硫氨酸亚砜还原酶(MsrA)的基因。

经对现有技术文献检索发现：杂志《Plant Physiology(植物生理)》在2000，123：255-263发表了文章“Differential regulation of plastidial and cytosolicisoforms of peptide methionine sulfoxide reductase in Arabidopsis(拟南芥甲硫氨酸亚砜还原酶质体和胞体的差异调控)”，该文献虽然对甲硫氨酸亚砜还原酶MsrA在茉莉酸、高盐、温度和病原菌胁迫处理下的表达做了充分肯定，但截止目前的报道显示该基因的转基因烟草植株的茉莉酸、高盐、温度和病原菌胁迫方面的效果没有明显提高，此外尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的在棉花中克隆甲硫氨酸亚砜还原酶的蛋白序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白编码序列，使其在植物细胞抗氧化上具有明显的作用，能够明显提高植物细胞对氧化物的抗性，降低氧化胁迫对植物的损害。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第19-786位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第19-786位的核苷酸序列杂交。所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第19-786位的核苷酸序列。

本发明分离出的棉花抗氧化类相关蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、低温、黄萎病处理下均能发挥作用，而这些逆境胁迫均可引起植物体内ROS的增加。

本发明的载体，它包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

本发明用上述DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。

在本发明中，术语“棉花抗氧化蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有棉花蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第19-786位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第19-786位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第19-786位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下(70％-85％一致性)，更佳的在高度严紧条件下(85％以上一致性)与SEQ ID NO.3中从核苷酸第19-786位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第19-786位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的棉花相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“棉花抗氧化蛋白或多肽”指具有棉花蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然棉花相关相同功能的、SEQ ID NO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括棉花MsrA蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的棉花多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与棉花相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用棉花多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“棉花保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

                  表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser

Gln  (Q)	Asn	Asn
			Glu  (E)	Asp	Asp
Gly  (G)	Pro；Ala	Ala
			His  (H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile  (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu  (L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys  (K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met  (M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe  (F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro  (P)	Ala	Ala
Ser  (S)	Thr	Thr
			Thr  (T)	Ser	Ser
Trp  (W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr  (Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val  (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

                               表2

79％identity in 788nt overlap

Query：511 cgccaggggaatgatgtggggacacagtacagatctgggatttacttttacagcccagag 570

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Sbjct：526 cgccaggggaatgatgtggggacgaggtacagatcaggcatatacttctacacagacgag 585

Query：571 caggagaaggcagcagtggaatccatggaaaaacagcagaaactcctcaacagaaagatt 630

           || ||||||| |||   |||  | ||||| |||||||||||  || | ||||||||||||

Sbjct：586 caagagaagttagctcgtgaagcaatggagaaacagcagaagatcttgaacaggaagatt 645

Query：631 gttactgaaattctgccggccaggaaattctatagagcagaggaatatcaccagcagtac 690

           || ||||| || || || |||| ||||||||| ||||| ||  | || ||||||||||||

Sbjct：646 gtgactgagatacttcctgccacgaaattctacagagcggaaaactaccaccagcagtac 705

Query：691 cttgcaaagggaggtcgttttggttgtaaacaatctgctgagaaaggatgcaatgatcct 750

           || ||||| || |||||  | |||   |  ||||||||||||||||| ||||| |||||

Sbjct：706 ctggcaaaaggtggtcgcatgggtctcagtcaatctgctgagaaaggttgcaacgatcca 765

Query：751 atccgatgctatggctaa 768

           ||||||||||||||||||

Sbjct：766 atccgatgctatggctaa 783

Query：棉花MsrA的核酸序列

Sbjct：油菜MsrA的核酸序列(Z48619)

表2为本发明的棉花MsrA蛋白与油菜MsrA蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。

                           表3

72％identity in 255aa overlap，83％similarity in 255aa overlap

Query：46 VAKPFFSFSQASLTLS--APISLPFPQTRRSISLHTRPMN-ILKSLGFGANNKPTASMDN 216

          ++KP  S S+A+L+LS  A  + PFP+T RSIS++  PMN +   LGFG+  +P  +  +

Sbjct：16 LSKPLQSLSKAALSLSKRAKPTSPFPKTARSISVYKSPMNNLFTRLGFGSRPQPDPAA-S 74

Query：217 CAIAQGPEDDVPPPGQQFAQFGAGCFWGVELAFQRVSGITKTEVGYSQGFMHNPSYEDVC 396

            AIAQGP+DDVP PGQQFAQFGAGCFWG ELA+QRV G+TKTEVGYS GF+ NPSYEDVC

Sbjct：75 AAIAQGPDDDVPSPGQQFAQFGAGCFWGAELAYQRVPGVTKTEVGYSHGFVDNPSYEDVC 134

Query：397 SGTTNHSEVVRVQYDPNECSYDTLLHVFWARHDPTTLNRQGNDVGTQYRSGIYFYSPEQE 576

           S TT H+E+VRVQYDP E S+++LL VFW RHDPTTLNRQGNDVGT+YRSGIYFY+ EQE

Sbjct：135 SETTGHNEIVRVQYDPKEVSFESLLDVFWKRHDPTTLNRQGNDVGTRYRSGIYFYTDEQE 194

Query：577 KAAVESMEKQQKLLNRKIVTEILPARKFYRAEEYHQQYLAKGGRFGCKQSAEKGCNDPIR 756

           K A E+MEKQQK+LNRKIVTEILPA KFYRAE YHQQYLAKGGR G  QSAEKGCNDPIR

Sbjct：195 KLAREAMEKQQKILNRKIVTEILPATKFYRAENYHQQYLAKGGRMGLSQSAEKGCNDPIR 254

Query：757 CYG 765

           CYG

Sbjct：255 CYG 257

Query：棉花MsrA的氨基酸序列

Sbjct：油菜MsrA的氨基酸序列(CAA62760)

表3为本发明的棉花蛋白与油菜的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

发明棉花蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然棉花相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的棉花MsrA多肽时，可以将棉花MsrA编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成棉花MsrA蛋白表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析棉花基因产物的表达，即分析棉花的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明提供的可用作探针的核酸分子，该分子通常具有棉花核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码棉花相关的核酸分子。

本发明的检测样品中是否存在棉花相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于棉花相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的棉花核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选棉花相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与棉花相关基因相关的棉花cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选棉花cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对棉花相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自棉花的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与棉花相关相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的棉花相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本发明具有实质性特点和显著进步，利用本发明的棉花蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与棉花相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明在植物细胞抗氧化上具有明显的作用，能够明显提高植物细胞对氧化物的抗性，降低氧化胁迫对植物的损害。因此，本发明具有很大的应用价值。

具体实施方式

下面结合实验室试验具体数据，以具体实施例来进一步阐述本发明：

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

棉花MsrA基因的克隆

1.组织分离(isolation)

将海岛棉棉花种子置于37℃发芽24小时，然后播种于温室中，待棉花叶片为2-3片时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(CTAB法)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据油菜MsrA基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)RT-PCR

PCR[MA001(SEQ ID NO.1)+MA002(SEQ ID NO.2)]得到484bp的片段，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(GeneBank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如油菜(Brassica napus)BnMsrA基因的同源性很高，故初步认为它是一个MsrA基因。

(2)3’-RACE

PCR[AP+MA301(5’-CTATCCGATGCTATGGCTAA-3’)]得到MA3’(293bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(GeneBank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如油菜(Brassica napus)BnMsrA基因的同源性很高，故初步认为它是一个与甲硫氨酸亚砜还原酶相关基因。

(3)5’-RACE

第一轮PCR[AAP+MA501(5’-AGGAGTTTCTGCTGTTTTTC-3’)]

第二轮PCR[(AUAP+MA502(5’-TTCCACTGCTGCCTTCTCCT-3’))得到MA5’(约605bp)(过程同(1))

将测序结果的重叠区拼接，发现过程(1)得到的片段既是该基因的完整编码区。

BLAST的结果证明从棉花中新得到的基因确为一个与油菜MsrA相关的基因。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的棉花MsrA蛋白的全长编码序列(SEQID NO.3)。

实施例2

棉花MsrA基因的序列信息与同源性分析

本发明新的棉花MsrA全长cDNA的长度为987bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于19-786位核苷酸(612个核苷酸)。根据全长cDNA推导出棉花MsrA的氨基酸序列，共255个氨基酸残基，分子量为28403.15道尔顿，等电点(pI)为8.42。详细序列见SEQ ID NO.3。

将棉花MsrA的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与油菜基因BnMsrA(Z48619)在核苷酸水平上具有79％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与油菜基因BnMsrA(CAA62760)也有72％的相同性(附表3)。由此可见，棉花基因MsrA与油菜基因MsrA无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。油菜基因BnMsrA(CAA62760)已经被证明在氧化胁迫条件下明显增强表达，并发挥着重要的作用，可以认为棉花基因MsrA在抗氧化方面也具有相似的作用。

实施例3

棉花基因MsrA蛋白或多肽在烟草中进行真核细胞表达及转基因植株的抗氧化性鉴定

含目的基因(棉花基因MsrA)的表达载体的构建

根据棉花MsrA基因的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将棉花MsrA基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。

1.发苗：种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用0.1％升汞消毒10-12分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干，放入MS培养基。光照培养5天，待苗长到4-5厘米便可以剪苗。

2.剪苗：剪取0.5-1厘米的下胚轴小片段放入预培养基，培养2天。

预培养基：MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)

3.转化共培养：将预培养2天的下胚轴放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入预培养基暗培养2天。

4.筛选培养：共培养结束后，将外植体放入筛选培养基。2周继代一次。2-4周有愈伤组织形成和芽的分化。待绿芽长到2厘米后，切下生根。

筛选培养基：MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)

生根培养基：MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)

5.转化植株培养；待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

含棉花基因MsrA的转基因烟草植株的抗氧化性鉴定

鉴于编码MsrA，如油菜的MsrA基因已被证明在抗氧化方面发挥作用，而棉花基因MsrA转录水平与油菜的MsrA具有较高的同源性，可进一步对含棉花基因MsrA的转基因烟草植株进行抗氧化鉴定。用300mM氯化钠和10⁴-10⁵spores/ml黄萎病菌处理转基因植株和转基因植株的种子(1小时、3小时、7小时、12小时、24小时、48小时、72小时)后研究MsrA基因在转基因植株中的表达情况以及各种处理对植株的生长情况。Northern blot分析结果证明，转基因植株MsrA转录水平在盐和黄萎病菌处理后其表达量显著增强，而对照非转基因植株虽表达量提高，但明显低于转基因植株。此外非转基因植株生长缓慢，最后在盐和黄萎病菌处理下枯萎而死，转基因植物依然能正常生长，只是比未经处理的植株生长稍慢。在抗低温、抗干旱试验中，转基因植株也明显表现出比对照(未转基因植株)生长正常。这证明棉花基因MsrA比油菜基因MsrA具有更有效的和更广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良植物抗氧化的研究和产业化生产中。

实施例4

棉花基因MsrA在棉花中的拷贝数分析

采用常规方法从棉花叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用BamH、EcoRI和KpnI酶切DNA[13μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene Images^TM Contents CDP-Star^TMlabelling module(PRN3540)，我们将MsrA基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIGlabeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现在杂交膜上出现一至五条不同的杂交条带，说明MsrA基因在棉花中是低拷贝基因。

实施例5

棉花MsrA基因在病原菌和盐胁迫条件下的不同时间处理的表达谱分析

1.RNA的提取：将生长了3-4片叶的棉花幼苗经100mMNaCl和10⁴-10⁵spores/ml黄萎病菌分别处理1小时、3小时、7小时、12小时、24小时、48小时和72小时，然后用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。

2.RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD₂₆₀；RNA含量计算：1 OD₂₆₀＝40μg/ml。

3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：1)取6ml 25*(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10*上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。

4.RNA尼龙膜上转移：1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。

5.膜上杂交信号的检出：1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene Images^TM Contents CDP-Star^TM labellingmodule标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明：随着病原菌和盐处理时间的延长，MsrA的表达逐步增强，说明MsrA是逆境信号如病原菌和盐诱导表达的，在棉花抗氧化胁迫中扮演重要的角色。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：20bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii).分子类型：寡核苷酸

(iii).序列描述：SEQ ID NO.1

CAG GGG AAT GAT GTG GGG AC

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：20bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii).分子类型：寡核苷酸

(iii).序列描述：SEQ ID NO.2

TTA GCC ATA GCA TCG GAT(A/T)G

(3)SEQ ID NO.3的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1059bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.3

<110>上海交通大学

<120>棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白编码序列

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1059

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium barbadense)

<220>

<221>CDS

<222>(19)..(786)

<223>

<400>1

tctcaaatac ccttaaaa atg ctt cga agc ctt gcg ctt act act tct tcc    51

                    Met Leu Arg Ser Leu Ala Leu Thr Thr Ser Ser

                     1               5                  10

tct tct tct ctg gtc gct aaa cct ttt ttt tca ttc tcc caa gct tcc    99

Ser Ser Ser Leu Val Ala Lys Pro Phe Phe Ser Phe Ser Gln Ala Ser

            15                  20                  25

ctc act ctt tct gct cct atc tct ctc cct ttc cct caa acc aga cga    147

Leu Thr Leu Ser Ala Pro Ile Ser Leu Pro Phe Pro Gln Thr Arg Arg

        30                  35                  40

tcc att tcc ctt cac aca cgc ccc atg aac atc ctc aaa agc ctc ggc      195

Ser Ile Ser Leu His Thr Arg Pro Met Asn Ile Leu Lys Ser Leu Gly

    45                  50                  55

ttt ggg gcc aac aac aag cca acc gct tca atg gat aat tgc gcc atc      243

Phe Gly Ala Asn Asn Lys Pro Thr Ala Ser Met Asp Asn Cys Ala Ile

60                  65                  70                  75

gct cag ggt cct gaa gac gac gtc ccg cct cct ggt caa cag ttt gct      291

Ala Gln Gly Pro Glu Asp Asp Val Pro Pro Pro Gly Gln Gln Phe Ala

                80                  85                  90

cag ttc ggt gcg ggc tgc ttt tgg ggc gtt gaa ctg gct ttc cag aga      339

Gln Phe Gly Ala Gly Cys Phe Trp Gly Val Glu Leu Ala Phe Gln Arg

            95                  100                 105

gtt tcg ggg atc acc aaa act gaa gtt ggg tat tcc caa gga ttc atg      387

Val Ser Gly Ile Thr Lys Thr Glu Val Gly Tyr Ser Gln Gly Phe Met

        110                 115                 120

cat aat ccg agt tat gaa gac gtg tgt tcg ggg act acc aac cac agt      435

His Asn Pro Ser Tyr Glu Asp Val Cys Ser Gly Thr Thr Asn His Ser

    125                 130                 135

gaa gtc gtg agg gtt cag tat gac cct aat gag tgt agc tat gac act      483

Glu Val Val Arg Val Gln Tyr Asp Pro Asn Glu Cys Ser Tyr Asp Thr

140                 145                 150                 155

ttg ctt cat gtc ttt tgg gct cgc cat gat cct act acc ctc aac cgc      531

Leu Leu His Val Phe Trp Ala Arg His Asp Pro Thr Thr Leu Asn Arg

                160                 165                 170

cag ggg aat gat gtg ggg aca cag tac aga tct ggg att tac ttt tac      579

Gln Gly Asn Asp Val Gly Thr Gln Tyr Arg Ser Gly Ile Tyr Phe Tyr

            175                 180                 185

agc cca gag cag gag aag gca gca gtg gaa tcc atg gaa aaa cag cag      627

Ser Pro Glu Gln Glu Lys Ala Ala Val Glu Ser Met Glu Lys Gln Gln

        190                 195                 200

aaa ctc ctc aac aga aag att gtt act gaa att ctg ccg gcc agg aaa      675

Lys Leu Leu Asn Arg Lys Ile Val Thr Glu Ile Leu Pro Ala Arg Lys

    205                 210                 215

ttc tat aga gca gag gaa tat cac cag cag tac ctt gca aag gga ggt      723

Phe Tyr Arg Ala Glu Glu Tyr His Gln Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Gly

220                 225                 230                 235

cgt ttt ggt tgt aaa caa tct gct gag aaa gga tgc aat gat cct atc      771

Arg Phe Gly Cys Lys Gln Ser Ala Glu Lys Gly Cys Asn Asp Pro Ile

                240                 245                 250

cga tgc tat ggc taa gttgccactt tttctgtatg cacttctgct tttgtctatg      826

Arg Cys Tyr Gly

            255

gaattttaat gccttgtgtt atctatgtag ttactgaagg tggtggactt gtaattattc    886

ataattccaa ggcagaccga tatctatgtt ttgtatatct acagtgatag gttaggacat    946

gatgtttgaa ctttcaaata tggcgatcat gtattaataa agaaatatta catgccttta   1006

tgggggagga tgtttccttt cacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa          1059

<210>2

<211>255

<212>PRT

<213>棉花(Gossypium barbadense)

<400>2

Met Leu Arg Ser Leu Ala Leu Thr Thr Ser Ser Ser Ser Ser Leu Val

1               5                   10                  15

Ala Lys Pro Phe Phe Ser Phe Ser Gln Ala Ser Leu Thr Leu Ser Ala

            20                  25                  30

Pro Ile Ser Leu Pro Phe Pro Gln Thr Arg Arg Ser Ile Ser Leu His

        35                  40                  45

Thr Arg Pro Met Asn Ile Leu Lys Ser Leu Gly Phe Gly Ala Asn Asn

    50                  55                  60

Lys Pro Thr Ala Ser Met Asp Asn Cys Ala Ile Ala Gln Gly Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Asp Val Pro Pro Pro Gly Gln Gln Phe Ala Gln Phe Gly Ala Gly

                85                  90                  95

Cys Phe Trp Gly Val Glu Leu Ala Phe Gln Arg Val Ser Gly Ile Thr

            100                 105                 110

Lys Thr Glu Val Gly Tyr Ser Gln Gly Phe Met His Asn Pro Ser Tyr

        115                 120                 125

Glu Asp Val Cys Ser Gly Thr Thr Asn His Ser Glu Val Val Arg Val

    130                 135                 140

Gln Tyr Asp Pro Asn Glu Cys Ser Tyr Asp Thr Leu Leu His Val Phe

145                 150                 155                 160

Trp Ala Arg His Asp Pro Thr Thr Leu Asn Arg Gln Gly Asn Asp Val

                165                 170                 175

Gly Thr Gln Tyr Arg Ser Gly Ile Tyr Phe Tyr Ser Pro Glu Gln Glu

            180                 185                 190

Lys Ala Ala Val Glu Ser Met Glu Lys Gln Gln Lys Leu Leu Asn Arg

        195                 200                 205

Lys Ile Val Thr Glu Ile Leu Pro Ala Arg Lys Phe Tyr Arg Ala Glu

    210                 215                 220

Glu Tyr His Gln Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Gly Arg Phe Gly Cys Lys

225                 230                 235                 240

Gln Ser Ala Glu Lys Gly Cys Asn Asp Pro Ile Arg Cys Tyr Gly

                245                 250                 255

Claims (4)

1、一种棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白编码序列，其特征在于，所分离出的DNA分子包括：编码具有棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第19-786位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第19-786位的核苷酸序列杂交，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第19-786位的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白编码序列，其特征是，所分离出的棉花抗氧化类相关蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、低温、黄萎病处理下均能发挥作用，而这些逆境胁迫均可引起植物体内ROS的增加。

3、根据权利要求1所述的棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白编码序列，其特征是，它的载体，包含上述的DNA分子，一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

4、根据权利要求4所述的棉花甲硫氨酸亚砜还原酶蛋白编码序列，其特征是，所述DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。