CN114381468B

CN114381468B - 一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用

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Publication number: CN114381468B
Application number: CN202111650848.5A
Authority: CN
Inventors: 贾开志
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114381468A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，提供一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用，该甲硫氨酸裂解酶的编码基因的cDNA序列为(a)、(b)和(c)中的任一所示：(a)如SEQ ID No.1所示的核苷酸；(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸；(c)与如SEQ ID No.1所示的核苷酸至少有80％以上同源性的核苷酸序列。并进一步提出了该甲硫氨酸裂解酶的制备工艺和具体应用，该甲硫氨酸裂解酶能够在高温65℃条件下高效降解甲硫氨酸，并耦合巴氏杀菌工艺去除食品的甲硫氨酸。

Description

一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用。

背景技术

甲硫氨酸裂解酶在医疗健康领域具有广泛的应用。研究结果证明，正常细胞对胞内甲硫氨酸浓度降低具有一定的耐受性，且甲硫氨酸浓度降低将减少胞内活性氧的种类，延长正常细胞的寿命、提高抗胁迫、代谢适应以及抗氧化功能，利用甲硫氨酸裂解酶降低正常细胞胞内甲硫氨酸含量将成为抗衰老的一项重要技术。同时，甲硫氨酸裂解酶降低胞内甲硫氨酸的浓度，显著抑制恶性肿瘤细胞的生长和迁移，通过食品添加甲硫氨酸裂解酶以降低哺乳动物胞内甲硫氨酸的浓度成为一项极具发展潜力治疗甲硫氨酸依赖肿瘤的重要手段。

但是，目前现有的甲硫氨酸裂解酶的转化率较低，无法有效降低食物中的甲硫氨酸，因此，亟待提供一种更加有效的甲硫氨酸裂解酶，以至少部分解决上述技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用，以至少部分地解决上述的技术问题。

1、一种甲硫氨酸裂解酶的编码基因，其特征在于，其cDNA序列为(a)、(b)和(c)中的任一所示。

(a)如SEQ ID No.1所示的核苷酸；

(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸；

(c)与如SEQ ID No.1所示的核苷酸至少有80％以上同源性的核苷酸序列。

上述“严谨杂交条件”，意指在所属领域中已知的低离子强度和高温条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比其他序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨序列杂交是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详细指导，可参考文献3。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度及pH下的热熔点(Tm)5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)。因为目标序列过量存在，在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据。严谨条件可为以下条件：其中在pH值7.0-8.3下，盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为0.01M-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5min、15min、30min、60min、120min或更长时间。

本发明的甲硫氨酸裂解酶的编码基因的有益效果是：

本发明的甲硫氨酸裂解酶的编码基因，能够在宿主细胞中高效表达甲硫氨酸裂解酶，该甲硫氨酸裂解酶能够在高温65℃条件下达到较高的甲硫氨酸裂解效率，能耦合巴氏杀菌工艺去除食品中的甲硫氨酸。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，与如SEQ ID No.1所示的核苷酸至少有90％以上同源性的核苷酸序列。

进一步，与如SEQ ID No.1所示的核苷酸至少有95％以上同源性的核苷酸序列。

进一步，与如SEQ ID No.1所示的核苷酸至少有97％以上同源性的核苷酸序列。

本发明的目的之二，是提供一种甲硫氨酸裂解酶，本发明的甲硫氨酸裂解酶由上述的甲硫氨酸裂解酶的编码基因编码所编码，其能够在高温65℃条件下达到较高的甲硫氨酸裂解效率，能耦合巴氏杀菌工艺去除食品中的甲硫氨酸。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述甲硫氨酸裂解酶的编码基因编码的甲硫氨酸裂解酶。

本发明的甲硫氨酸裂解酶的有益效果是：

该甲硫氨酸裂解酶能够在常温下达到较高的甲硫氨酸裂解效率。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述甲硫氨酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的目的之三，是提供一种甲硫氨酸裂解酶的生物合成方法，该方法得到的该甲硫氨酸裂解酶能够在高温65℃条件下达到较高的甲硫氨酸裂解效率，能耦合巴氏杀菌工艺去除食品中的甲硫氨酸。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述甲硫氨酸裂解酶的生物合成方法，包括如下步骤：

合成如SEQ ID No.1所示的hCGL 1491H序列；

基于所述hCGL 1491H序列，突变Glu339为Val，得到hCGL 149 1H-E339V序列；

合成如SEQ ID No.3所示的上游引物和如SEQ ID No.4所示的下游引物，并组合所述hCGL 1491H-E339V序列，得到重组序列；

将所述重组序列组装为表达载体；

表达所述表达载体，得到所述甲硫氨酸裂解酶。

本发明的甲硫氨酸裂解酶的生物合成方法的有益效果是：

该方法得到的该甲硫氨酸裂解酶能够在高温65℃条件下达到较高的甲硫氨酸裂解效率，能耦合巴氏杀菌工艺去除食品中的甲硫氨酸，且该方法操作简易，市场前景广阔，适合规模化推广应用。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，表达所述表达载体的宿主细胞为Escherichia coli BL21。

进一步，得到所述甲硫氨酸裂解酶的过程为收集诱导表达后的菌体，采用高压匀质进行破碎菌体，纯化。

进一步，所述的纯化的方法包括如下步骤：清洗并再生的High Performance Ni柱，用Lysis Buffer缓冲液进行柱平衡；平衡完毕后，将收集诱导表达后的菌体用LysisBuffer缓冲液重悬，高压匀质破碎细胞壁，离心取上清进行上样结合；上样完毕后，用含有20mM含有咪唑的裂解缓冲液将柱上的非特异性杂质洗去；用含有200mM咪唑的洗脱缓冲液收集目的蛋白；将收集的目的蛋白过脱盐柱进行纯化并收集，得到纯化的甲硫氨酸裂解酶。

进一步，Lysis Buffer缓冲液组分为：pH＝8.0的20mM Tris-HCl，300mM KCl，10％体积甘油。

进一步，裂解缓冲液由以下组分组成：pH＝8.0的20mM Tris-HCl，300mM KCl，20mM咪唑，10％体积甘油和1mM苯甲基磺酰氟。

进一步，洗脱缓冲液由如下组分组成：pH＝8.0的20mM Tris-HCl，300mM KCl，200mM咪唑，10％体积甘油和1mM苯甲基磺酰氟。

本发明的目的之四，是提供上述甲硫氨酸裂解酶在降解食品中甲硫氨酸中的应用。上述甲硫氨酸裂解酶能够在高温65℃条件下达到较高的甲硫氨酸裂解效率，该酶耦合巴氏杀菌工艺去除食品中的甲硫氨酸，具备广泛的应用前景。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述甲硫氨酸裂解在降解食品中甲硫氨酸中的应用。

本发明的甲硫氨酸裂解酶的有益效果是：

该甲硫氨酸裂解酶能够在高温65℃条件下达到较高的甲硫氨酸裂解效率该酶能够耦合65℃巴氏杀菌工艺高效降解食品中存在的甲硫氨酸，具备广泛的应用前景。

本发明的目的之五，是提供一种重组表达载体，其含有上述编码基因，并能够在宿主细胞中高效表达编码基因。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种重组表达载体，含有上述的甲硫氨酸裂解酶的编码基因。

本发明的重组表达载体的有益效果是：

该重组表达载体含有上述编码基因，并能够在宿主细胞中高效表达编码基因。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述重组表达载体为pET28a-1419H-F58Y-E339V。

本发明的目的之五，是提供一种宿主细胞，其含有上述编码基因。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种宿主细胞，上述宿主细胞含有如上所述的甲硫氨酸裂解酶的编码基因。

本发明的宿主细胞的有益效果是：

该宿主细胞含有上述编码基因，该基因基于宿主细胞密码子偏好性进行密码子优化，能够在宿主细胞中高效启动表达。

进一步，所述宿主细胞为大肠杆菌。

进一步，所述宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli BL21。

术语“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

术语“多肽”、“酶”和“蛋白质”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本发明中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

本发明中所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

除非另外定义，否则本申请所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

本发明的目的之一，是提供一种甲硫氨酸裂解酶的cDNA序列及甲硫氨酸裂解酶，该cDNA序列在宿主细胞中进行表达后所得到的甲硫氨酸裂解酶可以在降解食品中甲硫氨酸方面表达较好的效率。

本发明实施例中的甲硫氨酸裂解酶的编码基因的cDNA序列为(a)、(b)和(c)中的任一所示。

(a)如SEQ ID No.1所示的核苷酸；

序列SEQ ID No.1如下所示：

SEQ ID No.1：atgcaggaaaaagatgccagcagccagggttttctgccgcattttcagcattttgccacccaggccattcatgttggccaggatccggaacagtggaccagccgcgcagttgttccgccgattagcctgagcaccacctttaaacagggtgcccctggtcagcattcaggttttgaatatagtcgtagcggtaatccaacacgtaattgtctggaaaaagcagtagcagcactggatggtgcaaaatattgtctggcctttgcaagtggtctggcagcaaccgttacaatcacccatctgctgaaagcaggcgatcagattatctgtatggatgatgtttatggtggtactaatcgttattttcgtcaggtcgcatctgaatttggtctgaaaatttcatttgtggattgcagcaaaatcaaactgctggaagctgcaattaccccggaaacgaaactggtgtggattgaaaccccgactaatccaacccagaaagtgattgatattgaaggttgcgcacatattgttcataaacatggtgatattatcctggtagttgataatacatttatgagcccgtattttcagcgccctctggcactgggcgccgatattagcatgtatagcgcaaccaaatatatgaatggtcattcagatgttgtgatgggtctggtgagtgttaattgtgaaagcctgcataatcgcctgcgttttctgcagaatagtctgggtgcagttccgtcaccgattgattgttatctgtgtaatcgtggtctgaaaacactgcatgttcgtatggaaaaacattttaaaaacggtatggcagttgcacagtttctggaaagcaatccgtgggttgaaaaagttatttatccgggtctgccgtcacatcctcagcatgaactggttaaacgtcagtgcacaggttgcaccggtatggttacattttatattaaaggtaccctgcagcatgcagaaatttttctgaaaaacctgaaactgtttaccctggcagaaagcctgggtggttttgaaagtctggcggaactgcctgcaattatgacgcatgcaagcgttctgaaaaatgatcgtgatgttctgggtatttccgatacactgattcgtctgagcgttggtctggaagatgaagaagatctgctggaagatctggatcaggcactgaaagcagcacatcctccgagcggttctcatagctga。

本发明还提供一种甲硫氨酸裂解酶，该甲硫氨酸裂解酶的cDNA序列如上三种所述任意一种，这样所得到的甲硫氨酸裂解酶在裂解食物中的甲硫氨酸时能够表现出较好的效率。该甲硫氨酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：

SEQ ID No.2:MQEKDASSQGFLPHFQHFATQAIHVGQDPEQWTSRAVVPPISLSTTFKQGAPGQHSGYEYSRSGNPTRNCLEKAVAALDGAKYCLAFASGLAATVTITHLLKAGDQIICMDDVYGGTNRYFRQVASEFGLKISFVDCSKIKLLEAAITPETKLVWIETPTNPTQKVIDIEGCAHIVHKHGDIILVVDNTFMSPYFQRPLALGADISMYSATKYMNGHSDVVMGLVSVNCESLHNRLRFLQNSLGAVPSPIDCYLCNRGLKTLHVRMEKHFKNGMAVAQFLESNPWVEKVIYPGLPSHPQHELVKRQCTGCTGMVTFYIKGTLQHAEIFLKNLKLFTLAVSLGGFESLAELPAIMTHASVLKNDRDVLGISDTLIRLSVGLEDEEDLLEDLDQALKAAHPPSGSHS。

本发明还提供了一种甲硫氨酸裂解酶的生物合成方法，包括如下步骤：

S101：合成如SEQ ID No.1所示的hCGL 1491H序列；

S102：基于hCGL 1491H序列，突变Glu339为Val，得到hCGL 1491H-E339V序列；

S103：合成如SEQ ID No.3所示的上游引物和如SEQ ID No.4所示的下游引物，并组合hCGL 1491H-E339V序列，得到重组序列；

S104：将重组序列组装为表达载体；

S105：表达表达载体，得到甲硫氨酸裂解酶。

SEQ ID No.3：cagcattcaggttatgaattatagtcgtagcggtaatccaac。

SEQ ID No.4：tcataacctgaatgctgaccaggggcaccctg。

上述步骤的具体实现方式见实施例。

本发明还提供上述的甲硫氨酸裂解酶在降解食品中甲硫氨酸中的应用。例如将上述甲硫氨酸裂解酶，通过耦合巴氏消毒工艺，在65℃的温度下处理牛奶30min以上可以降解牛奶中的甲硫氨酸达85％以上。当然，本发明中的甲硫氨酸裂解酶也可以用于在其他温度范围内裂解麦芽糊精、面糊等其他食物中的甲硫氨酸。这里的食品，不仅包括狭义的供食用的食品，还包括食品原料和食品添加剂等其他作为食品可食用的组成部分的物质。

本发明还保护含有如上所述的cDNA序列的载体，以及含有如上所述的cDNA序列的宿主细胞，该宿主细胞优选地为大肠杆菌Escherichia coli BL21。本领域技术人员清楚如何根据需要在编写完成上述的cDNA序列后将其制备成为多种不同类型的载体，并根据培养条件在不同的宿主细胞中进行表达。

实施例1：

实验材料。

大肠杆菌Escherichia coli BL21，购自武汉淼灵生物科技有限公司；大肠杆菌感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3)，购自Trans Gen Biotech公司。

仪器：

CX41倒置相差显微镜和BX51荧光显微镜，均购自日本Olympus公司；DTX880酶联免疫检测仪，购自美国Beckman公司；751GD紫外分光光度计，购自杭州汇尔仪器有限公司；CytoFLEX流式细胞仪，购自贝克曼库尔特国际贸易(上海)有限公司。

实施步骤：

表达质粒pET28a的提取:

LB培养基配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L和卡纳霉素50mg/L。

取1个装有10mL上述LB培养基的试管，将含有pET28a质粒的E.coli hCGL1491H-E339V接种于试管中，在37℃、180rpm下过夜培养，按照质粒试剂盒中的方法提取质粒。质粒试剂盒购自OMEGABio-Tek公司，PlasmidMiniKitI(200)。质粒提取完成后将其做好标记置于4℃冰箱等待下一步使用。

PCR扩增带有编码His标签的hCGL1491H-F58Y-E339V

利用突变试剂盒(

IIFastMutagenesisKitV2，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将编码Phe58的核苷酸TAT突变为编码Tyr的核苷酸ATA。

1491H-F58Y-E339V上游引物：

5’—CAGCATTCAGGTtatGAATTATAGTCGTAGCGGTAATCCAAC—3’(SEQ ID No.3)；

1491H-F58Y-E339V下游引物：

5’—TCataACCTGAATGCTGACCAGGGGCACCCTG—3’(SEQIDNo.4)。

PCR扩增反应体系：将如SEQ ID No.1所示的hCGL1491H-E339V基因0.5μL、2×MaxBuffer12.5μL、dNTPs4μL、SEQIDNo.5所示的上游引物0.5μL、SEQIDNo.6所示的下游引物0.5μL、pfu聚合酶0.5μL、加ddH2O至25μL。

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃，20s，50℃，20s，72℃，10min，30个循环；最后延伸72℃，10min。

利用PCR扩增目标质粒，以ddH2O作为阴性对照，将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若扩增出目的条带分子量大约在7.1kb，包括pET28a载体的长度和基因序列，则初步证明目的片段扩增成功。

扩增产物经Dpn1消化后，重组环化得到重组产物。将重组产物加入Escherichiacoli BL21(DE3)感受态细胞中，将EP管重置于冰中30min，然后放入42℃水浴热激45s，再放入冰中静置2min。每管加入900μLLB培养基，在37℃、180rpm摇床培养60min；然后2000xg离心4min，取850μL上清，将沉淀轻轻混匀，涂布在含有卡纳霉素100mg/L的LB平板上，在37℃恒温箱中培养10-12h。

阳性产物的筛选

将平板上长出的单菌落接种于含有50mg/L卡纳霉素的LB平板上，37℃培养5h，挑取单菌落测序，测序序列结果显示载入的F58Y-His片段长度为1218bp，且F58位编码核苷酸替换为ATA(编码Y)，表明1491H-F58Y-E339V构建成功。

取少量活化后菌液加入含有卡那霉素的10mLLB培养基中，生长10小时。收集试管培养基中的菌液，接种于1L的含卡纳霉素LB培养基中，生长5小时，OD600达0.6～0.8时加2％半乳糖进行诱导培养，18℃、180rpm诱导18h。用高速冷冻离心机(J-26XP，Beckman)，2000xg，4℃离心30min，收集诱导后的菌体。

将收集的菌体在液氮中速冻，解冻后加入35mL的Lysis buffer重悬，进行高压匀质离心(1100MPa，5min)至溶液变为透明状态为止，匀质结束后，15000rpm，4℃离心30min，收集破碎细胞后离心得到的上清。

准备His-标记蛋白纯化柱，超滤水，超纯水洗3遍，Lysis buffer缓冲液洗3次，将上清过His-标记蛋白纯化柱，流穿1次；用裂解缓冲液清洗His-标记蛋白纯化柱上的杂蛋白，每次40mL，洗1次；用洗脱缓冲液洗脱目的条带，获得纯化的1491H-F58Y-E339V，继而通过脱盐柱除去洗脱缓冲液中的咪唑。

所述的Lysis Buffer柱平衡缓冲液由以下部分组成：pH值为8.0的20mM Tris-HCl，300mM KCl，10％体积甘油。

所述裂解缓冲液由如下组分组成：pH值为8.0的10mM Tris-HCl，300mM KCl，20mM咪唑，10％体积甘油和1mM苯甲基磺酰氟；

所述洗脱缓冲液由如下组分组成：pH值为8.0的20mMTris-HCl，300mM KCl，200mM咪唑，10％体积甘油和1mM苯甲基磺酰氟。

采用BCA(Bicinchoninic Acid)法对通过镍柱纯化的1491H-F58Y-E339V洗脱液浓度进行测定，浓度为0.25mg/mL，共收集了40mL蛋白洗脱液，蛋白最终质量为10mg。出发菌液为2L，计算得到的甲硫氨酸裂解酶的得率大约为5mg/L。

实施例2：高效降解食品中甲硫氨酸的甲硫氨酸裂解酶在食品中的应用

经过比对，选定脱脂牛奶作为甲硫氨酸裂解酶食品添加的对象。以甲硫氨酸作为指标，检测甲硫氨酸降解酶1491H-F58Y-E339V降解牛奶中甲硫氨酸的效果，500μL酶促反应体系包括：0.3mg甲硫氨酸裂解酶1491H-F58Y-E339V，5μM PLP，含2.05μM甲硫氨酸的牛奶，反应体系置于65℃温度下反应60min。利用衍生法结合液相检测牛奶中的甲硫氨酸浓度的变化，牛奶中游离甲硫氨酸的氨基能与衍生剂2，4-二硝基氟苯(DNFB)避光反应生成一种稳定衍生物，在365nm波长下有强吸收，可被UV-HPLC检测到。检测方法为：反应后取出与DNFB避光条件下60℃水浴衍生60min，100μL反应体系，200μLDNFB衍生剂，200μLNa2CO3-NaHCO3(pH＝9.0)缓冲液；衍生反应结束后加入50μL10％乙酸，振荡混合，5600rpm离心5min，取上清液过滤检测。利用InertsilODS-3C18column(4.6mm×250mm×5μm)(GLSciencesLnc,Japan)对牛奶中甲硫氨酸浓度进行检测。检测条件为：流动相A(水：三氟乙酸＝999：1)，流动相B(乙腈：三氟乙酸＝999：1)；柱温和流速分别为室温和1mL/min；洗脱梯度：0-5min20％流动相B，5-20min梯度升到50％，20-34min保持50％，34-37min梯度升到100％流动相B，37-40min保持100％流动相B洗脱，40-42min梯度降到20％，保持4min。计算结果本发明制备的耦合高温高效降解牛奶中甲硫氨酸生成挥发性有机含硫化合物的转化率达89.09％，降解牛奶中甲硫氨酸的降解效率为5.6μMMET·h^-1·mg(protein)^-1。

由此可见，本发明的甲硫氨酸裂解酶1491H-F58Y-E339V能耦合65℃的高温，高效降解牛奶中的甲硫氨酸，60min降解牛奶中甲硫氨酸生成挥发性有机含硫化合物(VOSCs)的转化率达80％以上。

因此，本发明得到的甲硫氨酸裂解酶能耦合65℃高温高效降解食品中甲硫氨酸，是目前已报道的能降解食品中甲硫氨酸效率最高的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

序列表

<110> 湖北工业大学

<120> 一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1218

<212> DNA

<213> Tuber melanosporum

<400> 1

atgcaggaaa aagatgccag cagccagggt tttctgccgc attttcagca ttttgccacc 60

caggccattc atgttggcca ggatccggaa cagtggacca gccgcgcagt tgttccgccg 120

attagcctga gcaccacctt taaacagggt gcccctggtc agcattcagg ttttgaatat 180

agtcgtagcg gtaatccaac acgtaattgt ctggaaaaag cagtagcagc actggatggt 240

gcaaaatatt gtctggcctt tgcaagtggt ctggcagcaa ccgttacaat cacccatctg 300

ctgaaagcag gcgatcagat tatctgtatg gatgatgttt atggtggtac taatcgttat 360

tttcgtcagg tcgcatctga atttggtctg aaaatttcat ttgtggattg cagcaaaatc 420

aaactgctgg aagctgcaat taccccggaa acgaaactgg tgtggattga aaccccgact 480

aatccaaccc agaaagtgat tgatattgaa ggttgcgcac atattgttca taaacatggt 540

gatattatcc tggtagttga taatacattt atgagcccgt attttcagcg ccctctggca 600

ctgggcgccg atattagcat gtatagcgca accaaatata tgaatggtca ttcagatgtt 660

gtgatgggtc tggtgagtgt taattgtgaa agcctgcata atcgcctgcg ttttctgcag 720

aatagtctgg gtgcagttcc gtcaccgatt gattgttatc tgtgtaatcg tggtctgaaa 780

acactgcatg ttcgtatgga aaaacatttt aaaaacggta tggcagttgc acagtttctg 840

gaaagcaatc cgtgggttga aaaagttatt tatccgggtc tgccgtcaca tcctcagcat 900

gaactggtta aacgtcagtg cacaggttgc accggtatgg ttacatttta tattaaaggt 960

accctgcagc atgcagaaat ttttctgaaa aacctgaaac tgtttaccct ggcagaaagc 1020

ctgggtggtt ttgaaagtct ggcggaactg cctgcaatta tgacgcatgc aagcgttctg 1080

aaaaatgatc gtgatgttct gggtatttcc gatacactga ttcgtctgag cgttggtctg 1140

gaagatgaag aagatctgct ggaagatctg gatcaggcac tgaaagcagc acatcctccg 1200

agcggttctc atagctga 1218

<210> 2

<211> 405

<212> PRT

<213> Tuber melanosporum

<400> 2

Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln

1 5 10 15

His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp

20 25 30

Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys

35 40 45

Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Tyr Glu Tyr Ser Arg Ser Gly

50 55 60

Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly

65 70 75 80

Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr

85 90 95

Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp

100 105 110

Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe

115 120 125

Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu

130 135 140

Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr

145 150 155 160

Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val

165 170 175

His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser

180 185 190

Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr

195 200 205

Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu

210 215 220

Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln

225 230 235 240

Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn

245 250 255

Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn

260 265 270

Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys

275 280 285

Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys

290 295 300

Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly

305 310 315 320

Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr

325 330 335

Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala

340 345 350

Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly

355 360 365

Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu

370 375 380

Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro

385 390 395 400

Ser Gly Ser His Ser

405

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> Tuber melanosporum

<400> 3

cagcattcag gttatgaatt atagtcgtag cggtaatcca ac 42

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Tuber melanosporum

<400> 4

tcataacctg aatgctgacc aggggcaccc tg 32

Claims

1.一种甲硫氨酸裂解酶hCGL-1491H-F58Y-E339V的编码基因，其特征在于，hCGL-1491H-F58Y的cDNA序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸。

2.权利要求1所示的甲硫氨酸裂解酶的编码基因编码的甲硫氨酸裂解酶。

3.如权利要求2所述的甲硫氨酸裂解酶hCGL-1491H-F58Y-E339V，其特征在于，所述hCGL-1419H-F58Y甲硫氨酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种甲硫氨酸裂解酶的生物合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

合成如SEQ ID No.1所示的hCGL-1491H-F58Y序列；

基于所述hCGL-1491H-F58Y序列，突变Glu339为Val，得到hCGL-1491H-F58Y-E339V序列；

合成如SEQ ID No.3所示的上游引物和如SEQ ID No.4所示的下游引物，并组合所述hCGL-1419H-F58Y-E339V序列，得到重组序列；

将所述重组序列组装为表达载体；

表达所述表达载体，得到所述甲硫氨酸裂解酶。

5.如权利要求2至3任一项所述的甲硫氨酸裂解酶在降解食品中甲硫氨酸中的应用。

6.一种重组表达载体，其特征在于，含有如权利要求1所述的甲硫氨酸裂解酶的编码基因。

7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET28a-1419H-F58Y-E339V。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求1所述的甲硫氨酸裂解酶的编码基因。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌Escherichiacoli BL21。