CN106701629B

CN106701629B - 荧光假单胞菌、荧光假单胞菌脂肪酶lipasebj10及其应用

Info

Publication number: CN106701629B
Application number: CN201710020302.9A
Authority: CN
Inventors: 吕加平; 张维清; 逄晓阳; 张书文; 刘鹭; 芦晶
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date: 2017-01-12
Filing date: 2017-01-12
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2037-01-12
Also published as: CN106701629A

Abstract

本发明公开了荧光假单胞菌、荧光假单胞菌脂肪酶及其应用；具体为，一株荧光假单胞菌，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.13279，保藏日期为：2016年11月15日；本发明还公开了一种荧光假单胞菌的脂肪酶，其为自原料乳分离出的荧光假单胞菌BJ‑10中开发得到的一种新的脂肪酶；本发明还公开一种荧光假单胞菌脂肪酶基因，并通过生物工程技术构建了含有脂肪酶基因的重组表达载体和基因工程菌，经培养基因工程菌后获得脂肪酶；本发明还公开一种荧光假单胞菌脂肪酶在生产生物柴油、洗涤剂和酯交换等生产工艺中的应用。

Description

荧光假单胞菌、荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10及其应用

技术领域

本发明涉及生物化工和生物工程技术领域，特别涉及一种荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10及其应用。

背景技术

脂肪酶(lipase E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶(acylglycerolhydrolases)，是一类能催化脂肪酸甘油酯水解为甘油和脂肪酸的酶类(或者是此反应的逆反应)，广泛存在于原核生物和真核生物中，脂肪酶的活性中心通常具有Gly-X1-Ser-X2-Gly的五肽模型(除个别如枯草芽胞杆菌为Ala-X1-Ser-X2-Gly)。

脂肪酶的天然底物是甘油酯类,然而研究表明，脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的水解和合成之外，还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚合物的合成和药物的合成等，尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性，催化旋光异构体的拆分和手性药物的合成成为酶工程领域研究的新热点。

目前，脂肪酶已广泛用于多个工业领域，如在洗涤剂中加入少量的假单胞菌脂肪酶,能提高洗涤剂的去污能力并降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量,减少去污剂对环境的污染；废水处理时加入一定量的脂肪酶；可高效除去脂肪，减少废水处理的成本和降低二次污染。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种荧光假单胞菌；

本发明还有一个目的是提供一种荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10，其为自原料乳分离出的荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）BJ-10中开发得到的一种新的脂肪酶LIPASEBJ10；

本发明还有一个目的是提供一种荧光假单胞菌的脂肪酶基因lipaseBJ10，并通过生物工程技术构建了含有脂肪酶基因lipaseBJ10的重组表达载体和基因工程菌，经培养基因工程菌后获得脂肪酶LIPASEBJ10；

本发明还有一个目的是提供一种荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10在生产生物柴油、洗涤剂和酯交换等生产工艺中的应用。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种荧光假单胞菌的脂肪酶，其特征在于，该脂肪酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO :3 所示。

优选的是，所述脂肪酶的多核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示。

一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株含有表达如权利要求1所述的脂肪酶的质粒。

一种荧光假单胞菌的脂肪酶在催化生产生物柴油中的应用。

一株荧光假单胞菌，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No. 13279，保藏日期为：2016年11月15日，分类命名为：荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3号；编码所述荧光假单胞菌的 16S rRNA 的基因的多核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示。

一种荧光假单胞菌的脂肪酶LIPASEBJ10基因，该基因编码的氨基酸序列如 SEQID NO :3 所示。

优选的是，其中，所述荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10基因的多核苷酸序列如SEQID NO :2 所示。

如上述的基因编码的荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10。

一种基因工程菌株，所述基因工程菌株含有表达如上述的荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10的质粒。

优选的是，其中，所述质粒含有如上述的荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10基因和表达载体片段。

优选的是，其中，所述表达载体为pET-28b(+)载体。

优选的是，其中，所述基因工程菌株通过将如权利要求1或2所述的荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10基因构建重组表达质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)而获得。

优选的是，其中，所述重组表达质粒为pET-22b(+)-lipaseBJ10，其制备方法为将如权利要求1所述的荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10基因经Nde I和Xho I酶切，然后与同样经Nde I和Xho I酶切的pET-28b(+) 载体连接，筛选，即得到重组质粒pET-22b(+)-lipaseBJ10。

如上述的基因工程菌株在催化生产生物柴油中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供的荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10具有良好的稳定性，和耐热性能，在62.5℃热处理1小时，脂肪酶LIPASEBJ10酶活残留97.37%，62.5℃下的D值为72.5小时；其具有酯类水解活性，最适的作用温度为45℃，最适作用 pH 值为9.4；

本发明提供的脂肪酶及其编码基因在食品加工，医药化妆品制备以及洗涤行业具有重要的应用潜力；

另外，本发明提供的荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10可应用于生产洗涤剂或应用于废水处理，在生产洗涤剂时，将假单胞菌脂肪酶少量加入洗涤剂中后，能很大提高洗涤剂的去污能力并降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，减少去污剂对环境的污染；在废水处理时，加入一定量的脂肪酶，可高效除去脂肪，减少废水处理的成本和降低二次污染；

本发明提供的基因工程菌株还可用于催化生产生物柴油。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“表达载体”意指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、

终止子等），使目的基因能够表达的载体。如本申请中提及的表达载体pET-22b(+)是一个具有典型表达结构的大肠杆菌高效表达载体。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷(DNA)、核糖核苷或核糖核苷酸（RNA）及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992); Rossolini等人, Mol Cell. Probes8:91-98 (1994)）。

术语“氨基酸”意指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酵素和酶。不同的氨基酸脱水缩合形成肽（蛋白质的原始片段），是蛋白质生成的前体。

术语“蛋白”意指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。

术语“PCR”意指聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方．聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

术语“引物”意指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，

除非特定限制，否则所述术语涵盖自然中生物的DNA复制和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为DNA引物）。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。除非特定限制，否则上游引物为在DNA复制时，作为DNA模板3`端的复制起始点的引物，下游引物为在DNA复制时，作为DNA模板5`端的复制起始点的引物。

术语“缓冲液”意指一类当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化作用的溶液。

附图说明

图1为脂肪酶LIPASEBJ10最适pH和pH稳定性；

图2为脂肪酶LIPASEBJ10最适温度和温度稳定性；

图3为金属离子对脂肪酶LIPASEBJ10的抑制性，其中，1-氯化镁；2-氯化锂；3-锡（II）二水合物；4-硫酸钠5-氯化钾；6-铜硝酸盐；7-硫酸锌；8-氯化钙；9-氯化镉；10 - 氯化钡；11-六偏磷酸钠；12-乙二胺四乙酸（EDTA）；13-醋酸铅；14-氯化锰；

图4为有机试剂对脂肪酶LIPASEBJ10酶活性影响，其中，1-乙腈，2-1辛醇，3-四氢呋喃，4-异丙醇，5-二甲亚砜（DMSO），6-正丙醇，7-异戊醇，8-异丁醇，9- N-丁基醇；

图5为表面活性剂对脂肪酶LIPASEBJ10酶活性影响，其中，从左至右依次为：乳酸钠、Tween-20、Tween-80、液体石蜡、Trition X-100、阿拉伯胶、果胶、明胶、β-环糊精、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、CMC、猪胆酸钠、脱氧胆酸钠、PVA、PEG 6000、PEG 2000、PEG20000、干酪素、卡拉胶、结冷胶、海藻酸钠、酪蛋白酸钠；

图6为62.5℃热处理，脂肪酶LIPASEBJ10酶活残留率；

图7为脂肪酶LIPASEBJ10分离纯化SDS-Page电泳图，其中，1、2、3为细胞上清，4、5为亲和层析后蛋白样品。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明的脂肪酶基因lipaseBJ10来自于基因组测序的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）BJ-10，该菌保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

一株荧光假单胞菌，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.13279，保藏日期为：2016年11月15日，分类命名为：荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3号；编码所述荧光假单胞菌的 16S rRNA 的基因的多核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示。

荧光假单胞菌形态学特征为：直杆状，具有数根极生鞭毛，无芽孢，革兰氏染色阴性。

本发明提供一种荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10在生产生物柴油、洗涤剂和酯交换等生产工艺中的应用。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10基因，该基因编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO :3 所示。

在一个优选方案中，所述荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO :2 所示。

在上述方案中，带有荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10基因的是核酸分子，核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等，其多核苷酸序列均可通过与SEQ ID NO :2所示多核苷酸序列通过直接的或者间接的碱基互补配对原则获得。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

如上述的基因编码的荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10。

一种基因工程菌株，所述基因工程菌株含有表达如上述的脂肪酶的质粒。

在一个优选方案中，所述质粒含有如上述的荧光假单胞菌脂肪酶LIPASEBJ10基因和表达载体片段。

在一个优选方案中，所述表达载体为pET-28b(+)载体。

在一个优选方案中，所述基因工程菌株通过将如权利要求1或2所述的脂肪酶基因构建重组表达质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)而获得。

在一个优选方案中，所述重组表达质粒为pET-22b(+)-lipaseBJ10，其制备方法为将如权利要求1所述的脂肪酶基因经Nde I和Xho I酶切，然后与同样经Nde I和Xho I酶切的pET-28b(+) 载体连接，筛选，即得到重组质粒pET-22b(+)-lipaseBJ10。

在一个优选方案中，如上述的基因工程菌株在催化生产生物柴油中的应用。

实施例 1 ：脂肪酶基因lipaseBJ10引物设计及开放阅读框边界确定

提取荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）BJ-10的基因组DNA，经测序验证无误后，利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的脂肪酶基因，确定了其中脂肪酶基因lipase7的开放阅读框，通过信号分析工具 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，分析发现其中没有信号肽。其多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，全长为1848bp(从起始密码子到终止密码子 )，其编码的脂肪酶LIPASEBJ10的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，共 615个氨基酸。

根据分析得到的脂肪酶基因lipaseBJ10序列，设计引物如下：上游引物：

5′-ccgcatatgggtgtctacgacta-3′多核苷酸序列如SEQ ID NO.4，

下划线部分为 Nde I酶切位点；下游引物：5′-ccgctcgagggtaatcacaaacgcctccg-3′，多核苷酸序列如SEQ ID NO.5下划线部分为Xho I酶切位点。

实施例2：脂肪酶lipaseBJ10的克隆及载体构建

2.1 PCR扩增

将实施例1设计的引物 (上游引物：5′-ccgcatatgggtgtctacgacta-3′多核苷酸序列如SEQ ID NO.6，

下游引物：5′-ccgctcgagggtaatcacaaacgcctccg-3′) 多核苷酸序列如SEQ IDNO.7

送至北京六合华大基因科技股份有限公司合成引物，合成的引物使用TE稀释到10μM，提取荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）BJ-10的基因组DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：

表1 PCR 反应体系：

使用以下PCR扩增程序扩增脂肪酶基因lipaseBJ10：

1)预变性：98℃变性30S；

2)35个循环：

变性：98℃，10s;

退火：55～72℃，30s；

延伸：72℃，90s；

3)延伸：72℃，10min；冷却到4℃。

将PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察。回收2000bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。

2.2 酶切

将纯化回收的PCR产物使用以下体系进行双酶切，酶切时间30min。

酶切体系如下表2:

37℃酶切反应30min。酶切后纯化回收得到经过双酶切的PCR产物。

质粒pET-22b(+)的双酶切：挑取含有质粒pET-22b(+)的大肠杆菌 DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用Nde I和XhoI 按以下体系双酶切，酶切时间1h。

酶切体系如下表3：

37℃酶切反应30min。酶切后纯化回收得到经过双酶切的pET-22b(+)载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为NEB公司生产的高效限制性内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒为TIANgel Midi Purification Kit，质粒提取试剂盒为TIANprep Mini Plasmid Kit，操作方法按其使用说明书。

2.3 连接

将经过双酶切的PCR产物和pET-22b(+)载体按如下表4所示体系进行连接：

16℃，链接过夜。由此得到连接产物。连接使用的T4连接酶购自TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO.,LTD。

2.4 转化及筛选

取10μL连接产物于50μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴 30min，后于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm 转速下，孵育培养45min。取一定量的菌液涂布于含100μg/mL 氨苄青霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mL LB 培养基中过夜培养后提取质粒，进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

2.5 基因多核苷酸序列测定

将筛选的正确阳性克隆送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，测序结果与脂肪酶基因lipaseBJ10多核苷酸序列进行比对，确认是将脂肪酶基因lipaseBJ10(其多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)插入到 pET-22b(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有脂肪酶基因lipaseBJ10的 pET-22b(+) 质粒 (命名为pET-22b(+)-lipaseBJ10)，可用于进行下一步试验。

实施例3：脂肪酶基因lipaseBJ10在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达

3.1 转化

取实施例2中得到的pET-22b(+)-lipaseBJ10质粒0.5～1μL与50μL 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴 30min，于 42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL的LB液体培养基，37℃200rpm培养 45h。培养物离心后涂布含有100μg/mL的氨苄青霉素LB平板，培养过夜20h后挑选单菌。由此得到含有pET-22b(+)-lipaseBJ10的大肠杆菌BL21(DE3)。

转化使用的感受态大肠杆菌BL21(DE3)购自TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD

实施例 4 ：脂肪酶LIPASEBJ10的表达和纯化

4.1 蛋白诱导

含有pET-22b(+)-lipaseBJ10的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中37℃培养至OD600为0.5-1.0左右，加IPTG至浓度1.0mM，28℃培养20个小时。300mL菌液4000rpm，4℃离心30min，收集菌体，用PBS 缓冲液洗涤菌体2次；4000rpm，4℃离心30min收集菌体。用 30mL(50mM，pH7.4)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，冰浴超声400w，超声5s，暂停5s，破碎15min；4℃，12000rmp离心15min，收集上清。上清于-80℃冷冻过夜，冷冻干燥制备成酶粉。

4.2 脂肪酶的纯化

用镍离子亲和层析柱对步骤4.1中收集的上清进行纯化得纯化的脂肪酶LIPASEBJ10(图7)，纯化的蛋白大小约64kD，符合理论预期。

具体实施方案如下：

1)使用过5mM的咪唑冲洗5个柱体积；

2)20mM咪唑洗脱10个柱体积；

3)最后,使用500～1000mM咪唑洗脱5个柱体积，收集中间3.5mL。用脱盐柱Sephadex G-25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。

4.3 脂肪酶LIPASEBJ10酶活测定

脂肪酶LIPASEBJ10活力测定采用对硝基苯酚酯法，具体方法如下：

1)配制10mM 的对硝基苯酚酯；

2)在1mL反应体系中加入940μL Tris-HCl buffer(50mM,pH 8.0)，40μL 乙醇，10μL 脂肪酶LIPASEBJ10酶液；

3) 35℃，反应3～5min后，410nm波长下测定吸光度。

酶活单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μmol 对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位U。

实施例5：脂肪酶lipaseBJ10的酶学性质

5.1 最适pH和 pH 稳定性

配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表5所示，其浓度均为20mM：

表5不同缓冲体系的pH

pH	缓冲体系	pH	缓冲体系
				7.0	Tris/HCl	9.0	Glycine/NaOH
7.5	Tris/HCl	9.5	Glycine/NaOH
				8.0	Tris/HCl	10.0	Glycine/NaOH
8.5	Tris/HCl	10.5	Glycine/NaOH

按4.3中测定条件(以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物)，将所述的缓冲液(Tris-HClbuffer)按照表5中的缓冲溶液替换，测定不同pH的缓冲溶液中重组脂肪酶LIPASEBJ10的酶活力，结果说明(图1A)脂肪酶LIPASEBJ10酶活在Ph7.0-10.5的范围内都具有一定的活性，在pH为9.5时最大，以20mM Glycine/NaOH缓冲液为最佳。

过夜处理置于不同的缓冲液中的脂肪酶LIPASEBJ10，按4.3中测定条件(以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物)测定脂肪酶酶活，脂肪酶LIPASEBJ10酶活在pH为8.5缓冲液中稳定性最高(图1B)。

5.2 最适温度和温度稳定性

在pH9.5，20mM的Glycine/NaOH作为缓冲溶液，按 4.3 中的反应混合液(以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物)置于30～55℃1h后，加入等量的脂肪酶LIPASEBJ10在各自的温度下反应3～5min，410nm测定酶活。结果(图2A)说明，脂肪酶LIPASEBJ10最适反应温度在45℃，高于45℃酶活将会大大降低。

将脂肪酶LIPASEBJ10置于不同温度(30～55℃)预处理1h，于45℃下，pH9.5，20mMGlycine/NaOH的缓冲溶液中，按 4.3 测定方法(以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物)测定脂肪酶LIPASEBJ10酶活。结果(图2B)说明，脂肪酶 LIPASE7在35℃的稳定性最好，随着温度升高，稳定性稍微下降。

5.3 金属离子抑制

以20mM pH7.0 的Tris-HCl为溶剂配制不同金属离子溶液，每种金属离子浓度均为2mM，将脂肪酶LIPASEBJ10酶液在各种金属离子溶液中 37℃下处理1h；以不加金属离子的20mM、pH7.0的Tris-HCl溶液为空白对照。再按照 4.3 中的测定方法(以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物)测定酶活，结果见图3，Mg²⁺、Li²⁺、Sn²⁺、Na⁺、K⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺对脂肪酶LIPASEBJ10酶活有促进作用，其它金属离子对脂肪酶LIPASEBJ10活性均表现出抑制作用。

5.4 有机溶剂对脂肪酶活性的影响

将脂肪酶LIPASEBJ10加入到乙腈、辛醇、四氢呋喃、异丙醇、二甲亚砜（DMSO）、正丙醇、异戊醇、异丁醇、N-丁基醇9种有机溶剂溶液中处理12h(对照为蒸馏水，其他溶液的浓度为体积分数)。然后按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物)测定酶活。结果（图4）表明脂肪酶LIPASEBJ10在乙腈、辛醇和四氢呋喃中的酶活性最高。

5.5表面活性剂对脂肪酶活性的影响

将脂肪酶LIPASEBJ10加入到乳酸钠、Tween-20、Tween-80、液体石蜡、TritionX-100、阿拉伯胶、果胶、明胶、β-环糊精、十二烷基硫酸钠和十二烷基磺酸钠等23种表面活性剂中处理12h(对照为蒸馏水，其他溶液的浓度为体积分数)。然后按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物)测定酶活。结果如图5所示。

实施例6：脂肪酶lipaseBJ10的耐热性

将脂肪酶lipaseBJ10溶解在20mM Glycine/NaOH（pH9.5）缓冲溶液中， 62.5℃水浴处理一小时，每10分钟取样，然后按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物)测定酶活。结果（图6）所示，处理30min，脂肪酶lipaseBJ10的酶活依然残存98.94%，热处理1h，脂肪酶lipaseBJ10的酶活依然残存97.37%，说明脂肪酶lipaseBJ10的耐热性较强。

实施例7：脂肪酶lipaseBJ10催化合成生物柴油

实验按照以下步骤实施：

（1）取100g大豆油置于250ml的锥形瓶中，摇床中65℃、200r/min预处理5分钟，空白对照以100g蒸馏水代替大豆油；

（2）加入3.8g甲醇、2500U脂肪酶lipaseBJ10，摇床中65℃、200r/min处理150min；

（3）0.2g样品用蒸馏水定容到500ml；

（4）取（3）步骤中溶液25ml置于碘量瓶中，加入0.023mol/L的高碘酸钾25ml，静置120s；

（5）向碘量瓶中加入20%碘化钾溶液15ml，随后，用0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定，近终点时，加2-3ml淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失。

由于甘油产率等于原料的转化率，采用下式计算原料和产品中的甘油含量：

式中：（1）V₁-空白试样消耗硫代硫酸钠标准液体积，ml；

（2）V₂-试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml；

（3）c-硫代硫酸钠标准溶液浓度，mol/L；

（4）m_样-试样质量；

（5）E-甘油相对分子质量。

通过计算，大豆油的转化率为92.71%，转化率高、耐高温，适合用于生物柴油的生产。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

<110>中国农业科学院农产品加工研究所

<120>荧光假单胞菌脂肪酶及其应用

<160>7

<210>1

<211>1392

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>1

ccgaaggtta gactagctac ttctggtgca acccactccc atggtgtgac gggcggtgtg 60

tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcgac attctgattc gcgattacta gcgattccga 120

cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cggactacga tcggttttgt gggattagct 180

ccacctcgcg gcttggcaac cctctgtacc gaccattgta gcacgtgtgt agcccaggcc 240

gtaagggcca tgatgacttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct 300

ccttagagtg cccaccatta cgtgctggta actaaggaca agggttgcgc tcgttacggg 360

acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacagcca tgcagcacct gtctcaatgt 420

tcccgaaggc accaatctat ctctagaaag ttcattggat gtcaaggcct ggtaaggttc 480

ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattca 540

tttgagtttt aaccttgcgg ccgtactccc caggcggtca acttaatgcg ttagctgcgc 600

cactaagagc tcaaggctcc caacggctag ttgacatcgt ttacggcgtg gactaccagg 660

gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcacctcag tgtcagtatc agtccaggtg 720

gtcgccttcg ccactggtgt tccttcctat atctacgcat ttcaccgcta cacaggaaat 780

tccaccaccc tctaccatac tctagtcagt cagttttgaa tgcagttccc aggttgagcc 840

cggggatttc acatccaact taactaacca cctacgcgcg ctttacgccc agtaattccg 900

attaacgctt gcaccctctg tattaccgcg gctgctggca cagagttagc cggtgcttat 960

tctgtcggta acgtcaaaat tgcagagtat taatctacaa cccttcctcc caacttaaag 1020

tgctttacaa tccgaagacc ttcttcacac acgcggcatg gctggatcag gctttcgccc 1080

attgtccaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct ggaccgtgtc tcagttccag 1140

tgtgactgat catcctctca gaccagttac ggatcgtcgc cttggtgagc cattacccca 1200

ccaactagct aatccgacct aggctcatct gatagcgcaa ggcccgaagg tcccctgctt 1260

tctcccgtag gacgtatgcg gtattagcgt ccgtttccga acgttatccc ccactaccag 1320

gcagattcct aggcattact cacccgtccg ccgctctcaa gagaagcaag cttctctcta 1380

ccgctcgact gc 1392

<210>2

<211>1848

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>2

atgggtgtct acgactacaa aaaccttact accgaggact ccaaagcact gttcgccgat 60

gccatggcga tcacgttgta ctcctaccac aacctggata acggctttgc cgtgggctac 120

cagcagcatg gcctggggct tggcttgccg gtgaccctgg tgcaggcgtt gctgggcagc 180

gccgactccc agggcgtgat ccccggtatc ccatggaacc ccgactcgga aaaggccgcc 240

ctcgacgcgg tgcaaaaggc cggttggacc cccatcagtg ccagcaccct cgactacggc 300

ggcaaggtcg atgcccgggg caccttcttt ggtgagaaaa ccggctatac cagtgcccag 360

gtggaagtcc tgggcaaata cgatgacgcc ggcaaactgc tggaaatcgg catcgccttc 420

cgtggcacct cggggcccag ggagaacctg attgttgatt ccatcggcga tgtgatcagc 480

gacttgctgg cagccttcgg ccctgcggac tatgcgaaaa actacgcggg ccaggcgttt 540

ggcgacttgc tcggcaaagt cgccgcgtat gcccgcgcgc aggggctcag tggccaggat 600

gtactggtca gcggccatag cctcggtggc ctggcggtca acagcatggc cgacttgagc 660

aacaccacct gggcgggttt ctataaggac gccaactacg tggcctatgc ctcgccgacc 720

cagagcagcg gcgacaaggt gttgaacatc ggttatgaaa acgacccggt ctatcgcgcc 780

ctcgacggtt cgtcgttcaa cctgtcgtcc ctcggggtgc atgaccaacc gcatgcctcc 840

agcgccgata acatcgtcag cttcaacgac cactacgcct cgacgctctg gaacatcctg 900

ccgttttcca ttctcaacct gccgacgtgg atttcccatt tacccacggg ttatggcgat 960

ggcatgagcc gcatcctcga atccaagttc tatgacctga ccagccgtga ttcgacgatc 1020

atcgtcgcca atctgtcgga cccggcgcgc gccaacacct gggtgcagga cctcaaccgc 1080

aatgccgaag cccaccaggg cagtacgttc attatcggca gcgacggcaa tgacctgatc 1140

cagggtggcc ggggcaacga ctacctggaa ggtcgcgccg gcaacgatac cttccgtgat 1200

ggcggcggct acaacatcct gctgggcggc aaggggttca acaccctgga cttgcagcag 1260

tcgctgaaaa acgtcgaagt ggccaacgat ggcgcaggca ccctgtacat ccgcgacggc 1320

caaggcggta tcagcatgac ccgcgatatg ggcgcgatag tgagcaagga aagctatctg 1380

ttgctgttca gcaaagaggt gacccacagc gtgaccgaca aggggttgct ggcgggcaag 1440

gacctgaccg cctatgcggc gtcgctcaag ggcgatgccg gcgccaatgt tctcaaggcc 1500

ggcgatagcg ggcagtggtt gtttggcctg gacggcaatg accacctgat cggcggtaaa 1560

ggcaacgatg ttctggtggg cggggccggc aatgacctgc tggaagcggg tggcgggcgc 1620

aataccttcc tgttcgacgg cgacttcggc caggaccgga tcctgggcta ccagtcgacg 1680

gacaaattgg tatttatggg cgtggcgggg gtgggcgggc agtacaacta cctcgaccat 1740

gccaaggcag tgggcagcga tacgctgctg accttcggcg ataactcggt gacgctggtg 1800

ggggtagggc tgggcagcct gtcggcggag gcgtttgtga ttacctga 1848

<210>3

<211>615

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<400>3

Met Gly Val Tyr Asp Tyr Lys Asn Leu Thr Thr Glu Asp Ser Lys Ala

1 5 10 15

Leu Phe Ala Asp Ala Met Ala Ile Thr Leu Tyr Ser Tyr His Asn Leu

20 25 30

Asp Asn Gly Phe Ala Val Gly Tyr Gln Gln His Gly Leu Gly Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Val Thr Leu Val Gln Ala Leu Leu Gly Ser Ala Asp Ser Gln

50 55 60

Gly Val Ile Pro Gly Ile Pro Trp Asn Pro Asp Ser Glu Lys Ala Ala

65 70 75 80

Leu Asp Ala Val Gln Lys Ala Gly Trp Thr Pro Ile Ser Ala Ser Thr

85 90 95

Leu Asp Tyr Gly Gly Lys Val Asp Ala Arg Gly Thr Phe Phe Gly Glu

100 105 110

Lys Thr Gly Tyr Thr Ser Ala Gln Val Glu Val Leu Gly Lys Tyr Asp

115 120 125

Asp Ala Gly Lys Leu Leu Glu Ile Gly Ile Ala Phe Arg Gly Thr Ser

130 135 140

Gly Pro Arg Glu Asn Leu Ile Val Asp Ser Ile Gly Asp Val Ile Ser

145 150 155 160

Asp Leu Leu Ala Ala Phe Gly Pro Ala Asp Tyr Ala Lys Asn Tyr Ala

165 170 175

Gly Gln Ala Phe Gly Asp Leu Leu Gly Lys Val Ala Ala Tyr Ala Arg

180 185 190

Ala Gln Gly Leu Ser Gly Gln Asp Val Leu Val Ser Gly His Ser Leu

195 200 205

Gly Gly Leu Ala Val Asn Ser Met Ala Asp Leu Ser Asn Thr Thr Trp

210 215 220

Ala Gly Phe Tyr Lys Asp Ala Asn Tyr Val Ala Tyr Ala Ser Pro Thr

225 230 235 240

Gln Ser Ser Gly Asp Lys Val Leu Asn Ile Gly Tyr Glu Asn Asp Pro

245 250 255

Val Tyr Arg Ala Leu Asp Gly Ser Ser Phe Asn Leu Ser Ser Leu Gly

260 265 270

Val His Asp Gln Pro His Ala Ser Ser Ala Asp Asn Ile Val Ser Phe

275 280 285

Asn Asp His Tyr Ala Ser Thr Leu Trp Asn Ile Leu Pro Phe Ser Ile

290 295 300

Leu Asn Leu Pro Thr Trp Ile Ser His Leu Pro Thr Gly Tyr Gly Asp

305 310 315 320

Gly Met Ser Arg Ile Leu Glu Ser Lys Phe Tyr Asp Leu Thr Ser Arg

325 330 335

Asp Ser Thr Ile Ile Val Ala Asn Leu Ser Asp Pro Ala Arg Ala Asn

340 345 350

Thr Trp Val Gln Asp Leu Asn Arg Asn Ala Glu Ala His Gln Gly Ser

355 360 365

Thr Phe Ile Ile Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu Ile Gln Gly Gly Arg

370 375 380

Gly Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Arg Ala Gly Asn Asp Thr Phe Arg Asp

385 390 395 400

Gly Gly Gly Tyr Asn Ile Leu Leu Gly Gly Lys Gly Phe Asn Thr Leu

405 410 415

Asp Leu Gln Gln Ser Leu Lys Asn Val Glu Val Ala Asn Asp Gly Ala

420 425 430

Gly Thr Leu Tyr Ile Arg Asp Gly Gln Gly Gly Ile Ser Met Thr Arg

435 440 445

Asp Met Gly Ala Ile Val Ser Lys Glu Ser Tyr Leu Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Lys Glu Val Thr His Ser Val Thr Asp Lys Gly Leu Leu Ala Gly Lys

465 470 475 480

Asp Leu Thr Ala Tyr Ala Ala Ser Leu Lys Gly Asp Ala Gly Ala Asn

485 490 495

Val Leu Lys Ala Gly Asp Ser Gly Gln Trp Leu Phe Gly Leu Asp Gly

500 505 510

Asn Asp His Leu Ile Gly Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Val Gly Gly

515 520 525

Ala Gly Asn Asp Leu Leu Glu Ala Gly Gly Gly Arg Asn Thr Phe Leu

530 535 540

Phe Asp Gly Asp Phe Gly Gln Asp Arg Ile Leu Gly Tyr Gln Ser Thr

545 550 555 560

Asp Lys Leu Val Phe Met Gly Val Ala Gly Val Gly Gly Gln Tyr Asn

565 570 575

Tyr Leu Asp His Ala Lys Ala Val Gly Ser Asp Thr Leu Leu Thr Phe

580 585 590

Gly Asp Asn Ser Val Thr Leu Val Gly Val Gly Leu Gly Ser Leu Ser

595 600 605

Ala Glu Ala Phe Val Ile Thr

610 615

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>4

ccgcatatgg gtgtctacga cta 23

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>5

ccgctcgagg gtaatcacaa acgcctccg 29

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>6

ccgcatatgg gtgtctacga cta 23

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>7

ccgctcgagg gtaatcacaa acgcctccg 29

Claims

1.一种荧光假单胞菌的脂肪酶在催化生产生物柴油中的应用，其特征在于，该脂肪酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO :3 所示，催化温度为65℃。

2.如权利要求1所述的荧光假单胞菌的脂肪酶在催化生产生物柴油中的应用，其特征在于，所述脂肪酶的多核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示。