CN104328132B - 一种脂肪酶与其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂肪酶基因及其编码的脂肪酶蛋白，与该蛋白因具有水解油酯的性质而在工业化生产和药物合成领域的潜在应用。本发明以深海热液口来源样品Fosmid文库进行454测序后得到的Fosmid文库基因信息片段的注释信息为研究材料，从宏基因组文库筛选到对应脂肪酶的克隆子，并对该Fosmid克隆子进行鸟枪法结合引物步移法测序，得到一个编码脂肪酶的ORF，其基因序列如序列表中<1>序列所示。将脂肪酶目的基因插入载体pET‑32a(+)表达载体中，表达纯化得到该基因编码的多肽其成熟肽。其氨基酸序列如序列表中<2>序列所示。本发明的脂肪酶酶活性质研究表明，该脂肪酶具有较好的脂肪酶特性，在工业化生产和药物合成等许多领域具有潜在应用价值。

Description

一种脂肪酶与其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种脂肪酶与其编码基因及其应用。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)也称为三酰基甘油水解酶，是能催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的一类特殊酯键水解酶类，它广泛存在于原核生物(如细菌)和真核生物(如霉菌、哺乳动物、植物等)中。研究表明，除了能够催化甘油酯类化合物的水解和合成之外，它还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚合物的合成和药物的合成等，利用某些脂肪酶的立体专一性，还可以催化化学方法难以完成的旋光异构体的拆分和手性药物的合成。因而脂肪酶在食品和营养、日用化学工业、油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成、以及药物合成等许多领域得到广泛应用。近年来人们还用含有脂肪酶及其它成分的复合制剂处理海中的石油，使之快速降解为适合微生物的营养成分，随着酶工程的不断发展，脂肪酶的应用研究正日益丰富，利用其进行新应用领域的开发也正成为研究热点。

作为一种生物催化剂，周围环境(温度、pH、有机试剂等)对酶的活性影响很大，很多酶在一些比较苛刻的反映条件下(高温、低温或者强酸碱环境)均会失去活性，这就限制了其应用范围。为了适应更苛刻的工业生产环境需求，需要我们在尊重生物多样性的前提条件下，不断在环境中进行新的淀粉酶来源的探索。

深海热液口烟囱是通过来自地壳的熔浆与海水相互作用而形成的特殊的地质结构，该环境被认为与地球早期环境相似，为特异微生物群落的形成和演化提供了良好的环境和物质基础，使得群落显示出独特的极端环境耐受力，蕴藏了大量的生物活性物质。热液口微生物中具有很多特殊的基因和酶，在现代工业、医药、环保、材料、生物工程和国防等领域具有广阔的开发应用前景。又因其与地球上生命形成初期的环境又十分相似，因此热液口又被喻为是研究生命起源与进化的天然实验室。近年来宏基因组学技术体系的建立使从不可培养微生物样品中直接获得酶资源成为可能。

宏基因组学又叫环境基因组学或群体基因组学，是指特定环境中全部生物遗传物质的总和，利用现代基因组技术直接研究自然生态环境中的有机群落，而不需要分离、培养单一种类的微生物。宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，然后根据不同环境样品的特点和建库目的采取了一些特殊的步骤和策略。其中主要包括以下几个关键因素：DNA提取质量、克隆载体的选择、宿主菌的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于深海热液口的淀粉酶基因脂肪酶F_93_ORF6蛋白。

本发明的另一目的在于提供该F_93_ORF6蛋白的生产方法。

本发明还有一个目的在于提供上述F_93_ORF6基因编码的脂肪酶在工业化生产和药物合成等许多领域的应用。

本发明公开了一种脂肪酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

进一步地，本发明公开了用于所述的脂肪酶基因特异性扩增的引物，包括以下两条序列：

上游引物见序列表中SEQ ID No.3；

下游引物见序列表中SEQ ID No.4；

进一步地，本发明还公开了所述的脂肪酶基因编码的脂肪酶，其氨基酸序列序列表SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明还公开了一种重组表达载体，所述的表达载体含有权利要求1所述核苷酸序列。

进一步地，本发明还公开了一种表达工程菌，其携带有上述的表达载体。

进一步地，所述的表达工程菌，其具体为转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

本发明公开了一种脂肪酶基因F_93_ORF6，其核苷酸片段的序列具体为序列表SEQID NO.1所示。

具体地，本发明通过对深海热液口4143-1宏基因组数据分析发现，共有6条拼接序列与脂肪酶基因有较高的同源性，以这些宏基因组序列信息设计引物，对2880个克隆子进行两步法筛选，最后筛选得Fosmid克隆子F_93。

本发明对在蛋白活性实验显示活性的Fosmid克隆子F_93进行鸟枪法结合引物步移法测序。通过ORF预测软件ORF finder进行预测发现，该克隆子共包含16个ORF。其中ORF6与α/β脂肪水解酶类似，其氨基酸序列如序列表中<2>序列所示。具有典型的Family IV的脂肪酶一级结构的特征。

本发明设计了特异性引物，将扩增的F_93_ORF6基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a(+)，构建重组表达载体pET-32a(+)M-F_93，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。将转化的工程菌培养，IPTG诱导该F_93_ORF6蛋白表达，该F_93_ORF6蛋白是通过表达载体pET-32a(+)M-F_93在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的。菌液离心收集菌体，进行超声破碎，离心取上清采用亲和层析进行纯化，得到所述的目的F_93_ORF6蛋白。

为直观的看到F_93_ORF6蛋白的酶活作用，本发明进行了脂肪酶水解作用的验证。并对本发明的脂肪酶F_93_OFR6蛋白进行了初步的活性性质的研究。

相对于现有技术，本发明的F_93_ORF6脂肪酶蛋白37℃条件下，比活力为22.13U/mg，最适温度为30℃左右，10℃-40℃之间有较明显的酶活(60％以上)，在偏碱性条件下(pH7.5-9.0)酶活相对较高，最适pH为8.0为，碱性脂肪酶。该酶的特异性底物为短碳链长度的甘油酯，具有应用工业化生产和药物合成等许多领域的潜力。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为添加酶切位点后F_93_ORF6基因片段的PCR产物电泳结果。

1、2：F_93_ORF6基因PCR产物；M：DL2000bp的DNA分子量标准。

图2为重组表达质粒pET-32a(+)M-F_93的构建图

图3为脂肪酶的表达和纯化电泳图。

M：蛋白分子量标准；1：诱导前总细菌蛋白；2：IPTG诱导后总细菌蛋白；

3：IPTG诱导后总细菌蛋白超声沉淀；4：IPTG诱导后超声上清总细菌蛋白；

5：纯化后的融合蛋白BL21(DE3)-pET32a-93；

图4为融合蛋白BL21(DE3)-pET32a-93western blot纯化验证结果。

M：蛋白分子量标准；1、2：纯化后的融合蛋白BL21(DE3)-pET32a-93；

图5为不同稀释倍数的纯化酶液作用三丁酸甘油酯平板的水解圈,其中50mM Tris溶液作阴性对照

图6为对硝基苯酚标准曲线。

图7为pH对脂肪酶活性的影响。

图8为温度对脂肪酶活性的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一：含脂肪酶序列克隆子的筛选

先将深海热液口宏基因组序列与NCBI non-redundant database进行信息比对，查找出与脂肪酶基因相似的信息；再根据注释信息查找对应的序列信息，设计特异性引物，从文库中筛选对应的克隆子。为了提高筛选效率，我们将参与454测序的2880克隆分为30组，即每个96孔板制备成一个混合质粒样品，另外再制备一个由2880个克隆混合而成的质粒样品作为筛选时的阳性对照，就这样先以那30个混合样作为PCR扩增模板进行第一轮筛选，找到该基因序列所对应的混合样编号，再以对应编号的96孔板为模板做第二轮筛选，即可找到文库中对应的克隆子。

PCR筛选异性引物为：

CL4542Contig1_up:5’-GCGTTGGTGGTGATAGCGCGGGG-3’

CL4542Contig1_down:5’-TTAACAATTATTCACGCAATCAC-3’。

二：目的克隆子的鸟枪法测序及ORF的预测

对Fosmid克隆子F_93进行鸟枪法结合引物步移法测序，即先将鸟枪法测序所得序列利用TGICL软件进行拼接，对于拼接后序列两端设计引物进行步移法测序，直到不同拼接序列形成一条完整的序列。对Fosmid克隆子F_93测序结果显示，该克隆子插入片段为27086bp，G/C含量为40.19％，通过ORF预测软件ORF finder进行预测发现，该克隆子共包含16个ORF。

其中ORF6的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示，通过Blast预测注释与来自Psychrobacter sp.PRmf-1的α/β脂肪水解酶类似，全长1104bp，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2序列所示，成熟蛋白理论分子量为40.9kD，理论等电点为8.75。具有典型的Family IV的脂肪酶一级结构的特征，含有该家族脂肪酶特有的保守三联体催化活性中心。

三：重组深海热液口来源的脂肪酶基因F_93_ORF6表达质粒的构建

依据F_93_ORF6基因的两端序列合成一对引物，上游引物含BamHⅠ切割位点，下游引物含HindⅢ切割位点。

F_93_BamHⅠ_up:5’-CGCGGATCCATGAGCAAATTAACTG-3’(SEQ ID NO.3)

F_93_HindⅢ_down:5’-CCCAAGCTTAAAACCATTTTGTGCA-3’(SEQ ID NO.4)

用PCR的方法，从实施例一中的深海热液口宏基因组序列文库中扩增得到脂肪酶序列克隆子F_93_ORF6基因片断(含酶切位点)，长度为1104bp左右，与预期大小一致(图1)。将回收纯化的F_93_ORF6基因PCR产物，用Bam HI和HindⅢ酶切后，与同样用Bam HI和HindⅢ切开的线性化载体pET-32a(+)连接，如图2所示，构成含F_93_ORF6基因片段的表达载体pET-32a(+)M-F_93。对纯化后的pET-32a(+)M-F_93重组质粒用T7和T7t引物进行双向测序，其序列与合成的模板序列结果完全一致，并且读码框正确。

四：重组深海热液口来源的脂肪酶F_93_ORF6的表达

将测序正确的重组表达质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中构建成工程菌株。挑取单菌落接种于Amp⁺的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，作为种子菌。先用50％甘油进行保种，再取剩余菌液按1∶100体积比接种于新鲜的Amp⁺LB培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至OD600约为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于18℃诱导表达过夜。4℃、5000rpm离心10min，收菌，并预留1ml菌液用于SDS-PAGE分析。用预冷的TE缓冲液(pH8.0)洗涤菌体后，再用预冷的超声缓冲液重悬菌体。以300W的功率，冰浴下超声30min～1hr使细菌细胞破碎(时间长短由菌量决定)，4℃、12000rpm离心30min后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析检测重组蛋白质的表达情况，结果如图3所示。

五：重组深海热液口来源的脂肪酶F_93_ORF6的纯化

重组蛋白的纯化采用亲和层析进行纯化。采用Pharmacia公司

Ni²⁺-Chelating Sepharose Fast Flow填料，以Ni²⁺为配体进行纯化。

Ni²⁺-Chelating Sepharose亲和层析柱大小为(1.6cm×4cm)，整个操作过程维持2ml/min的恒定流速，采用Tris-HCl缓冲液系统。将超声后的离心上清上柱，用超声缓冲液液洗柱至紫外吸收值达到基线；用不同浓度的咪唑(50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、300mmol/L、500mmol/L)的50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH 8.0缓冲液进行洗脱，每个浓度的咪唑都洗至平台期，收集各个洗脱峰进12％SDS-PAGE检测，对相应的洗脱峰溶液进行浓缩，得纯化后的浓缩蛋白。纯化结果如图3所示。通过Western blot试验可验证此蛋白是否为我们所需的目的蛋白，以及经过镍柱纯化的回收样是否混有其他杂蛋白，如图4所示。

六：深海热液口来源的脂肪酶F_93_ORF6的水解作用

用灭菌的中枪头倒置，在三丁酸甘油酯琼脂平板上打出四个小孔，分别注入不稀释、稀释10倍、稀释100倍的纯化酶液50μl和50mM Tris缓冲液(pH 8.0)50μl，作为对照，37℃过夜，观察透明圈的大小。结果如图5所示。

七：深海热液口来源的脂肪酶F_93_ORF6酶活与比活力测定

酶活检测相关溶液如下：

(1)溶液A：3g Tris碱，溶于适量去离子水，用HCl调pH至8.5，定容至300ml，配制成50mM Trisl缓冲液(pH 8.0)。

(2)溶液B：称取2.09g的对硝基苯丁酸酯(pNPB)溶于100ml 50mM Tris缓冲液(pH8.0)，配制成10mM对硝基苯丁酸酯溶液，置于棕色试剂瓶内保存。

(3)1mM标准对硝基苯酚母液：称取0.0139g的对硝基苯酚(pNP)溶于100ml50mMTris缓冲液(pH 8.0)，置于棕色试剂瓶内保存。

(4)10％三氯乙酸溶液：称取10g三氯乙酸(TCA)溶于100ml去离子水，配制成10％(w/v)置于棕色试剂瓶内保存。

分别采用以下两种方法进行酶活力测定：

(1)分光光度法

取2个试管，分别为对照管和样品管。将两试管中各加入溶液A 800μl和底物溶液B100μl，37℃水浴保温5min，然后在对照管中加入灭活的纯化酶液(沸水浴煮沸10min)100μl，样品管中加入纯化酶液100μl，立即混匀计时，在37℃水浴中准确反应10min后加入1ml10％三氯乙酸溶液终止反应，在405nm分光光度计测定吸光值，每个样品重复三次，取平均值。

酶活力单位(1U)定义：在pH8.0，37℃条件下，以1hr内催化产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

(2)对硝基苯酚标准曲线的绘制

分别取0,25,50,75,100,125,150μl的对硝基苯酚母液(1mM)，用溶液A稀释至3ml，分别测定在405nm处的吸光值。如图6所示，以对硝基苯酚浓度为为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

根据以下标准曲线，脂肪酶纯化酶液酶活(EA)计算公式如下：

EA＝(OD405-0.026)×55.56×稀释倍数/反应时间

比活力＝EA/纯化酶液蛋白浓度

此发明中测得脂肪酶F_93_ORF6酶活为5.40U,比活力为22.13U/mg。

八：pH对深海热液口来源的脂肪酶F_93_ORF6活力的影响

分别用pH 5.0，6.0(乙酸钠缓冲液)，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5(Tris-HCl缓冲液)，9.0，9.5，10.5(Gly-NaOH缓冲液)的50mM缓冲液代替酶活测定体系中的溶液A，为减少纯化蛋白的使用量，反应体系由之前的1ml缩减为100μl(即溶液A 80μl、底物溶液B 10μl、纯化酶液10μl)，其它条件不变。酶-底物反应体系在37℃反应10min后加入100μl 10％三氯乙酸溶液终止反应测定吸光值，每个梯度重复三次，取平均值。以测得的最高酶活力为100％，其余所得酶活力折算成百分数，再对pH作图。结果如图7,实验结果表明，该脂肪酶在pH8.0时，反应酶活最高，高于或低于该pH时，酶活都有明显下降。在偏酸性缓冲液时(pH5.0-6.5)，酶活力相对较低，而在偏碱性条件下(pH7.5-9.0)酶活相对较高，说明该酶为碱性脂肪酶。

九：温度对深海热液口来源的脂肪酶F_93_ORF6活力的影响

酶作用最适温度：将溶液A与底物溶液B的混合物，分别置于4℃，16℃，25℃，30℃，40℃,50℃,60℃温度下冰浴或预热5min后，加入10μl纯化酶液，分别在相应温度下反应10min，测定各温度下的酶活力。以测得的最高酶活力为100％，其余所得酶活力折算成百分数，再对温度作图。结果如图8，实验结果表明，该脂肪酶的最适温度为30℃左右，10℃-40℃之间有较明显的酶活(60％以上)，当温度上升到40℃以上时，酶活力迅速下降。

十：金属离子及表面活性剂对深海热液口来源的脂肪酶F_93_ORF6活力的影响

将选择的金属离子及表面活性剂用反应缓冲液配制成一定的浓度，加入底物溶液B及纯化酶液，使金属离子及其它物质的最终浓度为1mM，分别在37℃水浴中保温5min后，反应10min后测定酶的残留酶活，其中以不加任何物质的酶活力为100％。所选金属离子分别为Mg²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、K⁺、Na⁺、Ca²⁺(MgCl₂、MgSO₄、CuSO₄、NiSO₄、MnCl₂、ZnCl₂、KCl、NaCl、CaCl₂)，其它化学物质如EDTA、SDS、Tween20、Tween80。

表1实验结果表明，Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺等重金属离子对酶活性均有不同程度的较强抑制作用，而EDTA可能由于它络和了溶液中脂肪酶辅助因子的缘故，也有很强的抑制作用，K⁺、Ca²⁺对脂肪酶活性有轻微的激活作用，其它金属离子对酶活性基本没有太大影响。

表1为金属离子对脂肪酶活性的影响。

表2结果所示，各种去污剂的加入均对脂肪酶的催化活性有强抑制作用，可能是它们的加入破坏了蛋白分子以及蛋白与其它物质之间的非共价键而使酶蛋白解聚变性。

表2为各种去污剂对脂肪酶活性的影响。

十一：深海热液口来源的脂肪酶F_93_ORF6底物种类的特异性

选择不同碳链长度的对硝基苯酯：对硝基苯丁酸酯(pNPB，C4)、对硝基苯辛酸酯(pNPC，C8)、对硝基苯月桂酸酯(pNPL，C12),均用50mM Tris缓冲液(pH 8.0)，配制成浓度为10mM作为反应体系中的B液，其它条件均相同，测定脂肪酶不同底物种类的特异性，以测得的最高酶活力为100％。

表3实验结果表明，对硝基苯丁酸酯(pNPB，C4)在该酶的作用下水解活性仍是最高，而当基质换为对硝基苯辛酸酯(pNPC，C8)和对硝基苯月桂酸酯(pNPL，C12)时，水解活性急剧下降，推测该酶的最适底物为短碳链长度的甘油三酯。

表3为脂肪酶的底物特异性研究。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种脂肪酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.用于权利要求1所述的脂肪酶基因特异性扩增的引物，包括以下两条序列：

上游引物见序列表中SEQ ID No.3；

下游引物见序列表中SEQ ID No.4。

3.权利要求1所述的脂肪酶基因编码的脂肪酶，其氨基酸序列序列表SEQ ID NO.2所示。

4.一种重组表达载体，所述的表达载体含有权利要求1所述核苷酸序列。

5.一种表达工程菌，其携带有权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达工程菌，其具体为转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。