CN105420211A - 一种嗜热酯酶afest突变体及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜热酯酶AFEST突变体，该嗜热酯酶AFEST突变体的氨基酸序列与野生型嗜热酯酶AFEST的氨基酸序列SEQ？ID？NO.2有1-5个氨基酸残基的不同；所述不同包括氨基酸的替换、缺失或者插入。进一步地，不同体现在L47R、S？111T、A166V或者D175V。本发明还保护一种编码该嗜热酯酶AFEST突变体的基因，包含该基因的重组载体，以及包含该基因的工程菌。本发明还公开了该嗜热酯酶AFEST突变体的筛选方法，和在水解短链羧酸酯底物中的应用。本发明的嗜热酯酶AFEST突变体对对硝基苯酚丁酸酯的水解活性提高了4倍以上，且保持了与野生型嗜热酯酶AFEST相当的热稳定性。

Description

一种嗜热酯酶AFEST突变体及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种嗜热酯酶AFEST突变体及其筛选方法和应用。
背景技术
酯酶(Esterase)是一种用途十分广泛的生物催化剂，不仅可催化各种酯类在水相中的水解，也能在非水相中催化酯的合成、转酯等反应，常被用于洗涤剂、造纸工业、食品、制药工业及生物能源等方面。然而，由于天然酶都是在体内比较温和的环境中发挥作用的，而工业应用过程要求酶在比较严苛的环境(如高温、极端酸碱度、有机溶剂、非天然底物、产物抑制等)中发挥作用，因此天然酶在应用中往往遇到稳定性差、催化效率低等问题。为此必须选择稳定性良好、催化效率高的酶来满足工业生产的要求。
来自嗜热古菌Archaeoglobusfulgidus(闪烁球菌)的嗜热酯酶(AFEST)是目前稳定性最好的酯酶之一，其最适催化温度高达80摄氏度(MancoG,GiosuèE,D'AuriaS,HermanP,CarreaG,RossiM.Cloning,overexpression,andpropertiesofanewthermophilicandthermostableesterasewithsequencesimilaritytohormone-sensitivelipasesubfamilyfromthearchaeonArchaeoglobusfulgidus.ArchBiochemBiophys.2000,373(1):182-92.)。除了良好的热稳定性，AFEST还具有非常广泛的底物谱，能够催化一系列不同碳链长度、不同化学结构的酯底物。作为极具工业应用潜力的酯酶，虽然AFEST对上述底物已有较高的催化活性，但如果能够进一步提高其活力，则可以降低酶用量，缩短反应时间，从而降低工业生产成本。
天然能够产生AFEST的原始菌种(如Archaeoglobusfulgidus)培养条件苛刻，利用发酵原始菌株获得目标酶较为困难。另外，野生型菌株产酶水平非常低。此外，野生型菌株所产的酶系复杂，无法直接应用，而且目的酶的纯化困难，难以直接应用。
定向进化是对酶进行分子改造，从而改善其各方面性质的有力工具(CarterPJ(2006)Potentantibodytherapeuticsbydesign.NatRevImmunol6:343–357.BershteinS,TawfikDS(2008)Advancesinlaboratoryevolutionofenzymes.CurrOpinChemBiol12:151–158.KeaslingJD(2008)Syntheticbiologyforsyntheticchemistry.ACSChemBiol,3:64–76.)，其原理是模拟自然界进化原理，在实验室中人工构建目的蛋白的基因突变库，再利用筛选手段挑选出其中符合预期性质的突变体。然而由于随机突变库中的阳性率非常低，因此常规的基于微孔板或底物平板的筛选方法由于通量低，费时费力，因而在定向进化筛选中往往不能得到良好效果。前期工作中我们建立了基于体外区室化-荧光激活细胞分选(IVC-FACS)技术的超高通量筛选方法，能够对酶突变体进行高效快速的筛选，其筛选通量可达每小时一百万个(FuqiangMa,YuanXie,ChenHuang,YanFeng,GuangyuYang.Animprovedsinglecellultrahighthroughputscreeningmethodbasedoninvitrocompartmentalization.PlosOne,2014,9(2):e89785.)。可以用于对AFEST随机突变库的高通量筛选，进而获得活性提高的阳性突变体。
大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等优点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。在前期工作中，发明人已成功将嗜热酯酶AFEST在大肠杆菌中进行了高效表达。本发明以大肠杆菌作为宿主细胞，利用定向进化及高通量筛选的方法，获得了活性显著提高、但仍保持很高热稳定性的嗜热酯酶AFEST突变体。
发明内容
鉴于现有技术上的缺陷，本发明要解决的技术问题是开发一种对短链酯底物催化活性提高的酯酶AFEST突变体，同时保持较高的热稳定性，以满足工业应用的需要。
具体要解决的技术问题是：
首先，通过基因工程的方法，将嗜热酯酶AFEST基因克隆至pET28a质粒，并在大肠杆菌表达系统中高效表达；
其次，是要构建大容量的AFEST基因随机突变库，然后用IVC-FACS技术进行高通量筛选，并鉴定出活性提高的阳性突变体，并通过测序技术鉴定出突变位点，确定其在晶体结构中的位置。
再次，对阳性突变体进行蛋白表达、动力学性质表征及热稳定性表征，评估其作为潜在工业酶的应用价值。
本发明公开了一种嗜热酯酶AFEST突变体，该嗜热酯酶AFEST突变体的氨基酸序列与野生型嗜热酯酶AFEST的氨基酸序列SEQIDNO.2有1-5个氨基酸残基的不同；不同包括氨基酸的替换、缺失或者插入。
进一步地，上述嗜热酯酶AFEST也可以是经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQIDNO.2所示蛋白具有相同功能的衍生蛋白。
进一步地，氨基酸替换位置为由SEQIDNO.2表示的野生型嗜热酯酶AFEST氨基酸序列的第47、111、166和/或175位。
进一步地，所述不同体现在L47R、S111T、A166V或者D175V。L47R、S111T、A166V、D175V分别表示：第47位亮氨酸(L)被精氨酸(R)替换的嗜热酯酶AFEST突变体，第111位丝氨酸(S)被苏氨酸(T)替换的嗜热酯酶AFEST突变体，第166位丙氨酸(A)被缬氨酸(V)替换的嗜热酯酶AFEST突变体，第175位天冬氨酸(D)被缬氨酸(V)替换的嗜热酯酶AFEST突变体。
本发明还保护一种编码如上所述的嗜热酯酶AFEST突变体的基因。
本发明还保护一种包含如上所述的嗜热酯酶AFEST突变体的基因的重组载体。
本发明还保护一种包含如上所述的嗜热酯酶AFEST突变体的基因的工程菌。
本发明还包含一种包含以上嗜热酯酶AFEST突变体的可溶性蛋白或者固定化酶。
本发明还公开了一种以上嗜热酯酶AFEST突变体的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一、通过易错PCR扩增SEQIDNO.1得到突变片段后双酶切，与经同样酶双酶切的质粒进行连接，得到AFEST突变库质粒，然后转化到宿主中，得到带AFEST突变库质粒的工程菌；其中突变率的高低通过调节易错PCR体系中的锰离子的浓度来实现；
步骤二、将带AFEST突变库质粒的工程菌用IVC-FACS方法进行高通量筛选，得到AFEST活性相比于野生型提高的阳性突变体。
IVC-FACS的具体方法见实施例4以及文献(FuqiangMa,YuanXie,ChenHuang,YanFeng,GuangyuYang.Animprovedsinglecellultrahighthroughputscreeningmethodbasedoninvitrocompartmentalization.PlosOne,2014,9(2):e89785.)。SEQIDNO.1是野生型嗜热酯酶AFEST的核苷酸序列，其包含在NCBI数据库的编号为CP006577.1的菌株ArchaeoglobusfulgidusDSM8774的全基因组中；SEQIDNO.2为对应的野生型嗜热酯酶AFEST的氨基酸序列，其在NCBI数据库中的编号是WP_010879212.1。
进一步地，步骤一中的质粒是pET28a；步骤一中的宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、酿酒酵母、曲霉菌中的一种或者几种；锰离子的浓度是0.2-0.8mM。
本发明所述的重组载体，应理解为现有技术中任意的基因的重组载体，例如各种质粒，即将酯酶AFEST突变体的突变基因导入能使该AFEST突变体稳定表达的DNA载体质粒。
进一步地，步骤一中的宿主包括微生物E.coliBL21(DE3)-CodonPlus。
进一步地，本发明提供了构建酯酶AFEST随机突变库并进行高通量筛选的一种方法，具体表现为通过易错PCR的方法在SEQIDNO.1上引入随机核苷酸突变，突变率通过PCR体系中的锰离子浓度控制。AFEST随机突变库片段通过酶切连接的方法克隆到表达载体pET-28a上，再用电击转化的方法转化入克隆宿主Escherichiacoli10G中，抽提突变库质粒，重新转化表达宿主EscherichiacoliBL21(DE3)-CodonPlus，经过复苏、培养、诱导表达后，用膜挤出方法将单细胞、细胞裂解试剂、荧光底物、反应缓冲液等包裹在水-油-水二级微液滴中，经过孵育反应后，将二级微液滴稀释100倍，进行流式细胞仪(FACS)检测并分选群体中荧光强度最高的1％的微液滴。收集到的分选组分经过PCR扩增其中的目的片段，通过酶切连接后再次克隆到表达载体pET-28a上，重新转化到表达宿主EscherichiacoliBL21(DE3)-CodonPlus中，复苏后涂布卡那霉素抗性平板，挑取克隆进行96孔板复筛，并用野生型AFEST作为阳性对照，筛选出活性提高的突变体。通过对阳性突变体进行序列测定，确定其氨基酸突变类型。
本发明还公开了一种以上嗜热酯酶AFEST突变体在水解短链羧酸酯底物中的应用。
进一步地，短链羧酸酯底物包括对硝基苯酚丁酸酯。
其有益效果是：
1、建立了嗜热酯酶AFEST的大容量随机突变库，库容量高达200万个突变体；采用IVC-FACS技术对突变库进行高通量筛选，其筛选通量可达每小时一百万个，大大缩短了筛选周期和筛选效率。
2、获得了对对硝基苯酚丁酸酯活性提高4倍以上的嗜热酯酶AFEST突变体，且保持了与野生型嗜热酯酶AFEST相当的热稳定性。
3、构建的高效表达的基因工程菌，其培养条件简单，培养周期短，目的蛋白的表达水平高，且纯化方便。
以上优点使得嗜热酯酶AFEST突变体在工业催化领域中的应用极具潜力。
附图说明
图1是嗜热酯酶AFEST晶体结构示意图及突变位点在结构上的分布。
图2是嗜热酯酶AFEST野生型及突变体的最适反应温度测定曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、引物合成：本发明中所使用的引物均由北京华大基因公司合成制备。
2、实验中所使用T4DNA连接酶等购自于NewEnglandBiolabs公司；PrimeSTARMaxPremix高保真酶购自TakaRa公司；DreamTaqDNA聚合酶以及所有限制性内切酶均购自于Thermo公司；使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自于Axygen公司。大肠杆菌BL21(DE3)-CodonPlus来自Stratagene公司。
实施例1野生型酯酶AFEST基因的克隆
野生型酯酶AFEST基因由北京华大基因公司合成，其序列为SEQIDNO.1。通过上游引物SEQIDNO.3：5’-CCGCGCGGCAGCcatATGCTTGATATGCCAATC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶NdeI识别位点)和下游引物SEQIDNO.4：5’-GAGCTCGAATTCggatccCTAGTCGAACACAAGAAGAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)扩增目的基因，该PCR反应使用Takara的PrimeSTARMax聚合酶，PCR反应条件为：98℃2min，然后98℃10sec，55℃15sec，72℃10sec，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到1kb大小的条带，与预期结果相符。DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NdeI和BamHI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET28a(Novagen)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)-CodonPlus感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明克隆的酯酶AFEST基因序列正确，且正确连入pET28a中，将该重组质粒命名为pET28a-AFEST。
实施例2AFEST的表达、纯化及活力测定
将甘油管中的工程菌按体积比1％接种到含100μg/mLKan的4mLLB培养基试管中，37℃220rpm培养12h。将该4mL菌液转接至含50μg/mLKan的1LLB培养基摇瓶中，37℃220rpm培养约2.5h，使OD600达到0.8左右，加入0.1mMIPTG诱导剂，25℃200rpm诱导培养12-16h。将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液超声破碎，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后就能得到95％以上纯度的目的蛋白。酯酶AFEST活性测定参见文献ArchBiochemBiophys.2000,373(1):182-92。
实施例3酯酶AFEST的大容量随机突变库的构建
通过易错PCR(ep-PCR)的方法构建AFEST的突变库，其中突变率的高低通过调节PCR体系中的锰离子的浓度来实现。易错PCR体系为：DreamTaqTM(0.05U/μL)及其buffer(Takara)，dATP(250μM)，dGTP(250μM),dCTP(1050μM)，dTTP(1050μM)，AFESTupper(0.4μM)，AFESTlower(0.4μM),AFEST-pET-28a质粒(0.2ng/μL)，氯化锰(0.2-0.8mM)。其中AFESTupper序列SEQIDNO.3为5’-CCGCGCGGCAGCcatATGCTTGATATGCCAATC-3’，AFESTlower序列SEQIDNO.4为5’-GAGCTCGAATTCggatccCTAGTCGAACACAAGAAGAG-3’。PCR体系分装为25μL每管进行易错PCR(95℃for3min,1cycle；95℃for15s/55℃for30s/72℃for1min,30cycles；72℃for5min,1cycle)。纯化的目的片段用NdeI和BamHIII进行双酶切，然后用T4连接酶克隆到载体pET28a上，再将纯化后的连接体系电转化到Escherichiacoli10G宿主中。转化细胞经复苏后接种到50mL的LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，在37℃培养过夜，取培养液提取质粒，得到突变库质粒；同时，取样涂布卡纳霉素抗性的琼脂糖平板，计算库容量约为200万个。同时取若干克隆测定突变率，发现锰离子浓度为0.6mM时，获得突变率大约为平均每个基因2个变氨基酸残基。突变库的质粒转化宿主EscherichiacoliBL21(DE3)-CodonPlus，经LB液体培养、诱导、表达后进行筛选。
实施例4AFEST随机突变库的IVC-FACS高通量筛选
表达酯酶AFEST突变库的EscherichiacoliBL21(DE3)-CodonPlus细胞被包裹入w/o/w二级微液滴进行酶反应。具体来说，采用微型膜挤出仪(AvantiPolarLipids,AL,USA)，配套的两只注射器(Gastight1001syringe，1mL,Hamilton,NV,USA)以及孔径为8微米的Track-Etch聚碳酸酯膜(Millipore,USA)来制备微液滴。首先将膜固定在膜挤出仪中，然后用注射器吸取0.5mL的油相(油相成分为，含有2.9％(v/v)ABILEM90的轻石蜡油)润洗膜两次。乳化时，将100μL内水相(EscherichiacoliBL21(DE3)-CodonPlus细胞悬液)与400μL油相吸取到同一支注射器中，混合体系经膜挤出仪推注到另一个注射器中，然后再推回到第一个注射器中，这一过程称为一次乳化。生成的w/o一级微液滴通过显微镜(50i,Nikon,Japan,40×object)实时观察，通过优化乳化次数，使微液滴的直径分布在3～5μm。制备的微液滴通过8-μm孔径的膜分散到次水相(1×PBS,pH7.4包含1％(v/v)TritonX-102)中，从而生成w/o/w二级微液滴。具体步骤为：将一片新的膜置于膜挤出仪中，用0.5mL次水相润洗两遍。将200μL的一级乳液和400μL的次水相分别吸取到两支注射器中，首先，将一级乳液通过膜挤出仪注入第二支注射器的次水相中，再通过膜挤出仪将混合体系推回原注射器中，完成一次乳化。生成的二级微液滴的形态分布通过显微镜进行实时观察，通过优化乳化次数，使得最终二级微液滴的直径在10μm左右且大小相对均一。在微液滴的外水相中加入荧光底物荧光素二丁酸酯(Sigma,10mMindimethylsulfoxide)，终浓度为0.5mM。反应体系在37℃，1000rpm金属浴上震荡孵育30min进行酶反应。
用分选型流式细胞仪(BDFACSAriaTMII)检测反应体系的荧光信号，喷嘴100μm，样品检测速度10000/sec具有最高荧光强度的液滴(约占含细胞液滴的0.1％)被分选入空的2-mLeppendorf管中，以此为模板将阳性基因进行PCR扩增，扩增PCR体系为：DreamTaqTM(0.05U/μL)及其buffer(Takara),dATP(250μM),dGTP(250μM),dCTP(250μM),dTTP(250μM),AFESTupper(0.4μM),AFESTlower(0.4μM),分选细胞(1000个细胞的分选后体积约为5μL)。PCR的条件为：95℃for3min,1cycle；95℃for15s/55℃for30s/72℃for1min,30cycles；72℃for5min,1cycle。PCR产物重新克隆到pET-28a(+)质粒，获得单克隆挑入96孔板中进行培养，每个孔含有200μLLB培养基，37℃，400rpm进行培养；当细胞OD600达到0.6-0.8时加入1.0mM的IPTG，25℃诱导20h。3000rpm，30min收获细胞，弃上清，细胞通过冻融裂解，裂解液加入200μL的PBS混匀，3000rpm，30min取上清，得粗酶液。取10μL粗酶液与10μL4-nitrophenylbutyrate(Sigma,10mMinacetonitrile)及180μLPBS在新的96孔板中反应(37℃，5min)，分光光度计在OD405检测不同克隆的酶活性。选择活性相比于野生型提高的突变体并进行测序。阳性突变体经大量培养表达后用镍柱亲和层析进行纯化，酶的动力学参数根据报道的方法测定(ArchBiochemBiophys373:182-192.)。测得4种优选突变体对对硝基苯酚丁酸酯的动力学参数及其与野生型AFEST的比较如表1所示。从表1中可以看出，4种优选突变体对对硝基苯酚丁酸酯的催化效率是野生型的4倍左右，其中S111T甚至超过5倍。
表1.AFEST野生型及突变体对对硝基苯酚丁酸酯底物的动力学参数a
aKM为米氏常数，等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，kcat为转化数，等于底物饱和情况下每个酶分子每秒钟催化反应的底物个数，kcat/KM为酶的催化效率。动力学参数在37℃下测定。
通过在不同温度测定突变体及野生型AFEST的比活力，发现突变体的最适温度与野生型AFEST一致，均为80℃，如图2所示。证明本发明所获得的突变体在催化活性提高的同时并未降低其热稳定性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种嗜热酯酶AFEST突变体，其特征在于，所述嗜热酯酶AFEST突变体的氨基酸序列与野生型嗜热酯酶AFEST的氨基酸序列SEQIDNO.2有1-5个氨基酸残基的不同；所述不同包括氨基酸的替换、缺失或者插入。
2.如权利要求1所述的嗜热酯酶AFEST突变体，其特征在于，所述不同体现在L47R、S111T、A166V或者D175V。
3.一种编码如权利要求1或2所述的嗜热酯酶AFEST突变体的基因。
4.一种包含如权利要求3所述的嗜热酯酶AFEST突变体的基因的重组载体。
5.一种包含如权利要求3所述的嗜热酯酶AFEST突变体的基因的工程菌。
6.一种包含权利要求1或2所述的嗜热酯酶AFEST突变体的可溶性蛋白或者固定化酶。
7.一种如权利要求1或2所述的嗜热酯酶AFEST突变体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、通过易错PCR扩增SEQIDNO.1得到突变片段后双酶切，与经同样酶双酶切的质粒进行连接，得到AFEST突变库质粒，然后转化到宿主中，得到带AFEST突变库质粒的工程菌；其中突变率的高低通过调节易错PCR体系中的锰离子的浓度来实现；
步骤二、将所述带AFEST突变库质粒的工程菌用IVC-FACS方法进行高通量筛选，得到AFEST活性相比于野生型提高的阳性突变体。
8.如权利要求7所述的嗜热酯酶AFEST突变体的筛选方法，其特征在于，所述步骤一中的质粒是pET28a；所述步骤一中的宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、酿酒酵母、曲霉菌中的一种或者几种；所述锰离子的浓度是0.2-0.8mM。
9.一种如权利要求1或2所述的嗜热酯酶AFEST突变体在水解短链羧酸酯底物中的应用。
10.如权利要求9所述的嗜热酯酶AFEST突变体在水解短链羧酸酯底物中的应用，其特征在于，所述短链羧酸酯底物包括对硝基苯酚丁酸酯。
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Application publication date: 20160323

Assignee: Yichang Hanzhi Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: WUHAN NEW BIOCALYSIS SOLUTION Co.,Ltd.

Contract record no.: X2022420000012

Denomination of invention: A thermophilic esterase AFEST mutant and its screening method and Application

Granted publication date: 20190101

License type: Common License

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