CN101979589A - 类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因克隆及蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了1个克隆自辣椒疫霉菌的类单胺氧化酶C类脱水酶(MaoC-like dehydratase，MaoC)基因MaoC及其蛋白质制作技术，以及应用该基因编码的类单胺氧化酶C类脱水酶在制备生物降解物质聚羟基脂肪酸酯上的应用，该基因有897个碱基，编码一种含有298个氨基酸的蛋白质，分子量为33kDa，无信号肽序列，无内含子。

Description

类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因克隆及蛋白的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因的分离及其编码的蛋白质制备方法，以及其在制备生物降解物质聚羟基脂肪酸酯上的应用。

背景技术

在过去的50年内，石油化工塑料已是应用最多的材料，主要是因为这类塑料具有多种结构、多种性能，且原材料价格低廉。目前这类塑料产量年增长速度为9.9％，但给人类带来了重要的的“能源问题”和“环境问题”。

生物降解塑料是近些年发展起来的被全球公认的一种真正绿色环保塑料，易于被环境中的有机物质代降解，从根本上解决“白色污染”问题。目前全球研发的生物降解塑料品种已有几十种，其中聚羟基脂肪酸酯(PHA)是其中最为活跃的研究热点。PHA作为一种“生物可降解塑料”除用于环境友好型包装之外，还可用与热敏胶、压敏胶和水溶胶及拉成纤维等。此外，基于PHA具生物可降解和生物相容性，PHA可作为医用植入材料和可控药物缓释载体，PHA的寡聚物可作为酮体供体的营养添加剂，PHA的手性单体作为药物或手性合成的中间体，PHA膜蛋白可用于某些微量蛋白的分离；PHA合成基因还可用于调节微生物的新陈代谢，调节微生物于逆境条件下的生存能力，由此可用于改造工业微生物菌株，提高微生物发酵的效率等。作为生态环境友好型塑料，PHA是最具环保和最具发展前景的绿色塑料之一，该类塑料的不断开发和应用领域的不断拓宽将会给人类生活带来极其深远的影响。

PHA的生物合成是一个受多种酶参与催化、由不同的代谢途径控制的复杂过程。PHA合成需要β-酮基硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHA聚合酶。此外，(R)-专一的烯酰辅酶A水合酶(PhaJ)能通过脂肪酸的β-氧化提供合成PHA的前体物，它的使用为脂肪酸在重组菌株中合成PHA提供了有力的工具。

发明内容

基于上述的原因，本发明提供了1个克隆自辣椒疫霉菌的类单胺氧化酶C类脱水酶(MaoC-like dehydratase，MaoC)基因MaoC及其蛋白质制作技术，以及应用该基因编码的类单胺氧化酶C类脱水酶在制备生物降解物质聚羟基脂肪酸酯上的应用，该基因有897个碱基，编码一种含有298个氨基酸的蛋白质，分子量为33kDa，无信号肽序列，无内含子，通过特异性酶活测定实验，证明了该基因编码的蛋白质具有合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的生物活性，酶活力达到58.1U/mg。因此，该基因可有效合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)，为进一步应用可生物降解物质即绿色塑料聚羟基脂肪酸酯(PHA)提供了一定的技术储备。

本发明所提供的类单胺氧化酶C类脱水酶基因，其特征在于：其基因序列如Seq ID No：1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

该基因有897个碱基，编码一种含有298个氨基酸的蛋白质，分子量为33kDa，无信号肽序列，无内含子。

类单胺氧化酶C类脱水酶(MaoC-like dehydratase，MaoC)是最近发现的一种新乙酰辅酶A脱水酶(Enoyl-CoA hydratase)，该酶在脂肪酸β-氧化至PHA的合成过程中提供(R)-专一的羟烷基辅酶A(R-3-hydroxyacyl-CoA)。MaoC已经被证明对底物巴豆酰辅酶A(Crotonyl-CoA)具烯醇基辅酶A水解酶(Enoyl-CoA)的活性。MaoC因具乙酰辅酶A脱水酶(Enoyl-CoA hydratase)活性而成为与PHA合成相关的众多酶类成员之一。

而本发明所提供的MaoC基因与JGI(jgi/phycaf7/20609)中的辣椒疫霉全基因组序列中的MaoC基因氨基酸序列比对，同源性达99.33％，核苷酸序列有14个碱基的差异，氨基酸序列有2个氨基酸的差异，这种差异与菌株来源的不同有关，因此本发明所分离获得的MaoC基因是一个新的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因，本发明提供的有关MaoC基因具有聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶功能特性的信息具鲜明的原创性。

为了能够更好的将其应用，发明人提供了一种制备本发明所述MaoC基因及蛋白的分离制备方法

1、基因克隆具体步骤：

A：采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因组DNA，备用；

B：根据2008年由美国能源部基因研究所(U.S.Department of Energy Joint GenomeInstitute--DOE JGI)公布的辣椒疫霉全基因组草图序列，经生物信息学分析获得目的基因(MaoC)序列，设计特异引物(其序列如Seq ID No：3及Seq ID No：4所示)经PCR克隆获得基因全长；

2、制备蛋白质及酶活测定步骤：

A：MaoC基因原核表达载体构建，目的基因克隆至pET28a(+)载体中；

B：将上述重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli(BL21(DE3))感受态细胞，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)诱导表达；

C：表达产物酶活检测、SDS-GAGE分析及纯化。

本发明所用的载体和宿主菌均常见，pET28a(+)为MaoC基因表达载体，E.coli BL21(DE3)为该基因的表达宿主菌。其中由于BL21(DE3)是本领域的惯常写法，因此在权利要求中未对(DE3)中的括号进行删除，以免造成指代不明确，

通过上述方法克隆的基因及其制备的蛋白质，为研究该类基因的功能及其编码的蛋白质酶活，乃至为聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成提供了一个重要基因及其操作技术，为了验证其性质，发明人对该基因编码的蛋白质酶活进行了测定，其方法如下：

MaoC酶活测定是通过测定对底物巴豆酰辅酶A(Crotonyl-CoA)的水解程度，测定底物的消耗量即263nm波长下紫外吸收值的降低值，活力单位定义为每分钟消耗1u molcrotonyl-CoA所需的蛋白酶液量(mg)，蛋白酶液浓度测定采用Bradford法。经过这种方法的检测，结果证明酶活力达到58.1U/mg，证实了其可以对对底物巴豆酰辅酶A(Crotonyl-CoA)具烯醇基辅酶A水解酶(Enoyl-CoA)的活性，进而可以作为成为与聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)合成相关的众多酶类成员。基于这种原因，发明人将其应用于PHA的生物合成。

综上所述，本发明提供1个克隆自辣椒疫霉菌的类单胺氧化酶C类脱水酶(MaoC-likedehydratase)基因MaoC及其蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白水平，通过特异性酶活测定实验，证明了该基因编码的蛋白质具有合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的生物活性，酶活力达到58.1U/mg。因此，该基因可有效合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)，为进一步应用可生物降解物质即绿色塑料聚羟基脂肪酸酯(PHA)提供了一定的技术储备。

附图说明

图1.MaoC基因重组表达载体示意图

图中Kan为卡那抗性，MCS为多克隆位点，BamH I和EcoR I为双酶切位点，MaoC为目的基因；

图2.MaoC基因PCR扩增示意图

图中1为核酸Marker；2为扩增出的MaoC基因；

图3.MaoC原核表达诱导蛋白示意图

图中1为pET28a(+)-MaoC重组菌IPTG诱导前；2-7为pET28a(+)-MaoC重组菌IPTG诱导后，诱导出36KDa大小的目的蛋白；8为标准蛋白Marker；

图4.MaoC原核表达产物纯化示意图

图中1为MaoC诱导前阴性对照；2为MaoC诱导后蛋白液超声后上清；3为MaoC诱导后蛋白液超声后沉淀；4为Ni-NTA亲和纯化后穿过液；5为纯化后的洗脱蛋白；6为标准蛋白Marker。

具体实施方式

本发明所提供的实施例，均按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J等(Blac-kwe11科学出版社，1988)所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1(基因克隆及测序)

根据2008年由美国能源部基因研究所(U.S.Department of Energy Joint GenomeInstitute--DOE JGI)公布的辣椒疫霉全基因组草图序列，经生物信息学分析获得目的基因(MaoC)序列，设计特异引物(其序列如Seq ID No：3及Seq ID No：4所示)，以辣椒疫霉基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增步骤如下：

PCR反应程序为：95℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

反应体系为：ddH₂O(32.5μL)，10×buffer(5μL)，MgCL₂(4μL)，dNTP(4μL)，MaoC-F(1μL)，MaoC-R(1μL)，DNA(2μL)，TaqE(0.5μL)。

取10μL反应产物电泳，确定含有目基因单克隆，送上海博亚生物有限公司测序。测序结果与辣椒疫霉基因组全序列中的MaoC序列比对，确定目的基因。根据基因全长序列推测获得相应的氨基酸序列。

实施列2(基因表达)

提取表达载体pET28a(+)质粒备用；经PCR扩增后的基因通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收后待用。

将基因和载体质粒进行双酶切，酶切体系为：

混合后于37℃水浴酶切4小时以上，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收，待用。

基因和载体进行连接转化：

酶切后pET-28a(+)                1-3μL

酶切后MaoC基因                  5-7μL

Solution I                        1μL

                                              

Total                            10μL

于16℃水浴反应4小时后进行连接。

连接步骤：

取连接产物10μL加入到100μLDH5α感受态细胞中，放入42℃水浴中热激90sec，快速放入冰水中2min；加入800μL不含抗性LB培养基，37℃水浴1h以上；12000转/分离心2min，吸弃大部分上清培养基，剩余约100μL吹打悬浮沉淀；涂布含有卡那抗生素的LB琼脂平板，倒置平板37℃培养过夜。

重组质粒鉴定

从每一个培养平板上分别挑出五个菌落，接入5ml的LB培养基中，培养过夜，提取质粒备用。

PCR鉴定：取1μL质粒按前述基因扩增体系和步骤进行PCR，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。

双酶切鉴定：按前述载体双酶切体系和步骤，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。

测序鉴定：将PCR扩增产物和阳性菌落扩大培养后提取的质粒送测序公司测序检测。

目的蛋白试表达：

将阳性重组质粒转化表达宿主BL21(DE3)，涂于卡那抗性平板。

(1)从LB平板上分别挑取5个单克隆菌落，接入5ml LB(50mg/L Kan)的15ml离心管中，于37℃震荡培养OD值至0.6-0.8之间。

(2)每一个试管各取500μL菌液和15％的甘油1∶1(V/V)混合后装至灭菌冻存管中，-80℃保存。

(3)每一个试管中取500μL菌液，做为诱导前对照。

(4)每一个试管中加入5μL IPTG(终浓度为1mM/L)，37℃200rpm诱导表达4个小时。

(5)诱导结束后分别取500μL的菌液，与诱导前菌液共离心，12000rpm，2分钟。

(6)弃掉上清，分别加入10μL 5×样品缓冲液，于100℃加热5分钟变性，上样前离心，12000rpm，5分钟。

(7)15％SDS-PAGE电泳分析表达结果。

蛋白表达条件优化：

在确定蛋白正常重组表达后，其可溶性越高，越利于纯化和后续研究。为了优化高效表达条件，在温度、诱导剂剂量、时间等进行优化筛选，确定最佳表达条件。具体操作为：

a.分别取5个含100ml LB(100mg/ml AMP)的250ml锥形瓶，编号1-5，然后分别加入重组的MaoC-28a菌液1ml，37℃，200rpm振荡培养；

b.至菌液OD600约为0.6-0.8，对1-5号锥形瓶分别进行条件筛选

I.IPTG浓度和诱导时间不变，筛选适宜的诱导表达温度(依次为37℃、30℃、25℃、20℃、16℃)；

II.诱导温度和时间不变，筛选适宜的诱导剂浓度(IPTG浓度依次为0.2mM/L、0.4mM/L、0.6mM/L、0.8mM/L、1.0mM/L)；

III.诱导温度和IPTG浓度不变，筛选适宜的诱导时间(依次为1h，2h，4h，8h，16h)；

c.诱导后离心，4℃，5000rpm，6min，弃上清。

d.每100ml培养细胞沉淀，悬于10ml预冷的重悬液中，4℃下超声波进行细胞破碎(600W，每20sec间隔10sec共10次)，破碎后离心，4℃、15000rpm，30min。

e.1-5号样品分别取上清、沉淀，加入10μL的5×样品缓冲液，于100℃加热5分钟变性，上样前离心，12000rpm，5分钟。

f.15％SDS-PAGE电泳分析，确定可溶性蛋白表达的最佳条件。

通过对不同诱导温度、时间及诱导剂浓度等条件优化，结果于16℃，IPTG终浓度1mM/L，16h下，于pH8.5Buffer中，破菌后的上清液中MaoC可溶性蛋白表达量较高，后续大量蛋白诱导可依照此条件进行。

表达蛋白的大量表达：

挑取阳性克隆，接种至含50mg/L卡那霉素的10ml LB培养基中，37℃震荡培养过夜至OD600＝0.6-0.8，然后按1∶100接种至含50mg/L卡那霉素的1L LB培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.6-0.8。按照前述优化的表达条件进行，即冷却至16℃后，添加IPTG至1mM/L，培养16h，然后5000rpm，离心6分钟收集菌体，待用。

实施列3(蛋白纯化)

取MaoC菌液50ml，加入5ml甘油，20μLβ-巯基乙醇，250μL吐温-20，超声波破碎仪冰水浴下于300W条件下超声30分钟(超声3s间歇3s)后，菌液15000rpm离心20分钟，吸取上清待用，上清液及沉淀分别SDS-PAGE分析，确定目的蛋白以可溶的方式存在于上清液中。

取3ml Ni-NTA凝胶树脂加至纯化柱中，用重悬液(20mM Tris，150mM NaCl，pH8.5)冲洗2-5个柱体积，将超声破碎菌离心后的上清液过纯化柱3次以上，再进行洗杂。先用基本洗杂液WB I(20mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，pH8.5)洗杂200ml左右，然后依次用WB II(20mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，1％Tween-20，pH8.5)、WBIII(20mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，1M Urea，pH8.5)、WBIV(20mM Tris，150mMNaCl，40mM Imidazole，pH8.5)分别洗杂100ml左右，最后用洗脱液(20mM Tris，150mMNaCl，200mM Imidazole，pH8.5)洗脱10ml左右，SDS-PAGE分析，结果蛋白纯度达95％以上。浓度用Bradford方法测定，浓度为5.351mg/ml。

实施列4(酶活测定)

乙酰辅酶A脱水酶(Enoyl-CoA hydratase)是一种已经被证实的与聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxya lkanoate，PHA)合成相关的众多酶类的一员，对该酶活性的检测即是通过测定对底物巴豆酰辅酶A(Crotonyl-CoA)的水解程度。MaoC在本实施例中被证实具有类似于乙酰辅酶A脱水酶(Enoyl-CoA hydratase)的酶活特性，即MaoC是一种与聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxya lkanoate，PHA)合成相关的众多酶类的一员。具体如下：

MaoC酶活测定是通过测定对底物巴豆酰辅酶A(Crotonyl-CoA)的水解程度，测定底物的消耗量，即263nm波长下紫外吸收值的降低值，活力单位定义为每分钟消耗1u molcrotonyl-CoA所需蛋白酶液的量(mg)。具体步骤为：

取10μL MaoC蛋白酶液，加入90μL 50mM Tris(pH8.0)、0.25mM Crotonyl-CoA(巴豆酰辅酶A)，30℃反应5分钟后，测OD263nm下吸光值的减少量，煮沸灭活的蛋白酶液做阴性对照，不加蛋白酶液的做阳性对照，测吸光值所用的比色皿厚度为1cm。

经重复测定，最终计算出的MaoC酶活为58.1U/mg，证实了MaoC是一种与聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)合成相关的众多酶类的一员。

Claims (3)

1.类单胺氧化酶C类脱水酶基因，其特征在于：其基因序列如Seq ID No：1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述类单胺氧化酶C类脱水酶基因分离克隆及其蛋白质制备方法，其步骤如下：

1)MaoC基因分离克隆的具体步骤：

A：采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因组DNA，备用；

B：根据已公布的辣椒疫霉全基因组草图序列，经生物信息学分析获得目的基因MaoC的序列，设计特异引物，其序列如Seq ID No：3及Seq ID No：4所示，经PCR克隆得到MaoC基因全长序列；

2)制备蛋白质的具体步骤：

A：将MaoC基因原核表达载体构建，目的基因克隆至pET28a(+)表达载体中；

B：将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达。；

C：表达产物酶活性检测、SDS-GAGE分析及纯化。

3.类单胺氧化酶C类脱水酶基因，应用于制备生物降解物质聚羟基脂肪酸酯。

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