CN103589708B - 一种隶属于r型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用 - Google Patents

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CN103589708B CN201310091588.1A CN201310091588A CN103589708B CN 103589708 B CN103589708 B CN 103589708B CN 201310091588 A CN201310091588 A CN 201310091588A CN 103589708 B CN103589708 B CN 103589708B
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Abstract

本发明公开了一种隶属于R型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用。本发明所提供的隶属于R型水合酶的基因片段编码的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有水解巴豆酰辅酶A活性的由序列2衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的MaoC-Del63-88蛋白对于底物巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）具乙酰辅酶A水合酶活性，其酶活达126.7U/mg，显著高于原始MaoC蛋白的酶活（58.1U/mg）。本发明所提供的MaoC-Del63-88蛋白及其编码基因可用于有效合成聚羟基脂肪酸酯（PHA），为进一步应用绿色塑料聚羟基脂肪酸酯（PHA）提供了一定的技术储备。

Description

一种隶属于R型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种隶属于R型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用，特别涉及一种隶属于R型水合酶的基因片段MaoC-Del63-88及其编码蛋白与应用。
背景技术
在过去的50年内，石油化工塑料已是应用最多的材料，主要是因为这类塑料具有多种结构、多种性能，且原材料价格低廉。目前这类塑料产量年增长速度为9.9%，但给人类带来了严峻的“能源问题”和“环境问题”。
生物降解塑料是近些年发展起来的被全球公认的一种真正绿色环保塑料，易于被环境中的有机物质降解，从根本上解决“白色污染”问题。目前全球研发的生物降解塑料品种已有几十种，其中聚羟基脂肪酸酯（PHA）是其中最为活跃的研究热点。PHA作为一种“生物可降解塑料”除用于环境友好型包装之外，还可用于热敏胶、压敏胶和水溶胶及拉成纤维等。此外，基于PHA具生物可降解和生物相容性，PHA可作为医用植入材料和可控药物缓释载体，PHA的寡聚物可作为酮体供体的营养添加剂，PHA的手性单体作为药物或手性合成的中间体，PHA膜蛋白可用于某些微量蛋白的分离；PHA合成基因还可用于调节微生物的新陈代谢，调节微生物于逆境条件下的生存能力，由此可用于改造工业微生物菌株，提高微生物发酵的效率等。
PHA的生物合成是一个受多种酶参与催化、由不同的代谢途径控制的复杂过程。PHA合成需要β-酮基硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHA聚合酶等。此外，(R)-专一的烯酰辅酶A水合酶(PhaJ)能通过脂肪酸的β-氧化提供合成PHA的前体物，它的使用为脂肪酸在重组菌株中合成PHA提供了有力的工具。
隶属于R型水合酶（(R)-hydratase）的一种新酶类单胺氧化酶C类水合酶（MaoC-likehydratase，MaoC）是最近发现的一种新乙酰辅酶A水合酶（Enoyl-CoAhydratase），该酶在脂肪酸β-氧化至PHA的合成过程中提供(R)-专一的羟烷基辅酶A（R-3-hydroxyacyl-CoA）。MaoC已经被证明对底物巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）具乙酰辅酶A水合酶（Enoyl-CoAhydratase）的活性。MaoC因具乙酰辅酶A水合酶（Enoyl-CoAhydratase）活性而成为与PHA合成相关的众多酶类成员之一。
作为生态环境友好型塑料，PHA是最具环保和最具发展前景的绿色塑料之一，该类塑料的不断开发和应用领域的不断拓宽将会给人类生活带来极其深远的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种隶属于R型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用。
本发明所提供的隶属于R型水合酶的基因片段的编码蛋白，名称为MaoC-Del63-88，是由类单胺氧化酶C类水合酶（MaoC-likehydratase，MaoC）蛋白（GenBank：GU190361）进行部分氨基酸缺失后所得的蛋白，具体是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，即删除了MaoC蛋白（GenBank：GU190361）的第63-88位氨基酸后所得的蛋白；
（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有水解巴豆酰辅酶A活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2由272个氨基酸残基组成。
为了便于MaoC-Del63-88蛋白的纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（a）中的MaoC-Del63-88蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的MaoC-Del63-88蛋白可通过如下方法得到：将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到编码基因，再进行生物表达得到MaoC-Del63-88蛋白。
编码所述MaoC-Del63-88蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因（命名为MaoC-Del63-88）；所述MaoC-Del63-88基因是如下1）-4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列1的DNA分子；
2）序列表中序列1所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述MaoC-Del63-88蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述MaoC-Del63-88蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
其中，序列1由819个核苷酸组成，整个序列即为其编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
含有所述核酸分子（MaoC-Del63-88基因）的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可发光化合物的基因（GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）等。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为T7启动子。
在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在pET28a(+)载体的多克隆位点（如BamHI和EcoRI）处插入所述MaoC-Del63-88基因后所得的重组质粒。
所述表达盒由能够启动所述MaoC-Del63-88基因表达的启动子，所述MaoC-Del63-88基因，以及转录终止序列组成。
所述MaoC-Del63-88蛋白，或所述MaoC-Del63-88基因，或所述重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒在如下任一中应用也属于本发明的保护范围：
（1）水解巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）；
（2）制备水解巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）的产品；
（3）作为乙酰辅酶A水合酶（Enoyl-CoAhydratase）；
（4）制备具有乙酰辅酶A水合酶（Enoyl-CoAhydratase）活性的产品；
（5）合成聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)；
（6）制备合成聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)的产品。
活性成分为所述MaoC-Del63-88蛋白，或所述MaoC-Del63-88基因，或所述重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒的如下任一产品也属于本发明的保护范围：
（1）水解巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）的产品；
（2）具有乙酰辅酶A水合酶（Enoyl-CoAhydratase）活性的产品。
本发明的再一个目的是提供一种所述MaoC-Del63-88蛋白的制备方法。
本发明所提供的所述MaoC-Del63-88蛋白的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述MaoC-Del63-88蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达，得到所述MaoC-Del63-88蛋白；所述生物细胞可为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞；在本发明的一个实施例中，所述生物细胞具体为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。
在上述方法中，所述MaoC-Del63-88蛋白的编码基因MaoC-Del63-88的核苷酸序列具体如序列表中序列1所示。
在本发明的一个实施例中，所述MaoC-Del63-88基因是通过重组表达载体的形式导入目的大肠杆菌中；所述重组表达载体具体为在pET28a(+)载体的多克隆位点（如BamHI和EcoRI）处插入所述MaoC-Del63-88基因后所得的重组质粒。
在所述MaoC-Del63-88蛋白的制备方法中，所述“将所述MaoC-Del63-88蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达”包括用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）对导入所述MaoC-Del63-88基因的所述生物细胞（大肠杆菌BL21(DE3)）进行诱导的步骤；所述诱导的最佳温度为16℃，所述IPTG的最佳终浓度为1mM，所述诱导的最佳时间为16h。
本发明敲除了MaoC蛋白（GenBank：GU190361）的第63-88位氨基酸后得到了MaoC-Del63-88蛋白。实验证明，本发明所提供的MaoC-Del63-88蛋白对于底物巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）具乙酰辅酶A水合酶（Enoyl-CoAhydratase）活性，且与原始的MaoC蛋白相比具有更高的活性。MaoC-Del63-88蛋白的酶活力达到126.7U/mg，而原始的MaoC蛋白的酶活力为58.1U/mg，两者差异显著，具有统计学意义。因此，本发明所提供的MaoC-Del63-88蛋白及其编码基因可用于有效合成聚羟基脂肪酸酯（PHA），本发明为进一步应用绿色塑料聚羟基脂肪酸酯（PHA）提供了一定的技术储备。
附图说明
图1为MaoC-Del63-88蛋白的原核表达的SDS-PAGE图谱。其中，泳道1为IPTG诱导前；泳道2-4为IPTG诱导后；泳道M为标准蛋白Marker。
图2为MaoC蛋白的原核表达的SDS-PAGE图谱。其中，泳道1为IPTG诱导前；泳道2-5为IPTG诱导后；泳道M为标准蛋白Marker。
图3为MaoC-Del63-88蛋白的原核表达产物纯化后的SDS-PAGE图谱。其中，泳道M为标准蛋白Marker；泳道1为亲和层析纯化后的MaoC-Del63-88蛋白。
图4为MaoC蛋白的原核表达产物、超声裂解产物及亲和层析产物的SDS-PAGE图谱。其中，泳道1为重组菌IPTG诱导前；泳道2为表达产物超声裂解后上清液；泳道3为表达产物超声裂解后沉淀物；泳道4为表达产物超声裂解后上清液挂亲和层析Ni柱后的流穿液；泳道5为亲和层析洗脱液（即纯化后MaoC蛋白）；泳道M为标准蛋白Marker。
图5为纯化后的MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白的乙酰辅酶A水合酶活性测定结果。其中，1表示MaoC蛋白；2表示MaoC-Del63-88蛋白。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，如Sambrook等分子克隆实验手册（NewYork:GoldSpringHarborLaboratoryPress,1989），或Draper,J等（Blackwell，1988）所述的操作技术规程，或按试剂盒建议的实验方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）：记载在“FengBZ,LiP,WangH,ZhangXG(2010)FunctionalanalysisofPcpme6fromoomyceteplantpathogenPhytophthoracapsici.MicrobialPathogenesis49:23-31”一文中，公众可从山东农业大学获得。
pET28a(+)载体：购于Novagen公司，其产品目录号为69864-3。
大肠杆菌DH5α：购于北京全式金生物技术有限公司，TransGen目录号：CD201。
大肠杆菌BL21(DE3)：购于北京全式金生物技术有限公司，TransGen目录号：CD701。
巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）：购于上海西格玛Sigma公司，其产品目录号为28007-5MG。
实施例1、MaoC-Del63-88基因的获得
一、单胺氧化酶C类水合酶基因MaoC的获得
根据2008年由美国能源部基因研究所（U.S.DepartmentofEnergyJointGenomeInstitute--DOEJGI）公布的辣椒疫霉全基因组草图序列，经生物信息学分析获得目的基—类单胺氧化酶C类水合酶（MaoC-likehydratase，MaoC）的基因序列（GenBank：GU190361），设计两端分别带有酶切位点BamHI和EcoRI的特异引物MaoC-F和MaoC-R，以辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
MaoC-F：5’-CGCGGATCCATGAGTGTGAACGTGGACAAG-3’（下划线部分为酶切位点BamHI的识别序列，其后的序列为GenBank：GU190361的第1-21位，也为序列1的第1-21位）
MaoC-R：5’-CCGGAATTCTTACAAACGCGCACTGGCGTC-3’（下划线部分为酶切位点EcoRI的识别序列，其后的序列为GenBank：GU190361的第877-897位的反向互补序列，为序列1的第799-819位的反向互补序列）
反应体系（50μL）：ddH2O（32.5μL），10×buffer（5μL），MgCL2（4μL），dNTP（4μL），MaoC-F（1μL），MaoC-R(1μL)，DNA模板（2μL），Taq酶（0.5μL）。
PCR反应程序：95℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
反应结束后，取10μL反应产物电泳，确定含有目基因MaoC（大小约为900bp），送上海博亚生物有限公司测序。测序结果显示，PCR产物的核苷酸序列为“CGCGGATCC+GenBank：GU190361+GAATTCCGG”，即得到两端分别带有酶切位点BamHI和EcoRI的类单胺氧化酶C类水合酶基因—MaoC基因。
二、MaoC-Del63-88基因的获得
根据MaoC基因全长序列推测获得相应的氨基酸序列（GenBank：GU190361）。基于MaoC蛋白结构（PDBcode：3KH8）分析，发现第63-88位氨基酸反应在蛋白结构上可能盖在了MaoC蛋白的活性氨基酸位点（Asp-194，His-199和Gly-217）上，因此设计引物，对该段序列进行敲除，敲除第63-88位的氨基酸残基，以期得到活性更高的突变体。引物序列如下：
MaoC-Del63-88-F：5’-ATCCTGCACGGAGAGCAGTCG-3（序列1的第187-207位，为GenBank：GU190361的第265-285位）；
MaoC-Del63-88-R：5’-CTGTCCTTTGAAGGGCAGGCA-3’（序列1的第166-186位的反向互补序列，也为GenBank：GU190361的第166-186位的反向互补序列）。
以步骤1所得的两端分别带有酶切位点BamHI和EcoRI的MaoC基因为模板，用引物MaoC-F（序列同步骤一中）加引物MaoC-Del63-88-R进行PCR反应，同时用引物MaoC-Del63-88-F加引物MaoC-R（序列同步骤一中）进行PCR反应，以以上两次PCR反应的产物为模板用引物MaoC-F加引物MaoC-R（序列同步骤一中）进行PCR反应扩增并回收产物获得目的基因。
反应体系（50μL）：ddH2O（32.5μL），10×buffer（5μL），MgCL2（4μL），dNTP（4μL），MaoC-Del63-88-F（1μL），MaoC-Del63-88-R(1μL)，DNA模板（2μL），Taq酶（0.5μL）。
PCR反应程序：95℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
反应结束后，取10μL反应产物电泳，确定含有目的基因—敲除了第63-88位氨基酸残基的MaoC蛋白的编码基因（大小约为820bp），送上海博亚生物有限公司测序。测序结果显示，PCR产物的核苷酸序列为“CGCGGATCC+序列1+GAATTCCGG”，即得到两端分别带有酶切位点BamHI和EcoRI的目的基因，将该基因命名为MaoC-Del63-88基因。所述MaoC-Del63-88基因（序列1）与MaoC基因（GenBank：GU190361）相比，缺失了MaoC基因的第187-264位核苷酸。MaoC-Del63-88基因编码序列表中序列2所示的蛋白，将该蛋白命名为MaoC-Del63-88蛋白。
实施例2、MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白的原核表达及纯化
一、重组表达载体pET28a-MaoC-Del63-88和pET28a-MaoC的构建
用限制性内切酶BamHI和EcoRI分别双酶切（37℃水浴反应4小时以上）实施例1步骤一得到的两端分别带有酶切位点BamHI和EcoRI的MaoC基因，以及实施例1步骤二得到的两端分别带有酶切位点BamHI和EcoRI的MaoC-Del63-88基因；回收酶切产物，分别与经过同样双酶切的pET28a(+)载体骨架片段相连（16℃水浴反应4小时），取两种连接产物各10μL，分别加入到100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，放入42℃水浴中热激90s，快速放入冰水中2min；加入800μL不含抗生素的LB培养基，37℃水浴1h以上；12000rpm离心2min，吸弃大部分上清培养基，剩余约100μL吹打悬浮沉淀；涂布含有卡那抗生素的LB琼脂平板，倒置平板37℃培养过夜。
对于两种连接产物，分别挑取若干单菌落，接入5ml的LB培养基中，培养过夜，提取质粒进行PCR和酶切鉴定。PCR扩增所用引物为MaoC-F和MaoC-R，酶切鉴定所用内切酶为BamHI和EcoRI。
对于MaoC基因与pET28a(+)载体骨架片段的连接产物，将经PCR检测和酶切鉴定均得到大小约为900bp目的条带的重组质粒送样测序。将测序表明在pET28a(+)载体的多克隆位点BamHI和EcoRI之间插入GenBank：GU190361所示DNA片段的重组质粒命名为pET28a-MaoC。在重组表达载体pET28a-MaoC中，启动所述MaoC基因转录的启动子为T7启动子。
对于MaoC-Del63-88基因与pET28a(+)载体骨架片段的连接产物，将经PCR检测和酶切鉴定均得到大小约为820bp目的条带的重组质粒送样测序。将测序表明在pET28a(+)载体的多克隆位点BamHI和EcoRI之间插入序列表中序列1所示DNA片段的重组质粒命名为pET28a-MaoC-Del63-88。在重组表达载体pET28a-MaoC-Del63-88中，启动所述MaoC-Del63-88基因转录的启动子为T7启动子。
二、MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白的原核表达
1、预实验
（1）将步骤一构建的重组表达载体pET28a-MaoC和pET28a-MaoC-Del63-88分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂于含有卡那霉素的抗性LB平板上，37℃倒置培养过夜。
（2）从LB平板上挑取5个单克隆菌落，分别接入5mlLB（含有50mg/L的Kan）的15ml离心管中，于37℃震荡培养至OD值0.6-0.8之间。
（3）每一个试管各取500μL菌液和15％（体积分数）的甘油（溶剂为LB）按照体积比1:1的比例混合后装至灭菌冻存管中，-80℃保存。
（4）每一个试管中取500μL菌液，做为诱导前对照。
（5）每一个试管中加入5μL终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），37℃200rpm诱导表达4个小时。
（6）诱导结束后，分别取500μL的菌液，与步骤（4）中所取的诱导前菌液分别离心，12000rpm，2分钟。
（7）弃掉上清，分别加入10μL5×样品缓冲液，于100℃加热5分钟变性，上样前离心，12000rpm，5分钟。
（8）15％SDS-PAGE电泳分析表达结果。
结果显示，转入重组表达载体pET28a-MaoC-Del63-88的大肠杆菌BL21(DE3)在经IPTG诱导后，与诱导前相比，有大量的大小为33KDa的MaoC-Del63-88目的蛋白表达（图1）。另外，转入重组表达载体pET28a-MaoC的大肠杆菌BL21(DE3)在经IPTG诱导后，与诱导前相比，有大量的大小为36KDa左右的MaoC目的蛋白表达（图2）。
2、MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白表达条件的优化
根据步骤1的结果可确定MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白能够正常重组表达。由于目的蛋白在重组菌中的可溶性越高，越利于纯化和后续研究，所以为了优化高效表达条件，本发明的发明人在诱导温度、诱导剂IPTG的剂量、诱导时间等参数上进行了优化筛选，确定最佳表达条件。具体操作如下：
（a）分别取5个含100mlLB（100mg/mlKan）的250ml锥形瓶，编号1-5，然后分别加入1ml重组菌（转入重组表达载体pET28a-MaoC或pET28a-MaoC-Del63-88的大肠杆菌BL21(DE3)），37℃，200rpm振荡培养。
（b）至菌液OD600约为0.6-0.8，对1-5号锥形瓶分别进行如下任一条件筛选：
I.IPTG浓度（1.0mM）和诱导时间（4h）不变，筛选适宜的诱导表达温度，依次为37℃、30℃、25℃、20℃、16℃；
II.诱导温度（37℃）和时间（4h）不变，筛选适宜的诱导剂浓度，IPTG浓度依次为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM；
III.诱导温度（16℃）和IPTG浓度（1.0mM）不变，筛选适宜的诱导时间，依次为1h，2h，4h，8h，16h；
（c）诱导后4℃5000rpm离心6min，弃上清。
（d）每100ml重组菌菌悬液离心所得沉淀，悬于10ml预冷的重悬液（20mMTris，150mMNaCl，pH8.5）中，4℃下超声波破碎细胞（300W条件下超声30分钟，超声3s间歇3s），超声后，4℃15000rpm离心30min。
（e）1-5号样品分别取上清、沉淀，各加入10μL的5×样品缓冲液，于100℃加热5分钟变性，上样前12000rpm离心5min。
（f）15％SDS-PAGE电泳分析，确定可溶性目的蛋白表达的最佳条件。
结果显示，于16℃，IPTG终浓度1mM的条件下诱导16h，破菌后的上清液中可溶性MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白的表达量较高，后续大量蛋白诱导均采用此条件进行。
3、MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白的大量表达
挑取阳性重组菌克隆（转入重组表达载体pET28a-MaoC或pET28a-MaoC-Del63-88的大肠杆菌BL21(DE3)），接种至含50mg/L卡那霉素的10mlLB培养基中，37℃震荡培养过夜至OD600=0.6-0.8，然后按体积比1：100接种至含50mg/L卡那霉素的1LLB培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.6-0.8。按照步骤2所得的优化表达条件进行，即冷却至16℃后，添加IPTG至终浓度为1mM，诱导培养16h，然后5000rpm，离心6分钟收集菌体沉淀，待用。
按照每100ml重组菌菌悬液离心所得沉淀悬于10ml预冷的重悬液（20mMTris，150mMNaCl，pH8.5）的量，对所得菌体沉淀进行重悬，再于超声波破碎仪冰水浴下于300W条件下超声30分钟（超声3s间歇3s）后，超声后，15000rpm离心20分钟，吸取上清液，即得到待纯化的目的蛋白（MaoC-Del63-88蛋白或MaoC蛋白）粗制品。其间，可对上清液及沉淀分别进行SDS-PAGE分析，确定目的蛋白以可溶的方式存在于上清液中。
三、MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白的纯化
由于目的蛋白（MaoC-Del63-88蛋白或MaoC蛋白）中带有由6个His组成的标签，故而可用Ni柱对其进行纯化。具体如下：
重悬液：20mMTris，150mMNaCl，pH8.5；各浓度为相应组分的终浓度。
基本洗杂液WBⅠ：20mMTris，150mMNaCl，20mM咪唑，pH8.5；各浓度为相应组分的终浓度。
洗杂液WBⅡ：20mMTris，150mMNaCl，20mM咪唑，1%(v/v)Tween-20，pH8.5；各浓度为相应组分的终浓度。
洗杂液WBⅢ：20mMTris，150mMNaCl，20mM咪唑，1M尿素，pH8.5；各浓度为相应组分的终浓度。
洗杂液WBⅣ：20mMTris，150mMNaCl，40mM咪唑，pH8.5；各浓度为相应组分的终浓度。
洗脱液：20mMTris，150mMNaCl，200mM咪唑，pH8.5；各浓度为相应组分的终浓度。
取3mlNi-NTA凝胶树脂（GE公司，目录号：17-5268-01）加至纯化柱中，用重悬液冲洗2-5个柱体积，将步骤二所得的待纯化的目的蛋白（MaoC-Del63-88蛋白或MaoC蛋白）粗制品过纯化柱3次以上，再进行洗杂。先用基本洗杂液WBⅠ洗杂200ml左右，然后依次用洗杂液WBⅡ、洗杂液WBⅢ、洗杂液WBⅣ分别洗杂100ml左右，最后用洗脱液洗脱10ml左右，收集洗脱液，即获得纯化后的目的蛋白（MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白）。
SDS-PAGE分析所收集的洗脱液，结果显示两个目的蛋白（MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白）的纯度均达95%以上。其中，MaoC-Del63-88蛋白的纯化后SDS-PAGE结果如图3所示，MaoC蛋白纯化前后SDS-PAGE结果如图4所示。进一步用Bradford方法测定两个目的蛋白（MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白）的浓度（天根TianGen公司，目录号：PA102），结果显示MaoC-Del63-88蛋白的浓度为2.9mg/ml，MaoC蛋白的浓度为3.2mg/ml。
实施列3、MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白的乙酰辅酶A水合酶活性测定
本实施例通过测定对MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白底物巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）的水解程度（底物消耗量），来测定其乙酰辅酶A水合酶的活性高低。乙酰辅酶A水合酶活力单位（U）定义为每分钟消耗1μmol巴豆酰辅酶A所需目的蛋白（MaoC-Del63-88蛋白或MaoC蛋白）的量（mg）。由于巴豆酰辅酶A在263nm下具有吸收峰，且其吸收值（OD263）与试样中巴豆酰辅酶A的含量成正比，故而通过酶反应前后反应液的OD263nm值，计算底物巴豆酰辅酶A的消耗量，即按照如下公式计算底物巴豆酰辅酶A的消耗量：
底物消耗量=反应前底物含量-（反应前底物含量×反应后OD263）/反应前OD263
具体步骤为：
取10μL浓度调整为1mg/ml的实施例2得到的纯化后的目的蛋白（MaoC-Del63-88蛋白或MaoC蛋白）溶液，加入90μL巴豆酰辅酶A溶液（50mMTris、0.25mM巴豆酰辅酶A，pH8.0；各浓度为相应组分的终浓度），于30℃反应5分钟，反应前后分别测定反应体系的OD263nm值。同时以煮沸灭活的目的蛋白溶液做阴性对照，以不加目的蛋白溶液做阳性对照，测吸光值所用的比色皿厚度为1cm。实验重复3次，结果取平均值。
结果如表1和图5所示，最终计算出的MaoC蛋白的乙酰辅酶A水合酶的酶活为58.1U/mg，而MaoC-Del63-88蛋白的乙酰辅酶A水合酶的酶活为126.7U/mg，且两者差异显著，具有统计学意义。可见，本发明所提供的MaoC-Del63-88蛋白与原始MaoC蛋白相比，对底物巴豆酰辅酶A具有更高的乙酰辅酶A水合酶活性，为聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)的生物合成提供了重要的基因乃至酶类技术储备。
表1MaoC-Del63-88蛋白和MaoC蛋白的乙酰辅酶A水合酶活性测定结果单位（U/mg）
酶活 重复1 重复2 重复3 平均值±标准差
MaoC蛋白 59.6 57.2 57.5 58.1±1.71
MaoC-Del63-88蛋白 128.3 126.2 125.7 126.7±1.90

Claims (14)

1.蛋白质，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是序列表中序列1所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。
5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。
6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组细胞。
7.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。
8.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组病毒。
9.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为T7启动子。
11.根据权利要求10所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pET28a(+)载体的多克隆位点处插入权利要求2或3所述核酸分子后得到的重组质粒。
12.权利要求1所述蛋白质、或者权利要求2或3所述核酸分子、或者权利要求4和9-11中任一所述的重组载体、或者权利要求5所述的表达盒、或者权利要求6所述的重组细胞、或者权利要求7所述的重组菌、或者权利要求8所述的重组病毒在如下任一中应用：
(1)水解巴豆酰辅酶A；
(2)制备水解巴豆酰辅酶A的产品；
(3)作为乙酰辅酶A水合酶；
(4)制备具有乙酰辅酶A水合酶活性的产品；
(5)合成聚羟基脂肪酸酯；
(6)制备合成聚羟基脂肪酸酯的产品。
13.活性成分为权利要求1所述蛋白质、或者权利要求2或3所述核酸分子、或者权利要求4和9-11任一所述的重组载体、或者权利要求5所述的表达盒、或者权利要求6所述的重组细胞、或者权利要求7所述的重组菌、或者权利要求8所述的重组病毒的如下任一产品：
(1)水解巴豆酰辅酶A的产品；
(2)具有乙酰辅酶A水合酶活性的产品。
14.权利要求1所述蛋白质的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达，得到权利要求1所述蛋白质；所述生物细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞；
所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列具体如序列表中序列1所示。
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