CN102181413B

CN102181413B - 一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102181413B
Application number: CN2011100499124A
Authority: CN
Inventors: 段文娟; 杨禄良; 谢宁; 王海燕; 李卓夫
Original assignee: BEIJING CHALLENGE AGRICULTURE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING CHALLENGE AGRICULTURE TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2031-03-02
Also published as: CN102181413A

Abstract

本发明公开了一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。本发明提供的α-半乳糖苷酶是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1自N末端第20至739位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明为今后的高效表达生物反应器的建立提供技术参数，使其应用于不同的工业生产领域，本发明丰富了蛋白来源，该蛋白与已报道的蛋白氨基酸序列一致性低，为α-半乳糖苷酶的分类学提供了新的素材。

Description

一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase，EC 3.2.1.22)，也叫蜜二糖酶，是一种外切糖苷酶，它可作用于α-半乳糖苷键，催化α-半乳糖苷类的寡糖以及含α-半乳糖苷键的多聚糖。α-半乳糖苷广泛分布于植物、动物和微生物体内。

α-半乳糖苷酶作为一种新型的酶制剂，在饲料工业，食品工业，制糖工业，造纸工业以及医学界都发挥着重要的作用。不同的领域pH作用环境不同，对α-半乳糖苷酶的特点要求也就不同。例如，酸性α-半乳糖苷酶目前不适于应用于豆奶加工中，因为豆奶的pH约为6.2-6.4，而酸性α-半乳糖苷酶的pH在4.0-4.5，易造成豆奶中蛋白沉降，奶制品口感偏酸；甜菜糖生产中甜菜糖蜜的pH需用硫磺酸调至5.2，才能使酸性α-半乳糖苷酶发挥作用；在医学研究中，由B型血到O型血的血液转换，需在中性及碱性条件下作用，酸性条件下会使血细胞不稳定，这是因为血液的pH值在7.3，中性偏碱性的环境下，碱性的α-半乳糖苷酶会发挥明显的优势。

目前酶制剂工业中主要采用微生物作为主要酶源。微生物特别是丝状真菌，因其产生的α-半乳糖苷酶产量相对较高，可胞外分泌、酶学性质优良等特点而受到研究者的青睐。目前，α-半乳糖苷酶主要是利用原菌株的发酵生产，产量较低，成本较高。α-半乳糖苷酶的基因工程菌株目前报道也较少，主要还是在实验室研究阶段。因此，不断提高菌种产酶水平，研究α-半乳糖苷酶合成的调控机制、酶基因的克隆和异源高效表达，进行产业化推广应用是今后发展的主要方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，来自菌株WD(Alternaria sp.)No.4529，命名为LGAL蛋白，是如下(a)或(b)或(c)：

(a)由序列表中序列1自N末端第20至739位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的LGAL蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的LGAL蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的LGAL蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因(lgal基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)至5)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第58至2217位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)序列表中序列3所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有α-半乳糖苷酶活性蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有α-半乳糖苷酶活性蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对重组子进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组表达载体具体可为在原核表达载体pET-30a(+)的多克隆位点插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组质粒。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述表达盒、所述转基因细胞系或所述重组菌均可用于降解对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述表达盒、所述转基因细胞系或所述重组菌均可用于生产对硝基酚，具体可用于以对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖为底物生产对硝基酚。

以上任一所述应用的反应条件均可为37-50℃(优选45℃)，pH7.0-9.0。

本发明还提供了一种表达所述蛋白的菌株。本发明提供的菌株WD(Alternariasp.)，分离自河北省保定市的大豆种植地土壤中，已于2011年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No.4529。菌株WD(Alternaria sp.)No.4529简称菌株WD。

本发明提供的α-半乳糖苷酶(纯化后的洗脱液)的比活为1.122U/mg。该酶在37-50℃的温度范围内都具有高的酶活性，最适作用温度为45℃；该酶具有很好的温度稳定性，在37℃保温1小时酶活仍保持在60％以上，在45℃保温2min酶活保持在78％，在60℃保温1min酶活保持在43.5％。该酶在pH值为7.0-9.0的范围内都具有高的酶活性，最适pH值为7.0，pH值为9.0时酶活也相对较高，在pH值为5.0的条件下保温1小时后酶活为82％，在pH值为6.0的条件下保温1小时后酶活为67％，在pH值为7.0的条件下保温1小时后酶活为76％，在pH值为8.0的条件下保温1小时后酶活为71％，在pH值为9.0的条件下保温1小时后酶活为87％，在pH值为10.0的条件下保温1小时后，酶活为54％。

基于α-半乳糖苷酶应用如此广泛，对产α-半乳糖苷酶的菌株的筛选就很有必要。菌种的分离和筛选是各项后续研究工作的基础，在特殊的环境下长期生活的微生物可能具有特殊的生理机能和遗传基因，本发明中通过从富含微生物的多年种植大豆的土壤中筛选得到一注生产α-半乳糖苷酶的菌株链格孢霉(链格孢霉还未见α-半乳糖苷酶基因报道)。本发明中克隆获得新基因，并通过基因工程技术获得优良性质的重组蛋白，其研究意义在于根据菌株筛选进而获得新的重组蛋白，分析蛋白的酶学性质，为今后的高效表达生物反应器的建立提供技术参数，使其应用于不同的工业生产领域。本发明丰富了蛋白来源，该蛋白与已报道的蛋白氨基酸序列的低一致性，也为α-半乳糖苷酶的分类学提供了新的素材。

附图说明

图1为lgal基因(cDNA)的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为LGAL蛋白表达和纯化过程中的SDS-PAGE电泳图；泳道1表示重组菌R-pET-30a(+)诱导后的菌体，泳道2表示重组菌R-pET-lgal诱导前的菌体，泳道3表示重组菌R-pET-lgal诱导后的菌体，泳道4表示重组菌R-pET-lgal超声破碎后的沉淀，泳道5表示重组菌R-pET-lgal超声破碎后的上清液，泳道6表示重组菌R-pET-lgal步骤3得到的洗脱液，泳道M表示Marker。

图3为LGAL蛋白的最适反应温度曲线。

图4为LGAL蛋白在不同反应温度下的稳定性曲线。

图5为LGAL蛋白的最适pH值曲线。

图6为LGAL蛋白在不同pH值下的稳定性曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。引物使用DNA合成仪合成。PCR扩增试剂均购自上海申能博彩生物科技有限公司。对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖(pNPG)：购自Ameresco公司，产品目录号为0680-5G。对硝基酚标准品(pNP)：购自Fluka公司，产品目录号为73560。原核表达载体pET-30a(+)：购自Novagen公司，产品目录号69909-3。

实施例1、菌株WD的获得和鉴定、α-半乳糖苷酶(LGAL蛋白)及其编码基因(lgal基因)的发现

一、菌株WD的获得和鉴定

1、菌株WD的获得

菌株WD是2008年9月从大豆种植地土壤中自主筛选得到的。

2、菌株WD的鉴定

(1)菌株WD的形态特征

平板培养呈黑色绒状或带粉状，液体培养基培养，菌丝呈黑色团絮状，生长迅速。

(2)菌株WD的分子鉴定

提取菌株WD的基因组DNA，PCR扩增获得18sRNA序列(见序列表的序列4)。将序列4所示的18sRNA序列与现有菌株的18sRNA序列进行比对分析，发现与链格孢霉菌属的18sRNA相似性最高，达99％。确认菌株WD属于链格孢霉菌属(Alternaria)。链格孢霉属属于格孢菌目(Pleosporales)，格孢菌科(Pleosporaceae)。

18sRNA的扩增引物如下：

NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’；

NS2：5’-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3’。

PCR扩增体系(50μl)：10×PCR buffer(含MgCl₂)5μl，dNTP mix(2.5mmol/L)4μl，Taq plus DNA polymerase(3u/μl)1μl，NS1(10μmol/L)1μl，NS2(10μmol/L)1μl，基因组DNA 1μl，ddH₂O 37μl。

PCR扩增条件：94℃5min；94℃45s，55℃30s，72℃1min，25个循环；72℃10min。

将菌株WD(Alternaria sp.)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4529。菌株WD(Alternaria sp.)CGMCC No.4529简称菌株WD。

二、α-半乳糖苷酶(LGAL蛋白)及其编码基因(lgal基因)的发现

1、设计简并引物

搜寻现有的来源于格孢菌目的α-半乳糖苷酶基因蛋白序列，用多序列比对程序BLOCKS[http://blocks.fhcrc.org/block/make_blocks.html]分析，发现了两段保守序列LFVNDDGWFG和NIQYVKWDNNR。基于这两段保守序列，设计一对简并引物。

简并引物序列如下：

L700F：5’-CTCTTCGTCAACGACGA(T/C)GG(A/T/C/G)TGGTT-3’；

L820R：5’-GCGGTTGTTGTCCCA(T/C)TT(A/T/C/G)AC(A/G)TA(T/C)TG-3’。

2、获得编码基因的部分序列

以菌株WD的基因组DNA为模板，用简并引物进行touch-down PCR扩增。

PCR扩增体系(50μl)：10×PCR buffer(含MgCl₂)5μl，dNTP mix(2.5mmol/L)4μl，Taq DNA polymerase(3u/μl)1μl，L700F(10μmol/L)3μl，L820R(10μmol/L)3μl，基因组DNA 1μl，ddH₂O 33μl。

PCR扩增条件：

1 94℃ 3min

2 94℃ 45S

3 65℃ 30S -0.5s

4 72℃ 90S 2 20个循环

5 94℃ 45S

6 55℃ 30S

7 72℃ 90S 5 30个循环

8 72℃ 5min

PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，回收约500bp片段测序，测序结果即中间序列。

3、获得编码基因的全长序列

根据中间序列设计Tail-PCR(热不对称交错PCR)的巢式特异引物。通过上游Tail-PCR一轮获得部分序列，进而通过其测序结果设计上游Tail-PCR二轮特异引物继续扩增获得上游序列，并确定起始密码子位置。通过下游Tail-PCR确定获得下游序列，确定终止密码子位置。

巢式特异引物及简并引物(AD，arbitrary degenerate primers)如下：

上游一轮Tail-PCR特异引物：

LIAN USP1：5’-CGCATAGCACAGAGACACTC-3’；

LIAN USP2：5’-GATGATGCGTTCAACACTGT-3’；

LIAN USP3：5’-CCAAGACCATCAGGGAATTT-3’；

简并引物AD6：5’-CAWCGICNGAIASGAA-3’；

上游二轮Tail-PCR特异引物：

33USP1：5’-AACCACCCATCGTCCATCAC-3’；

33USP2：5’-CTTCAGGAGACTGGAACATC-3’；

33USP3：5’-TCCAAACCAAACTGAATCCC-3’；

简并引物AD2：5’-GTCGASWGANAWGAAN-3’；

下游Tail-PCR特异引物：

LIAN DSP1：5’-GGTAGAACCAGAAATGGTCA-3’；

LIAN DSP2：5’-CTGACCCGAAACCAACTAGC-3’；

LIAN DSP3：5’-ATCATCAGCTCCGTCTCTCG-3’；

简并引物AD9：5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’。

以菌株WD的基因组DNA为模板，采用上述引物通过Tail-PCR克隆获得上下游区域。

Tail-PCR反应体系(25μl)：2×PCR buffer(高GC)12.5μl，dNTP mix(10mmol/L)1μl，LA Taq(5u/μl)1μl，SP(10μmol/L)0.5μl，AD(10μmol/L)4μl，基因组DNA 1μl，ddH₂O 5.6μl。

Tail-PCR反应条件：

TAIL-PCR 1

1 94℃ 1min

2 25℃ 2min59s -0.2s

3 72℃ 2min30s

4 94℃ 1min

5 66℃ 30s

6 72℃ 2min30s

7 94℃ 1min

8 66℃ 30s

9 72℃ 1min30s

10 94℃ 1min

11 44℃ 1min

12 72℃ 2min30s 4 14个循环

13 72℃ 10min

TAIL-PCR 2

1 94℃ 1min

2 94℃ 1min

3 66℃ 30s

4 72℃ 1min

5 94℃ 1min

6 66℃ 30s

7 72℃ 1min

8 94℃ 1min

9 42℃ 30S

10 72℃ 1min 2 24个循环

11 72℃ 10min

TAIL-PCR 3

1 94℃ 1min

2 94℃ 30s

3 66℃ 30s

4 72℃ 1min

5 94℃ 30s

6 66℃ 30s

7 72℃ 1min

8 94℃ 30s

9 42℃ 30S

10 72℃ 1min 2 24个循环

11 72℃ 10min

PCR产物利用胶回收试剂盒(购自上海申能博彩生物技术有限公司)回收，连入PEASY-T3 Cloning Vector(购自北京全式金生物技术有限公司)，转化大肠杆菌TOP10细胞，分离含有基因的菌株，测序。

三序列被输入DNASTAR软件，并通过序列拼接程序组装。

获得序列全长为2382bp。该2382bp为编码基因的基因组序列，如序列表的序列3所示。将上述2382bp序列经过内含子分析[http://genes.mit.edu/GENSCAN.html]，发现拼接获得的基因含有多段内含子区域。将内含子部分去除，通过DS GENE软件进行ORF查找，发现2217bp的开放阅读框，如序列表的序列2所示。

用QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit，Cat.no.74903)，提取菌株WD的总RNA；利用MBI反转录试剂盒(Fermentas：RevertAid^TM First StrandcDNA Synthesis Kit，#K1621)进行反转录，获得cDNA；以cDNA为模板，用LF和LR组成的引物对进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，获得的片段大小2Kb左右，标示为lgal。PCR产物胶回收，连入PEASY-T3 CloningVector，转化大肠杆菌TOP10细胞，分离含有基因的菌株，测序，获得的cDNA序列如序列表的序列2所示。

LF：5’-TGGTATCCTATCCGCCCAGTTCC-3’；

LR：5’-CAAGTGCGTTACTGACGAAGATG-3’。

序列表的序列2所示核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示。

三、序列分析

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为LGAL蛋白，由739个氨基酸组成，自N末端起第1-19位氨基酸残基为信号肽，第20-739位氨基酸残基为成熟蛋白。利用PeptideMass程序预测成熟蛋白的分子量，成熟蛋白的分子量为81.2KDa。通过ProtParam[http://us.expasy.org/tools/protparam.html]预测该成熟蛋白的理论等电点，理论等电点约为4.93。在NCBI的GeneBank中利用BLAST服务器[http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast]将序列1所示的LGAL蛋白进行相似性分析，与核腔菌属Pyrenophora teres f.teres 0-1来源的假定蛋白(Genebank号为EFQ95810)及核腔菌属Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP来源的α-半乳糖苷酶(Genebank号为XP_001930603)的一致性较高，分别为85％和84％。LGAL蛋白是一种新的α-半乳糖苷酶。

将LGAL蛋白的编码基因命名为lgal基因，其cDNA序列如序列表的序列2所示，基因组序列如序列表的序列3所示。

实施例2、重组菌的制备

一、重组表达载体的制备

1、提取菌株WD的RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，用LYF和LYR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

LYF：5’-GTCGACATGTTTGGCATGAAGGGTGTTTG-3’(添加Sal I识别序列)；

LYR：5’-GCGGCCGCTCAGACCTTGTTCAACCAAATCA-3’(添加Not I识别序列)。

2、回收PCR扩增产物，与PEASY-T3 Cloning Vector(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号CT301)连接，挑取阳性克隆测序，测序结果表明得到了含有序列表的序列2所示DNA的重组质粒，将其命名为将重组质粒pT3-lgal。

3、用限制性内切酶Sal I和Not I双酶切重组质粒pT3-lgal，回收约2kb的DNA片段。

4、用限制性内切酶Sal I和Not I双酶切原核表达载体pET-30a(+)，回收载体骨架。

5、将步骤3回收的DNA片段与步骤4回收的载体骨架16℃过夜连接，连接产物热击转化大肠杆菌Trans10(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号CD101)感受态细胞，涂布于LB培养基平板(含有100μg/mL的卡那霉素)上，挑取阳性克隆，用液体LB培养基(含有100μg/mL的卡那霉素)扩大培养后提取质粒进行测序鉴定，测序结果表明，得到了重组表达载体pET-lgal。

重组表达载体pET-lgal的结构描述：骨架载体为原核表达载体pET-30a(+)，在Sal I和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的lgal基因。

二、重组菌的制备

将重组表达载体pET-lgal转化大肠杆菌Transetta(DE3)(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号CD801)，得到含有重组表达载体pET-lgal的大肠杆菌Transetta(DE3)，将其命名为重组菌R-pET-lgal。

将原核表达载体pET-30a(+)转化大肠杆菌Transetta(DE3)，得到含有原核表达载体pET-30a(+)的大肠杆菌Transetta(DE3)，将其命名为重组菌R-pET-30a(+)。

实施例3、LGAL蛋白的制备(基因工程表达获得α-半乳糖苷酶)

分别将重组菌R-pET-lgal和重组菌R-pET-30a(+)进行如下操作：

1、重组菌的发酵

(1)将重组菌接种于10ml液体LB培养基(含有100μg/mL的卡那霉素)，37℃摇床培养(250rpm，振幅26mm)过夜。

(2)按1％体积转接于100ml液体LB培养基(含有100μg/mL的卡那霉素)，250rpm，振幅26mm)至OD₆₀₀为0.6～0.8。

(3)诱导表达

加入IPTG(使其终浓度为0.4mmol/L)，28℃摇床培养(250rpm、振幅26mm)4小时，得到100ml发酵液。

2、蛋白的提取

(1)取步骤1得到的100ml发酵液，离心收集菌体。

(2)加入10倍菌体体积的20Mm Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬菌体，超声波破碎细胞(功率200W，破碎30个循环，每个循环为破碎5s停3s，)，离心，分别收集上清液和沉淀，得到10ml上清液。

3、蛋白的纯化

NTA-0缓冲液：由溶剂和溶质组成；溶剂为20mmol/L的Tris-Cl缓冲液(pH值为8.0)；溶质及其浓度如下：10％(体积百分含量)甘油，0.5mol/L氯化钠。

NTA-40缓冲液：由溶剂和溶质组成；溶剂为20mmol/L的Tris-Cl缓冲液(pH值为8.0)；溶质及其浓度如下：10％(体积百分含量)甘油，0.5mol/L氯化钠，40mmol/L咪唑。

将步骤2得到的上清液用Ni柱亲合层析纯化。步骤如下：

(1)取亲和层析树脂Ni-NTA Agarose 1.5-2ml(Ni-NTA Agarose购自Qiagen公司，产品目录号为30210)加入已放好垫片的塑料管中，待树脂全部沉积到一起时，放入上层垫片，压紧，这样就灌好一个亲和层析柱，备用。

(2)将亲和层析柱垂直摆放在4℃冰箱中，加入水15-20ml。

(3)水流尽后加入2～3ml 0.1mol/L硫酸镍水溶液(第一次使用时可以不加)。

(4)硫酸镍水溶液流尽后加入15～20ml NTA-0缓冲液。

(5)NTA-0缓冲液流尽后加入步骤2得到的上清液，带有组氨酸标签的蛋白可以与树脂上的镍结合。

(6)上清液全部流尽后，用NTA-0缓冲液20ml清洗柱子。

(7)用10ml NTA-40缓冲液冲洗柱子，收集洗脱液回收，得到10ml洗脱液。

4、SDS-PAGE电泳

收集重组菌R-pET-30a(+)诱导后的菌体，用等体积的20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH8.0)重悬，得到菌体悬浮液，作为电泳样本。分别收集重组菌R-pET-lgal诱导前后的菌体，用等体积的20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH8.0)重悬，得到菌体悬浮液，作为电泳样本。分别收集重组菌R-pET-lgal超声破碎后的上清液和沉淀，沉淀用等体积的20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH 8.0)重悬，作为电泳样本。收集重组菌R-pET-lgal步骤3得到的洗脱液，作为电泳样本。

分别取20μL各电泳样本，加入20μL 2×蛋白电泳缓冲液，混合，5min煮沸，用于SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳图见图2(目的条带为81.2KDa)。重组菌R-pET-30a(+)诱导后的菌体、重组菌R-pET-lgal诱导前的菌体均没有显示目的条带，重组菌R-pET-lgal诱导后的菌体显示目的条带，重组菌R-pET-lgal超声破碎后的沉淀没有显示目的条带，重组菌R-pET-lgal超声破碎后的上清液显示目的条带且深度高于诱导后的菌体，重组菌R-pET-lgal步骤3得到的洗脱液显示单一的目的条带。结果表明，重组菌R-pET-lgal经诱导后有蛋白的诱导表达，纯化后得到单一条带，且分子量与预测的理论分子量一致。

5、将重组菌R-pET-lgal步骤3得到的洗脱液进行蛋白定量分析(考马斯亮蓝法)，洗脱液中的蛋白浓度为249.628μg/ml。

实施例4、酶活测定及酶学性质分析

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的制备方法：在水中加入磷酸氢二钠和柠檬酸，磷酸氢二钠的终浓度为14.20g/L，柠檬酸的终浓度为10.505g/L，调pH值为7.0。

以对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖(pNPG)为底物，经酶解后测定释放的对硝基酚(pNP)的量，获得α-半乳糖苷酶活力。α-半乳糖苷酶活性定义为：1分钟内分解pNPG产生1μmol pNP的酶量作为1个酶活单位(1U)。

一、酶活的测定

分别检测洗脱液甲和洗脱液乙的酶活。洗脱液甲为实施例3中重组菌R-pET-lgal步骤3得到的洗脱液。洗脱液乙为实施例3中重组菌R-pET-30a(+)步骤3得到的洗脱液。

酶活检测方法(所用的缓冲液均为0.1M、pH值7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)：

(1)pNPG溶于缓冲液中，使其终浓度为20mmol/L，即为pNPG溶液；

(2)将洗脱液(洗脱液甲或洗脱液乙)用缓冲液稀释5倍，作为待测酶液；

(3)将20μl待测酶液，100μl pNPG溶液和1880μl缓冲液混合，摇匀，45℃温育5min，然后加入2mL 1M的Na₂CO₃水溶液终止反应；以等体积的缓冲液代替待测酶液，作为阴性对照；检测在OD₄₀₅nm处测吸光值。

将pNP标准品溶于0.1M、pH值为7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，得到不同浓度的标准品溶液，检测不同浓度的标准品溶液在OD₄₀₅nm处测吸光值，制作标准曲线。标准曲线为：y＝21.701X+0.0054；X：405nm处光吸收值；y：pNP浓度，单位为nmol/mL)。洗脱液的酶活计算公式：酶活性(U/ml)＝(21.701X+0.0054)×50×N/(t×1000)；X：405nm处光吸收值；t：反应时间(单位为分钟，数值为5)；N：步骤(2)中洗脱液的稀释倍数(数值为5)。

实验设3次重复，结果取平均值。洗脱液甲的酶活为0.28U。洗脱液乙的酶活为0.02U(宿主菌的本底活性)。

洗脱液甲的比活力＝洗脱液的酶活/洗脱液中的蛋白浓度＝0.28U/ml洗脱液÷249.628μg/ml洗脱液＝1.122U/mg。

二、酶学性质分析

1、酶的最适温度及温度稳定性

(1)最适温度

检测洗脱液甲的酶活。酶活检测方法中采用不同的反应温度(30℃、37℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃)，其它同步骤一。

将洗脱液甲45℃时的酶活(0.28U/ml)记作100％，计算其它温度下的酶活与45℃时的酶活的比值(相对酶活)见图3。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，洗脱液甲(LGAL蛋白)在37-50℃的温度范围内都具有高的酶活性，其中在45℃时酶的活性最高。

(2)温度稳定性

洗脱液甲的处理：将洗脱液甲在37℃、45℃和60℃下分别保持0.5min、1min、2min、3min、4min、7min、10min、20min、30min、40min、60min。

将洗脱液甲以及各个处理后的洗脱液甲检测酶活，方法同步骤一。

将未经处理的洗脱液甲(0min)的酶活(0.28U/ml)记作100％，计算各个处理后的酶活与未处理的酶活的比值(相对酶活)见图4。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，洗脱液甲(LGAL蛋白)在37℃保温1小时酶活仍保持在60％以上，在45℃保温2min酶活保持在78％，在60℃保温1min酶活保持在43.5％。

2、酶的最适pH值及pH值稳定性

(1)最适pH值

检测洗脱液甲的酶活。酶活检测方法同步骤一，但分别采用如下几种溶液作为缓冲液：

0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH3.0)：A1液10.275mL，B1液39.725mL，调节pH值，加水50mL稀释定容；

0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)：A1液31.575mL，B1液18.425mL，调节pH值，加水50mL稀释定容；

0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH7.0)：A1液41.175mL，B1液8.825mL，调节pH值，加水50mL稀释定容；

0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH8.0)：A1液48.625mL，B1液1.375mL，调节pH值，加水50mL稀释定容；

0.1M乙酸钠-乙酸缓冲液(pH4.0)：A2液9mL，B2液41mL，调节pH值，加水50mL稀释定容；

0.1M乙酸钠-乙酸缓冲液(pH5.0)：A2液35mL，B2液15mL，调节pH值，加水50mL稀释定容；

0.05M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0)：A3液25mL，B3液4.4mL，调节pH值，加水定容至100mL得0.05M工作液；

0.05M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH10.0)：A3液25mL，B3液16mL，调节pH值，加水定容至100mL得0.05M工作液。

A1液：0.2M磷酸氢二钠缓冲液；B1液：0.1M柠檬酸缓冲液。A2液：0.2M乙酸钠缓冲液；B2液：0.2M乙酸缓冲液。A3液：0.2M甘氨酸缓冲液；B3液：0.2M氢氧化钠缓冲液。

以pH值为7.0的条件下洗脱液甲的酶活(0.28U/ml)记作100％，计算其它pH值的酶活与pH值7.0的酶活的比值(相对酶活)见图5。实验设3次重复，结果取平均数。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，洗脱液甲(LGAL蛋白)在pH值为7.0-9.0的范围内都具有高的酶活性，最适pH值为7.0，pH值为9.0时酶活也相对较高。

(2)pH值稳定性

酶活检测方法与步骤一的方法的差异仅在于：在步骤(2)中分别用上述各种pH的缓冲液(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)稀释5倍，37℃温育1小时，作为待测酶液。

将用pH 7.0处理的洗脱液甲(0min)的酶活(0.28U/ml)记作100％，计算各个处理后的酶活与未处理的酶活的比值(相对酶活)见图6。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，洗脱液甲(LGAL蛋白)在pH值5.0-9.0之间具有较好的稳定性；在pH值为5.0的条件下保温1小时后，酶活为82％；在pH值为6.0的条件下保温1小时后，酶活为67％；在pH值为7.0的条件下保温1小时后，酶活为76％；在pH值为8.0的条件下保温1小时后，酶活为71％；在pH值为9.0的条件下保温1小时后，酶活为87％；在pH值为10.0的条件下保温1小时后，酶活为54％。