CN104745614A - 一种新型低温蛋白酶编码基因及其在大肠杆菌中的功能表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型低温蛋白酶编码基因及其在大肠杆菌中的功能表达，本发明从动性球菌Planococcus sp.11815中克隆到一段新型低温蛋白酶编码基因cpls8，序列分析表明：该基因所编码的蛋白序列共含有329个氨基酸残基，属S8家族丝氨酸蛋白酶，与目前数据库中已发表蛋白序列的最高源性仅为77％。该基因在E.coil Rosseta(DE3)实现了功能表达，酶学性质分析表明：其最适催化pH值为10，最适催化温度为37℃左右，在20～30℃之间可保持最高酶活的50％以上，因此属典型的低温碱性蛋白酶，在洗涤、食品、医药等领域具有广泛的应用前景。

Description

一种新型低温蛋白酶编码基因及其在大肠杆菌中的功能表达

技术领域

本发明属于基因的克隆与表达领域，尤其是一种新型低温蛋白酶编码基因及其在大肠杆菌中的功能表达。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质的一大类酶的通称，广泛存在于动物、植物和各种微生物中，自上世纪以来在食品、洗涤、皮革、饲料、造纸、制药等行业中得到了广泛的应用，占世界用酶市场60％以上的份额。目前所用蛋白酶一般都是中高温蛋白酶,最适酶活温度一般都在50℃左右,产酶菌的最适生长与产酶温度在30℃以上。而低温蛋白酶则是指：最适酶活温度在40℃以下，并且在20～30℃之间仍能保持较高催化活性的一类蛋白水解酶。该类蛋白酶一般具有如下几个特点：(1)酶的生产温度低，低温蛋白酶一般由嗜低温菌(psychrophiles)和耐低温菌(psychrotrophiles)产生，这些低温菌的最适生长与产酶温度一般均在20℃以下。(2)低温蛋白酶的最适酶活温度低，目前从低温菌中分离到的蛋白酶的最适催化温度最低的为25℃，但大部分的最适催化温度都在30℃到40℃之间，一般比中温蛋白酶的最适酶活温度要低10到20℃。(3)低温蛋白酶的热稳定性差，目前发现几乎所有的低温蛋白酶都对热敏感，这主要是由于酶分子的结构特点决定的。与中温酶相比,低温酶的共同特征是，盐桥的数量减少,疏水核内芳香环的相互作用减弱,脯氨酸与精氨酸残基数量减少,酶的疏水性减弱，使酶与溶剂的相互作用增强。这些结构特点都有利于酶分子柔顺性的增加以及低温条件下的催化活性，但同时也降低了酶分子的热稳定性。(4)低温蛋白酶的活化能低，Margesin报道,从冰川分离到的三株低温菌所产蛋白酶的活化能为36.9-38.0kJ/mol,而中温蛋白酶的活化能一般在60kJ/mol左右。

由于低温蛋白酶的最适催化温度及产酶温度均接近自然环境中的温度，因此在应用过程中可省去加热和冷却过程，与中高温蛋白酶相比具有节能、省时等特点，具有中高温蛋白酶无法取代的优越性。自上世纪70年代以来,世界上已有许多实验室在从事低温蛋白酶的研究。目前低温蛋白酶的研究方法概括起来主要有两种：(1)低温选育，低温选育是最早采用的方法,也是最常用的方法。即从低温环境中采集的样品在低温条件下进行培养、分离和筛选，得到低温下产蛋白酶的菌株；然后通过进一步筛选、比较所产蛋白酶在不同温度下的酶活,以及酶的热稳定性,活化能等性质,从而筛选到产低温蛋白酶的菌株。这是一种从自然界中获得低温蛋白酶的最有效的方法。利用这种方法已从冰川、南极,深海动物的消化道等样品中筛选到许多低温蛋白酶菌株。(2)突变选育；既在原有中高温蛋白酶分子结构基础之上，通过定点突变技术、DNA Shuffling以及易错PCR等酶分子定向进化技术改变原有酶分子的结构及催化特性，提高其在低温条件下的催化性能。目前采用该技术已成功对中温枯草芽孢杆菌素基因进行了改造。所产的低温枯草芽孢杆菌素在10℃下酶活提高100％。但目前采用该方法获得低温蛋白酶的例子尚不多见。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型低温蛋白酶编码基因及其在大肠杆菌中的功能表达，本申请人从南印度洋深海沉积物中分离纯化获得了一株产蛋白酶的嗜低温菌Planococcus sp.11813，保藏编号为：CGMCC No.8088，从中获得了一段编码新型低温蛋白酶的基因cpls8，新型低温蛋白酶编码基因，该基因所编码的蛋白序列共含有329个氨基酸残基，属S8家族丝氨酸蛋白酶，与目前数据库中已发表蛋白序列的最高源性仅为77％，并在大肠杆菌中实现了功能表达，获得一株高产低温蛋白酶的基因工程菌。

本发明实现目的的技术方案是：

一种新型低温蛋白酶编码基因，所述基因序列见序列1。

一种新型低温蛋白酶，由上述基因编码，其氨基酸序列见序列2。

一种产新型低温蛋白酶的基因工程菌，包括上述的基因。

而且，所述工程菌的宿主菌为E.coli Rosetta(DE3)。

而且，所述工程菌的载体为pET22b-cpls8。

上述基因工程菌发酵获得的低温蛋白酶。

而且，所述酶最适催化pH值为10，最适催化温度为37±5℃，在20～30℃之间保持最高酶活的50％以上。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明从动性球菌Planococcus sp.11815中克隆到一段新型低温蛋白酶编码基因cpls8，序列分析表明：该基因所编码的蛋白序列共含有329个氨基酸残基，属S8家族丝氨酸蛋白酶，与目前数据库中已发表蛋白序列的最高源性仅为77％。该基因在E.coil Rosseta(DE3)实现了功能表达，酶学性质分析表明：其最适催化pH值为10，最适催化温度为37℃左右，在20～30℃之间可保持最高酶活的50％以上，因此属典型的低温碱性蛋白酶，在洗涤、食品、医药等领域具有广泛的应用前景。

2、本发明获得的低温蛋白酶的最适反应pH值、最适作用温度、热稳定性以及不同金属离子对酶活的影响进行了检测，结果显示：该酶的最适pH值为10.0左右，最适作用温度在36～38℃之间，在30℃条件下酶活仍保持在最高酶活的80％以上，当反应温度超过38℃时，随着温度的升高，酶活力逐渐下降，当温度达到50℃以上时，酶活基本丧失；酶的热稳定性研究表明：重组蛋白酶在10℃条件下比较稳定，保温2h后酶活仍能达到90％以上，37℃保温1h后，残余酶活为60％左右，45℃保温30min，残留酶活为37％，保温1h后，残余酶活仅为15％；因此属于典型的低温碱性蛋白酶。不同的金属离子对酶活也有一定的影响；金属离子Ca²⁺对该重组蛋白酶有激活作用，Mn²⁺对酶活基本没有影响；Mg²⁺、Ba²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Zn²⁺则对其有一定的抑制作用，Ni²⁺对其抑制作用最强，浓度为1.0mmol/L的Ni²⁺可抑制90％以上的酶活。

附图说明

图1为重组质粒pET-22b-cpls8的构建；

图2为低温蛋白酶CPLS8在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE检测图；

图3为低温蛋白酶CPLS8纯化后的SDS-PAGE检测图；

图4为低温蛋白酶CPLS8的最适作用温度检测；

图5为低温蛋白酶CPLS8的热稳定性检测；

图6为低温蛋白酶CPLS8的最适作用pH检测。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一、本发明的目的在于采用分子生物学手段克隆了来自深海沉积物的细菌Planococcus sp.11815的新型低温蛋白酶编码基因cpls8，该基因所编码的蛋白序列共含有329个氨基酸残基，属S8家族丝氨酸蛋白酶，与目前数据库中已发表蛋白序列的最高源性仅为77％，因此属于新型低温蛋白酶。所述菌株Planococcus sp.11815的保藏日期为2013年08月29日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8088，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为：动性球菌Planococcus sp.

二、本发明提供海洋细菌新型低温蛋白酶编码基因的克隆及其在大肠杆菌中进行功能表达的方法。

1、蛋白酶编码基因cpls8的克隆：根据对来自于南印度洋深海沉积物中的菌株Planococcus sp.11815(所述菌株保藏日期为2013年08月29日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8088，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为：动性球菌Planococcus sp.)的菌株鉴定结果以及所产蛋白酶的序列分析结果，设计了兼并性引物：

cpls8F1：5’-CGAATTRTWGGTGGGAAAAACT-3’

cpls8R1：5’-TGYGGYGTYGCCATTGAAGT-3’

然后，以Planococcus sp.11815的全基因组为模板，通过PCR技术克隆到cpls8基因中565bp的一段保守区。PCR扩增条件为：95℃5分钟，95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃延伸5分钟。根据对该保守区的测序及分析比对结果，重新设计引物：

cpls8F2：5’-GATTATAACGGGCATGGCACC-3’

cpls8R2：5’-CCGGACAGACTGGCATATTTC-3

采用反向PCR的方法，分别获得该保守区的上下游序列，包括该基因的表达调控区。

2、蛋白酶编码基因cpls8在E.coli Rosetta(DE3)中的表达：根据克隆基因cpls8的ORF区序列，分别设计了上下游引物cpls8F-Nde Ⅰ和cpls8R-Xho I，并在该引物的末端添加了Nde Ⅰ和Xho I限制性酶切位点。

cpls8F-Nde Ⅰ：

5’-GGGAATTCCATATGAAAAATATTCATTTGATTCCATACCGC-3’

cpls8R-Xho I：

5’-CCGCTCGAGCCGGTCCAATCCATTAGCATAAGA-3’

以Planococcus sp.11815的基因组为模板，采用PCR的方式扩增出cpls8的开放阅读框(ORF)，回收PCR产物，并利用Nde Ⅰ和Xho I限制性酶切位点将其克隆至表达载体pET22b上得到表达载体pET22b-cpls8。将表达载体pET22b-cpls8转化至菌株E.coli Rosetta(DE3)中，接种于带氨苄青霉素的LB培养基中，200rpm，37℃震荡培养，待OD600为0.6～1.0时，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导6小时，收集菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液中(25mmol/L Tris-HCl缓冲液，10mmol/L CaCl₂，10％甘油，pH8.0)，超声破碎，离心，取上清，进行SDS-PAGE检测。

3、重组蛋白的分离纯化：

首先用5倍株床体积的缓冲液(25mmol/L Tris-HCl缓冲液，10mmol/LCaCl₂，10％甘油，pH8.0)洗涤平衡Ni2+-NTA柱，流速1mL/min；然后将超声裂解后的样品12000r/min离心10min。取上清，经0.45mm滤膜过滤后，流经Ni2+-NTA柱，流速1mL/min；待样品挂柱后，分别采用含有不同浓度咪唑(20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、200mM)的缓冲液(25mM Tris-HCl缓冲液，10mmol/L CaCl2，10％甘油，pH8.0)对挂柱蛋白进行分步洗脱，各收集组分经SDS-PAGE检测后，获得纯化的重组蛋白。

4、重组蛋白的活性检测及酶学性质分析：

本发明主要以suc-AAPF-pNa为底物进行酶活的检测，首先取50μL适当稀释的酶液(25mmol/L的Tris-HCl,10mmol/L CaCl2，10％甘油，pH 10.0)，37℃保温2min，加入同样温度的底物(用25mmol/L的Tris-HCl,10mmol/L CaCl2，10％甘油，pH 10.0的缓冲液配制的0.5mmol/L的suc-AAPF-pNa)400μL，于37℃反应10min，加入500μL 10％的三氯乙酸终止反应，静置离心，测定吸光度A₄₁₀，以提前灭活的反应体系为空白对照，通过已绘制的标准曲线计算酶活力。规定在37℃，pH 10.0的条件下，每分钟水解底物suc-AAPF-pNa释放出1μmolpNP所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。

5、本发明还分别对该重组酶的最适反应pH值、最适作用温度、热稳定性以及不同金属离子对酶活的影响进行了检测，结果显示：该酶的最适pH值为10.0左右，最适作用温度在36～38℃之间，在30℃条件下酶活仍保持在最高酶活的80％以上，当反应温度超过38℃时，随着温度的升高，酶活力逐渐下降，当温度达到50℃以上时，酶活基本丧失；酶的热稳定性研究表明：重组蛋白酶在10℃条件下比较稳定，保温2h后酶活仍能达到90％以上，37℃保温1h后，残余酶活为60％左右，45℃保温30min，残留酶活为37％，保温1h后，残余酶活仅为15％；因此属于典型的低温碱性蛋白酶。不同的金属离子对酶活也有一定的影响；金属离子Ca²⁺对该重组蛋白酶有激活作用，Mn²⁺对酶活基本没有影响；Mg²⁺、Ba²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Zn²⁺则对其有一定的抑制作用，Ni²⁺对其抑制作用最强，浓度为1.0mmol/L的Ni²⁺可抑制90％以上的酶活。

以下对上述步骤进行详细说明。

实施例1：

cpls8全基因的克隆

根据菌株分类鉴定及蛋白测序结果，设计了兼并性引物：

cpls8F1：5’-CGAATTRTWGGTGGGAAAAACT-3’

cpls8R1：5’-TGYGGYGTYGCCATTGAAGT-3’

提取海洋细菌Planococcus sp.11815基因组，并以其为模板，采用PCR的方式扩增出cpls8基因中565bp的一段保守区。PCR扩增条件为：95℃5分钟，95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃延伸5分钟。根据对该保守区的测序及分析比对结果，重新设计反向引物：

cpls8F2：5’-GATTATAACGGGCATGGCACC-3’

cpls8R2：5’-CCGGACAGACTGGCATATTTC-3

用Mbo I部分酶切Planococcus sp.11815基因组DNA，电泳分离并回收2～3kb的酶切片段，16℃连接环化，然后以此为模板，用反向引物cpls8F2和cpls8R2扩增出约600bp的条带，经胶回收及测序后，与已知的保守区拼接成完整的序列。反向PCR条件为：95℃5分钟，95℃30秒，50～55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃延伸5分钟。

实施例2：

cpls8全基因的序列分析

DNA序列分析比对及开放阅读框的定位使用NCBI网站的Blast和ORF Finder工具，蛋白分类及功能分析使用http://merops.sanger.ac.uk/，启动子及表达调控序列预测采用http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/的Promoter 2.0PredictionServer工具。

实施例3：

cpls8基因在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中的表达

根据克隆基因cpls8的ORF区序列，分别设计了上下游引物cpls8F-Nde Ⅰ和cpls8R-Xho I，并在该引物的末端添加了Nde Ⅰ和Xho I限制性酶切位点。

cpls8F-Nde Ⅰ：

5’-GGGAATTCCATATGAAAAATATTCATTTGATTCCATACCGC-3’

cpls8R-Xho I：

5’-CCGCTCGAGCCGGTCCAATCCATTAGCATAAGA-3’

以Planococcus sp.11815的基因组为模板，采用PCR的方式扩增出cpls8的开放阅读框(ORF)(PCR条件为：95℃5分钟，95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃延伸5分钟)，回收PCR产物，并利用Nde Ⅰ和Xho I限制性酶切位点将其克隆至表达载体pET22b上得到表达载体pET22b-cpls8，该基因所表达的氨基酸序列与载体上的组氨酸标签形成融合蛋白。将表达载体pET22b-cpls8转化至菌株E.coli Rosetta(DE3)中，接种于带氨苄青霉素的LB培养基中，200rpm，37℃震荡培养，待OD600为0.6～1.0时，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导6小时，收集菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液中(25mmol/L Tris-HCl缓冲液，10mmol/L CaCl₂，10％甘油，pH8.0)，超声破碎，离心，取上清，进行SDS-PAGE检测。

实施例4：

重组蛋白CPLS8的分离纯化

⑴收集并破碎菌体：将收集的菌体(菌体湿重约0.5g)重悬于10mL BindingBuffer(25mmol/L Tris-HCl缓冲液，10mmol/L CaCl₂，10％甘油，pH8.0)中，超声破碎，离心，取上清，并用0.45mm的滤膜过滤，取滤液待用。

⑵平衡Ni²⁺-NTA柱：用5～10倍株床体积的Binding Buffer(25mmol/LTris-HCl缓冲液，10mmol/L CaCl₂，10％甘油，pH8.0)洗涤平衡Ni²⁺-NTA柱，流速0.5～1mL/min。

⑶样品上柱：将细胞裂解所获得的上清液以0.5mL/min的流速，流经Ni²⁺-NTA柱；待样品完全挂柱后，再用2倍柱床体积的Binding Buffer(25mmol/LTris-HCl缓冲液，10mmol/L CaCl₂，10％甘油，pH8.0)冲洗Ni²⁺-NTA柱，去除未挂柱的杂蛋白。

⑷CPLS8的分离纯化：分别采用含有不同浓度咪唑(20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、200mM)的缓冲液(25mM Tris-HCl缓冲液，10mmol/L CaCl2，10％甘油，pH8.0)对挂柱蛋白进行分步洗脱，各收集组分经SDS-PAGE检测后，获得纯化的重组蛋白CPLS8。

实施例5：

重组酶CPLS8酶学性质的研究

⑴最适反应温度的测定：在不同温度(4℃、10℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃)和pH 10.0的条件下，测定低温蛋白酶CPLS8的酶活，将最高酶活定为100％，其他温度下的酶活与最高酶活的比值即为待测酶液在该温度下的相对酶活。

结果表明：该酶的最适作用温度在36～38℃之间，在30℃条件下酶活仍保持在最高酶活的80％以上，当反应温度超过38℃时，随着温度的升高，酶活力逐渐下降，当温度达到50℃以上时，酶活基本丧失。

⑵热稳定性的测定：将酶置于10℃、37℃、45℃的条件下保温2h，每隔一定时间取样在37℃、pH 10.0的条件下测定测残余酶活，在4℃条件下保存的待测酶的酶活力定为100％，绘制温度稳定性曲线。

结果表明：重组蛋白酶在10℃条件下比较稳定，保温2h后酶活仍能达到90％以上，37℃保温1h后，残余酶活为60％左右，45℃保温30min，残留酶活为37％，保温1h后，残余酶活仅为15％；因此属于典型的低温碱性蛋白酶。

⑶最适pH的测定：用不同pH值的磷酸盐缓冲液(pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、10.5、11.0)将待测酶液进行适当的稀释，在37℃及相应pH条件下测定酶活，酶活数值最大者计为100％，所对应的pH即为待测酶最适反应pH，其他pH下的单位酶活与最高值的比值即得出其相对酶活。

结果表明：该酶的最适作用pH为10.0左右，当pH值升至11时，仍能保持最高酶活的80﹪左右；当pH值降至7.0以下时，则酶活迅速降低，因此该酶属于典型的碱性蛋白酶。

⑷金属离子和其他抑制剂等对酶活的影响：将待测酶液置于各种金属离子(Ca²⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Zn²⁺，Mⁿ²⁺，Ba²⁺，1.0～5.0mmol/L)缓冲液中4℃保温1h，在pH10.0，37℃条件下测定残留的酶活。

结果表明：金属离子Ca²⁺对该重组蛋白酶有激活作用，Mn²⁺对酶活基本没有影响；Mg²⁺、Ba²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Zn²⁺则对其有一定的抑制作用，Ni²⁺对其抑制作用最强，浓度为1.0mmol/L的Ni²⁺可抑制90％以上的酶活。

表1：不同的金属离子对CPLS8酶活的影响.

本发明所述的低温蛋白酶CPLS8基因序列及推导氨基酸序列

Claims (7)

1.一种新型低温蛋白酶编码基因，其特征在于：所述基因序列见序列1。

2.一种新型低温蛋白酶，其特征在于：由权利要求1所述的基因编码，其氨基酸序列见序列2。

3.一种产新型低温蛋白酶的基因工程菌，其特征在于：包括权利要求1所述的基因。

4.根据权利要求3所述的产新型低温蛋白酶的基因工程菌，其特征在于：所述工程菌的宿主菌为E.coli Rosetta(DE3)。

5.根据权利要求3所述的产新型低温蛋白酶的基因工程菌，其特征在于：所述工程菌的载体为pET22b-cpls8。

6.权利要求3所述的基因工程菌发酵获得的低温蛋白酶。

7.根据权利要求6所述的低温蛋白酶，其特征在于：所述酶最适催化pH值为10，最适催化温度为37±5℃，在20～30℃之间保持最高酶活的50％以上。