CN105358706A - 用于蛋白质表达的酵母启动子 - Google Patents
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Abstract
公开了用于生产蛋白质的分离核酸、表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体,以及使用所述表达方法生产的蛋白质。更特别地,公开了从巴斯德毕赤酵母(<i>Pichia</i><i>?pastoris</i>)分离的具有启动子活性的核酸,以及使用巴斯德毕赤酵母启动子生产不同蛋白质和多肽的表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体。
Description
与相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年3月8日提交的美国临时申请序列号61/775,029的优先权,该临时申请通过引用结合到本文中。
公开内容领域
本发明涉及用于生产蛋白质和多肽的分离核酸、表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体,并且涉及使用所述表达方法生产的蛋白质和多肽。更特别地,本发明涉及从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分离的核酸,其中所述核酸具有启动子活性。本发明还涉及用于使用巴斯德毕赤酵母启动子生产蛋白质和多肽的表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体,并涉及使用所述表达方法生产的蛋白质和多肽。
发明背景和概述
酵母表达系统可用于有效地生产蛋白质,例如酶、激素和疫苗蛋白质,部分上是因为一些酵母迅速生产至高细胞密度,在简单和廉价的介质中生长,并且为真核生物因此可以以与哺乳动物中天然蛋白质相似的方式修饰蛋白质。此外,用合适的信号序列,表达的蛋白质可被分泌入培养基中以方便分离和纯化。一些酵母表达系统还为食品和制药工业所接受,因为其对于药物和食物产品的生产是安全的,不像真菌和细菌表达系统,它们可能在一些情况下,例如,对人食品制造,是不安全的。
因此,开发或改善可用于表达高水平蛋白质以增加产率、减少蛋白质分离和纯化费用以及降低人和动物健康产品和食物产品的成本的酵母表达系统,对多种工业,例如食品和动物饲料工业、人和动物健康工业等是有益的。
已经开发了多种类型的酵母表达系统,包括使用编码同源或异源蛋白质的核酸在酵母启动子控制下的诱导性或组成型蛋白质表达。启动子为连接编码蛋白质的核酸的5’末端的调节元件,并且可与宿主细胞(例如,酵母宿主细胞)中的多种调节因子相互作用以控制RNA从DNA转录。启动子还可控制RNA从DNA转录的时间。例如,在酵母菌巴斯德毕赤酵母中已经鉴定出AOX1启动子,并通常用于酵母表达系统中,因为其为紧密调节的强启动子。
由于酵母表达系统对多种工业,包括人类制药工业以及人食品和动物饲料工业的重要性,酵母表达系统的改善为许多研究和开发的焦点。因此,本发明人从巴斯德毕赤酵母中鉴定了对用于蛋白质在酵母中表达特别有效的启动子。本文所述启动子可用在,例如,甲醇-诱导性酵母表达系统中或用在用于蛋白质组成型表达的表达系统中。
在本发明一个说明性实施方案中,提供了一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含,例如,与选自如本文所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID
NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少90%、95%或98%同一性,或与其片段具有至少90%、95%或98%同一性的序列,其中所述分离核酸包含甲醇-诱导性的巴斯德毕赤酵母启动子序列。在其它实施方案中,提供包含这些启动子序列的表达载体、宿主细胞和DNA构建体。
在另一个实施方案中,提供使用这些启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包括在培养基中培养含有包含任何上述启动子序列与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。在另一个说明性实施方案中,提供根据该方法生产的分离蛋白质。
在本发明的一个说明性实施方案中,提供一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含,例如,与选自如本文所述的SEQ ID NO:7、SEQ ID
NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID
NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID
NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID
NO:14的序列具有至少90%、95%或98%同一性,或与其片段具有至少90%、95%或98%同一性的序列,其中所述分离核酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。在其它实施方案中,提供包含这些启动子序列的表达载体、宿主细胞和DNA构建体。
在另一个实施方案中,提供使用这些启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包括在培养基中培养含有包含任何上述启动子序列与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。在另一个说明性实施方案中,提供根据该方法生产的分离蛋白质。
下列条款清单中描述的所有实施方案也被考虑为按照本发明使用。对于下列条款中所述的所有实施方案,认为实施方案的任何可应用的组合均与本发明一致。
1.
一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID
NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID
NO:6的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列,其中所述分离核酸包含甲醇-诱导性巴斯德毕赤酵母启动子序列。
2. 条款1的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少95%同一性,或与其片段具有至少95%同一性。
3. 条款1的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少98%同一性,或与其片段具有至少98%同一性。
4. 条款1的分离核酸序列,其中所述分离核酸的序列为选自SEQ ID
NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID
NO:5和SEQ ID NO:6的序列,或其片段。
5.
条款1-4中任一项的分离核酸,与异源编码序列操作性连接。
6.
条款5的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。
7.
条款6的分离核酸,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
8.
条款7的分离核酸,其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶。
9.
条款8的分离核酸,其中所述蛋白质为植酸酶。
10.
条款8的分离核酸,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
11.
包含条款1-10中任一项的分离核酸的表达载体。
12.
包含条款11的表达载体的宿主细胞。
13.
包含条款1-10中任一项的分离核酸的宿主细胞。
14.
条款12或13中任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞为毕赤酵母属物种。
15.
条款14的宿主细胞,其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。
16.
包含条款1-10中任一项的分离核酸的DNA构建体。
17.
生产蛋白质的方法,所述方法包括步骤
在培养基中培养含有包含条款1-4中任一项的分离核酸与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。
18.
条款17的方法,其中所述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。
19.
条款18的方法,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
20.
条款19的方法,其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
21.
条款20的方法,其中所述蛋白质为植酸酶。
22.
条款20的方法,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
23.
条款17-22中任一项的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒与第二个表达盒组合表达。
24. 条款23的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16具有启动子活性。
25.
条款24的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒、第二个表达盒和第三个表达盒表达。
26. 条款25的方法,其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操作性连接。
27. 条款23的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操作性连接。
28.
根据条款17-27中任一项的方法生产的分离蛋白质。
29. 一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列,其中所述核酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子的序列。
30. 条款29的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID
NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少95%同一性,或与其片段具有至少95%同一性。
31. 条款29的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID
NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少98%同一性,或与其片段具有至少98%同一性。
32.
条款29的分离核酸序列,其中所述分离核酸的序列为选自SEQ ID
NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列,或其片段。
33.
条款29-32中任一项的分离核酸,与异源编码序列操作性连接。
34.
条款33的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。
35.
条款34的分离核酸,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
36.
条款35的分离核酸,其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
37.
条款36的分离核酸,其中所述蛋白质为植酸酶。
38.
条款36的分离核酸,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
39.
包含条款29-38中任一项的分离核酸的表达载体。
40.
包含条款39的表达载体的宿主细胞。
41.
包含条款29-38中任一项的分离核酸的宿主细胞。
42.
条款40或41中任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞为毕赤酵母属物种。
43.
条款42的宿主细胞,其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。
44.
包含条款29-38中任一项的分离核酸的DNA构建体。
45.
生产蛋白质的方法,所述方法包括在培养基中培养含有包含条款29-38中任一项的分离核酸与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。
46.
条款45的方法,其中所述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。
47.
条款46的方法,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
48.
条款47的方法,其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
49.
条款48的方法,其中所述蛋白质为植酸酶。
50.
条款48的方法,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
51.
条款45-50中任一项的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒与第二个表达盒组合表达。
52. 条款51的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16具有启动子活性。
53.
条款51的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒、第二个表达盒和第三个表达盒表达。
54.
条款53的方法,其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操作性连接。
55. 条款51的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操作性连接。
56.
根据条款45-55中任一项的方法生产的分离蛋白质。
57. 条款40或41中任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属(Hansenula)物种、毕赤酵母属(Pichia)物种、酵母菌属(Saccharomyces)物种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种、有孢圆酵母属(Torulaspora)物种、假丝酵母属(Candida)物种、耶氏酵母属(Yarrowia)物种和克鲁维酵母属(Kluveromyces)物种。
58.
包含条款44的DNA构建体的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种、酵母菌属物种、裂殖酵母属物种、有孢圆酵母属物种、假丝酵母属物种、耶氏酵母属物种和克鲁维酵母属物种。
59.
条款45-55中任一项的方法,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种、酵母菌属物种、裂殖酵母属物种、耶氏酵母属物种、有孢圆酵母属物种、假丝酵母属物种和克鲁维酵母属物种。
60.
条款12或13中任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞为甲醇营养型酵母。
61.
条款60的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
62.
包含条款16的DNA构建体的宿主细胞,其中所述宿主细胞为甲醇营养型酵母。
63.
条款62的宿主细胞,选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
64.
条款17-27中任一项的方法,其中所述宿主细胞为甲醇营养型酵母。
65.
条款64的方法,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
66. 条款25或53中任一项的方法,其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16具有启动子活性。
67.
生产一种或多种蛋白质的方法,所述方法包括在培养基中培养包含第一个表达盒、第二个表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述一个或多个额外表达盒的每个包含条款1-4中任一项的分离核酸与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接,其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。
68.
生产一种或多种蛋白质的方法,所述方法包括步骤
在培养基中培养包含第一个表达盒、第二个表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞,其中所述一个或多个额外表达盒的每个包含条款29-38中任一项的分离核酸与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接,其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。
69.
条款17或45中任一项的方法,进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化蛋白质的步骤。
70.
条款67或68中任一项的方法,进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化所述一种或多种蛋白质的一种或多种的步骤。
71.
条款1-70中任一项的分离核酸、宿主细胞、表达载体、分离蛋白质、DNA构建体或方法,其中所述分离核酸由SEQ ID NO. 1-14中的任一或其片段组成。
72.
由SEQ ID NO. 1-14中的任一或其片段组成的分离核酸。
73.
条款5的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。
74.
条款29的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。
75.
生产蛋白质或多肽的方法,所述方法包括步骤
在培养基中培养含有包含条款1-4中任一项的分离核酸与编码蛋白质或多肽的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞,其中所述培养在允许该蛋白质或多肽表达的条件下进行。
76.
生产蛋白质或多肽的方法,所述方法包括在培养基中培养含有包含条款29-38中任一项的分离核酸与编码蛋白质或多肽的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质或多肽表达的条件下进行。
附图简述
图1显示甲醇-诱导性启动子的核苷酸序列,CAM1_(FR839630_178837..180488)_selection (SEQ ID NO:1)。
图2显示甲醇-诱导性启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr1-1351_selection (SEQ ID NO:2)。
图3显示甲醇-诱导性启动子的核苷酸序列,THI4_selection (SEQ ID NO:3)。
图4显示甲醇-诱导性启动子的核苷酸序列,GPM2_selection (SEQ ID NO:4)。
图5显示甲醇-诱导性启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr2-0790_selection (SEQ ID NO:5)。
图6显示甲醇-诱导性启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr3-0842_selection (SEQ ID NO:6)。
图7显示组成型启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr1-0269_selection
(SEQ ID NO:7)。
图8显示组成型启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr2-0207_selection
(SEQ ID NO:8)。
图9显示组成型启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr2-0208_selection
(SEQ ID NO:9)。
图10显示组成型启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr2-0809_selection
(SEQ ID NO:10)。
图11显示组成型启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr4-0069_selection
(SEQ ID NO:11)。
图12显示组成型启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr4-0800_selection
(SEQ ID NO:12)。
图13显示组成型启动子的核苷酸序列,TEF2_selection巴斯德毕赤酵母CBS 7435染色体1,完整的复制子序列(SEQ ID NO:13)。
图14显示组成型启动子的核苷酸序列,PP7435_Chr3-0476_selection巴斯德毕赤酵母CBS 7435染色体3,完整的复制子序列(SEQ ID NO:14)。
图15显示AOX1启动子序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)。
图16显示AOX1启动子ATG起始密码子上游1000 bp的基因组序列(SEQ ID NO:16)。
图17显示用于检验用启动子表达α-半乳糖苷酶(A-gal)的报告质粒。
图18 (子图a-c)显示含报告质粒和不同启动子的毕赤酵母克隆中的A-gal表达的图。
说明性实施方案的详述
在本发明一个说明性实施方案中,提供一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含,例如,与选自如本文所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID
NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少90%、95%或98%同一性,或与其片段具有至少90%、95%或98%同一性的序列,其中所述核酸包含甲醇-诱导性巴斯德毕赤酵母启动子序列。在另一个实施方案中,所述分离核酸的序列为选自SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID
NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID
NO:6的序列,或其片段。在其它实施方案中,提供包含这些启动子序列的表达载体、宿主细胞和DNA构建体。
在另一个实施方案中,提供使用这些启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包括在培养基中培养含有包含任何上述启动子序列与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。在另一个说明性实施方案中,提供根据该方法生产的分离蛋白质。
在本发明一个说明性实施方案中,提供一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含例如,与选自如本文所述的SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID
NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID
NO:14的序列具有至少90%、95%或98%同一性,或与其片段具有至少90%、95%或98%同一性的序列,其中所述核酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子的序列。在另一个实施方案中,所述分离核酸序列为选自SEQ ID NO:7、SEQ ID
NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID
NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID
NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID
NO:14的序列,或其片段。在其它实施方案中,提供包含这些启动子序列的表达载体、宿主细胞和DNA构建体。上述启动子已经从目前被归类为巴斯德毕赤酵母酵母菌株的酵母菌株(即,NRRL
Y11430)中分离出。然而,该分类在某一时刻可能更改为Komagataella物种(例如,Komagataella phaffii)。
在另一个实施方案中,提供使用任何前段中的启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包括在培养基中培养含有包含任何前述启动子序列与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。在另一个说明性实施方案中,提供根据该方法生产的分离蛋白质。
下列条款清单中描述的所有实施方案均考虑为按照本发明使用。对于下列条款中所述的所有实施方案,认为实施方案的任何可应用的组合均与本发明一致。下列条款清单中描述的任何实施方案还考虑为与本申请的发明概述部分或本申请的说明性实施方案的详述部分所描述的任何实施方案一起使用。
1.
一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID
NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID
NO:6的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列,其中所述分离核酸包含甲醇-诱导性巴斯德毕赤酵母启动子序列。
2. 条款1的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少95%同一性,或与其片段具有至少95%同一性。
3. 条款1的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少98%同一性,或与其片段具有至少98%同一性。
4. 条款1的分离核酸序列,其中所述分离核酸的序列为选自SEQ ID
NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID
NO:5和SEQ ID NO:6的序列,或其片段。
5.
条款1-4中任一项的分离核酸,与异源编码序列操作性连接。
6.
条款5的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。
7.
条款6的分离核酸,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
8.
条款7的分离核酸,其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶。
9.
条款8的分离核酸,其中所述蛋白质为植酸酶。
10.
条款8的分离核酸,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
11.
包含条款1-10中任一项的分离核酸的表达载体。
12.
包含条款11的表达载体的宿主细胞。
13.
包含条款1-10中任一项的分离核酸的宿主细胞。
14.
条款12或13中任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞为毕赤酵母属物种。
15.
条款14的宿主细胞,其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。
16.
包含条款1-10中任一项的分离核酸的DNA构建体。
17.
生产蛋白质的方法,所述方法包括步骤
在培养基中培养含有包含条款1-4中任一项的分离核酸与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。
18.
条款17的方法,其中所述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。
19.
条款18的方法,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
20.
条款19的方法,其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
21.
条款20的方法,其中所述蛋白质为植酸酶。
22.
条款20的方法,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
23.
条款17-22中任一项的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒与第二个表达盒组合表达。
24. 条款23的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16具有启动子活性。
25.
条款24的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒、第二个表达盒和第三个表达盒表达。
26. 条款25的方法,其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操作性连接。
27. 条款23的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操作性连接。
28.
根据条款17-27中任一项的方法生产的分离蛋白质。
29. 一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列,其中所述核酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。
30. 条款29的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID
NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少95%同一性,或与其片段具有至少95%同一性。
31. 条款29的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID
NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少98%同一性,或与其片段具有至少98%同一性。
32.
条款29的分离核酸序列,其中所述分离核酸的序列为选自SEQ ID
NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列,或其片段。
33.
条款29-32中任一项的分离核酸,与异源编码序列操作性连接。
34.
条款33的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。
35.
条款34的分离核酸,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
36.
条款35的分离核酸,其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
37.
条款36的分离核酸,其中所述蛋白质为植酸酶。
38.
条款36的分离核酸,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
39.
包含条款29-38中任一项的分离核酸的表达载体。
40.
包含条款39的表达载体的宿主细胞。
41.
包含条款29-38中任一项的分离核酸的宿主细胞。
42.
条款40或41中任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞为毕赤酵母属物种。
43.
条款42的宿主细胞,其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。
44.
包含条款29-38中任一项的分离核酸的DNA构建体。
45.
生产蛋白质的方法,所述方法包括步骤
在培养基中培养含有包含条款29-38中任一项的分离核酸与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。
46.
条款45的方法,其中所述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。
47.
条款46的方法,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
48.
条款47的方法,其中所述蛋白质选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
49.
条款48的方法,其中所述蛋白质为植酸酶。
50.
条款48的方法,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
51.
条款45-50中任一项的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒与第二个表达盒组合表达。
52. 条款51的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16具有启动子活性。
53.
条款51的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒、第二个表达盒和第三个表达盒表达。
54.
条款53的方法,其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的序列的分离核酸操作性连接。
55. 条款51的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的序列的分离核酸操作性连接。
56.
根据条款45-55中任一项的方法生产的分离蛋白质。
57.
条款40或41中任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种、酵母菌属物种、裂殖酵母属物种、有孢圆酵母属物种、假丝酵母属物种、耶氏酵母属物种和克鲁维酵母属物种。
58.
包含条款44的DNA构建体的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种、酵母菌属物种、裂殖酵母属物种、有孢圆酵母属物种、假丝酵母属物种、耶氏酵母属物种和克鲁维酵母属物种。
59.
条款45-55中任一项的方法,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种、酵母菌属物种、裂殖酵母属物种、有孢圆酵母属物种、假丝酵母属物种、耶氏酵母属物种和克鲁维酵母属物种。
60.
条款12或13中任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞为甲醇营养型酵母。
61.
条款60的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
62.
包含条款16的DNA构建体的宿主细胞,其中所述宿主细胞为甲醇营养型酵母。
63.
条款62的宿主细胞,选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
64.
条款17-27中任一项的方法,其中所述宿主细胞为甲醇营养型酵母。
65.
条款64的方法,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
66. 条款25或53中任一项的方法,其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16具有启动子活性。
67.
生产一种或多种蛋白质的方法,所述方法包括在培养基中培养包含第一个表达盒、第二个表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述一个或多个额外表达盒的每个包含条款1-4中任一项的分离核酸与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接,其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。
68.
生产一种或多种蛋白质的方法,所述方法包括在培养基中培养包含第一个表达盒、第二个表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述一个或多个额外表达盒的每个包含条款29-38中任一项的分离核酸与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接,其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。
69.
条款17或45中任一项的方法,进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化蛋白质的步骤。
70.
条款67或68中任一项的方法,进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化所述一种或多种蛋白质的一种或多种的步骤。
71.
条款1-70中任一项的分离核酸、宿主细胞、表达载体、分离蛋白质、DNA构建体或方法,其中所述分离核酸由SEQ ID NO. 1-14中的任一或其片段组成。
72.
由SEQ ID NO. 1-14中的任一或其片段组成的分离核酸。
短语“由……组成”意指SEQ ID NO.所指定的序列除SEQ
ID NO.所对应的那些核苷酸序列外不包含额外的核苷酸序列。
73.
条款5的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。
74.
条款29的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。
75.
生产蛋白质或多肽的方法,所述方法包括步骤
在培养基中培养含有包含条款1-4中任一项的分离核酸与编码蛋白质或多肽的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞,其中所述培养在允许该蛋白质或多肽表达的条件下进行。
76.
生产蛋白质或多肽的方法,所述方法包括在培养基中培养含有包含条款29-38中任一项的分离核酸与编码蛋白质或多肽的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质或多肽表达的条件下进行。
本领域技术人员已知的任何酵母表达系统均可根据本发明使用。例如,美国专利号6,451,572、6,841,370、6,974,690、7,320,876、7,078,035、7,138,260和PCT公布号WO 2007/112739中描述了多种不同的酵母表达系统,其所有通过引用结合到本文中。在任何本文所述的实施方案中,可使用这些酵母表达系统中的任何。或者,可使用任何适合蛋白质表达的酵母物种或酵母表达系统,包括酵母物种,例如酵母菌属物种(例如,酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae))、克鲁维酵母属物种(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))、有孢圆酵母属物种、耶氏酵母属物种(例如,解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica))、裂殖酵母属物种(例如,粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces
pombe))。在另一个实施方案中,可使用甲醇营养型酵母物种例如毕赤酵母属物种(例如,巴斯德毕赤酵母或甲醇毕赤酵母(Pichia
methanolica))、汉逊酵母属物种(例如,多形汉逊酵母(Hansenula
polymorpha))、球拟酵母属(Torulopsis)物种、Komagataella物种、假丝酵母属物种(例如,博伊丁假丝酵母(Candida boidinii))和Karwinskia物种,特别是当启动子为甲醇-诱导性启动子时。在一个实施方案中,蛋白质可在甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母中表达。甲醇营养型酵母能够利用甲醇作为单一碳源产生维持细胞功能所需的能源。甲醇营养型酵母包含编码用于甲醇利用的酶的基因,例如编码醇氧化酶的基因。任何这些宿主细胞可为与本文所述启动子异源的宿主细胞菌株(即,宿主细胞通常不天然包含本文所述启动子)。
酵母表达系统可用于胞内生产充足量的蛋白质,或从酵母细胞分泌以使该蛋白质可方便地从培养基中分离或纯化。如本文所使用的,术语“表达”意指核酸在宿主细胞中的转录和/或翻译。酵母表达系统可包括,但不限于,用于表达蛋白质的酵母宿主细胞和表达载体(例如,DNA构建体)。所述表达载体可包含本文所述的启动子并且,如本领域已知的,启动子与表达载体异源(即,该组合不天然存在)。在一个实施方案中,蛋白质分泌入培养基受并入表达载体中的并且能够指导所表达蛋白质分泌出酵母细胞外的信号肽(例如,酵母α-因子信号肽、酵母KILM1信号肽、酵母PHO1信号肽或酵母SUC2信号肽)控制。在其它实施方案中,适合促进蛋白质从酵母细胞分泌的其它信号肽为本领域技术人员所已知。在一个方面,分泌后信号肽通常从蛋白质上切去。
在多个实施方案中,可使用本领域技术人员已知并且与酵母表达系统相容的任何表达载体(例如,自主复制或整合入宿主基因组的载体)。如本文所使用的,术语“载体”意指可通过整合入酵母细胞基因组或通过染色体外存在(例如,自主复制的质粒)转化酵母细胞的双链或单链形式或线性或环状形式的任何质粒,或其它载体。如本领域所已知的,载体(例如,表达载体或表达盒)为用于转化宿主细胞表达蛋白质、多肽或肽的核酸构建体,并且所述载体在其转化的宿主细胞中不天然存在。
在一个实施方案中,所述表达载体含有用于插入DNA片段的限制性核酸内切酶切割位点(例如,一个或多个克隆位点和/或多重克隆位点),和用于转化子选择的遗传标志。例如,用于转化子选择的遗传标志可包括允许转化的酵母在缺乏缺陷菌株所不能生产的必需营养物的培养基上生长的选择标志、编码已知生色底物的酶的选择标志或提供对药物包括但不限于G418、诺尔丝菌素(Nat)、Zeocin、杀稻瘟素或潮霉素的抗性的选择标志。在另一个实施方案中,所述表达载体含有用于转录终止的终止子序列(例如,AOX1或HSP150终止子)。在另一个实施方案中,所述表达载体具有含有多聚腺苷酸化位点的蛋白质编码序列下游的3’非翻译区。如本文所使用的,“3’非翻译区”意指不翻译为蛋白质并且位于蛋白质编码序列下游的核苷酸序列。通常,3’非翻译区包含用于mRNA加工的调节序列。在另一个实施方案中,所述表达载体具有用于载体,例如,在细菌宿主中,合成和复制的复制起点(例如,细菌复制起点)。美国专利号6,451,572、6,841,370、6,974,690、7,320,876、7,078,035、7,138,260和PCT公布号WO 2007/112739中描述了多种不同的表达载体,其所有通过引用结合到本文中。表达载体的构建和使用在Sambrook等,“Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (分子克隆:实验室手册)”,第3版,Cold Spring Harbor
Laboratory Press, (2001)中描述,其通过引用结合到本文中。在另一个实施方案中,表达载体,或其片段,可从新合成或可使用PCR扩增并连接表达载体的部分。
如本文所使用的,“调节序列”意指通常分别在蛋白质编码序列5’或3’末端上游或下游的核苷酸序列。调节序列不翻译为蛋白质。调节序列包括,但不限于,影响RNA加工或稳定性的序列例如多聚腺苷酸化信号序列、增强子、阻遏物结合位点和启动子。
在一个实施方案中,蛋白质编码序列可在表达载体中与能够指导蛋白质,例如,在酵母中表达的启动子序列操作性连接。如本文所使用的,“操作性连接”意指功能性连接。如本文所述,启动子可为组成型或诱导性启动子,例如甲醇诱导性启动子。如本文所使用的,“组成型启动子”意指调节目的基因表达的启动子。术语“组成型启动子”为本领域所已知。如本文所使用的,“诱导性启动子”意指在细胞中通过外部刺激,例如化学、光、温度变化、细胞密度变化或蛋白质例如激素开启的调节启动子。甲醇诱导性启动子可具有一些组成型活性,尽管甲醇诱导性启动子在甲醇存在下诱导时具有最大活性。同样,组成型启动子可具有一些可诱导活性,但如本文所使用的“组成型启动子”在甲醇存在下诱导时不具有最大活性。
如本文所使用的“启动子”意指通常位于蛋白质编码序列5’末端上游的核苷酸序列,其部分上通过与控制转录的各种调节因子相互作用控制RNA从DNA转录。在一个实施方案中,启动子可从与用于蛋白质表达的酵母宿主细胞相同的酵母物种衍生。在另一个实施方案中,启动子可从与用于蛋白质表达的酵母宿主细胞不同的酵母物种衍生。在一个实施方案中,启动子可包含充当指导起始转录的识别位点的TATA盒序列,包括,但不限于一个或多个转录增强子元件。增强子元件可在TATA盒序列的近端或远端并且可为正常的5’到3’取向或可为3’到5’取向。在另一个实施方案中,增强子元件可为启动子序列天然的增强子元件或其可为插入表达载体构建体的异源增强子元件。如本文所使用的“增强子元件”为可刺激启动子活性的调节元件。
在本文所述多个说明性实施方案中,启动子可为分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ
ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ
ID NO:6的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性,或与其片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的序列,其中所述分离核酸包含甲醇-诱导性巴斯德毕赤酵母启动子序列。在另一个实施方案中,所述分离核酸序列为选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列,或其片段,其中所述分离核酸包含甲醇-诱导性巴斯德毕赤酵母启动子序列。
在其它实施方案中,启动子可为分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性或与其片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的序列,其中所述分离核酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。在另一个实施方案中,所述分离核酸序列为选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列,或其片段,其中所述分离核酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。
如本文所使用的“分离核酸”意指基本上不含在该核酸所衍生自的生物的基因组DNA中天然位于该核酸两侧的序列的核酸。例如,在多个实施方案中,本发明的分离核酸可包含小于约2 kb、小于约1 kb、小于约0.5 kb、小于约0.1 kb的核苷酸序列、小于约0.05 kb或无核苷酸序列,所述核苷酸序列在所述分离核酸所衍生自的生物的基因组DNA中天然位于所述核酸分子两侧。
如本文所使用的,“其片段”当涉及分离核酸分子时意指SEQ ID NO: 1-14的分离核酸的片段。在多个说明性实施方案中,所述片段可为约50个核苷酸长、约100个核苷酸长、约200个核苷酸长、约300个核苷酸长、约400个核苷酸长、约500个核苷酸长、约600个核苷酸长、约700个核苷酸长、约800个核苷酸长或约900个核苷酸长。在其它实施方案中,所述片段可在SEQ ID NO: 1-14中任何的分离核酸的3’末端上游延伸约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约800个核苷酸或约900个核苷酸。在又其它的实施方案中,所述片段可包含SEQ ID NO: 1-14的每个中所存在的TATA盒序列上游和/或下游的约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、约300个核苷酸或约350个核苷酸。
在多个实施方案中,本文所述分离核酸可通过本领域所熟知的核酸(例如,DNA)纯化技术纯化。例如,可通过物理方法包括,但不限于,离心、压力技术,或通过使用具有核酸(例如,DNA)亲和性的物质,例如,二氧化硅小球将所述核酸与污染物分离。充分洗涤后,可将分离核酸悬浮在水或缓冲液中。在其它实施方案中,市售试剂盒为可用的,例如Qiagen™、Nuclisensm™,以及Wizard™ (Promega)和Promegam™。用于纯化核酸的方法在Sambrook等,“Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (分子克隆:实验室手册)”,第3版,Cold Spring Harbor
Laboratory Press, (2001)中描述,其通过引用结合到本文中。本文所述的分离核酸可为还经纯化的分离核酸,或所述分离核酸可为不纯的。“纯化的核酸”当通过重组技术生产时基本上不含其它细胞物质或培养基,或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。
本文所述分离核酸能够,在合适的杂交条件下(例如,合适的缓冲液、离子强度、温度、甲酰胺和MgCl2浓度),与互补核酸特异性杂交。本文所述分离核酸可通过置换、缺失、截短修饰,和/或可与其它核酸分子融合,其中所得分离核酸与互补核酸特异性杂交。
同样在本发明范围内的为与本文所述分离核酸或其片段互补的核酸,以及与本文所述分离核酸杂交的那些或与其补体在高度严格的条件下杂交的那些。如本文所使用的,术语“互补的”是指嘌呤和嘧啶核苷酸序列通过氢键结合形成双链核酸分子的能力。鸟嘌呤与胞嘧啶、腺嘌呤与胸腺嘧啶以及腺嘌呤和尿嘧啶为互补的并且可通过氢键结合,当两个核酸分子具有“互补”序列时导致形成双链核酸分子。互补DNA序列被称为“补体”。
根据本发明“高度严格的条件”意指在5X SSPE和50%甲酰胺中于65℃杂交,并在0.5X SSPE中于65℃洗涤。高度严格杂交的条件在Sambrook等,“Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆:实验室手册)”,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)中描述,其通过引用结合到本文中。在一些说明性的方面,杂交可沿所述分离核酸的全长,或沿着其长度的部分,或对其片段发生。
还包括具有与本文所述分离核酸或其片段具有约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、96%、97%、98%和99%同一性的分离核酸分子。序列之间百分比同一性或相似性的确定可,例如,使用GAP程序(Genetics Computer Group,软件;目前可经由http://www.accelrys.com上的Accelrys取得)进行,比对可使用,例如,ClustalW算法(VNTI软件,InforMax Inc.)进行。序列数据库可使用目的分离核酸序列或其片段的序列搜索。数据库搜索的算法通常基于BLAST软件(Altschul等,1990)。在一些实施方案中,百分比同一性可沿所述分离核酸的全长确定。
用于合成本文所述分离核酸的技术为本领域所熟知并且包括化学合成和重组方法。这样的技术在Sambrook等,“Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆:实验室手册)”,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)中描述,其通过引用结合到本文中。分离核酸分子还可商业上制成。用于合成本文所述分离核酸的技术为本领域所熟知。本文所述分离核酸可通过本领域已知的技术,例如,限制酶分析或测序分析以确定所述分离核酸的序列。因此,本文所述分离核酸可为合成的。
在说明性的方面,用包含编码目的蛋白质的异源核酸与本文所述启动子之一操作性连接的表达载体,使用本领域技术人员熟知的程序转化酵母细胞。术语“转化”意指核酸或核酸片段至宿主细胞内的转移。在说明性实施方案中,这样的转化方案包括电穿孔、醋酸锂方法和使用原生质球。在说明性的方面,表达的核酸编码序列可为异源核酸编码序列。如本文所使用的,异源编码序列定义为人造或合成的核酸或源自与启动子序列所衍生自的物种不同的物种的核酸。因此,异源编码序列与本文所述启动子的连接不天然发生。
在多个实施方案中,转化的酵母细胞可通过包括分批和连续发酵在内的技术在液体培养基中或在半固体培养基或固体培养基上生长。通常,如本文所使用的“允许蛋白质表达的条件”意指酵母在液体培养基中分批或连续发酵的条件,但并不排除在半固体培养基例如琼脂上生长。用于酵母细胞的培养基为本领域所已知并且通常添加碳源(例如,葡萄糖)。典型的酵母培养基为包含酵母提取物(10克)、Bacto蛋白胨(20克)和葡萄糖(20克)的YPD肉汤(Sunrise Science Products, Inc.)。在一个说明性的方面,转化的酵母细胞可在特定时期内在控制pH的环境(pH约6)中并将碳源(例如,葡萄糖)连续维持在已知支持酵母细胞生长至期需密度的预定水平于30℃需氧生长。
在一个说明性实施方案中,提供生产蛋白质的方法。所述方法包括在培养基中培养含有包含SEQ ID NO: 1-14中任一项的分离核酸或其片段与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。所述方法可进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基纯化蛋白质的步骤。如本文所使用的,“表达盒”意指指导酵母细胞制造RNA的表达载体元件。表达盒至少包括调节序列(例如,启动子)和RNA与蛋白质编码序列(即,开放阅读框)。所述分离核酸可为与SEQ
ID NO: 1-14中任何的分离核酸或其片段具有至少80%、至少85%、至少90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。在多个说明性的方面,所述蛋白质编码序列可来自细菌、酵母、真菌或病毒。
在该方法实施方案中,所述蛋白质可使用第一个表达盒与第二个表达盒组合表达。在另一个实施方案中,第二个表达盒可包含1) 编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它已知甲醇-调节启动子,例如AOX
1、AOX 2、FLD或DAS启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID
NO:16具有启动子活性,或2) SEQ ID NO: 1-14任一的分离核酸,或其片段,与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接。
在又一个实施方案中,所述蛋白质可使用第一个表达盒、第二个表达盒和第三个表达盒表达。在另一个说明性的方面,第三个表达盒可包含1) 编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它已知甲醇-调节启动子,例如AOX
1、AOX 2、FLD或DAS启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID
NO:16具有启动子活性,或2) SEQ ID NO: 1-14任一的分离核酸,或其片段,与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接。
在另一个实施方案中,可使用任何数目的额外表达盒,并且所述表达盒可包含1) 编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它已知甲醇-调节启动子,例如AOX
1、AOX 2、FLD或DAS启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID
NO:16具有启动子活性,或2) SEQ ID NO: 1-14中任一的分离核酸,或其片段,与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接。在另一个实施方案中,如上所述的第一个表达盒、第二个表达盒和第三个表达盒连同第四个表达盒、第五个表达盒和第六个表达盒一起用于所述方法中,其中所有的表达盒均包含SEQ ID NO: 1-14中任一的分离核酸或其片段,与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接。
在又一个实施方案中,提供生产一种或多种蛋白质的方法。所述方法包括在培养基中培养包含第一个表达盒、第二个表达盒和任选,一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤,其中每个表达盒包含1) 编码一种或多种蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它已知甲醇-调节启动子,例如AOX
1、AOX 2、FLD或DAS启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID
NO:16具有启动子活性,或2) SEQ ID NO: 1-14中任一的分离核酸,或其片段,与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接,其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。所述方法可进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化该一种或多种蛋白质的步骤。
在前述两个段落中所描述的任何实施方案中,所述分离核酸可为与SEQ ID NO: 1-14中任一的分离核酸或其片段具有至少80%、至少85%、至少90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。在前述两个段落中所描述的任何实施方案中,所述表达盒可被包含在一个表达载体或多个表达载体中。在前述两个段落中所描述的任何实施方案中,并有表达盒的表达载体可为自主复制或整合入宿主细胞基因组的载体。
在多个说明性实施方案中,本文所述与启动子操作性连接的任何异源编码序列所编码的蛋白质可为选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白(例如,疫苗抗原)和细胞信号传导蛋白的蛋白质。在一个实施方案中,所述蛋白质为用于动物饲料的酶。在该实施方案中,所述蛋白质可选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。在另一个实施方案中,所述蛋白质可为可用于糖基化的酶。在另一个方面,通过使用多个表达盒(每个含有异源编码序列与启动子操作性连接)可表达一种以上的蛋白质。然而,这些蛋白质实例为非限制性的并且能够在酵母中表达的任何蛋白质、多肽或肽均可根据本文所述的分离核酸、表达载体、宿主细胞、DNA构建体、方法和分离蛋白质表达。上述酶可来自任何物种(例如,真菌物种,如酵母物种)。
用于根据本发明使用的酵母-表达蛋白质可通过常规技术以纯化形式生产。如本文所使用的,“分离蛋白质”意指纯化的蛋白质。纯化蛋白质基本上不含其它酵母细胞污染物或来自培养基的污染物。例如,“基本上不含”其它酵母细胞污染物或来自培养基的污染物意指所述蛋白质为至少约60%纯的、至少约70%纯的、至少约80%纯的、至少约90%纯的、至少约95%纯的、至少约98%纯的、约60%纯的、约70%纯的、约80%纯的、约90%纯的、约95%纯的或约98%纯的(所有均基于干重)。通常,所述蛋白质被分泌入酵母培养基并且从培养基中收集。
在一个说明性实施方案中,为了从培养基中纯化,所述蛋白质可,例如,经受硫酸铵沉淀随后DEAE-Sepharose柱色谱。在其它实施方案中,可使用本领域技术人员已知的常规技术例如硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、凝胶过滤、阴离子或阳离子交换色谱、DEAE-Sepharose柱色谱、羟基磷灰石色谱、凝集素色谱、亲和色谱、溶剂-溶剂萃取、超滤和HPLC。
或者,可能不需要纯化步骤,这是因为蛋白质在培养基中可能以高的浓度存在,使得该蛋白质在培养基中为基本上纯的(例如,70-80%纯的)。在一个实施方案中,所述蛋白质通过冷却酵母培养物(例如至约4℃-约8℃)并使用诸如离心、微孔过滤和旋转式真空过滤的技术去除酵母细胞从培养基中收集而无进一步纯化步骤。然后可将无细胞培养基中的蛋白质通过诸如超滤和切向流过滤的技术浓缩。
在其中蛋白质不分泌入培养基的一些实施方案中,可例如通过超声处理、加热或化学处理裂解酵母细胞,并离心匀浆以去除细胞碎片。然后可使上清液经受硫酸铵沉淀以及根据需要额外的分级分离技术,例入凝胶过滤、离子交换色谱、DEAE-Sepharose柱色谱、亲和色谱、溶剂-溶剂萃取、超滤和HPLC以纯化蛋白质。应理解的是上述用于从培养基或从裂解的酵母细胞中纯化蛋白质的纯化方法为非限制性的并且若获得基本上纯的蛋白质需要这样的技术,可使用本领域技术人员已知的任何纯化技术纯化酵母-表达的蛋白质。
可根据本发明制备所纯化蛋白质制备物的多种制剂。在一些实施方案中,蛋白质可通过添加其它蛋白质(例如,明胶和脱脂奶粉)、化学剂(例如,甘油、聚乙二醇、EDTA、山梨酸钾、苯甲酸钠以及还原剂和醛类)、多糖、单糖、脂类(氢化植物油)等稳定化。在一个实施方案中,可将用于添加到食物产品或动物饲料掺和物中的蛋白质干燥(例如,喷雾干燥、滚筒干燥和冻干法)并通过已知方法配制为粉末、颗粒、丸剂、矿物块、液体和凝胶。在一个实施方案中,可使用胶凝剂例如明胶、藻酸盐、胶原、琼脂、果胶和角叉菜胶。
在备选的实施方案中,蛋白质表达可为胞内表达,例如为了酵母中生物转化过程的酶促作用,或为了在酵母细胞表面显示。对于这样的实施方案,如本文所述表达的所述蛋白质未进行纯化。
在多个实施方案中,上述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白(例如,疫苗抗原)和细胞信号传导蛋白。在另一个实施方案中,上述蛋白质选自抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白(例如,疫苗抗原)和细胞信号传导蛋白。在又一个实施方案中可根据本发明使用所述蛋白质、其片段、融合蛋白质(例如,嵌合蛋白质)或肽的编码序列。在另一个实施方案中,可表达修饰的蛋白质,例如突变的蛋白质或含非天然氨基酸的蛋白质。
在一个实施方案中,所述毒素可为蛋白质例如,肉毒杆菌毒素或vero细胞毒素-1,并且使用本文所述方法、分离核酸、表达载体、宿主细胞和DNA构建体制备后,可使用靶向剂修饰毒素以使它们特异性地指向患病细胞。在另一个说明性的方面,所述抗体可为人源化抗体、未人源化的抗体、纳米抗体或抗体片段例如抗体的Fab片段或单链抗体。在另一个实施方案中,所述激素可为,例如,促性腺素、促肾上腺皮质激素、生长激素、加压素、催产素、生长抑素、胃泌素或瘦素。在另一个说明性实施方案中,所述生长因子可为胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、红细胞生成素、血小板衍生生长因子、血小板生成素或骨形态发生蛋白。在一个方面,所述细胞因子可为IL-2、IFN-α、IFN-γ或GM-CSF。在另一个说明性方面,所述疫苗蛋白可为在病人或动物中具有免疫原性的任何合适疫苗蛋白,包括,但不限于,HPV蛋白(例如,HPV 16和HPV 18),和破伤风疫苗蛋白,作为例子。在另一个说明性实施方案中,所述酶可为,例如如本文所讨论的用于动物饲料的酶、乙酰胆碱酯酶、环氧合酶或可在酵母中表达的任何其它有用酶。在另一个实施方案中,可表达结构蛋白,例如,导素、肌动蛋白结合蛋白或肌球蛋白,并且,在另一个实施方案中,可使用本文所述方法、分离核酸、表达载体、宿主细胞和DNA构建体表达细胞信号传导蛋白例如ras蛋白、激酶、ErbB2蛋白(Her-2受体)。
在一个实施方案中,所述蛋白质为用于动物饲料的酶。在该实施方案中,所述蛋白质可选自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶,或其组合。例如,可根据本文所述方法表达多种植酸酶。可根据本发明表达的示例性植酸酶基因(即,植酸酶编码序列)为衍生自细菌、丝状真菌、植物和酵母的植酸酶基因,例如衍生自大肠杆菌的appA (Gene Bank登录号M58708)和appA2 (Gene Bank登录号250016)基因以及衍生自真菌黑曲霉(Aspergillus niger)的phyA和phyB基因,或这些基因保留或具有改善的肌醇六磷酸磷酸水解酶活性的任何突变体(参见,例如,Rodriguez等, Arch. of Biochem. and Biophys. 382: 105-112 (2000),通过引用结合到本文中)。还可根据本发明表达置换、缺失和截短的植酸酶基因,或其片段。
在一个实施方案中,使用本文所述方法表达的蛋白质可用于包含动物饲料掺和物的动物饲料。在多个实施方案中,可使用本领域已知的任何动物饲料掺和物,例如菜籽粉、棉籽粉、豆粉和玉米粉。任选的动物饲料掺和物成分包括糖和复合碳水化合物例如水溶性和水不溶性单糖、二糖和多糖。可添加到饲料掺和物的任选氨基酸成分为精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸乙基HCl、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸乙基HCl和类似物,及其盐。可任选添加的维生素为硫胺素HCl、核黄素、吡哆醇HCl、尼克酸、烟酰胺、肌醇、氯化胆碱、泛酸钙、生物素、叶酸、抗坏血酸和维生素A、B、K、D、E等。还可添加矿物质、蛋白质成分(包括从肉粉或鱼粉获得的蛋白质)、液体或粉末鸡蛋、鱼汁、乳清蛋白质浓缩物、油类(例如,大豆油)、玉米淀粉、钙、无机磷酸盐、硫酸铜、盐和石灰石。还可添加抗氧化剂。
在另一个实施方案中,提供含有包含SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 14的分离核酸或其片段的表达载体的试剂盒。在一个说明性的方面,所述分离核酸,或其片段,可为与SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 14的分离核酸,或与其片段具有80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在多个说明性实施方案中,所述片段可为约50个核苷酸长、约100个核苷酸长、约200个核苷酸长、约300个核苷酸长、约400个核苷酸长、约500个核苷酸长、约600个核苷酸长、约700个核苷酸长、约800个核苷酸长或约900个核苷酸长。在其它实施方案中,所述片段可从SEQ ID NO:
1-14中任何的分离核酸的3’末端上游延伸约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约800个核苷酸或约900个核苷酸。在又其它的实施方案中,所述片段可包含SEQ ID NO: 1-14的每个中所存在的TATA盒序列的上游和/或下游的约50个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、约300个核苷酸或约350个核苷酸。
在一个实施方案中,所述试剂盒中包含的表达载体(即,含有异源启动子)可具有本文所述的任何其它元件,例如选择标志、克隆位点如多克隆位点、增强子、终止序列、信号肽序列等。在另一个方面,所述表达载体可为自主复制或整合入宿主细胞基因组的载体。在另一个实施方案中,所述表达载体可为环状或线性的(即,用限制酶消化以使目的基因可容易地克隆入表达载体)。在另一个实施方案中,所述试剂盒可包含表达载体和编码表达标志或对照基因的对照开放阅读框(例如,编码LacZ-α片段的开放阅读框)以用作对照显示该表达载体是有能力与目的基因连接和使用的。
在另一个说明性的实施方案中,所述试剂盒可含有包含环状表达质粒的管。在另一个实施方案中,所述试剂盒可包含具有用限制酶消化因此容易克隆目的基因的线性表达载体的管。在一个实施方案中,所述管可为无菌的。在这些实施方案的任一中,所述试剂盒还可包含环状或线性表达载体和编码表达标志或对照基因的对照开放阅读框(例如,编码LacZ-α片段的开放阅读框)以用作对照显示该表达载体可与目的基因连接,和/或显示宿主细胞有能力转化。
在又一个实施方案中,所述试剂盒可包含多个不同的表达载体。在另一个实施方案中,所述多个不同的表达载体可包含相同的启动子,但不同的可选择标志,例如抵抗药物G418、诺尔丝菌素(Nat)、Zeocin、杀稻瘟素或潮霉素的基因。在该实施方案中,所述试剂盒还可包含在管或其它容器中的与相应载体分开的等份的药物(例如,G418、诺尔丝菌素(Nat)、Zeocin、杀稻瘟素或潮霉素)。
在上述任何试剂盒的实施方案中,所述分离核酸可由SEQ ID NO.
1-14中的任一或其片段组成。短语“由……组成”意指SEQ ID
NO.所指定的序列除SEQ ID NO.所对应的那些核苷酸序列外不含有额外的核苷酸序列。
在另一个说明性的方面,所述试剂盒可包含与表达载体一起使用的其它组分,例如用于转化酵母细胞的组分、用于将目的蛋白质编码序列并入表达载体的限制酶、连接酶、用于纯化表达载体构建体的组分、缓冲液(例如,连接缓冲液)、使用说明书(例如,为了帮助克隆)和适合在试剂盒中用于制造和使用本文所述表达载体的任何其它组分。在另一个实施方案中,表达载体或试剂盒的任何其它组分可在密闭管(例如,无菌或未灭菌的)或任何其它合适容器或包装(例如,无菌或未灭菌的)中包含在试剂盒中。前述段落中所述包含表达载体的试剂盒含有包含本文所述启动子与载体(其与启动子异源)操作性连接的表达载体(即,该组合不天然存在)。
下列实施例提供用于实施本发明实践的说明性方法。正因如此,这些实施例仅用于说明目的提供并不意在限制。
实施例
实施例
1
启动子表达水平
表
1
发酵样品
基因 | 甘油饥饿 | 甘油进料6 hr | 甲醇诱导2 hr | 甲醇诱导6 hr | 甲醇诱导18 hr | 甲醇诱导48 hr | 甲醇诱导66 hr |
AOX1 | 958 | 54 | 21806 | 17607 | 10035 | 581 | 911 |
AOX2 | 185 | 28 | 10035 | 1374 | 1697 | 64 | 119 |
CAM1 | 316 | 166 | 13201 | 13201 | 24457 | 36959 | 36959 |
FLD1 | 3405 | 1293 | 11173 | 10632 | 13473 | 21806 | 14995 |
GPM2 | 884 | 549 | 7280 | 8614 | 8357 | 14995 | 17607 |
PP7435_Chr1-1351 | 2102 | 149 | 12171 | 13473 | 14995 | 17607 | 11173 |
PP7435_Chr1-0269 | 7766 | 8636 | 3252 | 3772 | 6615 | 9483 | 5969 |
PP7435_Chr2-0207 | 13473 | 17607 | 1520 | 858 | 4496 | 3914 | 3742 |
PP7435_Chr2-0208 | 21806 | 28506 | 2298 | 1136 | 7155 | 7280 | 8949 |
PP7435_Chr2-0790 | 2457 | 356 | 7829 | 7502 | 6433 | 2064 | 822 |
PP7435_Chr2-0809 | 5566 | 4305 | 1668 | 4205 | 4799 | 6758 | 2899 |
PP7435_Chr3-0476 | 6758 | 9425 | 1648 | 5566 | 6104 | 10632 | 10035 |
PP7435_Chr3-0842 | 243 | 134 | 8614 | 6987 | 5684 | 7155 | 12171 |
PP7435_Chr4-0069 | 7502 | 12171 | 1746 | 1162 | 7829 | 9425 | 13473 |
PP7435_Chr4-0800 | 5064 | 5916 | 2382 | 5415 | 5415 | 6987 | 3964 |
SPI1 | 275 | 203 | 673 | 376 | 267 | 164 | 195 |
TDH1 | 8949 | 841 | 2102 | 951 | 2965 | 813 | 104 |
TEF2 | 7155 | 2248 | 4305 | 7829 | 10632 | 3246 | 757 |
THI4 | 1668 | 68 | 14995 | 12171 | 2542 | 429 | 419 |
*所有数目为每百万的转录物
表
2
摇瓶样品
基因 | 菌株1:甘油摇瓶 | 菌株2:甘油摇瓶 | 菌株3:甘油摇瓶 | 菌株4:甘油摇瓶 | 菌株5:甲醇诱导 |
AOX1 | 7 | 8 | 24 | 22 | 3167 |
AOX2 | 12 | 16 | 9 | 8 | 109 |
CAM1 | 537 | 513 | 661 | 789 | 24110 |
FLD1 | 762 | 743 | 357 | 1202 | 17607 |
GPM2 | 303 | 352 | 699 | 561 | 9425 |
PP7435_Chr1-1351 | 9 | 10 | 15 | 19 | 10035 |
PP7435_Chr1-0269 | 5587 | 5535 | 11983 | 10362 | 6375 |
PP7435_Chr2-0207 | 2226 | 2152 | 3466 | 3246 | 680 |
PP7435_Chr2-0208 | 3167 | 3121 | 7502 | 4402 | 864 |
PP7435_Chr2-0790 | 41 | 48 | 31 | 26 | 1877 |
PP7435_Chr2-0809 | 6542 | 6433 | 2965 | 4305 | 6758 |
PP7435_Chr3-0476 | 28506 | 21806 | 28506 | 28506 | 7829 |
PP7435_Chr3-0842 | 14 | 16 | 48 | 44 | 1171 |
PP7435_Chr4-0069 | 4887 | 5684 | 8141 | 9425 | 6542 |
PP7435_Chr4-0800 | 21806 | 17607 | 10035 | 21806 | 7502 |
SPI1 | 2500 | 2035 | 4799 | 1529 | 136 |
TDH1 | 1770 | 5415 | 1177 | 1095 | 2654 |
TEF2 | 17607 | 28506 | 3914 | 3803 | 12171 |
THI4 | 10 | 58 | 40 | 30 | 452 |
*所有数目为每百万的转录物
实施例
2
用于分离RNA以检查启动子表达水平的菌株生长
将BG10菌株作为菌斑维持在YPD琼脂板上。对于转录组分析,从菌斑接种50 ml该菌株的培养物并在BMGY中30℃ (200 rpm)生长约16小时。将停滞的培养物稀释100倍至新鲜BMGY培养基中并30℃ (200 rpm)生长6小时。认为此时间点用甘油作为碳源指数生长。将等分部分在15 ml管中离心下来。其后,丢弃上清液并将细胞沉淀迅速在液氮中冷冻。将细胞沉淀储存在-80℃以用于随后的总RNA分离。
对于发酵期间的RNA-Seq分析,将如上所述生长的摇瓶培养物扩大至使用标准甲醇诱导条件的1升发酵罐。在甲醇诱导之前、期间和结束时的多个时间点取细胞样品。收集细胞沉淀并在液氮中冷冻。将细胞沉淀储存在-80℃以用于随后的总RNA分离。
实施例
3
总RNA分离
使用FastRNA SPIN试剂盒(MP Bio)分离总RNA。细胞裂解使用BioSpec Mini–Beadbeater 96进行。总RNA从离心柱洗脱至15 μl无RNA酶/DNA酶水中,在液氮中冷冻并储存在-80℃。将RNA样品在干冰上运送至Illumina HiSeq机器上进行RNA-Seq分析。RNA样品使用Agilent BioAnalyzer分析,并且所有均显示完整的酵母核糖体RNA峰。
实施例
4
RNA文库产生和测序
mRNA文库使用Illumina试剂制备。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒从多聚A RNA有选择地产生标有条形码(bar-coded)的cDNA。标上条形码并扩增后,汇集总计12个样品(8个发酵样品,4个摇瓶样品)用于分析。进行50个碱基单端读出。数据以标准FASTQ格式提供给BioGrammatics。基于模糊碱基和质量得分修正读出,然后过滤消除所有小于40个碱基长的修正读出。从每个数据集除去约0.3%的读出。
实施例
5
RNA-Seq分析
将来自Illumina HiSeq机器的数据集输入CLC Genomics
Workbench (版本6)。使用CLC Genomics Workbench的标准软件工具用于RNA-Seq分析。将RNA读出映射到参考巴斯德毕赤酵母基因组上。产生横跨12个样品数据集的5202个注释基因的转录谱。基于该转录谱,鉴定了组成型或甲醇调节转录模式的基因。
实施例
6
蛋白质表达分析
将多个启动子插入启动子检验载体(Promoter Tester Vector),(报告质粒,pJ-G-Agal,图17)以检验蛋白质表达。简言之,使用pJ-G-A-gal中的α-半乳糖苷酶(A-gal)开放阅读框(ORF)测量恰在A-gal ORF的5’插入的启动子的表达水平。使用选择DNA引物(IDT-DNA,表3)从毕赤酵母基因组DNA (gDNA,BioGrammatics菌株野生型巴斯德毕赤酵母菌株Bg10) PCR扩增分离的DNA。
表3 用于启动子的PCR引物
通过用0.5 mm Zirconia/Silica珠(BioSpec Products, Inc.)在酚-氯仿存在下剧烈摇动破碎细胞、然后EtOH沉淀并悬浮在Tris-EDTA溶液(10mM Tris, 1 mM EDTA)中分离Bg10 gDNA。PCR用校对聚合酶通过标准方法和制造商的推荐(New England BioLabs, NEB)进行35个循环(98˚C 10秒,~55˚C 10秒和72˚C ~30秒)。PCR扩增子纯化后(凝胶分离和提取,DNA Clean and Concentrator, Zymo-Research),然后使用策略上放置在引物中的限制酶位点通过如制造商(NEB)所推荐的连接将各个纯化的PCR扩增子独立地切割和连接到pJ-G-A-gal报告载体中(图17)。使用标准方法分离、扩增和纯化所得的各个pJ-G-A-gal-启动子质粒。在大多数情况下,报告分子起始密码子的“A”为相对于用于扩增启动子的引物在报告分子的约-1到-1,500碱基对位置(如表3中所指示)的+1位。
在所有情况下,这些报告质粒中的启动子序列使用载体插入位点的5’和3’引物确定;序列横跨整个启动子和克隆接头获得(Genewiz, Inc.),并与各自的mRNA序列比较以证实启动子克隆同一性。在所有情况下,启动子与A-gal ORF之间的克隆接头设计为放置在A-gal
ATG起始密码子处,使得其在启动子天然ORF起始密码子的预测ATG的同一位置。
将纯化的、序列无误的启动子-报告分子构建体线性化以通过电穿孔转化和整合入Bg10毕赤酵母细胞的毕赤酵母基因组。限制酶消化后将DNA净化和浓缩至约~200 ng/ul,然后将各个构建体独立地转化入电转-感受态毕赤酵母(Bg10, BioGrammatics, Inc.)中。通过用DTT孵育对数期细胞并随后用山梨醇洗涤使Bg10细胞成为感受态的(毕赤酵母方案)。电穿孔后,在含800 ug/ml G418的YPD上选择转化子并30℃孵育~3天。使所分离克隆的细胞在相似的YPD-G418平板上长出菌斑,并使用这些菌斑的细胞测量报告基因的表达水平。
A-gal ORF的表达,受不同的启动子调节,通过测量A-gal酶活性确定。报告分子活性从用100 mM磷酸盐缓冲液pH 6.5和作为生色底物的α-X-GAL制作的YPD琼脂平板评分。报告分子活性通过细胞内或周围的蓝色产物检测(图18)。将图18子图A中的平板12和23分别复制铺板于不同碳源的平板A和平板B上,分别在图18子图B和C示出。因此图18中的指名,子图A的平板12和23分别指图18子图B和C。NO:7、NO:8等符号是指SEQ ID NO (即,用于表达α-半乳糖苷酶的启动子)。不同启动子的α-半乳糖苷酶的表达水平在下列8个表中用0、+1、+2、+3、+4和+5标记,表达水平从0到+5增加。标记为“12A”的表与图18子图B中所示多种碳源的结果相对应。标记为“23B”的表与图18子图C中所示多种碳源的结果相对应。
相对的α-半乳糖苷酶表达,板12/A,葡萄糖
启动子(seq ID/名称) | 图18 (子图/行/列) | 碳源 | 相对A-gal表达 (1 – 5) |
No:7 | A/A/2 | 葡萄糖 | 3 |
No:7 | A/A/3 | 葡萄糖 | 3 |
No:7 | A/A/4 | 葡萄糖 | 3 |
No: 7 | A/B/1 | 葡萄糖 | 3 |
No:8 | A/B/2 | 葡萄糖 | 2 |
No:8 | A/B/3 | 葡萄糖 | 4 |
No:8 | A/B/4 | 葡萄糖 | 2 |
No:8 | A/B/5 | 葡萄糖 | 4 |
对照 | A/C/1 | 葡萄糖 | 0 |
No:8 | A/C/2 | 葡萄糖 | 2 |
No:5 | A/C/3 | 葡萄糖 | 3 |
No:10 | A/C/4 | 葡萄糖 | 2 |
No:10 | A/C/5 | 葡萄糖 | 3 |
No:10 | A/D/1 | 葡萄糖 | 3 |
No:14 | A/D/2 | 葡萄糖 | 2 |
No:14 | A/D/3 | 葡萄糖 | 4 |
No:14 | A/D/4 | 葡萄糖 | 0 |
No:14 | A/D/5 | 葡萄糖 | 5 |
对照 | A/E/1 | 葡萄糖 | 0 |
对照 | A/E/2 | 葡萄糖 | 0 |
No:12 | A/E/3 | 葡萄糖 | 2 |
No:12 | A/E/4 | 葡萄糖 | 2 |
No:12 | A/E/5 | 葡萄糖 | 1 |
09479 | A/F/1 | 葡萄糖 | 3 |
09479 | A/F/2 | 葡萄糖 | 2 |
09479 | A/F/3 | 葡萄糖 | 3 |
No:13 | A/F/4 | 葡萄糖 | 4 |
UPP-513 | A/F/5 | 葡萄糖 | 4 |
UPP-354 | A/G/1 | 葡萄糖 | 4 |
DAS | A/G/2 | 葡萄糖 | 0 |
1-0469 | A/G/3 | 葡萄糖 | 4 |
GAP | A/G/4 | 葡萄糖 | 3 |
No:3 | A/H/1 | 葡萄糖 | 2 |
No:2 | A/H/2 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | A/H/3 | 葡萄糖 | 0 |
No:11 | A/H/4 | 葡萄糖 | 3 |
No:11 | A/H/5 | 葡萄糖 | 3 |
No:3 | A/I/1 | 葡萄糖 | 2 |
No:3 | A/I/2 | 葡萄糖 | 2 |
No:3 | A/I/3 | 葡萄糖 | 1 |
No:3 | A/I/4 | 葡萄糖 | 2 |
No:3 | A/J/2 | 葡萄糖 | 1 |
No:3 | A/J/3 | 葡萄糖 | 2 |
相对的α-半乳糖苷酶表达,板12/A,甘油
启动子(seq ID/名称) | 图18 (子图/行/列) | 碳源 | 相对A-gal表达 (1 – 5) |
No:7 | A/A/2 | 甘油 | 3 |
No:7 | A/A/3 | 甘油 | 3 |
No:7 | A/A/4 | 甘油 | 3 |
No: 7 | A/B/1 | 甘油 | 3 |
No:8 | A/B/2 | 甘油 | 3 |
No:8 | A/B/3 | 甘油 | 4 |
No:8 | A/B/4 | 甘油 | 3 |
No:8 | A/B/5 | 甘油 | 4 |
对照 | A/C/1 | 甘油 | 0 |
No:8 | A/C/2 | 甘油 | 2 |
No:5 | A/C/3 | 甘油 | 2 |
No:10 | A/C/4 | 甘油 | 2 |
No:10 | A/C/5 | 甘油 | 2 |
No:10 | A/D/1 | 甘油 | 2 |
No:14 | A/D/2 | 甘油 | 2 |
No:14 | A/D/3 | 甘油 | 4 |
No:14 | A/D/4 | 甘油 | 0 |
No:14 | A/D/5 | 甘油 | 5 |
对照 | A/E/1 | 甘油 | 0 |
对照 | A/E/2 | 甘油 | 0 |
No:12 | A/E/3 | 甘油 | 2 |
No:12 | A/E/4 | 甘油 | 2 |
No:12 | A/E/5 | 甘油 | 1 |
09479 | A/F/1 | 甘油 | 3 |
09479 | A/F/2 | 甘油 | 2 |
09479 | A/F/3 | 甘油 | 3 |
No:13 | A/F/4 | 甘油 | 3 |
UPP-513 | A/F/5 | 甘油 | 3 |
UPP-354 | A/G/1 | 甘油 | 4 |
DAS | A/G/2 | 甘油 | 0 |
1-0469 | A/G/3 | 甘油 | 3 |
GAP | A/G/4 | 甘油 | 2 |
No:3 | A/H/1 | 甘油 | 3 |
No:2 | A/H/2 | 甘油 | 0 |
No:2 | A/H/3 | 甘油 | 0 |
No:11 | A/H/4 | 甘油 | 2 |
No:11 | A/H/5 | 甘油 | 3 |
No:3 | A/I/1 | 甘油 | 2 |
No:3 | A/I/2 | 甘油 | 2 |
No:3 | A/I/3 | 甘油 | 1 |
No:3 | A/I/4 | 甘油 | 2 |
No:3 | A/J/2 | 甘油 | 1 |
No:3 | A/J/3 | 甘油 | 2 |
相对的α-半乳糖苷酶表达,板12/A,甲醇平板
启动子(seq ID/名称) | 图18 (子图/行/列) | 碳源 | 相对A-gal表达 (1 – 5) |
No:7 | A/A/2 | 甲醇 | 2 |
No:7 | A/A/3 | 甲醇 | 3 |
No:7 | A/A/4 | 甲醇 | 2 |
No: 7 | A/B/1 | 甲醇 | 2 |
No:8 | A/B/2 | 甲醇 | 3 |
No:8 | A/B/3 | 甲醇 | 4 |
No:8 | A/B/4 | 甲醇 | 2 |
No:8 | A/B/5 | 甲醇 | 4 |
对照 | A/C/1 | 甲醇 | 1 |
No:8 | A/C/2 | 甲醇 | 2 |
No:5 | A/C/3 | 甲醇 | 3 |
No:10 | A/C/4 | 甲醇 | 2 |
No:10 | A/C/5 | 甲醇 | 3 |
No:10 | A/D/1 | 甲醇 | 3 |
No:14 | A/D/2 | 甲醇 | 2 |
No:14 | A/D/3 | 甲醇 | 5 |
No:14 | A/D/4 | 甲醇 | 0 |
No:14 | A/D/5 | 甲醇 | 5 |
对照 | A/E/1 | 甲醇 | 0 |
对照 | A/E/2 | 甲醇 | 1 |
No:12 | A/E/3 | 甲醇 | 2 |
No:12 | A/E/4 | 甲醇 | 4 |
No:12 | A/E/5 | 甲醇 | 1 |
09479 | A/F/1 | 甲醇 | 4 |
09479 | A/F/2 | 甲醇 | 2 |
09479 | A/F/3 | 甲醇 | 4 |
No:13 | A/F/4 | 甲醇 | 3 |
UPP-513 | A/F/5 | 甲醇 | 3 |
UPP-354 | A/G/1 | 甲醇 | 4 |
DAS | A/G/2 | 甲醇 | 2 |
1-0469 | A/G/3 | 甲醇 | 3 |
GAP | A/G/4 | 甲醇 | 3 |
No:3 | A/H/1 | 甲醇 | 2 |
No:2 | A/H/2 | 甲醇 | 2 |
No:2 | A/H/3 | 甲醇 | 2 |
No:11 | A/H/4 | 甲醇 | 1 |
No:11 | A/H/5 | 甲醇 | 3 |
No:3 | A/I/1 | 甲醇 | 2 |
No:3 | A/I/2 | 甲醇 | 2 |
No:3 | A/I/3 | 甲醇 | 0 |
No:3 | A/I/4 | 甲醇 | 2 |
No:3 | A/J/2 | 甲醇 | 1 |
No:3 | A/J/3 | 甲醇 | 2 |
相对的α-半乳糖苷酶表达,板12/A,乙醇
启动子(seq ID/名称) | 图18 (子图/行/列) | 碳源 | 相对A-gal表达 (1 – 5) |
No:7 | A/A/2 | 乙醇 | 2 |
No:7 | A/A/3 | 乙醇 | 2 |
No:7 | A/A/4 | 乙醇 | 2 |
No: 7 | A/B/1 | 乙醇 | 1 |
No:8 | A/B/2 | 乙醇 | 0 |
No:8 | A/B/3 | 乙醇 | 3 |
No:8 | A/B/4 | 乙醇 | 2 |
No:8 | A/B/5 | 乙醇 | 4 |
对照 | A/C/1 | 乙醇 | 0 |
No:8 | A/C/2 | 乙醇 | 1 |
No:5 | A/C/3 | 乙醇 | 2 |
No:10 | A/C/4 | 乙醇 | 1 |
No:10 | A/C/5 | 乙醇 | 2 |
No:10 | A/D/1 | 乙醇 | 2 |
No:14 | A/D/2 | 乙醇 | 1 |
No:14 | A/D/3 | 乙醇 | 5 |
No:14 | A/D/4 | 乙醇 | 0 |
No:14 | A/D/5 | 乙醇 | 5 |
对照 | A/E/1 | 乙醇 | 0 |
对照 | A/E/2 | 乙醇 | 0 |
No:12 | A/E/3 | 乙醇 | 1 |
No:12 | A/E/4 | 乙醇 | 1 |
No:12 | A/E/5 | 乙醇 | 0 |
09479 | A/F/1 | 乙醇 | 3 |
09479 | A/F/2 | 乙醇 | 2 |
09479 | A/F/3 | 乙醇 | 3 |
No:13 | A/F/4 | 乙醇 | 3 |
UPP-513 | A/F/5 | 乙醇 | 3 |
UPP-354 | A/G/1 | 乙醇 | 4 |
DAS | A/G/2 | 乙醇 | 0 |
1-0469 | A/G/3 | 乙醇 | 3 |
GAP | A/G/4 | 乙醇 | 2 |
No:3 | A/H/1 | 乙醇 | 2 |
No:2 | A/H/2 | 乙醇 | 0 |
No:2 | A/H/3 | 乙醇 | 1 |
No:11 | A/H/4 | 乙醇 | 2 |
No:11 | A/H/5 | 乙醇 | 3 |
No:3 | A/I/1 | 乙醇 | 2 |
No:3 | A/I/2 | 乙醇 | 1 |
No:3 | A/I/3 | 乙醇 | 0 |
No:3 | A/I/4 | 乙醇 | 2 |
No:3 | A/J/2 | 乙醇 | 1 |
No:3 | A/J/3 | 乙醇 | 2 |
相对的α-半乳糖苷酶表达,板23/B,葡萄糖
启动子(seq ID/名称) | 图18 (子图/行/列) | 碳源 | 相对A-gal表达 (1 – 5) |
No:4 | B/A/1 | 葡萄糖 | 0 |
No:4 | B/A/2 | 葡萄糖 | 0 |
No:4 | B/A/3 | 葡萄糖 | 0 |
No: 4 | B/A/4 | 葡萄糖 | 0 |
No:4 | B/B/1 | 葡萄糖 | 0 |
11231 | B/B/2 | 葡萄糖 | 0 |
11231 | B/B/3 | 葡萄糖 | 0 |
No:1 | B/B/4 | 葡萄糖 | 0 |
No:1 | B/B/5 | 葡萄糖 | 0 |
No:1 | B/C/1 | 葡萄糖 | 0 |
No:14 | B/C/2 | 葡萄糖 | 0 |
No:14 | B/C/3 | 葡萄糖 | 0 |
No:14 | B/C/4 | 葡萄糖 | 0 |
No:14 | B/C/5 | 葡萄糖 | 0 |
No:14 | B/D/1 | 葡萄糖 | 2 |
No:14 | B/D/2 | 葡萄糖 | 1 |
No:2 | B/D/3 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | B/D/4 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | B/D/5 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | B/E/1 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | B/E/2 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | B/E/3 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | B/E/4 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | B/E/5 | 葡萄糖 | 0 |
UPP-513 | B/F/1 | 葡萄糖 | 4 |
UPP-345 | B/F/2 | 葡萄糖 | 4 |
DAS | B/F/3 | 葡萄糖 | 0 |
1-0469 | B/F/4 | 葡萄糖 | 3 |
GAP | B/F/5 | 葡萄糖 | 4 |
09476 | B/G/1 | 葡萄糖 | 2 |
UPP 222 | B/G/2 | 葡萄糖 | 3 |
No:13 | B/G/3 | 葡萄糖 | 4 |
No:13 | B/G/4 | 葡萄糖 | 4 |
No:2 | B/H/1 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | B/H/2 | 葡萄糖 | 0 |
No:13 | B/H/3 | 葡萄糖 | 4 |
No:2 | B/H/4 | 葡萄糖 | 0 |
No:3 | B/I/2 | 葡萄糖 | 0 |
No:2 | B/I/3 | 葡萄糖 | 0 |
No:3 | B/I/4 | 葡萄糖 | 0 |
No:3 | B/J/3 | 葡萄糖 | 0 |
相对的α-半乳糖苷酶表达,板23/B,甘油
相对的α-半乳糖苷酶表达,板23/B,甲醇
启动子(seq ID/名称) | 图18 (子图/行/列) | 碳源 | 相对A-gal表达 (1 – 5) |
No:4 | B/A/1 | 甲醇 | 4 |
No:4 | B/A/2 | 甲醇 | 4 |
No:4 | B/A/3 | 甲醇 | 4 |
No: 4 | B/A/4 | 甲醇 | 4 |
No:4 | B/B/1 | 甲醇 | 4 |
11231 | B/B/2 | 甲醇 | 2 |
11231 | B/B/3 | 甲醇 | 3 |
No:1 | B/B/4 | 甲醇 | 4 |
No:1 | B/B/5 | 甲醇 | 5 |
No:1 | B/C/1 | 甲醇 | 4 |
No:14 | B/C/2 | 甲醇 | 3 |
No:14 | B/C/3 | 甲醇 | 2 |
No:14 | B/C/4 | 甲醇 | 1 |
No:14 | B/C/5 | 甲醇 | 0 |
No:14 | B/D/1 | 甲醇 | 2 |
No:14 | B/D/2 | 甲醇 | 1 |
No:2 | B/D/3 | 甲醇 | 3 |
No:2 | B/D/4 | 甲醇 | 3 |
No:2 | B/D/5 | 甲醇 | 3 |
No:2 | B/E/1 | 甲醇 | 4 |
No:2 | B/E/2 | 甲醇 | 2 |
No:2 | B/E/3 | 甲醇 | 3 |
No:2 | B/E/4 | 甲醇 | 3 |
No:2 | B/E/5 | 甲醇 | 3 |
UPP-513 | B/F/1 | 甲醇 | 5 |
UPP-345 | B/F/2 | 甲醇 | 5 |
DAS | B/F/3 | 甲醇 | 3 |
1-0469 | B/F/4 | 甲醇 | 3 |
GAP | B/F/5 | 甲醇 | 3 |
09476 | B/G/1 | 甲醇 | 2 |
UPP 222 | B/G/2 | 甲醇 | 4 |
No:13 | B/G/3 | 甲醇 | 4 |
No:13 | B/G/4 | 甲醇 | 4 |
No:2 | B/H/1 | 甲醇 | 2 |
No:2 | B/H/2 | 甲醇 | 1 |
No:13 | B/H/3 | 甲醇 | 4 |
No:2 | B/H/4 | 甲醇 | 1 |
No:3 | B/I/2 | 甲醇 | 3 |
No:2 | B/I/3 | 甲醇 | 2 |
No:3 | B/I/4 | 甲醇 | 3 |
No:3 | B/J/3 | 甲醇 | 3 |
相对的α-半乳糖苷酶表达,板23/B,乙醇
启动子(seq ID/名称) | 图18 (子图/行/列) | 碳源 | 相对A-gal表达 (1 – 5) |
No:4 | B/A/1 | 乙醇 | 0 |
No:4 | B/A/2 | 乙醇 | 0 |
No:4 | B/A/3 | 乙醇 | 0 |
No: 4 | B/A/4 | 乙醇 | 0 |
No:4 | B/B/1 | 乙醇 | 0 |
11231 | B/B/2 | 乙醇 | 0 |
11231 | B/B/3 | 乙醇 | 0 |
No:1 | B/B/4 | 乙醇 | 0 |
No:1 | B/B/5 | 乙醇 | 0 |
No:1 | B/C/1 | 乙醇 | 0 |
No:14 | B/C/2 | 乙醇 | 0 |
No:14 | B/C/3 | 乙醇 | 0 |
No:14 | B/C/4 | 乙醇 | 0 |
No:14 | B/C/5 | 乙醇 | 0 |
No:14 | B/D/1 | 乙醇 | 1 |
No:14 | B/D/2 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/D/3 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/D/4 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/D/5 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/E/1 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/E/2 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/E/3 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/E/4 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/E/5 | 乙醇 | 0 |
UPP-513 | B/F/1 | 乙醇 | 4 |
UPP-345 | B/F/2 | 乙醇 | 4 |
DAS | B/F/3 | 乙醇 | 0 |
1-0469 | B/F/4 | 乙醇 | 3 |
GAP | B/F/5 | 乙醇 | 4 |
09476 | B/G/1 | 乙醇 | 2 |
UPP 222 | B/G/2 | 乙醇 | 3 |
No:13 | B/G/3 | 乙醇 | 4 |
No:13 | B/G/4 | 乙醇 | 4 |
No:2 | B/H/1 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/H/2 | 乙醇 | 0 |
No:13 | B/H/3 | 乙醇 | 4 |
No:2 | B/H/4 | 乙醇 | 0 |
No:3 | B/I/2 | 乙醇 | 0 |
No:2 | B/I/3 | 乙醇 | 0 |
No:3 | B/I/4 | 乙醇 | 0 |
No:3 | B/J/3 | 乙醇 | 0 |
Claims (76)
1. 一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列,其中所述分离核酸包含甲醇-诱导性的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)启动子序列。
2. 权利要求1的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少95%同一性,或与其片段具有至少95%同一性。
3. 权利要求1的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少98%同一性,或与其片段具有至少98%同一性。
4. 权利要求1的分离核酸序列,其中所述分离核酸的序列为选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列,或其片段。
5. 权利要求1的分离核酸,与异源编码序列操作性连接。
6. 权利要求5的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。
7. 权利要求6的分离核酸,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
8. 权利要求7的分离核酸,其中所述蛋白质选自甘露聚糖酶、淀粉酶、葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶。
9. 权利要求7的分离核酸,其中所述蛋白质为植酸酶。
10. 权利要求7的分离核酸,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
11. 包含权利要求1的分离核酸的表达载体。
12. 包含权利要求11的表达载体的宿主细胞。
13. 包含权利要求1的分离核酸的宿主细胞。
14. 权利要求12的宿主细胞,其中所述宿主细胞为毕赤酵母属(Pichia)物种。
15. 权利要求14的宿主细胞,其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。
16. 包含权利要求1的分离核酸的DNA构建体。
17. 生产蛋白质的方法,所述方法包括在培养基中培养含有包含权利要求1的分离核酸与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。
18. 权利要求17的方法,其中所述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。
19. 权利要求18的方法,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
20. 权利要求19的方法,其中所述蛋白质选自甘露聚糖酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
21. 权利要求19的方法,其中所述蛋白质为植酸酶。
22. 权利要求19的方法,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
23. 权利要求17的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒与第二个表达盒组合表达。
24. 权利要求23的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16具有启动子活性。
25. 权利要求24的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒、第二个表达盒和第三个表达盒表达。
26. 权利要求25的方法,其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操作性连接。
27. 权利要求23的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的分离核酸操作性连接。
28. 根据权利要求17的方法生产的分离蛋白质。
29. 一种分离核酸,其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列,其中所述核酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子的序列。
30. 权利要求29的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少95%同一性,或与其片段具有至少95%同一性。
31. 权利要求29的分离核酸,其中所述分离核酸的序列与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少98%同一性,或与其片段具有至少98%同一性。
32. 权利要求29的分离核酸序列,其中所述分离核酸的序列为选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列,或其片段。
33. 权利要求29的分离核酸,与异源编码序列操作性连接。
34. 权利要求33的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质。
35. 权利要求34的分离核酸,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
36. 权利要求35的分离核酸,其中所述蛋白质选自甘露聚糖酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
37. 权利要求35的分离核酸,其中所述蛋白质为植酸酶。
38. 权利要求35的分离核酸,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
39. 包含权利要求29的分离核酸的表达载体。
40. 包含权利要求39的表达载体的宿主细胞。
41. 包含权利要求29的分离核酸的宿主细胞。
42. 权利要求40的宿主细胞,其中所述宿主细胞为毕赤酵母属物种。
43. 权利要求42的宿主细胞,其中所述毕赤酵母属物种为巴斯德毕赤酵母。
44. 包含权利要求29的分离核酸的DNA构建体。
45. 生产蛋白质的方法,所述方法包括在培养基中培养含有包含权利要求29的分离核酸与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。
46. 权利要求45的方法,其中所述蛋白质选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白。
47. 权利要求46的方法,其中所述蛋白质为用于动物饲料的酶。
48. 权利要求47的方法,其中所述蛋白质选自甘露聚糖酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
49. 权利要求47的方法,其中所述蛋白质为植酸酶。
50. 权利要求47的方法,其中所述蛋白质为半乳糖苷酶。
51. 权利要求45的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒与第二个表达盒组合表达。
52. 权利要求51的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16具有启动子活性。
53. 权利要求51的方法,其中所述蛋白质使用第一个表达盒、第二个表达盒和第三个表达盒表达。
54. 权利要求53的方法,其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的序列的分离核酸操作性连接。
55. 权利要求51的方法,其中所述第二个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13的序列具有至少90%同一性,或与其片段具有至少90%同一性的序列的序列的分离核酸操作性连接。
56. 根据权利要求45的方法生产的分离蛋白质。
57. 权利要求40的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属(Hansenula)物种、毕赤酵母属物种、酵母菌属(Saccharomyces)物种、耶氏酵母属(Yarrowia)物种、假丝酵母属(Candida)物种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种、有孢圆酵母属(Torulaspora)物种和克鲁维酵母属(Kluveromyces)物种。
58. 包含权利要求44的DNA构建体的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种、酵母菌属物种、耶氏酵母属物种、假丝酵母属物种、裂殖酵母属物种、有孢圆酵母属物种和克鲁维酵母属物种。
59. 权利要求45的方法,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种、酵母菌属物种、耶氏酵母属物种、假丝酵母属物种、裂殖酵母属物种、有孢圆酵母属物种、假丝酵母属物种和克鲁维酵母属物种。
60. 权利要求12的宿主细胞,其中所述宿主细胞为甲醇营养型酵母。
61. 权利要求60的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
62. 包含权利要求16的DNA构建体的宿主细胞,其中所述宿主细胞为甲醇营养型酵母。
63. 权利要求62的宿主细胞,选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
64. 权利要求17的方法,其中所述宿主细胞为甲醇营养型酵母。
65. 权利要求64的方法,其中所述宿主细胞选自汉逊酵母属物种、毕赤酵母属物种和假丝酵母属物种。
66. 权利要求25的方法,其中所述第三个表达盒包含编码蛋白质的异源编码序列与具有包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的序列或任何其它AOX1或AOX2启动子序列的序列的分离核酸操作性连接,其中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16具有启动子活性。
67. 生产一种或多种蛋白质的方法,所述方法包括在培养基中培养包含第一个表达盒、第二个表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述一个或多个额外表达盒的每个包含权利要求1的分离核酸与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接,其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。
68. 生产一种或多种蛋白质的方法,所述方法包括在培养基中培养包含第一个表达盒、第二个表达盒以及一个或多个额外表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述一个或多个额外表达盒的每个包含权利要求29的分离核酸与编码一种或多种蛋白质的异源编码序列操作性连接,其中所述培养在允许该一种或多种蛋白质表达的条件下进行。
69. 权利要求17的方法,进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化蛋白质的步骤。
70. 权利要求67的方法,进一步包括从所培养的宿主细胞的培养基中纯化所述一种或多种蛋白质的一种或多种的步骤。
71. 权利要求1的分离核酸、宿主细胞、表达载体、分离蛋白质、DNA构建体或方法,其中所述分离核酸由SEQ ID NO. 1-14中的任一或其片段组成。
72. 由SEQ ID NO. 1-14中的任一或其片段组成的分离核酸。
73. 权利要求5的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。
74. 权利要求29的分离核酸,其中所述异源编码序列编码选自毒素、抗体、激素、酶、生长因子、细胞因子、结构蛋白、免疫原性蛋白和细胞信号传导蛋白的蛋白质或多肽。
75. 生产蛋白质或多肽的方法,所述方法包括步骤
在培养基中培养含有包含权利要求1的分离核酸与编码蛋白质或多肽的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞,其中所述培养在允许该蛋白质或多肽表达的条件下进行。
76. 生产蛋白质或多肽的方法,所述方法包括在培养基中培养含有包含权利要求29的分离核酸与编码蛋白质或多肽的异源编码序列操作性连接的第一个表达盒的宿主细胞的步骤,其中所述培养在允许该蛋白质或多肽表达的条件下进行。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023184539A1 (zh) * | 2022-04-02 | 2023-10-05 | 武汉远大弘元股份有限公司 | 一种甲醇诱导启动子及其在制备丙谷二肽中的应用 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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EP3527667B1 (en) | 2013-03-08 | 2020-11-25 | Biogrammatics, Inc. | Yeast promoters for protein expression |
EP3217807A4 (en) | 2014-11-11 | 2018-09-12 | Clara Foods Co. | Methods and compositions for egg white protein production |
WO2017058884A2 (en) | 2015-09-28 | 2017-04-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Modified bacterial protein expression system |
CN109536395A (zh) * | 2018-02-07 | 2019-03-29 | 四川润格生物科技有限公司 | 一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株及应用 |
KR102131882B1 (ko) * | 2018-02-14 | 2020-08-06 | 씨제이제일제당 주식회사 | 효모를 이용하여 이취가 개선된 발효 조성물의 제조방법 |
EP3997118A4 (en) | 2019-07-11 | 2023-07-19 | Clara Foods Co. | PROTEIN COMPOSITIONS AND CONSUMABLE PRODUCTS THEREOF |
US10927360B1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-23 | Clara Foods Co. | Compositions comprising digestive enzymes |
WO2022115636A1 (en) * | 2020-11-25 | 2022-06-02 | Esperovax Inc. | Cell viability switch for genetically modified organisms |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101460612A (zh) * | 2006-04-04 | 2009-06-17 | 诺维信公司 | 肌醇六磷酸酶变体 |
WO2010004042A2 (en) * | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Novozymes A/S | Pichia pastoris das promoter variants |
WO2012129036A2 (en) * | 2011-03-22 | 2012-09-27 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Promoters for high level recombinant expression in fungal host cells |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US14716A (en) * | 1856-04-22 | Machine for digging peat | ||
US14715A (en) * | 1856-04-22 | Improvement in cultivators | ||
US7078035B2 (en) | 1997-08-13 | 2006-07-18 | Diversa Corporation | Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
US6451572B1 (en) | 1998-06-25 | 2002-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Overexpression of phytase genes in yeast systems |
CN100347303C (zh) | 1999-03-31 | 2007-11-07 | 康乃尔研究基金会有限公司 | 具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶 |
US6841370B1 (en) | 1999-11-18 | 2005-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase |
EP1450627B1 (en) | 2001-10-31 | 2012-09-05 | Phytex, Llc | Use of phytase containing animal food |
GB0126164D0 (en) | 2001-10-31 | 2002-01-02 | Danisco | Sequences |
TWI262083B (en) | 2001-12-28 | 2006-09-21 | Syngenta Participations Ag | Microbially-expressed thermotolerant phytase for animal feed |
US7943360B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-05-17 | Verenium Corporation | Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
US7226771B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-05 | Diversa Corporation | Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
WO2005123911A2 (en) | 2004-06-21 | 2005-12-29 | Novozymes A/S | Proteases |
AT501955B1 (de) * | 2005-02-23 | 2007-08-15 | Univ Graz Tech | Mutierte aox1-promotoren |
ATE486944T1 (de) * | 2005-11-16 | 2010-11-15 | Korea Res Inst Of Bioscience | Translationselongationsfaktor-promotor aus pichia pastoris und verfahren zur herstellung von rekombinantem protein unter verwendung davon |
EP2001999B1 (en) * | 2006-04-04 | 2012-05-16 | Novozymes A/S | Phytase variants |
WO2008063302A2 (en) | 2006-10-10 | 2008-05-29 | Keck Graduate Institute | Novel p. pastoris pastoris promoters, and the use thereof to direct expression of proteins in yeast, preferably using a haploid mating strategy |
WO2008090211A1 (en) * | 2007-01-26 | 2008-07-31 | Novozymes A/S | Method for methanol independent induction from methanol inducible promoters in pichia |
EA017803B1 (ru) | 2007-04-20 | 2013-03-29 | Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх | Система экспрессии |
US20120003695A1 (en) * | 2009-02-25 | 2012-01-05 | Davidson Robert C | Metabolic engineering of a galactose assimilation pathway in the glycoengineered yeast pichia pastoris |
CN102994501B (zh) | 2012-10-15 | 2018-04-27 | 华南理工大学 | 具有组成型启动子活性的dna及其应用和巴斯德毕赤酵母表达载体 |
EP2964765B1 (en) | 2013-03-08 | 2019-05-08 | Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences | Yeast promoters from pichia pastoris |
EP3527667B1 (en) | 2013-03-08 | 2020-11-25 | Biogrammatics, Inc. | Yeast promoters for protein expression |
US9150870B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-10-06 | Lonza Ltd. | Constitutive promoter |
US9822357B2 (en) * | 2013-07-05 | 2017-11-21 | Technische Universitat Graz | Bidirectional promoter |
JP7278261B2 (ja) * | 2017-08-23 | 2023-05-19 | ノバルティス アーゲー | マルチコピー遺伝子タンパク質発現系 |
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-
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101460612A (zh) * | 2006-04-04 | 2009-06-17 | 诺维信公司 | 肌醇六磷酸酶变体 |
WO2010004042A2 (en) * | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Novozymes A/S | Pichia pastoris das promoter variants |
WO2012129036A2 (en) * | 2011-03-22 | 2012-09-27 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Promoters for high level recombinant expression in fungal host cells |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023184539A1 (zh) * | 2022-04-02 | 2023-10-05 | 武汉远大弘元股份有限公司 | 一种甲醇诱导启动子及其在制备丙谷二肽中的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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