CN101864424B - 重组4A β 15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法 - Google Patents
重组4A β 15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种重组4Aβ15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，是将4Aβ15基因插入含有α-factor信号肽的组成型酵母表达载体pGAPZαA中，经电击转化毕赤氏酵母菌株GS115，在YPD平板上进行培养后获得工程菌株G115Z20004Aβ15，经摇瓶发酵，在发酵上清中有高含量的4Aβ15的表达，发酵上清经UNOsphere阴离子交换柱的一步纯化可得到纯度大于85％的重组四价Aβ15。本发明利用以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系进行重组四价Aβ15的表达，并且通过在引物中引入XhoI和XbaI酶切位点以及Kex2信号肽切割位点和终止密码子TCA，保证了重组4Aβ15的天然氨端和羧端，大大提高工程菌株发酵上清中目标蛋白的含量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组4Aβ15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法。通过构建毕赤氏酵母重组工程菌株，使酵母高效分泌表达重组四价Aβ15，经UNOsphere阴离子交换柱的一步纯化可得到纯度大于85％的重组四价Aβ15。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性的记忆丧失、意识障碍及人格变化为临床特征的中枢神经系统退行性疾病，也是最常见的一种老年痴呆。目前有证据表明，β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积是AD病理的中心环节。因此，以Aβ为靶的免疫治疗方法成为AD研究的热点。已有的研究表明Aβ42全肽疫苗临床试验在防治AD方面切实有效，但出现一些副反应而被终止。通过去除可能引起副反应的Aβ42C末端序列，并将AβN末端B细胞表位串联形成多价Aβ疫苗，可达到有效且安全的免疫目的。四价Aβ15是4个Aβ42N端1-15氨基酸的串联体，目前国内生产的重组四价Aβ15，主要是大肠杆菌表达产物，其工艺缺陷是：4Aβ15基因在大肠杆菌表达系统中为胞内表达，表达量低，且主要以包涵体形式存在。在生产的过程中，包涵体形式的蛋白质需要变性和复性，纯化困难，增加成本。而且为了便于纯化，人们往往在4Aβ15基因的 下游带有一个组氨酸标签序列，使得四价4Aβ15在作为疫苗免疫人体的过程中可能产生一些非特异的抗体，从而产生一些副作用。
毕赤酵母(Picha pastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于高密度发酵的大规模生产，尤其是以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系，表达外源蛋白时无需添加甲醇为碳源，可避免环境污染(甲醇是易挥发的有毒物质)和减少下游产物纯化的步骤。此外Picha.patoris可将表达产物分泌于细胞外，而且自身蛋白的分泌却很少，非常有利于下游的纯化。目前国内外未见采用以GAP为启动子的毕赤氏酵母表达体系表达重组四价Aβ15的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组4Aβ15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，是选用以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系进行重组四价Aβ15的表达，并且通过在引物中引入XhoI酶切位点和XbaI酶切位点以及Kex2信号肽切割位点和终止密码子TCA，保证了酵母分泌表达的重组4Aβ15的天然氨端和羧端。
本发明所采用的技术原理：是将4Aβ15基因插入含有α-factor信号肽的组成型酵母表达载体pGAPZαA中，线性化后电击导入毕赤氏酵母菌株GS115(购自Invitrogen公司)，经摇瓶发酵获得工程菌株【该工程菌株于2010年1月29日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学，保藏登记号为：CCTCCNO：M2010034，命名为G115Z20004Aβ15，分类命名为毕赤 氏酵母(Pichapastoris)】，实现重组四价Aβ15在发酵上清中的分泌表达。收集发酵上清，用SDS-PAGE分析，发现有重组蛋白质的表达，其分子量为18Kd，与四价Aβ15的理论值8KD不一致。Westernblot分析显示重组蛋白能够与Aβ42抗体结合，具有免疫反应性。而且进一步采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析测定了重组蛋白的分子量和N端的氨基酸序列。质谱结果显示重组蛋白的分子量为8KD，与理论值一致，N端的氨基酸序列亦与Aβ15N端的序列相同。重组蛋白被证实为Aβ15后，摇瓶发酵，发酵上清经UNOsphere阴离子交换柱的一步纯化可得到纯度大于85％的重组四价Aβ15。
本发明所采用的技术方案：
一种重组4Aβ15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，其步骤如下：
1、4Aβ15基因的克隆
以含有4Aβ15基因的质粒p415为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增产物经回收后与pMD18T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序，确定阳性克隆。引物序列如下：
P1：5’-CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3’
P2：5’-GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3’
2、构建重组表达质粒
对含有4Aβ15基因的pMD18T载体进行XhoI和XbaI的双酶切，回收小片段，同样用XhoI和XbaI酶切pGAPZαA质粒，回收大片段，然后再用T4DNA连接酶连接，构建成含有α-factor信号肽的组成型 酵母表达载体pGAPZaA-4Aβ15。
3、筛选重组工程菌株
将组成型酵母表达载体pGAPZaA-4Aβ15经AvrII酶切，然后采用电击方式将酶切产物转化毕赤氏酵母GS115，将转化液涂布含有Zeocin 25，50，100μg/mL的YPD平板，培养后获得抗性菌株，挑取Zeocin100μg/mL抗性菌株进行PCR鉴定，选取阳性克隆即为工程菌株，命名为G115Z20004Aβ15。
4、摇瓶发酵
将高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28℃-30℃培养48-96h，使毕赤氏酵母GS115分泌表达4Aβ15。
对上述重组4Aβ15进行检测：
(1)SDS-PAGE检测：收集发酵上清，用12％SDS-PAGE检测发酵上清中重组4Aβ15的表达。
(2)Western blotting检测：将丙酮沉淀后，将发酵上清加样进行12％聚丙烯酰凝胶电泳，然后用电转移至硝酸纤维膜上，用1％BSA封闭硝酸纤维膜，然后依次加入一抗(Aβ42抗体)和二抗(羊抗小鼠HRP标记IgG)，TBST洗涤5次，HRP-DAB底物显色试剂盒显色。
(3)质谱分析：从考染凝胶上切下重组蛋白带，送中山大学中山医学院蛋白质组中心进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析。
5、重组四价Aβ15的纯化。
离心收集分泌型4Aβ15重组酵母工程菌株G115Z20004Aβ15的 发酵上清，然后用1N NaoH调节pH值至7.5-8.5，载样于UNOsphere阴离子交换柱(1ml，Biorad.America)，先用5-10ml 20mmolTris.cl(pH7.5-8.5)平衡UNOsphere阴离子交换柱，然后用0-1mol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0.3-0.4mol/L NaCl目标洗脱峰，得到纯度大于85％的重组四价Aβ15。
本发明利用以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系进行重组四价Aβ15的表达，并且通过在引物中引入XhoI酶切位点和XbaI酶切位点以及Kex2信号肽切割位点和终止密码子TCA，保证了酵母分泌表达的重组4Aβ15的天然氨端和羧端，大大提高工程菌株发酵上清中目标蛋白的含量。
附图说明
图1是本发明的重组表达质粒pGAPZaA-4Aβ15的构建图。
图2是本发明的酵母转化子的PCR的鉴定。1.DL-2000Marker；2.宿主菌GS115；3.GS115/pGAPZaA；4.GS115/pGAPZaA-4Aβ15。
图3是本发明的SDS-PAGE电泳图谱。1.蛋白质分子量标准；2.GS115诱导表达96小时上清；3.GS115/pGAPZaA诱导表达96小时上清；4-7.GS115/pGAPZaA-4Aβ15诱导表达24小时，48小时，72小时，96小时上清。
图4是本发明的Western blotting检测。1、3.GS115/pGAPZaA-4Aβ15发酵上清；2、4.GS115/pGAPZaA发酵上清；5.预染的蛋白质分子量。
图5是本发明的重组4Aβ15的质谱分析。
图6是UNOsphere阴离子交换柱对发酵上清的纯化。1.标准蛋白质分子量；2.GS115/pGAPZaA-4Aβ15发酵上清；3.穿透锋4-8.NaCl洗脱峰；7、8为0.3mol/L NaCl目标洗脱峰，重组四价Aβ15的纯度为90％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例一
14Aβ15基因的克隆与测序
以本研究室前期构建的pQE4Aβ15为模板，设计的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶分析，大小为220bp左右，与理论值一致。产物回收后克隆到pMD18T载体，送去上海生工进行序列测定，测序结果表明4Aβ15基因已成功克隆到pMD18T载体中。引物序列如下：
P1-5’CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3’
XhoI Lys-Arg(Kex2位点)
P2-5’GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3’
XbaI
2酵母组成型分泌表达载体的构建
对含有4Aβ15基因的pMD18T载体进行XhoI和XbaI的双酶切，回收小片段，同样用XhoI和XbaI酶切pGAPZαA质粒，回收大片段，然后再用T4DNA连接酶连接，连接后转化TOP10菌株，获得Zeocin抗性的转化子，从转化子中提取重组表达质粒，酶切鉴定和DNA序列 测定，证明重组表达质粒的构建完全正确。(载体构建如图1)。
3重组表达质粒电转化毕赤氏酵母GS115
挑取毕赤氏酵母GS115单菌落，接种至YPD培养基，28℃-30℃至OD600达到1.3～1.5，离心收集菌体，用冰预冷的无菌水和1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀各洗涤两次，最后用1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液悬浮，制成感受态细胞。将10μg的经AvrII线性化的4Aβ15基因与80μl的感受态细胞混匀，在1300V，25μF，200Ω条件下电击转化，用1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，在30℃孵育2小时，然后将菌液涂布于含有25，50，100μg/mL zeocin的YPD平板上，28℃-30℃培养36小时左右，结果在含25，50，100μg/mL分别得到40，32，20个抗性单菌落。
4酵母阳性转化子的PCR鉴定
挑取上述获得的100μg/mL Zeocin抗性单菌落置于无菌水中，混匀，在微波炉中加热2分钟，再置于-20℃冰箱中，冷冻5分钟，重复此过程一次。离心后取上清液进行PCR，PCR反应条件按常规设置。引物序列如下：
pGAP forward primer：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’；
3’-AOX1 primer：5’-GCAAAT GGCATTCTGACATCC-3’。
(参见INVITROGEN酵母手册)1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。结果表明，以GS115基因组为模板的反应管中，没有特异带出现。在以GS115/pGAPZaA基因组DNA为模板的反应管中，有约520bp的片段，是扩增自表达载体pGAPZaA本身的DNA片段。而在 以GS115/pGAPZa4Aβ15基因组DNA为模板的管中有约740bp的DNA片断出现，这表明约220bp大小的4Aβ15基因已整合到GS115的酵母基因组中。所得阳性克隆为重组工程菌株G115Z20004Aβ15(如图2)。
5重组4Aβ15的检测与鉴定
5.1重组4Aβ15的SDS-PAGE分析
挑阳性克隆单菌落接种于YPD培养基中，于28℃，250rpm/min培养；每24h取样，离心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后进行12％SDS-PAGE分析，结果显示在18kD左右处产生一条新的蛋白质条带(见图3)。
5.2重组4Aβ15的Western blotting鉴定
将丙酮沉淀后上请加样进行12％聚丙烯酰凝胶电泳，然后用电转移至硝酸纤维膜上，用1％BSA封闭硝酸纤维膜，然后依次加入一抗(Aβ42抗体)和二抗(羊抗小鼠HRP标记IgG)，TBST洗涤5次，HRP-DAB底物显色试剂盒显色。结果显示在18KD左右处，G115Z20004Aβ15发酵上清有明显的目的蛋白带，而作为负对照的GS115/pGAPZaA发酵上清则没有特异带的出现。这表明甲醇诱导表达的重组蛋白能够与Aβ42抗体结合，具有免疫反应性(见图4)。
5.3重组4Aβ15的质谱分析
从考染凝胶上切下重组蛋白带，送中山大学中山医学院蛋白质组中心进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析。质谱结果显示重组蛋白的分子量为8KD，与4Aβ15的分子量理论值一致，N端的氨 基酸序列亦与4Aβ15N端的序列相同，充分表明G115Z20004Aβ15发酵上清中的重组蛋白是4Aβ15(见图5)。
6摇瓶发酵
将高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28℃-30℃培养72h，使毕赤氏酵母GS115分泌表达4Aβ15。
7重组4Aβ15的纯化
离心收集分泌型4Aβ15重组酵母工程菌株G115Z20004Aβ15的发酵72小时上清，然后用1N NaoH调节pH值至8.0，载样于UNOsphere阴离子交换柱(1ml，Biorad.America)，先用5mL 20mmolTris.cl(pH8.0)平衡UNOsphere阴离子交换柱，然后用0-1mol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0.3mol/L NaCl目标洗脱峰，得到纯度为90％的重组四价Aβ15(如图6)。
实施例二
1将实施例一获得的高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28℃-30℃培养48h，使毕赤氏酵母GS115分泌表达4Aβ15。
2、离心收集分泌型4Aβ15重组酵母工程菌株G115Z20004Aβ15的发酵48小时上清，然后用1N NaoH调节pH值至7.5，载样于UNOsphere阴离子交换柱(1ml，Biorad.America)，先用8mL 20mmolTris.cl(pH 7.5)平衡UNOsphere阴离子交换柱，然后用0-1mol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0.35mol/LNaCl目标洗脱峰，得到纯度为86％的重组四价Aβ15。
实施例三
1将实施例一获得的高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28℃-30℃培养96h，使毕赤氏酵母GS115分泌表达4Aβ15。
2、离心收集分泌型4Aβ15重组酵母工程菌株G115Z20004Aβ15的发酵96小时上清，然后用1N NaoH调节pH值至8.5，载样于UNOsphere阴离子交换柱(1ml，Biorad.America)，先用10mL 20mmolTris.cl(pH 8.5)平衡UNOsphere阴离子交换柱，然后用0-0.5mol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0.4mol/LNaCl目标洗脱峰，得到纯度为88％的重组四价Aβ15。
对上述实施例所得产物进行检测，所得结果列表如下：
核苷酸或氨基酸序列表
<110>中山大学
<120>重组4Aβ15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法
<160>2
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)…(33)
<223>为了保持4Aβ15天然N端而设计的引物，在其中引入了XhoI酶切位点和Kex2信号肽切割位点，并删除了Kex2信号肽切割位点后的Ste13位点。
<400>1
ccgctcgaga aaagagatgc agaattccga cat
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)…(29)
<223>为了保持4Aβ15天然C端而设计的引物，引入了终止密码子TCA。
<400>2
gctctagatc attgatgatg aacttcata
Claims (1)
1.一种重组4Aβ15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，其特征在于，其步骤如下：
1)、4Aβ15基因的克隆
以含有4Aβ15基因的质粒为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增产物经回收后与pMD18T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序，确定阳性克隆；引物序列如下：
P1：5’-CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3’
P2：5’-GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3’
2)、构建重组表达质粒
对含有4Aβ15基因的pMD18T载体进行XhoI和XbaI的双酶切，回收小片段，同样用XhoI和XbaI酶切pGAPZαA质粒，回收大片段，然后再用T4DNA连接酶连接，构建成含有α-factor信号肽的组成型酵母表达载体；
3)、筛选重组工程菌株
将组成型酵母表达载体经AvrII酶切，然后采用电击方式将酶切产物转化毕赤氏酵母GS115，将转化液涂布含有Zeocin 25，50，100μg/mL的YPD平板，培养后获得抗性菌株，挑取Zeocin100μg/mL抗性菌株进行PCR鉴定，选取阳性克隆即为工程菌株；
4)、摇瓶发酵
将高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28℃-30℃培养48-96h，分泌表达4Aβ15；
5)、重组4Aβ15的纯化
离心收集分泌型4Aβ15重组酵母工程菌株的发酵上清，然后用1N NaOH调节pH值至7.5-8.5，载样于UNOsphere阴离子交换柱，先用5-10ml 20mmolTris.Cl平衡UNOsphere阴离子交换柱，然后用0-1mol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0.3-0.4mol/L NaCl目标洗脱峰，得到纯度大于85％的重组4Aβ15。
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Owner name: LIZHU MEDICINE GROUP CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: YAO ZHIBIN Effective date: 20111122 Owner name: YAO ZHIBIN Free format text: FORMER OWNER: ZHONGSHAN UNIVERSITY Effective date: 20111122 |
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 510275 GUANGZHOU, GUANGDONG PROVINCE TO: 519070 ZHUHAI, GUANGDONG PROVINCE |
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Effective date of registration: 20111122 Address after: 519070, No. 132, Guihua North Road, Xiangzhou District, Guangdong, Zhuhai, Gongbei Applicant after: LIVZON PHARMACEUTICAL Group Inc. Address before: 510275 room 74, medical science and technology building, No. two, 1001 Road, Zhongshan, Guangdong, Guangzhou Applicant before: Yao Zhibin Effective date of registration: 20111122 Address after: 510275 room 74, medical science and technology building, No. two, 1001 Road, Zhongshan, Guangdong, Guangzhou Applicant after: Yao Zhibin Address before: 510275 Xingang West Road, Guangdong, China, No. 135, No. Applicant before: Sun Yat-sen University |
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