CN1757708A - 一种分泌型毕赤酵母菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明构建了一种新的分泌型毕赤酵母表达载体用于表达带组氨酸标签的重组D－氨基酸氧化酶。工程菌培养过程中能够分泌重组D－氨基酸氧化酶，与胞内表达D－氨基酸氧化酶的重组菌株相比较，免除了细胞破碎步骤。利用蛋白质工程在DAO基因的N端加上了6个组氨酸，利用金属螯合亲和层析一步法纯化就可以去除杂酶，简化了目的蛋白质提纯工艺。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程菌和微生物发酵领域，具体地说，是关于一种表达D-氨基酸氧化酶的分泌型毕赤酵母菌株及其构建方法。
背景技术
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAO，EC 1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类，它催化D型氨基酸氧化脱氨反应生成相应的酮酸和氨，并伴随着一分子氧还原，而释放出过氧化氢。在两步酶法生产7-氨基酸头孢烷酸(7-ACA)工艺中，DAO用于转化头孢菌素C(CPC)的第一步反应。
巴斯德毕赤酵母已经成为一种主要的真核微生物表达系统(Cregg JM.，Vedvick TS.，Raschke WC.Bio/Technology.11：905-910，1993)。毕赤酵母可以高密度发酵，毕赤酵母表达系统中整合质粒常用的启动子是醇氧化酶启动子(Alcohol oxidasel promoter，PAOX1)和三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，PGAP)。
甲醇诱导型毕赤酵母菌株能够表达三角酵母来源的DAO(Yu J，Yang S，Yuan ZY.J.Mol.Catal B-Enzym.18：291-297，2002)，但是诱导型毕赤酵母菌在发酵过程中，需要添加甲醇诱导，而且发酵过程中条件控制比较复杂；而产物的提取需要先对细胞进行破碎，因此也有必要进一步加以改进。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有表达D-氨基酸氧化酶(DAO)的甲醇诱导型毕赤酵母菌的上述缺点和不足，从而提供一种表达DAO的分泌型毕赤酵母基因工程菌株。
本发明的另一个目的在于提供一种表达DAO的分泌型毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。
本发明的表达DAO的分泌型毕赤酵母菌株转化有重组质粒pMMWY01，该重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子，并含有D-氨基酸氧化酶基因和ZeocinTM抗性基因。
本发明的分泌型毕赤酵母重组菌株的构建方法包括以下步骤：
A、PCR扩增HDAO片段，割胶回收带有组氨酸纯化标签的DAO基因(HDAO)片段；HDAO基因片段与pGEM-T载体用T4连接酶连接后得到重组质粒pMMWY。质粒pMMWY用PstI酶切，割胶回收HDAO基因片段。
B、毕赤酵母表达载体pGAPZαB含有酿酒酵母来源的信号肽(Saccharomyces cerevisiaeα-Factor Secretion Signal)，载体pGAPZαB用PstI单酶切，乙醇沉淀回收线性化载体片段，用T4连接酶连接pGAPZαB线性化片段和HDAO基因片段，得到重组质粒pMMWY01。
C、将重组质粒pMMWY01电击转化入毕赤酵母宿主菌中，构建成表达D-氨基酸氧化酶的分泌型毕赤酵母重组菌株。
与现有技术中已知的DAO生产菌株相比，本发明的带组氨酸标签的重组DAO的表达菌株在培养过程中能够分泌重组D-氨基酸氧化酶，与胞内表达D-氨基酸氧化酶的重组菌株相比较，免除了细胞破碎步骤。
本发明中新构建的分泌型重组毕赤酵母菌株，借助酿酒酵母来源的信号肽分泌表达重组D-氨基酸氧化酶，免除了细胞破碎步骤。利用蛋白质工程在DAO基因的N端加上了6个组氨酸，我们称为组氨酸纯化标签，利用金属螯合亲和层析一步法纯化就可以去除杂酶，简化了目的蛋白质提纯工艺。
附图说明
图1为在毕赤酵母中分泌表达三角酵母DAO的重组整合质粒pMMWY01构建流程图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
以下实施例中，DNA片段连接、质粒的制备，化学转化法和克隆均参照分子克隆(Sambrook，J.，Fritsch，E.P.，Maniatis，T.(2001)“Molecular Cloning：A Laboratory Manual3rd ed，”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本发明构建的表达DAO的分泌型巴斯德毕赤酵母菌株MMWY01已于2005年8月9日提交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 205089。
实施例1、质粒构建
1、材料：
质粒pGEM-T：Promega公司产品，大小为3.0kb，含有氨苄青霉素抗性基因。
质粒pGAPZαB：Invitrogen公司产品，大小为3.1kb，含有Zeocin抗性基因，启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因。
质粒pLHB-3：按照Liu HB.等(Liu HB.，Jiang WH.，Yang YL.Cloning，Sequencing andExpression of D-amino acid oxidase gene.Chinese Journal of Biotechnology 15：337-342，1999)的方法构建，大小为6.4kb，含有带组氨酸纯化标签的DAO基因(HDAO)，卡那霉素抗性基因，启动子是T7lac，且带有组氨酸纯化标签。
2、方法：
如图1所示，以质粒pLHB-3为模板，设计扩增HDAO基因的一对引物如下：
上游引物：5’-AA
CA
ATGGCTAAAATCGTTGTT-3’；
下游引物：5’-CTAAAGGTTTGGTCGAGTAAG-3’。
扩增条件为：
94℃，30s，56℃，30s，72℃，1min，30个循环。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收得到约1.1kb大小HDAO基因片段；HDAO基因片段与pGEM-T载体用T4连接酶连接后得到重组质粒pMMWY。质粒pMMWY用Pst I酶切，割胶回收约1.1kb大小HDAO基因片段；表达载体pGAPZαB用Pst I酶切线性化。T4连接酶连接上述两个基因片段得到重组质粒pMMWY01，该重组质粒的启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因，含有HDAO基因和Zeocin抗性基因。
实施例2、质粒扩增：
实施例1得到的质粒pMMWY01采用常规的化学转化法《参考分子克隆》转化至大肠杆菌宿主菌DH5α(Takara)，挑取单个转化子接种到LB液体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化钠)中，在37℃培养扩增pMMWY01质粒。
实施例3、质粒转化
重组大肠杆菌在LB培养液中过夜培养后，参照《分子克隆》用碱裂解法从大肠杆菌抽提重组质粒pMMWY01，抽提的质粒pMMWY01再用Bln I酶切线性化，乙醇沉淀回收线性化重组质粒约10μg，然后将线性化质粒与毕赤酵母宿主菌GS115(his-mut+)感受态细胞80μl混合放于电转化杯，同时准备一份不添加线性化质粒pMMZY03的感受态细胞作为阴性对照，冰浴放置5min。采用Bio-rad电转化仪，电转化参数设置是1.5KV，25μF，200Ω，电击时间是4.6ms，电击转化后立即加人1ml冰浴的山梨醇。电击转化产物涂在含有100μg/ml ZeocinTM的YPDS(2％蛋白胨，1％酵母膏，2％葡萄糖，1M山梨醇，2％琼脂粉)平板上，放置28℃培养，2～3天后YPDS平板上长出转化子。
实施例4、转化子筛选
从YPDS平板上挑取10个转化子接种至YPD培养基(2％蛋白胨，1％酵母膏，2％葡萄糖)中，200rpm摇床培养，发酵温度为28℃，发酵至24h时取发酵液样品测定DAO活力。
一个酶活力单位(U)的DAO定义：37℃，pH8.5条件下，每分钟氧化脱氨生成1μmol酮酸所需的酶量。
采用比色法测定DAO活力(Nilsson.K.，Mosbach.K.，Appl.Biochem.Biotechnol.，6：293-308，1981)，具体如下：
所取发酵液样品经离心后取上清，加入用0.1mol/L、pH8.0的焦磷酸钠缓冲液配制的50mmol/L DL-甲硫氨酸溶液，在37℃浴中振荡反应30min，加入10％的三氯乙酸终止反应。将终止液稀释10倍后加入0.2％的2，4-二硝基苯肼饱和溶液，混匀静置10min。加入3mol/L的NaOH溶液，混匀后静置15min，离心后测定OD550值。
按照上述方法测定10个转化子的发酵液在24h时的DAO活力，结果如表1所示：
表1、DAO活力测定
| 菌株编号 | 时间(hr) | DAO活力(U/L) | 菌株编号 | 时间(hr) | DAO活力(U/L) |
| GAPS-1 | 24 | 150 | GAPS-6 | 24 | 198 |
| GAPS-2 | 24 | 102 | GAPS-7 | 24 | 174 |
| GAPS-3 | 24 | 75 | GAPS-8 | 24 | 95 |
| GAPS-4 | 24 | 210 | GAPS-9 | 24 | 230 |
| GAPS-5 | 24 | 79 | GAPS-10 | 24 | 94 |
上述结果是测定发酵上清液而得到，可见本发明的表达DAO的重组菌株是将DAO分泌到培养基中，因而是一种分泌型的表达菌株。
通过上述测定DAO活力的方法筛选出DAO表达最高的重组菌株，命名为MMWY01。该菌株并已于2005年8月9日提交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 205089。
Claims (8)
1、一种表达D-氨基酸氧化酶的分泌型毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述菌株转化有重组质粒pMMWY01，该重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子，并含有D-氨基酸氧化酶基因和ZeocinTM抗性基因。
2、如权利要求1所述的分泌型毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述重组质粒pMMWY01还带有组氨酸标签。
3、如权利要求1或2所述的分泌型毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述菌株的保藏号CCTCC M 205089。
4、一种分泌型毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
A、PCR扩增带有组氨酸纯化标签的D-氨基酸氧化酶基因片段，扩增的基因片段与pGEM-T载体连接后得到重组质粒pMMWY，质粒pMMWY用PstI酶切后回收带有组氨酸纯化标签的D-氨基酸氧化酶基因片段；
B、表达载体pGAPZαB用PstI酶切线性化后用连接酶与带有组氨酸纯化标签的D-氨基酸氧化酶基因片段相连接，得到重组质粒pMMWY01。
C、将重组质粒pMMWY01电击转化入毕赤酵母宿主菌中，构建成表达D-氨基酸氧化酶的分泌型毕赤酵母重组菌株。
5、如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A和B中所使用的连接酶为T4连接酶。
6、如权利要求4所述的方法，其特征在于，在将重组质粒pMMWY01电击转化入毕赤酵母宿主菌前还包括将重组质粒pMMWY01导入大肠杆菌进行扩增的步骤。
7、一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子，并含有D-氨基酸氧化酶基因和ZeocinTM抗性基因。
8、如权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒还带有组氨酸纯化标签。
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