CN105063066A

CN105063066A - 一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶及基因和应用

Info

Publication number: CN105063066A
Application number: CN201510487484.1A
Authority: CN
Inventors: 刘冬梅; 罗彤晖; 杨丹霞; 陈舒然; 黄智斌
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2015-08-10
Publication date: 2015-11-18

Abstract

本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶及基因和应用，本发明是利用PCR技术将蜡样芽孢杆菌LJ01中的亚硝酸盐还原酶(简称NiR)基因进行克隆并在大肠杆菌中进行了诱导表达，通过对加IPTG诱导含空质粒BL21、不加IPTG诱导含重组质粒BL21以及加IPTG诱导含重组质粒BL21的细胞进行超声破碎提取粗酶液，对其进行SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，利用亲和层析作用纯化得到高纯度的重组蛋白，解决了从蜡样芽孢杆菌中分离出纯度和含量较高NiR的难题。得到的大量的NiR重组蛋白可以用于食品中的亚硝酸盐的降解；也可用于非酸性环境中亚硝酸盐的降解及养殖水体中亚硝酸盐的降解。

Description

一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶及基因和应用

技术领域

本发明涉及一种含有蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的克隆表达以及通过大量表达以及高效亲和层析纯化方法得到纯度较高的亚硝酸盐还原酶(NiR)，从而对重组蛋白的性质进行研究。

背景技术

亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，主要原因有2个：(1)大量摄入亚硝酸盐对人体有害，亚硝酸盐的急性中毒作用是导致高铁血红蛋白症(Methemoglobin)，可产生常见的亚硝酸盐急性中毒症状，主要表现为组织缺氧、紫绀，伴随口唇、指甲和皮肤的颜色改变等现象；(2)亚硝酸盐还会造成人体或动物的慢性危害，亚硝酸盐在适宜的条件下，可与食品中蛋白质的分解产物胺进行反应，生成N-亚硝基化合物，目前已经合成该类化合物有100多种，已经证实其中约80％对动物有强致癌性，可诱发大肠、胃、肝、食道等器官的癌症。为预防亚硝酸盐的急性和慢性危害，探索降解食品中潜在致癌物亚硝酸盐的方法和机制，非常必要。NiR是脱氮过程中的第一限速酶，催化亚硝酸盐降解为一氧化氮，大部分反硝化细菌中都存在NiR，使得其可以高效快速有效降解亚硝酸盐。许多非食用细菌中NiR的分离纯化已被报道：Vigara从1944mgMonoraphidiumbraunii粗蛋白中纯化得到0.29mg铁氧还原蛋白–NiR[VigaraJ,García-SánchezMI,GarbayoI,etal.Purificationandcharacterizationofferredoxin–nitritereductasefromtheeukaryoticmicroalgaMonoraphidiumbraunii.PlantPhysiologyandBiochemistry,2002,40(5):401-405]；Ichiki从6170mg的Haloarculamarismortui粗蛋白中仅得到1.43mg的NiR[IchikiHandTanakaY.Purification,characterization,andgeneticanalysisofCu-containingdissimilatorynitritereductasefromadenitrifyingHalophilicArchaeon,Haloarculamarismortui.JournalofBacteriology,2001,183(14):4149–4156]；Inatomi对Haloferaxdenitrificans中的NiR进行纯化发现1060mg粗蛋白中只能得到0.08mg目的蛋白[InatomiKandHochsteinLI.ThepurificationandpropertiesofacoppernitritereductasefromHaloferaxdenitrificans.CurrentMicrobiology,1996,32:72-76]，国内外未见从蜡样芽孢杆菌中提纯NiR的研究。由于粗酶液中蛋白种类太多，而目的蛋白含量太低，导致纯化工作困难。为了提高NiR的含量，克隆表达技术得到了广泛的应用。通过克隆NiR基因然后在宿主细胞中大量表达，同时通过质粒使得重组蛋白带有特定标签从而简化纯化过程。

发明内容

为研究蜡样芽孢杆菌中NiR的性质，解决由于蜡样芽孢杆菌中NiR含量低而难于纯化的问题，本发明通过对其NiR编码基因的克隆表达来实现该蛋白在大肠杆菌中的大量表达，同时通过亲和层析法得到大量纯度较高的NiR，从而实现对LJ01中NiR的提纯。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其核苷酸序列如NO.1所示。

一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶，由权利要求1所述基因编码的蛋白质。

含有上述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒，该重组质粒中含组氨酸标签。

一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)以NCBI中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，进行上下游引物设计，设计的酶切位点为NcoI、SalI；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)LJ01的DNA，并以此为模板，通过PCR技术扩增蜡样芽孢杆菌LJ01亚硝酸盐还原酶的基因片段；所述蜡样芽孢杆菌LJ01的保藏编号为CGMCCNO.9360；

(3)利用NcoI、SalI工具酶将扩增片段和质粒pET-32a(+)于37℃下分别切成具有两个粘性末端的片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用T4DNA连接酶连接，再转入重组大肠杆菌中，利用抗生素氨苄青霉素进行筛选即获得阳性工程菌；

(4)将上述工程菌经诱导表达，采用亲和层析法纯化，即得到蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶。对经亲和层析纯化后的NiR进行变性和非变性聚丙烯酰胺电泳，同时进行GPC来检测其纯度和分子量。对重组蛋白进行金属含量的测定，从而确定其活性中心。对重组蛋白的氧化态和还原态进行UV-可见光全波长扫描，检测其在可见光区域的最大吸收峰。

所述上游引物为5’-GATGCCATGGATGAGTTATGAAAAAGTAT-3’(NcoI)，下游引物为5’-ACGCGTCGACCTAAGACGCTATTACTTCT-3’(SalI)。

所述诱导表达为加入诱导剂IPTG进行诱导，且诱导浓度为0.1～1.0mmol/L。

所述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶在降解亚硝酸盐中的应用，在降解过程中需加入电子供体蛋白。

所述的电子供体蛋白为细胞色素c或从蜡样芽孢杆菌LJ01中提取得到的电子供体蛋白，其添加量为亚硝酸盐还原酶的1/5～1/15。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)本发明通过对经IPTG诱导的含空质粒和重组质粒大肠杆菌及不加IPTG诱导的含重组质粒大肠杆菌粗酶液进行SDS-PAGE分析及亲和层析技术来验证工程菌可以诱导表达亚NiR重组蛋白。

(2)本发明可以通过IPTG诱导表达得到大量的细胞内NiR，可以应用到工业中进行大量生产。

(3)本发明利用亲和层析作用纯化得到纯度较高的NiR重组蛋白，并通过GPC和非变性聚丙烯酰胺电泳检测其纯度，解决了从蜡样芽孢杆菌中分离出纯度和含量较高NiR的难题。

(4)本发明得到的工程菌表达的重组蛋白要添加电子供体蛋白才能有效地降解亚硝酸盐。

(5)该克隆表达得到的大量的NiR重组蛋白可以用于食品中的亚硝酸盐的降解；由于其最适pH为6.5-7.5，所以也用于非酸性环境中亚硝酸盐的降解；还可以用于养殖水体中亚硝酸盐的降解。

蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)LJ01的保藏信息：蜡样芽孢杆菌LJ01于2014年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏号CGMCCNo.9360；该保藏证明已在中国专利CN104212739A中提交。

附图说明

图1为实施例1中利用蜡样芽孢杆菌LJ01基因组DNA为模板进行PCR扩增产物鉴定图，其中M为DNA分子量标准；1，2，3为PCR扩增产物。

图2为实施例3中构建的重组菌平板生长图，其中a为感受态细胞加无菌水组(阴性对照组)，b为感受态细胞加空质粒组(阳性对照组)，c为感受态细胞加重组质粒组(重组质粒组)。

图3为实施例3中构建的重组菌针对NiR基因的PCR目的片段鉴定图，其中M为DNA分子量标准；1～10为从平皿C上长出的重组菌菌落的PCR扩扩增后的目的片段。

图4为实施例4中构建的重组质粒进行酶切鉴定图，a为单酶切鉴定图，b为双酶切鉴定图，其中M为DNA分子量标准；1～4为重组质粒。

图5为实施例4中含有重组质粒pET-32a(+)-NiR的E.coliBL21经过诱导表达后所得到的粗酶液(重组组)、空白质粒pET-32a(+)的E.coliBL21诱导表达后所得到的粗酶液(阴性对照组)和含重组质粒pET-32a(+)-NiR的E.coliBL21不经诱导表达所得到的粗酶液(阳性对照组)通过SDS-PAGE电泳后的结果，其中1为阴性对照组；2为阳性对照组；3重组组。

图6为纯化后NiR蛋白质的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质分子量标准；1，2为纯化后的蛋白，3为阴性对照组，4为阳性对照组，5为重组组。

图7为经亲和层析纯化后的NiR的凝胶色谱层析(GPC)图。

图8为经亲和层析纯化后的NiR的非变性聚丙烯酰胺电泳图。其中1,2道为重组蛋白；M为卵清蛋白，分子量为45KDa。

图9为重组蛋白氧化态和还原态UV-可见光全波长扫描。其中a为氧化态NiR全波长扫描图；b为还原态NiR全波长扫描图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护范围并不局限于此。

实施例1

蜡样芽孢杆菌LJ01中NiR基因的克隆表达，包括如下步骤：

根据中的DNA序列，设计出NiR基因的PCR引物：上游引物为M1：5’-GATGCCATGGATGAGTTATGAAAAAGTAT-3’(NcoI)，如SEQIDNO.2，下游引物为M2：5’-ACGCGTCGACCTAAGACGCTATTACTTCT-3’(SalI)，如SEQIDNO.3，并人工合成这对上下游引物；

根据试剂盒中的说明书的步骤(细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0，为TakaraBiotechnology公司的产品，购自广州瑞真生物技术有限公司)，进行蜡样芽孢杆菌中基因组DNA的提取、NiR基因的克隆、PCR目的片段的回收。

以提取的蜡样芽孢杆菌基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增目的基因片段，PCR反应体系为：5μL10×buffer；4μLdNTP；1μL引物(M1，M2)；0.25μL高保真酶；3μLDNA；35.75μL无菌水，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环。用1％琼脂糖电泳检测目的基因PCR产物；电泳检测结果如图1中1、2、3条带，在1600KD附近有一条明显的DNA条带，该条带为经过上述步骤扩增所得的蜡样芽孢杆菌LJ01的NiR基因DNA序列，经测序，结果如序列。

将所得的LJ01NiR的基因DNA序列与质粒pET-32a(+)(为美国Novagen公司产品，购自上海吉然生物科技有限公司)分别进行NcoI、SalI单酶切，于37℃过夜反应20h，接着分别回收片段DNA和质粒DNA。

将上述两个片段进行连接，在连接反应体系中，于16℃下进行连接14～16h，即获得重组质粒pET-32a(+)-NiR，所述的连接反应体系为：回收酶切pET-32a(+)7μL，回收目的基因片段1μL，T4DNA连接酶1μL，T4DNA连接酶缓冲液1μL；

将构建好的表达载体pET-32a(+)-NiR质粒，转入E.coliBL21感受态细胞中，获得重组大肠杆菌，重组菌的菌落见图2，从图中可以看出，阴性组中未长出菌落，而阳性组的菌落较多，说明感受态细胞制备成功，于重组质粒组平皿上挑取10个单菌落进行PCR初步鉴定。

用PCR进行扩增，获得重组菌BL2110个菌落的目标片段NiR基因，结果如图3，其中只有3和10菌落无法扩增出NiR目的片段，其余8株菌均能扩增出目的片段；质粒pET-32a(+)-NiR用单酶切和双酶切方法鉴定，鉴定结果见图4所示，从图4a中清楚可见重组质粒经单酶切后有一个条带，且分子量与第二条Marker接近，与理论中重组质粒的大小7500bp吻合；从图4b中清楚可见重组质粒经双酶切后有两个条带，且一条大小在1000bp和2000bp之间约1600bp左右，另一条则在4000bp和7000bp之间约6000bp，说明构建好的载体经酶NcoI和SalI分别在CCATGG、GTCGAC的位点双酶切成两条片断，说明重组质粒pET-32a(+)-NiR构建成功。

所述的LB液体培养基为：按如下配方称取蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，然后用蒸馏水定容至1L，在121℃下灭菌20min冷却后即得。

所述的LB固体培养基为：指在LB液体培养基中加入15g琼脂，然后用蒸馏水定容至至1L，灭菌冷却后即得。

实施例2

利用实施例1所得的重组E.coliBL21进行蜡样芽孢杆菌NiR的诱导表达，具体如下：将实施例1所得的阳性克隆菌种涂平板于LB固体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)上，于37℃恒温箱中过夜培养，然后从固体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)上挑取单菌落接种到液体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)中，于37℃和180rpm下过夜培养；然后以体积百分比2％接种量接种LB液体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)，于37℃和180rpm下培养至对数生长期(OD₆₀₀＝0.6)时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，于30℃和180rpm下诱导培养4～5h后，得培养液，离心收集培养液菌体，提取NiR，其具体步骤如下：

将培养液用8000rpm离心收集菌体，用无菌水清洗两次，每100mL培养液加入10mL已4℃预冷的0.02mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH7.4)，冰浴超声波破碎菌体10min，每超声2s停2s，超声后取出，于4℃、9000rpm离心10min，取其上清液为NiR的粗蛋白液，于4℃下保存备用。

同时设立对照组，一组为加IPTG诱导的含有空质粒的BL21组(阴性对照组)，另一组为不加IPTG诱导的含重组质粒的BL21组(阳性对照组)，同时按本实施例的诱导表达过程进行诱导表达，对阴性对照组和阳性对照组的菌体蛋白进行相同条件的超声破碎和离心收集后收集粗酶液，在相同浓度下进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，3为加IPTG诱导的含有重组质粒的BL21组粗酶液；2为不加IPTG诱导的含重组质粒的BL21组粗酶液；1为加IPTG诱导的含空质粒的BL21组粗酶液。从图中可以看出1和2组的蛋白基本一致，而与前两条带相比，条带3在箭头所指的位置多出3处条带a、b、c，说明含有重组质粒的重组大肠杆菌在经IPTG诱导下产生了新的蛋白，该重组蛋白可能成功得到表达，是否有降解亚硝酸盐的活性，需要进一步验证。

实施例3

利用实施例2所得的重组大肠杆菌诱导表达的粗蛋白液进行亲和层析纯化，得到高纯度的NiR，所述的亲和层析步骤为：先用3-5倍体积的含20mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡Ni柱，上样后先用同样的缓冲液将杂蛋白洗脱下来，洗至基线后再用含500mM咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱得到重组蛋白，其产量为1L发酵液中可得到20-30mg重组蛋白。洗脱出的蛋白经聚乙二醇20000浓缩后进行SDS-PAGE检测，其结果见图6，其中M为标准品，条带1为上样量30mL洗脱出的蛋白，条带2为上样量为70mL洗脱出的蛋白，对比条带1和条带2得出箭头所指约20KDa出为目的蛋白NiR，对照3，4，5条带说明图5中箭头3所指的条带为重组蛋白，同时发现其中还有少许杂带，还需要进行下一步来确定其纯度。

实施例4

将实施例3得到的重组蛋白进行凝胶渗透色谱柱层析法(GPC)检测，利用浓度为将样品配制成1～2mol/L的溶液，过0.45μm过滤膜，进样体积为20μL。重组蛋白的凝胶渗透色谱法(GPC)见图7，图中可见在11.894min时出现一个大峰，而在13.549min处出现一个极小的峰，而重组蛋白已检测到活性，因此可以说明经亲和层析柱洗脱下的蛋白大部分为目标蛋白，且其出峰时间与分子量为45KDa的鸡卵清蛋白标准品的出峰时间接近，因此判断其分子量约为40KDa。

将实施例3得到的重组蛋白进行非变性聚丙烯酰胺电泳检测，结果见图8，其中泳道1，2为重组蛋白。图中显示泳道1，2均为单一条带，说明样品蛋白为单一蛋白，因此推测图6中1，2道中上方的条带为聚合物，同时重组蛋白较天然蛋白相比多了组氨酸头，因此导致重组NiR的单体分子量与预测的天然NiR分子量有差异。而根据图8中卵清蛋白分子量判断，该NiR重组蛋白的天然分子量约为40KDa，综上所述，该重组蛋白可能为二聚体。

实施例5

将实施例3得到的重组蛋白透析除去咪唑并用聚乙二醇20000浓缩至蛋白浓度为1mg/mL的重组蛋白进行酶活测定，当酶活体系为500μL：含100μL重组蛋白液，100μL的NaNO₂溶液(浓度为500μg/mL)，300μL的磷酸盐缓冲液，上述体系中无法降解亚硝酸盐，24h后检测NaNO₂的含量为93.46μg/mL；当添加100μL的细胞色素c(浓度为0.5mg/mL)时，体系能降解亚硝酸盐，经过24h的降解，将终浓度为100μg/mL的NaNO₂降解为0，其NiR酶活为668.40U，其中NiR的活力单位定义为：在37℃条件下，每分钟催化还原1ng亚硝酸钠所用酶量为一个酶活力单位。酶活计算公式如下：Activity(U)＝m/(M′t)，其中m为降解的亚硝酸钠的质量，单位为ng；M为反应物中酶蛋白质的质量，单位为mg；t为反应时间，单位为min。申请号为201410390980.0的中国发明专利公开了“一种蜡样芽孢杆菌及其在制备NiR中的应用”，在该应用中最后经葡聚糖凝胶纯化后的NiR酶活为4004.89U，分析重组蛋白酶活降低的原因，可能是因为重组蛋白中添加的6个组氨酸暴露在蛋白表面，使得电子供体蛋白和酶的结合位点面积减小，因此需要更长的时间来进行降解。上述实验结果表明，只有在电子供体蛋白的参与下，亚硝酸盐还原酶才有降解亚硝酸盐的酶活。

实施例6

将实施例5得到的NiR进行UV-可见光全波长扫描测定。氧化态NiR样品制备：配制0.1M铁氰化钾溶液，按3μL/mL比例添加入酶液；还原态NiR样品制备：直接在酶液中加入少许结晶状连二亚硫酸钠。结果见图9，从中可看出，氧化态NiR在419nm，451nm以及547nm处有吸收峰，而还原态的NiR在407nm，454nm，547nm和724nm处有吸收峰，对比Besson研究的Pseudomonasnautica中cd1型NiR的全波长图[BessonS,CarneiroC,MouraJJG,MouraI,FauqueG.Acytochromecd1-typenitritereductaseisolatedfromthemarinedenitrifierPseudomonasnautica617:purificationandcharacterization,Anaerobe,1995,1:219-226.]，发现重组蛋白可能存在血红素c的特征吸收峰(547nm)，然而没有血红素d1的特征吸收峰(629nm)。

实施例7

将实施例5得到的NiR用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法检测其中的金属元素含量，主要测定元素为铁和铜。其中ICP条件：高频发生器输出功率：1.55kW，等离子体气(氩气)：15.0L/min，辅助气(氩气)：0.8L/min，载气(氩气)：0.8L/min，补偿气(氩气)：0.35L/min，采样深度：10mm；MS条件：扫描方式：跳峰，测量点/峰：3点，扫描质量数：63Cu,56Fe,72Ge(内标)；碰撞池条件：碰撞气：氦气，4.3mL/min；进样条件：自动进样，溶液提升速率：0.4rps，溶液提升时间：30s，溶液稳定速率：0.1rps，溶液稳定时间：30s，内标元素Ge通过T型三通管在线引入，雾化器：MicroMist；雾化室温度：2℃；清洗条件：进样口水清洗进样针外壁15s，进样管道分别用5％硝酸溶液和水清洗20s。检测结果为：铁的含量为0.034mg/L；铜的含量为0.123mg/L，样品浓度为2/3mg/mL，因此最后得到样品中铁的含量为铁的含量为51mg/Kg，铜的含量为184.5mg/Kg，说明重组蛋白中同时含有铁和铜两种金属元素，且铜的含量约为铁的3.6倍。经过以上步骤得到的NiR蛋白，在电子供体蛋白的参与下，才有降解亚硝酸盐的酶活性，该酶分子量可能为40KDa，可能为二聚体，蛋白含血红素C的活性中心，蛋白中同时含有铁和铜两元素。

Claims

1.一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其核苷酸序列如NO.1所示。

2.一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶，其特征在于，由权利要求1所述基因编码的蛋白质。

3.含有权利要求1所述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，该重组质粒中含组氨酸标签。

5.一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(4)将上述工程菌经诱导表达，采用亲和层析法纯化，即得到蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶。

6.根据权利5所述的方法，其特征在于，所述上游引物为5’

-GATGCCATGGATGAGTTATGAAAAAGTAT-3’(NcoI)，下游引物为5’

-ACGCGTCGACCTAAGACGCTATTACTTCT-3’(SalI)。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述诱导表达为加入诱导剂IPTG进行诱导，且诱导浓度为0.1～1.0mmol/L。

8.权利要求2所述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶在降解亚硝酸盐中的应用，其特征在于，在降解过程中需加入电子供体蛋白。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的电子供体蛋白为细胞色素c或从蜡样芽孢杆菌LJ01中提取得到的电子供体蛋白，其添加量为亚硝酸盐还原酶的1/5～1/15。