CN110951803B

CN110951803B - 组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法、重组宿主细胞及重组宿主细胞与表达载体的应用

Info

Publication number: CN110951803B
Application number: CN201911069088.1A
Authority: CN
Inventors: 朱玥明; 闫军军; 陈朋; 曾艳; 孙媛霞
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2039-11-05
Also published as: CN110951803A

Abstract

本发明公开了一种组合利用内切型和外切型琼胶酶降解琼脂或或粗琼胶(红藻多糖提取物)获得高纯度新琼二糖的方法。本发明涉及一种琼胶酶AgaA和一种双功能酶AgaB，其中AgaA为内切型琼胶酶，能够迅速降解琼脂或琼脂糖产生新琼二糖、四糖和六糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；AgaB为双功能外切型琼胶酶，同时具有降解琼脂糖和紫菜多糖(即硫酸酯化的琼脂糖)的活性，能够降解琼脂或粗琼胶(红藻多糖提取物)或其寡糖产生单一产物新琼二糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。同时本发明还公开了利用基因工程技术重组表达和制备琼胶酶的方法。本发明所涉及的制备高纯度新琼二糖的方法及特异性琼胶酶(或紫菜多糖酶)，在制备琼胶寡糖领域有着广阔的应用前景。

Description

组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法、重组宿主细胞及重组宿主细胞与表达载体的应用

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体涉及利用特异性琼胶酶制备新琼寡糖的方法，特别是组合使用内切型琼胶酶和外切型双功能琼胶酶制备高纯度新琼二糖的方法。

背景技术

琼胶又叫琼脂、洋菜、冻粉、寒天、燕菜等，因其独特的天然性质和丰富的营养价值被广泛应用在各大工业领域。琼胶是从石花菜科和龙须菜科红藻类细胞壁中提取的水溶性多糖物质，由琼脂糖和琼脂胶两部分组成，其中琼脂糖是由(1-3)-O-β-D-半乳糖和(1-4)-O-3,6-内醚-α-L-半乳糖交替组成的线形链状分子，琼脂胶成分较复杂主要由长短不一的半乳糖残基的多糖链组成。琼胶具有良好的稳定性及凝胶性，常被用作微生物培养基、琼脂糖凝胶电泳、和色谱支持材料，也被认为是一种安全的食品添加剂，用于糖衣、釉料、加工奶酪、果冻糖等。但近年来随着琼胶自身应用的局限性，琼胶寡糖逐渐成为研究热点。目前降解琼胶的方法主要有化学法和酶促降解法，尽管化学法成本较低，但存在操作条件难控制、产物不均一、产物分析和回收难等问题，而利用酶解法制备琼胶寡糖,不仅反应条件温和，能耗低，而且酶催化具有高效性和专一性，能选择性地切断糖苷键，可克服化学降解法存在的问题，能实现更高效的寡糖生产。

琼胶酶是一类能够催化琼胶降解为琼胶寡糖的酶，根据其裂解琼胶的模式不同可将琼胶酶分为两类即α-琼胶酶和β-琼胶酶，其中α-琼胶酶切割琼脂糖的α-1,3键以产生琼脂寡糖，β-琼胶酶切割成β-1,4键以产生新琼寡糖。目前已经报道的文献中大多都是β-琼胶酶，且属于糖苷水解酶家族GH16、GH50、GH86 和GH118家族，其中GH16家族最为丰富，家族中已经超过了3000个功能异质的成员，但关于α-琼胶酶鲜有报道，只有在以下四种海洋细菌中鉴定出α-琼胶酶，Thalassomonas sp.LD5、Thalassomonas sp JAMB-A33和Alteromonassp.SH-1 及Alteromonas agalyticus GJ1B。琼胶酶主要来源于微生物和动物，在浩瀚的海洋生态系统中，丰富的海洋植物、动物、海水及海洋沉积物中都存在有产琼胶酶的细菌。

相对于琼脂应用的局限性，琼胶寡糖更具有多样的生物活性及巨大的应用价值，在医药方面，天然多糖因其粘度高、溶解性低，影响了其在医药、动物保健、食品等领域的应用，而不同聚合度的琼胶寡糖，被证明具有良好的抗肿瘤、抗病毒、增强免疫等药理作用和生物活性。同样在食品生产、化工等方面也有广阔的应用前景。目前运用生物酶法制备琼胶寡糖的工艺并不完善，大部分挖掘到的琼胶酶对琼脂糖降解效率较高，但对琼脂或者粗琼胶的降解效率较低。就产物而言，获得的寡糖产物聚合度也不均一，多以新琼四糖，六糖，八糖等混合物为主要产物。而不同聚合度的寡糖其生物活性和应用价值也存在很大差异，若不能得到聚合度单一的寡糖对其后续的应用会产生很大的影响。

中国专利CN109022397A和CN109182306A分别公布了一种内切型琼胶酶，利用该酶降解琼胶分别生成纯度较高的新琼二糖(86.2％)和新琼四糖(90.5％)，但产物中仍然有其他聚合度的新琼寡糖。中国授权专利CN104862294B公布了一种外切型琼胶酶，该酶能够特异性地降解琼胶产生唯一降解产物新琼二糖，但该专利仅提供使用浓度为0.25％琼脂糖生产新琼二糖的实施例。中国专利CN109182414A提供一种组合使用琼胶酶生产新琼二糖的方法，即构建表达两种琼胶酶的宿主菌，通过发酵方法，以2％琼脂糖为底物生产获得纯度较高的新琼二糖，但产物浓度只有500mg/L，相对底物的转化率很低；同时若以20％粗琼胶为底物，则需要另外加入硫酸酯酶对粗琼胶进行脱硫，否则降解效率较差。因此，挖掘更多对琼脂或粗琼胶具有较高降解活性的琼胶酶，同时开发利用高浓度底物制备单一产物的降解方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种组合利用特异性琼胶酶制备高纯度新琼二糖的方法，另外，本发明还提供该方法所涉及的新型内切琼胶酶AgaA和外切型双功能琼胶酶AgaB的制备方法。通过所述方法生产的新琼二糖纯度高达90％以上，具有广阔的应用前景，从而弥补现有技术的不足。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供两种新型特异性琼胶酶，所述新型琼胶酶包含如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

优选地，所述琼胶酶包含如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了一种特异性生产新琼二糖的方法及应用，其特征在于组合使用内切型琼胶酶和外切型双功能琼胶酶将琼脂或粗琼脂或琼脂糖降解为新琼二糖，具体而言，即利用内切型琼胶酶AgaA将琼脂或粗琼脂或琼脂糖降解为新琼二糖、四糖和六糖等新琼寡糖中间产物，此时由于大分子多糖聚合度降低使得底物彻底液化不再结成凝胶状。然后利用外切型双功能琼胶酶AgaB 将中间产物新琼四糖和新琼六糖彻底降解为新琼二糖，由于该酶还具有降解硫酸酯化的琼脂糖及其寡糖的活性，能够将反应体系中未降解的紫菜多糖(即硫酸酯化的琼脂糖)及其寡糖降解，大幅提高了反应的转化率，以琼脂为底物时转化率达到90-95％。也可同时加入内切型琼胶酶AgaA和外切型双功能琼胶酶 AgaB，或先加入外切型双功能琼胶酶AgaB再加入内切型琼胶酶AgaA，所得新琼二糖纯度及底物转化率与优选方法基本一致。

优选地，本发明所述生产新琼二糖的方法，在制备聚合度均一的新琼二糖及在医药、化妆品、食品和生物燃料等领域的应用；

第三方面，本发明提供两种重组载体，所述重组载体含有至少一个拷贝的如第一方面所述的核苷酸序列。

优选的，第三方面所述质粒为pet-32a。

第四方面，本发明提供一种通过结构域优化提高蛋白表达水平的方法，即通过将蛋白质N端的重复序列删除，从而提高基因的表达量。本发明通过该策略对内切型琼胶酶AgaA进行改造，使其蛋白表达量得以大幅提升，同时提高了该蛋白的纯化效率。

第五方面，本发明提供两种重组的宿主细胞，所述宿主细胞至少含有一个如第三方面所述的表达载体。

优选的，第五方面所述宿主菌为大肠杆菌BL21。

第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的两种琼胶酶的制备纯化方法，包括如下步骤：

(1)制备浓缩粗酶液

优选的，制备步骤(1)所述的浓缩粗酶液包括以下步骤：将琼胶酶AgaA 和AgaB的表达菌株Escherichia coli BL21进行活化后接到发酵培养基中，收集菌体，用缓冲液重悬，破碎离心取上清，即得所述浓缩粗酶液；

具体地，(a)取-80℃保存的琼胶酶表达菌株Escherichia coli BL21，在固体平板培养基上划线，37℃培养箱静置过夜培养12h；

(b)挑取单菌落，接种至含5mL发酵培养基的30mL试管中，37℃震荡培养12h左右；

(c)以0.5％的接种量接种至含100mL发酵培养基的250mL三角瓶中， 37℃、200r/min条件下培养3-4h；

(d)待菌液OD₆₀₀长至0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)于16℃诱导20-24h左右；

(e)收集步骤(d)培养的菌体，4℃、6000r/min离心30min，收集菌体，用2mL pH为7的缓冲液(20mM Tris-HCI)重悬菌体，用超声波细胞粉碎机破碎菌体，4℃下15000rpm离心30min,上清即为浓缩粗酶液。

优选的，如第六方面所述浓缩粗酶液纯化方法具体包括如下步骤：

(a)组氨酸标签蛋白纯化磁珠预处理，将磁珠置于旋涡混匀器上充分混匀，用移液器取5mL磁珠于15mL离心管中，进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下离心管；

(b)加入5mL的Binding buffer于上述装有磁珠的离心管中；上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，弃去上清，重复洗涤2-3次；

(c)将处理好的粗酶液加入到装有预处理磁珠的离心管中，在旋涡混匀器上振荡混匀15s,置于2-8℃环境下旋转混合30min；

(d)待目标蛋白与磁珠结合后，取10mL的Binding buffer加入离心管中，上下翻转数次，弃去上清，重复此步骤5-8次，充分洗脱未与磁珠结合的杂蛋白；

(e)目的蛋白洗脱，向离心管中加入适量Elution buffer上下翻转数次洗脱目的蛋白，用不同浓度的Elution buffer洗脱液将目的蛋白进行梯度洗脱，分别做样SDS-PAGE电泳检测，将条带单一大小一致的目的蛋白合并；

(f)超滤浓缩；用超滤管将洗脱液脱盐浓缩，在4℃高速冷冻离心机中4500 rpm离心，可重复添加缓冲液，洗净多余的盐离子；

第七方面，本发明提供一种如第一方面所述新型琼胶酶在制备聚合度单一的新琼二糖中的应用。

优选的，如第七方面所述利用组合降解模式所制备的新琼二糖在医药、化妆品、食品和生物燃料等领域的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

第一，本发明挖掘得到两种新型特异性琼胶酶，其中AgaA为内切型琼胶酶，其酶活高且稳定性强，能够快速将琼脂或琼脂糖液化，主产物为新琼二糖、新琼四糖和新琼六糖；而AgaB为外切型双功能琼胶酶，同时具有降解琼脂糖和紫菜多糖(即硫酸酯化的琼脂糖)的活性，其产物为聚合度单一的新琼二糖。目前已报道的双功能琼胶酶非常罕见，因此对琼脂或紫菜多糖等含有硫酸酯化底物的降解效率差，造成底物转化率低，且聚合度不均一。

第二，提供一种组合利用特异性琼胶酶制备高纯度新琼二糖的方法。通过该方法生产的新琼二糖纯度高且具有很强的生物活性，其降解产物中不含其他聚合度的新琼寡糖。同时，由于该方法中内切型琼胶酶对琼脂等底物的液化作用，能够使用浓度更高的底物进行转化反应。此外，研究结果表明，聚合度越低且均一的寡糖其降低成纤维细胞活性氧含量、提高角质形成细胞中水合通道蛋白Aquaporin 3含量的效果越好。因此，本发明所述的生产新琼二糖的方法具有潜在的工业化应用前景。

第三，提供一种通过结构域优化提高蛋白表达水平的方法，即通过将蛋白质N端的重复序列删除，从而提高基因的表达量。本发明通过该策略对内切型琼胶酶AgaA进行改造，使其蛋白表达量得以大幅提升，同时提高了该蛋白的纯化效率。

附图说明

图1显示本发明琼胶酶AgaA和AgaB在不同温度下的相对酶活力；

图2显示本发明琼胶酶AgaA和AgaB在不同pH下的相对酶活力；

图3显示本发明琼胶酶AgaA和AgaB在不同金属离子下的相对酶活力；

图4显示TLC分析AgaA和AgaB的降解产物；

图5显示组合利用双酶制备新琼二糖的转化率随反应时间变化趋势；

图6显示组合利用双酶制备的新琼二糖产物的HPLC及质谱检测

具体实施方式

下面将结合附图进一步详细说明具体案例的实施方式，以便于更好的理解本发明。但实施案例仅限于说明，并不限于此。实施案例中未标明的实验方法或条件均按常规方法操作，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述条件或按制造厂商所建议的条件运行。

本发明中，粗琼胶(红藻多糖提取物)指从紫菜、龙须菜等红藻中提取获得的多糖粗提物；琼脂，学名琼胶，指将粗琼胶进行精制获得的多糖混合物，含有琼脂糖和少量硫酸酯化的琼脂糖；紫菜多糖为硫酸酯化程度较高的琼脂糖；紫菜多糖酶指具有降解硫酸酯化底物的多糖水解酶。

实施例1琼胶酶AgaA和AgaB的挖掘和重组载体的构建

根据已筛选获得的海洋细菌Marinimicrobium sp.H1基因组测序与注释结果，以该菌基因组为模板设计相关引物扩增得到琼胶酶AgaA和AgaB的基因。序列分析显示，AgaA蛋白N端具有一段较长的含有大量丝氨酸残基的重复序列，实验证明该段序列存在时，蛋白表达水平很低，且无法利用Ni柱亲和层析法纯化获得该酶。因此，采取了结构域优化策略，将该重复序列删除构建截短蛋白重组表达载体。PCR条件为：95℃预变性3min，然后以95℃30s、55℃30s、 72℃2min进行32个循环，72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,采用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。

AgaAF:5'-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCCGCCGACTGGGACGG CCTG-3'

AgaAR:5'-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTCACCAAGCTGAACTAAAC GAAT-3'

AgaBF:5'-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGAGACTCCTTACGATTAATC AAA-3'

AgaBR:5'-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTCTTCGCGTCAAAACGTCGCT GGTAGA-3'

将纯化的AgaA和AgaB DNA片段连接到克隆载体pet-32a上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布在含有50μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB) 培养基固体平板上，37℃培养12小时后，挑取单菌落使用扩增引物进行PCR 验证。将出现特异性条带所对应的单克隆接入含有3mL LB培养基的试管中进行培养，使用质粒提取试剂盒进行质粒提取，测序分析。

实施例2琼胶酶AgaA和AgaB的异源表达与纯化

琼胶酶异源表达方法如下：

(a)将测序分析正确的质粒转表达菌株Escherichia coli BL21中进行诱导表达，涂板37℃培养箱静置培养12h；

(d)待菌液OD₆₀₀长至0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)于16℃诱导20-24h左右。

(e)收集步骤(d)培养的菌体，4℃、6000r/min离心30min，收集菌体，用2mL pH为7的缓冲液(50Mm Tris-HCI)重悬菌体，利用超声波细胞粉碎机破碎菌体，在4℃条件下15000rpm离心30min,上清即为浓缩粗酶液。

琼胶酶纯化方法如下：

(e)目的蛋白洗脱，向离心管中加入适量Elution buffer上下翻转数次洗脱目的蛋白，将洗脱的目的蛋白做样利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测琼胶酶纯化效果，纯化后的琼胶酶AgaA和AgaB在电泳胶上呈单一条带，证明目的蛋白可用于进一步的酶学性质分析。

实施例3温度对琼胶酶的影响

将纯化的琼胶酶稀释适当的倍数，取0.1mL稀释好的酶液加入0.9mL浓度为0.3％的琼胶底物中(缓冲液50mM Tris-HCl，pH＝7.0)，AgaA在30-80℃之间测试了其最适温度，AgaB在30-70℃之间测试了其最适温度，将反应液分别置于以上不同温度下反应20min，测定酶活力，判断最适反应温度。以酶反应最适温度下所测得的酶活力为100％，其它温度下酶活力与最高酶活力的比值为该温度下的相对酶活力，作温度—相对酶活力曲线，结果如图1所示，AgaA的最适温度为60℃，AgaB的最适反应温度为40℃。

实施例4 pH对琼胶酶的影响

用不同pH的缓冲液配制0.3％的琼胶底物(所选用缓冲液为：pH为4.0、 5.0、6.0的20mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为6.0、7.0、8.0、9.0的20mmol/L 的Tris-HCl缓冲液，pH为9.0、10.0、11.0的20mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)。加入适当稀释的琼胶纯酶，AgaA在60℃下反应20min，测定酶活力，AgaB在40℃下反应20min测定酶活力，判断最适反应pH值。以酶反应最适 pH值下所测得的酶活力为100％，其它pH值下酶活力与最高酶活力的比值为该 pH值下的相对活性，作pH—相对酶活力曲线，结果如图2所示。结果显示，琼胶酶AgaA和AgaB的最适反应pH都在6-7之间，偏好中性反应环境。

实施例5不同金属离子及EDTA对琼胶酶的影响

用纯水配制0.3％的琼胶底物，在此基础上测定不同金属离子对褐藻裂解酶的影响。配制1mol/L的各种金属离子母液，金属离子包括：Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、K⁺、Ba²⁺和EDTA。在AgaA和AgaB的纯酶液中加入各种金属离子，使金属离子终浓度为5mmol/L,4℃条件下放置12 h,使金属离子与酶分子充分结合，在最适温度与最适pH值条件下，测定酶活力。以未添加金属离子的反应液作为对照组，其酶活力设定为100％，测定结果如图 3所示。结果显示，Mg²⁺、Ca²⁺和Ba²⁺对AgaA有一定的激活作用，而Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、和Zn²⁺对其有明显的抑制作用，其他金属离子未见激活效果，对 AgaB有激活作用的金属离子为Ba²⁺，其中Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Zn²⁺、和Ni²⁺表现出明显的抑制作用。

实施例6琼胶酶AgaA和AgaB酶解产物薄层层析分析(TLC)

配制浓度为0.3％的琼脂底物，各取2mL底物与试管中，分别加入过量的纯酶AgaA和AgaB，于室温下反应24h,期间AgaA在反应进行0.1h、0.2h、0.3 h、2h、12h和24h时取样，AgaB在0.1h、0.3h、2h、12h和24h沸水浴5min 终止反应，利用薄层层析法检测，在TLC板底部1.5cm处用铅笔划线，取上述不同反应时间的反应液8μL，在铅笔划线处点样，用吹风机吹干，重复点样一次，再次用吹风机吹干，将TLC板置于展缸中进行展开，放入TLC板之前先将展开剂放入展缸中，盖上展缸盖使其内部空间均匀充满展剂成分，展剂配比为正丁醇：冰乙酸：水＝2:1:1(体积比)，待展开剂至前端1cm时停止展开，取出展板用吹风机吹干，均匀喷洒显色剂(10％硫酸乙醇)于表面，100℃下烘干，显色结果如图4所示。结果显示，AgaA为内切型琼胶酶，能够快速将琼脂或琼脂糖液化，主产物为新琼二糖、新琼四糖和新琼六糖；因为该酶不能水解硫酸酯化底物，即使加大酶量、延长反应时间也不能将琼脂彻底降解，TLC点样处仍然显示有黑色，即为未降解的大分子多糖底物。AgaB为外切型双功能琼胶酶，由于其同时具有降解琼脂糖和紫菜多糖(即硫酸酯化的琼脂糖)的活性，能够将琼脂彻底降解为聚合度单一的新琼二糖，反应后期TLC点样处不再有黑色显示。

实施例7双酶组合制备二糖及产物检测分析

分别配制浓度为0.5％、0.75％、1％的琼脂底物，在制备第一阶段向底物中加入11700U/mL的AgaA，置于50℃水浴中反应12h，测定反应不同时间产生新琼二糖的含量，计算其转化率。第一阶段反应可以让琼胶在AgaA的作用下迅速降解为新琼四糖和少量的新琼二糖和新琼六糖，从而促进高浓度底物的液化。在制备第二阶段，待第一阶段反应完成的基础上加入267U/mL的AgaB，在30℃水浴中反应24h,测定反应不同时间产生新琼二糖的含量，计算其转化率。在反应的第二阶段，AgaB会将第一阶段反应物中的新琼四糖和新琼六糖彻底降解为新琼二糖。利用高效液相色谱检测整个反应过程中寡糖的生成量，使用的色谱柱是Sugar-Pak1^TM色谱柱(6.5×300mm)，检测时间为30min，检测器为示差检测器,流动相为水，流速0.4mL/min。实验结果如图5所示，可见通过两阶段反应，新琼二糖转化率可达到94％。反应产物液相与质谱检测结果如图6所示，可见最终产物为聚合度单一的新琼二糖，纯度达到90％以上。

综上所述，本发明提供了一种组合利用特异性琼胶酶制备高纯度新琼二糖的方法，该方法通过结合内切型琼胶酶AgaA和外切型双功能琼胶酶AgaB各自的优势，利用双酶组合降解模式，生产聚合度单一的新琼二糖，该方法优点是底物转化率高且产物纯度高。同时本发明提供两种新型琼胶酶及其制备方法，其中内切琼胶酶AgaA稳定性好，能够快速将琼胶大分子降解为以新琼二糖、新琼四糖和新琼六糖为主的寡糖，而外切型双功能琼胶酶AgaB的特点在于能够同时降解琼脂糖和紫菜多糖，产生单一聚合度的新琼二糖。因此，本发明以期在未来的工业应用中提供一种高效的技术方法选择。

申请人声明，以上所述实施案例仅为本发明的较佳实施案例，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。任何熟悉本技术领域的技术人员应该明了，对本发明能轻易想到的任何改进，和具体方式的选择，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 组合利用特异性琼胶酶制备高纯度新琼二糖的方法及应用

<130> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 427

<212> PRT

<213> Marinimicrobium sp. H1

<400> 1

Ala Ala Asp Trp Asp Gly Leu Ala Val Pro Ala Asp Pro Gly Ala Gly

1 5 10 15

Asn Thr Trp Glu Leu Val Asp Ala Val Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Ser

20 25 30

Ala Pro Gly Asp Asp Lys Gly Gln Ala Phe Tyr Glu Arg Trp Ser Glu

35 40 45

Gly Phe Ile Asn Ser Trp Gln Gly Pro Gly Leu Thr Asp Tyr His Asp

50 55 60

Pro Asn Ser Ser Val Thr Glu Gly Asn Leu Val Ile Glu Ala Thr Arg

65 70 75 80

Lys Pro Asp Thr Asp Glu Val Tyr Thr Gly Ala Ile His Ser Lys Thr

85 90 95

Ser Val Gln Tyr Pro Val Tyr Val Glu Ala Arg Val Lys Ile Met Asp

100 105 110

Gln Val Leu Ala Asn Ala Val Trp Met Leu Ser Ala Asp Ser Thr Glu

115 120 125

Glu Ile Asp Ile Val Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Pro Asp Gln Thr

130 135 140

Trp Phe Ala Glu Arg Met His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg Asp

145 150 155 160

Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Glu Gly Ser Trp Tyr Thr Asp

165 170 175

Gly Arg Leu Trp Arg Glu Gln Phe Ser Arg Val Gly Val Tyr Trp Arg

180 185 190

Asp Pro Trp His Leu Glu Tyr Tyr Ile Asp Gly Glu Leu Val Arg Thr

195 200 205

Val Ser Gly Glu Glu Ile Ile Asp Pro Glu Gly Tyr Thr Asn Gly Thr

210 215 220

Gly Leu Ser Lys Gln Met Gln Ile Ile Val Asp Ala Glu Asp Gln Asp

225 230 235 240

Trp Arg Ser Asp Asn Gly Ile Met Ala Thr Asp Glu Glu Leu Ser Asp

245 250 255

Pro Asp Lys Asn Arg Phe Tyr Val Asp Trp Ile Arg Val Tyr Lys Pro

260 265 270

Ala Ser Met Thr Pro Asp Ala Ser Asp Asp Asp Thr Ala Ser Asn Thr

275 280 285

Gly Ala Thr Val Thr Thr Asp Phe Asp Ala Phe Phe Ala Thr Gly Lys

290 295 300

Asp Gly Glu Pro Val Ala Asp Asp Ser Val Glu Gly Phe Asn Pro Ala

305 310 315 320

Ala Asp Gly Lys Ile Asn Tyr Asn Thr Leu Gly Asp Trp Gly Asp Tyr

325 330 335

Ser Leu Thr Val Pro Glu Asp Gly Asp Tyr Arg Val Glu Val Asn Val

340 345 350

Ala Ser Pro Thr Gln Ser Gly Leu Ala Ala Asn Val Met Ile Asp Glu

355 360 365

Thr Asp Val Gly Gln Ile Ala Ile Thr Thr Thr Gly Gly Trp Glu Thr

370 375 380

Tyr Glu Thr Phe Ser Leu Asp Thr Pro Val Thr Leu Thr Ala Gly Thr

385 390 395 400

His Thr Val Arg Ile Gln Ser Ala Gly Ser Ala Thr Trp Gln Trp Asn

405 410 415

Gly Asn Leu Ile Arg Leu Val Gln Leu Gly Glu

420 425

<210> 2

<211> 781

<212> PRT

<213> Marinimicrobium sp. H1

<400> 2

Met Arg Leu Leu Thr Ile Asn Gln Ser Ile Ser Ile Leu Ile Cys Ser

1 5 10 15

Leu Ala Leu Ala Ala Cys Asp Ser Asp Thr Lys Glu Arg Glu Ser Asp

20 25 30

Pro Lys Pro Gln Ala Gln Leu Leu Glu Val Leu Tyr Asp Phe Glu Glu

35 40 45

Gly Val Lys Ser Ser Val Lys Pro Ser Ser Ala Asn Leu Ser Leu Gln

50 55 60

Pro Gly Pro Glu Glu Gly Asn Val Leu Ser Val Glu Phe Lys Ala Thr

65 70 75 80

Glu Ser Ser Tyr Ser Gly Val Thr Phe Lys Pro Glu Ala Pro Trp Asp

85 90 95

Trp Ser Gln Tyr Glu Ser Phe Asn Leu Arg Met Asp Met Lys Ser Ile

100 105 110

Gly Glu His Ser Thr Gln Ile Tyr Leu Asn Val Glu Asp Ala Asp Gly

115 120 125

Asn Val Phe Thr Arg Ser Val Asn Val Pro Val Gly Asp Phe Lys Thr

130 135 140

Tyr Tyr Ala Lys Met Ser Gly His Asp Ile Glu Gly Thr Tyr Asp Gly

145 150 155 160

Asp Asp Thr Glu Leu Asn Phe Ser Ser Gly Leu Arg Ser Asn Pro Pro

165 170 175

Thr Trp Asp Ser Glu Asp Glu Met Phe Val Trp Met Trp Gly Thr Gln

180 185 190

Gln Leu Asn Thr Ala Lys Ile Thr Lys Ile Ser Leu Ser Val Gln Gly

195 200 205

Ala Leu Phe Asp Lys Lys Val Leu Ile Asp Asp Ile Arg Leu Glu Ser

210 215 220

Asn Pro Pro Met Lys Lys Asp Phe Leu Val Gly Ile Val Asp Arg Phe

225 230 235 240

Gly Gln Asn Ala Lys Val Asp Tyr Pro Gly Lys Val Gln Ser Glu Asp

245 250 255

Glu Leu Ile Gln Arg Arg Lys Glu Glu Thr Ala Ser Leu Lys Glu Gly

260 265 270

Met Met Ala Asp Arg Ser Lys Phe Gly Gly Trp Lys Asn Gly Pro Gln

275 280 285

Leu Glu Ala Thr Gly Tyr Phe Arg Thr Glu Lys Tyr Asn Gly Lys Trp

290 295 300

Ser Leu Val Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Thr Gly Leu Asp

305 310 315 320

Ile Ile Arg Leu Ser Asn Thr Thr Thr Met Thr Gly Tyr Asp Tyr Asp

325 330 335

Gln Asp Leu Ile Lys Lys Arg Asp Lys Asp Glu Leu Thr Pro Glu Asp

340 345 350

Ser Ile Gly Met Ile Ser Val Ser Asp Glu Ala Lys Ala Ser Arg Phe

355 360 365

Val Ala Ser Glu Thr Arg Ala Asn Met Phe Lys Trp Leu Pro Gly Phe

370 375 380

Asp His Glu Leu Ala Asn His Tyr Ser Tyr Arg Arg Asp Ala His Ser

385 390 395 400

Gly Pro Leu Asp His Gly Glu Thr Phe Ser Phe Tyr Gln Ala Asn Leu

405 410 415

Glu Arg Lys Tyr Gly Glu Glu Thr Pro Ser Ser Phe Leu Lys Asp Trp

420 425 430

Glu Arg Val Thr Ile Ala Arg Met Leu Asn Trp Gly Phe Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Asn Trp Thr Asp Pro Gln Phe Tyr Asp Asn Glu Thr Ile Pro Tyr

450 455 460

Phe Ala Asn Gly Trp Ile Ile Gly Asp Phe Lys Thr Val Ser Ser Gly

465 470 475 480

Asn Asp Phe Trp Gly Pro Leu Pro Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Thr

485 490 495

Glu Arg Ala Asn Ala Thr Ala Ala Lys Val Ala Arg Glu Val Gln Gly

500 505 510

Ser Pro Trp Ala Val Gly Val Phe Ile Asp Asn Glu Met Ser Phe Gly

515 520 525

Arg Pro Glu Ser Asp Gln Leu Arg Tyr Gly Ile Val Ile Asn Thr Leu

530 535 540

Gly Arg Asp Ala Lys Ser Val Pro Thr Lys Arg Glu Phe Thr Arg Ala

545 550 555 560

Met Arg Glu Arg Tyr Glu Ser Ile Glu Ala Leu Asn Ala Ala Trp Asp

565 570 575

Ile Asp Leu Ala Ser Trp Glu Ala Phe Ala Glu Gly Phe Asp Pro Lys

580 585 590

Ala Ile Thr Pro Ala Gln Arg Glu Asp Tyr Ser Ser Met Leu Glu Leu

595 600 605

Tyr Ala Ser Glu Tyr Tyr Arg Ile Val Asp Gln Ala Leu Glu Lys His

610 615 620

Met Pro Asn His Leu Tyr Leu Gly Ser Arg Leu Pro Asp Trp Gly Met

625 630 635 640

Pro Ile Glu Val Val Arg Ser Ala Ala Lys Tyr Val Asp Val Val Ser

645 650 655

Tyr Asn Ala Tyr Lys Glu Gly Leu Thr Lys Ile Lys Trp Asp Phe Leu

660 665 670

Lys Asp Ile Asp Met Pro Ser Ile Ile Gly Glu Trp His Ile Gly Ala

675 680 685

Thr Asp Arg Gly Leu Phe His Pro Gly Leu Ile His Ala Ser Ser Gln

690 695 700

Gln Asp Arg Ala Arg Met Tyr Lys Asp Tyr Met Lys Ser Leu Ile Asp

705 710 715 720

Asn Pro Tyr Phe Val Gly Gly His Trp Phe Gln Tyr Met Asp Ser Pro

725 730 735

Ile Thr Gly Arg Ala Tyr Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Val Gly Phe Val

740 745 750

Asp Val Thr Asp Thr Pro Tyr Pro Glu Met Val Glu Ala Ala Lys Glu

755 760 765

Ile Gly Glu Ser Leu Tyr Gln Arg Arg Phe Asp Ala Lys

770 775 780

<210> 3

<211> 1284

<212> DNA

<213> Marinimicrobium sp. H1

<400> 3

gccgccgact gggacggcct ggcggtaccc gccgaccccg gcgccggcaa tacctgggag 60

ctggtcgacg ccgtgtccga tgacttcaac tactccgccc ccggcgacga caaaggccag 120

gcgttttacg agcgttggtc cgaagggttt atcaatagct ggcaggggcc ggggctcacg 180

gattaccacg acccgaactc ctctgtgacc gaggggaacc ttgttatcga agccacccgc 240

aaacccgaca ccgacgaggt atacaccggc gccattcatt ccaaaaccag cgttcaatac 300

ccggtctacg tcgaagcccg tgttaaaatc atggaccagg tcctcgccaa cgccgtctgg 360

atgctgagcg ccgactccac cgaagaaatt gacattgtgg aagcctacgg tagcagccgc 420

ccggatcaga cctggttcgc agagcgcatg cacctgtcgc accacgtctt tattcgcgac 480

ccgtttcagg actatcagcc caaagatgag ggctcctggt acacggatgg tcgcctgtgg 540

cgcgaacaat ttagccgagt cggcgtttac tggcgcgacc catggcacct ggagtactac 600

atcgacggcg agctggttcg caccgtctcc ggcgaggaaa tcatcgaccc ggagggctac 660

acaaacggca caggtcttag caagcagatg cagatcatcg ttgacgcaga ggatcaggac 720

tggcgctccg acaacggcat catggccacc gatgaagagc tgtcggaccc cgataaaaac 780

cggttctatg tagactggat tcgggtttac aagccagcgt ccatgacccc cgacgccagc 840

gacgacgaca ccgcctcgaa cacgggcgca acggtcacca ccgacttcga cgccttcttc 900

gccacgggca aagacggtga acccgtcgcc gacgacagcg tcgagggatt caaccccgcc 960

gccgatggca agatcaacta caacaccttg ggtgattggg gcgactacag ccttaccgta 1020

ccggaggatg gcgattaccg ggtagaggtc aatgtggcct cccccactca atccggtctg 1080

gcagccaatg tcatgatcga cgaaaccgac gtcgggcaaa tcgccatcac cacaacagga 1140

ggctgggaga cgtacgaaac gttcagcctc gacacccccg taacgctcac cgctggcacc 1200

cacaccgtca ggattcagag cgccggcagt gcaacctggc agtggaatgg caatttgatt 1260

cgtttagttc agcttggtga atga 1284

<210> 4

<211> 2346

<212> DNA

<213> Marinimicrobium sp. H1

<400> 4

atgagactcc ttacgattaa tcaaagtatc tcaattctga tctgttccct ggcgctcgcg 60

gcctgcgatt ccgacacgaa agaacgtgaa agcgacccta agccccaagc gcaacttctg 120

gaagtgttgt atgactttga agagggagtc aaaagcagcg taaaacccag tagtgccaat 180

ctttcgctgc agcccggtcc cgaagaaggc aatgtgcttt cggtggagtt caaagccact 240

gaaagcagct attccggcgt gacctttaag ccggaagccc cttgggattg gagccaatat 300

gagagcttca accttcggat ggacatgaaa agtatcggtg aacactcgac gcagatttac 360

ctgaacgtgg aagacgcgga tggcaatgtg ttcacccgaa gtgtgaatgt tccggtgggt 420

gatttcaaaa cctactacgc caagatgtcc ggccacgaca tcgaaggcac ctatgacggt 480

gacgataccg agcttaactt ctcctccggt ctgaggtcca acccacccac ttgggattca 540

gaggatgaga tgttcgtctg gatgtggggc actcaacagc tcaacaccgc caagattact 600

aaaatcagcc tgagcgttca gggcgccttg ttcgataaaa aagtattgat agatgacatt 660

cggctcgagt ccaacccccc catgaagaag gacttcctgg tggggatcgt ggaccggttt 720

ggtcagaatg ccaaagttga ctatccggga aaagtccaat ccgaggacga gctgattcag 780

cgccgaaagg aagaaaccgc ttctctcaaa gaaggaatga tggcggatcg ctccaagttt 840

ggaggctgga aaaatggccc acagctggag gcaaccgggt actttcgtac cgaaaagtac 900

aacggcaagt ggtccctggt ggatccggaa ggctacctgt acttcgccac cggcctggat 960

attatccgac tttcaaacac cactaccatg accggctatg attacgatca ggacttgatc 1020

aagaagcggg ataaagacga gctgaccccg gaagactcga ttggtatgat ttctgtcagt 1080

gacgaagcaa aggcatcacg gtttgtagcg tcagaaacac gggcgaatat gttcaagtgg 1140

ttgccaggtt tcgatcatga gctggccaat cattacagct accgccggga tgcccactcg 1200

ggcccactcg atcatggtga aaccttcagc ttttaccagg ccaacctgga gcgtaaatac 1260

ggtgaagaga caccgagctc cttcctcaag gactgggagc gggtcactat tgcgcgcatg 1320

ctgaattggg ggttcacgtc attgggcaac tggaccgacc cacagttcta cgacaacgag 1380

acaatcccgt actttgccaa cggctggatc atcggtgatt tcaaaaccgt atccagtggc 1440

aatgacttct gggggcccct tccggatgtc tttgatccaa aattcactga gcgtgccaat 1500

gccactgcag cgaaagtcgc gcgggaagtg cagggcagcc catgggctgt tggggtcttt 1560

atcgataacg aaatgagttt cggtcgtccc gaatccgatc agctgcgcta tggcattgtg 1620

attaacactc tgggtcgaga tgctaagagt gtgcccacca agcgtgaatt tacccgtgcg 1680

atgcgtgagc ggtacgagag catcgaagcg ctgaatgccg cctgggatat tgatctggcg 1740

agttgggaag cattcgccga aggctttgac cccaaagcga ttaccccagc gcagcgcgag 1800

gattactcct caatgctgga gctttatgcg tccgaatact atcggatagt cgaccaagcg 1860

ctggagaagc acatgccgaa ccatttgtat ttgggctctc gactaccgga ttgggggatg 1920

ccgattgagg tagtgcgctc tgccgccaag tatgttgatg tcgtaagtta caacgcttac 1980

aaagaagggt tgaccaaaat caaatgggac tttctgaaag atattgatat gccgagcatt 2040

atcggcgaat ggcacattgg cgctactgat cgcggactgt ttcacccggg gttgattcac 2100

gcctccagtc agcaggatcg ggcccggatg tacaaggact atatgaagtc tctgatcgat 2160

aacccgtact ttgtgggggg gcattggttc cagtatatgg actcgcccat taccggacgc 2220

gcttacgacg gggaaaacta caacgtcggc tttgtggatg tgaccgatac cccctatccc 2280

gaaatggtgg aagcggcgaa ggagattggt gaatctctct accagcgacg ttttgacgcg 2340

aagtaa 2346

Claims

1.一种组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法，其特征在于，该方法组合利用内切型琼胶酶AgaA和外切型双功能琼胶酶AgaB降解琼脂或琼脂糖或粗琼胶获得新琼二糖，内切型琼胶酶AgaA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，外切型双功能琼胶酶AgaB的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

2.如权利要求1所述一种组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法，其特征在于，编码所述内切型琼胶酶AgaA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求1所述一种组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法，其特征在于，所述外切型双功能琼胶酶AgaB同时具有降解琼脂糖和紫菜多糖的活性。

4.如权利要求1所述一种组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法，其特征在于，编码所述外切型双功能琼胶酶AgaB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.如权利要求1所述一种组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法，其特征在于，内切型琼胶酶AgaA和外切型双功能琼胶酶AgaB可以同时加入，或先加入内切型琼胶酶AgaA再加入外切型双功能琼胶酶AgaB，或先加入外切型双功能琼胶酶AgaB再加入内切型琼胶酶AgaA。

6.如权利要求1所述一种组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法，其特征在于，先加入内切型琼胶酶AgaA将琼脂或琼脂糖或粗琼胶液化，再加入外切型双功能琼胶酶AgaB进一步降解产生新琼二糖。

7.如权利要求1所述一种组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法，其特征在于，该方法中利用琼脂或琼脂糖或粗琼胶为底物，其中琼脂或琼脂糖浓度为1-20g/L，粗琼胶浓度为10-200g/L。

8.如权利要求1所述一种组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法，其特征在于，该方法中酶解温度为20-60℃，pH为5.0-9.0。

9.如权利要求1所述一种组合利用琼胶酶制备新琼二糖的方法，其特征在于，该方法能够将琼脂或琼脂糖充分水解，转化为新琼二糖，转化率为90-95%。

10.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞共表达内切型琼胶酶AgaA和外切型双功能琼胶酶AgaB，所述内切型琼胶酶AgaA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述外切型双功能琼胶酶AgaB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

11.如权利要求10所述的一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母中的任意一种。

12.如权利要求10所述的一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞至少包含一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

13.如权利要求10所述的重组宿主细胞在制备新琼二糖中的应用。