CN109182414A

CN109182414A - 一种生产新琼二糖的方法

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Publication number: CN109182414A
Application number: CN201810936884.XA
Authority: CN
Inventors: 产竹华; 易志伟; 陈兴麟; 高波良; 曾润颖
Original assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: LANNAO TECHNOLOGY (XIAMEN) Co.,Ltd.
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2038-08-16
Also published as: CN109182414B

Abstract

本发明涉及一种生产新琼二糖的方法，所述方法组合使用琼胶酶Agaz306、琼胶酶Agaz308、以及可选的硫酸酯酶，能够将粗琼胶和/或琼脂糖转化为新琼二糖。还提供了通过共表达上述三种酶的重组大肠杆菌发酵生产新琼二糖的方法。本发明所述方法生产的新琼二糖纯度高，能够降低成纤维细胞活性氧含量、提高角质形成细胞中水合通道蛋白Aquaporin 3含量，在药物、食品、或化妆品中具有广阔的应用前景。

Description

一种生产新琼二糖的方法

技术领域

本发明涉及酶工程和生物工程技术领域，具体涉及通过酶或重组菌降解琼胶制备琼胶寡糖，特别涉及组合使用琼胶降解酶生产新琼二糖的方法和重组菌。

背景技术

琼脂糖是海洋藻类——红藻中重要的多糖组成成分，其在食品、医疗、生物应用等领域具有重要的应用价值。琼胶寡糖是琼胶多糖经水解后聚合度为2～20的新型的海洋功能性低聚糖，主要由琼二糖的重复单位连接而成，包括琼寡糖(agaroligo saccharides)和新琼寡糖(neoagarooligo saccharides)两个系列，琼寡糖以3,6-内醚-α-L-半乳糖残基为还原性末端，新琼寡糖以β-D-半乳糖残基为还原性末端。大量的研究表明，琼胶寡糖在功能食品、医药等领域具由极大的应用潜力。传统生产琼胶寡糖的方法主要为化学降解法，其不仅具有工艺繁琐，而且严重污染环境等缺点。利用生物降解的方法不仅工艺简单，而且具有环境友好的优点。

目前酶或生物降解产生琼胶寡糖的方法中在底物、产物和工艺控制方面都有待改进。对于作用底物，现有技术中α琼胶酶和β琼胶酶大部分只能以琼脂糖为底物，而难以直接以粗琼胶为底物。对于产物，生物降解法产生的琼胶寡糖，通常是由不同分子大小的寡糖组成的复杂的物质，琼胶寡糖聚合度不均一，现有技术中能够生产二糖、四糖、六糖、八糖、十糖的酶均只是在特定生产工艺下，产物中含有相对较高的上述琼胶寡糖，并且，产物中琼胶寡糖的聚合度受工艺的影响较大，导致不同生产批次的琼胶降解产物组成差异较大。

另外，越来越多的研究表明聚合度不同的琼胶寡糖在抗氧化等生物活性方面存在较大差异，因此聚合度高度不均一的琼胶寡糖不仅影响后续应用，而且也无法确定有效或者主要的活性组份。因此，建立一种利用生物降解方法产单一组份的琼胶寡糖的生产工艺，对琼胶寡糖的生产和应用都有重要的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种生产新琼二糖的方法，所述方法组合使用琼胶酶Agaz306、琼胶酶Agaz308、以及可选的硫酸酯酶，能够将粗琼胶和/或琼脂糖转化为新琼二糖。还提供了通过过表达上述三种酶的重组大肠杆菌发酵生产新琼二糖的方法。本发明所述方法生产的新琼二糖纯度高，能够降低成纤维细胞活性氧含量、提高角质形成细胞中水合通道蛋白Aquaporin 3含量，药物、食品、或化妆品中具有广阔的应用前景。

具体而言，一方面，本发明提供一种生产新琼二糖的方法，其特征在于联合使用琼胶酶Agaz306和琼胶酶Agaz308将琼脂糖降解为新琼二糖，琼胶酶Agaz306的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，琼胶酶Agaz308的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述的方法，其特征在于利用琼胶酶Agaz306将琼脂糖降解为中间产物新琼四糖和新琼六糖，利用琼胶酶Agaz308将中间产物新琼四糖和新琼六糖降解为终产物新琼二糖。

本发明所述的方法，其特征在于还进一步包括使用硫酸酯酶对粗琼胶进行脱硫。

第二方面，本发明提供一种生产新琼二糖的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌过表达琼胶酶Agaz306和琼胶酶Agaz308，所述琼胶酶Agaz306的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，琼胶酶Agaz308的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述重组大肠杆菌，其特征在于所述琼胶酶Agaz306和琼胶酶Agaz308均为分泌表达，相应的琼胶酶Agaz306和琼胶酶Agaz308的编码基因上游融合有信号肽编码序列，例如PelB信号肽的编码序列。

本发明所述琼胶酶Agaz306和琼胶酶Agaz308位于相同或不同的核酸构建体。当位于相同核酸构建体时，琼胶酶Agaz306的编码序列和琼胶酶Agaz308的编码分别位于两个操纵子中。

本发明所述的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌还过表达外源硫酸酯酶。

所述硫酸酯酶优选为硫酯酶Sulz308,，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步，本发明提供一种包含琼胶酶Agaz308表达盒的质粒pACY-AGA1。

本发明提供一种包含琼胶酶Agaz308表达盒和琼胶酶Agaz306表达盒的质粒pACY-NAB1。

本发明提供一种包含硫酸酯酶Sulz308表达盒的质粒pET-Sul1。

本发明提供一种质粒组合，包括质粒pACY-NAB1和质粒pET-Sul1。

第三方面，本发明提供一种生产新琼二糖的方法，其特征在于在含有粗琼胶和/或琼脂糖的培养基中培养本发明所述重组大肠杆菌生产新琼二糖。

本发明所述生产新琼二糖的方法，其特征在于所述培养基中粗琼胶含量为20％，培养时间为31h左右，新琼二糖浓度约为450mg/L。

本发明所述生产新琼二糖的方法，其特征在于所述培养基中琼脂糖含量为2％，培养时间为28h左右，新琼二糖浓度约为500mg/L。

第四方面，本发明提供由所述方法生产的新琼二糖在制备药物、食品、或化妆品中的用途，其特征在于所述药物、食品、或化妆品降低成纤维细胞活性氧含量、和/或提高角质形成细胞中水合通道蛋白Aquaporin 3含量。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

第一、通过琼胶酶的组合，提高产物聚合度的均一化。现有技术中通过不断发现新的琼胶酶来研究其对琼脂糖的降解能力、分析其产物寻找产物聚合度较为稳定的酶。本发明是在前期发现的太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica)WPAGA1基因组分析的基础上，对其中的两种琼胶酶Agaz306和Agaz308的具体性能进行分析，组合使用，极大提高了产物新琼二糖的均一化。

第二、构建工程菌，通过工程菌直接发酵琼胶制备新琼二糖。现有技术中通过多步琼胶酶酶解的方法降解琼胶来生产琼胶寡糖，或者通过发酵海洋微生物降解琼胶酶，工艺复杂、海洋微生物培养困难。本发明基于两种琼胶酶Agaz306和Agaz308组合的作用，构建了过表达这两种琼胶酶的重组大肠杆菌，利用所述重组大肠杆菌直接发酵琼胶制备新琼二糖，操作简单、降解效率高。

第三、使用硫酸酯酶对粗琼胶脱硫，提高了粗琼胶的降解能力和降解效率。粗琼胶中的琼脂糖分子通常带有硫酸化修饰，严重影响了琼胶酶的催化效率。本发明通过组合使用硫酸酯酶进一步提高了琼脂糖降解效率，特别是提高了粗琼胶的降解效率，使得本发明所述方法能够直接以粗琼胶为底物生产新琼二糖。

第四、本发明产物中新琼二糖含量高，生物活性强。本发明所述方法获得的新琼二糖浓度高，几乎不含有聚合度更高的新琼四糖、六糖、八糖等琼胶寡糖。结果表明，本发明产物由于新琼二糖含量高，因此其降低成纤维细胞活性氧含量、提高角质形成细胞中水合通道蛋白Aquaporin 3含量的效果比高聚合度的琼胶寡糖更好。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。

图1：新琼寡糖定量标准曲线。

a：新琼二糖：

b：新琼四糖：

c：新琼六糖。

图2：琼胶酶Agaz306降解琼脂糖产生新琼四糖及新琼六糖。

a：TLC检测；

b：新琼二糖、新琼四糖及新琼六糖标准品离子色谱分析；

c：离子色谱分析Agaz306产物。

图3：琼胶酶Agaz308降解新琼四、六糖产生新琼二糖。

a：TLC分析产物；

b：离子色谱分析产物。

图4：重组质粒质粒pET-Sulz308图谱。

图5：重组质粒质粒pACY-AGA1图谱。

图6：重组质粒质粒pACY-NAB1图谱。

图7：利用大肠杆菌以龙须菜粗琼胶为底物生产单一琼胶寡糖。

a：含质粒pACY-NAB1的E.coli BL21(DE3)生长曲线；

b：琼胶寡糖产物浓度曲线。

图8：利用大肠杆菌以龙须菜粗琼胶为底物生产单一琼胶寡糖。

a：含质粒pET-Sul1、pACY-NAB1的E.coli BL21(DE3)生长曲线；

b：琼胶寡糖产物浓度曲线。

图9：琼胶寡糖聚合度对UV处理后的成纤维细胞中ROS含量的影响。

图10：琼胶寡糖聚合度对人角质形成细胞水合通道蛋白Aquaporin 3含量的影响

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例一、琼胶酶Agaz306、Agaz308的来源及酶活分析

本课题组自深海沉积物中分离获得一株能降解琼脂糖的海洋菌株Flammeovirgapacifica WPAGA1。基因组测序分析获得13个β-琼胶酶，利用PCR技术扩增相关琼胶酶基因。获得的相关琼胶酶基因通过琼脂糖凝胶电泳回收相关基因片段，后克隆到表达载体pEASY-Blunt E2中，并转入E.coli DH5α中，后测序分析验证基因序列。挑选正确的阳性克隆，37℃在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养，提取质粒并转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中。将含相关重组质粒的阳性克隆子于37℃含50μg/mL氨苄青霉素的50mL SOC培养基中培养至OD₆₀₀为0.5左右时，加入1mM的IPTG，16℃诱导12h。后10000×g离心10min，收集细胞，加入5mL的pH7.4的PBS缓冲液，超声破碎，条件为：冰浴，40％功率，破碎时间10min，5s/5s。10000×g离心15min，收集上清，获得粗酶溶液，利用DNS法分析相关琼胶酶的活性。选活性较好的琼胶酶，利用Ni²⁺-NTA柱纯化获得相关的重组蛋白，经过初步活性验证和分析，选取催化效率高、降解活性存在互补关系的琼胶酶Agaz306(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、琼胶酶Agaz308(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)进一步研究。

将50μL的琼胶酶Agaz306与250μL含0.2％的琼脂糖的pH7.4PBS缓冲液于37℃孵育12h，后进行TLC及离子色谱分析产物。DNS分析结果表明，琼胶酶Agaz306具有较好的活性，TLC分析检测其降解琼脂糖产物，表明其终产物无新琼四糖及新琼六糖。进一步离子色谱也表明该产物为新琼四、六糖，结果如图2所示。

为获得单一琼胶寡糖，在上述的混合溶液中加入了琼胶酶Agaz308。TLC分析显示，随着时间的延长，新琼四、六糖逐渐减少，而新琼二糖逐渐增加，反应12h后几乎只有新琼二糖，如图3所示。

实施例二、重组质粒的制备

1、重组质粒pET-Sul1的构建

(1)首先以引物Sulz308F和Sulz308R，从菌株Flammeovirga pacifica WPAGA1基因组中扩增出硫酸酯酶Sulz308；

(2)合成信号肽寡核苷酸链PelB-Sulz308，该序列末端18个碱基为硫酸酯酶Sulz308的序列；

(3)以上述Sulz308基因序列和信号肽PelB-Sulz308做为模板，利用引物PelB-Sulz308F和Sulz308RC进行PCR扩增，得到在5’端融合了信号肽PelB的硫酸酯酶Sulz308序列；

PCR扩增体系如下：

PCR反应条件如下：

其中第二步到第四步反应重复35个循环。

(4)回收PCR片段后用限制性内切酶BamH I、Nco I进行酶切；将质粒pET28a(+)也同样用BamH I、Nco I进行酶切，二者的反应体系和条件均为：BamH I、Nco I酶各1μL，DNA片段10μL，10×buffer 5μL，超纯水补足至50μL，反应温度37℃，时间30min。

(5)回收酶切后的片段，然后利用T4DNA连接酶将二者进行连接，得到重组质粒pET-Sul1。反应体系和条件为：基因片段及pET28a(+)质粒片段各1μL，T₄DNA连接酶1μL，10×T4连接酶buffer 1μL，超纯水补足至10μL，反应温度16℃，时间4h。

(6)将连接好的重组质粒pET-Sul1转入E.coli DH5α，挑选阳性克隆子，并测序验证，重组质粒pET-Sul1的图谱如图4所示。

(7)将测序验证正确的阳性克隆子接种于5mL含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床过夜培养后，提取质粒，并转入表达菌株E.coli BL21细胞中。

2、重组质粒pACY-AGA1的构建

(1)首先以引物Agaz306F和Agaz306R，从菌株Flammeovirga pacifica WPAGA1基因组中扩增出琼胶酶Agaz306；

(2)合成信号肽寡核苷酸链寡核苷酸链PelB-Agaz306，该序列末端18个碱基为琼胶酶Agaz306的序列

(3)以上述Agaz306基因序列和信号肽PelB-Agaz306做为模板，利用引物PelB-Agaz306F和Agaz306R进行PCR扩增，得到在5’端融合了信号肽PelB的琼胶酶Agaz306序列；

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

其中第二步到第四步反应重复35个循环。

(4)回收PCR片段后用限制性内切酶Nde I和Xho I进行酶切，将质粒pACYCDuet-1也同样用Nde I和Xho I进行酶切，二者的反应体系和条件均为：Nde I和Xho I酶各1μL，DNA片段10μL，10×buffer 5μL，超纯水补足至50μL，反应温度37℃，时间30min。。

(5)回收酶切后的片段，然后利用T₄DNA连接酶将二者进行连接，得到重组质粒pACY-AGA1。反应体系和条件为：基因片段及pACYCDuet-1质粒片段各1μL，T₄DNA连接酶1μL，10×_T4连接酶buffer 1μL，超纯水补足至10μL，反应温度16℃，时间4h。

(6)将连接好的重组质粒pACY-AGA1转入克隆菌株E.coli DH5α中，挑选阳性克隆子，并测序验证。重组质粒pACY-AGA1的图谱如图5所示。

(5)将正确的阳性克隆子接种于5mL含25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养，提取质粒，并转入表达菌株E.coli BL21中。

3、重组质粒pACY-NAB1的构建：

(1)首先以引物Agaz308F和Agaz308R，从菌株Flammeovirga pacifica WPAGA1基因组中扩增出琼胶酶Agaz308；

(2)合成信号肽寡核苷酸链PelB-Agaz308，该序列末端18个碱基为琼胶酶Agaz308的序列；

(3)以上述Agaz308基因序列和信号肽PelB-Agaz308做为模板，利用引物PelB-Agaz308F和Agaz308R进行PCR扩增，得到在5’端融合了信号肽PelB的琼胶酶Agaz308序列；

PCR扩增体系如下：

PCR反应条件如下：

其中第二步到第四步反应重复35个循环。

(2)回收PCR片段后用限制性内切酶Nco I和Not I进行酶切，反应条件及体系：NcoI和Not I酶各1μL，DNA片段10μL，10×buffer 5μL，超纯水补足至50μL，反应温度37℃，时间30min

(3)用限制性内切酶Nco I和Not I对重组质粒pACY-AGA1进行酶切，反应条件及体系：Nco I和Not I酶各1μL，质粒pACY-AGA1片段10μL，10×buffer5μL，超纯水补足至50μL，反应温度37℃，时间30min。

(4)将上述步骤(2)和(3)中获得的酶切片段回收后，用T₄连接酶进行连接，得到重组质粒pACY-NAB1。连接反应体系及条件为：两种酶切片段各1μL，T₄DNA连接酶1μL，10×T4连接酶buffer 1μL，超纯水补足至10μL，反应温度16℃，时间4h。

(4)将连接好的片段转入克隆菌株E.coli DH5α中，挑选阳性克隆子，并测序验证。重组质粒pACY-NAB1的图谱如图6所示。

(5)将测序正确的阳性克隆子接种于5mL含25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm过夜培养，提取质粒，转入表达菌株E.coli BL21中。

质粒构建过程中使用的引物和信号肽序列如表1所示。

表1：信号肽模板及所用引物序列

实施例三、工程菌E.coli BL21(pET-Sul1、pACY-NAB1)的制备和生长曲线测定

(1)将含重组质粒pACY-NAB1的E.coli BL21菌株按分子克隆实验指南中的方法制备成感受态细胞。

(2)将重组质粒pET-Sul1转入含重组质粒pACY-NAB1的E.coli BL21中，获得含两种重组质粒pET-Sul1、pACY-NAB1的表达菌株。

(3)分别将含两种重组质粒pET-Sul1、pACY-NAB1的重组E.coli BL21接种于50mL含25μg/mL氯霉素和卡那霉素的SOCB培养基中；以及将含pACY-NAB1的E.coli BL21接种于50mL含25μg/mL氯霉素的SOCA培养基中，37℃、200rpm摇床培养，至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.1mM IPTG，24℃继续摇床培养。

(4)将含两种重组质粒pET-Sul1、pACY-NAB1的E.coli BL21分别在培养2、6、8、10、12、14、16、20、32、38、44h时取样，以不含相应基因的空载体为对照调零，测OD₆₀₀分光光度值。将含重组质粒pACY-NAB1的E.coli BL21分别在培养2、6、8、12、14、20、24、26、30、36、49h时取样，以相应的空载体为对照调零，测OD₆₀0分光光度值，并绘制生长曲线。

实施例四、发酵液上清产物分析

1、TLC分析：

向发酵上清液中加入三倍体积的乙醇，置于-80℃1h，12000×g离心15min，收集上清液，重复3遍，后旋转真空干燥，浓缩复溶，TLC分析，展层液为正丁醇/乙酸/水(2:1:1，v/v/v),后10％H₂SO4均匀涂抹于层析板，100℃烘干显色，纯的新琼二糖为标准品。

2、离子色谱分析：

收集发酵上清，将反应液及琼胶寡糖标准品分别稀释至20mg/L，过0.22μm膜除菌后进行检测。检测条件如下所示。

色谱柱：Dionex CarboPac PA-100阴离子交换柱，包括分析柱(4×250mm)和保护柱(4×50mm)；

流动相：100mmol/L的NaOH和150mmol/L的NaAc，流速为0.25mL/min；

检测条件：安培检测器采用四电位脉冲安培法检测；

柱温：25℃；

进样体积：25μL。

3、新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖产物浓度检测和标准曲线分析

每隔一定时间取样，利用离子色谱分别检测相关产物的浓度，并绘制成浓度曲线。

标准曲线绘制：分别取0.1953mg/L、0.7812mg/L、3.125mg/L、12.5mg/L、50mg/L，离子色谱分析相应的吸收峰面积，结果如图1所示。

实施例五、工程菌E.coli BL21(pACY-NAB1)以琼脂糖和龙须菜粗琼胶为底物生产单一琼胶寡糖。

为了在大肠杆菌中生产新琼寡糖，将含有重组质粒pACY-NAB1的E.coli BL21分别接种于含25μg/mL氯霉素的50mL SOCA培养基和SOCB培养基中，37℃200rpm培养至OD₆₀₀约为0.6，加入IPTG至终浓度为0.1mM，24℃继续摇床培养，按照实施例三中的方法取样绘制生长曲线；同时将发酵液10000×g离心10min，收集上清，进行薄层层析及离子色谱分析产物。

培养基SOCA：2％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.05％NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl₂，20mM葡萄糖，2％的琼脂糖。

培养基SOCB：2％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.05％NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖，20％(v/v)龙须菜粗琼胶。

其中，龙须菜粗琼胶制备方法如下：龙须菜晒干，称取5g龙须菜，剪碎加入300mL水中，水浴加热2h，八层纱布过滤，收集水溶液，4℃储藏备用。

将含质粒pACY-NAB1的E.coli BL21(DE3)接种于培养基SOCA中培养，生长曲线分析结果显示，含有pACY-NAB1的E.coli BL21(DE3)在培养12h后，进入平稳期，OD₆₀₀大约为1.5，而含空载质粒的E.coli BL21(DE3)在培养24h进入稳定期，OD₆₀₀大约为3.5。进一步离子色谱分析寡糖产物，结果表明，新琼四、六糖随着培养时间的延长，浓度越来越低，而新琼二糖的浓度逐渐增高，在培养28h左右，新琼四、六糖几乎检测不到，而新琼二糖的浓度达到最高，约为500mg/L，结果如图7所示。含质粒pACY-NAB1的E.coli BL21(DE3)在培养基SOCB中发酵，琼胶降解效率相对较差，产物中新琼二糖浓度也较低。

实施例六、工程菌E.coli BL21(pET-Sul1、pACY-NAB1)以龙须菜粗琼胶为底物生产单一琼胶寡糖

为了在大肠杆菌中生产新琼寡糖，将含有重组质粒pET-Sul1、pACY-NAB1的E.coliBL21接种于含25μg/mL氯霉素及卡那霉素的50mL SOCB培养基中，37℃200rpm培养至OD₆₀₀约为0.6，加入IPTG至终浓度为0.1mM，24℃继续摇床培养，按照实施例三中的方法绘制生长曲线；同时将发酵液10000×g离心10min，收集上清，进行薄层层析及离子色谱分析产物。

含重组质粒pET-Sul1、pACY-NAB1的E.coli BL21诱导后的生长曲线结果表明，当培养16h后重组大肠杆菌生长进入平稳期，菌浓度OD₆₀₀约为2.0，而含空载体的E.coli BL21在相同培养条件下在30h后进入平稳期，OD₆₀₀约为3.4。当发酵24h后明显有新琼二糖产生，而离子色谱分析结果也发现新琼二糖的浓度显著提高，发酵31h左右，浓度达到最高，约为450mg/L，而新琼四糖及新琼六糖的几乎检测不到，结果如图8所示。共转染两种质粒pET-Sul1、pACY-NAB1的重组大肠杆菌能够直接以粗琼胶为底物生产新琼二糖。质粒pET-Sul1的共转化大幅度提高了对粗琼胶的降解效率(450mg/L)，寡糖产量已经接近实施例五中以琼脂糖为底物获得的产量(500mg/L)。

实施例七、基于成纤维细胞的活性氧(ROS)含量检测

(1)接种：以1.5×10⁵/孔细胞的接种密度接种于6孔板中，37℃，CO₂培养箱孵育过夜；

(2)按ROS检测试验设计(表2)配制不同的受试物；

(3)给药：待6孔板中细胞铺板率达到40％左右时，按阳性对照组和实验组进行分组给药，37℃、5％的CO₂培养箱中孵育培养24h，试验设计如表2所示；

(4)UVA辐照：根据实验分组，空白对照组直接进行ROS活性检测。溶剂对照组和实验组，采用剂量为5J/cm²的UVA进行辐照，辐照结束后，直接进行ROS活性检测；

(5)流式检测：PBS清洗细胞后，每孔加入1mL浓度为25μM DCFH-DA探针，37℃细胞培养箱孵育45min，弃掉含DCFH-DA的培养液，PBS清洗多次，胰蛋白酶消化细胞后，PBS清洗细胞1次，加入一定量新鲜PBS，流式细胞仪检测。

(6)结果分析：统计各组DCF Intensity(平均荧光强度)值，并分析。

表2：ROS检测试验设计

ROS含量检测结果如图9所示，成纤维细胞被紫外照射后，阴性对照组(无处理)ROS的含量显著提高，而阳性对照组(Vc处理)和新琼寡糖处理组的ROS含量则明显低于阴性对照组，表明它们具有显著的抑制ROS产生的作用。阳性对照组中，以Vc处理组和低聚合度新琼寡糖处理组(NA₂-NA₄)的保护效果又远优于高聚合度的新琼寡糖处理组(NA₆-NA₈)，表明低聚合度的新琼寡糖抑制ROS产生的性能更佳，和Vc的效果接近。

实施例八、基于角质形成细胞Aquaporin 3蛋白含量检测

(1)细胞接种：以2×10⁴个/孔的细胞接种密度接种至含有盖玻片的24孔板中，37℃，5％CO₂培养箱孵育过夜；

(2)配液：按照免疫荧光实验设计(表3)配置受试物；

表3：Aquaporin 3蛋白含量检测实验设计

(3)给药：根据表3的实验具体设计，待24孔板中细胞铺板率达到30％-40％时，进行分组给药，每组设3个复孔。37℃，5％CO₂培养箱继续培养24h。

(4)收样：孵育培养结束后，弃掉24孔板中培养液，采用PBS清洗爬片三次，用4％多聚甲醛室温固定细胞30min，4℃冰箱保存。

(5)细胞免疫荧光检测：对细胞进行通透，山羊血清封闭液37℃封闭30min；一抗工作液4℃孵育过夜；二抗工作液(Goat Anti-Rabbit IgG抗体按照1:200，Goat Anti-MouseIgG FITC抗体按照1:200稀释)37℃孵育2h。

(6)衬染：Hochest染液对细胞进行细胞核衬染，被染上的核区可用紫外激发出蓝色荧光。

(7)拍照：正置荧光显微镜下拍照，在同一视野下用蓝光通道激发目的蛋白的绿色荧光，用紫外激发细胞核区的蓝色荧光，分别拍照，将两张图片组合即为merge图。

(8)结果分析：利用Image-pro Plus(IPP)软件分析细胞在蓝光下激发出绿色荧光的照片中绿色荧光强度，计算单位面积下的荧光强度，统计分析结果。

实验结果如图10所示，结果表明相比于空白对照组，新琼寡糖处理细胞后能增加角质形成细胞中的水合通道蛋白Aquaporin 3的含量，而其中低聚合度的新琼寡糖(NA₂-NA₄)的效果比高聚合度(NA₆-NA₈)的更为明显，且有剂量依赖性(500ppm的效果优于125ppm)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 申请人名称国家海洋局第三海洋研究所

<120> 一种生产新琼二糖的方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 358

<212> PRT

<213> Flammeovirga pacifica

<400> 1

Val Ala Ile Leu Val Val Met Leu Phe His Phe Asp Ala Thr His Gly

1 5 10 15

Leu Phe Pro Gly Gly Ser Leu Gly Val Asp Ile Phe Phe Val Leu Ser

20 25 30

Gly Phe Leu Ile Thr Thr Leu Leu Leu Glu Glu Arg Ser Arg Thr Gly

35 40 45

Arg Ile Ser Leu Arg His Phe Phe Gln Arg Arg Ala Arg Arg Leu Leu

50 55 60

Pro Ala Leu Leu Ala Phe Leu Ala Val Phe Ala Val Val Thr Ile Val

65 70 75 80

Leu Ala Gln Pro Gly Ala Asp Arg Leu Pro Thr Thr Ile Val Thr Ser

85 90 95

Leu Phe Tyr Val Phe Asn Trp Ile Pro Ala Phe Gly Gly Asp Trp Thr

100 105 110

Pro Gly Ala Gly His Leu Trp Ser Leu Ser Val Glu Glu Gln Phe Tyr

115 120 125

Leu Leu Trp Pro Leu Ala Ile Ile Ile Ala Leu Arg Ser Gly Pro Arg

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Thr Met Ile Ala Leu Ser Val Leu Ile Phe Val Val Ser Ala Ser Leu

145 150 155 160

Pro Ala Ala Trp Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ala Leu Tyr Tyr Ser Thr

165 170 175

Asp Phe Arg Ala Gln Glu Leu Met Ala Gly Ala Ile Leu Ala Leu Ile

180 185 190

Arg Phe Arg Gly Ala Leu Arg Pro Pro Ile Val Glu Ser Arg Pro Phe

195 200 205

Arg Ala Ala Leu Val Leu Ser Val Leu Phe Leu Gly Val Phe Leu Phe

210 215 220

Arg Leu Asp Asp Pro Thr Gly Ile Leu Tyr Val Arg Leu Tyr Ala Leu

225 230 235 240

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260 265 270

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Ala Ala Glu Leu Ser Trp Gln Leu Ile Glu Arg Arg Gly Ser Phe Ala

305 310 315 320

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325 330 335

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355

<210> 2

<211> 257

<212> PRT

<213> Flammeovirga pacifica

<400> 2

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Gly Ser Thr Leu Asp Leu Arg Lys Trp Tyr Asp Ser Asn Pro Thr Trp

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65 70 75 80

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115 120 125

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165 170 175

Pro Leu Gly Phe Asn Met Ala Glu Asp Phe His Val Tyr Gly Val Glu

180 185 190

Trp Ser Pro Thr Phe Ile Arg Trp Tyr Cys Asp Gly Lys Met Leu Arg

195 200 205

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Pro Ala Val Tyr Glu Val Asp Tyr Val Arg Ala Trp Arg Lys Lys Glu

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Tyr

<210> 3

<211> 567

<212> PRT

<213> Flammeovirga pacifica

<400> 3

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85 90 95

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Asp Asn Asn Glu Phe Arg Leu Lys Glu Ala Ile Lys Val Met Glu Gly

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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275 280 285

Glu Gly Thr Arg Glu Arg Leu Ile Arg Gln Tyr Gln Ser Met Val Gly

290 295 300

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Leu Asp Lys Asn Thr Ile Ile Ile Phe Ser Ser Asp His Gly Leu Leu

325 330 335

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<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtttatat tgaaaagatt taatc 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttaatcgtgg ataagtactg ggtg 24

<210> 6

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tagggtaccg ttactttatg gacgacggct ggcgacgacg accagacgac gaggagcgac 60

gggtcggccg ctaccggtac aaatataact tttctaaa 98

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tagggtaccg ttactttatg gacg 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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<212> DNA

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cccagccggc gatggccgtg gccatactcg tggtc 95

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atccatatga aatacctgct gccg 24

Claims

1.一种生产新琼二糖的方法，其特征在于联合使用琼胶酶Agaz306和琼胶酶Agaz308将琼脂糖降解为新琼二糖，琼胶酶Agaz306的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，琼胶酶Agaz308的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于利用琼胶酶Agaz306将琼脂糖降解为中间产物新琼四糖和新琼六糖，利用琼胶酶Agaz308将中间产物新琼四糖和新琼六糖降解为终产物新琼二糖。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于还进一步包括使用硫酸酯酶对粗琼胶进行脱硫。

4.一种生产新琼二糖的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌过表达琼胶酶Agaz306和琼胶酶Agaz308，所述琼胶酶Agaz306的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，琼胶酶Agaz308的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.如权利要求4所述重组大肠杆菌，其特征在于所述琼胶酶Agaz306和琼胶酶Agaz308均为分泌表达，位于相同或不同的核酸构建体。

6.如权利要求4或5所述的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌还过表达外源硫酸酯酶，所述外源硫酸酯酶优选为硫酯酶Sulz308,，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

7.一种生产新琼二糖的方法，其特征在于在含有粗琼胶和/或琼脂糖的培养基中培养权利要求4-6任一的重组大肠杆菌生产新琼二糖。

8.如权利要求7所述生产新琼二糖的方法，其特征在于所述培养基中粗琼胶含量为20％，培养时间为31h左右，新琼二糖浓度约为450mg/L。

9.如权利要求7所述生产新琼二糖的方法，其特征在于所述培养基中琼脂糖含量为2％，培养时间为28h左右，新琼二糖浓度约为500mg/L。

10.权利要求1-3、7-8任一所述方法生产的新琼二糖在制备药物、食品、或化妆品中的用途，其特征在于所述药物、食品、或化妆品降低成纤维细胞活性氧含量、和/或提高角质形成细胞中水合通道蛋白Aquaporin 3含量。