寡聚透明质酸或者寡聚透明质酸盐的用途及其组合物
本发明是申请号为201210497017.3的母案的分案申请,该母案的申请日为2012年11月29日,发明名称为“一种芽孢杆菌、一种透明质酸酶及其制备方法和用途”。
技术领域
本发明属于酶学和药物化学领域,涉及聚透明质酸或者寡聚透明质酸盐的用途,以及含有聚透明质酸和/或寡聚透明质酸盐的组合物。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种酸性黏多糖,由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的无分支高分子糖胺聚糖,存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域,分子量一般为105-107Da(道尔顿)。
寡聚透明质酸是指分子量小于10kDa的透明质酸。研究表明,分子量对透明质酸的活性有很大影响,不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性(郭学平等,低分子量及寡聚玻璃酸,中国生化药物杂志, 2003,24(3):148-150)。
研究表明,寡聚透明质酸在体内具有促血管生成作用,在体外可促进内皮细胞的增生,促进创伤愈合(West DC,Kumar S.The effect of hyaluronate and itsoligosaccharides on endothelial cell proliferation and monolayerintegrity.Exp Cell Res.1989,183(1):179-96)。寡聚透明质酸盐具有促血管生成、促进创伤愈合等生物活性,在医药领域具有良好的应用前景。
在炎症过程中,寡聚透明质酸对树突细胞和巨噬细胞等免疫活性细胞具有强力活化作用(Termeer C,Benedix F,Sleeman J,et al. Oligosaccharides of Hyaluronanactivate dendritic cells via toll-like receptor 4.J Exp Med.2002,195(1):99-111)。
寡聚透明质酸在体外可抑制小鼠TA3/St乳腺癌细胞、大鼠CG神经胶质瘤细胞、人HCT克隆瘤细胞及人LXI肺癌细胞的生长,具有抗肿瘤作用(Ghatak S,Misra S,TooleBP.Hyaluronan constitutively regulates ErbB2phosphorylation and signalingcomplex formation in carcinoma cells.J Biol Chem.2005,280(10):8875-83)。
此外,寡聚透明质酸盐分子中的羟基、羧基和其他极性基团可与水分子形成氢键而结合大量的水分,保水效果明显,因此寡聚透明质酸盐可用于防晒、抗衰老、保湿化妆品中。
目前,透明质酸降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类,物理降解法很难将透明质酸降至10kDa以下,化学降解法和酶法可以制备寡聚透明质酸,但化学降解法制备寡聚透明质酸,需要较剧烈的反应条件(如较高的酸碱浓度等)才能达到最大程度的降解。此时,不但糖链上的糖苷键断裂,而且单糖(葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖)残基的结构也遭到破坏,如乙酰基被水解掉,单糖六元环断裂等(表现在红外图谱上是与欧洲药典标准图谱不一致),对制得的寡聚透明质酸的生物活性产生一定影响(郭学平等,低分子量及寡聚玻璃酸,中国生化药物杂志,2003,24(3):148-150)。化学降解法制备的寡聚透明质酸还容易发生褐变(中国专利申请号201110008110.9),生产过程会污染环境。而酶解法降解透明质酸时,只断裂单糖分子间的糖苷键,不会对其他结构造成破坏,而且酶解法反应条件温和,不用强酸强碱,制备的寡聚透明质酸不会发生褐变,不会造成环境污染,并且酶解法制备的寡聚透明质酸的双糖结构完整,红外图谱与欧洲药典图谱一致,因此酶解法最适合制备寡聚透明质酸。
降解透明质酸所用的酶主要是透明质酸酶(又称为玻璃酸酶),根据作用机制的不同,可以分为3类:(1)内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶,为水解酶,作用于β-1,4糖苷键,终产物主要为四糖,也可作用于软骨素或硫酸软骨素,并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。(2)水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶,为内切-β-葡糖苷酸酶,作用于β-1,3糖苷键,也是水解酶,主要降解产物是四糖,特异性降解透明质酸;(3)细菌透明质酸酶,也称为透明质酸裂解酶 (hyaluronate lyase),作用于β-1,4糖苷键,通过β-消去机制得到4,5- 不饱和双糖(Kreil,G,Hyaluronidases--a group of neglectedenzymes, Protein Sci,1995,4(9):1666-1669)。
目前工业生产寡聚透明质酸或其盐的方法是化学降解法,由于含透明质酸酶的动物组织来源有限,有文献报道的微生物来源透明质酸酶发酵液单位酶活较低,发酵液最高酶活是1.3×102IU/mL (WO2010130810A1;Eileen Ingham,K.T.Holland,G.Gowland andW.J.Cunliffe,Purification and Partial Characterization of Hyaluronate Lyase(EC4.2.2.1)from Propionibacterium acnes,Journal of General Microbiology(1979),115,411-418),其余文献报导的酶活均低于 100IU/mL,不可能大规模制备透明质酸酶,也就不可能用酶法大规模生产寡聚透明质酸或其盐。
此外,目前一般将分子量在104Da-106Da的透明质酸称为低分子透明质酸(LMW-HA)。分子量为2万-6万的LMW-HA可刺激体外培养的骨细胞的增生,增加培养基中骨细胞集落的数目和单个集落的面积(US 5646129)。使用含有妥布霉素和分子量为50万的HA的滴眼液治疗细菌性角膜溃疡,与只含妥布霉素的滴眼液相比,可显著缩短愈合时间(GandolfiSA,Massari A,Orsoni JG.Low-molecular-weight sodium hyaluronate in thetreatment of bacterial corneal ulcers s[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,1992,230(1):20-23)。韩国专利 (KR20080087941)提供了一种含分子量小于10万的HA的组合物,该组合物易于被人体吸收,口服可有效改善皮肤皱纹、提高皮肤弹性。日本专利(JP2000-103723)提供了一种含分子量20万-40万HA的组合物,该组合物可促进毛发生长。但是,与寡聚透明质酸或其盐的情形类似,酶解法制备的低分子透明质酸或其盐在结构上比化学法制备的要完整,化学法制备的低分子透明质酸或其盐的结构会发生开环、脱乙酰基等。
LMW-HA因其相对分子质量较小,外用时可被皮肤更好的吸收,促进皮肤营养的供给和废物排泄,从而防止皮肤老化,达到深层保湿和美容养颜的效果,而且还可促进表皮细胞的增殖和分化,清除氧自由基,修复日光或紫外线伤害的皮肤。口服LMW-HA易于吸收,不仅可以活化皮肤细胞,保持表皮湿润,同时具有良好的增强免疫功能和抗衰老功能。因此化妆品用及保健食品用HA多为LMW-HA。另外,LMW-HA 还具有促血管生成、细胞免疫活化和促进骨生成的作用,对治疗细菌性角膜溃疡具也有良好的疗效,在医药领域应用广泛。
LMW-HA是由高分子量HA降解得到的,降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类。物理降解法中的超声降解法虽然不添加化学试剂和酶,但很难将高分子量HA降解至分子量200kDa以下 (覃彩凤,王淼,陈晓峰.透明质酸的降解方法及工艺条件研究[J].2007, 4:32-36)。机械研磨法也是一种有效降低HA相对分子量的方法,有专利报道在室温下研磨时间为0.5h-12h,振荡频率为10Hz-30Hz,但不适用于大规模生产(CN101942037A)。化学降解法会造成结构破坏,这时不但糖链上的糖苷键断裂,而且单糖(葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖)残基的结构也可能遭到破坏,如乙酰基被水解掉、单糖六元环断裂等。
有报道酶解法生产低分子HA的制备过程,先将HA从发酵液中分离纯化出来,然后再添加入透明质酸酶进行酶解,再经过膜过滤、乙醇沉淀、脱水干燥得到低分子HA(CN101020724A),上述制备工艺所用的透明质酸酶为透明质酸酶成品,价格很高,很难实现工业化生产。目前,有文献报道的微生物来源透明质酸酶发酵液单位酶活较低,发酵液最高酶活是1.3×102IU/mL(WO2010130810A1),其余文献报道的酶活均低于102IU/mL,因此应用酶切法大规模生产低分子HA目前很难实现。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动,得到了一种芽孢杆菌和一种透明质酸酶。该透明质酸酶活性高,可达105IU/mL(发酵液),纯化后可以达到8×106-1.5×107IU/mg,远高于目前文献中报道的最高酶活。该透明质酸酶的分子量为123KDa,最适作用温度及pH分别为 42℃、6.5,热稳定性和pH稳定性高。该酶可催化裂解透明质酸和硫酸软骨素,但是不能降解海藻酸钠,肝素钠,壳聚糖,几丁质和羟甲基纤维素钠。利用该透明质酸酶降解高分子透明质酸,反应速度快、反应条件温和、环境污染小,可大规模工业化生产低分子透明质酸及寡聚透明质酸,还可生产低分子硫酸软骨素(本发明中是指分子量为 1,000-10,000的硫酸软骨素,也称为低分子量硫酸软骨素)。本发明采用芽孢杆菌发酵得到的透明质酸酶对高分子量透明质酸或其盐进行降解,酶活高、条件温和、操作简单、无环境污染。由此提供了下述发明:
本发明的一个方面涉及一种芽孢杆菌,其保藏编号为CGMCC No. 5744,保藏日期为2012年2月8日,保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
针对现今生物降解透明质酸或其盐所需降解酶活性低、来源有限、成本高的缺点,发明人从空气中分离得到了一种产透明质酸酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50,该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏,保藏号为CGMCCNo. 5744,保藏时间为2012年2月8日。
本发明的另一方面涉及一种制备透明质酸酶的方法,包括使用本发明的芽孢杆菌的步骤。
根据本发明的制备透明质酸酶的方法,其包括下述步骤:将本发明的芽孢杆菌斜面培养、种子培养、发酵培养、离心、硫酸铵分级沉淀、超滤,制得透明质酸酶。
根据本发明任一项所述的制备透明质酸酶的方法,其包括如下步骤:
(1)将本发明的芽孢杆菌进行斜面培养,得斜面菌种;
(2)取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中,在25-40℃、100-200rpm的条件下培养10-24h,得种子液;
(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中,在25-40℃、100 -300rpm的条件下培养12-24h,得透明质酸酶发酵液;
(4)离心分离发酵液,取上清液;
(5)将上清液用硫酸铵分级沉淀,过滤(例如采用0.65μm的微孔滤膜进行过滤),得到粗制的透明质酸酶;
(6)将步骤(5)沉淀出来的粗制透明质酸酶溶于磷酸盐缓冲液中,超滤除去小分子杂质,得纯化的透明质酸酶。
可选地,步骤(6)也可以采用如下的步骤(6-1)至(6-3):
(6-1):将步骤(5)中的粗制透明质酸酶溶于pH4.5-8.0的缓冲溶液中,得粗酶液;将粗酶液装入截留分子量为3.0×103-1.4×104Da 的透析袋,放入pH4.5-8.0的缓冲溶液中,4℃下透析过夜;
(6-2):将透析后的粗酶液进行离子交换色谱分离,色谱柱填料是DEAE琼脂糖凝胶FF介质,用0-0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱,并收集洗脱峰;
(6-3):将步骤(6-2)得到的透明质酸酶样品进行冷冻真空干燥,得到白色粉末,即为透明质酸酶。
步骤6-1至6-3是对透明质酸酶的进一步纯化。
上述分离纯化透明质酸酶的方法中,SDS-PAGE电泳检测步骤 (6-2)得到的透明质酸酶纯度达到97%以上。
上述步骤(1)中,每100mL斜面培养基中含有以下成分:蛋白胨0.2-2.0g,酵母粉0.2-2.0g,K2HPO4·3H2O 0.05-0.15g, MgSO4·7H2O 0.05-0.15g,葡萄糖0.5-1.5g,琼脂粉2.0g,pH调至 6.0-8.0,斜面培养的温度为25-40℃。
上述步骤(2)中,每100mL种子培养基中含有以下成分:蛋白胨0.2-2.0g,酵母粉0.2-2.0g,K2HPO4·3H2O 0.05-0.15g, MgSO4·7H2O 0.05-0.15g,葡萄糖0.5-1.5g,pH调至6.0-8.0。
上述步骤(3)中,每100mL发酵培养基中含有以下成分:蛋白胨0.2-2.0g,酵母粉0.2-2.0g,K2HPO4·3H2O 0.05- 0.15g,MgSO4·7H2O 0.05-0.15g,葡萄糖0.5-1.5g,吐温800.05mL, pH调至6.0-8.0。
可采用盐酸、硫酸或磷酸中的一种或一种以上调节斜面培养基、种子培养基和发酵培养基pH。
斜面种子培养和发酵培养的接种量可以通过现有技术得到,不需付出创造性的劳动。种子培养基的接种量能够达到发酵培养所需接种量的种子液即可,发酵培养基的接种量一般在3-15%即可。
上述步骤(4)中,发酵液离心的转速为10000-15000rpm,离心时间为10-20min。
上述步骤(5)中,硫酸铵分级沉淀的步骤是:将上清液中加入硫酸铵,使其质量体积浓度为20%-25%,过滤除去产生的沉淀,然后继续加入硫酸铵,至其质量体积浓度为35%-40%为止,得到的沉淀即为透明质酸酶。本发明中所述的质量体积浓度的意思是:每mL上清液中含有硫酸铵的质量(g)。
上述步骤(6)中,磷酸盐缓冲液的pH优选为6.0,浓度优选为 50mmol/L,在实际应用中可酌情变动。超滤所用的为超滤膜。超滤膜的截留分子量为3×104Da。
本发明的再一方面涉及一种透明质酸酶,其由上面任一项所述的制备透明质酸酶的方法制得。
本发明芽孢杆菌生产的透明质酸酶在发酵液中的酶活可达到 1×105-3×105IU/mL,大大高于文献报道中的最高酶活 (1.3×102IU/mL),且该酶热稳定性和pH稳定性高,用其降解高分子透明质酸,用来制备寡聚或低分子透明质酸,成本显著降低,可用于大规模生产,解决了动物来源的透明质酸酶成本高的问题,在生化研究领域及寡聚或低分子透明质酸的生产方面有广阔的应用前景。
本发明还涉及一种分离的多肽(或蛋白),其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;具体地,所述多肽(或蛋白)为透明质酸酶。
在本发明的一个实施方案中,所述透明质酸酶由本发明的芽孢杆菌制得。
本发明还涉及一种透明质酸酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
一种分离的多肽(或蛋白),其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;具体地,所述多肽(或蛋白)为透明质酸酶。
一种分离的多核苷酸,其编码SEQ ID NO:2所示所示的氨基酸序列;具体地,所述多核苷酸的序列为SEQ ID NO:3所示的序列或 SEQ ID NO:3的互补序列。
一种重组载体,其含有本发明的多核苷酸。
一种重组宿主细胞,其含有本发明的重组载体。
本发明的再一方面涉及一种制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法,包括使用本发明中任一项所述的透明质酸酶或者含有本发明中任一项所述的透明质酸酶的发酵液对分子量大于10kDa的透明质酸或其盐进行降解的步骤。
根据本发明制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法,其包含如下步骤:
1)配制透明质酸或其盐溶液:向纯化水中加入分子量大于10kDa 的透明质酸或其盐,配制成质量体积浓度为1-30%的溶液;
2)酶解:调节步骤1)中溶液的温度为20-48℃、pH为4-9,然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶,将透明质酸或其盐酶解至所需分子量,得酶解液;
3)灭活:将酶解液在50-90℃下保持10-60min,对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活;
优选地,还包括如下步骤:
4)过滤:向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐,搅拌至完全溶解,然后用孔径为0.45μm的滤膜过滤,得滤液,每100mL酶解液中加入0.1-10g的易溶性无机盐;
5)沉淀:将步骤4)的滤液与滤液体积3-20倍的醇或酮混合均匀,析出寡聚透明质酸盐沉淀;
6)脱水干燥:将步骤5)中的寡聚透明质酸盐沉淀分离出来,用有机溶剂脱水,然后真空干燥,得寡聚透明质酸盐。
根据本发明制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法,其中,步骤1)中,每1kg透明质酸或其盐加2×107-5×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
根据本发明的制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法,其中,步骤2)中,酶解温度为35-45℃,酶解pH为5.5-7.5,将透明质酸酶解至分子量为大于或等于3000Da,并且小于104Da。
根据本发明的制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法,其满足如下的A-F中的任一项或多项:
A.步骤1)中,透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐;
B.步骤2)中,采用酸或碱调节pH至4-9,所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸,所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾;
C.步骤3)中,将酶解液在55-65℃下保持20-30min,对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活;
D.步骤4)中,所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐;优选钠、钾、钙、锌、镁的氯化物、硫酸盐或硝酸盐;
E.步骤5)中,所述醇或酮为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇;
F.步骤6)中,脱水所用的有机溶剂为酮或醇。
上述方法中,所用的芽孢杆菌透明质酸酶即芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50CGMCCNO.5744发酵得到的透明质酸酶比活为8×106- 1.5×107IU/mg,酶的加入量为每kg透明质酸或其盐中加2×107- 5×107IU的纯化酶。透明质酸酶对透明质酸有很好的降解性,只要加入合适的透明质酸酶,即可以得到任意小分子量的透明质酸,因此在酶解时,控制时间的长短即可得到所需分子量的透明质酸。
此外,步骤4)中以滤膜过滤酶解液,滤去透明质酸酶等杂质,提高了产物的纯度,所选滤膜为本领域常用的过滤膜即可,只要满足孔径的要求都能用于本发明,滤膜的孔径为0.45μm,材质可以是纤维素酯类、聚砜类、或聚酰胺类。
上述步骤6)中,脱水所用的有机溶剂为与水互溶的有机溶剂,将寡聚透明质酸盐沉淀加入此有机溶剂中可以带走沉淀中的大部分水,优选的,有机溶剂为酮或醇,最优选的为常用的乙醇、丙酮。
本发明的制备寡聚透明质酸或其盐的方法操作简单,条件温和,对产品结构无破坏,无环境污染,而且发酵来源的透明质酸酶成本低,适合大规模工业化生产,制备的寡聚透明质酸盐具有透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强、颜色无褐变等优点,可用在化妆品、食品及医药领域,前景广阔。
本发明的再一方面涉及一种寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐,其由本发明中任一项所述的制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法制得。
本发明的再一方面涉及一种寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐,其 N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量≧65%、≧70%、≧75%、≧80%、≧85%、≧90%或≧95%(w/w);具体地,所述N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量通过HPLC法测得。更具体地,HPLC 的条件为:采用糖分析柱进行高效液相色谱测定;流动相为0.4mol/L NaH2PO4溶液;流速为0.6ml/min;柱温为35℃;检测波长为232nm;进样量为20μL。
例如可以采用下面的步骤:
a.标准对照品溶液:称取一定量的标准对照品(Hyaluronic acid disaccharideΔDiHA sodium salt,H9649,Sigma)用磷酸盐缓冲液 (pH6.0,5mmol/L)溶解配制成1mg/mL的溶液,得到标准对照品溶液;
b.样品预处理:称取一定量的待测样品(比较例1-7、实施例13-26 制备),用磷酸盐缓冲液(pH6.0,5mmol/L)溶解配制成1mg/mL的溶液。取1mL样品溶液加入1000IU的透明质酸酶(可以为实施例10-12 制备),42℃水浴2h;酶解结束后,将酶解液煮沸2min使酶失活,得到样品酶解液。
将样品酶解液转移至20mL容量瓶中,加入流动相稀释至刻度,混匀,过滤即得供试液。
c.标准对照品溶液处理:取1mL标准对照品溶液采用流动相稀释 20倍,过滤待用。
d.色谱条件:采用糖分析柱进行高效液相色谱测定;流动相为 0.4mol/L NaH2PO4溶液;流速为0.6ml/min;柱温为35℃;检测波长为232nm;进样量为20μL;
e.结果计算:
采用高效液相色谱分别对标准对照品和待测样品进行色谱分离,按外标法以透明质酸双糖峰面积计算;具体地,按以下公式计算寡聚透明质酸或其盐的含量(以N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量表示):
Ax:待测样品的透明质酸双糖峰面积;
AR:标准对照品的透明质酸双糖峰面积;
Wx:待测样品称样量,mg;
CR:标准对照品溶液浓度,mg/mL;
h(%)为待测样品干燥失重。
具体方法也可以参照公开号为CN102323344A的中国专利申请,其全部内容在此通过引用并入本发明。
根据本发明的任一项所述的寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐,其通过HPLC法和咔唑法测得的含量的差值小于1%。
根据本发明的任一项所述的寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐,其分子量为大于或等于3000Da,并且小于104Da。具体地,所述寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐为酶解法(酶切法)制得;更具体地,由本发明的透明质酸酶制得。
所得寡聚透明质酸盐为白色粉末或颗粒,含量大于95%,其0.1%水溶液的pH在6-8之间。其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致,性能良好,结构未被破坏。
本发明的再一方面涉及一种制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法,包括使用本发明中任一项所述的透明质酸酶或者含有本发明中任一项所述的透明质酸酶的发酵液对分子量大于1000kDa的透明质酸或其盐进行降解的步骤。
根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法,其包含如下步骤:
1)配制透明质酸或其盐溶液:向纯化水中加入分子量大于 1000kDa的透明质酸或其盐,配制成质量体积浓度为0.1-2%的溶液;
2)酶解:调节步骤1)中溶液的温度为20-48℃、pH为4-9,然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶,将透明质酸或其盐酶解至所需分子量,得酶解液;
3)灭活:将酶解液在50-90℃下保持10-60min,对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活;
优选地,还包括如下步骤:
4)过滤:向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐,搅拌至完全溶解,然后用孔径为0.45μm的滤膜过滤,得滤液,每100mL酶解液中加入0.1-10g的易溶性无机盐;
5)沉淀:将步骤4)的滤液与滤液体积1-10倍的醇或酮混合均匀,析出低分子透明质酸盐沉淀;
6)脱水干燥:将步骤5)中的低分子透明质酸盐沉淀分离出来,用有机溶剂脱水,然后真空干燥,得低分子透明质酸盐。
根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法,其中,步骤1)中,每1kg透明质酸或其盐中加106-107IU 的芽孢杆菌透明质酸酶。
根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法,其中,步骤2)中,酶解温度为35-45℃,酶解pH为5.5 -7.5,将透明质酸酶解至分子量为10kda-1000kDa;优选为10kDa -770kDa或10kDa-700kDa或10kDa-600kDa或10kDa-500kDa;更优选为10kDa-400kDa;进一步优选为10kDa-300kDa、10kDa- 200kDa、10kDa-150kDa、10kDa-100kDa、10kDa-50kDa或10kDa -30kDa。
根据本发明任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法,其满足如下的A-F中的任一项或多项:
A.步骤1)中,透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐;
B.步骤2)中,采用酸或碱调节pH至4-9,所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸,所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾;
C.步骤3)中,将酶解液在55-65℃下保持20-30min,对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活;
D.步骤4)中,所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐;优选钠、钾、钙、锌、镁的氯化物、硫酸盐或硝酸盐;
E.步骤5)中,所述醇或酮为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇;
F.步骤6)中,脱水所用的有机溶剂为酮或醇。
本发明的再一方面涉及一种低分子透明质酸或低分子透明质酸盐,其由本发明中任一项所述的制备低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的方法制得。
本发明的再一方面涉及一种低分子透明质酸或低分子透明质酸盐,其N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量≧90%或≧95% (w/w);具体地,所述N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量通过HPLC法测得。更具体地,HPLC的条件为:采用糖分析柱进行高效液相色谱测定;流动相为0.4mol/L NaH2PO4溶液;流速为 0.6ml/min;柱温为35℃;检测波长为232nm;进样量为20μL。具体的方法也可以参照上面的测寡聚透明质酸或其盐的含量(N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量)的方法进行。
根据本发明的任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐,其分子量为10kDa-1000kDa;优选为10kDa-770kDa或10kDa -700kDa或10kDa-600kDa或10kDa-500kDa;更优选为10kDa- 400kDa;进一步优选为10kDa-300kDa、10kDa-200kDa、10kDa-150kDa、10kDa-100kDa、10kDa-50kDa或10kDa-30kDa。具体地,所述低分子透明质酸或低分子透明质酸盐为酶解法(酶切法)制得;更具体地,由本发明的透明质酸酶制得。
根据本发明的任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐,其通过HPLC法和咔唑法测得的含量的差值小于1%。
不拘于理论的限制,在相同酶量的情况下,只要控制不同的酶解时间即可得到不同分子量的透明质酸盐,即只要控制合适的酶解时间即可得到低分子透明质酸盐或寡聚透明质酸盐。但实际上,会出现时间长了酶的活性可能降低、透明质酸盐的溶液会染菌等问题,所以优选通过控制加不同的酶量来控制得到不同分子量的透明质酸盐,如制备低分子透明质酸盐时可加酶量少一些,制备寡聚透明质酸盐时则需加酶量多一些。
可以间隔取样检测产物的分子量。寡聚透明质酸盐和低分子透明质酸盐的分子量测定采用GPC-MALLS法或Laurent法 (GPC-MALLS法更方便一些);本领域技术人员可以根据本领域知识自行选择合适的检测时间间隔。
本发明的再一方面涉及一种组合物,其包含本发明中任一项所述的透明质酸酶、本发明的多核苷酸、本发明的重组载体、本发明的重组宿主细胞、本发明任一项所述的寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐、或者本发明任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐;可选地,其还包含药学上或食品学上可接受的载体或辅料。具体地,所述组合物为化妆品;更具体地,所述化妆品为防晒、晒后修复、抗衰老、或保湿的化妆品。
本发明的再一方面涉及本发明的芽孢杆菌或本发明的多核苷酸或本发明的重组载体或本发明的重组宿主细胞在制备透明质酸酶中的用途。
可以利用本领域人员知悉的技术手段,将本发明的编码透明质酸酶的多核苷酸克隆至表达载体,转导至合适的宿主细胞,表达本发明的透明质酸酶。
本发明还涉及本发明中任一项所述的透明质酸酶在制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐、低分子透明质酸或低分子透明质酸盐、或者低分子硫酸软骨素中的用途。
本发明还涉及本发明任一项所述的寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐或者本发明任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐在制备促血管生成和/或促进创伤愈合或抗氧化或清除自由基或促进 HUVEC细胞增殖或抗肿瘤(例如乳腺癌、肺癌、或神经胶质瘤)或提高免疫力的药物或者在制备食品或保健品或化妆品中的用途;具体地,所述化妆品为防晒、晒后修复、抗衰老、或保湿的化妆品。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外促血管生成和/或促进创伤愈合或抗氧化或清除自由基或促进HUVEC细胞增殖或抑制肿瘤细胞(例如乳腺癌细胞、肺癌细胞、或神经胶质瘤细胞)的方法,包括给与受试者或使用有效量的本发明任一项所述的寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐或者本发明任一项所述的低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的步骤;具体地,所述受试者为哺乳动物,更具体地,所述受试者为人。
在本发明中,如果没有特别说明,“寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐”亦简称为“寡聚透明质酸或其盐”,寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的分子量小于10kDa;优选地,大于或等于3000Da,并且小于104Da。寡聚透明质酸盐的种类并不特别限定,包括但不限于:钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐等等。
在本发明中,如果没有特别说明,“低分子透明质酸或低分子透明质酸盐”亦简称为“低分子透明质酸或其盐”,低分子透明质酸或低分子透明质酸盐的分子量为10kDa-1000kDa;优选为10kDa-500kDa;更优选为10kDa-400kDa;进一步优选为10kDa-300kDa、10kDa- 200kDa、10kDa-150kDa、10kDa-100kDa、10kDa-50kDa或10kDa -30kDa。低分子透明质酸盐的种类并不特别限定,包括但不限于:钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐等等。
本发明中,对于某个成分的含量的百分比,如果没有特别说明,均指重量百分比(w/w)。
下面给出了本发明涉及的术语的解释。
表达载体
本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体,该载体可以包括一个或多个方便的限制位点,以便在这些位点插入或取代编码透明质酸酶的核酸序列。或者,可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时,可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。
载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构,可独立于染色体进行复制),例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者,载体是一个当导入宿主细胞时,将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外,可应用单个载体或质粒,或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒,或转座子。
优选本发明所述载体含有一个或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因,其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性,或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。
优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中,或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。
就进行自主复制的情况而言,载体还可以包含复制起点,使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如,fEhrlich,1978,美国国家科学院学报75:1433)。
可以向宿主细胞插入一个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少一个附加拷贝插入宿主细胞基因组中,或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记,通过在有合适选择试剂存在下培养细胞,挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。
用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等,分子克隆实验手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989)。
宿主细胞
本发明还涉及包含可用来重组生产透明质酸酶的本发明所述核酸序列(多核苷酸)的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞,从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于透明质酸酶编码基因及其来源。
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞,例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
制备方法
本发明还涉及重组制备本发明透明质酸酶的方法,该方法包括: (a)在适于产生透明质酸酶的条件下,培养含有核酸构建体的宿主细胞,该核酸构建体包含编码所述透明质酸酶的核酸序列;和(b)回收该肽。
在本发明所述制备方法中,用本领域已知方法在合适透明质酸酶产生的营养培养基中培养细胞。例如,可以在合适的培养基中,在允许透明质酸酶表达和/或分离的条件下,通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵) 来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中,采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如,美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果透明质酸酶被分泌到培养基中,则可以直接从培养基中回收。如果透明质酸酶不分泌,可以从细胞裂解物中回收。
可以用本领域已知方法回收所产生的透明质酸酶。例如,可以通过常规操作(包括,但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收。
可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述透明质酸酶,这些操作包括,但不限于层析(例如,离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、HPLC、电泳(例如,制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如,蛋白质纯化,J.C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
发明的有益效果
该发明中的产透明质酸酶菌种芽孢杆菌及该发明的透明质酸酶,均未见报道。该酶酶活高,解决了现有发酵来源的透明质酸酶酶活低、动物来源的透明质酸酶成本高的缺点。利用本发明的透明质酸酶生产寡聚透明质酸或其盐或者低分子透明质酸或其盐的制备方法操作简单,条件温和,对产品结构无破坏,无环境污染,而且发酵来源的透明质酸酶成本低,适合大规模工业化生产。本发明制备的寡聚透明质酸盐或低分子透明质酸盐具有结构完整、透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强、颜色无褐变等优点,还具有防晒及晒后修复的作用,可用在化妆品、食品及医药领域。
附图说明
图1:SDS-PAGE电泳图。其中,Marker为Unstained Protein Molecular WeightMarker,泳道1、2、3分别为实施例10、11、12 制备的透明质酸酶。
图2:不同方法制备的寡聚透明质酸盐的红外图谱,其中:
图2A为透明质酸钠的欧洲药典标准图谱,
图2B为比较例1寡聚透明质酸盐的红外图谱,
图2C为实施例13制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱,
图2D为实施例14制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱,
图2E为实施例15制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱,
图2F为实施例16制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱,
图2G为实施例17制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱,
图2H为实施例18制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱。
图3:温度对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶的热稳定性实验结果。图3A,温度对酶活性的影响;图3B,透明质酸酶的热稳定性实验结果。
图4:pH对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶的pH稳定性实验结果。图4A,pH对酶活性的影响;图4B,透明质酸酶的pH稳定性实验结果。
图5A:寡聚透明质酸盐的透皮吸收比例图。
图5B:寡聚透明质酸盐的DPPH自由基清除能力图。
图5C:低分子透明质酸盐的DPPH自由基清除能力图。
图5D:寡聚透明质酸盐的还原能力图。
图5E:低分子透明质酸盐的还原能力图。
图6A:寡聚透明质酸盐对L929细胞UVA辐照后的修复作用。
图6B:低分子透明质酸盐对L929细胞UVA辐照后的修复作用。
图6C:寡聚透明质酸盐对L929细胞UVA辐照的防护作用。
图6D:低分子透明质酸盐对L929细胞UVA辐照的防护作用。
本发明涉及保藏的生物材料:
本发明芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50,其于2012年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.5744,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所,100101。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
下述的实施例或比较例或实验例中,寡聚透明质酸盐及低分子透明质酸盐的分子量测定采用GPC-MALLS法;含量测定采用HPLC 法或咔唑法。寡聚透明质酸或低分子透明质酸与直接发酵制得的透明质酸(结构未被破坏)都是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的,因此它们的含量等于双糖的含量,可以用芽孢杆菌透明质酸酶将寡聚透明质酸或低分子透明质酸或者普通透明质酸降解成双糖,通过HPLC法测定双糖含量,得到寡聚透明质酸盐或低分子透明质酸盐的含量。还可采用咔唑法(凌沛学.透明质酸【M】.北京:中国轻工业出版社,2002)测定寡聚透明质酸或其盐或者低分子透明质酸或其盐的含量。如果透明质酸或其盐的结构受到破坏,则透明质酸酶不会对破坏部分的糖苷键进行裂解,这样会造成双糖含量降低。咔唑法的测定原理是通过测定己糖醛酸的含量来推测寡聚透明质酸或低分子透明质酸或直接发酵制得的透明质酸的含量。因此,也可用这两种方法测得的含量的差值来间接地考察透明质酸或其盐的结构是否受到破坏及破坏的程度。
本发明降解透明质酸或其盐所用的透明质酸酶(即芽孢杆菌透明质酸酶,下同)是由芽孢杆菌A50发酵得透明质酸酶发酵液,然后经离心、硫酸铵分级沉淀、超滤等步骤得到的。其制备过程是:取斜面菌种(芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50CGMCC NO.5744)接种于已灭菌的种子培养基中,25-40℃、100-200rpm下培养10-24小时,然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中,接种量为3-15%,25- 40℃、100-300rpm下培养12-24小时,发酵过程中用酸将pH维持在6.0-8.0,发酵结束得透明质酸酶发酵液,发酵液经10000-15000rpm离心10-20min得上清液,将上清液中加入硫酸铵,使其质量体积浓度为20%-25%,过滤除去产生的沉淀,然后继续加入硫酸铵,至其质量体积浓度为35%-40%为止,取得到的沉淀即为透明质酸酶,溶于磷酸盐缓冲液中,最后经3×104Da的超滤膜除去小分子杂质,得酶解用透明质酸酶。
所用的培养基为:
斜面培养基(100mL):蛋白胨0.2-2.0g,酵母粉0.2-2.0g, K2HPO4·3H2O 0.05-0.15g,MgSO4·7H2O 0.05-0.15g,葡萄糖0.5- 1.5g,琼脂粉2.0g,pH调至6.0-8.0,水,斜面培养的温度为25-40℃。
种子培养基(100mL):蛋白胨0.2-2.0g,酵母粉0.2-2.0g, K2HPO4·3H2O 0.05-0.15g,MgSO4·7H2O 0.05-0.15g,葡萄糖0.5- 1.5g,pH调至6.0-8.0。
发酵培养基(100mL):蛋白胨0.2-2.0g,酵母粉0.2-2.0g, K2HPO4·3H2O 0.05-0.15g,MgSO4·7H2O 0.05-0.15g,葡萄糖0.5- 1.5g,吐温800.05mL,pH调至6.0-8.0。
采用中国药典方法(参照中国药典2010版附录ⅦC玻璃酸酶测定法)测定由以上方案制得的发酵液中的透明质酸酶活力在1×105- 3×105IU/mL,纯化后的透明质酸酶比活为8×106-1.5×107IU/mg。
实施例1:芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50的获得和鉴定
1.芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50的获取
将装有富集培养基的平皿打开盖,放置于空气中,收集空气中沉降菌,约1小时后,盖上盖,置于25-40℃培养箱中有氧培养,培养 24小时后,将分离得到的单菌落接种于筛选培养基中,25-40℃, 150rpm,有氧培养12-16小时,采用中国药典方法测定透明质酸酶活力,选择酶活力最高的菌种作为本发明的菌种,菌种酶活力可达 105IU/mL。
上述所采用的各培养基组成如下:
富集培养基(100mL):蛋白胨0.2-2.0g,酵母粉0.2-2.0g, K2HPO4·3H2O 0.05-0.15g,MgSO4·7H2O 0.05-0.15g,透明质酸钠 0.01-1g,琼脂粉2.0g。
筛选培养基(100mL):蛋白胨0.2-2.0g,酵母粉0.2-2.0g, K2HPO4·3H2O 0.05-0.15g,MgSO4·7H2O 0.05-0.15g,透明质酸钠 0.01-1g。
得到芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50于2012年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为 CGMCC NO.5744,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,100101。
2.芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50的形态特征
菌体杆状,单个或链状。菌落乳白色,有皱褶。
3.芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50的分子生物学特征鉴定
按照Weisburg的方法合成细菌16S rDNA通用引物:
引物1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;(SEQ ID NO: 4);
引物2:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO:5)。
以菌株A50的总DNA(使用北京天恩泽柱式细菌基因组DNAout 试剂盒提取)为模板,扩增其16S rDNA片段,PCR扩增反应体系如下:
PCR反应条件如下:
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检验后测序(Weisburg W G,Bams S M,Pelletier DA,et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].Journal ofBacteriology,1991,173(2): 697-703)。得到的16S rDNA(SEQ ID NO:1,1418bp)如下:
实施例2:透明质酸酶的克隆和序列分析
用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提芽孢杆菌(Bacillus)A50的基因组DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA提取结果。然后对基因组进行测序获取该菌株的全基因组鸟枪序列。同时将从芽孢杆菌 (Bacillus)A50的发酵液中分离纯化出来的透明质酸酶,进行N端测序以及胰蛋白酶降解后的内肽段测序,获取该透明质酸酶的部分氨基酸序列。用NCBI上的BLAST工具将上述全基因组鸟枪序列与部分氨基酸序列进行比对,找到与氨基酸序列相似性为100%的基因片段,从而找到透明质酸酶基因所在的大体位置。再根据透明质酸酶的N端序列、SDS-PAGE电泳条带大小,以及利用GeneTool软件分析开放阅读框(ORF),确定出目标基因的具体位置及完整的核苷酸序列,再利用BioEdit软件将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。
透明质酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2,1106aa)如下:
NESTLLLNTSFEETEAPKSGWDQLGAPKWGVWRPTGSPIVTITKEASRTGEYGLKIAAAQSARAAVSQDVPVQGGQTYQLGTWLKTDNIVSGQGARLRVVLYEGTQQLGLLYSSRLTGTHDWSQIKMEVKTPANADSIRVQLFFETGTGTALFDDVSLQLIQPATSIAIEESEITIKEQETGLLHAQMVPADASSKVSWVSADPSIATVDNGKVTGVNPGGTTIMAFTDNGLAATSTVKVIKNDGIERPEVTQLDLQPKELELGSGQVRLLQAIIAPATADAEKLVWSSSNEAVASIQKGLIEAKASGTAVITVETEDGSLKSESQITVTDAVVDEYDQLRKKWKSLMTGLDSYDPTNVRMNEMIQNQTKSAETLWKTMFKNNDRSFLWINFASTDNSADIRDSYRNLTTMAKAFANEHSSLYRNPQLLKDITEALEWLYQNRYNESIAQYSNWWHWEIGVPNELNSLMVLLYDYLDQDSIHRYLKVVDHFQPDPTKSGATTPEKYREALGANRIDVSKVVGVRGVIVKDATKIAAARDALSQTFENVTEGDGFYEDGSFVQHENIAYNGSYGIVLIEGLTDMLELLSNSTWQVTDPKVTNVYDWIETAYEPFMYKGALMDMVRGRAISRNFLQDHQAGHTIIKSVIRMAQFAPEPYAEKYNSMAKYWLQEDTYLDYFKNAGNFRDITLAKQLLEKQEVTPRGDLDFHKTFASMDRVVHRKSGYAFGISMYSNRIQNYEDMNDENRKGWYTGEGMTYLYNGDLAQYSDDFWPTVDPYRMPGTTVDTMRRADGSGEHRSSESWTGGSTLKNFGSAGMSYDAWNSSLIAKKSWFMFDNEIVALGAGITSSEDRNVESIVENRKIRNDGSNQLVINGETLNLSNGGQNQTMAAKWAFLEGNVPGADIGYYFPEGKMLTIKKEERTGAWKDINYGGPAEAIKRSYTTMWFDHGVRPEQDTYSYVLLPGLNKEQTHQYSQNPDITILRNDSAVQAVQDVKENIIGANFWKDEKQSAGPLTVYQKASVTMQEKDGVLEIAVCDPTMENKGSIEIEIDGKAFKVLEADESITVENTKPSIKLKVNVNE AKGKTFTAKLKMIPSQKGNSPNSIR(SEQID NO:2)
透明质酸酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3,3324bp,编码 1106个氨基酸)如下:
AATGAATCTACTTTACTATTGAATACTAGTTTTGAAGAGACGGAGGCGCCAAAATCAGGCTGGGATCAATTAGGTGCACCAAAATGGGGTGTCTGGAGACCTACCGGAAGCCCCATTGTAACCATTACAAAGGAAGCAAGCCGTACGGGTGAGTATGGTTTAAAAATTGCCGCGGCGCAATCTGCTAGAGCTGCCGTGTCACAGGATGTACCTGTTCAGGGCGGGCAGACCTATCAGTTAGGCACCTGGCTGAAGACAGATAATATCGTCAGCGGTCAAGGGGCGCGGCTGAGGGTTGTTTTATATGAAGGAACCCAGCAGCTGGGCTTACTTTACTCTTCAAGATTAACTGGGACCCACGATTGGTCGCAAATAAAAATGGAGGTAAAGACTCCTGCCAATGCCGATAGCATCCGTGTCCAGCTTTTCTTTGAAACAGGAACGGGTACAGCCCTATTTGATGATGTTTCACTGCAGCTCATCCAGCCAGCTACGTCGATTGCTATCGAAGAAAGTGAAATCACCATCAAAGAGCAGGAAACAGGTTTATTGCATGCACAGATGGTTCCTGCTGATGCCAGCTCCAAAGTATCTTGGGTGTCGGCGGATCCATCGATTGCCACCGTTGATAACGGTAAGGTTACGGGTGTAAATCCCGGGGGGACAACGATTATGGCTTTTACCGATAACGGGCTTGCTGCCACTAGTACCGTAAAAGTGATCAAAAATGATGGTATTGAACGGCCGGAGGTAACACAGTTGGATCTACAACCAAAGGAACTCGAGCTTGGATCAGGTCAAGTGCGATTGCTTCAGGCAATTATCGCACCAGCCACTGCCGATGCAGAAAAGTTGGTATGGAGCTCTTCCAATGAAGCAGTCGCTTCTATTCAAAAAGGACTTATTGAAGCGAAAGCCTCAGGAACTGCTGTGATTACCGTAGAAACGGAAGATGGCAGCTTAAAGAGTGAAAGCCAGATTACCGTTACCGATGCAGTCGTAGATGAATATGATCAACTTCGGAAAAAGTGGAAAAGCCTGATGACTGGTCTTGATTCGTACGACCCGACGAATGTGCGGATGAACGAAATGATTCAGAACCAGACAAAATCAGCGGAAACCCTTTGGAAAACAATGTTTAAAAATAACGATCGTTCGTTCTTATGGATTAACTTTGCAAGCACTGACAATTCGGCTGATATTCGCGACAGCTACCGGAATCTAACGACCATGGCTAAAGCGTTTGCCAATGAACACTCCAGCCTTTATCGAAATCCGCAATTGCTAAAGGATATCACGGAGGCGCTAGAGTGGCTGTACCAAAATCGCTATAACGAAAGTATTGCTCAATATAGCAATTGGTGGCATTGGGAAATCGGTGTCCCGAATGAATTAAACAGTTTAATGGTTCTTCTATATGATTATTTGGATCAAGATAGTATTCATCGCTACTTGAAAGTAGTCGACCACTTTCAACCAGATCCAACGAAATCCGGAGCCACCACTCCCGAGAAATACCGGGAAGCTCTTGGCGCCAATCGGATTGATGTCAGCAAGGTAGTCGGTGTGCGAGGGGTAATTGTGAAGGACGCCACGAAAATTGCGGCTGCACGAGATGCCCTAAGCCAAACTTTTGAAAACGTAACTGAAGGAGACGGTTTTTATGAAGATGGCTCCTTCGTTCAGCATGAGAATATCGCCTATAACGGGTCATACGGCATTGTCTTAATTGAAGGCTTGACTGACATGCTCGAACTCTTAAGTAATTCTACTTGGCAAGTGACTGACCCTAAGGTTACCAATGTTTATGACTGGATTGAAACTGCCTATGAACCATTTATGTATAAAGGTGCTTTGATGGATATGGTGAGAGGAAGAGCGATTTCACGTAATTTCCTTCAGGATCATCAGGCTGGACACACCATTATCAAAAGTGTGATTCGAATGGCACAATTTGCTCCAGAGCCATATGCAGAGAAGTATAATTCCATGGCAAAATACTGGCTTCAAGAAGATACTTACCTGGATTATTTTAAAAACGCGGGTAACTTCCGCGATATCACTCTTGCAAAGCAGCTTTTGGAAAAACAAGAGGTCACCCCTCGCGGAGATCTTGATTTTCATAAGACTTTCGCCTCCATGGACCGGGTTGTCCACAGAAAATCGGGCTATGCGTTTGGTATCAGTATGTATTCAAACAGGATTCAAAATTATGAAGACATGAATGATGAAAACCGCAAAGGCTGGTATACCGGAGAAGGGATGACCTACTTATATAATGGTGACCTCGCTCAATATAGTGATGATTTCTGGCCGACAGTGGACCCGTACCGGATGCCAGGGACAACGGTTGATACGATGAGACGAGCGGATGGAAGTGGTGAGCACAGGTCGTCAGAGTCATGGACTGGCGGTTCAACCCTAAAGAATTTTGGTTCTGCAGGAATGTCTTATGATGCTTGGAATAGTTCATTGATTGCCAAAAAGTCATGGTTTATGTTCGATAACGAAATCGTTGCCCTTGGTGCAGGGATTACTAGCAGTGAAGACCGGAATGTTGAGAGTATTGTCGAAAACCGAAAGATTCGAAATGACGGTTCCAATCAATTGGTCATCAATGGTGAAACGCTGAATTTAAGCAATGGTGGTCAAAACCAAACGATGGCCGCTAAATGGGCTTTTCTTGAAGGGAATGTCCCAGGAGCAGATATTGGTTACTATTTCCCAGAAGGTAAAATGCTGACGATTAAAAAAGAAGAACGTACCGGTGCATGGAAAGATATTAATTATGGCGGTCCAGCTGAAGCGATCAAGCGATCCTACACAACGATGTGGTTTGACCATGGTGTCCGTCCTGAGCAGGATACGTACTCCTATGTTCTATTGCCAGGTTTAAATAAGGAACAAACACACCAATATTCTCAAAATCCTGATATTACGATTTTACGAAATGATTCTGCTGTCCAAGCGGTACAAGACGTAAAGGAGAATATCATAGGGGCTAATTTCTGGAAGGATGAAAAGCAAAGTGCTGGTCCGTTAACTGTTTATCAAAAAGCCTCCGTGACCATGCAGGAGAAGGATGGAGTCCTTGAGATTGCTGTATGTGATCCGACGATGGAAAACAAGGGTTCTATCGAAATCGAAATTGATGGCAAGGCGTTCAAGGTTTTAGAAGCCGATGAAAGTATCACGGTAGAAAATACGAAGCCGTCAATCAAGTTGAAGGTCAATGTGAATGAGGCAAAAGGGAAAACGTTCACAGCGAAATTGAAAATGATTCCGAGCCAAAAGGGCAATA GCCCGAACTCAATCAGATAATAA(SEQ ID NO:3)
基于NCBI/BLAST软件的氨基酸序列同源性分析表明:与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相似性最高的蛋白是一种解藻朊类芽孢杆菌(Paenibacillus alginolyticus)的黄原胶裂解酶XalB前体,相似度达46%,相似度在31-46%之间的蛋白大部分是透明质酸裂解酶,还有黄原胶裂解酶、多糖裂解酶-8家族,还有一些假定的或未命名的蛋白质,它们都属于粘多糖(GAG)裂解酶家族。
基于NCBI/BLAST软件的基因序列同源性分析表明:未发现与 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列同源的序列,说明具有SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的透明质酸酶基因是一种新的基因。
实施例3:透明质酸酶的制备(1)
斜面培养基组成(100mL):蛋白胨0.2g,酵母粉2.0g, K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO4·7H2O 0.05g,葡萄糖0.5g,琼脂粉2.0g,用盐酸将pH调至6.0。
种子培养基组成(100mL):蛋白胨0.2g,酵母粉2.0g, K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO4·7H2O 0.05g,葡萄糖0.5g,用盐酸将pH 调至6.0。
发酵培养基组成(100mL):蛋白胨0.2g,酵母粉2.0g, K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO4·7H2O 0.05g,葡萄糖0.5g,Tween80(吐温80)0.05mL。
取斜面菌种(芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50CGMCC NO.5744) 接种于已灭菌的种子培养基中,25℃,150rpm培养24小时,然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中,接种量为10%,25℃,200rpm 培养24小时,发酵过程中用硫酸将pH维持在6.0,发酵生产得到透明质酸酶发酵液,发酵液经10000rpm离心20min得上清液,将上清液中加入硫酸铵,使其浓度为20%,过滤除去产生的沉淀,然后继续加入硫酸铵,至其浓度为35%为止,取得到的沉淀即为透明质酸酶,将得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH6.0,50mmol/L)中,最后经3×104Da的超滤膜除去小分子杂质,得纯化后透明质酸酶。
采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为 1.0×105IU/mL,纯化后的透明质酸酶比活为8.0×106IU/mg。
实施例4:透明质酸酶的制备(2)
斜面培养基组成(100mL):蛋白胨1.0g,酵母粉1.0g, K2HPO4·3H2O 0.1g,MgSO4·7H2O 0.1g,葡萄糖1.0g,琼脂粉2.0g,用磷酸将pH调至7.0。
种子培养基组成(100mL):蛋白胨1.0g,酵母粉1.0g, K2HPO4·3H2O 0.1g,MgSO4·7H2O 0.1g,葡萄糖1.0g,用磷酸将pH 调至7.0。
发酵培养基组成(100mL):蛋白胨1.0g,酵母粉1.0g, K2HPO4·3H2O 0.1g,MgSO4·7H2O 0.1g,葡萄糖1.0g,Tween800.05mL。
取斜面菌种(芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50CGMCC NO.5744) 接种于已灭菌的种子培养基中,30℃,100rpm培养15小时,然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中,接种量为10%,35℃,300rpm 培养16小时,发酵过程中用硫酸将pH维持在7.0,发酵生产得到透明质酸酶发酵液,发酵液经15000rpm离心10min得上清液,将上清液中加入硫酸铵,使其浓度为22%,过滤除去产生的沉淀,然后继续加入硫酸铵,至其浓度为38%为止,取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH6.0,50mmol/L)中,最后经3×104Da的超滤膜除去小分子杂质,得纯化后透明质酸酶。
采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为 3.0×105IU/mL,纯化后的透明质酸酶比活为9.5×106IU/mg。
实施例5:透明质酸酶的制备(3)
斜面培养基组成(100mL):蛋白胨1.5g,酵母粉1.5g, K2HPO4·3H2O 0.15g,MgSO4·7H2O 0.15g,葡萄糖1.5g,琼脂粉2.0g,用硫酸将pH调至8.0。
种子培养基组成(100mL):蛋白胨1.5g,酵母粉1.5g, K2HPO4·3H2O 0.15g,MgSO4·7H2O 0.15g,葡萄糖1.5g,用硫酸将pH 调至8.0。
发酵培养基组成(100mL):蛋白胨0.5g,酵母粉1.5g, K2HPO4·3H2O 0.1g,MgSO4·7H2O 0.05g,葡萄糖1.5g,Tween80 0.05mL。
取斜面菌种(芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50CGMCC NO.5744) 接种于已灭菌的种子培养基中,35℃,200rpm培养13小时,然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中,接种量为10%,40℃,100rpm 培养12小时,发酵过程中用盐酸将pH维持在7.0,发酵生产得到透明质酸酶发酵液,发酵液经12000rpm离心15min得上清液,将上清液中加入硫酸铵,使其浓度为25%,过滤除去产生的沉淀,然后继续加入硫酸铵,至其浓度为35%为止,取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH6.0,50mmol/L)中,最后经3×104Da的超滤膜除去小分子杂质,得纯化后透明质酸酶。
采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为 1.2×105IU/mL,纯化后的透明质酸酶比活为9.0×106IU/mg。
实施例6:透明质酸酶的制备(4)
斜面培养基组成(100mL):蛋白胨2.0g,酵母粉0.5g, K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO4·7H2O 0.05g,葡萄糖1.0g,琼脂粉2.0g,用硫酸将pH调至6.5。
种子培养基组成(100mL):蛋白胨2.0g,酵母粉0.5g, K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO4·7H2O 0.05g,葡萄糖1.0g,用硫酸将pH 调至6.5。
发酵培养基组成(100mL):蛋白胨1.5g,酵母粉0.2g, K2HPO4·3H2O 0.15g,MgSO4·7H2O 0.15g,葡萄糖1.5g,Tween80 0.05mL。
取斜面菌种(芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50CGMCC NO.5744) 接种于已灭菌的种子培养基中,40℃,180rpm培养10小时,然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中,接种量为10%,36℃,280rpm 培养15小时,发酵过程中用磷酸将pH维持在8.0,发酵生产得到透明质酸酶发酵液,发酵液经10000rpm离心20min得上清液,将上清液中加入硫酸铵,使其浓度为20%,过滤除去产生的沉淀,然后继续加入硫酸铵,至其浓度为40%为止,取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH6.0,50mmol/L)中,最后经3×104Da的超滤膜除去小分子杂质,得纯化后透明质酸酶。
采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为 1.5×105IU/mL,纯化后的透明质酸酶比活为8.2×106IU/mg。
实施例7:透明质酸酶的制备(5)
斜面培养基组成(100mL):蛋白胨0.5g,酵母粉1.5g, K2HPO4·3H2O 0.15g,MgSO4·7H2O 0.1g,葡萄糖0.5g,琼脂粉2.0g,用磷酸将pH调至7.5。
种子培养基组成(100mL):蛋白胨0.5g,酵母粉1.5g, K2HPO4·3H2O 0.15g,MgSO4·7H2O 0.1g,葡萄糖0.5g,用磷酸将pH 调至7.5。
发酵培养基组成(100mL):蛋白胨2.0g,酵母粉0.2g, K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO4·7H2O 0.05g,葡萄糖0.5g,Tween80 0.05mL。
取斜面菌种(芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50CGMCC NO.5744) 接种于已灭菌的种子培养基中,36℃,120rpm培养14小时,然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中,接种量为10%,30℃,180rpm 培养20小时,发酵过程中用磷酸将pH维持在7.5,发酵生产得到透明质酸酶发酵液,发酵液经10000rpm离心20min得上清液,将上清液中加入硫酸铵,使其浓度为25%,过滤除去产生的沉淀,然后继续加入硫酸铵,至其浓度为40%为止,取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH6.0,50mmol/L)中,最后经3×104Da的超滤膜除去小分子杂质,得纯化后透明质酸酶。
采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为 2.0×105IU/mL,纯化后的透明质酸酶比活为9.3×106IU/mg。
实施例8:透明质酸酶的制备(6)
斜面培养基组成(100mL):蛋白胨1.0g,酵母粉1.0g, K2HPO4·3H2O 0.1g,MgSO4·7H2O 0.15g,葡萄糖1.5g,琼脂粉2.0g,用盐酸将pH调至7.0。
种子培养基组成(100mL):蛋白胨1.0g,酵母粉1.0g, K2HPO4·3H2O 0.1g,MgSO4·7H2O 0.15g,葡萄糖1.5g,用盐酸将pH 调至7.0。
发酵培养基组成(100mL):蛋白胨1.5g,酵母粉0.5g, K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO4·7H2O 0.15g,葡萄糖1.5g,Tween80 0.05mL。
取斜面菌种(芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50CGMCC NO.5744) 接种于已灭菌的种子培养基中,32℃,150rpm培养18小时,然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中,接种量为10%,28℃,200rpm 培养22小时,发酵过程中用盐酸将pH维持在8.0,发酵生产得到透明质酸酶发酵液,发酵液经15000离心10min得上清液,将上清液中加入硫酸铵,使其浓度为24%,过滤除去产生的沉淀,然后继续加入硫酸铵,至其浓度为36%为止,取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH6.0,50mmol/L)中,最后经3×104Da的超滤膜除去小分子杂质,得纯化后透明质酸酶。
采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为 1.8×105IU/mL,纯化后的透明质酸酶比活为8.4×106IU/mg。
实施例9:透明质酸酶的制备(7)
斜面培养基组成(100mL):蛋白胨2.0g,酵母粉1.5g, K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO4·7H2O 0.15g,葡萄糖0.5g,琼脂粉2.0g,用磷酸将pH调至7.0。
种子培养基组成(100mL):蛋白胨2.0g,酵母粉1.5g, K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO4·7H2O 0.15g,葡萄糖0.5g,用磷酸将pH 调至7.0。
发酵培养基组成(100mL):蛋白胨0.5g,酵母粉1.5g, K2HPO4·3H2O 0.15g,MgSO4·7H2O 0.1g,葡萄糖1.0g,Tween80 0.05mL。
取斜面菌种(芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50CGMCC NO.5744) 接种于已灭菌的种子培养基中,30℃,200rpm培养20小时,然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中,接种量为10%,34℃,220rpm 培养14小时,发酵过程中用磷酸将pH维持在7.5,发酵生产得到透明质酸酶发酵液,发酵液经12000rpm离心15min得上清液,将上清液中加入硫酸铵,使其浓度为25%,过滤除去产生的沉淀,然后继续加入硫酸铵,至其浓度为38%为止,取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH6.0,50mmol/L)中,最后经3×104Da的超滤膜除去小分子杂质,得纯化后透明质酸酶。
采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为 1.2×105IU/mL,纯化后的透明质酸酶比活为8.1×106IU/mg。
实施例10:透明质酸酶的制备(8)
将芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50的发酵液(例如可以使用实施例3 -9中任一实施例中制备的发酵液)在4℃下离心除去菌体,收集上清液。向上清液中缓慢加入硫酸铵固体粉末,使其质量体积浓度达到 20%,过滤除掉沉淀,继续向滤液中缓慢加入硫酸铵固体粉末,至其质量体积浓度达到40%,过滤收集沉淀。将沉淀溶解于50mM、pH4.5 的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中,得到粗酶液。将上述粗酶液装入截留分子量为3.0×103Da的透析袋中,放入pH4.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中,4℃,透析过夜。将透析袋内的溶液进行离子交换色谱分离,色谱柱填料是DEAE琼脂糖凝胶FF介质,用0-0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱,收集洗脱峰。将最终收集下来的洗脱液跑SDS-PAGE电泳,检测分离纯化效果。电泳结果如图1中的1泳道所示:透明质酸酶纯度为97.6%。同时将最终收集下来的目标蛋白酶洗脱液进行冷冻真空干燥,得到白色粉末,即为透明质酸酶。得到的透明质酸酶比活为 1.3×107IU/mg。
实施例11:透明质酸酶的制备(9)
将芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50的发酵液(例如可以使用实施例3 -9中任一实施例中制备的发酵液)在4℃下离心除去菌体,收集上清液。向上清液中缓慢加入硫酸铵固体粉末,使其质量体积浓度达到 25%,过滤除掉沉淀,继续向滤液中缓慢加入硫酸铵固体粉末,至其质量体积浓度达到40%,过滤收集沉淀。将沉淀溶解于50mM、pH6.5 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中,得到粗酶液。将上述粗酶液装入截留分子量为1.0×104Da的透析袋中,放入50mM,pH6.5的 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中,4℃,透析过夜。将透析袋内的溶液进行离子交换色谱分离,色谱柱填料是DEAE琼脂糖凝胶FF介质,用0-0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱,收集洗脱峰。将最终收集下来的洗脱液跑SDS-PAGE电泳,检测分离纯化效果。电泳结果如图1中的2泳道所示:透明质酸酶纯度为98.1。同时将最终收集下来的目标蛋白酶洗脱液进行冷冻真空干燥,得到白色粉末,即为透明质酸酶。得到的透明质酸酶比活为1.4×107IU/mg。
实施例12:透明质酸酶的制备(10)
将芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50的发酵液(例如可以使用实施例3 -9中任一实施例中制备的发酵液)在4℃下离心除去菌体,收集上清液。向上清液中缓慢加入硫酸铵固体粉末,使其质量体积浓度达到 20%,过滤除掉沉淀,继续向滤液中缓慢加入硫酸铵固体粉末,至其质量体积浓度达到40%,过滤收集沉淀。将沉淀溶解于50mM、pH8.0 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中,得到粗酶液。将上述粗酶液装入截留分子量为1.4×104Da的透析袋中,放入50mM,pH8.0的 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中,4℃,透析过夜。将透析袋内的溶液进行离子交换色谱分离,色谱柱填料是DEAE琼脂糖凝胶FF介质,用0-0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱,收集洗脱峰。将最终收集下来的洗脱液跑SDS-PAGE电泳,检测分离纯化效果。电泳结果如图1中的泳道3所示:透明质酸酶纯度为97.5%。同时将最终收集下来的目标蛋白酶洗脱液进行冷冻真空干燥,得到白色粉末,即为透明质酸酶。得到的透明质酸酶比活为1.5×107IU/mg。
本发明透明质酸酶酶活性高,热稳定性和pH稳定性好,能够满足工业化大批量降解透明质酸所需的酶用量,且酶的制备过程简单、条件温和,成本低,解决了化学降解污染环境、生物降解酶来源有限、活性低、价格高的缺陷。
下面列举以本发明比酶活在8×106-1.5×107IU/mg之间的透明质酸酶酶切法制备寡聚透明质酸盐或低分子透明质酸盐的实施例。
实施例13:寡聚透明质酸钠的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为2×104Da的透明质酸钠300kg,待完全溶解后,用冰乙酸调节pH为4.0,并升温至20℃,加入1.35×1010IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例3制备),酶解至分子量小于104Da时(中间不断取样采用GPC-MALLS法监测),将温度升高至50℃,维持60min,加入1kg NaCl,用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤酶解液,然后用20m3的乙醇沉淀,得到透明质酸钠沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒,HPLC法测得含量为96.8%;咔唑法测得含量为97.5%;分子量8.6kDa,pH6.8。其红外图谱见图2C,与欧洲药典标准图谱图2A一致(欧洲药典标准图谱的样品是未经降解的)。
实施例14:寡聚透明质酸钾的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为3×106Da的透明质酸钾10kg,待完全溶解后,用氢氧化钠调节pH为9.0,并升温至48℃,加入4×108IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例4制备),酶解至分子量小于104Da时,将温度升高至90℃,维持10min,加入100kg KCl,用0.45μm的聚砜滤膜过滤酶解液,然后用5m3的丙酮沉淀,得到透明质酸钾沉淀,该沉淀用丙酮脱水,然后真空干燥即得寡聚透明质酸钾。该寡聚透明质酸钾为白色粉末, HPLC法测得含量为98.8%;咔唑法测得含量为98.3%;分子量3.2kDa,pH6.5,其红外图谱图2D与欧洲药典标准图谱一致。
实施例15:寡聚透明质酸钠的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为1.6×106Da的透明质酸钠30kg,待完全溶解后,用氢氧化钾调节pH为8.0,并升温至40℃,加入1.2×109IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例5制备),酶解至分子量小于104Da时,将温度升高至60℃,维持60min,加入50kg NaCl,用0.45μm的尼龙滤膜过滤酶解液,然后用10m3的丙醇沉淀,得到透明质酸钠沉淀,该沉淀用丙醇脱水,然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色粉末,HPLC法测得含量为97.6%;咔唑法测得含量为97.8%;分子量6.2kDa,pH7.1,其红外图谱图2E与欧洲药典标准图谱一致。
实施例16:寡聚透明质酸钙的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为8×105Da的透明质酸钙60kg,待完全溶解后,用冰乙酸调节pH为7.0,并升温至35℃,加入2.4×109IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例6制备),酶解至分子量小于104Da时,将温度升高至70℃,维持30min,加入35kg CaCl2,用0.45μm的聚醚砜滤膜过滤酶解液,然后用3m3的异丙醇沉淀,得到透明质酸钙沉淀,该沉淀用异丙醇脱水,然后真空干燥即得寡聚透明质酸钙。该寡聚透明质酸钙为白色粉末,HPLC法测得含量为96.6%;咔唑法测得含量为97.3%;分子量5.6kDa,pH6.5,其红外图谱图2F与欧洲药典标准图谱一致。
实施例17:寡聚透明质酸钠的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为2×105Da的透明质酸钠200kg,待完全溶解后,用硫酸调节pH为6.0,并升温至25℃,加入8×109IU的芽孢杆菌透明质酸酶 (实施例7制备),酶解至分子量小于104Da时,将温度升高至80℃,维持20min,加入60kg NaCl,用0.45μm的聚醚砜滤膜过滤酶解液,然后用6m3的甲醇沉淀,得到透明质酸钠沉淀,该沉淀用甲醇脱水,然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒, HPLC法测得含量为98.7%;咔唑法测得含量为98.3%;分子量7.6kDa,pH7.3,其红外图谱图2G与欧洲药典标准图谱一致。
实施例18:寡聚透明质酸锌的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为105Da的透明质酸100kg,待完全溶解后,用氢氧化钠调节pH为5.0,并升温至20℃,加入4×109IU的芽孢杆菌透明质酸酶 (实施例8制备),酶解至分子量小于104Da时,将温度升高至55℃,维持40min,加入20kg ZnCl2,用0.45μm的硝化纤维素滤膜过滤酶解液,然后用4.5m3的乙醇沉淀,得到透明质酸锌沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得寡聚透明质酸锌。该寡聚透明质酸锌为白色颗粒,HPLC法测得含量为96.8%;咔唑法测得含量为97.6%;分子量9.1kDa,pH6.8,其红外图谱图2H与欧洲药典标准图谱一致。
实施例19:低分子透明质酸钠的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为3×106Da的透明质酸钠1kg,待完全溶解后,调节温度为48℃,用氢氧化钠调节pH为9.0,边搅拌边加入107IU芽孢杆菌透明质酸酶(实施例9制备)进行酶解。酶解至所需分子量,将温度升高至50℃,维持60min。加入2kg NaCl,完全溶解后经0.45μm的聚丙烯滤芯过滤,然后用1m3的丙酮沉淀,得到低分子HA沉淀,该沉淀用丙酮脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。该低分子透明质酸钠为白色粉末,HPLC法测得含量为98.3%;咔唑法测得含量为98.5%;经测定分子量为931kDa。
实施例20:低分子透明质酸钾的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为1×106Da的透明质酸钾20kg,待完全溶解后,调节温度为20℃,用冰乙酸调节pH为4.0,边搅拌边加入108IU芽孢杆菌透明质酸酶(实施例7制备)进行酶解。酶解至所需分子量,将温度升高至90℃,维持10min。加入100kg KCl,溶解后经0.45μm的硝化纤维素滤芯过滤,然后用10m3的乙醇沉淀,得到低分子HA沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钾。该低分子透明质酸钾为白色颗粒,HPLC法测得含量为96.8%;咔唑法测得含量为97.5%;分子量15kDa。
实施例21:低分子透明质酸锌的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为1.61×106Da的透明质酸钠12kg,待完全溶解后,调节温度为45℃,用冰乙酸调节pH为5.0,边搅拌边加入2×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例8制备)进行酶解。酶解至所需分子量,将温度升高至80℃,维持20min。加入40kg ZnCl2,溶解后0.45μm的聚醚砜滤芯过滤,然后用3m3的甲醇沉淀,得到低分子HA沉淀,该沉淀用甲醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸锌。该低分子透明质酸锌为白色颗粒,HPLC法测得含量为98.5%;咔唑法测得含量为98.2%;分子量754kDa。
实施例22:低分子透明质酸钾的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为1.77×106Da的透明质酸钾10kg,待完全溶解后,调节温度为38℃,用稀磷酸调节pH为6.0,边搅拌边加入5×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例9制备)进行酶解。酶解至所需分子量,将温度升高至60℃,维持30min。加入30kg K2SO4,溶解后经0.45μm 的聚醚砜滤芯过滤,然后用5m3的异丙醇沉淀,得到低分子HA沉淀,该沉淀用异丙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钾。该低分子透明质酸钾为白色颗粒,HPLC法测得含量为96.3%;咔唑法测得含量为97.3%;分子量421kDa。
实施例23:低分子透明质酸镁的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为2.25×106Da的透明质酸镁8kg,待完全溶解后,调节温度为42℃,用稀硫酸调节pH为5.5,边搅拌边加入3×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例6制备)进行酶解。酶解至所需分子量,将温度升高至55℃,维持50min加入60kg MgCl2,溶解后经0.45μm的聚丙烯滤芯过滤,然后用2.4m3的丙醇沉淀,得到低分子HA沉淀,该沉淀用丙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸镁。该低分子透明质酸镁为白色粉末,HPLC法测得含量为97.2%;咔唑法测得含量为98.1%;分子量538kDa。
实施例24:低分子透明质酸钙的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为2.46×106Da的透明质酸钙5kg,待完全溶解后,调节温度为40℃,用冰乙酸调节pH为7.0,边搅拌边向加入5×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例5制备)进行酶解。酶解至所需分子量,将温度升高至65℃,维持40min。加入50kg CaCl2,溶解后经0.45μm 的聚丙烯滤芯过滤,然后用4.5m3的丙酮沉淀,得到低分子HA沉淀,该沉淀用丙酮脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钙。该低分子透明质酸钙为白色颗粒,HPLC法测得含量为98.1%;咔唑法测得含量为98.2%;分子量205kDa。
实施例25:低分子透明质酸钠的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为2.78×106Da的透明质酸钠2kg,待完全溶解后,调节温度为35℃,用冰乙酸调节pH为6.5,边搅拌边向加入2×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例4制备)进行酶解。酶解至所需分子量,将温度升高至58℃,维持50min。加入70kg Na2SO4,溶解后经0.45μm 的硝化纤维素滤芯过滤,然后用4.8m3的乙醇沉淀,得到低分子HA 沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。该低分子透明质酸钠为白色粉末,HPLC法测得含量为98.6%;咔唑法测得含量为98.3%;分子量332kDa。
实施例26:低分子透明质酸钠的制备
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为1.41×106Da的透明质酸钠15kg,待完全溶解后,调节温度为43℃,用氢氧化钠调节pH为8.0,边搅拌边向加入4×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶(实施例3制备)进行酶解。酶解至所需分子量,将温度升高至65℃,维持40min。加入80kg NaCl,溶解后经0.45μm 的聚砜滤芯过滤,然后用8m3的乙醇沉淀,得到低分子HA沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。该低分子透明质酸钠为白色颗粒,HPLC法测得含量为98.2%;咔唑法测得含量为99.1%;分子量38kDa。
实施例27:透明质酸酶应用于低分子硫酸软骨素的制备
向1m3不锈钢溶解罐中配制1m3pH6.0的磷酸盐缓冲液,边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为5×104Da的硫酸软骨素50kg,待完全溶解后,并升温至37℃,加入9×108IU的芽孢杆菌透明质酸酶(例如可以使用实施例3-9中任一实施例中制备的透明质酸酶),酶解至分子量5000Da时,将温度升高至50℃,维持60min,用0.45μm的滤芯过滤酶解液,然后用20m3的乙醇沉淀,得到低分子硫酸软骨素沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子硫酸软骨素成品。该硫酸软骨素为白色颗粒,含量95.8%,分子量5.1kDa,pH6.8。
比较例1:化学降解法制备寡聚透明质酸钠(1)
向1L烧杯中加入1L纯化水,边搅拌边向烧杯中加入分子量为 8×105Da的透明质酸钠50g,待完全溶解后,加浓盐酸10mL,降解至分子量小于104Da时,用氢氧化钠调节pH至6.2,用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤降解液,然后用10L的乙醇沉淀,得到透明质酸钠沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为微黄色粉末,HPLC法测得含量为63.8%;咔唑法测得含量为98.9%;分子量8.1kDa,pH4.8。其红外图谱见图2B,其与与欧洲药典标准图谱有差异。
比较例2:化学降解法制备寡聚透明质酸钠(2)
向1L烧杯中加入1L纯化水,边搅拌边向烧杯中加入分子量为 5×105Da的透明质酸钠100g,待完全溶解后,加浓盐酸10mL,降解至分子量小于104Da时,用氢氧化钠调节pH至6.5,用0.45μm的聚砜滤膜过滤降解液,然后用10L的乙醇沉淀,得到透明质酸钠沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为微黄色粉末,HPLC法测得含量为60.2%;咔唑法测得含量为99.2%;分子量7.6kDa,pH4.2。
比较例3:化学降解法制备低分子透明质酸钠(1)
向1L烧杯中加入1L纯化水,边搅拌边向烧杯中加入分子量为 1×106Da的透明质酸钠10g,待完全溶解后,加氢氧化钠5g,升温至 65℃,降解所需分子量时,用冰乙酸调节pH至6.5,用0.45μm的聚砜滤膜过滤降解液,然后用5L的乙醇沉淀,得到低分子透明质酸钠沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。该低分子透明质酸钠为微黄色粉末,HPLC法测得含量为68.2%;咔唑法测得含量为97.5%;分子量15kDa,pH6.9。
比较例4:化学降解法制备低分子透明质酸钠(2)
向1L烧杯中加入1L纯化水,边搅拌边向烧杯中加入分子量为 1.41×106Da的透明质酸钠15g,待完全溶解后,加氢氧化钠6g,升温至65℃,降解所需分子量时,用浓盐酸调节pH至6.2,用0.45μm的聚砜滤膜过滤降解液,然后用4L的乙醇沉淀,得到低分子透明质酸钠沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。该低分子透明质酸钠为微黄色粉末,HPLC法测得含量为70.5%;咔唑法测得含量为96.8%;分子量39.2kDa,pH6.4。
比较例5:化学降解法制备低分子透明质酸钠(3)
向1L烧杯中加入1L纯化水,边搅拌边向烧杯中加入分子量为 1.61×106Da的透明质酸钠8g,待完全溶解后,加氢氧化钠6g,升温至 60℃,降解所需分子量时,用冰乙酸调节pH至6.8,用0.45μm的聚砜滤膜过滤降解液,然后用4L的乙醇沉淀,得到低分子透明质酸钠沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。该低分子透明质酸钠为微黄色粉末,HPLC法测得含量为73.2%;咔唑法测得含量为98.5%;分子量330kDa,pH6.2。
比较例6:化学降解法制备低分子透明质酸钠(4)
向1L烧杯中加入1L纯化水,边搅拌边向烧杯中加入分子量为 2.25×106Da的透明质酸钠5g,待完全溶解后,加氢氧化钠5g,升温至 60℃,降解所需分子量时,用冰乙酸调节pH至6.6,用0.45μm的聚砜滤膜过滤降解液,然后用2L的乙醇沉淀,得到低分子透明质酸钠沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。该低分子透明质酸钠为微黄色粉末,HPLC法测得含量为89.9%;咔唑法测得含量为96.8%;分子量530kDa,pH7.5。
比较例7:化学降解法制备低分子透明质酸钠(5)
向1L烧杯中加入1L纯化水,边搅拌边向烧杯中加入分子量为 2.46×106Da的透明质酸钠4g,待完全溶解后,加氢氧化钠4g,升温至 60℃,降解所需分子量时,用浓盐酸调节pH至6.2,用0.45μm的聚砜滤膜过滤降解液,然后用3L的乙醇沉淀,得到低分子透明质酸钠沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子透明质酸钠。该低分子透明质酸钠为白色粉末,HPLC法测得含量为95.8%;咔唑法测得含量为98.5%;分子量770kDa,pH7.6。
实验例1:酶解法(酶切法)与化学降解法制备的寡聚透明质酸盐的结构比较
寡聚透明质酸或低分子透明质酸与普通透明质酸都是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的,因此它们的含量等于双糖的含量,可以用芽孢杆菌透明质酸酶将寡聚透明质酸或低分子透明质酸或者普通透明质酸降解成双糖,通过HPLC法测定双糖含量,得到寡聚透明质酸盐或低分子透明质酸盐的含量;同时用咔唑法测定寡聚透明质酸盐或低分子透明质酸盐的含量。如果透明质酸或其盐的结构受到破坏,则透明质酸酶不会对破坏部分的糖苷键进行裂解,这样会造成双糖含量降低,HPLC法与咔唑法的测定值差别越大,说明寡聚透明质酸盐或低分子量透明质酸盐的结构破坏越大。
具体方法可以参照公开号为CN102323344A的中国专利申请,其全部内容在此通过引用并入本发明。
例如HPLC法可以采用下面的步骤:
a.标准对照品溶液:称取一定量的标准对照品(Hyaluronic acid disaccharideΔDiHA sodium salt,H9649,Sigma)用磷酸盐缓冲液 (pH6.0,5mmol/L)溶解配制成1mg/mL的溶液,得到标准对照品溶液;
b.样品预处理:称取一定量的待测样品(比较例1-7、实施例13-26 制备),用磷酸盐缓冲液(pH6.0,5mmol/L)溶解配制成1mg/mL的溶液。取1mL样品溶液加入1000IU的透明质酸酶(可以为实施例10-12 制备),42℃水浴2h;酶解结束后,将酶解液煮沸2min使酶失活,得到样品酶解液。
将样品酶解液转移至20mL容量瓶中,加入流动相稀释至刻度,混匀,过滤即得供试液。
c.标准对照品溶液处理:取1mL标准对照品溶液采用流动相稀释 20倍,过滤待用。
d.色谱条件:采用糖分析柱进行高效液相色谱测定;流动相为 0.4mol/L NaH2PO4溶液;流速为0.6ml/min;柱温为35℃;检测波长为232nm;进样量为20μL;
e.结果计算:
采用高效液相色谱分别对标准对照品和待测样品进行色谱分离,按外标法以峰面积计算,按以下公式计算透明质酸盐含量:
Ax:待测样品的透明质酸双糖峰面积;
AR:标准对照品的透明质酸双糖峰面积;
Wx:待测样品称样量,mg;
CR:标准对照品溶液浓度,mg/mL;
h(%)为待测样品干燥失重。
将比较例1-2及实施例13-18中得到的寡聚透明质酸盐的含量进行比较,见表1。
表1:寡聚透明质酸盐的含量
从表1可以看出,HPLC法和咔唑法测得的化学降解法制备的寡聚透明质酸盐含量差别较大,HPLC法和咔唑法测得的酶切法制备的寡聚透明质酸盐含量差别不大,均小于1%。说明酶切法制备的寡聚透明质酸盐结构完整,而化学降解法制备的寡聚透明质酸盐结构破坏较大。
同时红外图谱表明,酶切法制备的寡聚透明质酸盐与欧洲药典标准图谱一致,而化学降解法制备的寡聚透明质酸盐在波数1610cm-1附近与欧洲药典标准图谱差别较大,表明化学降解法制备的寡聚透明质酸盐结构被破坏,而酶切法制备的寡聚透明质酸盐结构完整。
实验例2:酶解法(酶切法)与化学降解法制备的低分子透明质酸盐的结构比较
将比较例3-7及实施例19-26中得到的低分子透明质酸盐的含量进行比较,见表2-3。
具体步骤参照实验例1。
表2:低分子透明质酸盐的含量(比较例3-7)
比较例 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
分子量(KDa) |
15 |
39.2 |
330 |
530 |
770 |
含量(HPLC法,%) |
68.2 |
70.5 |
73.2 |
89.9 |
95.8 |
含量(咔唑法法,%) |
97.5 |
96.8 |
98.5 |
96.8 |
98.5 |
差值(%) |
29.3 |
26.3 |
25.3 |
6.9 |
2.7 |
表3:低分子透明质酸盐的含量(实施例19-26)
从表2、3可以看出,化学降解法制备的低分子透明质酸盐当分子量小于77万时,随着分子量的降低,两种含量测定值差别越大;而酶解法制备的低分子透明质酸盐随分子量的变化,这两种方法测的含量差值均很小,均小于1%,这个现象说明酶解法产生的低分子透明质酸结构是完整的,而化学降解法制备的低分子透明质酸盐当分子量小于77万时,分子量越低,结构破坏越大。
动物酶降解得到的寡聚透明质酸盐,具有促血管生成、促进创伤愈合、抗肿瘤及免疫调节等生物活性。微生物来源透明质酸酶降解得到的寡聚透明质酸盐的生物学活性尚未见报道。但以下的实验研究表明该发明中得到的寡聚透明质酸盐无细胞毒性,与化学降解法得到的寡聚透明质酸盐相比,具有清除自由基作用强,还原能力强,因此可用于化妆品中;该寡聚透明质酸盐分子量小,易于被肠道吸收,可用于食品中;同时该寡聚透明质酸盐具有促血管生成、促进创伤愈合的作用,因此可用于医药领域。
微生物来源透明质酸酶降解得到的低分子透明质酸盐的生物学活性也尚未见报道。但上面的实施例19-26表明,酶切法制备的低分子透明质酸盐结构完整,同时以下的实验研究表明该发明中得到的低分子透明质酸盐,具有清除自由基作用强,还原能力强,也具有防晒及晒后修复作用,因此可用于化妆品及药品中;同时该低分子透明质酸盐可用于食品中,保持皮肤的润滑、有弹性。
实验例3:温度对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶的热稳定性实验
用pH6.0的磷酸盐缓冲液配制终浓度为2mg/mL的HA溶液,取 9.9mL作为底物溶液,并加入100μL适当稀释(只要232nm处的吸收值在0.3-0.7之间即可)的透明质酸酶液(例如可以使用实施例3-12 中任一实施例中制备的透明质酸酶),不同温度下水浴反应30min后,煮沸2min,以提前灭活的酶液稀释液作为对照,待冷却至室温时测定 232nm处的吸收值(该数值的大小代表透明质酸酶活性的高低),结果如图3A所示,最适反应温度为42℃。
将透明质酸酶的酶液分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下恒温保存不同时间测残余酶活,结果如图3B所示:40℃、45℃两个温度下酶活非常稳定,6h内几乎没有降低,表明该透明质酸酶在45℃以下活性非常稳定,满足室温下工业生产的需要。
实验例4:pH对透明质酸酶活性的影响以及透明质酸酶的pH稳定性实验
分别配制pH1.0-pH12.0的缓冲液,并用这些缓冲液配制相应pH 下2mg/mL的透明质酸溶液,分别取不同pH的9.9mL HA溶液作为底物溶液,并加入100μL适当稀释(只要232nm处的吸收值在0.3- 0.7之间即可)的透明质酸酶液(例如可以使用实施例3-12中任一实施例中制备的透明质酸酶),水浴反应30min后,煮沸2min,以提前灭活的酶液稀释液作为对照,待冷却至室温时测定232nm处的吸收值,结果如图4A所示:该酶的最适pH为6.5,在pH≤4.0或pH≥9.0 时该酶无活性。
将透明质酸酶(例如可以使用实施例3-12中任一实施例中制备的透明质酸酶)用不同pH的缓冲液适当稀释,并在室温下放置不同时间测定残余酶活,结果如图4B所示:该酶在pH5.0-6.0之间酶活较稳定,6h内基本没有降低。
可见,本发明的透明质酸酶不仅酶活性高,而且热稳定性和pH 稳定性好,能够满足工业化大批量降解透明质酸所需的酶用量,且酶的制备过程简单、条件温和,成本低,解决了化学降解污染环境、生物降解酶来源有限、活性低、价格高的缺陷。
实验例5:酶的底物特异性实验
用pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液分别配制终浓度为10mg/mL的硫酸软骨素、海藻酸钠、肝素钠、壳聚糖、几丁质和羟甲基纤维素钠溶液,各取9.9mL作为底物溶液,并加入100μL稀释适当倍数(只要232nm 处的吸收值在0.3-0.7之间即可)的透明质酸酶液(例如可以使用实施例3-12中任一实施例中制备的透明质酸酶),42℃水浴反应30min 后,煮沸2min,以提前灭活的酶液稀释液作为对照,待冷却至室温时测定232nm处的吸收值。结果如表4所示。
表4:透明质酸酶的底物特异性
底物 |
A232 |
硫酸软骨素 |
1.0813 |
海藻酸钠 |
0 |
肝素钠 |
0 |
壳聚糖 |
0 |
几丁质 |
0 |
羟甲基纤维素钠 |
0 |
结果显示,透明质酸酶不仅可以催化裂解透明质酸,也能作用于硫酸软骨素,但是不能降解海藻酸钠、肝素钠、壳聚糖、几丁质和羟甲基纤维素钠。
实验例6:化学降解法和酶切法制得的寡聚透明质酸盐的细胞毒性比较研究
试验采用L929小鼠成纤维细胞(购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)作为观察细胞,RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清作为完全培养基,阴性对照为不添加任何供试样品的完全培养基,阳性对照为5g/L苯酚溶液(溶于完全培养基),空白对照为无细胞完全培养基,供试品为完全培养基加寡聚透明质酸钠样品。培养72h后,按下式计算相对增殖率(RGR)。
式中:
RGR——相对增殖率,%;
A——供试品组(阴性、阳性组)吸光度,扣除空白;
A0——阴性对照组吸光度,扣除空白。
细胞毒性根据RGR按表5分级标准确定级别。阳性对照组至少为 3级反应,供试品细胞毒性反应程度不大于2级时,认为其细胞毒性可接受。
表5:细胞毒性反应分级(根据美国药典)
级别 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
RGR(%) |
≥100 |
80-99 |
50-79 |
30-49 |
0-29 |
表6:寡聚透明质酸钠的细胞毒性实验结果
结果表明,化学降解法制备的寡聚透明质酸钠浓度不大于1.0%时,是无细胞毒性的;酶切法制备的寡聚透明质酸钠浓度不大于3.0%时,是无细胞毒性的。与化学法降解的寡聚透明质酸钠相比,同样浓度下酶切法制备的寡聚透明质酸钠对促进细胞增殖有显著性影响(p ﹤0.05)。
实验例7:酶切法制得的寡聚透明质酸盐和低分子透明质酸盐的透皮吸收、抗氧化
活性以及还原能力研究
1.酶切法制备的寡聚透明质酸盐的透皮吸收研究
将无毛小鼠的皮肤材料固定于透皮吸收仪的扩散池,向扩散池的供给体一侧加入0.5%的寡聚透明质酸盐(分别为实施例13-18制备) 溶液,每三小时取样一次,检测接受液中的寡聚透明质酸盐含量。结果如图5A所示。从图中可以看出,寡聚透明质酸盐可以进入皮肤内部被吸收。
2.寡聚透明质酸盐和低分子透明质酸盐的抗氧化活性研究
分别对酶切法和化学降解法制备的寡聚透明质酸盐和低分子透明质酸盐清除DPPH自由基能力和还原能力进行了初步研究。
所用试剂:
不同分子量的透明质酸盐:
酶切寡聚透明质酸盐:实施例13-18制备;
化学法制备的寡聚透明质酸盐:按照比较例1-2制备;
酶切低分子透明质酸盐:实施例19-26制备;
化学法制备的低分子透明质酸盐:比较例3-7制备;
高分子透明质酸钠(分子量161万,HA-1610k):华熙福瑞达生物医药有限公司生产。
1)自由基清除能力研究
清除DPPH自由基能力的测定原理是:二苯基苦味肼自由基 (DPPH)是一种稳定的以氮为中心的自由基,DPPH的甲醇或乙醇溶液呈紫色,在510-530nm波长处有最大吸收,其浓度与吸光度呈线性关系。在有自由基清除剂存在时,自由基清除剂提供1个电子与 DPPH的孤对电子配对使其褪色,褪色程度与接收的电子呈定量关系,表现为溶液颜色变浅,吸光度减小(Alisi,C.S.等.Free radical scavenging and in-vitro antioxidant effectsof ethanol extract of the medicinal herb Chromolaena odorata Linn.BritishJournal of Pharmaceutical Research,2011,1(4),141-155.)。自由基清除剂的能力越强,吸光度越小。分别精密量取0.1mM DPPH(2-甲基-2,3-二氢 -5,6-二苯基吡嗪)乙醇溶液5.0mL和不同浓度样品溶液5.0mL置具塞试管中,混匀。以等体积的水与95%乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟,于523nm处分别测定溶液吸光度值。
寡聚透明质酸盐的实验结果如图5B,从图中可以看出,与化学降解法制备的寡聚透明质酸钠(比较例1或比较例2制备)相比,同样浓度下酶切法制备的寡聚透明质酸钠(实施例13-18制备)具有更强的DPPH自由基清除能力,p﹤0.05。
低分子透明质酸盐的实验结果如图5C,从图中可以看出,不论是化学降解法制备的低分子透明质酸盐还是酶切法制备的低分子透明质酸盐,随着分子量的降低,自由基清除能力提高。但是,分子量相近的低分子透明质酸盐,酶切法制备的低分子透明质酸盐的自由基清除能力大于化学降解法制备的低分子透明质酸盐。分子量大于100万的透明质酸盐几乎无自由基清除能力。
2)还原能力测定
还原能力测定原理:铁氰化钾在pH6.6的弱酸性环境下,被还原性物质还原生成黄血盐K4Fe(CN)6,其再与FeCl3提供的三价铁离子作用生成普鲁士蓝(Fe4[K4Fe(CN)6]3),其在700nm处有特定吸收,以测定普鲁士蓝的生成量为指标,吸光度值越大,其还原能力越强。以透明质酸盐水溶液为原料,测定其在此体系中生成普鲁士蓝的量,以此来判定还原能力大小(Oyaizu,M.Antioxidant activity of browing products of glucosaminefractionated by organic solvent and thin-layer chromatography.JapaneseJournal of Nutrition,1986,44, 307-315)。
分别精密量取不同浓度寡聚透明质酸盐(实施例13-18制备)和低分子透明质酸盐(实施例19-26制备)溶液2.5mL和磷酸盐溶液 2.5mL置具塞试管中,加入2.5mL 1.0%铁氰化钾溶液,混匀,50℃水浴20分钟。水浴后迅速冷却,加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液,3000rpm,离心10分钟。取上清液8mL加5mL水与1mL 0.1%三氯化铁溶液,以等体积的水代替三氯化铁溶液为空白对照。室温放置10 分钟,于700nm处测定溶液吸光度值。
寡聚透明质酸盐的还原能力结果如图5D,从图中可以看出,与化学降解法制备的寡聚透明质酸盐(比较例1或比较例2制备)相比,同样浓度下酶切法制备的寡聚透明质酸盐具有更强的还原能力,p﹤ 0.05。
低分子透明质酸盐的还原能力结果如图5E,从图中可以看出,不论是化学降解法制备的低分子透明质酸盐还是酶切法制备的低分子透明质酸盐,随着分子量的降低,还原能力提高。但是,分子量相近的低分子透明质酸盐,酶切法制备的低分子透明质酸盐的还原能力大于化学降解法制备的低分子透明质酸盐。分子量大于100万的透明质酸盐几乎无还原能力。
从上面的实验结果可以看出,酶切法制备的寡聚透明质酸盐(例如寡聚透明质酸钠)和低分子透明质酸盐(例如低分子透明质酸钠) 比化学法降解得到的寡聚透明质酸盐(例如寡聚透明质酸钠)和低分子透明质酸盐(例如低分子透明质酸钠)具有更强的DPPH自由基清除能力和还原能力,因此可以有效清除人体内的自由基,减少黑色素的形成,故可用在化妆品中,有防晒、晒后修复、美白、抗衰老的功效;还可用在保健食品及食品中,可清除体内自由基,有抗衰老作用;也可用在药品中,抵抗自由基对人体的侵害。
实验例6:酶切法制备的透明质酸盐在保健食品中的功效研究
1.酶切寡聚透明质酸盐在保健食品中的功效研究
以一种以寡聚透明质酸盐为主要功效成分的保健型口服液为例,寡聚透明质酸盐添加量为0.05-2%。口服液配方:添加0.5%寡聚透明质酸盐(实施例13-18中任一实施例制备),再添加25%食用糖或蜂蜜,用纯水溶解。溶解完全后采用超滤设备除菌,灌入10mL口服液瓶(经高温或紫外线臭氧消毒后)中,扎盖密封,以上操作均在净化车间。然后经产品质量检验后即得寡聚透明质酸盐口服液。受试者年龄为30-65岁,分为6组,每组30人,每人每天服用10-20mL 寡聚透明质酸盐口服液,连续服用一个月,使用效果如表7。另有对照组30人,每天服用只含有食用糖或蜂蜜的溶液。
表7:寡聚透明质盐口服液服用效果
从表7可以看出,寡聚透明质酸钠作为保健品可直接食用,极易吸收,具有增强免疫力,延缓衰老,恢复皮肤光泽弹性等多种功能。本发明的寡聚透明质酸盐分子量小,能够被人体肠道吸收,增加机体内组织中的透明质酸含量,补充皮肤随年龄的增高所致的透明质酸减少,并且口服吸收的小分子透明质酸在体内可生成高分子透明质酸,使皮肤细嫩光滑,关节灵活,防止皱纹产生,可用于食品领域。
2.酶切法制备的低分子透明质酸盐在保健食品中的功效研究
以一种主要功效成分为低分子透明质酸盐的保健型口服液为例,其中低分子透明质酸盐添加量为0.05%-2%。口服液配方:1.0%低分子透明质酸盐(可以是实施例19-26中任一实施例制备),25%食用糖或蜂蜜。配制方法:在洁净车间内配制,室温下取纯水搅拌,按照比例加入低分子透明质酸盐,再加入食用糖或蜂蜜搅拌至完全溶解,补纯水至100%。湿热灭菌后,灌入10mL口服液瓶(经高温或紫外线臭氧消毒后)中,扎盖密封,以上操作均在洁净车间。然后经产品质量检验后即得低分子透明质酸盐口服液。受试者年龄为22-55岁,分为8组,每组32人,每人每天服用20mL低分子透明质酸盐口服液,连续服用一个月。另有对照组30人,每天服用只含有食用糖或蜂蜜的溶液。
服用前后,由专人使用皮肤水分测定仪对受试者皮肤水分含量和水分流失量进行测定,前后测定时测定部位和室内温度湿度保持一致。人体皮肤水分测试结果如表8所示。
表8:皮肤水分含量测定结果
从表8可知,受试组连续服用低分子透明质酸盐口服液1个月后,皮肤水分含量比服用前明显提高,水分流失量情况也明显改善。观察可知,受试组人员的皮肤光泽度、紧致性、弹性均较对照组要好。因此,口服低分子透明质酸盐易于吸收,保水补水效果好,而且能够活化皮肤细胞,具有抗衰老的功效。
因此,口服寡聚透明质酸盐及低分子透明质酸盐后,均可使受试者皮肤光泽度、弹性等得到改善,可用于保健食品及普通食品中。
实验例7:酶切法制备的寡聚透明质酸盐促血管生成作用研究
以人脐静脉内皮细胞(HUVEC,山东省医学科学院提供)培养实验和鸡胚绒毛尿囊(CAM)模型实验(种蛋购自山东省农业科学院家禽研究所)来研究酶切法制备的寡聚透明质酸盐(实施例13-18 中任一实施例制备)是否能够促进血管生成。HUVEC增殖效果和 CAM血管生成结果见表9。实验步骤可以参考,例如王彦厚,王凤山,郭学平.低相对分子量质量透明质酸的制备及其促血管生成作用.中国生化药物杂志,2007,28(2):107-109。
表9:寡聚透明质酸钠促血管生成结果
由实验结果可知,寡聚透明质酸钠具有明显的促血管生成活性,在体内能促进CAM的血管生成,在体外能促进HUVEC细胞增殖,可用于创伤愈合等医药领域。
实验例8:透明质酸盐的防晒及晒后修复作用研究
日光中的紫外线(主要为UVA和UVB)是导致皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素。皮肤主体的三大细胞:角质形成细胞、成纤维细胞及黑素细胞均对紫外线敏感。UVA损伤主要是引起皮肤成纤维细胞DNA的氧化性损伤,可导致DNA突变及皮肤癌的发生。本实验以一定剂量的UVA照射小鼠成纤维细胞L929(购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库),然后以透明质酸盐处理细胞,研究透明质酸盐的降解方法及不同分子量透明质酸盐对L929细胞UVA辐照后的影响;以透明质酸盐作用于小鼠成纤维细胞株L929,然后以一定剂量的UVA照射细胞,研究透明质酸盐的降解方法及不同分子量透明质酸盐对L929细胞UVA辐照的防护作用。
所用试剂和细胞株:
纤维细胞株L929:购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;
不同分子量的透明质酸盐:
酶切寡聚透明质酸钠:实施例13-18制备;
化学法制备的寡聚透明质酸钠:按照比较例1-2制备;
酶切低分子透明质酸钠:实施例19-26制备;
化学法制备的低分子透明质酸盐:比较例3-7制备;
高分子透明质酸钠(分子量161万,HA-1610k):华熙福瑞达生物医药有限公司生产。
1.透明质酸盐的紫外修复作用研究
探讨不同制备方法以及不同分子量的透明质酸盐对L929小鼠成纤维细胞经UVA照射后的修复作用。
取处于对数生长期的L929细胞,胰酶消化后,调细胞密度 2×104/mL,接种于96孔细胞培养板,每孔100μL细胞悬液,置二氧化碳培养箱37℃、5%CO2常规培养过夜。96孔板中弃去培养液,每孔加入100μL PBS。除阴性对照组不进行照射外,其余试验组采用7.2J/cm2UVA照射L929细胞。照射后弃去PBS,按下面操作处理细胞:
未照射组(阴性对照组):加入100μL完全培养基;
照射组(阳性对照组):加入100μL完全培养基;
照射+透明质酸盐:加入含0.0625%透明质酸盐的100μL完全培养基;
继续培养24h后,每孔加入20μL MTT,放入细胞培养箱中继续孵育4h。弃去培养液,每孔加入150μL DMSO,避光震荡10min,于570nm 波长处用酶标仪测定光吸收值。按照以下公式计算细胞相对增殖率 (RGR):
式中Ac表示实验组的吸收值,Ac,0表示阴性对照组的吸收值。
结果如图6A、图6B所示,不同方法制备的寡聚透明质酸盐及不同分子量的透明质酸盐都具有UVA辐照后修复细胞损伤的作用,但是酶切法制备的寡聚透明质酸盐的晒后修复作用最好,化学法制备的寡聚透明质酸盐的效果次之,并且随着透明质酸盐分子量的降低,其修复效果越好。酶切法制备的寡聚透明质酸盐及低分子透明质酸盐的晒后修复效果要好于高分子量透明质酸盐。
2.透明质酸盐的防紫外作用研究
探讨不同制备方法制备的寡聚透明质酸盐及不同分子量的透明质酸盐对L929小鼠成纤维细胞对UVA照射的防护作用。
本实验以不同分子量透明质酸盐作用于小鼠成纤维细胞株L929,然后以一定剂量的UVA照射细胞,研究不同分子量透明质酸盐和不同制备方法制备的寡聚透明质酸盐对L929细胞UVA辐照的防护作用。
取处于对数生长期的细胞,胰酶消化后,调细胞密度2×104/mL,接种于96孔细胞培养板,每孔100μL细胞悬液,置二氧化碳培养箱37℃、 5%CO2常规培养过夜。过夜后弃去培养液,按下面分组处理细胞,放入细胞培养箱中孵育12h。
未照射组(阴性对照组):加入100μL完全培养基;
照射组(阳性对照组):加入100μL完全培养基;
照射+透明质酸盐:加入含0.0625%透明质酸盐的100μL完全培养基;
96孔板中弃去培养液,每孔加入100μL PBS。除无照射组外,其余试验组采用7.2J/cm2UVA照射L929细胞。照射后弃去PBS,每孔加入 20μL MTT,放入细胞培养箱中继续孵育4h。弃去培养液,每孔加入 150μL DMSO,避光震荡10min,于570nm波长处用酶标仪测定光吸收值。按照以下公式计算细胞相对增殖率(RGR):
式中Ac表示实验组的吸收值,Ac,0表示阴性对照组的吸收值。
结果如图6C、图6D所示,不同制备方法制备的寡聚透质酸盐及不同分子量的透明质酸盐都具有防UVA辐照的作用。酶切法制备的寡聚透明质酸盐对UVA辐照的预防效果最好,其次是酶切低分子透明质酸盐,化学法制备的寡聚透明质酸盐及高分子量透明质酸盐的预防效果最差。
综上所述,酶切法制备的寡聚透明质酸盐及低分子透明质酸盐都具有紫外修复及防紫外作用,其中酶切法制备的寡聚透明质酸盐的紫外修复及防紫外效果最好;低分子透明质酸盐的防紫外效果较好,紫外修复效果不如化学法制备的寡聚透明质酸盐,但均高于高分子量透明质酸盐。因此酶切法制备的寡聚透明质酸盐及低分子透明质酸盐可用于防晒及晒后修复的化妆品中。
综上可见,根据本发明所述的制备方法得到的寡聚透明质酸盐及低分子透明质酸盐,外用时可渗入皮肤表皮层,供给皮肤营养和水分,防止皮肤老化,还能防止紫外线的伤害,修复晒伤的皮肤细胞,可用于化妆品中;口服时易于吸收,不仅可以活化皮肤细胞,保持表皮湿润,同时具有良好的增强免疫功能和抗衰老功能,可用于食品和保健品中;另外,还具有促血管生成、细胞免疫活化和促进骨生成的作用,对治疗细菌性角膜溃疡具也有良好的疗效,可用于医药领域。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。