KR20030097456A - 오레오바시디움 속 신균주 ｂｒｄ-109(기탁번호:ｋｃｔｃ10182ｂｐ) 및 본 균주가 생산하는 베타-글루칸 생산방법 - Google Patents

오레오바시디움 속 신균주 ｂｒｄ-109(기탁번호:ｋｃｔｃ10182ｂｐ) 및 본 균주가 생산하는 베타-글루칸 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-글루칸을 생산하는 신균주 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) BRD-109(기탁번호:KCTC 10182BP) 및 본 균주가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법에 관한 것으로,
열 및 pH에 안정한 베타-글루칸을 생산하는 새로운 균주 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109)(기탁번호:KCTC 10182BP)이 제공된다.
또한, 본 발명의 균주를 배양하여 그 배양액과 균체로부터 분자량 100,000~5,000,000달톤의 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명에 의해 생산되는 베타-글루칸은 세포외로 분비되는 형태의 베타-글루칸으로서 물에 대한 용해성이 우수하고 정제하기에 편리하여 대량생산이 용이하며, 따라서 의약품, 화장품, 건강보조식품 및 사료첨가제 등을 포함하는 다양한 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

오레오바시디움 속 신균주 ＢＲＤ-109(기탁번호:ＫＣＴＣ 10182ＢＰ) 및 본 균주가 생산하는 베타-글루칸 생산방법{NOVEL STRAIN AUREOBASIDIUM SP. BRD-109(KCTC10182BP) AND METHOD FOR PREPARING BETA-GLUCAN THEREOF}
본 발명은 베타-글루칸을 생산하는 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) 신균주 BRD-109(기탁번호:KCTC 10182BP)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 열 및 pH에 안정한 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 오레오바시디움 속 신균주 BRD-109 및 본 균주가 생산하는 베타-글루칸 생산방법에 관한 것이다.
미생물이 생산하는 고분자물질은 이제까지 다양한 구조와 성질을 갖는 것이 밝혀져 왔고, 그 중에는 식물성 고분자에서 볼 수 없는 독특한 성질의 생리활성과 비교할 만한 물성적 특성을 갖는 것들이 있다. 따라서 미생물유래 고분자는 식물성 고분자를 대체할 수 있을 것으로 기대되며 그 개발연구가 활발하게 진행되어지고 있다. 이들 중에서도 버섯류를 포함하는 다양한 곰팡이류가 생산하는 베타-(1,3)(1,6)-글루칸{β-(1,3)(1,6)-glucan, 통칭하여 베타-글루칸이라고함}은 면역증강을 통한 다양한 암에 대한 항암활성 (Wagner 등, 1988), 항세균성 및 항바이러스 활성 (Bohn & BeMiller, 1995)이 우수하다. 또한, 상처 치료효과와 피부재생 효과가 (Jamas 등, 1991)가 탁월해 항염증 및 피부의 노화방지 효과가 확인되었으며, 이밖에, 혈압강하작용 (Chang & Miles, 1991), 혈당강하작용 (Chang & Miles, 1987) 등의 다양한 약리학적 효능이 여러 학회에 발표되어 의약품 산업 및 건강보조식품, 화장품 산업 등에의 응용이 기대되고 있다. 또한, 이들 베타-글루칸들은 점성, 젤형성능, 열안정성, pH안정성 및 유화활성 (Hamada, 1987)등이 뛰어나 식품, 화장품 및 다양한 공업 용도로서 주목받고 있다.
미생물이 생산하는 베타-글루칸은 의약용 및 식품용으로 이용가능한 고부가가치의 미생물소재이며, 미생물이 생산하는 다당류는 근본적으로 무독성ㆍ생분해성의 환경친화형 생물소재로서 전세계적으로 광범위하게 이용되고 있는 화학합성 고분자물질의 대체품으로 개발가능한 엄청난 잠재력을 가지고 있으며, 생분해성 고분자화합물의 유럽시장규모는 100조원 정도이다. 또한, 베타-글루칸은 면역증강효과를 통한 항암활성이 우수하며, 점성, 유화도, 보습능 등의 물성적 활성이 탁월하여 의약품, 식품, 화장품 등의 산업과 비료, 제지, 섬유 등의 공업분야에서도 이용성이 높은 무독성ㆍ생분해성의 생체 고분자물질로써 버섯으로부터 정제된 베타-글루칸은 20억원/kg (Sigma, USA)정도의 고가로 판매되고 있다.
국내ㆍ외에서도 베타-글루칸에 대한 연구가 점차 활성화되고 있으나, 주로 버섯이나 곰팡이 세포벽으로부터의 추출에 의존하고 있고, 그 생산수율이 매우 낮고 불순물의 함유로 순수 분리정제의 문제점으로 인하여 건강보조식품의 첨가제 수준으로 이용되고 있어, 고부가가치화 및 산업화에 괄목할만한 성과가 얻어지고 있지 않다.
따라서 베타-글루칸의 생산수율이 우수하고 정제하기에 간편한 세포외 분비형 (exo-type)의 베타-글루칸을 생성하는 균주를 순수분리하는 것이 필요하다.
이에 본 발명의 목적은 열 및 pH에 안정하며, 생산수율이 우수하고, 정제하기에 간편한 세포외 분비형의 베타-글루칸을 생산하는 새로운 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주로 부터 면역활성증강, 보습능, 피부자극완화능 및 세포재생효과가 우수한 세포외 분비형 베타-글루칸을 효과적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 얻어진 세포외 분비형 베타-글루칸을 포함하는 면역증강 조성물, 화장품 조성물, 건강보조식품 및 사료첨가제를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 오레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) 신균주 BRD-109(기탁번호:KCTC 10182BP)의 현미경 사진(×1200)을 나타내며,
도 2는 본 발명의 균주의 콩고레드결합에세이 결과를 나타내는 그래프이며,
도 3은 본 발명의 균주에서 생산된 BRD-글루칸을 라민나린나제로 가수분해하여 얻은 구성성분에 대한 TLC 분석 결과이며,
도 4는 본 발명의 균주에서 생산된 BRD-글루칸의13C-NMR 분석 결과이며,
도 5는 본 발명의 균주의 BRD-글루칸 생산에 대한 배양시간을 나타내는 그래프이며, 그리고
도 6은 본 발명의 균주의 분자량 측정 결과이며,
도 7은 본 발명의 균주에서 생산된 베타-글루칸(BRD-글루칸)이 마크로파지 니트라이트(Nitrite(NO))생산에 미치는 영향을 나타내는 그래프이며,
도 8은 본 발명의 균주에서 생산된 베타-글루칸(BRD-글루칸)이 LAK 세포의 활성능에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 일견지에 의하면, 열 및 pH에 안정한 베타-글루칸을 생산하는 새로운 균주 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109)(기탁번호:KCTC 10182BP)이 제공된다.
본 발명의 제 2 견지에 의하면, 상기 균주를 배양하여 그 배양액과 균체로부터 분자량 100,000달톤에서 5,000,000달톤까지의 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 3 견지에 의하면, 상기 방법으로 얻어진, 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109) 균주 (기탁번호:KCTC 10182BP)가 생산하는 베타-글루칸을 함유하여 마크로파지 및 LAK 세포를 활성화시키는 면역활성증강 효과를 나타냄을 특징으로 하는 면역증강 조성물이 제공된다.
본 발명의 제 4 견지에 의하면, 상기 방법으로 얻어진, 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109) 균주 (기탁번호:KCTC 10182BP)가 생산하는 베타-글루칸을 함유하여 보습능 및 피부세포 재생효과를 나타냄을 특징으로 하는 화장품 조성물이 제공된다.
본 발명의 제 5 견지에 의하면, 상기 방법으로 얻어진, 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109) 균주 (기탁번호:KCTC 10182BP)가 생산하는 베타-글루칸을 포함함을 특징으로 하는 건강보조식품이 제공된다.
본 발명의 제 6 견지에 의하면, 상기 방법으로 얻어진, 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109) 균주 (기탁번호:KCTC 10182BP)가 생산하는 베타-글루칸을 포함함을 특징으로 하는 사료첨가제가 제공된다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 베타-글루칸의 생산수율이 우수하고 정제하기에 간편한 세포외 분비형 (exo-type)의 베타-글루칸을 생성하는 균주를 순수분리하였고, 균주의 형태학적, 생리학적 및 배양학적 특성을 조사하여 본 균주를 동정하였다. 또한, 생산수율을 극대화하기 위하여 대량배양 조건을 확립과 간편한 분리ㆍ정제방법을 확립하였다. 본 발명의 균주 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidiumsp. BRD-109)으로부터 생산되는 베타-글루칸(BRD-glucan, 이하 통칭하여 'BRD-글루칸'이라 한다)은 면역활성증강, 보습능, 피부자극완화능, 세포재생효과 등이 우수하여 이를 면역증강 조성물, 화장품 조성물, 건강보조식품 또는 사료첨가제등에 매우 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명자들은 상기의 조건들을 만족시키는 균주를 탐색하기 위하여 토양으로부터 균주의 분리를 실시하여, 베타-글루칸의 생산수율이 우수하고 정제하기에 간편한 세포외 분비형 (exo-type)의 베타-글루칸을 생성하는 균주를 분리하고, 균주의 형태적, 생리학적 및 배양학적 특성을 조사하여 이 균주가 오레오바시디움 속 (Aureobasidiumsp.) 균주임을 확인하였으며, 본 발명에 따라 분리된 신균주를 오레오바시디움 속. BRD-109 (Aureobasidiumsp. BRD-109)로 명명하고 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 2002년 2월 25일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC 10182BP).
이러한 본 발명의 균주는 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 분자량 100,000달톤에서 5,000,000달톤까지의 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하며, 그 배양 조건은 서당 1.0~5.0중량%, 질산나트륨 0.01~0.05중량%, 제이인산칼륨 0.1~1.0중량%, 염화칼륨 0.05~0.50중량%, 황산마그네슘 0.02~0.2중량%, 황산제일철 0.001~0.01중량%로 구성된 액체배지에서 잘 자라는 것으로 확인되었다.
본 발명의 균주 배양은 일예로, 상기 액체 배지를 발효조에 넣고 121℃이상에서 30~60분간 가압 습윤 살균한 다음, 살균된 상기 액체 배지를 30℃로 냉각하고 상기 균주를 접종한 후, 30℃의 배양온도, 0.5~1.0 VVM의 에어공급 및 150~300 RPM 교반속도의 배양조건하의 발효조에서 배양된다.
상기 균주의 배양후, 그 배양물로부터 베타-글루칸의 정제는 일반적인 원심분리법 및 동결건조를 통하여 수행될 수 있다. 예를들어, 상기 베타-글루칸의 정제는 상기 균주의 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후, 균체가 제거된 상등액에서 분자량이 100,000 달톤에서 5,000,000달톤까지의 베타-글루칸을 회수한 다음 동결건조함으로써 분말상태의 베타-글루칸을 획득할 수 있다.
이러한 본 발명의 균주 오레오바시디움 속. BRD-109 (Aureobasidiumsp. BRD-109)으로부터 생산된 베타-글루칸을 본 발명자들은 BRD-109 글루칸이라 명명하였다.
상기 방법으로 얻어진 BRD-109 글루칸은 면역증강 조성물, 화장품 조성물, 건강보조식품 및 사료첨가제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 BRD-109 글루칸이 면역증강 조성물로 사용되는 경우, 마크로파지 및 LAK 세포를 활성화시키는 작용을 함으로써 면역증강 효과를 나타낼 수 있다. 이와 같은 면역증강 조성물에 첨가되어 사용되는 경우, 상기 BRD-109 글루칸은 다량 함유될수록 효과가 우수하며, 최소 10㎍/㎖의 양으로 함유되는 것이 바람직하다. 만일, 본 발명의 BRD-109 글루칸의 함량이 10㎍/㎖미만으로 함유되는 경우 면역증강 효과를 기대하기 어렵다. 보다 바람직하게, 상기 BRD-109 글루칸은 10~1,000㎍/㎖의 양으로 면역증강 조성물에 함유된다.
상기 BRD-109 글루칸은 우수한 보습능 및 피부세포 재생효과를 나타냄으로써 화장품 조성물에 사용될 수 있으며, 이러한 화장품 조성물에 첨가되어 사용되는 경우 상기 BRD-109 글루칸은 다량 첨가될 수록 좋으며, 바람직하게, 조성물의 총 중량에 대하여 최소 0.1중량%로 포함된다. 만일, 본 발명의 BRD-109 글루칸의 함량이 0.1중량%이하로 너무 적게 포함되는 경우에는 피부에 대한 보습능 및 세포재생효과가 발휘되지않을 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 BRD-109 글루칸은 0.1~2중량%의 양으로 화장품 조성물에 함유된다.
또한, 상기 BRD-109 글루칸이 건강보조식품 또는 사료첨가제에 사용되는 경우에 상기한 바와같은 면역활성증강 효과를 나타내어 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 그 첨가량은 대상에 따라 달라질 수 있으며 이에 한정하지 않는다. 상기 BRD-109 글루칸이 건강보조식품에 포함되어 사용되는 경우, 총 중량에 대하여 0.01~2중량%로 첨가되며, 사료첨가제에 포함되어 사용되는 경우에는 총 중량에 대하여 0.001~2중량%로 첨가되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다.
<실시예 1> BRD-109 글루칸 생산균주의 분리 및 보존
본 발명자들은 대전, 평택, 안성, 화성, 이천 일대의 토양시료를 채취하여 멸균된 생리 식염수에 넣고 진탕한 후 시료액의 상등액을 취하여 희석하고, 그 희석액을 서당 1.0∼5.0 중량%, 질산나트륨 0.01∼0.05 중량%, 제이인산칼륨 0.1∼1.0 중량%, 염화칼륨 0.05∼0.50 중량%, 황산마그네슘 0.02∼0.2 중량%, 황산제일철 0.001∼0.01 중량%(pH 7.0)로 구성된 아가배지상에서 24∼72시간 배양하여 점액성 물질을 생산하는 단일 콜로니 (single colony)의 분리미생물 약 60 여종을 얻었다. 순수분리된 미생물들을 상기의 액체배지에서 30℃에서 48∼72시간 배양한 후 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 제거하였다. 균체를 제거한 상등액에 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 폴리머를 침전시켰으며, 침전된 폴리머가 베타-글루칸인지의 여부는 콩고레드 다이 결합 분석법 (congo-red binding assay)을 이용하여 확인하였으며, 베타-글루칸의 생산량이 최대인 종을 선별하여 BRD-109로 명명하였다.
<실시예 2> 분리균주의 동정
분리균주를 동정하기위해 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 분석한 결과를 도 1과 표 1에 나타내었다. 분리균주는 무기염고체배지(Czapec-dox 배지)에서 분홍색을 띠며, 현미경관찰에서 효모처럼 버딩(buding)을 하고 6.7∼7.9 ×8.3∼11.7 ㎛ 정도의 크기를 가지며 25~40℃까지의 온도범위에서 생육가능하였다.
생리학적 특성으로는 D-글루코오스(D-glucose), D-갈락토오스 (D-Galactose), D-글루코사민 (D-glucosamine), DL-락테이트 (DL-lactate), D-리보스 (D-ribose), 인눌린 (inlunin), 갈락티톨(galactitol), 싸이트레이트 (citrate)에서 성장하며 삼투압에 대한 내성을 갖는다.
이러한 특징은 표 1에서 비교한 바와 같이 오레오바시디움 플루란스 (Aureobasidium pullulans)의 형태학적, 생리학적 및 배양학적 특성과 매우 유사하였다. 이에 본 발명자들은 이 균주를 오레오바시디움 속. BRD-109 (Aureobasidiumsp. BRD-109)로 명명하고 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 2002년 2월 25일자로기탁하였다(기탁번호:KCTC 10182BP).
<실시예 3> 베타-글루칸의 확인
본 발명에서 분리한 오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 점액성 다당류가 베타-글루칸인지의 여부를 확인하기 위하여, 알파-글루칸에는 결합하지 않고 베타-글루칸에만 특이적으로 결합하여 발색반응을 일으키는 콩고레드 다이 (congo-red dye)를 이용하였다. 오레오바시디움 속 BRD-109를 실시예 1의 배양액에서 30℃에서 72시간 배양한 후 12,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 균체를 제거하였다. 균체를 제거한 상등액의 3 배에 달하는 에틸알콜을 첨가하여 생물고분자인 다당류를 침전시킨 후 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 고분자인 다당류를 회수하였다. 회수된 다당류를 적당량의 증류수에 녹인 다음, 0.02 중량%의 콩고레드 다이를 첨가하여 30분간 반응 시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정함으로서 확인하였다. 도 2에 본 발명에서 분리한 균주의 콩고레드결합에세이 결과를 그래프로 나타내었다.
또한, TLC와 NMR로서 BRD-글루칸이 베타-글루칸임을 증명하는 실험결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 균체를 제거하고 증류수에 녹인 세포외 고분자인 다당류를 라미나린나제 (laminarinase, 0.25U/reaction, endo-β-1,3-glucanase)로 50mM 소디움 아세테이트 완충용액 (50mM sodium acetate-acetate buffer, pH5.0)이용하여 37℃에서 24시간 처리한 뒤, 분해산물을 TLC로 분석하였다. 그 결과, TLC상에 글루코스 (glucose)와 젠티오바이오즈(gentiobiose, β-1,6-glucose dimer)의 점(spot)이 보였고,13C-NMR 분석으로 104 ppm지역의 peak은 β-configuration의 C-1을, 88 ppm은 O-치환된 C-3을, 72 ppm은 O-치환된 C-6을 나타내었다. 이들의 결과로 볼 때, 오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 세포외 다당류는 베타-(1,3)(1,6)-글루칸임을 확인할 수 있었다.
오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109)의 생리·생화학적 및 배양학적 특성
특성 오레오바시디움 속. BRD-109 오레오바시디움 풀루란스 특성 오레오바시디움속. BRD-109 오레오바시디움 풀루란스
D-글루코스 + + DL-락테이트 W W
D-갈락토스 + + 숙시네이트 + +
L-소르보스 W W 시트레이트 + +
D-글루코사민 W W 메탄올 - -
D-리보스 + + 에탄올 + +
D-자일로스 + + 니트레이트 + +
L-아라비노스 + + 니트리트 + +
D-아라비노스 W W 에틸아민 + +
L-람노스 + + L-리신 + +
수크로스 + + 캐다베린 + +
말토스 + + 크레아틴 - -
α,α 트레할로스 + + 크레아티닌 - -
메틸-α-글루코시드 + + 2% MgCl2 + +
셀로비오스 + + 5% MgCl2 + +
살리신 + + 10% MgCl2 + +
아르부틴 + + 2% NaCl + +
멜리비오스 + + 5% NaCl + +
락토스 W + 10% NaCl + +
라피노스 + + 0.01% 시클로헥스이미드 - -
멜레지토스 + + 0.05% 시클로헥스이미드 - -
이눌린 W W 미코셀 - -
가용성 전분 + + 산 생성 W W
글리세롤 + + 우레아제 시험 + +
메조-에리트리톨 + + 전분 생성(루골) - -
리비톨 W W 전분 생성(마이저) - -
자일리톨 + + 발효 - -
L-아라비니톨 + + DBB - -
D-글루시톨 + + 젤라틴 W W
D-만니톨 + + 30℃ + +
갈락티톨 + + 50℃ + +
미오-이노시톨 + + 아밀라아제 + +
글루코노 δ-락톤 W W 셀룰라아제 - -
D-글루코네이트 + + 포스포리파아제 + +
D-글루쿠로네이트 + + 키티나아제 - -
D-갈락투로네이트 DNAse + +
+;양성, -;음성, W(weak); 약한 반응성
<실시예 4> 베타-글루칸의 배양 및 분리ㆍ정제
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸을 500L 발효조에서 배양하여 배양조건을 확립하였다(도 5 참조). 배양기간중 pH를 4로 조정하였고, 1차 공급을 배양시간 70시간에 시도하여 베타-글루칸의 최대생산량을 약 20g/L로 향상시켰다.
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸(BRD-글루칸)을 정제하기 위하여 30℃에서 170시간 배양한 후 증류수로 적당량 희석한 다음 12,000 rpm에서 30 분간 원심분리함으로서 세포외 수용성 BRD-글루칸을 균체로부터 제거하였다. 균체를 제거한 희석된 배양여액을 서서히 교반하면서 배양여액의 3 배에 달하는 95% 에틸알콜을 첨가하여 30 분간 교반한 후 2 시간동안 정치시켜 베타-글루칸을 침전시켰다. 침전 후 12,000rpm에서 10 분간 원심분리하여 알콜을 포함한 상등액을 제거하고 베타-글루칸을 회수하였다. 회수된 베타-글루칸은 다시 적당량의 증류수에 녹인 다음 동결건조하여 흰색 분말인 베타-글루칸을 제조하였다.
<실시예 5> 베타-글루칸의 분자량
증류수에 녹인 20 ㎕의 정제된 베타-글루칸을 PL-GFC 1000Å 컬럼 (8μ, 7.5 x 300 mm)에 주입하여 상온에서 분당 1 ml의 속도로 용출시키면서 RI 검출기가 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분자량을 알고 있는 표준물질인 덱스트란과 본 발명의 오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸의 분자량을 HPLC를 이용하여 비교분석한 결과 분자량은 약 430 만 달톤 정도인 것으로 밝혀졌다 (도 6 참조).
<실시예 6> 베타-글루칸의 물성적 실험
BRD-글루칸의 물성학적 특성을 조사하기 위해 여러조건에서 겉보기 점도를 측정하였다. 점도측정은 Brookfield rheometer DV-Ⅲ (Brookfield engineering Lab. INC USA)를 사용하여 이루어졌다.
＜실시예 6-1 농도별 점도 측정＞
정제된 BRD-글루칸을 증류수에 1, 2, 3, 4, 5%로 되도록 녹인 다음, 스핀들(spindle) SC4-34를 장착하여 0.5rpm에서 150rpm까지 점도를 측정하였다(표2 참조). 각 농도별에 대한 30rpm에서 측정된 겉보기 점도는 각각 25, 75, 125, 200, 280 cP로 측정되어 BRD-글루칸의 농도증가와 겉보기 점도의 증가는 비례적이었다.
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)의 농도별 점도 (Brookfield model DVⅢ-rheometer, SC4-34, 30rpm, RT)
농도 (%) 1 2 3 4 5
겉보기점도 (cP) 25 75 125 200 285
＜실시예 6-2 온도별 점도 측정＞
정제된 BRD-글루칸의 온도별 점도를 조사하기 위하여 BRD-글루칸의 농도를 2%가 되도록 15㎖의 증류수에 녹여 실온(25℃)에서 85℃까지의 온도범위에서 30분간 열처리한 다음, 각각의 그 온도에서 스핀들 SC4-34로 겉보기 점도를측정하였다(표 3 참조). BRD-글루칸은 50℃까지 겉보기 점도의 감수율이 약 15%였고, 85℃까지의 감수율이 약 30%였다. BRD-글루칸은 온도영향에 따라서 겉보기 점도가 감소하였다. 이는 일반적인 다당류에 나타나는 온도별에 대한 물성적 성질과 유사한 결과이다.
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)의 온도별 점 도 (Brookfield model DVⅢ-rheometer, SC4-34, 30rpm, RT)
온도 (℃) 실온(25) 30 50 70 85
겉보기점도 (cP) 75 62 60 48 50
＜실시예 6-3 pH별 점도 및 안정성 측정＞
pH별 점도측정은 BRD-글루칸의 농도를 2%로 하고 1N NaOH와 1N HCl용액으로 pH를 2에서 11까지 조절하면서 겉보기 점도를 측정하였다. pH에 대한 BRD-글루칸의 안정성 측정은 pH를 2-11까지 조절한 다음, 24시간후에 다시 점도를 측정하여 pH에 대한 안정성을 조사하였다(표 4 참조).
BRD-글루칸은 전 pH범위에서 겉보기 점도의 변화가 거의 없었으며, 안정성 실험에서도 같은 결과를 나타내었다. 이런 결과는 다른 다당류가 갖지 못하는 상당히 특징적인 물성적 성질이며, 응용용도에서 여러가지 제제화에 용이하게 이용될 수 있는 특징이다.
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)의 pH별 점도 및 안정성 측정 (Brookfield model DVⅢ-rheometer, SC4-34, 30rpm, RT)
pH별 2 3 5 7 9 11
0시간 24시간 0시간 24시간 0시간 24시간 0시간 24시간 0시간 24시간 0시간 24시간
겉보기점도(cP) 65 66 73 72 71 71 70 71 75 74 70 71
＜실시예 6-4 온도별 안정성 측정＞
온도별 점도측정은 BRD-글루칸의 농도를 2%로 하고 온도범위 25℃(실온)에서 85℃까지 하여 1시간 동안 열처리한 다음, 실온으로 냉각된 후에 점도를 측정하였다. 121℃의 열처리는 가압멸균기을 이용하여 15분간 처리한 다음, 실온으로 냉각된 후에 점도를 측정하였다(표 5 참조).
BRD-글루칸은 전 온도범위에서 상당히 안정하며, 특히 가압멸균기로 열처리하여도 겉보기 점도가 안정한 결과를 보였다. 이런 결과는 BRD-글루칸만이 가지는 독특한 물성적 특징이며, pH에 대한 안정성의 결과 마찬가지로 여러 가지 제제화에 상당히 용이함을 더욱 부각시키는 결과이다.
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)의 온도별 안정성 측정 (Brookfield model DVⅢ-rheometer, SC4-34, 30rpm, RT)
온도 (℃) 실온(25) 30 50 70 85 121
겉보기점도(cP) 75 68 69 75 70 67
＜실시예 7> 베타-글루칸(BRD-글루칸)의 마크로파지 활성능 및 LAK 세포의 활성능
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)을 면역조절물질로 사용하기에 적합한지 평가하기 위하여 시험관내(in vitro)에서 마크로파지의 활성 및 LAK 세포의 활성능을 조사하여, 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다. 마크로파지에 대한 활성을 측정하기 위하여 RAW 264.7 마크로파지 세포에 베타-글루칸(BRD-글루칸)을 10∼300㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 도 7의 결과와 같이 베타-글루칸(BRD-글루칸)의 300㎍/㎖ 농도에서 대조구(1 nmole/106cells)에 비해 48배정도(48±7 nmole/106cells)의 마크로파지의 기능을 강화시켰다.
마우스의 비장세포를 베타-글루칸(BRD-글루칸) 100㎍/㎖ 첨가 FCS-RPM1640배지에서 시험관내(in vitro)에서 배양한 것으로 종양세포 YAC-1에 대한 살해활성을 측정하였다. 도 8의 결과와 같이 베타-글루칸(BRD-글루칸)이 대조군보다 약 11% 정도의 항암면역증강활성을 나타내었다.
＜실시예 8> 베타-글루칸의 보습능 시험
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)을 화장품첨가제로 사용하기에 적합한지 평가하기 위하여 현재 화장품의 보습능을 유지하기 하기 위한 첨가제로 널리 이용되고 있는 히아루로닉산 (hyaluronic acid)과 오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸과의 보습능을 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 보습능의 비교는 각각의 0.5% 용액을 상대습도가 50%, 온도가 30℃인 데시케이터 내에 보관하면서 경시적으로 수분함량을 비교하였다.
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)의 보습능 비교시험
구 분 수분함량 (%)
경과시간 (hour)
0 2.5 5.0 7.5 22 27
대조구 (초순수) 100 90.3 78.9 67.5 30.6 15.9
히아루로닉산(0.5% 용액) 100 92.5 80.1 70.7 42.1 22.5
BRD-글루칸(0.5% 용액) 100 95.6 86.7 79.9 55.4 40.9
상기 표 6에서와 같이 오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)은 화장품의 보습능 향상을 위하여 널리 이용되고 있는 히아루로닉산(hyaluronic acid)에 비하여 27시간 경과 후 약 2배 정도의 보습능을 가진 것으로 평가되었다. 또한 히아루로닉산은 피부부자극이 강하고 피부에 여러 가지 부작용을 나타내는데 비하여 오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)은 세포증식효과 및 피부자극성 감소효과 등의 다양한 효능이 있으므로 새로운 화장품 첨가제로서 적합함을 알 수 있다.
<실시예 9> 베타-글루칸의 피부세포 증식효과 비교시험
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)을 화장품 첨가제로 이용하기 위하여 본 베타-글루칸의 피부세포 증식효과를 조사하였다. 피부세포 증식효과의 시험은 1.5 ml 디엠이엠배지 (DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium)가 함유되어 있는 플레이트 웰 (plate well) 12개에 인간의 표피결합조직 형성세포 (human dermal fibroblast)를 100,000 cell/well 수준으로 접종하고 37℃에서 24 시간 배양한 후 세포의 증식율을 MTT-어세이 방법으로 570 nm에서 측정하였다. 그 결과는 표 7와 같다
오레오바시디움 속 BRD-109가 생산하는 베타-글루칸(BRD-글루칸)의 피부세포 증식효과 시험
시료 세포증식율 (%)
대조구 (증류수) 80
BRD-글루칸 240
본 발명의 새로운 균주 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109)가 생산하는 베타-글루칸은 세포외로 분비되는 형태의 베타-글루칸으로서 물에 대한 용해성이 우수하고 정제하기에 편리하여 대량생산이 용이하며, 따라서 의약품, 화장품, 건강보조식품 및 사료첨가제 등을 포함하는 다양한 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 열 및 pH에 안정한 베타-글루칸을 생산하는 새로운 균주 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109)(기탁번호:KCTC 10182BP).
  2. 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109) 균주 (기탁번호:KCTC 10182BP)를 배양하여 그 배양액과 균체로부터 분자량 100,000~5,000,000달톤의 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 균주의 배양은 서당 1.0~5.0중량%, 질산나트륨 0.01~0.05중량%, 제이인산칼륨 0.1~1.0중량%, 염화칼륨 0.05~0.50중량%, 황산마그네슘 0.02~0.2중량%, 황산제일철 0.001~0.01중량%로 구성된 액체배지에서 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 균주의 배양은
    (1) 서당 1.0~5.0중량%, 질산나트륨 0.01~0.05중량%, 제이인산칼륨 0.1~1.0중량%, 염화칼륨 0.05~0.50중량%, 황산마그네슘 0.02~0.2중량%, 황산제일철 0.001~0.01중량%로 구성된 액체배지를 발효조에 넣고 121℃이상에서 30~60분간 가압습윤 살균하는 단계;
    (2) 살균된 상기 액체배지를 30℃(?~?)로 냉각하고 상기 균주를 접종하는 단계; 및
    (3) 30℃(?~?)의 배양온도, 0.5~1.0 VVM의 에어공급 및 150~300 RPM 교반속도의 배양조건하에 발효조에서 상기 균주를 배양하는 단계;
    를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 방법으로 얻어진, 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109) 균주 (기탁번호:KCTC 10182BP)가 생산하는 베타-글루칸을 함유하여 마크로파지 및 LAK 세포를 활성화시키는 면역활성증강 효과를 나타냄을 특징으로 하는 면역증강 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 베타-글루칸을 10~1,000㎍/㎖의 양으로 포함함을 특징으로 하는 면역증강 조성물.
  7. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 방법으로 얻어진, 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109) 균주 (기탁번호:KCTC 10182BP)가 생산하는 베타-글루칸을 함유하여 보습능 및 피부세포 재생효과를 나타냄을 특징으로 하는 화장품 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 베타-글루칸을 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1~2중량%로 포함함을 특징으로 하는 화장품 조성물.
  9. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 방법으로 얻어진, 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109) 균주 (기탁번호:KCTC 10182BP)가 생산하는 베타-글루칸을 포함함을 특징으로 하는 건강보조식품.
  10. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 방법으로 얻어진, 오레오바시디움 속 BRD-109(Aureobasidium sp.BRD-109) 균주 (기탁번호:KCTC 10182BP)가 생산하는 베타-글루칸을 포함함을 특징으로 하는 사료첨가제.
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