CN101218340A - 双歧杆菌属的微生物生产的多糖 - Google Patents
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Abstract
本发明提供多糖,该多糖含有半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和丙酮酸作为构成成分,其中所含的半乳糖、葡萄糖、鼠李糖的摩尔比为4∶2∶1,且其中所含的丙酮酸为4-7质量%。该多糖通过将长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)厌氧性培养获得。
Description
技术领域
本发明涉及双歧杆菌属(Bifidobacterium)的微生物生产的新型多糖以及含有该多糖的食品、化妆品、药物等的组合物。
背景技术
双歧杆菌属的微生物是肠内菌群中的最优势菌群之一。该微生物与乳酸菌同样,可以直接摄取菌体本身。有报道指出,通过摄取该微生物,得到了调节肠内菌群平衡的整肠作用、血清胆固醇值改善效果、免疫活化作用等。其中,对于免疫功能的增强,报道了:以乳酸菌或双歧杆菌属微生物作为有效成分的抗肿瘤剂(日本特开平7-82158号公报)以及细胞因子生成促进剂(日本特开平8-92112号公报)、以乳杆菌属(Lactobacillus)微生物作为有效成分的炎症性肠疾病预防治疗药(日本特开2003-73286号公报)、以双歧杆菌属微生物的细胞壁和/或细胞壁破碎物作为有效成分的粒细胞诱导剂(日本特开平7-330806号公报)、以双歧杆菌属微生物为有效成分的水溶性免疫活化物质(日本特开平9-241179号公报)等。但是它们都是以全部菌体本身或者是由细胞壁溶解酶处理或超声波菌体破碎得到的多糖组分作为有效成分。
另一方面,关于菌体外多糖的活化免疫功能的作用,有以下报道:以乳链球菌(Streptococcus lactis)或奶油色链球菌(Streptococcus oremoris)生产的多糖为有效成分的抗肿瘤剂(曰本专利第2678673号公报)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)或乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的粘性荚膜多糖类的抗肿瘤活性(日本特开平1-277484号公报)、以由乳杆菌属微生物的培养液得到的多糖作为有效成分的抗炎症剂或骨髓细胞增殖促进剂(日本特开平7-70209号公报)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)生产的含有磷的多糖类的自身免疫疾病预防效果(日本专利第3017493号公报)等。但是,这些均涉及由酸乳酪或发酵乳分离的乳酸菌所生产的多糖。
在人的肠内菌群中,双歧杆菌属微生物的存在菌数比乳酸菌的存在菌数多,存在于肠内的双歧杆菌属微生物生产的多糖被认为会具有机体防御功能。但是,关于这些双歧杆菌属微生物生产的多糖,目前仅报告有长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)生产的、只含葡萄糖的多糖类(日本特开平7-255465号公报)、长双歧杆菌生产的含有葡萄糖、半乳糖、糖醛酸等的多糖类(Appl.Microbiol.Biotechnil.43卷,995-1000页)等,并且对它们的功能并未明确。
发明内容
因此,人们需求具有新功能的来自双歧杆菌的多糖。
本发明人对于存在于人体肠内的、生产高粘性物质的双歧杆菌属微生物进行了深入的研究,发现长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)在培养液中生成大量的粘性物质,该粘性物质为新型多糖,并且该新型多糖具有保湿作用、免疫活化作用等功能,从而完成了本发明。
即,本发明提供新型多糖,该多糖含有半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、以及丙酮酸作为构成成分,其中所含的半乳糖、葡萄糖、鼠李糖的摩尔比为4∶2∶1,且其中所含的丙酮酸为4-7质量%。
在一个方案中,本发明的多糖含有以下式(I)的结构。
本发明还提供上述多糖的制备方法,该方法包含以下步骤:对具有生产该多糖的能力的双歧杆菌属的微生物进行培养的步骤;以及将由该微生物生产的多糖进行回收的步骤。
在另一个实施方案中,上述微生物是长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)JBL05株(NITE BP-82)。
本发明还提供长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)。
本发明又提供含有上述多糖的组合物,在一个实施方案中,上述组合物是食品组合物、化妆品组合物或药物组合物。
在另一实施方案中,上述食品组合物或药物组合物是免疫活化剂,上述化妆品组合物是保湿剂。
另外,本发明提供含有长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)的制剂。
本发明提供具有保湿作用、免疫活化作用的新型多糖。该多糖可用作食品组合物、化妆品组合物、药物组合物等的原料。另外,长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)以及含有该微生物的培养液也可制成制剂,可作为免疫活化剂等药物、或具有免疫活化活性的食品等利用。并且长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)及其菌体破碎物(破碎液)也可制成制剂,可用作化妆品组合物等。
附图简述
图1是表示长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)的培养时间与培养液粘度的关系的图表。
图2是表示本发明的多糖促进TNF-α生成的效果的图表。
图3是表示本发明的多糖促进亚硝酸盐生成的效果的图表。
图4是表示本发明的多糖促进TNF-α生成的效果的图表。
图5是表示本发明的多糖促进亚硝酸盐生成的效果的图表。
图6是表示本发明的多糖的保湿效果的图表。
实施发明的最佳方式
本发明的多糖含有半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和丙酮酸作为构成成分,其中所含的半乳糖、葡萄糖、鼠李糖的摩尔比为4∶2∶1,且其中所含的丙酮酸为4-7质量%。该多糖含有下式(I)所示的重复结构。
具有上述结构的多糖由从人体肠内分离出的长双歧杆菌JBL05株(NITEBP-82)生产。
本发明中使用的微生物可例举长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82),也可以使用该微生物以外的微生物。例如可分离肠内细菌,选择在微生物的周围产生荚膜状多糖的菌株,对该多糖进行分析获得。上述筛选方法得到的长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)的微生物学性质如下表1所示。
表1
A.形态学性状
(1)形状 0.6-0.8×1.0-4.0μm,呈棒状、Y字状、弯曲状
的革兰氏阳性杆菌
(2)运动性 -
(3)孢子 -
B.培养性状*1
(1)形状 正圆、表面·边缘均圆滑
(2)大小 直径0.5-2.5mm
(3)隆起 呈半球状
(4)颜色 黄褐色或乳白色
(5)特征 稍粘稠
*1涂布在BL琼脂培养基(日水制药株式会社)
后,放入37℃的AnaeroPack(厌氧菌培养皿)(三
菱气体化学株式会社),在密闭容器内、在厌氧
条件下培养48小时后形成菌落性状
C.生理学性质
(1)硝酸盐还原 -
(2)吲哚的生成 -
(3)过氧化氢酶 -
(4)最适生长温度 37℃
(5)最适pH pH 6.5-7.0
(6)厌氧度 专性厌氧性
(7)气体的生成 -
(8)糖利用性
阿拉伯糖+
木糖+
脂糖+
葡萄糖+
半乳糖+
甘露糖+
果糖+
蔗糖+
麦芽糖+
纤维二糖-
乳糖+
海藻糖-
蜜二糖+
棉子糖+
松三糖+
淀粉±
甘油-
甘露糖醇-
山梨醇-
肌醇-
(+:阳性-:阴性±:弱阳性)
根据这些表现形态所得到的分类学性质,由Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology Vol.2(1984)显示JBL05株为长双歧杆菌。该新型微生物)于2005年3月3日(原保藏日)保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构特许生物寄托中心(NPMD)(地址:292-0818日本国千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8),以长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)命名保藏。
本发明的多糖可通过将长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)在适当的培养基上培养获得。培养基可使用含双歧杆菌属微生物可利用的碳源、氮源、以及根据需要存在的半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸钠、微量的无机盐等的培养基。特别是大量生产多糖时优选使用含有脱脂乳或乳成分的培养基。这种情况下,可优选使用在脱脂乳被蛋白酶等酶分解得到的酶解脱脂乳中加入Cultivator(烧津水产化学工业株式会社)、乳糖、抗坏血酸钠等得到的培养基。
使用上述培养基,在培养温度20-40℃、厌氧条件下,将长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)搅拌或静置,培养16-60小时,控制pH为4-7,优选5-6,进行培养,由此在培养液中生产粘性物质。
由所得培养液回收多糖时,可以采用加热、酶处理、离心、过滤等本领域技术人员通常由培养液中回收目标物质的方法。例如,将含有粘性物质(多糖)和微生物菌体的培养液进行离心,除去菌体。培养液的粘度高时,例如通过用水稀释后离心可以除去菌体。接着,向所得上清中加入适当的有机溶剂,使蛋白质析出,例如通过离心除去沉淀,再添加有机溶剂,使多糖沉淀,然后通过离心等回收多糖。具体来说,向除去了菌体的上清中添加乙醇,使终浓度为20容量%,进行离心,除去含有蛋白质的沉淀物,再添加乙醇,使终浓度为50容积%,进行离心,回收沉淀物,得到粗纯化多糖。
或者,也可以采用将有机溶剂与阳离子组合回收多糖的方法。例如可以采用与下述方法同样的方法:使用一价阳离子和有机溶剂的回收方法、使用二价阳离子和有机溶剂的回收方法(日本特开昭58-5301号公报)、使用三价阳离子和有机溶剂的回收方法(日本特开昭59-196099号公报)等方法。从提高多糖回收率角度考虑,优选使用阳离子。一价阳离子可以使用钠离子、钾离子等。二价阳离子可以使用镁离子、钙离子等。三价阳离子可以使用铝离子等。这些阳离子与乙醇等有机溶剂一起添加到含有多糖的粘性溶液中,由此可以更多地回收多糖。使用二价或三价阳离子比使用一价阳离子可以提高多糖的回收率。
由所得粗纯化多糖进行多糖的纯化时,可按照本领域技术人员通常采用的方法,例如使用离子交换树脂的分级、凝胶过滤分级等进行,可以将它们单独或组合进行。使用离子交换树脂的方法没有特别限定,例如有以下方法:使多糖吸附于阴离子交换树脂(例如商品名DEAESephadex A-50(Pharmacia Corporation)等),采用氯化钠的梯度,使多糖洗脱,然后使用商品名TOYOPEARL HW65S(东ソ一株式会社)等进行凝胶过滤的方法等。通过凝胶过滤进行的纯化也可以测定分子量。
多糖的结构由下述方法确定。首先将纯化的多糖用例如甲酸、稀盐酸、三氟乙酸等酸水解,将该水解物通过HPLC进行分析,确定构成多糖的糖(单糖)。接着,将该酸水解物按照常规方法进行乙酰化,通过气相色谱进行分析(GC分析),可以求得构成糖的组成(构成糖的比例)。再按照常规方法将酸水解产物进行甲基化,通过GC-MS(质量)等进行分析,确定多糖的结合方式。还可通过NMR分析明确各单糖之间的结合状态,也可检测乙酰基的存在。与多糖结合的丙酮酸可通过在NADH存在下、通过乳酸脱氢酶测定丙酮酸还原为乳酸,由此进行定性定量测定。
长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)生产的多糖具有以下特征。
(1)多糖的构成成分含有半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和丙酮酸,其中的半乳糖、葡萄糖与鼠李糖的摩尔比为4∶2∶1。
(2)多糖中丙酮酸含有率为4-7质量%。
(3)分子量按照TOYOPEARL HW65S的凝胶过滤测定约为20万-250万。
(4)比旋光度约+130°。
(5)含有乙酰基。
(6)多糖含有下式(I)所示的重复结构。
本发明的多糖分子量根据培养条件和回收、纯化条件而变化,可通过培养条件等进行分子量的调节。
所得多糖具有优异的免疫活化活性和保湿能力,因此可用作食品组合物、药物组合物、化妆品组合物等组合物。药物组合物也包括含有本发明的多糖的准药物组合物、贴剂、伤口保护剂、急救胶布等卫生材料。
本发明的长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)以及含有该微生物的培养液本身也可以制成制剂使用。该制剂送达至肠内,微生物生产本发明的多糖,因此该制剂可用作免疫活化剂等药物、或者具有免疫活化活性的食品等。
实施例
以下,给出实施例说明本发明,但本发明并不受这些实施例的限定。
(实施例1:微生物的分离)
(培养基的制备)
用于分离双歧杆菌的培养基使用BL琼脂培养基(日水制药株式会社)和BS琼脂培养基。BL琼脂培养基是在高压灭菌器中、在115℃灭菌20分钟,无菌条件下加入5%马血液,分注到培养皿中作为平板使用。BS琼脂培养基如下制备。首先,将30g丙酸钠、100mg硫酸巴龙霉素、400mg硫酸新霉素、6g氯化锂用纯净水溶解,使总量为100ml,制备BS琼脂培养基的添加液。将50ml该BS琼脂培养基的添加液加入到1000ml BL琼脂培养基中,得到BS琼脂培养基。该BS琼脂培养基分注到培养皿上作为平板使用。
(微生物的筛选)
将人粪便用无菌水溶解,接种上述BL琼脂培养基和BS琼脂培养基上,在37℃下厌氧培养48小时。观察在平板上生长发育的菌的菌落性状、革兰氏染色标本的菌形态,将被认为是双歧杆菌的菌落分别分离到两片BL琼脂培养基上。一片在37℃下厌氧培养48小时,另一片在37℃下好氧培养48小时。在厌氧性生长的菌落中,分离出生产粘性物质的菌株(微生物)。所得微生物的生理学和形态学特征如上所述。鉴定为长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)。
(实施例2:多糖的结构分析)
(培养基的制备)
向9质量%的脱脂乳溶液中加入胰酶制剂(天野酶株式会社)和硅,使终浓度分别为0.36质量%和0.01质量%。接着用10N NaOH将溶液的pH调节为8,在55℃下反应4小时,得到酶解脱脂乳。向其中加入Cultivator(烧津水产化学工业株式会社)、乳糖、抗坏血酸钠,使终浓度分别为3.0质量%、2.5质量%和0.2质量%,在121℃下用高压灭菌器灭菌15分钟,作为液体培养基使用。
(多糖的纯化)
将用上述制备的液体培养基进行预培养的长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)接种于同样的液体培养基,浓度为1%(v/v),在37℃下进行40小时的静置厌氧培养,生产粘性物质。将培养液离心,除去菌体,然后向上清中加入乙醇,使终浓度为20%,在4℃下静置保存。静置过夜后通过离心除去含有蛋白质的沉淀物,向上清中加入乙醇,使终浓度为50%,在4℃下静置保存。静置过夜后,通过离心回收沉淀物,得到粗纯化多糖组分,冷冻干燥保存。
使用DEAE Sephadex A-50填充柱,进一步对该粗纯化多糖组分进行分级,将在0.07M-0.5M NaCl洗脱的组分作为纯化多糖组分。
(分子量的测定)
使用TOYOPEAL HW65S填充柱,对该纯化多糖组分进行凝胶过滤,多糖的分子量约为80万。该分子量根据培养条件、回收条件、纯化条件而变化,通过数次重复实验,可得到具有约20-250万之间的分子量的多糖。由此可以认为,通过培养条件、回收条件、纯化条件等可以调节分子量。
(比旋光度的测定)
使用日本分光DIP-360型数字旋光计测定的该多糖的比旋光度约+130°。
(成分分析)
接着,向所得多糖中加入甲酸进行水解。将该水解液减压干燥固化,再加入三氟乙酸进行水解,得到水解产物。使用ION-300柱(东京化成工业株式会社)进行HPLC分析,可知该多糖由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、丙酮酸构成。
通过常规方法用硼氢化钠还原该水解产物,加入乙酸酐和吡啶,进行乙酰化,用R-255柱(J&W Scientific)将乙酰化产物进行GC分析。结果,构成该多糖的半乳糖、葡萄糖、鼠糖的摩尔比为4∶2∶1。
在NADH的存在下,使乳酸脱氢酶与上述水解产物作用,产生乳酸。因此,可以确认该多糖组分中存在丙酮酸。多糖中的丙酮酸含有率为4-7质量%。
(结构分析)
为了明确多糖的结合方式,进行甲基化,然后进行分析。将上述水解产物按照常规方法进行甲基化。各甲基化单糖通过GC-MS(质量)进行分析,结果得到了1,5-二-O-乙酰基-2,3,4,6-四-O-甲基-葡萄糖醇、1,5-二-O-乙酰基-2,3,4,6-四-O-甲基-半乳糖醇、1,3,4,5-四-O-乙酰基-2,6-二-O-甲基-鼠李糖醇、1,3,5-三-O-乙酰基-2,4,6-三-O-甲基-半乳糖醇、1,4,5-三-O-乙酰基-2,3,6-三-O-甲基-葡萄糖醇、1,4,5-三-O-乙酰基-2,3,6-三-O-甲基-半乳糖醇和1,4,5,6-四-O-乙酰基-2,3-二-O-甲基-半乳糖醇的甲基化糖。
通过NMR分析对结合状态进行了研究。由这些数据可知,本发明的多糖具有以下的结构I(重复结构)。
还通过NMR分析检测出了乙酰基。
(实施例3:多糖的培养生产)
向实施例2中制备的酶解脱脂乳中加入抗坏血酸钠,使终浓度为0.2质量%,在121℃下用高压灭菌器灭菌15分钟,制备液体培养基。将用与此相同的液体培养基进行预培养的长双歧杆菌JBL05株(NITE BP-82)的培养液接种于上述制备的液体培养基,浓度为1%(v/v),微速搅拌,控制pH为6.0,在37℃下厌氧培养40小时。使用10N NaOH控制pH。将进行静置厌氧培养的情况作为比较例。
图1表示培养时间与培养液粘度的关系。与进行静置厌氧培养的情况比较,调节pH同时进行培养时,粘度在20小时以后急剧增加,可高效地生产本发明的多糖。粘度是使用TVB-10型粘度计(东机产业株式会社)、使用转子THM1,在15℃、转数50rpm下测定时的值。
(实施例4:粗纯化多糖组分对免疫活化的巨噬细胞的活化作用)
如下测定实施例2中制备的粗纯化多糖组分的免疫活化作用。向12周龄ddY系雄性小鼠(纪和实验动物研究所)的腹腔内注入2ml 4%(w/v)TGC培养基(曰水制药株式会社),4天后用12ml冷PBS清洗腹腔内,回收清洗液。将该液体在4℃下、以10000rpm离心10分钟,除去上清,得到腹腔渗出细胞。将上述细胞悬浮于含有10%FCS(Invitrogen株式会社)、青霉素G、和链霉素的IPMI 1640培养基(SIGMA-ALDRICH),在96孔板上以5×105细胞/孔接种,在5%CO2存在下、在37℃下培养。培养开始1小时后除去培养基,接着,分别添加到各200μl的、分别含有0μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml实施例2所得的粗纯化多糖组分的RPMI 1640培养基中,在5%CO2存在下、在37℃下培养4小时或20小时。培养4小时后的培养上清作为巨噬细胞的活化指标,在以下的TNF-α浓度测定中使用。培养20小时后的培养上清用于以下的硝酸盐浓度测定。
TNF-α浓度的测定是使用TNF-α感受性小鼠成纤维细胞(L929细胞,大日本制药株式会社)如下进行。向96孔板的各孔中接种4.0×104细胞/孔的L929细胞,在5%CO2存在下、在37℃下培养5小时。培养后除去培养基,接着添加50μl含有1.5μg/ml放线菌素D的RPMI 1640培养基,各加入100μl上述培养4小时后的培养上清。TNF-α的标准是向IPMI 1640培养基中以各种浓度溶解TNF-α(SIGMA-ALDRICH),将所得溶液以100μl/孔的比例添加,以此代替该培养上清。接着,在5%CO2存在下、在37℃下培养20小时。再加入3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H溴化四唑鎓(和光纯药工业株式会社),使终浓度为0.5mg/ml,在5%CO2的存在下、在37℃下培养4小时。然后除去培养基,加入100μl含有0.04N盐酸的异丙醇,一边振荡10分钟左右一边溶解甲,然后测定562nm(参照波长660nm)的吸光度。使用由TNF-α标准得到的校正曲线,计算TNF-α浓度。显著差异检验使用Dunnett多重比较检验,显著水准以p<0.05和p<0.01进行。结果如图2所示。
亚硝酸盐浓度的测定是将上述培养20小时后的培养上清分别以50μl加入到96孔板上,向其中分别加入50μl的Griess试剂,在暗处、室温下反应10分钟,然后通过测定562nm(参照波长660nm)的吸光度进行。校正曲线是在RPMI 1640培养基中以各种浓度溶解亚硝酸钠(和光纯药工业株式会社),使用该溶液代替培养上清,除此之外与上述同样操作,测定吸光度,制作该校正曲线。使用该校正曲线计算亚硝酸盐的浓度。显著差异检验使用Dunnett多重比较检验。显著水准以p<0.01进行。结果如图2所示。
如图2和图3所示,对于实施例2中得到的粗纯化多糖组分,可见其巨噬细胞的活化作用。
(实施例5:纯化多糖组分对于免疫活化的巨噬细胞的活化作用)
使用用实施例2的用柱纯化的纯化多糖组分的冻干品代替冻干粗纯化多糖组分,除此之外与实施例4同样进行TNF-α浓度和亚硝酸盐浓度的测定。结果,也可见该纯化多糖组分对巨噬细胞的活化作用。结果如图4和5所示。
(实施例6:多糖的保湿作用)
将实施例2中制备的冻干粗纯化多糖组分制备成1mg/ml的浓度,通过10名20岁年龄段女性上臂内侧水分蒸发量的变化确认其保湿能力。在受试部位以2cm的间隔画2×2cm大小的印记,测定涂布样品之前的水分蒸发量(TEWL)。将各20μl上述粗纯化多糖组分和作为对照的蒸馏水用玻璃棒涂布在上述区域,在45、90、150、210分钟后测定TEWL。测定时使用水分蒸发量测定装置(mobile Tewameter MSC100)。210分钟后各水分蒸发量如图6所示。与蒸馏水相比,粗纯化多糖组分的水分蒸发量要少,可见其保湿效果。
产业实用性
本发明的多糖是具有保湿作用、免疫活化作用的新型多糖。该多糖由从人体肠道内生长的微生物分离出来的长双歧杆菌生产,可作为食品组合物、化妆品组合物、药物组合物等的原料,在工业上有用。
Claims (10)
1.多糖,该多糖含有半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和丙酮酸作为构成成分,其中所含的半乳糖、葡萄糖、鼠李糖的摩尔比为4∶2∶1,且其中所含的丙酮酸为4-7质量%。
3.权利要求1或2的多糖的制备方法,该方法包含以下步骤:对具有生产该多糖的能力的双歧杆菌属微生物进行培养的步骤;以及将由该微生物生产的多糖进行回收的步骤。
4.权利要求3的方法,其中,上述微生物是保藏号为NITE BP-82的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JBL05株。
5.保藏号为NITE BP-82的长双歧杆菌JBL05株。
6.组合物,该组合物含有权利要求1或2的多糖。
7.权利要求6的组合物,该组合物是食品组合物、化妆品组合物或药物组合物。
8.权利要求7的组合物,其中,上述食品组合物或药物组合物是免疫活化剂。
9.权利要求7的组合物,其中,上述化妆品组合物是保湿剂。
10.制剂,该制剂含有保藏号为NITE BP-82的长双歧杆菌JBL05株。
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