WO2007007562A1 - ビフィドバクテリウム属の微生物が産生する多糖 - Google Patents

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Masanori Asada
Mamiko Kohno
Tadashi Kanaya
Tomoe Yoshino
Youichi Matsuura
Yuzo Kawahara
Shinichi Kitamura
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Morishita Jintan Co., Ltd.
Ipe Inc.
Osaka Prefecture University Pubic Corporation
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to novel polysaccharides produced by microorganisms of the genus Bifidobacterium and foods, cosmetics, and pharmaceutical compositions containing the same. Background skin
  • Bifidopacteria microorganisms are one of the most dominant bacteria in the intestinal flora. These microorganisms can be ingested in the same manner as lactic acid bacteria. Ingestion of these microorganisms has also been reported to produce an intestinal regulating effect that corrects intestinal bacterial cold, an improvement in 1 & L cholesterol level, and an immunostimulatory month.
  • anti-tumor agents that effectively use lactic acid bacteria and Bifidocterium microorganisms (Tofuhei 7-8 2 1 5 8) and cytokine production agents (specialized) Kaihei 8-9 2 1 1 2), Lactobacillus genus Lactobacillus microorganism preventive agent for inflammatory bowel disease (Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 3-7 7 2 8 6), Bifidopacteria genus A granulocyte inducer containing a cell wall and / or cell wall crushed material of an organism as an active ingredient (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Streptococcus lac is or Streptococcus teremoris.
  • Streptococcus cremoris an antitumor agent containing a polysaccharide as an active ingredient (particularly fF No. 2 6 7 8 6 7 3), Lactococcus lactis subsp. Cremoris and 7 Anti-tumor activity of the occult capsular polysaccharide of Lactococcus lactis subsp. Lactis (Japanese Published Patent Application No.
  • the number of Bifidopacteria microorganisms is larger than the number of acid bacteria in the season, and the number of Bifidobacteria present in the intestines is high.
  • Polysaccharides produced by the genus Mus are considered to have some biological defense function.
  • the polysaccharides produced by these Bifido genus microorganisms S are polysaccharides consisting only of glucose produced by Bifidobacterium longum (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 7-255545). ), Polysaccharides consisting of glucose, galactose, uronic acid, etc. (Appl. Microbiol. Biotechrxol. 4 3 ⁇ , 9 9 5
  • the present invention provides a novel polysaccharide, which contains galactose, glucose, lanose, and pizoleic acid as components, and the lactose, the glucose, and the rhamnose 2: comprising 1 molar ratio, and containing pyruvate 4-7 mass 0/0.
  • the polysaccharide of the present invention comprises the structure of the following formula (I): ⁇ -D-Glcp 1
  • the present invention also relates to a method for producing the above-described polysaccharide, a step of culturing a microorganism belonging to the genus Bifidobacteria having the ability to produce this polysaccharide, and a multi-product produced by the microorganism.
  • a method is provided that includes the step of recovering.
  • the above-mentioned microorganism is Bifidobacterium longum J B L05 strain (N I TE BP-82).
  • the present invention provides a bifido, nocterum ronum; Bifidobacterium lonum JBL05 strain (NI TEBP-82).
  • the present invention provides a composition containing the above-described training, and in one embodiment, the above-mentioned composition is a food composition, cosmetic composition or pharmaceutical composition 2>.
  • the product composition or pharmaceutical composition is immunostimulatory and the cosmetic composition is a humectant.
  • a preparation comprising H, -Bifidobacterium longum JBL 05 strain (NI TE BP-8 2).
  • a novel polysaccharide having a moisturizing action and an immunostimulatory action is provided.
  • This polysaccharide is used as a starting material for food compositions, cosmetic compositions, pharmaceutical compositions and the like.
  • bihui dopakuterumongam J B L 05 share (NT I TE
  • BP-82 BP-82
  • culture media containing these microorganisms are also formulated and used as pharmaceuticals such as immunostimulants or all products with immunostimulatory activity.
  • bifido butteryum longum J B L 05 strain (N I TE P-82) and this bacterial cell lysate (disruption liquid) are also formulated and used as cosmetic compositions.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the culture time and the viscosity of the culture solution of bifido paclarium longum JBL 05 strain ( ⁇ ⁇ ⁇ B F-82).
  • FIG. 2 is a graph showing the TNF-production promoting effect of the polysaccharide of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the nitrite production promoting effect of the polysaccharide of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the TNF- ⁇ production promoting effect of the polysaccharide of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the nitrite production promoting effect of the polysaccharide of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the moisturizing effect of the polysaccharide of the present invention. Best mode for carrying out
  • the polysaccharide of the present invention has galactose, glucose, rhamnose, and pyruvic acid as constituents, and includes galactose, glucose, and rhamnose in a molar ratio of 4: 2: 1, and pilpi, Contains 4-7 mass 0 / wt of acid.
  • This polysaccharide has the following formula (I) ⁇ -D-Glqp 1
  • Polysaccharide f having such a structure is isolated from the intestine of humans and produced from bifidopacterilongum JBL 05 strain (NITEB P-82).
  • NI TEBP-82 5 strains (NI TEBP-82) are exemplified, but microorganisms other than this microorganism can also be used. For example, isolate the intestinal bacteria, select strains that produce capsular polysaccharides around the microorganisms, and analyze the polysaccharides (obtained from this. Bifii obtained by such a screening method) Dobataterum Kumgam JBL 05 shares (N
  • I TE BP-82 The bacteriological properties of I TE BP-82) are shown in Table 1 below.
  • the polysaccharide of the present invention can be obtained by culturing Bifidopacteria longum JBL05 (NITEBBP-8 2) in an appropriate medium.
  • a medium containing carbon or raw opium nitrogen that can be used for Bifidopacterium microbes and, if necessary, cystine hydrochloride, sodium ascorbate, and a trace amount of inorganic salt is used.
  • skim milk or a medium containing milk components a medium obtained by adding cultivator (Yaizu Suisan Kagaku Co., Ltd.), ratatoses, sodium ascorbate, etc. to enzyme-degraded skim milk obtained by degrading skim milk with an enzyme such as protease can be preferably used.
  • EBP—8 2 is stirred or allowed to stand under anaerobic conditions at a culture temperature of 20 to 40 ° C., and pH is controlled to 4 to 7, preferably 5 to 6, for 16 to 60 hours. However, by culturing, a viscous substance is produced in the culture solution.
  • a person skilled in the art usually uses a method for recovering the target substance from the culture broth.
  • the culture solution containing viscous substances (polysaccharides) and microbial cells is centrifuged to remove the cells.
  • the cells can be removed by, for example, diluting with water and then centrifuging.
  • an appropriate organic solvent is added to the obtained supernatant to precipitate the protein, the precipitate is removed by, for example, centrifugation, an organic solvent is added to precipitate the polysaccharide, and centrifugation is performed. Collect the polysaccharide.
  • the final concentration in the supernatant after removing the cells is 20% by volume. Then, add ethanol to remove the precipitate containing protein by eccentric separation, add ethanol so that the final concentration is 50% by volume, centrifuge and separate the precipitate. By collecting, a crude polysaccharide can be obtained.
  • a recovery method using a monovalent cation and an organic solvent a recovery method using a divalent cation and an organic solvent (Japanese Patent Laid-Open No. 5-8530), a trivalent cation and an organic solvent, It is also possible to use a method similar to that used in the collection method using JP-A No. 5-9-1 9 6 0 9 9.
  • Gathion is preferably used because it increases the recovery rate of polysaccharides.
  • Monovalent ions such as sodium ion and potassium ion are used.
  • divalent gathion, magnesium ion, calcium ion, etc. are used.
  • trivalent cations include aluminum ions.
  • Bivalent V ⁇ using a trivalent cation can increase the polysaccharide ⁇ recovery rate compared to using a monovalent cation.
  • Purification of polysaccharides from the obtained crude purified polysaccharide is carried out by a person skilled in the art S, for example, fractionation using a ion exchange resin, fractionation by gel filtration, or a combination thereof.
  • a ion exchange resin for example, trade name DEAE Sephadex A-50 (Falmacia), etc.
  • the sodium chloride gradient is applied to the polysaccharide.
  • the molecular weight can be measured by gel filtration.
  • Polysaccharide refinement is determined by the following method. First, the refined polysaccharide is hydrolyzed with formic acid, dilute hydrochloric acid, trifluroacetic acid, etc. By analyzing the product with HP LC, the sugars (monosaccharides) that make up the polysaccharide are determined. Subsequently, this acid hydrolyzate is converted into an acylate by a conventional method and analyzed by gas chromatography (GC analysis), whereby the composition (ratio of composition) of the synthetic sugar can be obtained. Furthermore, the acid-branched hydrolyzate is methylated by conventional methods and analyzed by OC-MS (mass), etc., to determine the type of polysaccharide.
  • GC analysis gas chromatography
  • NTMR analysis reveals the binding state of each monosaccharide and also detects the presence of an alkyl group. Pyruvate bound to a polysaccharide can be measured permanently and quantitatively by measuring the reduction of pyruvate to lactic acid by lactate dehydrogenase in the presence of NADH. '
  • the polysaccharide produced by Bi 7-Bataterum Longum J BL 05 (N I TE B P-82) has the following characteristics.
  • the content of pyruvic acid in the polysaccharide is 4-7 mass 0 /. It is.
  • the molecular weight is about 200,000-250,000,000 with Gel Filter 51 by T0Y0PEARL HW65S.
  • the polysaccharide contains a repeating structure represented by the following formula (I) —.
  • the molecular weight of the polysaccharide of the present invention varies depending on the culture conditions and the recovery conditions. 1 ⁇ It is also possible to adjust the molecular weight depending on the culture conditions. Since the obtained polysaccharide has excellent immunostimulatory activity and moisturizing ability, it can be used as a composition such as a food composition, a pharmaceutical composition, and a chemical composition. Examples of the pharmaceutical product) include quasi-drugs containing the polysaccharide of the present invention, hygiene materials such as a patch, a wound protection kit, and an emergency bandage.
  • Bifidobacterium gum JBL 05 strain (N "ITEB P-82) of the present invention and culture night itself containing this microorganism can be formulated and used. Since the microorganisms produce the polysaccharide of the present invention when delivered to the drug, this preparation is used as a pharmaceutical such as an immunostimulant or a food that has immunostimulatory activity.
  • BL agar medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and BS agar medium were used.
  • the BL agar medium was sterilized in a photoclave at 115 ° C for 20 minutes, 5% horse blood was added to sterile 0 ⁇ , dispensed into a petri dish, and used as a plate.
  • BS agar was prepared as follows.
  • Pancleane (Amano Enzyme Co., Ltd.) Opto silicon was added to 9% by mass degreasing solution so that the final concentrations were 0.35% by mass and 0.01% by mass, respectively. Adjust the pH of the solution to 8 with I ON Na OH, 5
  • the reaction was carried out at 5 ° C for 4 hours to obtain enzymatic degradation degreasing.
  • Kanorechibeta Yamazu Suisankagaku Industry Co., Ltd.
  • Ratatosu and Asukorubin acid sodium ⁇ beam at each final concentration, 3.0 wt °, 2. 5 wt%, and 0.2 mass 0/0
  • This crudely purified polysaccharide fraction was further fractionated using DEAE Sephadex A-50 packed column, and the fraction eluted with 0.0 M to 0.5 M NaCl was purified. It was.
  • the bond ⁇ : state was examined by NMR analysis. From these data, it was found that the polysaccharide of the present invention has the following structure I (repeat structure).
  • the medium was inoculated and anaerobically cultured at 37 ° C. for 40 hours while controlling at a pH of 6.0 under slight stirring. I ON NaOH: was used for pH control.
  • Figure 1 shows the relationship between the incubation time and the viscosity of the culture solution. Compared with the anomaly in which static anaerobic culture was performed, when the culture was performed while adjusting the pH, the viscosity increased rapidly from 20 hours onward, and the multi-function of the present invention was produced efficiently. Viscosity is the value when TV B 1 10 Viscometer (Toki Sangyo Co., Ltd.) is used and low THM1 is used, and the temperature is determined at 15 ° C and 50 rpm.
  • Example 4 Immunostimulatory macrophage activating action of crude purified polysaccharide fraction
  • the immunostimulatory action of the crude purified polysaccharide fraction prepared in Implementation River 2 was measured as follows.
  • -ALDR I CH seeded in 96-well plates at 5 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the medium was removed, and then the crude purified polysaccharide fraction obtained in step 2 was used for g / m 1, 3 ⁇ g / m 1, 1 O g / m 1, and 30 ⁇ g, respectively.
  • Zm 1, and 10 O £ 111 111 in 1? 1 1 Add to 640 medium 200 1 and incubate at 37 ° C for 4 or 20 hours in the presence of 5% C 2 .
  • the culture supernatant after 4 hours of culture is used to measure the following TNTF concentrations as the target for the activity of the phage phage activity.
  • the culture supernatant after 20 hours of culture is used for the following nitrite (Nitrite) concentration measurements. Use Buko.
  • TNF- concentration was measured using TNF- ⁇ -sensitive fe mouse fibroblasts (L 929 cells, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the L 929 Hosotsuki follicles NOTE - Ueru of a 96-well plate 4. seeded so as to be 0 X 10 4 cells / well, 5 ° C0 2 presence, cry and incubated for 5 hours at 37 ° C. After the culture, remove the medium, and then add RPM 1 1640 medium 50 ⁇ 1 containing 1.5 ⁇ g / m 1 actinomycin D, and then add 100 ⁇ ⁇ Added one at a time.
  • TNF- ⁇ SI GMA-ALDR.
  • I CH was dissolved in various concentrations of C in RPM® 1640 medium instead of this culture ⁇ purification. . was added at a rate of ⁇ 1 Zwell then, 5% C0 2 presence and incubated for 20 hours at 37 ° C, further, to a final concentration of force 0. 5mgZml 3- (4, 5 one Jimechinore - 2- thiazolyl) -.
  • Example 5 Immunostimulation of sperm polysaccharide fraction for clophage activation
  • the lyophilized product of purified polysaccharide fraction purified with the power ram of Example 2 was used. Except for the above, measure the TNF concentration and nitrite concentration in the same manner as in Example 4. As a result, macrophage activation was also comforted with this purified polysaccharide fraction. The results are shown in Figs.
  • the freeze-dried crude purified fraction prepared in Example 2 was prepared to a concentration of 1 mg Zm 1 (concentration, and its moisturizing ability was confirmed by the change in the amount of water transpiration inside the _t arm of 10 women in their 20s.
  • the site was marked with a size of 2 X 2 cm at intervals of 2 cm, and the amount of water transpiration (TEWL) before the application of the sample was measured. 20/2, spread with glass rod and apply, and measured TEWL after 45, 90, 150, 210 minutes.
  • TEWL water transpiration
  • the polysaccharide of the present invention is a novel polysaccharide having a moisturizing action and an immunostimulatory action.
  • O Polysaccharides are produced from bifido pacteria longum isolated from microbes living in human intestines, and are industrially useful as raw materials for food compositions, cosmetic compositions, pharmaceutical compositions and the like.

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Abstract

構成成分として、ガラクトース、グルコース、ラムノース、およびピルビン酸を含有する多糖であって、該ガラクトースと、該グルコースと、該ラムノースとを４：２：１のモル比で含み、かつピルビン酸を４～７質量％含む多糖が提供される。この多糖は、ビフィドバクテリウム　ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ　ＢＰ−８２）を嫌気的に培養することにより得られる。

Description

明 細 書 ビフィドバクテリゥム属の微生物が産生する多糖 技術分野
本 明はビフイドパクテリゥム属 （Bifidobacterium属） の微生物が産 する新規多糖およびそれを含む食品、 化粧品、 医薬ロ¾などの組成物に関する。 背景皮術
ビフィ ドパクテリゥム属の微生物は、 腸内細菌叢における最優勢菌のひと つで る。 この微生物は乳酸菌と同様に菌体そのものが摂取され得る。 そし てこの微生物を摂取すること こより、 腸内細菌寒のノ ランスを整える整腸作 用、 1&L清コレステロール値の改善効果、 免疫賦活作月などが得られること 報告されている。 中でも、 免疫機能の増強については、 乳酸菌やビフィ ドノ クテリ ゥム属微生物を有効成 とする抗腫瘍剤 （特闘平 7— 8 2 1 5 8号 報） よびサイトカイン産生ィ足進剤 （特開平 8— 9 2 1 1 2号公報） 、 ラク トバチルス属 (Lactobacillus属） 微生物を有効成分とする炎症性腸疾患予 防治察剤 （特開 2 0 0 3— 7 3 2 8 6号公報） 、 ビフイ ドパクテリゥム属職 生物の細胞壁および/又は細 ϋ包壁破砕物を有効成分とする顆粒球誘導剤 （特 開平 7—3 3 0 8 0 6号公報） 、 ビフイドパクテリ ゥム属微生物を有効成分 とする水溶性免疫賦活物質 （特開平 9一 2 4 1 1 7 9号公報） などが報告さ れてレ、る。 しかしこれらはすべて菌体そのものまたは細胞壁溶解酵素処 や 超音波による菌体破砕により得られる多糖画分を 劾成分としているもので ある。
—方、 菌体外多糖の免疫機能賦活作用については、 ストレプトコッカス ラクチス (Streptococcus lac is)もしくはストレ: °トコッカス タレモリ ス (Streptococcus cremoris)が産 する多糖を有効成分とする抗腫瘍剤 （特 fF 第 2 6 7 8 6 7 3号公報） 、 ラグ トコッカス ラクチス サブスピーシス クレモリス (Lactococcus lactis subsp. cremoris)や 7ク 卜コッカス フグ チス サブスピーシス ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis)の来占 着性夾膜多糖類の抗腫瘍活性 （待開平 1一 2 7 7 4 8 4号公報） 、 ラク トノく チルス属微生物の培養液から得られる多糖を有効成分とする抗炎症剤あるい は骨髄細胞增殖促進剤 （特開平ァ一 7 0 2 0 9号公報） 、 ラクトバチルス デノレブルエッキー サブスピーシス ブノレガリクス (Lactobacillus delbrue cki i subsp. bulgaricus)が産生するリン含有多糖類の自己免疫疾患予防効 果 （特許第 3 0 1 7 4 9 3号公報） などが報告されてレヽる。 し力 し、 これら はいずれも ョーダルトゃ発酵乳 ら分離された乳酸菌が産生する多糖に関す るもので る。
元来、 ヒ トの腸内細菌叢にぉレヽて、 ビフイドパクテリゥム属微生物の存在 菌数は、 季し酸菌の存在菌数より多く、 腸内に存在してレ、たビフィドバクテリ ゥム属微生物が産生する多糖は何らかの生体防御機能を有すると思われる。 しかしな ら、 これらビフィド z クテリゥム属微生物 S産生する多糖にっレヽ ては、 ビ 7イドパクテリゥム ロンガム (Bifidobacterium longum) が産生 するグルコースのみからなる多糖類 （特開平 7— 2 5 5 4 6 5号公報） 、 ヒ、、 フイドバグテリゥム ロンガム力産生するグルコース、 ガラクトース、 ゥロ ン酸などカ らなる多糖類 (Appl. Microbiol. Biotechrxol. 4 3卷、 9 9 5
— 1 0 0 O頁） などが報告されるのみであり、 さらにこれらの機能について は明確でない。 発明の開^
従って、 新たな機能を有するビブイドパクテリゥムに由来する多糖が求め られている。 本発明者らは、 ヒトの腸内に存在する高粘性物霞を産生するビフィドノ ク テリゥム属微生物について鋭意研究したところ、 trフイ ドバタテリゥム 口 ンガム J BL05株 （NI TE BP— 82) が咅養液中に多量の粘性^!質 を産生すること、 この粘性物質が新規多糖であること、 そして、 この新裁多 糖が保湿作用、 免疫賦活作用などの機能を有することを見出し、 本発明を完 成するに至った。
すなわち、 本発明は、 新規多糖を提供し、 この多糖は構成成分として、 ガ ラタ トース、 グルコース、 ラ ノース、 およびピゾレビン酸を含有し、 該 ラ クトースと、 該グルコースと、 該ラムノースとを 4 ： 2 ： 1のモル比で含み、 かつピルビン酸を 4〜 7質量0 /0含む。
一^ の態様では、 本発明の多糖は、 以下の式 （I) の構造を含む。 β-D-Glcp 1
1
6 . →4 α-Ι 0 -(1-→4)-α-Ε)-0 -(1→4)-β-Ο-Ο1ςρ-(1-→3)-α-Ε>-α3ΐρ» -<l-→3)-o()-L-Rhap-(l-→ (I)
4
†
β-D-Galp 1 また、 本発明は、 上記多糠の製造方法であって、 この多糖を産生する能力 を有するビフィ ドバクテリクム属に属する微生物を培養する工程、 および該 微生物により生産された多修を回収する工程を含む方法を提供する。
一^ oの実施態様では、 上言己微生物がビフイドバクテリゥム 口ンガム (Bi fidobacterium longum) J B L05株 （N I TE BP— 82) である。
まナこ、 本発明は、 ビフイド、ノ クテリゥム ロン; ^ム (Bifidobacterium lo ngum) J BL05株 （NI T E BP— 82) を提供する。
さ らに本発明は、 上記多修を含有する組成物を提供し、 一つの実施鎮様で は上言己組成物が、 食品組成 、 化粧品組成物または医薬品組成物であ 2>。
別の実施態様では、 上記 品組成物または医薬品組成物が免疫賦活斉 ϋであ り、 上記化粧品組成物が保湿剤である。 また、 別の本発明は、 ヒ、 -フイ ドバタテリゥム ロンガム (Bifidobacteriu m longum) J BL 05株 （N I TE BP— 8 2) を含む製剤を提 する。
本発明により、 保湿作用、 免疫賦活作用を有する新規多糖が提供される。 この多糖は、 食品組成物、 化粧品組成物、 医薬品組成物などの原科と して用 レヽられる。 また、 ビフイ ドパクテリゥム ロンガム J B L 05株 （NT I TE
BP— 82) およびこの微生物を含む培養液も製剤化され、 免疫武活剤な どの医薬品、 あるいは免疫賦活活性を有する全品などとして利用さ; る。 さ らに、 ビフイ ドバタテリゥム ロンガム J B L 05株 （N I TE P- 8 2) およびこの菌体破碎物 （破碎液） も製剤ィ匕され、 化粧品組成物 どとし て利用される。 図面の簡単な説明
図 1は、 ビフイ ドパクラリウム ロンガム J BL 05株 （Ν Ι ΤΓΕ B F-82) の培養時間と培養液の粘度との関係を示すグラフである。
図 2は、 本発明の多糖の TNF— 産生促進効果を示すグラフである。 図 3は、 本発明の多糖の亜硝酸塩 (Nitrite) 産生促進効果を示すグラフ である。
図 4は、 本発明の多糖の T N F— α産生促進効果を示すグラフで feる。 図 5は、 本発明の多糖の亜硝酸塩 （Nitrite) 産生促進効果を示すグラフ である。
図 6は、 本発明の多糖の保湿効果を示すグラフである。 明を実施するための最良の形態
本発明の多糖は、 構成成分として、 ガラクトース、 グルコース、 ラムノー ス、 およびピルビン酸を "^有し、 ガラクトースと、 グルコースと、 ラムノー スとを 4 ： 2 ： 1のモル itで含み、 かつピルピ、ン酸を 4〜 7質量0/。含む。 そ して、 この多糖は以下の式 （I) β-D-Glqp 1
I
6
■→4)-α-Γ 3 - ·→4)·α-Ι 3 - — -β-Ε ΪΙς Ι^^-α-Ε ίΕίρ-ίΗΧβΗ^ρ -(1→ (I)
4
†
β-D-GaIp 1
で表される反復構造を含んでいる。 この tうな構造を有する多糖 fま、 ヒ トの 腸内から単離されこビフイ ドパクテリゥ ロンガム J BL 05株 (N I T E B P— 82) 力 ら、 生産される。
本発明に用いる微生物として、 ビフイドバタテリゥム ロンガム J BL O
5株 （N I TE B P— 82) が例示されるが、 この微生物以 の微生物も 使用できる。 例え ίま、 腸内細菌を分離し、 微生物の周囲に夾膜 の多糖を生 産する株を選択し、 多糖を分析すること（こより得られる。 このよ うなスクリ 一ユング方法で得られたビフイ ドバタテリゥム 口ンガム J B L 05株 （N
I TE BP— 82 ) の菌学的性質は以" の表 1の通りである。
表 1
A.形態的性状
(1) 形状 0.6〜0.8 X 1.0-4.0 jU m、棍棒状、 Y字状、わん曲状のグラム陽性桿菌
(2)運動性
(3)胞子
式会社）に塗布後、 37°Cァネロパック
Figure imgf000007_0001
入り密閉容器内で嫌気条 <牛下、
48時間培養した後のコロニー性状
G:生理学的性質
(1)硝酸塩還元
(2) インドーノレ生成
(3) カタラーゼ
(4) 至適生育温度 37°C
(5) 至適 pH pH6.5〜7.0
(6)嫌気度 偏性嫌気性
(7)ガス産生
(8) 糖資化 ft
ァラビノース
キシ口一ス
リボース
グノレコース
ガラクトース
マンノース
フラク I ^一ス
サッ ±3ロース
マノレ卜一ス
セロビ才一ス
ラク卜一ス
卜レ ヽロース
メリビ才一ス
ラフイノ一ス
メレチ! ~—ス
デンプン
グリセリン
マンニ I -ール
ソノレビ! ^一レ
イノシ! ル
陽性 一：陰性 ：弱陽性) これらの表 形質による分類学的个生質に基づき、 バージーズ ·マエユア ル ·ォブ ·システマチック . ノ クテリォロン一 (Bergey' s Manual of Syste matic Bacteri ology) Vol. 2 (1984)より J B L 0 5株は、 ビフィドバクテ リウム ロンガムであることが示された。 この新規な微 物は、 2 0 0 5年 3月 3日 （原寄託日） に、 独立行 法人製品評価技術基鍵機構特許微生物寄 託センター （N P MD ) (住所： 〒 2 9 2— 0 8 1 8 曰本国千葉県木更津 巿かずさ鎌足 2— 5 _ 8 ) にビフィ ドパクテリゥム ロンガム J B L 0 5株 (N I T E B P— 8 2 ) として寄託されている。
本発明の多糖は、 ビフイ ドパクテリゥム ロンガム J B L 0 5株 （N I T E B P - 8 2 ) を適切な培地で培養することにより得られる。 培地として は、 ビフィ ドパクテリゥム属の微 物が利用できる炭素?原おょぴ窒素源並び に必要に応じて、 システィン塩酸塩、 ァスコルビン酸ナトリウム、 微量の無 機塩などを含む培地が使用される。 特に、 多量の多糖産生には、 脱脂乳また は乳成分を含む培地を使用することが好ましい。 この場合、 脱脂乳をプロテ ァーゼなどの酵素で分解した酵素分解脱脂乳に、 カルチベータ （焼津水産化 学工業株式会社） 、 ラタトース、 ァスコルビン酸ナトリウムなどを加えた培 地が好ましく使用できる。
上記培地を用い、 ビフイ ドバクテリゥム ロンガム J B L 0 5株 （N I T
E B P— 8 2 ) を、 培養温度 2 0〜4 0 °C、 嫌気条件下、 撹拌あるいは静 置して、 1 6〜6 0時間、 p Hを 4〜 7、 好ましくは 5〜 6に制御しながら 培養を行うことにより、 培養液中 ίこ粘性物質が産生される。
得られた培養液からの多糖の回収には、 加熱、 酵素処理、 遠心、 ろ過など の、 当業者力 S通常、 培養液から目的物質を回収する方法が用いられる。 例え ば、 粘性物質 （多糖） および微生物菌体を含む培養液を遠心し、 菌体を除去 する。 培養液の粘度が高い場合は、 例えば、 水で希釈した後遠心することに より、 菌体を除去することができる。 次いで、 得られた上清に適切な有機溶 媒を加えてタンパク質を析出させ、 例えば遠心分離によつて沈殿を除去し、 さらに有機溶媒を添加して多糖を沈殿させ、 そして遠心分離などにより、 多 糖を回収する。 詳細には、 菌体を除去した上清に、 終濃度が 2 0容量％とな るようにエタノールを添力 Πし、 違心分離を行ってタンパク質を含む沈殿物 除去し、 さらに終濃度が 5 0容量％となるようにエタ ノールを添加し、 遠心、 分離を行って沈殿物を回収するこ とにより、 粗精製多糖が得られる。
あるい fま、 有機溶剤とカチオ とを組み合わせて参糖を回収する方法を后 いてもよレ、。 例えば、 1価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法、 2価 のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法 （特開昭 5 8 - 5 3 0 1号公報） 、 3価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法 （特隱昭 5 9— 1 9 6 0 9 9 号公報） などと同様の方法を用レヽることもできる。 ガチオンは、 多糖の回 it¾ 率を高める点から、 好ましく用 ヽられる。 1価カチ ンとしては、 ナトリク ムイオン、 カリウムイオンなど力 S用いられる。 2価ガチオンとしては、 マグ ネシゥムイオン、 カルシウムィ；^ンなどが用いられ 。 3価カチオンとして は、 アルミニウムイオンなどが泪いられる。 これら Oカチオンをエタノー/レ などの有機溶剤とともに、 多糖 含まれる粘性溶液に添加することにより、 より多くの多糖を回収すること力 Sできる。 2価ある Vヽは 3価のカチオンを用 いる方が、 1価のカチオンを用レ、た場合よりも多糖 < 回収率を高めること S 可能である。
得られた粗精製多糖からの多糖の精製は、 当業者力 S通常行う方法、 例えほ、 ィオン交換樹脂を用いる分画、 ゲルろ過による分面 どを単独あるいは組み 合わせて行われる。 イオン交換樹脂を用いる方法に特に制限はなく、 例え 、 陰イオン 換樹脂 （例えば、 商品名 DEAE Sephadex A— 50 (フアルマシア社） など） に多糖を吸着させ、 塩化ナトリウムのグラデ エントをかけて多糖を 溶出させ、 ついで、 商品名 T O Y O P E AR L HW 6 5 S (東ソ一株式会 社） などを用いてゲルろ過する方法などが挙げられる。 ゲルろ過による精襲 では、 分子量も測定できる。
多糖の精造は以下のような方法で決定される。 まず、 精 した多糖を、 !J えば、 蟻酸、 希塩酸、 トリフル才ロ酢酸などで酸加水分解し、 この加水分解 物を H P LCで分析すること こより、 多糖を構成する糖 （単糖） が決^:され る。 ついで、 この酸加水分解物を、 常法によりァ チル化し、 ガスクロマト グラフィ一で分析 （GC分析） することにより、 «成糖の組成 （構成 の比 率） 求められる。 さらに、 酸カ卩水分解物を常法によりメチル化して OC— MS (質量） などで分析することにより、 多糖の 合様式が決定される。 ま た、 NTMR分析により、 各単糖どうしの結合状態が明らかにされ、 ァ チル 基の 在も検出される。 多糖に結合しているピルビン酸は、 NADH 在下、 乳酸デヒ ドロゲナーゼによるピルビン酸の乳酸への還元を測定することによ り、 十生的かつ定量的に測定できる。 '
ビ 7イ ドバタテリゥム ロンガム J BL 05株 （N I TE B P- 8 2) が産 する多糖は、 以下の特徵を有する。
(1) 多糖の構成成分として、 ガラクトース、 グノレコース、 ラムノース、 お ょぴヒ。ルビン酸を含有し、 ガラクトースと、 グノレコースと、 ラムノースとを 4 : 2 : 1のモル比で含む。
(2) 多糖中のピルビン酸含有率は、 4〜 7質量0 /。である。
( 3 ) 分子量は、 T0Y0PEARL HW65Sによるゲルろ 51で約 20万〜 25 Ο万で ある。
(4) 比旋光度は、 約 +13 0° である。
(5) ァセチル基を含有する。
(6) 多糖は以下の式 （I) —で示される反復構造を含む。
β-D-Glcp 1
I
-→4 α-Ι θ3ΐ。·(1→4> -Ε 3 -(1→4 β-Ι 01ςρ·(1→3 α-] β3¾3·(1→3)-α(β Ι^Κ1ι¾7-(1·→ (I)
4
†
なお、 本発明の多糖の分子量は、 培養条件お び回収 '精製条件により変 化 1~る。 培養条件などにより分子量を調整することも可能である。 られた多糖は、 優れた免疫賦活活性および保湿能を有するため、 食品組 成物、 医薬品組成物、 化 ffi品組成物などの組^物として使用できる。 医薬品 組) ¾物としては、 本発明の多糖を含有する医案部外品組成物、 貼布斉 、 傷保 護斉【 救急絆創膏などの衛生材料も含まれる。
また、 本発明のビフィ ドバクテリゥム 口 ガム J BL 05株 （N" I TE B P-82) およびこの微生物を含む培養夜自体も製剤化して用 Vヽること が可能である。 この製剤が腸内に送達されると、 微生物が本発明の多糖を生 産 ~るので、 この製剤は、 免疫賦活剤などの医薬品、 あるいは免疫賦活活性 を^ rする食品などとして^ ij用される。 実施例
以下、 実施例を挙げて本発明を説明するが、 本発明がこれらの実進例に制 限されることはない。
(実施例 1 ：微生物の単離）
(培地の調製）
ビフィズス菌を単離する培地として、 BL寒天培地 （日水製薬株式会社） および B S寒天培地をィ 用した。 B L寒天培地は、 ォートクレーブで 1 1 5°C、 20分間滅菌し、 5%ゥマ血液を無菌 0勺に加え、 シャーレに分注して 平板として使用した。 B S寒天培地は、 以下 Οように調製した。 まず、 プロ ピ才ン酸ナトリウム 30 g、 硫酸パロモマイシン 1 0 Omg、 硫酸ネオマイ シン 40 Omg、 および 化リチウム 6 gを清製水で溶解し、 総量を 100 m 1 として、 B S寒天培: t也用添加液を調製し fe。 この B S寒天培地用添加液 5 O m 1を B L寒天培地 1 000m lに加え、 B S寒天培地を得た。 この B S寒天培地は、 シャ^ "レ ίこ分注して平板として使用した。 (微生物のスクリ一二ング）
ヒ ト糞便を滅菌水で溶解し、 上記の Bし寒天培地および B S寒;^培地に播 種し、 37°C、 48日寺間、 嫌気的に培養した。 平板上に生育した菌の集落性 状、 グラム染色標本の菌形態を観察し、 ビ-フィズス菌と思われる集落を 2枚 の B L寒天培地にそれぞれ分離した。一:^を 37 °C、 48時間、 織気的に培 養し、 残りの一方を 37°C、 48時間、 好気的に培養した。 嫌気 勺に生育し たコロニーのうち、 粘性物質を生産する浓 （微生物） を単離した。 得られた 微生物の生理学的および形態学的特徴は ir:記の通りであり、 ビフィドパクテ リウム ロンガム J B L 05株 （N I TE B P— 82) である と同定した。
(実施例 2 ：多糖の構造解析）
(培地の調製）
9質量％の脱脂季し溶液に、 パンクレア ン （天野ェンザィム株式会社） お ょぴシリコンをそ ぞれ終濃度が 0. 35質量％および 0. 01質量％とな るように加えた。 いで、 I ON Na OHで溶液の pHを 8に調整し、 5
5°Cで 4時間反応させて、 酵素分解脱脂 しを得た。 これに、 カノレチベータ (焼津水産化学工業株式会社） 、 ラタトース、 およびァスコルビン酸ナトリ ゥムを、 それぞれ終濃度で、 3. 0質量 ° 、 2. 5質量％、 および 0. 2質 量0 /0となるようにカロえ、 121 °C、 15分、 ォートクレーブで滅菌し、 液体 培地として使用しこ。
(多糖の精製）
上記で調製した液体培地を用いて前培養したビフイドパクテリ ゥム ロン ガム J BL05 （N I TE BP— 82) を、 1% (v/v ) となるよ うに同じ液体培地 ίこ接種し、 37° ( 、 4〇時間静置嫌気培養を疗い、 粘性物 質を生産させた。 培養液を遠心分離し、 菌体を除去した後、 上? Τに終濃度 2 0%となるようエタノールを加え、 4°Cで静置保存した。 一晩 置後、 遠心 によりタンパク質を含む沈澱物を除去し、 上清に終濃度 50% となるようェ タノールを加え、 4°Cで静置保存した。 一晚静置後、 遠心によ り沈澱物を回 収し、 粗精製多糖画分を得、 凍結乾燥して保存した。
この粗精製多糖画分を、 DEAE S e p h a d e x A— 50充填カラ ムを用いてさら【こ分画し、 0. 07M〜0. 5Mの N a C 1で溶出された画 分を精製多糖画分とした。
(分子量の測定）
TOYOPEARL HW653充 カラムを用いて、 この精製多糖画分 についてゲルろ iiiを行ったところ、 多修の分子量は約 80万であった。 なお、 この分子量は培養条件、 回収条件 ·精挺条件により変化し、 回の繰り返し 実験で、 約 20〜250万の間の分子 を有する多糖が得ら た。 このこと から、 培養条件、 回収条件、 精製条件などにより、 分子量を調整することも 可能であると思われる。
(比旋光度の浅 U定）
日本分光 D I P- 360型デジタル； ^光計を用いて測定しここの多糖の比 旋光度は、 約 + 1 30° であった。
(成分分析）
次に、 得られた多糖に蟻酸を加え、 カロ水分解した。 この加フ i 分解液を減圧 乾固後、 さらに トリフルォロ酢酸を加えて加水分解し、 加水分解生成物を得 た。 I ON— 3 00カラム （東京化成！:業株式会社） を用い：ヒ HPLC分析 により、 この多凝が、 ガラクトース、 グルコース、 ラムノース、 ピノレビン酸 から構成されることがわかった。
この加水分解 成物を常法により水泰化ホウ素ナトリゥムで還元し、 無水 酢酸とピリジンを加えてァセチル化し广こものを、 R— 225 ラム （J &W
S c i e n t i f i c) を用いて GC分析した。 その結果、 この多糖を構 成するガラク トースと、 グルコースと、 ラムノースとのモル]:匕は 4 : 2 : 1 であることがわかった。
上記加; 分解生成物に、 NADHの存在下、 乳酸デヒ " Kロゲナーゼを作用 させたところ、 乳酸が生じた。 従って、 この多糖画分にピルビン酸が存在す ることが痕認された。 また、 多糖中のピルビン酸含有率【 、 4〜7質量0 /0で あった。
(構造解析）
多糖の,洁合様式を明らかにする こめ、 メチル化して分析を行つた。 上記加 水分解生成物を常法によりメチルイ匕した。 各メチル化単糖を GC—MS (質 量） 分析 ίこかけ、 解析した。 その結果、 1， 5—ジー〇一ァセチルー 2, 3, 4, 6—テトラー 0—メチノレ一グノレシトール、 1 , 5—ジー Ο—ァセチルー 2, 3, 4 , 6ーテトラー 0-メチノレーガラクチトール、 1 , 3 , 4， 5一 テトラ一 Ο—ァセチルー 2, 6—ジ一 Ο-メチルーラム-トール、 1， 3， 5—トリ一 Ο—ァセチルー 2, 4 , 6—トリー 0-メチ レーガラクチトーノレ、 1 , 4, 5—トリー Ο—ァセチノレー 2 , 3， 6 _トリー Ο—メチノレーグルシ トール、 1 , 4, 5—トリー Ο—ァセチ/レ一 2， 3， 6 —トリ一 Ο—メチル ーガラクチトール、 および 1, 4, 5, 6—テトラ— Ο—ァセチルー 2, 3 —ジー Ο-メチルーガラクチトールのメチル化された糖 得られた。
また、 NMR分析により、 結合^:態を検討した。 これらのデータから、 本 発明の多糖は、 以下の構造 I (反復構造） を有することがわかった。
β-D-Glc 1
i
→4)-α-1 α -(1→4)-α-0-σ ·(1~4)-β"0-01(;ρ-(1→3)-α-] Ο -(1·→3)-α(β)^Κ1ι^-(1→ (I)
4
†
^-D-Galp 1 なお、 NMR解析により、 ァセチル基が検出された。 (実施 ί列 3 ：多糖の培養生産） 実施例 2で調製した酵素分解脱脂轧に、 ァスコルビン酸ナトリウムを終濞 度が 0. 2質量0 /0となるように力 Πえ、 1 2 1°C、 1 5分間、 オートクレーフ で殺菌し、 液体培地を調製した。 これと同じ液体培 ±feで前培養したビフィ バタテリ ゥム ロンガム J B L 0 5株 （N I TE B P— 8 2) の培養液 ¾r、 1 % (ν ^ν) となるように上首己調製した液体培地に接種し、 微速撹拌下、 ρΗ6. 0にコントロールしながら、 3 7 °Cにて 4 0時間、 嫌気的に培養 行った。 pHのコントロールには、 I ON NaOH:を使用した。 なお、 置嫌気; tき養を行った場合を比較例とした。
図 1に培養時間と培養液の粘度との関係を示す。 静置嫌気培養を行った暴 合と比狡すると、 pHを調整しつつ培養した場合は、 粘度は 20時間以降力 ら急激に增加し、 本発明の多修が効率よく生産され广こ。 なお、 粘度は TV B 一 10开 粘度計 （東機産業株 会社） を用い、 ロー ー THM1を使用し、 1 5°C、 回転数 5 0 r pmで !]定した時の値である。 (実 ¾例 4 ：粗精製多糖画分の免疫賦活マクロフ 一ジ活性化作用 ) 実施河 2で調製した粗精製多糖画分の免疫暉活作用を以下のようにして则 定した。 1 2週齢の d d Y系維性マウス （紀和実験動物研究所） の腹腔内 ίこ 4% (^/v) T G C培地 （日水製薬株式会社） を 2 m 1注入し、 4日後、 1 2m 1 の冷 PB Sを用いて厦腔内を洗浄し、 洗浄核を回収した。 この液 、 4°C、 1 0 0 0 0 r pm、 1 O分間遠心し、 上清を除去して腹腔滲出細胞を 得た。 記細胞を、 1 0%F C S (インビトロジェン株式会社） 、 ぺニシ ン0、 およびストレプトマイ、ンンを含む RPMI 1 6 4 0培地 （S I
-ALDR I CH) に懸濁し、 9 6穴プレートに 5 X 1 05cells/wellとな るよう播種し、 5%C02存在下、 3 7 °Cにて培養した。 培養開始 1時間後、 培地を除去し、 次いで、 実施 ί ϋ 2で得られた粗精製多糖画分をそれぞれ g/m 1、 3 μ g/m 1、 1 O g/m 1、 30 μ g Zm 1、 および 10 O £ノ111 1含む1 ? 1 1 640培地 200 1に添加し、 5%C〇 2存在 下、 37°Cにて 4時間または 20時間培養しこ。 4時間培養後の培養上清は、 マク 口ファージ活性ィ匕の 旨標として以下の TNTF—ひ濃度測定に用い、 20 時間培養後の培養上清は、 以下の亜硝酸塩 （Nitrite) 濃度測定に用いブこ。
T N F— 濃度の測定は、 TNF- α感受†feマウス繊維芽細胞 （ L 929 細胞、 大日本製薬株式会ネ土） を用いて以下の うに行った。 96穴プレート の备ゥエルに L 929細月包を 4. 0 X 104cells/wellとなるよう播種し、 5° C02存在下、 37 °Cにて 5時間培養しナこ。 培養後、 培地を除去し、 次 いで 1. 5 μ g/m 1ァクチノマイシン Dを含む RPM 1 1640培地 50 β 1 を添加し、 さらに上言己の 4時間培養後の 養上清を 1 00 μ 1ずつ加え た。 なお、 TNF— α標準として、 この培養 ±Τ清の代わりに、 RPMュ 1 6 40培地に TNF— α ( S I GMA-ALDR. I CH) を種々の濃度" C溶解 し fこ溶液を 1 00 μ 1 Zwellの割合で添加した。 次いで、 5%C02存在下、 37 °Cにて 20時間培養し、 さらに、 終濃度力 0. 5mgZmlとなるよう 3― (4， 5一ジメチノレ― 2—チアゾリル) ― 2, 5—ジフエエル一 2 Hテ トヲゾリゥムブロマイ ド （和光純薬工業株式会社） を加え、 5%C02存在 下、 3 7 °Cにて 4時間培養した。 その後、 培 を除去し、 0. 04N 酸を 含むイソプロパノールを 1 00 1加え、 1 O分間程度振動させながらホル マザンを溶解した後、 5 62 nm (参照波長 6 60 nm) の吸光度を 』定し た。 TNF— α標準から得られた検量線を用レヽて、 TNF—ひ濃度を算出し た。 有意差検定は、 Dunnettの多重比較検定 用い、 有意水準を pく 0· 0 5および ρく 0. 01と して行った。 結果を^ 12に示す。
硝酸塩濃度の測定は、 上記 20時間培養後の培養上清を 96穴プ ート に 5 0 /ζ 1ずつ入れ、 これにグリース試薬を 50 /i 1ずつ添加し、 暗 0?にて 室温 1 0分間反応させ、 その後、 562 nm (参照波長 660 nm) 吸光 度を測定することにより行った。 なお、 検量線は、 培養上清の代わりに、' R PM I 1640培地に亜硝酸ナトリウム （和光純薬工業株式会 it) を種々の 濃度で溶解した溶夜を用いたこと以外は、 上記と同様に操作して吸光度を測 定することにより ί乍成した。 この検量線 用いて、 亜硝酸塩の農度を算出し た。 有意差検定は、 Dunnettの多重比較検定を用い、 有意水準 ¾rp < 0. 0 1として行った。 結果を図 3に示す。
図 2および図 3 ίこ示すように、 実施例 2で得られた粗精製多磨画分につい てマクロファージの活性化作用が認めら た。
(実施例 5 ：精媒多糖画分の免疫賦活 クロファージ活性化 用） 凍結乾燥粗精製多糖画分の代わりに、 実施例 2の力ラムで精製した精製多 糖画分の凍結乾燥物を用いたこと以外は、 実施例 4と同様にして、 TNF- «濃度および亜硝酸塩濃度の測定を行つ fこ。 その結果、 この精製多糖画分に ついてもマクロファージの活性化作用が慰められた。 結果を図 4および 5に 示す。
(実施例 6 ：多磨の保湿作用）
実施例 2で調製した凍結乾燥粗精製多德画分を 1 m g Zm 1 ( 濃度に調製 し、 その保湿能力を 20代女性 1 0名の _t腕内側の水分蒸散量変化により確 露した。 被験部位【こ 2 c mの間隔で 2 X 2 c mの大きさの印をつけ、 サンプ ノレ塗布前の水分蒸散量 （TEWL) を測定した。 上記粗精製多嬉画分および コントロールとしての蒸留水を各 20/2しずつガラス棒で広げて塗布し、 4 5、 90、 150、 210分後の TEWLを測定した。 測定に【ま、 水分蒸散 量測定装置 （モパイル テヴァメーター MSC 100) を使厢した。 21 0分後のそれぞれの水分蒸散量を、 図 6〖こ示す。 粗精製多糖画分の水分蒸散 量は、 蒸留水に比べて少なく、 保湿効果力 認められた。 産業上の禾 U用可能性
本発明の多糖は、 保湿作用、 免疫賦活作用を有する新規多糖である。 こ o 多糖はヒ トの腸内に生息する微 物から単離されたビフィ ドパクテリゥム ロンガムから生産され、 食品組成物、 化粧品組成物、 医薬品組成物などの原 料として、 産業上有用である。

Claims

請求の範匿
1. 構成成分として、 ガラクトース、 グルコース、 ラムノース、 およびピル ビン酸を含有する多糖であって、 該ガラク トースと、 該グルコースと、 該ラ ムノースとを 4 ： 2 ： ： Lのモル比で含み、 力つピルビン酸を 4〜 7質量％含 む、 多糖。
2. 以下の式 （I) の搏造を含む、 請求項 1に記載の多糖。
β-D-Glqp 1
1
6
→4)-α-Ε 3 -(1→4 α-Ι ·θ32ρ-(1"→4)-β-Γ }1φ·{1→3>-(χ-Ι α ·(1→3)-α(β)-ί-Κ1ι¾7— (1→
4
†
β-D-Galp 1
3. 請求項 1または 2に記載の多糖の製造方法であって、 該多糖 産生する "f 力を有するビフィド z クテリゥム属に属する微生物を培養する: X程、 およ'' び該微生物により生産された多糖を回収する工程を含む、 方法。
4. 前記微生物がビフイ ドパクテリゥム ンガム (Bifidobacterium long um) J BL05株 （N I TE BP— 82) である、 請求項 3に言己載の方法。
5. ビフイ ドパクテリクム 口ンガム (Bifidobacterium longum) J B L 0 5株 (N I TE BP— 82) 。
6. 請求項 1または 2の多糖を含有する組成物。
7. 前記組成物が、 食品組成物、 化粧品組减物または医薬品組成 である、 請求項 6に言己載の組成物。
8. 前記食品組成物または医薬品組成物が免疫賦活剤である、 請求項 7に fE 載の組成物。
9 · 前記化 品組成物が保湿剤である請求項 7に記載 組成物。
1 0. ビフイ ドパクテリゥム ロンガム (Bifidobacterium longum) J B L 05株 （N I TE BP— 82) を含む、 製剤。
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