JP5192808B2 - ビフィドバクテリウム属の微生物が産生する多糖 - Google Patents
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Description
一方、菌体外多糖の免疫機能賦活作用については、ストレプトコッカスラクチス(Streptococcus lactis)もしくはストレプトコッカス クレモリス(Streptococcus cremoris)が産生する多糖を有効成分とする抗腫瘍剤(特許第2678673号公報)、ラクトコッカス ラクチス サブスピーシス クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)やラクトコッカス ラクチス サブスピーシス ラクチス(Lactococcus lactis subsp.lactis)の粘着性夾膜多糖類の抗腫瘍活性(特開平1−277484号公報)、ラクトバチルス属微生物の培養液から得られる多糖を有効成分とする抗炎症剤あるいは骨髄細胞増殖促進剤(特開平7−70209号公報)、ラクトバチルス デルブルエッキー サブスピーシス ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)が産生するリン含有多糖類の自己免疫疾患予防効果(特許第3017493号公報)などが報告されている。しかし、これらはいずれもヨーグルトや発酵乳から分離された乳酸菌が産生する多糖に関するものである。
元来、ヒトの腸内細菌叢において、ビフィドバクテリウム属微生物の存在菌数は、乳酸菌の存在菌数より多く、腸内に存在していたビフィドバクテリウム属微生物が産生する多糖は何らかの生体防御機能を有すると思われる。しかしながら、これらビフィドバクテリウム属微生物が産生する多糖については、ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)が産生するグルコースのみからなる多糖類(特開平7−255465号公報)、ビフィドバクテリウム ロンガムが産生するグルコース、ガラクトース、ウロン酸などからなる多糖類(Appl.Microbiol.Biotechnol.43巻、995−1000頁)などが報告されるのみであり、さらにこれらの機能については明確でない。
本発明者らは、ヒトの腸内に存在する高粘性物質を産生するビフィドバクテリウム属微生物について鋭意研究したところ、ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)が培養液中に多量の粘性物質を産生すること、この粘性物質が新規多糖であること、そして、この新規多糖が保湿作用、免疫賦活作用などの機能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、新規多糖を提供し、この多糖は構成成分として、ガラクトース、グルコース、ラムノース、およびピルビン酸を含有し、該ガラクトースと、該グルコースと、該ラムノースとを4:2:1のモル比で含み、かつピルビン酸を4〜7質量%含む。
一つの態様では、本発明の多糖は、以下の式(I)の構造を含む。
また、本発明は、上記多糖の製造方法であって、この多糖を産生する能力を有するビフィドバクテリウム属に属する微生物を培養する工程、および該微生物により生産された多糖を回収する工程を含む方法を提供する。
一つの実施態様では、上記微生物がビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)JBL05株(NITE BP−82)である。
また、本発明は、ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)JBL05株(NITE BP−82)を提供する。
さらに本発明は、上記多糖を含有する組成物を提供し、一つの実施態様では上記組成物が、食品組成物、化粧品組成物または医薬品組成物である。
別の実施態様では、上記食品組成物または医薬品組成物が免疫賦活剤であり、上記化粧品組成物が保湿剤である。
また、別の本発明は、ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)JBL05株(NITE BP−82)を含む製剤を提供する。
本発明により、保湿作用、免疫賦活作用を有する新規多糖が提供される。この多糖は、食品組成物、化粧品組成物、医薬品組成物などの原料として用いられる。また、ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)およびこの微生物を含む培養液も製剤化され、免疫賦活剤などの医薬品、あるいは免疫賦活活性を有する食品などとして利用される。さらに、ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)およびこの菌体破砕物(破砕液)も製剤化され、化粧品組成物などとして利用される。
図2は、本発明の多糖のTNF−α産生促進効果を示すグラフである。
図3は、本発明の多糖の亜硝酸塩(Nitrite)産生促進効果を示すグラフである。
図4は、本発明の多糖のTNF−α産生促進効果を示すグラフである。
図5は、本発明の多糖の亜硝酸塩(Nitrite)産生促進効果を示すグラフである。
図6は、本発明の多糖の保湿効果を示すグラフである。
で表される反復構造を含んでいる。このような構造を有する多糖は、ヒトの腸内から単離されたビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)から、生産される。
本発明に用いる微生物として、ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)が例示されるが、この微生物以外の微生物も使用できる。例えば、腸内細菌を分離し、微生物の周囲に夾膜状の多糖を生産する株を選択し、多糖を分析することにより得られる。このようなスクリーニング方法で得られたビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)の菌学的性質は以下の表1の通りである。
本発明の多糖は、ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)を適切な培地で培養することにより得られる。培地としては、ビフィドバクテリウム属の微生物が利用できる炭素源および窒素源並びに必要に応じて、システイン塩酸塩、アスコルビン酸ナトリウム、微量の無機塩などを含む培地が使用される。特に、多量の多糖産生には、脱脂乳または乳成分を含む培地を使用することが好ましい。この場合、脱脂乳をプロテアーゼなどの酵素で分解した酵素分解脱脂乳に、カルチベータ(焼津水産化学工業株式会社)、ラクトース、アスコルビン酸ナトリウムなどを加えた培地が好ましく使用できる。
上記培地を用い、ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)を、培養温度20〜40℃、嫌気条件下、撹拌あるいは静置して、16〜60時間、pHを4〜7、好ましくは5〜6に制御しながら培養を行うことにより、培養液中に粘性物質が産生される。
得られた培養液からの多糖の回収には、加熱、酵素処理、遠心、ろ過などの、当業者が通常、培養液から目的物質を回収する方法が用いられる。例えば、粘性物質(多糖)および微生物菌体を含む培養液を遠心し、菌体を除去する。培養液の粘度が高い場合は、例えば、水で希釈した後遠心することにより、菌体を除去することができる。次いで、得られた上清に適切な有機溶媒を加えてタンパク質を析出させ、例えば遠心分離によって沈殿を除去し、さらに有機溶媒を添加して多糖を沈殿させ、そして遠心分離などにより、多糖を回収する。詳細には、菌体を除去した上清に、終濃度が20容量%となるようにエタノールを添加し、遠心分離を行ってタンパク質を含む沈殿物を除去し、さらに終濃度が50容量%となるようにエタノールを添加し、遠心分離を行って沈殿物を回収することにより、粗精製多糖が得られる。
あるいは、有機溶剤とカチオンとを組み合わせて多糖を回収する方法を用いてもよい。例えば、1価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法、2価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法(特開昭58−5301号公報)、3価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法(特開昭59−196099号公報)などと同様の方法を用いることもできる。カチオンは、多糖の回収率を高める点から、好ましく用いられる。1価カチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどが用いられる。2価カチオンとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどが用いられる。3価カチオンとしては、アルミニウムイオンなどが用いられる。これらのカチオンをエタノールなどの有機溶剤とともに、多糖が含まれる粘性溶液に添加することにより、より多くの多糖を回収することができる。2価あるいは3価のカチオンを用いる方が、1価のカチオンを用いた場合よりも多糖の回収率を高めることが可能である。
得られた粗精製多糖からの多糖の精製は、当業者が通常行う方法、例えば、イオン交換樹脂を用いる分画、ゲルろ過による分画などを単独あるいは組み合わせて行われる。イオン交換樹脂を用いる方法に特に制限はなく、例えば、陰イオン交換樹脂(例えば、商品名DEAE Sephadex A−50(ファルマシア社)など)に多糖を吸着させ、塩化ナトリウムのグラディエントをかけて多糖を溶出させ、ついで、商品名TOYOPEARL HW65S(東ソー株式会社)などを用いてゲルろ過する方法などが挙げられる。ゲルろ過による精製では、分子量も測定できる。
多糖の構造は以下のような方法で決定される。まず、精製した多糖を、例えば、蟻酸、希塩酸、トリフルオロ酢酸などで酸加水分解し、この加水分解物をHPLCで分析することにより、多糖を構成する糖(単糖)が決定される。ついで、この酸加水分解物を、常法によりアセチル化し、ガスクロマトグラフィーで分析(GC分析)することにより、構成糖の組成(構成糖の比率)が求められる。さらに、酸加水分解物を常法によりメチル化してGC−MS(質量)などで分析することにより、多糖の結合様式が決定される。また、NMR分析により、各単糖どうしの結合状態が明らかにされ、アセチル基の存在も検出される。多糖に結合しているピルビン酸は、NADH存在下、乳酸デヒドロゲナーゼによるピルビン酸の乳酸への還元を測定することにより、定性的かつ定量的に測定できる。
ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)が産生する多糖は、以下の特徴を有する。
(1)多糖の構成成分として、ガラクトース、グルコース、ラムノース、およびピルビン酸を含有し、ガラクトースと、グルコースと、ラムノースとを4:2:1のモル比で含む。
(2)多糖中のピルビン酸含有率は、4〜7質量%である。
(3)分子量は、TOYOPEARL HW65Sによるゲルろ過で約20万〜250万である。
(4)比旋光度は、約+130°である。
(5)アセチル基を含有する。
(6)多糖は以下の式(I)で示される反復構造を含む。
なお、本発明の多糖の分子量は、培養条件および回収・精製条件により変化する。培養条件などにより分子量を調整することも可能である。
得られた多糖は、優れた免疫賦活活性および保湿能を有するため、食品組成物、医薬品組成物、化粧品組成物などの組成物として使用できる。医薬品組成物としては、本発明の多糖を含有する医薬部外品組成物、貼布剤、傷保護剤、救急絆創膏などの衛生材料も含まれる。
また、本発明のビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)およびこの微生物を含む培養液自体も製剤化して用いることが可能である。この製剤が腸内に送達されると、微生物が本発明の多糖を生産するので、この製剤は、免疫賦活剤などの医薬品、あるいは免疫賦活活性を有する食品などとして利用される。
[実施例1:微生物の単離]
(培地の調製)
ビフィズス菌を単離する培地として、BL寒天培地(日水製薬株式会社)およびBS寒天培地を使用した。BL寒天培地は、オートクレーブで115℃、20分間滅菌し、5%ウマ血液を無菌的に加え、シャーレに分注して平板として使用した。BS寒天培地は、以下のように調製した。まず、プロピオン酸ナトリウム30g、硫酸パロモマイシン100mg、硫酸ネオマイシン400mg、および塩化リチウム6gを精製水で溶解し、総量を100mlとして、BS寒天培地用添加液を調製した。このBS寒天培地用添加液50mlをBL寒天培地1000mlに加え、BS寒天培地を得た。このBS寒天培地は、シャーレに分注して平板として使用した。
(微生物のスクリーニング)
ヒト糞便を滅菌水で溶解し、上記のBL寒天培地およびBS寒天培地に播種し、37℃、48時間、嫌気的に培養した。平板上に生育した菌の集落性状、グラム染色標本の菌形態を観察し、ビフィズス菌と思われる集落を2枚のBL寒天培地にそれぞれ分離した。一方を37℃、48時間、嫌気的に培養し、残りの一方を37℃、48時間、好気的に培養した。嫌気的に生育したコロニーのうち、粘性物質を生産する株(微生物)を単離した。得られた微生物の生理学的および形態学的特徴は上記の通りであり、ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)であると同定した。
[実施例2:多糖の構造解析]
(培地の調製)
9質量%の脱脂乳溶液に、パンクレアチン(天野エンザイム株式会社)およびシリコンをそれぞれ終濃度が0.36質量%および0.01質量%となるように加えた。次いで、10N NaOHで溶液のpHを8に調整し、55℃で4時間反応させて、酵素分解脱脂乳を得た。これに、カルチベータ(焼津水産化学工業株式会社)、ラクトース、およびアスコルビン酸ナトリウムを、それぞれ終濃度で、3.0質量%、2.5質量%、および0.2質量%となるように加え、121℃、15分、オートクレーブで滅菌し、液体培地として使用した。
(多糖の精製)
上記で調製した液体培地を用いて前培養したビフィドバクテリウム ロンガム JBL05株(NITE BP−82)を、1%(v/v)となるように同じ液体培地に接種し、37℃、40時間静置嫌気培養を行い、粘性物質を生産させた。培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、上清に終濃度20%となるようエタノールを加え、4℃で静置保存した。一晩静置後、遠心によりタンパク質を含む沈澱物を除去し、上清に終濃度50%となるようエタノールを加え、4℃で静置保存した。一晩静置後、遠心により沈澱物を回収し、粗精製多糖画分を得、凍結乾燥して保存した。
この粗精製多糖画分を、DEAE Sephadex A−50充填カラムを用いてさらに分画し、0.07M〜0.5MのNaClで溶出された画分を精製多糖画分とした。
(分子量の測定)
TOYOPEARL HW65S充填カラムを用いて、この精製多糖画分についてゲルろ過を行ったところ、多糖の分子量は約80万であった。なお、この分子量は培養条件、回収条件・精製条件により変化し、数回の繰り返し実験で、約20〜250万の間の分子量を有する多糖が得られた。このことから、培養条件、回収条件、精製条件などにより、分子量を調整することも可能であると思われる。
(比旋光度の測定)
日本分光DIP−360型デジタル旋光計を用いて測定したこの多糖の比旋光度は、約+130°であった。
(成分分析)
次に、得られた多糖に蟻酸を加え、加水分解した。この加水分解液を減圧乾固後、さらにトリフルオロ酢酸を加えて加水分解し、加水分解生成物を得た。ION−300カラム(東京化成工業株式会社)を用いたHPLC分析により、この多糖が、ガラクトース、グルコース、ラムノース、ピルビン酸から構成されることがわかった。
この加水分解生成物を常法により水素化ホウ素ナトリウムで還元し、無水酢酸とピリジンを加えてアセチル化したものを、R−225カラム(J&W Scientific)を用いてGC分析した。その結果、この多糖を構成するガラクトースと、グルコースと、ラムノースとのモル比は4:2:1であることがわかった。
上記加水分解生成物に、NADHの存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させたところ、乳酸が生じた。従って、この多糖画分にピルビン酸が存在することが確認された。また、多糖中のピルビン酸含有率は、4〜7質量%であった。
(構造解析)
多糖の結合様式を明らかにするため、メチル化して分析を行った。上記加水分解生成物を常法によりメチル化した。各メチル化単糖をGC−MS(質量)分析にかけ、解析した。その結果、1,5−ジ−O−アセチル−2,3,4,6−テトラ−O−メチル−グルシトール、1,5−ジ−O−アセチル−2,3,4,6−テトラ−O−メチル−ガラクチトール、1,3,4,5−テトラ−O−アセチル−2,6−ジ−O−メチル−ラムニトール、1,3,5−トリ−O−アセチル−2,4,6−トリ−O−メチル−ガラクチトール、1,4,5−トリ−O−アセチル−2,3,6−トリ−O−メチル−グルシトール、1,4,5−トリ−O−アセチル−2,3,6−トリ−O−メチル−ガラクチトール、および1,4,5,6−テトラ−O−アセチル−2,3−ジ−O−メチル−ガラクチトールのメチル化された糖が得られた。
また、NMR分析により、結合状態を検討した。これらのデータから、本発明の多糖は、以下の構造I(反復構造)を有することがわかった。
なお、NMR解析により、アセチル基が検出された。
[実施例3:多糖の培養生産]
実施例2で調製した酵素分解脱脂乳に、アスコルビン酸ナトリウムを終濃度が0.2質量%となるように加え、121℃、15分間、オートクレーブで殺菌し、液体培地を調製した。これと同じ液体培地で前培養したビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)の培養液を、1%(v/v)となるように上記調製した液体培地に接種し、微速撹拌下、pH6.0にコントロールしながら、37℃にて40時間、嫌気的に培養を行った。pHのコントロールには、10N NaOHを使用した。なお、静置嫌気培養を行った場合を比較例とした。
図1に培養時間と培養液の粘度との関係を示す。静置嫌気培養を行った場合と比較すると、pHを調整しつつ培養した場合は、粘度は20時間以降から急激に増加し、本発明の多糖が効率よく生産された。なお、粘度はTVB−10形粘度計(東機産業株式会社)を用い、ローターTHM1を使用し、15℃、回転数50rpmで測定した時の値である。
[実施例4:粗精製多糖画分の免疫賦活マクロファージ活性化作用]
実施例2で調製した粗精製多糖画分の免疫賦活作用を以下のようにして測定した。12週齢のddY系雄性マウス(紀和実験動物研究所)の腹腔内に4%(w/v)TGC培地(日水製薬株式会社)を2ml注入し、4日後、12mlの冷PBSを用いて腹腔内を洗浄し、洗浄液を回収した。この液を、4℃、10000rpm、10分間遠心し、上清を除去して腹腔滲出細胞を得た。上記細胞を、10%FCS(インビトロジェン株式会社)、ペニシリンG、およびストレプトマイシンを含むRPMI1640培地(SIGMA−ALDRICH)に懸濁し、96穴プレートに5×105cells/wellとなるよう播種し、5%CO2存在下、37℃にて培養した。培養開始1時間後、培地を除去し、次いで、実施例2で得られた粗精製多糖画分をそれぞれ0μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、および100μg/ml含むRPMI1640培地200μlに添加し、5%CO2存在下、37℃にて4時間または20時間培養した。4時間培養後の培養上清は、マクロファージ活性化の指標として以下のTNF−α濃度測定に用い、20時間培養後の培養上清は、以下の亜硝酸塩(Nitrite)濃度測定に用いた。
TNF−α濃度の測定は、TNF−α感受性マウス繊維芽細胞(L929細胞、大日本製薬株式会社)を用いて以下のように行った。96穴プレートの各ウエルにL929細胞を4.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2存在下、37℃にて5時間培養した。培養後、培地を除去し、次いで1.5μg/mlアクチノマイシンDを含むRPMI1640培地50μlを添加し、さらに上記の4時間培養後の培養上清を100μlずつ加えた。なお、TNF−α標準として、この培養上清の代わりに、RPMI1640培地にTNF−α(SIGMA−ALDRICH)を種々の濃度で溶解した溶液を100μl/wellの割合で添加した。次いで、5%CO2存在下、37℃にて20時間培養し、さらに、終濃度が0.5mg/mlとなるよう3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2Hテトラゾリウムブロマイド(和光純薬工業株式会社)を加え、5%CO2存在下、37℃にて4時間培養した。その後、培地を除去し、0.04N塩酸を含むイソプロパノールを100μl加え、10分間程度振動させながらホルマザンを溶解した後、562nm(参照波長660nm)の吸光度を測定した。TNF−α標準から得られた検量線を用いて、TNF−α濃度を算出した。有意差検定は、Dunnettの多重比較検定を用い、有意水準をp<0.05およびp<0.01として行った。結果を図2に示す。
亜硝酸塩濃度の測定は、上記20時間培養後の培養上清を96穴プレートに50μlずつ入れ、これにグリース試薬を50μlずつ添加し、暗所にて室温10分間反応させ、その後、562nm(参照波長660nm)の吸光度を測定することにより行った。なお、検量線は、培養上清の代わりに、RPMI1640培地に亜硝酸ナトリウム(和光純薬工業株式会社)を種々の濃度で溶解した溶液を用いたこと以外は、上記と同様に操作して吸光度を測定することにより作成した。この検量線を用いて、亜硝酸塩の濃度を算出した。有意差検定は、Dunnettの多重比較検定を用い、有意水準をp<0.01として行った。結果を図3に示す。
図2および図3に示すように、実施例2で得られた粗精製多糖画分についてマクロファージの活性化作用が認められた。
[実施例5:精製多糖画分の免疫賦活マクロファージ活性化作用]
凍結乾燥粗精製多糖画分の代わりに、実施例2のカラムで精製した精製多糖画分の凍結乾燥物を用いたこと以外は、実施例4と同様にして、TNF−α濃度および亜硝酸塩濃度の測定を行った。その結果、この精製多糖画分についてもマクロファージの活性化作用が認められた。結果を図4および5に示す。
[実施例6:多糖の保湿作用]
実施例2で調製した凍結乾燥粗精製多糖画分を1mg/mlの濃度に調製し、その保湿能力を20代女性10名の上腕内側の水分蒸散量変化により確認した。被験部位に2cmの間隔で2×2cmの大きさの印をつけ、サンプル塗布前の水分蒸散量(TEWL)を測定した。上記粗精製多糖画分およびコントロールとしての蒸留水を各20μLずつガラス棒で広げて塗布し、45、90、150、210分後のTEWLを測定した。測定には、水分蒸散量測定装置(モバイル テヴァメーター MSC100)を使用した。210分後のそれぞれの水分蒸散量を、図6に示す。粗精製多糖画分の水分蒸散量は、蒸留水に比べて少なく、保湿効果が認められた。
Claims (8)
- 請求項1に記載の多糖の製造方法であって、該多糖を産生する能力を有するビフィドバクテリウム属に属する微生物を培養する工程、および該微生物により生産された多糖を回収する工程を含む、方法。
- 前記微生物がビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)である、請求項2に記載の方法。
- ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)。
- 請求項1に記載の多糖を含有する、食品組成物、化粧品組成物または医薬品組成物。
- 前記食品組成物または医薬品組成物が免疫賦活剤である、請求項5に記載の組成物。
- 前記化粧品組成物が保湿剤である、請求項5に記載の組成物。
- ビフィドバクテリウム ロンガムJBL05株(NITE BP−82)を含む、製剤。
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