JPH07330806A - 中性多糖体及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ビフィドバクテリウム属に属する微生物の細
胞壁から単離される顆粒球誘導作用を有する新規な中性
多糖体及び該中性多糖体を有効成分とする顆粒球誘導剤
を提供する。 【構成】 ビフィドバクテリウム属に属する微生物の細
胞壁及び／又は細胞壁破砕物から単離され、β−ガラク
トピラノシドとα−ガラクトフラノシドから成る１−３
ガラクタンを主鎖とし、β−ガラクトピラノシド５残基
につき４残基の割合、及びα−ガラクトフラノシド３残
基につき１残基の割合でβ−グルコピラノシドが１−６
結合した側鎖を有し、平均分子量９，４００ダルトン等
の理化学的性質を有する中性多糖体、及び該中性多糖体
を有効成分として含有する顆粒球誘導剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、顆粒球誘導効果を有す
る新規な中性多糖体及び該中性多糖体を有効成分とする
顆粒球誘導剤に関する。更に詳しくは、本発明は、ビフ
ィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微生物
（以下ビフィズス菌と記載することがある）の細胞壁か
ら単離され、顆粒球誘導作用を有する新規な中性多糖体
及び該中性多糖体を有効成分とする顆粒球誘導剤に関す
る。本明細書において、百分率は、特に断りのない限
り、重量による値である。

【０００２】

【従来の技術】グラム陽性細菌の細胞壁を構成する多糖
としては、テイコ酸 (teichoic acid)、テイクロン酸(t
eichuronic acid)、莢膜多糖(capsular polysaccharid
e) 等が知られている（今堀和友・山川民夫監修、「生
化学辞典」、第２版、第８６５ページ、１９９０年）。
ビフィドバクテリウム属に属する微生物の細胞壁を構成
する多糖においても、従来、テイコ酸様ポリマーの構造
［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(European Journal of Biochemistry)，第１６５巻，
第６４７〜６５２ページ，１９８７年及びジャーナル・
オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriology) ，
第１７２巻，第８４５〜８５２ページ，１９９０年］、
中性多糖の構造［ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(Journal of Biochemistry) ，第１０２巻，第１４２
３〜１４３２ページ，１９８７年及びジャーナル・オブ
・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry) ，第
１０３巻，第６１８〜６２１ページ，１９８８年］が報
告されているが、ガラクトフラノシドを構成成分とする
中性多糖類に関する報告は皆無である。

【０００３】ガラクトフラノシドは、真菌由来の糖鎖中
に存在することは知られているが［グリココンジュゲー
ト・ジャーナル(Glycoconjugate Journal)，第９巻、第
２２９〜２３４ページ，１９９２年］、ガラクトースポ
リマーとしては存在せず、グラム陽性菌の中性多糖類に
おける存在も知られていない。

【０００４】一方、ビフィズス菌は、ヒト腸内常在菌で
あり、腸内菌叢におけるビフィズス菌の割合を適度に保
持することがヒトの健康にとって重要であることが知ら
れている（本間道・光岡知足共編、「ビフィズス菌」、
第１１０〜１４３ページ、１９７８年）。更に、ビフィ
ズス菌の細胞壁そのもの及び細胞壁破砕物が、制がん作
用を有することは既に知られているが［特公昭５６−４
２２７１号公報、特公昭６２−３６００６号公報（これ
らの公報のものは、本発明者らの発明に係るものであ
る）及びキャンサー・リサーチ(Cancer Research) ，第
４５巻、第１３００〜１３０７ページ，１９８５年］、
その他の生理作用については知られていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな状況の中で、ビフィズス菌の細胞壁破砕物の中に存
在する生理活性作用を有する物質について鋭意研究を行
った結果、ビフィズス菌の表層物質が生理活性に重要な
役割を果たしていることを発見し、更に、ビフィズス菌
の細胞壁破砕物の中に存在する特定の理化学的性状を有
する中性多糖体が、顆粒球誘導作用を呈することを見い
出し、本発明を完成した。

【０００６】本発明の目的は、ビフィズス菌の細胞壁及
び／又は細胞壁破砕物から単離された顆粒球誘導作用を
有する中性多糖体を提供することである。

【０００７】本発明の他の目的は、ビフィズス菌の細胞
壁及び／又は細胞壁破砕物から単離された中性多糖体を
有効成分とする顆粒球誘導剤を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明の第１の発明は、次の化３に示される主鎖からなり、

【０００９】

【化３】

【００１０】（ただし、化３においてｎは１３〜２７）
該主鎖を構成するα−ガラクトフラノシド３残基に対し
て１残基の割合で１−６結合したβ−グルコピラノシド
側鎖及び該主鎖を構成するβ−ガラクトピラノシド５残
基に対して４残基の割合で１−６結合したβ−グルコピ
ラノシド側鎖を有することを特徴とする中性多糖体に係
るものであり、また、中性多糖体が、ビフィドバクテリ
ウム属に属する微生物の細胞壁及び／又は細胞壁破砕物
から単離され、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定
した平均分子量が、９，４００ダルトンであること、比
旋光度が、＋２．７（ｃ０．４、水）であること、核磁
気共鳴スペクトルにおけるアノメリックプロトンのシグ
ナルの化学シフトが４．５１〜４．５３ｐｐｍ（β−グ
ルコピラノシド）、５．１０ｐｐｍ（α−ガラクトピラ
ノシド）、５．２４ｐｐｍ（β−ガラクトフラノシド）
であること、室温の水に少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ溶
解すること、及びグルコースとガラクトースのモル比が
１：１．８であること、を望ましい態様としてもいる。

【００１１】前記課題を解決する本発明の第２の発明
は、次の化４に示される主鎖からなり、

【００１２】

【化４】

【００１３】（ただし、化４においてｎは１３〜２７）
該主鎖を構成するα−ガラクトフラノシド３残基に対し
て１残基の割合で１−６結合したβ−グルコピラノシド
側鎖及び該主鎖を構成するβ−ガラクトピラノシド５残
基に対して４残基の割合で１−６結合したβ−グルコピ
ラノシド側鎖を有することを特徴とする中性多糖体を有
効成分とする顆粒球誘導剤に係るものであり、また、中
性多糖体が、ビフィドバクテリウム属に属する微生物の
細胞壁及び／又は細胞壁破砕物から単離され、平均分子
量が９，４００ダルトン（ゲル濾過クロマトグラフィー
により測定）であること、比旋光度が＋２．７（ｃ０．
４、水）であること、核磁気共鳴スペクトルにおけるア
ノメリックプロトンのシグナルの化学シフトが４．５１
〜４．５３ｐｐｍ（β−グルコピラノシド）、５．１０
ｐｐｍ（α−ガラクトピラノシド）、５．２４ｐｐｍ
（β−ガラクトフラノシド）であること、室温の水に少
なくとも１００ｍｇ／ｍｌ溶解すること、及びグルコー
スとガラクトースのモル比が１：１．８であること、を
望ましい態様としてもいる。

【００１４】次に本発明について更に詳述する。まず、
本発明の中性多糖体の製造例について記載する。本発明
の中性多糖体は、例えば、ビフィズス菌を出発原料とし
て製造されるが、この出発原料となるビフィズス菌は、
ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) 属に属する微
生物、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティ
ス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム
・ブレーベ(Bifidobacterium breve) 、ビフィドバクテ
リウム・ロンガム(Bifidobacterium lomgum)等、であ
り、これらは、市販されているか又は寄託機関から容易
に入手し得る菌株である。

【００１５】該ビフィズス菌から中性多糖体を製造する
には、まず、該ビフィズス菌を、単独又は２種以上を混
合して、公知の方法により培養し、培地から菌体を分離
し、菌体を洗浄し、湿菌体を得る。この場合、この湿菌
体を公知の方法により凍結乾燥することもできる。得ら
れた湿菌体又は凍結乾燥菌体を公知の方法により破砕
し、該破砕物から細胞壁成分を分離する。

【００１６】次に、得られた細胞壁成分を、例えば、冷
５％トリクロロ酢酸溶液、冷０．５Ｍ水酸化ナトリウム
溶液等の水系溶媒で抽出し、抽出画分を水に対して透析
し、のち透析内液を凍結乾燥する。得られた水溶性画分
を、公知のゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、セフ
ァクリルＳ−４００等を使用）により精製し、得られる
低分子画分を凍結乾燥し、中性多糖体を得ることができ
る。本発明の中性多糖類は、ビフィズス菌の細胞壁を構
成する細胞壁成分として、該細胞壁及び／又は細胞壁破
砕物から上記の方法により好適に単離されるが、該方法
に限らず、それと同効のものであれば適宜の方法を使用
することが可能である。

【００１７】次に前記のようにして製造された本発明の
中性多糖体の物理化学的性状について記載する。 （１）分子量 分子量は、プルラン（Ｓｈｏｄｅｘ社製）を標準物質と
して使用したゲル濾過クロマトグラフィーにより、次の
条件により測定した。 カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳ
Ｏ社製）を充填した０．８×３０ｃｍカラム 溶離液：０．１５Ｍ塩化ナトリウム 流 速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：示差屈折計（エルマー社製） 測定温度：室温 その結果、中性多糖体の分子量は、７，０００〜１３，
０００ダルトンであり、平均分子量は９，４００ダルト
ンであった。

【００１８】（２）比旋光度 凍結乾燥した中性多糖体４０ｍｇを、１０ｍｌの精製水
に溶解し、光路長１０ｃｍのセル（日本分光社製）を用
いて２５℃の温度で測定した。その結果、中性多糖体の
比旋光度は、＋２．７°（ｃ０．４、水）であった。

【００１９】（３）核磁気共鳴スペクトル 核磁気共鳴スペクトル［ ¹Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨ
ｚ）］は、中性多糖体３０ｍｇを重水６００μｌに溶解
し、３０℃でＡＬＰＨＡ−５００装置（日本電子社製）
を用いて測定した。その結果は、図１に示すとおりであ
る。図１において、縦軸及び横軸は、それぞれ共鳴シグ
ナルの強度及び化学シフト（δ）である。図１から、本
発明の中性多糖体は、β−ヘキソフラノシド（δ＝５．
２４ｐｐｍ）、α−ヘキソピラノシド（δ＝５．１０ｐ
ｐｍ）、β−ヘキソピラノシド（δ＝４．５３ｐｐｍ、
４．５２ｐｐｍ）を含むことが判明した。

【００２０】（４）構成成分 中性多糖体を２Ｍトリクロロ酢酸中で１０５℃、６時間
加水分解し、乾燥窒素ガスを噴射してトリクロロ酢酸を
除去し、得られた単糖類を次の測定条件により高速液体
クロマトグラフィーで分析した。 カラム：ＩＯＮＰＡＫ ＫＳ−８０１（Ｓｈｏｄｅｘ社
製、０．８×３０ｃｍ） 溶離液：水 流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：示差屈折計（エルマー社製） 測定温度：７０℃ その結果、構成成分は、中性多糖体１ｍｇ当たりグルコ
ース０．３４ｍｇ及びガラクトース０．６１ｍｇであ
り、そのモル比は約１：１．８であった。

【００２１】（５）構成単糖の結合位置 中性多糖体の構成単糖の結合位置を調べるためにメチル
化分析［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journ
al of Biochemistry) ，第５５巻，第２０５〜２０８ペ
ージ，１９６４年］を行った。メチル化分析は、多糖体
及びオリゴ糖の構造解析に汎用される手法の１つであ
り、多糖体及びオリゴ糖の水酸基をメチル化した後の加
水分解で生ずる部分メチル化単糖の構造から、元の多糖
体及びオリゴ糖に存在したグリコシド結合の位置、分岐
の有無、各構成単糖の環状構造に関する情報が得られ
る。通常は、部分メチル化糖からアルジトールアセテー
ト等の誘導体を合成し、ガスクロマトグラフィーで分析
を行う。

【００２２】Ｉ．Ｃｉｕｃａｕらの方法［カーボハイド
レイト・リサーチ（Carbohydrate Research)，第１３１
巻，第２０９〜２１７ページ，１９８４年］により、中
性多糖体をメチル化、加水分解、還元、アセチル化し
て、部分メチル化アルジトールアセテートを合成し、分
析した。分析は、ＤＢ−１７キャピラリーカラム（Ｊ＆
Ｗ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製。０．３２ｍｍ×３０
ｍ）を用いた昇温ガスクロマトグラフィー（８０〜２８
０℃、８℃／ｍｉｎ）により行った。各ピークの同定
は、市販標準品（Ｂｉｏｃａｒｂ社製）との保持時間の
比較によって行い、必要に応じてマススペクトルで確認
した。

【００２３】この結果は、表１に示すとおりであり、テ
トラメチル誘導体として、２，３，４，６−ＯＭｅ−グ
ルコースが検出されたことから、中性多糖体は、グルコ
ピラノースを非還元末端とする側鎖を有するものと認め
られた。また、トリメチル誘導体として、２，５，６−
ＯＭｅ−ガラクトース及び２，４，６−ＯＭｅ−ガラク
トースが生成したことから、中性多糖体には、３結合ガ
ラクトフラノ−スと３結合ガラクトピラノースが含まれ
ること、ジメチル誘導体として、２，５−ＯＭｅ−ガラ
クトース及び２，４−ＯＭｅ−ガラクトースが生成した
ことから、分岐部分の糖残基は、３，６結合ガラクトフ
ラノースと３，６結合ガラクトピラノースであることが
判明した。

【００２４】次に中性多糖体の主鎖部分の構造を調べる
ために緩和スミス分解［ジャーナル・オブ・ジ・アメリ
カン・ケミカル・ソサイアティー(Journal of The Amer
icanChemical Society)，第７４巻，第４９７０〜４９
７１ページ，１９５２年］を行った。その結果、側鎖の
グルコース残基は分解され、ガラクトースのみから成る
主鎖が得られた。この糖鎖について再度メチル化分析を
行った結果、２，５，６−ＯＭｅ−ガラクトースと２，
４，６−ＯＭｅ−ガラクトースがモル比１：１の割合で
存在し、他の糖は検出されなかったことから、中性多糖
の主鎖は３結合ガラクトフラノースと３結合ガラクトピ
ラノースから構成されていることが判明した。

【００２５】この主鎖の ¹Ｈ−ＮＭＲ測定において、α
−ヘキソピラノ−スとβ−ヘキソフラノ−スのアノマー
水素のシグナルが検出されたが、先のメチル化分析の結
果と合わせて、それぞれα−ガラクトピラノースとβ−
ガラクトフラノースのアノマー水素であることが同定さ
れた。

【００２６】また、ガラクトフラノースの１位の水素と
ガラクトピラノースの３位の水素、及びガラクトピラノ
ースの１位の水素とガラクトフラノースの３位の水素間
に、近距離に存在する水素間で観察される核オーバーハ
ウザー効果が認められたことから、これらの水素は互い
に立体的に近い位置に存在することが示唆され、β−ガ
ラクトピラノシドとα−ガラクトフラノシドが交互に１
−３結合しているものと同定された。

【００２７】以上の結果から、本発明の中性多糖体は、
β−ガラクトピラノシドとα−ガラクトフラノシドが交
互に結合した１−３ガラクタンを主鎖とし、側鎖として
β−グルコピラノシドが１−６結合した構造を有するこ
とが判明した。尚、表１に示した部分メチル化糖のモル
比から、主鎖のガラクトース残基には側鎖が１００％結
合しておらず、側鎖が結合している割合はβ−ガラクト
ピラノシド５残基につき４残基、α−ガラクトフラノシ
ド３残基につき１残基であり、次の化５に示す構造を有
することが確認された。尚、化５においてｎは１３〜２
７である。

【００２８】

【表１】

【００２９】

【化５】

【００３０】（６）溶解性 常法により、中性多糖体の溶解性を測定した結果、室温
の水１ｍｌ当たり少なくとも１００ｍｇ溶解した。本発
明の中性多糖体は、高い水溶性を示すものであり、それ
自体で又は製薬上許容される種々の単体、賦形剤等と混
合し、錠剤、カプセル剤、注射剤等の形態の剤型の医薬
として好適に用いることができる。本発明の中性多糖体
を有効成分とする医薬は、人間及び動物に経口的に、又
は非経口的に投与することができ、非経口的投与は、例
えば、皮下、筋肉、静脈注射、点滴等である。

【００３１】本発明の中性多糖体の投与量は、動物か人
間により、また年齢、個人差、症状などに影響される
が、人間を対象とする場合の非経口投与量は、一般に成
人１日当たり、１〜１０００ｍｇが適当である。また、
本発明の中性多糖体を他の顆粒球誘導剤と併用すること
もできる。

【００３２】次に試験例を示して本発明を詳述する。 試験例 この試験は、本発明の中性多糖体の顆粒球誘導効果を調
べるために行った。 １）試料の調製 実施例１と同一の方法により中性多糖体を調製した。

【００３３】２）試験方法 ７週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ系雄マウス（日本チャールス・
リバー社から入手）１５匹を無作為に１群５匹に分け、
生理食塩液に溶解した中性多糖体を１匹当たり１μｇ又
は１０μｇの割合で尾静脈に投与し、投与４時間後に尾
静脈から採血し、血球カウンターで末梢血中の白血球数
を測定し、ライト−ギムザ染色により白血球中の顆粒
球、単球、リンパ球の割合を観察した。尚、対照として
生理食塩液のみを投与し、同様に試験を行った。

【００３４】３）試験結果 この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から
明らかなように、中性多糖体を投与した群においては、
白血球中の顆粒球の割合が顕著に増加し、中性多糖体が
顆粒球誘導活性を有することが立証された。尚、中性多
糖体及び動物の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の
結果が得られた。

【００３５】

【表２】

【００３６】次に実施例を示して本発明を更に具体的に
詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。

【実施例】

実施例１ ビフィドバクテリウム・インファンティス・ロイター(B
ifidobacterium infantis Reuter) ＡＴＣＣ１５６９７
（ＡＴＣＣから入手）を、２５ｌの半合成培地（ＳＥ培
地。組成は次に示す）中で撹拌しながらジャーファーメ
ンターで３７℃、２０時間培養し、冷却後加熱殺菌し
た。 ＳＥ培地組成：カゼイン分解物 ２５ （ｇ／ｌ） 乳糖 ２５ リン酸２水素１カリウム ５ リン酸１水素２ナトリウム ５ 酢酸アンモニウム １ ピルビン酸ナトリウム ０．１ システイン塩酸塩１水和物 ０．０４ アラニン ０．０１ アスパラギン ０．０１ グルタミン ０．０１ トリプトファン ０．０１ パントテン酸カルシウム ０．０００２ ビオチン ０．０００１ ｐＨ ６．６±０．１ （注：使用した物質はいずれも市販品である）

【００３７】菌体懸濁液を４℃で５０００ｇ、１５分間
高速遠心機により遠心して沈殿させ、得られた菌体を生
理食塩液６ｌに再懸濁し、同条件で遠心分離を５回反復
して洗浄した。更に、水で十分に洗浄し、分離した菌体
を真空凍結乾燥機により凍結乾燥し、約７５０ｇの乾燥
菌体を得た。

【００３８】この凍結乾燥菌体１０ｇを１４００ｍｌの
生理食塩液に懸濁し、液温を１０℃以下に保持しながら
１００ｍｌずつ超音波破砕機（オリンパス社製、出力３
００Ｗ、周波数２０ｋＨｚ）で３０分間処理して菌体を
破壊した。その後、４℃で１２，０００ｇ、２０分間遠
心し、沈殿を回収した。この沈殿をトリプシン（シグマ
社製）０．８ｇ、ＤＮａｓｅ（シグマ社製）０．０５
ｇ、ＲＮａｓｅ（シグマ社製）０．１２ｇを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）８００ｍｌに懸濁
し、３７℃で一晩反応させ、酵素を含まない同緩衝液を
用いて上記条件で遠心洗浄し、のちトリプシン（シグマ
社製）０．５ｇ、キモトリプシン（シグマ社製）０．４
ｇを含む同緩衝液８００ｍｌに懸濁し、３７℃で一晩酵
素処理を行った。

【００３９】次いで同様の遠心操作で懸濁液を０．０１
Ｎ塩酸に置換し、ペプシン（フナコシ社製）０．５ｇを
含む０．０１Ｎ塩酸５００ｍｌに懸濁し、３７℃で一晩
処理した。遠心洗浄後、沈殿をアクチナーゼＥ（科研製
薬社製）０．５ｇを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）５００ｍｌに再懸濁し、３７℃にて一晩反応
させた。アクチナーゼＥ処理を更に３回反復し、蒸留水
で十分遠心洗浄し、得られた沈殿を真空凍結乾燥機（ラ
ブコンコ社製）で凍結乾燥し、精製細胞壁約７．５ｇを
得た。

【００４０】この精製細胞壁３００ｍｇを冷５％トリク
ロロ酢酸溶液５０ｍｌに懸濁し、４℃で一晩撹拌し、の
ち２５０００ｇで１５分間遠心し、得られた上清４５ｍ
ｌを、透析膜（スペクトラム社製、分画分子量３５０
０）を用いて水に対して透析し、透析内液を凍結乾燥し
た。この可溶性画分を５ｍｌの水に溶解してセファクリ
ルＳ−４００ＨＲ（ファルマシア社製。２．５ｃｍ×１
２０ｃｍ）カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーに
かけ、２つのピークに分かれて溶出した。このうち低分
子画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥
し、中性多糖体約８０ｍｇを得た。

【００４１】得られた中性多糖体を、前記試験方法と同
一の方法により理化学的性状を試験した結果、平均分子
量９，４００、比旋光度＋２．７（ｃ０．４、水）、中
性多糖体１ｍｇ当たりグルコース０．３４ｍｇ及びガラ
クトース０．６１ｍｇであり、そのモル比は約１：１．
８、β−ヘキソフラノシド（δ＝５．２４ｐｐｍ）、α
−ヘキソピラノシド（δ＝５．１０ｐｐｍ）、β−ヘキ
ソピラノシド（δ＝４．５３ｐｐｍ、４．５２ｐｐｍ）
を含み、β−ガラクトピラノシドとα−ガラクトフラノ
シドから成る１−３ガラクタンの主鎖のβ−ガラクトピ
ラノシド５残基につき４残基、α−ガラクトフラノシド
３残基につき１残基の割合で側鎖が結合していた。

【００４２】実施例２ ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium lon
gum)ＡＴＣＣ１５７０７を２ｌの半合成培地（実施例１
と同一のＳＥ培地）中で撹拌しながらジャーファーメン
ターで３７℃、１６時間培養し、冷却後加熱殺菌した。
菌体懸濁液を４℃で５０００ｇ、１５分間高速遠心機に
より遠心し、沈殿させた菌体を生理食塩液３ｌに再懸濁
し、同条件で遠心分離を５回反復して洗浄した。更に、
水で十分に洗浄し、得られた菌体を真空凍結乾燥機（ラ
ブコンコ社製）により凍結乾燥し、約４０ｇの乾燥菌体
を得た。

【００４３】この凍結乾燥菌体１０ｇを１４００ｍｌの
生理食塩液に懸濁し、液温を１０℃以下に保持しながら
１００ｍｌずつ超音波破砕機（オリンパス社製、出力３
００Ｗ、周波数２０ｋＨｚ）で３０分間処理し、菌体を
破壊した。その後、４℃で１２，０００ｇ、２０分間遠
心して沈殿を回収した。この沈殿をトリプシン（シグマ
社製）０．８ｇ、ＤＮａｓｅ（シグマ社製）０．０５
ｇ、ＲＮａｓｅ（シグマ社製）０．１２ｇを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）８００ｍｌに懸濁
し、３７℃で一晩反応させ、酵素を含まない同緩衝液を
用いて上記条件で遠心洗浄し、のちトリプシン（シグマ
社製）０．５ｇ、キモトリプシン（シグマ社製）０．４
ｇを含む同緩衝液８００ｍｌに懸濁し、３７℃で一晩酵
素処理を行った。

【００４４】次いで同様の遠心操作により懸濁液を０．
０１Ｎ塩酸に置換し、ペプシン（フナコシ社製）０．５
ｇを含む０．０１Ｎ塩酸５００ｍｌ中で３７℃にて一晩
処理した。遠心洗浄後、沈殿をアクチナーゼＥ（科研製
薬社製）０．５ｇを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）５００ｍｌに再懸濁し、３７℃で一晩反応さ
せた。アクチナーゼＥ処理を更に３回反復し、蒸留水で
十分遠心洗浄した沈殿を真空凍結乾燥機で凍結乾燥し
て、精製細胞壁７ｇを得た。

【００４５】精製細胞壁５００ｍｇを冷０．５Ｍ水酸化
ナトリウム溶液１００ｍｌに懸濁し４℃で一晩撹拌し、
のち１０℃で３２０００ｇ、２５分間遠心し、上清９５
ｍｌを得た。液温の上昇を防止するために氷水で冷却し
ながら、この上清に２０％塩酸７．５ｍｌを徐々に添加
して中和した。中和後の上清を透析膜（スペクトラ社
製、分画分子量３５００）を用いて水に対して透析し、
透析内液をロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾
燥し、実施例１と同様にセファクリルＳ−４００ＨＲカ
ラムによるゲル濾過クロマトグラフィーを行い、中性多
糖体約１５０ｍｇを得た。

【００４６】得られた中性多糖体を、前記試験方法と同
一の方法により理化学的性状を試験した結果、平均分子
量９，４００、比旋光度＋２．７（ｃ０．４、水）、中
性多糖体１ｍｇ当たりグルコース０．３４ｍｇ及びガラ
クトース０．６１ｍｇであり、そのモル比は約１：１．
８、β−ヘキソフラノシド（δ＝５．２４ｐｐｍ）、α
−ヘキソピラノシド（δ＝５．１０ｐｐｍ）、β−ヘキ
ソピラノシド（δ＝４．５３ｐｐｍ、４．５２ｐｐｍ）
を含み、β−ガラクトピラノシドとα−ガラクトフラノ
シドから成る１−３ガラクタンの主鎖のβ−ガラクトピ
ラノシド５残基につき４残基、α−ガラクトフラノシド
３残基につき１残基の割合で側鎖が結合していた。

【００４７】実施例３ ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium b
ifidum) ＡＴＣＣ２９５２１を用いたことを除き、実施
例１と同一の方法により中性多糖体約７０ｍｇを得た。
得られた中性多糖体を、前記試験方法と同一の方法によ
り理化学的性状を試験した結果、平均分子量９，４０
０、比旋光度＋２．７（ｃ０．４、水）、中性多糖体１
ｍｇ当たりグルコース０．３４ｍｇ及びガラクトース
０．６１ｍｇであり、そのモル比は約１：１．８、β−
ヘキソフラノシド（δ＝５．２４ｐｐｍ）、α−ヘキソ
ピラノシド（δ＝５．１０ｐｐｍ）、β−ヘキソピラノ
シド（δ＝４．５３ｐｐｍ、４．５２ｐｐｍ）を含み、
β−ガラクトピラノシドとα−ガラクトフラノシドから
成る１−３ガラクタンの主鎖のβ−ガラクトピラノシド
５残基につき４残基、α−ガラクトフラノシド３残基に
つき１残基の割合で側鎖が結合していた。

【００４８】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明は、ビフィ
ズス菌の細胞壁から得られる新規な中性多糖体及びその
用途に係るものであり、本発明によって奏せられる効果
は次のとおりである。 １）本発明の中性多糖体は、従来報告されているビフィ
ズス菌の細胞壁そのもの及び細胞壁破砕物とは異なり、
高い水溶性を示すものであるため、大量投与が可能であ
る。 ２）本発明の中性多糖体は、腸内常在菌であるビフィズ
ス菌から得られることから、安全性の高い医薬成分とし
て有用である。 ３）本発明を有効成分とする顆粒球誘導剤は、白血球中
の顆粒球の割合を増す作用を有することから、これによ
り、細菌感染に対する抵抗性を増強することが期待され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の中性多糖体の核磁気共鳴スペ
クトルの一例を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の化１に示される主鎖からなり、 【化１】 （ただし、化１においてｎは１３〜２７）該主鎖を構成
   するα−ガラクトフラノシド３残基に対して１残基の割
   合で１−６結合したβ−グルコピラノシド側鎖及び該主
   鎖を構成するβ−ガラクトピラノシド５残基に対して４
   残基の割合で１−６結合したβ−グルコピラノシド側鎖
   を有することを特徴とする中性多糖体。
2. 【請求項２】 中性多糖体が、ビフィドバクテリウム属
   に属する微生物の細胞壁及び／又は細胞壁破砕物から単
   離され、次のａ）〜ｅ）の理化学的性質； ａ）ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した平均分
   子量が、９，４００ダルトンであること、 ｂ）比旋光度が、＋２．７（ｃ０．４、水）であるこ
   と、 ｃ）核磁気共鳴スペクトルにおけるアノメリックプロト
   ンのシグナルの化学シフトが４．５１〜４．５３ｐｐｍ
   （β−グルコピラノシド）、５．１０ｐｐｍ（α−ガラ
   クトピラノシド）、５．２４ｐｐｍ（β−ガラクトフラ
   ノシド）であること、 ｄ）室温の水に少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ溶解するこ
   と、 ｅ）グルコースとガラクトースのモル比が１：１．８で
   あること、を有する請求項１に記載の中性多糖体。
3. 【請求項３】 次の化２に示される主鎖からなり、 【化２】 （ただし、化２においてｎは１３〜２７）該主鎖を構成
   するα−ガラクトフラノシド３残基に対して１残基の割
   合で１−６結合したβ−グルコピラノシド側鎖及び該主
   鎖を構成するβ−ガラクトピラノシド５残基に対して４
   残基の割合で１−６結合したβ−グルコピラノシド側鎖
   を有することを特徴とする中性多糖体を有効成分とする
   顆粒球誘導剤。
4. 【請求項４】 中性多糖体が、ビフィドバクテリウム属
   に属する微生物の細胞壁及び／又は細胞壁破砕物から単
   離され、次のａ）〜ｅ）の理化学的性質； ａ）ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した平均分
   子量が、９，４００ダルトンであること、 ｂ）比旋光度が、＋２．７（ｃ０．４、水）であるこ
   と、 ｃ）核磁気共鳴スペクトルにおけるアノメリックプロト
   ンのシグナルの化学シフトが４．５１〜４．５３ｐｐｍ
   （β−グルコピラノシド）、５．１０ｐｐｍ（α−ガラ
   クトピラノシド）、５．２４ｐｐｍ（β−ガラクトフラ
   ノシド）であること、 ｄ）室温の水に少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ溶解するこ
   と、 ｅ）グルコースとガラクトースのモル比が１：１．８で
   あること、を有する請求項３に記載の顆粒球誘導剤。