FI110164B - Menetelmä oligosakkaridin valmistamiseksi depolymeroimalla antigeeninen polysakkaridi - Google Patents

Menetelmä oligosakkaridin valmistamiseksi depolymeroimalla antigeeninen polysakkaridi Download PDF

Info

Publication number
FI110164B
FI110164B FI932626A FI932626A FI110164B FI 110164 B FI110164 B FI 110164B FI 932626 A FI932626 A FI 932626A FI 932626 A FI932626 A FI 932626A FI 110164 B FI110164 B FI 110164B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
som
att
förfarande enligt
polysaccharide
process according
Prior art date
Application number
FI932626A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI932626A0 (fi
FI932626A (fi
Inventor
Monique Moreau
Original Assignee
Aventis Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pasteur filed Critical Aventis Pasteur
Publication of FI932626A0 publication Critical patent/FI932626A0/fi
Publication of FI932626A publication Critical patent/FI932626A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI110164B publication Critical patent/FI110164B/fi

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08BPOLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/09Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092Streptococcus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/025Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0266Klebsiella
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/025Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0283Shigella
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/085Staphylococcus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/095Neisseria
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/102Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08BPOLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/831Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

110164
Menetelmä oligosakkaridin valmistamiseksi depolymeroimalla antigeeninen polysakkaridi 5 Tämä keksintö kohdistuu patogeenisestä aineesta saadusta antigeenisestä polysakkaridista johdetun oligosakkaridin valmistusmenetelmään.
Bakteereilla samoin kuin hiivan kaltaisilla sienillä on pinta-10 rakenteessaan polysakkarideja. Suurinta osaa bakteereista peittää polysakkaridityyppinen erite, joka kiinnittyy bakteeriin enemmän tai vähemmän voimakkaasti, mutta joka ei ole mikään varsinainen kotelo. Eritettä kutsutaan kapseliksi tai glykokalyksiksi. Gramnegatiivisilla bakteereilla on lisäksi 15 lipopolysakkarideja (LPS) sisältävä ulkokalvo. Polysakkarideja on myös sienien seinämissä. Nämä polysakkaridit ovat itse asiassa pinta-antigeenejä, jotka saavat aikaan immuunivasteen infektoituneessa nisäkkäässä.
20 Tällaiset polysakkaridit muodostuvat toistuvista perusyksiköistä, joilla on tietynlaiset aineosat ja sidokset ja jotka ovat tyypillisiä kullekin sieni- tai bakteerilajille. Näissä tois- ·:·* tuvissa yksiköissä on epitooppeja, antigeenisyyteen ratkaise-• · *. *: vasti vaikuttavia rakenteita. Asian selventämiseksi kuviossa 1 •.1^5 on esitetty erityyppisiä kapsulaaristen polysakkaridien tai • · lipopolysakkaridien toistoyksikköjä. Toistoyksiköt sisältävät :***: usein erittäin labiileja funktionaalisia ryhmiä kuten esimer- ·'"· kiksi funktionaalisia fosfaattiryhmiä, joita on molekyylin rungossa tai haaroittuneessa asemassa, sekä myös O-asetyyli- ja .*.30 pyruvaattiryhmiä.
• · « | “* Polysakkaridi muodostuu itse asiassa joukosta polymeerimolekyy- :.· · lejä, jotka sisältävät glykosidiyksiköitä, joiden lukumäärä voi : : vaihdella molekyylistä toiseen. Siten polysakkaridia voidaan ;.’35 kuvata molekyylipainon mukaan ainoastaan keskimääräisen mole-• · · 9 » 2 110164 kyy].ipainon avulla. Homopolysakkaridissä glykosLdiyksiköt ovat monosakkarideja. Heteropolysakkaridissä glykosidiyksiköt muodostavat aineosaketjuja, jotka liittyvät toisiinsa tietyllä tavalla.
5
Polysakkaridin keskimääräinen molekyylipaino voidaan määrittää geelisuodat. uksen avulla. Keskimääräinen molekyylipaino ilmoitetaan eluointivakiona (KD) tai dekstraaniekvivalenttina (EqD) menetelmän mukaan, jota ovat kuvanneet Granath et ai, J. Chrom.
10 (1967) 28 : 69, ja joka on lyhyesti sanoen seuraavanlainen:
Polysakkaridiliuos analysoidaan ekskluusio-diffuusiogeelikroma-tografiakolonnin avulla, jossa ainekset erottuvat molekyylipai-nonsa mukaan. Tämän tyyppistä geeliä on myytävänä, esimerkiksi 15 sellaisilla kaupallisilla nimillä kuin Sephadex (Pharmacia), BioGel (Bio-Rad), Fractogel (Toyo-Soda), Sepharose (Pharmacia) ja Sephacryl (Pharmacia). Geelin fraktiointivyöhykkeen tulee luonnollisestikin olla analysoitavan molekulaarisen populaation edustamaan keskimääräiseen molekyylipainoalueeseen soveltuva.
20 Esimerkkinä voidaan mainita, että geelisuodatuskolonneilla Sepharose 2BCL, 4BCL ja 6BCL fraktiointivyöhykkeet dekstraaniek-vivalentteina ovat 20.000.000 - 100.000, 5.000.000 - 20.000 ja : 1.000.000 - 10.000. Tavallisesti eluenttina käytetään suolali- ,·] uosta, esimerkiksi natriumkloridia 0,2 M. Eluointivakio laske-25 taan seuraavan kaavan mukaisesti: » * * \ ·' Ve - Vo ’ Vt - Vo jossa I ’ : 30 Ve on kyseessä olevan valmisteen eluointivakio, Vt on kolonnin kokonaistilavuus ja Vo on kolonnin kuolluttilavuus.
Kuvioissa 2A ja 2B on annettu Salmonella typhin ja tyypin 1 *;’ Streptococcus pneumoniaen polysakkaridien eluointikäyrät Sepha-: 35 rose 4BCL kolonnissa. S. typhin polysakkaridi muodostuu siis polymeereistä, joiden suurimmat molekyylipainot eivät sovi 3 110164
Sepharose 4BCL:ään. Myös S. pneumoniae tyypin 1 polysakkaridi muodostuu pääasiallisesti polymeereistä, joiden molekyylipaino vaihtelee alueella 0 - 0,45 KD- Polysakkaridin keskimääräinen eluointivakio määritetään eluointikäyrän kaltevien osien tan-5 genttien leikkauspisteeksi eli karkeasti ottaen eluointikäyrän huipuksi. Kuvioiden 2A ja 2B polysakkaridien keskimääräiset eluointivakiot ovat siis nolla ja 0,04.
Dekstraania käyttäen laadittavan asteikkosarjän perusteella 10 voidaan eluointivakio muuttaa EqD:nä ilmoitettavaksi molekyyli-painoksi. Kuviossa 3 on esimerkkinä eräs asteikkosarjamalli.
Antigeenisen vaikutuksensa vuoksi polysakkaridit, jotka ovat esimerkiksi bakteerien tai sienten patogeenisten aineiden pin-15 ta-antigeenejä, ovat hyviä rokote-ehdokkaita. Polysakkaridiuu-tetta sisältävien rokotteiden on osoitettu tehoavan aikuisissa. Näin ei kuitenkaan ole asian laita pienillä lapsilla. Tämän huomattavan haitan poistamiseksi on onnistuneesti ehdotettu polysakkaridien liittämistä kovalenttisin sidoksin proteiinei-20 hin, jolloin näin saatavat molekyylit ovat luonteeltaan T-riip-puvaisia ja niiden immunogeenisyys on entistä parempi.
: Polysakkaridipohjäisiin rokotteisiin luetaan nykyään rokotteet, , ,·, jotka tehoavat infektioihin, joiden aiheuttajina ovat Neisseria 25 meningitidis ryhmät A, C, Y, W 135, Streptococcus pneumoniae, .! Haemophilus influenzae tyyppi B tai Salmonella typhi.
• · ‘·' Vaikka patogeenisten aineiden antigeeniset polysakkaridit ovat potentiaalisia kiintoisia immunogeenejä, niiden käyttö on tark- * » · • 30 kuutta vaativaa niiden huomattavan keskimääräisen molekyylipai- : : : non vuoksi, se voi olla jopa useampi miljoona dekstraaniekviva- ]· lentti, Erityisesti silloin, kun polysakkaridia halutaan käyt- tää konjugoidussa muodossa, siis proteiiniin kiinnitettynä, vastaan nousee vaikeasti ratkaistavia teknisiä ongelmia. Lii-:.· ·’ 35 tosvaiheen aikana voi muodostua geeliä tai flokkulanttia mikä : vaikeuttaa konjugaatin suodatussterilointia.
4 110164 Tämän vaikeuden poistamiseksi ori jo ehdotettu polysakkaridien koon pienentämistä niiden käsittelyn helpottamiseksi. Tätä varten on kehitetty erilaisia pilkkomismenetelmiä. On olemassa esimerkiksi sellaisia hyvin tunnettuja menetelmiä kuin fragmen-5 tointi ultraäänen avulla tai hydrolyysiilä happamassa, emäksisessä tai entsymaattisessa ympäristössä. Nämä fragmentointi-menetelmät eivät kuitenkaan ole vielä läheskään tyydyttäviä. Liian usein niiden vaikutuksesta ominaisepitoopit tuhoutuvat kokonaan tai osittain, jolloin menetetään spesifiselle anti-10 geenisyydelle olennaisia kemiallisia ryhmiä.
Kun happo- tai emäshydrolyysin kohteena on S. typhin ryhmä A tai N. meningitidis poistuu asetyy1iryhmiä, jotka ovat tarpeellisia polysakkaridin antigeeniselle spesifisyydelle. Lisäksi 15 hydrolysoimalla saatujen fragmenttien oikeanlainen uudelleen-asetylointi on erittäin vaikeaa ellei mahdotonta.
Fragmentoivalla hydrolyysimenetelmällä ei myöskään aina saada fragmentteja, jotka olisivat kooltaan suhteellisen homogeeni-20 siä, mutta farmaseuttisten aineiden valmistuksessa tuotteiden täytyy kuitenkin olla homogeenisiä, laadultaan muuttumattomia , ja standardien mukaisia.
. ,·. Ultraäänifragmentoinnissa puolestaan on esimerkiksi osoitettu, .·, ; 25 että H. influenzae tyypin B polysakkaridin päätefosfaattiryhmät .! häviävät u 1 traäänikäsittelyssä. Tämä antaa aihetta pelätä, että myös polysakkaridiketjujen haarautuneessa asemassa olevat ’·’ ' fosfaatti ryhmät häviävät tällaisen käsittelyn aikana.
: ',· 30 Lisäksi, vaikka ultraäänien avulla saadaan kooltaan suhteelli- V · sen homogeenisiä fragmentteja, ultraäänimenetelmällä tarpeeksi , ,·. pienten fragmenttien aikaansaaminen vaatii hyvin pitkän käsit-telyajan, ja se voi aiheuttaa haittoja, joista eräs on lait-teiston nopea kuluminen. Koska ultraäänien tehokkuus on rajal-· 35 linen, sitä ei teollisessa mittakaavassa kannata ajatella.
5 110164 i
Lopuksi mainittakoon, että polysakkaridien entsymaattisen depo-lymeroinnin käyttö rajoittuu polysakkarideihin, joiden sopivat entsyymit tunnetaan. Tämä huomattava haitta on kuitenkin tyypillistä entsyymien erittäin spesifiselle luonteelle suhteessa 5 niiden substraatteihin.
Rokotteiden alalla suurta teknistä ja taloudellista edistystä olisi siis depolymerointimenetelmä, jolla ei ole alan nykyisten menetelmien erilaisia haittapuolia. Toisin sanoen erityisesti 10 tarvittaisiin antigeenisten polysakkaridien depolymerointimenetelmä, jolla on joukko edullisia ominaisuuksia koska: - Sen avulla saadaan oligosakkarideja, joiden glykosidiyksikkö— jen määrä on pienempi samalla kun vähintään yksi fragmentoita- 15 van polysakkaridin epitoopin olennaisista rakenteellisista determinanteista säilyy.
- Sitä voidaan käyttää millaiseen tahansa aiottuun antigeeniseen polysakkaridirakenteeseen.
20 - Sen avulla saadaan kooltaan tarpeeksi homogeenisiä fragment-te ja, ja . ,·. - Se on halpa ja erittäin yksinkertainen toteuttaa.
25 ,! Yllättäen on havaittu, että näihin tavoitteisiin päästään hape- *t · tus-pelkistysdepolymerointireaktion avulla.
Tähän asti tällaista menetelmää, josta englannin kielessä käy-: V 30 tetään lyhennettä ORD, on käytetty fragmentoitaessa esimerkiksi V : sellaisia polysakkarideja kuin hepariinia, hyaluronihappoa, . ,·, dekstraania ja DNA:ta, ja tämä aivan eri kohteisiin kuin mitä * » tällä patenttihakemuksella on. On esimerkiksi tahdottu vähentää tuotteiden viskositeettia tai, kun kyseessä on ollut hepa- » * * V · 35 riinin kaltainen lineaarinen molekyyli, saada kooltaan pienem- :,it: piä fragmentteja, joiden on tiedetty olevan erilailla aktiivi- 6 110164 siä veren hyytymisen estäjiä. On selvää, että koska tuotteilla, joihin tätä menetelmää sovellettiin ei ollut immunogeenistä merkitystä, saatujen fragmenttien toistoyksikköjen integriteetin tutkimista ei otettu esille.
5
Toisaalta on olemassa lukuisia aiempia julkaisuja, esimerkiksi K. Uchida, Carbohydrate research, (1988) 173 : 89-99; H. Uchiy-ama, Journal of Biological Chemistry, (1990) 265 ; 7753-7759; S. W. Green, The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry IB ; 10 Academic Press (1980) : 1132; A. Herp, The Carbohydrates Chemistry and Biochemistry IB; Academic Press (1980); 1276; Kochetkov et al, Radiation Chemistry of Carbohydrates, Pergammon Press, Oxford, (1979), jotka kuvaavat ORD-reaktiota tuhoisana joko fosfaattiryhmille tai hii1ihydraattirenkäi11e ren-15 kaan hiili-hiilisidosten pilkkoutuessa.
Alan aiempaa tilaa tarkasteltaessa ORD-reaktiosta saatava vaikutelma on yleisesti ottaen, että se on tuhoa aiheuttava.
20 Mikään ei kuitenkaan anna aihetta ajatella, että ORD olisi parempi kuin esimerkiksi hydrolyysimenetelmä tai uitraäänikäsit-. tely suhteessa haluttuihin vaikutuksiin eli epitooppien sai ly t- : ',· tämiseen.
» · .·. ; 25 Tämän vuoksi ennen tätä keksintöä ei ole koskaan osoitettu, ·. . että on mahdollista saada oligosakkarideja, joiden iuonteen- '.,1 omainen toistoyksikkörakenne säilyy, suorittamalla hapetus- ‘ ’ pelkistysfragmentointi kyseessä olevalle polysakkaridille, niin että niitä voidaan käyttää aktiivisena aineena koostumuksissa, 30 joilla vahvistetaan yksilön immuunipuolustusta.
> · , ,·. Nyt on keksitty, että on mahdollista käyttää ORD-menetelmää ··, sellaisten oligosakkaridien saamiseen, jotka ovat säilyttäneet vähintään yhden .1 ähtöpolysakkaridin antigeenideterminantin.
: : 35 7 110164
Lisäksi on havaittu, että suoritettaessa hapetus-pelkistysdepo-lymerointi antigeeniselle polysakkaridille saadaan hyvissä olosuhteissa fragmentteja, joiden koon homogeenisuus on täysin tyydyttävä, vaikka on tunnettua, että ORD-reaktio on vapaita 5 radikaaleja tuottava reaktio, jossa polysakkaridi pilkkoutuu satunnaisesti.
Tästä johtuen keksintö tuo esiin oligosakkaridin, jossa on säilynyt vähintään yksi patogeenisestä aineesta saadun antigeeni-10 sen polysakkaridin antigeenideterminantti, tunnettu siitä, että se valmistetaan menetelmällä, jonka vaiheet ovat (i) saattaa tämä polysakkaridi hapetus-pelkistysdepolymerointireaktioon, (ii) koota näin saatu oligosakkaridi ja, haluttaessa, (iii) liittää se konjugaattikumppaniin tai kantajaan, niin että tämä 15 oligosakkaridi on konjugaatin muodossa tai kantajaan sidottu.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .
20 "Oligosakkaridilla" (ransk. tekstissä "oligoside") tarkoitetaan molekyyliryhmää, jokaisessa molekyylissä on lukumääräisesti . vähemmän glykosidiyksiköitä suhteessa lähtöpolysakkaridiin, ja I”, voi sisältää esimerkiksi 4-500 glykosidiyksikköä.
’••25 Oligosakkaridin keskimääräinen molekyylipaino määritetään edel-• · *.·; lä polysakkaridin yhteydessä selitettyjen sääntöjen mukaisesti.
• · » • Yleisesti ottaen tämän keksinnön mukaisen oligosakkaridin kes-• · · kimääräinen eluointivakio Sepharose 4BCL-kolonnissa on 0,3-0,9, erityisesti 0,4 - 0,8, esimerkiksi 0,6 - 0,7. Toisin ilmaistu- :*·30 na tällaisen oligosakkaridin keskimääräinen molekyylipaino on • · ,···, 200.000 - 2.000 EqD, erityisesti 150.000 - 10.000 EqD, aivan ^ erityisesti 60.000 - 30.000 EqD.
• · · ·...' Tämän keksinnön erään suositeltavan muodon mukaan antigeeninen ”•35 polysakkaridi on pinta-antigeeni, joka on saatu patogeenisestä .·. : aineesta, joka voi olla sieni samoin kuin gramnegatiivinen tai grampositiivinen bakteeri, erityisesti sukua Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Escherichia, Neisseria, Shigella tai Haemophilus.
δ 110164
Bakteriaalinen patogeeninen aine voi olla esimerkiksi Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi tai Haemophi1us influenzae.
5 Sieni peräinen patogeenin aine voi olla hiiva, erityisesti valittuna suvuista Candida, Cryptococcus, Hansensula, Lipomyces, Rh i noo1adi e11 a ja RhodotoruIa.
Tässä keksinnössä hapetus-pelkistysreaktio toteutetaan kun läs-10 nä on vähintään yksi hapetus-pelkistyssysteemi, joka voidaan valita erityisesti ryhmästä tiolit kuten glutationi ja systeii-ni, sekä happi, hydrokinoni, useamman valenssin metallien kuten raudan tai kuparin ionit, askorbiinihappo ja vetyperoksidi, kaksi V .1 i m e k s i ma i n i 11 u a suositeltavampina.
15
Eri koeparametr.it, jotka voivat vaikuttaa reaktiokinetiikkaan (tuotteiden pitoisuus, pH, lämpötila, reaktioaika) ovat seikkoja, jotka alan asiantuntija pystyy helposti määrittämään suhteessa lähtöpolysakkaridiin, valittuun hapetus-pelkistyssystee-20 miin sekä keskimääräiseen fragmenttien kokoon, johon halutaan päästä. Kun fragmentit on tarkoitettu erityisesti rokotteisiin alan asiantuntija pyrkii erityisesti säätämään eri parametrit , · siten, että saadaan keskimääräiseltä kooltaan sopivia fragment-teja, jotta siis hyvä antigeeninen vaikutus säilyy, tarvittaes-, ; 25 sa mukautettuna konjugaattien käyttöön, esimerkiksi edellä mai- . nittuna kokoluokkina. Yleisesti ottaen optimaaliset reaktio- olosuhteet saadaan määritettyä rutiinitestein. Suuntaa-anta-vasti kaikissa myöhemmissä esimerkeissä annetaan kuitenkin koe-arvot, joilla päästään hyviin tuloksiin.
,· 30 ·,* · Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi aiottu polysakkaridi voidaan uuttaa ja puhdistaa tunnetuin menetelmin, eri-. ···. tyisesti sa ostamalla alkoholilla tai setyylitrimetyyliammonium-bromidilla tai sitten geeiisuodatuksella. Yleiskatsauksen saa-' · 35 miseksi näistä menetelmistä viitataan erityisesti teokseen R.I.
Whistler, Methods in Carbohydrate Chemistry, (1965), I, 3-62.
110164 i 9
Edullisesti polysakkaridi valmistetaan vesiliuoksessa, jonka j pitoisuus on 5 mg/ml. Osoitetuet! edul.I.....ineri pitoisuus vaihte- lee alueella 0,5 - 50 mg/ml, erityisesti. 0,5 - 10 mg/ml. Tällaista vesiliuosta voidaan käyttää lähtötuotteena.
5
Edellä määritetyn kaltainen hapetus-pelkistyssysteemi lisätään polysakkaridivalmisteeseen yhdellä kertaa, jatkuvasti tai jatkuma ttomas ti lopullisen hapetus-pelkistyssysteemin sekä polysakkaridin painosuhteen ollessa 0,01 : 10, erityisesti 0,1 : 5, 10 esimerkiksi 0,1 : 1.
Keksinnön mukainen menetelmä voidaan toteuttaa pH:n ollessa 3 - 8,5, erityisesti 3 - 6,5. Reaktioseoksen lämpötilakaan ei ole ratkaiseva tekijä, se voi vaihdella alueella 4-60 C. erityises-15 ti 18-40 ° C.
Aika, joka polysakkaridin haluttuun fragmentoitumiseen tarvitaan on tavallisesti 30 minuutista 1 tuntiin muutoin kuin erityistapauksissa, esimerkiksi kun kyseessä on S. typhin polysak-20 karidin Vi reaktioaika on selvästi pitempi. Reaktioaika voidaan säätää sen mukaan minkä kokoisia fragmentteja halutaan : saada.
Eräässä erityisessä toteutusmuodossa polysakkaridin vesiliuok- • » . ; 25 seen, jonka pitoisuus on 0,5 - 50 mg/ml, erityisesti 0,5 - 10 mg/ml, lisätään askorbiinihappoa kunnes lopullinen pitoisuus on 0,01-25 mg, erityisesti 0,1 - 10 mg/ml. Luonnostaan reak-tioseokseen liuennut happi riittää tavallisesti, mutta jos näin ei ole, sitä voidaan injektoida liuokseen. Reaktion kiihdyttä-30 miseksi toimitaan edullisesti kun läsnä on useamman hapetusas-teen metallin kuten raudan tai kuparin liukoista suolaa. Ηθη tallisuolaa (metallisuoloja) voidaan lisätä kunnes pitoisuus on 1 μΗ - 100 mM, erityisesti 1-10 mM.
35 Vaihtoehtoisena toteutusmuotona yllä esillä tuotuun on toteutusmuoto, jossa askorbiinihappo korvataan vetyperoksidilla, 110164 .10 jota voidaan lisätä kunnes pitoisuus on 0,1. - 100 itiM, erityisesti 0,5 - 10 jtiM, mahdollisesti jonkin metall isuolan läsnäollessa .
5 0.1 igosakkar i di, joka on valmistettu saattamalla polysakkaridi depolymerointireaktioon 0RD:n avulla muodostuu joukosta molekyylejä, joiden keskimääräinen elointivakio on pienempi kuin polysakkaridilla, josta se fragmentoimalla on johdettu (vertailussa käytetty luonnollisesti samaa kromatografiakolonnia).
10 Oligosakkaridi voidaan eristää perinteisen tekniikan avulla, esimerkiksi saostamalla jonkin sopivan säestävän aineen kuten asetonin tai alkoholin avulla, suodattamalla kalvolla, jonka erotuskyky on sopiva, ekskluusio-diffuusio- tai ioninvaihtokro-matografian avulla. Tämän jälkeen voidaan valita käyttöön vain 15 tiettyjä oligosakkaridifraktioita, jotka sisältävät molekyylejä, joiden eluointivakio on sama tai suunnilleen sama kuin keskimääräinen eluointivakio.
Valinnaisesti keksinnön mukainen oligosakkaridi voidaan liittää 20 kovalenttisin sidoksin yhdisteeseen, joka on luonteeltaan peptidin, proteiinin tai jonkin muun orgaanisen polymeerin kuten polyakrylaatin kaltainen, ja muodostaa konjugaatti, joka edis-tää oligosakkaridin immunogeenisyyttä erityisesti nisäkkäillä. Konjugaattikumppani voi olla erityisesti bakteriaalinen prote-
'< I
: 25 Uni, esimerkiksi toksiini, vastaava anatoksiini tai multimee- risen toksiinin aliyksikkö samoin kuin kalvoproteiini, multi- ! meerisen kaivoproteiinin tai sytoplasmisen proteiinin aliyksik kö. Esimerkkinä voidaan mainita toksiinit, jotka liittyvät hinkuyskään, koleraan, jäykkäkouristukseen ja kurkkumätään.
» .* 30 Nämä proteiinit voidaan uuttaa alkuperäisistä bakteereista tai * · » » * saada rekombinaatiomenetelmin.
*
Liitosreaktio kovalenttisin sidoksin oligosakkaridille ja kon-jugaatiokumppanille rokotteena käytettävän konjugaatin valmis- ‘ 35 tamiseksi voidaan toteuttaa perinteisin menetelmin. Voidaan .· esimerkiksi saada oligosakkaridiin ilmestymään funktionaalinen .1 1 110164 ryhmä, joka voi reagoida kori jugaattikumppanin funktionaalisen r yhmän kanssa. Voidaan myös saattaa reaktioon bi funkt-ionaali-nen liitosaine oiigosakkaridin kanssa ja sen jälkeen konjugaat-t:ikumppanin kanssa tai päinvastoin. Yleiskuvan näistä erilai-1 5 sista liitostavoista voi saada erityisesti teoksesta W.E. Dick and M. Beurret, Conjuguates Vaccines, J.M. Cruse, R.E. Lewis Jr Eds, Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, (1988) 10 : 48. Lisäksi fragmentoitäessä hapetus-pelkistysfragmentointi-menetelmällä muodostuu pelkistäviä ryhmiä, erityisesti oligo-10 sakkarideissa, jotka on johdettu seuraavista: S. pneumoniae tyyppi 6B ja 19F, H. influenzae ja N. meningitidis ryhmä A.
Tämä mahdollistaa siis konjugointitekniikan, jossa käytetään pelkistävää aminointia.
15 Keksinnön mukaisen oligosakkaridin immunogeenisyyttä voidaan edistää myös käyttämällä kanninliposomeja, joihin oligosakkaridit on liitetty kovalenttisin sidoksin. Immunogeenisyyttä edistävät lisäksi myös vektorit, jotka säilyttävät oligosakkaridin yhtenäisen kokonaisuuden muodostaen ionisten tai hydrofo-20 bisten voimien avulla, esimerkiksi syklodekstriinit, liposomit tai ISCOMit.
Keksintö koskee siis edellä esitetyllä tavalla määritettyä oli- i ',· gosakkaridia, eri muodoissaan, erityisesti konjugaatin muodossa, ϊ 25 kännin]ipösömiin liitettynä tai vektoriin sisällytettynä. Tä-» , män keksinnön eräässä suositeitavimmassa toteutusmuodossa oli-* ! gosakkaridi on konjugaatin muodossa.
Keksinnön mukainen oligosakkaridi soveltuu erityisesti vahvis-** 30 tamaan yksilön immuunipuolustusta nisäkkäillä, erityisesti ih- ’ misellä, esimerkiksi ehkäisemään tai lieventämään sellaisen infektion vaikutuksia, jonka on aiheuttanut patogeeninen aine, esimerkiksi bakteeri- tai sieni-infektio. Voidaan käyttää erilaisista antigeenisistä polysakkarideista johdettujen keksinnön i ‘ 35 mukaisten oligosakkaridien seoksia samoin kuin keksinnön mu- ,* kaista oligosakkaridia seoksena muiden aktiivisten aineiden i 2 110164 kuin keksinnön mukaisen oligosakkaridin kanssa. Tällaiset, seokset soveltuvat moni.tehoisten rokotteiden vaimistukseen.
Tämän vuoksi, keksinnön kohteena ovat myös: 5 - Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana vähintään yhtä keksinnön mukaista oligosakkaridia: koostumus on erityisesti rokote; 10 - Keksinnön mukaisen oligosakkaridin terapeuttinen käyttö; - Menetelmä vahvistaa yksilön immuunipuolustusta esimerkiksi rokottamalla, johon kuuluu terapeuttisesti katsoen riittävän määrän antaminen vähintään yhtä keksinnön mukaista oligosakka- 15 ridia kohteelle, joka on tällaisen käsittelyn tarpeessa, esimerkiksi. tällaisen rokotteen tarpeessa; - Keksinnön mukaisen oligosakkaridin käyttö aktiivisena aineosana valmistettaessa farmaseuttista koostumusta, jonka tarkoi— 20 tus on vahvistaa yksilön immuunipuolustusta; .·. - Menetelmä valmistaa edellä määritellyn kaltainen farmaseutti- ne n koostumus, tunnettu siitä, että siinä (i) saatetaan lähtö- polysakkaridi hapetus-pelkistysdepolymerointireaktioon, (il) '/25 haluttaessa, liitetään saatu oligosakkaridi konjugaattikump-• · » *· ’· paniin tai liposomiin, tai sisällytetään se liposomeihin, IS- » * t : .* COMeihin tai syklodekstriineihin ja (lii) saatava tuote pannaan V : sopivaan farmaseuttiseen muotoon.
: Suositeltava farmaseuttinen koostumus sisältää vähintään yhden t · oligosakkaridin konjugaatin muodossa.
'·*' Keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus voidaan valmistaa *···' perinteiseen tapaan. Erityisesti liitetään keksinnön mukainen oligosakkaridi farmaseuttisesti katsoen sopivaan laimentimeen tai kantimeen, esimerkiksi pyrogeenittömään fysiologiseen suo- .13 110164 lal.luokseen. Keksinnön mukainen koostumus voi lisäksi sisältää tavallisia aineosia kuten puskuriainetta, säilytys- tai stabilointiainetta, adjuvanttia ja, tarvittaessa, kylmäkuivaus si-dosa.inetta. Keksinnön mukainen oligosakkaridi voidaan säilyt-5 tää kun läsnä on laimenninta, kanninta tai jotain edellä esiin tuotua aineosaa. Vaihtoehtoisesti laimenninta, kanninta tai aineosaa voidaan lisätä juuri ennen käyttöä.
Tämän vuoksi keksintö tuo esiin vaihtoehtona kokonaisuuden 10 ("kitti”), jonka osia ovat: a) farmaseuttinen koostumus, jonka pääasiallisena aktiivisena aineosana on vähintään yhtä keksinnön mukaista oligosakkaridia; 15 b) koostumus, joka sisältää vähintään yhtenä elementtinä jotain seuraavista: farmaseuttisesti hyväksyttävä laimennin tai kännin, puskuroivasti vaikuttava yhdiste, säilyttävä tai stabiloiva aine ja adjuvantti; 20 c) ohjeet samanaikaiseen antoon, esimerkiksi kohtien a) ja b) koostumusten seoksen muodossa.
• · ,·, : Keksinnön mukaista koostumusta voidaan antaa mitä tahansa ta- • · · * vallista tapaa käyttäen, erityisesti, subkutaanisesti, intramus-!*2J5 kulaarisesti tai intravenoosisti, esimerkiksi injektoitavan | · suspension muodossa tai suun kautta. Anto voi tapahtua kerta- ♦ ·* annoksena tai toistuvasti yhden tai useamman kerran tietyn ai-V · kavalin jälkeen. Sopiva annos vaihtelee eri parametrien mukaisesti, esimerkiksi hoidettavan yksilön ja antotavan mukaan.
• · · : '2:0 Mainittakoon kuitenkin, että hyviä tuloksia saavutetaan kerta-: : ; annoksien ollessa 1 - 200 pg oi.....Lgosakkaridia noin 1,5 ;ml:n ti lavuudessa.
• · · • * · • · · ·;·’ Keksintöä esitellään tarkemmin seuraavissa esimerkeissä, joissa » · · ::35 viitataan kuvioihin 1-4.
14 110164
Kuvio 1 esittelee Loistoyksiköitä, joita on seuraavien mikrobien kapsulaarisissä polysakkarideissa: S. pneumoniae tyyppi 14 (a), tyyppi 1 (b), S. typhj (e), S. pneumoniae tyyppi 6B (d), H. influenzae tyyppi B (e), S. pneumoniae tyyppi 1 9F (f), N.
5 meningitidis ryhmä A (g), S. pneumoniae tyyppi 18C (h), tyyppi 23F (i), Klebsiella ozaenae serotyyppi K4 (j), Shigella flexne-ri serotyyppi Ib (k) ja Cryptococcus neoformans kanta 98 (1). Huomattakoon, että (a) vastaa neutraalia polysakkaridia, (b) ja (c) vastaavat polysakkarideja, joissa on uronihappoja polysak-10 karidiketjussa, (d) ja (i) vastaavat fosforyloituja polysakkarideja, (j) ja (k) vastaavat lipopolysakkarideja, unionista ja neutraalia, ja (1) vastaa anionista sienen polysakkaridia.
Kuviot 2A ja 2B esittävät S. typhin (2A) ja S. pneumoniae tyy-15 pin 1 (2B) fragmentoimattomien polysakkaridien eluointikäyriä Sepharose 4BCL-kolonnissa. Kromatografiaolosuhteet ovat seuraavanlaiset: Sepharose-kolonniin, joka on etukäteen tasapainotettu NaCl 0,2 M:11a, pannaan 2 ml polysakkaridiliuosta, jonka pitoisuus on 5 mg/ml. Eluointi toteutetaan käyttämällä NaCl 20 0,2 M nopeudella 42 ml/h. Eluointikäyrä tulee analysoitua automaattisesti mittaamalla optinen tiheys 206 nm:ssa. 2A:ssa ja .·. 2B:ssä kolonnin kuolluttilavuus on 76,56 ml, kokonaistilavuus .·. : 201,84 ml.
'.'/•.5 Kuvio 3 esittää dekstraania käyttäen laadittavan asteikkosarjän • * 500.000:sta 20.000:een.
• · * V ' Kuvioissa 4A ja 4B esitetään oligosakkaridien eluointikäyriä, jotka on saatu, suorittamalla hapetus-pelkistysfragmentointi S.
• *30 typhin (4A) ja S. pneumoniae tyypin 1 (4B) polysakkarideille
Sepharose 4BCL-kolonnissa. Kromatografointiolosuhteet ovat \ samat kuin edellä tuotiin esiin kuvion 2 kuvauksessa.
I » · • « · ·*· Esimerkki 1 .* : 35 S. typhin polysakkaridin Vi f ragmentointi askorbiinihapon läs-:***: näollessa: 110164 15
Polysakkaridi Vi:n kuivaa jauhetta, joka on saatu Gotsehliehin menetelmällä, Gotschlich et ai, Prog. Tmmunobiol. Standard. (1972) 5 : 485, käsitellään pyrogeenittömällä vedellä, 1 mg/ml. Polysakkaridin keskimääräinen molekyylipaino (PM) vastaa KD nol-5 laa Sepharose 4BCL-kolonnissa.
500 ml:aan tätä valmistetta, joka on etukäteen kuumennettu 37 C:een lisätään hitaasti, ja jatkuvasti 2 tunnin ajan 12,5 ml vesiliuosta, joka sisältää 100 mM askorbiinihappoa, 10 mM CuS04 10 ja 10 mM FeS04, eli lopullinen askorbiinihappopitoisuus on 0,44 mg/rnl. Näin saadun reaktioliuoksen pH on noin pH 4. Reaktion annetaan jatkua samalla varovasti sekoittaen noin 3 h (aktiivisen aineen .1 .isäysaika mukaanlukien) 37°C:ssa.
15 Reaktioseos suodatetaan sitten ultrasuodatuskalvolla 3K (kat-kaisuraja : 3 kilodaltonia). Retentaatti pestään ensin kerran NaCl 0,5 M liuoksella, sitten toisen kerran vedellä. Retentaatti otetaan noin 100 ml:aan vettä ja kylmäkuivataan säilyttämistä varten.
20
Pilkkoutumisaste on noin 95% laskettuna Sepharose 4BCL-kolon-nissa suoritetusta geelisuodatuksesta saatujen käyrien integ-: roinnista (kuvio 4A). Näin saadun oligosakkaridin keskimääräi nen molekyylipaino arvioidaan Granathin menetelmällä, Granath *.'%5 et ai, (supra). Tämä, keskimääräisenä eluointivakiona ilmoi-/ / tettuna, on luokkaa 0,6, toisin sanoen molekyylipaino on noin * ·' 60 000 EqD (dekstraani vertailukohteena).
Oligosakkaridille suoritettu NMR-spektrometrianalyysi (nuclear j *30 magnetic resonance) osoittaa selvästi, että polysakkaridin tyy-pii linen toi st oy ks i kön rakenne on säilynyt fragmentoinnin jälkeen. Erityisen huomattavaa on, että ei ole menetetty yhtään haarautuneita funktionaalisia ryhmiä tai polysakkaridirungon sokereita.
35 16 110164
Polysakkaridin Vi to1stoyksikön tyypilliset kemialliset funktiot analysoidaan koi ori metrian avulla. O-asetyyliryhmä haarautuneessa asemassa analysoidaan Hestritiin menetelmällä, Hestrin, Biol. Che®. (1949) 188 : 249, lineaarisen rakenteen polyhappo 5 puolestaan menetelmällä jonka ovat kehittäneet Stone et ai,
Cl in. J. Microbiol. (1988) 28 : 719. Kokeet suoritetaan rin-I nukkain fragmentoimattomalle polysakkaridille Vi ja muodostu neelle oligosakkaridille.
10 Polysakkaridille ja oligosakkaridille mitatut suhteet [O-ase-tyyli]/[polyhappo] ovat identtiset. Tämä osoittaa hyvin, että polysakkaridin fragmentointimenetelmä on auttanut säilyttämään kaikki labiilit O-asetyyliryhmät.
15 Esimerkki 2 S. typhin polysakkaridin Vi fragmentointi vetyperoksidin (H202) läsnäollessa:
Polysakkaridi Vi:n kuivaa jauhetta, joka on saatu menetelmällä, 20 jonka ovat kehittäneet Gotschlich et ai, (supra), otetaan fosfaattipuskuriin 0,2 M pH 7,5 pitoisuuteen 0,4 mg/ml. Polysak-karidin molekyylipaino vastaa KD nollaa Sepharose 4BCL-kolonnis- ,* * * S3. · . 5.5 100 ml:aan tätä valmisteetta, joka on etukäteen kuumennettu ,* / 37°C:een lisätään hitaasti ja samalla varovasti sekoittaen 11 • | ml vesiliuosta, joka sisältää 0,3 mg/ml H202 ja 1,1 ml CuS04 ’·’ ‘ liuosta, pitoisuus 2,6 mg/ml. Reaktiota jatketaan samalla varovasti sekoittaen noin 1 h 37*C:ssa.
|**30 : : Koe toistetaan muutoin samoissa olosuhteissa, mutta reaktioaika on yhden tunnin asemesta 2 tuntia.
• » » "· Molemmissa tapauksissa saatava oligosakkaridi kootaan ja puh-ν’ 35 distetaan esimerkissä 1 kuvattuun tapaan.
j 7 ί 110164 Näin saadun oligosakkaridien ominaispiirteet määritetään samoin esimer ki ssä 1 mainituilla menetelm.i .1 lä. Tulokset ovat seuraa— vat: 5 - Molemmissa tapauksissa polysakkaridin Vi piikkoutumisaste on luokkaa 100 %.
Yhden ja kahden turmin jälkeen muodostuneiden oligosakkaridien keskimääräiset molekyylipainot ovat KD-arvoina luokkaa 0,7 ja 10 0,8, toisin sanoen 30.000 ja 10.000 EqD.
- Kummassakaan tapauksessa toistoyksikön rakenteessa ei ole havaittavissa muutoksia.
15 Esimerkki 3 N. meningitidis ryhmän A polysakkaridin fragmentointi: N. meningitidis ryhmän A polysakkaridin kuivaa jauhetta, joka on saatu menetelmällä, jonka ovat kehittäneet Gotschlich et ai, 20 (supra), otetaan fosfaattipuskuriin 0,2 M pH 7,5 joko pitoisuuteen 1 mg/ml tai p.i toi suuteen 5 mg/ml. Polysakkaridin keski— määräinen molekyylipaino vastaa K„ 0,15:ä Sepharose 4BCL-kolon-: nissa mitattuna.
.2.5 Valmisteet 1 ja 5 mg/ml kuumennetaan etukäteen 37°C:een.
• ♦ · • · .1 8 i 110164 ! liuosta, joka sisältää 100 mM. askorbi inihappoa, 1.0 mM CuS04 ja 10 mM FeS04, lopulliseksi askorbiinihappopitoisuudeksi tulee 0,26 mg/ml. Reaktion annetaan jatkua samalla sekoittaen 1 h 30 min samoissa olosuhteissa.
5
Kohdista 3a) ja 3b) saadut, oligosakkaridit kootaan ja puhdistetaan esimerkissä 1 kuvattuun tapaan. Analyysit suoritetaan esimerkin .1 tapaan. Mol emmi ssa tapauksissa on havaittavissa 100-prosenttinen pilkkoutuminen ilman toistoyksikön rakenteen 10 huononemista. NMR-arialyysi. Kohdasta 3a) saadun oiigosakkari-din keskimääräinen molekyylipaino vastaa Kd-arvoa 0,7 (eli 30.000 EqD), ja kohdasta 3b) saadun oligosakkaridin keskimääräinen molekyylipaino puolestaan vastaa Kd-arvoa 0,4 (eli 110.000 EqD).
15 Nämä tulokset kaikki yhdessä osoittavat, että vaihtelemalla koeolosuhteita (polysakkaridin ja hapetus-pelkistysaktiivisen aineen pitoisuus samoin kuin aktiivisen aineen lisäystapa ja reaktioaika) pystytään saamaan aikaan olennaisesti erilaisen 20 keskimääräisen molekyylipainon omaavia oligosakkarideja pilk-koutumisasteen pysyessä 100-prosenttisena.
Lopuksi voidaan sanoa, että tämä esimerkki samoin kuin esimerk- ..·. ki 2 osoittavat, että kyseessä on hapetus-pelkistysfragmentoin- .*,35 ti, ei happo- tai emäshydrolyysin avulla tapahtuva, koska tämä .* fragmentointi pystytään toteuttamaan pH:n ollessa lähes neut- raali.
i i :
Esimerkki 4 • '.jo S. pneumoniae tyypin 1 ja 19F ja H. influenzae tyypin B poiysak->/· ' karidin fragmentointi:
Toistetaan esimerkki 3 (3a ja 3b) käyttämällä S. pneumoniae tyyppien 1 ja 19F polysakkarideja, jotka on saatu menetelmällä, 35 jota on kuvattu ranskalaisessa patenttihakemuksessa FR-2495939, : _ julkaistu 18.6.1982, sekä H. influenzae tyypin B polysakkaride- 19 110164 ja, jotka on saatu menetelmällä, jonka ovat: kehittäneet Gotsch-1ich et ai, (supra).
Tulokset ovat: 5
Tapa a) Tapa b)
Kanta Polysakkaridin kesklmää- OJ igosakkaridin Pilkkoi»- Oligosakkaridin Pilkkoa- rätnen moiekyylipaino keskimääräinen tuois- keskimääräinen tunis molekyylipai.no aste mol eky ylipaino aste S. pneumoniae 1 0,04 0,β4 100 0,35 100 S. pneumoniae 19? 0,04 0,80 1.00 0,38 100 Ί n 0,1 0.75 100
_L U N. influenzae B NO NO
ND = ei määritetty
Oligosakkaridille suoritettu NMR-spektrometrianalyysi (nuclear 15 magnetic resonance) osoittaa selvästi, että polysakkaridin tyypillinen toistoyksikön rakenne on säilynyt fragmentoinnin jälkeen.
Esimerkki 5 \:2?0 N. meningitidis ryhmän A ja S. pneumoniae tyyppien 1, 14, 18C, · 19F ja 23F polysakkaridien fragmentointi puskuroimattomassa : : : ympäristössä: : V. Polysakkaridien valmistus ja reaktiot toteutetaan kuten esimer-t ;=25 keissä 3 ja 4 seuraavin poikkeuksin: (i) polysakkaridipreparaa-tit valmistetaan pitoisuuteen 5 mg/ml pyrogeenittömään veteen, ... (ii) reaktioliuos lisätään yhdellä kertaa lopulliseen pitoisuu-'teen 2,5 mg/ml ja (lii) reaktiota jatketaan vain 1 tunnin ajan.
• : /30 Saadut oligosakkaridit kootaan ja puhdistetaan esimerkin 1 ta-paan. Niiden ominaispiirteet arvioidaan kuten esimerkissä 1. Kaikkien polysakkaridien pilkkoutumisaste on 100% ilman, että Y ' toistoyksikköjen rakenne olisi huonontunut. Tämä viimeksi mai-*···' nittu osoitettiin myös kolorimetrian avulla: Heksoosien analyy- p.o 110164 sissä menetelmä oli Scott et ai, Anal. Chem. (.1953) 25 : 1650, heksosamiineilla menetelmänä oli Gatt et ai, Anal. Biochem. (1965) 15 : 167, ramnoosilla menetelmänä oli Dische et ai, J. Biol. Chem. (1948) 175 : 595 ja fosfaatilla menetelmänä oli 5 Chen et ai, Anal. Chem. (1956) 28 : 1756. S. pneumoniae tyypin 14 oligosakkaridin ja siitä fragmentoimalla johdetun oligosakkaridin suhteet [heksoosij/[heksosamiini] ovat olennaisesti samat. Samoin on asian laita suhteissa framnoosi]/[heksoosi] ja [fosfaatti]/[heksoosi] kun kyseessä ovat S. pneumoniae tyy-10 pit 18C ja 23F.
Oligosakkarideille suoritettu NMR-spektrometrianalyysi ei tuo esiin merkkejä, jotka viittaisivat toistoyksikköjen heterogeenisyyteen, vaan osoittaa siis, että oligosakkaridien toisto-15 yksikkö on säilynyt koskemattomana.
Oligosakkaridien keskimääräistä molekyy1ipainoa koskevat tulokset ovatkin seuraavanlaiset: 20 Kanta Polysakkaridin Oligosakkaridin keskimääräinen keskimääräinen molekyylipaino (KD) moiekyylipaino (KD) ; N.meningitidis A 0,15 0,66 .·. : S.pneumoniae 1 0,04 0,72 S.pneumoniae 14 0,01 0,72 * · \iS’ S. pneumoniae 18C 0,03 0,75 ' 25 S.pneumoniae 19F 0,04 0,67 S.pneumoniae 23F 0,07 0,57 : :': Esimerkki 6 * · * ;’”30 Konjugaatin S. typhin oligosakkaridi Vi/koleratoksiinin aliyk-sikkö B valmistaminen: i · f *»··* 6a) NHa-ryhmän vieminen oligosakkaridiin Vy.
2i 110164
Esimerkin 1 tapaan saatu oligosakkaridin Vi lyofilisaatti ote-I taan puskuri fosfaatti in, pH 8, pitoisuuteen 10 mg /nti. Tähän valmisteeseen lisätään diaminoheksaania ja NaCNBH3 liuoksina, lopulliset pitoisuudet 12,5 mg/ml. Reaktion annetaan jatkua 6 5 päivää ympäröivässä lämpötilassa. Sitten valmiste dialysoidaan vettä vasten ja kylmäkuivataan.
Analysoimalla menetelmällä, jonka ovat kehittäneet Shnyder et ai, Anal. Biochem. (1975) 64 : 284, tarkistetaan, ovatko NH2-10 ryhmät siirtyneet hyvin. Hestrinin kokeella osoitetaan, että 0-asetyy1iryhmät ovat edelleen säilyneet.
6b) Reaktiivisen funktionaalisen ryhmän tuominen 15 Kohdan 6a) lyofilisaattia otetaan liuokseen pitoisuuteen 40 mg/ml. 20 ml:aan tätä valmistetta lisätään 80 ml liuosta, joka sisältää 40 mg/ml disuksinimidyylisuberaattia (DSS) dimetyy-lisulfoksidissa (DMSO), Reaktion annetaan jatkua huoneen lämmössä yhden tunnin ajan. Sitten valmiste seostetaan seoksessa 20 DMSO/dioksaani.
. 6c) Konjugointi • · · • · « • · . Kohdan 6b) presipitaatti otetaan liuokseen, jossa on NaCl 0,5 M * * · ,*,25 pitoisuudella 40 mg/ml. Rinnan valmistetaan koleratoksiinin * « · aliyksikön B liuos (Tayot et ai, Eur. J. Biochem. (1981) 113 : 249) puskurifosfaatissa 0,2 M, pH 6,5, pitoisuus 10 mg/ml.
* * ·
Valmistetut kaksi liuosta sekoitetaan yhteen. Painosuhde oli-: .30 gosakkaridi/proteiini on noin 1. Reaktion annetaan jatkua ym-*'.· · päröivässä lämpötilassa 15 tunnin ajan.
,*··, 6d) Puhdistaminen v 35 Seos suodatetaan ultrasuodatusminikasetissa (Millipore), jonka kalvon erotuskynnys on 5.10“ daltonia proteiinin ja konjugoitu- 22 110164 mattonaan oligosakkaridin poistamiseksi· Retentaatti pestään NaCl 0,3 Milla ja säilytetään pitoisuudella 200/ig/ml NaCl:ssa 8/1.000, mertiolaatti 1/10.000, 4°C:ssa, steriilisuodatuksen jälkeen.
5
Esimerkki 7
Konjugaatio o 1 i g o sakkaridi/tetanusanatoksiin i. valmistaminen:
Konjugoidaan oligosakkarideja, jotka on saatu esimerkin 5 talo paan S. pneumoniae tyyppien 14 ja 23F polysakkarideista ja oligosakkarideja, jotka on saatu esimerkin 1 tapaan S. typhin polysakkaridista Vi toimimalla samoin kuin esimerkissä 6 ja korvaamalla koleratoksiinin aliyksikkö B tetanusanatoksiinilla, joka on valmistettu menetelmällä, jonka ovat kehittäneet Muel-15 ler ja Miller (Mueller and Miller, J. Bact. (1954) 67 : 671.
S. pneumoniaen oligosakkarideista saatuja konjugaatteja säilytetään pitoisuudella 250μρ/πι1.
20 Esimerkki 8
Konjugaattien immunogeenisen kyvyn toteennäyttäminen: * ♦ OFl-hiiriä (Iffa Credo) jaetaan 8 ryhmiin. Jokainen ryhmän ; hiiri saa 0,5 ml esimerkin 6 tai 7 tai molempien liuosta, 0,5 25 ml vastaavia luonnon polysakkarideja. Injektiot tehdään ihon ;*,·, alle. Injektiot toistetaan 14 päivän kuluttua. Rinnan piue-tään verrokkiryhmä, joka saa pelkkää fysiologista vettä.
• » · 14 ja 28 päivää ensimmäisen injektion jälkeen otetaan verinäyte i · » ’ .30 ja anti-polysakkaridi vasta-aineet IgG titrataan ELISA-kokeella v ’ (titrauslevyt peitetään fragmentoimattomilla polysakkarideil- . .·. la). Vasta-ainepitoisuudet 14 ja 28 päivän kuluttua osoitta- vat, että konjugaatit ovat immunogeenisiä. Kaikissa tapauksis-’·* sa vasta-ainepitoisuus on suurempi kuin vastaavalla luonnon V 35 polysakkaridilla aikaan saatu. Lisäksi on havaittavissa uudel- » i « * * 23 110164 leansitoutumisva ikutus , joka on tyypillinen T-rLippuvaisel le ant i geeπ i11e.
Esimerkki 9 5 Aktiivisena aineosina konjugaatteja sisältävä farmaseuttinen rokotekoostumus:
Muodostetaan esimerkin 7 mukaisesti saadusta S. typiiin oligosakkaridin Vi ja tetanusanatoksiinin konjugaatista 0#5 ml:n 10 rokoteannos injektoitavaksi subkutaanisesti ihmiselle. Annoksen koostumus: - Konjugoidut S.typhi oligosakkaridit Vi 10 μg - Puskuritosfaatti pH 7 475 μg (P04-ioneina) 15 - NaCl 4250 μg - Mertiolaatti 0,05 μg __ Vesi p.p.i. q.s.p. 0,5 ml ♦ » * < · * » * * * · · i t f

Claims (39)

110164 Pat ent t ivaat imukset
1. Menetelmä oligosakkaridin valmistamiseksi depolymeroimalla antigeeninen polysakkaridi, joka on saatu patogeenisestä aineesta ja jonka toistuvat perusyksiköt sisältävät ainakin yhden 5 labiilin funktionaalisen ryhmän, säilyttäen toistuvien perusyksiköiden labiileja funktionaalisia ryhmiä sisältävä rakenne, jotka labiilit funktionaaliset ryhmät, jotka määritellään funktioina, jotka polysakkaridin ollessa fragmentoimalla ultraäänellä tai hydrolysoimalla happamassa tai emäksisessä ympäris-10 tössä tapahtuvan depolymerointiprosessin kohteena joutuvat antigeenisyyttä heikentävän muutoksen alaiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä on seuraavat vaiheet: (i) saatetaan tämä polysakkaridi hapetus-pelkistysdepolymeroin-tireaktioon, 15 (ii) kootaan näin saatu oligosakkaridi ja, haluttaessa, (iii) joko liitetään vaiheesta (ii) saatu oligosakkaridi konjugaattikumppaniin tai kantajaan tai yhdistetään vaiheesta (ii) saatu oligosakkaridi vektoriin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, .'.20 että hapetus-pelkistysdepolymerointireaktio toteutetaan hape- tus-pelkistysaineen, joka on askorbiinihappo tai vetyperoksidi, • . ollessa läsnä. • t t
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ’ ’ l että hapetus-pelkistysdepolymerointireaktio toteutetaan metal-25 lisuolan, joka valitaan raudan tai kuparin suolojen joukosta, :\j ollessa läsnä. • · • · ·;·’ 4. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- : telmä, tunnettu siitä, että hapetus-pelkistysdepolymerointi- reaktio toteutetaan vesiliuoksessa, joka sisältää 0,5 - 50 ..'30 mg/ml mainittua polysakkaridia. : 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuos sisältää 0,5 - 10 mg/ml mainittua polysakkaridia. 110164
6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuoksen pH on alueella 3 - 8,5.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuoksen pH on alueella 3 - 6,5.
58. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetus-pelkistysdepolymerointi-reaktio toteutetaan lämpötilassa, joka on alueella 4 - 60 °C.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on alueella 18 - 40 °C.
10. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 2-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetus-pelkistysaine on askorbiinihappo, jota käytetään pitoisuutena 0,01 - 25 mg/ml.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että askorbiinihappoa käytetään pitoisuutena 0,1 - 10 mg/ml.
12. Patenttivaatimuksen 3 tai patenttivaatimuksen 3 ja minkä tahansa patenttivaatimuksen 4-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metallisuoloja on läsnä pitoisuutena 1 μΜ - 100 mM.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metallisuoloja on läsnä pitoisuutena 1-10 mM.
14. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, « t · .! .1 tunnettu siitä, että hapetus-pelkistysaine on vetyperoksidi, •ti; jota käytetään pitoisuutena 0,1 - 100 mM.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, .’. j että vetyperoksidia käytetään pitoisuutena 0,5 - 10 mM. • · ·;2Ϊ5 16. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- : : : telmä, tunnettu siitä, että labiili funktionaalinen ryhmä väli- • · · » taan fosfaatti-, o-asetyyli- ja pyruvaattiryhmien joukosta. ’· 17. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- telmä, tunnettu siitä, että antigeeninen polysakkaridi on pato-30 geenisestä bakteerista saatu kapsulaaripolysakkaridi. 110164
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patogeeninen bakteeri valitaan ryhmästä: Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Escherichia, Neisseria j a Haemophilus.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patogeeninen bakteeri valitaan ryhmästä: S. typhi, S. pneumoniae, N. meningitidis ja H. influenzae.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä on vaihe (iii) .
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugaattikumppani valitaan ryhmästä: peptidi, proteiini ja orgaaninen polymeeri.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konjugaattikumppani on bakteriaalinen proteiini.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteriaalinen proteiini valitaan ryhmästä: toksiini, anatoksiini, multimeerisen toksiinin aliyksikkö, kalvoproteiini ja multimeerisen kalvoproteiinin aliyksikkö. • ·
24. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ’· 2¾ että kantaja on liposomi.
25. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on valittu ryhmästä: syklodekstriinit, liposomit ja ISCOMit. .••25 1. Förfarande för framställning av en oligosackarid genom de- '·’ polymerisation av en antigen polysackarid, som har erhällits ur : ett patogent ämne och vars upprepade basenheter innehäller ät- :...· minstone en labil funktionell grupp under bibehällande av den ;·. hos de upprepade basenheterna existerande strukturen som inne-• * · ,·.3Ρ f attar de labila funktionella grupperna, vilka labila funktio-nella grupper, vilka definieras som funktioner, när polysacka-riden är föremäl för en depolymerisationsprocess genom frag-mentering med ultraljud eller genom sur eller alkalisk hydro- 110164 lys, undergär en modifiering som försvagar den antigena egen-skapen, kannetecknat av att förfarandet innefattar följande steg: (i) man läter nämnda polysackarid undergä en oxidations-reduk-5 tionsdepolymerisationsreaktion, (ii) man uppsamlar den sälunda erhällna oligosackariden, och, man om man önskar, (iii) antingen fogar den i steg (ii) erhällna oligosackariden tili en konjugatpartner eller bärare eller förenar oligosackariden som erhällits i steg (ii) med en 10 vektor.
2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att oxida-tions-reduktionsdepolymerisationsreaktionen genomförs i närvaro av ett oxidations-reduktionsmedel, som utgörs av askorbinsyra eller väteperoxid. 15 3. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att oxida- tions-reduktionsdepolymerisationsreaktionen genomförs i närvaro av ett metallsalt, som väljs ur en grupp som bestär av järn-eller kopparsalter.
4. Förfarande enligt vilket som heist föregäende patentkrav, ’•2Ö kännetecknat av att oxidations-reduktionsdepolymerisations- reaktionen genomförs i en vattenlösning som innehäller 0,5 - 50 • * * \ mg/ml av nämnda polysackarid.
5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att vatten-lösningen innehäller 0,5 - 10 mg/ml av nämnda polysackarid. *.’2£ 6. Förfarande enligt patentkrav 4 eller 5, kännetecknat av att lösningens pH är i omrädet 3 - 8,5. :·· · 7. Förfarande enligt patentkrav 6, kännetecknat av att lös- ningens pH är i omrädet 3 - 6,5. \ 8. Förfarande enligt vilket som heist föregäende patentkrav, ‘•30 kännetecknat av att oxidations-reduktionsdepolymerisations- reaktionen genomförs vid en temperatur som ligger i omrädet 4 -60 °C. 110164 I 9. Förfarande enligt patentkrav 8, kännetecknat av att tempe- j raturen är i omrädet 18 - 40 °C.
10. Förfarande enligt vilket som heist patentkrav 2-9, kännetecknat av att oxidations-reduktionsmedlet är askorbinsyra, som 5 används i en koncentration av 0,01 - 25 mg/ml.
11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av att askor-binsyran används i en koncentration av 0,1 - 10 mg/ml.
12. Förfarande enligt patentkrav 3 eller patentkrav 3 och vilket som heist av patentkraven 4-11, kännetecknat av att metall- 10 salter är närvarande i koncentrationen 1 μΜ - 100 mM.
13. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat av att metall-salter är närvarande i koncentrationen 1-10 mM.
14. Förfarande enligt vilket som heist patentkrav 1-9, kännetecknat av att oxidations-reduktionsmedlet är väteperoxid, som 15 används i en koncentration av 0,1 - 100 mM.
15. Förfarande enligt patentkrav 14, kännetecknat av att väteperoxid används i en koncentration av 0,5 - 10 mM.
16. Förfarande enligt vilket som heist föregäende patentkrav, ·.’·· kännetecknat av att den labila funktionella gruppen väljs ur en . :2t) grupp som bestär av fosfat-, o-acetyl- och pyruvatgrupper. .! 17. Förfarande enligt vilket som heist föregäende patentkrav, kännetecknat av att den antigena polysackariden är en kapsular ·’‘ polysackarid som erhällits ur en patogen bakterie.
18. Förfarande enligt patentkrav 17, kännetecknat av att den • · .*25 patogena bakterien väljs ur en grupp bestäende av: Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Salmonella, Escherichia, Neis- » · · :·: : seria och Haemophilus.
19. Förfarande enligt patentkrav 18, kännetecknat av att den pa-. togena bakterien väljs ur en grupp bestäende av: S. typhi, S. 3*0 pneumoniae, N. meningitidis och H. influenzae. 110164
20. Förfarande enligt vilket som heist patentkrav 1-19, känne-tecknat av att förfarandet innefattar steg (iii).
21. Förfarande enligt patentkrav 20, kännetecknat av att nämnda konjugatpartner väljs ur en grupp som bestar av: en peptid, ett 5 protein och en organisk polymer.
22. Förfarande enligt patentkrav 21, kännetecknat av att konju-gatpartnern är ett bakteriellt protein.
23. Förfarande enligt patentkrav 22, kännetecknat av att det bakteriella proteinet väljs ur en grupp som bestar av ett 10 toxin, ett anatoxin, en undergrupp av ett multimert toxin, ett membranprotein samt en undergrupp av ett multimert membranpro-tein.
24. Förfarande enligt patentkrav 20, kännetecknat av att bäraren utgörs av en liposom. 15 25. Förfarande enligt patentkrav 20, kännetecknat av att vek-torn är vald ur en grupp som bestar av: cyklodextriner, lipo-somer och ISCOM:er. • i · » 1 · · » ·
FI932626A 1991-10-10 1993-06-09 Menetelmä oligosakkaridin valmistamiseksi depolymeroimalla antigeeninen polysakkaridi FI110164B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9112478A FR2682388B1 (fr) 1991-10-10 1991-10-10 Procede de preparation d'un oligoside par depolymerisation d'un polyoside issu d'un agent pathogene, oligoside ainsi obtenu et son utilisation notamment comme agent vaccinal.
FR9112478 1991-10-10
PCT/FR1992/000955 WO1993007178A1 (fr) 1991-10-10 1992-10-09 Oligoside derive d'un polyoside antigenique issu d'un agent pathogene
FR9200955 1992-10-09

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI932626A0 FI932626A0 (fi) 1993-06-09
FI932626A FI932626A (fi) 1993-06-09
FI110164B true FI110164B (fi) 2002-12-13

Family

ID=9417772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI932626A FI110164B (fi) 1991-10-10 1993-06-09 Menetelmä oligosakkaridin valmistamiseksi depolymeroimalla antigeeninen polysakkaridi

Country Status (15)

Country Link
US (2) US6045805A (fi)
EP (1) EP0562107B1 (fi)
JP (1) JP3676803B2 (fi)
KR (1) KR100249709B1 (fi)
AT (1) ATE217015T1 (fi)
AU (1) AU661071B2 (fi)
CA (1) CA2098105C (fi)
DE (1) DE69232585T2 (fi)
DK (1) DK0562107T3 (fi)
ES (1) ES2174839T3 (fi)
FI (1) FI110164B (fi)
FR (1) FR2682388B1 (fi)
HU (1) HU219672B (fi)
NO (1) NO306905B1 (fi)
WO (1) WO1993007178A1 (fi)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT658118E (pt) * 1992-08-31 2002-05-31 Baxter Healthcare Sa Vacinas contra neisseria meningitidis do grupo c
NZ248766A (en) * 1992-09-24 1996-11-26 Ca Nat Research Council Capsular polysaccharide-protein conjugate vaccine against group b streptococcus type ii or v
US5514665A (en) * 1993-12-30 1996-05-07 University Of British Columbia Method of preventing or reducing the risk of infection by bacterial pathogens utilizing simple and conjugated dextrans
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
US5738855A (en) * 1994-10-17 1998-04-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Synthesis of typhoid fever vaccine from a plant or fruit polysaccharide
US5811102A (en) 1995-06-07 1998-09-22 National Research Council Of Canada Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines
US6284884B1 (en) * 1995-06-07 2001-09-04 North American Vaccine, Inc. Antigenic group B streptococcus type II and type III polysaccharide fragments having a 2,5-anhydro-D-mannose terminal structure and conjugate vaccine thereof
FR2748476B1 (fr) * 1996-05-07 1998-08-14 Pf Medicament Complexe immunogene, son utilisation, son procede de preparation et vaccin le contenant
US5965714A (en) * 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
US6797275B1 (en) * 1998-12-04 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of immunizing humans against Salmonella typhi using a Vi-rEPA conjugate vaccine
EP1035137A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
US6936258B1 (en) * 1999-03-19 2005-08-30 Nabi Biopharmaceuticals Staphylococcus antigen and vaccine
FR2806304B1 (fr) * 2000-03-17 2002-05-10 Aventis Pasteur Conjugues polysaccharidiques du pneumocoque a usage vaccinal contre le tetanos et la diphterie
RO122761B1 (ro) 2001-01-23 2010-01-29 Aventis Pasteur Vaccin multivalent antimeningococic conţinând polizaharid-proteină
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
EP2402753A1 (en) * 2002-03-11 2012-01-04 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Analysis of sulfated polysaccharides
PT1490409E (pt) * 2002-03-26 2009-04-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Sacáridos modificados possuindo uma estabilidade melhorada em água
FR2850106B1 (fr) 2003-01-17 2005-02-25 Aventis Pasteur Conjugues obtenus par amination reductrice du polysaccharide capsulaire du pneumocoque de serotype 5
EP1603950A2 (en) * 2003-03-17 2005-12-14 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
CA2530434A1 (en) 2003-06-23 2005-01-06 Aventis Pasteur, Inc. Immunization method against neisseria meningitidis serogroups a and c
WO2005044861A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-19 Wyeth Holdings Corporation Polysaccharides of helicobacter pylori
US20060039899A1 (en) * 2004-08-23 2006-02-23 Winn Robert T Animal nutritional product that increases weight gain and reduces diarrhea morbidity, mortality and severity by stimulation of natural immune response, nutritional support of immune function and supplemental nutricines and probiotics
FR2884830A1 (fr) * 2005-04-25 2006-10-27 Sanofi Pasteur Sa Procede de production de souches de staphylococcus aureus surproductrices
FR2899110A1 (fr) * 2006-03-31 2007-10-05 Sanofi Pasteur Sa Polysaccharides capsulaires de type 5 et de type 8 des souches surproductrices de staphylococcus aureus
US9139876B1 (en) 2007-05-03 2015-09-22 Momenta Pharmacueticals, Inc. Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin
JP2013506651A (ja) 2009-09-30 2013-02-28 ノバルティス アーゲー Staphylococcus.aureus5型および8型莢膜多糖の結合体
PT2493498T (pt) * 2009-10-30 2017-05-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Purificação de sacáridos capsulares de staphylococcus aureus tipo 5 e tipo 8
EP2526122B1 (en) * 2010-01-19 2020-06-10 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating heparin preparations
WO2012115952A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating heparin preparations
EP2870974A1 (en) 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella conjugate vaccines
SI3506935T1 (sl) 2016-09-02 2024-06-28 Sanofi Pasteur, Inc. Cepivo proti neisseriji meningitidis
US11197921B2 (en) 2017-01-31 2021-12-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for making polysaccharide-protein conjugates

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4356170A (en) * 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4673574A (en) * 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
SE8200751L (sv) * 1982-02-09 1983-08-10 Olle Larm Forfarande for kovalent koppling for framstellning av konjugat och hervid erhallna produkter
NL8202527A (nl) * 1982-06-22 1984-01-16 Univ Utrecht Vaccins tegen door bacterien met kapsel-polysacchariden verwekte ziekten en werkwijze voor het bereiden daarvan.
US4663160A (en) * 1983-03-14 1987-05-05 Miles Laboratories, Inc. Vaccines for gram-negative bacteria
US4762713A (en) * 1983-07-05 1988-08-09 The University Of Rochester Boosting of immunogenic conjugate vaccinations by unconjugated bacterial capsular polymers
US4695624A (en) * 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4808700A (en) * 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
IT1214609B (it) * 1985-05-17 1990-01-18 Opocrin Spa Esosaminoglicani solfati depolimerizzati ad attivita'antitrombotica, fibrinolitica, antinfiammatoria, loro procedimento di preparazione e composizioni farmaceutiche che li contengono.
IT1187753B (it) * 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US4727136A (en) * 1985-10-01 1988-02-23 Canadian Patents And Development Ltd. Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine
CA1291423C (en) * 1985-10-24 1991-10-29 Ping W. Tang Biochemical reagent
EP0302887B1 (en) * 1986-04-16 1994-06-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bacterial antigens, antibodies, vaccines, and methods of manufacture
US5302386A (en) * 1986-04-16 1994-04-12 Brigham And Women's Hospital, Inc. Bacterial antigens, antibodies, vaccines and methods of manufacture
AR243540A1 (es) * 1986-08-05 1993-08-31 Ajorca Sa Procedimiento quimico para la depolimerizacion controlada de polianiones naturales y productos asi obtenidos, excluidos sus usos farmaceuticos.
US5204098A (en) * 1988-02-16 1993-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polysaccharide-protein conjugates
US5153312A (en) * 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
US5476929A (en) * 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US5370872A (en) * 1991-08-12 1994-12-06 Swiss Serum And Vaccine Institute Berne Escherichia coliO-polysaccharide-protein conjugate vaccine
US5445817A (en) * 1992-08-21 1995-08-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Pertussis toxin used as a carrier protein with non-charged saccharides in conjugate vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
DK0562107T3 (da) 2002-08-19
DE69232585T2 (de) 2002-12-05
KR930703362A (ko) 1993-11-29
NO932102D0 (no) 1993-06-09
FI932626A0 (fi) 1993-06-09
FR2682388B1 (fr) 1995-06-09
US6045805A (en) 2000-04-04
US6007818A (en) 1999-12-28
CA2098105C (fr) 2003-04-29
FR2682388A1 (fr) 1993-04-16
EP0562107A1 (fr) 1993-09-29
HU219672B (hu) 2001-06-28
JP3676803B2 (ja) 2005-07-27
AU661071B2 (en) 1995-07-13
NO306905B1 (no) 2000-01-10
WO1993007178A1 (fr) 1993-04-15
HU9301682D0 (en) 1993-10-28
FI932626A (fi) 1993-06-09
ES2174839T3 (es) 2002-11-16
EP0562107B1 (fr) 2002-05-02
NO932102L (no) 1993-08-05
DE69232585D1 (de) 2002-06-06
ATE217015T1 (de) 2002-05-15
CA2098105A1 (fr) 1993-04-10
HUT70298A (en) 1995-09-28
AU2946992A (en) 1993-05-03
JPH06506233A (ja) 1994-07-14
KR100249709B1 (ko) 2000-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI110164B (fi) Menetelmä oligosakkaridin valmistamiseksi depolymeroimalla antigeeninen polysakkaridi
Fournier et al. Purification and characterization of Staphylococcus aureus type 8 capsular polysaccharide
EP1455817B1 (en) Staphylococcus aureus exopolysaccharide and process
KR20240110660A (ko) 비자연 아미노산을 갖는 폴리펩타이드-항원 접합체
Seid et al. Preparation and characterization of detoxified lipopolysaccharide-protein conjugates.
Paoletti et al. An oligosaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine against type III group B Streptococcus.
CA2941174C (en) Novel polysaccharide immunogens from clostridium difficile
EP0220387B1 (de) Konjugatimpfstoffe gegen Infektionen durch gramnegative Bakterien, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verwendung derselben
Inzana et al. Composition and antigenic activity of the oligosaccharide moiety of Haemophilus influenzae type b lipooligosaccharide
CN105377282A (zh) 环炔衍生化的糖
US20070031447A1 (en) Method of isolating biologically active fraction containing clinically acceptable native S-lipopolysaccharides obtained from bacteria producing endotoxic lipopolysaccharides
Gupta et al. Structures of the O1B and O1C lipopolysaccharide antigens of Escherichia coli
WO2020010016A1 (en) Self-adjuvanted immunogenic conjugates
EP2705853B1 (en) Exopolysaccharide of shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and pharmaceutical composition containing same
HUE029265T2 (en) Method of purifying carbohydrates from the group streptococci
RU2818894C1 (ru) Свободные от примеси с-полисахарида капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae с остатком 2,5-ангидроманнозы на восстанавливающем конце
JPH07330806A (ja) 中性多糖体及びその用途
Huang et al. Conjugation Methods in Synthetic Glycoconjugate Vaccines
US8951538B2 (en) Exopolysaccharide of Shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and phamaceutical composition containing same
Alonso et al. Aislamiento de acemannano immunoestimulador activo de Aloe barbadensis
EA044044B1 (ru) Иммуногенные композиции, содержащие конъюгаты полипептид-антиген с неприродными аминокислотами
Omari Synthesis of Campylobacter and Shigella glycoconjugate Vaccines
Farquharson Structural characterization of the capsular polysaccharide and O-antigen polysaccharide of Porphyromonas gingivalis ATCC 53978 and ATCC 33277

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired