CN105377282A - 环炔衍生化的糖 - Google Patents
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Abstract
本发明提供新颖的糖衍生物、缀合物和用于制备所述衍生物和缀合物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及糖衍生物、包含糖的缀合物和用于产生糖衍生物和缀合物的方法的领域。所述缀合物可用于免疫。
发明背景
细菌的荚膜糖已经多年用于针对有荚膜细菌的疫苗中。然而,由于糖是T-非依赖性的抗原,所以它们免疫原性弱。与载体的缀合可将T-非依赖性抗原转化成T-依赖性抗原,从而增强记忆应答,且允许产生保护性免疫。
尽管用于缀合的经典程序(还原性胺化,酰胺键形成等)依赖于多糖与载体蛋白的胺的随机反应,但使得配体能够位点特异性安装至蛋白上的新颖缀合方法正在出现[1]。位点特异性缀合,除了提供更均质的生物分子作为疫苗候选物,还可以有助于保持蛋白的免疫原性。
点击化学方法已被描述为用于通过以模块化方式将小亚基接合在一起而形成复杂物质的方法[2,3]。各种形式的点击化学反应是本领域已知的,诸如Huisgen
1,3-偶极环加成铜催化的反应[4],这经常被称为“点击反应”。其他替代方案包括环化加成反应,诸如Diels-Alder,亲核取代反应(尤其对于小张力环如环氧基和氮杂环丙烷化合物),脲化合物的羰基化学形成和涉及碳-碳双键的反应,诸如硫醇-炔反应中的炔烃。
叠氮化物-炔烃Huisgen环化加成反应在还原剂存在的情况下使用铜催化剂以催化结合至第一分子的末端炔基的反应。在含叠氮化物部分的第二分子存在的情况下,叠氮化物与活化炔反应,以形成1,4-二-取代的1,2,3-三唑。铜催化的反应在室温进行,并且足够特异性,使得经常不需要反应产物的纯化[5]。叠氮化物和炔官能团对于水性介质中的生物分子主要是惰性的,允许反应发生在复杂溶液中。形成的三唑是化学稳定的,且不经受酶促裂解,使点击化学产物在生物系统中高度稳定。然而,铜催化剂对于活细胞是有毒的,排除了生物应用。
已经提出不含铜的点击反应[6],其使用环张力(strain)(在环辛炔环中)代替铜催化剂以促进[3 + 2]叠氮化物-炔环化加成反应。闭合的环结构诱导乙炔的实质键角变形,这与叠氮基团高度反应,以形成三唑。
本发明的一个目标是提供用于将糖衍生化的进一步且改进的方法。本发明的另一个目标是提供用于将糖缀合至各种部分(诸如载体蛋白)的进一步且改进的方法。本发明的还有一个目标是提供得到具有更均匀结构的缀合物的缀合方法。本发明的还有一个目标是提供具有改善的免疫原性特性的缀合物。
发明概述
本发明人已经开发了用于将糖衍生化和用于将此类糖衍生物缀合至其他部分的新方法。本发明人还已经产生了相对于本领域已知的糖衍生物和缀合物具有改善特性的新颖糖衍生物和缀合物。具体而言,本发明的缀合物可具有改善的免疫学特性。
在一个方面,本发明提供了将糖衍生化的方法,其包括将八元环炔基连接至糖。本发明还提供了包含八元环炔基的糖衍生物。包含八元环炔基的糖衍生物可以通过所述将糖衍生化的方法获得或可获得。
在另一个方面,本发明提供了将糖衍生物缀合至含叠氮化物部分的方法,其包括使八元环炔基与叠氮化物反应以形成三唑键。本发明还提供了糖衍生物和含叠氮化物部分的缀合物,其中所述缀合物具有式R-S-T,其中R包含糖衍生物的残基,S是稠合至八元环烷基的三唑基,且T包含部分含叠氮化物部分的残基。
缀合物可以通过本发明的将糖衍生物缀合至含叠氮化物部分的方法获得或可获得。
本发明也涉及包含与药学上可接受的载体组合的本发明的缀合物的药物组合物。
本发明进一步涉及在哺乳动物中引起免疫应答的方法,其包括将本发明的缀合物或药物组合物施用于所述哺乳动物。
附图简述
图1显示三种含环辛炔化合物。
图2显示用于将环辛炔基团连接至GBS血清型II糖的通用反应方案。
图3显示具有连接的环辛炔基团的GBS血清型V糖(I)的结构。
图4显示具有连接的环辛炔基团的GBS血清型II糖(II)的结构。
图5显示用于经由酪氨酸残基将糖衍生物(II)缀合至GBS80载体蛋白的通用反应方案。
图6显示缀合物A的SDS-PAGE表征的结果(1=MW,2=GBS80-Y-N3,3=GBS80-Y-N3/PSV,纯化后)。
图7显示缀合物B的SDS-PAGE表征的结果(1=MW,2=GBS80-Y-N3,3=GBS80-Y-N3/PSII,纯化后)。
图8显示缀合物C的SDS-PAGE表征的结果(1=MW,2=GBS67-Y-N3,3=GBS67-Y-N3/PSII,纯化后,4=GBS67-Y-N3/PSII,纯化后)。
图9显示缀合物D的SDS-PAGE表征的结果(1=MW,2=GBS67-Y-N3,3=GBS67-Y-N3/PSII,纯化后,4=GBS67-Y-N3/PSII,纯化后)。
图10显示具有连接的环辛炔基团的MenY糖(III)的结构。
图11显示缀合物E的SDS-PAGE表征的结果(1=MW,2=CRM197-Y-N3,3=CRM197-Y-N3/MenY)。
图12显示用于测定针对GBS血清型II糖抗原(对于1.0 µg碳水化合物剂量)的IgG滴度的ELISA免疫测定结果。
图13显示用于测定针对GBS血清型II糖抗原(对于0.5 µg碳水化合物剂量)的IgG滴度的ELISA免疫测定结果。
图14显示用于测定针对GBS血清型II糖抗原(对于1.0 µg蛋白剂量)的IgG滴度的ELISA免疫测定结果。
图 15显示使用GBS菌株的调理吞噬测定结果。
图16显示各种抗原针对GBS血清型II糖的免疫应答。
图17显示各种抗原针对GBS80的免疫应答。
图18显示经由MenY二聚体与CRM 197的酪氨酸选择性缀合制备的构建体的结构。
发明详述
本发明涉及将糖衍生化的方法和将糖衍生物缀合至含叠氮化物部分的方法。本发明还涉及新颖的糖衍生物和缀合物。下面详细描述这些方法、糖衍生物和缀合物的特征。
将糖衍生化的方法
本发明基于新颖的糖衍生物和产生此类糖衍生物的方法。
糖
本发明的方法中使用的糖可以是任何糖,特别是来自病原生物体的糖。用于本发明的方法中使用的示例性糖如下述。具体而言,糖可以是细菌糖,例如,细菌荚膜糖。
可以使用寡糖形式的糖。这些通过以下方便地形成:对纯化的多糖进行片段化(例如通过水解),随后通常纯化期望大小的片段。可以从天然来源纯化糖。作为纯化的替代方案,可以通过完全或部分合成获得糖。
无乳链球菌荚膜糖
优选的细菌荚膜糖包括来自无乳链球菌(Streptococcus
agalactiae)(“GBS”)的那些。所述荚膜糖共价连接至GBS的肽聚糖骨架,并且与B群抗原不同,所述B群抗原是连接至肽聚糖骨架的另一种糖。
GBS是新生儿生命的前3月中的严重细菌感染和母亲中的败血发病率的主要原因[7]。GBS也是未怀孕成人中、特别是老人和具有基本医疗条件的成人中的发病率和死亡率的重要原因。所有GBS菌株都在其表面上具有荚膜多糖(CPS),这是主要的致病因子。已经表征了十种不同的CPS血清型(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX),其中五种(Ia、Ib、II、III、V)是北美和欧洲的大部分新生儿疾病的原因。已经制备了针对血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII ,VIII的单价缀合物疫苗,并且在动物模型中证明了有效性3。最近,已经证明,GBS菌毛蛋白,除了是细菌粘附和侵入中的重要结构以外,似乎比其他革兰氏阳性菌的那些更保守[8]。
GBS荚膜糖化学上相关,但抗原性上非常不同。所有GBS荚膜糖共有以下三糖核心:
β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp
各种GBS血清型的区别在于修饰其核心的方式。
GBS-相关疾病主要是由血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII 引起,其中超过85%由五种血清型引起:Ia、Ib、III和V。本发明可以使用来自任何血清型(特别是血清型Ia、Ib、II、III和V)的糖。
用于本发明的方法中的糖可以是其天然形式,或可已经被修饰。例如,糖可以比天然荚膜糖更短,或可被化学修饰。具体而言,本发明中使用的血清型V荚膜糖可以如参考文献9和10中所述进行修饰。例如,已经基本上脱唾液酸化的血清型V 荚膜糖。脱唾液酸化的GBS血清型V荚膜糖可通过以下制备:在温和酸性条件下(例如0.1M硫酸,80℃持续60分钟)处理纯化的GBS血清型V荚膜糖或者通过用神经氨酸酶处理,如参考文献9中所述。根据本发明使用的糖可以是如天然中发现的基本全长荚膜多糖,或可短于天然长度。可解聚全长多糖以提供用于本发明的较短片段,例如,通过在温和酸中水解、通过加热、通过大小层析等。具体而言,本发明中使用的血清型II和/或III荚膜糖可以如参考文 献11和12中所述进行解聚。
所述糖可以相对于自然中发现的荚膜糖进行化学修饰。例如,糖可被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酸化(N-propionated)(部分或全部)等。可在缀合之前、期间或之后进行去乙酰化,但优选在缀合之前进行。根据具体糖,去乙酰化可影响或不影响免疫原性。参考文献13讨论了各种血清型中的GBS糖上的O-乙酰化的关联,且在一些实施方案中,位置7、8和/或9 的唾液酸残基的O-乙酰化在缀合之前、期间和之后得到保留,例如通过保护/去保护、通过再乙酰化等。然而,本发明中使用的GBS糖通常在位置7、8和/或9基本上没有唾液酸残基的O-乙酰化。具体而言,当所述GBS糖通过如下所述的碱提取纯化时,则通常丧失O-乙酰化。可通过常规测定评价去乙酰化等的效果。
可以通过已知技术纯化荚膜糖,如参考文献14中所述。典型的方法涉及碱提取、离心、过滤、RNA酶/DNA酶处理、蛋白酶处理、浓缩、大小排阻层析、超滤、阴离子交换层析和进一步超滤。用酶变溶菌素处理GBS细胞(所述酶变溶菌素裂解细菌细胞壁以释放细胞壁组分)也是可用的。
作为替代方案,可使用参考文献15中描述的纯化方法。这涉及碱提取、乙醇/CaCl2处理、CTAB沉淀和再溶。参考文献16中描述了进一步替代方法。
脑膜炎奈瑟氏菌荚膜糖
糖可以是细菌荚膜糖。示例性细菌荚膜糖包含来自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)的那些。基于生物体的荚膜多糖,已经鉴定了脑膜炎奈瑟氏菌的各种血清群,包括A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z。本发明中的糖可以来自任何这些血清群。糖通常来自以下脑膜炎球菌血清群之一:A、C、W135和Y。
通常使用寡糖形式的荚膜糖。这些通过以下方便地形成:对纯化的荚膜多糖进行片段化(例如通过水解),随后通常纯化期望大小的片段。
通常进行多糖的片段化,以使寡糖的最终平均聚合度(DP)小于30(例如,对于血清群A,10至20,优选约10;对于血清群W135和Y,15至25,优选约 15-20;对于血清群C,12至22;等)。DP可通过离子交换层析或通过比色测定方便地测量[17]。
如果进行水解,则通常对水解产物进行筛分,以去除短长度寡糖[18]。这可以各种方式诸如超滤和随后离子交换层析实现。对于血清群A,优选去除聚合度小于或等于约6的寡糖;对于血清群W135和Y,优选去除聚合度小于约4的寡糖。
糖的化学水解通常涉及在本领域中标准的条件下用酸或碱处理。用于将荚膜糖解聚为它们的组分单糖的条件是本领域已知的。一种解聚方法涉及使用过氧化氢[19]。将过氧化氢添加至糖(例如,使最终H2O2浓度为1%),然后孵育混合物(例如在约55℃),直到已经实现期望的链长降低。随着时间降低随后可以从混合物移取样品, 然后测量样品中糖的(平均)分子大小。然后可以通过一旦已经达到期望的链长就快速冷却而停止解聚。
血清群C、W135和Y
用于从脑膜炎球菌制备荚膜多糖的技术已知多年,并且通常涉及包括多糖沉淀(例如,使用阳离子去污剂)、乙醇分馏、冷苯酚提取(以去除蛋白)和超速离心(以去除LPS)的步骤的方法[例如,参见参考文献20]。
更优选的方法[21]涉及多糖沉淀和随后使用低级醇溶解沉淀的多糖。可以使用阳离子去污剂诸如四丁基铵和十六烷基三甲基铵盐(例如,溴化物盐),或海美溴铵 (hexadimethrine
bromide)和肉豆蔻基三甲基铵盐实现沉淀。特别优选十六烷基三甲基溴化铵('CTAB') [22]。使用低级醇诸如甲醇、丙-1-醇、 丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二元醇等实现沉淀物质的溶解,但是乙醇特别适于溶解CTAB多糖复合物。可以向沉淀的多糖添加乙醇以得到50%至95%的最终乙醇浓度(基于乙醇和水的总含量)。
再溶解后,可进一步处理多糖以去除污染物。这在甚至较少的污染也不可接受(例如对于人疫苗生产)的情况下特别重要。这通常涉及一个或两个过滤步骤,例如深度过滤(可以使用通过活性炭过滤)、大小过滤和/或超滤。
一旦过滤去除污染物,可以沉淀多糖用于进一步处理和/或加工。这可以通过交换阳离子来方便地实现(例如通过添加钙盐或钠盐)。
用于纯化脑膜炎球菌糖的其他和替代方法公开于参考文献19和23。
作为纯化的替代方案,本发明的荚膜糖可以通过完全或部分合成获得,例如 Hib合成公开于参考文献24,MenA合成公开于参考文献25。
糖可以化学修饰,例如其可以被O-乙酰化或去-O-乙酰化。任何此类去-O-乙酰化或超-乙酰化可以在糖中的特定位置。例如,大多数血清群C菌株在唾液酸残基的位置C-7和/或C-8具有O-乙酰基,但约15%的临床分离株缺乏这些O-乙酰基[26,27]。乙酰化似乎不影响保护效力(例如,与Menjugate™产品不同,NeisVac-C™产品使用去-O-乙酰化的糖,但两种疫苗都是有效的)。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。血清群Y糖类似于血清群W135糖,除了二糖重复单元包括葡萄糖代替半乳糖。像血清群C糖,MenW135和MenY糖具有可变的O-乙酰化,但在唾液酸7 和9位置[28]。
血清群A
所述方法可以包括血清群A荚膜糖抗原。可以与用于血清群C、W135 和Y(参见上文)相同的方式纯化或缀合糖,尽管其在结构上不同-然而血清群C、W135和Y的荚膜基于唾液酸(N-乙酰基-神经氨酸,NeuAc),而血清群A的荚膜基于N-乙酰基-甘露糖胺,其是唾液酸的天然前体。血清群A 糖特别易于水解,并且其在水性介质中的不稳定性意指(a)针对血清群A的液体疫苗的免疫原性随着时间下降,以及(b)由于糖水解产物释放至疫苗中,质量控制更困难。
天然MenA荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸酯的均聚物,其在C3和C4具有部分O-乙酰基化。主要糖苷键是涉及D-甘露糖胺的C1的半缩醛基和C6的醇基的1-6磷酸二酯键。平均链长为93个单体。其具有下式:
已经制备修饰的糖抗原,其保留天然血清群A糖的免疫活性,但在水中稳定得多。由保护基团(blocking group)替代在单糖单元的碳3和4连接的羟基[参考文献29和30]。
具有保护基团替代羟基的单糖单元的数量可以变化。例如,所有或基本上所有的单糖单元可具有保护基团。或者,至少10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%或90%的单糖单元可具有保护基团。至少1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29或30个单糖单元可具有保护基团。
类似地,单糖单元上的保护基团的数量可以变化。例如,在任何特定单糖单元上的保护基团的数量可以是1或2。
替代羟基的保护基团可以经由羟基的衍生反应直接得到,即通过用另一种基团替代羟基的氢原子。充当保护基团的合适的羟基衍生物是,例如,氨基甲酸酯、磺酸酯、碳酸酯、酯、醚(例如甲硅烷基醚或烷基醚)和缩醛。此类保护基团的一些具体实例是烯丙基、Aloc、苄基、BOM、叔丁基、三苯甲基、TBS、TBDPS、TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、THP等。非直接可得且完全替代羟基的其他保护基团包括C1-12烷基、C3-12烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基、NR1R2 (R1和R2 在下段中定义)、H、F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6 烷基)、CN、CF3、CCl3
等。
典型的保护基团具有下式:-O-X-Y或-OR3,其中:X是C(O)、S(O)或SO2;Y是C1-12烷基、C1-12烷氧基、C3-12环烷基、C5-12芳基或C5-12芳基- C1-6烷基,其各自任选地由独立地选自以下的1、2或3个基团取代:F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3;或者Y是NR1R2;R1和R2独立地选自H、C1-12烷基、C3-12环烷基、C5-12芳基、C5-12芳基- C1-6烷基;或者R1和R2可以接合以形成C3-12饱和杂环基;R3是C1-12烷基或C3-12环烷基,其各自可以任选地由独立地选自以下的1、2或3个基团取代:F、Cl、Br、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3;或者R3是C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基,其各自可以任选地由选自以下的1、2、3、4或5个基团取代:F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、 CN、CF3或CCl3。当R3是C1-12烷基或C3-12环烷基时,其通常由上述定义的1、2或3个基团取代。当R1和R2接合以形成C3-12饱和杂环基时,意指R1
和R2与氮原子一起形成含有3到12之间的任何数量(例如,C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)的碳原子的饱和杂环基。除了氮原子以外,杂环基可含有1或2个杂原子(诸如N、O或S)。C3-12饱和杂环基的实例是吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、咪唑烷基、氮杂环丁烷基和氮杂环丙烯基。
可以通过标准衍生程序从-OH基团制备保护基团-O-X-Y和-OR3,诸如羟基与酰基卤、烷基卤、磺酰卤等的反应。因此,-O-X-Y中的氧原子通常是羟基的氧原子,而-O-X-Y中的-X-Y基团通常替代羟基中的氢原子。
或者,保护基团可以经由取代反应(诸如Mitsonobu-型取代)得到。从羟基制备保护基团的这些方法和其他方法是众所周知的。
用于本发明中使用的特定保护基团是-OC(O)CF3 [31]和氨基甲酸酯基团OC(O)NR1R2,其中R1和R2独立地选自C1-6烷基。通常,R1和R2都是甲基,即保护基团是-OC(O)NMe2。氨基甲酸酯保护基团对糖苷键具有稳定效果,并且可以在温和条件下制备。
特别优选的保护基团是-OC(O)CH3 [30]。在修饰的脑膜炎奈瑟氏菌血清群A糖(其具有该保护基团)中的4-和/或3-位置的比例可以变化。例如,具有保护基团的4-位置的比例可以是约0%,至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%、95%或约100%,其中优选至少80%和约100%。类似地,具有保护基团的3-位置的比例可以是约0%,至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或约100%,其中优选至少80%和约100%。通常,具有保护基团的4-和3-位置的比例在各位置上约相同。换言之,具有保护基团的4-位置与具有保护基团的3-位置的比例为约1∶1。然而,在一些实施方案中,具有保护基团的4-位置的比例可以相对于具有保护基团的3-位置的比例变化。例如,具有保护基团的4-位置与具有保护基团的3-位置的比例可以是1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3或1:2。类似地,具有保护基团的3-位置与具有保护基团的4-位置的比例可以是1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3或1:2。
典型的修饰的MenA糖含有n个单糖单元,其中至少h%的单糖单元在位置3和4两者上都没有-OH基团。h的值为24或更高(例如,25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99 或100)并且通常是50或更高。不存在的-OH基团是如上定义的保护基团。
其他典型的修饰的MenA糖包含单糖单元,其中单糖单元中的至少s 个在3位置没有-OH并且在4位置没有-OH。s的值至少为1(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90)。不存在的-OH基团是如上定义的保护基团。
用于本发明使用的合适的修饰的MenA糖具有下式:
其中
n是1至100的整数(尤其是5至25的整数,通常15至25);
T是式(A)或(B):
各Z基团独立地选自OH或如上定义的保护基团;且
各Q基团独立地选自OH或如上定义的保护基团;
Y选自OH或如上定义的保护基团;
E是H或氮保护基团(nitrogen protecting group);
并且其中多于约7%(例如8%、9%、10%或更高)的Q基团是保护基团。在一些实施方案中,在式(A)中的碳1上连接的羟基被如上定义的保护基团替代。在一些实施方案中,式(B)中的E是与环辛炔基团的连接点。
各n+2 Z基团可以是彼此相同或不同的。类似地,各n+2 Q基团可以是彼此相同或不同的。所有Z基团可以是OH。或者,至少10%、20、30%、40%、50%或60%的Z基团可以是OAc。通常,约70%的Z基团是OAc,剩余的Z基团是OH或如上定义的保护基团。至少约7%的Q基团是保护基团。通常,至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至100% 的Q基团是保护基团。
葡聚糖
所述糖可以是葡聚糖。葡聚糖是尤其在真菌细胞壁中发现的含有葡萄糖的多糖。α-葡聚糖包括葡萄糖亚单位之间的一个或多个α-连接, 而β-葡聚糖包括葡萄糖亚单位之间的一个或多个β-连接。根据本发明使用的葡聚糖包括β连接,且可仅含有β连接(即,没有α连接)。
葡聚糖可包含一个或多个β-1,3-连接和/或一个或多个β-1,6-连接。它还包含一个或多个β-1,2-连接和/或β-1,4-连接,但通常其仅有的β连接将是β-1,3-连接和/或β-1,6-连接。
葡聚糖可以是支链的或直链的。
全长的天然β-葡聚糖是不溶性的,且具有兆道尔顿范围的分子量。在本发明的缀合物中优选使用可溶的葡聚糖。增溶可通过将长的不溶性葡聚糖片段化来实现。这可通过水解,或更便利地通过用葡聚糖酶(例如用 β-1,3-葡聚糖酶或β-1,6-葡聚糖酶)消化来实现。作为替代方案,短葡聚糖可以通过连接单糖构建嵌段(building
blocks)来合成制备。
优选低分子量葡聚糖,特别是具有小于100 kDa的分子量(例如,小于80、70、60、50、40、30、25、20或15 kDa)的那些。还可能使用,例如,含有60或更少(例如,59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4)个葡萄糖单糖单元的寡糖。在该范围内,具有10至50或20至40个单糖单元的寡糖是优选的。
葡聚糖可以是真菌葡聚糖。“真菌葡聚糖”将通常从真菌获得,但当在真菌和非真菌(例如在细菌、低等植物或藻类)两者中发现特定的葡聚糖结构时,则非真菌生物体可用作替代来源。因此葡聚糖可源自念珠菌的细胞壁,所述念珠菌诸如白色念珠菌(C.
albicans),或来自粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)或诡谲腐霉菌 (Pythiumn insidiosum)。
存在各种真菌β-葡聚糖来源。例如,纯β-葡聚糖是市售可得的,例如石耳素(Calbiochem)是纯化自云南石耳(Umbilicaria
papullosa) 的β-1,6-葡聚糖。β-葡聚糖可以各种方式纯化自真菌细胞壁。例如,参考文献32公开了用于从不含细胞壁甘露聚糖的念珠菌制备水溶性β-葡聚糖提取物的两步程序,其涉及NaClO氧化和DMSO提取。所得产物(“念珠菌可溶性β-D- 葡聚糖”或“CSBG”)主要由具有直链β-1,6-葡聚糖部分的直链β-1,3-葡聚糖构成。类似地,参考文献33公开了从念珠菌生产GG-zym。来自白色念珠菌的此类葡聚糖包括(a)具有β-1,3-葡聚糖侧链且平均聚合度为约30的β-1,6-葡聚糖,和(b)具有β-1,6-葡聚糖侧链且平均聚合度为约4的β-1,3-葡聚糖。
在本发明的一些实施方案中,葡聚糖是具有一些β-1,6分支的β-1,3葡聚糖,如在例如昆布多糖中所见。昆布多糖在褐藻和海藻中发现。不同来源之间的昆布多糖的β(1-3):β(1-6)比例不同,例如在爱森藻(Eisenia
bicyclis)昆布多糖中其低至3:2,但在掌状海带(Laminaria digititata)昆布多糖中高至7:1[34]。因此,本发明使用的葡聚糖可具有1.5:1至7.5:1(例如,约 2:1、3:1、4:1、5:1、6:1或7:1)的β(1-3):β(1-6)比例。任选地,葡聚糖可具有末端甘露醇亚单位,例如1,1-α-连接的甘露醇残基[35]。葡聚糖还可包含甘露糖亚单位。
在其他的实施方案中,葡聚糖只具有或主要具有β-1,3连接,如在凝胶多糖中所见。这些葡聚糖可比包含其他连接的葡聚糖(特别是包含 β-1,3连接和更高比例的β-1,6连接的葡聚糖)引发更好的保护。因此,葡聚糖可仅由β-1,3-连接的葡萄糖残基构成(例如仅具有1,3连接的直链β-D-吡喃葡萄糖)。任选地,然而,所述葡聚糖可以包括并非β-1,3-连接的葡萄糖残基的单糖残基,例如,其可以包括β-1,6-连接的葡萄糖残基。β-1,3-连接的葡萄糖残基与这些其他残基的比例应当是至少8:1(例如>9:1、>10:1、>11:1、>12:1、>13:1、>14:1、>15:1、>16:1、>17:1、>18:1、>19:1、>20:1、>25:1、>30:1、>35:1、>40:1、>45:1、>50:1、>75:1、>100:1等)和/或存在至少五个(例如>5、>6、>7、>8、>9、>10、>11、>12、>13、>14、>15、>16、>17、>18、>19、>20、>30、>40、>50,>60等)仅通过β-1,3 连接连接至其他残基的相邻非末端残基中的一个或多个(例如 >1、>2、>3、>4、>5、>6、>7、>8、>9、>10、>11、>12等)序列。“非末端”意指所述残基不存在于葡聚糖的游离端。在一些实施方案中,所述相邻非末端残基可以不包括连接环辛炔基团处的任何残基。仅通过β-1,3连接与其他残基连接的五个相邻非末端残基的存在可以提供保护性抗体应答,例如针对白色念珠菌的抗体应答。
在进一步实施方案中,缀合物可包括两种不同的葡聚糖,例如具有 1.5:1至7.5:1的β(1-3):β(1-6)比例的第一葡聚糖,和只具有或主要具有 β-1,3连接的第二葡聚糖。例如缀合物可包括昆布多糖葡聚糖和凝胶多糖葡聚糖。
当β-葡聚糖以期望比例和/或序列包括β-1,3和β-1,6连接两者时,则该葡聚糖可以在自然中发现(例如昆布多糖),或其可以是人工制备的。例如,其可以全部或部分通过化学合成制备。用于化学合成β-1,3/β-1,6葡聚糖的方法是已知的,例如来自参考文献36-46。以期望比例包括β-1,3和β-1,6 连接两者的β-葡聚糖也可以从购得的葡聚糖开始且用β-1,6-葡聚糖酶(也称为葡聚糖内切-1,6-β-葡糖苷酶、1,6-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶等;EC 3.2.1.75)或β-1,3-葡聚糖酶(诸如外切-1,3-葡聚糖酶(EC3.2.1.58)或内切-1,3-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)处理购得的葡聚糖直至达到期望比例和/或序列来制备。
当期望仅含有β-1,3-连接的葡萄糖的葡聚糖时,可以寻求完成β-1,6-葡聚糖酶处理,因为β-1,6-葡聚糖酶将最终产生纯β-1,3葡聚糖。然而,更方便地,可以使用纯β-1,3-葡聚糖。这些可以通过化学和/或酶促合成来合成制备,例如使用(1→3)-β-D-葡聚糖合酶,其中几个已知来自许多生物体(包括细菌、酵母、植物和真菌)。用于化学合成β-1,3葡聚糖的方法是已知的,例如来自参考文献47-50。作为合成的有用替代方案,可以使用天然β-1,3-葡聚糖,诸如凝乳聚糖 (来自先前称为粪产碱菌粘变种(Alcaligenes faecalis var. myxogenes)的农杆菌属(Agrobacterium)的直链β-1,3-葡聚糖;购自例如Sigma-Aldrich目录号C7821)或副淀粉(来自眼虫属(Euglena)的β-1,3- 葡聚糖)。产生高水平β-1,3-葡聚糖的生物体是本领域已知的,例如参考文献51和52的农杆菌属(Agrobacterium),或参考文献53的小眼虫(Euglena gracilis)。
昆布多糖和凝胶多糖通常作为高分子量聚合物在自然界中发现,例如,具有至少100 kDa的分子量。它们经常不溶于水性介质中。因此,在它们的天然形式中,它们不完全适于免疫。因此,本发明可以使用较短的葡聚糖,例如含有60或更少(例 如59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4)的葡萄糖单糖单元的那些。可以使用具有2-60范围内数量的葡萄糖残基,例如10-50或20-40个葡萄糖单元的葡聚糖。具有25-30个葡萄糖残基的葡聚糖是特别有用的。合适的葡聚糖可以,例如通过天然葡聚糖的酸性水解,或通过例如用葡聚糖酶诸如β-1,3-葡聚糖酶的酶促消化形成。具有11-19,例如13-19并且尤其是15或17个葡萄糖单糖单元的葡聚糖也是有用的。具体而言,具有以下结构(A)或(B)的葡聚糖专门设想用于本发明中:
(A)
其中n+2在2-60,例如,10-50之间或2-40之间的范围内。优选地,n+2在25-30或6-19,例如,6或13-17的范围内。本发明人已经发现,n+2 = 6是合适的。n+2 = 15 也可以是合适的。
其中n在0-9,例如,1-7之间或2-6之间的范围内。优选地,n在3-4或1-3的范围内。本发明人已经发现,n = 2是合适的。
在一些实施方案中,葡聚糖是单一分子种类。在这些实施方案中,所有葡聚糖分子在序列方面是相同的。因此,所有葡聚糖分子在它们的结构性质方面是相同的,包括分子量等。通常,该葡聚糖形式通过化学合成获得,例如使用上文描述的方法。例如,参考文献48描述了单一β-1,3-连接的种类的合成。或者,在其他实施方案中,所述葡聚糖可从天然葡聚糖获得,例如来自上文描述的掌状海带(L.digitata)、土壤杆菌属或眼虫属的葡聚糖,其中将该葡聚糖纯化直至获得所需的单一分子种类。已经以该方式纯化的天然葡聚糖是商购可得的。作为单一分子种类的葡聚糖可通过测量葡聚糖样品的多分散性(Mw/Mn)进行鉴定。该参数可以通过SEC-MALLS,例如如参考文献54中所述方便地测量。用于本发明的该实施方案中的合适的葡聚糖具有约1,例如1.01或更低的多分散性。
天然葡聚糖(诸如凝胶多糖)的溶解度可以通过引入离子基团(例如通过硫酸化、特别是在凝胶多糖中的O-6)增加。此类修饰可用于本发明,但理想地避免,因为它们可改变所述葡聚糖的抗原性。
当糖是葡聚糖时,其通常是昆布多糖。
肺炎链球菌荚膜糖
如上所讨论,糖也可以是细菌荚膜糖。进一步示例性的细菌荚膜糖包含来自肺炎链球菌(S.pneumoniae)的那些。当糖是来自肺炎链球菌的荚膜糖时,其通常来自以下肺炎球菌血清型之一:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F,并且优选来自1、5、6B、14、19F和23F。来自肺炎链球菌的荚膜糖包含可以含有高达8个糖残基的重复寡糖单元。主要肺炎链球菌血清型的寡糖单元描述于参考文献55 和56。
金黄色葡萄球菌荚膜糖
其他示例性的细菌荚膜糖包含来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的那些,尤其是金黄色葡萄球菌5型和8型的荚膜多糖。5型和8型荚膜多糖的结构在参考文献57和58中被描述为:
5型
→ 4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1
→ 4)-α-L-FucNAc(1
→ 3)-β-D-FucNAc-(1
→
8型
→ 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1
→ 3)-α-L-FucNAc(1
→ 3)-β-D-FucNAc-(1
→
近期的NMR光谱数据[59]已经导致将这些结构修改为:
5型
→ 4)-β-D-ManNAcA-(1
→ 4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1
→ 3)-β-D-FucNAc-(1
→
8型
→ 3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1
→ 3)-α-L-FucNAc(1
→ 3)-α-D-FucNAc(1
→
该多糖可以相对于自然中发现的荚膜多糖进行化学修饰。
例如,多糖可被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酸化(部分或全部)等。可以在缀合之前、期间或之后进行去乙酰化,但通常在缀合之前进行。可通过常规测定评价去乙酰化等的效果。例如,金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖上O-乙酰化的相关性在参考文献60中讨论。据该文献中称,天然多糖具有75%O-乙酰化。这些多糖诱导针对多糖骨架和O-乙酰基两者的抗体。具有0%O-乙酰化的多糖仍然引发针对该多糖骨架的抗体。两种类型的抗体针对其O-乙酰基含量不同的金黄色葡萄球菌菌株具有调理活性。因此,本发明中使用的5型或8型荚膜多糖可具有0至100% O-乙酰化。
多糖的O-乙酰化程度可通过本领域已知的任何方法测定,例如质子NMR(例如如参考文献61、62、63或64中所述)。参考文献65中描述了另一种方法。类似方法可用于测定多糖的N-乙酰化的程度。可通过水解去除O-乙酰基,例如通过用碱诸如无水肼[66]或NaOH[60]处理。类似方法可用于去除N-乙酰基。为了维持5型和/或8型荚膜多糖上的高水平的O-乙酰化,尽可能减少导致O-乙酰基水解的处理,例如在极端pH下的处理。
可通过已知技术纯化荚膜多糖,如本文的参考文献中所述。典型方法涉及苯酚-乙醇灭活金黄色葡萄球菌细胞、离心、溶葡萄球菌素处理、RNA酶/DNA酶处理、离心、透析、蛋白酶处理、进一步透析、过滤、用乙醇/CaCl2沉淀、透析、冷冻干燥、阴离子交换层析、透析、冷冻干燥、大小排阻层析、透析和冷冻干燥[67]。另一种方法涉及高压灭菌金黄色葡萄球菌细胞、超滤含有多糖的上清液、浓缩、冻干、用偏高碘酸钠处理以去除磷壁酸、进一步超滤、渗滤、高效大小排阻液相层析、渗滤和冷冻干燥[68]。
本发明不限于纯化自天然来源的多糖,然而,可通过其他方法诸如全合成或部分合成获得所述多糖。
其他细菌荚膜糖
进一步示例性的细菌荚膜糖包括来自B型流感嗜血杆菌(Haemophilus
influenzae)、肠道沙门氏菌(Salmonella
enterica)Typhi Vi和艰难梭状芽胞杆菌 (Clostridium
difficile)的那些。
酿脓链球菌(A群链球菌或GAS)碳水化合物
本发明也可以使用非荚膜细菌糖。示例性的非荚膜细菌糖是酿脓链球菌(S. pyogenes)GAS碳水化合物(也被称为GAS细胞壁多糖,或GASP)。该糖的特征在于具有由交替的α-(1→2)和α-(1→3)连接和β-(1→3)-连接至交替的鼠李糖环的D-N-乙酰基葡糖胺(GlcpNAc)残基组成的L-鼠李吡喃糖(Rhap)骨架的分支结构([69])。
GAS碳水化合物将通常呈其天然形式,但是其可能已经被修饰。例如,糖可以比天然GAS碳水化合物更短,或可被化学修饰。
因此,根据本发明使用的糖可以是如自然中发现的基本上全长的GAS碳水化合物,或其可短于天然长度。全长多糖可解聚以提供较短片段用于本发明使用,例如通过在温和酸中水解、通过加热、通过大小层析等。已经提出将认为对应于GAS 碳水化合物的末端单元的短片段用于疫苗中使用[70]。因此,本发明中设想短片段。然而,优选使用基本上全长的糖。GAS碳水化合物通常具有约10,尤其约7.5-8.5 kDa的分子量。可通过HPLC,例如SEC-HPLC,使用TSK Gel G3000SW柱(Sigma)相对于普鲁兰多糖(pullulan)标准品,诸如购自Polymer
Standard Service的那些来测量分子量[71]。
所述糖可相对于自然中发现的GAS碳水化合物进行化学修饰。例如,所述糖可以进行去-N-乙酰化(部分或完全)、N-丙酸化(部分或完全)等。可通过常规测定评价去乙酰化等例如对免疫原性的影响。
衍生化
本发明部分涉及将糖衍生化的方法,其包括将八元环炔基连接至糖。
将八元环炔基通过共价键连接至糖。通常,将八元环炔基经由间隔基连接至糖。八元环炔基通常在间隔基的末端。间隔基的另一末端具有用于连接至糖的官能团。官能团的性质将取决于糖,特别是糖上可用于连接的一个或多个基团。八元环炔基的连接可以使用任何合适的方法根据糖和(当使用间隔基时)间隔基上的官能团的性质来实施。
例如,如果糖含有胺,则间隔基可以包括允许连接至胺的任何官能团(例如,琥珀酰亚胺酯)。类似地,如果糖含有醛,则间隔基可以包括允许连接至醛的任何官能团(例如,胺)。
在一些实施方案中,八元环炔基包括一个或多个氮原子,诸如1、2或3个氮原子。在一些实施方案中,将八元环炔基稠合至一个或多个其他环系统,诸如环丙烷或苯。在一个优选的实施方案中,将八元环炔基稠合至环丙烷基团。在另一个优选的实施方案中,将八元环炔基稠合至两个苯基团。在最优选的实施方案中,八元环炔基是环辛炔基。
在一个实施方案中,连接使用具有式X1-L-X2的化合物实施,其中X1是八元环炔基且X2-L是间隔基。在这些实施方案中,X2可以是可以与糖上的官能团反应的任何基团,并且L是间隔基中的连接部分。
在一些优选的实施方案中,X2是N-氧代琥珀酰亚胺。该基团适于连接至糖上的胺。在其他实施方案中,X2可以是胺基团,其适于连接至糖上的醛。L可以是具有1至10个碳原子(例如,C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)的直链烷基,例如-(CH2)4-或-(CH2)3-。L通常具有式–L3-L2-L1-,其中L1是羰基,L2是具有1至10个碳原子(例如,C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)的直链烷基,例如-(CH2)4-或-(CH2)5-或L2不存在,且L3是–NHC(O)-、羰基或-O(CH3)-。
在一个优选的实施方案中,L1是羰基,L2是-(CH2)5-且L3是–NHC(O)-。在另一个优选的实施方案中,L1是羰基,L2是-(CH2)4-且L3是羰基。在另一个优选的实施方案中,L1是羰基,L2不存在且L3是-O(CH3)-。
在一个实施方案中,X1是:
在另一个实施方案中,X1是:
优选地,X1是:
具有式X1-L-X2的优选的化合物是:
具有式X1-L-X2的另一优选的化合物是:
具有式X1-L-X2的特别优选的化合物是:
可需要糖的衍生化以引入官能团诸如胺和醛。在一些实施方案中,在将八元环炔基连接至糖之前将糖氧化,以便将醛基引入糖中的至少一个糖残基。该步骤可涉及将多于一个醛基引入糖。
例如,GBS荚膜糖不包括其天然形式的醛基,因此其通常在通过氧化(例如,高碘酸盐氧化)糖的唾液酸残基的部分(例如5至40%,特别是10至30%,优选约20%)连接环辛炔基团之前生成[72]。或者,如果所述方法使用被去唾液酸化的血清型V荚膜糖,则醛基可以在通过氧化(例如,高碘酸盐氧化)糖的半乳糖残基的部分(例如5至40%,特别是10至30%,优选约20%)连接八元环炔基之前在该糖中生成[10]。
典型的产生醛的反应包括使用高碘酸盐,特别是偏高碘酸盐(例如偏高碘酸钠或偏高碘酸钾,例如NaIO4),以氧化羟基[73]。技术人员能够鉴定合适的氧化条件。
糖的氧化之后可以是还原性胺化的步骤,例如,如果期望在糖上提供用于连接至间隔基的胺。
还原性胺化是有机化学中的标准技术。在一个实施方案中,糖残基中的醛基与间隔基中的胺基反应。这可通过在适当还原剂(例如氰基硼氢化物,诸如氰基硼氢化钠NaBH3CN;硼烷-吡啶;三乙酰氧基硼氢化钠;硼氢化物交换树脂;等)存在的情况下将多糖与间隔基组合而方便地实现。在另一个实施方案中,通过还原性胺化将醛基转化成胺基,以提供用于连接间隔基的胺基。还原性胺化涉及氨或伯胺(NH2R)。这可通过使用铵盐(例如氯化铵)与适当还原剂(例如,如上所列)的组合方便地实现。技术人员能够鉴定用于还原性胺化的合适条件。例如,本发明人已经发现,用载体蛋白以4:1多糖:蛋白比例(w/w)和用NaBH3CN以2:1多糖:NaBH3CN比例处理10mg/ml多糖是合适的。
当使用间隔基时,糖衍生物将包含间隔基部分。间隔基部分可包括原子诸如碳、氢、氧和/或氮。包含碳和氢的间隔基是典型的,也通常使用进一步包含氧和/或氮的间隔基。包括氮原子的间隔基可包括键合至氮原子的碳原子,该氮原子进而键合至第二个碳原子(–C–N–C–)。包括氧原子的间隔基通常作为羰基的部分包括氧原子。分子量为30-500Da的间隔基部分是典型的。含有两个羰基的间隔基也是典型的。
有用的间隔基部分可以是–NH–C(O)–(CH2)n–NH–C(O)–,其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。n的值通常为5。该间隔基中的末端–NH–通常连接至来自多糖部分的碳原子。该间隔基中的末端–C(O)–通常连接至环辛炔基团。优选的间隔基部分可通过涉及以下的方法方便地引入:还原性胺化氧化的糖残基中的醛;使所得–NH2基团与双官能间隔基反应,所述双官能间隔基是二元酸(例如己二酸,HOOC-(CH2)4-COOH)的二酯(例如二琥珀酰亚胺基酯);和还原性胺化产物([74])。
可用于将间隔基连接至糖中的–NH2基团的其他化学法包括:
- 丙烯酰化(例如,通过与丙烯酰氯反应),随后迈克尔加成至ε-NH2或–SH
[75]。所得间隔基部分是–NH–C(O)–(CH2)2–(丙酰胺基)。
- 与卤代酰基卤化物反应,随后与ε-NH2或-SH反应[74]。间隔基部分是–NH–C(O)–CH2–。
根据本发明将糖衍生化的方法可以得到如下所述的糖。
糖衍生物
本发明提供了包含八元环炔基的糖衍生物。糖衍生物可包括任何糖,并且当适当时,间隔基,如上所述。本发明还提供了通过上述方法获得或可获得的糖衍生物。糖衍生物不是天然存在的糖。
优选的糖衍生物包括来自无乳链球菌(“GBS”)的荚膜糖。在特别优选的实施方案中,糖是来自无乳链球菌(“GBS”)血清型II或V的荚膜糖。在一个实施方案中,糖衍生物是具有以下结构的GBS衍生物:
在另一个实施方案中,糖衍生物是具有以下结构的GBS衍生物:
缀合方法
本发明部分涉及将如上定义的糖衍生物缀合至含叠氮化物部分的方法,其包括使八元环炔基与叠氮化物反应以形成三唑键。在一些实施方案中,根据上述方法产生缀合方法中使用的糖衍生物。具体而言,糖衍生物可以通过将八元环炔基连接至糖来产生。缀合方法通常在金属催化剂诸如铜催化剂不存在的情况下实施。
本发明人已经发现,合适的缀合方法涉及在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中混合蛋白(通常以5 mg/ml的浓度)与糖(通常以约25-30 mg/ml的浓度溶解于水中)。通常,在室温搅拌蛋白和糖的混合物约6-12小时。
将糖衍生物缀合至含叠氮化物部分的方法经由[3+2]环化加成反应发生。该反应通过八元环炔中的环张力促进,其促进在铜催化剂不存在的情况下的叠氮化物-炔环化加成反应。本发明人已经发现,该缀合方法是特别有效的,并且能够产生比使用经典缀合方法可实现的更多的缀合物。使用[3+2]环化加成反应的通常缀合方法是本领域已知的,并且公开于参考文献77中。
将糖衍生物缀合至含叠氮化物部分的方法可以给出如下所述的缀合物。
含叠氮化物部分
通常,含叠氮化物部分是载体分子,诸如蛋白。含叠氮化物部分可以根据本领域已知的方法制备,例如参考文献78中公开的方法。
有用的载体蛋白包含细菌毒素或类毒素,诸如白喉类毒素或破伤风类毒素。还可使用毒素或类毒素的片段,例如破伤风类毒素的片段C[79]。例如,白喉毒素的CRM197突变体[80-82]对本发明是有用的。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)外膜蛋白[83]、合成肽[84,85]、热休克蛋白[86,87]、百日咳蛋白[88,89]、细胞因子[90]、淋巴因子[90]、激素[90]、生长因子[90]、人血清白蛋白(优选重组的)、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4+ T细胞表位的人工蛋白[91]诸如N19[92]、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[93,94]、肺炎球菌表面蛋白PspA[95]、肺炎球菌溶血素[96]、摄铁蛋白[97]、来自艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)的毒素A或B[98]、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白 A(rEPA)[99]、GBS蛋白[100]等。在优选的实施方案中,载体蛋白是GBS蛋白,诸如GBS67和GBS80 [101]。
通常,含叠氮化物部分包括间隔基。叠氮化物通常作为含叠氮化物部分中的末端基团存在,使得其可以参加如本文所述的缀合反应。
间隔基用于将叠氮基连接至该部分。用于将间隔基连接至载体分子诸如蛋白的方法是本领域已知的(参见例如参考文献78)。
间隔基可以是具有1至10个碳原子(例如,C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)的直链烷基,例如-(CH2)4-或-(CH2)3-。在一些优选的实施方案中,间隔基具有式–[(CH2)2O]n–,其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。合适地,n是3。
当使用间隔基时,含叠氮化物部分将包含间隔基部分。间隔基部分可以包括原子诸如碳、氢、氧和/或氮。包含碳和氢的间隔基是典型的,并且还通常使用进一步包含氧和/或氮的间隔基。包括氮原子的间隔基可以包括键合至氮原子的碳原子,所述氮原子进而键合至第二个碳原子(-C-N-C-)。包括氧原子的间隔基通常包括其作为羰基的部分。具有30-500 Da的分子量的间隔基部分是典型的。含有两个羰基的间隔基也是典型的。特别有用的间隔基部分包括–[(CH2)2O]n–,其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。合适地,n是3。
在优选的实施方案中,含叠氮化物部分含有一个或多个衍生化的氨基酸,诸如一个或多个衍生化的酪氨酸残基。用于衍生化酪氨酸残基的合适方法描述于PCT/US2012/045549。在优选的实施方案中,含叠氮化物部分是其中叠氮化物经由间隔基连接至蛋白的载体蛋白。含叠氮化物部分可以是其中叠氮化物经由间隔基连接至蛋白上的衍生化的酪氨酸残基的载体蛋白。本发明人已经发现,将叠氮化物经由蛋白上的酪氨酸残基连接至载体蛋白是特别优选的。在一些实施方案中,含叠氮化物部分是具有以下结构的含有至少一个衍生化的酪氨酸残基的载体蛋白,其中所述叠氮化物经由3H-1,2,4-三唑-3,5-(4H)-二酮连接:
例如,含叠氮化物部分可以是具有以下结构的含有至少一个衍生化的酪氨酸残基的载体蛋白:
本发明还提供如本文所述的含叠氮化物部分。
缀合物
本发明部分涉及如上述定义的糖衍生物和如上述定义的含叠氮化物部分的缀合物,其中所述缀合物具有式R-S-T,其中R包含糖衍生物的残基,S是稠合至八元环烷基的三唑基,且T包含含叠氮化物部分的残基。
在一些实施方案中,八元环烷基包括一个或多个氮原子,诸如1、2或3个氮原子。在一些实施方案中,将八元环烷基稠合至一个或多个除了三唑基以外的其他环系统,诸如环丙烷或苯。在一个优选的实施方案中,将八元环炔基稠合至除了三唑基以外的环丙烷基团。在另一个优选的实施方案中,将八元环炔基稠合至除了三唑基以外的两个苯基团。
在一个优选的实施方案中,R-S-T是:
在另一个优选的实施方案中,R-S-T是:
在一个最优选的实施方案中,R-S-T是:
该部分通常是载体分子,诸如蛋白。合适的载体蛋白如上所述。所述缀合物可以包括在糖和S之间的糖衍生物的残基中的间隔基。例如,间隔基可以是如上所述用于糖衍生物的间隔基。此外或可替代地,缀合物可以包括在该部分和S之间的含叠氮化物部分的残基中的间隔基。例如,间隔基可以是如上所述用于含叠氮化物部分的间隔基。通常,所述缀合物将包括在糖和S之间的糖衍生物的残基中的间隔基和在该部分和S之间的含叠氮化物部分的残基中的间隔基。
在一个特别优选的实施方案中,所述缀合物包括缀合至GBS80蛋白的GBS血清型V糖。在另一个特别优选的实施方案中,所述缀合物包括缀合至GBS80蛋白的GBS血清型II糖。在另一个特别优选的实施方案中,所述缀合物包括缀合至GBS67蛋白的GBS血清型V糖。在另一个特别优选的实施方案中,所述缀合物包括缀合至GBS67蛋白的GBS血清型II糖。
例如,所述缀合物可以具有以下结构:
缀合物可以通过如上所述的将糖衍生物缀合至含叠氮化物部分的方法获得或可获得。
在一些实施方案中,缀合物可具有过量载体蛋白(w/w)或过量糖(w/w),例如比例范围为 1∶5-5∶1。该缀合物可包含少量游离(即未缀合)的载体蛋白。当给定载体蛋白以游离和缀合形式存在于本发明的组合物中时,未缀合形式优选为作为整体的组合物中载体蛋白的总量的不超过5%,更优选以少于2%(以重量计)存在。当在本发明的药物组合物内包含缀合物时,该组合物还可以包含游离的载体蛋白作为免疫原[102]。缀合后,可分离游离和缀合的抗原。存在许多合适的方法,例如疏水层析、切向超滤、透析等。[也参见参考文献103、104等]。
缀合物与其他抗原的组合
除了提供如上所述的单独缀合物以外,本发明还提供包含本发明的缀合物和一种或多种其他抗原的组合物。该组合物通常是免疫原性组合物。
本发明的组合物可进一步包含一种或多种其他抗原,包括其他细菌、病毒或寄生虫抗原。这些可选自以下:
- 来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群B的蛋白抗原,诸如参考文献105-111中的那些,特别优选蛋白‘287’(见下文)和衍生物(例如‘ΔG287’)。
- 来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群B的外膜囊泡(OMV)制备物,诸如参考文献112、113、114、115等中公开的那些。
- 来自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原,诸如参考文献116中公开的来自血清群C的寡糖或参考文献117的寡糖。
- 来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如,参考文献118-120;参考文献127的第22和23章]。
- 来自甲型肝炎病毒,诸如灭活病毒的抗原[例如,121,122;参考文献127的第15章]。
- 来自乙型肝炎病毒的抗原,诸如表面和/或核心抗原[例如122,123;参考文献127的第16章]。
- 来自丙型肝炎病毒的抗原[例如124]。
- 来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原,诸如来自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA),也可任选与百日咳杆菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合[例如参考文献125和126;参考文献127的第21章]。
- 白喉抗原,诸如白喉类毒素[例如参考文献127的第13章]。
- 破伤风抗原,诸如破伤风类毒素[例如参考文献127的第27章]。
- 来自流感嗜血杆菌B的糖抗原[例如参考文献127的第14章]。
- 来自淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)的抗原[例如105,106,107]。
- 来自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如128,129,130,131,132,133,134]。
- 来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[例如135]。
- 来自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[例如136]。
- 脊髓灰质炎抗原[例如137,138;参考文献127的第24章],诸如IPV。
- 狂犬病抗原[例如139],诸如冻干的灭活病毒[例如140,RabAvert™]。
- 麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如参考文献127的第19、20和26章]。
- 流感抗原[例如参考文献127的第17和18章],诸如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
- 来自粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[例如141]。
- 来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)的抗原[例如142,143,144]。
- 来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)的抗原[例如145-147]。
- 来自表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的抗原[例如可由菌株ATCC-31432、SE-360和SE-10获得的I、II和/或III型糖,如参考文献148、149和150中所述]。
当使用糖或碳水化合物抗原时,其优选缀合至载体以增强免疫原性。流感嗜血杆菌B、脑膜炎球菌和肺炎球菌糖抗原的缀合是众所周知的。
必要时,可使毒性蛋白抗原脱毒(例如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[126])。
当所述组合物中包括白喉抗原时,优选还包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地,当包括破伤风抗原时,优选还包括白喉和百日咳抗原。类似地,当包括百日咳抗原时,优选还包括白喉和破伤风抗原。
抗原可以吸附至铝盐。当组合物中存在多于一种缀合物时,不需要吸附所有缀合物。
组合物中的抗原通常各以至少1μg/ml的浓度存在。通常,任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫应答。
作为本发明的组合物中使用蛋白抗原的一种替代方案,可使用编码该抗原的核酸[例如参考文献151-159]。本发明的组合物的蛋白组分因此可被编码该蛋白的核酸(优选DNA,例如质粒形式的DNA)替代。在实践方面,本发明的组合物中包括的抗原数可存在上限。本发明的组合物中的抗原数可以少于20、少于19、少于18、少于17、少于16、少于15、少于14、少于13、少于12、少于11、少于10、少于9、少于8、少于7、少于6、少于5、少于4、或少于3。本发明的组合物中的抗原数可少于6、少于5或少于4。
药学组合物和方法
本发明提供用于制备药物组合物的方法,其包括将本发明的缀合物与药学上可接受的载体混合的步骤。典型的‘药学上可接受的载体’包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的缓慢代谢的大分子,诸如蛋白、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、乳糖和脂质聚集体(诸如油滴或脂质体)。此类载体是本领域普通技术人员众所周知的。疫苗也可含有稀释剂,诸如水、盐水、甘油等。此外,辅助剂,诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等也可存在。无菌、无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型载体。药学上可接受的赋形剂的彻底讨论可见参考文献160。
本发明的组合物可以是水性形式(即溶液或悬浮液)或干燥形式(例如冻干形式)。如果使用干燥的疫苗,则在注射前将其重构成液体介质。缀合物疫苗的冻干是本领域已知的,例如Menjugate™产品以冻干形式呈现,而NeisVac-C™和Meningitec™以水性形式呈现。为了在冻干过程中稳定缀合物,通常可以在组合物中包括1mg/ml至30mg/ml(例如约25mg/ml)的糖醇(例如甘露醇)或二糖(例如蔗糖或海藻糖)。
药物组合物可包装在小瓶中或注射器中。可以提供有或没有针头的注射器。注射器将包括单一剂量的组合物,而小瓶可包括单一剂量或多个剂量。
本发明的糖的水性组合物适于从冻干形式重构其他疫苗。当本发明的组合物用于此类临时重构时,本发明提供用于重构此类冻干疫苗的方法,其包括将冻干物质与本发明的水性组合物混合的步骤。重构的物质可用于注射。
本发明的组合物可以包装成单位剂型或多剂量剂型。对于多剂量剂型,与预填充注射器相比更优选小瓶。可常规建立有效剂量体积,但组合物的典型人剂量具有0.5ml的体积,例如用于肌内注射。
组合物的pH通常为6至8,例如约7。可通过使用缓冲剂维持稳定的pH。如果组合物包含氢氧化铝盐时,典型使用组氨酸缓冲剂[161]。所述组合物可以是无菌和/或无热原的。本发明的组合物相对于人可以是等张的。
本发明的组合物是免疫原性的,更优选是疫苗组合物。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染),但将通常是预防性的。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的一种或多种抗原,以及需要的任何其他组分。“免疫有效量”意指以单一剂量或作为一系列剂量的部分向个体施用该量对于治疗或预防是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组(例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其他相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽范围内。
在各剂量内,个别糖抗原的量通常是1-50μg(测量为糖质量),例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg。
可将本发明的组合物以各种形式制备。例如,可将所述组合物制备为可注射剂,作为液体溶液或悬浮液。可将所述组合物制备为使用细粉或喷雾进行肺部施用,例如作为吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。可将所述组合物制备用于鼻腔、耳部或眼部施用,例如作为喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[例如参考文献162和163]。已报道成功地经鼻施用肺炎球菌糖[164,165]、Hib糖[166]、MenC糖[167]和Hib和MenC糖缀合物的混合物[168]。
本发明的组合物可包括抗微生物剂,特别当以多剂量形式包装时。
本发明的组合物可包含去污剂,例如吐温(聚山梨醇酯),诸如吐温80。去污剂通常以低水平(例如<0.01%)存在。
本发明的组合物可包括钠盐(例如氯化钠)以提供张力。10±2mg/ml NaCl的浓度是典型的。
本发明的组合物将通常包括缓冲剂。磷酸盐缓冲剂是典型的。
本发明的组合物将通常与其他免疫调节剂联合施用。具体而言,组合物将通常包括一种或多种佐剂。此类佐剂包括但不限于:
含有矿物质的组合物
适用作本发明中的佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐,诸如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐诸如氢氧化物(例如,羟基氧化物)、磷酸盐(例如,羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如参考文献169的第8和9章],或不同无机化合物的混合物(例如,磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物,任选地含有过量磷酸盐),其中化合物采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等),其中吸附至盐是典型的。也可将含有矿物质的组合物配制为金属盐的颗粒[170]。
本发明的疫苗中可包括铝盐,使得Al3+的剂量为0.2至1.0mg/剂量。
典型的磷酸铝佐剂是无定形羟基磷酸铝,PO4/Al摩尔比为0.84至0.92,以0.6mg Al3+/ml包括。可使用用低剂量磷酸铝吸附,例如50至100μg Al3+/缀合物/剂量。当其使用磷酸铝且不期望将抗原吸附至佐剂时,这通过在溶液中包括游离的磷酸根离子(例如,通过使用磷酸盐缓冲剂)而有利。
油乳液
适用作本发明中的佐剂的油乳液组合物包括角鲨烯-水乳液,诸如MF59 (5%角鲨烯、0.5% 吐温80和0.5% 司盘85,其使用微流化床配制成亚微米颗粒) [参考文献169的第10章;也参见参考文献171-173]。MF59用作FLUAD™流感病毒三价亚单位疫苗中的佐剂。
用于组合物中使用的特别有用的佐剂是亚微米水包油乳液。用于本文使用的优选亚微米水包油乳液是任选地含有不同量的MTP-PE的角鲨烯/水乳液,诸如含有4-5%w/v角鲨烯、0.25-1.0%w/v吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和/或0.25-1.0%司盘85(山梨聚糖三油酸酯),和任选的N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳液。参考文献171和174-175中详细描述了用于组合物中使用的亚微米水包油乳液、其制备方法和免疫刺激剂(诸如胞壁酰肽)。
完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作本发明中的佐剂。
皂苷制剂[参考文献169的第22章]
皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的分离自皂树(Quillaia
saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可商业获得自丽花菝葜(Smilax
ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla
paniculata)(婚纱花)和肥皂草 (Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂诸如QS21,以及脂质制剂诸如ISCOM。
已使用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术的特定纯化级分,包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地,所述皂苷为QS21。产生QS21的方法公开于参考文献176。皂苷制剂也可包含甾醇,诸如胆固醇[177]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献169第23章]。ISCOM通常还包括磷脂,诸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。优选地,ISCOM包括QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献177-179中进一步描述了ISCOM。任选地,ISCOM可不含额外的一种或多种去污剂[180]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献181和182。
病毒体和病毒样颗粒
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作本发明中的佐剂。这些结构通常含有任选与磷脂组合或一起配制的一种或多种来自病毒的蛋白。其通常无病原性,非复制型,且通常不含任何天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组产生或分离自全病毒。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(诸如HA或NA)、乙型肝炎病毒(诸如核心或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(诸如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(诸如反转录转座子Ty蛋白 p1)的蛋白。参考文献183-188进一步讨论了VLP。例如参考文献189进一步讨论了病毒体。
细菌或微生物衍生物
适用于本发明中的佐剂包括细菌或微生物衍生物,诸如肠细菌脂糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式公开于参考文献190。3dMPL的此类“小颗粒”小到足以通过0.22μm膜过滤除菌[190]。其他无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物,诸如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物,例如RC-529[191,192]。
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A的衍生物,诸如OM-174。例如参考文献193和194中描述了OM-174。
适用作本发明中的佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含有回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也已显示是免疫刺激的。
CpG可以包括核苷酸修饰/类似物诸如硫代磷酸酯修饰,且可以是双链或单链的。参考文献195、196和197公开了可能的类似物取代,例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献198-203中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
CpG序列可针对TLR9,诸如基序GTCGTT或TTCGTT [204]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答,诸如CpG-A ODN,或其可更特异地诱导B细胞应答,诸如CpG-B ODN。参考文献205-207中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选地,CpG为CpG-A ODN。
优选地,构建CpG寡核苷酸,使得5’末端可被受体识别。任选地,将两个CpG寡核苷酸序列在其3’末端连接以形成“免疫聚体(immunomers)” (例如参考文献204和208-210)。
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明中的佐剂。优选地,所述蛋白衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌 (“PT”)。参考文献211中描述了脱毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途,参考文献212中描述了其作为胃肠外佐剂的用途。所述毒素或类毒素优选呈全毒素(holotoxin)形式,其包含A和B亚单位两者。优选地,A亚单位含有脱毒突变;优选地,B亚单位未突变。优选地,所述佐剂为脱毒的LT突变体,诸如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物,特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的用途可见参考文献213-220。氨基酸取代的数字参考优选基于参考文献221中记载的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的比对,所述参考文献具体以其整体通过引用本文。
人免疫调节剂
适合用作本发明中的佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子,诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[222]、等)
[223]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
生物粘附剂和粘膜粘附剂
生物粘附剂和粘膜粘附剂也可以用作本发明中的佐剂。合适的生物粘附剂包括酯化的透明质酸微球[224]或粘膜粘附剂诸如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明中的佐剂[225]。
微粒
微粒也可以用作本发明中的佐剂。优选由生物可降解且无毒的材料(例如,聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)与丙交酯乙交酯共聚物形成的微粒(即直径为~100nm至~150μm,更优选直径 ~200nm至~30μm,最优选直径~500nm至~10μm的颗粒),其任选经处理以具有带负电表面(例如用SDS处理)或带正电表面 (例如用阳离子去污剂诸如CTAB处理)。
脂质体(参考文献169的第13和14章)
适用作佐剂的脂质体制剂的实例描述于参考文献226-228。
聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适用于本发明中的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[229]。此类制剂进一步包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇的组合[230]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种额外非离子表面活性剂诸如辛苯糖醇的组合[231]。优选的聚氧乙烯醚选自以下组:聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂描述于例如参考文献232和233。
胞壁酰肽
适用作本发明中的佐剂的胞壁酰肽的实例包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺 (thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。
咪唑并喹诺酮化合物
适于用作本发明中的佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的实例包括咪喹莫特及其同系物(例如,"Resiquimod 3M"),进一步描述于参考文献234和235。
缩氨基硫脲化合物
缩氨基硫脲化合物的实例,以及配制、制造和筛选都适合用作本发明中的佐剂的化合物的方法包括参考文献236中描述的那些。缩氨基硫脲类在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子诸如TNF-α中特别有效。
色胺酮化合物
色胺酮化合物的实例,以及配制、制造和筛选都适合用作本发明中的佐剂的化合物的方法包括参考文献237中描述的那些。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子诸如TNF-α中特别有效。
本发明也可包含以上鉴定的佐剂中的一种或多种的各方面的组合。例如,以下组合可用作本发明中的佐剂组合物:(1)皂苷和水包油乳液[238];(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL) [239];(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇;(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL12(任选地+甾醇) [240];(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳液的组合[241];(6)SAF,含有10%角鲨烯、0.4% 吐温80™、5% 普朗尼克-嵌段聚合物L121 和thr-MDP,或微流化成为亚微米乳液或涡旋以产生较大粒径乳液,(7)
RibiTM佐剂系统(RAS), (Ribi
Immunochem),其含有2%角鲨烯、0.2% 吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分,所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS),优选MPL+CWS(Detox™);和(8)一种或多种矿物盐(诸如铝盐)+LPS的无毒衍生物(诸如3dMPL)。
充当免疫刺激剂的其他物质公开于参考文献169的第7章。
使用铝盐佐剂是特别有用的,抗原通常吸附至此类盐。Menjugate™和NeisVac™缀合物使用氢氧化物佐剂,而Meningitec™使用磷酸盐佐剂。本发明的组合物中可能使一些抗原吸附至氢氧化铝,但使其他抗原与磷酸铝结合。然而,通常只使用单一盐,例如氢氧化物或磷酸盐,但不同时使用二者。不是所有缀合物都需要被吸附,即一些或所有可以在溶液中是游离的。
治疗方法
本发明还提供在哺乳动物中引起免疫应答的方法,其包括向哺乳动物施用本发明的药物组合物。所述免疫应答优选为保护性的,并且优选涉及抗体。所述方法可以引起加强应答。
哺乳动物优选是人。当所述疫苗用于预防性用途时,人优选是儿童(例如幼童或婴儿)或青少年;当疫苗用于治疗用途时,人优选是成人。意图用于儿童的疫苗也可施用于成人,例如,以评估安全性、剂量、免疫原性等。用于治疗的人的优选类别是处于医源感染风险中的患者,特别是具有晚期肾病和/或进行血液透析的患者。也优选处于医源感染风险中的其他患者,例如免疫缺陷患者或已经经历手术,特别是心脏手术,或创伤的患者。用于治疗的人的另一优选类别是处于菌血症风险中的患者。
本发明也提供用作药物的本发明的组合物。药物优选能够引起哺乳动物中的免疫应答(即它是免疫原性组合物),并且更优选是疫苗。
本发明也提供本发明的缀合物在制备用于引起哺乳动物中的免疫应答的药物中的用途。
这些用途和方法优选是预防和/或治疗由无乳链球菌(S.agalactiae)引起的疾病, 例如新生儿败血症或菌血症、新生儿肺炎、新生儿脑膜炎、子宫内膜炎、骨髓炎、 脓毒性关节炎等。
其中预防疾病的主体可以与接受本发明的缀合物的主体不同。例如,可以向雌性施用缀合物(怀孕之前或期间)以保护后代(所谓的‘母体免疫’[242-244])。
检查治疗性治疗的效力的一种方式涉及在施用本发明的组合物之后监测GBS感染。检查预防性治疗的效力的一种方式涉及施用组合物之后监测针对GBS抗原的免疫应答。
本发明的优选组合物可以在患者中赋予抗体滴度,所述抗体滴度优于各抗原组分对于可接受百分比的人主体的血清保护的标准。具有高于其中宿主被认为针对抗原血清转化的抗体滴度的相关抗体滴度的抗原是众所周知的并且,此类滴度由组织诸如WHO公布。优选多于80%的统计学显著的主体样品发生血清转化,更优选多于90%,仍更优选多于93%,最优选96-100%。
本发明的组合物将通常直接施用于患者。直接递送可通过肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或至组织间隙),或通过直肠、经口、阴道、局部、透皮、鼻内、眼、耳、肺或其他粘膜施用完成。优选在大腿或上臂进行肌内施用。注射可以经由针头(例如皮下针头)进行,但或者可以使用无针注射。肌内剂量通常为0.5
ml。
本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫。
剂量治疗可以是单剂量时间表或多剂量时间表。多剂量可用于初次免疫时间表和/或加强免疫时间表。初次剂量时间表之后可以是加强剂量时间表。可以常规确定引发剂量之间(例如4-16周)和引发和加强剂量之间的合适时机。
通用
除非另有说明,本发明的实施将采用本领域技术内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学的常规方法。此类技术在文献中已详细解释(例如,参考文献245-252等)。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”,例如,“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括额外物质,例如X+Y。在一些实施方案中,术语“包含”是指包括所示的活性剂,诸如所述多肽,以及包括其他活性剂,和药学上可接受的载体、赋形剂、润滑剂、稳定剂等,如制药工业中所已知。在一些实施方案中,术语“基本上由...组成”是指一种组合物,其唯一活性成分是所示的活性成分,然而,可以包括其他化合物,所述化合物用于稳定、保存等制剂,但不直接参与所示活性成分的治疗效果。使用过渡短语“基本上由...组成”意指权利要求的范围被解释为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤,或不实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。参见,In re
Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976);还参见MPEP § 2111.03。因此,术语“基本上由...组成”当在本发明的权利要求中使用时,并不旨在被解释为等同于“包含”。
与数值x相关的术语“约”意指,例如x±10%。
词语“基本上”不排除“完全”,例如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时,可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。
当本发明提供涉及多个相继步骤的方法时,本发明还可以提供涉及少于总数的步骤的方法。可在非常不同时间由不同人员在不同地点(例如在不同国家)进行不同的步骤。
应当理解,糖环可以以开放或闭合形式存在,并且虽然本文结构式中显示闭合形式,但本发明也涵盖开放形式。类似地,应当理解,糖可以以吡喃糖和呋喃糖形式存在,并且虽然本文的结构式中显示吡喃糖形式,但也涵盖呋喃糖形式。还涵盖糖的不同异头形式。
实施本发明的方式
A.
糖衍生化
使GBS血清型II和V糖与NaIO4进行反应以实现唾液酸残基氧化为醛基。唾液酸部分的氧化程度通过改变使用的NaIO4的量来控制。醛的还原性胺化为不同间隔基的插入提供胺基团,便于环辛炔基团连接至糖。测试各种含有环辛炔的化合物,以确定用于间隔基的最佳长度,如图1所示。
反应通过NMR光谱监测,且碳水化合物回收率使用唾液酸的比色测定定量。图2显示用于将环辛炔基团连接至GBS血清型II糖的通用反应方案。
使用该方法,产生二糖衍生物,如图3(具有连接的环辛炔基团的GBS血清型V糖(I))和图4(具有连接的环辛炔基团的GBS血清型II糖(II))所示。
具有连接的环辛炔基团的GBS血清型V糖(I)的合成中使用的各反应物的量如下:
化合物 | MW | mg | mmol NH2 | eq | ml |
GBS血清型V糖-NH2 | 1323 | 30 | 0.00453 | ||
环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯间隔基 | 380 | 13 | 10 | ||
三乙胺 | 0.05 | ||||
DMSO | 3 |
具有连接的环辛炔基团的GBS血清型II糖(II)的合成中使用的各反应物的量如下:
化合物 | MW | mg | mmol NH2 | eq | ml |
GBS血清型II糖-NH2 | 1323 | 40 | 0.00393 | ||
环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯间隔基 | 380 | 13 | 10 | ||
三乙胺 | 0.04 | ||||
DMSO | 3 |
进一步的糖衍生物如图10中所示产生(具有连接的环辛炔基团的MenY糖(Ⅲ))。
糖衍生物还使用图1中所示的其他两个环炔系统合成。
B.
缀合物的产生和纯化
使得能够缀合蛋白(GBS60或GBS67)的间隔基使用PCT/US2012/045549中描述的程序通过位点定向Mannich型反应安装至酪氨酸上,得到连接至末端叠氮化物基团的载体蛋白。使载体蛋白-叠氮化物与糖-环辛炔反应以实现叠氮化物-炔环化加成反应,得到载体蛋白-糖缀合物。图5显示用于经由酪氨酸残基将糖衍生物(II)缀合至GBS80载体蛋白的通用反应方案。
合成含有GBS蛋白的八种不同的缀合物,如下(其中“Y”表示经由酪氨酸残基连接至载体蛋白GBS80或GBS67,且“N3”表示三唑键):
A. GBS80-Y-N3-GBS血清型V糖
B. GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖
C. GBS67-Y-N3-GBS血清型II糖
D. GBS67-Y-N3-GBS血清型V糖
缀合以6:1 (w/w)的糖:蛋白比例(对于缀合物A-B)和4:1 (w/w)的糖:蛋白比例(对于缀合物C-D)实施。以5 mg/ml的浓度将蛋白(PBS中)添加至糖,随后在室温搅拌6-12小时,得到缀合物。缀合物使用羟基磷灰石柱纯化,以去除游离蛋白(用2mM
NaPi,pH 7.2流动相缓冲液,随后400mM
NaPi,pH 7.2流动相缓冲液)和游离糖(用2mM NaPi, 550mM
NaCl, pH 7.2流动相缓冲液,随后10mM NaPi, pH 7.2流动相缓冲液,随后35mM NaPi, pH 7.2流动相缓冲液,随后400mM
NaPi, pH 7.2流动相缓冲液)。
SDS-PAGE
(3-8%)用于证实缀合物的形成。缀合物A-D中每一种的SDS-PAGE表征的结果分别显示于图6-9。
HPAEC-PAD分析用于测定缀合物的糖含量。缀合物具有以下特性:
缀合物 | 蛋白 | 糖/蛋白(w/w) | 游离糖 (%) | 总蛋白 (mg) | 用于缀合的糖/蛋白 (w/w) | 产率 (% 最终蛋白) |
A | GBS80 | 2.2 | <5.5 | 648.0 | 6:1 | 21.1 |
B | GBS80 | 2.7 | <1.8 | 810.0 | 6:1 | 52.5 |
C | GBS67 | 1.1 | <4.5 | 975.0 | 4:1 | 29.5 |
D | GBS67 | 2.5 | <4.8 | 780.0 | 4:1 | 23.6 |
还合成含有CRM197蛋白的缀合物。具体而言,将糖衍生物(III)缀合至CRM 197蛋白,如下:
E. CRM197-Y-N3-MenY糖
缀合使用60当量的糖衍生物(2.1
mg)和1.5 mg蛋白实施。SDS-PAGE用于证实缀合物的形成。缀合物E的SDS-PAGE表征的结果显示于图11。
C.
使用缀合物的免疫研究
在小鼠中测试各种抗原的免疫原性,如下所概述。
使用
V
型菌株的攻击模型
通过用200 μl注射体积中的1.0 μg剂量的糖(以AlumOH作为佐剂)的腹膜内注射免疫八只CD1小鼠的组。注射在1、21和35天实施,其中采血在1、35和49天进行。用以下抗原在八只小鼠的组中实施免疫:(i) PBS、(ii)
CRM197-GBS血清型V糖、(iii)
TT- GBS血清型V糖、(iv)
GBS80-GBS血清型V糖和(v)
GBS80-Y-N3-GBS血清型V糖 (缀合物A)。缀合物(i)至(iv)使用经典缀合方法(例如,如参考文献[253]中所公开)制备,而缀合物(v)使用点击化学(click chemistry)制备。新生儿(neonate)用V型菌株攻击。下面显示结果:
抗原 | 保护/经处理 | %保护 |
PBS | 19/40 | 47 |
CRM197-GBS血清型V糖 | 61/70 | 87 |
TT- GBS血清型V糖 | - | - |
GBS80-GBS血清型V糖 | 54/57 | 95 |
GBS80-Y-N3-GBS血清型V糖 A | 23/70 | 33 |
使用
II
型菌株的攻击模型
通过用200 μl注射体积中的1.0 μg剂量的糖(以AlumOH作为佐剂)的腹膜内注射免疫八只CD1小鼠的组。注射在1、21和35天实施,其中采血在1、35和49天进行。用以下抗原在八只小鼠的组中实施免疫:(i) PBS,(ii)
CRM197-GBS血清型II糖,(iii)
TT- GBS血清型II糖,(iv)
GBS80-GBS血清型II糖和(v)
GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖(缀合物B)。缀合物(i)至(iv)使用经典缀合方法制备,而缀合物(v)使用点击化学(click
chemistry)制备。新生儿用II型菌株攻击。下面显示结果:
抗原 | 保护/经处理 | %保护 |
PBS | 18/60 | 30 |
CRM197-GBS血清型II糖 | 32/50 | 64 |
TT- GBS血清型II糖 | 19/30 | 63 |
GBS80-GBS血清型II糖 | 37/70 | 53 |
GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖 B | 58/65 | 89 |
这些结果显示,与用使用经典缀合方法获得的CRM197和GBS80缀合物相比,用GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖B实现了更高水平的保护。
用于测定针对
GBS
血清型
II
糖抗原的
IgG
滴度的
ELISA
免疫测定
来自免疫动物的血清中的针对GBS血清型II糖的IgG滴度如下测量。微量滴定板用抗原(例如,GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖B)包被,且将板在室温孵育过夜,然后在洗涤缓冲液(0.05%
Tween 20/PBS)中洗涤三次。每孔分配250 μl
PBS, 2% BSA, 0.05% Tween 20后,将板在37℃孵育90分钟,然后吸出以去除包被后溶液。将测试血清在PBS,
2% BSA, 0.05% Tween 20中1:400稀释。通过合并超免疫血清制备标准血清,并且选择标准合并物的初始稀释度以获得在405 nm约2.000的光密度(OD)。将板在37℃孵育1小时,然后用洗涤缓冲液洗涤,并且将100 μL稀释缓冲液中1:1000的碱性磷酸酶缀合的抗小鼠IgG分配于各孔中。将板在37℃孵育90分钟,然后用洗涤缓冲液洗涤。将100 μL底物缓冲液中4.0 mg/mL的对硝基苯基磷酸酯(p-NPP)的溶液分配于各孔中。将板在室温孵育30分钟,然后将100 μL EDTA 7% (w/v)二钠盐加上Na2HPO4
3.5% pH 8.0的溶液添加至各孔,以终止酶促反应。测量在405 nm的光密度(OD)。通过使用参考线测定方法计算针对GBS血清型II糖抗原的总IgG滴度,且结果表示为任意ELISA单位/mL
(EU/mL)。对于三种抗原中的每一种,将标准血清IgG滴度任意分配1.0 EU/mL的值。通过标准合并物的滴定曲线(偏差和斜率)内插获得的OD而估算各血清的IgG滴度。
结果显示于图12(对于1.0 µg碳水化合物剂量)、图13(对于0.5 µg碳水化合物剂量)和图14(对于1.0 µg蛋白剂量)。在1.0 µg碳水化合物剂量,GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖B IgG滴度与使用经典缀合方法获得的CRM197和GBS80缀合物没有统计学差异。在0.5 µg碳水化合物剂量,GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖B IgG滴度与所有新的缀合物和对照没有统计学差异。
调理吞噬测定
使用GBS菌株作为靶细胞和分化成粒细胞样细胞的HL-60细胞系(ATCC; CCL-240),通过将100
mM N,N-二甲基甲酰胺(Sigma)添加至生长培养基4天,进行调理吞噬测定。在吞噬细胞、10%幼兔补体(Cedarlane)和热灭活的小鼠抗血清存在的情况下,将指数中期的细菌细胞在37℃孵育1小时。阴性对照由具有免疫前血清或无HL-60或具有热灭活补体的反应组成。通过从在零时间点的CFU数的对数减去在1-h测定后存活的集落数的对数测定调理吞噬杀死的量。实验的结果显示于图15和下面:
抗原 | OPKA滴度 |
PBS | 10 |
CRM197-GBS血清型II糖 | 2306 |
GBS80-GBS血清型II糖 | 2443 |
GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖 B | 1415 |
GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖B OPKA和IgG滴度与使用经典缀合方法获得的CRM197和GBS80缀合物统计学相当。OPKA和IgG滴度显示与攻击动物模型中存活的%的良好相关性。
以不同的糖
:
蛋白比例制备的缀合物的免疫原性
用具有不同的糖:蛋白比例的缀合物评价针对GBS血清型II糖(以1.0 µg蛋白剂量)的免疫应答。结果显示于图16和下面:
抗原 | PS/蛋白比例 (w/w) | 保护/经处理 (攻击菌株DK21) | %保护 |
PBS | 6/59 | 10 | |
GBS80, GBS血清型II糖 | 42/79 | 53 | |
GBS80-GBS血清型II糖 | 1.8 | 36/60 | 60 |
GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖 | 2.7 | 32/80 | 40 |
GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖 | 1.1 | 68/69 | 98 |
还用具有不同的糖:蛋白比例的缀合物评价针对GBS80(以1.0 µg蛋白剂量)的免疫应答。结果显示于图17和下面:
抗原 | PS/蛋白比例 (w/w) | 保护/经处理(攻击菌株COH1) | %保护 |
PBS | 28/80 | 35 | |
GBS80 | 35/60 | 58 | |
GBS80, GBS血清型II糖 | 37/50 | 74 | |
GBS80-GBS血清型II糖 | 1.8 | 30/60 | 50 |
GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖 | 2.7 | 36/80 | 45 |
GBS80-Y-N3-GBS血清型II糖 | 1.1 | 49/70 | 70 |
抗接头抗体的存在的评价
经由MenY二聚体与CRM
197的酪氨酸选择性缀合制备构建体(图18)。发现针对接头的抗体水平较低。
应该理解的是,本发明已经仅借助实施例进行描述,并且可以作出修改,而仍在本发明的范围和精神内。
实施方案
本发明包括以下编号的实施方案:
1. 将糖衍生化的方法,其包括将八元环炔基连接至糖。
2. 实施方案1的方法,其中将八元环炔基稠合至环丙烷基团。
3. 实施方案1的方法,其中将八元环炔基稠合至两个苯基团。
4. 实施方案1的方法,其中所述八元环炔基是环辛炔基团。
5. 任一前述实施方案的方法,其中所述糖是荚膜糖。
6. 任一前述实施方案的方法,其中所述糖是GBS荚膜糖。
7. 任一前述实施方案的方法,其中所述糖是来自血清型Ia、Ib、II、III或V的GBS糖。
8. 任一前述实施方案的方法,其中所述糖是来自血清型II或V的GBS糖。
9. 任一前述实施方案的方法,其中所述八元环炔基经由间隔基连接连接至所述糖。
10. 实施方案9的方法,其中所述八元环炔基在所述间隔基的末端。
11. 实施方案10的方法,其中所述间隔基的另一末端具有用于连接至所述糖的官能团。
12. 实施方案11的方法,其中所述连接使用具有式X1-L-X2的化合物实施,其中X1是八元环炔基且X2-L是间隔基,其中X2是可以与糖上的官能团反应的任何基团,且L是间隔基中的连接部分。
13. 实施方案12的方法,其中X2是N-氧基琥珀酰亚胺。
14. 实施方案12或13的方法,其中L具有式–L3-L2-L1-,其中L1是羰基,L2是具有1至10个碳原子的直链烷基或L2不存在,且L3是–NHC(O)-、羰基或-O(CH3)-。
15. 实施方案12至14中任一项的方法,其中具有式X1-L-X2的化合物是:
。
16. 实施方案12至14中任一项的方法,其中具有式X1-L-X2的化合物是:
。
17. 实施方案12至14中任一项的方法,其中具有式X1-L-X2的化合物是:
。
18. 包含八元环炔基的糖衍生物。
19. 实施方案18的糖衍生物,其中所述八元环炔基是环辛炔基团。
20. 根据实施方案18的糖衍生物,其可通过实施方案1至17中任一项的方法获得。
21. 将如实施方案18至20中任一项中定义的糖衍生物缀合至含叠氮化物部分的方法,其包括使所述八元环炔基与所述叠氮化物反应以形成三唑键。
22. 实施方案21的方法,其中所述糖衍生物根据实施方案1至17中任一项的方法产生。
23. 实施方案21或实施方案22的方法,其中所述方法在金属催化剂不存在的情况下实施。
24. 实施方案21至23中任一项的方法,其中所述缀合经由[3+2]环化加成反应发生。
25. 实施方案21至25中任一项的方法,其中所述含叠氮化物部分是载体分子。
26. 实施方案25的方法,其中所述载体分子是蛋白。
27. 实施方案26的方法,其中所述蛋白是GBS蛋白。
28. 实施方案27的方法,其中所述GBS蛋白是GBS67或GBS80。
29. 实施方案21至28中任一项的方法,其中所述含叠氮化物部分包括间隔基。
30. 实施方案29的方法,其中所述含叠氮化物部分是具有以下结构的含有至少一个衍生化的酪氨酸残基的载体蛋白,其中所述叠氮化物经由3H-1,2,4-三唑-3,5-(4H)-二酮连接:
。
31. 实施方案21至30中任一项的方法,其中所述叠氮化物作为所述含叠氮化物部分中的末端基团存在。
32. 实施方案31的方法,其中所述含叠氮化物部分是具有以下结构的含有至少一个衍生化的酪氨酸残基的载体蛋白:
。
33. 如实施方案18至20中任一项中定义的糖衍生物和含叠氮化物部分的缀合物,其中所述缀合物具有式R-S-T,其中R包含所述糖衍生物的残基,S是稠合至八元环烷基的三唑基,且T包含所述含叠氮化物部分的残基。
34. 实施方案33的缀合物,其中所述缀合物包括在所述糖和S之间的糖衍生物的残基中的间隔基。
35. 实施方案34的缀合物,其中所述间隔基具有式–NH–C(O)–(CH2)n–NH–C(O)–,其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
36. 实施方案35的缀合物,其中n是5。
37. 实施方案33至36中任一项的缀合物,其中所述缀合物包括在所述部分和S之间的含叠氮化物部分的残基中的间隔基。
38. 实施方案37的缀合物,其中所述间隔基具有式–[(CH2)2O]n–,其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
39. 实施方案38的缀合物,其中n是3。
40. 实施方案33至39中任一项的缀合物,其中所述缀合物包括在所述糖和S之间的糖衍生物的残基中的间隔基和在所述部分和S之间的含叠氮化物部分的残基中的间隔基。
41. 实施方案33至40中任一项的缀合物,其中R-S-T是:
。
42. 实施方案33至40中任一项的缀合物,其中R-S-T是:
。
43. 实施方案33至40中任一项的缀合物,其中R-S-T是:
。
44. 实施方案33至43中任一项的缀合物,其可通过实施方案21至32中任一项的方法获得。
45. 药物组合物,其包含本发明的缀合物和药学上可接受的载体的组合。
46. 用于在哺乳动物中产生免疫应答的方法,其包括将根据实施方案33至43中任一项的缀合物或药物组合物施用于所述哺乳动物。
Claims (40)
1.将糖衍生化的方法,其包括将八元环炔基连接至糖,其中所述糖是荚膜糖。
2.权利要求1的方法,其中所述糖是GBS荚膜糖。
3.任一前述权利要求的方法,其中所述糖是来自血清型Ia、Ib、II、III或V的GBS糖。
4.任一前述权利要求的方法,其中所述糖是来自血清型II或V的GBS糖。
5.任一前述权利要求的方法,其中将所述八元环炔基稠合至环丙烷基团。
6.任一前述权利要求的方法,其中将所述八元环炔基稠合至两个苯基团。
7.任一前述权利要求的方法,其中所述八元环炔基是环辛炔基团。
8.任一前述权利要求的方法,其中所述八元环炔基经由间隔基连接连接至所述糖。
9.权利要求8的方法,其中所述八元环炔基在所述间隔基的末端。
10.权利要求9的方法,其中所述间隔基的另一末端具有用于连接至所述糖的官能团。
11.权利要求10的方法,其中所述连接使用具有式X1-L-X2的化合物实施,其中X1是八元环炔基且X2-L是间隔基,其中X2是可以与糖上的官能团反应的任何基团,且L是间隔基中的连接部分。
12.权利要求11的方法,其中X2是N-氧基琥珀酰亚胺。
13.权利要求11或12的方法,其中L具有式–L3-L2-L1-,其中L1是羰基,L2是具有1至10个碳原子的直链烷基或L2不存在,且L3是–NHC(O)-、羰基或-O(CH3)-。
14.权利要求11至13中任一项的方法,其中具有式X1-L-X2的化合物是:
。
15.权利要求11至13中任一项的方法,其中具有式X1-L-X2的化合物是:
。
16.权利要求11至13中任一项的方法,其中具有式X1-L-X2的化合物是:
。
17.包含八元环炔基的糖衍生物,其中所述八元环炔基是环辛炔基团,并且其中所述糖衍生物可通过权利要求1至16中任一项的方法获得。
18.将如权利要求17中定义的糖衍生物缀合至含叠氮化物部分的方法,其包括使所述八元环炔基与所述叠氮化物反应以形成三唑键,其中所述含叠氮化物部分是蛋白。
19.权利要求18的方法,其中所述方法在金属催化剂不存在的情况下实施。
20.权利要求18至19中任一项的方法,其中所述缀合经由[3+2]环化加成反应发生。
21.权利要求18至20中任一项的方法,其中所述蛋白是GBS蛋白。
22.权利要求21的方法,其中所述GBS蛋白是GBS67或GBS80。
23.权利要求18至22中任一项的方法,其中所述含叠氮化物部分包括间隔基。
24.权利要求23的方法,其中所述含叠氮化物部分是具有以下结构的含有至少一个衍生化的酪氨酸残基的载体蛋白,其中所述叠氮化物经由3H-1,2,4-三唑-3,5-(4H)-二酮连接:
。
25.权利要求18至24中任一项的方法,其中所述叠氮化物作为所述含叠氮化物部分中的末端基团存在。
26.权利要求25的方法,其中所述含叠氮化物部分是具有以下结构的含有至少一个衍生化的酪氨酸残基的载体蛋白:
。
27.如权利要求17中定义的糖衍生物和含叠氮化物部分的缀合物,其中所述缀合物具有式R-S-T,其中R包含所述糖衍生物的残基,S是稠合至八元环烷基的三唑基,且T包含所述含叠氮化物部分的残基。
28.权利要求27的缀合物,其中所述缀合物包括在所述糖和S之间的糖衍生物的残基中的间隔基。
29.权利要求28的缀合物,其中所述间隔基具有式–NH–C(O)–(CH2)n–NH–C(O)–,其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
30.权利要求29的缀合物,其中n是5。
31.权利要求27至29中任一项的缀合物,其中所述缀合物包括在所述部分和S之间的含叠氮化物部分的残基中的间隔基。
32.权利要求31的缀合物,其中所述间隔基具有式–[(CH2)2O]n–,其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
33.权利要求32的缀合物,其中n是3。
34.权利要求27至33中任一项的缀合物,其中所述缀合物包括在所述糖和S之间的糖衍生物的残基中的间隔基和在所述部分和S之间的含叠氮化物部分的残基中的间隔基。
35.权利要求27至34中任一项的缀合物,其中R-S-T是:
。
36.权利要求27至34中任一项的缀合物,其中R-S-T是:
。
37.权利要求27至34中任一项的缀合物,其中R-S-T是:
。
38.权利要求27至37中任一项的缀合物,其可通过权利要求18至26中任一项的方法获得。
39.药物组合物,其包含权利要求27至38中任一项的缀合物和药学上可接受的载体的组合。
40.用于在哺乳动物中产生免疫应答的方法,其包括将根据权利要求27至39中任一项的缀合物或药物组合物施用于所述哺乳动物。
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