WO2019151128A1 - 細胞標識剤及び細胞標識キット - Google Patents

細胞標識剤及び細胞標識キット Download PDF

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WO2019151128A1
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sialic acid
cell
cell labeling
labeling agent
monosaccharide derivative
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岩 徐
匠 石塚
珮妍 趙
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国立大学法人 宮崎大学
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/12—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by acids having the group -X-C(=X)-X-, or halides thereof, in which each X means nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium, e.g. carbonic acid, carbamic acid
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to a cell labeling agent and a cell labeling kit.
  • a metabolic labeling method for labeling sugar chains on the cell surface by utilizing the metabolism of monosaccharides by the sialic acid biosynthesis pathway is known.
  • a derivative of N-acetylmannosamine (ManNAc) having an azide group peracetylated N-azidoacetylmannosamine, Ac 4 ManNAz
  • Ac 4 ManNAz taken up into cells is deacetylated by the enzyme in the cytoplasm and metabolized to the corresponding N-azidoacetylsialic acid (SiaNAz).
  • SiaNAz is incorporated into the sialosugar complex.
  • SiaNAz is presented on the cell surface together with the sugar chain.
  • a reporter substance having a fluorescent dye or the like can be added to the azide group of SiaNAz by a click reaction such as an azide-alkyne cycloaddition reaction (CuAAC) using a copper catalyst.
  • CuAAC azide-alkyne cycloa
  • Non-Patent Document 1 discloses a metabolic labeling method using peracetylated N- (4-pentinoyl) mannosamine (Ac 4 ManNAl).
  • Ac 4 ManNAl is metabolized to the corresponding sialic acid (SiaNAl) in the cell, and SiaNAl is presented on the cell surface. Since SiaNAl has an alkyne at the end, the reporter substance can be added to the sugar chain on the cell surface by reacting the alkyne and azide with CuAAC.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a cell labeling agent and a cell labeling kit that are highly safe and can be applied clinically.
  • the cell labeling agent according to the first aspect of the present invention comprises: A 6-membered monosaccharide derivative that is metabolized to sialic acid in the cellular sialic acid biosynthetic pathway, Of the groups bonded to the carbon atoms constituting the 6-membered ring in the monosaccharide derivative, at least one group that does not change even when metabolized in the sialic acid biosynthetic pathway, It includes a ring structure having a carbon-carbon double bond or triple bond.
  • the monosaccharide derivative is The group containing the ring structure as R, Represented by It is good as well.
  • the monosaccharide derivative is The group containing the ring structure as R is represented by the formula (II) Represented by It is good as well.
  • the monosaccharide derivative is The group containing the ring structure as R, Represented by It is good as well.
  • the R is Below (a)-(m) Selected from the group consisting of It is good as well.
  • the cell labeling kit according to the second aspect of the present invention comprises: The cell labeling agent according to the first aspect of the present invention, A reporter substance that is presented outside the cell and reacts with the group that does not change when metabolized in the sialic acid biosynthetic pathway and binds to the sialic acid; Is provided.
  • the cell labeling agent and cell labeling kit according to the present invention are highly safe and can be applied clinically.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows a series of reaction in a sialic acid biosynthesis pathway. It is a figure which shows the synthesis method and structure of a monosaccharide derivative which concern on Example 1 of this invention. It is a figure which shows the click reaction of the monosaccharide derivative which concerns on Example 1, and the reporter substance containing a fluorescent substance.
  • 2 is a diagram showing a fluorescence spectrum of a fluorescent substance bound to a monosaccharide derivative according to Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows a time-dependent change of the fluorescence spectrum of the fluorescent substance couple
  • FIG. 1 shows the fluorescence image of the cell which added the fluorescent substance through the monosaccharide derivative which concerns on Example 1.
  • FIG. 1 shows the fluorescence image of the cell when the cell culture
  • the cell labeling agent according to the present embodiment contains a monosaccharide derivative that is metabolized to sialic acid in the sialic acid biosynthesis pathway of the cell.
  • the cells in the present embodiment are not particularly limited as long as the sialic acid biosynthesis pathway functions.
  • the cell is an animal cell.
  • the cell may be a cell collected from a living body, a primary cultured cell, or a cell line.
  • the cells may be normal cells or cancerous cells, that is, cancer cells.
  • the sialic acid biosynthetic pathway is a pathway in which monosaccharide derivatives such as ManNAc incorporated into cells are metabolized to the corresponding sialic acid by various enzymes and converted into sugar chains having sialic acid.
  • Monosaccharides that are metabolized to sialic acid through the sialic acid biosynthetic pathway are based on a six-membered ring structure. Therefore, the monosaccharide derivative has a 6-membered ring structure.
  • sialic acid is a generic term for derivatives of neuraminic acid, and in particular, a generic term for acyl derivatives of neuraminic acid.
  • FIG. 1 shows a sialic acid biosynthetic pathway in which Ac 4 ManNAl is metabolized by various enzymes and converted into a sugar chain to which SiaNAl (encircled by a one-dot chain line) is bound.
  • Ac 4 ManNAl is taken into the cell, it becomes CMP-sialic acid in the nucleus through the reaction of A to E in the cytoplasm, and the sugar chain to which SiaNAl is bonded is formed on the cell surface through the reactions of F and G.
  • Ac 4 ManNAl is taken into the cell, it becomes CMP-sialic acid in the nucleus through the reaction of A to E in the cytoplasm, and the sugar chain to which SiaNAl is bonded is formed on the cell surface through the reactions of F and G.
  • A, B, C, D, E, F and G are respectively non-specific esterase, ManNAc 6-kinase, sialic acid 9-phosphate synthase, sialic acid 9-phosphatase, CMP-sialic acid synthetase, CMP- By the action of sialic acid Golgi transporter and sialic acid transferase.
  • Examples of monosaccharide derivatives that are metabolized to sialic acid through the sialic acid biosynthetic pathway include mannosamine derivatives, glucosamine derivatives, and sialic acid.
  • Mannosamine derivatives, glucosamine derivatives, and sialic acid have at least one group that does not change even when metabolized in the sialic acid biosynthetic pathway among the groups bonded to the carbon atoms constituting the six-membered ring.
  • the “group” in this specification means a group of atoms, that is, an atomic group. Therefore, the “group” does not include a hydrogen atom directly bonded to a carbon atom constituting a 6-membered ring.
  • the group surrounded by the double-dot chain line including the amino group of Ac 4 ManNAl is maintained in SiaNAl. Yes.
  • the group surrounded by a two-dot chain line is a group that does not change even if it is metabolized by the sialic acid biosynthesis pathway in Ac 4 ManNAl.
  • the monosaccharide derivative according to the present embodiment among the groups bonded to the carbon atoms constituting the 6-membered ring in the monosaccharide derivative, at least one group that does not change even when metabolized in the sialic acid biosynthesis pathway is carbon and It includes a ring structure having a double bond or triple bond with carbon.
  • the monosaccharide derivative is preferably represented by the formula (I), where R is a group containing a ring structure. It is represented by
  • glucosamine derivative When a glucosamine derivative is used as the monosaccharide derivative, for example, the formula (II) The monosaccharide derivative represented by these is preferable.
  • the monosaccharide derivative is sialized in the sialic acid biosynthesis pathway.
  • a group that does not change even when metabolized to an acid is a group containing an amino group bonded to the 2-position (—NH—C ( ⁇ O) —O—C—R). R is contained in a group bonded to the 2-position.
  • sialic acid is represented by formula (IV) It is represented by In the sialic acid represented by the formula (IV), among the groups bonded to the carbon atoms constituting the 6-membered ring, a group that does not change even when metabolized in the sialic acid biosynthetic pathway is a carboxyl group ( -COOH containing carbon at the 1-position), hydroxy group bonded at the 4-position (-OH), acetylamide group bonded at the 5-position (-NHAc), and groups bonded at the 6-position (7-position, 8-position and 9-position) -C (OH) -C (OH) -C (OH)) containing
  • the group that does not change even when metabolized in the sialic acid biosynthetic pathway is a carboxyl group bonded to the 2-position A hydroxy group bonded to the 4-position, an acetylamide group bonded to the 5-position, and a group bonded to the 6-position (—C (OH) —C (OH) —C—NH—C ( ⁇ O) —O—C— R).
  • R is contained in a group bonded to the 6-position.
  • the monosaccharide derivative is sialic acid represented by the formula (III)
  • the monosaccharide derivative is taken into the cell and transported into the nucleus (E in FIG. 1). Thereafter, the monosaccharide derivative is presented on the cell surface via the Golgi apparatus in the same manner as Ac 4 ManNAl.
  • R examples include various groups including a ring structure having a carbon-carbon double bond or triple bond.
  • the structure of R is exemplified in the following (a) to (m).
  • R is shown in (a).
  • the monosaccharide derivative according to the present embodiment can be synthesized by a known method based on the structure using a monosaccharide as a starting material.
  • the monosaccharide derivative represented by the formula (I) may be obtained by binding a compound having R to the amino group of mannosamine hydrochloride and acetylating the obtained mannosamine derivative.
  • the monosaccharide derivative represented by the formula (II) may be obtained by binding a compound having R to the amino group of glucosamine hydrochloride and acetylating the obtained glucosamine derivative.
  • the structure of the synthesized monosaccharide derivative can be confirmed by a conventional method using a nuclear magnetic resonance method (Nuclear Magnetic Resonance, NMR), a mass spectrometry method (Mass Spectrometry, MS), or the like.
  • the cell labeling agent according to the present embodiment may contain only the above monosaccharide derivative, or may contain the above monosaccharide derivative as an active ingredient and further contain a pharmacologically acceptable carrier.
  • Pharmacologically acceptable carriers are various organic or inorganic carrier materials used as pharmaceutical materials.
  • the cell labeling agent may contain, for example, an excipient, a lubricant, a binder, a disintegrant, a solvent, a solubilizing agent, a suspending agent, an isotonic agent, a buffering agent, and the like.
  • the cell labeling agent may contain additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents and sweeteners as necessary.
  • the form of the cell labeling agent is not particularly limited, and examples thereof include solutions, granules, tablets, and capsules.
  • the monosaccharide derivative and other components may be blended and formulated by a known method.
  • the content of the monosaccharide derivative in the cell labeling agent is not particularly limited.
  • the cell labeling agent contains 1 to 100% by weight, 5 to 95% by weight, 10 to 90% by weight, 20 to 80% by weight, 30 to 70% by weight or 40 to 60% by weight is contained.
  • R is presented on the cell surface when the monosaccharide derivative is metabolized through the sialic acid biosynthesis pathway. Therefore, cells can be labeled with the cell labeling agent according to the present embodiment. Since R is a group including a ring structure having a carbon-carbon double bond or triple bond, it is highly reactive. Since R is a structure that does not normally exist in the living body, it can be subjected to a bioorthogonal reaction such as a click reaction between tetrazine or azide and the like and R, for example. Thereby, various functional substances can be specifically added to sugar chains on the cell surface via R.
  • a cell labeling agent may be added to a medium containing cells and the cells may be exposed to the cell labeling agent.
  • the concentration at the time of adding the cell labeling agent to the medium is, for example, that the concentration of the monosaccharide inducer in the medium is 0.1 to 1 mM, 0.1 to 500 ⁇ M, 0.1 to 50 ⁇ M, 0.1 to 30 ⁇ M, or 1 ⁇ 25 ⁇ M.
  • the time for exposing the cell to the cell labeling agent is appropriately adjusted according to the type of cell and the activity of the sialic acid biosynthesis pathway in the cell, but is 12 to 96 hours or 48 to 96 hours, preferably 72 hours. .
  • the monosaccharide derivative remaining in the medium may be removed and the cells may be washed. By doing so, cells labeled with R presented on the cell surface can be obtained.
  • cells labeled with R can be visualized.
  • a reporter substance that reacts with R may be used.
  • the reporter substance include a fluorescent substance and a luminescent substance bound to tetrazine or azide.
  • the fluorescent substance include FAM, cyanine dye, Cy3, Cy5, pyrene and rhodamine.
  • Observation methods include fluorescence microscope observation, fluorescence endoscope observation, confocal endoscope observation, multiphoton excitation fluorescence microscope observation, narrow-band light observation, and co-optical coherence tomographic image observation, depending on the type of reporter substance. Is used.
  • the cell labeling agent according to the present embodiment is not limited to in vitro, but can label cells in vivo (in vivo).
  • the cell labeling agent may be administered to a subject.
  • the cell labeling agent is administered to animals such as zebrafish, medaka, frog, mouse, rat, dog, rabbit, chimpanzee, monkey and human.
  • the administration route of the cell labeling agent is not particularly limited.
  • the cell labeling agent can be administered orally or parenterally.
  • the cell labeling agent may be administered systemically or locally.
  • cell labeling agents can be injected into, for example, intravascular, sublingual, rectal, intravaginal, cutaneous, subcutaneous, intradermal, intravesical, trachea, eye, nose and ear, etc. It is administered by a method such as injection, spraying, or application.
  • the dose of the cell labeling agent is not particularly limited as long as it is an amount that can label the target cells.
  • the dosage form, administration route and dosage are appropriately selected depending on the body weight or condition of the subject animal.
  • the dose of the cell labeling agent is also adjusted depending on the type of target cell and reporter substance.
  • the dosage is, for example, 0.01 to 1000 mg / kg, 0.1 to 100 mg / kg, or 1 to 10 mg / kg per dose.
  • target cells may be collected from the mouse and exposed to the reporter substance as described above.
  • the reporter substance When R is added to the cell surface, the cell can be visualized or detected by a reporter substance.
  • the cells may be immobilized for easy observation.
  • a tissue section prepared by a known method from a tissue such as an organ of a mouse administered with a cell labeling agent may be exposed to a reporter substance.
  • a functional substance such as a reporter substance can be added to the cell surface without using a copper catalyst. Can do. Therefore, even if a cell labeling agent is administered to a living body, it is highly safe and can be widely applied in clinical practice.
  • R when R is contained in the group bonded to the 6-position, R is not limited to the terminal of the group bonded to the 6-position, that is, the group bonded to the carbon at the 9-position, It may be contained in a group bonded to the 7th or 8th carbon.
  • the monosaccharide derivative is sialic acid represented by the formula (III)
  • it is transported into the nucleus without undergoing the reactions A to D shown in FIG. 1, and sialic acid is presented on the cell surface.
  • the monosaccharide derivative represented by the formula (III) since it is presented on the cell surface earlier than the mannosamine derivative and the glucosamine derivative, the cells can be labeled with higher efficiency.
  • R When the monosaccharide derivative is sialic acid represented by the formula (III), R may be contained in a group substituted with a carboxyl group bonded to the 2-position, or a group bonded to the 4-position or 5-position. . When the monosaccharide derivative is sialic acid represented by the formula (III), R is preferably contained in a group bonded to the 5th or 9th position in order to efficiently react with a reporter substance or the like.
  • the monosaccharide derivative is a sialic acid represented by the formula (IV), and is a group bonded to carbon atoms constituting the 6-membered ring, which does not change even if metabolized by the sialic acid biosynthetic pathway. R may be included. Even if it is the said monosaccharide derivative, a cell can be labeled efficiently like the monosaccharide derivative represented by Formula (III).
  • the cell labeling agent according to the present embodiment is also useful for capturing sugar chains on cells or cell surfaces.
  • biotin may be bound to R using a click reaction.
  • Cells with biotin added to the surface can be captured by, for example, a column in which streptavidin is immobilized on a carrier.
  • the cell labeling agent is also useful for detecting or quantifying the sugar chain.
  • the reporter substance may contain a radionuclide.
  • a radionuclide By adding a radionuclide to the cell surface, the cells can be detected or visualized by autoradiography, positron emission tomography (PET) or computed tomography projection (SPECT).
  • PET positron emission tomography
  • SPECT computed tomography projection
  • the radionuclide is not particularly limited and is selected depending on the mode of use.
  • nuclides that emit positrons such as 11 C, 14 C, 13 N, 15 O, 18 F, 19 F, 62 Cu, 68 Ga, and 78 Br may be used.
  • nuclides that emit ⁇ -rays such as 99m Tc, 111 In, 67 Ga, 201 Tl, 123 I, and 133 Xe may be used.
  • a functional group that gives free radicals via R may be added to the cell surface. If a functional group that gives free radicals is added to the surface of cancer cells, proliferation of cancer cells, tumor growth, and the like are suppressed by the free radicals.
  • cyclooctyne In order to react with R, cyclooctyne, cyclooctene, cyclobutene and cyclopropene may be used as a reporter substance in addition to azide and tetrazine.
  • a cell labeling kit in another embodiment, includes a cell labeling agent according to the present embodiment, and a reporter that reacts with R, reacts with R, and binds to sialic acid when it is metabolized in the sialic acid biosynthetic pathway presented outside the cell.
  • a substance that reacts with R, reacts with R, and binds to sialic acid when it is metabolized in the sialic acid biosynthetic pathway presented outside the cell.
  • a disease diagnosis method using the cell labeling agent according to the present embodiment includes a first administration step of administering the cell labeling agent to the subject, a second administration step of administering to the subject a reporter substance that reacts with R and binds to sialic acid, and detects the reporter substance Or an evaluation step for quantification.
  • the diagnostic method can be preferably used for diagnosis of cancer and inflammation.
  • the sialic acid biosynthetic pathway is activated compared to normal cells, and more sialic acid is presented on the cell surface. Therefore, for example, by comparing the amount of the reporter substance detected in the subject as a subject with the amount of the reporter substance detected in cells of the normal tissue of the subject or cells of a healthy person, cancer and Inflammation and the like can be diagnosed. Since the cell labeling agent can rapidly add a reporter substance or the like to the cell surface, it can be diagnosed quickly.
  • Example 1 Synthesis of monosaccharide derivative BCN-ManNAc
  • D-Mannosamine hydrochloride 35.9 mg
  • DMF dimethylformamide
  • DIEA N-diisopropylethylamine
  • FIG. 2 shows the structures of D-mannosamine hydrochloride, BCN-Man and BCN-ManNAc.
  • BCN-ManNAc 27.2 mg was obtained with a yield of 53%.
  • the identification results of BCN-ManNAc by NMR (AV-400M, Bruker) and MS (Exactive, ThermoFisher) are shown below.
  • BCN-ManNAc 2.0 mg was dissolved in 190 ⁇ L of DMSO to obtain a 20 mM BCN-ManNAc solution.
  • 1.0 mg of FAM-tetrazine was dissolved in 180 ⁇ L of DMSO to prepare a 10 mM FAM-tetrazine solution.
  • 89 ⁇ L of phosphate buffered saline (PBS) was prepared in a microtube, and 1 ⁇ L of BCN-ManNAc solution and 10 ⁇ L of FAM-tetrazine solution were added thereto, and the mixture was stirred well with a vortex mixer to obtain a mixed solution.
  • the final concentrations of BCN-ManNAc and FAM-tetrazine in the mixture are 200 ⁇ M and 1 ⁇ M, respectively.
  • FIG. 3 shows the fluorescence spectra of the mixture and the control. It was shown that the fluorescence intensity greatly increased when BCN-ManNAc and FAM-tetrazine reacted.
  • FIG. 5 shows the change with time of the fluorescence spectrum of the mixed solution. It was shown that after about 1800 seconds, the fluorescence intensity was almost maximized.
  • BCN-ManNAc was added to a medium containing 1 ⁇ 10 5 HeLa cells and cultured for 72 hours.
  • the medium used was DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum).
  • the final concentration of BCN-ManNAc added to the medium was 0, 2.5, 5, 10, 20, 25 ⁇ M.
  • the medium was removed and the cells were washed 3 times with PBS. 3.7% paraformaldehyde was added and the cells were fixed for 20 minutes at room temperature.
  • a final concentration of 1 ⁇ M FAM-tetrazine was added to the plate containing the immobilized cells and incubated at room temperature for 20 minutes.
  • the cells were observed for fluorescence using a confocal laser microscope (Leica TCS SP8, manufactured by Leica Microsystems).
  • FIG. 6 shows the fluorescence image of the cell imaged with the confocal laser microscope. Fluorescence of FAM bound to BCN-ManNAc was observed. FAM fluorescence was not observed in cells cultured in a medium containing no BCN-ManNAc, but increased in a BCN-ManNAc concentration-dependent manner.
  • FIG. 7 shows a fluorescence image of cells cultured in a medium containing 25 ⁇ M BCN-ManNAc. Cells exposed to FAM-tetrazine (+) were observed by fluorescence, whereas cells not exposed to FAM-tetrazine ( ⁇ ) were not observed. This showed that cells cultured in media containing BCN-ManNAc can be visualized by exposure to FAM-tetrazine.
  • the present invention is suitable for labeling cells and diagnosing cancer and inflammation.

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Abstract

細胞標識剤は、細胞のシアル酸生合成経路でシアル酸に代謝される６員環構造の単糖誘導体を含む。単糖誘導体における６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない少なくとも１つの基が、炭素と炭素との二重結合又は三重結合を有する環構造を含む。

Description

細胞標識剤及び細胞標識キット
　本発明は、細胞標識剤及び細胞標識キットに関する。
　シアル酸生合成経路による単糖類の代謝を利用して、細胞表面にある糖鎖を標識する代謝ラベリング法が知られている。代謝ラベリング法では、例えば、アジド基を有するＮ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の誘導体（ペルアセチル化Ｎ－アジドアセチルマンノサミン、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）が使用される。細胞内に取り込まれたＡｃ４ＭａｎＮＡｚは、細胞質で酵素によって脱アセチル化され、対応するＮ－アジドアセチルシアル酸（ＳｉａＮＡｚ）に代謝される。ＳｉａＮＡｚはシアロ糖複合体に組み込まれる。そして、ＳｉａＮＡｚは糖鎖とともに細胞表面に提示される。ＳｉａＮＡｚが有するアジド基には、銅触媒を用いたアジド－アルキンの付加環化反応（ＣｕＡＡＣ）等のクリック反応によって、蛍光色素等を有するレポーター物質を付加することができる。
　非特許文献１には、ペルアセチル化Ｎ－（４－ペンチノイル）マンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｌ）を用いた代謝ラベリング法が開示されている。Ａｃ４ＭａｎＮＡｌは細胞において対応するシアル酸（ＳｉａＮＡｌ）に代謝され、ＳｉａＮＡｌが細胞表面に提示される。ＳｉａＮＡｌは末端にアルキンを有するため、当該アルキンとアジドとをＣｕＡＡＣで反応させることで、レポーター物質を細胞表面の糖鎖に付加することができる。
Ｃｈａｎｇ，Ｐａｍｅｌａ　Ｖ．、外６名、「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ　Ｓｉａｌｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｌｉｖｉｎｇ　Ａｎｉｍａｌｓ　ｗｉｔｈ　Ａｌｋｙｎｙｌ　Ｓｕｇａｒｓ．」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２００９年、４８、４０３０－４０３３
　Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及びＡｃ４ＭａｎＮＡｌでは、細胞表面に提示されたシアル酸が有するアジド又はアルキンを介してレポーター物質を糖鎖に付加するためにＣｕＡＡＣを利用しなければならない。銅は生体に対して毒性を有するため、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ又はＡｃ４ＭａｎＮＡｌを用いた細胞への生体内でのレポーター物質の付加は安全であるとは言い難い。したがって、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及びＡｃ４ＭａｎＮＡｌを臨床に応用するのは困難である。
　本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、安全性が高く、臨床に応用することができる細胞標識剤及び細胞標識キットを提供することを目的とする。
　本発明の第１の観点に係る細胞標識剤は、
　細胞のシアル酸生合成経路でシアル酸に代謝される６員環構造の単糖誘導体を含み、
　前記単糖誘導体における６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、前記シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない少なくとも１つの基が、
　炭素と炭素との二重結合又は三重結合を有する環構造を含む。
　この場合、前記単糖誘導体は、
　前記環構造を含む基をＲとして、式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　で表される、
　こととしてもよい。
　また、前記単糖誘導体は、
　前記環構造を含む基をＲとして、式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　で表される、
　こととしてもよい。
　また、前記単糖誘導体は、
　前記環構造を含む基をＲとして、式（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　で表される、
　こととしてもよい。
　また、前記Ｒは、
　下記（ａ）～（ｍ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　からなる群から選択される、
　こととしてもよい。
　本発明の第２の観点に係る細胞標識キットは、
　上記本発明の第１の観点に係る細胞標識剤と、
　前記細胞の外に提示された、前記シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない前記基と反応して前記シアル酸に結合するレポーター物質と、
　を備える。
　本発明によれば、反応性に富む環構造を細胞表面に提示させることができるため、銅触媒を使用せず細胞を標識できる。よって、本発明に係る細胞標識剤及び細胞標識キットは安全性が高く、臨床に応用することができる。
シアル酸生合成経路における一連の反応を示す模式図である。 本発明の実施例１に係る単糖誘導体の合成方法及び構造を示す図である。 実施例１に係る単糖誘導体と蛍光物質を含むレポーター物質とのクリック反応を示す図である。 実施例１に係る単糖誘導体に結合した蛍光物質の蛍光スペクトルを示す図である。 実施例１に係る単糖誘導体に結合した蛍光物質の蛍光スペクトルの経時変化を示す図である。 実施例１に係る単糖誘導体を介して蛍光物質を付加した細胞の蛍光画像を示す図である。 実施例１に係る単糖誘導体を２５μＭの濃度で含む培地で培養した細胞を、ＦＡＭ－テトラジンに暴露した場合（＋）及びＦＡＭ－テトラジンに暴露しない場合（－）の細胞の蛍光画像を示す図である。
　本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。
　（実施の形態）
　本実施の形態に係る細胞標識剤は、細胞のシアル酸生合成経路でシアル酸に代謝される単糖誘導体を含む。本実施の形態における細胞は、シアル酸生合成経路が機能する細胞であれば特に限定されない。好ましくは、細胞は動物細胞である。細胞は、生体から採取した細胞、初代培養細胞又は細胞株であってもよい。細胞は、正常細胞であってもよいし、がん化した細胞、すなわちがん細胞であってもよい。
　シアル酸生合成経路は、細胞内に取り込まれたＭａｎＮＡｃ等の単糖誘導体を、種々の酵素によって対応するシアル酸に代謝し、シアル酸を有する糖鎖に変換する経路である。シアル酸生合成経路でシアル酸に代謝される単糖類は、６員環構造を母体とする。よって、上記単糖誘導体は、６員環構造である。なお、シアル酸とは、ノイラミン酸の誘導体の総称で、特には、ノイラミン酸のアシル誘導体の総称である。
　図１には、種々の酵素によってＡｃ４ＭａｎＮＡｌを代謝し、ＳｉａＮＡｌ（一点鎖線で包囲）が結合した糖鎖に変換するシアル酸生合成経路が示されている。Ａｃ４ＭａｎＮＡｌが細胞内に取り込まれると、細胞質でのＡ～Ｅの反応を介して、核内でＣＭＰ－シアル酸となり、Ｆ及びＧの反応を経て、ＳｉａＮＡｌが結合した糖鎖が細胞表面に提示される。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧの反応は、それぞれ非特異的エステラーゼ、ＭａｎＮＡｃ　６－キナーゼ、シアル酸９－リン酸シンターゼ、シアル酸９－ホスファターゼ、ＣＭＰ－シアル酸シンテターゼ、ＣＭＰ－シアル酸ゴルジトランスポーター及びシアル酸トランスフェラーゼの作用による。
　シアル酸生合成経路でシアル酸に代謝される単糖誘導体としては、例えば、マンノサミン誘導体、グルコサミン誘導体及びシアル酸が挙げられる。マンノサミン誘導体、グルコサミン誘導体及びシアル酸は、６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない基を少なくとも１つ有する。なお、本明細書での「基」とは、原子の集団、すなわち原子団を意味する。よって、「基」には、６員環を構成する炭素原子に直接結合した水素原子は含まない。
　図１においてマンノサミン誘導体であるＡｃ４ＭａｎＮＡｌの構造と、代謝によって生成したＳｉａＮＡｌの構造とを比較すると、Ａｃ４ＭａｎＮＡｌのアミノ基を含む、二点鎖線で包囲された基は、ＳｉａＮＡｌにおいて維持されている。二点鎖線で包囲された当該基が、単糖誘導体における６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、Ａｃ４ＭａｎＮＡｌにおけるシアル酸生合成経路で代謝されても変化しない基である。
　本実施の形態に係る単糖誘導体は、単糖誘導体における６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない少なくとも１つの基が、炭素と炭素との二重結合又は三重結合を有する環構造を含む。
　単糖誘導体としてマンノサミン誘導体を用いる場合、環構造を含む基をＲとすると、単糖誘導体は、好ましくは、式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で表される。
　また、単糖誘導体としてグルコサミン誘導体を用いる場合、例えば、式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で表される単糖誘導体が好ましい。
　式（Ｉ）で表されるマンノサミン誘導体及び式（ＩＩ）で表されるグルコサミン誘導体の場合、６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、単糖誘導体がシアル酸生合成経路でシアル酸に代謝されても変化しない基は、２位に結合したアミノ基を含む基（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ－Ｒ）である。Ｒは２位に結合した基に含まれている。
　シアル酸の構造を例示すると、シアル酸は、式（ＩＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 で表される。式（ＩＶ）で表されるシアル酸において、６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない基は、２位に結合したカルボキシル基（１位の炭素を含む－ＣＯＯＨ）、４位に結合したヒドロキシ基（－ＯＨ）、５位に結合したアセチルアミド基（－ＮＨＡｃ）及び６位に結合した基（７位、８位及び９位の炭素を含む－Ｃ（ＯＨ）－Ｃ（ＯＨ）－Ｃ（ＯＨ））である。
　単糖誘導体としてシアル酸を用いる場合、式（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 で表される単糖誘導体が好ましい。
　式（ＩＩＩ）で表される単糖誘導体では、６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない基は、２位に結合したカルボキシル基、４位に結合したヒドロキシ基、５位に結合したアセチルアミド基及び６位に結合した基（－Ｃ（ＯＨ）－Ｃ（ＯＨ）－Ｃ－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ－Ｒ）である。Ｒは６位に結合した基に含まれている。
　単糖誘導体が式（ＩＩＩ）で表されるシアル酸の場合、単糖誘導体は細胞内に取り込まれて、核内に輸送される（図１におけるＥ）。その後、単糖誘導体は、Ａｃ４ＭａｎＮＡｌと同様に、ゴルジ体を経て、細胞表面に提示される。
　上記のＲとしては、炭素と炭素との二重結合又は三重結合を有する環構造を含む種々の基が挙げられる。例えば、Ｒの構造は下記（ａ）～（ｍ）に例示される。好適には、Ｒは（ａ）に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　本実施の形態に係る単糖誘導体は、単糖を出発物質として、構造に基づいて公知の方法により合成することができる。例えば、式（Ｉ）で表される単糖誘導体は、マンノサミン塩酸塩のアミノ基にＲを有する化合物を結合させ、得られたマンノサミン誘導体をアセチル化すればよい。同様に、式（ＩＩ）で表される単糖誘導体は、グルコサミン塩酸塩のアミノ基にＲを有する化合物を結合させ、得られたグルコサミン誘導体をアセチル化すればよい。合成した単糖誘導体の構造は、核磁気共鳴法（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＮＭＲ）及び質量分析法（Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＳ）等を用いた常法によって確認できる。
　本実施の形態に係る細胞標識剤は、上記単糖誘導体のみを含んでもよいし、上記単糖体誘導体を有効成分として含み、薬理的に許容される担体をさらに含んでもよい。薬理的に許容される担体は、製剤材料として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。細胞標識剤は、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤及び緩衝剤等を含んでもよい。また、細胞標識剤は、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物を含んでもよい。細胞標識剤の形態は、特に限定されず、例示すると、液剤、顆粒、錠剤及びカプセル剤等である。
　細胞標識剤が、単糖誘導体とその他の成分との合剤とする場合、単糖誘導体とその他成分とを配合し、公知の方法で製剤化すればよい。細胞標識剤における単糖誘導体の含量は特に限定されず、例えば、細胞標識剤には単糖誘導体が１～１００重量％、５～９５重量％、１０～９０重量％、２０～８０重量％、３０～７０重量％又は４０～６０重量％含まれる。
　上述のように、上記単糖誘導体がシアル酸生合成経路で代謝されることで、Ｒが細胞表面に提示される。したがって、本実施の形態に係る細胞標識剤によって細胞を標識することができる。Ｒは炭素と炭素との二重結合又は三重結合を有する環構造を含む基であるため、反応性に富む。Ｒは、通常は生体中に存在しない構造であるため、例えばテトラジン又はアジド等とＲとの間でクリック反応等のバイオオルソゴナルな反応に供することができる。これにより、Ｒを介して種々の機能性物質を細胞表面の糖鎖に特異的に付加することができる。
　次に、本実施の形態に係る細胞標識剤の使用方法について説明する。上記細胞標識剤で細胞を標識するには、細胞を含む培地に細胞標識剤を添加し、細胞を細胞標識剤に暴露すればよい。培地に細胞標識剤を添加する際の濃度は、例えば、培地における単糖誘導剤の濃度が０．１～１ｍＭ、０．１～５００μＭ、０．１～５０μＭ、０．１～３０μＭ、又は１～２５μＭである。
　細胞を細胞標識剤に暴露する時間は、細胞の種類及び細胞におけるシアル酸生合成経路の活性に応じて適宜調整されるが、１２～９６時間又は４８～９６時間、好適には７２時間である。細胞標識剤への暴露後、培地に残存する単糖誘導体を除去し、細胞を洗浄すればよい。こうすることで、細胞表面に提示されたＲによって標識された細胞を得ることができる。
　例えば、Ｒで標識された細胞は可視化することができる。細胞を可視化する場合、Ｒと反応するレポーター物質を用いればよい。レポーター物質としては、例えばテトラジン又はアジドに結合させた蛍光物質及び発光物質等が挙げられる。蛍光物質としては、ＦＡＭ、シアニン色素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ピレン及びローダミン等が挙げられる。Ｒで標識された細胞を、テトラジンに結合させた蛍光物質を含むレポーター物質に暴露することで、テトラジンがＲと反応し、細胞表面に蛍光物質を付加することができる。なお、Ｒで標識された細胞を溶解させて得たライセートにレポーター物質を反応させてもよい。
　レポーター物質に蛍光物質を用いた場合、細胞を蛍光観察によって画像に捉えることができる。観察の方法としては、レポーター物質の種類に応じて、蛍光顕微鏡観察、蛍光内視鏡観察、共焦点内視鏡観察、多光子励起蛍光顕微鏡観察、狭帯域光観察及び共光干渉断層画像観察等が用いられる。
　本実施の形態に係る細胞標識剤は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏに限らず、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でも細胞を標識することができる。生体内の細胞を標識する場合、当該細胞標識剤を対象に投与すればよい。当該細胞標識剤の投与対象は、動物、例えばゼブラフィッシュ、メダカ、カエル、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、チンパンジー、サル及びヒトである。
　細胞標識剤の投与経路は特に限定されない。細胞標識剤は、経口的、又は非経口的に投与できる。細胞標識剤は、全身投与でも局所投与でもよい。ヒトに投与する場合、細胞標識剤は、例えば、血管内、舌下、直腸内、腹膣内、皮膚、皮下、皮内、膀胱内、気管、眼、鼻及び耳等への注射又はカテーテルを介しての注入、噴霧、あるいは塗布等の方法で投与される。
　細胞標識剤の投与量は、標的とする細胞を標識できる量であれば特に限定されない。細胞標識剤を動物に投与する場合には、投与形態、投与経路及び投与量が対象となる動物の体重又は状態によって適宜選択される。また、細胞標識剤の投与量は、標的とする細胞及びレポーター物質の種類によっても調整される。ヒトに投与する場合、投与量は、例えば、１回あたり０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、又は１～１０ｍｇ／ｋｇである。
　細胞標識剤を投与した動物、例えばマウスにおいてＲで標識された細胞を可視化又は検出するには、マウスから標的の細胞を採取し、上述のように当該細胞をレポーター物質に暴露すればよい。当該細胞表面にＲが付加されている場合は、レポーター物質によって細胞を可視化又は検出できる。なお、観察を容易にするため、細胞を固定化してもよい。また、細胞標識剤を投与したマウスの臓器等の組織から公知の方法で作製した組織切片をレポーター物質に暴露してもよい。
　以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る細胞標識剤によれば、Ｒが反応性に富むため、銅触媒を用いなくてもレポーター物質等の機能性物質を細胞表面に付加することができる。よって、細胞標識剤を生体に投与しても安全性が高く、臨床に広く応用することができる。
　なお、式（ＩＩＩ）で表されるシアル酸においてＲが６位に結合した基に含まれる場合、Ｒは６位に結合した基の末端、すなわち９位の炭素に結合した基に限らず、７位又は８位の炭素に結合した基に含まれてもよい。単糖誘導体が式（ＩＩＩ）で表されるシアル酸の場合、図１に示すＡ～Ｄの反応を経ずに核内に輸送され、細胞表面にシアル酸が提示される。このため、式（ＩＩＩ）で表される単糖誘導体によれば、マンノサミン誘導体及びグルコサミン誘導体よりも早く細胞表面に提示されるため、より高い効率で細胞を標識することができる。
　なお、単糖誘導体が式（ＩＩＩ）で表されるシアル酸の場合、Ｒは、２位に結合したカルボキシル基を置換した基、４位又は５位に結合した基に含まれていてもよい。単糖誘導体が式（ＩＩＩ）で表されるシアル酸の場合、レポーター物質等と効率よく反応させるため、Ｒは５位又は９位に結合した基に含まれるのが好ましい。
　なお、単糖誘導体は、式（ＩＶ）で表されるシアル酸であって、その６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない基にＲを含むものであってもよい。当該単糖誘導体であっても、式（ＩＩＩ）で表される単糖誘導体と同様に、細胞を効率よく標識することができる。
　また、本実施の形態に係る細胞標識剤は、細胞又は細胞表面の糖鎖の捕捉にも有用である。細胞を捕捉する場合、例えば、クリック反応を利用してＲにビオチンを結合させればよい。表面にビオチンが付加された細胞は、例えばストレプトアビジンを担体に固定化したカラムで捕捉することができる。また、細胞表面の糖鎖にＲが付加されるので、細胞標識剤は糖鎖の検出又は定量にも有用である。
　また、レポーター物質は、放射性核種を含んでもよい。放射性核種を細胞表面に付加することで、オートラジオグラフィー、陽電子放射断層法（ＰＥＴ）又はコンピュータ断層画像投影法（ＳＰＥＣＴ）によって細胞を検出又は可視化できる。放射性核種は、特に限定されず、使用の態様によって選択される。
　例えば、ＰＥＴによる細胞の検出の場合は、１１Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ及び７８Ｂｒ等の陽電子を放出する核種を用いればよい。ＳＰＥＣＴによる細胞の検出の場合は、例えば、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１２３Ｉ及び１３３Ｘｅ等のγ線を放出する核種を用いればよい。
　また、Ｒを介してフリーラジカルを与える官能基等を細胞表面に付加してもよい。がん細胞の表面にフリーラジカルを与える官能基を付加すれば、フリーラジカルによってがん細胞の増殖、腫瘍の成長等が抑制される。
　なお、Ｒと反応させるために、アジド及びテトラジンの他に、シクロオクチン、シクロオクテン、シクロブテン及びシクロプロペンをレポーター物質に用いてもよい。
　他の実施の形態では、細胞標識キットが提供される。当該細胞標識キットは、本実施の形態に係る細胞標識剤と、細胞の外に提示されたシアル酸生合成経路で代謝されても変化しない基、すなわちＲと反応してシアル酸に結合するレポーター物質と、を備える。
　別の実施の形態では、本実施の形態に係る細胞標識剤を用いた疾患の診断方法が提供される。当該診断方法は、上記細胞標識剤を対象に投与する第１の投与ステップと、Ｒと反応してシアル酸に結合するレポーター物質を当該対象に投与する第２の投与ステップと、レポーター物質を検出又は定量する評価ステップと、を含む。
　当該診断方法は、好適には、がん及び炎症等の診断に用いることができる。がん細胞及び炎症細胞では、正常な細胞と比較してシアル酸生合成経路が活性化しており、より多くのシアル酸が細胞表面に提示されている。よって、例えば、対象としての被験者で検出されたレポーター物質の量と、被験者の正常な組織の細胞又は健常者の細胞等で検出されたレポーター物質の量と、を比較することで、がん及び炎症等を診断することができる。当該細胞標識剤は、レポーター物質等を細胞表面に迅速に付加することができるため、素早く診断することができる。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　（実施例１：単糖誘導体ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃの合成）
　Ｄ－マンノサミン塩酸塩３５．９ｍｇをナスフラスコに入れ、減圧及び窒素置換を３回繰り返し、反応系内を窒素で置換した。そこへ脱水ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）２ｍＬ、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメチルＮ－スクシニミジルカーボネート（ＢＣＮ－ＮＨＳ）５３．３ｍｇ、及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）５８μＬを加え、室温で１２時間撹拌した。反応後、エバポレーターで溶媒を除去し、次いでシリカカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝４：１）で精製した。目的物を含むフラクションをナスフラスコに回収し、エバポレーターで溶媒を除去し、真空ポンプで乾燥させた。その結果、ＢＣＮ修飾マンノサミン（ＢＣＮ－Ｍａｎ）４２．２ｍｇを収率７１％で得た。
　ＢＣＮ－Ｍａｎ３５．０ｍｇをナスフラスコに入れ、反応系内を窒素で置換した。そこへ脱水ピリジン１ｍＬ、無水酢酸９３μＬを加え、室温で５時間撹拌した。反応後、エバポレーターで溶媒を除去し、次いでシリカカラムクロマトグラフィー（へキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製した。目的物であるアセチル化ＢＣＮ修飾マンノサミン（ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃ）を含むフラクションをナスフラスコに回収し、エバポレーターで溶媒を除去し、真空ポンプで乾燥させた。
　（結果）
　図２にＤ－マンノサミン塩酸塩、ＢＣＮ－Ｍａｎ及びＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃの構造を示す。ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃ２７．２ｍｇを収率５３％で得ることができた。ＮＭＲ（ＡＶ－４００Ｍ、Ｂｒｕｋｅｒ社製）及びＭＳ（Ｅｘａｃｔｉｖｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）によるＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃの同定結果を以下に示す。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）　δ：６．０９（ｓ，１Ｈ），５．３０　（ｄｄ，Ｊ＝４．２，１０．２Ｈｚ，１Ｈ），５．２１－５．００（ｍ，３Ｈ），４．４８－４．０１（ｍ，４Ｈ），２．３０－２．２３（ｍ，４Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．１１－２．０２（ｍ，４Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），１．３９（ｍ，１Ｈ），０．９７（ｍ，１Ｈ）
　１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）　δ：１７０．６１，１７０．０７，１６９．６５，１６８．１８，１５６．１１，９８．７５，９１．８８，７３．３９，７１．５３，７０．１９，６９．１５，６５．３３，６３．６５，６１．９７，５１．１１，２９．０１，２１．３９，２０．８９，２０．７５，２０．６４，２０．１９，１７．６２
　Ｃ２５Ｈ３３Ｏ１１ＮＣｌに関するＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｃｌ）－、計算値：５５８．１７３７、実測値５５８．１８０６
　（実施例２：ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃの反応性の確認）
　ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃ２．０ｍｇを１９０μＬのＤＭＳＯに溶解し、２０ｍＭのＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃ溶液とした。ＦＡＭ－テトラジン１．０ｍｇを１８０μＬのＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭのＦＡＭ－テトラジン溶液とした。マイクロチューブに８９μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を準備し、そこにＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃ溶液１μＬ、ＦＡＭ－テトラジン溶液１０μＬを加え、ボルテックスミキサーでよく撹拌し、混合液を得た。混合液におけるＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃ及びＦＡＭ－テトラジンの終濃度は、それぞれ２００μＭ及び１μＭである。
　１００μＬの混合液を３７℃で１．５時間反応させた。コントロールとしてＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃ２００μＭのみの試料１００μＬを調製した。分光蛍光光度計（ＪＡＳＣＯ　ＦＰ－８２００）を用いて混合液及びコントロールの蛍光スペクトルを測定した（λｅｘ＝４９２ｎｍ、λｅｍ＝５１７ｎｍ）。また、ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃ及びＦＡＭ－テトラジンの反応の時間依存性を評価するために、１００μＬの混合液の蛍光スペクトルを時間変化測定モードで４０００秒まで測定した。
　（結果）
　図３に示すようにＦＡＭ－テトラジンがＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃに結合すると、ＦＡＭの蛍光が強く発せられる。図４は、混合液及びコントロールの蛍光スペクトルを示す。ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃとＦＡＭ－テトラジンとが反応すると、蛍光強度が大きく増加することが示された。図５は、混合液の蛍光スペクトルの経時変化を示す。約１８００秒後には、蛍光強度がほぼ最大になることが示された。
　（実施例３：細胞の蛍光イメージング）
　１×１０５個のＨｅＬａ細胞を含む培地にＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃを加え、７２時間培養した。使用した培地は、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）である。培地に加えたＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃの終濃度は、０、２．５、５、１０、２０、２５μＭとした。培養後、培地を除去し、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。３．７％パラホルムアルデヒドを加え、室温で２０分間細胞を固定化した。固定化した細胞を含むプレートに終濃度１μＭのＦＡＭ－テトラジンを加え、室温で２０分間インキュベートした。共焦点レーザー顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ　ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて細胞に対する蛍光観察を行った。
　（結果）
　図６は、共焦点レーザー顕微鏡で撮像した細胞の蛍光画像を示す。ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃに結合したＦＡＭの蛍光が観察された。ＦＡＭの蛍光は、ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃを含まない培地で培養した細胞では観察されず、ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃの濃度依存的に増加した。図７は、２５μＭのＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃを含む培地で培養した細胞の蛍光画像を示す。ＦＡＭ－テトラジンに暴露した細胞（＋）が蛍光によって観察されたのに対し、ＦＡＭ－テトラジンに暴露していない細胞（－）は、観察されなかった。これにより、ＢＣＮ－ＭａｎＮＡｃを含む培地で培養した細胞は、ＦＡＭ－テトラジンへの暴露によって可視化できることが示された。
　本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０１８年２月５日に出願された、日本国特許出願２０１８－１８１７２号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１８－１８１７２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明は、細胞の標識並びにがん及び炎症等の診断に好適である。

Claims (6)

  1. 　細胞のシアル酸生合成経路でシアル酸に代謝される６員環構造の単糖誘導体を含み、
    　前記単糖誘導体における６員環を構成する炭素原子に結合した基のうち、前記シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない少なくとも１つの基が、
    　炭素と炭素との二重結合又は三重結合を有する環構造を含む、
    　細胞標識剤。
  2. 　前記単糖誘導体は、
    　前記環構造を含む基をＲとして、式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　で表される、
    　請求項１に記載の細胞標識剤。
  3. 　前記単糖誘導体は、
    　前記環構造を含む基をＲとして、式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　で表される、
    　請求項１に記載の細胞標識剤。
  4. 　前記単糖誘導体は、
    　前記環構造を含む基をＲとして、式（ＩＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　で表される、
    　請求項１に記載の細胞標識剤。
  5. 　前記Ｒは、
    　下記（ａ）～（ｍ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　からなる群から選択される、
    　請求項２から４のいずれか一項に記載の細胞標識剤。
  6. 　請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞標識剤と、
    　前記細胞の外に提示された、前記シアル酸生合成経路で代謝されても変化しない前記基と反応して前記シアル酸に結合するレポーター物質と、
    　を備える、細胞標識キット。
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