CN101925366A - 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法 - Google Patents

炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101925366A
CN101925366A CN2008801255960A CN200880125596A CN101925366A CN 101925366 A CN101925366 A CN 101925366A CN 2008801255960 A CN2008801255960 A CN 2008801255960A CN 200880125596 A CN200880125596 A CN 200880125596A CN 101925366 A CN101925366 A CN 101925366A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alkynes
organic group
dipole
compound
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2008801255960A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101925366B (zh
Inventor
G-J·布恩斯
郭军
宁兴海
M·沃尔菲特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Original Assignee
University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Georgia Research Foundation Inc UGARF filed Critical University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority to CN201410717307.3A priority Critical patent/CN104529711B/zh
Publication of CN101925366A publication Critical patent/CN101925366A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101925366B publication Critical patent/CN101925366B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
    • C07C251/32—Oximes
    • C07C251/50—Oximes having oxygen atoms of oxyimino groups bound to carbon atoms of substituted hydrocarbon radicals
    • C07C251/58—Oximes having oxygen atoms of oxyimino groups bound to carbon atoms of substituted hydrocarbon radicals of hydrocarbon radicals substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/33—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C211/39—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of an unsaturated carbon skeleton
    • C07C211/41—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of an unsaturated carbon skeleton containing condensed ring systems
    • C07C211/42—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of an unsaturated carbon skeleton containing condensed ring systems with six-membered aromatic rings being part of the condensed ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
    • C07C251/32—Oximes
    • C07C251/34—Oximes with oxygen atoms of oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C251/44—Oximes with oxygen atoms of oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with the carbon atom of at least one of the oxyimino groups being part of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/32—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C271/34—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C35/00—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C07C35/22—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring polycyclic, at least one hydroxy group bound to a condensed ring system
    • C07C35/37—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring polycyclic, at least one hydroxy group bound to a condensed ring system with a hydroxy group on a condensed system having three rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/587—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring
    • C07C49/657—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring containing six-membered aromatic rings
    • C07C49/683—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring containing six-membered aromatic rings having unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/16—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D261/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings
    • C07D261/20—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D271/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D271/12—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/94—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom spiro-condensed with carbocyclic rings or ring systems, e.g. griseofulvins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C07D311/90—Xanthenes with hydrocarbon radicals, substituted by amino radicals, directly attached in position 9
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/02—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems
    • C07C2603/04—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings
    • C07C2603/36—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing eight-membered rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)

Abstract

1，3-偶极-官能化合物(例如叠氮官能化合物)可与某些炔烃在环化反应中反应，以形成杂环化合物。还公开了有用的炔烃(例如有张力的环状炔烃)和制备此类炔烃的方法。1，3-偶极-官能化合物与炔烃的反应可以用于各种应用，包括将生物分子固定于基材上。

Description

炔烃以及炔烃与1，3-偶极-官能化合物反应的方法
本申请要求2007年11月21日提交的美国临时申请No.61/004,021、2007年12月4日提交的美国临时申请No.61/007,674以及2008年7月25日提交的美国临时申请No.61/137,061的权益，通过引用将所有这些申请整体并入本文。
政府资助
本发明是由政府支持在美国国立卫生研究院生物医学复合碳水化合物研究资源中心(Research Resource Center for Biomedical Complex Carbohydrates of the National Institutes of Health)的资助下作出的(资助号P41-RR-5351)。政府对本发明享有某些权利。
背景
生物正交反应(Bioorthogonal reaction)是各材料彼此间的反应，其中每一种材料与体内存在的官能团具有有限的反应性或基本上没有反应性。在叠氮化物和末端炔烃之间的有效反应(即，最广泛研究的“点击(click)”化学的例子)称为生物正交反应的有用例子。尤其，已将提供稳定的三唑类的Cu(I)催化的叠氮化物与末端炔烃的1，3-偶极环化反应(例如Binder等人，Macromol.Rapid Commun.2008，29：952-981)用于标记各种生物分子，包括蛋白、核酸、脂质和糖类。该环化加成(cycloaddition)还已经用于基于活性的蛋白谱、酶活性的监测以及微阵列的化学合成和小分子文库。
将叠氮化物安装入生物分子中的有吸引力的方法以代谢标记为基础，其中使用细胞的生物合成手段将含有叠氮化物的生物合成前体引入到生物分子中。该方法已经用于通过各种反应性探针来标记活体系统的蛋白、聚糖和脂质。这些探针能够促进糖选择性糖蛋白的定位(mapping)和鉴定糖基化部位。炔烃探针还已经用于叠氮化物修饰的生物分子的细胞表面成像，且一种特别有吸引力的方法包括通过[3+2]环化加成，从无荧光前体产生荧光探针。
尽管使叠氮化物与末端炔烃反应具有明显实用性，但使用该反应在生物系统中的应用实际上已经受到包括存在不合需要的铜催化剂在内的因素的限制。因此，对于新的生物正交反应存在着持续的、尚未满足的需求。
概述
在一个方面，本发明提供炔烃以及制备炔烃的方法。在一个实施方案中，该炔烃具有下式：
Figure BPA00001186284600021
其中：各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；且各R3和R4独立地表示氢或有机基团(例如，其可包含可裂解连接基(cleavable linker))。还提供某些炔烃与聚合物或共聚物的共混物，其可任选形成共聚物胶束，该共混物如本文所述可例如用于控制药物的传递。
在另一个实施方案中，炔烃包括：包括至少两个末端(end)的可裂解连接基片段；连接于可裂解连接基片段的第一末端的炔烃片段；以及连接于可裂解连接基片段的第二末端的生物素化片段。在优选实施方案中，该炔烃片段包括有张力(strained)的环状炔烃片段。在某些实施方案中，该炔烃进一步包括至少一种重质同位素。任选地，该炔烃进一步包括至少一种可检测标记，例如荧光标记。
诸如上文所述炔烃之类的炔烃可以与至少一种1，3-偶极官能化合物(例如叠氮官能(azide-functional)化合物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物和氧化偶氮官能(azoxy-functional)化合物和/或酰基重氮官能(acyl diazo-functional)化合物)在环化反应中反应，以形成杂环化合物，该反应优选基本上不存在添加的催化剂(例如Cu(I))。任选地，可以在活细胞内或活细胞的表面上发生该反应。在某些实施方案中，至少一种1，3-偶极-官能化合物包括1，3-偶极-官能生物分子，例如肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂质、糖类、寡糖和/或多糖。任选地，1，3-偶极-官能生物分子包括可检测标记，如亲合标记标记亲合标记。本文还公开了通过炔烃与至少一种1，3-偶极-官能化合物(的反应)所形成的杂环化合物。在某些实施方案中，可以在活细胞内或活细胞的表面上发生炔烃与至少一种1，3-偶极-官能化合物之间的反应。
对于其中杂环化合物包括生物素化片段的实施方案，杂环化合物可以与结合生物素的化合物(例如抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白)结合。
在另一个方面，本发明提供在其表面上具有如本文所述的炔烃的基材。该基材可以为树脂、凝胶、纳米颗粒或它们的组合的形式。任选地，该基材是三维基质。在优选的实施方案中，式I的炔烃的X基团表示与基材表面的连接点。此类基材可以用于固定生物分子，如肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂质、糖类、寡糖和/或多糖。本文还公开包含固定的生物分子(例如固定在三维基质上的蛋白)的制品。
相对于本领域已知的生物正交反应，本文所公开的组合物和方法可提供优点。参见例如Baskin等人，QSAR Comb.Sci.2007，26：1211-1219。例如，令人惊奇地发现，如本文所述的式I的炔烃(例如其中X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；且各R3和R4独立地表示氢或有机基团)比其他有张力的环状炔烃(例如其中X表示CH2)具有更高的对1，3-偶极官能化合物的反应性。参见例如Codelli等人，J.Am.Chem.Soc.2008，130：11486-11493；Johnson等人，Chem.Commun.2008，3064-3066；Sletten等人，Organic Letters 2008，10：3097-3099；以及Laughlin等人，Science 2008，320：664-667。此外，本文公开了具有制备各种式I的炔烃的灵活性的便利方法。另外，式I的炔烃具有不仅与叠氮化物反应，而且与各种其他1，3-偶极-官能化合物反应的能力。
定义：
术语“包含”及其变化在这些术语出现在说明书和权利要求书之处不具有限制性含义。
本文所使用的“一个”、“一种”、“该”、“至少一种”和“一种或多种”可互换使用。
本文所使用的术语“或”一般在意义上包括“和/或”，除非该用法的上下文另有清楚规定。
另外本文中，用端点描述的数值范围包括包含在该范围内的所有数值(例如1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
以上概述无意描述本发明的每一个公开的实施方案或每一种执行(implementation)。以下的描述更具体地举例说明示例性实施方案。在贯穿本申请中的几处，通过实例名单来提供指导，所述实施例可以各种组合使用。在每一种情况下，所描述的名单仅仅用作一个代表性组，而不应解释为排他性名单。
附图简述
图1示出了用于标记叠氮官能生物分子的示例性试剂。
图2示出了方案1：示例性的试剂和条件：a)TBSCl，吡啶；b)Br2，CHCl3；c)LDA，四氢呋喃；d)氯甲酸4-硝基苯酯，吡啶，CH2Cl2；e)N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，三乙胺(TEA)。LDA＝二异丙基酰胺锂，TBS＝叔丁基二甲基甲硅烷基。
图3示出了方案2：示例性的试剂和条件：a)甲醇中的化合物3。
图4示出了化合物3与叠氮官能氨基酸和糖类的示例性的无金属环化加成。Boc＝叔丁氧羰基，TDS＝2，3-二甲基-2-丁基二甲基甲硅烷基(thexyldimethylsilyl)。
图5示出了方案3：示例性反应条件：a)1，三乙胺，DMF，室温，78％；b)20％三氟乙酸(TFA)，室温，95％；c)2，TEA，DMF，室温，68％。
图6示出了用化合物2和9标记的细胞表面的实施方案。将不存在或存在Ac4ManNAz(25微摩尔)条件下生长3天的Jurkat细胞：a)用化合物2和9(30微摩尔)孵育0-180分钟，或者b)用化合物2和9(0-100微摩尔)在室温下孵育1小时。接着，将所述细胞用抗生物素蛋白-FITC在4℃下孵育15分钟，此后，评价细胞溶解产物的荧光强度。样品如下标明：用2(○)或9(□)孵育的空白细胞，以及用2(●)或9(■)孵育的Ac，ManNAz细胞。
图7示出了细胞标记程序的毒性评价和与化合物9环化加成反应的实施方案。将在(a)不存在Ac4ManNAz(25微摩尔)或(b)存在Ac4ManNAz(25微摩尔)的条件下生长3天的Jurkat细胞用化合物9(0-100微摩尔)在室温下孵育1小时。将细胞洗涤三次，然后用用与荧光素缀合的抗生物素蛋白在4℃下孵育15分钟，此后将细胞洗涤三次。在该程序过程中用台盼蓝排斥法在不同时间点评价细胞活力：在用9孵育之后(黑)、在抗生物素蛋白-FITC孵育之后(灰)和在完成程序之后(白)。对于空白和Ac4ManNAz处理的细胞两者，在相同条件下用CuICl(1mM)处理导致大约98％的细胞死亡。
图8示出了用化合物9和抗生物素蛋白-Alexa Fluor 488标记的细胞的实施方案的荧光图像。将在不存在Ac4ManNAz(100微摩尔)(d-f)或存在Ac4ManNAz(100微摩尔)(a-c)的情况下生长3天的CHO细胞用化合物9(30微摩尔)在4℃下(a，d)或室温下(b、c、e、f)孵育1小时。接着，将细胞用抗生物素蛋白-Alexa Fluor 488在4℃下孵育15分钟，并在洗涤、固定以及用远红外荧光染料TO-PRO将核染色之后，进行成像(a、b、d、e)，或者在洗涤之后，在37℃下孵育1小时，然后进行固定、核染色，以及成像(c、f)。融合(merged)表示将用Alexa Fluor(488纳米(nm))和TO-PRO-3碘化物(633nm)标记的细胞的图像融合。
图9示出了包含炔烃片段、可裂解连接基片段和生物素化片段的示例性化合物。
图10示出了方案4：示例性反应条件：a)DMF，80℃，70％；b)硫代乙酸钾(KSAc)，DMF，60℃，90％；c)NH2NH2，乙醇(EtOH)，回流，95％；d)N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，DMF，0℃，56％；e)DIPEA，DMF，室温，85％。
图11示出了方案5：示例性反应条件：a)对甲苯磺酸(TsOH)，室温，81％；b)DMF，80℃，86％；c)0.1N HCl，EtOH，室温，90％；d)9，NaH，DMF，0℃，88％；e)0.1N HCl，EtOH，室温，88％；f)CCl4，PPh3，二氯甲烷(DCM)，室温，96％；g)KSAc，DMF，60℃，90％；h)NH2NH2，EtOH，回流，95％；然后(Boc)2O，TEA，EtOH，91％；i)20％ TFA，DCM，室温，95％；j)DIPEA，DMF，0℃；然后(Boc)2O，TEA，EtOH，60％(经两个步骤)；k)20％ TFA，DCM，室温，然后8 DIPEA，DMF，室温，80％(经两个步骤)。
图12示出了示例性可裂解连接基。
图13示出了示例性的炔烃和反应性二烯烃。
图14示出了方案6：示例性反应条件：a)TMSCH2N2，BF3OEt2，DCM，-10℃，3小时，71％；b)NaBH4，1∶1 EtOH/THF，室温，7小时，100％；C)Br2，CHCl3，室温，0.5小时，58％；d)LDA，THF，0.5小时，57％；e)戴斯-马丁(Dess-Martin)试剂，DCM，0.5h；f)氯甲酸4-硝基苯酯，吡啶，DCM，18小时，92％；g)三甘醇-1，8-二胺，TEA，DCM，室温，3小时，80％；h)溴乙酸，NaH，THF，22％；i)三甘醇-1，8-二胺，HATU偶联剂，DIPEA，DMF，室温，2小时，75％；j)N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2-氨基氧基-乙酰胺，AcOH，1∶1 DCM/MeOH，63％。
图15示出了化合物61-68和二阶常数。
图16示出了方案7：示例性的试剂和条件：a)LiAlH4，AlCl3，Et2O，0℃，61％；b)Br2，CHCl3，0℃，58％；c)叔丁醇钾(t-BuOK)，THF，室温，25％。
图17示出了方案8：示例性的试剂和条件：a)TEA，CH2Cl2，室温，77％。
图18示出了方案9：示例性的试剂和条件：a)NaH，苄基溴，DMF，室温，59％；b)乙酸酐(Ac2O)，吡啶，室温，81％。
图19示出了方案10：a)LDA，Et3SiCl，THF，室温，85％；b)SELECTFLUOR氟化试剂，DMF，室温，66％c)LDA，Et3SiCl，THF，室温，79％；d)SELECTFLUOR氟化试剂，DMF，室温，51％；e)NaBH4，EtOH，室温，78％；f)Br2，CHCl3，0℃，46％；g)c)t-BuOK，THF，室温，49％。
图20示出了用于药物传递的共聚物胶束的使用。A)聚酯和聚乙二醇基团在水中自组装。B)官能化共聚物胶束作为药物传递装置。C)共聚物胶束的肟改性的炔烃衍生物。
图21示出了用4-二苯并环辛炔官能团(functionality)制备大分子。
图22示出了4-二苯并环辛炔醇与各种硝酮的环化加成。将化合物以6mN的终浓度按1∶1摩尔比混合，并进行反应，持续规定的时间。
说明性实施方案的详述
诸如本文所述的那些炔烃之类的炔烃可以与至少一种1，3-偶极-官能化合物在环化反应中反应，以形成杂环化合物。在优选实施方案中，在基本上不存在添加的催化剂(例如Cu(I))的情况下进行该反应。示例性1，3-偶极-官能化合物包括但不限于叠氮官能化合物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物、氧化偶氮官能化合物和/或酰基重氮官能化合物。
示例性炔烃包括下式的炔烃：
Figure BPA00001186284600061
其中：各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团(优选C1-C10有机结构部分(moiety))；各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团(优选C1-C10有机结构部分)；X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；且各R3和R4独立地表示氢或有机基团(在某些实施方案中表示有机结构部分)。在优选实施方案中，各R1表示氢和/或各R2表示氢。任选地，R3包括共价结合的有机染料(例如荧光染料)。
对于本发明来说，本文所使用的术语“有机基团”指烃基，将其分类为脂族基团、环状基团或脂族基团和环状基团的组合(例如烷芳基和芳烷基)。在本发明的上下文中，本发明化合物的适合有机基团是不干涉炔烃与1，3-偶极-官能化合物形成杂环化合物的反应的那些基团。在本发明的上下文中，术语“脂族基团”指饱和或不饱和的直链或支链烃基。该术语用来涵盖例如烷基、烯基和炔基。术语“烷基”指饱和的直链或支链一价烃基，包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、戊基、庚基等。术语“烯基”指具有一个或多个烯属不饱和基团(即碳-碳双键)的不饱和的直链或支链一价烃基，如乙烯基。术语“炔基”指具有一个或多个碳-碳三键的不饱和的直链或支链一价烃基。术语“环状基团”指闭环烃基，将其分类为脂环族基、芳族基或杂环基团。术语“脂环族基”指具有与脂族基的那些性质类似的性质的环状烃基团。术语“芳族基”或“芳基”指单核或多核芳族烃基。术语“杂环基团”指闭环烃类，其中环中的一个或多个原子是非碳元素(例如氮、氧、硫等)。
作为简化贯穿本申请中所使用的某些术语的讨论和叙述的方式，使用术语“基团”和“结构部分”来在允许取代或可被取代的化学种类(chemical species)与不允许取代或不可被取代的化学种类之间进行区分。因此，当术语“基团”用来描述化学取代基时，所述化学物质包括未被取代的基团和具有非过氧化O、N、S、Si或F原子的基团(例如在链以及羰基或其他常规取代基中)。当使用术语“结构部分”来描述化合物或取代基时，仅仅有意包括未被取代的化学物质。例如短语“烷基”有意不仅包括纯的开链饱和烃烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、叔丁基等，而且包括携带本领域已知的其他取代基的烷基取代基，所述其他取代基例如是羟基、烷氧基、烷基磺酰基、卤素原子、氰基、硝基、氨基、羧基等。因此，“烷基”包括醚基、卤代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羟烷基、磺基烷基等。另一方面，短语“烷基结构部分”限于仅仅包括纯的开链饱和烃烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、叔丁基等。
式I的炔烃通常是有张力的环状炔烃。令人惊奇地发现，与其他有张力的环状炔烃(例如其中X表示CH2)相比，本文所述的式I的炔烃(例如其中X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；且各R3和R4独立地表示氢或有机基团)对1，3-偶极-官能化合物具有更高的反应性。
在式I的炔烃的某些实施方案中，X可表示C＝N-OR3，其中R3是有机基团。例如，R3可以具有式-(CH2)aC(O)Y，其中：a是1-3；Y表示OH或NHR5；且R5表示氢或含伯胺的有机基团的生物素化产物。含伯胺的基团可例如具有式-(CH2CH2O)b(CH2)c-Ld-(CH2CH2O)e(CH2)fNH2和/或-(CD2CD2O)b(CD2)c-Ld-(CD2CD2O)e(CD2)fNH2，其中b＝0-100(例如10-100)；c＝0-100(优选1-10)；d＝0-100(优选1-10)；e＝0-100(例如10-100)；f＝0-100(优选1-10)；以及L是任选的可裂解连接基(例如二硫基(disulfide))。
在式I的炔烃的某些实施方案中，X可表示CHOR3，其中R3选自烷基、芳基、烷芳基和芳烷基。例如R3可具有式-C(O)Z，其中Z表示烷基、OR6或NHR7；以及R6和R7各自独立地选自烷基、芳基、烷芳基和芳烷基。在某些实施方案中，R7可以是含伯胺的有机基团的生物素化产物。含伯胺的有机基团可以例如具有式-(CH2CH2O)b(CH2)c-Ld-(CH2CH2O)e(CH2)fNH2和/或-(CD2CD2O)b(CD2)c-Ld-(CD2CD2O)e(CD2)fNH2，其中b＝0-100(例如10-100)；c＝0-100(优选1-10)；d＝0-100(优选1-10)；e＝0-100(例如10-100)；f＝0-100(优选1-10)；以及L是任选的可裂解连接基(例如二硫基)。
式I的示例性炔烃是其中X表示C＝O的物质(species)，下式的炔烃：
Figure BPA00001186284600081
式I的另一示例性炔烃是其中X表示CHOH的物质，下式的炔烃：
Figure BPA00001186284600082
式I的另一示例性炔烃是其中X表示CHNH2的物质，下式的炔烃：
式I的另一示例性炔烃是其中X表示C＝N-OR3的物质，下式的炔烃：
Figure BPA00001186284600091
其中R3表示氢或有机基团(在某些实施方案中表示有机结构部分)。
另外的示例性炔烃包括炔烃，其具有：包含至少两个末端的可裂解连接基片段；连接于可裂解连接基片段的第一末端的炔烃片段；以及连接于可裂解连接基片段的生物素化片段。在某些实施方案中，炔烃片段包括有张力的环状炔烃片段。在某些实施方案中，炔烃进一步包含至少一种重质同位素。任选地，炔烃进一步包含至少一个可检测标记(例如荧光标记)。
在式I的炔烃的某些实施方案中，X可表示聚合基团或共聚基团。对于其中X表示共聚基团的实施方案，共聚基团可以包括亲水片段(hydrophilic segment)和疏水片段(hydrophobic segment)。例如共聚基团可以包括式-[CH2CH2O]n-[C(O)(CH2)5O]m-H的片段，其中n＝0-100(例如10-100)，且m＝0-100(例如10-100)。通常将其上的水滴或水溶液滴表现小于90度的接触角的表面称为“亲水性的”。疏水性材料与水的接触角通常大于90度。
本文还公开了制备式I的炔烃的示例性方法。在一个实施方案中，该方法包括：将下式的烯烃溴化：
Figure BPA00001186284600092
获得下式的二溴化物：
将式XV的二溴化物脱去溴化氢，获得下式的炔烃：
Figure BPA00001186284600101
其中：各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；以及R3和R4独立地表示氢或有机基团(例如其可包含可裂解连接基)。
各种1，3-偶极-官能化合物可以用来与本文所公开的炔烃反应。本文所使用的“1，3-偶极-官能化合物”意图包括连接有至少一个1，3-偶极基团的化合物。本文所使用的“1，3-偶极基团”有意指具有三原子π电子系统的基团，所述系统含有在3个原子上离域的4个电子。示例性1，3-偶极基团包括但不限于叠氮基团、氧化腈基团、硝酮基团、氧化偶氮基团和酰基重氮基团。在某些实施方案中，1，3-偶极-官能化合物可以是生物分子，其上连接有至少一个1，3-偶极基团。任选地，至少一个1，3-偶极-官能化合物可以包括可检测标记(例如免疫测定标记或亲合标记)。
可将一种或多种1，3-偶极-官能化合物(例如叠氮官能化合物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物和氧化偶氮官能化合物和/或酰基重氮官能化合物)与本文所描述的炔烃在有效在环化反应中反应且形成杂环化合物的条件下结合(combined)。优选地，有效形成杂环化合物的条件可以包括基本上不存在添加的催化剂。有效形成杂环化合物的条件还可以包括存在或不存在各种溶剂，包括但不限于水性溶剂(例如水)和非水溶剂；质子和非质子溶剂；极性和非极性溶剂；以及它们的组合。杂环化合物可以在宽的温度范围内形成，其中当牵涉生物分子时，0-40℃(在某些实施方案中为23-37℃)的温度范围是特别有用的。便利地，反应时间可以短于1天，有时为1个小时或甚至更短。
在某些实施方案中，可以在活细胞内或在活细胞的表面上发生一种或多种1，3-偶极-官能化合物与炔烃之间的环化反应。可以在体内或体外发生此类反应。本文所用的术语“体内”指受试者体内的反应。本文所用的术语“体外”指已从受试者体中除去(例如分离)的组织(例如细胞)中的反应。可除去的组织包括例如原代细胞(例如新近从受试者取出且能够在组织培养基中有限生长或维持的细胞)、培养细胞(例如能够在组织培养基中扩展生长或维持的细胞)和它们的组合。
1，3-偶极-官能化合物的示例性实施方案是式R8-N3的叠氮官能化合物(例如由化合价结构R8--N-N＝N+来表示)，其中R8表示有机基团(例如生物分子)。任选地，R8可以包括可检测标记(例如亲合标记)。
式R8-N3的叠氮官能化合物与式I的示例性炔烃的环化反应可以得到一种或多种下式的杂环化合物：
Figure BPA00001186284600111
其中：各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；各R3和R4独立地表示氢或有机基团(例如，其可包括可裂解连接基)；以及R8表示有机基团(例如，其可包括生物分子和任选的可裂解连接基)。
1，3-偶极-官能化合物的另一示例性实施方案是式R8-CNO的氧化腈官能化合物(例如由化合价结构R8-+C＝N-O-来表示)，其中R8表示有机基团(例如生物分子)。任选地，R8可以包括可检测标记(例如亲合标记)。
式R8-CNO的氧化腈官能化合物与式I的示例性炔烃的环化反应可以得到一种或多种下式的杂环化合物：
Figure BPA00001186284600112
其中：各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；各R3和R4独立地表示氢或有机基团(例如，其可包括可裂解连接基)；以及R8表示有机基团(例如，其可包括生物分子和任选的可裂解连接基)。
1，3-偶极-官能化合物的另一示例性实施方案是式(R10)2CN(R10)O的硝酮官能化合物(例如由化合价结构(R10)2C＝+N(R10)-O-来表示)，其中各R10独立地表示氢或有机基团，条件是至少一个R10表示有机基团(例如生物分子)。任选地，至少一个R10可以包括可检测标记(例如亲合标记)。
式(R10)2CN(R10)O的硝酮官能化合物与式I的示例性炔烃的环化反应可以得到一种或多种下式的杂环化合物：
Figure BPA00001186284600121
其中：各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；各R3、R4和R10独立地表示氢或有机基团，条件是至少一个R10表示有机基团(例如，其可包括生物分子和任选的可裂解连接基)。
1，3-偶极-官能化合物的另一个示例性实施方案是式R10-NN(R10)O的氧化偶氮官能化合物(例如由化合价结构R10-N＝+N(R10)-O-来表示)，其中各R10独立地表示氢或有机基团，条件是至少一个R10表示有机基团(例如生物分子)。任选地，至少一个R10可以包括可检测标记(例如亲合标记)。
式R10-NN(R10)O的氧化偶氮官能化合物与式I的示例性炔烃的环化反应可以得到一种或多种下式的杂环化合物：
Figure BPA00001186284600131
其中：各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；各R3、R4和R10独立地表示氢或有机基团，条件是至少一个R10表示有机基团(例如，其可包括生物分子和任选的可裂解连接基)。
对于其中形成自炔烃与一种或多种1，3-偶极-官能化合物之间的环化反应的杂环化合物包括可检测标记的实施方案，可以使用可检测标记来检测杂环化合物。例如，对于其中可检测标记为亲合标记的实施方案，可以使用亲和性结合(例如亲合色谱)来检测杂环化合物。
另外，对于形成自炔烃与一种或多种1，3-偶极-官能化合物之间的环化反应的杂环化合物包括生物素化片段的实施方案，可以通过使杂环化合物与结合生物素的化合物(例如抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白)接触来结合杂环化合物。此外，可以通过本文所述的方法来检测结合的杂环化合物。
本文所公开的炔烃与1，3-偶极-官能化合物之间的环化反应可以用于各种应用。例如，本文所公开的炔烃可以连接于基材的表面。在某些实施方案中，炔烃的X基团表示与基材表面的连接点。本领域技术人员将认识到，可有利地选择X基团，以包括官能团(例如生物素、活化酯、活化碳酸酯等)，从而能够通过各种反应将炔烃连接于官能基材(例如胺官能团、硫醇官能团等)。
具有连接于其表面的炔烃的基材可以与1，3-偶极-官能化合物反应，以形成杂环化合物，有效地将1，3-偶极-官能化合物化学与基材结合。此类基材可以为例如树脂、凝胶、纳米颗粒(例如包括磁性纳米颗粒)或它们的组合的形式。在某些实施方案中，此类基材可以为微阵列或甚至三维基质或脚手架的形式。示例性三维基质包括但不限于以商品名ALGIMATRIX 3D培养系统、GELTRIX基质和GIBCO三维脚手架购得的那些三维基质，全部可从Invitrogen(Carlsbad，CA)购得。此类三维基质可尤其有用于包括细胞培养的应用。
通过使1，3-偶极-官能生物分子与具有连接于其表面的炔烃的基材在有效用于形成杂环化合物的环化反应的条件下接触，可以将1，3-偶极-官能生物分子(例如1，3-偶极-官能肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂质、糖类、寡糖和/或多糖)固定在基材表面上，优选共价键连接于基材表面。优选地，有效形成杂环化合物的条件可以包括基本上不存在添加的催化剂。有效形成杂环化合物的条件还可以包括存在或不存在各种溶剂，包括但不限于水性溶剂(例如水和其他生物学流体)和非水性溶剂；质子和非质子溶剂；极性和非极性溶剂；和它们的组合。杂环化合物可以在宽温度范围内形成，其中温度范围0-40℃(在某些实施方案中为23-37℃)是特别有用的。便利地，反应时间可以短于一天，有时为一个小时或甚至更短。
例如，当基材为三维基质的形式，且1，3-偶极-官能生物分子为1，3-偶极-官能蛋白(例如叠氮官能蛋白)时，该环化反应可以得到具有固定于三维基质上的蛋白的制品。此类基质可以具有各种用途，包括但不限于分离和/或固定细胞系。对于这些应用特别有用的蛋白包括但不限于胶原、纤连蛋白、明胶、层粘连蛋白、玻连蛋白和/或其他常用于细胞铺板(cell plating)的蛋白。
对于另一例子，1，3-偶极-官能化合物与其中X表示聚合基团或共聚基团的式I的炔烃之间的环化反应可用于例如控制如下文所述的药物的传递。例如，其中X表示包括亲水片段和疏水片段的共聚基团的式I的炔烃可以与聚合物或共聚物共混。此外，当其中X表示包括亲水片段和疏水片段的共聚基团的式I的炔烃与具有亲水片段和疏水片段的共聚物共混时，可以形成共聚物胶束。尤其有用的具有亲水片段和疏水片段的共聚物包括式R9O-[CH2CH2O]p-[C(O)(CH2)5O]o-H的那些共聚物，其中R9表示烷基(例如甲基)，p＝0-100(例如1-100)，以及o＝0-100(例如1-100)。
包括如上文所述的式I的炔烃的共聚物胶束可以有利地用于控制药物的传递。例如，包括式I的炔烃的共聚物胶束可以与至少一种1，3-偶极-官能药物结合(combined)，并允许在有效形成杂环化合物的条件下反应，将药物连接于共聚物胶束。参见例如Nishiyama等人，Adv.Polym.Sci.2006，193：67-101；Gaucher等人，J.Control.Release 2005，109：169-188；Choi等人，J.Dispersion Sci.Tech.2003，24：475-487；Lavasanifar等人，Adv.Drug Delivery Rev.2002，54：169-190；以及Rosier等人，Adv.Drug Delivery Rev.2001，53：95-108。
此外，因为其不需要有毒催化剂(如铜)，由本发明提供的新颖环化加成反应可以用于活细胞的标记。例如，可首先用叠氮官能前体代谢性标记细胞，以产生叠氮官能生物分子(也称为生物缀合物)，如叠氮官能糖蛋白(也称为糖缀合物)。然后可以使所述细胞与式I的炔烃在溶液中或在如上所述的基材上，在允许在细胞表面上标记(通过环化加成反应)叠氮官能生物分子的条件下接触。可以在细胞表面上检测到所得三唑缀合物，或者它可以被细胞内吞，并在细胞内被检测到。
式I的炔烃也可以用于成像应用，包括例如作为核磁共振成像(MRI)的试剂。对于另一个例子，式I的炔烃可以含有荧光标记。式I的炔烃还可用于利用质谱的定性或定量蛋白质组学和糖组学应用。可以选择式I的炔烃，以含有一种或多种重质同位素，例如氘、13C、15N、35S等，然后可用于标记和/或固定如本文所述的叠氮官能生物分子。
式I的炔烃还可以用于诸如疫苗之类的应用。例如，式I的炔烃可以与叠氮官能蛋白(例如叠氮官能碳水化合物、叠氮官能肽和/或叠氮官能糖肽)反应，且所得三唑缀合物可以用作疫苗的载体蛋白。
通过以下实施例来说明本发明。应理解，特定的实施例、材料、量和程序根据如本文所阐述的本发明的范围和精神广义地来解释。
实施例
实施例1
显现由不含铜的快速Huisgen环化加成获得的活细胞的代谢性标记的糖缀合物
生物系统中极其罕见的叠氮化物作为生物缀合的有吸引力的化学处理手段(chemical handles)出现(Kolb和Sharpless，Drug Discovery Today 2003，8：1128-1137；Dedola等人，Org.Biomol.Chem.20075：1006-1017；Moses和Moorhouse，Chem.Soc.Rev.2007，36：1249-1262；Nandivada等人，Adv.Mater.2007，19：2197-2208；Wu和Fokin，Aldrichimica Acta 2007，40：7-17)。尤其，用于获得稳定的三唑类的叠氮化物与末端炔烃的CuI-催化的1，3-偶极环化加成(Rostovtsev等人，Angew.Chem.2002，114：2708-2711；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.2002，41：2596-2599；Tornoe等人，J.Org.Chem.2002，67：3057-3064)已经用于各种生物分子的标记(Chin等人，Science 2003，301：964-967；Wang等人，J.Am.Chem.Soc.2003，125：3192-3193；Kho等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 2004，101：12479-12484；Gierlich等人，Org.Lett.2006，8：3639-3642；Link等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 2006，103：10180-10185)、基于活性的蛋白谱(activity-based protein profiling)(Speers等人，J.Am.Chem.Soc.2003，125：4686-4687)以及微阵列和小分子文库的化学合成(Sun等人，Bioconjugate Chem.2006，17：52-57)。
用于将叠氮化物安装到生物分子中的一种有吸引力的方法以代谢性标记为基础，其中通过使用细胞生物合成机制将含有叠氮化物的生物合成前体并入到生物分子中(Prescher和Bertozzi，Nat.Chem.Biol.2005，1：13-21)。该方法已经用于用各种反应性探针标记活体系统的蛋白、聚糖和脂质。这些探针可以促进糖类选择性糖蛋白的定位和鉴定糖基化部位(Hanson等人，J.Am.Chem.Soc.2007，129：7266-7267)。炔烃探针已经用于叠氮化物改性的生物分子的细胞表面成像，一种特别有吸引力的方法包括通过[3+2]环化加成从无荧光前体产生荧光探针(Sivakumar等人，Org.Lett.2004，6：4603-4606)。
CuI催化剂的细胞毒性排除了其中细胞必需保持存活的应用(Link和Tirrel，J.Am.Chem.Soc.2003，125：11164-11165)，因此对于不含Cu1的[3+2]环化加成存在着巨大的需求(Turner等人，J.Am.Chem.Soc.1973，95：790-792；Agard等人，J.Am.Chem.Soc.2004，126：15046-15047；vanBerkel等人，Chem-BioChem 2007，8：1504-1508)。在这方面，可以通过环张力来活化炔烃，例如，将炔烃限制在八元环内产生了18 kcalmol-1的张力，在与叠氮化物的[3+2]环化加成时，在过渡状态(transition state)下释放所述张力的许多(部分)(Turner等人，J.Am.Chem.Soc.1973，95：790-792；Agard等人，J.Am.Chem.Soc.2004，126：15046-15047)。结果，环辛炔(例如1)与叠氮化物在室温下反应，不需要催化剂(图1)。该应力促进的环化加成已经用于标记生物分子，而没有可观察到的细胞毒性(Agard等人，J.Am.Chem.Soc.2004，126：15046-15047)。然而该方法的范围因为反应速率缓慢而受到限制(Agard等人，ACS Chem.Biol.2006，1：644-648)。将吸电子基团附加到辛炔环上可增加张力促进的环化加成的速率；然而，目前的用膦2的Staudinger连接提供了用叠氮化物标记细胞表面的最有吸引力的试剂。
据认为，4-二苯并环辛炔醇(如化合物3)对于用叠氮化物标记活细胞是理想的，因为预期芳族环施加额外的环张力并且与炔烃缀合，由此增加用叠氮化物的无金属[2+3]环化加成中的炔烃的反应性。然而该化合物具有优异的稳定性，因为芳族环的邻位氢原子保护炔烃不受亲核性攻击。此外，3的羟基提供了用于掺混标记(如荧光探针和生物素)的处理手段。
可从已知的(方法)(Jung等人，J.Org.Chem.1978，43：3698-3701；Jung和Miller，J.Am.Chem.Soc.1981，103：1984-1992)容易地制备化合物3：将3-羟基-1，2:5，6-二苯并环辛-1，5，7-三烯(4)，通过保护羟基为TBS醚，获得5，将5溴化，以60％的收率获得二溴化物6(方案1；图2)。在后来的转化过程中失去TBS保护基，但在对醇4进行溴化时具有低收率。通过用LDA在THF中于0℃处理，将6去除溴化氢(Seitz等人，Angew.Chem.1969，81：427-428；Seitz等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1969，8：447-448)，以45％的收率获得目标环辛炔3。
化合物3具有优异的长货架寿命，在处理之后不与亲核体(如硫醇和胺)反应。然而，一经暴露于叠氮化物，就发生快速反应，以高收率获得相应的三唑。例如，通过相应的含叠氮基的糖和氨基酸衍生物与3在甲醇中反应30分钟，以定量收率获得作为区域异构体的三唑10-13(方案2；图3和图4)。使用1H NMR谱法，通过苄基质子信号的积分来监测3与苄基叠氮在甲醇中和在水/乙腈的混合物(1∶4v/v)中的反应进程，并且分别测定了0.17m-1s-1和2.3m-1s-1的二阶速率常数。与3在乙腈/水中的反应速率常数大约比与辛炔1的反应速率常数大三个数量级。
已经确立了3的优异反应性，我们将注意力集中在经生物素改性的4-二苯并环辛炔醇的制备(9；方案1；图2)。此类试剂应使得在用含叠氮基的生物合成前体代谢性标记细胞，随后与9环化加成和用经荧光探针改性的抗生物素蛋白处理之后，有可能显现生物分子。或者，与9的糖缀合物的生物素化使得有可能使用固定在固体载体上的抗生物素蛋白来分离这些衍生物，用于糖组学研究。可以容易地通过两步反应来制备化合物9，该两步反应涉及用氯甲酸4-硝基苯酯处理3，获得活化中间体7，随后与8进行即时反应。还可以用荧光标记将4-二苯并环辛炔醇(9)官能化，以获得荧光衍生物(方案3；图5)。
接着，在25微摩尔N-叠氮基乙酰基甘露糖胺(Ac4ManNAz)的存在下，将Jurkat细胞培养三天，以将N-叠氮基乙酰基唾液酸(SiaNAz)结构部分(moieties)代谢性引入到糖蛋白中(Luchansky和Bertozzi，Chem-BioChem 2004，5：1706-1709)。作为阴性对照，使用在不存在Ac4ManNAz下生长的Jurkat细胞。将细胞暴露于30微摩尔的化合物9溶液，持续各种时段，在洗涤之后，用抗生物素蛋白-异硫氰酸荧光素(FITC)在4℃下将细胞染色15分钟。通过测量细胞溶解产物的荧光强度来确定两步骤细胞表面标记的效率。为了比较，也通过与生物素改性的膦2进行Staudinger连接，随后用抗生物素蛋白-FITC处理来标记细胞表面的叠氮基结构部分。在60分钟的孵育时间之后，用9的标记几乎完全(图6a)。
有趣的是，在相同条件下，膦2(Agard等人，ACS Chem.Biol.2006，1：644-648)获得明显更低的荧光强度，这表明通过Staudinger连接的细胞表面标记更慢且效率更低。在每一种情况下，对照细胞表现出非常低的荧光强度，这证明背景标记是可忽略的。已发现，用9的两步骤标记方法对细胞活力没有影响，如通过形态学和台盼蓝排斥法所确定的(数据没有示出；图7)。
通过用各种浓度的2和9孵育细胞，随后用抗生物素蛋白-FTIC(图6b)染色来研究细胞表面标记的浓度依赖性。正如所预期的，显示叠氮基结构部分的细胞显示了荧光强度的剂量依赖性增加。在3微摩尔的9下实现了可靠的荧光标记；然而，在30到100微摩尔的浓度下获得了最佳的结果。在高于100微摩尔的浓度下，由于9的有限溶解度，没有观察到标记的增加。
接着，将注意力集中于通过共焦显微镜术显现活细胞的含叠氮基的糖缀合物。因此，在Ac4ManNAz(100微摩尔)的存在下，将粘附性中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养3天。将所得的细胞表面叠氮基结构部分用9(30微摩尔)处理1小时，然后用抗生物素蛋白-AlexaFluor 488在4℃下处理15分钟。正如所预期的，仅仅在表面处观察到染色(图8)，并且在环境温度或4℃下进行时，该标记程序同等有效。此外，空白细胞显示出很低的荧光染色，这证实了背景标记是可以忽略的。
通过内吞作用使细胞表面糖缀合物不断地再循环，并且为了监测该过程，使代谢性标记的细胞与9和抗生物素蛋白-AlexaFluor488按照标准规程反应，并在37℃下孵育1小时，然后通过共焦显微镜术来检查。我们观察到，显著量的标记糖蛋白已经内在化进入膜泡区室(vesicular compartments)中。
在这些研究完成时，Bertozzi及其同事报道了二氟化环辛炔(DIFO)，其以与化合物3几乎相同的反应速率与叠氮化物反应(Baskin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007，104：16793-16797)。连接于AlexaFluor的DIFO用于调查聚糖运输的动力学。已发现，在孵育1小时之后，标记的聚糖与用于内涵体和高尔基体的标记共定位。
4-二苯并环辛炔醇(如3和9)对于研究人员来说具有几个有利特征，例如容易化学合成以及通过芳族结构部分的官能化而进一步增强环化加成速率的可能性。芳族环的改性还可以提供令人兴奋的获得在用含叠氮基的化合物进行[3+2]环化加成时变成有荧光性的试剂的机会，这将使得有可能实时监测糖蛋白和其他生物分子在活细胞中的运输。
一般方法和材料
化学品购自Aldrich和Fluka，并且无需进一步纯化而使用。从CaH2蒸馏出(distilled)二氯甲烷，在分子筛
Figure BPA00001186284600191
上储存。从P2O5中蒸馏出吡啶，并在分子筛
Figure BPA00001186284600192
上储存。从钠中蒸馏出THF。所有反应在无水条件下在氩气氛中进行。通过薄层色谱(TLC)在Kieselgel 60 F254(Merck)上监测反应。通过在紫外(UV)光(254nm)下进行检查或者通过用甲醇中的5％硫酸进行炭化来进行检测。在硅胶(Merck，70-230目)上进行快速色谱。Iatrobeads(60微米)购自Bioscan。在Varian Merc 300光谱仪上以及在配备有Sun工作站的Varian 500和600MHz光谱仪上记录1H NMR(ID，2D)和13C NMR。在CDCl3中记录1H和13C NMR波谱，并且以相对于作为受保护的化合物的内标的溶剂峰(1H，δ7.24；13C，δ77.0)的ppm给出化学位移(δ)。使用二氢苯甲酸作为基质，在VOYAGER-DE Applied Biosystems上记录负离子基质辅助激光解吸附电离飞行时间(质谱)(MALDI-TOF)。通过使用THF中的2，5-二羟基-苯甲酸作为基质，以正模式，使用VOYAGER-DE Applied Biosystems获得高分辨率质谱。
3-叔丁基-二甲基甲硅烷基-氧基-1，2:5，6-二苯并环辛-1，5，7-三烯(5)
将叔丁基二甲基氯硅烷(tert-Butyl dimethyl silyl chloride)(3.0g，20mmol)添加到4(2.2g，10mmol)在CH2Cl2(20mL)和吡啶(5mL)的混合物中的搅拌溶液中。在室温下搅拌6小时之后，将反应混合物用水稀释，并用CH2Cl2(40mL)萃取。合并的有机萃取物用水和盐水洗涤，然后干燥(MgSO4)。将溶剂减压蒸发，通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯，7/1，v/v)纯化残留物，获得5(2.9g，87％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.60(1H，芳族化合物)，7.32-7.11(7H，芳族化合物)，6.93(1H，d，J＝7.5Hz，CH＝CH)，6.85(1H，d，J＝7.5Hz，CH＝CH)，5.51(1H，dd，J＝6.3，9.6Hz，CHOSi)，3.54(1H，dd，J＝6.3，9.6Hz，CH2)，3.21(1H，dd，J＝6.3，9.6Hz，CH)，0.96(3H，s，CH3)，0.95(3H，s，CH3)，0.94(3H，s，CH3)，0.10(3H，s，CH3)，0.07(3H，s，CH3)；13CNMR(75MHz，CDCl3)：δ148.0，141.6，140.8，139.2，138.3，135.5，135.0，134.9，133.0，131.9，131.6，130.9，130.8，130.2，77.0，52.1，34.5，30.7，30.5，23.1，5.8，0.1；MALDI HRMS：m/z 359.1811[M+Na+]。C22H28NaOSi的计算值359.1807。
3-羟基-7，8-二溴-1，2:5，6-二苯并环辛烯(6)
在0℃下，将溴(0.8g，5mmol)的CHCl3溶液滴加到5(1.7g，5mmol)的CHCl3(30mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌12小时，直到反应完全(通过TLC监测)。所得混合物用饱和硫代硫酸钠水溶液(15mL)洗涤，并干燥(MgSO4)。将该溶剂减压蒸发，通过硅胶柱色谱(己烷/CH2Cl2，7/1，v/v)纯化残留物，获得6(1.2g，60％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.54-7.47(2H，芳族化合物)，7.31-6.72(6H，芳族化合物)，5.77(1H，d，J＝5.4Hz，CHBr)，5.22(1H，dd，J＝3.6，15.9Hz，CHOH)，5.19(1H，d，J＝5.4Hz，CHBr)，3.50(1H，dd，J＝3.6，15.9Hz，CH2)，2.75(1H，dd，J＝3.6，15.9Hz，CH2)；13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ141.3，140.0，137.2，134.0，133.4，131.5，131.3，130.9，127.8，126.2，123.7，121.3，76.5，70.0，62.3，32.2；MALDI HRMS：m/z 402.9313[M+Na+]。C16H14Br2NaO的计算值402.9309。
3-羟基-7，8-二脱氢-1，2:5，6-二苯并环辛烯(3)
在室温下，在氩气氛下，向6(1.1g，3mmol)的四氢呋喃(50mL)溶液中滴加溶于四氢呋喃中的二异丙基酰胺锂(2.0M)，(5mL)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，此后，将它倾入冰水(50mL)中，并将所得混合物用CH2Cl2(2 x 100mL)萃取。合并的萃取物用水和盐水洗涤，然后干燥(MgSO4)。将溶剂减压蒸发，通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯，5/1，v/v)纯化残留物，获得3(0.30g，45％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.67(1H，芳族化合物)，7.37-7.18(7H，芳族化合物)，4.57(1H，dd，J＝2.1，14.7Hz，CHOH)，3.04(1H，dd，J＝2.1，14.7Hz，CH2)，2.86(1H，dd，J＝2.1，14.7Hz，CH2)；13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ154.5，150.6，128.6，127.1，1127.0，126.0，125.8，125.1，124.7，123.0，122.7，121.7，111.9，109.6，74.2，47.7。
碳酸7，8-二脱氢-1，2:5，6-二苯并环辛烯-3-基酯4-硝基苯基酯(7)
向3(0.22g，1mmol)的CH2Cl2(30mL)溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(0.4g，2mmol)和吡啶(0.4ml，5mmol)。在环境温度下搅拌4小时之后，将反应混合物用盐水(2×10mL)洗涤，并将有机层干燥(MgSO4)。将溶剂减压蒸发，通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10/1，v/v)纯化残留物，获得7(0.34g，89％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.23-8.18(2H，芳族化合物)，7.56-7.54(2H，芳族化合物)，7.46-7.18(8H，芳族化合物)，5.52(1H，dd，J＝3.9，15.3Hz，CHOH)，3.26(1H，dd，J＝3.9，15.3Hz，CH2)，2.97(1H，dd，J＝3.9，15.3Hz，CH2)；13CNMR(75MHz，CDCl3)：δ154.5，150.7，149.1，148.7，129.0，127.4，127.3，126.7，126.5，125.5，125.2，124.3，124.0，122.6，122.4，120.8，120.6，120.2，112.2，108.5，80.6，44.8；MALDI HRMS：m/z 408.0852[M+Na+]。C23H15NNaO5的计算值408.0848。
碳酸7，8-二脱氢-1，2:5，6-二苯并环辛烯-3-基酯，8’-生物素基胺(biotinylamine)-3′，6′-二氧杂辛烷1’-酰胺(9)
在氩气氛下，向8(37mg，0.1mmol)和NEt3(30mg，0.3mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加7(39mg，0.1mmol)。在环境温度下将反应混合物搅拌过夜之后，减压除去溶剂，通过硅胶柱色谱(CH2C12/CH3OH，20/1，v/v)纯化残留物，获得9(44mg，71％)。1H NMR(500MHz，CD3OD)：δ7.59(1H，芳族化合物)，7.42-7.33(7H，芳族化合物)，5.44，(1H，dd，J＝5.0，14.1Hz，CHOH)，4.60，4.46(m，2H，CHNH)，4.24(s，4H，OCH2CH2O)，3.72(m，4H，OCH2)，3.64(m，2H，CH2NH)，3.55(m，1H，CHS)，3.33(dd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝4.8Hz，1H，CHHexoS)，3.23(t，2H，J＝6Hz，CH2-NH2)，3.22，(1H，dd，J＝5.0，14.1Hz，CH2)，2.88，(1H，dd，J＝5.0，14.1Hz，CH2)，2.68(d，1H，J＝12.45Hz，CHHendoS)，2.20(t，2H，J＝7.5Hz，CH2CO)，δ1.4(m，6H，生物素-CH2)。13CNMR(75MHz，CD3OD)：δ175.0，164.9，156.9，152.5，151.3，129.9，128.2，128.1，127.2，127.1，126.0，125.7，123.8，121.2，112.7，109.8，76.8，70.2，70.1，69.8，69.4，62.1，60.4，55.8，54.6，46.0，42.6，40.6，39.9，39.1，35.5，28.6，28.3，25.6，17.5，16.1，12.0；MALDI HRMS：m/z 643.2575[M+Na+]。C33H40N4NaO6S的计算值643.2566。
用于与碳水化合物和肽的点击反应的一般程序
将3-羟基-7，8-二脱氢-1，2:5，6-二苯并环辛烯(2.2mg，0.01mmol)溶于CH3OH(1mL)中，并添加叠氮化物(3-叠氮基丙基2，3，4，6-四-O-乙酸酯-α-D-吡喃甘露糖苷，1-O-[二甲基(1，1，2-三甲基丙基)甲硅烷基]-4，6-O-异丙叉基-2-叠氮基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖，4，7，8-三-O-乙酰基-5-乙酰氨基-9-叠氮基-2，3-无水-3，5，9-三-脱氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯以及4-叠氮基-N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酸，1.0当量)。通过TLC监测反应，在室温下将反应混合物搅拌30分钟之后，反应已进行完全。减压蒸发溶剂，通过硅胶柱色谱纯化残留物，分别以定量收率获得所需产物10-13。
化合物10；1H NMR(500MHz，CDCl3.)：δ7.83(1H，m，芳族化合物)，7.58-6.99(7H，m，芳族化合物)，5.33-4.98(4H，m，2-H，3-H，4-H，CHOH)，4.90-4.61(1H，m，1-H)，4.26，4.10(2H，m，6-H)，3.93(1H，m，5-H)，3.70-3.60(2H，m，OCH2CH2)，3.58-3.41(2H，m，CH2N)，3.31，3.20，3.06，2.91(2H，m，CHOHCH2)，2.35-1.94(12H，m，CH3CO)，1.38-1.14(2H，m，CH2CH2N)；13CNMR(75MHz，CDCl3)：δ170.9，170.2，148.5，146.9，145.5，144.9，141.2，139.3，138.0，136.7，135.5，133.8，133.0，132.3，131.6，130.3，129.5，129.0，128.3，127.7，127.2，126.5，125.0，124.2，98.0，97.4，70.1，69.5，68.8，66.2，65.4，64.9，64.4，62.6，47.0，45.1，40.5，32.1，31.1，30.6，29.9，22.9，20.9，14.3；MALDI HRMS：m/z674.2330[M+Na+]。C33H37N3NaO11的计算值674.2326。
化合物11；1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ7.80，7.65(1H，d，J＝7.5Hz，芳族化合物)，7.48-7.06(7H，芳族化合物)，5.82，5.72，5.60，5.48(1H，d，J＝7.09Hz，1-H)，，5.13-4.60(1H，m，CHOH)，4.40-4.20(2H，m，2-H 3-H)，4.10-3.90(2H，m，5-H，6-H)，3.89-3.63(1H，m，6-H)，3.54-3.40(2H，m，4-H，HCHCHOH)，3.07，2.66(1H，m，HCHCHOH)，1.54-1.20(6H，m，CH(CH3)C(CH3)2)，0.98-0.60(13H，m，2 CH3，CH(CH3)2)，0.35-0.19(6H，m，Si(CH3)2)；13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ151.0，149.2，148.5，148.0，146.1，145.3，142.4，141.6，140.8，139.4，138.1，136.6，135.7，134.9，133.4，132.4，131.6，130.6，129.5，128.9，127.3，103.5，100.4，99.8，80.6，73.3，70.9，69.3，68.8，65.5，50.1，46.6，45.4，44.4，37.3，33.3，32.5，28.4，23.4，22.6，21.9，4.6，1.4，0.7，0.0；MALDI HRMS：m/z 630.2980[M+Na+]。C33H45N3NaO6Si的计算值630.2975。
化合物12；1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ7.95-7.69(1H，m，芳族化合物)，7.60-7.03(7H，m，芳族化合物)，6.77-6.26(1H，m)，5.98-8.81(1H，m)，5.80-5.61(1H，m)，5.58-5.33(1H，m)，5.32-5.16(2H，m)，5.16-4.94(1H，m)，4.93-4.80(1H，m)，4.69-4.34(1H，m)，4.24-4.06(1H，m)，3.95-3.60(3H，m)，3.53-2.90(2H，m)，2.32-1.57(12H，m)；13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ169.6，160.5，147.8，145.5，145.1，144.6，143.9，140.5，138.7，138.2，137.1，135.7，134.5，133.5，132.7，132.2，131.8，131.2，130.8，129.5，129.0，128.3，127.7，127.2，126.5，125.9，124.8，122.7，108.0，107.5，75.1，69.6，68.8，67.1，66.6，52.8，51.7，47.3，46.4，45.3，28.7，28.3，22.0，19.8；MALDI HRMS：m/z 699.2282[M+Na+]。C34H36N4NaO11的计算值699.2278。
化合物13；1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ7.8-6.8(12H，m，芳族化合物)，5.33，5.17(1H，dd，J＝5.1，10.5Hz CHOH)，4.37(1H，m，CHCOOH)，3.8，3.233.77，3.20(2H，m，CH2CHOH)，3.21，2.93(2H，m，CH2CHNH)，1.35(9H，m，C(CH3)3)；13C NMR(75MHz，CD3OD)：δ156.6，145.1，414.3，139.6，139.4，138.0，137.3，136.1，135.3，135.0，133.7，133.4，132.1，131.7，130.6，130.3，130.0，129.5，129.2，128.8，128.3，128.0，127.6，126.9，126.6，126.6，126.2，125.3，125.1，124.8，79.4，76.8，76.2，68.6，58.5，54.9，46.2，40.5，37.1，29.6，29.3，27.5；MALDIHRMS：m/z 549.2118[M+Na+]。C30H30N4NaO5的计算值549.2114。
N-Boc-3，6-二氧杂辛烷-l，8-二胺
在室温下，经2小时时期将二碳酸二叔丁酯(di-Boc)(6g，28mmol，0.5当量)的CH2Cl2(100mL)溶液滴加到三(乙二醇)-1，8-二胺(7.6g，56mmol)和二异丙基乙胺(10mL，57mmol)的混合物中。将反应混合物搅拌6小时，此后，将它真空浓缩。通过快速硅胶柱色谱(CH2C12/CH3OH，10/1，v/v)纯化，获得N-Boc-3，6-二氧杂辛烷-1，8-二胺(4.1g，58％)。1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ3.6(s，4H)，3.54(t，2H)，3.53(t，2H)，3.24(t，2H)，2.8(t，2H)，1.4(s，9H)；MALDIHRMS：m/z 271.1641[M+Na+]。C11H24N2NaO4的计算值271.1634。
N-Boc-N’-生物素基-3，6-二氧杂辛烷-l，8-二胺
将维生素H(生物素)(2.2g，9mmol)、六氟磷O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓(HBTU)(3g，8mmol)和DIPEA(1.8mL，10mmol)在DMF(100mL)中的溶液在室温下搅拌10分钟，然后滴加到N-Boc-3，6-二氧杂辛烷-1，8-二胺(1.5g，6mmol，1)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，此后，真空脱除DMF，获得油状残留物，通过快速硅胶柱色谱(CH2C12/CH3OH，25/1，v/v)纯化该残留物，获得N-Boc-N’-生物素基-3，6-二氧杂辛烷-1，8-二胺(2.0g，90％)。1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ4.5(m，1H)，4.3(m，1H)，3.6(s，4H)，3.54(tt，4H)，3.39(t，2H)，3.26(t，2H)，2.9(dd，1H)，2.7(d，1H)，2.2(t，2H)，1.7-1.5(m，8H)，1.4(s，9H)；MALDI HRMS：m/z 497.2416[M+Na+]。C21H38N4NaO6S的计算值497.2410。
N-生物素基-3，6-二氧杂辛烷-1，8-二胺(8)
将N-Boc-N’-生物素基-3，6-二氧杂辛烷-1，8-二胺(1.9g，4mmol)溶于50％TFA的CH2Cl2(20mL)溶液中，并在室温下搅拌1小时。减压蒸发溶剂，获得油状残留物，通过快速硅胶柱色谱(CH2C12/CH3OH，10/1，v/v)将其纯化，获得7(1.3g，92％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.85(t，1H，J＝5.7Hz，NHCO)，6.42，6.35(s，2H，NH)，4.29，4.11(m，2H，CHNH)，3.5(s，4H，OCH2CH2O)，3.3(m，4H，OCH2)，3.16(m，2H，CH2NH)，3.10(m，1H，CHS)，2.81(dd，1H，J1＝12.0Hz，J2＝4.8Hz，1H，CHHexoS)，2.64(t，2H，J＝6Hz，CH2-NH2)，2.52(d，1H，J＝12.45Hz，CHHendoS)，2.06(t，2H，J＝7.5Hz，CH2CO)，1.6(s，2H，NH2)，δ1.4(m，6H，生物素-CH2)；13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ171.9，160.6，71.7，71.6，69.5，69.1，64.4，59.2，55.0，54.2，40.7，38.4，35.1，28.4，28.1，25.2；MALDI HRMS：m/z 397.1892[M+Na+]。C16H30N4NaO4S的计算值397.1885。
生物学实验用试剂
将合成化合物2和9在DMF中重构，并在80℃下储存。DMF的终浓度从不超过0.56％，以避免毒性效应。
细胞表面叠氮化物的标记和通过荧光强度的检测
将人Jurkat细胞(克隆E6-1；ATCC)在含有L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640培养基(ATCC)中培养，所述培养基被调节至含有碳酸氢钠(1.5g L-1)、葡萄糖(4.5g L-1)、HEPES(10mM)和丙酮酸钠(1.0mM)，并且补充有青霉素(100u mL-1)/链霉素(100微克mL-1；Mediatech)和胎牛血清(FBS，10％；Hyclone)。在潮湿的5％ CO2气氛下于37℃保持细胞。使Jurkat细胞在全乙酰化N-叠氮基乙酰基甘露糖胺(Ac4ManNaz；终浓度25微摩尔)的存在下生长3天，导致将相应的N-叠氮基乙酰基唾液酸(SiaNAz)代谢并入到它们的细胞表面糖蛋白中。将携带叠氮化物的Jurkat细胞和未处理的对照细胞用标记缓冲液(DPBS，补充有FBS(1％))中的生物素化化合物2和9(0-100微摩尔)在室温下孵育0-180分钟。所述细胞用标记缓冲液洗涤三次，然后用与荧光素缀合的抗生物素蛋白(Molecular Probes)在4℃下孵育15分钟。在三次洗涤和细胞溶解之后，使用微板阅读器(BMG Labtech)分析细胞溶解产物的荧光强度(485ex/520em)。数据点按一式三份收集，代表三个独立的实验。在台盼蓝排斥程序中的不同时间点评价细胞活力。
细胞的标记和基于荧光显微镜术的检测
将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(克隆K1；ATCC)在含有L-谷氨酰胺(2mM)的Kaighn′s改良型Ham′s F-12培养基中培养，所述培养基被调节至含有碳酸氢钠(1.5g L-1)，并且补充有青霉素(100u mL-1)/链霉素(100微克mL-1)和FBS(10％)。在潮湿的5％ CO2气氛下于37℃保持细胞。使CHO细胞在Ac4ManNaz(终浓度100微摩尔)的存在下生长3天，导致将SiaNAz代谢并入到它们的细胞表面糖蛋白中。然后将携带叠氮化物的CHO细胞和未处理的对照细胞转移到盖玻片上，在它们的初始培养基中培养36小时。活的CHO细胞用生物素化化合物9(30微摩尔)在标记缓冲液(DPBS，补充有FBS(1％))在4℃下或在室温下处理1小时，随后用与Alexa Fluor 488(Molecular Probes)缀合的抗生物素蛋白在4℃下孵育15分钟。将细胞用标记缓冲液洗涤三次，用甲醛(3.7％的PBS溶液)固定或在固定之前于37℃下孵育1小时。细胞核用远红外荧光TO-PRO-3染料(Molecular Probes)标记。在成像之前，细胞用PermaFluor(Thermo Electron Corporation)固定。在Zeiss Axioplan2荧光显微镜上进行初始分析。使用60X(NA1.42)油浸物镜来获取共焦图像。在z轴向(z dimensions)上收集光段的堆叠(stack)。以对于各目的的计算最佳值为基础的步长为0.25到0.5微米。随后，各堆叠被折叠为(collapsed into)单一图像(z轴投影)。使用ImageJ 1.39f软件(National Institutes of Health，USA)和Adobe Photoshop CS3扩展版10.0(Adobe Systems Incorporated)进行离线分析，从而同等处理所有图像。
实施例2
含有生物素和可裂解连接基的炔烃试剂
生物系统中极其罕见的叠氮化物作为生物缀合的有吸引力的化学处理手段出现(Dedola等人，Org.Biomol.Chem.2007，5，1006；Kolb和Sharpless，Drug Dis.Today 2003，8，1128；Moses和Moorhouse，Chem.Soc.Rev.2007，36，1249；Nandivada等人，Adv.Mater.2007，19，2197；Wu和Fokin，Aldrichimica ACTA 2007，40，7；Agard等人，ACS Chem.Biol.2006，1，644)。尤其，用于获得稳定的三唑的Cu(I)催化的叠氮化物与末端炔烃的1，3-偶极环化加成已经用于标记各种生物分子，包括蛋白、核酸、脂质和糖类(Chin等人，Science 2003，301，964；Gierlich等人，Org.Lett.2006，8，3639；Kho等人，Proc.Natl.Acad.Sci.2004，101，12479；Link等人，Proc.Natl.Acad.Sci.2006，103，10180；Wang等人，J.Am.Chem.Soc.2003，125，3192)。环化加成也已用于基于活性的蛋白谱(Speers等人，J.Am.Chem.Soc.2003，125，4686)、酶活性的监测以及微阵列和小分子文库的化学合成(Sun等人，Bioconjugate Chem.2006，17，52)。
用于将叠氮化物安装到生物分子中的一种有吸引力的方法以代谢性标记为基础，其中使用细胞生物合成机制将含有叠氮化物的生物合成前体并入生物分子中(Prescher和Bertozzi，Nat.Chem.Biol.2005，1，13)。该方法已经用于用各种反应性探针标记生命系统的蛋白、聚糖和脂质。这些探针可以促进糖类选择性糖蛋白的定位和鉴定糖基化部位(Hanson等人，J.Am.Chem.Soc.2007，129，7266)。炔烃探针已经用于叠氮化物改性的生物分子的细胞表面成像，一种特别有吸引力的方法涉及通过[3+2]环化加成，从无荧光前体产生荧光探针(Sivakumar等人，Org.Lett.2004，6，4603)。
我们在这里描述包括炔烃片段、可裂解连接基片段和生物素的试剂。预期此类化合物对于生物学研究是有价值的。因此，该试剂的炔烃片段可与各种含有叠氮化物片段的生物分子反应，以获得稳定的三唑加合物。生物素片段提供了通过使用固定的抗生物素蛋白的亲和色谱来取回标记的化合物的机会。可裂解连接基允许释放标记和捕捉的生物分子，用于分析。例如，可以通过标准蛋白质组学或糖组学分析来表征释放的蛋白或糖蛋白(Too，Expert Rev.Proteomics 2007，4，603；Bantscheff等人，Anal.Bioanal.Chem.2007，389，1017；Lau等人，Proteomics 2007，7，2787)。蛋白和糖蛋白的释放比先前报道的连接于固定抗生物素蛋白的生物分子的分析(Hanson等人，J.Am.Chem.Soc.2007，129，7266)实用得多。化合物21是该新类试剂的一个实例(图9)。它含有用于与叠氮化物、二硫化物(其可以用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)裂解)和生物素反应的4-二苯并环辛醇片段。
在蛋白质组学上，生物系统的生理状态之间的差别的定量是有技术挑战性的任务(Too，Expert Rev.Proteomics 2007，4，603；Bantscheff等人，Anal.Bioanal.Chem.2007，389，1017；Lau等人，Proteomics 2007，7，2787)。另外，对于使用染料和荧光团的差别蛋白凝胶或印迹染色的经典方法，基于质谱的定量方法正得到普及。后者方法中的大多数采用差别稳定同位素标记来产生可通过质谱仪来识别的具体质量标记(mass tag)，且同时提供定量的基础。可以通过(i)代谢标记、(ii)化学手段、(iii)酶促法或(iv)通过用合成肽标准形成尖峰而将这些质量标记引入到蛋白或肽中。
由炔烃、可裂解连接基和生物素组成的试剂可以用于将质量标记引入到蛋白、糖蛋白和其他含有叠氮化物片段的生物分子中。因此，通过使用试剂例如21和22，可以引入不同的质量标记，以定量蛋白、糖蛋白、糖肽、肽和碳水化合物。21和22的化学合成分别在方案4和5(图10和11)中描述。在图12中描述了各种炔结构部分、可裂解连接基和生物素衍生物，在图13中描述了炔烃和反应性二烯烃衍生物。
实施例3
用于标记活细胞和纳米颗粒的快速点击反应
用于制备4-二苯并环辛炔醇和使用该化合物用于制备含胺的点击试剂的替换方法(alterative approach)。
可以通过替换的合成路线(方案6；图14)来制备4-二苯并环辛炔醇45。因此，在-10℃下，在含于CH2Cl2(20ml)的BF3·OEt2的存在下，将已知的二苯并环庚烯酮(41)用三甲基甲硅烷基重氮甲烷处理，以良好的收率获得6H-二苯并[a，e]环辛三烯-5-酮(42)。在乙醇和THF的混合物中用硼氢化钠还原酮42，获得醇43，可通过以下方式将其转化为4-二苯并环辛炔醇45：将双键溴化，随后通过含于THF中的LDA处理将所得化合物44消除。可通过采用戴斯-马丁试剂将化合物45氧化为相应的酮46。
将化合物45和46转化为含胺的衍生物49、50和51。这些化合物的吸引之处在于能容易地用各种探针(如荧光标记和生物素)将其衍生化。此外，该胺提供连接于聚合物载体的容易的化学处理手段。因此，通过与氯甲酸4-硝基-苯酯(0.4g，2mmol)和吡啶反应将醇45转化为对硝基苯酯49。通过使49与过量的三(乙二醇)-1，8-二胺反应来获得目标化合物49。通过以下方式获得化合物50：在二异丙基酰胺锂的存在下，使46与溴乙酸在四氢呋喃中反应，随后在偶联试剂HATU和碱DIPEA的存在下，将所得酸48与三(乙二醇)-1，8-二胺在DMF中缩合。最后，通过在乙酸的存在下，使酮51与N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2-氨基氧基-乙酰胺(84mg，0.251mmol)在甲醇和二氯甲烷的混合物中进行肟形成反应来制备衍生物51。51的一个特征是：肟连接基可通过用酸的水溶液处理而裂解，以将捕捉的化合物从点击试剂中脱离。
实验
6H-二苯并[a，e]环辛三烯-5-酮(42)。在-10℃下，经1小时向二苯并环庚烯酮41(2.888g，14.0mmol)和BF3·OEt2(2.59ml，21.0mmol)在CH2Cl2(30ml)中的搅拌溶液中滴加三甲基甲硅烷基重氮甲烷(10.5ml，21.9mmol)的CH2Cl2(20ml)溶液。将混合物在-10℃下搅拌2小时，然后倾入冰水中。水层用CH2Cl2(3×100ml)萃取，并将有机层合并。合并的有机层用盐水洗涤，并干燥(MgSO4)。减压除去溶剂，通过快速硅胶色谱(2∶1-1∶2 v/v己烷/CH2Cl2)纯化粗产物，获得灰白色固体状的产物(2.220g，72％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.26(1H，q，J＝1.4，6.6Hz)，7.13-7.43(7H，m)，7.05(2H，q，J＝3.8，12.9Hz)，4.06(2H，s)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ196.6，136.9，136.3，135.4，133.8，133.1，132.4，131.4，130.6，129.3，128.8，128.0，127.3，126.9，48.4。MALDI HRMS：m/z[M+Na+]。C6H12NaO的计算值：243.0786(Chaffms，S.；Brettreich，M.；Wudl，F.Synthesis 2002，1191-1194)。
5，6-二氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-醇(43)。在室温下，向42(2.203g，10mmol)在1∶1 EtOH/THF(120ml)中缓慢加入硼氢化钠(0.757g，20mmol)，将反应混合物在室温下搅拌7小时。TLC显示反应完全，通过缓慢加入乙酸(1ml)，将反应混合物猝灭。蒸发溶剂，将残留物溶于CH2Cl2(100ml)和盐水(100ml)中，用CH2Cl2(4×100ml)萃取。将有机相合并，干燥(MgSO4)，蒸发，获得白色固体状的产物(2.223g，100％)，其未经进一步纯化而直接在下一步反应中使用。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.50(1H，m)，7.14-7.30(7H，m)，6.90(2H，q，J＝2.7，12.0Hz)，5.31(1H，q，J＝6.3，10.0Hz)，3.41(2H，m)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ141.7，136.7，136.2，134.5，131.7，131.5，130.1，129.9，129.3，128.7，127.4，127.2，126.9，125.9，74.4，42.7。MALDI HRMS：m/z[M+Na+]。C16H14NaO的计算值：245.0942。
11，12-二溴-5，6，11，12-四氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-醇(44)。在室温下，向43(2.223g，10mmol)在1∶1 CHCl3(50ml)中的搅拌溶液中滴加溴(0.512ml，10mmol)，将反应混合物在室温下搅拌0.5小时。TLC显示反应完全，在室温下，减压除去溶剂。通过快速硅胶色谱(2∶1-1∶2 v/v己烷/CH2Cl2)纯化残留物，获得浅黄色油状的产物(2.220g，58％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.54-7.47(2H，芳族化合物)，7.31-6.72(6H，芳族化合物)，5.77(1H，d，J＝5.4Hz，CHBr)，5.22(1H，dd，J＝3.6，15.9Hz，CHOH)，5.19(1H，d，J＝5.4Hz，CHBr)，3.50(1H，dd，J＝3.6，15.9Hz，CH2)，2.75(1H，dd，J＝3.6，15.9Hz，CH2)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ141.3，140.0，137.2，134.0，133.4，131.5，131.3，130.9，127.8，126.2，123.7，121.3，76.5，70.0，62.3，32.2。MALDI HRMS：m/z 402.9313[M+Na+]。C6H14Br2NaO的计算值：402.9309。
5，6-二氢-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-醇(45)。在室温下，在氩气氛下，向44(1.528g，4mmol)的四氢呋喃(40ml)搅拌溶液中滴加含于四氢呋喃的二异丙基酰胺锂(2.0M)(8ml，16mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，此后，通过滴加水(0.5ml)将该反应混合物猝灭。减压蒸发溶剂，通过快速硅胶色谱(2∶1-0∶1 v/v己烷/CH2Cl2)纯化残留物，获得白色固体状的产物(0.503g，57％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.67(1H，芳族化合物)，7.37-7.18(7H，芳族化合物)，4.57(1H，dd，J＝2.1，14.7Hz，CHOH)，3.04(1H，dd，J＝2.1，14.7Hz，CH2)，2.86(1H，dd，J＝2.1，14.7Hz，CH2)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ154.5，150.6，128.6，127.1，1127.0，126.0，125.8，125.1，124.7，123.0，122.7，121.7，111.9，109.6，74.2，47.7。
6H-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛三烯-5-酮(46)。向45(0.172g，0.781mmol)的CH2Cl2(40ml)搅拌溶液中加入戴斯-马丁试剂(0.397g，0.937mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，TLC显示反应完全。将反应混合物过滤通过短的硅胶垫，用CH2Cl2洗涤。浓缩滤液，通过快速硅胶色谱(1∶1-0∶1v/v己烷/CH2Cl2)纯化残留物，获得白色固体状的产物(0.158g，93％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.29-7.57(8H，m)，4.17(1H，d，J＝10.6Hz)，3.64(1H，J＝10.6Hz)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ200.4，154.7，148.2，131.21(2C)，131.18，129.3，128.2，127.8，126.3，125.9，122.2，111.1，109.4，49.3。MALDI HRMS：m/z[M+Na+]。C16H10NaO的计算值：241.0629。
碳酸5，6-二氢-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-基酯4-硝基-苯酯(47)。向45(0.22g，1mmol)的CH2Cl2(30mL)溶液中加入氯甲酸4-硝基-苯酯(0.4g，2mmol)和吡啶(0.4ml，5mmol)。在环境温度下搅拌4小时之后，用盐水(2x10mL)洗涤反应混合物，将有机层干燥(MgSO4)。减压蒸发溶剂，通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯，10/1，v/v)纯化残留物，获得47(0.34g，89％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.23-8.18(2H，芳族化合物)，7.56-7.54(2H，芳族化合物)，7.46-7.18(8H，芳族化合物)，5.52(1H，dd，J＝3.9，15.3Hz，CHOH)，3.26(1H，dd，J＝3.9，15.3Hz，CH2)，2.97(1H，dd，J＝3.9，15.3Hz，CH2)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ154.5，150.7，149.1，148.7，129.0，127.4，127.3，126.7，126.5，125.5，125.2，124.3，124.0，122.6，122.4，120.8，120.6，120.2，112.2，108.5，80.6，44.8。MALDI HRMS：m/z 408.0852[M+Na+]。C23H15NNaO5的计算值：408.0848。
(5，6-二氢-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-基氧基)-乙酸(48)。在0℃下，向溴乙酸(0.280g，2mmol)的四氢呋喃(40ml)搅拌溶液中缓慢加入氢化钠(60％油分散体，0.120g，3.0mmol)。将混合物在0℃下搅拌10分钟，然后加入45(0.220g，1.0mmol)。将混合物在0℃下搅拌另外10分钟，然后温热至室温并搅拌1天。通过一滴HOAc将反应猝灭。过滤通过短硅胶垫，用EtOAc洗涤，然后减压浓缩。通过快速硅胶色谱(1∶0-1∶1 CH2Cl2/EtOAc)纯化残留物，获得白色固体状的产物(0.60g，22％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.69(1H，d，J＝7.7Hz)，7.49(1H，d，J＝6.7Hz)，7.41(1H，m)，7.27-7.35(5H，m)，4.25(1H，m)，4.15(2H，d，J＝8.0Hz)，3.30(1H，dd，J＝2.2，14.8Hz)，2.72(1H，dd，J＝3.6，14.8Hz)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ154.5，150.6，128.6，127.1，1127.0，126.0，125.8，125.1，124.7，123.0，122.7，121.7，111.9，109.6，74.2，47.7。MALDI HRMS：m/z 301.0838[M+Na+]。C18H14NaO3的计算值：301.0841。
{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸5，6-二脱氢-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-基酯(49)。在室温下，向47(0.077g，0.2mmol)和三(乙二醇)-1，8-二胺(0.293ml，2mmol)在CH2Cl2(20ml)中的搅拌溶液中加入Et3N(0.139ml，1.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，此后，减压脱除溶剂。通过快速Iatrobeads色谱(flash chromatography on Iatrobeads)(8-30％v/v MeOH/CH2Cl2)纯化残留物，获得浅黄色固体状的产物(0.063g，80％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.51(1H，d，J＝7.3Hz)，7.24-7.37(7H，m)，5.81(1H，s，NH)，5.48，(1H，br)，3.50-3.68(8H，m)，3.39(2H，m)，3.16(1H，d，J＝14.8Hz)，2.91(2H，br)，2.88(1H，d，J＝14.8Hz)，2.57(2H，br，NH2)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ155.7，152.2，151.1，130.0，128.1，128.0，127.2，127.1，126.3，126.0，123.9，123.8，121.3，113.0，110.0，76.7，72.8，70.3，70.2，70.1，70.0，46.2，41.5，41.0。MALDI HRMS：m/z 417.1746[M+Na+]。C23H26N2NaO4的计算值：417.1790。
N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2-(5，6-二氢-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-基氧基)-乙酰胺(50)。在室温下，向48(5.6mg，0.02mmol)和三(乙二醇)-1，8-二胺(0.0292ml，0.2mmol)在DMF(3ml)中的搅拌溶液中加入HATU偶联试剂(7.6mg，0.02mmol)和DIPEA(0.0348ml，0.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，此后减压除去溶剂。通过快速Iatrobeads色谱(8-30％ v/v MeOH/CH2Cl2)纯化残留物，获得无色油状的产物。MALDI HRMS：m/z 431.1916[M+Na+]。C24H28N2NaO4的计算值：431.1947。
N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2-(6H-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-亚基氨基氧基)-乙酰胺(51)。将46(46mg，0.211mmol)、N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2-氨基氧基-乙酰胺(84mg，0.251mmol)和乙酸(0.1ml)在1∶1 v/v MeOH/CH2Cl2(4ml)中的溶液在室温下搅拌2天。减压脱除溶剂，通过快速Iatrobeads色谱(4-15％ v/v MeOH/CH2Cl2)纯化残留物，获得浅黄色固体状的产物(56mg，63％)。MALDI HRMS：m/z 444.1835[M+Na+]。C24H27N3NaO4的计算值：444.1899。
4-二苯并环辛炔醇衍生物的环化加成的反应动力学。
制备4-二苯并环辛炔醇(61)的许多类似物(63-68)，通过1H NMR波谱中的苄基质子信号的积分来确定这些改性对与苄基叠氮的环化加成的反应速率的影响。图15示出了化合物61-68的二阶常数。令人惊奇的发现是，不具有羟基官能团的化合物62比类似的4-二苯并环辛炔醇(61)反应慢大约70倍。61的羟基的酰化(例如在化合物63和64中)导致反应速率的缓慢下降。61的烷基化(例如在化合物65中)也导致更慢的反应速率。具有偕-二氟的化合物66以与化合物61类似的速率反应。有趣地，酮67以比1稍高的反应速率发生反应。肟68具有与61类似的反应速率。这些结果证明，61的羟基的改性可对环化加成的速率产生剧烈影响。
实验
70的合成。向LiAlH4(0.38g，10mmol)和AlCl3(1.3g，10mmol)在Et2O(100mL)中的搅拌溶液中加入69(1.1g，5mmol)。将反应物在0℃下保持12小时，然后用水(100ml)将它猝灭。水层用醚(4×100ml)萃取，合并的有机萃取物用水(100ml)和盐水(100ml)洗涤。通过柱色谱(己烷/CH2Cl2，2/1，v/v)纯化粗产物，获得两种70(0.63g，61％；方案7；图16)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：6.90-7.21(m，8H，芳族化合物)，6.67(s，2H，CH＝CH)，3.11(s，4H，-CH2-CH2-)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：140.0，136.9，131.6，130.3，130.1，128.7，128.5，127.1，125.6。HRMS，C16H14Na的计算值(M+Na)：229.0993。实测值：229.1003。
71的合成。在0℃下，将溴(0.4g，2.5mmol)的CHCl3(10mL)溶液滴加到70(0.5g，2.5mmol)的CHCl3(20mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌12小时，直到反应完全为止(通过TLC监测)。所得混合物用饱和硫代硫酸钠水溶液(15mL)洗涤，干燥(MgSO4)。减压蒸发溶剂，通过硅胶柱色谱(己烷/CH2Cl2，10/1，v/v)纯化残留物，获得71(0.53g，58％；方案7；图16)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.06-7.52(m，8H，芳族化合物)，5.79(s，2H，Ph-CH-Br)，3.05(dd，2H，PhHCH)，2.84(m，2H，PhHCH)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：141.8，138.7，131.3，130.6，129.3，126.6，35.7。
62的合成。在室温下，在氩气氛下，向71(0.36g，1mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液中滴加含于四氢呋喃的t-BuOK(2.0M)，(2mL)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，此后，将其倾入冰水(10mL)中，所得混合物用CH2Cl2(2X50mL)萃取。合并的萃取物用水、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，将溶剂减压蒸发。通过硅胶柱色谱(己烷/CH2Cl2，2/1，v/v)纯化残留物，以获得62(50mg，25％；方案7；图16)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.29-7.14(m，8H，芳族化合物)，3.28-3.15(m，2H，-HCH-HCH-)，2.40-2.27(m，2H，-HCH-HCH-)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：153.8，129.6，127.9，126.7，126.3，124.2，111.8，36.7。
63的合成。向72(38mg，0.1mmol)的CH2Cl2(15mL)搅拌溶液中加入73(15mg，0.2mmol)和TEA(10μL)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。减压蒸发溶剂，通过硅胶柱色谱(CH2C12/CH3OH，20/1，v/v)纯化残留物，获得63(25mg，77％；方案8；图17)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：6.94-7.43(m，8H，芳族化合物)，5.42(m，1H，Ph-CH-O)，3.61(m，2H，CH2OH)，3.30(m，2H，CH2NH)，3.08(dd，1H，J＝15.0，1.8Hz，PhHCH)，2.84(dd，1H，J＝15.0，3.9Hz，PhHCH)，1.53-1.68(m，2H，CH2CH2OH)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：150.8，149.1，128.9，128.0，127.0，126.1，126.0，125.9，125.8，125.3，125.1，125.0，122.8，122.6，120.3，111.9，108.9，58.6，45，2，36.8，36.7，31.6。HRMS，C20H19O3Na计算值(M+Na)：344.1263。实测值：344.1896。
64的合成。向61(22mg，0.1mmol)的吡啶(4mL)搅拌溶液中加入Ac2O(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。减压蒸发溶剂，通过硅胶柱色谱(己烷/CH2Cl2，1/1，v/v)纯化残留物，获得64(21mg，81％；方案9；图18)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.43-7.17(m，8H，芳族化合物)，5.49(m，1H，Ph-CH-OAc)，3.06(dd，1H，J＝15.6，2.4Hz，PhHCH)，2.84(dd，1H，J＝15.6，2.4Hz，PhHCH)，2.17(s，3H，CH3)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：169.9，151.3，151.1，130.1，128.3，128.1，127.4，127.3，126.5，126.2，124.0，121.6，113.2，110.0，76.6，46.5，21.4。C18H14O2Na(M+Na)：的HRMS计算值285.0891。实测值：285.1005。
65的合成。向61(22mg，0.1mmol)的DMF(2mL)搅拌溶液中加入NaH(8mg，0.2mmol)，将混合物在室温下搅拌1小时，然后加入苄基溴(BnBr，34mg，0.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将溶剂减压蒸发，通过硅胶柱色谱(己烷/CH2Cl2，2/1，v/v)纯化残留物，获得65(18mg，59％；方案9；图18)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.70(m，1H，芳族化合物)，7.39-7.17(m，13H，芳族化合物)，4.55(dd，2H，J＝11.6，3.0Hz，CH2Ph)，4.26(m，1H，Ph-CH-OBn)，3.23(dd，1H，J＝15.0，2.4Hz，PhHCH)，2.84(dd，1H，J＝15.0，2.4Hz，PhHCH)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：152.6，151.1，137.3，128.4，127.3，127.1，127.0，126.5，126.2，125.8，125.7，125.1，125.0，123.6，123.0，120.5，111.8，109.5，81.5，71.0，46.1。C23H18ONa(M+Na)的HRMS，计算值：333.1255。实测值：333.1905。
74的合成。在室温下，使用注射泵经1小时向LDA(20ml，40mmol，2.0M THF溶液)的THF(200mL)搅拌溶液中加入酮69(4.4g，20mmol)的THF(40mL)溶液。在室温下搅拌另外20分钟之后，加入三乙基氯硅烷(6.7ml，40mmol)。将该溶液在室温下搅拌1小时。将反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩，通过柱色谱(己烷/CH2Cl2，10/1，v/v)直接纯化粗产物，获得透明的油74(5.8g，85％；方案10；图19)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.25-6.95(m，8H，芳族化合物)，6.72(t，2H，J＝7.0Hz，CH＝CH)，6.11(s，1H，J＝7.0Hz，CH＝C)，0.87-0.82(m，9H，CH2-CH3)，0.61-0.48(m，6H，CH2-CH3)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：151.9，138.2，137.3，137.2，136.7，136.5，134.0，132.6，130.1，129.3，129.0，128.6，128.0，127.1，127.0，126.2，112.7，6.9，5.1。C22H26OSiNa(M+Na)的HRMS计算值：357.1651。实测值：357.1993。
75的合成。在0℃下，经由加样漏斗经10分钟，向商品名为SELECTFLUOR，得自Air Products(Allentown，PA)的氟化试剂(1-氯甲基-4-氟-l，4-二氮杂双环(diazoniabicyclo)[2.2.2]辛烷双-(四氟硼酸酯))(6.3g，18mmol)在DMF(20ml)中的搅拌溶液中加入硅烯醇醚(silyl enol ether)74(5.0g，15mmol)的DMF(20ml)溶液。经30分钟，边搅拌边使反应物缓慢温热至室温，然后用水(100mL)将其猝灭。水层用醚(4 X 100ml)萃取，合并的有机萃取物用水(3 X 100mL)和盐水(1 X 200mL)洗涤。通过柱色谱(己烷/CH2Cl2，1/1，v/v)纯化粗产物，获得75(2.4g，66％；方案10；图19)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.80-7.06(m，8H，芳族化合物)，6.85(s，2H，CH＝CH)，4.41-4.36(m，1H，CHF)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：196.4，152.8，144.1，140.4，138.5，135.8，135.5，135.4，131.5，129.6，128.3，127.7，126.9，125.3，124.6，124.1，63.6，56.9；19F(CDCl3，283MHz)δ：-109.1(s，1F)。C16H11FONa(M+Na)的HRMS计算值：261.0692。实测值：261.1237。
76的合成。室温下，使用注射泵，经1小时向LDA(10ml，20mmol，2.0M THF溶液)的THF(100mL)搅拌溶液中加入酮75(2.4g，10mmol)的THF(20mL)溶液。在室温下搅拌另外20分钟之后，加入三乙基氯硅烷(3.3ml，20mmol)。将该溶液在室温下搅拌1小时。将反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩，通过柱色谱(己烷/CH2Cl2，5/1，v/v)直接纯化粗产物，获得透明油76(2.8g，79％；方案10；图19)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.41(m，2H，芳族化合物)，7.22(m，4H，芳族化合物)，7.08(m，2H，芳族化合物)，6.91(s，2H，CH＝CH)，0.94(t，9H，J＝7.8Hz，CH2-CH3)，0.63(m，6H，CH2-CH3)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：145.8，142.6，137.3，137.2，136.3，136.1，134.2，133.3，132.6，132.1，130.1，130.0，129.6，129.3，128.9，128.8，128.7，128.5，128.2，127.5，127.4，6.7，6.3，5.2；19F(CDCl3，283MHz)δ：-111.978(s，1F)。C22H23FOSiNa(M+Na)的HRMS计算值：373.1400。实测值：373.1522。
77的合成。在0℃下，经由加样漏斗，经10分钟向SELECTFLUOR氟化试剂(3.5.g，10mmol)的DMF(15ml)搅拌溶液中加入硅烯醇醚76(2.8g，8mmol)的DMF(10ml)溶液。经30分钟，边搅拌边使反应物缓慢温热至室温，然后用水(100mL)将其猝灭。水层用醚(4 X 100mL)萃取，合并的有机萃取物用水(3 X 100mL)和盐水(1 X 100mL)洗涤。通过柱色谱(CH2Cl2)纯化粗产物，获得77(1.0g，51％；方案10；图19)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：8.05(m，1H，芳族化合物)，7.69(m，1H，芳族化合物)，7.51(m，1H，芳族化合物)，7.39-7.21(m，5H，芳族化合物)，6.92(d，1H，CH＝CH，J＝14.8Hz)，6.73(d，1H，CH＝CH，J＝14.8Hz)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：188.1，134.6，133.6，132.8，132.3，131.1，130.8，130.5，130.1，129.8，129.6，129.3，126.8，15.0，124.8，115.3；19F(CDCl3，283MHz)δ：-110.1(s，2F)。C16H10F2ONa(M+Na)的HRMS计算值：279.0597。实测值：279.1032。
78的合成。经5分钟，向77(1.0g，4mmol)的EtOH(30mL)搅拌溶液中加入NaBH4(0.3g，8mmol)。将反应物在室温下保持2小时，然后用水(100ml)将其猝灭。水层用CH2Cl2(3 X 100mL)萃取，合并的有机萃取物用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤。通过柱色谱(己烷/EtOAc，5/1，v/v)纯化粗产物，获得78(0.78g，78％；方案10；图19)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.02-7.74(m，8H，芳族化合物)，6.94(d，1H，J＝12.3Hz，CH＝CH)，6.85(d，1H，J＝12.3Hz，CH＝CH)，5.60(m，1H，Ph-CH-OH)，2.82(m，1H，OH)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：136.0，135.9，135.0，133.8，131.2，130.6，130.0，128.1，127.9，126.8，124.6，121.5，121.4；19F(CDCl3，282MHz)δ：-69.8(d，1F，J＝259.4Hz)，-111.7(dd，1F，J＝259.4，21.4Hz)。C6H12F2ONa(M+Na)的HRMS计算值：281.0754。实测值：281.1122。
79的合成。在0℃下，向溴(0.16g，1.0mmol)的CHCl3(10mL)搅拌溶液中滴加78(0.25g，1.0mmol)的CHCl3(10mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌12小时，直到反应完全(通过TLC监测)。所得混合物用饱和硫代硫酸钠水溶液(10mL)洗涤，干燥(MgSO4)。减压蒸发溶剂，通过硅胶柱色谱(己烷/EtOAc，8/1，v/v)纯化残留物，获得79(0.19g，46％；方案10；图19)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：6.96-7.82(m，8H，芳族化合物)，5.62(d，1H，J＝10.8Hz，Ph-CH-Br)，5.17(d，1H，J＝10.8Hz，PhHCH)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：132.7，132.4，131.0，130.8，129.2，129.0，128，128.4，128.3，127.8，125.4，123.8，111.5，57.3，56.5，50.5；19F(CDCl3，282MHz)δ：-98.8(d，1F，J＝341.1Hz)，-110.4(d，1F，J＝341.1Hz)。
66的合成。在室温下，在氩气氛下，向79(40mg，0.1mmol)的四氢呋喃(10mL)搅拌溶液中滴加含于四氢呋喃的t-BuOK(2.0M)，(0.5mL)。将反应混合物在室温下搅拌6小时，此后，将其倾入冰水(10mL)中，所得混合物用CH2Cl2(2 X 50mL)萃取。合并的萃取物用水、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，减压蒸发溶剂。通过硅胶柱色谱(己烷/EtOAc，5/1，v/v)纯化残留物，获得66(10mg，49％；方案10；图19)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.19-7.92(m，8H，芳族化合物)，5.39(d，1H，J＝23.4，10.8Hz，-CH-OH)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：131.3，129.5，129.4，128.4，127.9，127.5，126.8，126.6，125.9，125.7，124.8，124.5，120.3，107.3，82.8；19F(CDCl3，282MHz)δ：-91.5(d，1F，J＝253.8Hz)，-103.4(d，1F，J＝253.8Hz)。
(6H-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-亚基氨基氧基)-乙酸(68)。将6H-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛三烯-5-酮67(21.8mg，0.1mmol)和(羧甲基)羟基胺半盐酸盐(21.8mg，0.2mmol)在1∶1∶0.02 v/v/v MeOH/CH2Cl2/HOAc(8ml)中的溶液在室温下搅拌2天。减压脱除溶剂，通过快速硅胶色谱(EtOAc)纯化残留物，获得白色固体状的产物(17.8mg，61％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.54(1H，d，J＝7.4Hz)，7.46(1H，d，J＝7.4Hz)，7.18-7.39(6H，m)，4.53(2H，m)，4.23(1H，d，J＝12.8Hz)，3.16(1H，d，J＝12.8Hz)。13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ175.2 & 173.6，154.1153.2，130.7，129.5，19.3，129.2，129.1，128.1，128.0，127.1，126.9，125.5，125.2，122.7，113.9，111.2，84.7，68.3 & 67.1，35.0 & 33.2。MALDI HRMS：m/z 314.0810[M+Na+]。C8H13NNaO3的计算值：314.0793。
使用与4-二苯并环辛炔醇环化加成对大分子和纳米材料的改性
用于获得稳定三唑的Cu(I)催化的叠氮化物与末端炔烃的1，3-偶极环化加成已经用于标记各种生物分子，包括蛋白、核酸、脂质和糖类。该反应也已用于改性聚合物和纳米级材料。去除高度细胞毒性的Cu(I)的潜在难度使得用于缀合生物或医学应用的化合物或材料的1，3-偶极环化加成的使用变复杂。使用4-二苯并环辛炔醇代替末端炔烃用于与叠氮化物的环化加成应克服该问题。
为了证明4-二苯并环辛炔醇在生物缀合中的用途，制备嵌段共聚物83和84。采用这些材料在水中形成有机胶束，结果显示，这些材料的4-二苯并环辛炔片段可与含叠氮基的分子反应(图20A，B)。
众所周知，由聚酯和聚乙二醇嵌段组成的嵌段共聚物在水中自组装，形成有机胶束。这些纳米材料作为药物传递装置引人注意。用例如组织或肿瘤靶向结构部分将有机胶束衍生化可以获得智能药物传递装置。另外，用荧光标记或MRI试剂(如生物素)将有机胶束改性，对于成像目的来说是有价值的(图20C)。
聚乙二醇甲基醚(81)或叠氮化物(82)(MW约2000Da)与己内酯在催化量的SnOct的存在下的共聚合分别获得共聚物83和84(方案11，图21)。用三苯基膦还原84的叠氮基片段，使所得聚合物85的胺与86和87反应，分别获得二苯并环辛基衍生物88和89。将溶于少量THF中的83和88或89的混合物(9/1，w/w)加到水中。Cryo-TEM显示，形成了直径大约为的有机胶束。所得胶束用含叠氮基的糖类90孵育，在24小时的反应时间之后，通过渗析除去未反应的糖类。通过用TFA水解，随后通过高pH阴离子交换色谱进行定量来对胶束分析糖含量。确定大约45％的环辛炔被糖类改性。
预期化合物84也可用于形成胶束，与化合物环化加成的所得叠氮化物的叠氮基结构部分用二苯并环辛基片段改性。
实验
PEG44-b-PCL26 83的合成。如所报道那样，合成PEG45-O-PCL23嵌段共聚物。在氩气氛下，将预定体积(12.0mL)的ε-己内酯单体置于容纳一定量(9.0g)的PEG 81的烧瓶中。然后，加入一滴SnOct。在冷却到液氮温度之后，将烧瓶抽空12小时，密封，并在130℃下保持24小时。将合成的聚合物溶于THF中，通过用冷的己烷沉淀来回收，并在室温下真空干燥。相对于PEG81的聚合度，通过1H NMR来计算PCL的聚合度。
叠氮化物-PEG44-b-PCL26 84的合成。采用具有一些修改的先前报道的用于制备PEG-b-PCL的方法，在氩气流下，于130℃，通过单罐阳离子开环聚合来合成叠氮化物-PEG-b-PCL。简言之，在氮气氛下，将预定体积(3.3mL)的ε-己内酯单体置于容纳预称重量(2.5g)的叠氮化物-PEG-OH 82的烧瓶内。然后，加入一滴SnOct。在冷却到液氮温度之后，将烧瓶抽空，密封，并在130℃下保持24小时。然后将合成的聚合物溶于THF中，通过沉淀到冷的己烷中来回收，并在室温下真空干燥。通过1H NMR来测定叠氮化物-PEO44-b-PCL26 84嵌段共聚物的数均分子量(Mn)。
胺-PEG44-b-PCL26 85的合成。将Pd/C(10wt.％/活性炭，50mg)加入到叠氮化物-PEG44-b-PCL2684(200mg)在EtOH和HOAc(50μL)中的溶液中，此后，使H2鼓泡通过溶液1小时，随后在H2气氛下搅拌16小时。将混合物过滤，真空浓缩。然后将残留物溶于THF中，通过沉淀到冷的己烷中来回收，在室温下真空干燥，获得胺-PEG44-b-PCL26 85。
DIDO-PEO-PCL共聚物(88)。在室温下，向碳酸5，6-二氢-l1，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-基酯4-硝基-苯酯86(11.6mg，0.03mmol)和共聚物85(98mg，0.02mmol)在CH2Cl2(10ml)中的搅拌溶液中加入Et3N(0.014ml，0.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，此后，减压脱除溶剂。通过尺寸排阻色谱(SEC)在LH-20柱上(1∶1 v/v MeOH/CH2Cl2)纯化残留物，获得浅黄色固体状的产物(101mg，97％)。
DIDO-PEO-PCL共聚物(89)。在室温下，向(5，6-二氢-11，12-二脱氢-二苯并[a，e]环辛烯-5-基氧基)-乙酸88(8.3mg，0.03mmol)和共聚物85(98mg，0.02mmol)在DMF(15ml)中的搅拌溶液中加入HATU偶联试剂(11.4mg，0.03mmol)和DIPEA(0.0104ml，0.06mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时，此后减压脱除溶剂。通过SEC色谱在LH-20柱上(1∶1 v/v MeOH/CH2Cl2)纯化残留物，获得浅黄色固体状的产物(100mg，96％)。
二苯并环辛醇与各种1，3-偶极的环化加成
已经发现，4-二苯并环辛炔醇可在不存在催化剂或促进剂的情况下在环境温度下与1，3-偶极(如硝酮和酰基重氮衍生物)反应，这可提供生物缀合反应的独特机会。
通过Dicken等人，J.Org.Chem.1982，47，2047-2051；和Inouye等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.1983，56，3541-3542中所公开的程序的修改程序来制备硝酮。将甲苯(20ml)中的N-烷基羟基胺盐酸盐(10.0mmol)、乙醛酸(0.92g，10.0mmol)和碳酸氢钠(1.68g，20.0mmol)在室温下搅拌过夜。将固体过滤，并将滤液浓缩，获得硝酮。然后将该硝酮未经任何纯化而直接使用。
因此，将硝酮91-95与4-二苯并环辛炔醇混合，在3分钟到3.5小时的反应时间之后，以几乎定量的收率分离相应的2，3-二氢-异噁唑环化加成产物。从图18中可以看出，硝酮的化学性质对反应速率具有剧烈影响。尤其，缺电子硝酮93和94以比相应的叠氮化物快得多的速率进行反应。
实验
通过NMR计算二阶速率常数的一般方法。
将基材单独溶解于适当溶剂中，在6mM浓度下按1∶1混合。通过起始原料的消失和如由在多个化学位移下的积分所测定的两种区域异构产物的出现来监测转化百分率。通过绘制1/[基材]与时间的关系曲线和线性回归分析来测定反应的二阶速率常数。二阶速率常数相当于所确定的斜率的一半。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和可获得的电子材料(例如GenBank氨基酸和核苷酸序列提交(submissions)；以及蛋白数据库(pdb)提交)的全部公开内容通过引用并入本文。前述详细说明和实施例仅仅为了清楚理解而给出。不应从其中理解不必要的限制。本发明不限于所示出和描述的确切细节，因为本领域技术人员所显而易见的变化将包括在由权利要求书定义的本发明的范围内。

Claims (69)

1.下式的炔烃：
Figure FPA00001186284500011
其中：各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；以及
各R3和R4独立地表示氢或有机基团。
2.权利要求1所述的炔烃，其中各R1表示氢。
3.权利要求1或2的炔烃，其中各R2表示氢。
4.前述权利要求中任一项所述的炔烃，其中R3包含共价结合的有机染料。
5.权利要求4所述的炔烃，其中所述有机染料是荧光染料。
6.前述权利要求中任一项所述的炔烃，其中X表示C＝N-OR3，且R3表示具有式-(CH2)aC(O)Y的有机基团，其中：
a是1-3；
Y表示OH或NHR5；以及
R5表示氢或含伯胺的有机基团的生物素化产物。
7.权利要求6所述的炔烃，其中所述生物素化产物是式-(CH2CH2O)b(CH2)c-Ld-(CH2CH2O)e(CH2)fNH2和/或-(CD2CD2O)b(CD2)c-Ld-(CD2CD2O)e(CD2)fNH2的含伯胺的基团的生物素化产物，其中b＝0-100；c＝0-100；d＝0-100；e＝0-100；f＝0-100；以及L是任选的可裂解连接基。
8.权利要求7所述的炔烃，其中如果存在，所述可裂解连接基是二硫基。
9.权利要求1-5中任一项所述的炔烃，其中X表示CHOR3，其中R3选自烷基、芳基、烷芳基和芳烷基。
10.权利要求9所述的炔烃，其中R3表示-C(O)Z，其中：
Z表示烷基、OR6或NHR7；
R6和R7各自独立地选自烷基、芳基、烷芳基和芳烷基。
11.权利要求10所述的炔烃，其中R7是含伯胺的有机基团的生物素化产物。
12.权利要求11所述的炔烃，其中所述生物素化产物是式-(CH2CH2O)b(CH2)c-Ld-(CH2CH2O)e(CH2)fNH2和/或-(CD2CD2O)b(CD2)c-Ld-(CD2CD2O)e(CD2)fNH2的含伯胺的基团的生物素化产物，其中b＝0-100；c＝0-100；d＝0-100；e＝0-100；f＝0-100；以及L是任选的可裂解连接基。
13.权利要求12所述的炔烃，其中如果存在，所述可裂解连接基为二硫基。
14.权利要求1-5中任一项所述的炔烃，其中R3表示聚合基团或共聚基团。
15.权利要求14所述的炔烃，其中所述共聚基团包含亲水片段和疏水片段。
16.权利要求14或15所述的炔烃，其中所述共聚基团包含式-[CH2CH2O]n-[C(O)(CH2)5O]m-H的片段，其中n＝0-100和m＝0-100。
17.下式的炔烃：
18.下式的炔烃：
Figure FPA00001186284500022
19.下式的炔烃：
Figure FPA00001186284500031
20.下式的炔烃：
Figure FPA00001186284500032
其中R3表示氢或有机基团。
21.组合物，其包含权利要求14-16中任一项所述的炔烃与聚合物或共聚物的共混物。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述共聚物包含亲水片段和疏水片段。
23.权利要求21或22所述的组合物，其中所述共聚物具有式R9O-[CH2CH2O]p-[C(O)(CH2)5O]o-H，其中R9表示烷基，p＝0-100，以及o＝0-100。
24.权利要求23所述的组合物，其中R9表示甲基。
25.权利要求21-24中任一项所述的组合物，其中所述组合物形成共聚物胶束。
26.用于控制药物传递的方法，所述方法包括：
将至少一种1，3-偶极-官能药物与权利要求25所述的包含炔烃的共聚物胶束结合；以及
允许所述至少一种1，3-偶极-官能药物与所述包含炔烃的共聚物胶束在有效形成杂环化合物的条件下反应。
27.下式的化合物：
Figure FPA00001186284500033
式II                         式III
其中：
各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；
各R3和R4独立地表示氢或有机基团；以及
R8表示有机基团。
28.下式的化合物：
Figure FPA00001186284500041
其中：
各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；
各R3和R4独立地表示氢或有机基团；以及
R8表示有机基团。
29.权利要求27或28所述的化合物，其中R8表示生物分子。
30.权利要求29所述的化合物，其中所述生物分子选自肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂质、糖类、寡糖、多糖和它们的组合。
31.下式的化合物：
Figure FPA00001186284500051
其中：
各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；以及
各R3、R4和R10独立地表示氢或有机基团，条件是至少一个R10表示有机基团。
32.下式的化合物：
Figure FPA00001186284500052
其中：各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；以及
各R3、R4和R10独立地表示氢或有机基团，条件是至少一个R10表示有机基团。
33.权利要求31或32所述的化合物，其中表示有机基团的至少一个R10表示生物分子。
34.权利要求33所述的化合物，其中所述生物分子选自肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂质、糖类、寡糖、多糖和它们的组合。
35.制备杂环化合物的方法，所述方法包括：
将至少一种1，3-偶极-官能化合物与至少一种权利要求1-20中任一项所述的炔烃结合；以及
允许所述至少一种1，3-偶极-官能化合物与所述至少一种炔烃在有效形成杂环化合物的条件下反应。
36.权利要求35所述的方法，其中所述1，3-偶极-官能化合物选自叠氮官能化合物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物、氧化偶氮官能化合物、酰基重氮官能化合物和它们的组合。
37.权利要求35或36所述的方法，其中有效形成杂环化合物的条件包括基本上不存在添加的催化剂。
38.权利要求35-37中任一项所述的方法，其中在活细胞内或活细胞表面上发生所述反应。
39.权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述至少一种1，3-偶极-官能化合物包括1，3-偶极-官能化生物分子。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述至少一种1，3-偶极-官能化合物包含可检测的标记。
41.权利要求40所述的方法，其进一步包括检测所述杂环化合物。
42.权利要求40或41所述的方法，其中所述可检测的标记是亲合标记。
43.权利要求42所述的方法，其进一步包括使用亲合结合来分离所述杂环化合物。
44.炔烃，其包含：
包含至少两个末端的可裂解连接基片段；
连接于所述可裂解连接基片段的第一末端的炔烃片段；以及
连接于可裂解的连接基片段的第二末端的生物素化片段。
45.权利要求44所述的炔烃，其中所述炔烃片段包括有张力的环状炔烃片段。
46.权利要求44或45所述的炔烃，其进一步包括至少一种重质同位素。
47.权利要求44-46中任一项所述的炔烃，其进一步包含至少一种可检测标记。
48.权利要求47所述的炔烃，其中所述可检测的标记包括荧光标记。
49.杂环化合物，其通过权利要求44-48中任一项所述的至少一种炔烃与至少一种1，3-偶极-官能化合物的反应而形成。
50.权利要求49所述的杂环化合物，其中所述1，3-偶极-官能化合物选自叠氮官能化合物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物、氧化偶氮官能化合物、酰基重氮官能化合物和它们的组合。
51.制备杂环化合物的方法，所述方法包括：
将至少一种1，3-偶极-官能化合物与至少一种权利要求44-48中任一项所述的炔烃结合；以及
允许所述至少一种1，3-偶极-官能化合物与所述至少一种炔烃在有效形成所述杂环化合物的条件下反应。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述1，3-偶极-官能化合物选自叠氮官能化合物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物、氧化偶氮官能化合物、酰基重氮官能化合物和它们的组合。
53.权利要求51或52所述的方法，其中有效形成杂环化合物的条件包括基本上不存在添加的催化剂。
54.权利要求51-53中任一项所述的方法，其中在活细胞内或活细胞的表面上发生所述反应。
55.权利要求51-54中任一项所述的方法，其中所述至少一种1，3-偶极-官能化合物包括1，3-偶极-官能化生物分子。
56.权利要求51-55中任一项所述的方法，其进一步包括使所得杂环化合物与结合生物素的化合物接触。
57.权利要求56所述的方法，其中所述结合生物素的化合物包括抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白。
58.权利要求51-57中任一项所述的方法，其进一步包括检测所述杂环化合物。
59.制备炔烃的方法，所述方法包括：
将下式的烯烃溴化：
获得下式的二溴化物：
Figure FPA00001186284500082
将式XV的二溴化物脱去溴化氢，获得下式的炔烃：
Figure FPA00001186284500083
其中：
各R1独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
各R2独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸根、亚硝酸根、硫酸根和C1-C10有机基团；
X表示C＝O、C＝N-OR3、C＝N-NR3R4、CHOR3或CHNHR3；以及
R3和R4独立地表示氢或有机基团。
60.基材，在其表面上具有权利要求1-20中任一项所述的炔烃。
61.权利要求60所述的基材，其中所述基材为树脂、凝胶、纳米颗粒或它们的组合的形式。
62.权利要求60或61所述的基材，其中所述基材为三维基质。
63.权利要求60-62中任一项所述的基材，其中所述炔烃的X基团表示与基材表面的连接点。
64.将生物分子固定在基材上的方法，所述方法包括：
提供权利要求60-63中任一项所述的基材；
使所述基材与1，3-偶极-官能生物分子在有效形成杂环化合物的条件下接触。
65.权利要求64所述的方法，其中所述1，3-偶极官能生物分子选自叠氮官能生物分子、氧化腈官能生物分子、硝酮官能生物分子、氧化偶氮官能生物分子、酰基重氮官能生物分子和它们的组合。
66.权利要求64或65所述的方法，其中所述生物分子选自肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂质、糖类、寡糖、多糖和它们的组合。
67.制品，其包含通过权利要求64-66中任一项所述的方法制备的固定生物分子。
68.制品，其包含固定于三维基质上的蛋白。
69.用于固定细胞的方法，所述方法包括：
提供权利要求60-63中任一项所述的基材；
使所述基材与包含1，3-偶极-官能生物分子的细胞在有效形成杂环化合物的条件下接触。
CN200880125596.0A 2007-11-21 2008-11-21 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法 Active CN101925366B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410717307.3A CN104529711B (zh) 2007-11-21 2008-11-21 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US402107P 2007-11-21 2007-11-21
US61/004021 2007-11-21
US767407P 2007-12-14 2007-12-14
US61/007674 2007-12-14
US13706108P 2008-07-25 2008-07-25
US61/137061 2008-07-25
PCT/US2008/084345 WO2009067663A1 (en) 2007-11-21 2008-11-21 Alkynes and methods of reacting alkynes with 1,3-dipole-functional compounds

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410717307.3A Division CN104529711B (zh) 2007-11-21 2008-11-21 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101925366A true CN101925366A (zh) 2010-12-22
CN101925366B CN101925366B (zh) 2015-02-04

Family

ID=40510055

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410717307.3A Active CN104529711B (zh) 2007-11-21 2008-11-21 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法
CN200880125596.0A Active CN101925366B (zh) 2007-11-21 2008-11-21 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410717307.3A Active CN104529711B (zh) 2007-11-21 2008-11-21 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法

Country Status (6)

Country Link
US (5) US8133515B2 (zh)
EP (2) EP2907525B1 (zh)
JP (4) JP5498952B2 (zh)
CN (2) CN104529711B (zh)
DK (2) DK2907525T3 (zh)
WO (1) WO2009067663A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103534233A (zh) * 2011-03-25 2014-01-22 生命科技公司 用于标记靶分子的杂双官能酯
CN103983764A (zh) * 2014-04-17 2014-08-13 深圳先进技术研究院 对细胞进行原位标记的方法和应用
CN105377282A (zh) * 2013-01-15 2016-03-02 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 环炔衍生化的糖
US10905678B2 (en) 2014-04-08 2021-02-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
CN113557228A (zh) * 2019-03-08 2021-10-26 阿比蒂斯有限公司 位点特异性的抗体偶联和作为其具体实例的抗体-药物偶联物
US11312942B2 (en) 2016-06-08 2022-04-26 Sony Corporation Material-fixing substrate and method for producing same, and material-fixing agent used for material-fixing substrate

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5498952B2 (ja) * 2007-11-21 2014-05-21 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
US9005577B2 (en) 2008-04-30 2015-04-14 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Substrate based PET imaging agents
CA2737661C (en) 2008-09-23 2019-08-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
US8426649B2 (en) 2009-02-19 2013-04-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cyclopropenones and the photochemical generation of cyclic alkynes therefrom
US8258347B2 (en) 2009-02-19 2012-09-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cyclopropenones and the photochemical generation of cyclic alkynes therefrom
FR2951449B1 (fr) * 2009-10-15 2011-11-25 Commissariat Energie Atomique Procede de fonctionnalisation de molecules biologiques
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
US8901312B2 (en) 2010-03-26 2014-12-02 Jnc Corporation Cyclic compound, method for producing cyclic compound, and method for modifying biological molecule
JP5920936B2 (ja) 2010-04-27 2016-05-18 シンアフィックス ビー．ブイ． 縮合シクロオクチン化合物及び無金属クリック反応におけるそれらの使用
WO2012016048A1 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Life Technologies Corporation Anti- viral azide-containing compounds
US20120028335A1 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Life Technologies Corporation Anti-viral azide-containing compounds
US8912322B2 (en) 2010-07-29 2014-12-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Aza-dibenzocyclooctynes and methods of making and using same
WO2012016188A2 (en) * 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
CN103347862B (zh) * 2010-09-27 2018-07-20 乔治亚大学研究基金公司 包含潜在的1,3-偶极-官能化合物的方法和由此制备的材料
US20120208722A1 (en) * 2010-10-19 2012-08-16 Richard Dluhy Surface enhanced raman spectroscopy platforms and methods
WO2012054749A1 (en) 2010-10-20 2012-04-26 Li-Cor, Inc. Cyanine dyes and their conjugates
CN103502218B (zh) 2011-03-04 2016-08-17 生命科技公司 用于缀合生物分子的化合物和方法
WO2012142003A2 (en) 2011-04-15 2012-10-18 Life Technologies Corporation Chemical ligation
EP2532639A1 (en) * 2011-06-09 2012-12-12 ModiQuest B.V. Method for preparing a reactive coating
US9717803B2 (en) 2011-12-23 2017-08-01 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
WO2014004278A1 (en) * 2012-06-26 2014-01-03 The Curators Of The University Of Missouri Photocleavable drug conjugates
WO2014009426A2 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Innate Pharma Screening of conjugated antibodies
EP2879665B1 (en) * 2012-07-31 2017-03-29 The University of Akron Polymeric structures containing strained cycloalkyne functionality for post-fabrication azidealkyne cycloaddition functionalization
WO2014031762A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Academia Sinica Benzocyclooctyne compounds and uses thereof
ES2659270T3 (es) 2012-10-23 2018-03-14 Synaffix B.V. Anticuerpo modificado, conjugado de anticuerpo y proceso de preparación de los mismos
WO2014066733A2 (en) 2012-10-25 2014-05-01 Life Technologies Corporation Methods and compositions for enzyme-mediated site-specific radiolabeling of glycoproteins
WO2014072482A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Innate Pharma Recognition tags for tgase-mediated conjugation
EP2971280B1 (en) 2013-03-15 2018-08-29 Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University Biosensor microarray compositions and methods
US10611824B2 (en) 2013-03-15 2020-04-07 Innate Pharma Solid phase TGase-mediated conjugation of antibodies
JP6245707B2 (ja) * 2013-03-28 2017-12-13 静岡県公立大学法人 ［１８ｆ］ｆまたは蛍光色素で標識されたｐｅｇ化生物活性物質の製造方法、ならびにその体内動態解析
PL2991683T3 (pl) 2013-05-02 2020-03-31 Glykos Finland Oy Koniugaty glikoproteiny lub glikanu z toksycznym ładunkiem
US20160107999A1 (en) 2013-05-24 2016-04-21 Synaffix B.V. Substituted azadibenzocyclooctyne compounds and their use in metal-free click reactions
US10071169B2 (en) 2013-06-20 2018-09-11 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
KR20160042871A (ko) 2013-06-21 2016-04-20 이나뜨 파르마, 에스.아. 폴리펩티드의 효소적 콘쥬게이션
EP2818867A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies conjugated to at least one nucleic acid molecule and their use in multiplex immuno-detection assays
JP6327547B2 (ja) * 2013-08-02 2018-05-23 国立研究開発法人理化学研究所 新規化合物及びその利用
CN105829543B (zh) 2013-10-14 2021-06-01 西纳福克斯股份有限公司 糖基改造的抗体、抗体-缀合物及其制备方法
WO2015057065A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 Synaffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
WO2015057064A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 Synaffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
US20170190726A9 (en) 2013-12-12 2017-07-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prodrug for release of cisplatin and cyclooxygenase inhibitor
US11168085B2 (en) 2014-01-24 2021-11-09 Synaffix B.V. Process for the cycloaddition of a hetero(aryl) 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
US9803201B2 (en) 2015-03-17 2017-10-31 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Disulfide-containing alkyne linking agents
CN115487351A (zh) 2016-02-06 2022-12-20 哈佛学院校长同事会 重塑造血巢以重建免疫
EP3413916A1 (en) 2016-02-08 2018-12-19 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
WO2017137457A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
JP7020403B2 (ja) 2016-05-02 2022-02-16 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
EP3472210A1 (en) 2016-06-17 2019-04-24 Life Technologies Corporation Site-specific crosslinking of antibodies
EP3484448A4 (en) 2016-07-13 2020-04-01 President and Fellows of Harvard College MIMETIC SCAFFOLDS OF CELLS HAVING ANTIGEN AND METHODS OF PREPARING AND USING THEM
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
EP3707167A4 (en) 2017-11-09 2021-08-04 National Research Council of Canada ANTIBODY GLYCOCONJUGATES AND METHOD OF MANUFACTURING AND USE
WO2019092148A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Innate Pharma Antibodies with functionalized glutamine residues
WO2019151128A1 (ja) * 2018-02-05 2019-08-08 国立大学法人 宮崎大学 細胞標識剤及び細胞標識キット
CN111801340A (zh) 2018-03-02 2020-10-20 生命技术公司 新型淬灭剂和报告基因染料组合
WO2019240219A1 (ja) 2018-06-14 2019-12-19 持田製薬株式会社 新規な架橋アルギン酸
CN112672764A (zh) 2018-06-19 2021-04-16 格莱科斯生物医药公司 结合物
CN112672765A (zh) 2018-06-29 2021-04-16 格莱科斯生物医药公司 结合物
CN114302749A (zh) * 2019-06-28 2022-04-08 持田制药株式会社 使用了化学交联海藻酸的移植用器件
GB201913598D0 (en) * 2019-09-20 2019-11-06 Univ Birmingham Labelling of biomolecules
WO2021116037A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Dicationic fluorescent dyes
WO2021123506A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Glykos Biomedical Oy Stabile conjugate
WO2021155297A1 (en) * 2020-01-29 2021-08-05 President And Fellows Of Harvard College Methods for labeling and targeting cells
WO2021151984A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Innate Pharma Treatment of cancer
CN111620848A (zh) * 2020-04-29 2020-09-04 华东师范大学 含吡喃和中环骨架的三环稠合芳香体系化合物及其合成和应用
KR20230112656A (ko) 2020-11-25 2023-07-27 이나뜨 파르마 에스.에이. 암의 치료
WO2022250679A1 (en) * 2021-05-27 2022-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Cyclooctynes for click chemistry
US11377424B1 (en) * 2021-05-27 2022-07-05 Massachusetts Institute Of Technology Cyclooctynes for click chemistry
CN116102403A (zh) * 2021-11-11 2023-05-12 中国科学院福建物质结构研究所 一种联烯醇类化合物的制备方法
WO2023227660A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Innate Pharma Nectin-4 binding agents
CN114853556B (zh) * 2022-06-14 2023-08-29 绍兴文理学院 一种5H-二苯并[a,d]环庚烯骨架的新合成方法
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3711489A (en) * 1971-03-31 1973-01-16 Pfizer Certain 8,9-dihydro(3,4,7,8)cycloocta(1,2-d)imidazoles
SE403775B (sv) * 1973-11-21 1978-09-04 Du Pont Nya etenoantracenderivat (bensenobens(e)isoindolderivat) avsedda till anvendning som inhibitorer vid friradikal-polymerisation av vinylforeningar
US5723289A (en) 1990-06-11 1998-03-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel selex
ES2073649T3 (es) 1990-11-17 1995-08-16 Nihon Nohyaku Co Ltd Derivados de hidrazona, procedimientos para su produccion, y usos de los mismos.
US5767259A (en) 1994-12-27 1998-06-16 Naxcor Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains
SE9500342D0 (sv) * 1995-01-31 1995-01-31 Marek Kwiatkowski Novel chain terminators, the use thereof for nucleic acid sequencing and synthesis and a method of their preparation
US5843650A (en) 1995-05-01 1998-12-01 Segev; David Nucleic acid detection and amplification by chemical linkage of oligonucleotides
US5874532A (en) * 1997-01-08 1999-02-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for solution phase synthesis of oligonucleotides and peptides
EP0968223B1 (en) * 1997-01-08 2016-12-21 Sigma-Aldrich Co. LLC Bioconjugation of macromolecules
US7427678B2 (en) * 1998-01-08 2008-09-23 Sigma-Aldrich Co. Method for immobilizing oligonucleotides employing the cycloaddition bioconjugation method
WO2002029003A2 (en) 2000-10-06 2002-04-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding dna and rna
KR101138643B1 (ko) 2002-05-30 2012-04-26 더 스크립스 리서치 인스티튜트 구리 촉매 작용하에서의 아지드와 아세틸렌과의 리게이션
US7597876B2 (en) * 2007-01-11 2009-10-06 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
SI3002289T1 (en) 2002-08-23 2018-07-31 Illumina Cambridge Limited MODIFIED NUCLEOTES FOR POLYUCULOTIDE SEQUENCING
WO2004055160A2 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry
WO2006038185A2 (en) 2004-10-07 2006-04-13 Koninklijke Philips Electronics N.V. Use of the staudinger ligation in imaging and therapy end kits for imaging and therapy
US20060147963A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Affymetrix, Inc. Detection of polynucleotides on nucleic acid arrays using azido-modified triphosphate nucleotide analogs
JP4944098B2 (ja) 2005-05-02 2012-05-30 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 分析物の高感度検出のための新規標識方法
WO2007039858A2 (en) * 2005-10-04 2007-04-12 Koninklijke Philips Electronics N.V. Targeted imaging and/or therapy using the [3+2] azide-alkyne cycloaddition
US8114636B2 (en) 2006-02-10 2012-02-14 Life Technologies Corporation Labeling and detection of nucleic acids
JP5498952B2 (ja) 2007-11-21 2014-05-21 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2010122071A (ja) * 2008-11-19 2010-06-03 Okayama Univ 物質を固定化した物質固定化担体および物質固定化担体を作製する方法

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103534233A (zh) * 2011-03-25 2014-01-22 生命科技公司 用于标记靶分子的杂双官能酯
CN103534233B (zh) * 2011-03-25 2016-08-24 生命科技公司 用于标记靶分子的杂双官能酯
CN105377282A (zh) * 2013-01-15 2016-03-02 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 环炔衍生化的糖
CN105377282B (zh) * 2013-01-15 2020-07-17 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 环炔衍生化的糖
US10905678B2 (en) 2014-04-08 2021-02-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
US11872215B2 (en) 2014-04-08 2024-01-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Site-specific antibody-drug glyconjugates and methods
CN103983764A (zh) * 2014-04-17 2014-08-13 深圳先进技术研究院 对细胞进行原位标记的方法和应用
CN103983764B (zh) * 2014-04-17 2016-06-29 深圳先进技术研究院 对细胞进行原位标记的方法和应用
US11312942B2 (en) 2016-06-08 2022-04-26 Sony Corporation Material-fixing substrate and method for producing same, and material-fixing agent used for material-fixing substrate
CN113557228A (zh) * 2019-03-08 2021-10-26 阿比蒂斯有限公司 位点特异性的抗体偶联和作为其具体实例的抗体-药物偶联物

Also Published As

Publication number Publication date
US9932297B2 (en) 2018-04-03
US9725405B2 (en) 2017-08-08
US20150126706A1 (en) 2015-05-07
WO2009067663A8 (en) 2009-07-23
US20120172575A1 (en) 2012-07-05
JP5498952B2 (ja) 2014-05-21
US20100297250A1 (en) 2010-11-25
JP6659397B2 (ja) 2020-03-04
EP2222341B1 (en) 2015-02-25
JP5956487B2 (ja) 2016-07-27
JP2014177458A (ja) 2014-09-25
EP2907525B1 (en) 2018-05-16
CN104529711A (zh) 2015-04-22
US20170320815A1 (en) 2017-11-09
WO2009067663A1 (en) 2009-05-28
CN104529711B (zh) 2020-02-07
JP2016145221A (ja) 2016-08-12
JP2011504507A (ja) 2011-02-10
DK2907525T3 (en) 2018-08-06
JP2018039841A (ja) 2018-03-15
CN101925366B (zh) 2015-02-04
US20120322974A9 (en) 2012-12-20
US20120040011A9 (en) 2012-02-16
US9227943B2 (en) 2016-01-05
US8133515B2 (en) 2012-03-13
EP2907525A3 (en) 2015-12-02
US8940859B2 (en) 2015-01-27
US20160159732A1 (en) 2016-06-09
DK2222341T3 (en) 2015-03-09
EP2222341A1 (en) 2010-09-01
EP2907525A2 (en) 2015-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101925366B (zh) 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法
KR20180132501A (ko) 초휘도 이량체성 또는 중합체성 염료
More et al. Characteristics of new bioreductive fluorescent probes based on the xanthene fluorophore: Detection of nitroreductase and imaging of hypoxic cells
Lv et al. Enhanced tumor diagnostic and therapeutic effect of mesoporous silica nanoparticle-mediated pre-targeted strategy
Genady et al. New functionalized mercaptoundecahydrododecaborate derivatives for potential application in boron neutron capture therapy: Synthesis, characterization and dynamic visualization in cells
Zhang et al. Design and synthesis of NBD-S-dye dyads for fluorescently discriminative detection of biothiols and Cys/Hcy
US8541604B2 (en) Process for the functionalization of biological molecules
US20190076554A1 (en) Reactive fluorogenic compound and nanocomposite for sensing hydrogen sulfide comprising the same
CN107434814B (zh) 改性共轭聚合物及其制备方法和应用
WO2021023731A1 (fr) Utilisation de composés fluorophores de type aza-bodipy comme agents de contraste dans l'infrarouge très lointain
Anwar et al. A review ofsynthesis of fluorescein based advanced materials
CN115925746B (zh) 一种基于卟啉的可还原降解的含氟表面活性剂及其制备与应用
CN114574194B (zh) 一种pH荧光探针、其合成方法及其应用
Ortega et al. Carbosilane dendrimers peripherally functionalized with dansyl fluorescence tags and their cellular internalization studies
Geng et al. A triphenylamine-based near-infrared fluorescence turn off probe for nitroreductase imaging
CN117659113A (zh) 胆固醇和三苯基膦基修饰不对称轴向取代硅(ⅳ)酞菁及其制备方法和应用
CN111777643A (zh) 共轭寡聚物-钌配合物及其合成方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
CN117866044A (zh) 具有聚集诱导发射效应的化合物、纳米颗粒、其制备方法、应用及包含其的药物
He et al. Estrogen Receptor β-Targeted H2O2-Responsive Near-Infrared Fluorescence Probes in Prostate Cancer Study

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant