JP2023512036A - 癌の処置 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ネクチン－４発現腫瘍細胞によって特徴付けられる癌の処置における使用のための、化学療法剤に対する腫瘍の感受性を増加させることにおける使用のための、化学療法剤に複合化されたネクチン－４ポリペプチドに結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。ある実施形態において、本発明は、抗ネクチン－４抗体の、切断可能なリンカーを通したエキサテカン又はＳＮ－３８などのカンプトテシン類似体への複合体を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、いかなる図面も含めて、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１月３１日提出の米国仮特許出願第６２／９６８，１７５号明細書の利益を主張する。
配列表の参照
本願は、電子方式の配列表と共に提出されている。本配列リストは、２０２１年１月２５日作成の「Ｎｅｃｔｉｎ－４－１＿ＳＴ２５」という名称のファイルとして提供されており、サイズが２９ＫＢである。本配列リストの電子方式の情報は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、特に腫瘍において、低い不均一発現を含む異なるレベルのネクチン－４発現を含む、ネクチン－４発現腫瘍細胞によって特徴付けられる癌の処置における使用のための、カンプトテシンに複合化されたネクチン－４ポリペプチドに結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
米国では、２０１６年に７０，０００人超が新たに膀胱癌と診断され、約１６，０００人が死亡したと推定されている。尿路上皮癌には、膀胱、尿管、腎盂の癌が含まれ、それぞれ５０：３：１の比率で発生する。尿路上皮癌は、多発性の過程である。上部尿路癌を有する患者は、人生のある時点で膀胱癌を発症する３０％～５０％の可能性を有する。膀胱癌は、膀胱内の細胞が異常又は制御不能に増殖し始めると発生する。最も一般的なタイプの膀胱癌は、尿路上皮癌（ＵＣ）と呼ばれる。ＵＣでは、膀胱の内層（尿路上皮）で異常な増殖が起こる。これは、疾患が進行に伴って広がり得る。これは、膀胱周辺又は体の他の部位に広がり得る（転移）。これは、進行性尿路上皮癌と呼ばれる。
尿路上皮癌（ＵＣ）は、広範な異なる細胞表面抗原の発現増加によって特徴付けられるため、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を使用した特定の治療標的化の機会を提供する。表面抗原の中でも、ＴＲＯＰ－２（ヒト栄養膜細胞表面抗原）、ＳＬＩＴＲＫファミリータンパク質（例えば、ＳＬＩＴＲＫ６）、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、ＴＦ－Ａｇ（Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ抗原）、ＦＧＦ１Ｖ、Ｆｎ１４（ＦＧＦ誘導性１４）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）及びネクチン－４（ポリオウイルス受容体関連タンパク質４、ＰＶＲＬ４としても知られる）を含むいくつかの抗原がＡＤＣの開発に適していることが示されている。
ネクチン－４は、２００１年にＬｏｐｅｚグループによってヒト気管から最初にクローニングされた（非特許文献１を参照されたい）。ネクチン－４遺伝子のコピー数の増加は、発癌において頻繁に起こる事象であり、さらに上皮から間葉への移行、浸潤及び転移を促進していることが報告されている。ネクチン－４タンパク質の発現は、健常組織では限られているが、いくつかの腫瘍では有意に高いレベルで発現し、特にトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）（非特許文献２を参照されたい）を含む乳癌、膵臓癌及びＵＣで過剰発現する。しかし、ネクチン－４は、非小細胞肺癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌の腫瘍標本でも発現している。非特許文献３は、膀胱（６０％）及び乳房（５３％）の腫瘍組織における免疫組織化学（Ｈスコア≧１００）による中程度～強い染色を報告した。非特許文献４は、ネクチン－４の高発現が１４８のＴＮＢＣ症例のうちの８６（５８％）に存在していたことを報告した。
非特許文献３は、抗体ＡＧＳ－２２に基づいて、非常に強力な微小管破壊剤ＭＭＡＥに複合化された抗ネクチン－４抗体を開発した。この研究により、以前にネオアジュバント／アジュバント、局所進行又は転移の状況で白金含有化学療法剤及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤を受けたことのある、局所進行性又は転移性尿路上皮癌を有する患者の処置におけるヒト臨床試験で有望な結果をもたらした、ＡＤＣ薬剤候補のエンホルツマブベドチンがもたらされた（特許文献１及び特許文献２、Ａｇｅｎｓｙｓ Ｉｎｃ．を参照されたい）。他のいくつかのグループも、様々な毒性剤に結合した抗ネクチン－４剤を提案している。特許文献３（ＩＮＳＥＲＭ）は、いくつかの抗ネクチン－４抗体を報告し、広範な細胞傷害剤との潜在的な結合を提案している。同様に、特許文献１（Ａｇｅｎｓｙｓ Ｉｎｃ．）も抗ネクチン－４抗体を提供し、広範な細胞毒性剤への潜在的な結合を提案している。さらに、Ｂｉｃｙｃｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、切断可能なバリン－シトルリンジペプチドを介して細胞傷害性オーリスタチン（ＭＭＡＥ）ペイロードに複合化されたネクチン－４結合タンパク質で構成される抗ネクチン－４標的化剤の開発を報告した。
ＵＣのための開発が報告されているＡＤＣには、進行性ＵＣについて、サシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２、抗ＴＲＯＰ２）、エンホルツマブベドチン（ＡＳＧ－２２ＭＥ、抗ネクチン－４）、シルトラツマブベルドチン（ＡＳＧ－１５ＭＥ、抗ＳＬＩＴＲＫ６）、非筋層浸潤性膀胱癌についてオポルツズマブモナトックス（ＶＢ４－８４５、抗ＥｐＣＡＭ）が含まれる。
残念ながら、ＡＤＣは、有望な結果を示しているが、多くの標的療法は、患者に十分な及び／又は持続的な抗腫瘍応答を提供しない。例えば、エンホルツマブベドチン（抗ネクチン－４ ＡＤＣ）は、ＥＶ－２０１第２相試験でＵＣにおいて４４％のＯＲＲ（客観的奏効率）及び１２％のＣＲ（完全奏効率）という印象的な治療奏功を示したが、患者の約半数が処置を中止した（２０１９）。中断の大半は、ＲＥＣＩＳＴ（４８％）又は臨床症状（５％）によって評価される進行性疾患によるものであった。また、中止した１８％の患者は、有害事象、とりわけ神経障害を経験した。したがって、ネクチン－４を標的とするＡＤＣには限界があり、当技術分野では、ＵＣ及び他の癌を患っている患者への利益を改善する必要がある。
ＵＣでは、一般に、癌が体の離れた部分に広がっていない場合又は癌が広がっている場合の両方において、個体は、最初にシスプラチンベースのレジメン（放射線を伴う又は伴わない）で処置される。カンプトテシン化合物は、一般に、ＵＣの処置に使用されない。非特許文献５は、進行性又は転移性尿路上皮腫瘍を有する患者でカンプトテシン類似体ＲＦＳ２０００を研究した。非特許文献５は、それが、事前の化学療法に失敗した進行性／転移性尿路上皮腫瘍を有する患者で有意な活性を発揮せず、この研究の結果がＲＦＳ２０００のさらなる調査を提案しないと結論付けた。過去数十年にわたり、非常に多くのカンプトテシン類似体が作製されており、その中にはエキサテカンがある。非特許文献６は、患者３４９人の第３相試験で膵臓癌の処置においてエキサテカンを評価し、ゲムシタビンに加えたエキサテカンがゲムシタビン単独に対して有効性において優れていないことを見出した。
米国特許第８，６３７，６４２号明細書 国際公開第２０１２／０４７７２４号パンフレット 国際公開第２０１８／１５８３９８号パンフレット
Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４６）：４３２０５－１５ Ｍ－Ｒａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ａｐｒ １；２８（４）：７６９－７７６ Ｃｈａｌｌｉｔａ－Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７６（１０）：３００３－３０１３ Ｚｅｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｆｒｏｎｔ．Ｍｅｄ．６：２００ ｄｅ Ｊｏｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ２２：３２９－３３３ Ａｂｏｕ－Ａｌｆａ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２４（２７）：４４４１－４４４７
ある態様において、本開示は、エキサテカン分子に複合化されたネクチン－４結合剤及びネクチン－４発現癌、とりわけＵＣ、乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）、非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌又は食道癌の処置におけるその使用を提供する。ある態様において、本開示は、細胞内で切断可能なジペプチド、自己排除スペーサー及びカンプトテシン類似体を含む非常に強力なリンカーを提供する。非常に強力なリンカーは、腫瘍抗原に結合する抗体に複合化することができる。したがって、そのようなリンカーに複合化された抗体及び抗体組成物も提供される（例えば、抗体が腫瘍抗原、任意選択によりネクチン－４に結合する場合）。ある態様において、本開示は、腫瘍細胞上のネクチン－４発現レベルにかかわらず、ネクチン－４発現癌を有する個体に使用できる処置方法を提供する。
ある態様において、本開示は、腫瘍細胞がＰ糖タンパク質（Ｐｇｐ）を発現する個体において有利に使用することができる処置方法を提供する。
ある態様において、本開示は、化学療法剤（例えば、Ｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）によって輸送される化学療法剤、白金製剤（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプレーション、ネダプラチン、フェナントリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル（タキソール）及びドセタキセル（タキソテール））による処置を以前に受けた個体に有利に使用できる処置方法を提供する。
ある態様において、本開示は、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むＡＤＣ、ＣＤＲ又はポリペプチド鎖トラスツズマブ）を含む組成物による処置後に応答しないか又は進行している、腫瘍又は癌が耐性を有する個体において有利に使用することができる処置方法を提供する。
ある態様において、本開示は、低用量又は従来の抗ネクチン－４ ＡＤＣに使用される用量よりも低い用量、例えば５ｍｇ／ｋｇ体重未満、３ｍｇ／ｋｇ体重未満、１．２５ｍｇ／ｋｇ体重未満、１ｍｇ／ｋｇ体重未満、１２５ｍｇ未満の固定用量において、個体における抗腫瘍効果を媒介するために使用できる処置方法を提供する。
ある態様において、本開示は、既存の神経障害、糖尿病又は高血糖症、心不全、眼病変を有する個体に使用できる処置方法を提供する。
ある態様において、本開示は、低レベル又は中程度のレベルのネクチン－４ポリペプチドの腫瘍細胞発現（例えば、腫瘍細胞膜でのネクチン－４ポリペプチドの発現）によって特徴付けられるネクチン－４発現癌を有する個体に使用できる処置方法を提供する。
カンプトテシン類似体又は誘導体（例えば、５環若しくは６環カンプトテシン、エキサテカン又はＳＮ－３８分子）に複合化されたネクチン－４結合剤の投与を含む処置が提供される。ネクチン－４は、一般に、腫瘍細胞で発現するが、ネクチン－４の発現レベルは、ＡＤＣなどの抗ネクチン－４剤の治療効果に影響を与え得る。腫瘍細胞におけるネクチン－４の発現は、一部の個体では非常に高くなり得るが（例えば、免疫組織化学による評価による）、他の個体は、腫瘍細胞ネクチン－４発現が低いか、又は中程度であるか、又は高発現と見なされるレベルを下回る疾患を有し、したがってエンホルツマブベルドチンなどの薬剤に対する応答性が低いか又は応答しない可能性がある。非高レベルの腫瘍細胞ネクチン－４発現（例えば、低又は中レベル）によって特徴付けられるネクチン－４発現癌を有する個体を処置する能力は、高ネクチン－４発現レベルに限定されることなく、より幅広い集団における使用、例えば腫瘍細胞上で異なるレベルのネクチン－４発現を有する対象（例えば、低又は中ネクチン－４対象及び高ネクチン－４対象）によって特徴付けられる対象の集団を処置することに利点を提供する。この利点は、ＵＣなどの非常に高い腫瘍ネクチン－４発現を示すことが多い（但し、常にではない）ことが知られているネクチン４発現癌において注目され、乳癌（例えば、ＴＮＢＣ、Ｈｅｒ２＋乳癌）、非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌又は食道癌など、腫瘍細胞ネクチン－４発現のレベルに幅広い多様性があるネクチン－４発現癌にさらに大きい関心が寄せられる可能性がある。ある実施形態において、ネクチン－４発現癌は、Ｈｅｒ２ポリペプチドの発現によってさらに特徴付けられる（例えば、Ｈｅｒ２過剰発現又は高発現癌、Ｈｅｒ２低発現癌）。
本開示の処置は、例えば、腫瘍細胞がその表面で腫瘍抗原（例えば、ネクチン－４）のレベルにおいて高い不均一性を有する個体内の腫瘍によって特徴付けられることが知られている癌タイプにおいて有利に使用することができる。
ある態様において、本開示は、低レベル又は中程度のレベルの腫瘍細胞ネクチン－４発現によって特徴付けられるネクチン－４発現癌を有する個体を処置する方法を提供する。患者は、進行性若しくは難治性の癌を有し得るか、又は腫瘍ネクチン－４発現が低いか若しくは中程度のままである初期段階の癌を有し得る。処置は、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化されたネクチン－４結合剤の投与を含む。ある実施形態において、腫瘍は、免疫組織化学スコア、例えば２９０、２５０、２００、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０又は１００以下又は未満のＨスコアによって決定される、低又は中程度のネクチン－４発現によって特徴付けられる。ある実施形態において、前記個体は、尿路上皮癌又は乳癌を有する。ある実施形態において、前記個体は、非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌又は食道癌を有する。ある実施形態において、癌又は腫瘍は、進行した再発性又は転移性の癌であり、任意選択により進行した再発性又は転移性の尿路上皮癌である。ある態様において、本開示は、ネクチン－４発現癌を有する個体の集団を処置する方法を提供し、ここで、集団は、免疫組織化学スコア、例えば２９０、２５０、２００、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０又は１００以下又は未満のＨスコアによって決定される、低又は中程度のネクチン－４発現によって特徴付けられる癌又は腫瘍を有する個体を含む。
ある態様において、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片は、細胞内で切断可能な（例えば、プロテアーゼ切断可能な）オリゴペプチド（例えば、ジ、トリ、テトラ又はペンタペプチド）を介してカンプトテシン類似体に複合化される。ある態様において、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片は、細胞内で切断可能な（例えば、プロテアーゼ切断可能な）ジ、トリ、テトラ又はペンタペプチド及び自己排除スペーサー（例えば、細胞内で切断可能なペプチドとカンプトテシンとの間に位置する自己排除スペーサー）を介してカンプトテシン類似体に複合化される。ある態様において、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片は、細胞内で切断可能な（例えば、プロテアーゼ切断可能な）ジペプチド又はトリペプチド及び自己排除スペーサーを介してカンプトテシン類似体に複合化される。ある態様において、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片は、細胞内で切断可能な（例えば、プロテアーゼ切断可能な）テトラペプチド又はペンタペプチド及び自己又は非自己排除スペーサーを介してカンプトテシン類似体に複合化される。
任意選択により、抗体は、式Ｉ～ＸＩの何れか１つのリンカー毒素で機能化される。
ある態様において、カンプトテシン類似体は、エキサテカン又はＳＮ－３８分子である。
ある態様において、本開示は、カンプトテシン、例えばカンプトテシン類似体、エキサテカン若しくはエキサテカン誘導体又はＳＮ－３８分子に複合化された（例えば、共有結合された）ネクチン－４結合タンパク質、抗体又は抗体断片を提供する。
ある態様において、本開示は、癌を有する個体を処置する方法を提供し、方法は、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化されたネクチン－４結合剤で前記個体を処置することを含む。ある実施形態において、前記個体は、尿路上皮癌又は乳癌を有する。
ある態様において、本開示は、ネクチン－４の腫瘍細胞発現レベルに基づいて、個体が処置に適しているかを決定する前ステップなしで個体を処置する方法を提供し、方法は、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化されたネクチン－４結合剤で前記個体を処置することを含む。ある実施形態において、前記個体は、尿路上皮癌又は乳癌を有する。
ある態様において、本開示は、腫瘍細胞上の高レベルのネクチン－４によって特徴付けられる腫瘍を有する個体と、腫瘍細胞上の低レベルのネクチン－４によって特徴付けられる腫瘍を有する個体との両方を含む個体の集団における癌の処置における使用のための、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化されたネクチン－４結合剤を提供する。ある実施形態において、前記個体は、尿路上皮癌又は乳癌を有する。
ある態様において、本開示は、癌（例えば、ネクチン－４発現癌）を有する個体を処置する方法を提供し、ここで、個体は、オーリスタチン又はＭＭＡＥ分子（例えば、エンホルツマブベドチン）に複合化された抗体又は抗原結合分子（例えば、ネクチン－４抗体又は抗原結合分子）による処置（例えば、処置中又は処置後）にもかかわらず、抵抗性であり、応答せず、再発及び／又は進行した癌を有し、方法は、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化されたネクチン－４結合剤で前記個体を処置することを含む。ある実施形態において、前記個体は、尿路上皮癌、乳癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌又は食道癌を有する。ある実施形態において、癌又は腫瘍は、進行した再発性又は転移性の癌であり、任意選択により進行した再発性又は転移性の尿路上皮癌である。
ある態様において、本開示は、癌（例えば、ネクチン－４発現癌）を有する個体を処置する方法を提供し、ここで、個体は、局所進行性又は転移性の尿路上皮癌を有し、オーリスタチン又はＭＭＡＥ分子に複合化された抗体又は抗原結合剤（例えば、エンフォルツマブベドチン）による処置を以前に受けており、方法は、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化されたネクチン－４結合剤で前記個体を処置することを含む。
ある態様において、本開示は、癌（例えば、ネクチン－４発現癌）を有する個体における薬剤耐性を低減又は予防する方法を提供し、方法は、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化されたネクチン－４結合剤で前記個体を処置することを含む。
本明細書の任意の実施形態において、個体は、オーリスタチン又はＭＭＡＥ分子に複合化された抗体（例えば、エンホルツマブベドチン）による前処置後、抵抗性であり、非応答性であり、再発及び／又は進行していると特定することができる。
本明細書の任意の実施形態において、個体は、ＨＥＲ２陽性腫瘍又は癌（例えば、ネクチン－４陽性、ＨＥＲ２陽性腫瘍又は癌）、任意選択によりＨＥＲ２過剰発現又はＨＥＲ２高発現の腫瘍又は癌、任意選択によりＨＥＲ２低発現の腫瘍又は癌を有すると特定され得る。本明細書の他の実施形態において、個体は、Ｈｅｒ２陰性の腫瘍又は癌を有すると特定することができる。任意選択により、腫瘍又は癌は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。
ある態様において、本開示は、Ｈｅｒ２ポリペプチドを発現する腫瘍細胞（例えば、ネクチン－４及びＨｅｒ２の両方をその表面に発現する腫瘍細胞）によって特徴付けられる癌（例えば、ネクチン－４発現癌）を有する個体を処置する方法を提供し、方法は、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化（例えば、細胞内で切断可能なリンカーを介して）されたネクチン－４結合剤で前記個体を処置することを含む。ある実施形態において、癌は、Ｈｅｒ２を過剰発現するか、又はその表面で高レベルにおいて発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる。ある実施形態において、癌は、その表面で低レベルのＨｅｒ２を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる。ある実施形態において、方法は、Ｈｅｒ２ポリペプチド（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ）に結合する抗体で個体を処置すること（例えば、組み合わせて個体に投与すること）をさらに含み；任意選択により、Ｈｅｒ２に結合する抗体は、ＡＤＣであり；任意選択により、Ｈｅｒ２に結合する抗体が、細胞傷害剤、任意選択によりオーリスタチン、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）又はカンプトテシン類似体若しくは誘導体（例えば、エキサテカン又はその誘導体、ＳＮ－３８）に複合化され；任意選択により、Ｈｅｒ２に結合する抗体は、トラスツズマブエムタンシン又はトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１ａ）である。ある実施形態において、個体は、乳癌を有する。ある実施形態において、個体は、胃癌を有する。ある実施形態において、個体は、結腸直腸癌を有する。ある実施形態において、個体は、膵臓癌を有する。ある実施形態において、個体は、膀胱癌を有する。ある実施形態において、個体は、頭頸部癌を有する。
カンプトテシン類似体又は誘導体に複合化されたネクチン－４結合剤は、月に１～４回、例えば２週間に１回、３週間に１回又は４週間に１回、有利に投与することができる。
カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化されたネクチン－４結合剤は、月に１～４回、例えば２週間に１回、３週間に１回又は４週間に１回、０．１～１０又は１～１０ｍｇ／ｋｇ体重で有利に投与することができる。
ある態様において、本開示は、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はエキサテカン誘導体又はＳＮ－３８分子に複合化された（例えば、共有結合された）ネクチン－４結合剤を提供する。
本明細書の任意の実施形態において、カンプトテシン類似体又は誘導体、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化された（例えば、共有結合した）ネクチン－４結合剤は、リンカーを介して、化合物１若しくは２の構造を含む分子で機能化されるか、又は式Ｉ若しくはＩＩのリンカー－カンプトテシン分子で機能化されている、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、システイン、リジン、グルタミン残基、非天然アミノ酸残基）を有するヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体、非抗体ペプチド又はタンパク質足場）を含むとして特徴付けることができる。本明細書の任意の実施形態において、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片は、式ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ若しくはＸＩの構造を有するリンカー－カンプトテシン分子又は化合物３～１７の何れかで機能化されているとして特徴付けることができる。
ある実施形態において、カンプトテシン類似体に複合化された抗ネクチン－４抗体又は抗体断片は、エキサテカン分子、例えば化合物１（１ａ又は１ｂ）の構造を有する分子に複合化されたネクチン－４結合抗体又は抗体断片である。ある実施形態において、カンプトテシン類似体に複合化されたネクチン－４結合抗体又は抗体断片は、ＳＮ－３８分子、例えば化合物２の構造を有する分子に複合化されたネクチン－４結合抗体又は抗体断片である。ある実施形態において、ネクチン－４結合抗体又は抗体断片は、リンカー（例えば、さらなるスペーサー、例えば本明細書に記載のスペーサー（Ｙ’）を有する又は有しない切断可能なリンカー分子）を介して、以下の構造を有する分子で機能化されている、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、システイン、リジン、グルタミン又は非天然アミノ酸残基）を有するヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むとして特徴付けることができる。
Figure 2023512036000002
ある実施形態において、細胞傷害剤に複合化されたネクチン－４結合タンパク質、抗体又は抗体断片は、式（Ｉ）：
Ａｂ－Ｘ－Ｚ 式（Ｉ）
（式中、
Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）であり；
Ｘは、Ａｂ及びＺを連結するリンカー分子であり（例えば、Ａｂ及びＺのそれぞれに共有結合している）、Ｘは、例えば、生理学的条件下、任意選択により細胞内条件下において切断可能な部分、任意選択によりプロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチドを含み、任意選択により、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離又は非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含み、任意選択により、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に配置されたスペーサー（Ｙ）をさらに含み；及び
Ｚは、カンプトテシン類似体、任意選択によりエキサテカン分子又はＳＮ－３８分子である）
によって表される免疫複合体であると特定することができる。
ある実施形態において、抗体又は他の抗原結合ペプチド若しくはタンパク質、例えば腫瘍抗原（例えば、ネクチン－４又は別の適切な腫瘍抗原）に結合する抗体若しくは非抗体ペプチド又はタンパク質足場に複合化することができる、切断可能なペプチド含有リンカー（例えば、リンカーを含むオリゴペプチド又はジ、トリ、テトラ又はペンタペプチド）及びリンカー毒素分子並びにそのようなリンカーに複合化された抗体及び抗体組成物と、癌の処置におけるそれらの使用方法とが本明細書で提供される。ある実施形態において、ジペプチド含有リンカー毒素分子は、構造（Ｘ－Ｚ）を含み、Ｘは、抗原結合タンパク質上の相補的な反応基と反応するのに適している、任意選択により保護されている、反応基を含むリンカー分子であり、スペーサー部分（Ｙ）は、反応基と切断可能なジペプチドとの間に位置し、切断可能なジペプチドは、バリン－シトルリン、バリン－アラニン又はフェニルアラニン－リジンから選択され、自己脱離又は非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）は、切断可能な部分とＺとの間に位置し、Ｚは、カンプトテシン類似体、任意選択によりエキサテカン分子又はＳＮ－３８分子である。そのような切断可能なペプチド含有リンカーを抗原結合タンパク質に複合化する方法がさらに提供される。
ある実施形態において、カンプトテシン類似体に複合化された抗体は、式（Ｉ）：
Ａｂ－Ｘ－Ｚ 式（Ｉ）
（式中、
Ａｂは、腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）であり；
Ｘは、Ａｂ及びＺを連結するリンカー分子であり（例えば、Ａｂ及びＺのそれぞれに共有結合している）、Ｘは、バリン－シトルリン、バリン－アラニン又はフェニルアラニン－リジンジペプチドを含み、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離又は非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含み、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に配置されたスペーサー（Ｙ）をさらに含み；及び
Ｚは、カンプトテシン類似体、任意選択によりエキサテカン分子又はＳＮ－３８分子である）
によって表される免疫複合体であると特定することができる。
ある実施形態において、カンプトテシン類似体を腫瘍に送達若しくは標的化する方法又はカンプトテシン類似体を腫瘍（例えば、癌を有する対象）において放出する方法が提供され、方法は、癌を有する対象に、式（Ｉ）：
Ａｂ－Ｘ－Ｚ 式（Ｉ）
（式中、
Ａｂは、腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）であり；
Ｘは、Ａｂ及びＺを連結するリンカー分子であり（例えば、Ａｂ及びＺのそれぞれに共有結合している）、Ｘは、バリン－シトルリン、バリン－アラニン又はフェニルアラニン－リジンジペプチドを含み、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離又は非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含み、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に配置されたスペーサー（Ｙ）をさらに含み；及び
Ｚは、カンプトテシン類似体、任意選択によりエキサテカン分子又はＳＮ－３８分子である）
によって表される免疫複合体を投与することを含む。
ある実施形態において、カンプトテシン類似体に複合化された抗体又はネクチン－４結合剤は、式（ＩＩ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
（式中、
Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチド又は他の腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）であり；
Ｘは、Ａｂ及びＺを連結するリンカー分子であり、Ｘは、例えば、生理学的条件下、任意選択により細胞内条件下において切断可能な部分、任意選択によりプロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチドを含み、任意選択により、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離又は非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含み、任意選択により、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に配置されたスペーサー（Ｙ）をさらに含み；
Ｚは、カンプトテシン類似体であり、任意選択により、Ｚは、エキサテカン分子又はＳＮ－３８分子を含む分子、例えば化合物１又は２の構造を有する分子であり；
ｎは、１であり；及び
ｍは、４～８であるか、又は任意選択により、ｍは、４、５、６、７又は８から選択される整数である）
によって表される免疫複合体であると特定することができる。
ある実施形態において、カンプトテシン類似体に複合化されたネクチン－４結合剤は、式（ＩＩ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
（式中、
Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）であり；
Ｘは、Ａｂ及びＺを連結する分子であり、Ｘは、例えば、生理学的条件下、任意選択により細胞内条件下において切断可能な部分、任意選択によりプロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチドを含み、任意選択により、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離又は非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含み、任意選択により、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に配置されたスペーサー（Ｙ）をさらに含み；
Ｚは、カンプトテシン類似体であり、任意選択により、Ｚは、エキサテカン分子又はＳＮ－３８分子を含む分子であり；
ｎは、１であり、組成物中の免疫複合体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、２～４、４～８、任意選択により６～８であるｍ（Ｘ－Ｚ部分の数）を有する）
によって表される免疫複合体の組成物として特徴付けることができる。任意選択により、組成物中の免疫複合体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、４、６、７若しくは８であるか、又は少なくとも４、６、７若しくは８であるｍを有する。
式Ｉ又はＩＩにおいて、（Ｘ－Ｚ）部分は、任意選択により、式ＩＩＩ～ＸＩの何れか又は化合物３～１７の何れかの構造を有して特徴付けられ得る。
式Ｉ又はＩＩにおいて、分子Ｘ又はスペーサーＹは、任意選択により、反応基（Ｒ）又は反応基（Ｒ）と、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）のアミノ酸若しくは抗原結合タンパク質（例えば、抗体）のアミノ酸に結合されている相補的な反応基（Ｒ’）との反応物の残基を含むものとして特定することができる。
本明細書の任意の実施形態において、エキサテカン分子は、エキサテカンの１位のアミンを介してリンカー（Ｘ）に結合していると特定することができる（エキサテカン分子がリンカーに組み込まれる場合、ＮＨは、１位のＮＨ２を置換する）。本明細書の任意の実施形態において、ＳＮ－３８分子は、９位のＯＨを介してリンカー（Ｘ）に結合していると特定することができる（Ｏは、化合物２に示されるＳＮ－３８分子がリンカーに組み込まれる場合、９位のＯＨを置換する）。
ある実施形態において、エキサテカンに複合化されたネクチン－４結合剤は、以下の構造を含むリンカー－エキサテカン分子でスペーサー（Ｙ）を介して機能化されている、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、システイン残基、グルタミン残基）を有するヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むとして特徴付けることができる。
Figure 2023512036000003
ある実施形態において、エキサテカンに複合化されたネクチン－４結合剤は、以下の構造を含むリンカー－エキサテカンでスペーサー（Ｙ）を介して機能化されている、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、システイン残基、グルタミン残基）を有するヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むとして特徴付けることができる。
Figure 2023512036000004
ある実施形態において、エキサテカンに複合化されたネクチン－４結合剤は、以下の構造を含むリンカー－エキサテカン分子でスペーサー（Ｙ）を介して機能化されている、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、システイン残基、グルタミン残基）を有するヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むとして特徴付けることができる。
Figure 2023512036000005
ある実施形態において、エキサテカンに複合化されたネクチン－４結合剤は、以下の構造を含むリンカー－エキサテカン分子でスペーサー（Ｙ）を介して機能化されている、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、システイン残基、グルタミン残基）を有するヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むとして特徴付けることができる。
Figure 2023512036000006
スペーサー（Ｙ）は、置換又は非置換のアルキル又はヘテロアルキル鎖であるか又はそれを含むものとして特定することができ、任意選択により、Ｙは、２～１００原子又は２～４０原子、任意選択により２～３０、２～２０、４～４０、４～３０又は４～２０原子の鎖長を有し、任意選択により、１つ以上の原子は、炭素以外、例えば酸素、硫黄、窒素又は他の原子であり得、任意選択により、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド又はアルキルアミドで置換されている。例えば、Ｙは、１つ以上のエチレンオキシドモノマーを含み得、任意選択により、Ｙは、ポリエチレンオキシド部分を含み、任意選択により、Ｙは、構造－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ－を含み、式中、ｘは、１～１２、任意選択により１～８、任意選択により１～６である。
ある態様において、本開示は、既存の抗ネクチン－４ＡＤＣ療法（例えば、オーリスタチンに複合化された抗ネクチン－４抗体；エンホルツマブベルドチン）と比較して改善された（より低い）薬剤耐性を示す処置を提供する。ある態様において、癌の処置及び／若しくは予防並びに／又は腫瘍細胞の死滅を、それを必要とする個体において行う方法が提供され、ここで、処置は、月に１～２回の頻度（例えば、２週間に１回、３週間に１回又は４週間に１回）における、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０回又はそれを超える、カンプトテシン類似体（例えば、エキサテカン又はＳＮ－３８分子）に複合化されたネクチン－４結合剤の投与を含む。
ある態様において、本開示は、カンプトテシン類似体（例えば、１つ以上のカンプトテシン部分に複合化された抗ネクチン－４抗体又は抗体断片）など、カンプトテシン分子に複合化されたネクチン－４結合タンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）で前記個体を処置することを含む、癌の処置及び／若しくは予防並びに／又は腫瘍細胞の死滅を、それを必要とする個体において行う方法或いは個体の腫瘍にカンプトテシン分子を送達及び／又は放出する方法を提供し、ここで、任意選択により、カンプトテシンは、エキサテカン又はＳＮ－３８である。ある実施形態において、前記個体は、ネクチン－４発現腫瘍を有し、任意選択により、腫瘍は、ＨＥＲ２発現腫瘍又はＨＥＲ陰性腫瘍、例えば尿路上皮癌、乳癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌又は食道癌である。ある実施形態において、癌又は腫瘍は、進行した再発性又は転移性の癌であり、任意選択により進行した再発性又は転移性の尿路上皮癌である。ある実施形態において、癌又は腫瘍は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。
本明細書の任意の実施形態の一態様において、個体は、放射線療法、手術、化学療法及び／又は生物製剤による処置による前処置を受けている。
本開示の免疫複合体の組成物も提供される。本開示の免疫複合体及び典型的には活性成分又は本組成物の処方、送達、安定性若しくは他の特徴を促進する不活性成分であり得る１つ以上のさらなる成分（例えば、様々な担体）を含む、薬学的に許容可能な組成物及びキットも提供される。免疫複合体及びＡＤＣをスクリーニング、試験及び作製する方法も提供される。
これらの態様は、より詳細に記載され、本明細書で提供される本発明の説明からさらなる態様、特性及び利点が明らかとなるであろう。
ＦＡＣＳ（ＭＦＩ：蛍光強度の平均）によって決定された、ＳＵＭ１９０ヒト乳癌腫瘍細胞の表面におけるＨＥＲ２及びネクチン－４ポリペプチドの発現レベルを示す。ＳＵＭ１９０腫瘍細胞は、ＨＥＲ２を低～中レベル（中央蛍光単位１７７７）で発現し、ネクチン－４をより低いレベル（中央蛍光単位９９１）で発現した。 ＦＡＣＳ（ＭＦＩ：蛍光強度の平均）によって決定された、ＳＵＭ１８５ヒト乳癌腫瘍細胞の表面におけるＨＥＲ２及びネクチン－４ポリペプチドの発現レベルを示す。ＳＵＭ１８５細胞は、ＨＥＲ２を中～高レベル（中央蛍光単位２８８０）で発現し、ネクチン－４をより高いレベル（中央蛍光単位４３２６）で発現した。 右側のパネルは、ＳＵＭ１８５及びＳＵＭ１９０腫瘍細胞を発現するＨＥＲ－２及びネクチン－４の死を引き起こすことにおけるＮ４ ＡＤＣ１（抗ネクチン－４）の有効性を示す。左側の２つのパネルは、同じそれぞれの細胞におけるＨＥＲ２ ＡＤＣ１（抗Ｈｅｒ２）の有効性を示す。ＳＵＭ１９０細胞において、Ｎ４ ＡＤＣ１は、ＨＥＲ２ ＡＤＣ１と比較して２０倍増加した効力を有し、低いネクチン－４表面発現（ＳＵＭ１９０よりもＳＵＭ１８５で約４倍低い表面ネクチン－４）によって特徴付けられるＳＵＭ１８５細胞でもより高い比較効力を有した。 抗体エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）及びＮ４１ｍＡｂＣ）並びにアイソタイプ対照抗体（ＩＣ）について、ヒトＳＵＭ１８５乳癌細胞の内在化をＸ軸の抗ネクチン－４抗体濃度に対するＹ軸の発光（細胞生存度を示す）として示す。 第１のスペーサー、Ｖａｌ－Ｃｉｔ切断可能部分及びＰＡＢ自己脱離スペーサー（ＶＣ－エキサテカン）を有するリンカーを介してエキサテカンに複合化された抗Ｉｇ様Ｖドメイン抗体エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）及びアイソタイプ対照（ＩＣ）による、Ｘ軸の抗ネクチン－４抗体濃度に対するＹ軸の細胞生存度としてヒトＳＵＭ１８５乳癌細胞の死滅を示す。 ＶＣ－エキサテカンリンカーを介してエキサテカンに、又はＧＧＦＧ切断可能リンカー（ＧＧＦＧ－ＤｘＤ）を介してカンプトテシンＤｘＤに複合化された抗Ｉｇ様Ｖドメイン抗体エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）及びアイソタイプ対照（ＩＣ）による、Ｘ軸の抗ネクチン－４抗体濃度に対するＹ軸の細胞生存度としてヒトＳＵＭ１９０乳癌細胞の死滅を示す。 ＶＣ－エキサテカンリンカーを介して、第１のスペーサー、Ｖａｌ－Ａｌａ切断可能部分及びＰＡＢ自己脱離スペーサー（ＶＣ－エキサテカン）を有するリンカーを介して、又は第１のスペーサーがＰＥＧ８部分（８ＰＥＧ単位）を含むＶＣ－エキサテカンリンカーを介してエキサテカンに複合化された抗Ｉｇ様Ｖドメイン抗体エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）及びアイソタイプ対照（ＩＣ）による、Ｘ軸の抗ネクチン－４抗体濃度に対するＹ軸の細胞生存度としてヒトＳＵＭ１９０乳癌細胞の死滅を示す。 均等な薬物対抗体比（ＤＡＲ＝８）でＧＧＦＧ－ＤｘＤリンカー、ＶＣ－エキサテカンリンカー、ＶＡ－エキサテカンリンカー又はＰＥＧ８－ＶＡ－エキサテカンリンカーの何れかに複合化されたエンホルツマブ（ｍＡｂＡ）に基づくカンプトテシンＡＤＣの５ｍｇ／ｋｇの単回用量でのインビボ有効性を示す。 ２つの異なる抗ネクチン４抗体に対する５ｍｇ／ｋｇのカンプトテシンＡＤＣの単回投与でのインビボ有効性を示す。エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）又は代替の抗ネクチン－４特異的抗体（ｍＡｂＢ）の何れかを均等な薬物対抗体比（ＤＡＲ＝８）でそれぞれＰＥＧ８－ＶＡ－エキサテカンリンカーに複合化した。ＧＧＦＧ－ＤｘＤリンカーに複合化されたエンホルツマブ（ｍＡｂＡ）及びアイソタイプ対照も比較のために試験された。
定義
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。請求項で使用される場合、「含む」という語と組み合わせて使用されるとき、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２又はそれを超えるものを意味し得る。
「含む」が使用される場合、これは、任意選択により、「から基本的になる」又は「からなる」により置き換えられ得る。
「ネクチン－４」及び「ネクチン－４ポリペプチド」は、ネクチン４遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ９６ＮＹ８を参照されたい）又はそのような遺伝子から調製されるｃＤＮＡによってコードされるタンパク質又はポリペプチドを指す。ネクチン－４ポリペプチドという用語には、天然に存在する任意のアイソフォーム、対立遺伝子又は変異体が包含される（例えば、配列番号１又はその少なくとも１００、２００、３００、４００若しくは５００個のアミノ酸残基の連続配列と９５％、９８％又は９９％同一のネクチン－４ポリペプチド）。標準的なヒトネクチン－４（アイソフォーム１）の５１０アミノ酸残基配列（３１アミノ酸シグナルペプチドを含む）は、以下のように示される。
Figure 2023512036000007
配列番号１は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ識別子Ｑ９６ＮＹ８－１に対応し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の特定の態様は、哺乳動物のネクチン－４タンパク質及び他の種、例えば非ヒト霊長類、カニクイザルのネクチン－４オルソログを含むが、これに限定されない、ヒトネクチン－４又はその相同体に結合する抗ネクチン－４抗体を提供する。
「ＨＥＲ２」（ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＥｒｂＢ－２としても知られる）という用語は、「ヒト上皮成長因子受容体２」を表す。これは、ＨＥＲ２の変異体及びアイソフォームを含む。
「癌抗原」と交換可能に使用される「腫瘍抗原」という用語は、癌細胞によって差次的に発現される抗原又は腫瘍促進効果（例えば、免疫抑制効果）を有する腫瘍又は腫瘍隣接組織の非腫瘍細胞（例えば、免疫細胞）によって発現され、それにより癌を標的とするために利用することができる抗原を指す。腫瘍抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を刺激する可能性のある抗原である。これらの抗原のいくつかは、正常細胞によってコードされているが、必ずしも発現されているわけではないか、又はより低いレベル若しくはより低い頻度で発現されている。これらの抗原は、正常細胞ではサイレントである（すなわち発現していない）もの、特定の分化段階でのみ発現されるもの及び胚及び胎児抗原などの一時的に発現されるものとして特徴付けることができる。他の腫瘍抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異ｐ５３）、内部欠失又は染色体転座に起因する融合タンパク質などの突然変異細胞遺伝子によってコードされる。さらに他の腫瘍抗原は、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスで輸送されるものなどのウイルス遺伝子によってコードすることができる。さらに他の腫瘍抗原は、腫瘍促進効果に寄与するか又はそれを媒介することができる免疫細胞、例えば免疫回避に寄与する細胞、単球又はマクロファージ、任意選択によりサプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞又は骨髄由来サプレッサー細胞で発現することができる。腫瘍抗原は、多くの場合、過剰発現するか、又は異常な時期に発現するか、又は標的細胞集団によって発現される正常な細胞表面抗原である。理想的には、標的抗原は、増殖性細胞（例えば、腫瘍細胞）又は腫瘍若しくは腫瘍隣接組織に存在する腫瘍促進細胞（例えば、免疫抑制効果を有する免疫細胞）でのみ発現するが、実際には、これが観察されることは、稀である。その結果、標的抗原は、多くの場合、増殖／疾患組織と健康組織との間の差次的発現に基づいて選択される。腫瘍抗原の例には、ネクチン－４、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、クリプト、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４７、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｓｉｇｌｅｃファミリーメンバー、例えばＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）又はＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＰＳＣＡ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ７０、Ｅ－セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｄ６及びＴＭＥＦＦ２が含まれる。腫瘍抗原の例には、サイトカイン受容体、キラーＩｇ様受容体、ＣＤ２８ファミリータンパク質など、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）、例えばキラーＩｇ様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＰＤ－Ｌ１、ＩＬ－６受容体も含まれる。例には、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）又は任意選択によりＭＩＣＡ及び／若しくはＭＩＣＢ以外の抗原、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－Ｃ０１７－１Ａ／ＧＡ７３３、プロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、受容体タンパク質チロシンキナーゼ３（ＴＹＲＯ－３）、ネクチン（例えば、ネクチン－４）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリーのタンパク質、レチノイン酸初期転写物－１（ＲＡＥＴ１）ファミリーのタンパク質、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ＤＲ５、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１又はＮＴＲＫＲ１（ＥＣ ２．７．１０．１）としても知られる、ＴＲＯＰ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリー、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、アンジオポエチン－２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦアルファ、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリーのメンバー、例えばＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ＨＥＲ－４又は少なくとも１つのＨＥＲサブユニットから構成されるヘテロ二量体受容体、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ－１、ＣＡ１２５、インテグリン受容体、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３インテグリン、ＰＤＧＦベータ受容体、ＳＶＥ－カドヘリン、ＩＬ－８受容体、ｈＣＧ、ＩＬ－６受容体、ＣＳＦ１Ｒ（腫瘍関連単球及びマクロファージ）、α－フェトプロテイン、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシドも含まれるが、これは、網羅的であることを意図していない。ある態様において、目的の抗原は、例えば、ヒト抗体が結合した場合に細胞内内在化を起こすことができる抗原（例えば、上に挙げた抗原の何れか１つ）である。
「免疫複合体」という用語は、別の分子（例えば、カンプトテシン類似体、エキサテカン分子、ＳＮ－３８分子）に複合化された抗原結合剤（例えば、抗体結合ポリペプチド又は抗体）を指す。免疫複合体が治療剤（例えば、カンプトテシン類似体、エキサテカン分子、ＳＮ－３８分子）に複合化された抗体を含む場合、免疫複合体は、「抗体薬物複合体」又は「ＡＤＣ」とも呼ばれ得る。
本明細書で使用される場合、「処置」及び「処置すること」などは、一般に、所望の薬理学的及び生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患、その症状又は状態を予防又は部分的に予防する点で予防的であり得、且つ／又は疾患、状態、症状又は疾患に起因する有害効果の部分的又は完全な治癒の点で治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を網羅し、（ａ）予防的早期無症候性介入など、疾患の素因を有し得るが、依然としてそれを有すると診断されていない対象に疾患が発生するのを防ぐこと；（ｂ）例えば疾患を有すると診断された対象において疾患を阻害すること、例えばその発症を阻止すること；又は疾患を緩和すること、例えば損傷の改善又は修復など、疾患及び／又はその症状又は状態の退行を引き起こすことを含む。任意選択により、処置は、腫瘍量の減少、病変のサイズ及び／又は数の減少、癌の進行の低減又は遅延（例えば、無増悪生存期間の増加）、癌転移の遅延又は予防及び／又は生存率の増加を引き起こし得る（例えば、それを引き起こす方法として特徴付けられ得る）。任意選択により、処置は、対象において、例えば標準的な基準、任意選択によりＲＥＣＩＳＴ基準に従い、安定疾患、部分応答又は完全応答を引き起こすか又はそれを提供し得る（例えば、引き起こすか又は提供する方法として特徴付けられ得る）。
ネクチン－４結合剤（例えば、抗体又は抗体断片）に関して「癌の処置」などが言及されるときには常に、
（ａ）癌の処置方法であって、ネクチン－４結合剤を、（少なくとも１つの処置のために）そのような処置を必要とする個体、哺乳動物、特にヒトに、癌の処置を可能にする用量（治療有効量）、任意選択により本明細書で特定される用量（量）で投与するステップを含む方法；
（ｂ）癌の処置のためのネクチン－４結合剤の使用；
（ｃ）癌（特にヒト）の処置における使用のためのネクチン－４結合剤；
（ｄ）癌の処置のための医薬製剤の製造のためのネクチン－４結合剤の使用；
（ｅ）ネクチン－４結合剤を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、癌の処置のための薬学的調製物の製造のためにネクチン－４結合剤を使用する方法；
（ｆ）癌の処置に適した有効用量のネクチン－４結合剤を含む医薬製剤；
（ｇ）本願が提出された国で特許を取得できる対象物に応じて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）の任意の組み合わせ
が含まれる。
本明細書で使用される「生検」という用語は、診断を確立するためなど、検査目的の組織の除去として定義される。生検の種類の例には、シリンジに取り付けられた針などによる吸引の適用によるもの；組織断片の器械的除去によるもの；内視鏡を介した適切な器具での除去によるもの；病変全体などの外科的切除によるものなどが含まれる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を指す。重鎖における定常ドメインのタイプに依存して、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの１つに割り当てられる。これらの一部は、サブクラス又はアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などにさらに分類される。代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」及び「ミュー」とそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は、周知である。ＩｇＧは、生理学的状況において最も共通する抗体であり、且つ実験室で最も容易に作製されるため、本明細書で使用される抗体の代表的なクラスである。任意選択により、本抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒト又はそうでなければヒトに適切な抗体である。「抗体」には、全長抗体及び本明細書に記載の抗体の何れかの断片又は誘導体が含まれる。
抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基は、「超可変領域」とも呼ばれ得る。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）及び／又は「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）及び９１～９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１－９１７）又は抗原結合に関与する必須アミノ酸を決定するための同様の系からのアミノ酸残基を含む。一般的には、この領域中のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前出に記載の方法により行われる。「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基付番」及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、本明細書では、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対するこの付番系を指す。Ｋａｂａｔ付番系を用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＣＤＲの短縮又はそれへの挿入に対応する少数の又はさらなるアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に１個のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列での抗体の配列の相動性の領域でのアライメントにより、所与の抗体に対して決定され得る。
「特異的に結合する」という語は、単離標的細胞の表面上に存在するタンパク質、その中のエピトープ又はネイティブタンパク質の何れかの組換え形態を用いて評価した場合、抗体が好ましくは競合的結合アッセイにおいて結合パートナー、例えばネクチン－４に結合し得ることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的な結合を決定するための他の方法は、当技術分野で周知である。例えば、結合は、放射性標識、質量分析などの物理的方法又は例えば細胞蛍光分析（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ）を使用して検出される直接的又は間接的な蛍光標識によって検出することができる。対照の非特異的薬剤で見られる量を超える結合は、薬剤が標的に結合することを示す。
抗体が特定のモノクローナル抗体と「競合する」と言われる場合、これは、本抗体が、組換え分子（例えば、ネクチン－４）又は表面発現分子（例えば、ネクチン－４）の何れかを用いた結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が結合アッセイにおいて、配列番号３、７又は９の何れかの重鎖可変領域及び配列番号４、８又は１０のそれぞれの軽鎖可変領域を有する抗体の、ネクチン－４ポリペプチド又はネクチン－４発現細胞への結合を減少させる場合、抗体は、そのような抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
「内在化」という用語は、「細胞内内在化」と互換的に使用され、細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面に分子を移動させるプロセスに関連する分子的、生化学的及び細胞的事象を指す。分子の細胞内内在化に関与するプロセスは、周知であり、とりわけ細胞外分子（ホルモン、抗体、有機小分子など）；膜関連分子（細胞表面受容体など）；細胞外分子に結合した膜結合分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンド又は膜結合分子に結合した抗体）の内在化に関与し得る。したがって、「内在化の誘導及び／又は増加」は、細胞内内在化が開始され、且つ／又は細胞内内在化の速度及び／若しくは程度が増加する事象を含む。
「親和性」という用語は、本明細書で使用される場合、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］（式中、［Ａｂ－Ａｇ］は、抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定められる解離定数Ｋｄにより与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。モノクローナル抗体の親和性を決定するための方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９－６０１（１９８３）で見出すことができ、この参考文献は、全体的に参照により本明細書に組み込まれる。モノクローナル抗体の親和性を決定するための当技術分野で周知のある標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析など）の使用である。
本明細書に関連して、「決定基」はポリペプチド上の相互作用又は結合の部位を指す。
「エピトープ」という用語は、抗原性決定基を指し、抗体が結合する抗原上のエリア又は領域である。タンパク質エピトープは、直接結合に関与するアミノ酸残基並びに特異的な抗原結合抗体又はペプチドにより効果的に阻止されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。これは、例えば抗体又は受容体と組み合わせ得る複合抗原分子上の最も単純な形態又は最小構造領域である。エピトープは、直鎖状又は立体構造／構造であり得る。「直鎖状エピトープ」という用語は、アミノ酸の直鎖状配列（一次構造）上で隣接するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「立体構造又は構造エピトープ」という用語は、全てが隣接しておらず、したがって分子の折り畳みにより互いに対して近接するようになるアミノ酸の直鎖状配列の分離部分を表す（二次、三次及び／又は四次構造）アミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。立体構造エピトープは三次元構造に依存する。したがって、「立体構造」という用語は、「構造」と交換可能に使用されることが多い。
「薬剤」という用語は、本明細書では、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子又は生体物質から作製される抽出物を指すために使用される。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」及び「Ｆｃ領域」という用語は、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０～約ａａ４５０からの、抗体重鎖のＣ末端断片又は他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合、α、δ、ε及びμ）におけるその対応配列又はその天然のアロタイプを指す。別段の指定がない限り、免疫グロブリンに対する一般的に受容されるＫａｂａｔアミノ酸付番は、この開示を通じて使用される（Ｋａｂａｔ ｅｔ． ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい）。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で使用される場合、ＣＤＲとして定められる領域を除く、抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離される近接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）にさらに分けられ得る。
「単離」、「精製」又は「生物学的に純粋」という用語は、実質的に又は基本的に、そのネイティブ状態で見られるような通常それに付随する成分を含まない物質を指す。純度及び均一性は、一般的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析学的化学技術を用いて決定される。標品中に存在する主要な種であるタンパク質は実質的に精製されている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー並びに天然のアミノポリマー及び非天然のアミノポリマーに適用される。
「組換え」という用語は、例えば細胞又は核酸、タンパク質又はベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入又はネイティブ核酸若しくはタンパク質の改変により修飾されているか、又は細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内では見出されない遺伝子を発現するか、又はそうでなければ異常に発現されるか、発現が少ないか又は全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
本明細書に関連して、ポリペプチド又はエピトープに「結合」する抗体という用語は、特異性及び／又は親和性をもって前記決定基に結合する抗体を指す。
「同一性」又は「同一である」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上の一連のアミノ酸残基間の一致数により決定される場合の、ポリペプチド間の配列関連性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）により扱われるギャップアライメント（存在する場合）を用いた２つ以上の配列のより小さいものの間の完全な一致のパーセントを評価する。関連ポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ ＤｅｖｅｒｅｕＸ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられるが限定されない。
同一性を決定するための方法は、試験される配列間の一致が最大となるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．），ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前出）から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用し得る。
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和した（二重結合又は三重結合を含まない）炭化水素基を含む直鎖又は分岐炭化水素鎖を指す。アルキル基は、例えば、１～２０個の炭素原子を有し得る（本明細書に出現するときには常に、「１～２０」などの数値範囲は、所与の範囲内の各整数を指し；例えば、「１～２０個の炭素原子」は、アルキル基が、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などから最大２０個までの炭素原子からなり得ることを意味するが、本定義は、数値範囲が指定されていない「アルキル」という用語の出現もカバーする）。化合物のアルキル基は、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」又は同様の名称で指定することができる。単なる一例として、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」は、アルキル鎖に１～４個の炭素原子があること、すなわちアルキル鎖がメチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル及びｔ－ブチルから選択されることを示す。典型的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル及びヘキシルが含まれるが、決してこれらに限定されない。アルキル基は、置換されていても又はされていなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、１つ以上のヘテロ原子、すなわち１つ以上の炭素原子の代わりに炭素以外の元素（酸素、硫黄、窒素、リンを含むが、これらに限定されない）を含む直鎖又は分岐アルキル基を指す。
基が「置換された」と記載されている場合には常に、その基は、示された置換基の１つ以上で置換されている。置換基が示されていない場合、示される「置換された」基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、チオカルボニル、カルバミル、チオカルバミル、アミド、スルホンアミド、スルホンアミド、カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、アミノ、モノ置換アミノ基及びジ置換アミノ基並びにそれらの保護誘導体から個別に且つ独立して選択される１つ以上の基で置換され得ることを意味する。
置換基の数が指定されていない場合（例えば、ハロアルキル）、１つ以上の置換基が存在し得る。例えば、「ハロアルキル」は、同じ又は異なるハロゲンを１つ以上含み得る。別の例として、「Ｃ１～Ｃ３アルコキシフェニル」は、１つ、２つ又は３つの原子を含む、１つ以上の同じ又は異なるアルコキシ基を含み得る。
特定の番号を有する「化合物」又は「式」への言及（例えば、「化合物１」、「化合物２」、「式Ｉ」又は「式ＩＩ」）は、文脈上明確に別段の指示がない限り、特定の番号を有する化合物又は式由来の全ての化合物を指定する。例えば、化合物１は、化合物１ａ及び１ｂへの言及を含む。
ネクチン－４結合剤
本開示のネクチン－４結合ＡＤＣ組成物を調製するために使用されるネクチン－４結合ドメインは、様々な免疫グロブリン又は非免疫グロブリン足場、例えばブドウ球菌プロテインＡのＺドメインに基づくアフィボディ、操作されたＫｕｎｉｔｚドメイン、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの第１０の細胞外ドメインに基づくモノボディ又はアドネクチン、リポカリン由来のアンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ（操作されたアンキリンリピートドメイン、多量体化ＬＤＬＲ－Ａモジュール、アビマー又はシステインリッチノッチンペプチドの何れかから容易に得ることができる。超可変領域、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、重鎖及び軽鎖可変領域及びそれらを含む抗体、例えば全長抗体又は抗体断片は、細胞、例えば腫瘍細胞の表面に発現するヒトネクチン－４に結合する。ネクチン－４発現腫瘍細胞を排除するための処置に使用される場合、ネクチン－４結合剤は、本明細書に開示される細胞傷害性分子に複合化されると、例えば免疫エフェクター及び／又は腫瘍細胞以外の細胞の非存在下において、ネクチン－４結合ＡＤＣを腫瘍細胞と接触させるアッセイで決定される、ネクチン－４発現腫瘍細胞の死を引き起こすことができる。
一実施形態において、抗ネクチン－４抗原結合タンパク質又は抗体は、成熟ネクチン－４ポリペプチド、例えば配列番号１の残基３２～５１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する。
ある実施形態において、抗ネクチン－４抗原結合タンパク質又は抗体は、ネクチン－４ポリペプチドのＩｇ様Ｖタイプドメインに結合する。例えば、抗原結合タンパク質又は抗体は、配列番号１の残基３２～１４４のアミノ酸配列（以下に配列番号２としても示される）を有するネクチン－４のドメインに結合できる（又はそのドメイン内又は少なくとも部分的にそのドメイン内のエピトープに結合する）ものとして特徴付けることができる。
ＧＥＬＥＴＳＤＶＶＴＶＶＬＧＱＤＡＫＬＰＣＦＹＲＧＤＳＧＥＱＶＧＱＶＡＷＡＲＶＤＡＧＥＧＡＱＥＬＡＬＬＨＳＫＹＧＬＨＶＳＰＡＹＥＧＲＶＥＱＰＰＰＰＲＮＰＬＤＧＳＶＬＬＲＮＡＶＱＡＤＥＧＥＹＥＣＲＶＳＴＦＰＡＧＳＦＱＡＲＬＲＬＲ（配列番号２）
ある実施形態において、抗原結合タンパク質又は抗体は、任意の既知の抗ネクチン－４抗体の超可変領域（例えば、Ｋａｂａｔ付番による重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、２及び３）を含む。ある実施形態において、抗原結合タンパク質又は抗体は、ネクチン－４ポリペプチドへの結合について、抗体ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１などの任意の１つ以上の既知の抗ネクチン－４抗体と競合する。一実施形態では、抗原結合タンパク質又は抗体は、抗体ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１の何れかとしてのネクチン－４ポリペプチドを認識するか、結合するか、又はその実質的に又は本質的に同じであるか、又は同じである、エピトープ又は「エピトープ部位」に対して免疫特異性を有する。
いくつかの実施形態では、抗ネクチン－４抗体は、野生型ネクチン－４ポリペプチドと比較して、抗体ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１の何れかのネクチン－４上の結合部位又はエピトープ内の１、２、３、４個又はそれを超える残基が異なるアミノ酸で置換された突然変異体ヒトネクチン－４ポリペプチドに対して有意に低い結合を示すように選択することができる。
いくつかの実施形態において、抗ネクチン－４抗体は、野生型ネクチン－４ポリペプチドと比較して、Ｉｇ様Ｖタイプドメインを欠く（例えば、ドメインが欠失している）突然変異ヒトネクチン－４ポリペプチドに対して、結合を欠いているか、又は有意に低い結合を示すことによって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、抗ネクチン－４抗体は、野生型ネクチン－４ポリペプチドと比較して、Ｉｇ様Ｖタイプドメイン内の１、２、３、４個又はそれを超える残基が異なるアミノ酸で置換された突然変異体ヒトネクチン－４ポリペプチドに対して有意に低い結合を示すように選択することができる。
いくつかの実施形態では、抗ネクチン－４抗体は、野生型ネクチン－４ポリペプチドと比較して、Ｉｇ様Ｖタイプドメイン（又はその一部）が存在しないか、異なるポリペプチド又は異なるドメイン（例えば、非ヒト又は非霊長類ネクチン－４ポリペプチド、非ネクチン－４ポリペプチド、非Ｉｇ様Ｖタイプドメイン）からのアミノ酸配列で置換された突然変異体ヒトネクチン－４ポリペプチドに対して有意に低い結合を示すものとして選択又は特徴付けることができる。
ネクチン－４突然変異体で遺伝子移入された細胞への抗ネクチン－４抗体の結合を測定し、抗ネクチン－４剤が野生型ネクチン－４ポリペプチド（例えば、配列番号１）に結合する能力と比較することができる。抗ネクチン－４剤と突然変異体ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合の減少は、結合親和性の低下（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験などの公知の方法又は突然変異体ポリペプチドへの結合のＢｉａｃｏｒｅ試験によって測定される）及び／又は抗ネクチン－４剤の全結合能力の低下（例えば、抗ネクチン－４剤濃度対ポリペプチド濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少によって証明される）があることを意味する。結合の有意な減少は、抗ネクチン－４剤がネクチン－４に結合している場合、突然変異した残基が、抗ネクチン－４剤への結合に直接関与するか、又は結合タンパク質に近接していることを示す。
いくつかの実施形態では、結合の有意な減少は、抗ネクチン－４抗体と突然変異ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合親和性及び／又は能力が、抗体と野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超又は９５％超減少することを意味する。特定の実施形態では、結合は検出可能限界以下に減少される。いくつかの実施形態において、抗ネクチン－４抗体の突然変異ネクチン－４ポリペプチドへの結合が、抗ネクチン－４抗体と野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間に観察される結合の５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％未満）である場合、結合の有意な減少が証明される。
いくつかの実施形態では、抗ネクチン－４抗体は、野生型ネクチン－４ポリペプチド（例えば、配列番号１の配列を含む）における残基３２～１４４に対応するセグメント中の残基（又はその部分配列、任意選択により、少なくとも４、５、６、１０、２０又は４０残基の部分配列）が欠けている（例えば、欠失しているか、又は別のアミノ酸で置換されている）、突然変異体ネクチン－４ポリペプチドに対して有意に低い結合を示す（例えば、結合の喪失を示す）。
抗体は、当技術分野で公知の様々な技術により作製し得る。一般的には、これらは、ネクチン－４ポリペプチド、好ましくはヒトネクチン－４ポリペプチドを含む免疫原での非ヒト動物、好ましくはマウスの免疫付与によって作製される。ネクチン－４ポリペプチドは、ヒトネクチン－４ポリペプチドの全長配列又はその断片若しくは誘導体、一般的には免疫原性断片、すなわちネクチン－４ポリペプチドを発現する細胞の表面に露出したエピトープ、例えばＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１抗体によって認識されるエピトープを含む、ポリペプチドの部分を含み得る。このような断片は、一般的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７連続アミノ酸、さらにより好ましくはその少なくとも約１０連続アミノ酸を含有する。断片は、一般的には、基本的に受容体の細胞外ドメイン由来である。ある実施形態において、免疫原は、脂質膜中、一般的には細胞の表面の、野生型ヒトネクチン－４ポリペプチドを含む。具体的な実施形態において、免疫原は、任意選択により処理されるか又は溶解されるインタクトな細胞、特にインタクトなヒト細胞を含む。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは組換えネクチン－４ポリペプチドである。特定の実施形態において、免疫原は、インタクトなネクチン－４発現細胞を含む。
非ヒト哺乳動物に抗原で免疫付与するステップは、マウスにおいて抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の任意の方式で行われ得る（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。
抗体は、例えば（その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４）に開示されるような免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリの選択によっても作製され得る。
ネクチン－４への結合についてモノクローナル抗体ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１と競合する１つ以上の抗体の同定は、抗体競合が評価され得る様々な免疫学的スクリーニングアッセイの何れか１つを用いて容易に決定し得る。多くのこのようなアッセイは、日常的に実施され、当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６６０，８２７号明細書を参照されたい）。
例えば、調べようとする試験抗体は、異なるソースの動物から得られるか、又は異なるＩｇアイソタイプのものでもあり、対照（例えば、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１）及び試験抗体を混合し（又は予め吸着させ）、ネクチン－４ポリペプチドを含有する試料に適用する、単純な競合アッセイを使用し得る。ウエスタンブロッティング及び表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））分析の使用に基づくプロトコルは、このような競合実験での使用に適切である。
特定の実施形態において、ネクチン－４抗原試料に適用する前のある時間、対照抗体（例えば、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１）を様々な量の試験抗体（例えば、約１：１０又は約１：１００）と予め混合する。他の実施形態において、対照及び様々な量の試験抗体をネクチン－４抗原試料への曝露中に単純に混合し得る。（例えば未結合抗体を排除するための分離又は洗浄技術を使用することによって）遊離抗体から結合抗体を、（例えば種特異的な又はアイソタイプ特異的な二次抗体を使用するか、又は検出可能標識でＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１を特異的に標識することにより）試験抗体からＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１を区別し得る限り、試験抗体がＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１の抗原への結合を減少させるか否かを判定し得る。完全に無関係な抗体の非存在下での（標識化）対照抗体の結合は、対照高値となり得る。対照低値は、標識化（ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１）抗体を完全に同じタイプの（ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１）非標識抗体と温置することによって得られ得、ここで競合が起こり、標識抗体の結合を減少させる。試験抗体は、例えば、約１：１０～約１：１００のＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１：試験抗体の任意の比率でのＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１のネクチン－４抗原への結合を少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％又はより好ましくは少なくとも約８０％又は９０％（例えば、約６５～１００％）低減し得る。任意選択により、そのような試験抗体は、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１のネクチン－４抗原への結合を少なくとも約９０％（例えば、約９５％）低下させる。
例えば、フローサイトメトリー試験により競合を評価することもできる。このような試験において、ネクチン－４ポリペプチドを保有する細胞を最初に例えばＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１と温置し、次いで蛍光色素又はビオチンで標識される試験抗体と温置し得る。本抗体は、飽和量のＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１との予備温置時に得られる結合が、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１との予備温置を行わずに抗体により得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％又は１０％）（蛍光手段により測定される場合）である場合、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１と競合すると言われる。代わりに、抗体は、飽和量の試験抗体と予備温置される細胞上で（蛍光色素又はビオチンにより）標識化ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１抗体と共に得られる結合が、試験抗体との予備温置を行わずに得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％又はそれ未満（例えば約３０％、２０％又は１０％）である場合、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１と競合すると言われる。
試験抗体が予め吸着され、ネクチン－４抗原が固定化される表面に飽和濃度で適用される単純な競合アッセイも使用し得る。単純競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（商標）チップ（又は表面プラズモン共鳴分析に適切な他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１）をネクチン－４飽和濃度で表面と接触させ、ネクチン－４及び対照抗体の表面結合を測定する。対照抗体のこの結合を試験抗体の非存在下でのネクチン－４含有面への対照抗体の結合と比較する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での対照抗体によるネクチン－４含有面の結合の顕著な減少は、試験抗体が対照抗体と実質的に同じネクチン－４上の領域を認識し、試験抗体が対照抗体と「交差反応」するようになることを示す。試験抗体は、例えば、対照（ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１など）抗体のネクチン－４抗原への結合を少なくとも約３０％以上、好ましくは約４０％減少させ得る。任意選択により、このような試験抗体は、少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、少なくとも約７０％又はそれを超える）だけネクチン－４抗原への対照抗体（例えば、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１）の結合を減少させる。当然のことながら、対照及び試験抗体の順序は逆転し得、すなわち対照抗体を最初に表面に結合させ得、試験抗体をその後に競合アッセイにおいて表面と接触させる。好ましくは、ネクチン－４抗原に対してより高い親和性を有する抗体は、（抗体が交差反応することが推測される）第２の抗体に対して見られる結合の減少がより大きい規模であると予想されるため、最初に表面に結合させる。このようなアッセイのさらなる例は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＳａｕｎａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：３３－４１で提供される。
抗体は、ネクチン－４陽性腫瘍細胞によって特徴付けられる癌を有する個体、すなわち抗ネクチン－４抗体を使用する本明細書に記載の方法の１つによる処置の候補である個体由来のネクチン－４発現腫瘍細胞に結合する。したがって、細胞上のネクチン－４を特異的に認識する抗体が得られると、任意選択によりネクチン－４陽性細胞（例えば、癌細胞）に結合する能力について試験することができる。これは、任意選択により、ネクチン－４ポリペプチドをその表面に高レベルで発現する腫瘍細胞及び／又はその表面に低レベルで発現する腫瘍細胞に結合するその能力について試験することができる。特に、本抗体の１つで患者を処置する前に、例えば血液試料又は腫瘍生検中の、患者から採取した悪性細胞に結合する抗体の能力を任意選択により試験して、処置が患者に有益になる可能性を最大化することができる。
一実施形態において、抗体は、ネクチン－４発現細胞、例えば悪性細胞に結合する能力を試験するイムノアッセイで検証される。例えば、血液試料又は腫瘍生検が実施され、腫瘍細胞が収集される。次いで、所与の抗体が細胞に結合する能力を、当業者に周知の標準的な方法を使用して評価する。抗体の細胞への結合を評価するために、抗体を直接的又は間接的に標識することができる。間接的に標識される場合、典型的には、二次標識抗体が添加される。
抗体がエピトープ領域内で結合するか否かの判定は、当業者にとって公知のように行い得る。このようなマッピング／特徴評価方法の一例として、抗ネクチン－４抗体に対するエピトープ領域は、ネクチン－４タンパク質における露出アミン／カルボキシルの化学修飾を用いて、エピトープ「フットプリンティング」により決定され得る。このようなフットプリンティング技術のある具体例は、ＨＸＭＳ（質量分析により検出される水素－重水素交換）の使用であり、ここで受容体及びリガンドタンパク質アミドプロトンの水素／重水素交換、結合及び逆交換が起こり、タンパク質結合に加わる骨格アミド基は、逆交換から保護され、したがって重水素化されたままとなる。関連領域は、この点でペプシンのタンパク質分解、ファストマイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離及び／又はエレクトロスプレーイオン化質量分析により同定され得る。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ Ｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７（２）ｐｐ．２５２－２５９（１９９９）Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。適切なエピトープ同定技術の別の例は核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、一般的には遊離抗原及び抗体などの抗原結合ペプチドと複合体形成する抗原の二次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。抗原は、一般的には、１５Ｎで選択的に同位体標識され、抗原に対応するシグナルのみがＮＭＲ－スペクトルで見られ、抗原結合ペプチドからのシグナルが見られないようになる。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸由来の抗原シグナルは、一般に、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルにおいて位置をシフトさせ、結合に関与するアミノ酸はそのように同定され得る。例えばＥｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４；（４４）：１４９－６７；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８１（１）ｐｐ．６１－６７（１９９８）；及びＳａｉｔｏ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６ Ｊｕｎ；９（３）：５１６－２４を参照されたい。
エピトープマッピング／特徴評価は質量分析方法を用いて行うこともできる。例えば、Ｄｏｗｎａｒｄ，Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００ Ａｐｒ；３５（４）：４９３－５０３及びＫｉｓｅｌａｒ ａｎｄ Ｄｏｗｎａｒｄ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｍａｙ １；７１（９）：１７９２－１８０１を参照されたい。プロテアーゼ消化技術もエピトープマッピング及び同定との関連で有用であり得る。抗原性決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化により、例えばネクチン－４に対して約１：５０の比率でトリプシンを使用することによってｐＨ７～８でｏ／ｎ消化を使用することにより、続いてペプチド同定のために質量分析（ＭＳ）を行うことにより決定し得る。続いて、抗ネクチン－４結合物によりトリプシン切断から保護されるペプチドは、トリプシン消化に供した試料及び抗体と温置し、続いて例えばトリプシン（それにより結合物に対するフットプリントが明らかになる）による消化に供した試料の比較により同定し得る。キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素も又は代替的に同様のエピトープ特徴評価方法で使用し得る。さらに、酵素性消化により、可能性のある抗原性決定基配列が表面に露出していない、したがっておそらく免疫原性／抗原性について関連がないと思われるネクチン－４ポリペプチドの領域内にあるか否かを分析するための迅速な方法が提供され得る。
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープを明らかにするのに有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内の各残基をアラニン残基で置き換え、結合親和性に対する結果を測定する。突然変異が結合親和性の顕著な低下につながる場合、結合に関与する可能性が高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち折り畳まれていないタンパク質に結合しない抗体）を使用して、アラニン置換がタンパク質の全体的な折り畳みに影響しないことを確認し得る。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５；２６７：３８３－３８６；及びＷｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：１－６を参照されたい。
エピトープ「フットプリンティング」のために電子顕微鏡も使用し得る。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５５：２７５－２７８は、低温電子顕微鏡、三次元画像再構成及びＸ結晶学の同時適用を使用して、ネイティブササゲモザイクウイルスのキャプシド表面上のＦａｂ断片の物理学的フットプリントを決定した。
エピトープ評価のための「標識不含」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））及び反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Ｆａｅｇｅｒｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １９９０；３：２０８－１４；Ｎｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３；６４６：１５９－１６８；Ｌｅｉｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８；３７：３３０８－３３１１；Ｋｒｏｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２００２；１７：９３７－９４４を参照されたい。
抗体と同じであるか又は実質的に同じであるエピトープへの抗体結合が本明細書に記載の代表的な競合アッセイの１つ以上で同定され得ることにも留意すべきである。
脊椎動物又は細胞における抗体の免疫化及び産生時又は候補抗体若しくはアミノ酸配列のライブラリーの生成時に（例えば、ファージディスプレイ技術による）、抗体若しくは非抗体ペプチド又はタンパク質足場を単離するために特定の選択ステップが実施され得る。これに関し、特定の実施形態において、（ａ）ネクチン－４ポリペプチドを含む免疫原で非ヒト哺乳動物を免疫すること又は抗体若しくはポリペプチド配列のライブラリーを調製すること；及び（ｂ）前記免疫動物又は前記抗体若しくは配列のライブラリーから抗体を調製すること；及び（ｃ）ネクチン－４に結合することができるステップ（ｂ）からの抗体を選択すること、任意選択により、ネクチン－４のＩｇ様Ｖセットドメインに結合することができるステップ（ｂ）からの抗体を選択することを含む、そのような抗体を産生する方法が提供される。
ある態様において、抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析など）によって決定されるように、ヒトネクチン－４に関して１×１０－８Ｍ以下、任意選択により、１×１０－９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有することができる。より特定の例示的な態様において、ネクチン－４について、約１×１０－８Ｍ～約１×１０－１０Ｍ又は約１×１０－９Ｍ～約１×１０－１１ＭのＫＤを有する抗ネクチン－４抗体が提供される。
実施形態の何れかのある態様において、本方法に従って調製される抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、抗体を産生するために使用される非ヒト動物は、げっ歯類、ウシ、ブタ、家禽、ウマ、ウサギ、ヤギ又はヒツジなどの哺乳動物である。本発明の抗体は、任意選択により、抗体ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２若しくはＮ４１の何れか又はその誘導体の何れか以外の抗体、例えばそれらのそれぞれの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は抗原結合領域の全体又は一部を含む抗体であると特定することができる。
ネクチン－４ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、発現ベクター中に置き、次いで、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るために、これを、そのままでは免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に遺伝子移入する。本明細書の他の箇所に記載されるように、多数の目的の何れかのために、例えば抗体をヒト化する断片若しくは誘導体を作製するか、又は例えば抗体の結合特異性を最適化するために抗原結合部位において抗体の配列を修飾するためにこのようなＤＮＡ配列を修飾し得る。ある実施形態において、抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードする単離された核酸配列並びに（例えば、そのゲノム中に）そのような核酸を含む組換え宿主細胞が提供される。
任意の実施形態において、抗ネクチン－４結合タンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）は、腫瘍細胞によって発現されるネクチン－４の細胞内内在化を誘導するその能力について評価することができる。例えば、本明細書の実施例に記載のＦａｂ－Ｚａｐアッセイは、ネクチン－４発現細胞（例えば、腫瘍細胞）における内在化を評価する簡便な方法として使用することができる。本明細書の任意の実施形態において、抗ネクチン－４結合タンパク質、抗体若しくは抗体断片又はそのような抗体若しくは断片を含む抗体－薬物複合体は、腫瘍細胞の表面のネクチン－４に結合すると、細胞内内在化を起こすことができるとして特徴付けられる。
ある態様において、抗ネクチン－４抗体は、本明細書に記載の例示的な抗体の何れかの機能保存的変異体である抗体であり、例えば、配列番号３の重鎖可変領域及び配列番号４の軽鎖可変領域を有する抗体（ＡＳＧ－２２ＭＥ）の機能保存的変異体、配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号８の軽鎖可変領域を有する抗体（１４Ａ５．２）の機能保存的変異体又は配列番号９の重鎖可変領域及び配列番号１０の軽鎖可変領域を有する抗体（Ｎ４１）の機能保存的変異体である。「機能保存的変異体」は、タンパク質（例えば、抗体又は抗体フラグメント）中の所与のアミノ酸残基が、類似の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するものによるアミノ酸の置換を含むがそれに限定されない、ポリペプチドの全体的な立体構造及び機能を改変することなく、変更されたものである。保存されていると示されているもの以外のアミノ酸は、タンパク質内で異なり得、同様の機能を有する任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列の類似性パーセントは変動し得、例えば、クラスター法などのアラインメントスキームに従って決定される場合、７０％～９９％であり得る（類似度はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく）。「機能保存的変異体」には、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドも含まれ、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％であり、これは、それが比較される天然、参照又は親タンパク質と同じ又は実質的に類似の特性又は機能を有する。
本開示よる使用のためのＡＤＣを調製するために使用することができる例示的な抗ネクチン－４ ＶＨ及びＶＬ対は、エンホルツマブベドチンで使用される抗体成分であるＡＳＧ－２２ＭＥのＶＨ及びＶＬ（又は超可変領域のアミノ酸残基）、以下に列挙される重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）及び以下に列挙される軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４）を使用することにより、エンホルツマブ抗体（又はＡＳＧ－２２ＭＥ）から得ることができる。Ｋａｂａｔ付番によるＣＤＲには、配列番号３及び４で下線が引かれている。米国特許第８，６３７，６４２号明細書及び国際公開第２０１２／０４７７２４号パンフレットも参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。任意選択により、ＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、組み込むように改変される）。ある実施形態において、本開示による使用のための抗ネクチン－４抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番による）を含む。ある実施形態において、抗ネクチン－４抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番による）を含む。
ＡＳＧ－２２ＭＥ（エンホルツマブ）ＶＨ：
Figure 2023512036000008
ＡＳＧ－２２ＭＥ（エンホルツマブ）ＶＬ：
Figure 2023512036000009
エンホルツマブ又はＡＳＧ－２２ＣＥ／ＡＳＧ－２２ＭＥの全長重鎖及び軽鎖は、配列番号５及び６に示されている。ある実施形態において、抗ネクチン－４抗体は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。
ＡＳＧ－２２ＣＥ／ＡＳＧ－２２ＭＥ（エンホルツマブ）全長重鎖：
Figure 2023512036000010
ＡＳＧ－２２ＣＥ／ＡＳＧ－２２ＭＥ（エンホルツマブ）全長軽鎖：
Figure 2023512036000011
本開示よる使用のためのＡＤＣを調製するために使用することができる別の例示的な抗ネクチン－４ ＶＨ及びＶＬ対は、抗体１４Ａ５．２、以下に列挙される重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）及び以下に列挙される軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）に由来し得る。Ｋａｂａｔ付番によるＣＤＲには、配列番号７及び８で下線が引かれている。抗体配列は、国際公開第２０１８／１５８３９８号パンフレットにも開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。任意選択により、ＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、組み込むように改変される）。ある実施形態において、本開示による使用のための抗ネクチン－４抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番による）を含む。ある実施形態において、抗ネクチン－４抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番による）を含む。
１４Ａ５．２ ＶＨ：
Figure 2023512036000012
１４Ａ５．２ ＶＬ：
Figure 2023512036000013
本開示よる使用のためのＡＤＣを調製するために使用することができる別の例示的な抗ネクチン－４ ＶＨ及びＶＬ対は、抗体Ｎ４１、以下に列挙される重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号９）及び以下に列挙される軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）から得ることができる。Ｋａｂａｔ付番によるＣＤＲには、配列番号９及び１０で下線が引かれている。抗体のＶＨ、ＶＬ及びそれぞれのＣＤＲ配列は、国際公開第２０１７／０４２２１０号パンフレットにも開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。任意選択により、ＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、組み込むように改変される）。ある実施形態において、本開示による使用のための抗ネクチン－４抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番による）を含む。ある実施形態において、抗ネクチン－４抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番による）を含む。
Ｎ４１ ＶＨ：
Figure 2023512036000014
Ｎ４１ ＶＬ：
Figure 2023512036000015
抗体の断片及び誘導体（別段の指定がない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本願で使用される場合の１つ又は複数の「抗体」という用語に包含される）は、当技術分野で公知の技術により作製し得る。「断片」は、インタクト抗体の一部分、一般的には抗原結合部位又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；（１）１本鎖Ｆｖ分子、（２）会合する重鎖分子がなく、軽鎖可変ドメインを１つのみ含有する１本鎖ポリペプチド又は軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するそれらの断片、及び（３）会合する軽鎖分子がなく、重鎖可変領域を１つのみ含有する１本鎖ポリペプチド又は重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片を含むが限定されない、近接アミノ酸残基の１つの連続した配列からなる一次構造を有するポリペプチド（本明細書で「１本鎖抗体断片」又は「１本鎖ポリペプチド」と呼ぶ）である何らかの抗体断片；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。とりわけ、ナノボディ、ドメイン抗体、単ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」が挙げられる。
ある実施形態では、抗体は、ヒト化される。抗体の「ヒト化」型は、マウス免疫グロブリン由来の最小配列を含有する特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。殆どの部分に対して、ヒト化抗体は、オリジナル抗体の所望の特異性、親和性及び能力を維持しながら、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基がオリジナル抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は移入されたＣＤＲ若しくはフレームワーク配列の何れでも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに高め、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てがオリジナル抗体のものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、通常はヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；及び米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。
ヒト化抗体を作製することにおいて使用しようとするヒト可変ドメイン、軽鎖及び重鎖の両方の選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」方法に従い、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対して抗体の可変ドメインの配列をスクリーニングする。次に、マウスのものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容される（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，ｐｐ．２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．１９６，１９８７，ｐｐ．９０１）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列からの特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体のために同じフレームワークを使用し得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８９，ｐｐ．４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，ｐ．２６２３（１９９３））。
抗体がネクチン－４に対する高親和性及び他の有利な生物学的特性を保有してヒト化されることは、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従い、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析の過程によってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性が高い三次元構造を例示し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンのその抗原への結合能に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基を選択し、コンセンサス及び輸入配列から組み合わせ得、標的抗原に対する親和性向上などの所望の抗体特性が達成されるようになる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的に且つ最も実質的に関与する。一例において、ヒト化抗体鎖のＦＲは、非ヒトドナー（例えば、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１抗体）の可変領域と少なくとも約６０％の全配列同一性、好ましくは少なくとも約７０％、７５％又は８０％の全配列同一性を有するヒト可変領域に由来する。任意選択により、ヒト化重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、非ヒトドナー（例えば、ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１抗体）のそれぞれの重鎖及び／又は可変領域と少なくとも約６０％、７０％又は８０％の全配列同一性を共有する。「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫付与のために使用されるマウスとして、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子により置換されているマウス宿主である。したがって、このマウスにより、又はこのマウスのＢ細胞から作製されるハイブリドーマにおいて産生される抗体は既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。ヒト抗体は、免疫付与のためにヒト抗体レパートリーを発現するように操作されている他のトランスジェニック動物を使用することによる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）か又はファージディスプレイ法を用いた抗体レパートリーの選択によるなど、様々な他の技術によっても作製され得る。このような技術は、当業者にとって公知であり、本願で開示されるようにモノクローナル抗体から出発して実行され得る。
有利には、本開示のカンプトテシン類似体含有リンカーは、複合化された抗原結合剤（例えば、ペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗体断片）を調製するための過程で使用することができ、抗原結合剤－薬物複合体、例えば抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を得ることができる。１つの実施形態において、抗原結合剤複合体を調製するための過程は、カンプトテシン類似体（Ｚ）を抗原結合剤に複合化することを含む。ある実施形態において、カンプトテシン類似体（Ｚ）は、リンカー（Ｘ）を介して抗原結合剤に複合化されていると特定することができる。Ｘは、抗体（Ａｂ）及びカンプトテシン類似体（Ｚ）などの抗原結合剤を結合するリンカーであり、例えば、複合化時、Ｘは、Ａｂ及びＺの一方又は両方への共有結合に続くリンカーの残基である。
本明細書の実施形態において、抗体－薬物複合体を調製する過程は、抗体（Ａｂ）などの抗原結合剤をカンプトテシン類似体（Ｚ）と接触及び／又は反応させるステップを含む。接触は、本開示の一態様の抗原結合剤薬物複合体が形成又は取得されるのに適した条件下で実施することができる。Ｚは、例えば、カンプトテシン類似体（Ｚ）及びリンカー（Ｘ）又はリンカー（Ｘ）の一部を含む化合物に含まれ得、ステップは、抗原結合剤を、カンプトテシン類似体（Ｚ）及びリンカー（Ｘ）又はリンカー（Ｘ）の一部を含む化合物と接触させることを含む。過程は、任意選択により、形成された抗原結合剤薬物複合体を単離又は回収するステップ及び任意選択により薬剤として使用するために組成物をさらに処理するステップ、任意選択により、ヒト対象への投与のために前記抗原結合剤複合体を（例えば、薬学的賦形剤と共に）製剤化するステップを指定できる。
任意選択により、ＡＤＣを作製する方法は、抗体Ａｂ）を２、３、４、５、６、７又は８分子のカンプトテシン類似体に複合化することを含む。任意選択により、得られる組成物は、２～４、４～６、６～８のＤＡＲによって特徴付けられる。任意選択により、方法は、抗体を４分子のカンプトテシン類似体に複合化することを含む。任意選択により、方法は、ＤＡＲを評価すること、ＤＡＲが所定の仕様（例えば、本明細書に開示されるＤＡＲ又はＤＡＲ範囲、約２、４、６又は８のＤＡＲなど）に対応する場合、薬剤として使用するために組成物をさらに処理すること、任意選択により、ヒト対象への投与のために前記抗体を（例えば、薬学的賦形剤と共に）製剤化することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、リンカー（Ｘ）－（Ｚ）要素は、（Ｘ）及び（Ｚ）を含む化合物を（Ａｂ）と接触（及び反応）させ、それにより薬物複合体を形成する前に、調製及び単離される。
いくつかの実施形態において、方法は、
（ａ）リンカー（Ｘ）又はリンカー（Ｘ）の一部を（Ａｂ）と接触及び／又は反応させて、Ａｂ－Ｘ複合体を形成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）のＡｂ－Ｘを、カンプトテシン類似体（Ｚ）又はリンカー（Ｘ）及び（Ｚ）の第２の部分を含む化合物と接触及び／又は反応させ、それにより抗体薬物複合体を形成することと
を含む。
Ｘは、例えば、生理学的条件下、任意選択により細胞内条件下において切断可能な部分を含む分子を表すことができる。ある実施形態において、Ｘは、（ｉ）スペーサー（Ｙ）、（ｉｉ）切断可能部分、及び（ｉｉｉ）任意の自己脱離又は非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）を含む分子を表す。切断可能部分は、例えば、オリゴペプチド（例えば、ジ、トリ、テトラ又はペンタペプチド）であり得る。スペーサーＹは、Ａｂと切断可能部分との間に配置することができ、スペーサー系（Ｙ’）は、切断可能部分とＺとの間に配置することができる。
いくつかの実施形態において、リンカーＸ又はスペーサーＹは、任意選択により、抗体のアミノ酸又は抗体のアミノ酸に結合する相補的な反応基（Ｒ’）と（例えば、適切な条件下において、任意選択により脱保護後に）反応することができる反応基（Ｒ）を含むものとして特定することができる。任意選択により、Ｒは、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基と反応する基である。
いくつかの実施形態において、リンカーＸ又はスペーサーＹは、任意選択により、反応基Ｒと抗体のアミノ酸又は抗体のアミノ酸に結合する相補的な反応基（Ｒ’）との反応物の残基を含むものとして特定することができる。任意選択により、Ｒは、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基と反応する基と、前記遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基との反応物の残基である。
任意の実施形態において、抗体又は抗体断片を化合物（例えば、リンカー及び／又はカンプトテシン類似体）と接触及び／又は反応させるステップの前に、方法は、抗体又は抗体断片を調製、選択又は提供するステップを含む。ある実施形態において、ステップは、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片を調製、選択又は提供することと、抗体又は抗体断片が本明細書に開示される抗ネクチン－４抗体又は抗体断片の特徴を有するかを決定又は試験することとを含む。
例えば、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片は、ネクチン－４又はネクチン－４のＶドメインに結合する能力について試験することができる。次いで、ネクチン－４（又はＶドメイン）に結合することが決定された抗体又は抗体断片を、化合物（例えば、リンカー（Ｘ）及び／又はカンプトテシン類似体（Ｚ））と接触及び／又は反応させる。例えば、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片は、突然変異体ネクチン－４ポリペプチド（例えば、Ｉｇ様Ｖセットドメインを欠く突然変異体ネクチン－４ポリペプチド）に結合する能力について試験することができる。次いで、突然変異ネクチン－４ポリペプチドへの結合の減少又は喪失を有する（例えば、野生型ネクチン－４ポリペプチドへの結合と比較して）ことが決定された抗体又は抗体断片を、化合物（例えば、リンカー（Ｘ）及び／又はカンプトテシン類似体（Ｚ））と接触及び／又は反応させる。
本明細書でさらに説明されるように、細胞傷害剤を抗体に複合化するためのいくつかの周知の方法は、抗体が最初にリンカー又はリンカーの一部で改変され、その後、細胞傷害剤が抗体－リンカー組成物に複合化される反応が続く、複数の反応ステップを含む。
ある実施形態において、
（ｉ）抗原結合剤（例えば、ペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗体断片（例えば、ネクチン－４に結合するもの））を、（ａ）薬剤のアミノ酸（例えば、アミノ酸の側鎖若しくはグリカン又はアミノ酸若しくはアミノ酸のグリカンに結合した基）と反応することができる第１の反応基、及び（ｂ）第２の反応基（Ｒ’）を含む化合物（Ｌ）と接触させて、化合物（Ｌ）で機能化された１つ以上のアミノ酸を含む改変された薬剤を得ることと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の改変剤を、（ａ）反応基（Ｒ’）に相補的な反応基（Ｒ）、（ｂ）細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるアミノ酸単位（例えば、ジ、トリ、テトラ又はペンタペプチド）、（ｃ）任意選択により、非自壊性又は自壊性スペーサー（Ｙ’）、及び（ｄ）細胞傷害剤（Ｚ）を含む化合物と反応させることと
を含む、抗原結合剤－薬物複合体を調製するための過程が提供される。任意選択により、ステップ（ｉｉ）の化合物は、Ｒとアミノ酸単位との間に配置されたスペーサー（Ｙ）をさらに含む。
一実施形態において、Ｒ及びＲ’は、クリック反応又は付加環化を起こすことができ、任意選択により、Ｒはアルキン部分を含むか又はアルキン部分であり、Ｒ’はアジド部分を含むか若しくはアジド部分であるか、又はＲ’はアルキン部分を含むか又はアルキン部分であり、Ｒはアジド部分を含むか若しくはアジド部分であり、ステップ（ｉｉ）の反応は、１，３－双極性付加環化である。
ある実施形態において、ステップ（ｉ）の反応は、触媒の存在下で実施され、任意選択により、触媒は酵素（例えば、トランスグルタミナーゼ）である。
ある実施形態において、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片を化合物（Ｌ）と接触させる前に、ステップ（ｉ）は、抗ネクチン－４抗体又は抗体断片を改変するステップを含む。例えば、抗体又は抗体断片は、抗体のグリコシル化を（例えば、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７で）改変できる酵素と反応又は接触させることによって改変することができる。一例において、改変は、コアＮ－アセチルグルコサミン置換基を含む抗体を得るために、エンドグリコシダーゼの存在下において、コアＮ－アセチルグルコサミンを有する抗体グリカンの脱グリコシル化を含み、前記コアＮ－アセチルグルコサミン及び前記コアＮ－アセチルグルコサミン置換基は、任意選択によりフコシル化されている。エンドグリコシダーゼの例としては、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＥ、ＥｆＥｎｄｏ１８Ａ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＴ及びＥｎｄｏＳＨ及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。
抗原結合タンパク質（例えば、抗体）分子とカンプトテシン類似体分子は、リンカーによって結合される。そのような実施形態において、免疫複合体は、例えば、式（ＩＩ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
（式中、
Ａｂは、抗ネクチン４抗原結合タンパク質（例えば、抗体）であり；
Ｘは、Ａｂ及びＺを連結するリンカー、例えばＡｂ及びＺの一方又は両方への共有結合に続くリンカーの残基であり；
Ｚは、カンプトテシン類似体であり、任意選択により、Ｚは、化合物１又は２（エキサテカン又はＳＮ－３８分子）の構造を含み；
ｎは、１又は２であり；及び
ｎが１である場合、ｍは、１～８の何れかであるか、又は任意選択により、ｍは、１～８又は１～６から選択される整数であり、任意選択により、ｍは、１～４から選択される整数であり、任意選択により、ｍは、２又は４であり、任意選択により、ｍは、２、３、４、５、６、７又は８であり；ｎが２である場合、ｍは、１～４の何れかであるか、又は任意選択により、ｍは、１～４又は１～３から選択される整数であり、任意選択により、ｍは、１～４から選択される整数であり、任意選択により、ｍは、２又は４であり、任意選択により、ｍは、１、２、４又は４である）
によって表すことができる。任意選択により、「ｎ」を指定して、分岐又は重合の程度を表すことができる。「ｎ」及び「ｍ」は、複数の抗体を含む組成物における平均を表すように特定することができる。
ある実施形態において、Ｘは、例えば、生理学的条件下、任意選択により細胞内条件下において切断可能な部分を含む分子を表すことができる。ある実施形態において、Ｘは、（ｉ）スペーサー（Ｙ）、（ｉｉ）切断可能部分、及び（ｉｉｉ）任意の自己脱離又は非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）を含む分子を表す。スペーサーＹは、Ａｂと切断可能部分との間に配置することができ、スペーサー系（Ｙ’）は、切断可能部分とＺとの間に配置することができる。分子Ｘ又はスペーサーＹは、任意選択により、反応基（Ｒ）又は反応基Ｒと抗体のアミノ酸又は抗体のアミノ酸に結合する相補的な反応基（Ｒ’）との反応物の残基を含むものとして特定することができる。
変数ｍは、免疫複合体の１抗体分子あたりの－Ｘ－（Ｚ）ｎ部分の数を表す。複数の抗ネクチン－４ ＡＤＣを含む組成物では、１抗体分子あたりの－Ｘ－Ｚ部分の数「ｍ」は変化し得る。したがって、本明細書の式の複数の免疫複合体を含む例示的な組成物において、ｍは、１つのＡｂあたりの－Ｘ－（Ｚ）ｎ部分の平均数であり、この場合、ｍは、平均薬物負荷又は薬物：抗体比（ＤＡＲ）とも呼ばれる。平均薬物負荷又はＤＡＲは、有利には、１つのＡｂあたり１～約８（－Ｘ－（Ｚ）ｎ）部分の範囲であり得る。部分Ｘに結合したＺ部分の数「ｎ」は、例えば、１又は２であり得る。典型的には、ｎは、１である。いくつかの実施形態において、ｎは、１であり、ｍは、平均薬物負荷を表し、ｍは、２～８である。いくつかの実施形態において、ｎは、１であり、ｍは、平均薬物負荷を表し、ｍは、２～６である。いくつかの実施形態において、ｎは、１であり、ｍは、平均薬物負荷を表し、ｍは、４～８である。いくつかの実施形態において、ｎは、１であり、ｍは、平均薬物負荷を表し、ｍは、６～８、任意選択により約６、７又は８である。いくつかの実施形態において、ｎは、１であり、ｍは、平均薬物負荷を表し、ｍは、４～６、任意選択により約４、５又は６である。
１つのＡｂあたりの（－Ｘ－Ｚ）部分の数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ及びＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けられ得る。ｍに関する免疫複合体の量的分布も決定され得る。場合により、ｍが特定の値である均一な免疫複合体の分離、精製及び特徴付けは、他の薬物負荷を有する免疫複合体とは区別され、逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動などの手段によって達成され得る。
ある実施形態において、本開示の処置方法で使用される抗ネクチン－４組成物は、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
（式中、
Ａｂは、抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）であり；
Ｘは、Ａｂ及びＺを連結する分子、例えばＡｂ及びＺの一方又は両方への共有結合に続くリンカーの残基であり；
Ｚは、エキサテカン又はＳＮ－３８分子を含むカンプトテシン類似体、例えば化合物１又は２の構造を含む分子であり；
ｎは、１又は２であり；
抗体試料中の免疫複合体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、２又は４、少なくとも２、２～４、少なくとも４、４～６又は４～８であるｍ（Ｘ－Ｚ部分の数）を有し、任意選択により、ｎは、１であり、抗体試料中の免疫複合体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、２又は４、少なくとも２、２～４、少なくとも４、４～６又は４～８であるｍ（Ｘ－Ｚ部分の数）を有する）
によって表される複数の免疫複合体を含むものとして特徴付けられる。
ある実施形態において、本開示の処置方法で使用される抗ネクチン－４組成物は、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
（式中、
Ａｂは、抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）であり；
Ｘは、Ａｂ及びＺを連結する分子、例えばＡｂ及びＺの一方又は両方への共有結合に続くリンカーの残基であり；
Ｚは、エキサテカン又はＳＮ－３８分子を含むカンプトテシン類似体、例えば化合物１又は２の構造を含む分子であり；
ｎは、１であり；
抗体試料中の免疫複合体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、６、少なくとも６、６～８又は８であるｍ（Ｘ－Ｚ部分の数）を有する）
によって表される複数の免疫複合体を含むものとして特徴付けられる。
ある実施形態において、本開示の処置方法で使用される抗ネクチン－４組成物は、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
（式中、
Ａｂは、抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）であり；
Ｘは、Ａｂ及びＺを連結する分子、例えばＡｂ及びＺの一方又は両方への共有結合に続くリンカーの残基であり；
Ｚは、エキサテカン又はＳＮ－３８分子を含むカンプトテシン類似体、例えば化合物１又は２の構造を含む分子であり；
ｎは、１であり；
抗体試料中の免疫複合体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、８であるｍ（Ｘ－Ｚ部分の数）を有する）
によって表される複数の免疫複合体を含むものとして特徴付けられる。
細胞傷害剤を含むリンカーを、抗体又は抗原結合タンパク質に対して、特定のアミノ酸残基に非特異的又は特異的に共有結合するために様々な方法を使用することができる。リンカー（Ｘ）は、リンカーの切断が細胞内環境で細胞傷害剤を放出するように、任意選択により実施例に示されるように細胞内条件下、例えば生理学的条件下において切断可能な部分を含むことができる。リンカーは、抗体分子上の化学反応基、例えば、遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシル、チオール又はカルボキシル基（例えば、Ｎ又はＣ末端、１つ以上のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つ以上のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基又は１つ以上のシステイン残基のスルフヒドリル基）、炭水化物又は一般的に抗体に導入又は操作された任意の反応基に結合することができる。リンカーが結合する部位は、抗体分子のアミノ酸配列中の天然の残基であり得るか、又は例えばＤＮＡ組換え技術（例えば、アミノ酸配列にシステイン又はプロテアーゼ切断部位を導入することにより、非天然アミノ酸残基を導入することにより）又はタンパク質生化学（例えば、糖鎖工学による、還元、ｐＨ調整又はタンパク質分解、アミノ酸結合グリカンの酵素的改変）によって抗体分子に導入することができる。
特定の実施形態において、リンカー（Ｘ）の前駆体である中間体を、適切な条件下で細胞傷害剤（Ｚ）と反応させる。特定の実施形態において、反応基は、細胞傷害剤及び／又は中間体上で使用される。いくつかの実施形態において、細胞傷害剤と中間体又は誘導体化細胞傷害剤との間の反応の生成物は、その後、適切な条件下で抗体分子と反応する。他の実施形態において、リンカー（Ｘ）の前駆体は、最初に適切な条件下で抗体分子と反応されて、リンカー（Ｘ）の前駆体に結合された抗体を生成し、その後、抗体は、細胞毒性剤（Ｚ）を含む分子と反応する。
いくつかの実施形態において、リンカー（Ｘ）は、細胞内環境（例えば、リソソーム又はエンドソーム又はカベオレア内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソーム又はエンドソームプロテアーゼを含むが、これらに限定されない細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカー又はアミノ酸単位を含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカー部分は、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。切断剤には、カテプシンＢ及びＤ並びにプラスミンが含まれ得、これらの全ては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内に活性薬物を放出することが知られている。最も典型的なものは、細胞内に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカーである。特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔリンカー又はフェニルアラニン－リジン（Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）リンカーである（例えば、バリン－シトルリンによるドキソルビシンの合成が記載される米国特許第６，２１４，３４５号明細書を参照されたい）。バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）要素は、以下に示す構造を有し得る。
Figure 2023512036000016
別の特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、バリン－アラニン（Ｖａｌ－Ａｌａ）リンカーである。ｖａｌ－ａｌａ要素は、以下に示す構造を有し得る。
Figure 2023512036000017
別の特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、グリシン含有オリゴペプチドリンカー、例えばグリシン及びフェニルアラニン含有オリゴペプチドリンカー、任意選択によりＧＧＦＧ、ＧＧＦＧＧ又はＧＧＦＧＧＧリンカーである（例えば、米国特許第６，８３５，８０７号明細書を参照されたく、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、任意選択により細胞内プロテアーゼによって切断可能であることに加えて、リンカーは、ネクチン－４に結合し、且つ／又はネクチン－４によって媒介される細胞間相互作用を阻害する、抗体の能力への干渉を避けるため、スペーサー又はストレッチャーとして作用するように機能して、Ｚから抗体を遠ざけることができる。リンカーは、スペーサー単位（Ｙ）及び／又はスペーサー若しくはスペーサー系（Ｙ’）を含み得る。したがって、スペーサーＹは、Ａｂと切断可能部分との間に配置することができる。スペーサー系（Ｙ’）は、切断可能部分とＺとの間に配置することができる。又はスペーサーＹ（又はそれを含むリンカーＸ）は、任意選択により、反応基（Ｒ）又は反応基Ｒと抗体のアミノ酸又は抗体のアミノ酸に結合する相補的な反応基（Ｒ’）との反応物の残基を含むものとして特定することができる。スペーサーＹは、例えば、抗体のアミノ酸、例えば硫黄原子、第一級若しくは第二級アミノ基又は抗体の炭水化物基と（例えば、その反応基Ｒを介して）結合を形成する分子であり得、スペーサー又はストレッチャー（Ｙ）は、抗体を、細胞傷害剤（Ｚ）又は切断可能なアミノ酸単位（例えば、ペプチジルリンカー、切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチド）に連結し、任意選択により、さらに自己脱離及び／又は非自己脱離スペーサー（Ｙ’）と結合し、Ｚに連結する。したがって、スペーサー（Ｙ）が一端でアミノ酸単位（例えば、切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチド）に連結している場合、切断可能なアミノ酸単位は、したがって、Ｚに直接結合するか、又はアミノ酸単位及びＺを連結する非自壊性又は自壊性スペーサーなどのさらなるスペーサー（Ｙ’）を含むことができる。
スペーサー（Ｙ）は、任意選択により、置換又は非置換のアルキル又はヘテロアルキル鎖であるか又はそれを含むものとして特定することができ、任意選択により、Ｙは、２～１００原子、任意選択により２～４０、２～３０、２～２０、４～４０、４～３０又は４～２０原子の鎖長を有し、任意選択により、１つ以上の原子は、炭素以外、例えば酸素、硫黄、窒素又は他の原子であり得、任意選択により、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド又はアルキルアミドで置換されている。
スペーサー（Ｙ）は、任意選択により、安定性強化部分を含むものとして特定することができる。例えば、スペーサーＹは、リンカー設計においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分又はポリサルコシン（ポリ－Ｎ－メチルグリシン又はＰＳＡＲ）部分と直交することができる（例えば、国際公開第２０１９／０８１４５５号パンフレット、国際公開第２０１５／０５７６９９号パンフレット及び国際公開第２０１６／０５９３７７号パンフレットを参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの特定の実施形態において、スペーサー（Ｙ）は、１つ以上のエチレンオキシドモノマーを含み得、任意選択により、Ｙは、ポリエチレンオキシド部分を含み、任意選択により、Ｙは、１～２４個、任意選択により１～１２個、任意選択により１～８個、任意選択により１～６個のポリエチレンオキシド部分を含み、任意選択により、Ｙは、構造－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ－を含み、式中、ｘは、１～１２、任意選択により１～８、任意選択により１～６である。
適切な安定性強化部分の例であるスペーサー鎖Ｙは、国際公開第２０１５／０５７６９９号パンフレット又は国際公開第２０１９／０８１４５５号パンフレットに開示された安定性強化部分を含み得る。例えば、スペーサー鎖Ｙは、直交連結部分及び安定性強化部分を含み得る。安定性強化部分は、直交連結部分に結合したＰＥＧホモポリマー又は一般に任意の単一分子量ホモポリマー（例えば、ＰＥＧ又はポリサルコシンホモポリマー）であり得る。ホモポリマーは、例えば、１～４、１～６、１～８、１～１０、１～１２、少なくとも６、８若しくは１０又は６～１２、６～２４、６～７２単位のＰＥＧ又は他のモノマーを有することができる。直交コネクターという用語は、ホモポリマー単位が、細胞傷害剤との関係で（直列配置ではなく）並列配置になる（ホモポリマーはＰｅｐ－Ｙ’－Ｚ部分と平行である）ように、リンカー部分（例えば、スペーサーＹの鎖）をホモポリマー単位に連結し、リンカー（例えば、切断可能なオリゴペプチド（Ｐｅｐ）及びスペーサーＹ’）を介して細胞傷害剤（Ｚ）に連結する、分岐リンカー単位成分を指す。直交連結部分は、例えば、グルタミン酸、リジン及びグリシンから任意選択により選択される１つ以上の天然又は非天然アミノ酸であり得る。任意選択により、アミノ酸直交コネクター部分は、１つのアミノ酸のα－カルボキシル基と他のアミノ酸のα－アミノ基との間のペプチド結合を介して、直交連結部分のアミノ酸残基が、ペプチジルリンカーのアミノ酸残基（例えば、式Ｖ又はＶＩの（Ｐｅｐ））に連結されるように、スペーサー鎖Ｙの末端に配置される。Ｙは、例えば、直交コネクター部分と、式Ｄ：
Figure 2023512036000018
 （式中、Ｒ１及びＲ２は、異なり、及び
Ｒ１及びＲ２の一方は、Ｈ又は不活性基であり、Ｒ１及びＲ２の他方は、機能化された反応基であり、前記基は、直交連結部分の結合可能な基に共有結合するために反応性であり、不活性基が非反応性であるような反応条件では、Ｚ１及びＺ２は、同一であるか又は異なり、任意選択のスペーサーであり、ｎは、１以上であり、及びｋは、２以上である）
の部分との反応の結果を含むことができる。
別の例において、スペーサーＹは、米国特許出願公開第２０１７／００７２０６８Ａ１号明細書に開示される基を含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれ、例えば、式（Ｅ）：
Figure 2023512036000019
 （式中、
ａは、０又は１であり；及び
Ｒ１は、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子によって任意選択により置換され、任意選択により中断される水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｒ３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基からなる群から独立して選択され；式Ｅによる基又はその塩は、スペーサー鎖Ｙの前記第１末端と第２末端との間に位置する）
による基又はその塩である。
アミノ酸単位（例えば、切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチド）とＺとの間に配置されたスペーサー又はスペーサー系（Ｙ’）は、自己脱離性又は非自己脱離性であり得る。スペーサーＹ’は、例えば、置換又は非置換のアルキル又はヘテロアルキル鎖を含み得、任意選択により、Ｙは、２～３０原子、任意選択により２～２０、４～２０、２～１０又は４～２０原子の鎖長を有し、任意選択により、１つ以上の原子は、炭素以外、例えば酸素、硫黄、窒素又は他の原子であり得、任意選択により、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド又はアルキルアミドで置換されている。ある実施形態において、Ｙ’は、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル基を含む。ある実施形態において、Ｙ’は、非自己脱離スペーサーであり、（ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ））基を含み、例えば、Ｙ’は、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、ＨＯ－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－又は－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－基であり得るか又はそれを含み得る。
「自己脱離」スペーサー単位により、別の加水分解ステップなしで薬物部分の放出が可能になる。自己脱離スペーサーを使用する場合、アミノ酸単位の切断又は変換の後、スペーサーのアミノ酸単位に連結した側が遮断されなくなり、その結果、１つ以上の部分Ｚが放出される。自己脱離スペーサー系は、例えば、国際公開第０２／０８３１８０号パンフレット及び国際公開第２００４／０４３４９３号パンフレットに記載されているものであり得、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、当業者に公知の他の自己脱離スペーサーも同様である。特定の実施形態において、リンカーのスペーサー単位は、ｐ－アミノベンジル単位を含む。このようなある実施形態において、ｐ－アミノベンジルアルコールがアミド結合を介してアミノ酸単位に結合され、ベンジルアルコールと細胞傷害剤との間でカルバメート、メチルカルバメート又はカーボネートが作製される。ある実施形態において、スペーサー単位は、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。自己脱離スペーサー単位の例にはさらに、２－アミノイミダゾール－５－メタノイ誘導体（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）及びオルト－又はパラ－アミノベンジルアセタールなど、ｐ－アミノベンジルアルコールに電子的に類似した芳香族化合物（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５６０３０Ａ１号明細書を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。スペーサーは、置換及び非置換の４－アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，２，２２３）及び２－アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，５５．５８６７）など、アミド結合加水分解時に環化を受けるｍａｔに使用できる。グリシンのα位で置換されているアミン含有薬物の排除（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，２７，１４４７）も自壊性スペーサーの例である。ｐ－アミノベンジル自己脱離スペーサー（例えば、ＰＡＢ）は、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｌａ又はＶａｌ－Ｃｉｔ切断可能なジペプチド単位と一緒に使用するのに特に適している（ＰＡＢは、ジペプチドとカンプトテシン類似体（Ｚ）との間に配置される。
「非自己脱離」スペーサー単位は、スペーサー単位の一部又は全部が、抗体－目的部分複合体の酵素的（例えば、タンパク質分解）切断の際に部分Ｚに結合したままであるものである。Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙアミノ酸単位とエキサテカン分子との間のスペーサーとしての使用に適した非自己脱離スペーサー単位の例には、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、ＨＯ－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－及び－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（例えば、ＧＧＦＧ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－エキサテカン単位を形成するため）が含まれるが、これらに限定されない。ＧＧＦＧアミノ酸単位とエキサテカンとの間のそのようなスペーサーの使用は、化合物３の構造を有するエキサテカン含有分子の放出をもたらす。非自己脱離スペーサー単位の他の例には、グリシンスペーサー単位及びグリシン－グリシンスペーサー単位が含まれるが、これらに限定されない。配列特異的な酵素的切断を受けやすいペプチドスペーサーの他の既知の組み合わせを同様の方法で使用することができる。例えば、腫瘍細胞関連プロテアーゼによる、グリシン－グリシンスペーサー単位を含有する抗体－目的部分複合体の酵素的切断は、抗体－目的部分複合体の残りの部分からのグリシン－グリシン－薬物部分の放出を生じるであろう。１つのそのような実施形態において、グリシン－グリシン－薬物部分は、その後、腫瘍細胞において別個の加水分解ステップに供され、それによりグリシン－グリシンスペーサー単位が薬物部分から切断される。
例示的なリンカー－カンプトテシン部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＩＩＩ及びＩＶに示す構造の何れかを含むことができ、Ｚは、カンプトテシン類似体であり、Ｙ及びＹ’は、スペーサーである。
Figure 2023512036000020
Figure 2023512036000021
スペーサー（Ｙ）及び（Ｙ’）は、任意選択により、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって任意選択により置換され、任意選択により中断される、直鎖又は分岐のＣ１～Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２～Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ２０シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ２０シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ２０アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ２０アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ２０アリールアルケニレン基、Ｃ９～Ｃ２０アリールアルキニレン基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基からなる群から独立して選択されるものとして特定することができ、Ｒ１は、独立して、任意選択により置換された水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基からなる群から選択される。
スペーサー（Ｙ）及び（Ｙ’）は、任意選択により、Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－、－Ｃ１～Ｃ１０ヘテロアルキレン－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－、－アリーレン－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０ヘテロアルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－Ｃ（＝Ｏ）－、－アリーレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０ヘテロアルキレン－ＮＨ－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－ＮＨ－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－ＮＨ－、－アリーレン－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－ＮＨ－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－ＮＨ－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－ＮＨ－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－ＮＨ－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０ヘテロアルキレン－Ｓ－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－Ｓ－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－）－Ｓ－、－アリーレン－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－Ｓ－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｓ－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｓ－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｓ－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－アリーレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－であるか又はそれを含むものとして特定することができ、それぞれの場合において、任意選択により、－Ｘ、－Ｒ’、－Ｏ、－ＯＲ’、＝Ｏ、－ＳＲ’、－Ｓ－、－ＮＲ’２、－ＮＲ’３ ＋、＝ＮＲ’、－ＣＸ３、－ＣＮ、－ＯＣＮ、－ＳＣＮ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、－ＮＣＳ、－ＮＯ、－ＮＯ２、＝Ｎ２、－Ｎ３、－ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’２、－ＳＯ３ －、－ＳＯ３Ｈ、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、－ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ’、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、－ＰＯ３、－ＰＯ３Ｈ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、－Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯ２、－Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’２、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’２及びＣ（＝ＮＲ’）ＮＲ’２から選択される１つ以上の置換基で置換され、各Ｘは、独立して、ハロゲン：－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ又は－Ｉであり；各Ｒ’は、独立して、－Ｈ、－Ｃ１～Ｃ２０アルキル、－Ｃ６～Ｃ２０アリール又は－Ｃ３～Ｃ１４複素環である。
スペーサー（Ｙ）は、任意選択により、例えば、鎖の一端に、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル若しくはカルボキシル基又は炭水化物と反応するか、又は抗体のアミノ酸に（例えば、遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル若しくはカルボキシル基又は炭水化物を介して）結合している相補的な反応基（Ｒ’）又は抗ネクチン－４抗体への結合時の抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基との反応基（Ｒ）の反応物の残基又は抗体のアミノ酸に結合されている相補的な反応基（Ｒ’）と反応する反応基（Ｒ）を含むものとして特定することができる。反応基対Ｒ及びＲ’の例には、双直交反応、好ましくは付加環化、例えば、ディールス・アルダー反応又は１，３－双極性付加環化、例えば、アジドとシクロオクチンとの間（銅を含まないクリックケミストリー）、ニトロンとシクロオクチンとの間、アルデヒド及びケトンからのオキシム／ヒドラゾン形成及びテトラジン連結が可能な広範な基が含まれる（国際公開第２０１３／０９２９８３号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１７／００７２０６８Ａ１号明細書も参照されたく、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｒは、アルキンであり得、且つＲ’は、アジドであり得るか、又はＲは、アジドであり得、Ｒ’は、アルキンであり得る。したがって、結果として得られるリンカー及び機能化抗体又はそのＹ要素は、任意の実施形態において、ＲとＲ’の反応から生じる基（ＲＲ’）を含むことができ、例えば、ＲＲ’は、アルキンとアジドとの反応から生じるトリアゾールであるか又はそれを含むことができる。
ある実施形態において、反応基Ｒ及びＲ’は、一緒に「クリック」反応を起こすことができる相補的な試薬である（すなわちクリックケミストリー試薬又は反応基）。例えば、１，３－双極子官能性化合物は、好ましくは、添加触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））の実質的な不存在下において、環化反応でアルキンと反応して複素環式化合物を形成することができる。少なくとも１つの１，３－双極子基が結合した様々な化合物（３つの原子にわたって非局在化された４つの電子を含む３原子パイ電子系を有する）を使用して、本明細書に開示されるアルキンと反応させることができる。例示的な１，３－双極子基には、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン、アゾキシ基及びアシルジアゾ基が含まれるが、これらに限定されない。
例としては、ｏ－ホスフェン芳香族エステル、アジド、フルミネート、アルキン（歪みシクロアルキンを含む）、シアン化物、アントラセン、１，２，４，５－テトラジン又はノルボルネン（又は他の歪みシクロアルケン）が挙げられる。
一実施形態において、Ｒは、末端アルキン又はアジドを有する部分であり；そのような部分は、例えば、米国特許第７，７６３，７３６号明細書に記載され、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。末端アルキンとアジドとの間のクリック反応の触媒として銅（及び他の金属塩）を使用するための適切な反応条件は、米国特許第７，７６３，７３６号明細書に提供される。
ある実施形態において、Ｒは、置換又は非置換シクロアルキンである。特定の化合物を含むシクロアルキンは、例えば米国特許第７，８０７，６１９号明細書に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、シクロアルキンは、式Ａ：
Figure 2023512036000022
 （式中、
Ｒ１は、カルボニル、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、ハロゲン化アルキル、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトン及びハロスルホニルから選択され；
Ｒ１は、三重結合によって結合された２つの炭素以外のシクロオクチン基上の任意の位置に存在し得る）
の化合物であり得る。
いくつかの実施形態では、修飾シクロアルキンは式Ａのものであり、三重結合によって結合された２つの炭素原子以外のシクロオクチン環の１つ以上の炭素原子は、１つ以上の電子求引基、例えば、ハロ（ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード）、ニトロ基、シアノ基、スルホン基又はスルホン酸基で置換されている。したがって、例えば、いくつかの実施形態において、主題の改変シクロアルキンは、式Ｂ：
Figure 2023512036000023
 （式中、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、（ａ）Ｈ；（ｂ）ハロゲン原子（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード）；（ｃ）－Ｗ－（ＣＨ２）ｎ－Ｚ（式中、ｎは、１～４の整数（例えば、ｎ＝１、２、３又は４）であり；Ｗは、存在する場合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；Ｚは、ニトロ、シアノ、スルホン酸又はハロゲンである）；（ｄ）－（ＣＨ２）ｎ－Ｗ－（ＣＨ２）ｍ－Ｒ４（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１又は２であり；ＷはＯ、Ｎ、Ｓ又はスルホニルであり；ＷがＯ、Ｎ又はＳの場合、Ｒ４はニトロ、シアノ又はハロゲンであり；Ｗがスルホニルの場合、Ｒ４はＨである）；又は（ｅ）－ＣＨ２）ｎ－Ｒ４（式中、ｎは、１～４の整数（例えば、ｎ＝１、２、３又は４）であり；Ｒ４は、ニトロ、シアノ、スルホン酸又はハロゲンである）であり；及び
Ｒ１は、カルボニル、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、ハロゲン化アルキル、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトン及びハロスルホニルから選択される）
のものである。Ｒ１は、三重結合によって連結された２つの炭素以外のシクロオクチン基上の任意の位置に存在し得る。
ある実施形態において、Ｒは、置換又は非置換の複素環歪みアルキンである。特定の化合物を含むシクロアルキンは、例えば米国特許第８，１３３，５１５号明細書に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、アルキンは、式Ｃ：
Figure 2023512036000024
 （式中、
各Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩及びＣ１～Ｃ１０アルキル又はヘテロアルキルからなる群から独立して選択され；
各Ｒ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩及びＣ１～Ｃ１０有機基からなる群から独立して選択され；Ｘは、Ｎ－Ｒ３Ｒ４、ＮＨ－Ｒ４、ＣＨ－Ｎ－ＯＲ４、Ｃ－Ｎ－ＮＲ３Ｒ４、ＣＨＯＲ４又はＣＨＮＨＲ４を表し；各Ｒ３は水素又は有機基を表し、Ｒ４はリンカーの連結部分Ｃを表す）
のものである。一実施形態において、Ｒ又はＲ’は、以下のＤＢＣＯ（ジベンジルシクロオクチル）基である。
Figure 2023512036000025
本明細書で上記したようなアルキンは、好ましくは添加触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））の実質的な不存在下において、環化反応で少なくとも１つの１，３－双極子官能性化合物と反応して、複素環式化合物を形成することができる。少なくとも１つの１，３－双極子基が結合した多種多様な化合物（３つの原子にわたって非局在化された４つの電子を含む３原子パイ電子系を有する）を使用して、本明細書に開示されるアルキンと反応させることができる。例示的な１，３－双極子基には、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン、アゾキシ基及びアシルジアゾ基が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書の式において、Ｙ’は、任意選択により、存在しないか、又はスペーサー、任意選択により例えばｐ－アミノベンジル単位を含む自己脱離スペーサー若しくは非自己脱離スペーサーであり得る。任意選択により、Ｙ’は、置換又は非置換のアルキル又はヘテロアルキル鎖であるか又はそれを含み、任意選択により、Ｙ’は、２～４０原子、任意選択により２～３０、２～２０、４～４０、４～３０又は４～２０原子の鎖長を有し、任意選択により、１つ以上の原子は、炭素以外、例えば酸素、硫黄、窒素又は他の原子であり得、任意選択により、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド又はアルキルアミドで置換されている。
抗ネクチン－４結合タンパク質に複合化することができる例示的なリンカー－カンプトテシン分子（例えば、式Ｉ～ＸＩのＸ－Ｚ部分）は、任意選択により、式Ｖ：
（Ｒ）－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ） 式（Ｖ）
（式中、
Ｒは、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル若しくはカルボキシル基と反応するか、又は抗体のアミノ酸に結合されている相補的な反応基（Ｒ’）と反応する基であるか、又は抗ネクチン－４結合タンパク質への複合化時、Ｒは、反応基（Ｒ）と抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル若しくはカルボキシル基又は抗体のアミノ酸に結合されている相補的な反応基（Ｒ’）との反応物の残基であり；
Ｙは、任意選択により、存在しないか又はスペーサーであり；
Ｐｅｐは、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカー、例えばバリン－シトルリン、バリン－アラニン又はフェニルアラニン－リジンジペプチドであるか又はそれを含み；
Ｙ’は、任意選択により、存在しないか、又はスペーサー、任意選択により自己脱離スペーサー若しくは非自己脱離スペーサーであり；及び
Ｚは、カンプトテシン類似体又は誘導体、任意選択によりエキサテカン又はＳＮ－３８分子である）
によって表すことができる。
得られた本発明によるネクチン－４結合免疫複合体は、例えば、式（ＶＩ）：
Ａｂ－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ） 式（ＶＩ）
（式中、
Ａｂは、抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（例えば、抗体）であり；
Ｙは、任意選択により、存在しないか又はスペーサーである。任意選択により、式ＶＩは、（Ａｂ）と（Ｙ）との間において、反応基（例えば、マレイミド、第一級アミン）と、抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（Ａｂ）のアミノ酸の側鎖又は炭水化物との反応物の残基を含む。代わりに、反応基（例えば、マレイミド、第一級アミン）と、抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（Ａｂ）のアミノ酸の側鎖との反応物の残基は、Ｙに含まれると特定することができ；
Ｐｅｐは、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるアミノ酸単位（例えば、ペプチジルリンカー）であるか又はそれを含み（例えば、（Ｐｅｐ）は、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチド、例えばバリン－シトルリン、バリン－アラニン又はフェニルアラニン－リジン単位である）；
Ｙ’は、任意選択により、存在しないか、又はスペーサー、任意選択により自己脱離スペーサー若しくは非自己脱離スペーサーであり；及び
Ｚは、カンプトテシン類似体又は誘導体、任意選択によりエキサテカン又はＳＮ－３８分子である）
によって表すことができる。
任意選択により、式は、（例えば、（Ａｂ）とＹの末端（又はＹが存在しない場合には（Ｐｅｐ若しくはＸ））との間において）反応基（Ｒ）と、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル若しくはカルボキシル基又は抗体のアミノ酸に結合されている相補的な反応基（Ｒ’）との反応物の残基（ＲＲ’）を含むものとして特定することができる。
一例において、（ＲＲ’）が反応基（Ｒ）と抗体に結合している相補的な反応基（Ｒ’）との反応物の残基である場合（例えば、Ｒ’は抗体のアミノ酸の側鎖又はグリカンに結合している）、本発明によるネクチン－４結合免疫複合体は、例えば、式（ＶＩｂｉｓ）：
Ａｂ－（ＲＲ’）－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ） 式（ＶＩｂｉｓ）
（式中、Ａｂ、Ｙ、Ｐｅｐ、Ｙ’及びＺは、式ＶＩで定義した通りであり、及びＲＲ’は、双直交反応、好ましくは付加環化、例えばディールス・アルダー反応又は１，３－双極性付加環化の結果である）
によって表すことができる。ある実施形態において、ＲＲ’は、
Figure 2023512036000026
 からなる群から選択される構造を有し、ここで、Ｘ８は、Ｏ又はＮＨであり、Ｘ９は、Ｈ、メチル及びピリジルから選択され、構造（ＲＲ’ｃ）及び（ＲＲ’ｄ）であり、
Figure 2023512036000027
 結合は、単結合又は二重結合の何れかを表す。
任意の実施形態において、エキサテカン分子（又は他の６環カンプトテシン）は、エキサテカンの１位のアミンを介してＹ’（又はＹ’が存在しない場合（Ｐｅｐ））に結合していると特定することができる。
任意の実施形態において、ＳＮ－３８分子（又は他の５環カンプトテシン）は、ＳＮ－３８の９位のアミンを介してＹ’（又はＹ’が存在しない場合（Ｐｅｐ））に結合していると特定することができる。
カンプトテシンは、周知であり、様々な置換を有するコア環系を共有する広範なカンプトテシン誘導体及び類似体があるが、以下の基本的なカンプトテシン構造と比較して環Ａ及び／又はＢに改変又は置換を有することが好ましい。
Figure 2023512036000028
トポテカン、イニロテカン、エキサテカン、ＤＸｄ、９－アミノカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、１０－ヒドロキシカンプトテシン、ルルトテカン、カンプトテシン、ギマテカン、ベロテカン及びルビテカンを含む多くのカンプトテシン類似体が報告されている。さらなるカンプトテシン類似体は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１９，１０，１０，１３８６－１３９２、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８６：７７６－７８２及びＴａｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８８：７６０－７６９に開示され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。トポテカン、イリノテカン、ベロテカン及びＤＸｄ（トラスツズマブデルクステカンの一部として）の４つの類似体は、ＦＤＡによって承認されている。ある実施形態において、カンプトテシン類似体は５環化合物である（例えば、カンプトテシンはＦ環を欠いている）。ある実施形態において、カンプトテシン類似体は、例えばＦ環を含む、六環化合物である。
基本的なカンプトテシン構造、ＳＮ－３８分子（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン；イリノテカンの活性代謝産物）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１９，１０，１０，１３８６－１３９に開示されるカンプトテシン類似体などのいくつかの例は、５つの環（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ環）を有し、例えばＢ環上の置換基を介してリンカー（例えば、スペーサーＹ若しくはＹ’又はリンカーＸ）に結合することができる。
ＳＮ－３８：
Figure 2023512036000029
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１９，１０，１０，１３８６－１３９２の化合物：
Figure 2023512036000030
任意選択により、カンプトテシン類似体は、六環化合物（追加的にＦ環）であり、この化合物は、そのようなＦ環上の置換基を介してリンカーに結合している。そのような六環化合物の例には、ＤＸｄ及びエキサテカンが含まれるが、これらに限定されない。
したがって、カンプトテシン類似体には、エキサテカン、ＳＮ－３８及びそのような部分を含む広範な分子の何れかが含まれ、例えば、エキサテカンは、非置換であり得、１位のアミンで置換され得、例えば、置換基は、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、ＨＯ－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－基又は米国特許第６，８３５，８０７号明細書に示される他の基（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）であるか又はそれを含む。
ある実施形態において、本開示の抗体は、インビボ又はインビトロで、ネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下で（例えば、切断可能な部分の酵素的切断とそれに続くスペーサーＹ’の自己脱離により）、化合物１の構造を有するエキサテカン分子を放出する。
カンプトテシン類似体又は類似体エキサテカンは、Ｍｉｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８６：７７６－７８２及びＴａｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８８：７６０－７６９に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。エキサテカンの構造は、以下の化合物１ａに示されている。
Figure 2023512036000031
エキサテカンは、１位のアミノ基の窒素原子を介してリンカーに結合することができ、その結果、エキサテカン部分は、リンカーに結合するか又はリンカー－エキサテカン分子（（Ｘ－Ｚ）分子）内に存在する場合、例えば抗体に複合化されている場合、エキサテカンは化合物１ｂの構造を有する。
Figure 2023512036000032
したがって、化合物１ａのエキサテカンが１位のアミンを介してリンカーに結合している場合（及び例えばリンカーが抗体に結合している場合）、エキサテカンは、１位の改変基である（すなわち１位のＮＨ２基がＮＨ又はＯＨ若しくはＯ基で置換されている）ことが理解される。例えば、エキサテカンは、切断可能なオリゴペプチドを含むリンカーを介して抗体に結合することができる。例には、米国特許第６，８３５，８０７号明細書に示されるグリシン及びフェニルアラニン含有ペプチド又はＰＡＢ分子に結合したジペプチドのバリン－シトルリン又はバリン－アラニンなど、ジ、トリ、テトラ及びペンタペプチドが含まれるか、又はその開示は、参照により本明細書に組み込まれる。１位のアミノで活性なエキサテカン又はエキサテカン誘導体を遊離させることができる様々な適切なリンカーＺ構造が知られている。例えば、式ＩＩＩ及び化合物１３に示すように、１位のアミンに結合した（ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ））基を介して、切断可能なオリゴペプチドにエキサテカンを連結することができ、これにより、エキサテカンを含む化合物１３が遊離する。化合物１ａのエキサテカンの１位のＮＨ２における置換基の例には、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、ＨＯ－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－及び－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－などの基を含む、（ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ））が含まれる。エキサテカンは、１位のＮＨ２が例えばＮＨ基、ＯＨ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ基によって置換されているエキサテカン誘導体であると特定できる。一実施形態において、置換されたエキサテカン又はエキサテカン誘導体（例えば、１位で誘導される）は、化合物１３の構造を有する。
ある実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＶＩＩに示される構造であるか又はそれを含み、（Ｙ）は、反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば、抗体上（例えば、１つ以上のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つ以上のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基又は１つ以上のシステイン残基のＳ原子上）の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基との反応物の残基を（例えば、その末端に）含むスペーサーである。式ＶＩＩ又は化合物３若しくは４の構造を含むリンカーで機能化された抗ネクチン－４結合タンパク質は、化合物１ａの構造を有する化合物を（例えば、細胞内で、ネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下で）放出又は産生する。
Figure 2023512036000033
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物３の構造を有し得る。このようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩で還元された後、抗体中のシステイン残基を介して抗体に複合化され得る。
Figure 2023512036000034
得られた抗体－薬物複合体は、化合物３の構造を有する化合物で機能化された１つ又は複数のシステイン残基を含む抗体を含む（ここで、化合物３は、システイン残基のＳ原子を介して結合している）。
別の実施形態において、リンカーは、Ｒ基として第一級アミンを有することができ、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下で抗体と反応すると、リンカーで機能化された１つ又は複数のアクセプターグルタミン残基を含む抗体を生成することができる。例えば、リンカー（Ｘ－Ｚ）又はそれで機能化された抗体は、以下の化合物４として示される構造を有するか又はそれを含む。
Figure 2023512036000035
ある実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＶＩＩＩに示される構造であるか又はそれを含み、（Ｙ）は、反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば、抗体上（例えば、１つ以上のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つ以上のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基又は１つ以上のシステイン残基のＳ原子上）の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基又は例えばグリコシル化アミノ酸残基のグリカン構造（例えば、抗体のＫａｂａｔ残基Ｎ２９７に結合した天然の、切断された又は他の方法で改変されたＮ－グリカン）との反応物の残基を（例えば、その末端に）含むスペーサーである。式ＶＩＩＩ又は化合物５、６若しくは７の構造を含むリンカーで機能化された抗ネクチン－４結合タンパク質は、化合物Ｉａの構造を有する化合物を（例えば、細胞内で、ネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下で）放出又は産生する。
Figure 2023512036000036
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物５、６又は７の構造を有し得る。このようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤で還元された後、抗体中のシステイン残基を介して抗体に結合することができる。
Figure 2023512036000037
Figure 2023512036000038
別の実施形態において、リンカーは、Ｒ基として第一級アミンを有することができ、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下で抗体と反応すると、リンカーで機能化された１つ又は複数のアクセプターグルタミン残基を含む抗体を生成することができる。例えば、リンカー（Ｘ－Ｚ）又はそれで機能化された抗体は、以下の化合物８として示される構造を有するか又はそれを含む。
Figure 2023512036000039
ある実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＩＸに示される構造であるか又はそれを含み、（Ｙ）は、反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば、抗体上（例えば、１つ以上のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つ以上のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基又は１つ以上のシステイン残基のＳ原子上）の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基又は例えばグリコシル化アミノ酸残基のグリカン構造（例えば、抗体のＫａｂａｔ残基Ｎ２９７に結合した天然の、切断された又は他の方法で改変されたＮ－グリカン）との反応物の残基を（例えば、その末端に）含むスペーサーである。式ＩＸの構造を含むリンカーで機能化された抗ネクチン－４結合タンパク質は、化合物Ｉａの構造を有する化合物を（例えば、細胞内で、ネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下で）放出する。
Figure 2023512036000040
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物９ａ、９ｂ、９ｃ及び９ｄの構造を有し得る。このようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤で還元された後、抗体中のシステイン残基を介して抗体に結合することができる。
Figure 2023512036000041
Figure 2023512036000042
別の実施形態において、リンカーは、Ｒ基として第一級アミンを有することができ、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下で抗体と反応すると、リンカーで機能化された１つ又は複数のアクセプターグルタミン残基を含む抗体を生成することができる。例えば、リンカー（Ｘ－Ｚ）又はそれで機能化された抗体は、以下の化合物１０として示される構造を有するか又はそれを含む。
Figure 2023512036000043
ある実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式Ｘに示される構造であるか又はそれを含み、（Ｙ）は、反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば、抗体上（例えば、１つ以上のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つ以上のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基又は１つ以上のシステイン残基のＳ原子上）の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基又は例えばグリコシル化アミノ酸残基のグリカン構造（例えば、抗体のＫａｂａｔ残基Ｎ２９７に結合した天然の、切断された又は他の方法で改変されたＮ－グリカン）との反応物の残基を（例えば、その末端に）含むスペーサーである。
Figure 2023512036000044
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物１１の構造を有し得る。このようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩で還元された後、抗体中のシステイン残基を介して抗体に結合することができる。
Figure 2023512036000045
ある実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＸＩに示される構造であるか又はそれを含み、（Ｙ）は、反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば、抗体上（例えば、１つ以上のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つ以上のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基又は１つ以上のシステイン残基のＳ原子上）の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基又は例えばグリコシル化アミノ酸残基のグリカン構造（例えば、抗体のＫａｂａｔ残基Ｎ２９７に結合した天然の、切断された又は他の方法で改変されたＮ－グリカン）との反応物の残基を（例えば、その末端に）含むスペーサーである。
Figure 2023512036000046
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物１２の構造を有し得る。このようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤で還元された後、抗体中のシステイン残基を介して抗体に結合することができる。
Figure 2023512036000047
別の実施形態において、リンカーは、Ｒ基として第一級アミンを有することができ、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下で抗体と反応すると、リンカーで機能化された１つ又は複数のアクセプターグルタミン残基を含む抗体を生成することができる。例えば、リンカー（Ｘ－Ｚ）又はそれで機能化された抗体は、以下の化合物１３として示される構造を有するか又はそれを含む。
Figure 2023512036000048
式ＸＩ又は化合物１２及び１３のオリゴペプチド含有リンカーで機能化された抗ネクチン－４結合タンパク質は、以下のエキサテカンを含む構造に示されているように、１位のアミンに存在するＯＨ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）置換基を有する置換されたエキサテカンの放出を（例えば、細胞内で、ネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下で）生じる。
Figure 2023512036000049
以下の化合物１５及び１６に示す適切なリンカーのさらなる例は、Ｒ基としてマレイミドを有し、ＰＡＢ分子に結合したフェニルアラニン含有ペプチドを有する。
Figure 2023512036000050
Ｒ基としてマレイミドを有し、直交ポリサルコシン部分を有する例示的なリンカーは、以下の化合物１７の構造を有し得ることが示される。このようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤で還元された後、抗体中のシステイン残基を介して抗体に結合することができる。
Figure 2023512036000051
例示的なリンカーの何れかにおいて、抗体に結合する場合、末端の反応基は、反応基と抗体上のアミノ酸残基、例えば、遊離アミノ、アミノ酸のヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基との反応物の残基によって置換されるものとして特定することができる。
式ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ又はＸＩの例示的なリンカーは、第一級アミンを有する構造として調製される場合、トランスグルタミナーゼ酵素が、抗体の一次構造内、例えば免疫グロブリン定常ドメイン内又は定常領域に挿入又は付加（例えば、融合）されたＴＧａｓｅ認識タグ内の、アクセプターグルタミン残基へのリンカーの複合化を触媒するように、トランスグルタミン酵素（例えば、細菌トランスグルタミナーゼ、ＢＴＧ）の存在下で抗体と反応することができる。ＢＴＧを介した抗体への複合化における使用のための方法及びリンカーは、国際公開第２０１４／２０２７７３号パンフレットに記載され、その開示は、参照により組み込まれる。ＢＴＧによって触媒される複合化は、組成物中の平均薬物：抗体比の正確な制御を可能にする。「トランスグルタミナーゼ」という用語は、「ＴＧａｓｅ」又は「ＴＧ」と交換可能に使用され、ペプチド結合グルタミンのγ－カルボキサミド基と、リジン又はアミノペンチル基などの構造的に関連する第一級アミン、例えばペプチド結合リジンの、ε－アミノ基との間のアシル転移反応によってタンパク質を架橋できる酵素を指し、これにより、ε－（γ－グルタミル）リジンイソペプチド結合が生じる。ＴＧａｓｅには、とりわけ、ＥＣ参照ＥＣ２．３．２．１３（タンパク質－グルタミン－γ－グルタミルトランスフェラーゼ）を有する酵素などの細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）が含まれる。「アクセプターグルタミン」残基という用語は、抗体のグルタミン残基に言及する場合、ＴＧａｓｅによって認識されるグルタミン残基を意味し、グルタミンとリジン又はアミノペンチル基などの構造的に関連する第一級アミンとの間の反応を介して、ＴＧａｓｅによって架橋することができる。好ましくは、アクセプターグルタミン残基は、表面露出グルタミン残基である。「ＴＧａｓｅ認識タグ」という用語は、アクセプターグルタミン残基を含み、適切な条件下でポリペプチド配列に組み込まれる（例えば、付加される）場合、ＴＧａｓｅによって認識され、アミノ酸配列内のアミノ酸側鎖と反応相手との間の反応を介してＴＧａｓｅによる架橋を生じるアミノ酸配列を指す。認識タグは、酵素認識タグを含むポリペプチド中に天然に存在しないペプチド配列であり得る。ＴＧａｓｅ認識タグの例には、アミノ酸配列：ＬＬＱ、ＬＬＱＧ、ＬＳＱＧ、ＧＬＬＱ、ＳＬＬＱＧ、ＧＧＧＱＧＧＬ、ＬＬＱＧＧ、ＬＬＱＧＡ、ＬＬＱＧＧ及びＬＬＱＧＡ若しくはＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ又は１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８若しくは９つの）配列改変を有する変異体が含まれる。
国際公開第２０１３／０９２９８３号パンフレット及び国際公開第２０２０／１８８０６１号パンフレット（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に例示されているように、リンカー－カンプトテシン類似体部分（Ｘ－Ｚ）は、第一級アミン及び第１の反応基（Ｒ）を含む部分がＢＴＧの存在下で抗体に複合化される第１のステップと、それに続く抗体－リンカー複合体を、（ｉ）第１の反応基と反応する第２の反応基（Ｒ’）と、（ｉｉ）カンプトテシン類似体（Ｚ）とを含む分子と反応させるステップを含む、２ステップの過程で、抗体（アクセプターグルタミン）のグルタミン残基に結合できる。反応基対Ｒ及びＲ’の例には、双直交反応、例えば、１，３－双極性付加環化、例えば、アジドとシクロオクチンとの間（銅を含まないクリックケミストリー）、ニトロンとシクロオクチンとの間、アルデヒド及びケトンからのオキシム／ヒドラゾン形成及びテトラジン連結が可能な広範な基が含まれる（国際公開第２０１３／０９２９８３号パンフレットも参照されたい）。したがって、結果として得られるリンカー及び機能化抗体又はそのＹ要素は、ＲとＲ’の反応から生じるＲＲ’基、例えばトリアゾールを含むことができる。
抗ネクチン－４免疫複合体は、１ｍｇ／ｍｌ～５００ｍｇ／ｍｌの濃度で医薬製剤中に組み込むことができ、前記製剤は２．０～１０．０のｐＨを有する。本製剤は、緩衝液系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤及び界面活性剤をさらに含み得る。ある実施形態において、医薬処方物は、水性処方物、すなわち水を含む処方物である。このような処方物は、一般に溶液又は懸濁液である。さらなる実施形態において、本医薬処方物は水性溶液である。「水性処方物」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む処方物として定義される。同様に「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
別の実施形態において、本医薬処方物は、凍結乾燥処方物であり、医師又は患者が使用前にそれに溶媒及び／又は希釈剤を添加する。
別の実施形態において、本医薬処方物は、事前に溶解する必要がない使用準備済みの乾燥処方物（例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥）である。
さらなる態様において、本医薬処方物は、このような抗体の水溶液及び緩衝液を含み、この抗体は１ｍｇ／ｍＬ又はそれを超える濃度で存在し、前記処方物のｐＨは約２．０～約１０．０である。
別の実施形態において、本処方物のｐＨは、約２．０～約１０．０、約３．０～約９．０、約４．０～約８．５、約５．０～約８．０及び約５．５～約７．５からなる一覧から選択される範囲である。
さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はこれらの混合物からなる群から選択される。これらの具体的な各緩衝液は、本発明の代替的な実施形態を構成する。
さらなる実施形態において、本処方物は、薬学的に許容可能な保存剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は等張剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物はキレート剤も含む。本発明のさらなる実施形態において、本処方物は安定化剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は界面活性剤をさらに含む。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照する。
本開示の医薬処方物中に他の成分が存在し得る可能性がある。このようなさらなる成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジンなどのアミノ酸）が挙げられ得る。このようなさらなる成分は、当然のことながら、本開示の医薬処方物の全体的な安定性に悪影響を与えるべきではない。
本発明による医薬組成物の投与は、いくつかの投与経路、例えば静脈内によるものであり得る。適切な抗体製剤は、他の既に開発されている治療用ＡＤＣでの経験を調べることによっても決定し得る。
任意の実施形態において、組成物は、本開示の複数のネクチン－４結合免疫複合体を含むものとして特徴付けることができ、試料中の免疫複合体の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、本明細書に開示されるリンカーで機能化された１抗体あたり少なくとも４、６又は８個のアミノ酸残基を有する。任意の実施形態において、組成物は、本開示の複数のネクチン－４結合免疫複合体を含むものとして特徴付けることができ、試料中の免疫複合体の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、リンカー－カンプトテシン部分、例えば、本明細書の式の（Ｘ－Ｚ）単位又は（－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ））単位で機能化された１抗体あたり少なくとも２、４、６又は８個のアミノ酸残基を有する。任意の実施形態において、組成物は、本開示の複数のネクチン－４結合免疫複合体を含むものとして特徴付けることができ、試料中の免疫複合体の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、１抗体あたり同数の機能化されたアミノ酸を有し、任意選択により、数は４、６又は８である。
悪性腫瘍の診断、予後及び処置
いくつかの態様において、その表面にネクチン－４を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌の診断、予後、モニタリング及び処置に有用な方法並びに抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体断片）及び免疫複合体が記載される。治療的使用において、処置は、本開示の抗体カンプトテシン類似体をヒト対象又は個体に投与することを含む。実施形態は、カンプトテシン類似体又は誘導体分子、例えばエキサテカン又はＳＮ－３８分子に複合化されたネクチン－４結合剤による、ネクチン－４発現癌の診断、予後、モニタリング及び処置に有用な方法である。適切なネクチン－４結合剤は、典型的には、カンプトテシン類似体の複数の分子に複合化される。カンプトテシン類似体は、プロテアーゼ切断可能なオリゴペプチドリンカーを含むリンカーを介して抗体に複合化することができる。例示的な医薬組成物は、１抗体分子あたり平均で１～８個のカンプトテシン類似体分子、任意選択により、１抗体分子あたり２～８個、４～８個、６～８個のカンプトテシン類似体分子又は例えば１抗体分子あたり約４、５、６、７又は８個のカンプトテシン類似体分子を含むことができる。
カンプトテシン類似体に複合化されたネクチン－４結合剤（例えば、抗ネクチン－４抗体又は抗体フラグメント）は、ネクチン－４を（例えば、腫瘍細胞膜又は細胞表面に）発現する腫瘍細胞によって特徴付けられるネクチン－４発現癌を有する個体を処置するために有利に使用することができる。そのような癌の例は、尿路上皮癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌；ＨＥＲ２陽性乳癌）、非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌（例えば、結腸癌）、頭頸部扁平上皮癌及び食道癌である。
カンプトテシン類似体に複合化されたネクチン－４結合剤は、ネクチン－４高発現腫瘍で使用することができる。
カンプトテシン類似体に複合化されたネクチン－４結合剤は、異種及び／又は低ネクチン－４発現腫瘍にも使用できる。そのような腫瘍において、本開示の免疫複合体は、任意選択により、ＭＤＲ１媒介耐性及び／又はバイスタンダー抗腫瘍効果の回避を介して、有利な有効性を提供することができる。
カンプトテシン類似体に複合化されたネクチン－４結合剤は、ネクチン－４の発現レベルにかかわらず、個体内の腫瘍細胞におけるネクチン－４発現レベルの不均一性にかかわらず、且つ／又は個体が以前にエンホルツマブベルドチンで処置されたかにかかわらず、個体を処置するために有利に使用することができる。例えば、カンプトテシン類似体分子に複合化されたネクチン－４結合剤は、エンホルツマブベルドチンで以前に処置された個体を処置するために有利に使用することができる。そのような個体は、任意選択により、エンホルツマブベルドチン処置後の不均一及び／又は低ネクチン４発現腫瘍によって特徴付けられる癌を任意選択により有し得る。個体は、オーリスタチン又はＭＭＡＥ分子（例えば、エンフォルツマブベドチン）に複合化された抗体による処置（例えば、処置中又は処置後）にもかかわらず、抵抗性である、応答していない、再発及び／又は進行した癌を有し得る。例えば、個体は、局所進行性又は転移性の尿路上皮癌を有し、オーリスタチン又はＭＭＡＥ分子に複合化された抗体（例えば、エンホルツマブベドチン）による処置を以前に受けていてもよい。
進行した再発性又は転移性尿路上皮癌では、相当な割合の個体が腫瘍細胞で高レベルのネクチン－４を発現し、例えば、少なくとも２９０のＨスコアである（ＥＶ－２０１臨床試験コホート１ネクチン－４発現を参照されたい）。しかし、一部の患者のＨスコアは、２５０未満であり、一部の患者は、２００未満である。少数の患者のＨスコアは、１５０未満であり、Ｈスコアが１００未満の患者もいた。トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）では、患者の６２％が腫瘍細胞でネクチン－４の発現が高く、３８％の患者が腫瘍細胞でネクチン－４の発現が低いことが報告されている（Ｒａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃ．２８：７６９－７７６）。他の種類の癌では、ネクチン－４発現のＨスコアの中央値は、典型的には、ＵＣで観察される値よりも低く、とりわけ非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌及び食道癌で顕著である。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、進行した再発性又は転移性の癌、任意選択により進行した再発性又は転移性の尿路上皮癌を有する。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、エストロゲン受容体及び／又はプロゲステロン受容体の検査が陽性であり、及び上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）又は過剰ＨＥＲ２タンパク質の検査が陰性である、乳癌を有し、任意選択により、癌は、ＨＥＲ２の検査が陽性であるが、ＨＥＲ２は低レベルで発現している。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、例えばエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及び過剰ＨＥＲ２タンパク質についての試験で陰性である乳癌を有する。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、ＨＥＲ２タンパク質について陽性である乳癌を有し、任意選択により、癌は過剰なＨＥＲ２タンパク質を発現し（ＨＥＲ２過剰発現）、任意選択により、癌は、低レベルのＨＥＲ２タンパク質（過剰なＨＥＲ２発現よりも低い）を発現する。ある実施形態において、個体は、ＨＥＲ２ポリペプチド（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ）に結合する薬剤（例えば、抗体）と組み合わせて、本開示による抗ネクチン－４ ＡＤＣで処置され、任意選択により、ＨＥＲ２に結合する抗体は、ＡＤＣであり；任意選択により、ＨＥＲ２に結合する抗体は、細胞傷害剤、任意選択によりオーリスタチン、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）又はカンプトテシン類似体（例えば、化合物１、２又は１３）に複合化され；任意選択により、ＨＥＲ２に結合する抗体は、トラスツズマブエムタンシン又はトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１ａ）である。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、非小細胞肺癌、任意選択により肺腺癌を有する。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、膵臓癌を有する。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、卵巣癌を有する。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、頭頸部扁平上皮癌を有する。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、食道癌を有する。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、結腸直腸癌を有する。本明細書で使用される場合、結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、結腸癌、直腸癌及び結腸直腸癌（結腸及び直腸領域の両方の癌）を指す。
ある実施形態において、本開示に従って処置される個体は、ＨＥＲ２タンパク質について陽性であるＮＳＣＬＣ又は肺腺癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、尿路上皮癌又は膀胱癌を有し、任意選択により、癌は過剰なＨＥＲ２タンパク質を発現し（ＨＥＲ２過剰発現）、任意選択により、癌は、低レベルのＨＥＲ２タンパク質（過剰なＨＥＲ２発現よりも低い）を発現する。ある実施形態において、個体は、Ｈｅｒ２ポリペプチド（例えば、トラスツズマブ又はペルツズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域を含む抗体）に結合する薬剤（例えば、抗体）と組み合わせて、本開示による抗ネクチン－４ ＡＤＣで処置され、任意選択により、Ｈｅｒ２に結合する抗体は、ＡＤＣであり；任意選択により、Ｈｅｒ２に結合する抗体は、細胞傷害剤、任意選択によりオーリスタチン、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）又はカンプトテシン類似体（例えば、化合物１、２又は１４）に複合化され；任意選択により、Ｈｅｒ２に結合する抗体は、トラスツズマブエムタンシン又はトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１ａ）である。
ある態様において、本開示の処置方法は、腫瘍組織におけるネクチン－４発現の評価又は検出に依存せず、腫瘍細胞上のネクチン－４の発現レベル及び／又は前記個体からの組織サンプル中のネクチン－４発現腫瘍細胞の頻度又は数に依存しない。
ある態様において、本開示は、癌の処置及び／又は抗腫瘍免疫応答の誘発を、それを必要とする個体において行う方法を提供し、ここで、前記個体は、進行した再発性又は転移性の尿路上皮癌又は乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）を有し、前記方法は、個体がネクチン－４を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）を含む腫瘍組織を有するか否かの事前決定を必要としない。
ある態様において、本開示は、癌の処置及び／又は腫瘍細胞の死滅を、それを必要とする個体において行う方法を提供し、ここで、前記個体は、進行した再発性又は転移性の尿路上皮癌又は乳癌（例えば、ＴＮＢＣ）を有し、前記方法は、個体が、例えば免疫組織化学評価（例えば、Ｈスコア又は他の適切なＩＨＣスコアリング方法）によって定義される、高レベルのネクチン－４を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）を含む腫瘍組織を有するか否かの事前決定を必要としない。
ある態様において、個体の癌を処置する及び／又は腫瘍細胞を死滅させる方法は、腫瘍細胞のネクチン－４発現レベルの事前測定を必要としない。
ある態様において、個体の癌、任意選択により進行した再発性又は転移性の尿路上皮癌又は乳癌（例えば、ＴＮＢＣ、ＨＥＲ２陽性癌）を処置する方法は、２９０、２５０、２００、１５０又は１００以下又は未満のネクチン－４発現のＨスコアによって特徴付けられる癌を有する個体を処置することを含む。
個体の癌を処置又は予防するための任意の実施形態において、方法は、（ｉ）腫瘍細胞がネクチン－４を発現する個体を特定する（例えば、免疫組織化学によって決定される）ステップ、及び（ｉｉ）本開示の抗ネクチン－４抗体カンプトテシン類似体薬物複合体の有効量を個体に投与するステップを含むものとして特定することができる。
個体の癌を処置又は予防するための任意の実施形態において、方法は、（ｉ）腫瘍細胞が（ａ）ネクチン－４（例えば、免疫組織化学によって決定される）及び（ｂ）ＨＥＲ２（任意選択により、腫瘍細胞は低レベルのＨＥＲ２を発現する）（例えば、免疫組織化学によって決定される；Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ（商標）によって決定される）を発現する個体を特定するステップ、及び（ｉｉ）カンプトテシン類似体又は誘導体分子に複合化された抗ネクチン－４抗体の有効量を、任意選択によりＨｅｒ２ポリペプチド（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ）に結合する薬剤（例えば、抗体）と組み合わせて、個体に投与するステップを含むものとして特定することができ；任意選択により、Ｈｅｒ２に結合する抗体は、ＡＤＣであり；任意選択により、Ｈｅｒ２に結合する抗体は、細胞傷害剤、任意選択によりオーリスタチン、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）又はカンプトテシン類似体（例えば、化合物１、２又は１４）に複合化され；任意選択により、Ｈｅｒ２に結合する抗体は、トラスツズマブエムタンシン又はトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１ａ）である。
個体の癌を処置又は予防するための任意の実施形態において、方法は、（ｉ）腫瘍細胞が低又は中レベルのネクチン－４発言を有する個体を特定する（例えば、免疫組織化学によって決定される）ステップ、及び（ｉｉ）カンプトテシン類似体又は誘導体分子に複合化された抗ネクチン－４抗体の有効量をステップ（ｉ）で特定した個体に投与するステップを含むものとして特定することができる。
個体の癌（例えば、ネクチン－４陽性癌）を処置又は予防するための任意の実施形態において、方法は、（ｉ）癌が低レベルのネクチン－４発現によって特徴付けられる（例えば、免疫組織化学によって決定される）個体を特定するステップ、及び（ｉｉ）本開示の抗ネクチン－４抗体カンプトテシン類似体薬物複合体の有効量をステップ（ｉ）で特定した個体に投与するステップを含むものとして特定することができる。ある実施形態において、個体は、１５０以下若しくは１５０未満又は１００以下若しくは１００未満のネクチン－４発現のＨスコアによって特徴付けられる癌を有する。
個体の癌（例えば、ネクチン－４陽性癌）を処置又は予防するための任意の実施形態において、方法は、（ｉ）癌が中レベルの腫瘍ネクチン－４発現によって特徴付けられる（例えば、免疫組織化学によって決定される）個体を特定するステップ、及び（ｉｉ）本開示の抗ネクチン－４抗体カンプトテシン類似体薬物複合体の有効量を個体に投与するステップを含むものとして特定することができる。ある実施形態において、個体は、２９０、２５０、２００、１５０以下又は未満のネクチン－４発現のＨスコアによって特徴付けられる癌を有し、任意選択により、癌は、少なくとも１００のネクチン－４発現のＨスコアによって特徴付けられる。
またさらなる実施形態において、（ｉ）癌が２９０、２５０、２００、１５０、１２０又は１００以下又は未満の腫瘍ネクチン－４発現のＨスコアによって特徴付けられる個体を特定すること、及び（ｉｉ）本開示の抗ネクチン－４抗体カンプトテシン類似体薬物複合体の有効量を個体に投与することを含む、個体における癌（例えば、ネクチン－４陽性癌）を処置又は予防するための方法が提供される。任意選択により、ステップ（ｉ）は、組織化学（例えば、ＩＨＣ）によって腫瘍細胞上のネクチン－４発現を評価するステップを含むものとして特定され得る。
またさらなる実施形態において、（ｉ）癌が２００、１５０、１２０又は１００以下又は未満の腫瘍ネクチン－４発現のＱＳスコアによって特徴付けられる個体を特定すること、及び（ｉｉ）本開示の抗ネクチン－４抗体カンプトテシン類似体薬物複合体の有効量を個体に投与することを含む、個体における癌（例えば、ネクチン－４陽性癌；乳癌）を処置又は予防するための方法が提供される。任意選択により、ステップ（ｉ）は、組織化学（例えば、ＩＨＣ）によって腫瘍細胞上のネクチン－４発現を評価するステップを含むものとして特定され得る。
個体から、例えば生検からの生物学的試料を入手し、評価することができる。任意選択により、試料は、ホルムアルデヒド（例えば、ホルマリン）固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料として保存される。脱パラフィン後、スライドはネクチン－４（及び／又はＨＥＲ２）の発現を検出する方法に適している。
腫瘍細胞におけるネクチン－４及び／又はＨＥＲ２の発現は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。特定の実施形態において、アッセイには、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイ、例えば定量的ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング又はインセルウエスタンブロッティング）及び他のイムノアッセイが含まれる。
組織切片のＩＨＣ染色は、試料中のタンパク質の存在を評価又は検出する信頼できる方法であることが示されている。免疫組織化学技術は、抗体を利用して、一般に発色法又は蛍光法により、インサイツで細胞抗原をプローブ及び可視化する。したがって、抗体又は抗血清、いくつかの実施形態においてポリクローナル抗血清及びいくつかの実施形態において各マーカーに特異的なモノクローナル抗体が、発現を検出するために使用される。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識又は西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素で抗体自体を直接標識することによって検出することができる。代わりに、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を含む標識された二次抗体と組み合わせて、標識されていない一次抗体が使用される。免疫組織化学プロトコル及びキットは、当技術分野で周知であり、市販されている。
いくつかの実施形態において、ＩＨＣアッセイは、標的抗原への抗体の結合が直接決定される直接アッセイである。この直接アッセイでは、蛍光タグ又は酵素標識された一次抗体などの標識試薬を使用し、さらなる抗体相互作用なしで視覚化できる。いくつかの実施形態において、ＩＨＣアッセイは間接アッセイである。典型的な間接アッセイでは、複合化されていない一次抗体が抗原に結合し、次に標識された二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体が酵素標識に複合化されている場合、発色基質又は蛍光基質を添加して抗原を可視化する。いくつかの二次抗体が一次抗体の異なるエピトープと反応し得るため、シグナル増幅が発生する。免疫組織化学に使用される一次抗体及び／又は二次抗体は、典型的には、検出可能な分子で標識される。放射性同位元素、金コロイド粒子、蛍光標識及び酵素基質標識を含む、多数の標識が利用可能である。
強い染色、中程度の染色及び弱い染色は、当業者に周知の説明である。いくつかの態様において、強い染色、中程度の染色及び弱い染色は、較正された染色レベルであり、範囲が確立され、染色の強度が範囲内でビニングされる。いくつかの実施形態において、強い染色は、強度範囲の７５パーセンタイルを超える染色であり、中程度の染色は、強度範囲の２５パーセンタイル～７５パーセンタイルまでの染色であり、低い染色は、強度範囲の２５パーセンタイル未満の染色である。いくつかの態様において、当業者は、特定の染色技術に精通しており、ビンのサイズを調整し、染色カテゴリーを定義する。
様々な染色強度（例えば、抗ネクチン－４抗体で染色した場合）の対照細胞株（例えば、ペレットに遠心分離し、ホルマリン固定及びパラフィン包埋し、例えば、組織マイクロアレイとして調製し、例えば、抗ネクチン－４抗体で染色した）は、ＩＨＣ分析の対照として利用され得る。当業者は、陰性、弱い、中程度及び高いｃ－ｍｅｔ染色強度を有する他の対照細胞ペレットが、本願の教示及び当技術分野で周知であり、本明細書に開示される方法を使用して、容易に識別され得ることを理解する。
いくつかの実施形態において、癌又は腫瘍は、ネクチン－４陽性である（例えば、ＩＨＣアッセイを使用して決定される）場合、ネクチン－４発現癌腫瘍であると考えられる。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の５％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の１０％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の２０％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の３０％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の４０％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の５０％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の６０％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の７０％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の８０％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の９０％以上がネクチン－４タンパク質を発現（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度で発現）する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。
いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の５％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の１０％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の２０％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の３０％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の４０％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の５０％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の６０％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の７０％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の８０％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。いくつかの実施形態において、試料中の腫瘍細胞の９０％以上がネクチン－４タンパク質を中程度及び／又は強い染色強度で発現する場合、個体の癌又は腫瘍はネクチン－４陽性である。
個体の癌又は腫瘍が高ネクチン－４発現によって特徴付けられるか否か（例えば、低又は中程度のネクチン４発現）を決定するための免疫組織化学アッセイの評価には、典型的には、公知のスコアリング方法の適用が含まれる。
低、中及び高腫瘍ネクチン－４発現は、米国特許出願公開第２０１３／０００５６７８号明細書に記載されているように「Ｈスコア」に基づいて決定することができる。Ｈスコアは、式：（３×強く染色された細胞のパーセンテージ）＋（２×中程度に染色された細胞のパーセンテージ）＋（弱く染色された細胞のパーセンテージ）で得られ、０～３００の範囲を与える。Ｈスコアは、特にＵＣで使用されている。
本明細書の方法の何れかのいくつかの実施形態において、低又は中ネクチン－４発現（例えば、低又は中レベルのネクチン－４発現を有する腫瘍又は腫瘍細胞）は、約２５０以下、約２２０以下、約２００以下、約１８０以下、約１６０以下、約１５０以下、約１４０以下、約１３０以下、約１２０以下、約１１０以下又は約１００以下のＨスコアに対応する。
本明細書の方法の何れかのいくつかの実施形態において、低ネクチン－４発現（例えば、低レベルのネクチン－４発現を有する腫瘍又は腫瘍細胞）は、２００以下、約１８０以下、約１６０以下、約１５０以下、約１４０以下、約１３０以下、約１２０以下、約１１０以下又は約１００以下のＨスコアに対応する。
本明細書の方法の何れかのいくつかの実施形態において、高ネクチン－４発現（例えば、高レベルのネクチン－４発現を有する腫瘍又は腫瘍細胞）は、約２９０以上のＨスコアに対応する。
別の例では、ネクチン－４染色は、以下の式：ＱＳ＝Ｐ（陽性細胞の割合）×Ｉ（強度）を使用してクイックスコア（ＱＳ）に従ってスコア付けすることができ、最大スコアは３００である。ＱＳは、例えば、乳癌で使用されている。例えば、ＴＮＢＣでは、一部の研究グループが低ネクチン－４発現グループをＱＳ＝又は＜１００と定義している。本明細書の方法の何れかのいくつかの実施形態において、低又は中ネクチン－４発現（例えば、低又は中レベルのネクチン－４発現を有する腫瘍又は腫瘍細胞）は、約２００以下、約１８０以下、約１６０以下、約１５０以下、約１４０以下、約１３０以下、約１２０以下、約１１０以下又は約１００以下のＱＳスコアに対応する。
ＨＥＲ２の腫瘍細胞発現を評価するためのアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、ＦＤＡ承認のＳＰｏＴ－Ｌｉｇｈｔ ＨＥＲ２ ＣＩＳＨなどのアッセイを使用して、ＨＥＲ２過剰発現を検出することができる。発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）は、ＨＥＲ２遺伝子の増幅を検出する。Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎとも呼ばれるこの技術は、乳癌細胞が細胞表面でＨＥＲ２受容体タンパク質を過剰発現しているかどうかを確認するために使用される試験である。
ＨＥＲ２について別の広く使用されているアッセイは、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（Ｄａｋｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）であり、これは、ホルマリン固定パラフィン包埋癌組織におけるＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を決定するために使用される半定量的免疫組織化学アッセイである。例えば、低レベルのＨＥＲ２を発現する腫瘍は、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）により＋１～＋２のスコアによって識別することができる。
ある態様において、処置は、既存の神経障害、糖尿病又は高血糖症、心不全、眼病変を有する個体に使用される。そのような状態は、本開示の抗ネクチン－４抗体薬物複合体よりも高い毒性又はより狭い治療域を有するエンホルツマブベルドチンなどの抗ネクチン－４ ＡＤＣによる処置について、個体を不適当とし得る。
任意の実施形態において、処置方法は、任意選択により、（ａ）個体の癌の病期及び／又は疾患の進行を評価するステップ；及び（ｂ）個体が再発性、転移性及び／又は進行性の癌を有する場合、カンプトテシン類似体又は誘導体分子に複合化された抗ネクチン－４抗体の有効量を個体に投与するステップを含み得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）個体の癌の病期及び／又は疾患の進行を評価すること；及び（ｂ）個体が再発性、転移性及び／又は進行性の癌を有する場合、エキサテカン分子に複合化された抗ネクチン－４抗体の有効量を個体に投与することを含む、尿路上皮癌を有する個体の腫瘍を処置する方法を含む。
任意選択により、個体は、手術及び／又は治療剤、例えば化学療法剤、抗体、ＡＤＣ又は放射線療法による処置にもかかわらず（例えば、その間又はその後）、抵抗性であるか、応答していないか、又は再発及び／若しくは進行した癌（例えば、尿路上皮癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌；ＨＥＲ２陽性癌）、非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌又は食道癌）を有し得る。
本明細書の任意の実施形態において、処置応答は、周知の基準、例えば、バージョン１．１などの固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４５：２２８－２４７を参照されたい）又は免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）（Ｗｏｌｃｈｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：７４１２－７４２０を参照されたい）に従って定義及び／又は評価することができる。
任意選択により、本開示の抗ネクチン－４抗体薬物複合体で処置される個体は、化学療法剤（例えば、Ｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）によって輸送できることが知られている化学療法剤、例えばアントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）及びエトポシド）による処置に応答しないか、又はその後に進行した、耐性を示す腫瘍又は癌を有する。Ｐｇｐによって認識される化合物は、典型的には、適度な疎水性（オクタノール－水分配係数、ｌｏｇＰ＞１）として特徴付けられ、生理学的条件下で正味のカチオン電荷を有する滴定可能なプロトンを含むことが多く、主に芳香族部分を有する「天然産物」である。
いくつかの実施形態において、抗ネクチン－４抗体、抗体断片を含むＡＤＣは、化学療法剤の組み合わせ投与なしで使用又は投与される。任意選択により、個体は、進行した、再発した、又は以前の治療剤による以前の処置に応答しなかった癌を有するものとして特徴付けることができ、任意選択によりさらに、以前の処置は、エンホルツマブベルドチンの投与及び／又はＰＤ－１中和剤（例えば、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、ニボルマブ）の投与を含み、任意選択により、以前の治療剤は化学療法剤である。
任意選択により、任意の実施形態において、個体は、エンホルツマブベルドチンによる処置に不適格であり、且つ／又はエンホルツマブベルドチンによる処置に適していないか若しくは適応とされない癌を有すると特徴付けることができる。
カンプトテシン類似体分子に複合化された抗ネクチン－４抗体でヒトを処置するための例示的な処置プロトコルは、例えば、カンプトテシン類似体分子に複合化された抗ネクチン－４抗体の有効量を患者に投与することを含み、方法は、カンプトテシン類似体分子に複合化された少なくとも１用量の抗ネクチン－４抗体が、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～１ｍｇ／ｋｇ体重、１～１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１～５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、少なくとも１つの投与サイクルを含む。ある実施形態において、複数の用量、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０用量が投与される。ある実施形態において、用量の投与は、少なくとも２、３又は４週間隔てられる。ある実施形態において、投与サイクルは２週間～８週間又は少なくとも４、６、８又は１６週間である。
一実施形態において、カンプトテシン類似体分子に複合化された抗ネクチン－４抗体は、静注によって投与される。
実施例１：Ｈｅｒ２及びネクチン－４を共発現するヒト腫瘍細胞。
ＨＥＲ２の研究及びネクチン－４遺伝子発現研究は、異なる種類の癌における主要なゲノム変化の多次元マップに基づいて、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（国立癌研究所と国立ヒトゲノム研究所の共同研究）を使用して実施された。ＨＥＲ２とネクチン－４発現の有意な相関関係は、特に、膵臓癌患者、肺腺癌患者、乳癌及び膀胱癌の試料で観察された。観察された最も高い相関は膵臓癌であり、相関値は、スピアマン０．７１及びピアソン０．７８であった。
ＳＵＭ１８５及びＳＵＭ１９０ヒト乳癌腫瘍細胞株（Ｂｉｏｖｉｔ ｉｎｃ．）におけるＨＥＲ２及びネクチン－４発現は、フローサイトメトリーによって決定された。ＳＵＭ１８５は、ＥＲ陰性の患者の胸水に由来する。ＰＲ陰性且つＨｅｒ２陽性の未分化乳癌。細胞株はＨｅｒ２を過剰発現する。ＳＵＭ１９０は、ＥＲ陰性の患者の原発腫瘍に由来する。ＰＲ陰性及びＨｅｒ２陽性（増幅）乳癌。腫瘍細胞並びにアイソタイプ対照を、１０μｇ／ｍｌ（１５分間、４℃）で、抗ネクチン－４抗体（Ｆｃガンマ受容体結合が減少したＮ２９７Ｑ突然変異を含むヒトＩｇＧ１アイソタイプとして改変されたＡＳＧ－２２ＭＥ）又は抗Ｈｅｒ２抗体（Ｆｃガンマ受容体結合が減少したＮ２９７Ｑ突然変異を含むヒトＩｇＧ１アイソタイプとして改変されたトラスツズマブ）で染色し、その後、１：２００の希釈においてＰＥ複合化ポリクローナルヤギ抗ヒト抗体で染色した。試料は、Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＨＴＳ）を用いたサイトフルオロメトリー分析によって分析された。
代表的な結果は、ＳＵＭ１９０ヒト乳癌腫瘍細胞について図１に、ＳＵＭ１８５ヒト乳癌腫瘍細胞について図２に示されている。ＭＦＩ：蛍光強度の平均。ＳＵＭ１９０腫瘍細胞は、ＨＥＲ２を低～中レベル（中央蛍光単位１７７７）で発現し、ネクチン－４をより低いレベル（中央蛍光単位９９１）で発現した。ＳＵＭ１８５細胞は、ＨＥＲ２を中～高レベル（中央蛍光単位２８８０）で発現し、ネクチン－４をより高いレベル（中央蛍光単位４３２６）で発現した。
Figure 2023512036000052
実施例２：ＨＥＲ２＋ネクチン４＋ヒト腫瘍細胞に対するカンプトテシン類似体で機能化された抗ネクチン－４ ＡＤＣの有効性
抗ネクチン－４抗体－薬物複合体を調製し、ＨＥＲ２＋ネクチン４＋ヒト腫瘍細胞に対する有効性についてトラスツズマブ抗体－薬物複合体と比較した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプとして配列番号９及び１０のＶＨ及びＶＬを有する抗ネクチン－４抗体－薬物複合体を調製した。トラスツズマブ（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）の重鎖及び軽鎖を有する抗Ｈｅｒ２抗体－薬物複合体を調製した。抗ネクチン－４抗体と抗Ｈｅｒ抗体の両方が、鎖間ジスルフィドの部分的還元後、抗体のシステイン残基を介してリンカー－カンプトテシン類似体にそれぞれ確率論的に複合化された。２～１０モル当量の範囲の還元剤トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を抗体（３ｍｇ／ｍＬ）と共に撹拌（３５０～４００ｒｐｍ、＋３７℃）しながら２時間インキュベートして、ジスルフィドを還元した。リンカー毒素の複合化は、９．２又は１２モル当量の過剰モルのリンカー毒素を添加し、３７℃の撹拌ホイール上で一晩インキュベートすることにより行った。得られたＡＤＣの平均薬物負荷（薬物：抗体比）は約８であった。さらなる例において、抗ネクチン－４抗体は、同じ方法を使用して、リンカーを含む第２のカンプトテシン（ＳＮ－３８）にも複合化した。この実施例で使用されるＡＤＣは、以下の通りである。
Ｎ４ ＡＤＣ１：以下の構造を有する、リンカーに複合化された抗ネクチン－４。
Figure 2023512036000053
Ｈｅｒ２ ＡＤＣ１：以下の構造を有する、リンカーに複合化された抗Ｈｅｒ２。
Figure 2023512036000054
Ｎ４ ＡＤＣ２：以下の構造を有する、リンカーに複合化された抗ネクチン－４。
Figure 2023512036000055
得られたＡＤＣを、実施例１のＳＵＭ１９０及びＳＵＭ１８５腫瘍細胞を発現するネクチン－４／Ｈｅｒ２の死を誘導する能力について試験した。簡潔には、細胞を９６ウェルプレートに播種した（Ｖ＝８０μｌ）。Ｎ４ ＡＤＣ１及びＨｅｒ２ ＡＤＣ１又はヒトＩｇＧ１－アイソタイプ対照（ＩＣ）－リンカー－毒素又は培地（濃度５ｘ）を、Ｎ４ ＡＤＣ１及びアイソタイプ対照について、（５３０ｎＭ～３０ｎＭ）から開始される１：２段階希釈及び１：５段階希釈（７ｎＭから７ｘ１０－２ｎＭ）で試験した。Ｎ４ ＡＤＣ２及びアイソタイプ対照は、（５３０ｎＭ～５．３ １０－２）から開始して１：１０の段階希釈で試験された。細胞死を引き起こすＡＤＣの能力は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３－２装置を使用してコンフルエンスを評価することによって決定され；処置後６日目の生存度は、Ｅｎｓｐｉｒｅ２装置を使用したＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（ＣＴＧ）アッセイを使用して決定された。各ＡＤＣのＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８による６日目の発光細胞生存度のデータを使用して決定された。実験は２回繰り返した。
代表的な結果を図３に示す。図３の右側の２つのパネルは、Ｎ４ ＡＤＣ１（抗ネクチン－４）が腫瘍細胞の死を引き起こすのに効果的であることを示し、Ｎ４ ＡＤＣ１は四角付きの実線で示され、アイソタイプ対照は破線で示されている。図３の２つの左側のパネルは、同じそれぞれの細胞におけるＨｅｒ２ ＡＤＣ１（抗Ｈｅｒ２）の有効性を示し、ＨＥＲ２ ＡＤＣ１はドット付きの実線で示され、アイソタイプ対照は破線で示されている。ＩＣ５０値を以下の表にまとめる。Ｎ４ ＡＤＣ１は、はるかに低いネクチン－４表面発現（ＳＵＭ１８５よりもＳＵＭ１９０で約４倍低い表面ネクチン－４）によって特徴付けられるＳＵＭ１９０細胞でも特に強力であった。カンプトテシン類似体ＳＮ３８を有するＮ４ ＡＤＣ２（抗ネクチン－４）も同様に優れた効力を示した（以下のＩＣ５０表を参照されたい）。
Figure 2023512036000056
結果は、ネクチン－４を発現するＳＵＭ１８５において、抗ネクチン－４ ＡＤＣ（Ｎ４ ＡＤＣ１）が抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣ（Ｈｅｒ２ ＡＤＣ１）よりも相当強力であり、ＩＣ５０がネクチン－４ ＡＤＣの４０分の１であったことを示している。注目すべきことに、ＳＵＭ１８５細胞は比較的高レベルでネクチン－４を発現し、ネクチン－４発現レベルはこれらの細胞におけるＨｅｒ２の約２倍である（実施例１を参照されたい）。しかし、興味深いことに、抗ネクチン－４（Ｎ４ ＡＤＣ１）及び抗Ｈｅｒ２（Ｈｅｒ－２ ＡＤＣ１）ＡＤＣは、はるかに低いレベルのネクチン－４表面発現を有するＳＵＭ１９０細胞で試験すると、抗ネクチン－４ ＡＤＣ（Ｎ４ ＡＤＣ１）が非常に強力なままであった。これらのＳＵＭ１９０細胞では、ネクチン４の表面発現はＨｅｒ２の半分にすぎなかったが、抗ネクチン４カンプトテシンＡＤＣは、抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣと少なくとも同等であるか又は場合によってより強力なままであり、抗ネクチン－４ ＡＤＣのＩＣ５０は、抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣよりも６倍低かった。
したがって、細胞内で切断可能なペプチドリンカーとカンプトテシン類似体化合物との組み合わせは、ピロロベンゾジアゼピン及びオーリスタチンなどの最も広く使用されている細胞毒性剤と比較して、オフターゲット毒性が改善されていない、より低いネクチン－４発現レベルによって特徴付けられるものを含む、ネクチン－４発現腫瘍細胞を排除するための有効な手段となり得る。抗ネクチン－４ ＡＤＣは、ＨＥＲ２低及び／又はＨＥＲ２中発現癌を含むが、これらに限定されないＨＥＲ２陽性癌の処置に有用なアプローチも提供し得る。
実施例３：抗ＨＥＲ２ ＡＤＣと組み合わせた抗ネクチン－４カンプトテシン類似体ＡＤＣの有効性
抗ネクチン－４ ＡＤＣ（Ｎ４ ＡＤＣ１）と抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣ（Ｈｅｒ２ ＡＤＣ１）は、組み合わせて使用した場合に腫瘍細胞死を引き起こす能力を評価するために試験された。
使用した抗ネクチン－４カンプトテシン類似体ＡＤＣは、実施例２に示すＮ４ ＡＤＣ１であった。抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣも実施例２で使用したものであった（Ｈｅｒ２ ＡＤＣ１）。細胞死を引き起こすＡＤＣの能力は、実施例２に記載されるように、６日目にＳＵＭ１９０細胞のコンフルエンスを評価し、生存度を決定することによって決定された。結果は、抗ネクチン－４ ＡＤＣと抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣの組み合わせが、何れかのＡＤＣ単独と比較して、ネクチン－４＋Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞の死を引き起こす効力が改善された（より低いＩＣ５０）ことを示した。
実施例４：細胞内内在化
ネクチン－４の内在化を誘導する抗ネクチン－４抗体の能力を、より低いレベルのネクチン－４を発現するＳＵＭ１９０細胞株及びより高いレベルのネクチン－４を発現するＳＵＭ１８５細胞で評価した。試験した抗体は、エンホルツマブ（ヒトＩｇＧ１アイソタイプとして配列番号３及び４のＶＨ及びＶＬ）及びＮ４１（ヒトＩｇＧ１アイソタイプとして配列番号９及び１０のＶＨ及びＶＬ）であった。ＣＴＧ基質を使用した細胞生存度の測定（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ））により、抗ネクチン－４抗体がネクチン－４発現細胞を標的とし排除できるようにするＦａｂ－ＺＡＰヒト内在化キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、内在化を間接的に決定した。Ｆａｂ－ＺＡＰは、ヤギ抗ヒト一価抗体とリボソーム不活性化タンパク質であるサポリンの化学複合体である。使用される抗体は、ヒトＩｇＧの重鎖及び軽鎖の両方に対しアフィニティー精製されたポリクローナル抗体である。この二次複合体は、一次抗体が内在化する可能性を評価するために使用される。
簡潔には、ある濃度範囲の抗体又は対照項目をＳＵＭ１９０又はＳＵＭ１８５細胞の上でインキュベートした。インキュベーション後、結合していない抗体を洗い流し、Ｆａｂ－ＺＡＰを細胞の上に加えた。新たに形成された複合体（抗ネクチン４抗体＋Ｆａｂ－ＺＡＰ）は、サポリンが放出された細胞に内在化され、タンパク質合成を停止させ、細胞死をもたらした。抗体の内在化能力は、細胞の生存度によって間接的に決定され、細胞死滅はより効率的であり、抗体の内在化能力はより優れていた。
各抗体について、発光対抗ネクチン－４抗体濃度をグラフにプロットした。結果を図４に示す。エンホルツマブ及びＮ４１は両方、ＳＵＭ１８５細胞及びＳＵＭ１９０細胞の両方で、内在化を誘導する能力において非常に強力であった。
実施例５：アンカーネクチン－４ドメイン欠失タンパク質への結合
内在化抗体エンホルツマブ及びＮ４１は、ヒトネクチン－４の異なるドメインに結合する能力について評価された。
野生型ｈｕネクチン４タンパク質は、以下の表１にまとめた３つの細胞外Ｉｇ様ドメイン（Ｖ、Ｃ１及びＣ２）から構成される。
Figure 2023512036000057
ネクチン－４ドメイン上の抗体の結合の特徴付けは、野生型ヒトネクチン－４タンパク質を発現するように作製された細胞及びＩｇ様Ｃ２タイプ１及びＩｇ様Ｃ２タイプ２ドメインを有し、Ｉｇ様Ｖドメインを欠く改変ネクチン－４（Ｃ１Ｃ２コンストラクト）を発現するように作製された細胞を使用して、フローサイトメトリーによって行われた。後者のタンパク質は、フローサイトメトリー細胞選別用のＶ５タグをさらに有し、細胞は、ネクチン４－Ｃ１Ｃ２－Ｖ５選別細胞として使用された。
野生型ネクチン－４（Ｃｌ．３Ｃ８細胞株）、Ｃ２コンストラクト（Ｉｇ様Ｃ２タイプ２ドメインを含み、ＶドメインとＣ１ドメインの両方を欠く）及びＣ１Ｃ２コンストラクトにより、試験抗体がＶ又は異なるＣドメインに結合するかの判断が可能となる。簡潔には、異なるヒトネクチン－４ドメインをコードする核酸配列をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物は、適切な制限部位で発現ベクターに挿入された。リーダーペプチド並びにＣ１Ｃ２及びＣ２についてアミノ酸配列ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号１３）を有するＮ末端Ｖ５タグを付加し、細胞表面での発現をフローサイトメトリーにより確認した。得られた異なるヒトネクチン－４ドメイン断片を含むタンパク質のアミノ酸配列を以下に示す（Ｖ５タグに下線が引かれている）。次いで、ベクターをＣＨＯ細胞株に遺伝子移入して、細胞表面で異なるネクチン－４ドメインタンパク質を発現する安定なクローンを得た。
ｈｕネクチン４ Ｃｌ．３Ｃ８細胞株（野生型ネクチン－４）のネクチン－４アミノ酸配列：
Figure 2023512036000058
ｈｕネクチン４－Ｃ１Ｃ２－Ｖ５細胞株のネクチン－４アミノ酸配列（Ｖドメインを欠失）：
Figure 2023512036000059
ｈｕネクチン４－Ｃ２－Ｖ５細胞株のネクチン－４アミノ酸配列（Ｖ及びＣ１ドメインを欠失）：
Figure 2023512036000060
内在化抗体Ｎ４１及びエンホルツマブは両方、ネクチン－４タンパク質全体に結合し、Ｖドメインを欠いたＣ１Ｃ２コンストラクトへの結合を喪失した。したがって、Ｎ４１及びエンホルツマブは、Ｖドメイン内のネクチン－４に結合する。
実施例６：乳癌細胞に対するエキサテカンＡＤＣのインビトロ細胞毒性（ネクチン－４高／ＳＵＭ１８５モデル）
本発明者らは、エキサテカンに複合化されたヒトＩｇＧ１アイソタイプとして配列番号３及び４のＶＨ及びＶＬを有する抗Ｉｇ様Ｖドメイン抗体エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）によるＳＵＭ１８５細胞の死滅を評価した。この実験では、エンホルツマブ抗体は、同じ毒素と均等な薬物対抗体比で結合した対照抗体と共に試験された。ＡＤＣは、スペーサー、細胞内で切断可能なジペプチドバリン－シトルリン（ＶＣ）及びＰＡＢ自己排除スペーサーを含む、以下に示すリンカーを介して、１抗体あたり毒素８（ＤＡＲ＝８）で、抗体がエキサテカンに複合化された状態で調製された。
Figure 2023512036000061
各ＡＤＣについて、ある濃度範囲のＡＤＣをネクチン－４発現細胞の上でインキュベートした。インキュベーション後、ＣＴＧ基質を１／１の比率で添加し、発光シグナルをプレートリーダー（Ｅｎｓｐｉｒｅ）で読み取り、細胞生存度に比例するＡＴＰ存在（代謝的に活性な細胞の指標）の定量化を可能にした。
結果を図５に示す。ｍＡｂＡ－ＶＣ－エキサテカンは、非標的アイソタイプ対照ＡＤＣ（ＩＣ－ＶＣ－エキサテカン）よりも効率的にＳＵＭ１８５を死滅させることができた。
実施例７：乳癌細胞に対するエキサテカン及びＤｘｄ ＡＤＣのインビトロ細胞毒性（低ネクチン－４／ＳＵＭ１９０モデル）
抗Ｉｇ様Ｖドメイン抗体エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）を、実施例６に示す構造を有するＶＣ－エキサテカンリンカーを介してエキサテカンに、又はＧＧＦＧ－Ｄ×Ｄと呼ばれる細胞内で切断可能なテトラペプチドリンカーを介してカンプトテシン類似体ＤｘＤに複合化した。アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体も各リンカーに複合化した。各リンカーは、１抗体あたり毒素８（ＤＡＲ＝８）で抗体に複合化された。
ＧＧＦＧ－ＤｘＤリンカー（ＧＧＦＧ－ＤｘＤ）の構造は、以下の通りであった。
Figure 2023512036000062
インビトロ細胞傷害性は、実施例６のように評価された。結果を図６に示す。ｍＡｂＡ－ＶＣ－エキサテカン免疫複合体は、ｍＡｂＡ－ＧＧＦＧ－ＤｘＤ免疫複合体よりも効率的にネクチン－４低発現ＳＵＭ１９０細胞を死滅させることができた。
実施例８：乳癌細胞に対する異なる切断可能なリンカーを有するエキサテカンＡＤＣのインビトロ細胞傷害性（ネクチン－４低／ＳＵＭ１９０モデル）
本発明者らは、バリン－シトルリン－ＰＡＢリンカー、バリン－アラニン－ＰＡＢリンカー又はＰＥＧ８－バリン－アラニン－ＰＡＢリンカーの何れかを介してエキサテカンに複合化されたヒトＩｇＧ１アイソタイプとして配列番号３及び４のＶＨ及びＶＬを有する抗Ｉｇ様Ｖドメイン抗体エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）によるＳＵＭ１９０細胞の死滅を評価した。それぞれの場合において、エンホルツマブは、同じ毒素と均等な薬物対抗体比で結合したアイソタイプ対照（ＩＣ）抗体と共に試験された。１抗体あたり毒素８（ＤＡＲ＝８）でリンカーを介して抗体がエキサテカンに複合化されたＡＤＣを調製した。
バリン－シトルリン－ＰＡＢリンカー（ＶＣ－エキサテカン）の構造は、実施例６に示される通りであった。ＰＥＧ８－バリン－シトルリン－ＰＡＢリンカー（ＰＥＧ８－ＶＣ－エキサテカン）の構造は、化合物６として本明細書に示されている。
バリン－アラニン－ＰＡＢリンカー（ＶＡ－エキサテカン）の構造は、以下の通りであった。
Figure 2023512036000063
ＰＥＧ８－バリン－アラニン－ＰＡＢリンカー（ＰＥＧ８－ＶＡ－エキサテカン）の構造は、以下の通りであった。
Figure 2023512036000064
インビトロ細胞傷害性は、実施例６のように評価された。結果を図７に示す。ｍＡｂＡに複合化された場合、各エキサテカンリンカーは、ネクチン－４低発現ＳＵＭ１９０細胞の効率的な死滅を可能にした。
実施例９：ヒト乳癌のマウスモデルにおけるＡＤＣのインビボ有効性（ネクチン－４低／ＳＵＭ１９０モデル）
本発明者らは、バリン－シトルリン－ＰＡＢリンカー（ＶＣ－エキサテカン）、バリン－アラニン－ＰＡＢリンカー（ＶＡ－エキサテカン）又はＰＥＧ８－バリン－アラニン－ＰＡＢリンカー（ＰＥＧ８－ＶＡ－エキサテカン）の何れかを介して、それぞれエキサテカンに複合化された、エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体のインビボでの有効性を比較した。また、細胞内で切断可能なテトラペプチドリンカー（ＧＧＦＧ－ＤｘＤ）を介して抗体に複合化された六環カンプトテシン類似体ＤｘＤも試験した。各リンカー及び毒素は、１抗体あたり毒素８（ＤＡＲ＝８）の薬物対抗体当量比で複合化された。
ＳＵＭ１９０細胞を、ＰＢＳで１／２に希釈した成長因子を含む１００μｌのマトリゲル中の５０万細胞の用量で、ＣＢ１７－ＳＣＩＤ免疫不全マウスに皮下注射した。腫瘍が１９５～２５０ｍｍ３の体積に達したとき、５ｍｇ／ｋｇのカンプトテシンＡＤＣの単回注射による静脈内処置のために、マウスを無作為にグループ化した。腫瘍の成長は、週に２回フォローされた。カプラン・マイヤー生存曲線は、以下の基準に従い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７ソフトウェアを使用して作成された。腫瘍体積が１５００ｍｍ３に達したとき、マウスを安楽死させ、屠殺日に死亡したと見なした。腫瘍が壊死の兆候を示したとき、マウスを安楽死させ、同日に死亡したと見なした。
結果は、５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＶＣ－エキサテカン、ＶＡ－エキサテカン及びＰＥＧ８－ＶＡ－エキサテカンが全て同様に腫瘍体積の増加を防ぐのに効果的であり、全て腫瘍体積の増加を防止する上でＧＧＦＧ－ＤｘＤよりも効果的であったことを示した。結果を図８に示す。
実施例１０：ヒト乳癌のマウスモデル（ネクチン－４低／ＳＵＭ１９０モデル）におけるＡＤＣの有効性に対する様々な抗体の効果
本発明者らは、それぞれが同じＰＥＧ８－バリン－アラニン－ＰＡＢリンカー（ＰＥＧ８－ＶＡ－エキサテカン）を介してエキサテカンに結合した場合の、エンホルツマブ（ｍＡｂＡ）と、ネクチン－４のＩｇＶドメインに少なくとも部分的に結合した別のネクチン－４結合抗体（ｍＡｂＢ）のインビボ有効性を比較した。また、ＰＥＧ８－ＶＡ－エキサテカンに結合したアイソタイプ対照（ＩＣ）抗体及び細胞内で切断可能なテトラペプチドリンカー（ＧＧＦＧ－ＤｘＤ）を介して結合した六環カンプトテシン類似体ＤｘＤも試験した。各リンカー及び毒素は、１抗体あたり毒素８（ＤＡＲ＝８）の薬物対抗体当量比で複合化された。
ＳＵＭ１９０細胞を、ＰＢＳで１／２に希釈した成長因子を含む１００μｌのマトリゲル中の５０万細胞の用量で、ＣＢ１７－ＳＣＩＤ免疫不全マウスに皮下注射した。腫瘍が１９５～２５０ｍｍ３の体積に達したとき、５ｍｇ／ｋｇのカンプトテシンＡＤＣの単回注射による静脈内処置のために、マウスを無作為にグループ化した。腫瘍の成長は、週に２回フォローされた。カプラン・マイヤー生存曲線は、以下の基準に従い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７ソフトウェアを使用して作成された。腫瘍体積が１５００ｍｍ３に達したとき、マウスを安楽死させ、屠殺日に死亡したと見なした。腫瘍が壊死の兆候を示したとき、マウスを安楽死させ、同日に死亡したと見なした。
結果は、５ｍｇ／ｋｇの用量で、ｍＡｂＡ－ＰＥＧ８－ＶＡ－エキサテカンとｍＡｂＢ－ＰＥＧ８－ＶＡ－エキサテカンが同様に腫瘍体積の増加を防ぐのに効果的であることを示した。両方、腫瘍体積の増加を防止する上で、ｍＡｂＡ－ＧＧＦＧ－ＤｘＤよりも効果的であった。結果を図９に示す。
本明細書で引用される、刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、本明細書の他の箇所でなされる特定の文献の何れかの個別に提供される組み込みにかかわらず、（法律によって許される最大の限度で）各参考文献が個々に及び具体的に参照により組み込まれることが示され、本明細書でその全体において記載されているかのように、同定度に参照により全体的に本明細書に組み込まれる。
別段の指定がない限り、本明細書で提供される全ての厳密値は、対応する近似値の代表である（例えば、特定の要因に関して提供される全ての代表的厳密値又は測定値は、必要に応じて、「約」により修飾される対応する近似測定値も提供すると見なされ得る）。数値に関連して「約」が使用される場合、これは、特定された数値の＋／－１０％に対応する値を含むと特定できる。
１つ又は複数の要素に関する「含む」、「有する」、「包含する」又は「含有する」などの語を使用した本発明の何らかの態様又は実施形態の本明細書の記述は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その特定の１つ又は複数の要素「からなる」、「から基本的になる」又はそれを「実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態に対する支持を提供するものとする（例えば、特定の要素を含む場合の本明細書に記載の組成物は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載するものとしても理解されるべきである）。
本明細書で提供されるあらゆる実施例又は代表的な語（例えば、「など」）の使用は、本発明を単により良好に明らかにするものとして意図され、別段の主張がない限り、本発明の範囲において限定を提起しない。本明細書のいかなる語も、何らかの請求項に記載されていない要素を本発明の実施に必須であるものとして示すものと解釈すべきではない。

Claims (36)

  1. 個体において癌を処置し、且つ／又は腫瘍細胞を死滅させる方法であって、治療有効量の、カンプトテシン類似体に複合化されたネクチン－４結合タンパク質を前記個体に投与することを含み、カンプトテシン類似体に複合化された前記ネクチン－４結合タンパク質は、式（Ｉ）：
    Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）） 式（Ｉ）
    （式中、
    Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質であり；
    Ｘは、Ａｂ及びＺを連結するリンカー分子であり、Ｘは、生理学的条件下、任意選択により細胞内条件下において切断可能な部分、任意選択によりプロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチドを含み、任意選択により、Ｘは、前記プロテアーゼ切断可能なペプチドとＺとの間に位置する自己脱離スペーサーをさらに含み；及び
    Ｚは、エキサテカン分子である）
    によって表される免疫複合体である、方法。
  2. 前記個体は、免疫組織化学によって決定される、腫瘍細胞上の低又は中程度のネクチン－４発現によって特徴付けられる癌を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 癌の処置及び／又は腫瘍細胞の死滅を、それを必要とする個体において行う方法であって、前記個体は、腫瘍細胞上の低又は中程度のネクチン－４発現によって特徴付けられるネクチン－４発現癌を有し、前記方法は、治療有効量の、リンカーを介してカンプトテシン類似体に複合化されたネクチン－４結合タンパク質を前記個体に投与することを含む、方法。
  4. 前記個体は、オーリスタチンに複合化されたネクチン－４結合剤による処置後に再発及び／又は進行しており、任意選択により、オーリスタチンに複合化された前記ネクチン－４結合タンパク質は、エンホルツマブベルドチンである、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
  5. オーリスタチンに複合化されたネクチン－４結合剤、任意選択によりエンホルツマブベルドチンによる処置後、応答せず、再発し、且つ／又は進行している癌を有する個体において癌を処置し、且つ／又は腫瘍細胞を死滅させる方法であって、治療有効量の、リンカーを介してカンプトテシン類似体に複合化されたネクチン－４結合タンパク質を前記個体に投与することを含む方法。
  6. 前記個体は、尿路上皮癌、任意選択により進行した再発性又は転移性の尿路上皮癌を有する、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
  7. 前記個体は、乳癌を有する、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
  8. 前記個体は、ＴＮＢＣを有する、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
  9. 前記個体は、エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体の検査が陽性であり、且つ過剰ＨＥＲ２タンパク質の検査が陰性である乳癌を有する、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
  10. 前記個体は、非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌又は食道癌を有する、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
  11. 前記癌は、ＨＥＲ２陽性である、請求項１～７又は１０の何れか一項に記載の方法。
  12. 腫瘍におけるネクチン－４発現のレベルの評価又は検出に依存しない、請求項１～１１の何れか一項に記載の方法。
  13. 前記個体が、ネクチン－４を発現する腫瘍細胞を有するかを決定する予備ステップを含む、請求項１～１２の何れか一項に記載の方法。
  14. ネクチン－４に特異的に結合する前記抗体は、ヒトネクチン－４ポリペプチドのＩｇ様Ｖセットドメインに結合する、請求項１～１３の何れか一項に記載の方法。
  15. 前記リンカーは、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチドを含む、請求項１～１４の何れか一項に記載の方法。
  16. 前記プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチドは、バリン－シトルリン、バリン－アラニン又はフェニルアラニン－リジンジペプチドである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラ又はペンタペプチドは、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンを含む、請求項１５に記載の方法。
  18. エキサテカンに複合化された前記ネクチン－４結合タンパク質は、化合物１の分子をインビボで、任意選択により前記腫瘍内において、任意選択により腫瘍細胞内において放出又は送達する、請求項１～１７の何れか一項に記載の方法。
  19. 前記ネクチン－４結合タンパク質は、ヒトネクチン－４ポリペプチド上のエピトープへの結合について、抗体ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４１の重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体と競合する、請求項１～１８の何れか一項に記載の方法。
  20. 前記ネクチン－４結合タンパク質は、抗体ＡＳＧ－２２ＭＥ、１４Ａ５．２又はＮ４の機能保存的変異体である、請求項１～１９の何れか一項に記載の方法。
  21. 前記ネクチン－４結合タンパク質は、配列番号１の残基３２～１４４のアミノ酸配列を有するネクチン－４ Ｉｇ様Ｖセットドメイン上のエピトープに結合する、請求項１～２０の何れか一項に記載の方法。
  22. カンプトテシン類似体に複合化された抗体を含む組成物であって、カンプトテシン類似体に複合化された前記抗体は、式（Ｘ）：
    Ａｂ－（Ｙ）－（Ｘ）－（Ｙ’）－（Ｚ） 式（Ｘ）
    （式中、
    Ａｂは、抗体であり；
    Ｙは、任意選択により、存在しないか、又はスペーサー、任意選択により置換若しくは非置換アルキル若しくはヘテロアルキル鎖であって、任意選択により、１つ以上の原子は、炭素以外、例えば酸素、硫黄、窒素若しくは他の原子であり得る、置換若しくは非置換アルキル若しくはヘテロアルキル鎖であり、任意選択により、前記鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド又はアルキルアミドで置換されており、Ｙは、２～１００原子の鎖長を有し、任意選択により、さらに、Ｙは、前記抗体のアミノ酸の側鎖との反応基の反応物の残基を含み；
    Ｘは、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであるか又はそれを含み；
    Ｙ’は、任意選択により、存在しないか、又は任意選択により自己脱離スペーサー若しくは非自己脱離スペーサーを含むスペーサーであり；及び
    Ｚは、エキサテカン分子である）
    によって表される免疫複合体である、組成物。
  23. Ｘは、ｖａｌ－ｃｉｔ、ｖａｌ－ａｌａ又はｖａｌ－ｐｈｅジペプチドを含み、及びＹ’は、自己脱離スペーサーであり、任意選択により、Ｙ’は、ｐ－アミノベンジル単位を含む、請求項２２に記載の組成物。
  24. エキサテカンに複合化された前記抗体は、化合物１又は２の分子をインビボで、任意選択により腫瘍内において、任意選択により腫瘍細胞内において送達又は放出する、請求項２２又は２３に記載の組成物。
  25. 試料中の前記免疫複合体の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、（－（Ｙ）－（Ｘ）－（Ｙ’）－（Ｚ））単位で機能化されている、１抗体あたり少なくとも２、４、６又は８個のアミノ酸残基を有する、請求項２２～２４の何れか一項に記載の組成物。
  26. 前記抗体は、ヒトネクチン－４ポリペプチドに結合する、請求項２２～２５の何れか一項に記載の組成物。
  27. リンカー－エキサテカン分子であって、式Ｖ：
    （Ｒ）－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ） 式（Ｖ）
    （式中、
    Ｒは、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル若しくはカルボキシル基と反応するか、又は抗原結合タンパク質若しくは抗体のアミノ酸に結合されている相補的な反応基（Ｒ’）と反応する基であり；
    Ｙは、任意選択により、存在しないか又はスペーサーであり；
    Ｐｅｐは、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカー、任意選択によりバリン－シトルリン、バリン－アラニン又はフェニルアラニン－リジンジペプチドであるか又はそれを含み；
    Ｙ’は、任意選択により、存在しないか、又はスペーサー、任意選択により自己脱離スペーサー若しくは非自己脱離スペーサーであり；及び
    Ｚは、エキサテカン分子である）
    によって表されるリンカー－エキサテカン分子。
  28. 式ＶＩＩＩ～Ｘの何れか１つの構造を有するか、又は化合物５～１１若しくは１５～１７の何れか１つの構造を有するリンカー－エキサテカン組成物。
  29. 免疫複合体を作製するための方法であって、任意選択により、前記免疫複合体は、癌の処置における使用のためのものであり、前記方法は、リンカー（Ｘ）を介してエキサテカン分子を抗原結合タンパク質に複合化することを含み、任意選択により、前記リンカー－エキサテカン分子は、請求項２７又は２８に記載の構造を有する、方法。
  30. 腫瘍抗原、任意選択によりネクチン－４に特異的に結合する抗原結合タンパク質又は抗体を提供することと、抗体薬物複合体が形成されるように適した条件下において、前記抗原結合タンパク質又は抗体を、エキサテカン分子を含む分子と接触及び／又は反応させることと、前記抗体薬物複合体を分離することとを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記抗原結合タンパク質又は抗体は、カンプトテシン類似体又は前記エキサテカン分子に、前記抗原結合タンパク質又は抗体（Ａｂ）及びカンプトテシン類似体又は前記エキサテカン分子を連結するリンカー（Ｘ）を介して複合化される、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 腫瘍抗原、任意選択によりネクチン－４に特異的に結合する抗原結合タンパク質又は抗体を提供することと、前記抗原結合タンパク質又は抗体を、式Ｖ：
    （Ｒ）－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ） 式（Ｖ）
    （式中、
    Ｒは、前記抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル若しくはカルボキシル基と反応するか、又は前記抗原結合タンパク質若しくは抗体のアミノ酸に結合されている相補的な反応基（Ｒ’）と反応する基であり；
    Ｙは、任意選択により、存在しないか又はスペーサーであり；
    Ｐｅｐは、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカー、任意選択によりバリン－シトルリン、バリン－アラニン又はフェニルアラニン－リジンジペプチドであるか又はそれを含み；
    Ｙ’は、任意選択により、存在しないか、又はスペーサー、任意選択により自己脱離スペーサー若しくは非自己脱離スペーサーであり；及び
    Ｚは、エキサテカン分子である）
    によって表されるリンカー－エキサテカン分子と接触及び／又は反応させることとを含む、請求項２９～３１の何れか一項に記載の方法。
  33. カンプトテシン類似体に複合化された前記抗体は、式（Ｘ）：
    Ａｂ－（Ｙ）－（Ｘ）－（Ｙ’）－（Ｚ） 式（Ｘ）
    （式中、
    Ａｂは、抗体であり；
    Ｙは、任意選択により、存在しないか、又はスペーサー、任意選択により置換若しくは非置換アルキル若しくはヘテロアルキル鎖であって、任意選択により、１つ以上の原子は、炭素以外、例えば酸素、硫黄、窒素若しくは他の原子であり得る、置換若しくは非置換アルキル若しくはヘテロアルキル鎖であり、任意選択により、前記鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド又はアルキルアミドで置換されており、Ｙは、２～１００原子の鎖長を有し、任意選択により、さらに、Ｙは、前記抗体のアミノ酸の側鎖との反応基の反応物の残基を含み；
    Ｘは、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断可能なペプチジルリンカーであるか又はそれを含み；
    Ｙ’は、任意選択により、存在しないか、又は任意選択により自己脱離スペーサー若しくは非自己脱離スペーサーを含むスペーサーであり；及び
    Ｚは、エキサテカン分子である）
    によって表される免疫複合体である、請求項２９～３２の何れか一項に記載の方法。
  34. 前記抗原結合タンパク質又は抗体は、腫瘍細胞であって、その表面にネクチン－４を発現する腫瘍細胞において、ネクチン－４の細胞内内在化を誘導することができる、請求項１～２６又は２８～３３の何れか一項に記載の方法又は組成物。
  35. 前記抗原結合タンパク質又は抗体は、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－エキサテカン、Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカン、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ－エキサテカン、（ＰＥＧ）ｎ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－エキサテカン、（ＰＥＧ）ｎ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカン又は（ＰＥＧ）ｎ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ－エキサテカンを含むリンカー－エキサテカン部分に複合化され、ｎは、１～１６の整数、任意選択により１～８の整数、任意選択により８である、請求項１～２６又は２８～３４の何れか一項に記載の方法又は組成物。
  36. 請求項２９～３５の何れか一項に記載の方法によって産生される免疫複合体。
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