WO2024012536A1 - 抗Nectin-4抗体、其抗体药物偶联物及应用 - Google Patents

抗Nectin-4抗体、其抗体药物偶联物及应用 Download PDF

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Abstract

一种抗Nectin-4抗体、其抗体药物偶联物及应用，该抗Nectin-4抗体及其抗体药物偶联物可用于治疗疾病。

Description

抗Nectin-4抗体、其抗体药物偶联物及应用 技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及抗Nectin-4抗体、其抗体药物偶联物及应用。
背景技术
Nectin-4是免疫球蛋白超家族(IgSF)中细胞黏附分子之一，是一种钙非依赖性细胞黏附分子(cell adhesionmolecules,CAM)，也被称为脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白(poliovirus receptor-like protein 4,PVRL4)或脊髓灰质炎病毒相关受体(poliovirus receptor-related,PRR4)。Nectin-4是一种单次跨膜蛋白，包含胞外区、跨膜区和胞内区，在胞外区含有三个高度糖基化的结构域，即靠近胞膜的两个C2结构域和远离细胞膜的一个V结构域。Nectin-4分子通过自身N-端的V结构域与H蛋白结合，从而实现病毒对细胞的感染。Nectin-4通过与钙黏素相互作用参与粘着连接的形成和维持。Nectin-4介导Ca2+非依赖性的粘附，通过驱动细胞间附着和基质非依赖性整合素蛋白β4/SHP-2/c-Src的活化来促进锚定非依赖性生长。
Nectin-4在胎儿发育过程中表达，与其他Nectins在成人组织中的广泛表达不同，其在成人组织中的表达显著下降。多个研究机构证实Nectin-4在包括乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中作为致癌因子的肿瘤相关抗原再表达。Nectin-4在正常成人组织中的皮肤角质层、皮肤附属结构(汗腺和毛囊)、膀胱移行上皮、唾液腺、食管、乳腺和胃中弱到中等程度表达，在喉头、垂体，胎盘，睾丸，输尿管和子宫有较弱的表达。该靶点具有较好的特异性，可以介导抗体内吞，是ADC药物潜在的治疗靶点。
发明内容
本申请提供一种抗Nectin-4的抗体及其药物偶联物。
本申请的一个或多个实施方式提供一种抗体或抗原结合单元，所述抗体或抗原结合单元特异性结合Nectin-4，并且包含(a)-(f)中的一个或多个：
(a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
(d)VL CDR1，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
(e)VL CDR2，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
(f)VL CDR3，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在一个或多个实施方式中，所述抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3，可选的还包含如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1和如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2中的一个或多个。
在一个或多个实施方式中，所述抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3。
在一个或多个实施方式中，所述抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3。
在一个或多个实施方式中，所述抗体或抗原结合单元包含重链可变区和/或轻链可变区。在一个或多个实施方式中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与 SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一个或多个实施方式中，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一个或多个实施方式中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在一个或多个实施方式中，所述抗体或抗原结合单元还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。在一个或多个实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。在一个或多个实施方式中，所述轻链恒定区是λ链或κ链恒定区。
在一个或多个实施方式中，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一个或多个实施方式中，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一个或多个实施方式中，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在一个或多个实施方式中，所述抗体包含重链和轻链。在一个或多个实施方式中，所述抗体包含两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。
在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一个或多个实施方式中，所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一个或多个实施方式中，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
本申请的一个或多个实施方式提供生物材料，其选自：
(1)一种核酸，其编码所述的抗体或抗原结合单元或其一部分；
(2)包含(1)的载体、宿主细胞或微生物；
(3)上述(2)的表达产物、悬浮液或上清液。
在一个或多个实施方式中，编码SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的核酸序列如SEQ  ID NO:13所示。在一个或多个实施方式中，编码SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO:15所示。
表1序列

本申请的一个或多个实施方式提供制备本申请中上述抗体或抗原结合单元的方法，包括：培养本申请中上述宿主细胞使本申请上述抗体或抗原结合单元表达，及自宿主细胞中分离所述抗体或抗原结合单元。
本申请的一个或多个实施方式提供一种抗体药物偶联物，包含通过接头与药物(如本文所述药物)偶联的所述的抗体或抗原结合单元，或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一个或多个实施方式中，所述接头为可裂解的接头。
本申请的一个或多个实施方式提供具有式I-A、式I-B、式I-C结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：

Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
D为药物(如本文所述药物)。
本申请的一个或多个实施方式提供具有式I-A结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中
Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
D为药物(如本文所述药物)；
M为其中*连接Abu，**连接B，R选自：-(CH2)r-、-(CHRm)r-、C3-C8碳环基、-O-(CH2)r-、亚芳基、-(CH2)r-亚芳基-、-亚芳基-(CH2)r-、-(CH2)r-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-(CH2)r-、C3-C8杂环基、-(CH2)r-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-和-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2)r-；其中各Rm独立为H、C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
B为或为其中*连接M，**连接L，***连接G；
L为-(AA)i-(FF)f-，其中，AA为氨基酸或多肽，i是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；或各AA独立选自以下氨基酸或肽序列：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、 β-Ala-Leu-Ala-Leu和Gly-Phe-Leu-Gly；各FF独立为 其中各RF独立为C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NO2或卤素，其中*连接AA，**连接D，z为0、1、2、3或4；f为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
G为其中n为1-24，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；
p为1-10。
在一个或多个实施方式中，R为-(CH2)r-，r为1或5。
在一个或多个实施方式中，AA为Val-Cit，i为1。
在一个或多个实施方式中，各FF独立为 其中*连接AA，**连接D。
在一个或多个实施方式中，FF为f为1，其中*连接AA，**连接D。
在一个或多个实施方式中，L为其中*连接B，**连接D。
在一个或多个实施方式中，L为其中*连接B，**连接D。
在一个或多个实施方式中，G为n为4-12。
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
在一个或多个实施方式中，n为4。
在一个或多个实施方式中，n为8。
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
本申请的一个或多个实施方式提供具有式I-B结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中
Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
D为药物(如本文所述药物)；
M为其中*连接Abu，**连接L，R选自：-(CH2)r-、-(CHRm)r-、C3-C8碳环基、-O-(CH2)r-、亚芳基、-(CH2)r-亚芳基-、-亚芳基-(CH2)r-、-(CH2)r-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-(CH2)r-、C3-C8杂环基、-(CH2)r-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-和-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2)r-；其中各Rm独立为H、C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
L为-(AA)i-(FF)f-，其中，AA为氨基酸或多肽，i是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；各AA独立选自以下氨基酸或肽序列：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu和Gly-Phe-Leu-Gly；各FF独立为 其中各RF独立为C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NO2或卤素，其中*连接AA，**连接D；z为0、1、2、3或4；f为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
p为1-10。
在一个或多个实施方式中，R为-(CH2)r-，r为1或5。
在一个或多个实施方式中，AA为Val-Cit，i为1。
在一个或多个实施方式中，各FF独立为 其中*连接AA，**连接D。
在一个或多个实施方式中，FF为f为1；其中*连接AA，**连接D。
在一个或多个实施方式中，L为其中*连接M，**连接D。
在一个或多个实施方式中，L为其中*连接M，**连接D。
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
本申请的一个或多个实施方式提供具有式I-C结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中
Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
D为药物(如本文所述药物)；
M为其中*连接Abu，**连接V，R选自：-(CH2)r-、-(CHRm)r-、C3-C8碳环基、-O-(CH2)r-、亚芳基、-(CH2)r-亚芳基-、-亚芳基-(CH2)r-、-(CH2)r-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-(CH2)r-、C3-C8杂环基、-(CH2)r-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-和-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2)r-；其中各Rm独立为H、C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
V为其中*连接M，**连接-NH-CH2-；
p为1-10。
在一个或多个实施方式中，R为-(CH2)r-，r为1或5。
在一个或多个实施方式中，V为其中*连接M，**连接-NH-CH2-。
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
本申请的一个或多个实施方式提供具有式I-A-1或I-A-2结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-A-1、I-A-2为：
其中
Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
R选自：-(CH2)r-、-(CHRm)r-、C3-C8碳环基、-O-(CH2)r-、亚芳基、-(CH2)r-亚芳基-、-亚芳基-(CH2)r-、-(CH2)r-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-(CH2)r-、C3-C8杂环基、-(CH2)r-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-和 -(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2)r-；其中各Rm独立为H、C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
D为药物(如本文所述药物)；
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；
p为1-10。
在一个或多个实施方式中，R为-(CH2)r-，r为1或5。
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
在一个或多个实施方式中，n为4。
在一个或多个实施方式中，n为8。
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
本申请的一个或多个实施方式提供具有式I-A-3或I-A-4结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-A-3、I-A-4为：
其中
Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
D为药物(如本文所述药物)；
n为1-24的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24；
p为1-10。
在一个或多个实施方式中，n为4-12。
在一个或多个实施方式中，n为4-8。
在一个或多个实施方式中，n为4。
在一个或多个实施方式中，n为8。
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
在一个或多个实施方式提供具有式I-A-5、I-A-6、I-A-7、I-A-8、I-A-9、I-A-10或I-A-11结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-A-5、I-A-6、I-A-7、I-A-8、I-A-9、I-A-10、I-A-11为：


其中
Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
D为药物(如本文所述药物)；
p为1-10。
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
在一个或多个实施方式中，本文所述抗体药物偶联物中药物为细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物。
在一个或多个实施方式中，药物为抗癌药物。
在一个或多个实施方式中，药物为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂。
在一个或多个实施方式中，药物为微管蛋白抑制剂，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、美登素(maytansine)类。
在一个或多个实施方式中，药物为奥瑞他汀(auristatin)类，选自单甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E；MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(monomethyl auristatin F；MMAF)、和澳瑞他汀F(auristatin F；AF)。
在一个或多个实施方式中，药物为DNA损伤剂，选自卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物PBD(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)。
在一个或多个实施方式中，药物为DNA拓扑异构酶抑制剂或其盐，选自伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物SN-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(D-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3H)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(苯基甲基)-(2E)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(3-羟基苯基丙基)-(E)-2-丙烯酰胺、12-β-D-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6H)-二酮、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺。
在一个或多个实施方式中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。
在一个或多个实施方式中，药物为其中
X1和X2各自独立地为：
H，
羟基，
C1-C6烷基，
被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，
C2-C6烯基，
C2-C6炔基，
C1-C6烷氧基，
C1-C6氨基烷氧基，
卤素，
硝基，
氰基，
巯基，
烷硫基，
氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，
在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，
连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，
连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，
氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，
杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，
任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，
吗啉-1-基，或
哌啶-1-基；
X3为C1-C6烷基；
X4为H、-(CH2)q-CH3、-(CHRn)q-CH3、C3-C8碳环基、-O-(CH2)q-CH3、亚芳基-CH3、-(CH2)q-亚芳基-CH3、-亚芳基-(CH2)q-CH3、-(CH2)q-(C3-C8碳环基)-CH3、-(C3-C8碳环基)-(CH2)q-CH3、C3-C8杂环基、-(CH2)q-(C3-C8杂环基)-CH3、-(C3-C8杂环基)-(CH2)q-CH3、-(CH2)qC(O)NRn(CH2)q-CH3、-(CH2CH2O)q-CH3、-(CH2CH2O)q-CH2-CH3、-(CH2)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH3、-(CH2)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH2-CH3、-(CH2CH2O)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH3、-(CH2CH2O)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH2-CH3、或-(CH2CH2O)qC(O)NRn(CH2)q-CH3；其中各Rn独立为H、C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
**为连接点；
y为0、1或2；
Y为O、S或CR1DR2D，其中R1D和R2D各自独立地为H或C1-C6烷基；
s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0。
在一个或多个实施方式中，X4为H或C1-C6烷基。
在一个或多个实施方式中，药物为其中X1和X2各自独立地为C1-C6烷基、卤素或-OH，**为连接点。
在一个或多个实施方式中，所述C1-C6烷基为-CH3。
在一个或多个实施方式中，所述卤素为F。
在一个或多个实施方式中，药物为其中X1和X2各自独立地为C1-C6烷基、卤素或-OH，**为连接点。
在一个或多个实施方式中，所述C1-C6烷基为-CH3。
在一个或多个实施方式中，所述卤素为F。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自为-CH3。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自独立地为F、Cl、Br或I。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自为F。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自独立地为-CH3、F或-OH。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自独立地为F或-CH3。
在一个或多个实施方式中，X1为-CH3及X2为F。
在一个或多个实施方式中，药物为其中X1和X2各自独立地为C1-C6烷基、卤素或-OH，**为连接点。
在一个或多个实施方式中，所述C1-C6烷基为-CH3。
在一个或多个实施方式中，所述卤素为F。
在一个或多个实施方式中，药物为其中X1和X2各自独立地为C1-C6烷基、卤素或-OH；**为连接点。
在一个或多个实施方式中，所述C1-C6烷基为-CH3。
在一个或多个实施方式中，所述卤素为F。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自为-CH3。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自独立地为F、Cl、Br或I。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自为F。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自独立地为-CH3、F或-OH。
在一个或多个实施方式中，X1和X2各自独立地为F或-CH3。
在一个或多个实施方式中，X1为-CH3及X2为F。
在一个或多个实施方式中，药物为其中**为连接点；
R2为H或C1-C8烷基；
R3为H、C1-C8烷基、C3-C8碳环基、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环基)、C3-C8杂环基或C1-C8烷基-(C3-C8杂环基)；
R4为H、C1-C8烷基、C3-C8碳环基、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环基)、C3-C8杂环基或C1-C8烷基-(C3-C8杂环基)；
R5为H或甲基；
或者R4和R5连接形成碳环基，并具有式结构式-(CRaRb)j-，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C8烷基或C3-C8碳环基，j为2、3、4、5和6；
R6为H或C1-C8烷基；
R7为H、C1-C8烷基、C3-C8碳环基、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环基)、C3-C8杂环基或C1-C8烷基-(C3-C8杂环基)；
各个R8各自为H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环基或O-(C1-C8烷基)；
R9为H或C1-C8烷基；并且
R10为–C(R8)2–C(R8)2–芳基、–C(R8)2–C(R8)2–(C3-C8杂环基)或–C(R8)2–C(R8)2–(C3-C8碳环基)。
在一个或多个实施方式中，药物为其中**为连接点。
在一个或多个实施方式提供具有式I-A-12、I-A-13、I-A-14、I-A-15、I-A-16、I-A-17、I-A-18、I-A-19、I-A-20、I-A-21、I-A-22、I-A-23、I-A-24或I-A-25结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-A-12、I-A-13、I-A-14、I-A-15、I-A-16、I-A-17、I-A-18、I-A-19、I-A-20、I-A-21、I-A-22、I-A-23、I-A-24、I-A-25为：




其中
Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
p为1-10。
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
在一个或多个实施方式提供具有式I-B-1结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-B-1为：
其中
Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
p为1-10。
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
在一个或多个实施方式提供具有式I-C-1结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-C-1为：
其中
Abu为本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元；
p为1-10。
在一个或多个实施方式中，p为2-8。
在一个或多个实施方式中，p为4-8。
在一个或多个实施方式中，p为6-8。
在一个或多个实施方式中，p为7-8。
在一个或多个实施方式提供药物组合物，其包含本申请的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元、本申请的生物材料、或本申请的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物以及药物可接受的载体、赋形剂和/或辅料。在一个或多个实施方式中，所述药物组合物还包含任选的其他药物。
一个或多个实施方式提供了药物组合物，其包含抗体或抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物以及药物可接受的载体、赋形剂和/或辅料。在一个或多个实施方式中，所述药物组合物还包含任选的其他抗癌药物。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，所述药物组合物可以皮下给药、静脉给药、口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。
在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
在一个或多个实施方式提供本文所述的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元、生物材料、或抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物、或者药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。在一个或多个实施方式中，所述药物还与其他药物联用。
在一个或多个实施方式提供本文所述抗体或抗原结合单元、本申请的生物材料、或本申请的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物、或者本申请的药物组合物在治疗疾病中的用途。在一个或多个实施方式中，所述用途包括与其他抗癌药物联用。
一个或多个实施方式提供了治疗疾病的方法，该方法包括对有需要的患者施用有效量的本文所述抗体或抗原结合单元、抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或药物组合物。所述有效量是指活性化合物或药剂的量，其导致研究人员﹑兽医﹑医生或其他临床医生正寻求的组织、系统、动物、个体以及人的生物或药用响应，包括治疗疾病。通常，合适的剂量范围可以是约0.1～100毫克/千克，给药频率可以例如是每月给药一次。给药方式可以是静脉输注，静脉推注，也可以是皮下注射、肌肉注射等。在一个或多个实施方式中，所述方法还包括向患者施用其他抗癌药物。
一个或多个实施方式所述疾病为Nectin-4表达或过表达相关的疾病。在一个或多个实施方式中，所述疾病为Nectin-4异常表达相关的疾病。在一个或多个实施方式中，所述疾病为癌症或肿瘤。在一个或多个实施方式中，所述疾病为表达或过表达Nectin-4的肿瘤。在一个或多个实施方式中，所述疾病为表达或过表达Nectin-4的癌症。在一个或多个实施方式中，所述疾病为实体瘤或血液癌症。在一个或多个实施方式中，所述疾病选自乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌(TNBC)；局部、转移性TNBC)、胰腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌、鳞状细胞癌或肺腺癌)、头颈癌(例如，头部和颈部鳞状细胞癌)、宫颈癌(例如，宫颈鳞状细胞癌)、卵巢癌、绒毛膜癌、皮肤癌、食管癌(例如，食管腺癌)、胃癌、子宫癌(例如，子宫内膜癌)、胆囊癌、肝癌、肝细胞癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、结直肠癌、结肠癌和前列腺癌。
在一个或多个实施方式中，所述抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物为本申请式I-A、式I-B、式I-C的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物。
药学上可接受的盐包括抗体药物偶联物与该技术领域众所周知的各种各样的有机和无机抗衡离子产生的药学上可接受的盐，仅仅示例性盐包括，当分子含有酸性官能团时，有机或无机盐如钠盐﹑钾盐﹑钙盐﹑镁盐﹑铵盐﹑异丙胺﹑三甲胺﹑二乙胺基﹑三乙胺﹑三丙胺、乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、 咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基、哌啶、多胺树脂及四烷基铵盐等；以及当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、马来酸盐和草酸盐。酸的其它非限制例子包括硫酸、硝酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸水杨酸等。溶剂合物包括水合物。
一个或多个实施方式提供了制品，其包含本文所述的抗体或抗原结合单元、抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或者药物组合物；
容器；和
包装插页或标签或说明书，其指示该抗体或抗原结合单元、抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或者药物组合物用于治疗疾病。
附图说明
图1：抗体ASG-AM、ASG-22与T47D细胞的结合曲线；
图2：ADC对OVCAR-3、T-47D和MDA-MB-468细胞的增殖抑制效应；其中，图2A为ADC对OVCAR-3细胞的增殖抑制效应；图2B为ADC对T-47D细胞的增殖抑制效应；图2C为ASG-AM-MMAE对MDA-MB-468细胞的增殖抑制效应；
图3：ADC在人乳腺癌MDA-MB-468裸鼠皮下移植瘤模型中的肿瘤抑制活性；
图4：ADC在人绒毛膜癌JEG-3细胞株皮下异种移植雌性NOD/SCID小鼠动物模型中的肿瘤抑制活性。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中使用的科学和技术术语的含义是本领域技术人员所通常理解的含义。
定义
应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
本文所用的术语“包含”或“包括”意味着抗体、组合物或方法等包括所列举的元素，例如组份或步骤，但不排除其它。“基本上由……组成”意味着抗体、组合物或方法等排除对组合的特征有根本影响的其它元素，但不排除对抗体、组合物或方法等无本质上影响的元素。“由……组成”意味着排除未特别列举的元素。
本文所用术语“抗体”指免疫球蛋白(Ig)分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。抗体包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab-和F(ab')2片段、Fv和Fab表达库。
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。
本发明公开的抗体、抗原结合单元或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化、嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(例如类Fab、类Fab'和类F(ab')2)、类单链Fvs(scFv)。
术语“单克隆抗体”(mAb)是指一群这样的抗体分子：其只含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子中的一种分子种类。具体地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该群体的所有分子中是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸的接头(linker)连接而成的抗体。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子通常是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。在一个或多个实施方式中，免疫球蛋白分子的种类为IgG。两条重链和两条轻链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为Vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为Vλ。
抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)决定了抗原识别和特异性。轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是形成抗原结合结构域的短的、非连续的与抗原特异性结合的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“框架”(“FR”)区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。框架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。具有特定位置的CDR的抗原结合域形成了与抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其抗原表位的非共价结合。通常在抗体分子中，每条重链和轻链有三个CDR，分别被称为VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3。按照位置顺序，通常重链可变区包含VH FR1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VH CDR3以及VH FR4，轻链可变区包含VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3以及VL FR4。对于给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以通过已知方法鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸(参见Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest,(1983)和Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。
人源化抗体的框架区及CDR区不必准确对应于亲本序列，例如供体抗体CDR或共有框架可通过至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失而突变诱发，使得该位点的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。通常，至少80％、至少85％、更至少90％或至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR及CDR序列的那些残基。如本文使用的，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker,From Genes to Clones[从基因到克隆](Verlagsgesellschaft,Weinheim,德国1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的各位置由该家族中最频繁出现于该位置的氨基酸占据。若两个氨基酸同等频繁地出现，则共有序列中可包括任一个。
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)和Chothia等在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services在“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用EU或Chothia编号系统。
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括但不限于鱼类、鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。
“重链恒定区”包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或变体或片段中的至少一种。抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，抗体的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。
“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的一部分氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接。
“嵌合抗体”指其可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施方案中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区来自人源。
本文所用术语“表位”包括任意能够特异性结合免疫球蛋白或其片段或T细胞受体的蛋白决定区。表位决定区通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。
如本文所用，术语“特异性结合”或“发生免疫反应”是指在免疫球蛋白分子与其目标抗原的一个或多个抗原决定簇之间发生的非共价相互作用。免疫学结合相互作用的强度或亲和力可以以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中较小的KD代表较大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可使用本领域熟知方法进行定量。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向同等影响该速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(koff)两者可通过计算浓度和实际的缔合和解离速率测定(参见Malmqvist,M.,Nature 361:186-87(1993))。koff/kon比率能够消除所有与亲和力无关的参数，并且等于平衡解离常数KD(参见Davies等人(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。特异性结合可由放射性配体结合测定、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术结合测定、或本领域技术人员已知的类似测定所测。
本发明中关于细胞、核酸、多肽等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA、RNA、多肽是指分别于细胞天然环境中的其它组分如DNA或RNA中的一种或多种所分离的分子。 本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一个或多个实施方式中，分离的核酸、多肽等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。
术语“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。
术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸、β-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。
如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates,Sunderland Mass.(1991))。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸(诸如α-、α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非常规氨基酸也可为适用于本公开多肽的组分。非常规氨基酸的示例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酰、σ-N-甲基精氨酸及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示方法中，左手方向为氨基末端方向，并且右手方向为羧基末端方向，与标准用法和惯例一致。常规(或天然)氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：Ala，一字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、缬氨酸(Val，V)等。
术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体形成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。
当应用于多肽时，术语“基本上相同”是指两个肽序列在诸如通过GAP或BESTFIT程序使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，并最优选至少99％序列同一性。
多聚核苷酸是由四个碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，或当多聚核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(U)。“多聚核苷酸序列” 可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。
术语“多核苷酸”、“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、DNA、RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
多聚核苷酸或多聚核苷酸序列(或多肽或抗体序列)与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“同一性或序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用目测或本领域已知的软件程序来确定该比对和同一性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al.eds.(2007)在Current Protocols in Molecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST，例如BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+Swi ssProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化都涵盖在本公开之内，条件是氨基酸序列的同一性保持至少90％，如至少92％、95％、98％或99％。在一些实施方案中，变化为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的取代。基因编码的氨基酸大致分以下类：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸盐、谷氨酸盐；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)无电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。其它家族的氨基酸包括(i)脂肪族-羟基家族的丝氨酸和苏氨酸；(ii)含酰胺家族的天冬酰胺和谷氨酰胺；(iii)脂肪族家族的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及(iv)芳族家族的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一些实施方案中，保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。例如，可以合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸单独的置换亮氨酸，用谷氨酸盐置换天冬氨酸盐，用丝氨酸置换苏氨酸，或用一个结构相关的氨基酸类似的置换一个氨基酸，且对所得分子的结合或特性不会有重要影响，特别是该置换不涉及结合位点内的氨基酸。氨基酸改变是否产生功能性肽可以容易地通过测定多肽衍生物的比活性来确定。所述测定在本文进行了详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域普通技术人员容易地制备。
在一些实施方案中，氨基酸取代具有如下效果：(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改进此类类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括 序列不同于天然存在的肽序列的各种突变蛋白。例如，可在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)中进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应当显著改变亲本序列的结构特性(例如，置换的氨基酸不应当趋于破坏亲本序列中存在的螺旋结构，或破坏表征亲本序列的其它类型二级结构)。人工识别的多肽的二级和三级结构的示例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354:105(1991)。
VL、VH的保守氨基酸取代的氨基酸数目可以为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。重链恒定区、轻链恒定区、重链或轻链的保守氨基酸取代的氨基酸数目可以为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个、约18个、约19个、约22个、约24个、约25个、约29个、约31个、约35个、约38个、约41个、约45个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。
本文所用术语“试剂”表示化学化合物、化学化合物混合物、生物大分子或由生物材料制得的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“经标记的”是指掺入可检测标记，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可由标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)，荧光标记物(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶标记物(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素酰基，被二级报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减小可能的空间位阻。术语“药剂”或“药物”是指适当施用于患者时能够诱导期望的治疗效果的化合物或组合物。
“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其±10％、±5％或±1％的范围。
“EC50”即半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。
“IC50”表示50％抑制浓度，即对指定的生物过程抑制一半时所需的药物或者抑制剂的浓度。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。
术语“癌症”意指或意在描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长失控。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤或白血病。此类癌症的更具体实例包括 但不限于大肠癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、腹膜癌、输卵管癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈鳞形细胞癌、鼻咽癌、喉癌、肺腺癌、肺鳞癌、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌、脑癌、肾癌、肾细胞癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、外阴癌、睾丸癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、子宫颈癌、膀胱癌、视网膜母细胞瘤、神经胶母细胞瘤、间皮瘤、口腔上皮样癌、绒毛膜癌和头颈癌。
术语“过表达”或“过表达的”可互换地指一种基因，与正常细胞相比，其通常在某些细胞，如癌细胞中以可检测到的更高水平的转录或翻译。过表达可以是蛋白质或RNA的过表达(由于增加的转录，转录后加工，翻译，翻译后加工，改变的稳定性和改变的蛋白质降解)，以及蛋白质运输模式改变导致的局部过表达(核定位增加)和增强的功能活性，例如，如增加底物的酶水解。与正常细胞或对照细胞相比，过表达可以是1％、5％、10％、20％、30％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些实施例中，本发明的抗Nectin-4抗体及抗体药物偶联物用于治疗表达或过表达Nectin-4的实体瘤。
如本文使用，术语“过表达Nectin-4的肿瘤”是指过表达Nectin-4的肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)。在一些实施例中，肿瘤样品中的Nectin-4表达高于免疫组织的背景水平(例如用免疫组织化学染色测定)表明肿瘤是过表达Nectin-4的肿瘤。检测肿瘤中Nectin-4表达的方法是本领域已知的，例如免疫组织化学测定法。
如本文所用，术语“给予”、“给药”和“施用”可互换使用，意指递送物质(例如，抗Nectin-4抗体或ADC)以实现治疗目的(例如，治疗与Nectin-4表达或过表达相关的疾病)。给予方式可以是肠胃外、肠内和局部。肠胃外给予通常是通过注射，包括但不限于静脉、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、以及胸骨内注射和输注。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指药物，例如抗体或ADC的量，该量足以降低或改善病症(例如癌症)或其一种或多种症状的严重程度和/或持续时间；预防病症进展；引起病症消退；预防与病症相关的一种或多种症状复发、发展、发作或进展；检测病症；或增强或改善另一疗法(例如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果的量。例如，抗体的有效量可以抑制肿瘤生长(例如，抑制肿瘤体积的增加)；减少肿瘤生长(例如，减小肿瘤体积)；减少癌细胞的数量；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。例如，有效量可以改善无病生存(DFS)、改善总体存活(OS)或降低复发的可能性。
术语“患者”和“受试者”可互换使用，是指需要诊断、预后或治疗的任何哺乳动物，包括但不限于人类、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛等。
如本文所用，术语“有需要”是指已将患者鉴定为需要特定方法或治疗。在一些实施例中，可以通过任何诊断方式进行识别。在本文描述的任何方法和治疗中，患者可能需要。
本文所用术语“治疗肿瘤的药物”是指具有抑制肿瘤在人体中发展或累进的功能特性的试剂，尤其是恶性(癌性)病变，诸如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病。抑制转移在很多情况下是抗肿瘤药的特性。
术语“抗体药物偶联物”或“ADC”是指与一个或多个化学药物连接的结合蛋白(如抗体或抗原结合单元)，其可以任选地为治疗剂或细胞毒性剂。在优选的实施例中，ADC包括抗体，药物(例如细胞毒性药物)和能够使药物与抗体附接或偶联的接头。可包含在ADC中的药物的非限制性实例是有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、用于基因治疗的载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢物、含硼剂、化学保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂(例如，TEC-家族激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂)和放射增敏剂。
术语“抗体药物偶联物”和“ADC”可互换使用。术语“抗Nectin-4抗体药物偶联物”和“抗Nectin-4 ADC”可互换使用，是指包含特异性结合Nectin-4的抗体的ADC，其中抗体与一种 或多种药物偶联。在一个或多个实施方式中，抗Nectin-4 ADC包含与依喜替康偶联的抗体。在一个或多个实施方式中，抗Nectin-4抗体或ADC与Nectin-4(例如人Nectin-4)结合。
术语“药物抗体偶联比”或“DAR”是指ADC的与抗体附接的药物(例如，依喜替康)的数量。ADC的DAR可以在1到10的范围内，但是取决于抗体上的连接位点的数量，更高的负载(例如20)也是可能的。提及负载到单个抗体上的药物的数量时，或可替代地，提及一组ADC的平均或均值DAR时，可以使用术语DAR。在一些实施方式中，其值选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。当考虑小分子药物的平均结合个数时，即抗体的药物平均结合数，或称为平均药物抗体偶联比，其值选自约0至约10，或约2至约8。在一些实施方式中，药物抗体偶联比为约3至约6。在另一些实施方式中，药物抗体偶联比为约6至约8，或约7至约8。DAR值在本文可用p表示。ADC的DAR值可利用紫外可见吸收光谱法(UV-Vis)、高效液相色谱-疏水色谱(HPLC-HIC)、高效液相色谱-反相色谱(RP-HPLC)、液相色谱质谱联用(LC-MS)等测定。这些技术在Ouyang,J.Methods Mol Biol,2013,1045:p.275-83中有记载。
各种取代基如下定义。在一些情况下，取代基(例如，烷基、烯基、炔基、烷氧基、氨基烷氧基、氨基烷基、氨基烷基氨基、烷基氨基、杂环基、杂环氨基、和芳基)中碳原子的数量由前缀“Cx-Cy”或“Cx-y”指示，其中x是碳原子的最小值并且y是碳原子的最大值。因此，例如，“C1-C6烷基”是指含有从1至6个碳原子的烷基。如果取代基被描述为“被……取代的”，则碳或氮上的氢原子被非氢基团取代。例如，被取代的烷基取代基是烷基取代基，其中烷基上的至少一个氢原子被非氢基团取代。用于说明，单氟烷基是被一个氟基取代的烷基，并且二氟烷基是被两个氟基取代的烷基。应该认识到，如果在取代基上存在一个以上的取代，则每个取代可以是相同的或不同的(除非另有说明)。如果取代基被描述为“任选被……取代”，则取代基可以是(1)未被取代的或(2)被取代的。可能的取代基包括但不限于羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6氨基烷氧基、卤素、硝基、氰基、巯基、烷硫基、氨基、C1-C6氨基烷基、C1-C6氨基烷基氨基、连接至杂环的C1-C6烷基、连接至杂环的C1-C6烷基氨基、杂环基、氨基取代的杂环基、杂环氨基、氨基甲酰基、吗啉-1-基、哌啶-1-基、-(CH2)q-CH3、-(CHRn)q-CH3、C3-C8碳环基、-O-(CH2)q-CH3、亚芳基-CH3、-(CH2)q-亚芳基-CH3、-亚芳基-(CH2)q-CH3、-(CH2)q-(C3-C8碳环基)-CH3、-(C3-C8碳环基)-(CH2)q-CH3、C3-C8杂环基、-(CH2)q-(C3-C8杂环基)-CH3、-(C3-C8杂环基)-(CH2)q-CH3、-(CH2)qC(O)NRn(CH2)q-CH3、-(CH2CH2O)q-CH3、-(CH2CH2O)q-CH2-CH3、-(CH2)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH3、-(CH2)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH2-CH3、-(CH2CH2O)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH3、-(CH2CH2O)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH2-CH3、或-(CH2CH2O)qC(O)NRn(CH2)q-CH3；其中各Rn独立为H、C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
“烷基”指饱和脂肪族烃基基团，该术语包括直链和支链烃基。例如，C1-C20烷基，如C1-C6烷基。C1-C20烷基指具有1至20个碳原子的烷基，例如具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子、7个碳原子、8个碳原子、9个碳原子、10个碳原子、11个碳原子、12个碳原子、13个碳原子、14个碳原子、15个碳原子、16个碳原子、17个碳原子、18个碳原子、19个碳原子或20个碳原子的烷基。烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基等。所述烷基可以是非取代的或被一个或多个取代基所取代，所述取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羟基、羰基、羧基、芳基、杂芳基、胺基、卤素、磺酰基、亚磺酰基、膦酰基等。
“烷氧基”是指烷基中至少1个碳原子被氧原子取代所形成的基团。非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、正 己氧基、环丙氧基和环丁氧基。所述的烷基定义与上文所述的“烷基”定义相同。
“烯基”是指含有1至10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个)碳-碳双键，由2至20个碳原子组成的直链或者支链不饱和脂肪族烃基，优选2至12个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个)碳原子的烯基，更优选2至8个碳原子的烯基，进一步优选2至6个碳原子的烯基。非限制性实例包括乙烯基、丙烯-2-基、丁烯-2-基、丁烯-2-基、戊烯-2-基、戊烯-4-基、己烯-2-基、己烯-3基、庚烯-2-基、庚烯-3-基、庚烯-4-基、辛烯-3-基、壬烯-3-基、癸烯-4-基和十一烯-3-基。所述的烯基可以任选进一步被1个或者多个取代基所取代。
“炔基”是指含有1至10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)碳-碳叁键，由2至20个碳原子组成的直链或者支链不饱和脂肪族烃基，优选2至12个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)碳原子的炔基，更优选2至8个碳原子的炔基，进一步优选2至6个碳原子的炔基。非限制性实例包括乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、丁炔-3-基、3,3-二甲基丁炔-2-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、己炔-1-基、1-庚炔-1-基、庚炔-3-基、庚炔-4-基、辛炔-3-基、壬炔-3-基、癸炔-4-基、十一炔-3-基、十二炔-4-基。所述的炔基可以任选进一步被一至多个取代基所取代。
“碳环基”是指仅仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳香族的单环或多环的烃自由基，其可包括稠合或桥接环系统，具有3至15个碳原子，例如具有3至10个(例如3、4、5、6、7、8、9或10个)碳原子，并且其是饱和的或不饱和的并且通过单键与分子的剩余部分连接。单环自由基包括，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环自由基包括，例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基等。当在说明书中具体说明时，碳环基可被独立地选自下列中的一种或多种取代基任选取代：烷基、卤素、卤代烷基、氰基、硝基、氧代、芳基、芳烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基、杂芳基烷基。
“芳基”指具有完全共轭的π电子体系的全碳单环或全碳稠合环，通常具有5-14个碳原子，例如，6个、10个、12个、14个碳原子。芳基可以是非取代的，或被一个或多个取代基所取代，所述取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羟基、羧基、芳基、芳烷基、胺基、卤素、磺酰基、亚磺酰基、膦酰基。非取代的芳基实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。
“杂芳基”是指取代的或未取代的芳香环，其可以是3至8元(例如3、4、5、6、7、8元)的单环、5至12元(例如5、6、7、8、9、10、11、12元)双环或者10至15元(例如10、11、12、13、14、15元)三环体系，且包含1至6个(例如1、2、3、4、5、6个)选自N、O或S的杂原子，优选5至8元杂芳基，杂芳基的环中选择性取代的1至4个(例如1、2、3、4个)N、S可被氧化成各种氧化态。杂芳基可以连接在杂原子或者碳原子上，杂芳基可以是桥环或者螺环，非限制性实例包括环吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡喃基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、咪唑基、哌啶基苯并咪唑基、苯并吡啶基、吡咯并吡啶基。杂芳基任选进一步被1个或多个取代基所取代。
“环烷基”是指饱和的环烃基，其环可以为3至10元(例如3、4、5、6、7、8、9、10元)的单环、4至12元(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12元)双环或者10至20元(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20元)多环体系，环碳原子优选3至10个碳原子，进一步优选3至8个碳原子。“环烷基”非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、1,5-环辛二烯基、1,4-环己二烯基和环庚三烯基等。当环烷基被取代时，可以任选进一步被1个或者多个取代基所取代。
“杂环烷基”是指取代的或未取代的饱和非芳香环基，其可以是3至8元(例如3、4、5、6、7、8元)的单环、4至12元(例如4、5、6、7、8、9、10、11、12元)双环或者10至15 元(例如10、11、12、13、14、15元)三环体系，且包含1、2或3个选自N、O或S的杂原子，优选3至8元杂环基。“杂环烷基”的环中选择性取代的1、2或3个N、S可被氧化成各种氧化态；“杂环烷基”可以连接在杂原子或者碳原子上；“杂环烷基”可以为桥环或者螺环。“杂环烷基”非限制性实例包括环氧乙基、氮杂环丙基、氧杂环丁基、氮杂环丁基、1,3-二氧戊环基、1,4-二氧戊环基、1,3-二氧六环基、氮杂环庚基、哌啶基、哌叮基、吗啉基、硫代吗啉基、1,3-二噻烷基、四氢呋喃基、四氢吡咯基、四氢咪唑基、四氢噻唑基、四氢吡喃基、氮杂二环[3.2.1]辛烷基、氮杂二环[5.2.0]壬烷基、氧杂三环[5.3.1.1]十二烷基、氮杂金刚烷基和氧杂螺[3.3]庚烷基。
“杂环基”是指稳定的3元至18元芳香性或非芳香性环取代基，其由2至8个(例如2、3、4、5、6、7或8个)碳原子和选自氮、氧和硫中的1至6个(1、2、3、4、5或6个)杂原子组成。除非在说明书中另外具体说明，杂环基可以是单环、双环、三环或四环环系统，其可以包括稠合或桥接环系统；且杂环基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子任选地被季铵化；且杂环基可以部分或完全饱和。此类杂环基的实例包括但不限于，二氧戊环基、二噁英基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、哌咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、1,2,4-亚噻二唑-5(4H)-基、四氢呋喃基、三氧杂环己基、三噻烷基、三嗪烷基(triazinanyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫代吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。当在说明书中具体说明时，杂环基可以被选自下列中的一个或多个取代基任选取代：烷基、烯基、卤素、卤代烷基、氰基、氧代、硫代(thioxo)、硝基、芳基、芳烷基、环烃基、环烃基烷基、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基。
“烷氧基”是指式-O-(烷基)，其中烷基为本文定义的烷基。烷氧基的非限制性列举为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。烷氧基可为取代的或未取代的。
“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、或碘(I)。
“氨基”指-NH2。
“氰基”，是指-CN。
“硝基”指-NO2。
“羟基”，是指-OH。
“羧基”，是指-COOH。
“巯基”是指-SH。
“羰基”是指C＝O。
当上文所述的“烷基”、“烷氧基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”、“杂芳基”、“碳环基”、“碳环”、“杂环基”、“杂环”、“环烷基”、“杂环烷基”或者“杂环基”被取代时，可以选进一步被0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个选自F、Cl、Br、I、羟基、巯基、硝基、氰基、氨基、C1-6烷基氨基、＝O、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、-NRq4Rq5、＝NRq6、-C(＝O)OC1-6烷基、-OC(＝O)C1-6烷基、-C(＝O)NRq4Rq5、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C6-10芳基、C5-10杂芳基、-C(＝O)OC6-10芳基、-OC(＝O)C6-10芳基、-OC(＝O)C5-10杂芳基、-C(＝O)OC5-10杂芳基、-OC(＝O)C3-8杂环烷基、-C(＝O)OC3-8杂环烷基、-OC(＝O)C3-8环烷基、-C(＝O)OC3-8环烷基、-NHC(＝O)C3-8杂环烷基、-NHC(＝O)C6-10芳基、-NHC(＝O)C5-10杂芳基、-NHC(＝O)C3-8环烷基、-NHC(＝O)C3-8杂环烷基、-NHC(＝O)C2-6烯基或者-NHC(＝O)C2-6炔基的取代基所取代，且其中所述的取代基C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C6-10芳基、C5-10杂芳基、-NHC(＝O)C6-10芳基、-NHC(＝O)C5-10杂芳基、-NHC(＝O)C3-8 杂环烷基或者-NHC(＝O)C3-8环烷基任选进一步被1至3个选自OH、F、Cl、Br、I、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-NRq4Rq5或者＝O的取代基所取代；Rq1选自C1-6烷基、C1-6烷氧基或者C6-10芳基；Rq2、Rq3选自H或者C1-6烷基；其中，Rq4、Rq5选自H、C1-6烷基、-NH(C＝NRq1)NRq2Rq3、-S(＝O)2NRq2Rq3、-C(＝O)Rq1或者-C(＝O)NRq2Rq3，其中所述的C1-6烷基任选进一步被1个或者多个选自OH、F、Cl、Br、I、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-8环烷基或者C3-8杂环烷基的取代基所取代；或者Rq4与Rq5及N原子形成一个3至8元杂环，所述杂环可以含有1个或者多个选自N、O或者S的杂原子。
“药学上可接受的盐”或者“其药学上可接受的盐”是指化合物保持游离酸或者游离碱的生物有效性和特性，且所述的游离酸通过与无毒的无机碱或者有机碱，所述的游离碱通过与无毒的无机酸或者有机酸反应获得的盐。
“药物组合物”是指一种或多种化合物、其药学上可接受的盐或前药和其它化学组分形成的混合物，其中，“其它化学组分”是指药学上可接受的载体、赋形剂和/或一种或多种其它治疗剂。
“载体”是指不会对生物体产生明显刺激且不会消除所给予化合物的生物活性和特性的材料，即，可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。“赋形剂”是指加入到药物组合物中以促进化合物给药的惰性物质。非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、淀粉、纤维素衍生物(包括微晶纤维素)、明胶、植物油、聚乙二醇类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中有描述，在此通过引用并入本申请。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，包括顺反异构体、对映异构体和构象异构体。
“任选”或“任选地”或“选择性的”或“选择性地”是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，该描述包括其中发生该事件或状况的情况及其中未发生的情况。例如，“选择性地被烷基取代的杂环基”是指该烷基可以但未必存在，该描述包括其中杂环基被烷基取代的情况，及其中杂环基未被烷基取代的情况。
抗Nectin-4抗体
本发明提供抗体或抗原结合单元。在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元能够特异性结合Nectin-4(例如，人Nectin-4)。在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元具有以下一种或多种特性：与Nectin-4(例如人Nectin-4)体外结合、与表达Nectin-4的细胞结合、高亲和力、内吞。
在一个或多个实施方式中，抗体的抗原结合单元是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体。
在一个或多个实施方式中，抗体可以为单克隆抗体。
本发明公开的抗体或抗原结合单元的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、 放射免疫实验(RIA)、表面等离子共振、流式细胞术(Facs)或酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测。
本发明还包括与本文所述抗体结合同一表位的抗体。例如，本发明的抗体特异性结合包括人Nectin-4上一个或多个氨基酸残基的表位。
在一个或多个实施方式中，抗体包含重链恒定区，例如IgG、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在一个或多个实施方式中，抗体或抗原结合单元包含选自人IgG恒定结构域、人IgA恒定结构域、人IgE恒定结构域、人IgM恒定结构域和人IgD恒定结构域的免疫球蛋白重链恒定结构域。在一个或多个实施方式中，抗体或抗原结合单元包含IgG1重链恒定区、IgG2重链恒定区、IgG3重链恒定区或IgG4重链恒定区。在一个或多个实施方式中，重链恒定区为IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。在一个或多个实施方式中，抗体或抗原结合单元包含轻链恒定区，例如κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。
在一个或多个实施方式中，将本发明抗体或抗原结合单元连接至可检测试剂，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可由标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)，荧光标记物(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶标记物(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素酰基，被二级报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一个或多个实施方式中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减小可能的空间位阻。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元可用作检测样品中Nectin-4(例如人Nectin-4)是否存在。在一个或多个实施方式中，抗体包含可检测试剂。抗体为多克隆抗体，或更优选单克隆抗体。可使用完整的抗体或抗原结合单元(例如Fab、scFv或F(ab')2)。所述检测方法可用于在体外及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，分析物mRNA体外检测技术包括Norhtern杂交和原位杂交；分析物蛋白质体外检测技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、以及免疫荧光；分析物基因组DNA体外检测技术包括Southern杂交。此外，分析物蛋白质的体内检测技术包括向患者体内导入标记的抗分析物蛋白抗体。例如，可以用放射性标记标记抗体，然后可以通过标准成像技术检测患者体内该放射性标记物的存在和位置。
在一个或多个实施方式中，在生物样品中可检测Nectin-4作为临床测试过程的一部分，例如，用于确定给定治疗方案的功效。将抗体偶联(如物理连接)到可检测物质可有利于检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的一个示例包括鲁米诺；生物发光材料的示例包括荧光素酶、荧光素和水母蛋白；合适放射性材料的示例包括125I、131I、35S或3H。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:3所示的VH CDR2；和如SEQ ID NO:4所示的VH CDR3。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:5所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:6所示的VLCDR2；和如SEQ ID NO:7所示的VLCDR3。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:3所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:4所示的VH CDR3；如 SEQ ID NO:5所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:6所示的VLCDR2；如SEQ ID NO:7所示的VLCDR3。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元，其重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性；和/或其轻链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。在一个或多个实施方式中，这些有序列同一性的氨基酸序列至少CDR不变。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:8所示的重链可变区和如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体的重链包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体的轻链包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比具有合适的序列同一性的氨基酸序列，比如具有至少80％序列同一性，或者至少90％序列同一性，或者至少95％序列同一性，或者至少99％序列同一性。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元的重链或其片段还包含信号肽，例如MELGLCWVFLVAILEGVQC(SEQ ID NO:18)，其DNA序列为atggagctgggcctgtgttgggtgtttctggtggccatcctggagggcgtgcagtgc(SEQ ID NO:19)。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元的轻链或其片段还包含信号肽，例如MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO:20)，其DNA序列为atggacatgagagtgcctgcccagctgctgggcctgctgctgctgtggttccctggcagcagatgc(SEQ ID NO:16)。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元与Nectin-4结合的结合解离平衡常数(KD)为约1μM或更低。在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元与Nectin-4结合的KD在约100nM至约1pM之间或更低。在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元与Nectin-4结合的KD在约10nM至约1pM之间或更低。在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元与Nectin-4结合的KD在约10nM至约1nM之间或更低。
在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元与人Nectin-4(例如SEQ ID NO:1所示的抗原Nectin-4-His)结合的KD为约100nM至约1pM之间或更低。在一个或多个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合单元与人Nectin-4结合的KD在约10nM至约1pM之间或更低；或者，在约10nM至约1nM之间或更低。
抗体药物偶联物
本发明的抗体或抗原结合单元可以与药物偶联形成抗Nectin-4抗体药物偶联物(抗Nectin-4 ADC)。由于抗体药物偶联物(ADC)能够选择性地将一种或多种药物递送至靶组织(例如，表达或过表达Nectin-4的肿瘤)，抗体药物偶联物(ADC)可以增加抗体在治疗疾病(例如癌症)中的治疗功效。在一个或多个实施方式中，本发明的抗体药物偶联物(ADC)，其包含本文所述的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元和至少一种药物(例如依喜替康)。本发明的ADC具有以下一种或多种特性：与Nectin-4(例如人Nectin-4)体外结合、与表达Nectin-4的细胞结合、高亲和力、内吞、减少或抑制癌细胞或肿瘤生长。
本发明的抗原结合单元可以与本文所述的药物偶联。在一个或多个实施方式中，本文所述的抗原结合单元通过接头与药物偶联形成抗Nectin-4 ADC。
本发明的抗Nectin-4 ADC包含与一个或多个药物连接的特异性结合Nectin-4(例如人Nectin-4)的抗体或抗原结合单元。ADC的特异性可以由抗体(例如抗Nectin-4抗体)或其抗原结合单元的特异性决定。在一个或多个实施方式中，抗Nectin-4抗体与一种或多种药物(例如DNA拓扑异构酶抑制剂)连接，所述药物(例如DNA拓扑异构酶抑制剂)被递送至表达或过表达Nectin-4的细胞，特别是表达或过表达Nectin-4的癌细胞。在一个或多个实施方式中，抗Nectin-4抗体药物偶联物包含通过接头与药物(例如依喜替康)偶联的抗Nectin-4抗体。本文所述的抗Nectin-4抗体或抗原结合单元为ADC提供了结合Nectin-4的能力，使得附着于抗体的药物可以被递送至表达或过表达Nectin-4的细胞，特别是表达或过表达Nectin-4的癌细胞。
在一个或多个实施方式中，ADC为如式I-A所示的结构或其立体异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
其中Abu、M、B、G、L、D、p如本文所定义。
在一个或多个实施方式中，Abu为抗体ASG-AM。
在一个或多个实施方式中，ADC为ASG-AM-ExaD8或ASG-AM-ExaD4或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一个或多个实施方式中，ADC为如式I-B所示的结构或其立体异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
其中Abu、M、L、D、p如本文所定义。
在一个或多个实施方式中，Abu为抗体ASG-22或ASG-AM。
在一个或多个实施方式中，ADC为ASG-22-MMAE或ASG-AM-MMAE或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一个或多个实施方式中，ADC为如式I-C所示的结构或其立体异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
其中Abu、M、V、D、p如本文所定义。
在一个或多个实施方式中，Abu为抗体ASG-AM。
在一个或多个实施方式中，ADC为ASG-AM-Dxd或其药学上可接受的盐或溶剂合物。药物组合物
可将本发明所述抗体或抗原结合单元、偶联有本发明所述抗体或抗原结合单元的抗体药物偶联物掺入适于施用的药物组合物中。制备此类组合物所涉及的原理和考虑事项以及选择组分的指南在本领域中是熟知的。
此类组合物通常包含抗体或抗原结合单元或抗体药物偶联物和药学上可接受的载体。在一个或多个实施方式中，抗原结合单元为与靶蛋白特异性结合的最小抑制片段。如，基于抗体的可变区序列并保留结合靶蛋白序列能力的肽。在一个或多个实施方式中，药物组合物还包含抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、稳定剂、缓冲剂、分散介质、包衣、抑菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适载体描述于Remington's Pharmaceutical Sciences中。此类载体或稀释剂可选择包括但不限于水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。
在一个或多个实施方式中，待用于体内施用的制剂必须为无菌的，这可通过无菌滤膜过滤容易地实现。
药物组合物可以以剂量单位形式配制，易于施用，剂量均匀。如本文所用，剂量单位形式是指用于待治疗的患者，适合作为单位剂量的物理上可分离的单位；每个单位含有经计算与所需药物载体结合产生期望治疗效果的预定量的一种或多种所述抗体或抗原结合单元或抗体药物偶联物。
所述药物组合物可放于容器或分配器中，并与给药说明书一起包装。
本发明所述药物组合物还可根据要治疗的具体情况而包含其它活性成分，优选具有互补活性但对彼此无负面影响的那些。在一个或多个实施方式中，组合物可包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类活性成分以对预期目的有效的量适当地联合存在。
本发明的组合物可以配制成中性的或盐的形式。
治疗方法和用途
本文所述的抗体或抗原结合单元或ADC可用于多种应用中，包括但不限于治疗方法，例如肿瘤的治疗。在一个或多个实施方式中，所述抗体或抗原结合单元或ADC可用于抑制肿瘤生长、减少肿瘤体积和/或降低肿瘤的致瘤性。使用方法可以是体外、离体或体内方法。
在一个或多个实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包括在体外使肿瘤与抗体或抗原结合单元或ADC或包含其的药物组合物接触。例如，将表达Nectin-4的永生化细胞系或癌细胞培养在添加了抗体或抗原结合单元或ADC或包含其的药物组合物的培养基中。在一个或多个实施方式中，从患者样品中分离肿瘤细胞并将其添加到含有抗体或抗原结合单元或ADC或包含其的药物组合物的培养基中培养。在一个或多个实施方式中，抑制肿瘤生长的方法 包括使肿瘤或肿瘤细胞与抗体或抗原结合单元或ADC或包含其的药物组合物在体内接触。
本发明提供的抗体或抗原结合单元或ADC或包含其的药物组合物可以用于诊断、预后、监控、治疗、缓解和/或预防患者中Nectin-4异常表达相关的疾病和病症。通过使用常规方法鉴定患者中存在Nectin-4异常表达相关的疾病和病症时，可以给药本发明所述的抗体或抗原结合单元或ADC或包含其的药物组合物。在一个或多个实施方案中，通过免疫组织化学(IHC)、流式细胞术或核酸杂交等来检测Nectin-4表达的程度。
在一个或多个实施方式中，本发明涉及治疗以Nectin-4为治疗靶点的相关疾病的方法，从而改善、减缓、抑制、治疗或预防Nectin-4异常表达(例如，Nectin-4过表达)相关的任何疾病或病症；涉及提供治疗患者肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)的方法、缓解患者肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)症状的方法、避免患者肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)复发的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本文所述的抗体或抗原结合单元或ADC。
在一个或多个实施方式中，本发明提供了预防、治疗或改善疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的本文所述的抗体或抗原结合单元或ADC或包含其的药物组合物。在一个或多个实施方式中，本发明提供了所述抗体或抗原结合单元或ADC在制备用于预防、治疗或改善疾病的药物中的应用。在一个或多个实施方式中，所述疾病为Nectin-4表达相关的疾病。在一个或多个实施方式中，所述疾病为Nectin-4异常表达相关的疾病。在一个或多个实施方式中，所述疾病为Nectin-4过表达相关的疾病。在一个或多个实施方式中，所述疾病为表达Nectin-4的肿瘤。在一个或多个实施方式中，所述疾病为过表达Nectin-4的肿瘤。在一个或多个实施方式中，所述疾病为过表达Nectin-4的癌症。在一个或多个实施方式中，所述疾病为过表达人Nectin-4的癌症。
在一个或多个实施方式中，本发明提供了治疗肿瘤(包括良性肿瘤和癌症)的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的本文所述的抗体或抗原结合单元或ADC或包含其的药物组合物。癌症的实例包括但不限于实体瘤、血液学癌及转移性病灶。此类癌症的具体实例包括但不限于乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌(TNBC)；局部、转移性TNBC)、胰腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌,鳞状细胞癌或肺腺癌)、头颈癌(例如，头部和颈部鳞状细胞癌)、宫颈癌(例如，宫颈鳞状细胞癌)、卵巢癌、绒毛膜癌、皮肤癌、食管癌(例如，食管腺癌)、胃癌、子宫癌(例如，子宫内膜癌)、胆囊癌、肝癌、肝细胞癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、结直肠癌、结肠癌和前列腺癌。在一个或多个实施方式中，癌症是转移性或晚期癌症。在一个或多个实施方式中，患者为具有增加的Nectin-4表达水平的患者。在一个或多个实施方式中，患者是人。可以将本发明的抗体或抗原结合单元或ADC出于治疗目的给予人患者。此外，本发明的抗体或抗原结合单元或ADC可以给予表达Nectin-4的非人哺乳动物(出于兽医学目的或作为人类疾病的动物模型)。所述人类疾病的动物模型可用于评估本发明抗体或抗原结合单元或ADC的治疗功效(例如，剂量测试和给药时间过程)。
对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体或衍生物(例如ADC或药物组合物)、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、代谢频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。在一个或多个实施方式中，有效剂量的范围为从约0.1mg/kg到约100mg/kg，给药频率可以例如是每月给药一次。例如，给药方式可以是静脉输注，静脉推注，也可以是皮下注射、肌肉注射等。应注意，剂量值可随欲缓解的病状的类型及严重程度变化。此外应了解，对任何特定患者而言，特定给药方案可根据患者需要及给予组合物或监督组合物给予的人员的专业判断而随时调整， 且本文所阐述的剂量范围仅为例示性的，且不意欲限制所要求的组合物的范畴或实践。
抗体或抗原结合单元或ADC的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外和口服。施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体或抗原结合单元或ADC引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是Ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化的制剂。
各种已知输送系统可用于施用本发明抗体或抗原结合单元或编码其的多核苷酸或ADC，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。
联合疗法
在一个或多个实施方式中，本发明抗体或抗原结合单元或ADC可以结合其它治疗或预防方案，包括一种或多种本发明抗体或抗原结合单元或ADC以及一种或多种其它治疗剂或方法一起使用或组合使用。对于组合治疗，抗体或抗原结合单元或ADC可以与其它治疗剂可同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种其它治疗剂之前或之后施用本发明抗体或抗原结合单元或ADC。
在一个或多个实施方式中，在向患者施用本发明的抗体或抗原结合单元或ADC时，还可以向患者联合施用本文公开的抗体或抗原结合单元或ADC或药物组合物或免疫缀合物，以及一种或多种其它疗法，例如治疗方式和/或其它制剂(例如治疗剂)。
在一个或多个实施方式中，本发明抗体或抗原结合单元或ADC可以与免疫检查点抑制剂一起使用。在一个或多个实施方式中，本发明抗体或抗原结合单元或ADC与其它治疗或预防方案联合施用，例如放射性疗法。
此类联合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种制剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的疗法，例如治疗方式和/或治疗剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体或抗原结合单元或ADC的施用。抗体或抗原结合单元或ADC和/或其他疗法，例如治疗剂或治疗方式可以在活动性疾病期间或在缓解或活动度更小的疾病期间施用。抗体或抗原结合单元或ADC可以在其他治疗前、与其他治疗同时、治疗后或在疾病缓解期间施用。
抗体制备方法
使用常规重组DNA技术，可将本发明的抗体的一个或多个CDR插入框架区。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码框架区和CDR组合产生的与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。
抗体可以通过使用常规重组DNA技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production of Protein Therapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,in Reference Module in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
抗体(例如抗Nectin-4抗体)或其抗原结合单元基因可以通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，则平端连接)插入表达载体内。表达载体可以为质粒、逆转录病毒、YAC、EBV衍生的附加体等等。为了表达抗体(例如抗Nectin-4抗体)，可将编码全长轻链和重链的DNA插入表达载体内，使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。“可操作地连接”意指抗体基因连接到载体内，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。
重链和轻链的一致性序列J区可用于设计用作引物的寡核苷酸，以便在J区内引入有用的限制性位点，用于随后将V区片段连接于C区片段。C区cDNA可通过定点诱变修饰，以在人序列的类似位置放置一个限制性位点。在一个或多个实施方式中，在插入抗体相关的轻链或重链基因序列之前，表达载体已经携带抗体恒定区序列。例如，将抗Nectin-4抗体相关的VH和VL序列转换为全长抗体基因的一种方法是将它们分别插入已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段，并且VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。
重组表达载体可以编码促进宿主细胞分泌抗体重链和轻链的信号肽。或者，可以将抗体重链和轻链基因克隆到编码促进宿主细胞分泌抗体重链和轻链的信号肽的载体中，使得信号肽与抗体重链和轻链基因的氨基末端框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)，例如，MELGLCWVFLVAILEGVQC(SEQ ID NO:18)、MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO:20)。
除抗体重链和轻链基因之外，重组表达载体还可以携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。调节序列包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列在例如Goeddel，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA，1990中有描述。本领域技术人员了解表达载体的设计，包括调节序列的选择可以取决于待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调节序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，如衍生自巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如美国专利5,168,062，4,510,245和4,968,615。
除抗体链基因和调节序列之外，重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择赋予已引入载体的宿主细胞针对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性的标记物基因。合适的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在具有氨甲蝶呤选择/扩增的DHFR-宿主细胞中使用)、neo基因(用于G418选择)和GS基因。对于重链和轻链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞内。在一个或多个实施方式中，插入基因片段需含有可选择标记物基因，常见的可选择标记物包括二氢叶酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、新霉素抗性、潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。抗体将通过一个或多个纯化步骤纯化。纯化可以采用常规方法进行，例如先离心细胞悬液并收集上清液，再次离心进一步去除杂质。Protein A亲和柱和离子交换柱等方法可以用于纯化抗体蛋白。
本发明的抗体(例如抗Nectin-4抗体)可以通过在宿主细胞中重组表达抗体的重链和轻链基因来制备。例如，用一种或多种携带编码抗体的重链和轻链DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得重链和轻链在宿主细胞中表达，表达的抗体可以分泌到培养宿主细 胞的培养基内，从所述培养基中可以回收抗体。“转染”指通常用于将外源DNA引入真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如电穿孔、脂转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。用于获得抗体重链和轻链基因，将这些基因掺入表达载体内并将载体引入宿主细胞内的标准重组DNA方法在本领域众所周知，例如美国专利号4,816,397中描述的那些。表达抗体重链和轻链的DNA可以置入同一载体中或置入不同载体中；若置入不同载体中，表达抗体重链的载体和表达抗体轻链的载体可以以适当比例转染宿主细胞(如Tihomir S.Dodev et al.,A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies,Scientific Reports volume 4,Article number:5885(2014))。在一个或多个实施方式中，抗体表达载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾巴。其他元件可以包括增强子，Kozak序列及插入序列两侧RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，pLXSN，pLNCX，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，pSVL，pMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI，pCS2或pCHO1.0等。
本发明的抗体(例如抗Nectin-4抗体)能够在真核宿主细胞中表达。在某些实施方案中，抗体的表达在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中进行。用于表达本发明抗体的示例性宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)或从CHO细胞修饰的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44或ExpiCHO、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、SP2细胞、CV1细胞、鼠L细胞、人胚肾细胞HEK293或从HEK293细胞修饰的HEK293T、HEK293F或HEK293E细胞。将编码抗体链基因的重组表达载体引入宿主细胞内后，将宿主细胞在培养基内培养允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到培养基的一段时间来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
通过使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production of Protein Therapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,in Reference Module in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
对于本发明的抗体(例如抗Nectin-4抗体)的重组表达，可以用两种重组表达载体共转染宿主细胞，第一重组表达载体编码抗体重链，第二重组表达载体编码抗体轻链。两个重组表达载体可以含有相同的可选择标记物，或者它们可以各自含有分开的可选择标记物。可替代地，可以使用编码抗体重链和轻链的重组表达载体转染宿主细胞。
本发明的抗体(例如抗Nectin-4抗体)还可以通过化学合成(例如，通过Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984 The Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.中描述的方法)来生产。还可以使用无细胞平台(参见例如，Chu等人，BiochemiaNo.2，2001(Roche Molecular Biologicals)以及Murray等人，2013，Current Opinion in Chemical Biology，17:420–426)生成变体抗体。
通过重组表达产生的抗体(例如抗Nectin-4抗体)，可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法将它纯化，例如通过层析(例如，离子交换、亲和层析和分级柱层析)、离心、差异溶解度、或纯化蛋白质的任何其它标准技术。例如利用蛋白A或蛋白G进行亲和层析，其主要提供了免疫血清中的IgG级分。另外，可将免疫球蛋白所靶向的特异抗原或其表位固定于柱上，以通过免疫亲和色谱来纯化免疫特异性抗体。本发明的抗体(例如抗Nectin-4抗体)可以与本领域已知的异源多肽序列融合，以促进纯化。免疫球蛋白的纯化可参考D.Wilkinson的文章(The Scientist，由The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.出版，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25-28页)。
此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明的抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。变体(包括衍生物)编码相对于原重链可变区VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3和轻链可变区VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的取代、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。在一个或多个实施方式中，本文所述取代为保守氨基酸取代。
合成方法
本发明还提供了药物偶联物，如抗体药物偶联物，及中间体的制备方法。本发明的药物偶联物，如抗体药物偶联物，及中间体可以通过已知制剂和方法制备。在一些实施方式中，制备方法如下所述。
的制备方法
第一步：通式1-1化合物和通式1-1’化合物在碱性条件下反应得到通式1-2化合物；
第二步：通式1-2化合物和通式(AA)i-(FF1)f在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式1-3化合物；
第三步：去除通式1-3化合物氨基保护基W1得到通式1-4化合物；
第四步：通式1-4化合物和通式1-5化合物在碱性条件下反应得到通式1-6化合物；
第五步：通式1-6化合物和二(对硝基苯)碳酸酯在碱性条件下反应得到通式1-7化合物。
第一步：通式1化合物和通式1’化合物在碱性条件下反应得到通式2化合物；
第二步：通式2化合物和通式(AA)i-(FF1)f在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式3化合物；
第三步：去除通式3化合物氨基保护基W1得到通式4化合物；
第四步：通式4化合物和通式5化合物在碱性条件下反应得到通式6化合物；
第五步：通式6化合物和二(对硝基苯)碳酸酯在碱性条件下反应得到通式7化合物。
其中
W1为氨基保护基，例如为9-芴甲氧羰基；W2为羧酸活性酯，例如为琥珀酰亚胺酯。
其中，B、G、n、R、AA、i、f如本文所定义；
M’为其中*连接B，R选自：-(CH2)r-、-(CHRm)r-、C3-C8碳环基、-O-(CH2)r-、亚芳基、-(CH2)r-亚芳基-、-亚芳基-(CH2)r-、-(CH2)r-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-(CH2)r-、C3-C8杂环基、-(CH2)r-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-和-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2)r-；其中各Rm独立为H、 C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；或R为-(CH2)r-，或r为1或5；
L’为-(AA)i-(FF’)f，其中，AA为氨基酸或多肽，i是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；或各AA独立选自以下氨基酸或肽序列：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu和Gly-Phe-Leu-Gly；或AA为Val-Cit，i为1；各FF’独立为 其中RF为C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NO2或卤素，其中*连接AA；或z为0或RF为F；或z为0、1、2、3或4，或z为1或2；或各FF’独立为 其中*连接AA；f为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；或FF’为对氨基苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯或对氨基苄醇，f为1；或L’为其中*连接B；或L’为 其中*连接B；
各FF1独立为其中各RF独立为C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NO2或卤素；z为0、1、2、3或4；其中*连接AA；
各FF2独立为 其中各RF独立为C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NO2或卤素；z为0、1、2、3或4；其中*与AA连接。
上述碱性条件可以用试剂来提供，该试剂包括有机碱和无机碱类，所述有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、N,N-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂。
上述缩合剂可以选自N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。
的制备方法
通式1-7化合物和D在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式1-8化合物。
通式7化合物和D在缩合剂存在下、在碱性条件下反应得到通式8化合物。
其中，M’、B、L、D、G、n、R、AA、FF、FF2、i、f如本文所定义。
上述碱性条件可以用试剂来提供，该试剂包括有机碱和无机碱类，所述有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、N,N-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂。
上述缩合剂可以选自N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。
的制备方法
通式1-8化合物和Abu在弱酸性条件下偶联得到通式1-9化合物。
通式8化合物和Abu在弱酸性条件下偶联得到通式9化合物。
其中，Abu、M、B、L、D、G、n、R、AA、FF、i、f如式I-A中所述。
上述弱酸性条件可以用试剂来提供，该试剂包括有机酸和无机酸类，所述有机酸类包括但不限于乙酸、苯甲酸、酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸、柠檬酸、枸椽酸、水杨酸、咖啡酸、山梨酸、奎宁酸、齐墩果酸、丁二酸、绿原酸、甲酸、丙酸，所述无机酸类包括但不限于碳酸、亚硝酸、乙酸、次氯酸、氢氟酸，亚硫酸、氢硫酸、硅酸、偏硅酸、磷酸、偏磷酸、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠。
药物偶联物可以采用常规方法进行纯化，例如用制备型高效液相色谱(prep-HPLC)等方法。
以下将结合具体实施例说明本申请，本申请的内容不限于此。
如无明确说明，以下方法中使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的方法都是本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例所描述的内容可以毫无疑义地施行所述方法并获得相应的结果。
实施例1：人Nectin-4胞外抗原Nectin-4-His表达
人Nectin-4胞外抗原Nectin-4-His按照常规方法进行制备：将编码抗原Nectin-4-His(将人Nectin-4胞外序列(序列来源Q96NY8)的信号肽序列更换为白蛋白信号肽，并在C-末端添加8×HIS标签(HHHHHHHH)构建得到Nectin-4-His，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的DNA序列克隆至表达载体，瞬时转染真核细胞HEK293F细胞或稳转CHO细胞，挑选稳定细胞株，纯化表达，得到的抗原Nectin-4-His。
MKWVTFISLLFLFSSAYSGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASHHHHHHHH(SEQ ID NO:1，下划线部分为白蛋白信号肽)。
得到的蛋白质经测序分析，结果与预期一致。
实施例2：抗Nectin-4抗体及其制备
抗Nectin-4抗体ASG-AM的重链如SEQ ID NO:12所示，轻链如SEQ ID NO:14所示。为了便于在宿主细胞中表达，分别在重链和轻链上添加了N端信号肽，其中，重链信号肽如SEQ ID NO:18所示，其DNA序列如SEQ ID NO:19所示，轻链信号肽如SEQ ID NO:20所示，其DNA序列如SEQ ID NO:16所示。对照抗体ASG-22的重链和轻链的氨基酸序列见表2。
将编码抗体重链和轻链的DNA序列克隆至表达载体，构建重组表达载体，然后瞬时转染HEK293F细胞，培养并纯化获得抗体。经验证，得到的抗体与预期一致。
表2对照抗体ASG-22的氨基酸序列

实施例3：抗体ASG-AM的亲和力测定-SPR
采用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术(BIAcore：GE Healthcare，T200)对候选抗体(ASG-22、ASG-AM)与人Nectin-4胞外抗原的亲和力进行检测。
用Protein A芯片(Cat#29127556，GE Healthcare)进行捕获，5μg/ml抗体稀释液以10μl/min的流速通过实验流路(Fc2、Fc4)，捕获10秒(s)；之后流速调为30μl/min，依次进不同浓度的实施例1制备的抗原Nectin-4-His稀释液(0nM、1.23nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM、100nM)，同时经过实验流路(Fc2、Fc4)和参比流路(Fc1、Fc3)表面，结合时间120s，解离时间180s，最后通过Glycine 1.5对芯片进行再生。使用BiaEvaluation 3.2进行拟合分析，拟合模型用1:1模型，拟合结果见下表3。
抗体ASG-AM相比于对照抗体ASG-22，亲和力有明显提升。
表3抗体与抗原的亲和力
实施例4：抗体ASG-AM的亲和力测定-BLI
采用生物膜干涉法(Bio-Layer Interferometry，BLI)技术在Octet平台(Fertebio，Octet QKe)对候选抗体(ASG-22、ASG-AM)与人Nectin-4胞外抗原的亲和力进行检测。
用Protein A生物传感器(Fortebio,18-5010)进行抗体上样，抗体浓度为20μg/mL，上样时间60s，Nectin-4-His抗原浓度设置为200nM、100nM、50nM、25nM和0nM，抗原结合时间为180s，解离时间为200s，最后用Acquisition 8.2对数据进行处理分析，得到亲和常数(见表4)，结果可知抗体ASG-AM相对对照抗体ASG-22亲和力有明显提升。
表4抗体与抗原的亲和力
实施例5：抗体ASG-AM细胞结合曲线
通过FACS检测抗体ASG-AM与T-47D细胞(人乳腺导管癌细胞，来源于中国科学院细胞库，目录号TCHu 87)的结合活性，并与对照抗体ASG-22进行比较，四参数法分析候选抗体与细胞结合的EC50。方法简述如下：胰酶消化T-47D细胞，100nM起始，3倍梯度稀释候选抗体并在4℃下与T-47D细胞孵育0.5～1小时(h)，随后加入PE标记的抗人Fc的二抗(Invitrogen,12-4998-82)，流式细胞仪检测红色荧光值的信号强度，并使用Graphpad Prism作图并计算EC50，结合曲线和EC50结果如图1所示。结果显示，抗体ASG-AM与对照抗体ASG-22与T-47D细胞的结合曲线基本一致。
实施例6：内吞实验
通过FACS方法检测37℃孵育一定时间后残留在细胞表面抗体的相对数量，以此反应内吞效率。方法简述如下：细胞使用T-47D细胞(人乳腺导管癌细胞，来源于中国科学院细胞库，目录号TCHu 87)，将待测抗体调整至10μg/mL，与细胞(密度为0.5*106个/mL)在冰上结合1h，预冷PBS洗3遍，随后放入37℃分别孵育0h、2h和4h，加入0.2％N3Na终止内吞反应，PBS洗三遍，随后加入PE标记的抗人Fc的二抗(Invitrogen 12-4998-82)，4℃孵育30min，流式细胞仪检测红色荧光信号。各待测抗体的内吞结果如下表5，结果显 示，二者内吞效率没有明显差异。
表5抗体的内吞结果
实施例7：化合物(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮盐酸盐(D-1)的合成步骤
1.N,N'-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1,7-二基)二乙酰胺的合成
氮气氛围中，将叔丁醇钾四氢呋喃溶液(42mL，1M)加入干燥反应瓶中搅拌，降温至0-5℃。将溶于四氢呋喃(25mL)的N-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺(CAS号：143655-49-6，5g，21mmol)，缓慢滴加到反应瓶中，随后滴加亚硝酸叔丁酯(4.32g，2eq)(控温0-5℃)，升温至15-20℃搅拌2h。反应完全后，降温至0-5℃，滴加醋酸(25mL)、醋酸酐(25mL)(控温不超过10℃)，滴完搅拌20min。保持5-10℃根据N-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺的量加锌粉(8eq)，20-25℃搅拌1h。过滤，乙酸乙酯(50mL)漂洗固体，降温至0-5℃，滴加15％NaCO3水溶液(50mL)洗三次，乙酸乙酯(25mL)萃取，合并有机相，饱和NaCl水溶液洗涤。加入乙酸乙酯(10mL)，40℃搅拌30min，缓慢降至0-5℃搅拌2h。过滤，固体用乙酸乙酯/石油醚(1/2，10mL)洗涤。真空干燥得灰色粉末(2.1g，33.7％)。LC-MS:[M+H]+＝297。
2.N-(8-氨基-5,6-二氟-1-氧代-1,2,3,4-四氢萘-2-基)乙酰胺的合成
将N,N'-(3,4-二氟-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1,7-二基)二乙酰胺(500mg，1.68mmol)加入2M盐酸乙醇溶液(5mL)，50℃搅拌4h，检测反应完全后，加水(7.5mL)，降温至0-5℃，滴加三乙胺(1.03g)搅拌3h。过滤，分别用40％冷乙醇水溶液(3mL)，水(3mL)洗涤。真空干燥得灰色粉末(320mg，74.6％)。LC-MS:[M+H]+＝255。
3.N-((9S)-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H苯并[de]哌喃并[3'；4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺的合成
氮气氛围下将N-(8-氨基-5,6-二氟-1-氧代-1,2,3,4-四氢萘-2-基)乙酰胺(1.1g，1eq)、(S)-4-乙基-4-羟基-7,8-二氢-1H-哌喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4H)-三酮(1.15g，1eq)及甲苯(50mL)加入到反应瓶，升温至回流，搅拌1h后加入4-甲基苯磺酸吡啶(100mg)，继续搅拌回流20h。降至室温搅拌1h。过滤，固体分别用丙酮(10mL)，冷乙醇(5mL)洗涤。真空干燥得灰褐色粉末(1.1g，53％)。LC-MS:[M+H]+＝482。
4.(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮盐酸盐的合成
将N-((9S)-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺(1.1g，2.28mmol)、6M盐酸水溶液(44mL)加入到反应瓶，氮气氛围下回流搅拌4h。浓缩除去溶剂，HPLC纯化得到白色粉末(200mg，18％)。LC-MS:[M+H]+＝440。
实施例8：4-((30S,33S,36S)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB07)的合成步骤
1)(S)-30-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-26-氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27-氮杂-三十一烷-31-酸(CB01)的合成。
0-5℃氮气保护下，将8.14g N2-芴甲氧羰基-L-2,4-二氨基丁酸(CB00-2)用40mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加入10g 4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂二十六烷酸-N-琥珀酰亚胺酯(CB00-3)和10mLDMF，保持0-5℃滴加6.5mLDIPEA，加完1h后室温下搅拌反应4h，反应完成后减压除去DMF，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比20:1作为洗脱溶剂)得到淡黄色油状液体14.2g CB01。
2)[(S)-1-[[(S)-1-[[4-(羟甲基)苯基]氨基]-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基]氨基]-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(CB02)的合成。
室温氮气保护下，11g(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酸(CB00-4)和5.5g对氨基苯甲醇(CB00-5)用400mL二氯甲烷和200mL甲醇溶解，机械搅拌下，分批加入17g 2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)，避光下反应15h。反应完成后减压除去溶剂得到糊状固体，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比20:1作为洗脱溶剂)得到灰白色固体11.9g。
3)(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(CB03)的合成。
室温氮气保护下，11.9g[(S)-1-[[(S)-1-[[4-(羟甲基)苯基]氨基]-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基]氨基]-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(CB02)中加入300mL乙腈，搅拌下滴加18mL哌啶，滴加完毕后室温下反应2h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂和哌啶，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比20:1作为洗脱溶剂)得到白色固体7.5g CB03。
4)(9H-芴-9-基)甲基((30S,33S,36S)-41-氨基-36-((4-(羟甲基)苯基)氨基甲酰基)-33-异丙基-26,31,34,41-四氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,32,35,40-四氮杂-30-基)氨基甲酸酯(CB04)的合成。
0℃氮气氛围下，将14.2g(S)-30-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-26-氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27-氮杂-三十一烷-31-酸(CB01)溶解于100mLDMF中，分批加入11g N,N,N′,N′-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(HATU)，搅拌反应30min后，加入7.5g的(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(CB03)，保持0℃下反应2.5h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比10:1作为洗脱溶剂)得到固体9.66g CB04。
5)N-((S)-3-氨基-4(((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基)胺基)-4-氧基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(CB05)的合成。
室温氮气保护下，9.66g的(9H-芴-9-基)甲基((30S,33S,36S)-41-氨基-36-((4-(羟甲基)苯基)氨基甲酰基)-33-异丙基-26,31,34,41-四氧-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,32,35,40-四氮杂-30-基)氨基甲酸酯(CB04)溶解于50mL DMF，加入12mL二乙胺，搅拌反应1.5h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比7.5:1作为洗脱溶剂)得到淡黄色固体7.7g CB05。
6)N-((S)-3-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-丁酮-2-基)胺基)-4-氧代)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(CB06)的合成。
7.7g N-((S)-3-氨基-4(((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)胺 基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基)胺基)-4-氧基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(CB05)溶于40mLDMF中，0-5℃氮气氛围下，分批加入马来酰亚胺基乙酸琥珀酰亚胺酯(CB00-1)，保持0-5℃反应4h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比10:1作为洗脱溶剂)得到淡黄色固体9.5g CB06。
7)4-((30S,33S,36S)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB07)的合成。
9.5g N-((S)-3-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)胺基)-1-氧-5-脲基戊烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-丁酮-2-基)胺基)-4-氧代)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-26-酰胺(CB06)溶于50mLDMF中，0℃氮气氛围下，加入14.0g二(对硝基苯)碳酸酯((PNP)2CO)，溶解后再加入8.2mLN,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，保持0℃反应4h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷和甲醇体积比8:1作为洗脱溶剂)得到白色固体2.6g CB07。
实施例9：4-((18S,21S,24S)-18-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-21-异丙基-14,19,22-三氧-24-(3-脲丙基)-2,5,8,11-四氧-15,20,23-三氮杂二十五烷-25-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB14)的合成
CB14的制备参考实施例8中CB07的合成，将4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂二十六烷酸-N-琥珀酰亚胺酯替换为4,7,10,13-四氧杂十四烷酸-N-琥珀酰亚胺酯。最终得到白色固体CB14。
实施例10：中间体(CB07-Exatecan)的合成
4-(30S,33S,36S)-30-(2-(2,5-二氧杂-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧杂-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,32,35-三氮杂庚三氨基乌头-37-基)苯甲酰基(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-氨基甲酸酯的合成。
将4-((30S,33S,36S)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB07)(2.6g，2.21mmol)与N,N-二甲基甲酰胺(23mL)加入反应瓶R1，氮气保护下搅拌降温至0-5℃。同时取(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮甲磺酸盐(依喜替康甲磺酸盐，0.98g，1.84mmol，Advanced ChemBlocks公司)与N,N-二甲基甲酰胺(5mL)加入到另一个反应瓶R2，0-5℃滴加三乙胺(230mg，2.27mmol)，搅拌至全溶后。将反应瓶R2中溶液滴加到反应瓶R1中，然后用N,N-二甲基甲酰胺(2mL)洗涤反应瓶R2后，洗涤液加入到反应瓶R1中。再称取1-羟基苯并三唑(497mg，3.68mmol)、吡啶(1.45g，18.4mmol)加入到反应瓶R1。0-5℃搅拌10min，升至室温搅拌5.5h反应完全后，35℃减压浓缩除去溶剂。用制备型高效液相色谱(prep-HPLC)纯化，冻干，得到白色粉末(1.6g，59％)。LC-MS:[1/2M+H]+＝737。
实施例11：中间体(CB07-D-1)的合成
4-(30S,33S,36S)-30-(2-(2,5-二氧杂-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧杂-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂-27,32,35-三氮杂庚三氨基乌头-37-基)苯甲酰基(1S,9S)-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-氨基甲酸酯的合成
将4-((30S,33S,36S)-30-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-33-异丙基-26,31,34-三氧-36-(3-脲丙基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧-27,32,35-三氮杂三十七烷-37-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(CB07)(220mg，0.189mmol)与N,N-二甲基甲酰胺(5mL)加入反应瓶R1，氮气保护下搅拌降温至0-5℃。同时取(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-4,5-二氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮盐酸盐(D-1)(90mg，0.189mmol)与N,N-二甲基甲酰胺(5mL)加入到另一个反应瓶R2，0-5℃滴加三乙胺3滴，搅拌至全溶后。将反应瓶R2中溶液滴加到反应瓶R1中，再称取1-羟基苯并三唑(60mg，0.44mmol)、吡啶(0.5mL)加入到反应瓶R1。0-5℃搅拌10min，升至室温搅拌3h反应完全后，减压浓缩除去溶剂。用制备型高效液相色谱(prep-HPLC)纯化，冻干，得到白色粉末(55mg，20％)。LC-MS:[1/2M+H]+＝739。
实施例12：中间体(CB14-Exatecan)的合成
4-(18S,21S,24S)-18-(2-(2,5-二氧六环-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰氨基)-21-异丙基-14,19,22-三氧代-24-(3-脲基丙基)-2,5,8,11-四氧-15,20,23-三氮杂二十五烷-25-胺基)-(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-氨基甲酸酯的合成
类似地，将4-((18S,21S,24S)-18-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-21-异丙基-14,19,22-三氧-24-(3-脲丙基)-2,5,8,11-四氧-15,20,23-三氮杂二十五烷-25-胺基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(190mg，0.19mmol)与N,N-二甲基甲酰胺(23mL)加入反应瓶R1，氮气保护下搅拌降温至0-5℃。同时取(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮甲磺酸盐(依喜替康甲磺酸盐；101mg，0.19mmol；Advanced ChemBlocks公司)与N,N-二甲基甲酰胺(5mL)加入到另一个反应瓶R2，0-5℃滴加三乙胺(3滴)，搅拌至全溶后。将反应瓶R2中溶液滴加到反应瓶R1中，然后用N,N-二甲基甲酰胺(1mL)洗涤反应瓶R2后，洗涤液加入到反应瓶R1中。再称取1-羟基苯并三唑(60mg，0.44mmol)、吡啶(0.5mL)加入到反应瓶R1。0-5℃搅拌10min，升至室温搅拌5.5h反应完全后，35℃减压浓缩除去溶剂。用制备型高效液相色谱(prep-HPLC)纯化，冻干，得到白色粉末。
实施例13：ASG-22-MMAE的制备
ASG-22-MMAE的结构式如下
将抗体ASG-22用10mM琥珀酸调整到浓度为10mg/ml，加入2.5摩尔当量TCEP，然后用1M Tris base将体系pH调至8。25℃孵育1.5小时还原。用10mM琥珀酸超滤换液去除TCEP。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，Aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
偶联反应时，加入6摩尔当量的MC-VC-PAB-MMAE，25℃搅拌1小时后，加入0.1M乙酰半胱氨酸至终浓度为2mM，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mM琥珀酸经Sephadex G-25树脂洗脱。
DAR值采用反向色谱进行检测，ASG-22-MMAE的DAR值为3.14。
DAR值的测定：
实验方法
样品处理：将待测样品用水稀释至约1mg/mL，加入0.5M DTT(二硫苏糖醇)，在37℃ 水浴还原30min，13000g离心5min后，取上清液进行液相色谱分析。
仪器条件：采用0.1％DFA(二氟乙酸)ACN(乙腈)和0.05％DFA H2O为流动相，流速0.5mL/min，使用Waters BioResolve色谱柱(2.1*100mm,2.7μm)进行液相色谱分离，检测波长214nm。
结果计算：样品经还原后，经反相色谱分离可以得到轻重链偶联不同个数药物的色谱峰，采用面积归一化法计算各峰的百分含量，通过这些峰的百分含量计算药物抗体偶联比(DAR)。
其中L0为轻链不偶联小分子药物的百分含量，L1为轻链偶联1个小分子药物的百分含量，H0为重链不偶联小分子药物的百分含量，H1为重链偶联1个小分子药物的百分含量，H2为重链偶联2个小分子药物的百分含量，H3为重链偶联3个小分子药物的百分含量。
实施例14：ASG-AM-MMAE的制备
ASG-AM-MMAE的结构式如下
将抗体ASG-AM用10mM琥珀酸调整到浓度为10mg/ml，加入2.5摩尔当量TCEP，然后用1M Tris base将体系pH调至8。25℃孵育1.5小时还原。用10mM琥珀酸超滤换液去除TCEP。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，Aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
偶联反应时，加入6摩尔当量的MC-VC-PAB-MMAE，25℃搅拌1小时后，加入0.1M乙酰半胱氨酸至终浓度为2mM，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mM琥珀酸经Sephadex G-25树脂洗脱。
ASG-AM-MMAE的DAR值为3.48。
实施例15：ASG-AM-ExaD8制备
ASG-AM-ExaD8的结构式如下
将抗体ASG-AM用10mM琥珀酸调整到浓度为18mg/ml，加入4.5摩尔当量TCEP(三(2-羧乙基)膦，tris(2-carboxyethyl)phosphine)，然后用1M Tris碱(Tris base)将体系pH调至8。25℃孵育1.5小时还原。用10mM琥珀酸超滤换液去除TCEP。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，Aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
偶联反应时，加入12摩尔当量的CB07-Exatecan，25℃搅拌1小时后，加入0.1M乙酰半胱氨酸至终浓度为2mM，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mM琥珀酸经Sephadex G-25树脂洗脱交换。
通过反相色谱测得ASG-AM-ExaD8的DAR为7.59。
实施例16：ASG-AM-ExaD4制备
ASG-AM-ExaD4的结构式如下
将抗体ASG-AM用10mM琥珀酸调整到浓度为18mg/ml，加入2.5摩尔当量TCEP，然后用1M Tris碱将体系pH调至8。25℃孵育1.5小时还原。用10mM琥珀酸超滤换液去除TCEP。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，Aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
偶联反应时，加入6摩尔当量的CB07-Exatecan，25℃搅拌1小时后，加入0.1M乙酰半胱氨酸至终浓度为2mM，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mM琥珀酸经Sephadex G-25树脂洗脱交换。
通过反相色谱测得ASG-AM-ExaD4的DAR为4.03。
实施例17：ASG-AM-Dxd制备
ASG-AM-Dxd的结构式如下
将抗体ASG-AM用10mM琥珀酸调整到浓度为18mg/ml，加入4.5摩尔当量TCEP，然后用1M Tris碱将体系pH调至8。25℃孵育1.5小时还原。用10mM琥珀酸超滤换液去除TCEP。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过硫基与DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，Aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定硫基的浓度。
偶联反应时，加入12摩尔当量的Deruxtecan(MCE,Cat.#HY-13631E)，25℃搅拌1小时后，加入0.1M乙酰半胱氨酸至终浓度为2mM，继续搅拌15分钟终止反应。反应混合物用0.22微米的滤器过滤后，用10mM琥珀酸经Sephadex G-25树脂洗脱交换。
通过反相色谱测得ASG-AM-Dxd的DAR为7.88。
实施例18：ADC体外药效的比较
本试验使用T-47D细胞、OVCAR-3细胞和MDA-MB-468细胞进行，分别消化细胞并铺于96孔板中，T-47D、OVCAR-3和MDA-MB-468都按照每孔6000个细胞的密度进行铺板，培养箱培养4h加入待测试药物，待测药物按照12.5μg/mL起始，4倍梯度稀释，共9个梯度。培养箱培养3天后，用细胞计数试剂盒-8(CCK-8，日本同仁化学)试剂进行相对细胞增殖分析。试验结果(参见图2A-C)可知，ASG-22-MMAE和ASG-AM-MMAE在体外有相近的体外药效。
实施例19：ASG-AM-Dxd体外药效
比较ASG-AM-Dxd在多种细胞上的体外药效，试验步骤参考实施例18，药物加入后孵育时间调整为7天，待测物对不同细胞的EC50结果如下表6。
表6 ASG-AM-Dxd对不同细胞的EC50结果
实施例20：ADC在MDA-MB-468移植瘤模型中的药效
用人乳腺癌MDA-MB-468裸鼠皮下移植瘤模型对ADC的体内抗肿瘤活性进行评价。
雌性裸鼠皮下接种MDA-MB-468肿瘤细胞，建立MDA-MB-468裸鼠移植瘤模型。接种18天后，平均肿瘤体积约为140mm3，根据肿瘤体积大小采用随机区组法将动物分为6组，每组6只，分组当天记为Day 0。ASG-22-MMAE、ASG-AM-MMAE均分别设1mg/kg和5mg/kg剂量组，于Day 0分组当天各组小鼠通过尾静脉注射(IV)单独给药，共给药1次。ASG-AM-Dxd按5mg/kg剂量，于Day 0分组当天尾静脉注射(IV)给药，共给药1次。同时设溶媒对照组(生理盐水)，分组当天尾静脉(IV)单次给药，共给药1次。结果如表7和图3。
给药21天后，溶媒对照组平均肿瘤体积为382.85±23.2mm3，Day 21试验结束。与溶媒对照组相比，Day21时，不同剂量ASG-22-MMAE(1mg/kg和5mg/kg)组，相对肿瘤增殖率(T/C)分别为49.82％(TGI＝49.14％，P<0.001)和17.56％(TGI＝81.91％，P<0.001)。
不同剂量ASG-AM-MMAE(1mg/kg和5mg/kg)组，相对肿瘤增殖率(T/C)分别为53.76％(TGI＝44.70％，P<0.001)和21.51％(TGI＝78.06％，P<0.001)。
ASG-AM-Dxd(5mg/kg)剂量组的相对肿瘤增殖率(T/C)为13.98％(TGI＝85.71％，P<0.001)。
在本次试验中，Day 21时，溶媒对照组动物平均体重上涨，上涨了3.11％。ASG-22-MMAE的低、高剂量组、ASG-AM-MMAE的低、高剂量组和ASG-AM-Dxd剂量组，动物平均体重均有上涨，分别上涨了1.03％、2.42％、3.93％、2.98％和1.46％。试验中药物相关死亡动物数均为0，未发现药物相关的其他毒副作用。
表7各ADC对人乳腺癌MDA-MB-468裸鼠异种移植瘤模型动物肿瘤体积的影响

注：1.Day 0表示分组给药当天；2.*：与溶媒对照组相比，P<0.05；**：与溶媒对照
组相比，P<0.01；***：与溶媒对照组相比，P<0.001。
实施例21：JEG-3细胞株皮下异种移植瘤的药效学评价
研究目的：
临床前评价测试药物ASG-AM-ExaD4、ASG-AM-ExaD8和ASG-AM-Dxd在人绒毛膜癌JEG-3细胞株皮下异种移植雌性NOD/SCID小鼠动物模型中的药效学研究。
实验设计
本实验分为以下5组，每组6只，给药开始于分组当天。实验设计详见下表8。
表8人绒毛膜癌JEG-3皮下异种移植模型中的给药途径、剂量及方案

注：分组当天为第0天，给药从第0天开始。
试验方法
JEG-3细胞培养在含10％胎牛血清的MEM添加0.01mM NEAA培养液中。收集指数生长期的JEG-3细胞，PBS重悬至适合浓度用于小鼠皮下肿瘤接种。
实验小鼠于右侧背部皮下接种1×107JEG-3细胞，细胞重悬在1：1的PBS与基质胶中(0.2mL/只)定期观察肿瘤生长情况待肿瘤生长至平均体积129.56mm3时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。分组当天设定为Day 0，给药开始于Day 0。
试验结果
实验期间各组小鼠无明显异常或体重降低。
JEG-3异种移植模型各治疗组和对照组肿瘤生长情况见下表9和图4。各治疗组单次给药后均能显著抑制肿瘤生长，ASG-AM-ExaD4和ASG-AM-ExaD8的药效显著强于ASG-AM-Dxd。
表9 JEG-3异种移植模型中各组药效分析表


注：a.数据以“平均值±标准误差”表示；
b.TGI％＝[1-(Ti-T0)/(Ci-C0)]x100其中T0及C0分别是给药组及溶媒对照组分组当天
(Day 0)的平均肿瘤体积，Ti及Ci分别是给药组及溶媒对照组Day 13时的平均肿瘤体积；
c.*P<0.05，**P<0.01及***P<0.001与溶媒对照组肿瘤体积相比。

Claims (32)

  1. 一种抗体或抗原结合单元，其特征在于，所述抗体或抗原结合单元特异性结合Nectin-4，并且包含(a)-(f)中的一个或多个：
    (a)VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
    (b)VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
    (c)VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
    (d)VL CDR1，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
    (e)VL CDR2，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
    (f)VL CDR3，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
  2. 如权利要求1所述的抗体或抗原结合单元，其特征在于，所述抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3，可选的还包含SEQ ID NO:2所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1和如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2中的一个或多个。
  3. 如权利要求1或2所述的抗体或抗原结合单元，其特征在于，所述抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3。
  4. 如权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合单元，其特征在于，所述抗体或抗原结合单元包含如SEQ ID NO:2所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:3所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:4所示的VH CDR3、如SEQ ID NO:5所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:6所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:7所示的VL CDR3。
  5. 如权利要求1-4任一项所述的抗体或抗原结合单元，其特征在于，所述抗体或抗原结合单元包含重链可变区和/或轻链可变区；
    所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
    所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％ 或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
  6. 一种抗体或抗原结合单元，其特征在于，所述抗体或抗原结合单元包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
  7. 如权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合单元，其特征在于，所述抗体或抗原结合单元还包含重链恒定区和/或轻链恒定区；或者，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型；所述轻链恒定区是λ链或κ链恒定区。
  8. 如权利要求7所述的抗体或抗原结合单元，其特征在于，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
    所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列相比具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
  9. 一种抗体，其特征在于，所述抗体的重链包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
  10. 生物材料，其选自：
    (1)一种核酸，其编码权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元；
    (2)包含(1)的载体、宿主细胞或微生物；
    (3)上述(2)的表达产物、悬浮液或上清液。
  11. 制备权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元的方法，包括：培养如权利要求10所述的宿主细胞使权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元表达，及自宿主细胞中分离所述抗体或抗原结合单元。
  12. 一种抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，包含通过接头与药物偶联的权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元。
  13. 具有式I-A、式I-B、式I-C结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物：
    Abu为权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元；
    D为药物；
    M为R选自：-(CH2)r-、-(CHRm)r-、C3-C8碳环基、-O-(CH2)r-、亚芳基、-(CH2)r-亚芳基-、-亚芳基-(CH2)r-、-(CH2)r-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-(CH2)r-、C3-C8杂环基、-(CH2)r-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-和-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2)r-；其中各Rm独立为H、C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；在式I-A中*连接Abu，**连接B；在式I-B中*连接Abu，**连接L；在式I-C中*连接Abu，**连接V；
    B为其中*连接M，**连接L，***连接G；
    L为-(AA)i-(FF)f-，其中，AA为氨基酸或多肽，i是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；各FF独立为 其中各RF独立为C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-NO2或卤素，其中*连接AA，**连接D，z为0、1、2、3或4；f为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
    G为其中n为1-24；
    V为或V为其中*连接M，**连接-NH-CH2-；
    p为1-10。
  14. 如权利要求13所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，所述B为其中*连接M，**连接L，***连接G。
  15. 如权利要求13或14所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，各AA独立选自以下氨基酸或肽序列：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu和Gly-Phe-Leu-Gly。
  16. 如权利要求15所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，AA为Val-Cit。
  17. 如权利要求13-16任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，i为1。
  18. 如权利要求13-17任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂 合物，其特征在于，各FF独立为 其中*连接AA，**连接D。
  19. 如权利要求18所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，FF为其中*连接AA，**连接D。
  20. 如权利要求13-19任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，f为1。
  21. 如权利要求13-20任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，L为 在式I-A中*连接B，**连接D，在式I-B中*连接M，**连接D。
  22. 具有式I-A-1或I-A-2结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-A-1、I-A-2为：
    其中
    Abu为权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元；
    R选自：-(CH2)r-、-(CHRm)r-、C3-C8碳环基、-O-(CH2)r-、亚芳基、-(CH2)r-亚芳基-、-亚芳基-(CH2)r-、-(CH2)r-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-(CH2)r-、C3-C8杂环基、-(CH2)r-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2CH2O)r-CH2-和-(CH2CH2O)rC(O)NRm(CH2)r-；其中各Rm独立为H、C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各r独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
    D为药物；
    n为1-24的整数；
    p为1-10。
  23. 如权利要求13-22任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，所述R为-(CH2)r-，r为1或5。
  24. 具有式I-A-3或I-A-4结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-A-3、I-A-4为：
    其中
    Abu为权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元；
    D为药物；
    n为1-24的整数；
    p为1-10。
  25. 如权利要求13-24任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，n为4-12；或n为4-8；或n为4或8。
  26. 具有式I-A-5、I-A-6、I-A-7、I-A-8、I-A-9、I-A-10或I-A-11结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-A-5、I-A-6、I-A-7、I-A-8、I-A-9、I-A-10、I-A-11为：


    其中
    Abu为权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元；
    D为药物；
    p为1-10。
  27. 如权利要求12-26任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，所述药物为抗癌药物、细胞毒性药物、细胞分化因子、干细胞营养因子、类固醇类药物、治疗自身免疫疾病的药物、抗炎症药物或治疗传染性疾病的药物；或药物为抗癌药物；或药物为微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂或DNA拓扑异构酶抑制剂；或所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)类、美登素(maytansine)类；或药物为奥瑞他汀(auristatin)类，选自MMAE、MMAF或AF；或药物为DNA损伤剂，选自卡奇霉素(calicheamicin)类、倍癌霉素(duocarmycin)类、安曲霉素类衍生物PBD(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮杂)；或药物为DNA拓扑异构酶抑制剂或其盐，选自伊立替康、伊立替康盐酸盐、喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氯-10-羟基喜树碱、喜树碱类衍生物SN-38、22-羟基旱莲木碱、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、依喜替康、硅基高喜树碱(homosilatecan)、6,8-二溴-2-甲基-3-[2-(D-吡喃木糖基氨基)苯基]-4(3H)-喹唑啉酮、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(苯基甲基)-(2E)-2-丙烯酰胺、2-氰基-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(3-羟基苯基丙基)-(E)-2-丙烯酰胺、12-β-D-吡喃萄萄糖基-12,13-二氢-2,10-二羟基-6-[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]-5H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[3,4-c]咔唑-5,7(6H)-二酮、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4-吖啶甲酰胺二盐酸盐、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-4- 吖啶甲酰胺；或所述DNA拓扑异构酶抑制剂为喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、贝洛替康、伊立替康、22-羟基旱莲木碱或依喜替康。
  28. 如权利要求12-26任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，所述药物为其中
    X1和X2各自独立地为：
    H，
    羟基，
    C1-C6烷基，
    被一个或多个羟基、卤素、硝基或氰基取代的C1-C6烷基，
    C2-C6烯基，
    C2-C6炔基，
    C1-C6烷氧基，
    C1-C6氨基烷氧基，
    卤素，
    硝基，
    氰基，
    巯基，
    烷硫基，
    氨基，被氨基保护基取代的氨基，在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基，
    在氨基部分任选被氨基保护基或C1-C6烷基取代的C1-C6氨基烷基氨基，
    连接至杂环的C1-C6烷基，所述杂环任选被一个或多个C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、卤素、硝基或氰基取代，
    连接至杂环的C1-C6烷基氨基，所述杂环任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基取代，所述氨基任选被氨基保护基、卤素、硝基、氰基或保护基取代，
    氨基取代的杂环基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或一个或多个C1-C6烷基取代，
    杂环氨基，其在杂环部分的氮原子或氨基部分任选被保护基或C1-C6烷基取代，
    任选被氨基甲酰基保护基或C1-C6烷基取代的氨基甲酰基，
    吗啉-1-基，或
    哌啶-1-基；
    X3为C1-C6烷基；
    X4为H、-(CH2)q-CH3、-(CHRn)q-CH3、C3-C8碳环基、-O-(CH2)q-CH3、亚芳基-CH3、-(CH2)q-亚芳基-CH3、-亚芳基-(CH2)q-CH3、-(CH2)q-(C3-C8碳环基)-CH3、-(C3-C8碳环基)-(CH2)q-CH3、C3-C8杂环基、-(CH2)q-(C3-C8杂环基)-CH3、-(C3-C8杂环基)-(CH2)q-CH3、-(CH2)qC(O)NRn(CH2)q-CH3、-(CH2CH2O)q-CH3、-(CH2CH2O)q-CH2-CH3、-(CH2)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH3、-(CH2)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH2-CH3、-(CH2CH2O)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH3、-(CH2CH2O)qC(O)NRn(CH2CH2O)q-CH2-CH3、或-(CH2CH2O)qC(O)NRn(CH2)q-CH3；其中各Rn独立为H、C1-C6烷基、C3-C8碳环基、苯基或苄基；并且各q独立为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；或者X4为H或C1-C6烷基；
    **为连接点；
    y为0、1或2；
    Y为O、S或CR1DR2D，其中R1D和R2D各自独立地为H或C1-C6烷基；
    s和t各自独立为0、1或2，但不同时为0；
    或药物为其中X1和X2各自独立地为C1-C6烷基、卤素或-OH；或所述C1-C6烷基为-CH3；或所述卤素为F；**为连接点；
    或药物为其中X1和X2各自独立地为C1-C6烷基、卤素或-OH；或所述C1-C6烷基为-CH3，或所述卤素为F；**为连接点；
    或药物为其中X1和X2各自独立地为C1-C6烷基、卤素或-OH；或所述C1-C6烷基为-CH3；或所述卤素为F；**为连接 点；或药物为其中X1和X2各自独立地为C1-C6烷基、卤素或-OH；或所述C1-C6烷基为-CH3，或所述卤素为F；**为连接点；
    或者药物为其中**为连接点；
    R2为H或C1-C8烷基；
    R3为H、C1-C8烷基、C3-C8碳环基、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环基)、C3-C8杂环基或C1-C8烷基-(C3-C8杂环基)；
    R4为H、C1-C8烷基、C3-C8碳环基、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环基)、C3-C8杂环基或C1-C8烷基-(C3-C8杂环基)；
    R5为H或甲基；
    或者R4和R5连接形成碳环基，并具有式结构式-(CRaRb)j-，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C8烷基或C3-C8碳环基，j为2、3、4、5和6；
    R6为H或C1-C8烷基；
    R7为H、C1-C8烷基、C3-C8碳环基、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环基)、C3-C8杂环基或C1-C8烷基-(C3-C8杂环基)；
    各个R8各自为H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环基或O-(C1-C8烷基)；
    R9为H或C1-C8烷基；并且
    R10为–C(R8)2–C(R8)2–芳基、–C(R8)2–C(R8)2–(C3-C8杂环基)或–C(R8)2–C(R8)2–(C3-C8碳环基)；
    或药物为其中**为连接点。
  29. 具有式I-A-12、I-A-13、I-A-14、I-A-15、I-A-16、I-A-17、I-A-18、I-A-19、I-A-20、I-A-21、I-A-22、I-A-23、I-A-24、I-A-25、式I-B-1或式I-C-1结构或者其立体异构体的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述式I-A-12、I-A-13、I-A-14、I-A-15、I-A-16、I-A-17、I-A-18、I-A-19、I-A-20、I-A-21、I-A-22、I-A-23、I-A-24、I-A-25、式I-B-1、式I-C-1为：





    其中
    Abu为权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元；
    p为1-10。
  30. 如权利要求13-29任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其特征在于，p为2-8；或p为4-8；或p为6-8；或p为7-8。
  31. 一种药物组合物，其包含权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元或权利要求10所述的生物材料或权利要求12-30任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物以及药物可接受的载体、赋形剂和/或辅料；或者，任选的其他抗癌药物。
  32. 权利要求1-9任一项所述的抗体或抗原结合单元或权利要求10所述的生物材料或权利要求12-30任一项所述的抗体药物偶联物或者其药学上可接受的盐或溶剂合物或者权利要求31所述的药物组合物在治疗疾病或制备用于治疗疾病的药物中的用途；或所述用途还包括与其他抗癌药物联用；或者，所述疾病为Nectin-4异常表达相关的疾病；或者，所述疾病为表达或过表达Nectin-4的肿瘤；或者，所述疾病为表达或过表达Nectin-4的癌症；或者，所述疾病为实体瘤或血液癌症；或者，所述疾病选自乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、肺癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌、绒毛膜癌、皮肤癌、食管癌、胃癌、子宫癌、胆囊癌、肝癌、肝细胞癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、结直肠癌、结肠癌和前列腺癌。
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