CN116942845A

CN116942845A - 抗psma抗体、其药物偶联物及其医药用途

Info

Publication number: CN116942845A
Application number: CN202310073228.2A
Authority: CN
Inventors: 张昊颖; 杨阳; 张小敏; 金薪盛; 陶维康
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2022-02-07
Filing date: 2023-02-07
Publication date: 2023-10-27

Abstract

本披露涉及抗PSMA抗体、其药物偶联物及其医药用途。具体而言，本披露涉及如通式(Ab‑L‑D)所示的抗PSMA抗体‑卡巴他赛药物偶联物，其中Ab为抗PSMA抗体，L和n如说明书中所定义。

Description

抗PSMA抗体、其药物偶联物及其医药用途

技术领域

本披露涉及抗PSMA抗体、其药物偶联物，及其制备方法。同时，本披露中所述的抗PSMA抗体或其ADC可用于制备治疗疾病或病症的药物。

背景技术

这里的陈述仅提供与本披露有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。

前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)属于谷氨酸II型羧肽酶(Glutamate carboxypeptidase II，GCPII)，它在神经系统中作为NAALDase，酶解NAAG得到谷氨酸，与谷氨酸的神经传递相关。在小肠中作为FOLH1，分解叶酸-聚-γ-谷氨酸(folyl-poly-γ-glutamate，FPGn)得到叶酸，与叶酸代谢相关(Curr Med Chem.2012；19(6):856–870.)。而在前列腺中，PSMA表达在上皮细胞上，与前列腺癌的发生有关。PSMA由750个氨基酸组成，包括胞内域(包含19氨基酸)，跨膜域(包含24个氨基酸)和胞外域(包含707个氨基酸)。结晶结果显示胞外部分由3个结构域组成，分别为蛋白酶样结构域、顶端结构域和C末端结构域。三者都参与底物的结合，前两者直接与底物结合，C末端结构域在使PSMA形成二聚体中发挥作用(The EMBO Journal(2006)25,1375–1384)。

PSMA除了由前列腺上皮细胞表达以外，还可以由非前列腺组织表达，例如小肠，近端肾小管和唾液腺，但其水平远低于前列腺组织。而PSMA在前列腺癌细胞中高表达，特别是在转移性疾病、激素难治性疾病和高级别病变中的表达最高。另外，PSMA还高表达于所有实体瘤的新生血管的内皮细胞中，但其在正常血管中没有表达，所以它也被作为实体瘤治疗的靶点(Clinical Cancer Research,Vol.3,81-85,January 1997；Urologic Oncology:Seminars and Original Investigations,1(1),18-28.；Clin Cancer Res.2010November15；16(22):5414-5423.)。雄激素剥夺或雄激素受体拮抗剂治疗均可上调前列腺特异膜抗原(PSMA)的表达(J Nucl Med2017；58:81-84)，这为靶向疗法与传统激素疗法联合治疗提供依据。

抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)，将单克隆抗体通过接头与具有生物活性的药物相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和药物(如细胞毒性剂)的高效性，同时又避免了抗体的疗效偏低和药物的毒副作用过大等缺陷。与以往传统的化疗药物相比，抗体-药物偶联物能更精准地杀伤肿瘤细胞并降低将对正常细胞的影响。因此，采用不同策略开发新的靶向PSMA的ADC药物具有广阔的前景。

披露内容

本披露涉及抗PSMA抗体、其抗体药物偶联物，以及其医药用途。更具体的，本披露提供多种序列全新的抗PSMA抗体，以及其与细胞毒性物质(卡巴他赛或艾日布林)偶联的ADC。

在一些实施方案中，本披露提供一种通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

Ab为抗PSMA抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中：

i)所述重链可变区的HCDR1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，和所述轻链可变区的LCDR1包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，和LCDR3包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列；或

ii)所述重链可变区的HCDR1包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO：24的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，和所述轻链可变区的LCDR1包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和LCDR3包含SEQID NO：28的氨基酸序列；

L为接头；

n为1至10。

在一些实施方案中，前述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的Ab-L-D具有如下结构：

其中：

Ab为抗PSMA抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中：

i)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

ii)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

L为接头；

n为1至10。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为1-10、n为1-9、n为1-8、n为1-7、n为1-6、n为1-5、n为1-4、n为1-3或n为1-2。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体包含人免疫球蛋白框架区(FR)。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体包含：

所述重链可变区包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；且所述重链可变区的FR包含3K回复突变；和

所述轻链可变区包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；且所述轻链可变区的FR包含71Y回复突变；上述的回复突变位点依据Kabat编号规则。

i)所述重链可变区包含与SEQ ID NO：3、11或12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或

所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：4、13或14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或

ii)所述重链可变区包含与SEQ ID NO：29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或

所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

i)所述重链可变区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或

ii)所述重链可变区包含SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含SEQ ID NO：13或14的氨基酸序列；或

iii)所述重链可变区包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。

所述重链可变区包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体包含重链恒定区和轻链恒定区。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体的重链恒定区为IgG1恒定区。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体，所述的轻链恒定区为κ链恒定区。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体，所述的重链和/或轻链恒定区包含减少重链和轻链之间二硫键的氨基酸突变。具体的，本披露中的抗PSMA抗体为包含至少一个未配对的半胱氨酸残基的位点特异性改造的IgG1同种型抗体。在一些实施方案中，未配对的半胱氨酸残基将包含重链/轻链的链间残基，而不是重链/重链的链间残基。在其他实施方案中，未配对的半胱氨酸残基由链内二硫键产生。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体的轻链的C214残基(根据Kabat EU索引编号)被置换成其他残基或删除。在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体的重链的C220残基(根据Kabat EU索引编号)被置换成其他残基或删除。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体的重链恒定区包含C220S突变，和/或所述的抗PSMA抗体的轻链恒定区包含C214S突变；所述突变根据EU索引编号。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体的重链恒定区包含SEQ ID NO：15或16的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体的重链恒定区包含SEQ ID NO：15和所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体的重链恒定区包含SEQ ID NO：16和所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体包含重链和轻链，其中：

所述重链包含与SEQ ID NO：19具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：20具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或

所述重链包含与SEQ ID NO：21具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：22具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或

所述重链包含与SEQ ID NO：31具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：32具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或

所述重链包含与SEQ ID NO：33具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：34具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；

所述重链包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，和所述轻链包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列；或

所述重链包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，和所述轻链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；或

所述重链包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，和所述轻链包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列；或

所述重链包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和所述轻链包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的接头-L-为-L¹-L²-L³-L⁴-，其中：

L¹选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-、-CH₂-C(O)-NR¹-W-C(O)-和-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C_1-8亚烷基、C_1-6亚烷基-C_3-6环烷基，其中所述的C_1-6亚烷基、C_1-6亚烷基-C_3-6环烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；

L²为-(CH₂CH₂O)_p(CH₂)_mC(O)-或化学键，其中p为1至20的整数，m为1至5的整数；

L³为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述的氨基酸选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，并任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；和

L⁴选自-NR²(CR³R⁴)_t-、-NR⁵-PAB、-C(O)NR⁵、-C(O)NR⁵(CH₂)_t-和化学键，其中t为1至6的整数；

R¹、R²和R⁵相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

R³和R⁴相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中：

L¹为-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-，和-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-，其中W选自C_1-8亚烷基其中W选自C_1-8亚烷基；

L²为-(CH₂CH₂O)_p(CH₂)_mC(O)-或化学键，其中p为1至8的整数，m为1至4的整数；

L³为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述的氨基酸选自甘氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和瓜氨酸中的一个或多个；和

L⁴为-NR²(CH₂)t-或-NR⁵-PAB-，其中R²和R⁵相同或不同，且各自独立地选自氢原子或烷基，t为1或4；

L¹为-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-，和-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-，其中W选自C_1-8亚烷基其中W选自C_1-3亚烷基；

L⁴为-NR²(CH₂)t-或-NR⁵-PAB-，其中R²和R⁵相同或不同，且各自独立地选自氢原子或C_1-3烷基，t为1或4；

L¹为其中s是1-5的整数；

L²为-(CH₂CH₂O)₂(CH₂)₂C(O)-、-(CH₂CH₂O)₄(CH₂)₂C(O)-、或化学键；

L³为包含甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸的四肽残基，或包含缬氨酸-瓜氨酸的二肽残基；

L⁴为-NCH3CH₂、-NHCH2-或-NH-PAB-

其中所述的L¹端与Ab相连，L⁴端与药物相连。

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的-L-为：

在一些实施方案中，如前所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物具有如下所示的结构：

其中：Ab和n如前任一项中所定义。

其中：

Ab为抗PSMA抗体，其包含：

如SEQ ID NO：19所示的重链和如SEQ ID NO：20所示的的轻链；或

如SEQ ID NO：21所示的重链和如SEQ ID NO：22所示的的轻链；

其中n为1至8。

其中：

Ab为抗PSMA抗体，其包含：

如SEQ ID NO：19所示的重链和如SEQ ID NO：20所示的的轻链；或

如SEQ ID NO：21所示的重链和如SEQ ID NO：22所示的的轻链；

其中n为3至5。

本披露进一步提供一种制备抗体-药物偶联物的方法，其包括将如前任一项所述的抗PSMA抗体还原，然后与L-D所示的化合物进行偶联反应，得到本申请所述的抗体偶联药物。

在另一方面，本披露还提供一种抗PSMA抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：

所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO：4中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其包含：

所述重链可变区的HCDR1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，和所述轻链可变区的LCDR1包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ IDNO：9的氨基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其中：

所述重链可变区包含与SEQ ID NO：3、11或12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或

所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：4、13或14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其中：

ii)所述重链可变区包含SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含SEQ ID NO：13或14的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其中：

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其中包含：

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其中所述的抗PSMA抗体是抗体片段。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体是抗体片段，其中所述的抗体片段为Fab、Fab'、F(ab')₂、Fab'-SH、Fd、Fv、scFv、dsFv、双抗体或结构域抗体。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其包含重链恒定区和轻链恒定区。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，所述的重链恒定区源于IgG1。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，所述的轻链恒定区为κ链恒定区。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，所述的重链和/或轻链恒定区包含减少链间二硫键的氨基酸突变。具体的，本披露中的抗PSMA抗体为包含至少一个未配对的半胱氨酸残基的位点特异性改造的IgG1同种型抗体。在一些实施方案中，未配对的半胱氨酸残基将包含重链/轻链的链间残基，而不是重链/重链的链间残基。在其他实施方案中，未配对的半胱氨酸残基由链内二硫键产生。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其轻链的C214残基(根据Kabat EU索引编号)被置换成其他残基或被删除。在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其重链的C220残基(根据Kabat EU索引编号)被置换成其他残基或被删除。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其重链恒定区包含C220S突变，和/或所述的抗PSMA抗体的轻链恒定区包含C214S突变；所述突变根据EU索引编号。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其中：

所述重链恒定区包含SEQ ID NO：15或16的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其包含重链和轻链，其中：

所述重链包含与SEQ ID NO：21具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：22具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

所述重链包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，和所述轻链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其包含重链和轻链，其具有以下特性中的至少一种：

a)所述抗PSMA抗体与人PSMA结合的KD值≤2nM，所述KD值通过Biacore测定；

b)所述抗PSMA抗体与表达PSMA的LNCaP细胞结合的EC50≤0.4nM，所述EC50通过FACS检测；和

c)所述抗PSMA抗体能够被表达PSMA的细胞内吞。

在一些实施方案中，本披露还提供分离的核酸，其编码如前任一项所述的抗PSMA抗体。

在一些实施方案中，本披露还提供载体，其包含如前所述的分离的核酸。

在一些实施方案中，本披露还提供其包含如前所述的核酸或载体的宿主细胞。

在一个方面，本披露提供制备结合PSMA的抗体的方法，其包括在适于表达所述抗体的条件下培养前述的宿主细胞。

在又一个方面，本披露提供一种抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其包含如前任一项所述的抗PSMA抗体。

在又一个方面，本披露提供一种抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其包含如前任一项所述的抗PSMA抗体和药物，其中所述的药物偶联至所述的抗PSMA抗体。

在一些实施方案中，前述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的药物选自细胞毒性剂、放射性标记物、荧光团、发色团、显像剂、免疫调节剂、血管生成抑制剂、细胞增殖抑制剂、促细胞凋亡剂和细胞裂解酶中的一种或多种。

在一些实施方案中，前述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其具有Ab-L-D”的结构，

其中：Ab为如前任一项所述的抗PSMA抗体，L为接头单元，D”为药物，n为1-10。

在一些实施方案中，前述的Ab-L-D”所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的接头-L-为-L¹-L²-L³-L⁴-，其中：

R³和R⁴相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。

L¹为-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-，和-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-，其中W为C_1-8亚烷基；

L⁴为-NR²(CH₂)t-或-NR⁵-PAB-，其中R²和R⁵相同或不同，且各自独立地选自氢原子或烷基，t为1或4。

L¹为其中s为1-5的整数；

L⁴为-NCH3CH₂、-NHCH2-或-NH-PAB-

其中所述的L¹端与Ab相连，L⁴端与药物相连。

在一些实施方案中，前述的Ab-L-D”所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的-L-为：

在一些实施方案中，前述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的药物是艾日布林。

在一些实施方案中，前述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，具有如通式Ab-L-D’所示的结构：

其中：

Ab为抗PSMA抗体；

L为接头单元；

n为1至10。

在一些实施方案中，前述的Ab-L-D’所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的接头-L-为-L¹-L²-L³-L⁴-，其中：

L¹为其中s为1-5的整数；

L⁴为-NCH3CH₂、-NHCH2-或-NH-PAB-

其中所述的L¹端与Ab相连，L⁴端与药物相连。

在一些实施方案中，前述的Ab-L-D’所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的-L-为：

/>

在一些实施方案中，前述的通式Ab-L-D’所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，具有如下所示的结构：

其中：

Ab为抗PSMA抗体；L为接头单元；n为1至10。

其中：

Ab为抗PSMA抗体，其包含：

如SEQ ID NO：19所示的重链和如SEQ ID NO：20所示的的轻链；或

如SEQ ID NO：21所示的重链和如SEQ ID NO：22所示的的轻链；

n为1至8；优选地，n为3至5。

另一方面，本披露提供一种药物组合物，其包含如前任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项所述的抗PSMA抗体，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。在一些实施方案中，所述单位剂量的药物组合物中含有0.1-3000mg或1-1000mg如前所述的抗PSMA抗体或如前所述的抗体-药物偶联物。

另一方面，本披露提供如前任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项所述的抗PSMA抗体，或包含其的药物组合物作为药物的用途。

另一方面，本披露提供如前任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项所述的抗PSMA抗体，或前述的药物组合物在制备用于治疗PSMA介导的疾病或病症的药物中的用途。在一些实施方案中，其中所述PSMA介导的疾病或病症为癌症。在一些实施方案中，其中所述的PSMA介导的疾病或病症为表达PSMA的疾病或病症。

另一方面，本披露提供如前任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项所述的抗PSMA抗体，或前述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。

在一些实施方案中，前述的肿瘤或癌症选自：前列腺癌、头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、肉瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、咽鳞癌、口腔鳞癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝胆癌、胰腺癌、胰管癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、大细胞肺癌、三阴性乳腺癌和小细胞肺癌。

在一些实施方案中，前述的肿瘤或癌症为表达PSMA的肿瘤或癌症。

另一方面，本披露进一步涉及一种治疗肿瘤或癌症的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效剂量的如前任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项所述的抗PSMA抗体，或前述的药物组合物；优选地，其中所述的肿瘤或癌症为表达PSMA的肿瘤或癌症。

另一方面，本披露进一步提供如前任一项述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项述的抗PSMA抗体作为药物，优选作为治疗癌症或肿瘤的药物，更优选作为治疗表达PSMA的癌症或肿瘤的药物。

本披露提供的抗PSMA抗体及抗体-药物偶联物与细胞表面抗原具有良好的亲和力，可有效的被表达PSMA的细胞内吞，并具有很强的抑制肿瘤细胞或癌细胞生长的效果，同时具有良好的安全性(如：在血浆中的完整性较高，不易发生药物部分的脱落)。

附图说明

图1显示抗体的体外内吞活性。

图2显示ADC分子对SCID-beige小鼠LNCaP肿瘤生长的影响。

具体实施方式

一.术语

为了更容易理解本披露，以下对某些技术和科学术语进行了描述。除非在本文中另有明确定义，本文使用的全部技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。

除非上下文另外清楚要求，否则在专利说明书和权利要求书中，应将词语“包含”、“具有”、“包括”等理解为“包括但不仅限于”的意义，而不是排他性或穷举性意义。

术语“和/或”，意指包含“和”与“或”两种含义。例如短语“A、B和/或C”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。当本披露中使用商品名时，旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的药物和活性药物部分。

本披露所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。

术语“氨基酸突变”包括氨基酸取代(也称氨基酸替换)、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低或对Fc受体的结合。氨基酸序列缺失和插入包括在多肽链的氨基端和/或羧基端的缺失和插入。具体的氨基酸突变可以是氨基酸取代。在一个实施方式中，氨基酸突变是非保守性的氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种天然氨基酸的衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR，基因合成等。预计基因工程以外的改变氨基酸侧链基团的方法，如化学修饰也可能是可用的。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。本文中，可采用位置+氨基酸残基的方式表示特定位点的氨基酸残基，例如366W，表示在366位点上的氨基酸残基为W。T366W则表示第366位点上的氨基酸残基由W取代了原来的T。

术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全长抗体和抗体片段(或抗原结合片段，或抗原结合部分)，只要它们展现出期望的抗原结合活性。完整抗体通常包含两条轻链和两条重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域、重链可变区，接着是三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域，或轻链可变域，接着是一个恒定轻域(轻链恒定区、CL)。术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文可互换使用，指具有与天然抗体结构基本类似的结构或具有如本文所限定的Fc区的重链的抗体。天然完整抗体轻链包括轻链可变区VL及恒定区CL，VL处于轻链的氨基末端，轻链恒定区包括κ链及λ链；重链包括可变区VH及恒定区(CH1、CH2及CH3)，VH处于重链的氨基末端，恒定区处于羧基末端，其中CH3最接近多肽的羧基末端，重链可属于任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亚型)、IgA(包括IgA1及IgA2亚型)、IgM及IgE。

术语抗体“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的域。本文中，抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)各包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。其中，术语“互补决定区”或“CDR”指可变结构域内主要促成与抗原结合的区域；“框架”或“FR”是指除CDR残基之外的可变结构域残基。VH包含3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3个CDR区：LCDR1、LCDR2和LCDR3。每个VH和VL由从氨基末端(也称N末端)排到羧基末端(也称C末端)按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

可以通过各种公知方案来确定CDR的氨基酸序列边界，例如：“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则、“ABM”编号规则、“contact”编号规则(参见Martin,ACR.Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018Oct 16；9:2278)等；各种编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。示例性的，如下表1中所示。

表1.CDR编号系统之间的关系

CDR	IMGT	Kabat	AbM	Chothia	Contact
						HCDR1	27-38	31-35	26-35	26-32	30-35
HCDR2	56-65	50-65	50-58	52-56	47-58
						HCDR3	105-117	95-102	95-102	95-102	93-101
LCDR1	27-38	24-34	24-34	24-34	30-36
						LCDR2	56-65	50-56	50-56	50-56	46-55
LCDR3	105-117	89-97	89-97	89-97	89-96

除非另有说明，本披露中的可变区和CDR序列均适用Kabat编号规则。

术语“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原相结合。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab′)₂、单域抗体、单链Fab(scFab)、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fc区”或“片段可结晶区”用于定义抗体重链的C末端区域，包括天然Fc区和改造的Fc区。在一些实施方案中，Fc区包含了相同或不同的两个亚基。在一些实施方案中，人IgG重链的Fc区定义为从Cys226位置处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。用于本文所述抗体的合适Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4的Fc区。在一些实施方案中，Fc区的边界还可以变化，例如缺失Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)或缺失Fc区的C末端甘氨酸和赖氨酸(根据EU编号系统的残基446和447)。除非另有说明，Fc区的编号规则为EU编号系统，又称作EU索引。

术语“嵌合”抗体指抗体中的重和/或轻链的一部分由特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分由另外的不同来源或物种衍生的抗体。

术语“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如，可以通过保留非人CDR区并用其人对应物(即，恒定区以及可变区的框架区部分)替换抗体的其余部分来实现。

术语“人抗体”、“人源抗体”、“全人抗体”、“完全人抗体”可以互换使用，意指可变区及恒定区是人序列的抗体。该术语涵盖源自人基因但具有，例如，降低可能的免疫原性、增加亲和力、消除可能会引起不期望的折叠的半胱氨酸或糖基化位点等序列已发生改变的抗体。该术语涵盖这些在非人细胞(其可能会赋予不具人细胞特征的糖基化)中重组产生的抗体。该术语亦涵盖已在含有一些或所有人免疫球蛋白重链及轻链基因座的转基因小鼠中产生的抗体。人抗体的含义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

术语“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合部位与其结合配体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总体的强度。除非另外指明，如本文所用，结合“亲和力”是指内部结合亲和力，其反映出结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1:1相互作用。分子X对其配体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些方法)测量。

如本文所使用的，术语“kassoc”或“ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，术语“kdis”或“kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。术语“KD”指解离常数，其获得自kd与ka的比率(即kd/ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公知的方法测定抗体的KD值。例如，使用生物传感系统例如系统测量表面等离子体共振，或通过溶液平衡滴定法(SET)测量溶液中的亲和力。

术语“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列突变的Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的例子包括但不限于：C1q结合和补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

术语“单克隆抗体”指基本上均质的抗体的群，即在该群中包含的抗体分子的氨基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突变以外。相比之下，多克隆抗体制剂通常包含在其可变结构域具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，其通常特异性针对不同表位。“单克隆”表示从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。在一些实施方式中，本披露提供的抗体是单克隆抗体。

术语“抗原”是指能够由诸如抗原结合蛋白(包括例如抗体)的选择性结合剂结合，且另外能够用于动物中以产生能够结合该抗原的抗体的分子或分子部分。抗原可具有一个或多个能够与不同的抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的表位。

术语“表位”指能够与抗体或其抗原结合片段特异性结合的抗原上的区域(area或region)。表位可以由连续氨基酸串(线性表位)形成或包含非连续氨基酸(构象表位)，例如因抗原的折叠(即通过蛋白质性质的抗原的三级折叠)而变成空间接近。构象表位和线性表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，抗体对构象表位的结合丧失。表位包含处于独特空间构象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10个氨基酸。筛选结合特定表位的抗体(即那些结合相同表位的)可以使用本领域例行方法来进行，例如但不限于丙氨酸扫描，肽印迹，肽切割分析，表位切除，表位提取，抗原的化学修饰(见Prot.Sci.9(2000)487-496)，和交叉阻断。

术语“抗PSMA抗体”和“结合PSMA的抗体”是指能够以足够的亲和力结合PSMA的抗体。在一个实施例中，抗PSMA抗体与无关蛋白的抗体的结合程度小于该抗体与PSMA结合的约10％，所述结合可通过表面等离子体共振测定法测量。

术语“能够特异性结合”、“特异性结合”或“结合”是指相比其他抗原或表位，抗体能够以更高的亲和力结合至某个抗原或其表位。通常地，抗体以约1×10^-7M或更小(例如约1×10^-8M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或其表位。在一些实施方案中，抗体与抗原结合的KD为该抗体结合至非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10％或更低(例如1％)。可使用已知的方法来测量KD，例如通过表面等离子体共振测定法所测量的。然而，特异性结合至抗原或其表位的抗体可能对其它相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其它物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相应抗原具有交叉反应性。

术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。编码多肽或融合蛋白的分离的核酸指编码多肽或融合蛋白的一个或更多个核酸分子，包括在单一载体或分开的载体中的这样的一个或更多个核酸分子，和存在于宿主细胞中一个或更多个位置的这样的一个或更多个核酸分子。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外说明，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体。

术语序列“同一性”指，当对两条序列进行最佳比对时，必要时引入间隙，以获取最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，两条序列的氨基酸/核酸在等价位置相同的程度(百分比)。为测定序列同一性百分比，比对可以通过本领域技术已知的技术来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。

术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接附加的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(AAV或AAV2)，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。术语“表达载体”或“表达构建体”是指可对宿主细胞进行转化，且含有指导和/或控制与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译且在存在内含子时影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，可以含有突变。该术语包括这样的突变体后代，其与在初始转化细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞包括原核和真核宿主细胞，其中真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞系植物细胞和真菌细胞。示例性的宿主细胞如下：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、A549细胞、3T3细胞和HEK-293细胞、巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)。如在本申请中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，并且所有这样的名称均包括子代。因而，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而与传代的次数无关。还应理解的是，由于有意或无意的突变，使得并非所有子代均具有完全相同的DNA内容物。包括与筛选出其的原始转化细胞具有相同功能或生物活性的突变子代。

“抗体-药物偶联物”(antibody drug conjugate，ADC)，是将抗体直接或通过连接单元与具有生物活性的药物相连后得到的。

“药物(Drug，缩写：D)”是任何具有生物或可检测活性的物质，例如治疗剂、可检测标记、结合剂等和在体内代谢成活性剂的前药。治疗剂的实例包括细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞生长抑制剂和免疫调节剂。化学治疗剂是可用于治疗癌症的化学化合物。代表性治疗剂包括细胞毒素、细胞毒性剂和细胞生长抑制剂。

细胞毒性效应是指缺失、消除和/或杀死目标细胞。细胞毒性剂是指对细胞具有细胞毒性和/或细胞生长抑制效应的药剂。细胞生长抑制效应是指抑制细胞增殖。细胞生长抑制剂是指对细胞具有细胞生长抑制效应、由此抑制细胞的特定亚组的生长和/或扩增的药剂。

额外代表性治疗剂包括放射性同位素、化学治疗剂、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促细胞凋亡剂和细胞裂解酶(例如，RNAse)。这些药物描述词并不互斥，且因此，可使用一个或多个上述术语描述治疗剂。例如，所选放射性同位素也是细胞毒素。治疗剂可制备为上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。通常，具有放射性同位素作为药物的偶联物被称为放射性免疫偶联物，具有化学治疗剂作为药物的那些被称为化学免疫偶联物。

细胞毒性剂的实例包括，但不限于，蒽环霉素、奥里斯他汀、CC-1065、尾海兔素(dolastatin)、多卡米星、烯二炔、格尔德霉素(geldanamycin)、美登素(maytansine)、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、SN-38、微管溶素(tubulysin)、hemiasterlin、艾日布林、Trabectedin、Lubinectedin和其立体异构体、等排物、类似物或衍生物。也可使用化学治疗剂、植物毒素、其他生物活性蛋白质、酶(即，ADEPT)、放射性同位素、光敏剂(即，用于光动力学治疗)。

尾海兔素和其肽类似物和衍生物奥里斯他汀是高度有效的抗有丝分裂剂，已显示其具有抗癌和抗真菌活性。参见，例如，美国专利号5,663,149和Pettit等人，Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965,(1998)。示例性尾海兔素和奥里斯他汀包括，但不限于，尾海兔素10、奥里斯他汀E、奥里斯他汀EB(AEB)、奥里斯他汀EFP(AEFP)、MMAD(单甲基奥里斯他汀D或单甲基尾海兔素10)、MMAF(单甲基奥里斯他汀F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-D,L-异亮氨酸(dolaisoleuine)-D,L-脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸)、MMAE(单甲基奥里斯他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-D,L-异亮氨酸-D,L-脯氨酸-降麻黄碱)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)。

术语“标记”当本文中使用时是指直接或间接缀合至抗体以便生成“标记的”抗体的可检测化合物或组合物。标记可以是自身可检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶促标记的情况下，标记可催化底物化合物或组合物可检测的化学变化。可充当可检测标记的放射性核素包括，例如，I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、和Pd-109。标记也可以是不可检测的实体，诸如毒素。

放射性同位素或其他标记的实例包括，但不限于，³H、¹¹C、¹³N、¹⁴C、¹⁵N、¹⁵O、³⁵S、¹⁸F、³²P、³³P、⁴⁷Sc、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷⁵Se、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、⁹⁴Tc、⁹⁵Ru、⁹⁷Ru、⁹⁹Tc、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁵Ru、¹⁰⁷Hg、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹¹¹In、¹¹³In、¹²¹Te、¹²²Te、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁵Te、¹²⁶I、¹³¹I、¹³¹In、¹³³I、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁵³Pb、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁵Tm、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶H、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁸Tm、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁸⁹Re、¹⁹⁷Pt、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²⁰¹Tl、²⁰³Hg、²¹¹At、²¹²Bi、²¹²Pb、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁴Ac和²²⁵Ac。

术语“接头单元”、“接头”、“连接单元”或“连接片段”是指一端与抗体连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与抗体或药物相连。接头附接至抗体可以多种方式完成，诸如经由表面赖氨酸、还原性偶联至氧化碳水化合物、通过还原链间二硫键释放的半胱氨酸残基、在特定位点处改造的反应性半胱氨酸残基、和含有酰基供体谷氨酰胺的标签或通过在转谷氨酰胺酶和胺存在下多肽改造使得具有反应性的内源性谷氨酰胺。多种ADC连接系统是本领域已知的，包括基于腙-、二硫化物-和肽-的连接。

接头可以包含一种或多种接头构件。示例性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”，在本文中也称作“MCC”)和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。接头可以选自以下的元件或其组合：延伸物、间隔物和氨基酸单元。可以通过本领域已知方法合成接头，诸如US2005-0238649A1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

接头元件包括但不限于：

MC＝6-马来酰亚氨基己酰基，结构如下：

Val-Cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的示例二肽)，

瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸，

PAB＝对氨基苄氧羰基(“自我牺牲”接头元件的示例)，

Me-Val-Cit＝N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶B的切割)，

MC(PEG)6-OH＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可附着于抗体半胱氨酸)，

SPP＝N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯，

SPDP＝N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，

SMCC＝琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，

IT＝亚氨基硫烷。

“L-D、L-D’或L-D”是指药物(D)连接至接头(L)产生的接头-药物部分。

“载药量”，也称药物抗体比例(Drug-to-Antibody Ratio，DAR)，即ADC中每个抗体所偶联的药物的平均数量。其可在例如每个抗体偶联约1至约10个药物的范围内，并且在某些实施例中，在每个抗体偶联约1至约8个药物的范围内，优选自2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，1-3，3-4，3-5，5-6，5-7，5-8和6-8的范围。本披露的ADC通式包括前述一定范围内的抗体药物偶联物的集合。在本披露的实施方式中，载药量可表示为n，是小数或整数。可用常规方法如UV/可见光光谱法，质谱，ELISA试验、HIC和RP-HPLC测定载药量。

本披露的一个实施方案中，药物通过连接单元偶联在抗体的巯基上。

可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载药量，包括：

(1)控制药物连接子片段和单抗的摩尔比，

(2)控制反应时间和温度，

(3)选择不同的反应试剂。

术语“烷基”指饱和的直链或带有支链的脂肪族烃基，其具有1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)碳原子(即C_1-20烷基)。所述烷基优选具有1至12个碳原子的烷基(即C_1-12烷基)，更优选具有1至6个碳原子的烷基(即C_1-6烷基)。非限制性的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“亚烷基”指二价烷基，其中烷基如上所定义，其具有1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)碳原子(即C_1-20亚烷基)。所述亚烷基优选具有1至12个碳原子的亚烷基(即C_1-12亚烷基)，更优选具有1至6个碳原子的亚烷基(即C_1-6亚烷基)。非限制性的实例包括：-CH₂-、-CH(CH₃)-、-C(CH₃)₂-、-CH₂CH₂-、-CH(CH₂CH₃)-、-CH₂CH(CH₃)-、-CH₂C(CH₃)₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂-等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“烯基”指分子中含有至少一个碳碳双键的烷基，其中烷基的定义如上所述，其具有2至12个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)碳原子(即C_2-12烯基)。所述烯基优选具有2至6个碳原子的烯基(即C_2-6烯基)。非限制性的实例包括：乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基等。烯基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“炔基”指分子中含有至少一个碳碳三键的烷基，其中烷基的定义如上所述，其具有2至12个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)碳原子(即C_2-12炔基)。所述炔基优选具有2至6个碳原子的炔基(即C_2-6炔基)。非限制性的实例包括：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。炔基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“烷氧基”指-O-(烷基)，其中烷基的定义如上所述。非限制性的实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基等。烷氧基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“环烷基”指饱和或部分不饱和的单环全碳环(即单环环烷基)或多环系统(即多环环烷基)，其具有3至20个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即3至20元环烷基)。所述环烷基优选具有3至12个环原子的环烷基(即3至12元环烷基)，更优选具有3至8个环原子的环烷基(即3至8元环烷基)，最优选具有3至6个环原子的环烷基(即3至6元环烷基)。

所述的单环环烷基，非限制性的实例包括：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基和环辛基等。

所述的多环环烷基包括：螺环烷基、稠环烷基和桥环烷基。

术语“螺环烷基”指环之间共用一个碳原子(称螺原子)的多环系统，其环内可以含有一个或多个双键，或其环内可以含有一个或多个选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，条件是至少含有一个全碳环且连接点在该全碳环上，其具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元螺环烷基)。所述螺环烷基优选具有6至14个环原子的螺环烷基(即6至14元螺环烷基)，更优选具有7至10个环原子的螺环烷基(即7至10元螺环烷基)。所述螺环烷基包括单螺环烷基和多螺环烷基(如双螺环烷基等)，优选单螺环烷基或双螺环烷基，更优选3元/4元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/3元、5元/4元、5元/5元、5元/6元、5元/7元、6元/3元、6元/4元、6元/5元、6元/6元、6元/7元、7元/5元或7元/6元单螺环烷基。非限制性的实例包括：

其连接点可在任意位置；

等。

术语“稠环烷基”指环之间共享毗邻的两个碳原子的多环系统，其为单环环烷基与一个或多个单环环烷基稠合，或者单环环烷基与杂环基、芳基或杂芳基中的一个或多个稠合，其中连接点在单环环烷基上，其环内可以含有一个或多个双键，且具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元稠环烷基)。所述稠环烷基优选具有6至14个环原子的稠环烷基(即6至14元稠环烷基)，更优选具有7至10个环原子的稠环烷基(即7至10元稠环烷基)。所述稠环烷基包括双环稠环烷基和多环稠环烷基(如三环稠环烷基、四环稠环烷基等)，优选双环稠环烷基或三环稠环烷基，更优选3元/4元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/3元、5元/4元、5元/5元、5元/6元、5元/7元、6元/3元、6元/4元、6元/5元、6元/6元、6元/7元、7元/5元或7元/6元双环稠环烷基。非限制性的实例包括：

，其连接点可在任意位置；

等。

术语“桥环烷基”指环之间共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环系统，其环内可以含有一个或多个双键，且具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)碳原子(即5至20元桥环烷基)。所述桥环烷基优选具有6至14个碳原子的桥环烷基(即6至14元桥环烷基)，更优选具有7至10个碳原子的桥环烷基(即7至10元桥环烷基)。所述桥环烷基包括双环桥环烷基和多环桥环烷基(如三环桥环烷基、四环桥环烷基等)，优选双环桥环烷基或三环桥环烷基。非限制性的实例包括：

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其连接点可在任意位置。

环烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氧代基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“杂环基”指饱和或部分不饱和的单环杂环(即单环杂环基)或多环杂环系统(即多环杂环基)，其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，且具有3至20个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即3至20元杂环基)。所述杂环基优选具有3至12个环原子的杂环基(即3至12元杂环基)；进一步优选具有3至8个环原子的杂环基(即3至8元杂环基)；更优选具有3至6个环原子的杂环基(即3至6元杂环基)；最优选具有5或6个环原子的杂环基(即5或6元杂环基)。

所述的单环杂环基，非限制性的实例包括：吡咯烷基、四氢吡喃基、1,2,3,6-四氢吡啶基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基和高哌嗪基等。

所述的多环杂环基包括螺杂环基、稠杂环基和桥杂环基。

术语“螺杂环基”指环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环系统，其环内可以含有一个或多个双键，且其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，条件是至少含有一个单环杂环基且连接点在该单环杂环基上，其具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元螺杂环基)。所述螺杂环基优选具有6至14个环原子的螺杂环基(即6至14元螺杂环基)，更优选具有7至10个环原子的螺杂环基(即7至10元螺杂环基)。所述螺杂环基包括单螺杂环基和多螺杂环基(如双螺杂环基等)，优选单螺杂环基或双螺杂环基，更优选3元/4元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/3元、5元/4元、5元/5元、5元/6元、5元/7元、6元/3元、6元/4元、6元/5元、6元/6元、6元/7元、7元/5元或7元/6元单螺杂环基。非限制性的实例包括：

等。

术语“稠杂环基”指环之间共享毗邻的两个原子的多环杂环系统，其环内可以含有一个或多个双键，且其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，其为单环杂环基与一个或多个单环杂环基稠合，或者单环杂环基与环烷基、芳基或杂芳基中的一个或多个稠合，其中连接点在单环杂环基上，且具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元稠杂环基)。所述稠杂环基优选具有6至14个环原子的稠杂环基(即6至14元稠杂环基)，更优选具有7至10个环原子的稠杂环基(即7至10元稠杂环基)。所述稠杂环基包括双环和多环稠杂环基(如三环稠杂环基、四环稠杂环基等)，优选双环稠杂环基或三环稠杂环基，更优选3元/4元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/3元、5元/4元、5元/5元、5元/6元、5元/7元、6元/3元、6元/4元、6元/5元、6元/6元、6元/7元、7元/5元或7元/6元双环稠杂环基。非限制性的实例包括：

等。

术语“桥杂环基”指环之间共用两个不直接连接的原子的多环杂环系统，其环内可以含有一个或多个双键，并且其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，其具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元桥杂环基)。所述桥杂环基优选具有6至14个环原子的桥杂环基(即6至14元桥杂环基)，更优选具有7至10个环原子的桥杂环基(即7至10元桥杂环基)。根据组成环的数目可以分为双环桥杂环基和多环桥杂环基(如三环桥杂环基、四环桥杂环基等)，优选双环桥杂环基或三环桥杂环基。非限制性的实例包括：

等。

杂环基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氧代基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的单环全碳芳环(即单环芳基)或多环芳环系统(即多环芳基)，其具有6至14个(例如6、7、8、9、10、11、12、13或14个)环原子(即6至14元芳基)。所述芳基优选具有6至10个环原子的芳基(即6至10元芳基)。所述的单环芳基，例如苯基。所述的多环芳基，非限制性的实例包括：萘基、蒽基、菲基等。所述多环芳基还包括苯基与杂环基或环烷基中的一个或多个稠合，或萘基与杂环基或环烷基中的一个或多个稠合，其中连接点在苯基或萘基上，并且在这种情况下，环原子个数继续表示多环芳环系统中的环原子个数，非限制性的实例包括：

等。

芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氧代基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“杂芳基”指具有共轭的π电子体系的单环杂芳环(即单环杂芳基)或多环杂芳环系统(即多环杂芳基)，其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，其具有5至14个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个)环原子(即5至14元杂芳基)。所述杂芳基优选具有5至10个环原子的杂芳基(即5至10元杂芳基)，更优选具有5或6个环原子的杂芳基(即5或6元杂芳基)。

所述的单环杂芳基，非限制性的实例包括：呋喃基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、呋咱基、吡咯基、N-烷基吡咯基、吡啶基、嘧啶基、吡啶酮基、N-烷基吡啶酮(如等)、吡嗪基、哒嗪基等。

所述的多环杂芳基，非限制性的实例包括：吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、酞嗪基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、喹唑啉基、苯并噻唑基、咔唑基等。所述多环杂芳基还包括单环杂芳基与一个或多个芳基稠合，其中连接点在芳香环上，并且在这种情况下，环原子个数继续表示多环杂芳环系统中的环原子个数。所述多环杂芳基还包括单环杂芳基与环烷基或杂环基中的一个或多个稠合，其中连接点在单环杂芳环上，并且在这种情况下，环原子个数继续表示多环杂芳环系统中的环原子个数。非限制性的实例包括：

等。/>

杂芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“氨基保护基”是指为了使分子其它部位进行反应时氨基保持不变，在氨基上引入的易于脱去的基团。非限制性的实例包括：(三甲基硅)乙氧基甲基、四氢吡喃基、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、笏甲氧羰基(Fmoc)、烯丙氧羰基(Alloc)、三甲基硅乙氧羰基(Teoc)、甲氧羰基、乙氧羰基、邻苯二甲酰基(Pht)、对甲苯磺酰基(Tos)、三氟乙酰基(Tfa)、三苯甲基(Trt)、2,4-二甲氧基苄基(DMB)、乙酰基、苄基、烯丙基、对甲氧苄基等。

术语“羟基保护基”是指在羟基上引入的易于脱去的基团，用于阻断或保护羟基而在化合物的其它官能团上进行反应。非限制性的实例包括：三甲基硅基(TMS)、三乙基硅基(TES)、三异丙基硅基(TIPS)、叔丁基二甲基硅基(TBS)、叔丁基二苯基硅基(TBDPS)、甲基、叔丁基、烯丙基、苄基、甲氧基甲基(MOM)、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基(THP)、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、对硝基苯甲酰基等。

术语“环烷基氧基”指环烷基-O-，其中环烷基如上所定义。

术语“杂环基氧基”指杂环基-O-，其中杂环基如上所定义。

术语“芳基氧基”指芳基-O-，其中芳基如上所定义。

术语“杂芳基氧基”指杂芳基-O-，其中杂芳基如上所定义。

术语“烷硫基”指烷基-S-，其中烷基如上所定义。

术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。

术语“卤代烷氧基”指烷氧基被一个或多个卤素取代，其中烷氧基如上所定义。

术语“氘代烷基”指烷基被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。

术语“羟烷基”指烷基被一个或多个羟基取代，其中烷基如上所定义。

术语“甲叉基”指＝CH₂。

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。

术语“羟基”指-OH。

术语“巯基”指-SH。

术语“氨基”指-NH₂。

术语“氰基”指-CN。

术语“硝基”指-NO₂。

术语“氧代”或“氧代基”指“＝O”。

术语“羰基”指C＝O。

术语“羧基”指-C(O)OH。

术语“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)、-C(O)O(环烷基)、(烷基)C(O)O-或(环烷基)C(O)O-，其中烷基和环烷基如上所定义。

化学式中简称“Me”为甲基。

化学式中简称“Ph”为苯基。

术语“THF”指四氢呋喃。

术语“EtOAc”指乙酸乙酯。

术语“MeOH”指甲醇。

术语“DMF”指N,N-二甲基甲酰胺。

术语“DIPEA”或“DIEA”指二异丙基乙胺。

术语“TFA”指三氟乙酸。

术语“MeCN”指乙晴。

术语“DMA”指N,N-二甲基乙酰胺。

术语“Et₂O”指乙醚。

术语“DCE”指1,2二氯乙烷。

术语“DIPEA”指N,N-二异丙基乙胺。

术语“NBS”指N-溴代琥珀酰亚胺。

术语“NIS”指N-碘代丁二酰亚胺。

术语“Cbz-Cl”指氯甲酸苄酯。

术语“Pd₂(dba)₃”指三(二亚苄基丙酮)二钯。

术语“Dppf”指1,1’-双二苯基膦二茂铁。

术语“HATU”指2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯。

术语“KHMDS”指六甲基二硅基胺基钾。

术语“LiHMDS”或“LHMDS”指双三甲基硅基胺基锂。

术语“MeLi”指甲基锂。

术语“n-BuLi”指正丁基锂。

术语“NaBH(OAc)₃”指三乙酰氧基硼氢化钠。

术语“DCM”指二氯甲烷。

术语“DMAP”指4-二甲氨基吡啶。

术语“DMBOH”指2,4-二甲氧基苄醇。

术语“EDCI”指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。

术语“MTBE”指甲基叔丁基醚。

术语“DMF”指N,N-二甲基甲酰胺。

术语“DMTMM”指4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。

术语“EtOAc”指乙酸乙酯。

术语“CBTX”为卡巴他赛(Cabazitaxel)。

术语“DUB”指1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯。

术语“TMSCI”指三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilane)。

术语“Ac”指乙酰基。

术语“Bz”指苯甲酰基。

术语“DMB”指2,4-二甲氧基苄基。

本披露的化合物可以存在特定的立体异构体形式。术语“立体异构体”是指结构相同但原子在空间中的排列不同的异构体。其包括顺式和反式(或Z和E)异构体、(-)-和(+)-异构体、(R)-和(S)-对映异构体、非对映异构体、(D)-和(L)-异构体、互变异构体、阻转异构体、构象异构体及其混合物(如外消旋体、非对映异构体的混合物)。本披露化合物中的取代基可以存在另外的不对称原子。所有这些立体异构体以及它们的混合物，均包括在本披露的范围内。可以通过手性合成、手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(-)-和(+)-异构体、(R)-和(S)-对映异构体以及(D)-和(L)-异构体。本披露某化合物的一种异构体，可以通过不对称合成或者手性助剂来制备，或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，得到纯的异构体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过色谱法完成。

本披露所述化合物的化学结构中，键表示未指定构型，即如果化学结构中存在手性异构体，键/>可以为/>或/>或者同时包含/>和/>两种构型。

本披露的化合物可以以不同的互变异构体形式存在，并且所有这样的形式包含在本披露的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指平衡存在并且容易从一种异构形式转化为另一种异构形式的结构异构体。其包括所有可能的互变异构体，即以单一异构体的形式或以所述互变异构体的任意比例的混合物的形式存在。非限制性的实例包括：酮-烯醇、亚胺-烯胺、内酰胺-内酰亚胺等。内酰胺-内酰亚胺平衡实例是在如下所示的A和B之间：

如当提及吡唑基时，应理解为包括如下两种结构中的任何一种或两种互变异构体的混合物：

所有的互变异构形式在本披露的范围内，且化合物的命名不排除任何互变异构体。

本披露的化合物包括其化合物的所有合适的同位素衍生物。术语“同位素衍生物”是指至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同的原子替代的化合物。可引入到本披露化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘等的稳定和放射性的同位素，例如分别为²H(氘，D)、³H(氚，T)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²p、³³p、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、¹⁸F、³⁶Cl、⁸²Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁹I和¹³¹I等，优选氘。

相比于未氘代药物，氘代药物有降低毒副作用、增加药物稳定性、增强疗效、延长药物生物半衰期等优势。本披露的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本披露的范围之内。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换，其中氘的替换可以是部分或完全的，部分氘的替换是指至少一个氢被至少一个氘替换。

当一个位置被特别地指定为氘D时，该位置应理解为具有大于氘的天然丰度(其为0.015％)至少1000倍的丰度的氘(即至少15％的氘掺入)。示例中化合物的具有大于氘的天然丰度可以是至少1000倍的丰度的氘(即至少15％的氘掺入)、至少2000倍的丰度的氘(即至少30％的氘掺入)、至少3000倍的丰度的氘(即至少45％的氘掺入)、至少3340倍的丰度的氘(即至少50.1％的氘掺入)、至少3500倍的丰度的氘(即至少52.5％的氘掺入)、至少4000倍的丰度的氘(即至少60％的氘掺入)、至少4500倍的丰度的氘(即至少67.5％的氘掺入)、至少5000倍的丰度的氘(即至少75％的氘掺入)、至少5500倍的丰度的氘(即至少82.5％的氘掺入)、至少6000倍的丰度的氘(即至少90％的氘掺入)、至少6333.3倍的丰度的氘(即至少95％的氘掺入)、至少6466.7倍的丰度的氘(即至少97％的氘掺入)、至少6600倍的丰度的氘(即至少99％的氘掺入)、至少6633.3倍的丰度的氘(即至少99.5％的氘掺入)或更高丰度的氘。

“取代”或“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选1～6个，更优选1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下(通过实验或理论)确定可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和键的碳原子(如烯)结合时可能是不稳定的。

本披露还包括各种氘化形式的式(Ab-L-D)或(Ab-L-D’)抗体-药物偶联物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式(Ab-L-D)或(Ab-L-D’)抗体-药物偶联物。在制备氘代形式的式(Ab-L-D)或(Ab-L-D’)抗体-药物偶联物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

“任选的”或“任选”是指随后所描述的事件或环境可以但不必然发生，其包括该事件或环境发生或不发生两种情形。例如“任选被卤素或者氰基取代的C_1-6烷基”包括烷基被卤素或者氰基取代的情形和烷基不被卤素和氰基取代的情形。

术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入受试者的血流中。或者，最好按可保持本披露化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的示例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。

药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液，例如1,3-丁二醇中制备的溶液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用包括合成甘油单或二酯在内的任何调和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以制备注射剂。

术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本披露的抗体或抗体-药物偶联物的盐，这类盐用于受试者时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本披露抗体、或抗体药物偶联物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性示例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。

术语“药学上可接受的载体”指药学配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。

术语“赋形剂”是在药物制剂中除活性成分以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。

术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。

术语“受试者”或“个体”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。如本文所使用的，术语“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“施用”或“给予”，当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。

术语“样本”是指从受试者分离的流体、细胞、或组织的采集物，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本、细针穿刺、手术切除的组织、器官培养物或细胞培养物。

“治疗(treatment或treat)”和“处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本披露的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。

“有效量”一般是足以降低症状的严重程度及/或频率、消除这些症状及/或潜在病因、预防症状及/或其潜在病因出现及/或改良或改善由疾病状态引起或与其相关的损伤(例如肺病)的量。在一些实施例中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以治疗疾病状态或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状，或者以其他方式预防、阻碍、延迟或逆转该疾病状态或以任何方式与该疾病相关的任何其他不理想症状的进展的量。“预防有效量”是当给予受试者时将具有预定预防效应，例如预防或延迟该疾病状态的发作(或复发)，或者降低该疾病状态或相关症状的发作(或复发)可能性的量。完全治疗或预防效未必在给予一个剂量之后便发生，可能在给予一系列剂量之后发生。因而，治疗或预防有效量可以一次或多次给予的方式给予。“治疗有效量”和“预防有效量”可取决于多种因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括例如患者改善的健康状况。

二、具体实施方式的描述

A.示例性的抗PSMA的抗体

在一个方面中，本披露提供结合PSMA的抗体。在一个方面中，提供结合PSMA的分离的抗体。在一个方面中，本披露提供特异性结合PSMA的抗体。

在某些实施方案中，前述的抗PSMA抗体具有以下特性中的至少一种：

c)所述抗PSMA抗体能够被表达PSMA的细胞内吞。

在一个方面中，本披露提供一种抗PSMA的抗体，其包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDRs：

(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；(ii)HCDR2，其包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列；(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；(iv)LCDR1，其包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；(v)LCDR2，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；和(vi)LCDR3，其包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列。

在一个方面中，本披露提供一种抗PSMA的抗体，其包含SEQ ID NO：3的重链可变区的HCDRs和SEQ ID NO：4的轻链可变区的LCDRs。

在一些实施方案中，所述的CDRs序列根据本领域内公知的编号方法获得，所述的编号规则包括但不限于Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact。

在一个方面中，本披露提供一种抗PSMA的抗体，其包含：

HCDR1，其序列如SEQ ID NO：5所示，或与SEQ ID NO：5相比包含3、2或1个氨基酸差异；

HCDR2，其序列如SEQ ID NO：6所示，或与SEQ ID NO：6相比包含3、2或1个氨基酸差异；

HCDR3，其序列如SEQ ID NO：7所示，或与SEQ ID NO：7相比包含3、2或1个氨基酸差异；

LCDR1，其序列如SEQ ID NO：8所示，或与SEQ ID NO：8相比包含3、2或1个氨基酸差异；

LCDR2，其序列如SEQ ID NO：9所示，或与SEQ ID NO：9相比包含3、2或1个氨基酸差异；和

LCDR3，其序列如SEQ ID NO：10所示，或与SEQ ID NO：10相比包含3、2或1个氨基酸差异。

在一个方面中，本披露提供一种抗PSMA的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在另一个方面，抗PSMA抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO：3、11或12中的任一氨基酸序列分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相对于参考序列的替代(例如保守替代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗PSMA抗体保留结合PSMA的能力。在某些实施方案中，替代、插入或缺失发生在CDR以外的区域中(即，FR中)。

在另一个方面，抗PSMA抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO：4、13或14中的任一氨基酸序列分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相对于参考序列的替代(例如保守替代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗PSMA抗体保留结合PSMA的能力。在某些实施方案中，替代、插入或缺失发生在CDR以外的区域中(即，FR中)。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体包含如SEQ ID NO：3、11或12任一所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO：4、13或14任一所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体包含如SEQ ID NO：3所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO：4任一所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体包含选自SEQ ID NO：11或12所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO：13或14所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体包含如SEQ ID NO：12所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO：14所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体其包含重链恒定区和轻链恒定区。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其重链恒定区的序列如SEQ IDNO：15或16所示。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其轻链恒定区的序列如SEQ IDNO：17或18所示。

所述重链包含与SEQ ID NO：19具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：20具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或

所述重链包含与SEQ ID NO：21具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：22具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其包含如SEQ ID NO：19所示的重链，和如SEQ ID NO：20所示的轻链。

在一些实施方案中，前述的抗PSMA抗体，其包含如SEQ ID NO：21所示的重链，和如SEQ ID NO：22所示的轻链。

B.抗体结构

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是全长抗体。

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。

在一个实施方案中，抗体片段是Fab、Fab'、Fab'-SH或F(ab')₂片段，特别是Fab片段。“Fab”，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段。“Fab片段”可以是抗体经木瓜蛋白酶裂解产生的。“Fab'”含有VL、CL以及VH和CH1，还含有CH1和CH2结构域之间的区域，以使得在两个Fab'片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，以形成F(ab')2分子。“Fab'-SH”是其中恒定区的半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab'片段。“F(ab')₂”包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段。

在另一个实施方案中，抗体片段是双抗体，三抗体或四抗体。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的VH和VL。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点，两个抗原可以是相同或不同的

在另一个实施方案中，抗体片段是单链Fab片段。“单链Fab片段”或“scFab”是由VH，CH1，VL，CL和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头在N端至C端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。在一个实施方式中，所述接头是具有至少30个氨基酸的多肽。在另一个实施方式中，所述接头是具有32至50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL和CH1之间的天然二硫键而被稳定化。另外，通过插入半胱氨酸残基(例如在重链可变区中的位置44和轻链可变区中的位置100，根据Kabat编号)产生链间二硫键，这些单链Fab分子可以进一步被稳定化。

在另一个实施方案中，抗体片段是单链可变片段(scFv)。“scFv”是包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链可变区和重链可变区通过短的柔性肽接头连续连接，能够表达为单链多肽，并且其中scFv保持其所源自的完整抗体的特异性。除非特别指出，否则在本文中scFv可以以任何一种顺序具有VL和VH可变区，例如相对于多肽的N端和C端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。

在另一个实施方案中，抗体片段是由VH和CH1结构域组成的Fd片段。

在另一个实施方案中，抗体片段是由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。

在另一个实施方案中，抗体片段是dsFv，dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(Protein Engineering.7:697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。

在另一个实施方案中，抗体片段是单域抗体，单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。

在另一个实施方案中，抗体片段是结构域抗体(domain antibody,dAb)；参见例如美国专利No.6,248,516。结构域抗体(dAb)为抗体的功能结合结构域，其对应于人抗体的重(VH)或轻(VL)链的可变区。dAB具有约13kDa的分子量、或者为小于完整抗体大小十分之一。dAB良好地表达于包括细菌、酵母和哺乳动物细胞体系的各种宿主中。此外，即使经历严厉条件下，例如冻干或者热变性，dAb高度稳定和保持活性。参见例如，美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；美国系列No.2004/0110941；欧洲专利0368684；美国专利6,696,245；WO04/058821；WO04/003019和WO03/002609。

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。

在某些实施方案中，抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体通过人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变区，其中CDR或其部分衍生自非人抗体，而FR或其部分衍生自人抗体。任选地，人源化抗体还会包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，可将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如提供CDR序列的抗体)的相应残基替代。

人源化抗体及其生成方法综述于如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于如Riechmann等，Nature 332:323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“再表面”(resurfuacing))；Dall’Acqua等，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；和Osbourn等，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer 83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。

可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等，J.Immunol.151:2296(1993))；衍生自轻链可变区或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库获得的框架区(见例如Baca等，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点(即不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些实施方案中，结合特异性之一针对PSMA，而其它特异性针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合PSMA的两种(或更多种)不同表位。也可以使用多特异性(例如双特异性)抗体来将细胞毒性药剂或细胞定位于表达PSMA的细胞。多特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(见Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983))，和“杵臼”工程化(见例如美国专利No.5,731,168和Atwell等，J.Mol.Biol.270:26(1997))。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(见例如WO2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980和Brennan等，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny etal.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用共同轻链技术来规避轻链错配问题(见例如WO 98/50431)；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等，J.Immunol.,152:5368(1994))；和例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。

C.抗体的修饰

在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入、和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。

a)替代、插入、和删除变体

在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括CDR和FR。保守替代在表2中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表2中在“示例性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

表2

原始残基	示例性替代	优选的替代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp,Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

依照常见的侧链特性，氨基酸可以如下分组:

(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)碱性的：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的成员。

在某些实施方案中，替代、插入或缺失可以在一个或多个CDR内发生，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对CDR做出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以例如在CDR中的抗原接触残基外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个CDR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。

一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如带电荷的残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，Ala或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对初始替代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。此外，可通过研究抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为替代候选物被打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，和单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。

b)Fc区修饰

在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文所提供的抗体的Fc区中。

在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰可减少Fc与Fc受体的结合，例如其与Fcγ受体的结合，并且降低或消除效应子功能。在一些实施方案中，改造的Fc区与天然Fc区相比，对Fc受体的结合亲和力下降50％、80％、90％或95％以上。在一些实施方案中，所述Fc受体是人Fcγ受体，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIB、FcγRIIIa。在一些实施方案中，改造的Fc区与天然Fc区相比，对补体，如C1q的结合亲和力也降低。在一些实施方案中，改造的Fc区与天然Fc区相比，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力增强；比如在Fc区引入M252Y/S254T/T256E突变。在一些实施例中，改造的Fc区具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。对于IgG₁Fc区，在238、265、269、270、297、327和329等位置的氨基酸残基取代可降低的效应子功能。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG₁ Fc区，并且在234和235位置的氨基酸残基为A，编号依据为EU索引。对于IgG₄ Fc区，在228等位置的氨基酸残基取代可降低的效应子功能。

在某些实施方案中，抗体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如在Fc区的位置298、333、和/或334(采用EU编号系统)的替代。

在某些实施方案中，本文中的抗体的Fc域包含“杵臼”突变。“杵臼”是一种用于工程化改造抗体重链同二聚体进行异二聚化(例如为了有效生成双特异性抗体，多特异性抗体，或独臂抗体)的设计策略。一般地，此类技术牵涉引入第一多肽(诸如第一抗体重链中的第一CH3域)的界面处的隆起(“杵”)和第二多肽(诸如第二抗体重链中的第二CH3域)的界面中的对应空腔(“臼”)，使得隆起能安置在空腔中从而促进异二聚体形成和阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽(诸如第一抗体重链中的第一CH3域)的界面的较小氨基酸侧链用较大侧链(例如精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将较大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸，丝氨酸，缬氨酸，或苏氨酸)替换在第二多肽(诸如第二抗体重链中的第二CH3域)的界面中创建与隆起相同或相似尺寸的补偿性空腔。可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变)或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一些实施方案中，杵修饰包含Fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代T366W，而臼修饰包含Fc域的两个亚基之中的另一中的氨基酸替代T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，Fc域的包含杵修饰的亚基另外包含氨基酸替代S354C，而且Fc域的包含臼修饰的亚基另外包含氨基酸替代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致形成Fc区的两个亚基之间的二硫桥，如此进一步稳定二聚体(Carter,J.Immunol.Methods 248:7-15(2001))。杵臼突变的例示性组合包括但不限于表3中所述。

表3

关于杵臼技术的别的细节描述于例如美国专利No.5,731,168；美国专利No.7,695,936；WO 2009/089004；US 2009/0182127；Marvin and Zhu,Acta PharmacologicaSincia(2005)26(6):649-658；Kontermann,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26:1-9；Ridgway等，Prot Eng 9:617-621(1996)；和Carter,J Immunol Meth 248:7-15(2001)。

Fc区的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端；也可以是缩短的C末端，例如在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面中，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。因此，在一些实施方式中，完整抗体的组合物可以包括去除了所有K447残基和/或G446+K447残基的抗体群体。在一些实施方式中，完整抗体的组合物可以包括没有去除K447残基和/或G446+K447残基的抗体群体。在一些实施方式中，完整抗体的组合物具有带有和不带有K447残基和/或G446+K447残基的抗体混合物的抗体群体。

D.重组方法

抗PSMA抗体可以使用重组方法来产生。对于这些方法，提供编码抗体的一个或更多个分离的核酸。

在一个实施方案中，本披露提供了编码如前所述的抗体的分离的核酸。此类核酸可以给自独立的编码前述的任一多肽链。在另一方面中，本披露提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在另一方面中，本披露提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，提供制备抗PSMA抗体的方法，其中所述方法包括，在适合表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生抗体，将编码蛋白的核酸分离并插入一个或更多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可以使用常规程序容易地分离和测序，或者通过重组方法产生或通过化学合成获得。

用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。在表达后，可以在可溶级分中从细菌细胞糊状物分离，并且可进一步纯化。

E.测定

本文提供的多肽或融合蛋白可以通过本领域已知的多种测定法对其物理/化学特征和/或生物学活性进行鉴定、筛选或表征。在一个方面中，例如通过已知方法如ELISA、蛋白印迹法等，测试本披露的多肽或融合蛋白活性。

F.治疗方法与施用途径

本文提供的前述任何抗PSMA抗体、包含其的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐可用于治疗疾病。

在一个方面，本披露提供抗PSMA抗体、包含其的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐在药物的制造或制备中的用途。在一些实施方案中，本披露提供的抗PSMA抗体、包含其的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐在制备用于肿瘤或癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，所述的其中所述的肿瘤或癌症包括但不限于头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、咽鳞癌、口腔鳞癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、大细胞肺癌、三阴性乳腺癌和小细胞肺癌。在一些实施方案中，本披露提供的抗PSMA抗体、包含其的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗PSMA相关的疾病的药物中的用途。在一个此类实施方案中，所述用途进一步包括向受试者施用有效量的至少一种另外的治疗剂(例如一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的治疗剂)。

在又一个的方面，提供包含所述抗PSMA抗体或其药物偶联物的药物组合物，例如，其用于以上任何制药用途或治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何多肽或融合蛋白和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种另外的治疗剂。

本披露的抗PSMA抗体或其药物偶联物可单独使用或与其他试剂联合用于治疗。例如，本披露的抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。

本披露的抗PSMA抗体或其药物偶联物可通过任何合适的手段施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗，则病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何适当的途径，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短期的还是长期的。本文考虑多种给药时间方案，包括但不限于，单次或在多个时间点多次施用，推注施用和脉冲输注。

本披露的抗PSMA抗体或其药物偶联物将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、试剂的递送部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业者已知的其他因素。抗PSMA抗体或其药物偶联物可以与或不与目前用于预防或治疗所述病症的一种或更多种试剂一起配制。此类其它试剂的有效量取决于药物组合物中存在的量、病症或治疗的类型以及其它因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用路径使用，或以本文所述剂量的约1至99％使用，或以其它剂量使用，并通过经验/临床确定为合适的任何途径使用。

为了预防或治疗疾病，本披露的抗PSMA抗体或其药物偶联物(当单独使用或与一种或更多种其他另外的治疗剂组合使用时)的适当的剂量将取决于待治疗的疾病的类型，治疗分子的类型，疾病的严重性和病程，是为预防还是治疗目的施用，之前的治疗，患者的临床病史和对治疗分子的响应，和主治医师的判断。治疗分子恰当地以一次或经过一系列治疗施用于患者。

G.制品

在本披露的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。该制品包含容器和在容器上或与容器联合的标签或包装插页(packageinsert)。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以自各种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断疾患的组合物，并且可具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的至少一种活性试剂是本披露的抗PSMA抗体或其药物偶联物。标签或包装插页指示使用该组合物是来治疗选择的病况。此外，制品可以包含：(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本披露的抗PSMA抗体或其药物偶联物；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他方面的治疗剂。本披露的该实施方案中的制品可进一步包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可以用于治疗特定病况。备选地，或另外地，制品可进一步包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液。从商业和用户立场，它可进一步包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

以下结合实施例进一步描述本披露，但这些实施例并非限制本发明的范围。

本披露实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

一、抗体的制备

实施例1：PSMA高表达细胞株CHO-K1的构建

将pCDH-huPSMA或pCDH-cynoPSMA慢病毒表达载体质粒与pVSV-G，pCMV-dR8.91慢病毒系统包装载体用Lipofectamine 3000转染试剂转染至293T细胞中，收集含有病毒的培养基上清，过滤并进行超高速离心，弃去上清后，用1mL无菌PBS重悬。使用浓缩后的病毒感染中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1，经嘌呤霉素筛选两至三周，再进行FACS单细胞分选。

通过FACS检测慢病毒感染的CHO-K1细胞表面的PSMA表达，挑选出PSMA表达量高的单克隆细胞株huPSMA-CHO-K1和cynoPSMA-CHO-K1。将挑选出的单克隆细胞株扩大培养，冻存备库以便后续实验。相关氨基酸序列如下：

人PSMA氨基酸序列(UniProtKB-Q04609-1)：

MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA

SEQ ID NO：1

猴PSMA氨基酸序列(UniProtKB-A0A2K5VNZ0-1)：

MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSQAWGEVKRQISIATFTVQAAAETLSEVA

SEQ ID NO：2

实施例2：小鼠抗人PSMA单克隆抗体的制备

2.1免疫和融合

使用人PSMA-His蛋白(ACRO，PSA-H52H3)和LNCaP细胞(ATCC，CRL-1740^TM)对小鼠进行交叉免疫。蛋白免疫的用量为25μg，细胞免疫为每次5×10⁶个细胞，每周免疫一次。免疫3次后取血测定血清中抗体的效价。选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，采用PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(ATCC，CRL-8287^TM)进行融合，得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以0.5-1×10⁶个/mL的密度用MC半固体完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×OPI和2％甲基纤维素的RPMI-1640培养基)重悬，分装于35mm细胞培养皿中，37℃，5％CO₂孵育7-9天。融合后第7-9天，根据细胞克隆大小，挑取单细胞克隆至加有200μL/孔的HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)的96孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂培养3天进行检测。

2.2杂交瘤细胞筛选

根据杂交瘤细胞生长密度，用结合ELISA方法进行杂交瘤培养上清检测。选择与huPSMA-CHO-K1和cynoPSMA-CHO-K1细胞结合能力强，同时与野生型CHO-K1细胞没有结合杂交瘤细胞，及时进行扩增冻存保种和二到三次亚克隆直至获得单细胞克隆。

2.3杂交瘤抗体序列测定

挑选出体外活性好的单克隆杂交瘤细胞株mAb19-1，克隆其中的抗体序列，再进行人源化，重组表达和活性评价。

从杂交瘤中克隆序列过程如下：收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)，反转录(PrimeScript^TMReverse Transcriptase，Takara，cat#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-PrimerSet(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。得到的抗体序列如下：

mAb19-1重链可变区：

EVKLVESEGGLVQPGSSMKLSCTASGFTFSDYYMAWVRQVPERGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFIISRDNAKNILYLQMSSLKSEDTATYYCARGGDYWDAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO：3mAb19-1轻链可变区：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTS SLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNRLPRTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO：4注：下划线部分为依照Kabat编号规则确定的CDR区。

表4.mAb19-1抗体CDR序列

实施例3：鼠源抗人PSMA单克隆抗体的人源化

通过比对Kabat人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。并对FR区的部分氨基酸进行回复突变，再与恒定区重组(示例性的，与SEQ ID NO：15或16所示的人IgG1重链恒定区和SEQ ID NO：17或18所示的人κ轻链恒定区)，获得人源化抗体。

mAb19-1抗体的人种系轻链模版为IGKV1-39*01，人种系重链模版为IGHV3-7*01。

表5.mAb19-1抗体人源化设计

人源化抗体的可变区序列如下：

hu19-1 VH1

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDYWDAMDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：11

hu19-1 VH2

SEQ ID NO：12

hu19-1 VL1

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNRLPRTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：13

hu19-1 VL2

SEQ ID NO：14

注：单划线部分为CDR，双划线处为回复突变位点。

抗体的恒定区如下：

人IgG1的重链恒定区

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:15

人IgG1的重链恒定区变体：

SEQ ID NO:16

κ链恒定区:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:17

κ链恒定区变体:

SEQ ID NO:18

示例性的人源化抗体的重、轻链可变区组合如下：

表6.mAb19-1的人源化抗体

可变区	VL1	VL2
			VH1	19L1H1	19L2H1
VH2	19L1H2	19L2H2

注：19L1H1表示该抗体包含重链可变区hu19-1VH1和轻链可变区hu19-1VL1，且其重链恒定区的序列为SEQ ID NO：15，轻链恒定区的序列为SEQ ID NO：17，其他类推。

分别克隆、表达、纯化上述抗体，经亲和力检测实验，最终选出活性好的人源化抗体。

示例性的人源化抗体的重、轻链氨基酸序列如下：

19L2H2(简称P19)重链：

SEQ ID NO：19

19L2H2(简称P19)轻链：

注：序列中下划线部分为可变区，斜体部分为恒定区。

SEQ ID NO：20

为了控制抗体偶联药物中药物的载量，对P19抗体进行轻重链恒定区的进行氨基酸突变改造，去除轻、重链间的部分二硫键，获得M-P19抗体，其序列如下：

M-P19重链：

SEQ ID NO：21

M-P19轻链：

SEQ ID NO：22

本披露中使用的AB-PG1-XG1-006(简称H-AB-P1，参照WO2003034903A2制备)抗体制备抗体偶联药物，其序列如下：

表7.H-AB-P1的CDR序列

H-AB-P1重链可变区：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTQYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDFLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：29

H-AB-P1轻链可变区：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKTGKVPKFLIYEASTLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQNYNSAPFTFGPGTKVDIK

SEQ ID NO：30H-AB-P1重链：

SEQ ID NO:31H-AB-P1轻链：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKTGKVPKFLIYEASTLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQNYNSAPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:32

对H-AB-P1分子进行轻、重链恒定区进行氨基酸突变改造，去除轻、重链间的部分二硫键，获得M-H-AB-P1，其序列如下：

M-H-AB-P1重链：

SEQ ID NO:33M-H-AB-P1轻链：

SEQ ID NO:34二、化合物的制备

本披露实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或质谱(MS)确定。NMR的测定使用BrukerAVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10^-6(ppm)作为单位给出。

MS的测定使用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(Thermo，型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。

UPLC的测定使用Waters Acquity UPLC SQD液质联用仪。

HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)。

UV-HPLC的测定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度计。

薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm至0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm至0.5mm硅胶板。

柱层析一般使用烟台黄海200～300目硅胶为载体。

本披露的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。

实施例中如无特殊说明，反应均在氩气氛或氮气氛下进行。

氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。

氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。

加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。

氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。

微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。

实施例中如无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。

实施例中如无特殊说明，反应的温度为室温，温度范围是20℃至30℃。

实施例中pH＝6.5的PBS缓冲液的配制：取KH₂PO₄ 8.5g，K₂HPO₄.3H₂O 8.56g，NaCl5.85g，EDTA 1.5g置于瓶中，定容至2L，超声波使其全部溶解，摇匀即得。

纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂的体系包括：A：二氯甲烷和异丙醇体系，B：二氯甲烷和甲醇体系，C：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和酸性或碱性试剂等进行调节。

本披露部分化合物是通过Q-TOF LC/MS来表征的。Q-TOF LC/MS使用安捷伦6530精确质量数四级杆-飞行时间质谱仪和安捷伦1290-Infinity超高效液相色谱仪(安捷伦Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色谱柱)。

本披露抗体-药物偶联物的药物部分可选择本领域公知的细胞毒性药物，示例性的药物为卡巴他赛(Cabazitaxel)和艾日布林。本披露中示例性的抗体-药物偶联物的合成路线如下。

实施例2-1.化合物L1-D的合成

(1)1b的合成

将底物1a(44mg,0.12mol，采用专利申请“CN111689980A中说明书第7页的中间体“化合物4””公开的方法制备而得)，和无水DCM(1.6mL)一起加入到单口瓶中，加入搅拌子，氩气保护下置换三次，开启搅拌；滴入三甲基氯硅烷(0.4mL)，滴完后在室温下反应半小时。LC-MS显示原料反应完全。浓缩蒸干得粗品1b(50mg，收率～100％)。

MS:363[M+19]。

(2)1d的合成

在25mL单口瓶中，加入1c(Cabazitaxel,卡巴他赛，50mg,0.06mmol，购买来源：Meilunbio货号：MB1403)和无水THF(1mL)，氩气保护下置换三次，开启搅拌。干冰乙醇冷却到-60℃左右。滴入LHMDS(0.09mL，0.09mmol，LHMDS在THF溶液中的浓度为1M)，随后反应允许在-60℃搅拌30分钟。将1b(42mg,0.12mmol)溶于1mL的无水THF里，滴入反应液里。反应液慢慢升到室温并过夜。监控反应完全，停止反应，将反应液降温到0℃左右，加入饱和氯化铵溶液，随后用EtOAc萃取，有机相合并，无水硫酸钠干燥，过滤蒸干得到淡黄色固体粗品。粗品过柱纯化，DCM/MeOH＝30/1洗脱得到白色固体产品(30mg，收率：43.7％)。

Ms(ESI):m/z 1144.4[M+1]⁺。

(3)1e的合成

在25mL单口瓶中将1d(30mg，0.0263mmol)溶于1mL的无水DCM里，氮气置换三次，冰浴冷却至0-5℃，开启搅拌。滴入DBU(12mg,0.0789mmol)的DCM(1.6mL)溶液。0-5℃下反应一个小时后，取样LC-MS检测，原料反应完全，生成了产物。加入5mL的H₂O稀释，DCM(5mL×3)萃取，有机相合并，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后得粗品1e(30mg)。

Ms(ESI):m/z 922.40[M+1]⁺。

(4)L1-D的合成

在25mL单口瓶中，加入1f(12.4mg,0.0263mmol，按照EP2907824B中的实施例73中的方法制备而得)，1e(30mg,0.0263mmol)，以及DMF(2mL)，开启搅拌，氩气置换三次。冰浴冷却至0-5℃。加入DIEA(5mg,0.04mmol)以及HATU(11mg,0.0289mmol)，随后在0-5℃下搅拌一个小时。取样LC-MS检测，原料反应完全，生成了产物。将反应液直接送制备HPLC分离，得L1-D(6.33mg，收率17.5％)。

Ms(ESI):m/z 1376.50[M+1]⁺。

¹H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.09-8.07(m,2H),7.71-7.26(m，14H),7.24-7.02(m，3H)，6.81-6.60(m，3H)，5.68-5.47(m，1H)，5.03-4.92(m,1H),4.82-4.72(m，2H)，4.68-4.34(m，2H)，4.32-4.22(m，1H)，4.21-4.08(m，1H)，3.98-3.71(m,7H),3.54-3.45(t，2H)，3.45-3.38(s，3H)，3.34-3.18(m,4H),3.17-2.94(m，1H)，2.74-2.58(m，1H)，2.50-2.33(m,2H),2.31-2.18(m，3H)，1.99-1.87(m,3H),1.81-1.52(m,15H),1.36-1.12(m，18H)。

实施例2-2.L2-D的合成

(1)L2-D的合成

在25mL单口瓶中，加入1c(25mg,0.03mmol)，无水THF(1mL)，氩气保护下置换三次，开启搅拌。干冰乙醇冷却到-60℃左右。滴入0.045mL的LHMDS(LHMDS在THF溶液中的浓度是1M)，随后反应允许在-60℃搅拌30分钟。氩气保护下往反应液里快速加入固体2a(44mg，0.06mmol；参照WO2019108797，实施例6记载的方法合成)，反应允许慢慢升到室温并过夜。取样LC-MS检测显示有目标产物的质谱峰，原料少量剩余。停止反应，将反应液降温到0℃左右，加入饱和氯化铵溶液，随后用EtOAc)萃取，有机相合并，无水硫酸钠干燥，过滤蒸干得到粗品。经过制备HPLC分离得到白色固体L2-D(6.99mg，收率：16.3％，HPLC纯度96.3065％)。

Ms(ESI):m/z 1434.6[M+1]。

¹H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.11-8.10(m,2H),7.61-7.47(m，5H),7.26-7.25(m，1H)，6.68(s，2H)，6.33-6.19(m，1H)，5.59-5.40(m,1H),5.27-5.26(m，1H)，5.14-5.08(m，2H)，5.05-4.99(m，1H)，4.83(s，1H)，4.81-4.69(m,1H),4.32-4.30(m，2H)，4.20-4.14(m，1H)，3.95-3.81(m,2H),3.54-3.38(m，6H)，3.30(s，3H)，3.27-3.12(m,1H),2.76-2.65(m，1H)，2.44-2.03(m,8H),1.98(s,3H),1.85-1.67(m，8H)，1.38-1.20(m，26H)，0.99-0.77(m,8H)。

实施例2-3.L3-D的合成

(1)3c的合成

将3a(0.52g，1.65mmol，参考专利EP2486933B1，138页合成)和3b(0.70g，1.98mmol，参考文献Inorganica Chimica Acta,2016,vol.450,p.211-215)溶于DMF(10ml，20V)中，冰水浴降温至0-5度，加入DMTMM(0.59，2.13)，加毕，撤去冰水浴，升至室温22度，搅拌2小时。冰水浴降温，加入20mL水淬灭反应。乙酸乙酯(30mL*2)萃取，合并有机相，饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到1.8g浅黄色固体，粗品用柱层析分离纯化，得到0.96g白色固体。

(2)3e的合成

将3c(650mg，1.0mmol)溶于8mL的无水DCM里，冰浴冷却下开启搅拌。滴入包含DBU(450mg,3.0mmol)的DCM(1.0mL)溶液。冰浴下反应一个小时后，再加入原料3d(260mg，1.0mmol，供应商：Amatek；货号：B-0614)和HATU(420mg，1.1mmol)搅拌1-2小时；反应液旋干，上反相柱过柱纯化，收集产物，冻干得到约0.1g化合物3e。

(3)3f的合成

将3e(100mg，0.15mmol)溶于5mL的无水DCM里，冰浴冷却下开启搅拌。滴入苯甲醚(49mg,0.45mmol)和二氯乙酸(300mg，1.5mmol)室温搅拌过夜。反应液旋干，上反相柱过柱纯化，收集产物，冻干得到约40mg化合物3f。

MS(ESI):m/z 541(M+Na)。

(4)L3-D的合成

在25mL单口瓶中，加入3f(40mg,0.077mmol)，和1e粗品(34mg，0.037

mmol)，再加DMF(2mL)，开启搅拌，氩气置换三次。冰浴冷却。加入10mg的DIEA以及21mg的HATU，随后反应允许在冰浴下搅拌一个小时。取样检测显示原料完全消耗。停止反应，将反应液直接送制备HPLC分离，得7.5毫克L3-D(收率14.2％)。

MS(ESI)：m/z1444(M+Na)。

¹H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.01-8.15(m,2H),7.42-7.75(m，5H),7.07-7.41(m，13H)，6.59-6.76(m，1H)，6.05-6.27(m，1H)，5.49-5.72(m，1H)，4.89-5.02(m,1H),4.82-4.72(m，1H)，4.74-7.85(m，1H)，4.36-4.72(m，3H)，4.00-4.33(m，4H)，3.56-3.99(m,8H),3.38-3.55(m，5H)，3.16-3.37(m，4H)，2.96-3.15(m,1H),2.59-2.76(m，1H)，1.83-2.58(m，19H)，1.53-1.82(m,4H),1.03-1.47(m，16H)。

实施例2-4.L4-D的合成

(1)4b的合成

将500mL反应瓶放入冰水浴中，往反应瓶中加入1，4-二氧六环(125mL)和水(125mL)的混合溶液，再加入将4a(2.48g，17mmol，厂家：毕得；批号：AGX860；纯度：98％)和碳酸氢钠(3.14g，37.4mmol)。最后分批加入FmocCl(4.84g，18.7mmol)，加完后，自然升温到20度反应3小时，监控反应完全，加入乙酸乙酯，分液，水相再调pH＝3，用乙酸乙酯提取，有机相干燥，浓缩得到6.1g白色固体。

MS(ESI):m/z 383.2(M+H)。

(2)4c的合成

将底物4b(46mg,0.12mmol)，无水DCM(1.6mL)一起加入到单口瓶中，冷却到0度左右；滴入0.4mL的TMSCl，滴完后在0度下反应1-2小时。5度左右浓缩蒸干得粗品4c(50mg，直接投入下一步)。

(3)4d的合成

在25mL单口瓶中，加入1c(50mg,0.06mmol)，无水THF(1mL)，氩气保护下置换三次，开启搅拌。反应液冷却到-60℃以下。滴入0.09mL的LHMDS(LHMDS在THF溶液中的浓度为1M)，在-60℃搅拌30分钟。将50mg的4c溶于1mL的无水THF里，滴入反应液里，反应液升温到-20度左右搅拌1小时。取样甲醇中LC-MS检测。停止反应，反应液直接爬制备板，展开剂得到产物45mg。

MS(ESI):m/z 1180(M+Na)

(4)4e的合成

将4d(45mg，0.039mmol)溶于1mL的无水DCM里，冰浴冷却下开启搅拌。滴入包含DBU(18mg,0.12mmol)的DCM(0.2mL)溶液。冰浴下反应1-2小时。取样甲醇中LC-MS检测显示反应完成。加入5mL的H₂O稀释，DCM(5mL×3)萃取，有机相合并，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后得粗品4e(50mg)。

MS(ESI):m/z 958(M+Na)

(5)L4-D的合成

在25mL单口瓶中，加入1f(18.4mg,0.039mmol)，和4e粗品(50mg，0.039mmol)，再加DMF(1.5mL)，开启搅拌，氩气置换三次。冰浴冷却。加入7.6mg的DIEA以及16.3mg的HATU，随后反应在冰浴下搅拌一个小时。取样LC-MS中控显示原料完全消耗。停止反应，将反应液直接制备，得7.0毫克L4-D，收率12.9％，纯度95％。

MS(ESI):m/z 1390(M+H)。

¹H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.10-8.09(m,3H),7.61-7.30(m，14H),7.25-7.12(m，3H)，6.67(s，2H)，5.65-5.50(m，1H)，5.05-5.01(m,1H),4.85-4.78(m，2H)，4.72-4.33(m，2H)，4.19-4.17(m，1H)，4.21-4.08(m，1H)，3.95-3.86(m,7H),3.82-3.59(t，4H)，3.58-3.46(m，3H)，3.28-3.22(m,4H),3.07-3.01(m，1H)，2.77-2.66(m，1H)，2.40-2.23(m,2H),2.19-2.08(m，3H)，2.05-1.93(m,3H),1.71-1.55(m,15H),1.39-1.23(m，18H)。

实施例2-5.L5-D的合成

(1)5a的合成

在25mL单口瓶中加入原料3c(300mg，460.32μmolq)，加二氯甲烷(10mL)搅拌，氮气置换保护，冰浴冷至0-5℃，加苯甲醚(594mg，4.60mmol，10.0eq)，二氯乙酸(149mg，1.38mmol，3.0eq)，撤除冰浴，25℃搅拌16小时。取样LC-MS检测，原料反应完全，停止反应，反应液浓缩干，得浅黄色泡沫900mg，粗品过反相柱纯化，H₂O/ACN(0-60％)洗脱，得浅黄色泡沫产品5a 272mg。

Ms(ESI):m/z 502.15[M+1]⁺。

(2)5b的合成

在25mL单口瓶中加入原料5a(40mg，69.79μmol)，原料1e(64mg，69.79μmol)，DIEA(14mg，104.68μmol)，加二氯甲烷(2mL)搅拌，氮气置换保护，冰浴冷至0-5℃，加HATU(29mg，76.76mmol)，0-5℃搅拌1小时。取样LCMS检测，原料反应完全，停止反应，反应液浓缩干，得浅黄色泡沫100mg，粗品过反相柱纯化，H₂O/ACN(0-60％)洗脱，得浅黄色油状物产品5b50mg。

Ms(ESI):m/z 1427.45[M+Na]⁺。

(3)L5-D的合成

在5mL单口瓶中加入原料5b(31mg，22.06μmol)，加DMF(0.5mL)搅拌，氮气置换保护，冰浴冷至0-5℃，加DBU(10mg，66.17mmol)，0-5℃搅拌1小时，再加入原料5c(15mg，44.12μmol，购买来源：苏州爱玛特，货号：B-0736)，HATU(18mg，48.78mmol)，0-5℃搅拌2小时，取样LCMS检测，原料反应完全，停止反应，反应液直接过反相柱纯化，H₂O/ACN(0-60％)洗脱，得类白色固体产品L5-D28mg。

Ms(ESI):m/z 1532.70[M+Na]⁺。

¹H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)8.02-8.17(m,2H),7.65-7.86(m，3H),7.57-7.65(m，1H),7.46-7.56(m，2H)，7.28-7.44(m，6H)，7.11-7.26(m，6H)，6.67-6.72(m，1H)，6.02-6.28(m，1H)，5.53-5.67(m，1H)，4.39-5.50(m，6H)，4.22-4.34(m，1H)，4.09-4.22(m，1H)，3.76-4.04(m,6H),3.50-3.72(m，17H)，3.20-3.34(m，4H)，2.99-3.15(m,1H),2.60-2.76(m，1H)，1.80-2.58(m，18H)，1.61-1.80(m,5H),1.03-1.48(m，16H)。

实施例2-6.L6-D的制备

L6-D的合成，参考WO2021148003第63页，实施例2-1中的L-1的合成制备。

三、ADC的制备

ADC原液药物载量分析

ADC是一种抗体交联物类药物，其治疗疾病的机理是依赖抗体的靶向性将药物运送到细胞中，进而将细胞杀死或抑制细胞生长。药物的载量对药效起着决定性的作用。本披露采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定ADC的载药量，过程基本如下：

1、测定方法：

裸抗和待测样品ADC(浓度为1mg/mL)，加入4μL 0.25M DDT(sigma)还原，37℃水浴1小时，结束后取出到内插管中。使用高效液相色谱仪Agilent 1200进行检测，色谱柱选用Agilent PLRP-S 1000A 8μm 4.6*250mm，柱温：80℃；DAD检测器波长280nm；流速：1mL/分钟；进样量为：40μL；之后通过样品与裸抗的谱图比对，区分出轻重链的位置，然后对检测样品的谱图进行积分，计算出DAR值。

2、溶液配制

1)0.25M DTT溶液：取DTT 5.78mg，加入150μL纯化水充分溶解后，配得0.25M DTT溶液，-20℃保存。

2)流动相A(0.1％ TFA水溶液)：量取1000mL纯化水，加入1mL TFA，充分混匀后使用，2-8℃保存14天。

3)流动相B(0.1％ TFA乙腈溶液)：量取1000mL乙腈，加入1mL TFA，充分混匀后使用，2-8℃保存14天。

3、数据分析

通过将样品与裸抗的谱图比对，区分出轻、重链的位置，然后对检测样品的谱图进行积分，计算出载药量DAR值。计算公式如下：

表8

名称	连接药物数
		LC	0
LC+1	2
		HC	0
HC+1	2
		HC+2	4
HC+3	6

LC峰面积总和＝LC峰面积+LC+1峰面积

HC峰面积总和＝HC峰面积+HC+1峰面积+HC+2峰面积+HC+3峰面积

LC DAR＝Σ(连接药物数*峰面积百分比)/LC峰面积总和

HC DAR＝Σ(连接药物数*峰面积百分比)/HC峰面积总和

DAR＝LC DAR+HC DAR

三、ADC的制备

实施例3-1.ADC-1的制备

在37℃条件下，向抗体H-AB-P1的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，2.88mL，195nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的水溶液(10mM，54.5μL，545nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物L1-D(2.23mg，1620nmol)溶解于161μL二甲亚砜(国药，货号30072418)中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-1的PBS缓冲液(1.74mg/mL，17.3mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算载药量，DAR值为：n＝4.30。

实施例3-2.ADC-2的制备

在37℃条件下，向抗体M-H-AB-P1的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，2.93mL，198nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的水溶液(10mM，99μL，990nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物L1-D(2.72mg，1976nmol)溶解于100μL二甲亚砜(国药，货号30072418)中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-2的PBS缓冲液(1.93mg/mL，14.7mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算载药量，DAR值为：n＝3.93。

实施例3-3.ADC-3的制备

在37℃条件下，向抗体P19的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，2.48mL，168nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的水溶液(10mM，41.9μL，419nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物L1-D(1.84mg，1344nmol)溶解于140μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-3的PBS缓冲液(1.54mg/mL，17mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算载药量，DAR值为：n＝4.10。

实施例3-4.ADC-4的制备

在37℃条件下，向抗体M-P19的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，2.78mL，188nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的水溶液(10mM，93.9uL，939nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物L1-D(2.58mg，1880nmol)溶解于95μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-4的PBS缓冲液(1.84mg/mL，14.7mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算载药量，DAR值为：n＝3.97。

实施例3-5.ADC-5的制备

在37℃条件下，向抗体H-AB-P1的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，0.50mL，34nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的水溶液(10mM，10.2μL，102nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物L2-D(0.48mg，335nmol)溶解于30μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-5的PBS缓冲液(0.38mg/mL，9.5mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算平均值：n＝4.15。

实施例3-6.ADC-6的制备

将化合物L3-D(0.51mg，359nmol)溶解于30μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-6的PBS缓冲液(5.19mg/mL，1.05mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算平均值：n＝4.03。

实施例3-7.ADC-7的制备

将化合物L4-D(0.50mg，360nmol)溶解于30μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-7的PBS缓冲液(1.01mg/mL，0.90mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算平均值：n＝1.85。

实施例3-8.ADC-8的制备

在37℃条件下，向抗体H-AB-P1的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，0.92mL，62nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的水溶液(10mM，17.3μL，173nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物L5-D(0.93mg，616nmol)溶解于45μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-8的PBS缓冲液(0.92mg/mL，10.7mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算平均值：n＝4.64。

实施例3-9.ADC-9的制备

在37℃条件下，向抗体H-AB-P1的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，0.58mL，39nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的水溶液(10mM，10.2μL，102nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物L3-D(0.46mg，323nmol)溶解于65μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-9的PBS缓冲液(0.48mg/mL，10.6mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算平均值：n＝2.74。

实施例3-10.ADC-10的制备

将化合物L5-D(0.59mg，391nmol)溶解于65μL二甲亚砜中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-10的PBS缓冲液(0.37mg/mL，10mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算平均值：n＝4.14。

实施例3-11.ADC-11的制备

在37℃条件下，向抗体P19的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.6mL，40.4nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的水溶液(10mM，10.5μL，105nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物L6-D(0.57mg，410nmol)溶解于30μl DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-11的PBS缓冲液(0.49mg/mL，10.8mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算平均值：n＝4.53。

实施例3-12.ADC-12的制备

在37℃条件下，向抗体M-P19的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，2.1mL，141.4nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl))的水溶液(10mM，72μL，720nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物L6-D(2.0mg，1438nmol)溶解于100μl DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-12的PBS缓冲液(1.57mg/mL，13.3mL)，于4℃冷藏储存。

RP-HPLC计算平均值：n＝3.96。

以下用生化测试方法验证本披露的抗体及ADC的活性

测试例1：抗体细胞水平的ELISA结合实验

将huPSMA-CHO-K1、cynoPSMA-CHO-K1、CHO-K1 WT(野生型)或肿瘤细胞LNCaP(PSMA高表达，购于ATCC，货号CRL-1740)、22RV1(PSMA低表达，购于ATCC，货号CRL-2505)和PC-3(不表达PSMA，购于ATCC，货号CRL-1435)制备成2×10⁴细胞/mL细胞悬液，以100μL/孔加入细胞培养板中，5％CO₂，37℃培养至90％细胞聚集度后，弃去上清，加入50μL/孔4％多聚甲醛水溶液固定细胞。室温1小时后，以PBST洗涤3次，加入5％脱脂牛奶，37℃孵育3小时，以PBST洗涤3次备用。

50μL/孔加入用1％BSA稀释的不同浓度待测抗体至之前准备好的细胞板中，37℃孵育2小时。用PBST洗涤3次，加入工作浓度的Goat anti-Mouse IgG(H+L)-HRP抗体(Jackson)，37℃孵育1小时。用PBST洗涤3次，50μL/孔加入显色底物TMB(KPL 52-00-03)，室温避光孵育10分钟后在酶标仪(PE Victor 3)上OD450读数。结果见表9-1至9-3。

表9-1.抗体与PSMA-CHO-K1细胞结合OD450结果

抗体	huPSMA-CHO-K1	cynoPSMA-CHO-K1	CHO-K1 WT
				mAb19-1	1.13	0.69	不结合

表9-2.抗体与肿瘤细胞结合结果

表9-3.抗体与huPSMA-CHO-K1细胞结合结果

抗体	Emax	EC₅₀(nM)
			19L1H1	0.90	0.09
19L1H2	0.86	0.09
			19L2H1	0.98	0.11
19L2H2	1.06	0.09
			H-AB-P1	1.30	0.22

结果显示：mAb19-1抗体可特异性结合表达人和猴PSMA的CHO-K1细胞和表达PSMA的肿瘤细胞，且对PSMA表达量不同的肿瘤细胞，其结合活性不同。本披露中的人源化抗体可特异性结合表达人PSMA的CHO-K1细胞。

测试例2：抗体细胞水平的FACS结合实验

本实验通过检测细胞表面抗体的荧光信号，根据荧光信号强弱评价抗体的结合活性。

将细胞LNCaP(ATCC，CRL-1740)用FACS缓冲液(2％胎牛血清(Gibco，10099141)和pH7.4 PBS)制备成1×10⁶/mL的细胞悬液，100μL/孔加入96孔圆底板中。离心去除上清后加入50μL/孔用FACS缓冲液稀释的不同浓度待测抗体，放于4℃冰箱中避光孵育1小时。以FACS缓冲液500g离心洗涤3次后，加入工作浓度的FITC标记的山羊抗人IgG(H+L)二抗(JacksonImmuno Research，109-095-003)，放于4℃冰箱中避光孵育40分钟。以FACS缓冲液500g离心洗涤3次后，在BD FACSCantoII流式细胞仪上检测几何平均数荧光强度，计算抗体对表达PSMA的细胞结合EC₅₀值。结果见下表10。

表10.抗体与PSMA高表达天然肿瘤细胞的结合活性

抗体	P19	H-AB-P1	IgG1
				EC₅₀(μg/mL)	0.3145	0.4249	不结合
Emax	4722	4617	/

结果显示，P19与表达PSMA的肿瘤细胞有很好的结合活性。

测试例3：Biacore检测抗体的亲和力

用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556,GE)亲和捕获IgG抗体，然后于芯片表面流经稀释在HBS-EP缓冲液pH 7.4(Cat.#BR-1001-88,GE)中的一系列浓度梯度的人PSMA-His(ACRO，PSA-H52H3)、猴PSMA-His(ACRO，PSA-C5247)和鼠PSMA-His(ACRO，PSA-M5245)抗原。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟，并追踪解离动力学10分钟，用Biacore T200仪器(GE)实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用10mM Gly-HCl pH1.5(Cat.#BR-1003-54,GE)将生物传感芯片洗净再生。使用GE的BIAevaluation软件以1:1(Langmuir)结合模型分析所得数据，测定的ka(kon)、kd(koff)和KD值，结果见下表11。

表11.抗体对PSMA蛋白的亲和力

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注：“/”表示未检测。

结果显示，本披露的P19与人和食蟹猴PSMA均有较高的亲和力，但不结合鼠PSMA。恒定区突变获得的M-P19与P19亲和力一致。

测试例4：抗体DT3C内吞实验

本实验的目的是根据DT3C蛋白进入细胞后，活化的DT对细胞进行杀伤，间接反映了PSMA抗体的内吞情况。根据IC₅₀和最大杀伤值来评价抗体的体外内吞活性。

DT3C是重组表达的融合蛋白，由白喉毒素的Fragment A(仅毒素部分)和G群链球菌的3C片段(IgG结合部分)融合而成，该蛋白能够与抗体的IgG部分高度亲和，在抗体发生内吞时一同进入细胞，在胞内弗林蛋白酶的作用下，释放出具有毒性的DT，DT能够抑制EF2-ADP核糖基化的活性，阻断蛋白翻译过程，最终导致细胞死亡。而未进入细胞的DT3C则不具有杀伤细胞的活性。根据细胞杀伤情况来评价抗体的内吞活性。

用含20％low IgG FBS的新鲜细胞培养基配制LNCaP细胞(CRL-1740^TM)悬液，细胞密度为5×10⁴细胞/mL，以50μL/孔加入细胞培养板中，5％CO₂，37℃培养16小时。用无血清培养基将DT3C(Sigma，货号D0564)稀释成1.6μM，用无血清培养基将抗体稀释成266.4nM，将80μL DT3C和80μL抗体溶液按照1:1的体积混匀，室温下静置孵育30分钟。DT3C摩尔浓度为抗体摩尔浓度的6倍。

用无血清培养基4倍梯度稀释DT3C和抗体混合物，共8个梯度，第9和10个点为纯培养基。C25-IgG1为同型IgG1阴性对照组。取50μL稀释好的混合物加入50μL的细胞中，培养箱中孵育三天。每孔加入50μL CTG，室温下避光孵育10分钟，将白色底膜贴在细胞培养板底部，置于酶标仪Victor 3上读取化学发光值。结果见下表12和图1。

表12.抗体的体外内吞活性

抗体	IC₅₀(nM)	Imax(％)
			P19	0.25	88.0
H-AB-P1	2.71	57.7

结果显示，P19可被表达PSMA的LNCaP细胞内吞，且P19的内吞活性明显优于H-AB-P1抗体。

测试例5：抗体药代动力学实验

静脉注射SD大鼠(雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司)，4只一组，共给药1次，每只按体重注射3mg/kg P19。于给药前及给药后5分钟、8小时、1天，2天、4天、7天、10天、14天、21天、28天采集全血0.3mL，不加抗凝，取血后在室温放置30分钟，1000g离心15分钟，取上清(血清)置于EP管中，于-80℃保存。采用ELISA的方法测定血清中的抗体浓度。结果见下表13。

表13.抗体的半衰期及药代动力学参数

抗体	P19
		T1/2(天)	10.5±1.3
AUC 0-t(μg/mL*h)	7548.67

结果显示，在大鼠体内，P19表现出较长的血浆半衰期，且有较好的血浆稳定性。

测试例6：ADC分子细胞活性实验

本实验的目的是检测卡巴他赛毒素及其ADC分子对表达PSMA细胞的杀伤作用，根据IC₅₀和I_max来评价PSMA-ADC的体外活性。

LNCaP(人前列腺癌细胞，ATCC，CRL-1740^TM)、22RV1(人前列腺癌细胞，ATCC，CRL-2505^TM)、PC-3(人前列腺癌细胞，ATCC，CRL-1435^TM)细胞用胰酶消化，新鲜培养基中和，1000rpm离心后用培养液重悬。计数后将细胞悬液密度调整至1.48×10⁴/mL，将细胞铺入96孔板，每孔加入135μL调整后的细胞悬液，每孔2000个细胞。铺板只用中间的60个孔，在第十二列取六个孔作为无细胞的纯培养基对照。边孔加入等体积的PBS。5％CO₂，37℃培养16小时。

用PBS将待测的ADC分子稀释9个浓度点，并设置纯PBS对照组，ADC分子的终浓度是1500nM、300nM、60nM、12nM、2.4nM、0.48nM、0.096nM、0.0192nM和0.00384nM。用100％DMSO溶解小分子裸毒素，使其母液浓度为20mM，小分子毒素用DMSO溶解后进一步在PBS中稀释，小分子毒素的终浓度为10000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.23nM、0.64nM、0.128nM和0.0256nM，DMSO的终浓度为0.5％，每个样品做双复孔。将培养板放入37℃，5％CO₂培养箱培养120小时。

第五天取出培养板，使其回复至室温，每孔加入75μL CellTiter-Glo检测液，室温下避光放置10分钟。将Backseal膜贴在细胞培养板底部，置于酶标仪Victor 3上读取发光信号值。用Graphpad Prism软件根据受试化合物各浓度的对数值与相应的信号值进行曲线拟合，并计算IC₅₀值。将杀伤的最大值定为化合物的最大杀伤率(I_max)，杀伤率计算如下：

杀伤率(％)＝(RLU_{无药对照读值}-RLU_样品读值)/(RLU_{无药对照读值}-RLU_{溶媒对照读值})×100％

结果见表14。

表14.ADC对LNCaP、22RV1、PC-3细胞的杀伤效果

注：+代表细胞上PSMA的表达量，+越多代表表达量越高；-表示不表达PSMA。

结果显示，PSMA-ADC对PSMA高表达的细胞有明显的杀伤作用，对PSMA低表达的细胞杀伤作用显著降低，几乎不杀伤不表达PSMA细胞，即本披露中的ADC分子对细胞的杀伤是具有选择性的。而细胞毒素卡巴他赛对细胞的杀伤几乎没有选择性。

测试例7：ADC分子PSMA高表达CDX模型体内药效评价

实验采用对数生长的LNCap细胞，接种于6-8周龄SCID/beige雄性小鼠右侧腋下皮下，接种后第23天筛选出肿瘤大小合适的小鼠，平均体积约180mm³左右，随机分成3组，每组8只。给药方式为一周一次，均为腹腔注射给药。分组当天记为第0天，开始腹腔注射给药，分别于第0天、第6天、第13天、第20天和第27天累计给药5次。

每周测量2次瘤体积和体重，记录数据。实验数据表示为平均数(Mean)±标准误(SEM)，用GraphPad Prism 8软件进行作图及统计分析。

肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、宽。

相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100％，其中T、C为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。

抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。

结果见表15和图2。

表15.ADC分子对SCID-beige小鼠LNCaP肿瘤的疗效

结果显示，ADC-2和ADC-4在小鼠LNCap肿瘤模型中均具有明显抑瘤作用(P<0.01)。相同剂量下，ADC-4抑制肿瘤生长的效果优于ADC-2。

测试例8：PSMA高表达CDX模型药效评价

本实验在雄性SCID/beige小鼠右侧腋下皮下接种人前列腺癌细胞LNCaP建立肿瘤模型，腹腔给予不同剂量的PSMA-ADC药物，通过测量肿瘤体积(TV)和体重(BW)来评价ADC药物的抗肿瘤作用及其安全性。

实验采用对数生长的LNCap细胞，5×10⁶细胞/只/200μL接种于6-8周龄SCID/beige雄性小鼠右侧腋下皮下，接种后第21天筛选出肿瘤大小合适的小鼠，平均体积约150mm³左右，随机分成6组，每组8只。给药方式：腹腔注射给药，给药体积为10mL/kg，一周一次，连续3次，后面停药继续观察一周。分组当天记为第零天(D0)，开始腹腔注射给药，每周2次监测肿瘤体积、动物重量并记录数据。第28天(D28)测量肿瘤后，结束实验。

实验数据表示为平均数(Mean)±标准误(SEM)，用GraphPad Prism 8软件进行作图及统计分析。*P<0.05表示给药组与vehicle组(溶媒对照组)比较具有显著性差异，**P<0.01表示给药组与vehicle组比较具有高度显著性差异，***P<0.001表示给药组与vehicle组比较具有极高度显著性差异。

抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。

结果见表16。

表16.ADC分子对SCID-beige小鼠LNCaP肿瘤的疗效

结果显示：受试药ADC-4 6mpk、18mpk具有明显的药效，D28抑瘤率分别为61.65％(P<0.001)、90.66％(P<0.001)，2mpk几乎无任何药效，与溶媒对照组瘤体大小无区别；ADC-12 2mpk、6mpk具有明显的药效，从D3开始瘤体积逐渐减小，后期肿瘤几乎全部消退，D28抑瘤率均为100％以上(P<0.001)。

Claims

1.一种通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

Ab为抗PSMA抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中：

i)所述重链可变区的HCDR1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，和所述轻链可变区的LCDR1包含SEQID NO：8的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；或

ii)所述重链可变区的HCDR1包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，和所述轻链可变区的LCDR1包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和LCDR3包含SEQID NO：28的氨基酸序列；

L为接头；

n为1至10。

2.根据权利要求1所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

3.根据权利要求1或2所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体包含：

i)所述重链可变区包含与SEQ ID NO：3、11或12具有至少90％同一性的氨基酸序列；和/或

所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：4、13或14具有至少90％同一性的氨基酸序列；或

ii)所述重链可变区包含与SEQ ID NO：29具有至少90％同一性的氨基酸序列；和/或

所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：30具有至少90％同一性的氨基酸序列；

优选地，

i)所述重链可变区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列；或

iii)所述重链可变区包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含SEQID NO：30的氨基酸序列；

更优选地，

所述重链可变区包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体包含：

野生型的重链恒定区或其变体，所述变体包含减少轻链和重链之间二硫键的氨基酸取代；

野生型的轻链恒定区或其变体，所述变体包含减少轻链和重链之间二硫键的氨基酸取代；

优选地，所述重链恒定区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，其变体包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，其变体包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗PSMA抗体包含重链和轻链，其中：

所述重链包含与SEQ ID NO：19具有至少85％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：20具有至少85％同一性的氨基酸序列；或

所述重链包含与SEQ ID NO：21具有至少85％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：22具有至少85％同一性的氨基酸序列；或

所述重链包含与SEQ ID NO：31具有至少85％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：32具有至少85％同一性的氨基酸序列；或

所述重链包含与SEQ ID NO：33具有至少85％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：34具有至少85％同一性的氨基酸序列；

优选地，

6.根据权利要求1至5中任一项所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的接头-L-为-L¹-L²-L³-L⁴-，其中：

优选地，

更优选地，

L¹为其中s是1-5的整数；

L⁴为-NCH3CH₂、-NHCH2-或-NH-PAB-；

其中所述的L¹端与Ab相连，L⁴端与药物相连；

更优选地，所述的-L-为：

7.根据权利要求1至6中任一项所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物具有如下所示的结构：

其中：Ab和n如权利要求1中所定义；优选地，所述的通式Ab-L-D所示的抗体-药物偶联物具有如下所示的结构：

其中：

Ab为抗PSMA抗体，其包含：

如SEQ ID NO：19所示的重链和如SEQ ID NO：20所示的的轻链；或

如SEQ ID NO：21所示的重链和如SEQ ID NO：22所示的的轻链；

其中n为1至8；优选地，n为3至5。

8.一种抗PSMA抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：

所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO：4中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；优选地，

所述重链可变区的HCDR1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，和所述轻链可变区的LCDR1包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ IDNO：9的氨基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的抗PSMA抗体，其为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

10.根据权利要求8或9所述的抗PSMA抗体，其中：

所述重链可变区包含与SEQ ID NO：3、11或12具有至少90％同一性的氨基酸序列；和/或

所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：4、13或14具有至少90％同一性的氨基酸序列；优选地，

ii)所述重链可变区包含SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含SEQ ID NO：13或14的氨基酸序列；更优选地，

11.根据权利要求8至10中任一项所述的抗PSMA抗体，其中所述的抗PSMA抗体是抗体片段；优选地，其中所述的抗体片段为Fab、Fab'、F(ab')₂、Fab'-SH、Fd、Fv、scFv、dsFv、双抗体或结构域抗体。

12.根据权利要求8至10中任一项所述的抗PSMA抗体，其包含：

13.根据权利要求12所述的抗PSMA抗体，其包含重链和轻链，其中：

所述重链包含与SEQ ID NO：21具有至少85％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链包含与SEQ ID NO：22具有至少85％同一性的氨基酸序列；

优选地，

14.根据权利要求8至13中任一项所述的抗PSMA抗体，其具有以下特性中的至少一种：

c)所述抗PSMA抗体能够被表达PSMA的细胞内吞。

15.分离的核酸，其编码权利要求8至14中任一项所述的抗PSMA抗体。

16.宿主细胞，其包含权利要求15所述的分离的核酸。

17.制备抗PSMA抗体的方法，其包括在适于表达所述抗体的条件下培养权利要求16所述的宿主细胞。

18.一种抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其包含根据权利要求8至14中任一项所述的抗PSMA抗体和药物；优选地，其中所述的药物选自细胞毒性剂、放射性标记物、荧光团、发色团、显像剂、免疫调节剂、血管生成抑制剂、细胞增殖抑制剂、促细胞凋亡剂和细胞裂解酶中的一种或多种。

19.根据权利要求18所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，具有如通式Ab-L-D’下所示的结构：

其中：

Ab为抗PSMA抗体；L为接头；n为1至10。

20.根据权利要求19所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的接头-L-为-L¹-L²-L³-L⁴-，其中：

优选地，

更优选地，

L¹为其中s为1-5的整数；

L⁴为-NCH3CH₂、-NHCH2-或-NH-PAB-；

其中所述的L¹端与Ab相连，L⁴端与药物相连；

更优选地，所述的-L-为：

21.根据权利要求19至20中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，具有如下所示的结构：

其中：

Ab为抗PSMA抗体，n为1至8；

优选地，Ab包含：

如SEQ ID NO：19所示的重链和如SEQ ID NO：20所示的的轻链；或

如SEQ ID NO：21所示的重链和如SEQ ID NO：22所示的的轻链；

n为3至5。

22.一种药物组合物，其包含权利要求1至7、18至21中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或权利要求8至14中任一项所述的抗PSMA抗体，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

23.根据权利要求1至7、18至21中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或权利要求8至14中任一项所述的抗PSMA抗体，或权利要求22所述的药物组合物在制备用于治疗PSMA介导的疾病或病症的药物中的用途；优选地，所述PSMA介导的疾病或病症为表达PSMA的疾病或病症。

24.根据权利要求1至7、18至21中任一项所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或权利要求8至14中任一项所述的抗PSMA抗体，或权利要求22所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途；

优选地，其中所述肿瘤或癌症选自：

前列腺癌、头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、肉瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、咽鳞癌、口腔鳞癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝胆癌、胰腺癌、胰管癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、大细胞肺癌、三阴性乳腺癌和小细胞肺癌；

更优选地，所述的肿瘤或癌症表达PSMA。