CN116685342A - 癌症的治疗 - Google Patents

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CN116685342A CN202180087838.7A CN202180087838A CN116685342A CN 116685342 A CN116685342 A CN 116685342A CN 202180087838 A CN202180087838 A CN 202180087838A CN 116685342 A CN116685342 A CN 116685342A
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M•克雷姆
S•尚特克斯
B•罗西
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Abstract

本发明涉及与化疗剂缀合的能够结合Nectin‑4多肽的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白用于增加肿瘤对所述化疗剂的敏感性以及用于治疗以Nectin‑4表达性肿瘤细胞为特征的癌症。

Description

癌症的治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月25日提交的美国临时申请第63/118,198号和2021年8月5日提交的美国临时申请第63/229,589号的权益；这些美国临时申请全文以引用方式并入本文；包括任何附图。
对序列表的引用
本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表作为创建于2021年11月24日的大小为67KB的以“Nectin-4-2PCT_ST25”命名的文件提供。该序列表的电子格式中的信息全部以引用方式并入本文。
技术领域
本发明提供了能够与缀合至化疗剂的Nectin-4多肽结合的抗原结合蛋白，其用于增加肿瘤对所述化疗剂的敏感性，用于治疗以Nectin-4表达性肿瘤细胞为特征的癌症。
背景技术
在美国，2016年估计有超过70,000例膀胱癌新诊断，约16,000人死亡。尿路上皮癌涵盖膀胱癌、输尿管癌和肾盂癌，其发生率分别为50:3:1。尿路上皮癌是一个多灶性过程。患有上尿路癌的患者有30％到50％的机会在其生命中的某个阶段患上膀胱癌。当膀胱中的细胞开始异常或不受控制地生长时，就会发生膀胱癌。最常见的膀胱癌类型被称为尿路上皮癌(UC)。在UC中，膀胱内壁(尿路上皮)发生异常生长。随着疾病的进展，它可能会传播。它可以扩散到膀胱周围的区域或身体的其它部位(转移)。这被称为晚期尿路上皮癌。
尿路上皮癌(UC)的特征在于一系列不同细胞表面抗原的表达增加，因此为使用抗体-药物缀合物(ADC)进行特异性治疗靶向提供了机会。在表面抗原中，有几种抗原已被证明适合ADC的开发，包含TROP-2(人类滋养层细胞表面抗原)、SLITRK家族蛋白(例如SLITRK6)、EpCAM、HER2、TF-Ag(Thomsen-Friedrich抗原)、FGF1V、Fn14(FGF-诱导型14)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)和Nectin-4(脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白4，也被称为PVRL4。
Nectin-4最初由Lopez小组于2001年从人气管中克隆出来(参见Reymond等人(2001)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》276(46):43205-15)。据报道，Nectin-4基因的拷贝数增加是癌变过程中的常见事件，并且其可以促进上皮-间质转化、侵袭和转移。虽然nectin-4蛋白在健康组织中的表达受限，但在几种肿瘤中的表达水平显著升高，并且在乳腺癌中尤其过度表达，该乳腺癌包括三阴性乳腺癌(TNBC)(参见M-Rabet等人《肿瘤学年鉴(Ann Oncol.)》2017年4月1日；28(4):769-776)、胰腺癌和UC。然而，nectin-4也在非小细胞肺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌和食道癌肿瘤样本中表达。Challita-Eid等人(2016)《癌症研究(Cancer Res.)》76(10):3003-3013报道了在膀胱(60％)和乳腺(53％)肿瘤组织中通过免疫组织化学(H评分≥100)进行的中等至强染色。Zeindler等人2019《医学前沿(Front.Med.)》6:200报道了在148例TNBC病例中有86例(58％)存在Nectin-4的高表达。
Challita-Eid等人(2016),同上，开发了一种抗Nectin-4抗体，该抗体与基于抗体AGS-22的高效微管破坏剂MMAE缀合。这项工作催生了ADC候选药物维汀-恩弗妥单抗(enfortumab vedotin)(参见美国专利第8,637,642号和PCT公布第WO2012/047724号，Agensys公司(Agensys Inc.))，该药物在治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的人体临床试验中取得了可喜的结果，这些患者以前曾在新辅助/辅助、局部晚期或转移性环境中接受过含铂化疗和PD-1/PD-L1检查点抑制剂。其它几个小组也提出了与多种毒性药剂结合的抗Nectin-4药剂。PCT专利申请WO2018/158398(INSERM)报道了几种抗Nectin-4抗体，并提出了与一系列细胞毒性药剂的潜在偶联。类似地，美国专利第8,637,642号(Agensys公司)也提供了抗Nectin-4抗体，并提出了与一系列细胞毒性药剂的潜在偶联。此外，BicycleTherapeutics公司报道了一种抗Nectin-4靶向剂的开发，该靶向剂包含Nectin-4结合蛋白，该蛋白通过可切割接头缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)与细胞毒性澳瑞他汀(MMAE)有效载荷缀合。迄今为止，已报道在缀合至化疗剂时具有活性的所有抗Nectin-4抗体靶向Nectin-4的Ig样V型结构域，因此认为Ig样V型结构域提供抗Nectin-4 ADC的最强内化。
维汀-恩弗妥单抗(抗Nectin-4 ADC)结合Nectin-4的Ig样V型结构域，该Ig样V型结构域与高度内化抗Nectin-4抗体相关。维汀-恩弗妥单抗在EV-201 2期研究(2019)中显示出令人印象深刻的治疗应答，其中UC的ORR(客观应答率)为44％，CR(完全应答率)为12％，大约一半的患者停止治疗。如通过RECIST(48％)或临床症状(5％)所评估的，大部分停药是由于疾病进展。此外，18％的停药患者出现了不良事件，尤其是神经病变。因此，靶向Nectin-4的ADC具有局限性，并且本领域需要针对患有UC和其它癌症的患者的改善益处。
在UC中，当癌症尚未扩散到身体的远处部位或癌症已经扩散时，通常首先用基于顺铂的方案(有或没有放射)治疗个体。喜树碱化合物通常不用于治疗UC。de Jonge等人,2004《试验性新药(Invest New Drugs)》22:329-333研究了喜树碱类似物RFS2000在晚期或转移性尿路上皮肿瘤患者中的作用。De Jonge等人2004得出的结论是，该喜树碱类似物对先前化疗失败的晚期/转移性尿路上皮肿瘤患者没有显著活性，并且此研究的结果不建议进一步研究RFS2000。在过去的几十年中，已经制造了大量的喜树碱类似物，其中包括依喜替康(exatecan)。Abou-Alfa等人,2006《临床肿瘤学杂志(Journal of ClinicalOncology)》24(27):4441-4447在一项349名患者的3期临床试验中评估了依喜替康治疗胰腺癌的效果，发现除了吉西他滨(gemcitabine)外，依喜替康的功效并不优于单独使用吉西他滨。
发明内容
已经开发了许多高功效的细胞毒性剂(诸如吡咯并苯二氮卓和澳瑞他汀)用于与抗体缀合，然而在用于治疗的剂量下，掺入这些剂的ADC由于该剂的毒性仍然引起严重的副作用。其它细胞毒性剂(诸如喜树碱)毒性较低，但其本身也具有有限的抗肿瘤活性。细胞毒性剂的抗肿瘤活性可以通过与抗Nectin-4抗体缀合而增强，然而如本文所证明的，当与金标准抗Nectin-4抗体(诸如恩弗妥单抗(ASG-22))缀合时，基于喜树碱类似物的ADC在体内测试时仍具有局限性。发明人在本文中提供了用于改善细胞毒性剂向Nectin-4阳性肿瘤的递送的方法。特别地，本申请显示，通过将细胞毒性剂缀合至抗体，该抗体结合Nectin-4的桥接Ig样V和Ig样C2 1型结构域的结构域或区域，可以获得强抗肿瘤作用。桥接Ig样V和Ig样C21型结构域的结构域与细胞间相互作用相关，在本文中也称为VC1桥接结构域、VC1决定簇或VC1表位。使用展现出与Nectin-4突变体的结合降低的ADC靶向此结构域导致抗肿瘤活性的效力是具有高细胞内内化潜力的金标准抗Ig样V型结构域ADC的3倍，这些Nectin-4突变体与野生型或非突变Nectin-4相比具有VC1桥接结构域氨基酸取代(残基K197和/或S199处，如包含K197T/S199A双重取代的突变体举例说明)。有可能细胞间相互作用是通过第一细胞上的Nectin-4与第二细胞上的Nectin-1和/或Nectin-4的相互作用(Nectin-4:Nectin-1或Nectin-4:Nectin-4相互作用)来介导。
此外，本申请显示，通过用细胞内可切割的接头使结合VC桥接结构域的抗体官能化，可以在以具有高Pgp表达的肿瘤为特征的癌症中获得特别强的抗肿瘤作用，该细胞内可切割的接头在接头切割时释放出依喜替康。抗Nectin-4-依喜替康ADC允许在MDR-高肿瘤模型中的有效抗肿瘤作用，该MDR-高肿瘤模型对替代释放喜树碱类似物Dxd的相同抗体有抗性。
在一些方面，提供了一种抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，该抗体特异性结合人Nectin-4多肽并且能够使肿瘤对细胞毒性剂(或例如包含此类抗体的蛋白质)敏化，用于治疗癌症和/或抑制抗癌药物抗性的方法中。任选地，结合人Nectin-4多肽的抗体与细胞毒性剂(例如，化疗剂)组合使用(施用)。
本公开的一个目的是提供一种抗癌组合物，该抗癌组合物包含癌症敏化组合物和抗癌剂(例如，细胞毒性剂、化疗剂)，其中癌症敏化组合物包含结合Nectin-4多肽的VC1桥接结构域的抗体(例如，全长抗体、抗体片段)。
在一些方面，提供了一种抗体(例如全长抗体、抗体片段)，该抗体结合人Nectin-4多肽并且能够使肿瘤对细胞毒性剂敏化，用于制备抗体药物缀合物。
在一些方面，提供了通过将细胞毒性剂与结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体(例如全长抗体、抗体片段)缀合，来将细胞毒性剂(例如，喜树碱、依喜替康)递送至肿瘤(例如，实体瘤内的肿瘤细胞)的改进方法。
在本文涉及免疫缀合物或ADC的任何实施方案中，细胞毒性剂可通过接头与抗体缀合或结合，该接头包含细胞内可切割的部分(例如，寡肽、二肽、三肽或四肽)和任选地自消除间隔子。在任何实施方案中，细胞毒性剂通过接头与抗体缀合或结合，该接头包含细胞内可切割的部分和任选地自消除间隔子，导致例如在肿瘤或肿瘤细胞中，切割可切割部分时释放细胞毒性剂(例如，喜树碱类似物、依喜替康、具有化合物1、2或13的结构的化合物)。
细胞毒性剂的改善的递送和/或对化疗剂或细胞毒性剂的敏化可能是Nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成和/或非锚定依赖性生长的抗体介导的抑制的结果，导致ADC的改善的肿瘤穿透。
根据本发明的一个方面，提供了一种任选地用于治疗癌症的敏化剂-细胞毒性药物缀合物，其中该敏化剂-细胞毒性药物缀合物包含：(a)结合人Nectin-4的VC1桥接结构域的至少一个抗原结合结构域，任选地其中该抗原结合结构域包含(i)重链可变区，该重链可变区包含与具有抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的Kabat重链CDR1、2和3和人框架区(例如，来自本文公开的人V基因(IGHV)组)的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含与具有抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的Kabat轻链CDR1、2和3和人框架区(例如，来自本文公开的人V基因(IGKV)组)的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列，和(b)至少一个细胞毒性药物部分。多肽(i)和(ii)可指定为彼此缔合(例如，通过共价键和/或非共价键)以形成结合Nectin-4的抗原结合结构域。
在一个方面，掺入本公开的抗体的ADC提供增强的效力，并且因此对于治疗患有特别抗性疾病的患者的具有较低Nectin-4表达(例如，低于高表达)或异质Nectin-4表达(例如，尿路上皮癌)的疾病特别有利。在一些实施方案中，这允许治疗不依赖于或不需要在治疗之前评估或检测肿瘤中的Nectin-4表达水平。
在一个方面，掺入本公开的抗体的ADC提供ADC的增强的肿瘤穿透，这可以改善抗肿瘤活性、减少所需的ADC的量和/或减少与细胞毒性剂相关的毒性。与金标准内化抗Nectin-4抗体(例如，Ig V型结构域抗体)相比的这种改善的治疗窗口的结果是，本公开的ADC对于治疗患有对其它治疗有抗性的疾病的患者是有利的，常规ADC不适用于这些患者(例如，由于毒性)，并且/或者对于与额外的治疗剂组合使用是有利的，这些额外的治疗剂作为介导其自身毒性的单一剂(例如，单独的化疗剂或掺入到ADC中)。
在一些方面，提供了一种特异性结合Nectin-4的抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，其中该抗体结合人Nectin-4的VC1桥接结构域。
在一些方面，提供了一种特异性结合Nectin-4的抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，其中相比于与野生型人Nectin-4多肽的结合，该抗体展现出与包含残基K197和/或S199(参考SEQ ID NO:1)处的氨基酸取代的突变体人Nectin-4多肽的结合降低。
在一些方面，提供了一种抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，该抗体包含抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的重链和轻链CDR。
在任何方面，本公开的抗体用于制备抗体药物缀合物。在任何方面，本公开的抗体用于减少Nectin-4表达性肿瘤细胞之间的细胞间粘附、抑制Nectin-4:Nectin-1相互作用、抑制Nectin-4:Nectin-4相互作用、减少Nectin-4表达性肿瘤细胞的生长和/或减少Nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成(例如，用于上述的方法中)。
在一些方面，提供了一种抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，该抗体结合人Nectin-4多肽并且能够减少Nectin-4表达性肿瘤细胞之间的细胞间粘附和/或减少Nectin-4表达性肿瘤细胞的生长和/或簇形成(例如，如使用三维或非粘附性肿瘤细胞培养物所评估的；肿瘤球状体测定)，用于制备抗体药物缀合物。
在一些方面，提供了一种抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，该抗体能够抑制Nectin-4:Nectin-1相互作用和/或Nectin-4:Nectin-4相互作用(例如，抗体能够减少第一细胞上的Nectin-4与第二细胞上的Nectin-1和/或Nectin-4的相互作用，任选地其中细胞是肿瘤细胞)。
在一些方面，抗体药物缀合物的制备包括将抗体与细胞毒性剂缀合的步骤(例如，通过接头部分，接头部分进一步包含细胞内可切割的部分)。
在一些方面，提供了制备抗体药物缀合物的方法，这些方法包括将根据本公开的抗Nectin-4抗体与细胞毒性剂缀合。
还提供了一种抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物包含与细胞毒性剂缀合的抗Nectin-4抗体。
还提供了治疗癌症的方法，这些方法包括施用包含与细胞毒性剂缀合的抗Nectin-4抗体的抗体药物缀合物。
本公开的抗Nectin-4抗体提供的增加的抗肿瘤效力和更大的治疗窗口(例如，特别是与喜树碱衍生物缀合时)提供了在患有肿瘤的个体中改善治疗结果的可能性，这些肿瘤对包含抗HER2剂(例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)，包含曲妥珠单抗的ADC)的组合物的治疗具有抗性、无应答或在该治疗后已进展。改善的治疗窗口提供了与其它剂(特别是化疗剂和/或抗HER2剂)组合治疗的可能性。
在一些方面，提供了一种与细胞毒性剂(任选地化疗剂)缀合的Nectin-4结合剂，以及其在治疗Nectin-4表达性癌症中的用途，该癌症例如UC、乳腺癌(例如，TNBC)、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌或食道癌，其中结合剂是结合人Nectin-4多肽并且能够使肿瘤或肿瘤细胞(特别是转移性癌症)对细胞毒性剂敏化的抗体。
在一些方面，提供了一种与细胞毒性剂(任选地化疗剂)缀合的Nectin-4结合剂，以及其在治疗Nectin-4表达性癌症中的用途，这些癌症例如UC、乳腺癌(例如，TNBC)、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌或食道癌，其中结合剂是结合人Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体；例如与桥接Ig样C2 1型结构域和Ig样V型结构域的一段氨基酸结合、与至少部分位于桥接Ig样C2 1型结构域和Ig样V型结构域的氨基酸内的表位结合。
与Nectin-4的VC1桥接结构域结合的特征可任选地表征为结合(例如，至少部分地)(a)人Nectin-4多肽Ig样V型结构域和(b)人Nectin-4多肽Ig样C2 1型结构域的能力。在另一个方面，与Nectin-4的VC1桥接结构域结合的特征可任选地表征为保留与其中Ig样V型结构域已经缺失的Nectin-4多肽(例如，Nectin-4多肽，该多肽包含Ig样C2 1型结构域和Ig样C2 2型结构域，但缺乏Ig样V型结构域；SEQ ID NO:32的多肽)的部分结合，任选地其中相比于与野生型Nectin-4蛋白的结合，该抗体以降低的水平保留与缺失Ig样V型结构域的Nectin-4蛋白的结合；任选地进一步，其中该抗Nectin-4抗体不结合缺乏Ig样V型和Ig样C21型结构域的Nectin-4多肽，例如具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的多肽。在另一个方面，与Nectin-4的VC1桥接结构域结合的特征可任选地表征为展现出与包含残基A72、G73、S195、K197、S199、L150、S152、Q234和I236(参考SEQ ID NO:1)处的一个或多个氨基酸取代的突变体Nectin-4多肽的结合降低，任选地相比于与野生型人Nectin-4多肽的结合，与包含残基K197、S199和/或Q234处的一个或多个氨基酸取代的突变体Nectin-4多肽的结合降低，任选地相比于与野生型人Nectin-4多肽的结合，与包含残基K197和/或S199处的一个或多个氨基酸取代的突变体Nectin-4多肽的结合降低。任选地，使用制备成表达Nectin-4多肽的细胞通过流式细胞术来评估结合，并且确定荧光强度水平(例如，MFI)。
在一个实施方案中，提供了一种作为抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的功能保守变体的Nectin-4结合抗体或抗体片段。在一个实施方案中，Nectin-4结合抗体包含：(i)VH结构域，该结构域包含与选自包含SEQ ID NO:6、24、42或50的组的序列所定义的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列(任选地其中每个重链框架区被人重链框架区取代)，和/或(ii)VL结构域，该结构域包含与选自包含SEQ ID NO:7、25、43或51的组的序列所定义的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列(任选地其中每个轻链框架区被人轻链框架区取代)。
在一个实施方案中，提供了一种Nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列(Kabat H-CDR 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:11、12和13的氨基酸序列(Kabat L-CDR 1、2和3)。
在一个实施方案中，提供了一种Nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:14、15和16的氨基酸序列(H-CDR 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:17、18和13的氨基酸序列(L-CDR1、2和3)。
在一个实施方案中，提供了一种Nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列(H-CDR 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:22、18和23的氨基酸序列(L-CDR1、2和3)。
在一个实施方案中，提供了一种Nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:44、45和46的氨基酸序列(H-CDR 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列(L-CDR1、2和3)。
在一个实施方案中，提供了一种Nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:52、53和54的氨基酸序列(H-CDR 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:55、56和57的氨基酸序列(L-CDR1、2和3)。
在本文的任何实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段或包含此类抗体或片段的抗体-药物缀合物能够在与肿瘤细胞表面上的Nectin-4结合时经历细胞内内化。
在本文的任何实施方案中，抗Nectin-4抗体与细胞毒性剂缀合。在本文的任何实施方案中，与细胞毒性剂缀合的抗Nectin-4抗体与另外的细胞毒性剂(例如，化疗剂、由P-糖蛋白(Pgp，人MDR1基因的产物)转运的化疗剂、铂剂、紫杉烷)组合使用，其中另外的细胞毒性剂与缀合至细胞毒性剂的抗Nectin-4抗体分开施用。
在一个方面，提供了一种在有需要的个体中治疗癌症和/或杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的本公开的特异性结合人Nectin-4多肽的抗体，任选地其中该抗体通过接头与细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)缀合。
在一个方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可用于患有Nectin-4表达性癌症的个体，而不管肿瘤细胞上的Nectin-4表达水平如何。
在一个方面，本公开提供了治疗方法，这些治疗方法可有利地用于其肿瘤细胞表达P-糖蛋白(Pgp)的个体。
在一个方面，本公开提供了治疗方法，这些治疗方法可有利地用于已经接受过用化疗剂(例如，由P-糖蛋白(Pgp)转运的化疗剂、铂类药剂(例如，奥沙利铂、顺铂、卡波铂、奈达铂、菲铂、吡铂、沙铂)、紫杉烷(例如，紫杉醇(TaxolTM)和多西他赛(TaxotereTM))进行的先前治疗的个体。
在一方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可有利地用于其肿瘤或癌症具有抗性，即对用包含抗HER2抗体的组合物(例如曲妥珠单抗，一种包含重和轻可变区、CDR或多肽链曲妥珠单抗的ADC)进行的治疗无应答或在该治疗后已进展的个体。
在一个方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可用于以较低或低于常规抗Nectin-4 ADC所用剂量的剂量介导个体中的抗肿瘤作用，例如，小于3mg/kg体重、小于1.25mg/kg体重、小于1mg/kg体重、小于125mg固定剂量。
在一个方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可用于患有现有神经病、糖尿病或高血糖、心功能不全、眼部病变的个体。
在一个方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可用于患有Nectin-4表达性癌症的个体，该癌症的特征在于Nectin-4多肽的低或中等水平的肿瘤细胞表达(例如，Nectin-4多肽在肿瘤细胞膜处的表达)。
在一个方面，抗Nectin-4抗体或抗体片段通过细胞内可切割的(例如，蛋白酶可切割的)寡肽(例如，二肽、三肽、四肽或五肽)与细胞毒性剂缀合。在一个方面，抗Nectin-4抗体或抗体片段通过细胞内可切割的(例如，蛋白酶可切割的)二肽、三肽、四肽或五肽和自消除间隔子与细胞毒性剂(例如，喜树碱衍生物)缀合。在一个方面，抗Nectin-4抗体或抗体片段通过细胞内可切割的(例如，蛋白酶可切割的)四肽或五肽和自消除或非自消除间隔子与细胞毒性剂(例如，喜树碱衍生物)缀合。
在一个方面，细胞毒性剂是高度有效的化疗剂，任选地是选自由以下组成的组的细胞毒性剂：紫杉烷类、蒽环类(anthracyclines)、喜树碱类、埃博霉素类(epothilones)、丝裂霉素类(mytomycins)、康普瑞汀类(combretastatins)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)、氮芥类(nitrogen mustards)、美登木素类(maytansinoids)、倍癌霉素类(duocarmycins)、微管溶素类(tubulysins)、尾海兔素类(dolastatins)和澳瑞他汀类、烯二炔类(例如，卡奇霉素类(calicheamicins)、埃斯波霉素类(esperamicins)、shishijimicins和namenamicins)、吡咯并苯二氮卓类(例如，吡咯并苯二氮卓二聚体和吲哚并-吡咯并苯二氮卓二聚体)、鹅膏毒素类(amatoxins)和乙烯亚胺类。在一个实施方案中，细胞毒性剂是DNA损伤剂，包括例如DNA嵌入剂，例如将其自身插入到细胞的DNA结构中并结合DNA从而引起DNA损伤的剂(例如柔红霉素(daunorubicin))。化合物包括拓扑异构酶抑制剂，即阻断拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)作用的化学化合物。此类化合物用于广泛的实体瘤和血液恶性肿瘤，特别是淋巴瘤。拓扑异构酶I抑制剂包括喜树碱类，例如伊立替康(irinotecan)(被批准用于治疗结肠癌)、拓扑替康(topotecan)(被批准用于治疗卵巢癌和肺癌)、喜树碱、片螺素D(lamellarin D)、茚并异喹啉(indenoisoquinoline)、茚替康(indimitecan)。另外的喜树碱类包括斯拉替康(silatecan)、柯西替康(cositecan)、依喜替康、勒托替康(lurtotecan)、吉马替康(gimatecan)、贝洛替卡(belotecan)和鲁比替康(rubitecan)。拓扑异构酶II抑制剂包括例如依托泊苷(etoposide)(VP-16)、替尼泊苷(teniposide)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)、安吖啶(amsacrine)、玫瑰树碱(ellipticines)、金精三羧酸(aurintricarboxylic acid)和HU-331(由大麻二酚(cannabidiol)合成的喹诺酮(quinolone))。
任选地，将所述抗体用式I到XI中任一个的接头-毒素官能化。
在一个方面，细胞毒性剂是喜树碱类似物，例如依喜替康、Dxd或SN-38分子。
在一个方面，本发明提供了本公开的Nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段与喜树碱(例如喜树碱类似物、依喜替康或依喜替康衍生物、Dxd分子或SN-38分子)缀合(例如共价结合)。
在本文的任何实施方案中，与喜树碱类似物，例如依喜替康或SN-38分子缀合(例如共价结合)的本公开的Nectin-4结合抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺残基、非天然氨基酸残基)的与人Nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过接头用包含化合物1或2的结构的分子官能化，或用式I或II的接头-喜树碱分子官能化。在本文的任何实施方案中，Nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为用具有式III、IV、V、VI、VII、VII、IX、X或XI结构的接头-喜树碱分子官能化，或用化合物3到12中任一个官能化。
在一个实施方案中，与喜树碱衍生物缀合的Nectin-4抗体或抗体片段是与依喜替康分子，例如具有化合物1(1a或1b)的结构的分子缀合的Nectin-4抗体或抗体片段。在任何实施方案中，可切割接头或包含接头的免疫缀合物或ADC可以表征为例如在接头的酶促切割时，释放依喜替康分子，例如具有化合物1(1a或1b)的结构的分子。在一个实施方案中，与喜树碱衍生物缀合的Nectin-4抗体或抗体片段是与SN-38分子，例如具有化合物2的结构的分子缀合的Nectin-4抗体或抗体片段。在一个实施方案中，Nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或非天然氨基酸残基)的与人Nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过接头(例如，具有或不具有另外的间隔子，例如本文所述的间隔子(Y')的可切割接头分子)用具有以下结构的分子官能化：
或
或
在一个实施方案中，与细胞毒性剂缀合的Nectin-4抗体或抗体片段可以被指定为由式(I)表示的免疫缀合物：
Ab–X–Z式(I)
其中，
Ab是特异性结合人Nectin-4多肽的抗体或抗体片段(例如，结合人Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体或抗体片段；和/或相比于与野生型人Nectin-4多肽的结合，展现出与包含残基K197和/或S199(参考SEQ ID NO:1)处的氨基酸取代的突变体人Nectin-4多肽的结合降低的抗体或抗体片段)；
X是连接Ab和Z的接头分子(例如，与Ab和Z中的每一个共价结合)，其中X包含例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分，任选地蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，任选地其中X进一步包含定位在可切割部分和Z之间的自消除或非自消除间隔子系统(Y')，任选地其中X进一步包含定位在Ab和可切割部分之间的间隔子(Y)；并且
Z是细胞毒性剂，任选地其中Z是喜树碱类似物，任选地其中Z是依喜替康，任选地其中Z是依喜替康并且接头的切割导致释放具有化合物1的结构的化合物(依喜替康)。
在一个实施方案中，与细胞毒性剂缀合的Nectin-4抗体或抗体片段可以被指定为由式(I)表示的免疫缀合物：
Ab–X–Z式(I)
其中，
Ab是根据本公开的特异性结合人Nectin-4多肽的抗体或抗体片段；
X是连接Ab和Z的接头分子(例如，与Ab和Z中的每一个共价结合)，其中X包含缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸二肽，其中X进一步包含定位在可切割部分和Z之间的自消除或非自消除间隔子系统(Y')，并且其中X进一步包含定位在Ab和可切割部分之间的间隔子(Y)；并且
Z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地是依喜替康分子或SN-38分子。
在一个实施方案中，提供了一种将细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)递送或靶向至肿瘤的方法、一种在肿瘤中(例如在患有癌症的受试者中)释放细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物、Dxd、依喜替康)的方法、或一种使肿瘤或癌症对细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)敏化的方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用由式(I)表示的免疫缀合物：
Ab–X–Z式(I)
其中，
Ab是特异性结合人Nectin-4多肽的抗体或抗体片段；
X是连接Ab和Z的接头分子(例如，与Ab和Z中的每一个共价结合)，其中X包含例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分，任选地蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，任选地其中X进一步包含定位在可切割部分和Z之间的自消除或非自消除间隔子系统(Y')，任选地其中X进一步包含定位在Ab和可切割部分之间的间隔子(Y)；并且
Z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地是依喜替康分子或SN-38分子，任选地其中Z是依喜替康并且其中接头的切割导致释放具有化合物1的结构的化合物(依喜替康)。
在一个实施方案中，与细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)缀合的抗体或抗体片段可以被指定为由式(II)表示的免疫缀合物：
Ab–(X–(Z)n)m式(II)
其中，
Ab是根据本公开的特异性结合人Nectin-4多肽的抗体或抗体片段；
X是连接Ab和Z的接头分子，其中X包括例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分，任选地蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，任选地其中X进一步包括定位在所述可切割部分和Z之间的自消除或非自消除间隔子系统(Y')，任选地其中X进一步包括定位在Ab和所述可切割部分之间的间隔子(Y)；
Z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地Z是包含依喜替康分子或SN-38分子的分子，例如具有化合物1或2的结构的分子；
n为1；并且
m为4到8，或任选地m为选自4、5、6、7或8的整数。
在一个实施方案中，与细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)缀合的Nectin-4抗体或抗体片段可以表征为由式(II)表示的免疫缀合物的组合物：
Ab–(X–(Z)n)m式(II)
其中，
Ab是根据本公开的特异性结合人Nectin-4多肽的抗体或抗体片段；
X是连接Ab和Z的分子，其中X包括例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分，任选地蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，任选地其中X进一步包括定位在所述可切割部分和Z之间的自消除或非自消除间隔子系统(Y')，任选地其中X进一步包括定位在Ab和所述可切割部分之间的间隔子(Y)；
Z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地Z是包含依喜替康分子或SN-38分子的分子；
其中n为1，并且该组合物中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物具有介于2和4之间、介于4和8之间，任选地介于6和8之间的m(X-Z部分的数量)。任选地该组合物中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物的m为，或至少为4、6、7或8。
在式I或II中，(X-Z)部分可以任选地被表征为具有式III到XI中任一个或化合物3-12中任一个的结构。
在式I或II中，分子X或间隔子Y可以任选地被指定为包含反应性基团(R)或反应性基团(R)与抗原结合蛋白(例如，抗体)的氨基酸或与附接至抗体或抗体片段的氨基酸的互补反应性基团(R')的反应的残基。
在本文的任何实施方案中，依喜替康分子可以被指定为通过依喜替康的位置1处的胺与接头(X)结合(当依喜替康分子是接头的一部分时，NH替换位置1处的NH2)。在一个实施方案中，依喜替康与接头(X)结合，例如与X的对氨基苄氧羰基(PAB)自消除间隔子部分的羰基结合。在本文的任何实施方案中，SN-38分子可以被指定为通过位置9处的OH与接头(X)结合(当化合物2中所示的SN-38分子是接头的一部分时，O替换位置9处的OH)。
在一个实施方案中，与依喜替康缀合的Nectin-4结合剂可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基)的与人Nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过间隔子(Y)用包含以下结构的接头-依喜替康分子官能化：
在一个实施方案中，与依喜替康缀合的Nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基)的与人Nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过间隔子(Y)用包含以下结构的接头-依喜替康官能化：
在一个实施方案中，与依喜替康缀合的Nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基)的与人Nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过间隔子(Y)用包含以下结构的接头-依喜替康分子官能化：
在一个实施方案中，与依喜替康缀合的Nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基)的与人Nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过间隔子(Y)用包含以下结构的接头-依喜替康分子官能化：
间隔子(Y)可以被指定为或包含取代或未经取代的烷基或杂烷基链，任选地其中Y的链长为2-40个原子，任选地2-30个、2-20个、4-40个、4-30个或4-20个原子，任选地其中一个或多个原子可以不是碳，例如是氧、硫、氮或其它原子，任选地其中链的任何碳被烷氧基、羟基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代。例如，Y可以包括一个或多个环氧乙烷单体，任选地Y包括聚环氧乙烷部分，任选地Y包括结构-(CH2CH2O)x-，其中x为1到12，任选地1到8，任选地1到6。
在一个方面，本发明提供了一种治疗，与现有的抗Nectin-4 ADC疗法(例如与澳瑞他汀；维汀-恩弗妥单抗缀合的抗Nectin-4抗体或抗体片段)相比，该治疗显示出改善的功效和/或改善的(更低的)耐药性。在一个方面，提供了一种在有需要的个体中治疗和/或预防癌症和/或杀死肿瘤细胞的方法，其中该治疗包括以每月1到2次的频率(例如每两周一次、每三周一次或每四周一次)施用2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次与喜树碱衍生物(例如依喜替康或SN-38分子)缀合的Nectin-4结合剂。
在一个方面，本发明提供了一种在有需要的个体中治疗和/或预防癌症和/或杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括用与喜树碱分子缀合的Nectin-4结合抗体或抗体片段(例如，与一个或多个喜树碱部分缀合的抗Nectin-4抗体或抗体片段)治疗所述个体，任选地其中该喜树碱是依喜替康、Dxd或SN-38。在一个实施方案中，所述个体患有Nectin-4表达性肿瘤，任选地其中该肿瘤是HER2表达性肿瘤或HER阴性肿瘤，例如尿路上皮癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌或食道癌。在一个实施方案中，所述个体患有Pgp表达性肿瘤。在一个实施例中，所述癌症或肿瘤是晚期复发性或转移性癌症，任选地是晚期复发性或转移性尿路上皮癌。在一个实施例中，所述癌症或肿瘤是三阴性乳腺癌(TNBC)。
在一个方面，本发明提供了一种在有需要的个体中治疗癌症、杀死肿瘤细胞和/或将细胞毒性剂递送至肿瘤的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的抗体-药物缀合物，该抗体-药物缀合物包含通过可切割接头缀合至化合物1的依喜替康的抗Nectin-4抗体，任选地其中接头的切割导致释放具有化合物1的结构的化合物(依喜替康)，任选地其中可切割接头包含可切割的寡肽(例如，二肽、三肽或四肽、val-cit、val-phe、val-ala)和自消解间隔子(例如PAB)，并且其中所述个体患有在用结合剂(任选地Nectin-4结合剂)治疗后已经复发和/或已经进展的癌症，该结合剂通过接头缀合至能够被Pgp转运的细胞毒性剂(例如，接头是在切割时释放细胞毒性剂的细胞内可切割的接头)。在任何实施方案中，能够被Pgp转运的细胞毒性剂是除依喜替康以外的喜树碱类似物，任选地其中能够被Pgp转运的细胞毒性剂是五环喜树碱类似物、六环喜树碱、德卢替康(deruxtecan)或Dxd，任选地其中接头的裂解导致释放除依喜替康以外的喜树碱类似物(例如，Dxd，具有化合物13的结构)。在一个实施方案中，通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的结合剂包含通过接头与具有化合物13结构的化合物(Dxd，德卢替康)缀合的结合Nectin-4的抗体，任选地其中接头包含可切割的含有甘氨酸的寡肽接头，例如含有甘氨酸和苯丙氨酸的寡肽接头，GGFG接头。在一个实施方案中，通过可切割接头与化合物1的依喜替康缀合的抗Nectin-4抗体包含与人Nectin-4多肽的VC1桥接结构域结合的抗体，例如本公开的抗体。
在本文任何实施例的一个方面中，所述个体已经接受过放射疗法、手术、化疗和/或用生物剂治疗的先前治疗。
还提供了本公开的免疫缀合物的组合物。还提供了药学上可接受的组合物和试剂盒，其包括本公开的免疫缀合物，以及通常可以是促进组合物的调配、递送、稳定性或其它特性的活性成分或非活性成分的一种或多种另外的成分(例如，各种载体)。还提供了筛选、测试和制备抗Nectin-4抗体和抗体片段以及包含它们的免疫缀合物或ADC的方法，以及用于其中的工具和试剂。
在本文提供的本发明的描述中将更加充分地描述这些方面，并且额外的方面、特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1示出了SUM190人乳腺癌肿瘤细胞表面的HER2和Nectin-4多肽的表达水平，如通过FACS所确定(MFI：荧光强度平均值)。SUM190肿瘤细胞以低至中等水平表达HER2(中值荧光单位为1777)并以低水平表达Nectin-4(中值荧光单位为991)。
图2示出了SUM185人乳腺癌肿瘤细胞表面的HER2和Nectin-4多肽的表达水平，如通过FACS所确定(MFI：荧光强度平均值)。SUM185细胞以中等至高水平表达HER2(中值荧光单位为2880)并以高水平表达Nectin-4(中值荧光单位为4326)。
图3右侧图片示出了N4 ADC1(抗Nectin-4)在导致HER-2和Nectin-4表达性SUM185和SUM190肿瘤细胞的死亡中的功效。两个左侧图片示出了HER2 ADC1(抗Her2)在相同的相应细胞中的功效。与SUM190细胞中的HER2 ADC1相比，N4 ADC1的效力增加了20倍，甚至在以较低的Nectin-4表面表达为特征的SUM185细胞中也具有更高的比较效力(SUM185中的表面Nectin-4是SUM190中的约1/4)。
图4A示出了抗Nectin-4抗体与整个(野生型)Nectin-4蛋白的结合的MFI，如使用被制备成表达Nectin-4的细胞通过流式细胞术评估的。mAb 6(5E7)和7(10B12)显示出比其它抗体低的平台。
图4B示出了通过流式细胞术评估的，抗Nectin-4抗体与被制备成表达修饰的Nectin-4的细胞的结合的MFI，该修饰的Nectin-4具有Ig样C2 1型结构域和Ig样C2 2型结构域并且缺乏Ig样V结构域(C1C2构建体)。左侧图片示出了mAb 6(5E7)和7(10B12)保留与C1C2构建体的结合。右侧图片。右侧图片示出了与完全结合C1C2构建体的mAb2相比，mAb 6和7的MFI降低。
图5示出了Nectin-4的结构域结构。用作ADC的抗体恩弗妥单抗和N41与Ig样V型结构域结合。本文获得的抗体1至5结合Ig样C2 1型结构域(C1结构域)和/或Ig样C2 2型结构域(C2结构域)，但不结合Ig样V型结构域。本文获得的抗体6(5E7)和7(10B12)以及抗体6CB11和6A7结合Ig样V型结构域(V结构域)和Ig样C2 1型结构域(C1结构域)两者。
图6示出了不同抗体1至7和同种型对照(IC)在SUM185细胞上的结合谱，如通过流式细胞术评估的。根据这个实验，C1和/或C2结构域特异性抗体(mAb 1-5)大体上表现出具有与恩弗妥单抗相当的结合谱，而抗体6和7(mAb 6和7)具有不同的谱。
图7A示出了与恩弗妥单抗相比，抗体1至7中的每一种的呈发光(指示细胞活力)形式的在SUM190细胞上的内化与抗Nectin-4抗体浓度的关系。图7B示出了与恩弗妥单抗相比，mAb6在SUM185细胞上的发光(指示细胞活力)。mAb6(5E7)在诱导SUM185细胞中的内化方面比恩弗妥单抗更高效。
图8A示出了mAb6(5E7)抗体以及同种型对照抗体(IC)对人乳腺癌细胞的杀伤，该mAb6抗体与喜树碱类似物Dxd(通过实施例7中示出的GGFG-Dxd接头)或依喜替康(通过实施例7中示出的(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康)接头)缀合，全部以相等的药物/抗体比(DAR＝8)，并且与V结构域结合EnhertuTM(曲妥珠单抗德卢替康(抗HER2))比较。图8B示出了与图8A的包含相同喜树碱类似物的接头缀合的mab6(5E7)以及与喜树碱类似物缀合的免疫对照、以相同的DAR缀合至包含喜树碱类似物的接头的mAb3和EnhertuTM对人乳腺癌细胞的杀伤。图8C示出了“5E7-依喜替康”(缀合至实施例7中示出的依喜替康接头(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康)的5E7)在导致HER-2和Nectin-4表达性SUM185、SUM190、MDA-MB-468(TNBC)人肿瘤细胞和MC38(结肠癌)和B16F10(黑色素瘤)鼠肿瘤细胞的死亡方面的功效，以及关于5E7-依喜替康导致细胞死亡的能力的EC50值。
图9示出了在人乳腺癌小鼠模型中，与相同剂量的恩弗妥单抗、N41和同种型对照抗体(IC)相比，3mg/kg单剂量的呈喜树碱ADC形式的mAb6(5E7)抗体的功效。每种抗体以相等的药物/抗体比(DAR＝8)与相同的喜树碱类似物(Dxd)和含有四肽的接头(GGFG)缀合。仅5E7能够有效地控制肿瘤生长。
图10示出了与PadcevTM(维汀-恩弗妥单抗)(以DAR＝4缀合至澳瑞他汀化合物MMAE的恩弗妥单抗)和EnhertuTM相比，mAb6(5E7)抗体以相对高的水平杀伤表达Nectin-4的SUM185人乳腺癌细胞。这种设置用作抗HER2抗性的模型。
图11A和11B示出了如通过流式细胞术确定的，抗Nectin-4抗体分别在大鼠和食蟹猴Nectin 4表达性CHO细胞系上的结合。恩弗妥单抗和mAb6和7结合大鼠Nectin-4，而mAb1-5不与其结合。
图12A和12B示出了人Nectin-4蛋白的结构，其中取代以着色显示；指示了对应于突变体7(12A)和7bis(12B)中被取代的C1结构域残基的白色区域。
图13A和13B示出了人Nectin-4蛋白的结构的几个视图，其中取代以着色显示；指示了对应于突变体1、2、3、4、5、6、7、8和9中被取代的残基的白色区域。
图14A示出了与抗体5E7相比，6C11B在SUM190细胞上的发光(指示细胞活力)。图14B示出了与抗体5E7相比，6A7在SUM190细胞上的发光(指示细胞活力)。6C11B和6A7两者在诱导SUM190细胞中的内化方面均与5E7一样高效。
图15A、15B和15c示出了在用ADC治疗的小鼠中肿瘤生长随时间(肿瘤植入后的天数)的演变。图15A和15B示出了用3mg/kg体重的剂量通过静脉注射以相同DAR缀合至相同接头-有效负载的不同抗体进行的治疗。图15C示出了用10mg/kg体重的剂量通过静脉注射与接头缀合的抗体5E7进行的治疗，这些接头设计成在接头切割时释放Dxd或依喜替康。
图16A示出了用PadcevTM(维汀-恩弗妥单抗)、缀合至Dxd的抗体5E7或缀合至依喜替康的5E7处理的细胞的发光(指示细胞活力)。这些细胞是内源性表达MDR1 p-糖蛋白并且经工程化以表达Nectin-4的MC-38细胞。具有依喜替康作为有效负载的ADC在这种药物抗性设置中高度有效地降低细胞活力。图16B示出了在存在或不存在Pgp抑制剂环孢素的情况下，以150nM ADC并归一化成对照抗体，用PadcevTM(维汀-恩弗妥单抗)、缀合至Dxd的抗体5E7或缀合至依喜替康的5E7处理的MC38细胞的肿瘤生长(曲线下面积)，表明了PadcevTM和缀合至Dxd的抗体5E7的抗肿瘤活性受到Pgp的负面影响。
图17A和17B示出了在MDR1 p-糖蛋白表达性肿瘤的模型中，在用维汀-恩弗妥单抗、缀合至德卢替康的抗体6A7或缀合至依喜替康的6A7注射一次(图17A)或一周注射三次(图17B)进行治疗的小鼠中，肿瘤生长随时间的演变。缀合至依喜替康的抗体6A7能够在此药物抗性模型中诱导肿瘤体积的显著降低。
具体实施方式
引言
发明人在本文中提供了用于改善细胞毒性剂向Nectin-4阳性肿瘤的递送的方法。特别地，本发明尤其来源于以下观察结果：与Nectin-4中桥接Ig样V型结构域和Ig样C2 1型结构域的区域中的与细胞间相互作用相关的位点结合的某些抗体产生的抗肿瘤活性的效力是金标准抗Ig样V型结构域ADC的3倍。细胞间相互作用可能通过第一细胞上的Nectin-4与第二细胞上的Nectin-1和/或Nectin-4的相互作用(Nectin-4:Nectin-1或Nectin-4:Nectin-4相互作用)来介导。当制备成携带拓扑异构酶I抑制剂(喜树碱类似物Dxd和依喜替康)的ADC时，与Nectin-4上的前述位点结合的抗体，相比于金标准抗体恩弗妥单抗或与Nectin-4上的桥接Ig样V型结构域和Ig样C2 1型结构域的不同区域结合的比较抗体，展现出更高的体内抗肿瘤活性。
一般来讲，抗体和片段可任选地因使肿瘤对细胞毒性剂敏化(或在敏化方法中)的能力和/或因抑制(或在抑制方法中)抗癌药物抗性的能力而被采用。因此，本公开的抗体和片段可与细胞毒性剂(例如，化疗剂)组合使用(施用)，其中细胞毒性剂作为单独施用的非缀合剂或在与抗Nectin-4抗体相同的药物调配物中施用，或作为其中细胞毒性剂缀合至抗Nectin-4抗体的免疫缀合物施用。
本公开的一个目的是抗体(例如全长抗体、抗体片段)，该抗体与Nectin-4上的包含选自由S195、K197和S199(参考SEQ ID NO:1)组成的组的一个、两个或三个残基的表位结合。
本公开的一个目的是抗体(例如全长抗体、抗体片段)，该抗体与包含选自由S195、K197和S199(参考SEQ ID NO:1)组成的组的一个或多个(或全部)残基处的突变的突变体Nectin-4多肽的结合降低，任选地，该突变体Nectin-4多肽具有突变S195A、K197T和S199A。
本公开的一个目的是用于制备抗体药物缀合物的抗体(例如全长抗体、抗体片段)，该抗体与包含选自由S195、K197和S199(参考SEQ ID NO:1)组成的组的一个或多个(或全部)残基处的突变的突变体Nectin-4多肽的结合降低，任选地，该突变体Nectin-4多肽具有突变S195A、K197T和S199A。
本公开的一个目的是包含选自由S195、K197和S199(参考SEQ ID NO:1)组成的组的一个或多个(或全部)残基处的突变的人Nectin-4多肽。突变体人Nectin-4多肽可以是全长Nectin-4多肽或其片段，例如细胞外结构域片段、VC结构域片段、包含V和C1结构域的片段或包含SEQ ID NO:1的Nectin-4多肽的至少10、20、30、50、100或200个连续氨基酸残基的片段。任选地，突变体Nectin-4多肽包含残基K197和S199处的突变(例如，K197T和S199A)，任选地，突变体Nectin-4多肽包含残基S195、K197和S199处的突变(例如，S195A、K197T和S199A)，任选地，突变体Nectin-4多肽包含残基A72、G73、K197和S199处的突变(例如A72P/G73N/K197T/S199A)。还提供了例如在细胞表面处，表达(制备成表达)此类多肽的重组宿主细胞。突变体多肽和/或宿主细胞可以用于制造、测试、制备或筛选抗体和/或抗体药物缀合物的方法中。
与突变体Nectin-4多肽的降低的结合可以和与没有突变的Nectin-4多肽(例如，野生型Nectin-4多肽，诸如包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽)的结合进行比较。
本公开的一个目的是作为抗体5E7、10B12或6A7的功能保守变体的Nectin-4结合抗体或抗体片段。本公开的一个目的是与抗体5E7、10B12或6A7竞争结合Nectin-4上的表位的Nectin-4结合抗体或抗体片段。本公开的一个目的是与抗体5E7、10B12或6A7结合Nectin-4上相同的位点或表位的Nectin-4结合抗体或抗体片段。本公开的一个目的是包含抗体5E7、10B12或6A7的重链和轻链CDR的抗体或抗体片段。本公开的一个目的是抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段结合Nectin-4并且包含与抗体5E7、10B12或6A7的重链和轻链CDR具有至少70％、80％、85％、90％、95％或98％序列同一性的重链和轻链CDR。
本公开的一个目的是制备ADC的方法。当制备ADC时，有利的是将细胞毒性剂(例如拓扑异构酶抑制剂或喜树碱类似物)连接至结合Nectin-4上的前述位点的抗体。在一个目的中，提供了用于制备ADC的方法，该方法包括将细胞毒性剂(Z)与抗Nectin-4抗体缀合，该抗Nectin-4抗体与Nectin-4上的包含选自由S195、K197和S199组成的组的一个、两个或三个残基的表位结合并且/或者与具有突变S195A、K197T和S199A的突变体Nectin-4多肽的结合降低。任选地，方法包括在适合形成抗体药物缀合物的条件下使所述抗Nectin-4抗体与细胞毒性剂(Z)接触和/或反应，以及分离抗体药物缀合物，任选地进一步其中抗Nectin-4抗体通过连接抗体(Ab)和细胞毒性剂(Z)的接头(X)缀合至细胞毒性剂，任选地进一步，其中细胞毒性剂(Z)是拓扑异构酶I抑制剂喜树碱，任选地是五环喜树碱类似物，任选地是六环喜树碱类似物，任选地是依喜替康、SN-38或Dxd。
本公开的一个目的是包含与细胞毒性剂缀合的本文所述的Nectin-4结合抗体或抗体片段的ADC，任选地进一步其中细胞毒性剂是拓扑异构酶I抑制剂，任选地是喜树碱类似物。当制备为携带拓扑异构酶I抑制剂(喜树碱类似物Dxd和依喜替康)的ADC时，与Nectin-4上的前述位点结合的抗体在杀死表达Nectin-4和P-糖蛋白两者的癌细胞系，特别是HCT116、A375、MC38、A549、HT29和MDA-MB-231细胞系的能力方面是高度有效的。因此，在癌症多药物抗性方面具有功效的此类ADC可有利地用于治疗对其它药物(例如，澳瑞他汀、MMAE)具有抗性的Nectin-4表达性癌症。本公开的一个目的是本公开的免疫缀合物用于治疗以下疾病的用途：癌症，任选地尿路上皮癌，任选地晚期复发或转移性尿路上皮癌，乳腺癌，TNBC，非小细胞肺癌，胰腺癌，卵巢癌，头颈部鳞状细胞癌或食道癌。本公开的一个目的是本公开的免疫缀合物用于治疗个体的癌症的用途，其中所述个体在使用缀合至澳瑞他汀或能够被Pgp转运的细胞毒性剂的Nectin-4结合剂治疗后已经复发和/或进展，任选地其中缀合至澳瑞他汀的Nectin-4结合剂是维汀-恩弗妥单抗。本公开的一个目的是本公开的免疫缀合物用于治疗个体的癌症的用途，其中所述个体在使用结合HER2的抗体、任选地与细胞毒性剂缀合的结合HER2的抗体、任选地与喜树碱类似物缀合的结合HER2的剂治疗后已经复发和/或进展，任选地其中抗体包含曲妥珠单抗的CDR和/或可变区。在一个方面，个体患有Nectin-4表达性癌症，该癌症的特征在于肿瘤细胞上的低或中等Nectin-4表达，任选地如通过免疫组织化学所确定的。在一个方面，个体患有Nectin-4和HER2表达性癌症。在一个方面，个体患有以肿瘤细胞表面处表达低或中等水平的HER2蛋白的肿瘤细胞为特征的癌症。在一个方面，个体患有以肿瘤细胞表面处表达高水平的HER2蛋白的肿瘤细胞为特征的癌症。在一个方面，个体患有尿路上皮癌，任选地晚期复发或转移性尿路上皮癌，乳腺癌，TNBC，非小细胞肺癌，胰腺癌，卵巢癌，头颈部鳞状细胞癌或食道癌。在一个方面，个体已经接受过使用化疗剂(任选地被P-糖蛋白(Pgp)转运的化疗剂，铂剂或紫杉烷)的先前治疗，和/或其癌症在该先前治疗之后已经进展。
定义
如本说明书中所用，“一个”或“一种”可意指一个(种)或多个(种)。如权利要求中所用，当与词语“包含”结合使用时，词语“一个”或“一种”可意指一个(种)或超过一个(种)。如本文所用，“另一个”可意指至少第二个或更多。
当使用“包括”时，这可以任选地由“基本上由…组成”或“由…组成”替换。
“Nectin-4”和“Nectin-4多肽”是指由NECTIN4基因(参见Uniprot登录号Q96NY8)或由此类基因制备的cDNA编码的蛋白质或多肽。任何天然存在的同种型、等位基因或变体均涵盖在术语Nectin-4多肽中(例如，与SEQ ID NO:1或与其至少100个、200个、300个、400个或500个氨基酸残基的连续序列具有95％、98％或99％同一性的Nectin-4多肽)。典型的人Nectin-4(异构体1)的510个氨基酸残基序列，包含31个氨基酸信号肽，如下所示：
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SEQ ID NO:1对应于UniProt KB标识符Q96NY8-1，其公开内容通过引用并入本文。
本公开的某些方面提供了与人Nectin-4或其同源物结合的抗Nectin-4抗体，该同源物包括但不限于哺乳动物Nectin-4蛋白和来自其它物种(例如非人灵长类动物，食蟹猴)的Nectin-4直系同源物。
术语“HER2”(也被称为HER2/neu和ErbB-2)代表“人表皮生长因子受体2”。其包含HER2的变体和同种型。
术语“免疫缀合物”和“抗体缀合物”可互换使用，并且是指与另一种分子(例如，喜树碱衍生物、依喜替康分子、SN-38分子)缀合的抗原结合剂，例如抗体结合多肽或抗体。当免疫缀合物包含与治疗剂(例如，细胞毒性剂或抗癌剂)缀合的抗原结合剂时，免疫缀合物也可称为“抗体药物缀合物”或“ADC”。细胞毒性剂的示例包括喜树碱类、紫杉烷类、蒽环类、喜树碱类、埃博霉素类、丝裂霉素类、康普瑞汀类、长春花生物碱类、氮芥类、美登木素类、卡奇霉素类(calicheamycins)、倍癌霉素类、微管溶素类、尾海兔素类和澳瑞他汀类、烯二炔类、吡咯并苯二氮卓类和乙烯亚胺类。
如本文所使用的，“治疗(treatment和treating等)”通常意指获得期望的药理学和生理学效果。就预防或部分预防疾病、其症状或病症而言，所述效果可以是预防性的和/或就疾病、病症、症状或归因于疾病的副作用的部分或完全治愈而言可以是治疗性的。如本文所用的术语“治疗”涵盖对哺乳动物、特别是人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者中发生，诸如预防性早期无症状干预；(b)抑制疾病，例如阻止其发展；或缓解疾病，例如引起疾病和/或其症状或病状的消退，诸如损伤的改善或补救，例如在已经被诊断为患有该疾病的受试者中。任选地，治疗可以引起(例如，可以表征为引起的方法)肿瘤负荷的减少、病变的大小和/或数量的减少、癌症进展的减少或延迟(例如，无进展生存期增加)、癌症转移的延缓或预防和/或增加生存期。任选地，治疗可以引起或提供(例如，可以表征为引起或提供的方法)受试者的稳定疾病、部分应答或完全应答，例如根据标准化标准，任选地RECIST标准。
每当提及Nectin-4结合剂(例如抗体或抗体片段)的“癌症治疗”等时，其都包括：
(a)一种治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：以允许治疗癌症的剂量(治疗有效量)，任选地如本文规定的剂量(量)向需要这种治疗的个体、哺乳动物、尤其是人施用Nectin-4结合剂(用于至少一种治疗)；
(b)Nectin-4结合剂在治疗癌症中的用途；
(c)Nectin-4结合剂，其用于治疗癌症(尤其在人中)；
(d)Nectin-4结合剂在制备用于治疗癌症的药物制剂中的用途；
(e)一种使用Nectin-4结合剂制备用于治疗癌症的药物制剂的方法，所述方法包括将Nectin-4结合剂与药学上可接受的载体混合；
(f)一种药物制剂，其包括有效剂量的适合于治疗癌症的Nectin-4结合剂；
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的任意组合，符合在提交本申请的国家允许授予专利的主题。
如本文所使用的，术语“活检”被定义为出于检查目的，诸如为了确立诊断而去除组织。活检类型的示例包括通过施加抽吸，诸如经由附接至注射器的针；-通过仪器去除组织碎片；-通过经由内窥镜用适当的器械去除；-通过手术切除，诸如整个病灶的手术切除；等。
如本文所用，术语“抗体”是指多克隆抗体和单克隆抗体。根据重链中的恒定结构域的类型，抗体被归属于五种主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些中的若干个进一步分为亚类或同种型，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由多肽链的两个相同对构成，每一对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50至70kDa)。每个链的N端限定主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别被称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。IgG是本文所采用的抗体的示例性类别，因为它们是生理情况下最常用的抗体并且因为它们在实验室环境中最容易制备。任选地，该抗体是单克隆抗体。抗体的特定示例是人源化、嵌合、人类或另外人类适宜性的抗体。“抗体”还包括任何本文所述的抗体的任何片段或衍生物。
抗体中负责抗原结合的氨基酸残基也可以被称为高变区。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，1991)和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol)，1987；196:901-917)或用于确定负责抗原结合的必需氨基酸的类似系统。通常，该区域中的氨基酸残基的编号通过Kabat等人，出处同上中所述的方法执行。诸如“Kabat位置”、“如Kabat中的可变结构域残基编号”和“根据Kabat”之类的短语在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可包含与可变结构域的FR或CDR的缩短或向其中的插入相对应的更少或附加氨基酸。例如，重链可变结构域可包含在CDR H2的残基52之后的单氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过在同源性区域处对给定抗体的序列与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定该抗体的残基的Kabat编号。
术语“特异性结合”意指抗体可以优选地在竞争性结合测定中与结合配偶体，例如Nectin-4结合，如使用蛋白质、其中的表位的重组形式，或存在于隔离的靶细胞的表面上的天然蛋白质所评估的。用于确定特异性结合的竞争性结合测定和其它方法是本领域众所周知的。例如结合可以通过放射性标记、物理方法(如质谱法)或使用例如细胞荧光分析(例如FACScan)检测的直接或间接荧光标记来检测。结合高于对照非特异性药剂所见的量表明所述药剂与靶标结合。
当抗体被称为与特定单克隆抗体“竞争”时，这意味着抗体在使用重组分子(例如，Nectin-4)或表面表达的分子(例如，Nectin-4)的结合测定中与单克隆抗体竞争。例如，如果在结合测定中测试抗体降低具有SEQ ID NO:6或24中任一个的重链可变区和SEQ ID NO:7或25的相应轻链可变区的抗体与Nectin-4多肽或Nectin-4表达性细胞的结合，则抗体被称为分别与此类抗体“竞争”。
术语“内化”可与“细胞内内化”互换使用，是指与将分子从细胞的细胞外表面易位至细胞的细胞内表面的过程相关的分子、生物化学和细胞事件。负责分子的细胞内内化的过程为人们所熟知，并且可尤其涉及细胞外分子(诸如激素、抗体和有机小分子)；膜相关分子(诸如细胞表面受体)；与细胞外分子(例如，与跨膜受体结合的配体或与膜相关分子结合的抗体)结合的膜相关分子的复合物的内化。因此，“诱导和/或增加内化”包括其中细胞内内化启动和/或细胞内内化的速率和/或程度增加的事件。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力由解离常数Kd给出，定义为[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度，[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和力常数Ka由1/Kd定义。用于确定单克隆抗体的亲和力的方法可以在以下参考文献中找到：Harlow等人,《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),冷泉港,纽约,1988)；Coligan等人(编者),《免疫学实验指南(CurrentProtocols in Immunology)》,格林出版协会和威立国际科学出版社(Greene PublishingAssoc.and Wiley Interscience),纽约,(1992,1993)以及Muller,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》，92:589-601(1983)，这些参考文献全文以引用方式并入本文。本领域众所周知的用于确定单克隆抗体的亲和力的一种标准方法是使用表面等离子共振(SPR)筛选(如通过用BIAcoreTMSPR分析装置进行分析)。
在本文的上下文中，“决定簇”是指多肽上相互作用或结合的位点。
术语“表位”是指抗原决定簇，并且是抗体所结合的抗原上的区或区域。蛋白质表位可包含直接参与结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效封闭的氨基酸残基，即，抗体的“足迹”内的氨基酸残基。其是可与例如抗体或受体组合的复合抗原分子上的最简单形式或最小结构区域。表位可为线性的或构象/结构的。术语“线性表位”被定义为由线性氨基酸序列上连续的氨基酸残基构成的表位(一级结构)。术语“构象或结构表位”被定义为由并不都连续并因此代表通过分子折叠而彼此接近的线性氨基酸序列的分开部分的氨基酸残基构成的表位(二级、三级和/或四级结构)。构象表位取决于三维结构。因此术语“构象”通常可与“结构”互换使用。
术语“试剂(agent)”在本文中用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制备的提取物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的试剂。
术语“Fc结构域”、“Fc部分”和“Fc区”是指抗体重链的C末端片段，例如，来自人γ(γ)重链的约氨基酸(aa)230至约aa 450，或其在其它类型的抗体重链中的对应序列(例如，人抗体的α、δ、ε和μ)，或其天然存在的同种异型。除非另外指明，否则在整个本公开中使用免疫球蛋白的公认Kabat氨基酸编号(参见Kabat等人，(1991)，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Protein of Immunological Interest)，第5版，美国公共卫生署(United States Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda,MD))。
如本文所用，所谓“骨架”或“FR”残基意指除被定义为CDR的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域骨架可被进一步细分为由这些CDR分开的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指基本上或实质上不含如在其天然状态下发现的通常与之相伴的组分。通常使用分析化学技术诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来确定纯度和均质性。作为存在于制剂中的主要物质的蛋白质基本上被纯化。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“重组”在参考例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，指示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或变更天然核酸或蛋白质来修饰，或该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或表达在其他情况下异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
在本文的上下文内，“结合”多肽或表位的术语抗体指定特异性和/或亲和性地结合所述决定簇的抗体。
术语“同一性”或“相同”在两个或更多个多肽的序列之间的关系中使用时是指多肽之间的序列相关性的程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的链之间的匹配数所确定。“同一性”度量通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的具有空位对齐(如果有的话)的两个或更多个序列中的更小序列之间的相同匹配的百分比。可易于通过已知方法计算相关多肽的同一性。此类方法包括但不限于以下文献中描述的那些：《计算分子生物学》(Computational Molecular Biology)，Lesk,A.M.编辑，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)，纽约(New York)，1988；《生物计算：信息学和基因组计划》(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，Smith,D.W.编辑，学术出版社(Academic Press)，纽约(New York)，1993；《序列数据的计算机分析第1部分》(ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1)，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西州(New Jersey)，1994；《分子生物学中的序列分析》(SequenceAnalysis in Molecular Biology)，von Heinje,G.，学术出版社(Academic Press)，1987；《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，M.斯托克顿出版社(M.Stockton Press)，纽约(New York)，1991；以及Carillo等人，《工业和应用数学会应用数学杂志》(SIAM J.Applied Math.)，48，1073(1988)。
用于确定同一性的方法被设计为给出所测试的序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在公开可用的计算机程序中有所描述。用于确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包含GCG程序包，包含GAP(Devereux等人,《核酸研究(Nucl.Acid.Res.)，12，387(1984)；威斯康星大学遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,University ofWisconsin)，威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，215，403-410(1990))。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和其他来源(《BLAST手册(BLAST Manual)》，Altschul等人，NCB/NLM/NIH贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(Md.)20894；Altschul等人，出处同上)公开获得。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
如本文所使用的，“烷基”是指包括完全饱和(无双键或三键)烃基的直链或支链烃链。烷基可以具有例如1至20个碳原子(无论其在本文何时出现，诸如“1至20”等数值范围是指在给定范围内的每个整数；例如，“1至20个碳原子”意味着烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成，至多且包含20个碳原子，但本定义还涵盖了未指定数值范围的情况下术语“烷基”的出现)。化合物的烷基可以命名为“C1-C4烷基”或类似名称。仅举例来讲，“C1-C4烷基”指示在烷基链中存在一到四个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包含但是决不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。烷基可以是经取代的或未经取代的。
如本文所使用的，术语“杂烷基”是指含有一个或多个杂原子的直链或支链烷基，即碳以外的元素(包含但不限于氧、硫、氮、磷)代替一个或多个碳原子。
每当基团被描述为“经取代的”时，该基团被一个或多个指定的取代基取代。如果未指明取代基，则意味着所指明的“取代的”基团可以被单独并且独立地选自以下的一个或多个基团取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、杂烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、硫代羰基、氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、酰氨基、磺酰氨基、磺酰氨基、羧基、异氰酸根、硫氰酸根、异硫氰酸根、硝基、甲硅烷基、亚磺酰基、亚磺酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲磺酰基、三卤代甲磺酰氨基、氨基、单-取代氨基和二-取代氨基，及其受保护的衍生物。
在未指定取代基的数量(例如卤代烷基)的情况下，可以存在一个或多个取代基。例如，“卤代烷基”可以包含相同或不同的卤素中的一个或多个。作为另一实例，“C1-C3烷氧基苯基”可以包含含有一个、两个或三个原子的相同或不同烷氧基中的一个或多个。
除非上下文另行明确指出，否则对具有特定编号的“化合物”或“式”的提及(例如，“化合物1”、“化合物2”、“式I”或“式II”)表示衍生自具有特定编号的化合物或式的所有化合物。化合物1，例如包含对化合物1a和1b的提及。
Nectin-4结合抗体和抗体片段
高变区、重链和轻链CDR、重链和轻链可变区以及包括它们的抗体(例如全长抗体或抗体片段)将结合在细胞(例如肿瘤细胞)表面上表达的人Nectin-4。在一个实施方案中，抗体对Nectin-4的结合由单个抗原结合结构域或由两个相同的抗原结合结构域介导，任选地其中每个抗原结合结构域包含VH和VL结构域对或单个可变结构域(例如，sdAb)。
当用于消除Nectin-4表达性肿瘤细胞的疗法中时，作为免疫缀合物或作为非缀合(“裸”)抗体(例如，任选地与单独施用的细胞毒性剂组合)，Nectin-4结合抗体(例如，全长抗体、抗体片段)或包含此类抗体的蛋白质、缀合物或复合物可有利地抑制由Nectin-4介导的细胞间相互作用，例如，如通过评估Nectin-4表达性细胞的细胞簇形成(例如，在三维细胞培养系统中，通过评估肿瘤球状体形成或生长)和/或非锚定依赖性生长所确定的。当用于消除Nectin-4表达性肿瘤细胞的疗法中时，作为具有细胞毒性剂的免疫缀合物或作为与单独施用的细胞毒性剂组合的非缀合(“裸”)抗体，Nectin-4结合抗体可有利地能够使肿瘤对细胞毒性剂敏化，例如抗体可增强细胞毒性剂抑制肿瘤细胞的增殖或导致肿瘤细胞死亡的能力，例如抑制成簇(例如，成球状体)的肿瘤细胞的增殖或导致其死亡的能力，或抑制肿瘤细胞簇(例如，球状体)的形成或生长的能力。当作为免疫缀合物用于消除Nectin-4表达性肿瘤细胞的疗法中时，抗Nectin-4免疫缀合物在与如本文公开的细胞毒性分子缀合时可有利地能够引起Nectin-4表达性肿瘤细胞的死亡。
表达Pgp的肿瘤细胞可具有对某些细胞毒性剂的降低的敏感性。可任选地使用表达Pgp的细胞(例如，肿瘤细胞)来测试抗体和细胞毒性剂(无论细胞毒性剂是否与抗体缀合)。
肿瘤球状体通常对化疗较不敏感，部分是由于其结构提供的保护，也由于其较慢的增殖速率，因此肿瘤球状体可用于评估抗体或免疫缀合物的抗肿瘤作用。可测试抗体或免疫缀合物以浓度依赖性方式抑制球状体形成或破坏癌细胞球状体形成的能力。例如，可使用实时数字摄影来测试抗体或免疫缀合物改变不同癌细胞系中的球状体形成的能力。
抗体或免疫缀合物可例如表征为能够将癌细胞维持为单细胞(或增加其维持)，这些细胞可因此变得对细胞毒性剂(例如化疗)更敏感。促进将癌细胞维持为单细胞以增加对化疗的敏感性可通过在抗体或免疫缀合物的存在下单独或组合地以不同浓度添加不同的化疗剂(例如，多柔比星、顺铂、紫杉醇、喜树碱或喜树碱类似物)进行体外测试，任选地进一步与仅结合Ig样V结构域或Ig样C2 1或2型结构域的抗体或免疫缀合物进行比较。将癌细胞维持为单细胞以增加对化疗的敏感性还可以例如通过添加具有不同毒素的靶向Nectin-4的不同结构域的不同免疫缀合物进行体外测试，其中当抗体结合Nectin-4的VC1结构域时，化疗剂或ADC的IC50将较低，或者对于其中抗体结合Nectin-4的VC1结构域的ADC，用于控制肿瘤生长的剂量将较低。对化疗的敏感性可评估为细胞活力、细胞增殖或细胞毒性，例如使用不同的读出(诸如通过发光的CTG、使用Incucyte的汇合或胱天蛋白酶3/7或膜联蛋白V)来监测。在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段结合野生型人Nectin-4多肽，例如具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，以及结合具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的修饰的人Nectin-4多肽(含有Ig样C2 1和2型结构域但缺乏Ig样V型结构域的Nectin-4蛋白)。任选地，抗体保留与缺乏Ig样V型结构域的多肽的部分结合，任选地其中相比于与野生型Nectin-4蛋白的结合，抗体以降低的水平保留与缺乏Ig样V型结构域的Nectin-4蛋白的结合，例如其中降低的水平是与野生型Nectin-4的结合的5％-50％之间、任选的5％-30％之间、任选的5％-25％之间、任选的5％-15％之间。任选地进一步，抗Nectin-4抗体不结合缺乏Ig样V型结构域和Ig样C2 1型结构域两者的Nectin-4多肽，例如具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的多肽。任选地，使用制备成表达Nectin-4多肽的细胞通过流式细胞术来评估结合，并且确定荧光强度水平(例如，MFI)。
在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段不与人Nectin 1蛋白、人Nectin2蛋白、人Nectin 3蛋白和人PVR蛋白中的任一者结合。相应的Nectin或PVR蛋白可被指定为在细胞表面处表达。
在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段结合：
Nectin-4多肽，该多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，和
Nectin-4多肽，该多肽具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列(相比于与SEQ ID NO:1的结合，任选地以降低的水平，任选地5％-50％之间的水平)，其中抗Nectin-4抗体或抗体片段不结合以下中的任一种：
具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的多肽，
具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的多肽，
具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的多肽，和
具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的多肽。
任选地进一步，抗Nectin-4抗体或抗体片段不结合具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的多肽。
任选地进一步，抗Nectin-4抗体或抗体片段结合大鼠Nectin-4多肽(例如，SEQ IDNO:35的氨基酸序列)。
在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段结合Nectin-4的VC1桥接结构域、表位或决定簇。
在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段在选自由A72、G73、S195、K197、S199、L150、S152、Q234和I236(参考SEQ ID NO:1)组成的组的的1、2、3、4或5个或更多个残基处结合人Nectin-4。在一个实施方案中，抗Nectin-4抗原结合蛋白或抗体在选自由K197、S199和Q234组成的组的1、2或3个残基、任选地残基K197和/或S199处结合人Nectin-4。在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段结合人Nectin-4的残基K197。在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段结合人Nectin-4的残基S199。在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段结合人Nectin-4的残基Q234。结合可以例如通过评估抗体或抗体片段与突变体Nectin-4多肽(例如，如在细胞表面处表达的)的结合是否已经降低或丧失来确定，该突变体Nectin-4多肽中的所述残基被不同残基取代。
在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段能够结合Ig样V型结构域和Ig样C2 1型结构域两者，例如结合Ig样V型结构域上的决定簇或表位和Ig样C2 1型结构域上的决定簇或表位。
在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段保留与包含Ig样C2 1型结构域但缺乏Ig样V型结构域的修饰的Nectin-4多肽(例如，缺乏SEQ ID NO:3的全部或部分氨基酸序列的Nectin-4多肽)的至少部分结合。部分结合可以被表征为保留结合，但是相比于与具有SEQ ID NO:1的残基的氨基酸序列的野生型人Nectin-4多肽的结合，以降低的水平结合(例如，如通过流式细胞术评估的)。Nectin-4多肽可以被指定为在细胞(例如，被制备成表达多肽的宿主细胞)的表面处表达。
抗体可以通过本领域已知的多种技术产生。通常，它们是通过用包括Nectin-4多肽(优选地人Nectin-4多肽)的免疫原对非人动物(优选地小鼠)进行免疫而产生的。Nectin-4多肽可包含人Nectin-4多肽的全长序列或其片段或衍生物，通常是免疫原性片段，即，包含暴露于表达Nectin-4多肽的细胞的表面上的表位(例如，由5E7、10B12、6C11B或6A7抗体识别的表位)的多肽的一部分。Nectin-4多肽可以被指定为包含VC1桥接结构域或其片段或子序列或由其组成。此类片段通常包含成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选地其至少约10个连续氨基酸。片段通常基本上衍生自受体的细胞外结构域。在一个实施例中，免疫原包括脂质膜中的野生型人Nectin-4多肽，通常位于细胞表面。在一个具体实施方案中，该免疫原包含完整细胞，特别是完整人类细胞，任选地其经过处理或裂解。在另一个优选的实施例中，多肽是重组Nectin-4多肽。在具体实施例中，免疫原包括完整的Nectin-4表达性细胞。
用抗原免疫非人哺乳动物的步骤可以以本领域众所周知的任何方式进行，用于刺激小鼠中抗体的产生(参见例如，E.Harlow和D.Lane,《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual.)》,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(1988)，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。
还可通过选择免疫球蛋白的组合文库来产生抗体，如例如(Ward等人，《自然》(Nature)，341(1989)，第544页，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文)中所公开。
使用可以评估抗体竞争的多种免疫筛选测定中的任何一种，可以容易地确定与单克隆抗体5E7、10B12、6C11B或6A7竞争结合Nectin-4的一种或多种抗体的鉴定。许多此类测定是常规实践的，并且在本领域中是众所周知的(参见例如，美国专利第5,660,827号，其通过引用并入本文)。
例如，在待检查的测试抗体获自不同的来源动物，或者甚至是不同的Ig同种型的情况下，可以使用简单的竞争测定，其中将对照(例如，5E7、10B12、6C11B或6A7)和测试抗体混合(或预先吸附)，并且应用到含有Nectin-4多肽的样品上。基于蛋白质印迹和使用表面等离子共振(例如BiacoreTM)分析的方案适用于此类竞争研究。
在某些实施方案中，在应用于Nectin-4抗原样品之前，将对照抗体(例如，5E7、10B12、6C11B或6A7)与不同量的测试抗体(例如，约1:10或约1:100)预混合一段时间。在其它实施例中，可以在暴露于Nectin-4抗原样品期间，简单地混合对照和不同量的测试抗体。只要可以将结合抗体与游离抗体区分开(例如，通过使用分离或洗涤技术以消除未结合的抗体)并且将5E7、10B12、6C11B或6A7与测试抗体区分开(例如，通过使用物种特异性或同种型特异性的二级抗体或通过具有可检测标记的特异性标记5E7、10B12、6C11B或6A7)，就可以确定测试抗体是否降低5E7、10B12、6C11B或6A7与抗原的结合。在不存在完全无关的抗体的情况下，(标记的)对照抗体的结合可用作对照高值。对照低值可以通过将标记的(5E7、10B12、6C11B或6A7)抗体与完全相同类型的未标记抗体(5E7、10B12、6C11B或6A7)一起温育来获得，其中将发生竞争并降低标记抗体的结合。测试抗体可以例如将5E7、10B12、6C11B或6A7与Nectin-4抗原的结合降低至少约50％，诸如至少约60％，或更优选地至少约80％或90％(例如，约65-100％)，其中5E7、10B12、6C11B或6A7:测试抗体的任何比率介于约1:10和约1:100之间。任选地，此类测试抗体将5E7、10B12、6C11B或6A7与Nectin-4抗原的结合降低至少约90％(例如，约95％)。
还可以通过例如流式细胞术测试评估竞争。在此类测试中，携带给定Nectin-4多肽的细胞可以首先与例如5E7、10B12、6C11B或6A7一起温育，然后与用荧光染料或生物素标记的测试抗体一起温育。如果与饱和量的5E7、10B12、6C11B或6A7一起预温育获得的结合是通过未与5E7、10B12、6C11B或6A7一起预温育的抗体获得的结合(如通过荧光的平均值测量的)的约80％，优选地约50％、约40％或更低(例如，约30％、20％或10％)，则称抗体与5E7、10B12、6C11B或6A7竞争。或者，如果在与饱和量的测试抗体一起预温育的细胞上用标记的5E7、10B12、6C11B或6A7抗体(通过荧光染料或生物素)获得的结合是未与测试抗体一起预温育获得的结合的约80％，优选地约50％、约40％或更低(例如，约30％、20％或10％)，则称抗体与5E7、10B12、6C11B或6A7竞争。
还可以使用简单的竞争测定，其中测试抗体被预吸附，并且以饱和浓度施加到其上固定有Nectin-4抗原的表面。简单竞争测定中的表面优选地是BiacoreTM芯片(或适用于表面等离子共振分析的其它介质)。然后使对照抗体(例如，5E7、10B12、6C11B或6A7)以Nectin-4饱和浓度与表面接触，并且测量对照抗体的Nectin-4和表面结合。将对照抗体的这种结合与在不存在测试抗体的情况下对照抗体与含有Nectin-4的表面的结合进行比较。在测试测定中，在存在测试抗体的情况下，对照抗体与含有Nectin-4的表面的结合显著降低，这表明测试抗体识别Nectin-4上与对照抗体基本上相同的区域，使得测试抗体与对照抗体“交叉反应”。测试抗体可以例如将对照(诸如5E7、10B12、6C11B或6A7)抗体与Nectin-4抗原的结合降低至少约30％或更多，优选地约40％。任选地，此类测试抗体将使对照抗体(例如，5E7、10B12、6C11B或6A7)与Nectin-4抗原的结合降低至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％或更多)。应当理解，对照抗体和测试抗体的顺序可以颠倒：即，可以首先使对照抗体结合到表面，并且然后在竞争测定中使测试抗体与表面接触。优选地，对Nectin-4抗原具有较高亲和力的抗体首先与表面结合，因为预期对于第二抗体所见的结合减少(假设抗体交叉反应)将具有更大的量级。此类测定的另外的示例提供于以下文献中：例如，Saunal(1995)《免疫法杂志(J.Immunol.Methods)》183:33-41，其公开内容通过引用并入本文。
抗体将结合来自患有以Nectin-4阳性肿瘤细胞为特征的癌症的一个或多个个体(即，使用抗Nectin-4抗体通过本文描述的方法之一进行治疗的候选个体)的Nectin-4表达性肿瘤细胞。因此，一旦获得特异性识别细胞上的Nectin-4的抗体，就可以任选地测试其与Nectin-4阳性细胞(例如，癌细胞)结合的能力。可以任选地测试其结合在其表面高水平表达Nectin-4多肽的肿瘤细胞和/或在其表面低水平表达Nectin-4多肽的肿瘤细胞的能力。具体而言，在用本发明抗体之一治疗患者之前，可以任选地测试抗体结合取自患者的恶性细胞的能力(例如，在血液样品或肿瘤活检中)，以最大限度地提高疗法对患者有益的可能性。
在一个实施例中，在免疫测定中验证抗体，以测试它们与Nectin-4表达性细胞(例如，恶性细胞)结合的能力。例如，进行血液样品或肿瘤活检，并收集肿瘤细胞。然后使用本领域技术人员熟知的标准方法评估给定抗体与细胞结合的能力。为了评估抗体与或细胞的结合，可以直接或间接标记抗体。当间接标记时，通常添加二级标记抗体。
确定抗体是否在表位区内结合可以以本领域的技术人员已知的方式进行。作为此类作图/表征方法的一个实例，抗Nectin-4抗体的表位区域可以通过使用Nectin-4蛋白中暴露的胺/羧基的化学修饰的表位“足迹法(foot-printing)”来确定。此类足迹法技术的一个具体示例是使用HXMS(通过质谱法检测的氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白酰胺质子的氢/氘交换、结合和反向交换，其中参与蛋白质结合的主链酰胺基受到保护免于反向交换，并且因此将保持氘代。此时，可以通过消化蛋白水解、快速微孔高效液相色谱分离和/或电喷雾电离质谱法鉴定相关区域。参见例如，Ehring H,《分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)》,第267(2)卷,第252-259页,(1999)；Engen,J.R.和Smith,D.L.(2001)《分析化学(Anal.Chem.)》73,256fA-265A。合适的表位鉴定技术的另一个示例是核磁共振表位作图(NMR)，其中通常比较游离抗原和与抗原结合肽(诸如抗体)复合的抗原的二维NMR谱中信号的位置。通常用15N选择性地同位素标记抗原，使得在NMR谱中仅看到与抗原相对应的信号，并且看不到来自抗原结合肽的信号。与游离抗原的光谱相比，源自参与与抗原结合肽相互作用的氨基酸的抗原信号通常将在复合物的光谱中移位，并且可以以所述方式鉴定参与结合的氨基酸。参见例如，恩斯特先灵研究基金会研讨会(Ernst Schering Res FoundWorkshop.)2004；(44):149-67；Huang等人,《分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)》,第281(1)卷,第61-67页(1998)；以及Saito和Patterson,《方法(Methods.)》1996年6月；9(3):516-24。
也可以使用质谱法进行表位作图/表征。参见例如，Downard,《质谱学杂志(J MassSpectrom.)》2000年4月；35(4):493-503，以及Kiselar和Downard,《分析化学(AnalChem.)》1999年5月1日；71(9):1792-1801。蛋白酶消化技术也可以用于表位作图和鉴定。抗原决定簇相关区域/序列可以通过蛋白酶消化确定，例如通过以约1:50的比率使用胰蛋白酶与Nectin-4或在pH 7-8下消化o/n，随后进行用于肽鉴定的质谱(MS)分析。随后可以通过将经历胰蛋白酶消化的样品和与抗体一起温育并且然后通过例如胰蛋白酶消化的样品进行比较，鉴定通过抗Nectin-4结合剂保护而免受胰蛋白酶切割的肽(从而揭示粘合剂的足迹)。其它酶如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等也可以或可替代地用于类似的表位表征方法中。此外，酶促消化可以提供用于分析潜在的抗原决定簇序列是否在Nectin-4多肽的未表面暴露的区域内的快速方法，并且因此，在免疫原性/抗原性方面最可能不相关。
定点诱变是可用于阐明结合表位的另一种技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白质区段内的每个残基用丙氨酸残基取代，并且测量结合亲和力的结果。如果突变导致结合亲和力显著降低，则很可能参与结合。对结构表位特异的单克隆抗体(即，不结合未折叠蛋白质的抗体)可以用于验证丙氨酸取代不影响蛋白质的总体折叠。参见例如Clackson和Wells,《科学(Science)》1995；267:383–386；和Wells,《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》1996；93:1–6。
电子显微镜也可以用于表位“足迹法”。例如，Wang等人,《自然(Nature)》1992；355:275-278使用冷冻电镜术、三维图像重建和X射线晶体学的协调应用，以确定Fab片段在天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的物理足迹。
用于表位评估的其它形式的“无标记”测定包含表面等离子共振(SPR、BIACORETM)和反射干涉光谱法(RifS)。参见，例如，等人，《分子识别杂志(Journal OfMolecular Recognition)》1990；3:208-14；Nice等人，《色谱期刊(J.Chromatogr.)》1993；646:159–168；Leipert等人,《德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)》1998；37:3308–3311；/>等人,《生物传感器和生物电子学杂志(Biosensors and Bioelectronics)》2002；17:937-944。
还应注意，可以在本文所述的示例性竞争测定中的一种或多种竞争测定中，鉴定结合与抗体相同或基本上相同的表位的抗体。
在脊椎动物或细胞中免疫接种和产生抗体后，或在生成候选抗体或抗体序列的文库后，可以执行特定选择步骤以分离受权利要求书保护的抗体。就这一点而言，在具体的实施方案中，提供了产生此类抗体的方法，这些方法包括：(a)用包含Nectin-4多肽的免疫原使非人哺乳动物免疫或制备抗体或抗体序列的文库；和(b)从所述免疫动物，或从所述抗体或序列的文库制备抗体；和(c)选择来自步骤(b)的能够结合Nectin-4的抗体，任选地选择来自步骤(b)的能够结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体。任选地，选择来自步骤(b)的能够结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体可以通过任何合适的方法来进行，包括但不限于本文所述的那些(例如，表位作图/表征方法、测试抗体与Nectin-4突变体的结合是否降低、测试抗体是否结合经修饰成缺乏Ig样V结构域的Nectin-4蛋白等等。
在一方面，抗体相对于人Nectin-4的平均解离常数(KD)可以不超过1×10-8M、任选地小于1×10-9M，如通过例如表面等离子共振(SPR)筛选(如通过用BIAcoreTMSPR分析装置的分析)所确定的。在更具体的示例性方面，提供了抗Nectin-4抗体，其对Nectin-4的KD为约1×10-8M到约1×10-10M，或约1×10-9M到约1×10-11M。
在一个实施方案中，本公开的结合Nectin-4的抗体能够抑制由Nectin-4介导的细胞间相互作用，例如，如通过评估Nectin-4表达性细胞的细胞簇形成和/或非锚定依赖性生长所确定的。例如，可以使Nectin-4表达性肿瘤细胞与结合Nectin-4的抗体接触，并且评估抗体是否降低Nectin-4表达性肿瘤细胞之间的细胞间粘附，和/或降低Nectin-4表达性肿瘤细胞的生长和/或簇形成(例如，如使用三维或非粘附性肿瘤细胞培养物所评估的；肿瘤球状体测定)。
在一个实施方案中，本公开的结合Nectin-4的抗体能够抑制由Nectin-4介导的细胞间相互作用，如通过评估Nectin-4表达性肿瘤细胞的球状体形成所确定的。确定抗体是否能够抑制球状体形成可以例如包括在结合Nectin-4的抗体的存在下，在三维或非粘附性肿瘤细胞培养物中(例如，在肿瘤球状体测定中)培养Nectin-4表达性肿瘤细胞，以及评估抗体是否抑制球状体形成。
在一个实施方案中，提供了一种用于鉴定或选择抗体的方法，该抗体用于制备或生产免疫缀合物(例如，抗体药物缀合物)，或用于治疗癌症(例如，与化疗剂组合，或作为ADC)，该方法包括：使结合Nectin-4的抗体与Nectin-4表达性肿瘤细胞接触(例如，在三维或非粘附性肿瘤细胞培养物中；在肿瘤球状体测定中)，以及评估抗体是否抑制Nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成(例如，球状体形成)和/或非锚定依赖性生长。任选地，方法包括在确定抗体能够抑制Nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成和/或非锚定依赖性生长后，选择用于治疗癌症的抗体。
在一个实施方案中，提供了一种用于鉴定或选择抗体的方法，该抗体用于制备或生产免疫缀合物(例如，抗体药物缀合物)，或用于治疗癌症(例如，与化疗剂组合，或作为ADC)，该方法包括：使结合Nectin-4的抗体与Nectin-4表达性肿瘤细胞接触(例如，三维或非粘附性肿瘤细胞培养物中的细胞；肿瘤球状体测定)，以及评估抗体是否抑制Nectin-4表达性肿瘤细胞的球状体形成。任选地，方法包括在确定抗体能够抑制Nectin-4表达性肿瘤细胞的球状体形成后，选择用于治疗癌症的抗体。
任选地，在任何方法中，肿瘤细胞表达Pgp(MDR1)。
任选地，在任何方法中，方法进一步包括在评估肿瘤或肿瘤细胞生长的抑制之前或之后，优选地通过接头部分，将抗体与细胞毒性剂(例如，喜树碱类似物)缀合的步骤。任选地，本描述的免疫缀合物由此产生。
在一个实施方案中，选择用于制备或生产免疫缀合物(例如，抗体药物缀合物)或用于治疗癌症(例如，Nectin-4阳性癌症)的抗体可包括使在细胞表面处表达Nectin-4多肽的细胞(例如，肿瘤细胞)与结合Nectin-4的抗体药物缀合物接触，并且评估抗体药物缀合物引起细胞死亡的能力(例如，效力、IC50)。在一个实施方案中，与具有抗体恩弗妥单抗的VH和VL的抗体药物缀合物相比(当相应的ADC具有相同的接头-细胞毒性药物和药物：抗体比率时)，所选的抗体在引起细胞死亡方面更有效(例如，更低的IC50)。任选地，抗体药物缀合物包含与喜树碱类似物缀合的结合Nectin-4的抗体。
在一个实施方案中，提供了可以用于选择和/或鉴定适用于本文的方法的抗体的方法。方法还可有利地在抗体药物缀合物的制备方法期间用作“生物测定”，以便测试和/或监测抗体药物缀合物的质量或活性。在一个示例中，方法可包括例如以下步骤：(i)提供抑制Nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成和/或非锚定依赖性生长的抗体，其中该抗体与细胞毒性剂缀合，和(ii)使在细胞表面处表达Nectin-4多肽的细胞与步骤(i)的抗体药物缀合物接触，并且评估抗体药物缀合物引起细胞死亡的能力(例如，效力、IC50)。任选地，如果确定抗体药物缀合物能够引起细胞死亡，任选地具有预定的功效或效力(例如，与参考标准抗体药物缀合物组合物相比，与预定的IC50值相比)，则选择该抗体药物缀合物(例如，用于制备中的进一步加工，用于填充到容器诸如小瓶或注射器中，用于治疗癌症等)。
关于活性测定中结合的“IC50”(或EC50)(例如，引起细胞死亡的能力)，是指抗Nectin-4抗体的抑制性或有效浓度，该浓度产生其关于感兴趣的活性的最大应答或作用的50％。
本文的测定可特别用于结合VC1桥接结构域的抗体。例如，在一个实施方案中，提供了一种制备、鉴定或测试Nectin-4结合抗体或包含此种Nectin-4结合抗体的抗体药物缀合物的方法，该方法包括使抗体或抗体药物缀合物(或来自其生产批次的样品)与在细胞表面处表达Nectin-4(任选地野生型Nectin-4多肽)的细胞接触，该抗体或抗体药物缀合物相对于抗体和野生型Nectin-4多肽之间的结合，展现出与包含残基K197和/或S199处的突变的突变体Nectin-4多肽的结合降低，以及评估该抗体或抗体药物缀合物经历细胞内内化、诱导抗体-Nectin-4复合物的细胞内内化和/或引起细胞死亡的能力。
在一些实施方案中，提供了一种测试结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体的方法，该方法包括：(i)在细胞毒性剂的存在下使抗体与在细胞表面处表达Nectin-4的细胞(任选地其中细胞表达Pgp)接触，任选地其中抗体与细胞毒性剂缀合，和(ii)评估该抗体或缀合抗体引起细胞死亡的能力，任选地评估与在单独的细胞毒性剂的存在下观察到的细胞死亡相比，抗体或缀合抗体在细胞毒性剂的存在下是否增加细胞死亡。在一个实施方案中，细胞表达Pgp，并且细胞毒性剂是喜树碱类似物，任选地依喜替康。
在一些实施方案中，提供了一种测试ADC的方法，该ADC包含与细胞毒性剂(例如喜树碱类似物、依喜替康)缀合的结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体，该方法包括：(i)在细胞毒性剂的存在下使ADC与在细胞表面处表达Nectin-4的细胞(任选地其中细胞表达Pgp)接触，和(ii)评估ADC引起细胞死亡的能力，任选地与参考ADC相比，任选地与在单独的细胞毒性剂的存在下观察到的细胞死亡相比。
在任何实施方案的一个方面，根据本发明方法制备的抗体是单克隆抗体。另一方面，用于产生抗体的非人动物是哺乳动物，如啮齿动物、牛、猪、家禽、马、兔、山羊或绵羊。本发明的抗体可以任选地被指定为除了抗体5E7、10B12、6C11B或6A7中任一个之外的抗体，或其衍生物，例如，这些抗体全部或部分包括它们相应的重链和轻链CDR或抗原结合区。
从杂交瘤中分离编码与Nectin-4多肽上存在的表位结合的抗体的DNA，并将其置于表达载体中，然后将所述表达载体转染到宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其它方式产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。如在本说明书的其他地方所述，可修饰此类DNA序列以用于大量目的中的任一个目的，例如用于人源化抗体，产生片段或衍生物，或用于修饰抗体的序列(例如，在抗原结合位点中)，以优化抗体的结合特异性。在一个实施例中，提供了对抗体的轻链和/或重链的进行编码的分离的核酸序列，以及包括(例如，在其基因组中)此类核酸的重组宿主细胞。
在一个方面，抗Nectin-4抗体是这样的抗体，其是具有抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的重链和轻链CDR或可变区的抗体的功能保守变体。“功能保守变体”是指蛋白质(例如抗体或抗体片段)中的给定氨基酸残基已经改变而不更改多肽的整体构象和功能的变体，包含但不限于用具有类似性质(如例如，极性、氢键合潜力、酸性、碱性、疏水性、芳香族等)的氨基酸替换氨基酸。除被指示为保守的那些氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可不同，使得类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似度百分比可变化并且可为例如70％至99％，如根据比对方案(诸如通过聚类方法(Cluster Method))确定，其中相似度基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包含如通过BLAST或FASTA算法确定的具有至少60％氨基酸同一性，优选地至少75％，更优选地至少85％，仍优选地至少90％并且甚至更优选地至少95％，并且具有与其所比较的天然或亲本蛋白相同或基本上类似的性质或功能的多肽。
可以基于与Nectin-4多肽(例如在细胞表面处作为缺乏Ig样V结构域的膜锚定的Nectin-4多肽)的VC1桥接结构域的结合来评估和/或选择抗体。在一个方面，抗体结合存在于Nectin-4多肽的Ig样V结构域上的抗原决定簇和存在于C2 1型结构域上的抗原决定簇，例如存在于细胞表面处表达的蛋白质中。在一个实施方案中，决定簇不完全存在于Ig样V结构域上，并且不完全存在于Ig样C2 1型结构域上。在一个实施方案中，与野生型膜结合的Nectin-4多肽相比，抗体与缺乏Ig样V结构域的膜锚定的Nectin-4多肽(即具有SEQ ID NO:32中示出的氨基酸序列的Nectin-4多肽)的结合部分降低。
在一个方面，提供了一种测试和/或产生抗Nectin-4抗体(例如，适合用于具有细胞毒性剂的免疫缀合物的抗体)的方法，该方法包括：
(a)提供结合Nectin-4蛋白的多种抗体，
(b)评估抗体是否与Nectin-4的VC1桥接结构域结合，和
(c)任选地，选择与Nectin-4的VC1桥接结构域结合的抗体(例如，选自在步骤(b)中评估的那些)。任选地，步骤(b)可包括评估抗体与缺乏Ig样V结构域的膜锚定的Nectin-4多肽的结合是否部分降低和/或抗体与包含一个或多个氨基酸取代(例如，在残基A72、G73、S195、K197、S199、L150、S152、Q234和I236处)的突变体Nectin-4多肽(任选地，包含残基K197、S199和/或Q234处的一个或多个氨基酸取代的突变体Nectin-4多肽；任选地包含取代S195A/K197T/S199A的突变体Nectin-4多肽、任选地包含取代A72P/G73N/K197T/S199A的突变体Nectin-4多肽、或任选地包含取代L150S/S152A/Q234R/I236S的突变体Nectin-4多肽)的结合是否降低的步骤。
在一个方面，提供了一种测试和/或产生抗Nectin-4抗体(例如，适合用于具有细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)的免疫缀合物的抗体)的方法，该方法包括：
(a)提供结合Nectin-4蛋白的多种抗体，
(b)评估抗体是否引起Nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成和/或非锚定依赖性生长的抑制，和
(c)任选地，选择引起Nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成和/或非锚定依赖性生长的抑制的抗体(例如，选自在步骤(b)中评估的那些)。任选地，步骤(b)可额外包括评估抗体是否结合Nectin-4的VC1桥接结构域和/或选择结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体的步骤。
在一个方面，提供了一种测试和/或产生抗Nectin-4抗体(例如，适合用于具有细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)的免疫缀合物的抗体)的方法，该方法包括：
(a)提供结合Nectin-4蛋白的多种抗体，
(b)评估抗体是否能够减少Nectin-4表达性肿瘤细胞之间的细胞间粘附和/或减少Nectin-4表达性肿瘤细胞的生长和/或簇形成(例如，如使用三维或非粘附性肿瘤细胞培养物所评估的；肿瘤球状体测定)，和
(c)任选地，选择能够减少Nectin-4表达性肿瘤细胞之间的细胞间粘附和/或减少Nectin-4表达性肿瘤细胞的生长和/或簇形成的抗体(例如，选自在步骤(b)中评估的那些)。任选地，步骤(b)可额外包括评估抗体是否结合Nectin-4的VC1桥接结构域和/或选择结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体的步骤。
在一个方面，提供了一种测试和/或产生抗Nectin-4抗体(例如，适合用于具有细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)的免疫缀合物的抗体)的方法，该方法包括：
(a)提供结合Nectin-4蛋白的多种抗体，
(b)评估抗体是否能够抑制由Nectin-4介导的细胞间相互作用，例如，如通过评估Nectin-4表达性细胞的细胞簇形成和/或非锚定依赖性生长所确定的，和
(c)任选地，选择能够抑制由Nectin-4介导的细胞间相互作用的抗体(例如，选自在步骤(b)中评估的那些)。
在一个方面，提供了一种测试和/或产生抗Nectin-4抗体(例如，适合用于具有细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)的免疫缀合物的抗体)的方法，该方法包括：
(a)提供结合Nectin-4蛋白的一种或多种抗体，
(b)评估抗体是否能够使肿瘤(例如转移性癌症、Nectin-4表达性肿瘤)对细胞毒性剂(例如，本文公开的剂(Z)、喜树碱类似物)敏化，和
(c)任选地，选择能够使肿瘤对细胞毒性剂(例如，本文公开的剂(Z)、喜树碱类似物)敏化的抗体(例如，从步骤(b)中选择)。任选地，步骤(b)可额外包括在细胞毒性剂的存在下使每种抗体与肿瘤细胞、任选地Pgp表达性肿瘤细胞(例如，在三维肿瘤细胞培养物中、在肿瘤球状体测定中)接触，并且确定与在不存在抗体的情况下的细胞毒性剂相比，抗体是否增强细胞毒性剂引起肿瘤细胞死亡的能力。任选地，步骤(b)可额外包括评估抗体是否结合Nectin-4的VC1桥接结构域和/或选择结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体的步骤。
在一个方面，提供了一种测试和/或产生ADC(例如，包含结合VC1桥接结构域的抗Nectin-4抗体的ADC，该抗Nectin-4抗体与拓扑异构酶I抑制剂、喜树碱类似物、依喜替康缀合)的方法，该方法包括：
(a)提供包含结合VC1桥接结构域的抗Nectin-4抗体的ADC，该抗Nectin-4抗体与拓扑异构酶I抑制剂、任选地喜树碱类似物、任选地依喜替康缀合，
(b)使ADC与Pgp表达性肿瘤细胞接触，并且评估抗体是否能够引起Pgp表达性肿瘤细胞的死亡(例如，包括确定引起细胞死亡的效力、IC50)，和
(c)任选地，选择能够引起Pgp表达性肿瘤细胞的死亡的ADC。任选地，步骤(b)可包括确定与单独的拓扑异构酶I抑制剂(不存在抗体的情况下)相比，ADC是否能够引起Pgp表达性肿瘤细胞的死亡。任选地，步骤(c)可包括选择与单独的拓扑异构酶I抑制剂(不存在抗体的情况下)相比，能够引起Pgp表达性肿瘤细胞的死亡增加的ADC。
在一个方面，提供了一种选择或测试免疫缀合物或测试拓扑异构酶抑制剂用于抗Nectin-4免疫缀合物(例如，与抗Nectin-4抗体组合使用，通过与抗Nectin-4抗体缀合用于免疫缀合物中)的适用性的方法，该方法包括：
(a)提供抗Nectin-4抗体，任选地其中抗体结合Nectin-4的VC1桥接结构域，
(b)提供拓扑异构酶抑制剂(例如，在步骤c中分别评估的一种或多种剂)，并且将该剂与(a)的抗体缀合(例如，如果评估多种，则使每种剂分别缀合)，
(c)评估步骤(b)的拓扑异构酶抑制剂缀合抗体是否能够引起Pgp表达性肿瘤细胞的死亡，和
任选地，如果任选地与包含参考或比较拓扑异构酶抑制剂缀合抗体的免疫缀合物相比，拓扑异构酶抑制剂缀合抗体引起细胞死亡的能力增强，则选择该免疫缀合物或拓扑异构酶抑制剂用于免疫缀合物。比较物或参考物可包含不同的拓扑异构酶抑制剂和/或不同的抗Nectin-4抗体。
在一个方面，提供了一种选择或测试化疗剂或细胞毒性剂与结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗Nectin-4抗体一起使用(例如，与抗Nectin-4抗体组合使用，通过与抗Nectin-4抗体缀合用于免疫缀合物中)的适用性的方法，该方法包括：
(a)提供结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗Nectin-4抗体，
(b)提供细胞毒性剂或化疗剂(例如，在步骤c中分别评估的一种或多种剂)，
(c)评估抗体是否能够使肿瘤(例如，Pgp表达性肿瘤、来自转移性癌症的肿瘤、Nectin-4表达性肿瘤)对该剂敏化，和
(d)任选地，选择其抗肿瘤活性被该抗体增加的剂(例如，与抗Nectin-4抗体组合使用，通过与抗Nectin-4抗体缀合用于免疫缀合物中)。任选地，步骤(c)可额外包括在该剂的存在下使抗体与肿瘤细胞(例如，Pgp表达性肿瘤细胞、三维肿瘤细胞培养物中的细胞、肿瘤球状体测定中的细胞)接触，并且确定与在不存在抗体的情况下的细胞毒性剂相比，抗体是否增强细胞毒性剂引起肿瘤细胞死亡的能力。任选地，步骤(a)可额外包括评估抗体是否结合Nectin-4的VC1桥接结构域和/或选择结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体的步骤。
在上述产生抗体的方法中的任一者中，方法可进一步包括评估抗体与人Nectin-4多肽的结合亲和力的步骤，例如评估1:1结合拟合和/或解离或脱离速率(kd(1/s))，如在SPR单价结合亲和力测定中确定的。
然后可将测试、选择和/或产生的抗体用于进一步评价、用于进一步加工、产生一定量的抗体、用于与细胞毒性剂缀合、用于调配或填充到容器或小瓶中、用于治疗癌症。在一个方面，提供了一种通过该方法产生的缀合抗体或抗体药物。
在一个示例中，抗体筛选或测试可包括使用突变体ILT2多肽来表征和/或定向对抗体的选择。例如，产生或测试结合Nectin-4的抗体的方法可包括以下步骤：
(a)提供结合Nectin-4多肽的多种抗体，
(b)使每个所述抗体与突变体Nectin-4多肽接触，该突变体Nectin-4多肽包含选自由A72、G73、S195、K197、S199、L150、S152、Q234和I236组成的组的1、2、3、4或5个或更多个残基处的突变，或任选地残基K197和/或S199处的突变，或任选地选自由K197、S199和Q234组成的组的1、2或3个残基处(参考SEQ ID NO:1)的突变，并且相对于抗体与包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的野生型Nectin-4多肽之间的结合，评估抗体与突变体Nectin-4多肽之间的结合，和
(c)任选地，选择相对于抗体与包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型Nectin-4多肽之间的结合，与突变体Nectin-4多肽的结合降低的抗体(例如，用于进一步评价、用于与细胞毒性剂缀合、用于进一步加工、产生一定量的抗体、用于治疗)。任选地，突变体Nectin-4多肽包含取代S195A/K197T/S199A、取代A72P/G73N/K197T/S199A和/或取代L150S/S152A/Q234R/I236S。
有利地，抗体可任选地基于与Nectin-4多肽表面上的与本文所述的任何抗体相同的区域或表位的结合来鉴定和选择。在一个方面，抗体结合与抗体5E7、10B12、6C11B或6A7中的任一种基本上相同的表位。在一个实施方案中，抗体结合Nectin-4的表位，该表位与抗体5E7、10B12、6C11B或6A7结合的表位至少部分地重叠或包含其中的至少一个残基。由抗体结合的残基可以被指定为存在于Nectin-4多肽的表面上(例如，存在于在细胞的表面上表达的Nectin-4多肽上)。
抗Nectin-4抗体与Nectin-4上的特定位点的结合可以通过测量抗Nectin-4抗体与用Nectin-4突变体转染的细胞的结合来评估，如与抗Nectin-4抗体结合野生型Nectin-4多肽(例如，SEQ ID NO:1)的能力相比。本公开提供了突变体Nectin-4多肽，这些多肽允许表征抗体(包括结合VC结构域的抗体)的结合位点。在一个实施方案中，提供了包含表2的突变体中所示的突变的突变体Nectin-4多肽、编码此类突变体的核酸以及表达前述多肽的重组宿主细胞。在一个实施方案中，提供了突变体Nectin-4多肽，该多肽包含选自由A72、G73、S195、K197、S199、L150、S152、Q234和I236组成的组的1、2、3、4或5个或更多个残基处的突变，或任选地残基K197和/或S199处的突变，或任选地选自由K197、S199和Q234组成的组的1、2或3个残基处(参考SEQ ID NO:1)的突变；编码此类突变体的核酸，以及表达前述多肽的重组宿主细胞。抗Nectin-4抗体和突变体Nectin-4多肽(例如，表2的突变体)之间的结合降低意味着结合亲和力降低(例如，如通过已知方法，诸如表达特定突变体的细胞的FACS测试，或通过与突变体多肽结合的Biacore测试所测量的)和/或抗Nectin-4抗体的总结合能力降低(例如，如通过抗Nectin-4抗体浓度对比多肽浓度的绘图中Bmax的下降所证明的)。结合的显著降低表明，当抗Nectin-4抗体与Nectin-4结合时，突变后的残基直接参与与抗Nectin-4抗体的结合或与结合蛋白非常接近。
在一些实施方案中，结合的显著降低意味着相对于抗体与野生型Nectin-4多肽之间的结合，抗Nectin-4抗体与突变体Nectin-4多肽之间的结合亲和力和/或能力降低大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施方案中，结合减少到可检测限度以下。在一些实施例中，当抗Nectin-4抗体与突变体Nectin-4多肽的结合小于抗Nectin-4抗体与野生型Nectin-4多肽之间观察到的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证明结合显著降低。
在一些实施方案中，提供了抗Nectin-4抗体，这些抗体对突变体Nectin-4多肽(例如，表2的突变体)(其中包含由抗体5E7、10B12、6C11B或6A7结合的氨基酸残基的区段中的残基被不同的氨基酸取代)表现出显著更低的结合，相比于与不包含此类取代的野生型Nectin-4多肽(例如，SEQ ID NO:1的多肽)的结合。
在一个方面，抗Nectin-4抗体结合位于Nectin-4的VC1桥接结构域之上或之内的表位。在一个方面，抗Nectin-4抗体与抗体5E7、10B12、6C11B或6A7竞争结合Nectin-4的VC1桥接结构域上的表位。
在一个方面，抗Nectin-4抗体与具有选自由K197(例如，K197T取代)、S199(例如，S199A取代)和Q234(例如，Q234R取代)(参考SEQ ID NO:1)组成的组的一个、两个或三个残基处的突变的Nectin-4多肽具有降低的结合，任选地丧失结合。
在一个实施方案中，抗体此外与包含选自由S195、K197和S199(参考SEQ ID NO:1)组成的组的一个或多个(或全部)残基处的突变的突变体Nectin-4多肽具有降低的结合，任选地，该突变体Nectin-4多肽具有突变S195A、K197T和S199A。
在一个实施方案中，抗体此外与包含选自由A72、G73、K197和S199(参考SEQ IDNO:1)组成的组的一个或多个(或全部)残基处的突变的突变体Nectin-4多肽具有降低的结合，任选地，该突变体Nectin-4多肽具有突变A72P、G73N、K197T和S199A。
在一个实施方案中，抗体此外与包含选自由L150、S152、Q234和I236(参考SEQ IDNO:1)组成的组的一个或多个(或全部)残基处的突变的突变体Nectin-4多肽具有降低的结合，任选地，该突变体Nectin-4多肽具有突变L150S、S152A、Q234R和I236S。
在一个实施方案中，抗体此外与包含选自由A72、G73、S195、K197、S199、L150、S152、Q234和I236(参考SEQ ID NO:1)组成的组的一个或多个(或全部)残基处的突变的突变体Nectin-4多肽具有降低的结合，任选地，该突变体Nectin-4多肽具有突变A72P、G73N、S195A、K197T、S199A、L150S、S152A、Q234R和I236S。
在每种情况下，结合的降低或丧失可以被指定为相对于抗体与包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型Nectin-4多肽之间的结合。
在一个方面，抗Nectin-4抗体结合Nectin-4上的表位，该表位包含选自由A72、G73、S195、K197、S199、L150、S152、Q234和I236组成的组的氨基酸残基(例如，这些残基中的一个、两个、三个、四个或五个)，或任选地选自由K197、S199和Q234(参考SEQ ID NO:1)组成的组的1、2、或3个残基。
在一个方面，抗Nectin-4抗体结合Nectin-4上的表位，该表位包含选自由S195、K197和S199(参考SEQ ID NO:1)组成的组的氨基酸残基(例如，这些残基中的一个、两个或三个)。
在一个方面，抗Nectin-4抗体结合Nectin-4上的表位，该表位包含选自由A72、G73、K197和S199组成的组的氨基酸残基(例如，这些残基中的一个、两个、三个或四个)。
在一个方面，抗Nectin-4抗体结合Nectin-4上的表位，该表位包含选自由L150、S152、Q234和I236组成的组的氨基酸残基(例如，这些残基中的一个、两个、三个或四个)。
在一个方面，抗Nectin-4抗体结合位于Nectin-4的VC1桥接结构域之上或之内的表位。在一个方面，抗Nectin-4抗体与抗体5E7、10B12、6C11B或6A7竞争结合人Nectin-4蛋白的VC1桥接结构域上的表位。
在一个实施方案中，本公开的抗体的VH区包含与由人V基因群的基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该人V基因群的基因选自由以下组成的组：IGHV1-18、IGHV1-2、IGHV1-24、IGHV1-3、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV2-26、IGHV2-5、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-54、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-7、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-9、IGHV3-NL1、IGHV4-28、IGHV4-30-1、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-4、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1和IGHV7-4-1。任选地，本公开的抗体的VH区包含有包含来自所述基因的氨基酸序列(例如，CDR和/或人框架区，例如根据Kabat编号)的VH。
在一个实施方案中，本公开的抗体的VL区包含与由人V基因群的基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该人V基因群的基因选自由以下组成的组：IGKV1-12、IGKV1-13、IGKV1-16、IGKV1-27、IGKV1-33、IGKV1-39、IGKV1-5、IGKV1-6、IGKV1-8、IGKV1-9、IGKV1-NL1、IGKV1D-12、IGKV1D-13、IGKV1D-16、IGKV1D-17、IGKV1D-33、IGKV1D-39、IGKV1D43、IGKV1D8、IGKV2-24、IGKV2-28、IGKV2-29、IGKV2-30、IGKV2-40、IGKV2D-26、IGKV2D-28、IGKV2D-29、IGKV2D-30、IGKV2D-40、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV3D-11、IGKV3D-15、IGKV3D-20、IGKV3D-7、IGKV4-1、IGKV5-2、IGKV6-21和IGKV6D-21。任选地，本公开的抗体的VL区包含有包含来自所述基因的氨基酸序列(例如，CDR和/或人框架区，例如根据Kabat编号)的VL。
根据本公开的示例性抗Nectin-4 VH和VL对是抗体5E7的VH和VL对，以下列出了其重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)，并且以下列出了其轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。在具体的实施方案中，提供了基本上结合与单克隆抗体5E7相同的表位或决定簇的抗体；任选地，该抗体包含抗体5E7的高变区。在本文的任何实施方案中，抗体5E7可由氨基酸序列和/或编码其的核酸序列表征。在一个实施方案中，单克隆抗体包含5E7的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含5E7的重链可变区的抗体或抗体片段。根据一个实施方案，抗体或抗体片段包含5E7的重链可变区的三个CDR。还提供了进一步包含5E7的可变轻链可变区或5E7的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个CDR的抗体或抗体片段。任选地，HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以被指定为所有(或各自独立地)是Kabat编号系统的序列、Chotia编号系统的序列、IMGT编号系统或任何其它适合的编号系统的序列。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个轻链或重链CDR可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。
在一个方面，抗Nectin-4抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:6的VH结构域具有至少约60％、70％或80％的序列同一性、任选地至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的VH结构域。在另一个方面，抗Nectin-4抗体包含与SEQ ID NO:7的VL结构域具有至少约60％、70％或80％的序列同一性、任选地至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的VL结构域。
任选地，VH和VL包含(例如，经修饰以掺入)人受体框架。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区的VH CDR1、CDR2和/或CDR3(例如，根据Kabat编号)。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区的VL CDR1、CDR2和/或CDR3(例如，根据Kabat编号)。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含VH和VL，该VH包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且该VL包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3。
5E7 VH:
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTLDKSSSTTYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGYGNYGDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:6)
5E7 VL:
DVVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:7)
5E7 CDR:
Kabat：
IMGT：
Chothia：
在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体可例如包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:8-10的氨基酸序列，并且该轻链可变区包含SEQ ID NO:11-13的氨基酸序列。抗Nectin-4抗体可例如包含：具有氨基酸序列：SYWMH(SEQ ID NO:8)的HCDR1或其至少4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：EIDPSDSYTNYNQKFKG(SEQ ID NO:9)的HCDR2或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：GYGNYGDY(SEQ ID NO:10)的HCDR3或其至少4、5或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:11)的LCDR1或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：QMSNLAS(SEQ ID NO:12)的LCDR2区或其至少4、5或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；和/或具有氨基酸序列：AQNLELPWT(SEQ ID NO:13)的LCDR3区或其至少4、5、6、7或8个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可缺失或被不同氨基酸取代。CDR位置可以根据Kabat编号。
根据本公开的另一个示例性抗Nectin-4 VH和VL对是抗体10B12的VH和VL对，以下列出了其重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)，并且以下列出了其轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)。在具体的实施方案中，提供了基本上结合与单克隆抗体10B12相同的表位或决定簇的抗体；任选地，该抗体包含抗体10B12的高变区。在本文的任何实施方案中，抗体10B12可被表征为氨基酸序列和/或编码其的核酸序列。在一个实施方案中，单克隆抗体包含10B12的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含10B12的重链可变区的抗体或抗体片段。根据一个实施方案，抗体或抗体片段包含10B12的重链可变区的三个CDR。还提供了还包含10B12的可变轻链可变区或10B12的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个CDR的抗体或抗体片段。HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可任选地指定为全部(或各自独立地)是Kabat编号系统的那些、Chotia编号系统的那些(例如，具有CDR-H1氨基酸序列GYTFTSY(SEQ ID NO:26)的抗体)、IMGT编号系统的那些(例如，具有CDR-H1氨基酸序列GYTFTSYW(SEQ ID NO:27)的抗体)或任何其它合适的编号系统。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个轻链或重链CDR可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。
在一个方面，抗Nectin-4抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:24的VH结构域具有至少约60％、70％或80％的序列同一性、任选地至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的VH结构域。在另一个方面，抗Nectin-4包含与SEQ ID NO:25的VL结构域具有至少约60％、70％或80％的序列同一性、任选地至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的VL结构域。
任选地，VH和VL包含(例如，经修饰以掺入)人受体框架。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区的VH CDR1、CDR2和/或CDR3(例如，根据Kabat编号)。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区的VL CDR1、CDR2和/或CDR3(例如，根据Kabat编号)。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含VH和VL，该VH包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且该VL包含具有SEQ IDNO:25的氨基酸序列的轻链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3。
10B12 VH:
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGYGNYGDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:24)
10B12 VL:
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:25)
根据本公开的另一个示例性抗Nectin-4 VH和VL对是抗体6C11B的VH和VL对，以下列出了其重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)，并且以下列出了其轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)。在具体的实施方案中，提供了基本上结合与单克隆抗体6C11B相同的表位或决定簇的抗体；任选地，该抗体包含抗体6C11B的高变区。在本文的任何实施方案中，抗体6C11B可由氨基酸序列和/或编码其的核酸序列表征。在一个实施方案中，单克隆抗体包含6C11B的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含6C11B的重链可变区的抗体或抗体片段。根据一个实施方案，抗体或抗体片段包含6C11B的重链可变区的三个CDR。还提供了进一步包含6C11B的可变轻链可变区或6C11B的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个CDR的抗体或抗体片段。任选地，HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以被指定为所有(或各自独立地)是Kabat编号系统的序列、Chotia编号系统的序列、IMGT编号系统或任何其它适合的编号系统的序列。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个轻链或重链CDR可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。
在一个方面，抗Nectin-4抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:42的VH结构域具有至少约60％、70％或80％的序列同一性、任选地至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的VH结构域。在另一个方面，抗Nectin-4抗体包含与SEQ ID NO:43的VL结构域具有至少约60％、70％或80％的序列同一性、任选地至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的VL结构域。
任选地，VH和VL包含(例如，经修饰以掺入)人受体框架。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区的VH CDR1、CDR2和/或CDR3(例如，根据Kabat编号)。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区的VL CDR1、CDR2和/或CDR3(例如，根据Kabat编号)。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含VH和VL，该VH包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且该VL包含具有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的轻链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3。
6C11B VH：
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTIHWVKQNHGKSLEWIGRINPKNGDIIHNQNFMGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVCYCARSGYGSSYGFAYWGQGTLVTVSA
(SEQ ID NO:42)
6C11B VL：
DIVMTQSPTSLVVSLGQRATISCRASQSVTTPRYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:43)
6C11B CDR：
Kabat：
抗Nectin-4抗体可例如包含：具有氨基酸序列：EYTIH(SEQ ID NO:44)的HCDR1或其至少4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：RINPKNGDIIHNQNFMG(SEQ ID NO:45)的HCDR2或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：SGYGSSYGFAY(SEQ ID NO:46)的HCDR3或其至少4、5或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：RASQSVTTPRYSYMH(SEQ ID NO:47)的LCDR1或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：YASNLES(SEQ ID NO:48)的LCDR2区或其至少4、5或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；和/或具有氨基酸序列：QHSWEIPYT(SEQ ID NO:49)的LCDR3区或其至少4、5、6、7或8个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可缺失或被不同氨基酸取代。CDR位置可以根据Kabat编号。
根据本公开的另一个示例性抗Nectin-4 VH和VL对是抗体6A7的VH和VL对，以下列出了其重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)，并且以下列出了其轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:51)。在具体的实施方案中，提供了基本上结合与单克隆抗体6A7相同的表位或决定簇的抗体；任选地，该抗体包含抗体6A7的高变区。在本文的任何实施方案中，抗体6A7可由氨基酸序列和/或编码其的核酸序列表征。在一个实施方案中，单克隆抗体包含6A7的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含6A7的重链可变区的抗体或抗体片段。根据一个实施方案，抗体或抗体片段包含6A7的重链可变区的三个CDR。还提供了进一步包含6A7的可变轻链可变区或6A7的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个CDR的抗体或抗体片段。任选地，HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以被指定为所有(或各自独立地)是Kabat编号系统的序列、Chotia编号系统的序列、IMGT编号系统或任何其它适合的编号系统的序列。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个轻链或重链CDR可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。
在一个方面，抗Nectin-4抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:50的VH结构域具有至少约60％、70％或80％的序列同一性、任选地至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的VH结构域。在另一个方面，抗Nectin-4抗体包含与SEQ ID NO:51的VL结构域具有至少约60％、70％或80％的序列同一性、任选地至少约85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的VL结构域。
任选地，VH和VL包含(例如，经修饰以掺入)人受体框架。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区的VH CDR1、CDR2和/或CDR3(例如，根据Kabat编号)。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区的VL CDR1、CDR2和/或CDR3(例如，根据Kabat编号)。在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体包含VH和VL，该VH包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且该VL包含具有SEQ IDNO:51的氨基酸序列的轻链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3。
6A7 VH：
QVQLKESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGHGLEWVGEIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTIDKSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCARSGNYDAMDYWGQGTSVTVSA
(SEQ ID NO:50)
6A7 VL：
DIVMTQAAFSSAVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPHFLIYQMSNLASGVPDRFTSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:51)
6A7 CDR：
Kabat：
抗Nectin-4抗体可例如包含：具有氨基酸序列：SYWMH(SEQ ID NO:52)的HCDR1或其至少4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：EIDPSDSYTNYNQKFKG(SEQ ID NO:53)的HCDR2或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：SGNYDAMDY(SEQ ID NO:54)的HCDR3或其至少4、5或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:55)的LCDR1或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：QMSNLAS(SEQ ID NO:56)的LCDR2区或其至少4、5或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；和/或具有氨基酸序列：AQNLELPWT(SEQ ID NO:57)的LCDR3区或其至少4、5、6、7或8个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可缺失或被不同氨基酸取代。CDR位置可以根据Kabat编号。
在任何方面，抗体或抗体片段(例如，10B12、6C11B、6A7或5E7)的指定的可变区、FR和/或CDR序列可包含一个或多个序列修饰，例如取代(1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、或更多个序列修饰)。在一个实施方案中，取代是保守修饰。
抗体的片段和衍生物(其被本申请中使用的术语“抗体(antibody或antibodies)”涵盖，除非另有说明或上下文明显矛盾)可以通过本领域已知的技术产生。“片段”包含完整抗体的一部分，通常为抗原结合位点或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双抗体；作为具有由连续氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的多肽的任何抗体片段(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽或含有轻链可变结构域的三个CDR而没有相关联的重链分子的其片段，以及(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽或含有重链可变区的三个CDR而没有相关联的轻链分子的其片段；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。尤其包含纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”。
抗Nectin-4抗体或抗体片段(例如可变区和/或CDR)可任选地体现为多特异性(例如双特异性)抗体或蛋白。例如，多特异性蛋白可包含本文的任何实施方案的抗体的高变区(例如，VH和VL)和不同抗体(例如，结合除Nectin-4以外的感兴趣的抗原的抗体)的高变区(例如，VH和VL)。
还涵盖由细胞表达的本公开的抗体或抗体片段，以及利用其治疗癌症的方法。例如，可构建表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞。CAR通常被工程化以包含与T细胞抗原受体复合物ζ链的胞内信号传导结构域融合的胞外单链抗体(scFv)，并且当在效应细胞，诸如T细胞或NK细胞中表达时，具有基于单克隆抗体的特异性重定向抗原识别的能力。在一个方面，提供了经基因工程化的免疫细胞，这些经基因工程化的免疫细胞在细胞表面膜上表达并携带Nectin-4特异性嵌合免疫受体，该嵌合免疫受体包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域(TM)和Nectin-4特异性胞外结构域(例如，衍生自或包含抗体或抗体片段或本公开的抗体的可变重链和轻链区域的结构域)。还提供了Nectin-4特异性嵌合免疫受体、对受体进行编码的DNA构建体以及含有处于适当朝向进行表达的构建体的质粒表达载体。
在一个实施例中，抗体是人源化的。“人源化”形式的抗体是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有衍生自鼠免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供体抗体)的CDR的残基替换，同时维持原始抗体所需的特异性、亲和力和能力。
在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或导入的CDR或框架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包括基本上全部至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于原始抗体的那些，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列中的那些。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等人,《自然(Nature)》,321,第522页(1986)；Reichmann等人,《自然(Nature)》,332,第323页(1988)；Presta,《当代结构生物学观点(Op.Struct.Biol.)》,2,第593页(1992)；Verhoeyen等人,《科学(Science)》,239,第1534页；和美国专利第4,816,567号，这些文献的全部内容以引用方式并入本文)。
用于制备人源化抗体的人可变结构域，轻链和重链两者的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库，筛选抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近小鼠的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》151,第2296页(1993)；Chothia和Lesk，《分子生物学杂志》(J.Mol.196,1987,第901页)。另一种方法使用来自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》89,第4285页(1992)；Presta等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,151,第2623页(1993))。
更重要的是，抗体是人源化的，保留对Nectin-4的高亲和力和其它有利的生物学性质。为了实现此目标，根据优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域的技术人员熟悉的。可获得计算机程序，其展示和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维结构。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从共有序列和输入序列中选择并组合FR残基，使得实现期望的抗体特性，诸如对靶抗原的亲和力增加。通常，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。在一个示例中，人源化抗体链的FR衍生自与非人供体(例如，5E7、10B12、6C11B或6A7抗体)的可变区具有至少约60％总体序列同一性，并且优选地至少约70％或80％总体序列同一性的人可变区。任选地，人源化重链和/或轻链可变区与非人供体(例如，5E7、10B12、6C11B或6A7抗体)的相应重链和/或轻链可变区共享至少约60％、70％或80％的总体序列同一性。制备“人源化”单克隆抗体的另一种方法是使用转基因鼠(XenoMouse)(Abgenix，Fremont，CA)作为用于免疫的小鼠。XenoMouse是一种小鼠宿主，其免疫球蛋白基因已被功能性人免疫球蛋白基因替换。因此，由此小鼠或由此小鼠的B细胞制备的杂交瘤产生的抗体已经人源化。转基因鼠描述于美国专利第6,162,963号中，其通过引用以其整体并入本文。人抗体也可以根据各种其它技术产生，如通过使用已经被工程化以表达人抗体库的其它转基因动物用于免疫(Jakobovitz等人，《自然(Nature)》362(1993)255)，或通过使用噬菌体展示方法从抗体库选择。此类技术是本领域的技术人员已知的，并且可以从本申请公开的单克隆抗体开始实施。
有利地，本公开的抗体可在用于制备抗体-缀合物的方法中使用。在一个实施方案中，用于制备抗体-缀合物的方法包括将细胞毒性剂(Z)与本公开的抗Nectin-4抗体或抗体片段缀合。在一个实施方案中，细胞毒性剂(Z)可以被指定为通过接头(X)与抗体或片段缀合。X是连接抗体或片段(Ab)和细胞毒性剂(Z)的接头，例如，在缀合时，X是与Ab和Z中一者或两者共价连接后的接头的残基。
在本文的实施方案中，用于制备抗体-药物缀合物的方法包括使本公开的抗Nectin-4抗体或抗体片段(Ab)与细胞毒性剂(Z)接触和/或反应的步骤。接触可在合适的条件下进行，使得形成或获得本公开的一个方面的抗体药物缀合物。Z可例如包含在包含细胞毒性剂(Z)和接头(X)或接头(X)的一部分的化合物中，使得该步骤包括使本公开的抗Nectin-4抗体或抗体片段与包含细胞毒性剂(Z)和接头(X)或接头(X)的一部分的化合物接触。方法可任选地指定以下步骤：分离或回收形成的抗体药物缀合物，以及任选地进一步加工该组合物以用作药物，任选地调配所述抗体(例如，与药物赋形剂一起)以施用于人类受试者。
任选地，制备ADC的方法包括将抗体或抗体片段与2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个细胞毒性剂分子缀合。任选地，所获得的组合物的特征在于，DAR介于2和4之间、介于4和6之间、介于6和8之间。任选地，方法包括将抗体与4个细胞毒性剂分子缀合。任选地，所述方法进一步包括评估DAR，并且如果DAR对应于预定规格(例如，本文公开的DAR或DAR范围，DAR约为2、4、6或8等)，则进一步加工所述组合物以用作药物，任选地调配所述抗体(例如，与药物赋形剂一起)以施用于人类受试者。
在一些实施方案中，在使包含(X)和(Z)的化合物与(Ab)接触(和反应)之前制备和分离接头(X)-(Z)元件，从而形成抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，方法包括：
(a)使接头(X)或接头(X)的一部分与(Ab)接触和/或反应以形成Ab-X缀合物，以及
(b)使步骤(a)的Ab-X与细胞毒性剂(Z)或包含接头(X)和(Z)的第二部分的化合物接触和/或反应，从而形成抗体药物缀合物。
X可以例如表示包括例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分的分子。在一个实施例中，X表示包括(i)间隔子(Y)、(ii)可切割部分和(iii)任选的自消除或非自消除间隔子系统(Y')的分子。所述可切割部分可以例如是寡肽(例如二肽、三肽、四肽或五肽)。所述间隔子Y可以定位在Ab和所述可切割部分之间，并且所述间隔子系统(Y')可以定位在所述可切割部分和Z之间。
在一些实施例中，接头X或间隔子Y可以任选地被指定为包括反应性基团(R)，所述反应性基团能够与抗体的氨基酸或与附接至所述抗体的氨基酸的互补反应性基团(R')反应(例如在合适的条件下，任选地在脱保护之后)。任选地，R是与抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基具反应性的基团。例如，R可以是具有以下结构的马来酰亚胺-N-基，该基团与抗体上的硫醇基(也称为巯基)反应：
在一些实施例中，接头X或间隔子Y可以任选地被指定为包括反应性基团R与抗体的氨基酸或与附接至所述抗体的氨基酸的互补反应性基团(R')反应的残基。任选地，R是与抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基具反应性的基团与所述游离氨基、羟基、巯基或羧基反应的残基。
在任何实施方案中，在使抗Nectin-4抗体或抗体片段与化合物(例如接头和/或细胞毒性剂)接触和/或反应的步骤之前，方法包括制备、选择或提供抗Nectin-4抗体或抗体片段的步骤。在一个实施方案中，该步骤包括制备、选择或提供抗Nectin-4抗体或抗体片段，以及确定或测试该抗体或抗体片段是否具有本公开的抗Nectin-4抗体或抗体片段的特征。
例如，可测试抗Nectin-4抗体或抗体片段与Nectin-4的VC1桥接结构域结合的能力。然后使确定与Nectin-4的VC1桥接结构域结合的抗体或抗体片段与化合物(例如，接头(X)和/或细胞毒性剂(Z))接触和/或反应。例如，可测试抗Nectin-4抗体或抗体片段与突变体Nectin-4多肽(例如，包含残基Q234、K197和/或S199处的取代的突变体Nectin-4多肽)结合的能力。然后使确定与突变体Nectin-4多肽的结合减少或丧失(例如，相比于与野生型Nectin-4多肽的结合)的抗体或抗体片段与化合物(例如接头(X)和/或细胞毒性剂(Z))接触和/或反应。
在另一个示例中，可测试抗Nectin-4抗体或抗体片段降低Nectin-4表达性肿瘤细胞(例如，粘附性肿瘤细胞)之间的细胞间粘附的能力和/或降低Nectin-4表达性肿瘤细胞的生长的能力(例如，在三维细胞培养物中，在肿瘤球状体形成测定中)。然后使确定具有降低Nectin-4表达性肿瘤细胞之间的细胞间粘附的能力和/或减少Nectin-4表达性肿瘤细胞(例如，粘附性肿瘤细胞)的生长的能力的抗体或抗体片段与化合物(例如，接头(X)和/或细胞毒性剂(Z))接触和/或反应。
在另一个示例中，可测试抗Nectin-4抗体或抗体片段使肿瘤对细胞毒性剂(例如，细胞毒性剂Z或与Z相同类别的药物，例如喜树碱剂)敏化的能力。然后使确定具有使肿瘤对细胞毒性剂敏化的能力的抗体或抗体片段与化合物(例如，接头(X)和/或细胞毒性剂(Z))接触和/或反应。
任选地，方法可包括在使抗体与化合物(例如，接头(X)和/或细胞毒性剂(Z))接触之前的任何两个或更多个抗体测试步骤。
如本文进一步描述的，用于将细胞毒性药剂与抗体缀合的一些众所周知的方法涉及多个反应步骤，其中首先用接头或接头的一部分修饰抗体，然后进行使细胞毒性药剂与抗体-接头组合物缀合的反应。
在一个实施方案中，提供了一种用于制备抗体-缀合物的方法，该方法包括：
(i)通过培养用表达载体转化的宿主细胞来获得抗Nectin-4抗体，该表达载体含有编码抗体的多核苷酸；从获自先前步骤中的培养物中收集并纯化感兴趣的抗体，
(ii)使抗Nectin-4抗体或抗体片段与化合物(L)接触，该化合物(L)包含(a)能够与抗体的氨基酸(例如，氨基酸的侧链或聚糖，或附接至氨基酸或氨基酸的聚糖的基团)反应的第一反应性基团和(b)第二反应性基团(R')，以获得包含用化合物(L)官能化的一个或多个氨基酸的经修饰的抗体；以及
(iii)使步骤(i)的经修饰的抗体与包括以下各项的化合物反应：(a)与反应性基团(R')互补的反应性基团(R)；(b)被细胞内肽酶或蛋白酶切割的氨基酸单元(例如二肽、三肽、四肽或五肽)；(c)任选的非自消除或自消除间隔子(Y')；以及(d)细胞毒性剂(Z)。任选地，步骤(ii)的化合物进一步包括置于R和氨基酸单元之间的间隔子(Y)。
任选地，获得抗Nectin-4抗体的步骤可进一步包括以下步骤：通过注射抗原使动物免疫来制备抗体产生细胞，收集血液，测定其抗体滴度以确定何时切除脾；制备骨髓瘤细胞；将抗体产生细胞与骨髓瘤融合；筛选产生期望抗体的杂交瘤组；将杂交瘤分成单细胞克隆(克隆)；培养杂交瘤或饲养植入杂交瘤的动物，以产生大量单克隆抗体；和/或检查由此产生的单克隆抗体的生物活性和结合特异性，或测定其作为标记试剂的性质；等。
任选地，获得抗Nectin-4抗体的步骤可进一步包括制备细胞文库的步骤。
在一个实施方案中，R和R'能够进行点击反应或环加成，任选地其中R包含或为炔烃部分并且R'包含或为叠氮化物部分，或者其中R'包含或为炔烃部分并且R包含或为叠氮化物部分，并且其中步骤(ii)的反应是1,3-偶极环加成。
在一个实施例中，步骤(i)的反应在存在催化剂的情况下进行，任选地所述催化剂是酶(例如，转谷氨酰胺酶)。
在一个实施例中，在使抗Nectin-4抗体或抗体片段与化合物(L)接触之前，步骤(i)包括修饰抗Nectin-4抗体或抗体片段的步骤。例如，可以通过使抗体或抗体片段与能够修饰抗体糖基化的酶反应或接触来修饰所述抗体或抗体片段(例如，在Kabat残基N297处)。在一个实例中，所述修饰包括在存在内切糖苷酶的情况下对具有核心N-乙酰氨基葡糖的抗体聚糖进行去糖基化，以获得包括核心N-乙酰氨基葡糖取代基的抗体，其中所述核心N-乙酰氨基葡糖和所述核心N-乙酰氨基葡糖取代基任选地被岩藻糖基化。内切糖苷酶的示例包括EndoS、EndoA、EndoE、Endo18A、EndoF、EndoM、EndoD、EndoH、EndoT和EndoSH和/或它们的组合。
抗原结合蛋白(例如抗体)分子和细胞毒性剂(例如，喜树碱衍生物分子)通过接头连接。在此类实施例中，所述免疫缀合物可以例如由式(II)表示：
Ab–(X–(Z)n)m 式(II)
其中，
Ab是抗Nectin 4抗体或抗体片段)；
X是连接Ab和Z的接头，例如，与Ab和Z中一者或两者共价连接后的接头的残基；
Z是细胞毒性剂，例如喜树碱类似物，任选地Z包含化合物1或2的结构(依喜替康或SN-38分子)；
n为1或2；并且
当n为1时，m为1至8，或任选地m为选自1至8或1至6的整数，任选地m为选自1至4的整数，任选地m为2或4；任选地，m为2、3、4、5、6、7或8；并且当n为2时，m为1至4，或任选地m为选自1至4或1至3的整数，任选地m为选自1至4的整数，任选地m为2或4；任选地，m为1、2、4或4。任选地，“n”可以被指定为表示支化度或聚合度。“n”和“m”可以被指定为表示包括多种抗体的组合物中的平均值。
在一个实施例中，X表示包括例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分的分子。在一个实施例中，X表示包括(i)间隔子(Y)、(ii)可切割部分和(iii)任选的自消除或非自消除间隔子系统(Y')的分子。所述间隔子Y可以定位在Ab和所述可切割部分之间，并且所述间隔子系统(Y')可以定位在所述可切割部分和Z之间。分子X或间隔子Y可以任选地被指定为包括反应性基团(R)或反应性基团R与抗体的氨基酸或与附接至抗体的氨基酸的互补反应性基团(R')反应的残基。
变量m表示免疫缀合物中每个抗体分子的–X–(Z)n部分的数量。在包括多个抗Nectin-4 ADC的组合物中，每个抗体分子的-X-Z部分的数量“m”可以变化。因此，在包括多个本文化学式的免疫缀合物的示例性组合物中，m是每个Ab的–X–(Z)n部分的平均数量，在这种情况下，m也可以被称为平均载药量或药物:抗体比率(DAR)。平均载药量或DAR可以有利地在每个Ab 1个到约8个(–X–(Z)n)部分的范围内。与部分X附接的Z部分的数量“n”可以例如为1或2。通常，n为1。在一些实施例中，n为1，并且m表示平均载药量，m介于2和8之间。在一些实施方案中，n为1，并且m表示平均载药量，m介于2和6之间。在一些实施方案中，n为1，并且m表示平均载药量，m介于4和8之间。在一些实施例中，n为1，并且m表示平均载药量，m介于6和8之间，任选地为约6、7或8。在一些实施方案中，n为1，并且m表示平均载药量，m介于4和6之间，任选地为约4、5或6。
每个Ab的(–X–Z)部分的数量可以通过常规方法表征，如质谱法、ELISA测定法和HPLC。还可以确定免疫缀合物关于m的定量分布。在一些情况下，可以通过如反相HPLC或电泳等手段来实现其中m为特定值的均质免疫缀合物的分离、纯化和表征，以区别于具有其它载药量的免疫缀合物。
在一个实施方案中，用于本公开的治疗方法的抗Nectin-4组合物的特征在于包含多个由式(I)表示的免疫缀合物：
Ab–(X–(Z)n)m 式(II)
其中，
Ab是抗Nectin-4抗原结合蛋白(例如抗体或抗体片段)；
X是连接Ab和Z的分子，例如，与Ab和Z中一者或两者共价连接后的接头的残基；
Z是细胞毒性剂，任选地拓扑异构酶抑制剂，任选地喜树碱类似物，任选地包含依喜替康或SN-38分子(例如，具有化合物1或2的结构的分子)的喜树碱类似物；
n为1或2；并且
其中抗体样品中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物的m(X-Z部分的数量)为2或4、至少2、介于2和4之间、至少4、介于4和6之间或介于4和8之间，任选地其中n为1，并且抗体样品中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物的m(X-Z部分的数量)为2或4、至少2、介于2和4之间、至少4、介于4和6之间或介于4和8之间。
在一个实施方案中，用于本公开的治疗方法的抗Nectin-4组合物的特征在于包含多个由式(I)表示的免疫缀合物：
Ab–(X–(Z)n)m 式(II)
其中，
Ab是抗Nectin-4抗原结合蛋白(例如抗体或抗体片段)；
X是连接Ab和Z的分子，例如，与Ab和Z中一者或两者共价连接后的接头的残基；
Z是喜树碱类似物，其包括依喜替康或SN-38分子的分子，例如包括化合物1或2的结构的分子；
n为1；并且
其中抗体样品中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物的m(X-Z部分的数量)为6、至少6、介于6和8之间或8。
应当理解，多种方法可用于将包含细胞毒性剂的接头与抗体或抗原结合蛋白共价连接，非特异性或特异性连接至特定氨基酸残基。接头(X)可包含例如在生理条件下，任选地如实施例中所示在细胞内条件下可切割的部分，使得接头的切割在细胞内环境中释放细胞毒性剂(例如，化合物1、化合物2、化合物13等)。接头可以与抗体分子上的化学反应性基团结合，例如与游离氨基、亚氨基、羟基、硫醇或羧基结合(例如，结合至N末端或C末端、结合至一个或多个赖氨酸残基的ε氨基、一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基团、或结合至一个或多个半胱氨酰残基的巯基)，与碳水化合物结合，或通常与引入或工程化到抗体中的任何反应性基团结合。与接头结合的位点可以是抗体分子氨基酸序列中的天然残基，或者可以将其引入抗体分子中，例如通过DNA重组技术(例如，通过在氨基酸序列中引入半胱氨酸或蛋白酶切割位点，通过引入非天然氨基酸残基)或通过蛋白质生物化学(例如，还原、pH调节或蛋白水解，通过糖工程、氨基酸结合聚糖的酶促修饰)。
在一些实施方案中，接头(X)包含肽残基，这些肽残基包含选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸，任选地接头(X)包含四肽残基。
在某些实施例中，作为接头(X)的前体的中间体在适当条件下与细胞毒性药剂(Z)反应。在某些实施例中，在细胞毒性药剂和/或中间体上使用反应性基团。在一些实施例中，细胞毒性药剂与中间体或衍生的细胞毒性药剂之间的反应产物随后在适当条件下与抗体分子反应。在其它实施例中，接头(X)的前体首先在适当的条件下与抗体分子反应以产生与接头(X)的前体结合的抗体，所述抗体随后与包括细胞毒性药剂(Z)的分子反应。
在一些实施例中，接头(X)可被存在于细胞内环境中(例如，在溶酶体或内体或小窝内)的切割剂切割。接头可以包括例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包含但不限于溶酶体或内体蛋白酶)切割的肽基接头或氨基酸单元。在一些实施例中，肽基接头部分是至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。切割剂可以包含组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知所有这些都会水解二肽药物衍生物，从而在靶细胞内释放活性药物。最典型的是可被细胞中存在的酶切割的肽基接头。在一个具体的实施方案中，能够被细胞内蛋白酶切割的肽基接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见例如，美国专利第6,214,345号，其描述了多柔比星与缬氨酸-瓜氨酸接头的合成)。缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)元件可以具有如下所示的结构：
在另一个具体实施例中，可被细胞内蛋白酶切割的肽基接头是缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)接头。val-ala元件可以具有如下所示的结构：
在另一个具体的实施方案中，能够被细胞内蛋白酶切割的肽基接头是含有甘氨酸的寡肽接头，例如含有甘氨酸和苯丙氨酸的寡肽接头，任选地GGF、DGGF、(D-)D-GGF、EGGF、SGGF、KGGF、DGGFG、DDGGFG、KDGGFG、GGFGGGF GGFG、GGFGG或GGFGGG接头(参见例如，美国专利第6,835,807号，其公开内容通过引用并入本文)，其中“(D-)D”表示D-天冬氨酸。
在一些实施方案中，接头还可用作间隔子或延伸物以使抗体与Z保持距离，以便避免干扰抗体结合Nectin-4和/或抑制由Nectin-4介导的细胞间相互作用的能力。接头可以包括间隔子单元(Y)和/或间隔子或间隔子系统(Y')。因此，间隔子Y可以定位在Ab和可切割部分之间。间隔子系统(Y')可定位在可切割部分和Z之间。分子X或间隔子Y可任选地被指定为包含反应性基团(R)或反应性基团R与抗体的氨基酸或与附接至抗体的氨基酸的互补反应性基团(R')反应的残基。间隔子Y可例如是与抗体的氨基酸(例如，抗体的硫原子、伯氨基或仲氨基或碳水化合物基团)形成键(例如，通过其反应性基团R)的分子，并且间隔子或延伸物(Y)将抗体连接至细胞毒性剂(Z)或可切割的氨基酸单元(例如，肽基接头、可切割的二肽、三肽、四肽或五肽)，可切割的氨基酸单元任选地进一步具有自消除和/或非自消除间隔子(Y')，其进而连接至Z。因此，当间隔子(Y)的一端与氨基酸单元(例如，可切割的二肽、三肽、四肽或五肽)连接时，可切割的氨基酸单元可以进而直接连接至Z或者可包含额外的间隔子(Y')，诸如连接氨基酸单元和Z的非自消除或自消除间隔子。
间隔子(Y)可以任选地被指定为或包括经取代或未经取代的烷基或杂烷基链，任选地其中Y的链长为2-100个原子，任选地2-40个、2-30个、2-20个、4-40个、4-30个或4-20个原子，任选地其中一个或多个原子可以不是碳，例如是氧、硫、氮或其它原子，任选地其中链的任何碳被烷氧基、羟基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代。
间隔子(Y)可以任选地被指定为包括稳定性增强部分。例如，间隔子Y可以在接头设计中正交聚乙二醇(PEG)部分或聚肌氨酸(聚-N-甲基甘氨酸或PSAR)部分(参见例如，WO2019/081455、WO2015/057699和WO2016/059377，其公开内容通过引用并入本文)。
在一些具体实施例中，间隔子(Y)可以包括一个或多个环氧乙烷单体，任选地Y包括聚环氧乙烷部分，任选地Y包括1到24个、任选地1到12个、任选地1到8个、任选地1到6个聚环氧乙烷部分，任选地Y包括结构-(CH2CH2O)x-，其中x为1到12，任选地1到8，任选地1到6。
合适的稳定性增强部分的实例，间隔子链Y，可以包括在PCT公开号WO2015/057699或WO2019/081455中公开的稳定性增强部分。例如，间隔子链Y可以包括正交连接子部分和稳定性增强部分。稳定性增强部分可以是PEG均聚物，或通常是结合到正交连接子部分的任何单一分子量均聚物(例如PEG或聚肌氨酸均聚物)。均聚物可具有例如1-4个、1-6个、1-8个、1-10个、1-12个、至少6个、8个或10个，或6-12个、6-24个、6-72个PEG单元或其它单体。术语正交连接子是指将接头部分(例如，间隔子Y的链)连接至均聚物单元并通过接头(例如，可切割的寡肽(Pep)和间隔子Y')连接到细胞毒性剂(Z)以使均聚物单元相对于细胞毒性剂处于平行构型(与串联构型相反)(均聚物与Pep-Y'-Z部分平行)的支链接头单元组件。正交连接子部分可以例如是一种或多种天然或非天然氨基酸，其任选地选自谷氨酸、赖氨酸和甘氨酸。任选地，氨基酸正交连接子部分置于间隔子链Y的末端，使得正交连接子部分氨基酸残基通过一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基之间的肽键连接到肽基接头的氨基酸残基(例如，式V或VI中的(Pep))。Y可以例如包括正交连接子部分与式D的部分反应的结果：
其中R1和R2不同，并且
R1和R2中的一者是H或惰性基团，R1和R2中的另一者是功能化反应性基团，所述基团对于与正交连接子部分的可结合基团共价结合是反应性的，在惰性基团是非反应性的此类反应条件下，Z1和Z2，相同或不同，是任选的间隔子，并且n为1或更大并且k为2或更大。
在另一个示例中，间隔子Y包含美国专利公布第US2017/0072068A1号(其公开内容通过引用并入本文)中公开的基团，例如根据式(E)或其盐的基团：
其中
a为0或1；并且
R1选自由以下组成的组：氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，这些C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被选自O、S和NR3的一个或多个杂原子取代并任选地被所述一个或多个杂原子中断，其中R3独立地选自由氢和C1-C4烷基组成的组；并且其中根据式E或其盐的基团位于间隔子链Y的所述第一端和第二端之间。
根据此方面，间隔子Y可包含-(琥珀酰亚胺-3-基-N)—CH2CH2—C(═O)—、-(琥珀酰亚胺-3-基-N)—CH2CH2CH2—C(═O)—、-(琥珀酰亚胺-3-基-N)—CH2CH2CH2CH2—C(═O)—、-(琥珀酰亚胺-3-基-N)—CH2CH2CH2CH2CH2—C(═O)—。
任选地，此类间隔子Y可进一步包含以下结构：—NH—(CH2CH2—O)n-CH2CH2—C(═O)—，其中n为1至6、优选地2至4的整数。此类结构包括例如—NH—CH2CH2—O—CH2CH2—C(═O)—、—NH—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—C(═O)—、—NH—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—C(═O)—、—NH—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—C(═O)—、—NH—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—C(═O)—、—NH—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—O—CH2CH2—C(═O)—。
放置在氨基酸单元(例如可切割的二肽、三肽、四肽或五肽)和Z之间的间隔子或间隔子系统(Y')可以是自消除或非自消除的。例如，间隔子Y'可以包括经取代或未经取代的烷基或杂烷基链，任选地其中Y的链长为2-30个原子，任选地2-20个、4-20个、2-10个或4-20个原子，任选地其中一个或多个原子可以不是碳，例如是氧、硫、氮或其它原子，任选地其中链的任何碳被烷氧基、羟基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代。在一个实施例中，Y'包括对氨基苄氧羰基。在一个实施方案中，Y'是非自消除间隔子并且包含-(CH2)n-C(═O)—的结构，其中n为0至5的整数，所述结构通过–O-或单键连接至可切割部分。例如，Y'可以是或可以包括–C(＝O)–、–O–C(＝O)–、–O–CH2–C(＝O)–、–O–CH2CH2–C(＝O)–、–O–CH2CH2CH2–C(＝O)–、–O–CH2CH2CH2CH2–C(＝O)–、–O–CH2CH2CH2CH2CH2–C(＝O)–、HO–O–CH2–C(＝O)–、–CH2–C(＝O)–、–CH2CH2–C(＝O)–、–CH2CH2CH2–C(＝O)–、–CH2CH2CH2CH2–C(＝O)–、–CH2CH2CH2CH2CH2–C(＝O)–、–CH2–O–CH2–C(＝O)–或–CH2CH2–O–CH2–C(＝O)集团。
“自消除”间隔子单元允许药物部分的释放，而无需单独的水解步骤。当使用自消除间隔子时，在氨基酸单元的切割或转化后，间隔子的与氨基酸单元连接的一侧变为未封闭，这导致最终释放一个或多个部分Z。自消除间隔子系统可以例如是在WO02/083180和WO2004/043493(其公开内容通过引用整体并入本文)中描述的那些自消除间隔子系统，以及本领域技术人员已知的其它自消除间隔子。在某些实施例中，接头的间隔子单元包括对氨基苄基单元。在一个此类实施例中，对氨基苯甲醇通过酰胺键附接到氨基酸单元，并且在苯甲醇和细胞毒性药剂之间制备氨基甲酸酯、氨基甲酸甲酯或碳酸酯。在一个实施方案中，间隔子单元是例如具有以下结构的对氨基苄氧羰基(PAB)：
自消除间隔子单元的实例进一步包含但不限于在电子上与对氨基苯甲醇相似的芳香族化合物(参见例如，US 2005/0256030 Al)，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等人(1999)《生物有机化学与医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)》和邻氨基苄基缩醛或对氨基苄基缩醛。可以使用间隔子在酰胺键水解时进行环化，如经取代和未经取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人,《化学生物学(Chemistry Biology)》,1995,2,223)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人,《有机化学杂志(J.Org.Chem.)》,1990,55.5867)。消除在甘氨酸的α位被取代的含胺药物(Kingsbury等人,《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》,1984,27,1447)也是自消除间隔子的示例。对氨基苄基自消除间隔子(例如，PAB)特别适合与Phe-Lys、Val-Ala或Val-Cit可切割的二肽单元一起使用(PAB置于二肽和喜树碱衍生物(Z)之间)。
“非自消除”间隔子单元是这样一种间隔子单元，其中部分或全部间隔子单元在抗体-感兴趣的部分缀合物的酶促(例如，蛋白水解)切割时保持与部分Z结合。适合用作Gly-Gly-Phe-Gly氨基酸单元和依喜替康分子之间的间隔子的非自消除间隔子单元的实例包含但不限于包含–O–CH2–C(＝O)–、HO–O–CH2–C(＝O)–、–CH2CH2–C(＝O)–、–CH2CH2CH2–C(＝O)–、–CH2–O–CH2–C(＝O)–和–CH2CH2–O–CH2–C(＝O)–(例如，以形成GGFG–CH2CH2–O–CH2–C(＝O)–依喜替康单元)。在GGFG氨基酸单元和依喜替康之间使用此种间隔子导致具有化合物13的结构的分子的释放。非自消除间隔子单元的其它实例包含但不限于甘氨酸间隔子单元和甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。可以以类似方式使用对序列特异性酶促切割敏感的肽间隔子的其它已知组合。例如，肿瘤细胞相关蛋白酶对含有甘氨酸-甘氨酸间隔子单元的抗体-所关注部分缀合物的酶促切割将导致甘氨酸-甘氨酸-药物部分从抗体-所关注部分缀合物的剩余部分释放。在一个此类实施例中，甘氨酸-甘氨酸-药物部分随后在肿瘤细胞中经历单独的水解步骤，从而将甘氨酸-甘氨酸间隔子单元从药物部分上切割下来。
示例性的接头-细胞毒性药物部分(X-Z)可包含下式III和IV中所示的任何结构。
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间隔子(Y)和(Y')可以任选地被指定为独立地选自由以下组成的组：直链或支链C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基、C2-C20亚炔基、C3-C20亚环烷基、C5-C20亚环烯基、C8-C20亚环炔基、C7-C20烷基亚芳基、C7-C20芳基亚烷基、C8-C20芳基亚烯基和C9-C20芳基亚炔基，这些亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被选自由O、S和NR1组成的组的一个或多个杂原子取代并任选地被该一个或多个杂原子中断，其中R1独立地选自由以下组成的组：氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，这些烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
间隔子(Y)和(Y’)可任选地被指定为是或包含C1-C10亚烷基-、-C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10杂亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10杂亚烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10杂亚烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8烷基)-)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-O-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-O-C(＝O)-、-亚芳基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-O-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-O-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-O-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-，这些基团在每种情况下被选自以下的取代基中的一种或多种取代基取代：-X、-R'、-O、-OR'、＝O、-SR'、-S-、-NR'2、-NR'3 +、＝NR'、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NR'C(＝O)R'、-C(＝O)R'、-C(＝O)NR'2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R'、-OS(＝O)2OR'、-S(＝O)2NR'、-S(＝O)R'、-OP(＝O)(OR')2、-P(＝O)(OR')2、-PO3、-PO3H2、-C(＝O)X、-C(＝S)R'、-CO2R'、-CO2、-C(＝S)OR'、C(＝O)SR'、C(＝S)SR'、C(＝O)NR'2、C(＝S)NR'2和C(＝NR')NR'2，其中每个X独立地为卤素：-F、-Cl、-Br或-I；并且每个R'独立地为-H、-C1-C20烷基、-C6-C20芳基或-C3-C14杂环。
在一个实施方案中，间隔子(Y)可任选地被指定为例如在链的一端包含与抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基或碳水化合物反应的反应性基团(R)。在一些方面，间隔子Y包含R基团–(琥珀酰亚胺-3-基-N)--(CH2)n 3-C(＝O)，其中n3是2至8的整数，并且–(琥珀酰亚胺-3-基-N)-具有由以下式F表示的结构:
以上结构的位置3可以是与抗体的连接位置。在位置3与抗体的键的特征在于通过形成硫醚进行键合。
在一个实施方案中，间隔子(Y)可任选地被指定为例如在链的一端包含：反应性基团(R)，该反应性基团与附接至抗体的氨基酸(例如，通过游离氨基、羟基、巯基或羧基或碳水化合物)的互补反应性基团(R')具有反应性；或在与抗Nectin-4抗体缀合时，反应性基团(R)与抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基或与附接至抗体的氨基酸的互补反应性基团(R')反应的残基。反应性基团对R和R'的实例包含一系列基团，这些基团能够进行双正交反应，优选地环加成，例如Diels-Alder反应或1,3-偶极环加成，例如在叠氮化物和环辛炔之间(无铜点击化学)、在硝酮和环辛炔之间，由醛和酮形成肟/腙以及四嗪连接(另见WO2013/092983或US2017/0072068A1，其公开内容通过引用并入本文)。例如，R可以是炔烃并且R'可以是叠氮化物，或者R可以是叠氮化物并且R'可以是炔烃。所得接头和官能化抗体或其Y元件因此在任何实施例中可以包括由R和R'反应产生的基团(RR')，例如RR'可以是或包括由炔烃和叠氮化物反应产生的三唑。
在一个实施例中，反应性基团R和R'是互补的试剂，它们一起能够进行“点击”反应(即，点击化学试剂或反应性基团)。例如，1,3-偶极官能化合物可以在环化反应中与炔烃反应形成杂环化合物，优选地在基本上不存在添加的催化剂(例如，Cu(I))的情况下。具有与其附接的至少一个1,3-偶极基团的多种化合物(具有含有在三个原子上离域的4个电子的三原子π电子系统)可用于与本文公开的炔烃反应。示例性的1,3-偶极基包含但不限于叠氮化物、腈氧化物、硝酮、偶氮氧基和酰基重氮基。
实例包含邻膦芳酸酯、叠氮化物、雷酸盐、炔烃(包含任何应变环炔烃)、氰化物、蒽、1,2,4,5-四嗪或降冰片烯(或其它应变环烯烃)。
在一个实施方案中，R是具有末端炔烃或叠氮化物的部分；此类部分描述于例如美国专利第7,763,736号中，其公开内容通过引用并入本文。使用铜(和其它金属盐)作为末端炔烃和叠氮化物之间的点击反应催化剂的合适反应条件在美国专利第7,763,736号中公开。
在一个实施例中，R是经取代或未经取代的环炔烃。包含特定化合物的环炔烃描述于例如美国专利第7,807,619号中，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，环炔烃可以是式A化合物：
其中：
R1选自羰基、烷基酯、芳基酯、经取代的芳基酯、醛、酰胺、芳基酰胺、烷基卤化物、硫酯、磺酰酯、烷基酮、芳基酮、经取代的芳基酮和卤代磺酰基；
R1可以在环辛炔基团上的任何位置，而不是在通过三键连接的两个碳上。
在一些实施例中，经修饰的环炔烃具有式A，其中环辛炔环中的一个或多个碳原子，除了通过三键连接的两个碳原子之外，被一个或多个吸电子基团取代，例如，卤素(溴、氯、氟、碘)、硝基、氰基、砜基或磺酸基。因此，例如，在一些实施例中，主题经修饰的环炔烃具有式B：
其中：
R2和R3各自独立地为：(a)H；(b)卤素原子(例如，溴、氯、氟、碘)；(c)-W-(CH2)n-Z(其中：n是1-4的整数(例如，n＝1、2、3或4)；W，如果存在，是O、N或S；并且Z是硝基、氰基、磺酸或卤素)；(d)-(CH2)n-W-(CH2)m-R4(其中：n和m各自独立地为1或2；W是O、N、S或磺酰基；如果W是O、N或S，则R4是硝基、氰基或卤素；并且如果W是磺酰基，则R4是H)；或(e)-CH2)n-R4(其中：n是1-4的整数(例如，n＝1、2、3或4)；并且R4是硝基、氰基、磺酸或卤素)；并且
R1选自羰基、烷基酯、芳基酯、经取代的芳基酯、醛、酰胺、芳基酰胺、烷基卤化物、硫酯、磺酰酯、烷基酮、芳基酮、经取代的芳基酮和卤代磺酰基。R1可以在环辛炔基团上的任何位置，而不是在通过三键连接的两个碳上。
在一个实施例中，R是经取代或未经取代的杂环应变炔烃。包括特定化合物的环炔烃描述于例如美国专利第8,133,515号中，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施例中，炔烃具有式C：
其中：
每个R1独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐和C1-C10烷基或杂烷基；
每个R2独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐和C1-C10有机基团；X表示N-R3R4、NH-R4、CH-N-OR4、C-N-NR3R4、CHOR4或CHNHR4；并且每个R3表示氢或有机基团，并且R4表示接头的连接部分C。在一个实施例中，R或R'是以下DBCO(二苄基环辛基)基团：
如上文所述的那些炔烃可以在环化反应中与至少一种1,3-偶极官能化合物反应形成杂环化合物，优选地在基本上不存在添加的催化剂(例如，Cu(I))的情况下。具有与其附接的至少一个1,3-偶极基团的多种化合物(具有含有在三个原子上离域的4个电子的三原子π电子系统)可用于与本文公开的炔烃反应。示例性的1,3-偶极基包含但不限于叠氮化物、腈氧化物、硝酮、偶氮氧基和酰基重氮基。
在本文的化学式中，Y'可以任选地不存在或可以是间隔子，任选地为自消除间隔子，例如包含对氨基苄基单元，或非自消除间隔子。任选地，Y'为或包括经取代或未经取代的烷基或杂烷基链，任选地其中Y的链长为2-40个原子，任选地2-30个、2-20个、4-40个、4-30个或4-20个原子，任选地其中一个或多个原子可以不是碳，例如是氧、硫、氮或其它原子，任选地其中链的任何碳被烷氧基、羟基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代。
可以与抗Nectin-4抗体缀合的示例性接头-细胞毒性剂分子(例如，式I到XI的X-Z部分)可以任选地由式V表示：
(R)–(Y)–(Pep)–(Y’)–(Z)式(V)
其中，
R是与抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基具反应性或与附接至抗体的氨基酸的互补反应性基团(R')具反应性的基团，或在与抗Nectin-4结合蛋白缀合时，R是反应性基团(R)与抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基或与附接至抗体的氨基酸的互补反应性基团(R')反应的残基；
Y任选地不存在或者是间隔子；
Pep是或包括被细胞内肽酶或蛋白酶切割的肽基接头，例如缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸二肽；
Y'任选地不存在或者是间隔子，任选地是自消除间隔子或非自消除间隔子；并且
Z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地是依喜替康分子、Dxd或SN-38分子。
根据本发明的所得Nectin-4结合性免疫缀合物可以例如由式(VI)表示：
Ab–(Y)–(Pep)–(Y’)–(Z)式(VI)
其中，
Ab是抗Nectin-4抗体；
Y任选地不存在或者是间隔子。任选地，式VI在(Ab)和(Y)之间包含反应性基团(例如，马来酰亚胺、伯胺)与抗Nectin-4抗原结合蛋白(Ab)的氨基酸的侧链或碳水化合物反应的残基。任选地，反应性基团(例如马来酰亚胺、伯胺)与抗Nectin-4抗原结合蛋白(Ab)的氨基酸的侧链反应的残基可以被指定为包括在Y中；
Pep是或包括被细胞内肽酶或蛋白酶切割的氨基酸单元(例如肽基接头)(例如，(Pep)是蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，例如缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸单元)；
Y'任选地不存在或者是间隔子，任选地是自消除间隔子或非自消除间隔子；并且
Z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱衍生物，任选地是依喜替康分子、Dxd或SN-38分子。
任选地，该式可以被指定为(例如，在(Ab)和Y(或(Pep或X)，如果Y不存在的话)的末端之间)包含反应性基团(R)与抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基或与附接至抗体的氨基酸的互补反应性基团(R')反应的残基(RR')。
在一个实例中，其中(RR')是反应性基团(R)与附接至抗体的互补反应性基团(R')反应的残基(例如R'附接至抗体的氨基酸的侧链或聚糖)，根据本发明的Nectin-4结合性免疫缀合物可以例如由式(VIbis)表示：
Ab–(RR’)–(Y)–(Pep)–(Y’)–(Z) 式(VIbis)
其中，Ab、Y、Pep、Y'和Z如式VI中所定义，并且RR'是双正交反应(优选地环加成，例如Diels-Alder反应或1,3-偶极环加成)的结果。在一个实施例中，RR'具有选自由以下组成的组的结构：
其中X8为O或NH，X9选自H、甲基和吡啶基，并且在结构(RR’c)和(RR’d)中，键表示单键或双键。
在任何实施方案中，依喜替康分子(或其它6环喜树碱)可以被指定为通过依喜替康的位置1处的胺与Y'(或(Pep)，如果Y'不存在的话)结合。
在任何实施方案中，SN-38分子(或其它5环喜树碱)可以被指定为通过SN-38的位置9处的胺与Y'(或(Pep)，如果Y'不存在的话)结合。
细胞毒性剂，也称为(Z)部分，包括例如细胞毒性剂，诸如抗肿瘤剂。细胞毒性剂的示例是本领域已知的。例如，Z可以是烷化剂，优选地DNA烷化剂。烷化剂是可以在生理条件下(例如，pH 7.4、37℃、水溶液)用烷基替换氢原子的化合物。烷化反应通常根据N、O和S杂原子亲核试剂与亲电子烷化剂的取代反应来描述，但迈克尔加成反应也是重要的。烷化剂的示例包括氮芥和硫芥、乙烯亚胺、甲磺酸盐、CC-1065和倍癌霉素、亚硝基脲、含铂剂、实现拓扑异构酶II介导的DNA位点依赖性烷化的剂(例如普梭草素(psorospermin)和相关双呋喃并氧杂蒽酮(bisfuranoxanthone))、海鞘素和其它或相关DNA小沟烷化剂。
在一个实施方案中，Z是螯合的金属，诸如配位数为2至8(包括端值)的正二价或正三价金属的螯合物。此类金属的特定示例包括锝(Tc)、铼(Re)、钴(Co)、铜(Cu)、金(Au)、银(Ag)、铅(Pb)、铋(Bi)、铟(In)、镓(Ga)、钇(Y)、铽(Tb)、钆(Gd)和钪(Sc)。一般来讲，金属优选为放射性核素。特定的放射性核素包括99mTc、186Re、188Re、58Co、60Co、67Cu、195Au、199Au、110Ag、203Pb、206Bi、207Bi、111In、67Ga、68Ga、88Y、90Y、160Tb、153Gd和47Sc。螯合的金属可以是例如与任何合适的多齿螯合剂(例如，无环或环状多胺、聚醚(例如，冠醚及其衍生物))螯合的以上类型的金属中的一种；聚酰胺；卟啉类；和碳环衍生物。
抗Nectin-4抗体或抗体片段也可以用于诊断，例如，以检测Nectin-4肿瘤细胞。在此类实施方案中，抗体或抗体片段可缀合至效应分子，诸如可用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层扫描)和非放射性顺磁性金属离子。关于可缀合至抗体以用作诊断剂的金属离子，大体参见美国专利第4,741,900号。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉亲和素、亲和素和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮(umbelliferone)、萤光素、异硫氰酸萤光素、罗丹明、二氯三嗪基胺萤光素、丹磺酰氯和藻红蛋白(phycoerytbrin)；合适的发光材料包括鲁米诺(luminol)；合适的生物发光材料包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；并且合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。
在一个实施方案中，细胞毒性剂(Z)是DNA小沟结合和/或烷化剂，例如吡咯并苯并二氮卓、倍癌霉素或其衍生物。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂选自由以下组成的组：紫杉烷类、蒽环类、喜树碱类、埃博霉素类、丝裂霉素类、康普瑞汀类、长春花生物碱类、氮芥类、美登木素类、卡奇霉素类、倍癌霉素类、微管溶素类、尾海兔素类和澳瑞他汀类、烯二炔类、鹅膏毒素类(amatoxins)、吡咯并苯二氮卓类、乙烯亚胺类、放射性同位素、治疗性蛋白和多肽以及毒素或其片段。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂选自环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、4-(双(2-氯乙基)氨基)苯酚、4-(双(2-氟乙基)氨基)苯酚、N,N-双(2-氯乙基)-对苯二胺、N,N-双(2-氟-乙基)-对苯二胺、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司丁(lomustine)、苏消安(treosulfan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、拓扑替康、伊立替康(inirotecan)、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、勒托替康、喜树碱(camptothecin)、克雷斯托(crisnatol)、丝裂霉素C(mitomycin C)、丝裂霉素A(mitomycin A)、甲氨蝶呤(methotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate)、霉酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韦林(ribavirin)、羟基脲(hydroxyurea)、去铁胺(deferoxamine)、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖孢苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、雷洛昔芬(raloxifen)、甲地孕酮(megestrol)、戈舍瑞林(goserelin)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、维替泊芬(vertoporfin)、酞菁(phthalocyanine)、光敏剂Pc4、demethoxy-hypocrellin A、干扰素-α、干扰素-γ、肿瘤坏死因子、洛伐他汀(lovastatin)、十字孢碱(staurosporine)、放线菌素D(actinomycin D)、博来霉素A2(bleomycin A2)、博来霉素B2(bleomycin B2)、培洛霉素(peplomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、N-(5,5-二乙酰氧基苯基)多柔比星、吗啉代多柔比星、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、毒胡萝卜素(thapsigargin)、N8-乙酰基精胺、他利霉素(tallysomycin)、埃斯波霉素(esperamycin)、丁酸、视黄酸、l,8-二羟基双环[7.3.1]十三碳-4-烯-2,6-二炔-13-酮、蛇形菌素(anguidine)、足叶草毒素(podophyllotoxin)、康普瑞汀A-4、水鬼蕉碱(pancratistatin)、微管溶素A、微管溶素D、洋红霉素(carminomycin)、链霉黑素(streptonigrin)、依利醋铵(elliptmium acetate)、美登素(maytansine)、美登醇(maytansinol)、卡奇霉素、mertansine(DM1)、N-乙酰基-γ1 I-卡奇霉素、卡奇霉素-γ1 I、卡奇霉素-α2 I、卡奇霉素-α3 I、倍癌霉素SA、倍癌霉素A、CC-1065、CBI-TMI、倍癌霉素C2、倍癌霉素B2、centanamycin、尾海兔素、澳瑞他汀E、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏素(amanin)、鹅膏酰胺(amaninamide)、鹅膏无毒环肽(amanullin)和鹅膏蕈酸(amanullinicacid)以及它们的衍生物。
示例性澳瑞他汀实施方案包括N末端连接的单甲基澳瑞他汀药物部分，其包含下式(a1)和(a2)中任一个的结构：
其中(a1)和(a2)的波浪线表示与接头(例如，接头X或部分Y、Pep或Y')的共价连接位点，并且在每个位置处独立地:
R2选自H和C1-C8烷基；
R3选自H、C1-C8烷基、C1-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R4选自H、C1-C8烷基、C1-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R5选自H和甲基；
或者R4和R5共同形成碳环并且具有式-(CRaRb)n，其中Ra和Rb独立地选自H、C1-C8烷基和C3-C8碳环，并且n选自2、3、4、5和6；
R6选自H和C1-C8烷基；
R7选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
每个R8独立地选自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烷基)；
R9选自H和C1-C8烷基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；
R11选自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m是1-1000的整数；
R13是C2-C8烷基；
R14是H或C1-C8烷基；
R15每次出现时独立地为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；
R16每次出现时独立地为H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；并且
n是0至6的整数。
在一个实施方案中，R3、R4和R7独立地为异丙基或仲丁基并且R5为-H或甲基。在示例性实施方案中。R3和R4各自为异丙基，R5为-H，并且R7为仲丁基。
在又另一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，并且R9为-H。
在仍另一个实施方案中，R8每次出现时为-OCH3。
在示例性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，R7为仲丁基，R8每次出现时为-OCH3，并且R9为-H。
在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10为芳基。
在示例性实施方案中，R10为-苯基。
在示例性实施方案中，当Z为-0-时，R11为-H、甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，并且R16为-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，当Z为–NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
式(a1)的一个示例性澳瑞他汀实施方案是MMAE，其中波浪线表示与接头的共价连接：
式(a2)的示例性澳瑞他汀实施方案是MMAF，其中波浪线指示与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价连接(参见US 2005/0238649和Doronina等人(2006)《生物缀合化学(Bioconjugate Cfiem.)》17:1 14-124)：
其它示例性Z实施方案包括在五肽澳瑞他汀药物部分的C末端具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽澳瑞他汀药物部分的C末端具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008603)。
其它药物部分包括以下MMAF衍生物，其中波浪线指示与接头的共价连接：
/>
包含间隔子(Y)的接头的示例如下所示，该间隔子(Y)包含伯胺、作为(Pep)部分的缬氨酸-瓜氨酸、作为(Y')部分的PAB以及作为(Z)部分的MMAF：
在一个实施方案中，Z部分是DNA小沟结合剂，任选地Z包含吡咯并苯并二氮卓(PBD)。在一个实施方案中，Z是吡咯并苯并二氮卓单体。在一个实施方案中，Z是包含两个吡咯并苯并二氮卓单元的吡咯并苯并二氮卓二聚体。在一个实施方案中，Z是包含三个吡咯并苯并二氮卓单元的吡咯并苯并二氮卓三聚体。在一个实施方案中，Z是包含多于三个吡咯并苯并二氮卓单元的吡咯并苯并二氮卓多聚体。PBD的结构以及式和其生产方法描述于例如以下PCT公布：第WO 2013/177481号、第WO 2011/130616号、第WO 2004/043880号、第WO2005/085251号、第WO2012/112687和第WO 2011/023883号中，其各自的公开内容通过引用并入本文。
吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮卓是与鸟嘌呤残基共价连接的序列选择性小沟结合DNA-相互作用剂家族。据报道，PBD的C11a位置处的S-手性为它们提供了适当的三维形状以完美地适合DNA小沟。PBD可具有不同的效果和作用模式。PBD可以是不引起DNA交联的DNA结合剂或DNA烷化剂，或者PBD可以是DNA交联剂。
吡咯并苯并二氮卓单元或单体可具有如下通式结构：
其中PBD可以在芳族A环和吡咯并C环两者中具有不同数量、类型和位置的取代基，并且可以在C环的饱和度方面变化。在B环中，在N10-C11位置存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其是负责烷化DNA的亲电子中心。
PBD的生物活性可通过将两个PBD单体或单元连接在一起来增强，通常通过它们的C8/C8'-羟基官能团经由柔性亚烷基接头连接在一起。
在本文的任何实施方案的一个方面，吡咯并苯并二氮卓单体或单元是吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮卓。在本文的任何实施方案的一个方面，吡咯并苯并二氮卓二聚体是C8/C8'-连接的吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮卓二聚体。
PBD可通过任何合适的位置附接至接头。例如，PBD可通过下文指示的PBD单元中的任何位置与接头连接。
在一个实施方案中，PBD二聚体包含以下通式的结构，其中与化合物内的其它取代基或官能团的示例性附接点由箭头指示：
其中：
R12和R12’和/或R2和R2’分别一起形成双键＝CH2或＝CH-CH3；或
R2’和R12’不存在，并且R2和R12独立地选自：
(iia)C1-5饱和脂族烷基；
(iib)C3-6饱和环烷基；
(iic)
，其中R21、R22和R23各自独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中R12基团中的碳原子总数不超过5；
(iid)
，其中R25a和R25b中的一者为H，并且另一者选自：
苯基，该苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；和噻吩基；以及
(iie)
，其中R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，该苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；和噻吩基；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、硝基、Me3Sn和卤基；其中R和R'独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NHRR′、硝基、Me3Sn和卤基；
或者：
(a)R10为H，并且R11为OH、ORA，其中RA为烷基；
(b)R10和R11在它们所结合的氮和碳原子之间形成氮-碳双键；或
(c)R10为H，并且R11为SOzM，其中z为2或3，并且M为单价药学上可接受的阳离子；
R"为C3-12亚烷基，该链可被以下中断：一个或多个杂原子，例如O、S、NRN2(其中RN2为H或C1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶；
Y和Y'选自O、S或NH；并且
R6'、R7'、R9'分别选自与R6、R7和R9相同的基团，并且R10’和R11’与R10和R11相同，其中如果R11和R11为SOzM，则M表示二价药学上可接受的阳离子。
在另一个示例中，PBD二聚体包含以下通式的结构：
其中R6、R7、R9、R6’、R7’、R9’、R10、R11、R10’和R11’如上文所定义，并且其中“K”环是取代的或未取代的芳环或非芳环，任选地6元环，任选地苯基。
在一个实施方案中，细胞毒性剂(Z)是喜树碱，例如其具有或包含喜树碱或喜树碱类似物的结构。喜树碱是众所周知的，广泛的喜树碱类似物也是众所周知的，这些喜树碱类似物共享具有各种取代的核心环系统，但优选地在以下基本喜树碱结构中的环A和/或B中具有修饰或取代：
已经报道了许多喜树碱类似物，包括拓扑替康、伊立替康、依喜替康、DXd、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、10-羟基喜树碱、勒托替康、喜树碱、吉马替康、贝洛替康和鲁比替康。另外的喜树碱类似物公开于Li等人,《ACS药物化学快报(ACS Med.Chem.Lett.)》2019,10,10,1386–1392,《日本癌症研究杂志(Jpn.J.Cancer Res.)》86:776-782和Takiguchi等人1997《日本癌症研究杂志(Jpn.J.Cancer Res.)》88:760-769中，这些文献的公开内容通过引用并入本文。四种类似物拓扑替康、伊立替康、贝洛替康和DXd(作为德卢替康-曲妥珠单抗的一部分)已获得FDA批准。在一个实施例中，喜树碱类似物是五环化合物(例如，喜树碱缺少F环)。在一个实施例中，喜树碱类似物是六环化合物，例如，包括F环。
一些示例诸如基本喜树碱结构SN-38分子(7-乙基-10-羟基喜树碱；伊立替康的活性代谢物)，并且Li等人,《ACS药物化学快报(ACS Med.Chem.Lett.)》2019,10,10,1386–139中公开的喜树碱类似物具有五个环(A、B、C、D和E环)并且可以例如通过B环上的取代基附接到接头(例如间隔子Y或Y'，或接头X)。
SN-38：
Li等人,《ACS药物化学快报(ACS Med.Chem.Lett.)》2019,10,10,1386–139的化合物：
任选地，喜树碱类似物是六环化合物(另外的F环)，其中化合物通过这种F环上的取代基附接到接头。此类六环化合物的示例包括但不限于DXd(目录号：1599440-33-1)和依喜替康。
因此喜树碱类似物包括依喜替康、SN-38和包含此类部分的一系列分子中的任何一种分子，例如依喜替康可以未经取代或可以在位置1的胺处被取代，例如其中取代基是或包含–C(＝O)–、–O–C(＝O)–、–O–CH2–C(＝O)–、HO–O–CH2–C(＝O)–、–CH2CH2–C(＝O)–、–CH2CH2CH2–C(＝O)–、–CH2–O–CH2–C(＝O)–、–CH2CH2–O–CH2–C(＝O)–基团或美国专利第6,835,807号中所示的其它基团，该美国专利的公开内容通过引用并入本文。
在一个实施例中，本公开的抗体在存在Nectin-4表达性肿瘤细胞的情况下(例如，在对可切割部分进行酶促切割随后进行间隔子Y’的自消除时)在体内或体外释放具有化合物1的结构的依喜替康分子。
喜树碱衍生物或类似物依喜替康描述于Mitsui等人1995《日本癌症研究杂志(Jpn.J.Cancer Res.)》86:776-782和Takiguchi等人1997《日本癌症研究杂志(Jpn.J.Cancer Res.)》88:760-769中，这些文献的公开内容通过引用并入本文。依喜替康的结构如以下化合物1a中所示：
依喜替康可以通过位置1处的氨基的氮原子与接头偶联，使得当依喜替康部分与接头结合或存在于接头-依喜替康分子((X-Z)分子)内时，例如与抗体缀合时，依喜替康将具有化合物1b的结构：
因此，应当理解，当化合物1a的依喜替康通过位置1处的胺附接至接头时(并且，例如，当接头进而附接至抗体时)，依喜替康将被理解为位置1处的经修饰的基团(即位置1处的NH2基团被NH，或可替代地被OH或O基团替换)。例如，依喜替康可以通过包括可切割寡肽的接头与抗体偶联。实例包含二肽、三肽、四肽和五肽，如美国专利第6,835,807号中所示的含甘氨酸和苯丙氨酸的肽，或附接至PAB分子的二肽缬氨酸-瓜氨酸或缬氨酸-丙氨酸，或所述美国专利的公开内容通过引用并入本文。已知各种合适的接头-Z结构可以在位置1的氨基处释放活性依喜替康或依喜替康衍生物。如式VII、VIII和IX中或实施例7的(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康)接头中所示，依喜替康可通过附接至位置1的胺的对氨基苄氧羰基(PAB)基团连接至可切割的寡肽，该接头在切割时导致具有化合物1a结构的依喜替康的释放。在一个示例中，如式III和化合物13(Dxd)以及实施例7中的ggfg-Dxd接头7中所示，依喜替康可通过附接至位置1的胺的(CH2–C(＝O))基团连接至可切割的寡肽，该接头在切割时导致含有依喜替康的化合物13(Dxd)的释放。化合物1的依喜替康的位置1的NH或NH2处的取代基的示例包括–C(＝O)–、–O–C(＝O)–，或包含诸如–O–CH2–C(＝O)–、HO–O–CH2–C(＝O)–、–CH2CH2–C(＝O)–、–CH2CH2CH2–C(＝O)–、–CH2–O–CH2–C(＝O)–和–CH2CH2–O–CH2–C(＝O)–的基团的(CH2–C(＝O))。
在一个实施方案中，经取代的依喜替康衍生物(例如，在位置1处衍生)具有化合物13的结构。
Dxd的结构在下文示出：
Dxd可通过碳链末端的氧原子与接头偶联，使得当Dxd部分与接头结合或存在于接头-Dxd分子((X-Z)分子)内时，例如与抗体缀合时，碳链末端OH将被O替换。
在一个实施方案中，接头部分(X–Z)是或包含以下式VII中所示的结构，其中(Y)是间隔子，该间隔子(例如，在其末端)包含反应性基团(R)与氨基酸残基，例如抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基反应的残基(例如，一个或多个赖氨酸残基的ε氨基，一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基，或一个或多个半胱氨酰残基的S原子)。用包含式VII或化合物3或4的结构的接头官能化的抗Nectin-4结合蛋白将释放或产生(例如在细胞内，在Nectin-4表达性肿瘤细胞的存在下)具有化合物1a的结构的化合物。
具有马来酰亚胺作为R基团的示例性接头可以具有以下化合物3的结构。在用还原剂(例如，三(2-羧乙基)膦盐酸盐)还原链间二硫键后，此类接头可以通过抗体中的半胱氨酸残基与抗体缀合。
所得抗体-药物缀合物将包含抗体，该抗体包含用具有化合物3的结构的化合物官能化的一个或多个半胱氨酸残基(其中化合物3通过半胱氨酸残基的S原子结合)。
在另一个实施例中，接头可以具有伯胺作为R基团，并且当在存在转谷氨酰胺酶的情况下与抗体反应时，可以产生包括用接头官能化的一个或多个受体谷氨酰胺残基的抗体。例如，接头(X–Z)或用该接头官能化的抗体具有或包含如以下化合物4所示的结构：
在一个实施方案中，接头部分(X–Z)是或包含以下式VIII中所示的结构，其中(Y)是间隔子，该间隔子(例如，在其末端)包含反应性基团(R)与氨基酸残基，例如抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基反应的残基(例如，一个或多个赖氨酸残基的ε氨基，一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基，或一个或多个半胱氨酰残基的S原子)，或例如糖基化氨基酸残基的聚糖结构(例如与抗体的Kabat残基N297结合的天然、截短或以其它方式修饰的N-聚糖)。用包含式VIII或化合物5、6或7的结构的接头官能化的抗Nectin-4结合蛋白将释放或产生(例如在细胞内，在Nectin-4表达性肿瘤细胞的存在下)具有化合物Ia的结构的化合物。
具有马来酰亚胺作为R基团的示例性接头可具有以下化合物5或6的结构。在用还原剂还原链间二硫键后，此类接头可以通过抗体中的半胱氨酸残基与抗体缀合。
在另一个实施例中，接头可以具有伯胺作为R基团，并且当在存在转谷氨酰胺酶的情况下与抗体反应时，可以产生包括用接头官能化的一个或多个受体谷氨酰胺残基的抗体。例如，接头(X–Z)或用该接头官能化的抗体具有或包含如以下化合物7所示的结构：
/>
在一个实施方案中，接头部分(X–Z)是或包含以下式IX中所示的结构，其中(Y)是间隔子，该间隔子(例如，在其末端)包含反应性基团(R)与氨基酸残基，例如抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基反应的残基(例如，一个或多个赖氨酸残基的ε氨基，一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基，或一个或多个半胱氨酰残基的S原子)，或例如糖基化氨基酸残基的聚糖结构(例如与抗体的Kabat残基N297结合的天然、截短或以其它方式修饰的N-聚糖)。用包含式IX的结构的接头官能化的抗Nectin-4结合蛋白将释放(例如在细胞内，在Nectin-4表达性肿瘤细胞的存在下)具有化合物Ia的结构的化合物。
具有马来酰亚胺作为R基团的示例性接头可具有以下化合物8的结构。在用还原剂还原链间二硫键后，此类接头可以通过抗体中的半胱氨酸残基与抗体缀合。
在另一个实施例中，接头可以具有伯胺作为R基团，并且当在存在转谷氨酰胺酶的情况下与抗体反应时，可以产生包括用接头官能化的一个或多个受体谷氨酰胺残基的抗体。例如，接头(X–Z)或用该接头官能化的抗体具有或包含如以下化合物9所示的结构：
在一个实施方案中，接头部分(X–Z)是或包含以下式X中所示的结构，其中(Y)是间隔子，该间隔子(例如，在其末端)包含反应性基团(R)与氨基酸残基，例如抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基反应的残基(例如，一个或多个赖氨酸残基的ε氨基，一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基，或一个或多个半胱氨酰残基的S原子)，或例如糖基化氨基酸残基的聚糖结构(例如与抗体的Kabat残基N297结合的天然、截短或以其它方式修饰的N-聚糖)。
具有马来酰亚胺作为R基团的示例性接头可具有以下化合物10的结构。在用还原剂(例如，三(2-羧乙基)膦盐酸盐)还原链间二硫键后，此类接头可以通过抗体中的半胱氨酸残基与抗体缀合。
在一个实施方案中，接头部分(X–Z)是或包含以下式XI中所示的结构，其中(Y)是间隔子，该间隔子(例如，在其末端)包含反应性基团(R)与氨基酸残基，例如抗体上的游离氨基、羟基、巯基或羧基反应的残基(例如，一个或多个赖氨酸残基的ε氨基，一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基，或一个或多个半胱氨酰残基的S原子)，或例如糖基化氨基酸残基的聚糖结构(例如与抗体的Kabat残基N297结合的天然、截短或以其它方式修饰的N-聚糖)。
具有马来酰亚胺作为R基团的示例性接头可具有以下化合物11的结构。在用还原剂还原链间二硫键后，此类接头可以通过抗体中的半胱氨酸残基与抗体缀合。
在另一个实施例中，接头可以具有伯胺作为R基团，并且当在存在转谷氨酰胺酶的情况下与抗体反应时，可以产生包括用接头官能化的一个或多个受体谷氨酰胺残基的抗体。例如，接头(X–Z)或用该接头官能化的抗体具有或包含如以下化合物12所示的结构：
用式XI或化合物11和12的含寡肽接头官能化的抗Nectin-4结合蛋白导致释放(例如，在细胞内，在Nectin-4表达性肿瘤细胞的存在下)经取代的依喜替康，其具有存在于位置1的胺处的OH–CH2–C(＝O)取代基，如下文的结构中所示：
当制备为具有伯胺的结构时，式III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X或XI的示例性接头可以在存在转谷氨酰胺酶(例如细菌性转谷氨酰胺酶，BTG)的情况下与抗体反应，使得转谷氨酰胺酶催化接头与抗体初级结构内(例如在免疫球蛋白恒定结构域内或在插入或附加到(例如融合到)恒定区的TGase识别标签内)的受体谷氨酰胺残基的缀合。用BTG介导的与抗体缀合的方法和接头描述于PCT出版物第WO2014/202773号中，所述出版物的公开内容通过引用并入。BTG催化的缀合允许精确控制组合物中的平均药物：抗体比率。术语“转谷氨酰胺酶”，可与“TGase”或“TG”互换使用，是指能够通过肽结合型谷氨酰胺的γ-羧酰胺基团与赖氨酸或结构相关的伯胺(如氨基戊基，例如肽结合型赖氨酸)的ε-氨基之间的酰基转移反应来交联蛋白质从而产生ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键的酶。TGase尤其包含细菌性转谷氨酰胺酶(BTG)，如具有EC参考EC 2.3.2.13的酶(蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰转移酶)。术语“受体谷氨酰胺”残基，当提及抗体的谷氨酰胺残基时，是指被TGase识别并且可以通过谷氨酰胺和赖氨酸或结构相关的伯胺(如氨基戊基)之间的反应被TGase交联的谷氨酰胺残基。优选地，受体谷氨酰胺残基是表面暴露的谷氨酰胺残基。术语“TGase识别标签”是指包括受体谷氨酰胺残基的氨基酸序列，并且当在合适的条件下掺入(例如附加到)多肽序列中时，所述氨基酸序列被TGase识别并通过氨基酸序列内的氨基酸侧链和反应伙伴之间的反应导致TGase交联。识别标签可以是不天然存在于包括酶识别标签的多肽中的肽序列。TGase识别标签的实例包含氨基酸序列：LLQ、LLQG、LSQG、GLLQ、SLLQG、GGGQGGL、LLQGG、LLQGA、LLQGG和LLQGA，或EQKLISEEDL或具有一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)序列修饰的变体。
如WO2013/092983和WO2020/188061(其公开内容通过引用并入本文)中所举例说明的，接头-药物部分(X-Z)可以在两步过程中与抗体中的谷氨酰胺残基(受体谷氨酰胺)缀合，该两步过程包括：第一步骤，其中包含伯胺和第一反应性基团(R)的部分在BTG的存在下与抗体缀合；以及随后的使抗体-接头缀合物与包含以下各项的分子反应的步骤：(i)与第一反应性基团具反应性的第二反应性基团(R')；以及(ii)细胞毒性剂(Z)。反应性基团对R和R'的实例包含一系列基团，这些基团能够进行双正交反应，例如叠氮化物和环辛炔之间的1,3-偶极环加成(无铜点击化学)、硝酮和环辛炔之间的1,3-偶极环加成、由醛和酮形成肟/腙以及四嗪连接(另见WO2013/092983)。所得接头和官能化抗体或其Y元件因此可以包括由R和R'反应产生的RR'基团，例如三唑。
抗Nectin-4免疫缀合物可以以1mg/ml到500mg/ml的浓度掺入药物调配物中，其中所述调配物的pH为2.0到10.0。调配物可以进一步包括缓冲系统、一种或多种防腐剂、一种或多种张力剂、一种或多种螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施例中，药物调配物是含水调配物，即包括水的调配物。此类调配物通常是溶液或悬浮液。在另外的实施例中，药物调配物是水溶液。术语“含水调配物”定义为包括至少50％w/w水的调配物。同样，术语“水溶液”定义为包括至少50％w/w水的溶液，并且术语“水性悬浮液”定义为包括至少50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施例中，药物调配物是冻干调配物，医师或患者在使用之前加入溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施例中，药物调配物是干燥调配物(例如，冷冻干燥或喷雾干燥)，无需任何预先溶解即可使用。
在另外的方面，药物调配物包含此类抗体的水溶液和缓冲液，其中抗体以1mg/ml或更高的浓度存在，并且其中所述调配物的pH为约2.0到约10.0。
在另一个实施例中，调配物的pH处于选自由以下组成的列表的范围内：约2.0到约10.0、约3.0到约9.0、约4.0到约8.5、约5.0到约8.0和约5.5到约7.5。
在另外的实施方案中，缓冲液选自由以下组成的组：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、二羟乙甘氨酸、三甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或它们的混合物。这些特定缓冲液中的每一种构成本发明的替代性实施例。
在另外的实施例中，调配物进一步包括药学上可接受的防腐剂。在另外的实施例中，调配物进一步包括等渗剂。在另外的实施例中，调配物还包括螯合剂。在本发明的另外的实施例中，调配物进一步包括稳定剂。在另外的实施例中，调配物进一步包括表面活性剂。为了方便起见，参考《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practiceof Pharmacy)》,第19版,1995。
本发明的药物调配物中可能存在其它成分。此类额外的成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油质媒剂、蛋白质(例如，人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如，氨基酸，诸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，此类额外的成分不应对本发明的药物调配物的总体稳定性产生不利影响。
根据本发明的药物组合物的施用可以通过几种施用途径，例如静脉内施用。也可以通过检查其它已经开发的治疗性ADC的经验确定合适的抗体调配物。
在任何实施例中，组合物可以被表征为包括多个本公开的Nectin-4结合性免疫缀合物，其中样品中至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物具有每个抗体至少4个、6个或8个氨基酸残基，所述氨基酸残基用本文公开的接头官能化。在任何实施例中，组合物可以被表征为包括多个本公开的Nectin-4结合性免疫缀合物，其中样品中至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物具有每个抗体至少2个、4个、6个或8个氨基酸残基，所述氨基酸残基用接头-喜树碱部分，例如本文化学式的(X–Z)单元或(–(Y)–(Pep)–(Y’)–(Z))单元官能化。在任何实施例中，组合物可以被表征为包括多个本公开的Nectin-4结合性免疫缀合物，其中样品中至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物具有每个抗体相同数量的官能化氨基酸，任选地其中所述数量为4、6或8。
恶性肿瘤的诊断、预后和治疗
在一些方面，描述了可用于诊断、预后、监测和治疗以在表面处表达Nectin-4的肿瘤细胞为特征的癌症的方法以及抗体、抗体片段和免疫缀合物。在治疗方法中，该治疗包括向人类受试者或个体施用本公开的抗体。在一些实施方案中，提供了用于改善向Nectin-4阳性肿瘤递送细胞毒性剂(特别是喜树碱类似物)的改善方法。细胞毒性剂的改善的递送可能是Nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成和/或非锚定依赖性生长的抗体介导的抑制的结果，导致细胞毒性剂和/或包含此类剂的ADC的肿瘤穿透改善。使用本公开的ADC的治疗对于治疗具有较低或异质Nectin-4表达的疾病、对于患有特别抗性疾病或其它ADC不适合的患者、和/或对于与作为单一剂介导毒性的额外的治疗剂(例如，化疗剂)组合使用是特别有利的。
在一个实施方案中，抗Nectin-4抗体或抗体片段可用于使肿瘤对细胞毒性剂或化疗剂敏化。与抗癌剂本身相比，通过降低癌细胞的化学抗性，抗Nectin-4抗体可用于加强或增强抗癌剂对癌症的毒性。包含抗Nectin-4抗体或抗体片段的癌症敏化组合物可用于使肿瘤(例如，Pgp表达性肿瘤)对抗癌剂敏化，以降低化学抗性并改善抗癌剂的治疗效果。
在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体或抗体片段可被指定为与化疗剂组合用于治疗人类个体中的肿瘤，其中抗Nectin-4抗体、抗体片段和化疗剂被调配用于分开施用并且同时或相继施用。例如，治疗可包括向个体施用有效量的以下各项中的每一种：(a)本公开的抗Nectin-4抗体或抗体片段，和(b)抗癌剂，任选地化疗剂，任选地已知能够被P-糖蛋白(Pgp)转运的化疗剂，任选地蒽环，长春花生物碱，依托泊苷，紫杉烷，铂化合物或任选地喜树碱。
在一个实施方案中，抗体或抗体片段与细胞毒性剂，例如喜树碱、依喜替康或SN-38分子缀合。抗体或抗体片段通常与细胞毒性剂(例如喜树碱类似物、依喜替康)的多个分子缀合。细胞毒性剂，例如喜树碱或依喜替康，可通过包含蛋白酶可切割的寡肽接头的接头与抗体缀合。示例性药物组合物可以包含平均每个抗体分子1到8个细胞毒性剂(例如，喜树碱衍生物、依喜替康)分子，任选地每个抗体分子2-8个、4-8个、6-8个细胞毒性剂分子，或例如每个抗体分子约2个、4个、5个、6个、7个或8个细胞毒性剂分子。当抗体或抗体片段与依喜替康缀合(即，通过接头)时，此类免疫缀合物特别有利于治疗Pgp表达性肿瘤(例如，以表达Pgp(MDR1)为特征的肿瘤)。以表达Pgp为特征的肿瘤包括用化疗剂和ADC治疗后的肿瘤，例如，已经显示用包含澳瑞他汀(MMAE)有效载荷的ADC治疗诱导肿瘤上的Pgp表达。另外，已知一系列以天然Pgp/MDR1表达为特征的肿瘤，例如以下癌症表达显著水平的MDR1：肾癌、肾上腺皮质癌、胆管癌、肝癌、直肠癌、结肠癌、脑癌、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、胃癌、AML、甲状腺癌、DLBC、食管癌、乳腺癌、肉瘤、睾丸癌、子宫癌、胸腺瘤、宫颈癌、肺癌、膀胱癌(例如，尿路上皮癌)以及头颈部鳞状细胞癌。
与细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂(例如，抗Nectin-4抗体或抗体片段)可以有利地用于治疗患有Nectin-4表达性癌症的个体，该Nectin-4表达性癌症以表达Nectin-4(例如，在肿瘤细胞膜或细胞表面处)的肿瘤细胞为特征。此类癌症的示例是尿道上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌；HER2阳性乳腺癌)、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌(例如结肠癌)、头颈部鳞状细胞癌和食道癌。
与细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂可用于Nectin-4高表达性肿瘤。
与细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂也可用于异质和/或低Nectin-4表达性肿瘤。在此类肿瘤中，本公开的免疫缀合物可以提供有利的功效，任选地通过避免MDR1介导的抗性和/或旁观者抗肿瘤作用。
与细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂可有利地用于治疗个体，无论Nectin-4表达水平如何，无论个体内肿瘤细胞上的Nectin-4表达水平的异质性如何，和/或无论该个体先前是否已经用维汀-恩弗妥单抗治疗过。当细胞毒性剂是依喜替康时，与细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂也可有利地用于治疗个体，无论肿瘤Pgp表达如何和/或无论个体先前是否已经用包含能够被Pgp转运的细胞毒性剂的ADC治疗过(例如，包含与除依喜替康之外的喜树碱类似物缀合的抗Nectin-4抗体的ADC、包含与Dxd缀合(例如，通过含GGFG接头)的抗Nectin-4抗体或包含与澳瑞他汀、蒽环、长春花生物碱、依托泊苷、紫杉烷或铂化合物缀合的抗Nectin-4抗体的ADC)。
在一个实施方案中，与喜树碱衍生物分子缀合的Nectin-4结合剂可有利地用于治疗先前已经用维汀-恩弗妥单抗治疗过的个体。在维汀-恩弗妥单抗治疗后，此类个体可以任选地患有以异质和/或低Nectin4表达性肿瘤为特征的癌症。在维汀-恩弗妥单抗治疗后，此类个体可任选地患有以Pgp表达性肿瘤为特征的癌症。个体可能患有尽管用与澳瑞他汀或MMAE分子缀合的抗体(例如，维汀-恩弗妥单抗)治疗但仍(例如在期间或之后)具有抗性、无应答、复发和/或进展的癌症。例如，个体可能患有局部晚期或转移性尿路上皮癌，并且先前接受过用与澳瑞他汀或MMAE分子缀合的抗体(例如，维汀-恩弗妥单抗)进行的治疗。
在一个实施方案中，包含通过接头与依喜替康缀合的Nectin-4结合剂的免疫缀合物有利地用于治疗先前已经用免疫缀合物治疗的个体，该免疫缀合物包含通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂。在一个实施方案中，包含通过接头与依喜替康缀合的Nectin-4结合剂的免疫缀合物有利地用于在免疫缀合物治疗之后，治疗患有以异质和/或低Nectin4表达性肿瘤为特征的癌症的个体，该免疫缀合物包含通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂。在一个实施方案中，包含通过接头与依喜替康缀合的Nectin-4结合剂的免疫缀合物有利地用于治疗患有癌症的个体，该癌症尽管用Nectin-4结合剂治疗过但仍(例如在期间或之后)具有抗性、无应答、复发和/或进展，该Nectin-4结合剂通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合。任选地，通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂包含通过接头与喜树碱类似物缀合的抗Nectin-4抗体，以便在接头切割时释放除依喜替康外的喜树碱类似物(例如，Dxd或德卢替康)。任选地，通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂包含与Dxd缀合(例如，通过含GGFG接头)的抗Nectin-4抗体。任选地，通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂包含与澳瑞他汀、蒽环、长春花生物碱、依托泊苷、紫杉烷或铂化合物缀合的抗Nectin-4抗体。任选地，通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂包含结合Nectin-4的IgV结构域的抗Nectin-4抗体。任选地，通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂包含结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗Nectin-4抗体。在一个实施方案中，包含通过接头与依喜替康缀合的Nectin-4结合剂的免疫缀合物包含具有可酶促切割部分(和任选地自消解间隔子)的接头，其导致在切割时释放依喜替康。
在晚期复发性或转移性尿路上皮癌中，很大一部分个体会在肿瘤细胞上表达高水平的Nectin-4，例如H评分至少为290(参见EV-201临床试验队列1Nectin-4表达)。然而，一部分患者的H评分小于250，并且有些小于200。少数患者的H评分小于150，有些患者的H评分小于100。在三阴性乳腺癌(TNBC)中，据报道62％的患者在肿瘤细胞上具有高Nectin-4表达，并且38％在肿瘤细胞上具有低Nectin-4表达(Rabat等人,2017《肿瘤学年鉴(AnnalsOnc.)》28:769-776)。在其它癌症类型中，Nectin-4表达的中值H评分值通常低于在UC中观察到的值，特别是在非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌和食道癌中观察到的。
在一个实施例中，根据本公开治疗的个体患有晚期复发性或转移性癌症，任选地患有晚期复发性或转移性尿路上皮癌。
在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有癌症(例如，乳腺癌)，该癌症对雌激素受体和/或孕酮受体测试呈阳性，而对表皮生长因子受体2(HER2)或过量HER2蛋白测试呈阴性，任选地该癌症对HER2测试呈阳性但HER2以低水平表达。
在一个实施例中，根据本公开治疗的个体患有三阴性乳腺癌(TNBC)，例如对雌激素受体、孕酮受体和过量HER2蛋白测试呈阴性的乳腺癌。
在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有对HER2蛋白测试呈阳性的癌症(例如，乳腺癌)，任选地其中该癌症表达过量的HER2蛋白(HER2过表达)，任选地该癌症表达低水平的HER2蛋白(低于过量HER2表达)。在一个实施方案中，个体用抗Nectin-4 ADC与结合HER2多肽的剂(例如，抗体)(例如，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)组合治疗；任选地，其中结合HER2的剂是ADC；任选地，其中结合HER2的抗体与细胞毒性剂，任选地澳瑞他汀、美登木素(例如，DM1)或喜树碱类似物(例如，化合物1、2或13)缀合；任选地，其中结合HER2的抗体是恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)或德卢替康-曲妥珠单抗(trastuzumabderuxtecan，DS-8201a；EnhertuTM)。
在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有非小细胞肺癌，任选地患有肺腺癌。
在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有胰腺癌。
在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有卵巢癌。
在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有头颈部鳞状细胞癌。
在一个实施方案中，根据本公开治疗的个体患有食道癌。
在一个实施例中，根据本公开治疗的个体患有结肠直肠癌。如本文所使用的，结肠直肠癌(CRC)是指结肠癌、直肠癌和结肠直肠癌(结肠区域和直肠区域两者的癌症)。
在一个实施例中，根据本公开治疗的个体患有对HER2蛋白测试呈阳性的NSCLC或肺腺癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、尿路上皮癌或膀胱癌，任选地其中所述癌症表达过量的HER2蛋白(HER2过表达)，任选地所述癌症表达低水平的HER2蛋白(低于过量HER2表达)。在一个实施方案中，个体用根据本公开的抗Nectin-4 ADC与结合HER2多肽的剂(例如，抗体)(例如，包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的重链和轻链CDR或可变区的抗体)组合治疗。任选地，其中结合HER2的剂是ADC；任选地，其中结合HER2的抗体与细胞毒性剂，任选地澳瑞他汀、美登木素(例如，DM1)或喜树碱类似物(例如，化合物1、2或13)缀合；任选地，其中结合Her2的抗体是恩美曲妥珠单抗或德卢替康-曲妥珠单抗(DS-8201a)。
如本文所示，在切割时(例如，在包含细胞毒性剂Z的细胞内可切割的接头的切割时)释放依喜替康的ADC在治疗对具有接头的ADC具有抗性的肿瘤中特别有利，这些接头在切割时释放被Pgp转运的细胞毒性剂(除依喜替康之外)，例如澳瑞他汀或Dxd。因此，在一个实施方案中，当用抗Nectin-4结合剂(例如，抗Nectin-4 ADC)和抗HER2 ADC的组合治疗HER2阳性癌症时，抗HER2 ADC可被设计成在切割时(例如，在包含细胞毒性剂Z的细胞内可切割的接头的切割时)释放依喜替康。抗Nectin-4结合剂(例如，抗Nectin-4 ADC)可被设计成在切割时(例如，在包含细胞毒性剂Z的细胞内可切割的接头的切割时)释放依喜替康，或可释放任何其它细胞毒性剂(Z)，例如其中Z是紫杉烷、蒽环、喜树碱、埃博霉素、丝裂霉素、康普瑞汀、长春花生物碱、氮芥、美登木素、倍癌霉素、微管溶素、尾海兔素、澳瑞他汀、烯二炔、吡咯并苯二氮卓、鹅膏毒素或乙烯亚胺。
因此，在一个方面，本公开提供了结合人Nectin-4多肽的免疫缀合物，该免疫缀合物用于治疗癌症(例如，HER2阳性Nectin-4阳性癌症)，其中结合人Nectin-4多肽的免疫缀合物由下式表示：
AbN4–(X N4–(Z N4))
其中，
AbN4是特异性结合人Nectin-4多肽的多肽、肽或抗体；
XN4是连接AbN4和ZN4的分子，其中XN4包含可切割部分，例如在生理条件下可切割部分，任选地在胞内条件下可切割部分，任选地是蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽；并且
ZN4包含细胞毒性剂；
其中结合人Nectin-4多肽的免疫缀合物与由下式表示的结合人HER2多肽的免疫缀合物组合使用：
AbHER2–(XHER2–(ZHER2))
其中，
AbHER2是特异性结合人HER2多肽的多肽、肽或抗体，任选地其中AbHER2包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的重链和轻链CDR或可变区；
XHER2是连接AbHER2和ZHER2的分子，其中XHER2包含可切割部分，例如在生理条件下可切割部分，任选地在胞内条件下可切割部分，任选地是蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽；并且
ZHER2是依喜替康。结合人HER2多肽的免疫缀合物在可切割部分的切割时释放依喜替康。任选地，ZN4是依喜替康，任选地，结合人Nectin-4多肽的免疫缀合物在可切割部分的切割时释放依喜替康。
此外，在一个方面，本公开提供了结合人HER2多肽的免疫缀合物，该免疫缀合物用于治疗癌症(例如，HER2阳性Nectin-4阳性癌症)，其中结合人HER2多肽的免疫缀合物由下式表示：
AbHER2–(XHER2–(ZHER2))
其中
AbHER2是特异性结合人HER2多肽的多肽、肽或抗体，任选地其中AbHER2包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的重链和轻链CDR或可变区；
XHER2是连接AbHER2和ZHER2的分子，其中XHER2包含可切割部分，例如在生理条件下可切割部分，任选地在胞内条件下可切割部分，任选地是蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽；并且
ZHER2是依喜替康；
其中结合人HER2多肽的免疫缀合物与由下式表示的结合人Nectin-4多肽的免疫缀合物组合使用：
AbN4–(XN4–(ZN4))
其中，
AbN4是特异性结合人Nectin-4多肽的多肽、肽或抗体；
XN4是连接AbN4和ZN4的分子，其中XN4包含可切割部分，例如在生理条件下可切割部分，任选地在胞内条件下可切割部分，任选地是蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽；并且
ZN4包含细胞毒性剂。结合人HER2多肽的免疫缀合物在可切割部分的切割时释放依喜替康。任选地，ZN4是依喜替康，任选地，结合人Nectin-4多肽的免疫缀合物在可切割部分的切割时释放依喜替康。
在一方面，本公开的治疗方法不依赖于对肿瘤组织中Nectin-4表达的评估或检测和/或不依赖于肿瘤细胞上Nectin-4的表达水平和/或来自所述个体的组织样品中Nectin-4表达性肿瘤细胞的频率或数量。在一个方面，本公开的治疗方法不依赖于评估或检测肿瘤Pgp(MDR1)表达。
在一个方面，本发明提供了在有需要的个体中治疗癌症和/或引发抗肿瘤免疫应答的方法，其中所述个体患有晚期复发性或转移性尿路上皮癌或乳腺癌(例如TNBC)，其中所述方法不需要预先确定该个体是否具有包含表达Nectin-4的细胞(例如肿瘤细胞)的肿瘤组织。
在一个方面，本发明提供了在有需要的个体中治疗癌症和/或杀死肿瘤细胞的方法，其中所述个体患有晚期复发性或转移性尿路上皮癌或乳腺癌(例如TNBC)，其中所述方法不需要预先确定该个体是否具有包含表达高水平Nectin-4的细胞(例如肿瘤细胞)的肿瘤组织，如通过免疫组织化学评估(例如H评分或其它适当的IHC评分方法)所定义的。
在一方面，在个体中治疗癌症和/或杀死肿瘤细胞的方法不需要预先确定肿瘤细胞的Nectin-4表达水平。
在一方面，在个体中治疗癌症，任选地晚期复发性或转移性尿路上皮癌或乳腺癌(例如TNBC、HER2阳性癌症)的方法包括治疗患有特征在于Nectin-4表达的H评分不大于或小于290、250、200、150或100的癌症的个体。
在用于在个体中治疗或预防癌症的任何实施方案中，方法可被指定为包括以下步骤：(i)鉴定其肿瘤细胞表达Nectin-4(例如，通过免疫组织化学确定)的个体；以及(ii)向个体施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物。
在用于在个体中治疗或预防癌症的任何实施方案中，方法可被指定为包括以下步骤：(i)鉴定其肿瘤细胞表达(a)Nectin-4(例如通过免疫组织化学确定)和(b)HER2的个体，任选地其中肿瘤细胞表达低水平的HER2(例如，通过免疫组织化学确定；通过HerceptestTM确定)；以及(ii)向个体施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物，任选地与结合Her2多肽的剂(例如，抗体)(例如，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)组合；任选地，其中结合Her2的抗体是ADC；任选地，其中结合Her2的抗体与细胞毒性剂，任选地澳瑞他汀、美登木素(例如，DM1)或喜树碱衍生物(例如，化合物1、2或13)缀合。任选地，其中结合Her2的抗体是恩美曲妥珠单抗或德卢替康-曲妥珠单抗(DS-8201a)。
在用于在个体中治疗或预防癌症的任何实施方案中，方法可被指定为包括以下步骤：(i)鉴定其肿瘤细胞具有低或中等水平的Nectin-4表达(例如，通过免疫组织化学确定)的个体；以及(ii)向步骤(i)中鉴定的个体施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物。
在用于在个体中治疗或预防癌症(例如，Nectin-4阳性癌症)的任何实施方案中，方法可被指定为包括以下步骤：(i)鉴定其癌症特征在于低水平Nectin-4表达(例如通过免疫组织化学确定)的个体；以及(ii)向步骤(i)中鉴定的个体施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物。在一个实施例中，所述个体患有特征在于Nectin-4表达的H评分不大于或小于150或100的癌症。
在用于在个体中治疗或预防癌症(例如，Nectin-4阳性癌症)的任何实施方案中，方法可被指定为包括以下步骤：(i)鉴定其癌症特征在于中等水平肿瘤Nectin-4表达(例如通过免疫组织化学确定)的个体；以及(ii)向个体施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物。在一个实施例中，所述个体患有特征在于Nectin-4表达的H评分不大于或小于290、250、200、150的癌症，任选地进一步其中所述癌症的特征在于Nectin-4表达的H评分至少为100。
在又另一个实施方案中，提供了一种用于在个体中治疗或预防癌症(例如，Nectin-4阳性癌症)的方法，该方法包括：(i)鉴定其癌症特征在于肿瘤Nectin-4表达的H评分不大于或小于290、250、200、150、120或100的个体；以及(ii)向个体施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物。任选地，步骤(i)可以被指定为包括通过组织化学(例如IHC)评估肿瘤细胞上的Nectin-4表达的步骤。
在又另一个实施方案中，提供了一种用于在个体中治疗或预防癌症(例如，Nectin-4阳性癌症；乳腺癌)的方法，该方法包括：(i)鉴定其癌症特征在于肿瘤Nectin-4表达的QS评分不大于或小于200、150、120或100的个体；以及(ii)向个体施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物。任选地，步骤(i)可以被指定为包括通过组织化学(例如IHC)评估肿瘤细胞上的Nectin-4表达的步骤。
可以获取和评估来自个体的生物样品，例如来自活检的生物样品。任选地，将样品保存为甲醛(例如福尔马林)固定石蜡包埋(FFPE)样品。脱蜡后，载玻片适用于检测Nectin-4(和/或HER2)表达的方法。
Nectin-4和/或HER2在肿瘤细胞中的表达可以通过本领域已知的任何方法来确定。在某些实施例中，测定包含免疫组织化学(IHC)测定、荧光活化细胞分选(FACS)测定，例如定量FACS、ELISA、免疫印迹(例如蛋白质印迹、斑点印迹或细胞内蛋白质印迹)和其它免疫测定。
组织切片的IHC染色已被证明是评估或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。免疫组织化学技术利用抗体原位探测和可视化细胞抗原，通常通过显色或荧光方法。因此，抗体或抗血清(在一些实施例中，多克隆抗血清，以及在一些实施例中，对每种标志物具有特异性的单克隆抗体)用于检测表达。可以通过直接标记抗体本身来检测抗体，例如用放射性标记、荧光标记、半抗原标记(如生物素)或酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)进行标记。可替代地，将未标记的初级抗体与经标记的二级抗体联合使用，所述二级抗体包括抗血清、多克隆抗血清或对初级抗体具有特异性的单克隆抗体。免疫组织化学方案和试剂盒在本领域是众所周知的并且是可商购的。
在一些实施例中，IHC测定是直接测定，其中直接确定抗体与靶抗原的结合。这种直接测定使用经标记的试剂，如荧光标签或酶标记的初级抗体，其无需例另外的抗体相互作用即可观察到。在一些实施例中，IHC测定是间接测定。在典型的间接测定中，未缀合的初级抗体与抗原结合，然后经标记的二级抗体与初级抗体结合。当二级抗体与酶标记结合时，添加显色或荧光底物以提供抗原的可视化。发生信号放大是因为几种二级抗体可能与初级抗体上的不同表位发生反应。用于免疫组织化学的初级抗体和/或二级抗体通常用可检测分子进行标记。有多种标签可供选择，包含放射性同位素、胶体金颗粒、荧光标签和酶底物标签。
强染色、中等染色和弱染色是本领域技术人员熟知的描述。在一些方面，强染色、中等染色和弱染色是校准的染色水平，其中建立了一个范围并且将染色强度分级在该范围内。在一些实施例中，强染色是在强度范围的第75个百分位以上的染色，中等染色是在强度范围的第25到75个百分位的染色，而低染色是在强度范围的第25个百分位以下的染色。在一些方面，熟悉特定染色技术的本领域技术人员调整箱大小并定义染色类别。
(例如，当用抗Nectin-4抗体染色时)具有不同染色强度的对照细胞系(例如，离心成团块，福尔马林固定和石蜡包埋，例如，被制备成组织微阵列，并且例如用抗Nectin-4抗体染色)可用作IHC分析的对照。普通技术人员理解，具有阴性、弱、中等和高c-met染色强度的其它对照细胞团块可以使用本领域公知和本文公开的本申请的教导和方法容易地鉴定。
在一些实施例中，当癌症或肿瘤为(例如，使用IHC测定被确定为)Nectin-4阳性时，其被认为是Nectin-4表达性癌症肿瘤。在一些实施方案中，当样品中5％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施例中，当样品中10％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中20％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中30％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中40％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中50％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中60％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中70％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中80％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中90％或更多的肿瘤细胞表达Nectin-4蛋白(例如，以任何强度表达Nectin-4蛋白)时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。
在一些实施例中，当样品中5％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中10％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中20％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中30％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中40％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中50％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中60％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中70％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中80％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。在一些实施方案中，当样品中90％或更多的肿瘤细胞以中等和/或强染色强度表达Nectin-4蛋白时，个体的癌症或肿瘤为Nectin-4阳性。
评估免疫组织化学测定以确定个体的癌症或肿瘤是否以高Nectin-4表达(例如低或中等Nectin-4表达)为特征通常将涉及应用已知的评分方法。
低、中等和高肿瘤Nectin-4表达可以基于美国专利公布第2013/0005678号中描述的“H评分”来确定。H评分是通过下式获得的：(3×强染色细胞百分比)+(2×中等染色细胞百分比)+(弱染色细胞百分比)，得到0到300的范围。H评分特别用于UC中。
在本文的任何方法的一些实施例中，低或中等Nectin-4表达(例如，具有低或中等Nectin-4表达水平的肿瘤或肿瘤细胞)对应于约250或更低、约220或更低、约200或更低、约180或更低、约160或更低、约150或更低、约140或更低、约130或更低、约120或更低、约110或更低或约100或更低的H评分。
在本文中的任何方法的一些实施例中，低Nectin-4表达(例如，具有低Nectin-4表达水平的肿瘤或肿瘤细胞)对应于200或更低、约180或更低、约160或更低、约150或更低、约140或更低、约130或更低、约120或更低、约110或更低或约100或更低的H评分。
在本文中的任何方法的一些实施例中，高Nectin-4表达(例如，具有高Nectin-4表达水平的肿瘤或肿瘤细胞)对应于约290或更高的H评分。
在另一个实例中，Nectin-4染色可以根据Quick score(QS)使用下式进行评分：QS＝P(阳性细胞百分比)×I(强度)，最高评分为300。QS已例如用于乳腺癌中。例如，在TNBC中，一些研究小组已将Nectin-4低表达组定义为QS＝或<100。在本文的任何方法的一些实施例中，低或中等Nectin-4表达(例如，具有低或中等Nectin-4表达水平的肿瘤或肿瘤细胞)对应于约200或更低、约180或更低、约160或更低、约150或更低、约140或更低、约130或更低、约120或更低、约110或更低或约100或更低的QS评分。
用于评估HER2的肿瘤细胞表达的测定是本领域熟知的。例如，如FDA批准的SPoT-Light HER2 CISH等测定法可用于检测HER2过表达。显色原位杂交(CISH)检测HER2基因扩增。该技术也被称为减影探针技术显色原位杂交，是用于观察乳腺癌细胞是否在细胞表面过表达HER2受体蛋白的测试。
另一种广泛使用的HER2测定是HercepTestTM(丹科北美有限公司(Dako NorthAmerica,Inc.))，这是一种半定量免疫组织化学测定，用于在福尔马林固定、石蜡包埋的癌组织中确定HER2蛋白的过表达。例如，表达低水平HER2的肿瘤可通过HercepTestTM以+1至+2的评分来鉴定。
在一方面，所述治疗用于患有现有神经病、糖尿病或高血糖、心功能不全、眼部病变的个体。此类病症可以使个体不适合用具有比本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物更高的毒性或更窄的治疗窗口的抗Nectin-4 ADC(如维汀-恩弗妥单抗)进行治疗。
在任何实施方案中，治疗方法可任选地包括以下步骤：(a)评估个体中的癌症阶段和/或疾病进展；和(b)如果个体患有复发性、转移性和/或进行性癌症，则向个体施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，本发明包括治疗患有尿路上皮癌的个体的肿瘤的方法，该方法包括：(a)评估个体的癌症阶段和/或疾病进展；和(b)如果个体患有复发性、转移性和/或进行性癌症，则向个体施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物。
任选地，用本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物治疗的个体可能患有尽管进行了手术和/或用治疗剂(例如化疗剂、抗体、ADC或放射疗法)治疗但仍(例如在期间或之后)具有抗性、无应答、复发和/或进展的癌症(例如，尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌；HER2阳性癌症)、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、头颈部鳞状细胞癌或食管癌)。
在本文的任何实施方案中，治疗应答可以根据众所周知的标准来定义和/或评估，例如实体瘤应答评估标准(RECIST)，诸如1.1版，参见Eisenhauer等人(2009)《欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)》45:228-247，或免疫相关应答标准(irRC)，参见Wolchock等人(2009)《临床癌症研究(Clinical Cancer Research)》15:7412-7420。
任选地，用本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物治疗的个体患有肿瘤或癌症，该肿瘤或癌症在用化疗剂(例如，已知能够被P-糖蛋白(Pgp)转运的化疗剂，例如蒽环类(多柔比星、柔红霉素、紫杉烷类(紫杉醇、多西他赛)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、长春地辛)和依托泊苷)治疗后表现出抗性、对治疗无应答或进展。被Pgp识别的化合物通常被表征为适度疏水(辛醇与水的分配系数，logP>1)，通常含有在生理条件下带有净阳离子电荷的可滴定质子，并且主要是带有芳香族部分的“天然产物”。
在一些实施例中，在没有组合施用化疗剂的情况下使用或施用包括抗Nectin-4抗体、抗体片段的ADC。
在其它实施方案中，抗Nectin-4抗体、抗体片段或包含它们的ADC任选地与化疗剂组合使用或施用。示例性化疗剂包括但不限于安吖啶(amsacrine)、博来霉素、白消安(busulfan)、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、crisantaspase、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素(dactinomycin)、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基尿素、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、脂质体多柔比星、脂质体柔红霉素、洛莫司丁、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、甲基苄肼(procarbazine)、雷替曲塞、赛特铂(satraplatin)、链脲菌素(streptozocin)、喃氟啶-尿嘧啶(tegafur-uracil)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、噻替派(thiotepa)、硫鸟嘌呤、拓扑替康、苏消安、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或它们的组合。在一个实施方案中，将抗Nectin-4抗体、抗体片段(或包含它们的ADC)和化疗剂调配用于分开施用，并且同时或相继施用。
任选地，所述个体可以被表征为患有癌症，所述癌症在用先前疗法进行先前治疗之前已经进展、复发或对所述先前治疗无应答，任选地进一步其中所述先前疗法包括施用维汀-恩弗妥单抗和/或施用PD-1中和剂(例如，帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、纳武单抗(nivolumab))，任选地其中所述先前疗法是化疗剂。
任选地，在任何实施例中，所述个体可以被表征为不适合用维汀-恩弗妥单抗治疗，和/或患有不适合或不适应用维汀-恩弗妥单抗治疗的癌症。
用于用与喜树碱衍生物分子缀合的抗Nectin-4抗体治疗人的示例性治疗方案包括，例如，向患者施用有效量的本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物，其中该方法包括至少一个施用周期，其中以0.1-10mg/kg体重、0.1-5mg/kg体重、0.1-1mg/kg体重、1-10mg/kg体重或1-5mg/kg体重的剂量施用至少一剂与喜树碱衍生物分子缀合的抗Nectin-4抗体。在一个实施例中，施用多个剂量，例如至少2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个剂量。在一个实施例中，间隔至少2周、3周或4周施用剂量。在一个实施例中，施用周期介于2周和8周之间，或至少为4周、6周、8周或16周。
在一个实施方案中，本公开的抗Nectin-4抗体药物缀合物通过静脉注射施用。
实施例
实施例1：共表达Her2和Nectin-4的人肿瘤细胞
基于不同类型癌症的关键基因组变化的多维图谱，使用癌症基因组图谱(CancerGenome Atlas，国家癌症研究所和国家人类基因组研究所之间的合作)对HER2和Nectin-4基因表达进行了研究。特别是在胰腺癌、肺腺癌患者、乳腺癌和膀胱癌患者的样品中观察到HER2和Nectin-4表达的显著相关性。观察到的最高相关性是胰腺癌，相关值：Spearman0.71和Pearson 0.78。
通过流式细胞术确定SUM185和SUM190人乳腺癌肿瘤细胞系(Biovit公司(Biovitinc.))上的HER2和Nectin-4表达。SUM185源自患有ER阴性、PR阴性和HER2阳性乳腺间变性癌患者的胸腔积液。细胞系过度表达Her2。SUM190源自患有ER阴性、PR阴性和HER2阳性(扩增性)乳腺癌的患者的原发性肿瘤。将肿瘤细胞用抗Nectin-4抗体(ASG-22ME，其被修饰为含有N297Q突变的人IgG1同种型，该突变具有降低的Fcγ受体结合)或抗Her2抗体(曲妥珠单抗，其被修饰为含有N297Q突变的人IgG1同种型，该突变具有降低的Fcγ受体结合)以及同种型对照进行染色，浓度为10μg/ml(在4℃下)，然后用1:200稀释的PE缀合的多克隆山羊抗人抗体进行染色。用Canto II(HTS)通过细胞荧光分析来分析样品。
图1示出了SUM190人乳腺癌肿瘤细胞的代表性结果，并且图2示出了SUM185人乳腺癌肿瘤细胞的代表性结果。MFI：荧光强度中值。SUM190肿瘤细胞以低至中等水平表达HER2(中值荧光单位为1777)并以低水平表达Nectin-4(中值荧光单位为991)。SUM185细胞以中等至高水平表达HER2(中值荧光单位为2880)并以高水平表达Nectin-4(中值荧光单位为4326)。
HER2(MFI) Nectin-4(MFI)
SUM185 2880 4326
SUM190 1777 991
实施例2：用喜树碱衍生物官能化的抗Nectin-4 ADC对HER2+Nectin4+人肿瘤细胞 的功效
制备抗Nectin-4抗体-药物缀合物，并且与曲妥珠单抗抗体-药物缀合物比较对HER2+Nectin4+人肿瘤细胞的功效。制备具有SEQ ID NO:28和29的VH和VL作为人IgG1同种型的抗Nectin-4抗体-药物缀合物。
N41 VH：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDTSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARELIHAMDNWGQGTSVTVSS
(SEQ ID NO:28)。
N41 VL：
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGNSPQLLVFAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:29)。
制备具有曲妥珠单抗(人IgG1同种型)的重链和轻链的抗HER2抗体-药物缀合物。在部分还原链间二硫键后，抗Nectin-4抗体和抗HER2抗体均各自通过抗体中的半胱氨酸残基随机缀合至接头-喜树碱衍生物。将2-10摩尔当量范围的还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐与抗体(3mg/mL)一起在搅拌(350-400rpm，+37℃)下温育2小时，以还原二硫化物。通过添加摩尔过量(9.2或12摩尔当量)的接头-毒素进行接头-毒素的缀合，所述接头-毒素在+37℃下在搅拌轮上温育过夜。所得ADC的平均载药量(药物：抗体比率)约为8。在另一个实例中，抗Nectin-4抗体也使用相同的方法与含有接头的第二种喜树碱(SN-38)缀合。本实例中使用的ADC如下。
N4 ADC1：与具有以下结构的接头缀合的抗Nectin-4：
Her2 ADC1：与具有以下结构的接头缀合的抗HER2：
N4 ADC2：与具有以下结构的接头缀合的抗Nectin-4：
测试所得ADC诱导实施例1的Nectin-4/HER2表达性SUM190、MCF-7肿瘤细胞死亡的能力。简而言之，将细胞接种在96孔板中(V＝80μl)。N4 ADC1和HER2 ADC1或人IgG1同种型对照(IC)-接头-毒素或培养基(浓度5x)在1:2系列稀释中从(530nM至30nM)开始进行测试，N4 ADC1和同种型对照在1:5系列稀释中(7nM至7x10-2nM)进行测试。在从(530nM开始到5.310-2)的1:10连续稀释液中测试N4 ADC2和同种型对照。通过使用Incucyte S3-2装置评估汇合来确定ADC引起细胞死亡的能力；使用Cell Titer GloTM(CTG)测定法用Enspire2装置确定处理后第6天的活力。每个ADC的IC50值用GraphPad Prism8使用第6天的发光细胞活力数据确定。将实验重复两次。
代表性结果示出在图3中。图3的两个右侧图片显示N4 ADC1(抗Nectin-4)可有效导致肿瘤细胞死亡，其中N4 ADC1被示出为带正方形的实线并且同种型对照被示出为虚线。图3的两个左侧图片示出了HER2 ADC1(抗HER2)在相同的相应细胞中的功效，其中HER2ADC1被示出为带点的实线并且同种型对照被示出为虚线。IC50值总结在下表中。N4 ADC1甚至在以低得多的Nectin-4表面表达为特征的SUM185细胞中也特别有效(SUM185中的表面Nectin-4是SUM190中的约1/4)。携带喜树碱衍生物SN38的N4 ADC2(抗Nectin-4)也显示出良好的效力(参见下面的IC50表)。
表：ADC的IC50值
结果显示，在表达Nectin-4的SUM185中，抗Nectin-4 ADC(N4 ADC1)比抗HER2 ADC(Her2 ADC1)有效得多，其中Nectin-4 ADC的IC50为1/40。值得注意的是，SUM185细胞以相对较高的水平表达Nectin-4，这些细胞中的Nectin-4表达水平约为HER2表达水平的两倍(参见实施例1)。然而，有趣的是，当在Nectin-4表面表达水平低得多的SUM190细胞中测试抗Nectin-4 ADC(N4 ADC1)和抗HER2(HER-2ADC1)ADC时，抗Nectin-4 ADC(N4 ADC1)仍然非常有效。在这些SUM190细胞中，Nectin-4表面表达仅为HER2表面表达的一半，但抗Nectin-4喜树碱ADC仍然至少与抗HER2 ADC一样有效，或者可能更有效，其中抗Nectin-4ADC的IC50是抗Her2 ADC的IC50的1/6。
因此，细胞内可切割的肽接头与喜树碱衍生物化合物的组合可能表示一种用于消除Nectin-4表达性肿瘤细胞的有效方式，包括那些以较低Nectin-4表达水平为特征的肿瘤细胞，与最广泛使用的细胞毒性剂(诸如吡咯并苯二氮卓类和奥瑞他汀)相比，其脱靶毒性没有提高。抗Nectin-4 ADC也可能为治疗HER2阳性癌症(包含但不限于HER2低和/或HER2中等表达性癌症)提供有价值的方法。
实施例3：抗Nectin-4喜树碱衍生物ADC与抗HER2 ADC组合的功效
测试了抗Nectin-4 ADC(N4 ADC1)和抗Her2 ADC(Her2 ADC1)以评估它们在组合使用时引起肿瘤细胞死亡的能力。
所使用的抗Nectin-4喜树碱衍生物ADC是如实施例2中所示的N4 ADC1。抗Her2ADC也是实例2中使用的那些(Her2 ADC1)。如实例2中所述，通过在第6天评估SUM190细胞的汇合度并确定其活力来确定ADC引起细胞死亡的能力。结果显示，与单独使用任一种ADC相比，抗Nectin-4 ADC和抗Her2 ADC的组合在导致Nectin-4+Her2+肿瘤细胞死亡方面具有提高的效力(较低IC50)。
实施例4：生成一组新的抗Nectin-4抗体
免疫
用重组人Nectin-4蛋白使Balb/c小鼠免疫，该蛋白具有与C末端6-His标签融合的以下Nectin-4氨基酸序列片段：
GRCPAGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVV(SEQ ID NO:2)。
在第二次IP注射(IP2)后，回收免疫小鼠的血清以执行滴定。这些滴定允许确定每种血清的滴度并选择用于融合的最佳应答小鼠。对被制备成在其表面表达全长人Nectin-4的CHO细胞系(下文所述的huNectin4 Cl.3C8细胞系)进行血清滴定。
使用免疫前血清未观察到背景信号。所有免疫小鼠在两次IP注射后对免疫的应答弱，并且EC50不能计算，因为滴定曲线没有达到平台期。根据曲线，小鼠#2、#3和#4表现出对huNectin4更高的反应性，并用于融合过程。
将通过融合过程生成的杂交瘤接种到含有甲基纤维素半固体培养基的一孔板中，并且在37℃、10％ CO2下温育11天至13天。挑取生长中的集落并分配到平底96孔板中。5天至7天后，收获杂交瘤上清液用于流式细胞术筛选#1。
流式细胞术筛选#1
通过流式细胞术测试15个板的杂交瘤上清液在野生型人Nectin-4表达性CHO细胞系上的结合。简而言之，在PBS、BSA 0.5％、EDTA 5mM的缓冲液中以每孔0.2x106个细胞使用Nectin-4表达性细胞。将第一抗体与细胞在+5℃±3℃下在上清液50μL中温育1小时。对照抗体包括同种型恩弗妥单抗T1-1。细胞在染色缓冲液中洗涤三次，并且使用在+5℃±3℃下温育30分钟的二级抗体来揭示结合的抗Nectin-4抗体，使用对杂交瘤上清液具有特异性的山羊抗小鼠IgG Fc和山羊抗人IgG Fc特异性–PE作为对照抗体。采集HTFC流式细胞仪(Intellicyt)，在ForeCytTM软件上进行资料分析。
选择给出阳性信号(至少包括弱阳性信号)的所有杂交瘤用于进一步表征。为了在这第1次筛选测试后对杂交瘤进行排序，根据结合水平将它们的谱标注成+/-至+++。选择35个克隆并转移到新的板中用于第二次流式细胞术筛选测定。
流式细胞术筛选#2
为了验证结果和第一次筛选的选择，有必要基于与筛选#1相同的方法对所选的35个克隆执行第二次筛选。通过流式细胞术证实总共19个克隆对于人Nectin-4表达性细胞系呈阳性。还保留了具有较低MFI的四个克隆。这些杂交瘤在24孔板中扩增至1mL。收获上清液，并且将细胞在RA1裂解缓冲液中冷冻以保存RNA。
总之，通过流式细胞术评价了近1000种杂交瘤上清液对人Nectin-4表达性CHO细胞系的结合性质。2轮筛选后，选择23个杂交瘤用于进一步表征和Koff确定。
Koff筛选
对23个所选的克隆执行Koff筛选。此测试允许确定杂交瘤上清液中存在的每种抗体的解离速率。用于此测试的蛋白质是具有如下氨基酸序列的单体huNectin4-his-BirA蛋白：
GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASHHHHHHLHHILDAQKMVWNHR(SEQ ID NO:30)
简言之，使用AMC抗小鼠Fc生物传感器(Fortebio Corp.)，通过在Kinetic缓冲液1X(KB1X)中浸泡10分钟，然后在RPMI培养基中浸泡10分钟，用200μL/孔平衡，将所选的抗体上清液在200μL最终体积的KB1X中1/3稀释，并将重组蛋白huNectin4-BirA蛋白在KB1X中稀释到100nM。步骤描述于下表中，其中对于每个步骤，制备96孔板(200μL的每种缓冲液)。在Fortebio数据分析上获得结果。
筛选#1、#2导致选择了9种抗体用于克隆过程。Koff筛选显示，所有测试的抗体都具有高Koff(范围从3.75E-3s-1至5.88E-3s-1)，表明对于这些抗体，抗体/蛋白质相互作用的解离是快速的。
与锚定的Nectin-4结构域缺失蛋白的结合
新抗体作为人IgG1同种型(用于下文中的进一步测试)重组产生，并且与已知的比较抗体恩弗妥单抗和N4一起测试，评估它们结合人Nectin-4上的不同结构域的能力。FDA批准的ADC维汀-恩弗妥单抗的抗体组分恩弗妥单抗(ASG-22ME)已经证明作为ADC具有高内化能力和有效抗肿瘤活性。抗体N41作为ADC具有高内化能力和有效抗肿瘤活性。恩弗妥单抗和N41都被认为结合膜上远端处Nectin-4的Ig样V型结构域。
野生型huNectin4蛋白由下表1中总结的三个细胞外Ig样结构域(V、C1和C2)组成。
表1
通过流式细胞术使用被制备成表达野生型人Nectin-4蛋白的细胞和被制备成表达经修饰的Nectin-4的细胞来表征抗体在Nectin-4结构域上的结合，该经修饰的Nectin-4具有Ig样C2 1型结构域和Ig样C2 2型结构域并且缺乏Ig样V结构域(C1C2构建体)。后一种蛋白质另外带有用于流式细胞术细胞分选的V5标签，并且细胞被用作Nectin4-C1C2-V5分选的细胞。
野生型Nectin-4(Cl.3C8细胞系)、C2构建体(含有Ig样C2 2型结构域且缺少V结构域和C1结构域)和C1C2构建体允许确定测试抗体是否与V结构域或不同的C结构域结合。简而言之，通过PCR扩增编码不同人Nectin-4结构域的核酸序列。将PCR产物在适当的限制性位点处插入到表达载体中。添加前导肽，并且对于C1C2和C2，添加具有氨基酸序列GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:41)的N末端V5标签，并通过流式细胞术确认细胞表面的表达。所产生的含有不同的人Nectin-4结构域片段的蛋白质的氨基酸序列如下所示(V5标签带下划线)。然后，将载体转染到CHO细胞系中以获得在细胞表面表达不同Nectin-4结构域蛋白的稳定克隆。
huNectin4 Cl.3C8细胞系(野生型Nectin-4)中的Nectin-4氨基酸序列：
GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV(SEQ ID NO:31)
huNectin4-C1C2-V5细胞系(缺少V结构域)中的Nectin-4氨基酸序列：
PPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV(SEQ IDNO:32)
huNectin4-C2-V5细胞系(缺少V结构域和C1结构域)中的Nectin-4氨基酸序列：
ASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV(SEQ ID NO:33)
所选九种抗体中的三种不结合整个Nectin-4蛋白。此结果与Koff实验一致，显示这三种抗体在样品中的浓度不足以生成可靠的结果(捕获信号<0.3nm)。与整个(野生型)Nectin-4结合的结果在图4A中示出，并且与C1C2构建体结合的结果在图4B中示出。对于剩下的六种所选抗体，四种抗体保留与整个Nectin-4蛋白以及与缺乏Ig样V型结构域的C1C2构建体的完全结合，这表明它们在C1和/或C2结构域内结合。相比之下，金标准内化抗体N41和恩弗妥单抗与整个Nectin-4蛋白结合并且丧失与C1C2构建体的所有结合。N41和恩弗妥单抗因此与V结构域内的Nectin-4结合。两种抗体10B12(也称为mAb7)和5E7(也称为mAb6)显示出既不对应于抗Ig样V结构域抗体也不对应于抗Ig样C2 1型和/或2型结构域抗体的谱。在1μg/mL的浓度下，mAb 1-5显示在100000范围内的荧光(MFI)值，而mAb 6和7的MFI介于5000和15000之间。因此，抗体5E7和10B12显示与C1C2构建体结合的部分丧失，表明它们部分在V结构域上并且部分在Ig样C2 1型结构域上结合Nectin-4，其中与C1C2构建体结合的丧失被证实是当用克隆和纯化的抗体重复时结合的降低但不是完全丧失。鉴于Nectin-4蛋白的结构分析以及对人、食蟹猴、大鼠和小鼠Nectin-4的抗体结合谱，认为抗体10B12(mAb7)和5E7(mAb6)在结构域C1和V的连接处结合Nectin-4。图5表示了Nectin-4和抗体的结构域。
与Hu-Nectin4 IgC1C2-V5分选细胞结合的EC50值
总而言之，获得并表征了超过35种抗体，并且在此免疫中获得的抗体基本上都是结合Ig样C2 1型和/或2型结构域的抗体。未获得对Ig样V组(V set)结构域具有特异性的抗体，该Ig样V组结构域与ADC中使用的高度内化金标准抗体相关。
实施例5：通过流式细胞术滴定测定表征与Nectin-4的结合
尽管在实施例4中未获得恩弗妥单抗或N41样抗Ig样V组结构域抗体，但是结合Ig样C2 1型和/或2型结构域的抗体未被丢弃，并且仍然在流式细胞术滴定测定中、在它们内化能力的测定中以及在与拓扑异构酶抑制剂(喜树碱类似物德卢替康)缀合的直接细胞毒性测定中进一步表征。
在这个实验中，通过流式细胞术评估了抗Nectin-4抗体结合SUM185细胞(表达相对高水平的Nectin-4)上的Nectin-4的能力。将一定浓度范围的抗体在细胞顶部温育，并且通过添加二级抗体“山羊抗人H+L PE”来揭示结合的抗nectin-4抗体(荧光与抗nectin-4抗体与细胞的结合成正比)。简而言之，使用胰蛋白酶将SUM185细胞从烧瓶中分离(37℃，5分钟)，然后用培养基洗涤一次。将50000个细胞与从20μg/ml开始的一定浓度范围的测试抗体(8个点，稀释因子4)在4℃下一起温育30分钟。细胞用冰冷的SB洗涤三次，并且通过在冰上以1/200添加二级抗体“山羊抗人H+L PE”(Jackson Immunoresearch)30分钟来揭示结合的抗-nectin-4抗体。细胞用冰冷的SB洗涤两次。在流式细胞仪上进行采集。
图6中示出了结果。根据它们的结合谱观察到存在两组不同的抗Nectin-4抗体。大体来讲，除了两种抗体之外，实施例4的新抗体具有与恩弗妥单抗相似的谱，显示出与SUM185细胞结合的相似高的平台。实施例4的两种抗体5E7(mAb6)和10B12(mAb7)是例外，其具有特征在于与SUM185细胞结合的较低平台的不同谱。图6示出了实施例4的不同抗体和同种型对照(IC)在SUM185细胞上的结合谱。根据这个实验，C1和/或C2特异性抗体(mAb1-5)大体上表现出具有与恩弗妥单抗相当的结合谱。
实施例6：细胞内内化
在表达较低水平nectin-4的SUM190细胞系和表达较高水平Nectin-4的SUM185细胞中评估抗Nectin-4抗体诱导nectin-4内化的能力。通过使用Fab-ZAP人内化试剂盒(Advanced Targeting Systems)间接确定内化，以允许抗Nectin-4抗体靶向和消除Nectin-4表达性细胞，并且使用CTG底物(CellTiter-发光细胞活力测定(Promega))测量细胞活力。Fab-ZAP是山羊抗人单价抗体和核糖体失活蛋白皂草素的化学缀合物。所使用的抗体是针对人IgG的重链和轻链两者的亲和纯化的多克隆抗体。这种二级抗体用于评估初级抗体内化的潜力。
简而言之，将一定浓度范围的抗Nectin-4抗体或对照与SUM190或SUM185细胞一起温育。在4℃下温育45分钟后，洗去未结合的抗体，并且将Fab-ZAP添加到细胞顶部。将新形成的复合物(抗nectin-4抗体+Fab-ZAP)内化到释放皂草素的细胞中并停止蛋白质合成，从而导致细胞死亡。抗体的内化能力间接由细胞活力确定：细胞杀伤效率越高；抗体的内化能力越好。
图7A示出了SUM190细胞上的内化，显示了将每种抗体以及恩弗妥单抗的发光与抗Nectin-4抗体浓度绘制在图表上。与阴性对照(IC)相比，实施例4的多种新的抗Nectin-4抗体诱导Nectin-4的内化，并且连续地诱导细胞的死亡。然而，结合Ig样C2 1型和/或2型结构域而不结合Ig样V组结构域的5种抗体在诱导内化方面的效力都比恩弗妥单抗低得多，表明高度内化抗体是结合Ig V组结构域的抗体。然而，两种非IgV、非C1C2抗体(5E7和10B12)在诱导内化方面与恩弗妥单抗一样有效。
图7B示出了与恩弗妥单抗相比，mAb6在SUM185细胞上的内化，显示了将每种抗体的发光与抗Nectin-4抗体浓度绘制在图表上。抗体5E7(mAb6)在诱导SUM185细胞中的内化方面比恩弗妥单抗更有效。
实施例7：作为ADC的新抗体对肿瘤细胞系的体外细胞毒性
Nectin-4低/SUM 190乳腺癌模型
我们评估了与喜树碱类似物(Dxd或依喜替康)缀合的5E7抗体(mAb6)杀死SUM190细胞的能力。在这个实验中，对5E7抗体，连同以相等药物/抗体比率与相同毒素缀合的抗Ig样V结构域抗体恩弗妥单抗和N41及对照抗体一起进行了测试。制备第一ADC，其中通过接头以8个毒素/抗体(DAR＝8)将抗体缀合至喜树碱类似物(Dxd)，该接头包含具有以下所示结构的细胞内可切割的四肽接头(GGFG)，称为ggfg-Dxd：
制备第二ADC，其中通过可切割接头以8个毒素/抗体(DAR＝8)将抗体缀合至另一种喜树碱类似物(依喜替康)，该可切割接头具有以下结构，称为PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康：
简而言之，将不同剂量范围(起始点150nM，3个点的稀释因子2，然后5个点的稀释因子5)的每种测试抗体与细胞一起温育5天，然后通过添加CTG底物测量细胞活力。将发光与抗体浓度绘制在图表上。
对于每种ADC，将一定浓度范围的ADC与nectin-4表达性细胞一起温育。温育后，以1/1的比率添加CTG底物，并且用读板器(Enspire)读取发光信号。允许定量存在的ATP(代谢活性细胞的指示物)，其与细胞活力成正比。
结果在图8A和8B中示出。图8A示出了mAb6(5E7)抗体以及同种型对照抗体(IC)对人乳腺癌细胞的杀伤，该mAb6抗体与喜树碱类似物Dxd(通过GGFG-Dxd接头)或依喜替康(通过(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康)接头)缀合，全部以相等的药物/抗体比(DAR＝8)，并且与V结构域结合EnhertuTM(曲妥珠单抗德卢替康(抗HER2))比较。图8B示出了与包含相同喜树碱类似物的接头缀合的mab6(5E7)以及与喜树碱类似物缀合的免疫对照、以相同的DAR缀合至包含喜树碱类似物的接头的mAb3和EnhertuTM对人乳腺癌细胞的杀伤。
三种Nectin-4靶向的ADC比非靶向的ADC(IC-GGFG-喜树碱)更高效地降低细胞活力。无论使用何种接头，EnhertuTM和5E7缀合的任一种包含喜树碱类似物的接头都比缀合至喜树碱类似物的mAb3更有效。
SUM185、MDA-MB-468、MC38和B16F10细胞系
进一步测试与依喜替康(通过PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康接头)缀合的抗体5E7对其它癌细胞系的细胞杀伤。图8C示出了“5E7-依喜替康”(缀合至依喜替康接头(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康)的5E7)能够引起HER-2和Nectin-4表达性SUM185和SUM190以及MDA-MB-468(TNBC)人肿瘤细胞和人Nectin-4表达性MC38(结肠癌)和B16F10(黑色素瘤)鼠肿瘤细胞的死亡的功效。细胞活力的EC50值如下所示。
实施例8：用于表征抗IgVC1抗体结合的改进流式细胞术滴定测定
由于被抗体5E7识别的Nectin-4受体的特异性结构域，改进了实施例5的流式细胞术滴定方案。假设在实施例5中，胰蛋白酶以影响或破坏抗VC1结构域抗体5E7的表位的方式切割肿瘤细胞上的Nectin-4。为了探索这种可能性，在用胰蛋白酶分离后，使肿瘤细胞生长过夜以便允许Nectin-4的再表达。
使用胰蛋白酶将SUM190 nectin-4表达性细胞从烧瓶中分离(37℃，5分钟)，然后用培养基洗涤一次。将50,000个细胞/孔接种到96孔平底板中，并在温育箱中在37℃下温育过夜。从20μg/ml开始(3个点，稀释因子20)制备不同剂量范围的抗体，并在洗涤过的细胞上在4℃下温育60分钟。细胞在冰上用冰冷SB(染色缓冲液)洗涤两次，并且通过在冰上以1/200添加二级抗体“山羊抗人H+L PE”(Jackson Immunoresearch)30分钟来揭示结合的抗-nectin-4抗体。通过上下移液几次来分离细胞，转移到96孔U底板中，并用SB洗涤三次。在流式细胞仪上进行采集。
实施例9：ADC在人乳腺癌小鼠模型(Nectin-4低/SUM190模型)中的体内功效
我们在人乳腺癌小鼠模型中比较了作为喜树碱ADC的5E7抗体与恩弗妥单抗和N41的功效。在这个实验中，将5E7抗体连同以8个毒素/抗体(DAR＝8)的相等药物/抗体比与ggfg-Dxd接头缀合的恩弗妥单抗和N41及对照抗体一起测试。
将SUM190细胞皮下移植到CB17-SCID免疫缺陷小鼠中，剂量为100μl Matrigel中50万个细胞，生长因子在PBS中以1/2稀释。当肿瘤达到介于195mm3和250mm3之间的体积时，将小鼠随机分成9只小鼠的组，单次注射3mg/kg喜树碱ADC进行静脉内治疗。每周两次跟踪肿瘤生长。使用GraphPad Prism V7软件根据以下标准建立Kaplan Meier生存曲线：当肿瘤体积达到1500mm3时，小鼠被安乐死并在处死当天被认为死亡(D)。当肿瘤出现坏死迹象时，小鼠被安乐死并在同一天被认为死亡(D)(在个体肿瘤生长的图表上用红色星号表示)。
结果显示，在10mg/kg剂量下，所有ADC在防止肿瘤体积增加方面类似地高效。然而，在较低剂量的ADC(3mg/kg)下，抗体5E7显示出很强的阻止肿瘤生长的能力，而N41和恩弗妥单抗都不再显示出控制肿瘤生长的能力。图9中示出了3mg/kg剂量的结果。
实施例10：ADC在药物抗性的乳腺癌模型(人乳腺癌，HER2/Nectin-4高/SUM185模 型)中的比较性体外功效
我们接下来评估了与PADCEVTM(维汀-恩弗妥单抗)和ENHERTUTM相比，与喜树碱类似物缀合的5E7抗体杀死SUM185细胞的能力。这种设置用作抗HER2抗性的模型。SUM185细胞以相对较高的水平表达Nectin-4，这些细胞中的Nectin-4表达水平约为HER2表达水平的两倍(参见实施例1)。在这个实验中，将5E7抗体作为具有DAR＝8的ADC与PADCEVTM(DAR＝4，FDA批准的PADCEVTM的规格)和对照抗体一起测试，这些对照抗体均以相等的药物/抗体比与相同的毒素缀合。5E7通过ggfg-Dxd接头与喜树碱类似物Dxd缀合。
简而言之，将不同剂量范围(起始点150nM，3个点的稀释因子2，然后5个点的稀释因子5)的每种测试抗体在细胞上温育5天，然后通过添加CTG底物测量细胞活力。将发光与抗体浓度绘制在图表上。
对于每种ADC，将一定浓度范围的ADC与nectin-4表达性细胞一起温育。温育后，以1:1的比率添加CTG底物，并且用读板器(Enspire)读取发光信号，从而允许量化存在的ATP(代谢活性细胞的指示物)，其与细胞活力成正比。
图10中示出了结果。5E7-ggfg-Dxd和PADCEVTM能够比ENHERTUTM更高效地杀死SUM185。在每种情况下，Nectin 4靶向的ADC比它们的非靶向ADC(IC)对应物更高效地降低细胞活力。
实施例11：抗Nectin-4抗体的物种交叉反应性的表征
通过流式细胞术测试抗Nectin-4抗体与被制备成分别表达小鼠、食蟹猴和大鼠Nectin-4蛋白(包括在以下序列中未示出的N末端V5标签)的不同CHO细胞系的结合。
由细胞表达的蛋白质的成熟氨基酸序列如下：
小鼠Nectin-4：
ELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDPDEQVGQVAWARVDPNEGIRELALLHSKYGLHVNPAYEDRVEQPPPPRDPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARMRLRVLVPPLPSLNPGPPLEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTQSSRSFTHPRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDRRITHTLQVAFLAEASVRGLEDQNLWQVGREGATLKCLSEGQPPPKYNWTRLDGPLPSGVRVKGDTLGFPPLTTEHSGVYVCHVSNELSSRDSQVTVEVLDPEDPGKQVDLVSASVIIVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHSDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRTEEDDDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV(SEQ ID NO:34)
大鼠Nectin-4：
MPLSLGAEMWGPEAWLLLLFLASFTGRYSAGELETSDLVTVVLGQDAKLPCFYRGDPDEQVGQVAWARVDPNEGTRELALLHSKYGLHVSPAYEDRVEQPPPPRDPLDGSILLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARMRLRVLVPPLPSLNPGPPLEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTQSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHTLQVAFLAEASVRGLEDQNLWHVGREGATLKCLSEGQPPPKYNWTRLDGPLPSGVRVKGDTLGFPPLTTEHSGVYVCHVSNELSSRASQVTVEVLDPEDPGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRTEEEDDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV(SEQ ID NO:35)
食蟹猴Nectin-4：
GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARADAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHVGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRTEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV(SEQ ID NO:36)
实施例4的所有抗Nectin-4抗体结合人和食蟹猴Nectin 4蛋白，但缺乏与小鼠Nectin 4蛋白的结合。仅5E7、10B12显示了与大鼠Nectin 4表达性细胞的结合。图11A和11B示出了抗Nectin-4抗体在大鼠和食蟹猴Nectin-4表达性CHO细胞系上的结合。
实施例12：Nectin家族交叉反应性的表征
通过流式细胞术测试抗Nectin-4抗体与被制备成分别表达人Nectin 1、Nectin2、Nectin 3和PVR蛋白的不同CHO细胞系的结合。分别用已知的抗人Nectin1、抗人Nectin2、抗人Nectin3和抗人PVR抗体控制和验证每种细胞系的表达。由细胞表达的蛋白质的成熟氨基酸序列如下：
Nectin-1：
MGLAGAAGRWWGLALGLTAFFLPGVHSQVVQVNDSMYGFIGTDVVLHCSFANPLPSVKITQVTWQKSTNGSKQNVAIYNPSMGVSVLAPYRERVEFLRPSFTDGTIRLSRLELEDEGVYICEFATFPTGNRESQLNLTVMAKPTNWIEGTQAVLRAKKGQDDKVLVATCTSANGKPPSVVSWETRLKGEAEYQEIRNPNGTVTVISRYRLVPSREAHQQSLACIVNYHMDRFKESLTLNVQYEPEVTIEGFDGNWYLQRMDVKLTCKADANPPATEYHWTTLNGSLPKGVEAQNRTLFFKGPINYSLAGTYICEATNPIGTRSGQVEVNITEFPYTPSPPEHGRRAGPVPTAIIGGVAGSILLVLIVVGGIVVALRRRRHTFKGDYSTKKHVYGNGYSKAGIPQHHPPMAQNLQYPDDSDDEKKAGPLGGSSYEEEEEEEEGGGGGERKVGGPHPKYDEDAKRPYFTVDEAEARQDGYGDRTLGYQYDPEQLDLAENMVSQNDGSFISKKEWYV(SEQ ID NO:37)
Nectin-2：
MARAAALLPSRSPPTPLLWPLLLLLLLETGAQDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGGIIGGIIAAIIATAVAATGILICRQQRKEQTLQGAEEDEDLEGPPSYKPPTPKAKLEAQEMPSQLFTLGASEHSPLKTPYFDAGASCTEQEMPRYHELPTLEERSGPLHPGATSLGSPIPVPPGPPAVEDVSLDLEDEEGEEEEEYLDKINPIYDALSYSSPSDSYQGKGFVMSRAMYV(SEQ ID NO:38)
Nectin-3：
MARTLRPSPLCPGGGKAQLSSASLLGAGLLLQPPTPPPLLLLLFPLLLFSRLCGALAGPIIVEPHVTAVWGKNVSLKCLIEVNETITQISWEKIHGKSSQTVAVHHPQYGFSVQGEYQGRVLFKNYSLNDATITLHNIGFSDSGKYICKAVTFPLGNAQSSTTVTVLVEPTVSLIKGPDSLIDGGNETVAAICIAATGKPVAHIDWEGDLGEMESTTTSFPNETATIISQYKLFPTRFARGRRITCVVKHPALEKDIRYSFILDIQYAPEVSVTGYDGNWFVGRKGVNLKCNADANPPPFKSVWSRLDGQWPDGLLASDNTLHFVHPLTFNYSGVYICKVTNSLGQRSDQKVIYISDPPTTTTLQPTIQWHPSTADIEDLATEPKKLPFPLSTLATIKDDTIATIIASVVGGALFIVLVSVLAGIFCYRRRRTFRGDYFAKNYIPPSDMQKESQIDVLQQDELDSYPDSVKKENKNPVNNLIRKDYLEEPEKTQWNNVENLNRFERPMDYYEDLKMGMKFVSDEHYDENEDDLVSHVDGSVISRREWYV(SEQ ID NO:39)
PVR(Nectin-5)：
DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGISRNAIIFLVLGILVFLILLGIGIYFYWSKCSREVLWHCHLCPSSTEHASASANGHVSYSAVSRENSSSQDPQTEGTR(SEQ ID NO:40)
结果显示，抗Nectin-4抗体对人Nectin家族成员没有交叉反应性。图显示了抗Nectin-4抗体对表达人Nectin 1、人Nectin 2、人Nectin 3和人PVR的CHO细胞的流式细胞术结果。没有抗体呈现出与各细胞系结合。
实施例13：通过SPR的亲和力测定
通过SPR(表面等离子体共振)方法测试抗体对野生型人Nectin-4蛋白的结合亲和力。在25℃下在Biacore T200 ap设备(通用电气医疗集团的Biacore)上进行测量。用Biacore T100评价软件对传感图进行分析。使用具有约600RU的固定化蛋白A的CMR传感器芯片。将抗Nectin-4抗体捕获到蛋白A芯片上(将抗体在HBS-EP+1X缓冲液中稀释至1μg/ml，并以40μL/min注射120s)。将重组人单体huNectin4-his-BirA蛋白以100nM至1.56nM范围内的不同浓度注射到捕获抗体上(HuNectin4-His-BirA在HBS-EP+1X中以1/2稀释液稀释，以40μl/min注射120s)，并允许解离600s。芯片用NaOh 10mM 2X以40μl/min再生30s。根据曲线的轮廓使用1:1动力学结合模型或两态反应模型拟合传感器图集。
结果在下表中示出。KD差异大体来讲似乎不与5E7和10B12抗体在消除肿瘤细胞的能力方面的效力增加相关。因此，结合亲和力并不能解释抗体作为ADC的效力差异。
实施例14：通过SPR通过竞争结合Nectin-4的表位作图
通过SPR(表面等离子体共振)方法以及使用Ni-NTA(NTA)生物传感器(Fortebio)的OCTET分析，测试实施例13的抗体以及先前报道的抗体N4.1(N41)、抗体14A5和恩弗妥单抗彼此竞争结合野生型人Nectin-4蛋白的能力。简而言之，将在Kinetic缓冲液10X中稀释至5μg/mL的人Nectin4-His-BirA蛋白捕获到生物传感器上。注射在Kinetic缓冲液10X中稀释至10μg/mL的第一抗体，然后第二次注射在Kinetic缓冲液10X中稀释至10μg/mL的第一抗体，以便使信号饱和。注射在Kinetic缓冲液10X中稀释至10μg/mL的第二抗体。
结果在下表中示出。黑色方块表示第一抗体和第二抗体之间的实质性或直接竞争(第一抗体阻止第二抗体的结合/引起第二抗体的结合的丧失)，灰色方块表示潜在的部分竞争(第一抗体引起第二抗体的结合的潜在减少但不丧失)，白色方块表示无竞争。抗体5E7和10B12彼此竞争结合Nectin-4。然而，在5E7或10B12与任何其它抗体之间不存在竞争，除了用结合Ig样V结构域的抗体观察到的结合的潜在部分减少。抗Ig样C2 2型结构域抗体(mAb1-5)彼此竞争结合Nectin-4，抗Ig样V结构域抗体也是如此。
实施例15：使用Nectin-4点突变体的抗体的表位作图
细胞表面表达的人Nectin-4点突变体
抗Nectin-4抗体在全长和Ig样V结构域缺失蛋白上的结合谱、以及抗体的物种结合谱(结合人、食蟹猴和大鼠Nectin-4，但不结合小鼠Nectin-4)、以及非人Nectin-4蛋白之间的物种间差异，允许鉴定Ig样V结构域和Ig样C2 1型结构域(也称为“C1”)的连接处的残基。与公开的Nectin-4结构域的结构组合，设计了表面暴露的氨基酸残基处的Nectin-4突变。基于蛋白质数据库参考：4FRW(结构域V和C1)，对Nectin-4结构域结构建模。使用的人Nectin-4是NCBI参考序列：NP_112178.2，使用的小鼠Nectin-4是NCBI参考序列：AAL79833.1，使用的食蟹猴Nectin-4是NCBI参考序列：XP_005541277.1，使用的大鼠Nectin-4是NCBI参考序列：NP_001102546.1。表达Nectin-4突变体的细胞然后用于测试抗Nectin-4抗体与不同Nectin-4突变体的结合丧失，以鉴定结合Nectin-4上的相同位点的抗体。特别地，在残基K197T和/或S199A处具有C1-V连接处取代的突变体，或在结构域C1和V的连接处具有额外和/或相邻取代的突变体7、7bis和9，可鉴定具有作为免疫缀合物的有利应用的抗体。突变体7具有取代S195A/K197T/S199A。突变体7bis具有取代A72P/G73N/K197T/S199A。突变体9包括关键残基Q234取代，并且具有取代L150S/S152A/Q234R/I236S。图12A和12B示出了人Nectin-4蛋白的分子模型，表明了突变体7(12A)和突变体7bis(12B)中的取代残基的位置；这些突变体在C1结构域中鉴定在Nectin-4蛋白的相对面上的结构域C1和V结构域的连接处的两个位点。图13A和13B示出了人Nectin-4蛋白的分子模型的不同视图，表明了突变体1、2、3、4、5、6、7、8和9中的取代残基的位置。
通过PCR生成Nectin-4突变体。扩增的序列在琼脂糖凝胶上电泳，并且使用Macherey Nagel PCR Clean-Up Gel Extraction试剂盒纯化。然后用ClonTech InFusion系统将为每种突变体生成的纯化的PCR产物连接到表达载体中。将含有突变序列的载体制备成Miniprep并且测序。测序之后，使用Promega PureYieldTM质粒Midiprep系统，将含有突变序列的载体制备成Midiprep。在测试转基因表达之前，使HEK293T细胞在DMEM培养基(英杰公司(Invitrogen))中生长，使用英杰公司的Lipofectamine 2000用载体转染并且在37℃下在CO2温育箱中温育48小时。在Hek-293T细胞中转染突变体，如下表所示。靶向氨基酸突变在下表2中示出，该表列出了存在于野生型Nectin-4中的残基/存在于突变体Nectin-4中的残基/残基的位置，位置参考是具有SEQ ID NO:1中示出的前导肽的Nectin-4蛋白。
表2
抗体与Nectin-4突变体之间的缔合结果在下表中示出。(+)意指发生抗体-Nectin-4缔合。(-)意指未发生抗体-Nectin-4缔合。与突变体5相关的结果是无关的，因为不存在所述蛋白质的表达。
表3
因此，抗体10B12、5E7和6A7在Nectin-4上具有结合位点，该结合位点涵盖在突变体7和7bis(S195A/K197T/S199A和A72P/G73N/K197T/S199A)中突变的C1结构域残基。抗体6C11B在Nectin-4上具有结合位点，该结合位点涵盖在突变体3(A76S/Q77R/E78A/S91N)中突变的V结构域残基。抗体1B7A在Nectin-4上具有结合位点，该结合位点涵盖在突变体2(V90S/P92A/A93S/E95A/G96D)和突变体3(A76S/Q77R/E78A/S91N)中突变的V结构域残基。
因此，抗体10B12、5E7和6A7结合与恩弗妥单抗、N41和14A5(它们结合Nectin-4的V结构域上的表位)的结合不同的Nectin-4上的表位。尽管6C11B和恩弗妥单抗结合Nectin-4的相同区域，但它们的表位是不同的。
实施例16：抗VC 1结构域抗体的第二次免疫和定向筛选
为了获得具有与抗体5E7和10B12相同或相似功能性质的其它抗体，使用实施例4的方法进行进一步免疫。使用具有与C末端6-His标签融合的全长野生型Nectin-4氨基酸序列的重组人Nectin-4蛋白使Balb/c小鼠免疫，随后在被制备成在表面处表达全长人Nectin-4的CHO细胞系上确定每种血清的滴度以选择用于融合的最佳应答小鼠。
使杂交瘤生长，并且收获上清液，并使用上文所述的野生型Nectin-4表达性Cl.3C8细胞通过流式细胞术在两个连续筛选(筛选#1和确认筛选#2)中筛选与Nectin-4的结合，其中抗体5E7用作阳性对照，同种型对照作为阴性对照。扩增这些杂交瘤，收获上清液，并且冷冻细胞以保存RNA。
如实施例4中那样，通过这个方法，在表达野生型Nectin-4的CHO细胞系上观察到两组滴定，第一组的大部分抗体具有较高平台，并且第二轮廓具有较低平台，该较低平台由具有与5E7基本上相同的IC50的一种抗体表示。
通过确定在人、大鼠、小鼠和食蟹猴Nectin-4上的物种交叉反应性以及如实施例4中的与Nectin-4结构域取代的蛋白质的结合来进一步表征所选的杂交瘤。使用含有整个Nectin-4蛋白的野生型人Nectin-4细胞系和人Nectin4-C1C2-V5分选细胞系，通过流式细胞术评估新抗体结合人Nectin-4上的不同结构域的能力。
在Nectin-4表达性Cl.3C8细胞上滴定的抗体之中(观察到与5E7相当的IC50值)，六种抗体结合Ig样V结构域，显示与整个Nectin-4蛋白的结合，丧失与C1C2构建体的所有结合，七种抗体是抗Ig样C2 1型结构域结合剂，显示与整个Nectin-4蛋白以及C1(仅具有C2 1型结构域)和C1C2构建体(仅具有C2 1型结构域和C2 2型结构域)的完全结合。两种抗体(克隆6C11B和6A7)显示出与野生型Nectin-4结合的部分丧失并且保留与C1C2构建体的结合，以及与C1构建体结合的丧失，这表明它们部分在V结构域上并且部分在Ig样C2 1型结构域上结合Nectin-4。
根据实施例11中的方法，通过流式细胞术测试抗Nectin-4抗体与被制备成分别表达小鼠、食蟹猴和大鼠Nectin-4蛋白的不同CHO细胞系的结合。抗体6C11B和6A7与大鼠和食蟹猴Nectin-4蛋白结合。如实施例12中那样，通过流式细胞术进一步测试抗Nectin-4抗体与被制备成分别表达人Nectin 1、Nectin 2、Nectin 3和PVR蛋白的不同CHO细胞系的结合。抗体6C11B和6A7分别不结合人Nectin 1、Nectin 2、Nectin 3和PVR蛋白中的任一种。如实施例14中那样，通过SPR通过评估竞争结合Nectin-4来进行表位作图。抗体6A7与5E7竞争结合人Nectin-4，而抗体6C11B不与5E7竞争结合人Nectin-4。5E7和6A7鉴定了不同于6C11B的表位箱，这可以通过抗体在Nectin-4蛋白的不同或相对面上的结构域C1和V的连接处与Nectin-4的结合来解释。图12，如上文所讨论，示出了Nectin-4的第一面上的表位箱，其涉及突变体7中被取代残基中的一个或多个，以及Nectin-4的第二面上的另一个表位箱，其涉及突变体9中被取代残基中的一个或多个。
如实施例6中那样，使用Fab-ZAP人内化试剂盒(Advanced Targeting Systems)在SUM190细胞系上评估抗nectin-4抗体诱导nectin-4内化的能力，使用CTG底物(CellTiter-发光细胞活力测定(Promega))测量细胞活力。图14A和14B分别示出了与5E7相比，抗体6C11B和6A7各自的内化(测量为发光的细胞活力)，表明6C11B和6A7均显示出诱导肿瘤细胞上Nectin-4的细胞内内化的较强能力。
实施例17：抗Nectin 4抗体-药物缀合物(ADC)的体内功效
人乳腺癌细胞系SUM190PT(BioIVT 28068A1-6281)在以下含有Ham's F12、FBS1g/L、HEPES 10mM、乙醇胺5mM、胰岛素5μg/mL、氢化可的松1μg/mL、脱铁转铁蛋白5μg/mL、三碘甲状腺原氨酸(T3)6.7ng/mL、亚硒酸钠8.7ng/mL的细胞培养基中培养。
使用7周龄至8周龄的免疫缺陷CB17-SCID小鼠。产生具有人Fc区的抗Nectin-4抗体恩弗妥单抗、5E7、6A7、6C11B和1B7A，并且将它们通过细胞内可切割的接头ggfg-Dxd或PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康与有效载荷Dxd(德卢替康)或依喜替康缀合。ggfg-Dxd接头将在切割时释放Dxd(德卢替康)，并且PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康接头将在切割时释放依喜替康。
将SUM190细胞皮下移植到CB17-SCID免疫缺陷小鼠中，剂量为100μl Matrigel中50万个，该Matrigel含有在PBS中以1/2稀释的生长因子。在第21天，当肿瘤根据实验达到146.9mm3±63.2mm3或213.2mm3±77.5mm3的平均体积时，根据实验将小鼠随机分成8只或9只小鼠的组，并且通过单次注射3mg/kg体重或10mg/kg体重的ADC或作为对照的PBS进行静脉内治疗。每周两次跟踪肿瘤生长。使用GraphPad Prism V7软件根据以下标准建立KaplanMeier生存曲线：当肿瘤体积达到1500mm3时，小鼠被安乐死并在处死当天被认为死亡(D)。当肿瘤高度坏死时，小鼠被安乐死并在同一天被认为死亡(D)。
图15A和15B中呈现了3mg/kg剂量的结果，其中可以看出，被发现丧失与具有K197T/S199A突变的Nectin-4结合的抗IgVC1 ADC 5E7-ggfg-Dxd和6A7-ggfg-Dxd在限制小鼠中肿瘤生长方面表现出最高的效率。此外，ADC 6C11-ggfg-Dxd和1B7A-ggfg-Dxd在控制肿瘤生长方面比恩弗妥单抗-ggfg-Dxd和N4.1-ggfg-Dxd稍微更高效。
此外，与缀合至被设计成在接头切割时释放Dxd的ggfg-Dxd的5E7相比，缀合至被设计成在接头切割时释放依喜替康的PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康的5E7在控制小鼠中的肿瘤生长方面显示出更高的效率，如图15C的10mg/kg剂量所示。
实施例18：ADC在Pg-p表达性癌症模型中的体外功效
内源性表达MDR1 P-糖蛋白(Pgp)的MC-38细胞被工程化以表达Nectin-4并在DMEM+10％ FBS中培养。在ADC的存在下，用媒介物(DSMO)或用已知作为Pgp抑制剂的环孢菌素A(5μM，DMSO中的储备溶液)处理细胞。所测试的ADC如下：
(a)PADCEVTM，
(b)通过在切割时释放Dxd的ggfg-Dxd接头缀合至德卢替康(Dxd)的抗体5E7(5E7-GGFG-DxD)，和
(c)通过在切割时释放依喜替康的PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康接头缀合至依喜替康的抗体5E7(5E7-依喜替康)。
ADC和等效同种型对照ADC以150nM至2.3 10-3nM的剂量范围使用。与细胞共温育5天后，通过加入Cell Titer GloTM(CTG)底物来测量细胞活力。将发光与抗体浓度作图。
图16A示出了用PadcevTM(维汀-恩弗妥单抗)、缀合至Dxd的抗体5E7或缀合至依喜替康的5E7处理的细胞的发光(指示细胞活力)。具有依喜替康(5E7-依喜替康)作为有效负载的ADC在这种药物抗性设置中高度有效地降低细胞活力。图16B示出了在存在或不存在Pgp抑制剂环孢素的情况下，以150nM ADC并归一化成对照抗体，用PadcevTM(维汀-恩弗妥单抗)、缀合至Dxd的抗体5E7或缀合至依喜替康的5E7处理的MC38细胞的肿瘤生长(曲线下面积)。结果表明PadcevTM和缀合至Dxd的抗体5E7的抗肿瘤活性受到Pgp的负面影响。
实施例19：ADC在Pg-p表达性癌症模型中的体内功效
内源性表达MDR1 P-糖蛋白的MC-38细胞被工程化以表达Nectin-4并培养。在实验的第1天，在7周龄至8周龄的免疫缺陷CB17-SCID小鼠中皮下注射MC-38细胞，剂量为100μlMatrigel中50万个细胞，该Matrigel含有在PBS中以1/2稀释的生长因子。在这个实验中测试的ADC如下：
(a)PADCEVTM，
(b)通过在切割时释放Dxd的ggfg-Dxd接头缀合至德卢替康(Dxd)的抗体6A7(6A7-德卢替康)，和
(c)通过在切割时释放依喜替康的PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依喜替康接头缀合至依喜替康的抗体6A7(6A7-依喜替康)。
在第一个实验中，第7天时，对每只小鼠静脉内注射10mg/kg的单剂量的维汀-恩弗妥单抗(PADCEVTM)或缀合至依喜替康或德卢替康的抗体6A7。在第二个实验中，第7、14和21天时，对每只小鼠静脉内注射10mg/kg的三个剂量的维汀-恩弗妥单抗(PADCEVTM)或缀合至依喜替康的6A7。从第一次注射开始跟踪小鼠的肿瘤体积。图17A(单剂量)和17B(三个剂量)呈现了随时间的平均肿瘤体积，直到每组发生两例死亡。图17A还显示，与单次注射维汀-恩弗妥单抗或单次注射缀合至德卢替康的6A7相比，单次注射缀合至依喜替康的6A7(右图中的最右侧曲线)诱导显著更高的肿瘤生长降低。此外，图17B显示，与一周注射三次维汀-恩弗妥单抗相比，一周连续注射三次缀合至依喜替康的6A7具有更大的抗肿瘤作用。
本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)据此全文以引用方式并入本文，就好像每篇参考文献单独且具体地指示为以引用方式并入并在本文中完全阐述一样(达到法律所允许的最大程度)，而不管在本文其他地方对特定文档进行的任何单独提供的并入。
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序列表
<110> 先天制药公司
<120> 癌症的治疗
<130> Nectin-4-2 PCT
<150> US 63/118,198
<151> 2020-11-25
<150> US 63/229,589
<151> 2020-08-05
<160> 57
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 1
Met Pro Leu Ser Leu Gly Ala Glu Met Trp Gly Pro Glu Ala Trp Leu
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Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Phe Thr Gly Arg Cys Pro Ala Gly
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Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp Ala
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Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly Gln
50 55 60
Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu Ala
65 70 75 80
Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu Gly
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Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser Val
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Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys Arg
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Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg Leu Arg
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Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Glu
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His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln
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Asn Leu Trp His Ile Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu Ser
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Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro
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Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro
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Thr Thr Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly
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<220>
<223> 人工
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Gly Glu Gln Val Gly Gln Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu
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Gly Ala Gln Glu Leu Ala Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val
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Gly Glu Tyr Glu Cys Arg Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln
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Val Lys Gly Thr Thr Ser Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala
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Ala Val Thr Ser Glu Phe His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly
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Gln Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu
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Arg
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Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Glu Glu Gly Gln
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Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr Ser Ser Arg Ser
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Arg Glu Leu Ile His Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Asn Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Phe Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 30
Gly Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp
1 5 10 15
Ala Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly
20 25 30
Gln Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu
35 40 45
Ala Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu
50 55 60
Gly Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser
65 70 75 80
Val Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys
85 90 95
Arg Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg Leu
100 105 110
Arg Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu
115 120 125
Glu Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr
145 150 155 160
Ser Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu
165 170 175
Phe His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys
180 185 190
Val Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Ile
195 200 205
Leu His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp
210 215 220
Gln Asn Leu Trp His Ile Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu
225 230 235 240
Ser Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly
245 250 255
Pro Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro
260 265 270
Pro Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn
275 280 285
Glu Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro
290 295 300
Gln Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser His His
305 310 315 320
His His His His Leu His His Ile Leu Asp Ala Gln Lys Met Val Trp
325 330 335
Asn His Arg
<210> 31
<211> 479
<212> PRT
<213> 人类
<400> 31
Gly Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp
1 5 10 15
Ala Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly
20 25 30
Gln Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu
35 40 45
Ala Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu
50 55 60
Gly Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser
65 70 75 80
Val Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys
85 90 95
Arg Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg Leu
100 105 110
Arg Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu
115 120 125
Glu Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr
145 150 155 160
Ser Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu
165 170 175
Phe His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys
180 185 190
Val Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Ile
195 200 205
Leu His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp
210 215 220
Gln Asn Leu Trp His Ile Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu
225 230 235 240
Ser Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly
245 250 255
Pro Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro
260 265 270
Pro Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn
275 280 285
Glu Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro
290 295 300
Gln Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val
305 310 315 320
Val Val Gly Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val
325 330 335
Val Val Leu Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr
340 345 350
Gln Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg
355 360 365
Arg Leu His Ser His His Thr Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser
370 375 380
Val Gly Leu Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser
385 390 395 400
Ser Cys Ser Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr
405 410 415
Leu Thr Thr Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro
420 425 430
Gly Ser Gly Arg Ala Glu Glu Glu Glu Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys
435 440 445
Gln Ala Met Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys
450 455 460
Pro Thr Gly Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val
465 470 475
<210> 32
<211> 363
<212> PRT
<213> 人类
<400> 32
Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Glu Glu Gly Gln
1 5 10 15
Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly Ser Pro Ala Pro
20 25 30
Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr Ser Ser Arg Ser
35 40 45
Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu Phe His Leu Val
50 55 60
Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys Val Val Ser His
65 70 75 80
Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Ile Leu His Val Ser
85 90 95
Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln Asn Leu Trp
100 105 110
His Ile Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu Ser Glu Gly Gln
115 120 125
Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro Leu Pro Ser
130 135 140
Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro Leu Thr Thr
145 150 155 160
Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu Phe Ser Ser
165 170 175
Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro Gln Glu Asp Ser
180 185 190
Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Val Val Gly Val
195 200 205
Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Leu Met
210 215 220
Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln Lys Tyr Glu
225 230 235 240
Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg Leu His Ser
245 250 255
His His Thr Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser Val Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser Ser Cys Ser Val
275 280 285
Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Thr Val
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Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly Ser Gly Arg
305 310 315 320
Ala Glu Glu Glu Glu Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys Gln Ala Met Asn
325 330 335
His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro Thr Gly Asn
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Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val
355 360
<210> 33
<211> 263
<212> PRT
<213> 人类
<400> 33
Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln Asn Leu Trp His Ile Gly Arg
1 5 10 15
Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu Ser Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser
20 25 30
Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro Leu Pro Ser Gly Val Arg Val
35 40 45
Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro Leu Thr Thr Glu His Ser Gly
50 55 60
Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro Gln Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val
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Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Val Val Gly Val Ile Ala Ala Leu
100 105 110
Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Leu Met Ser Arg Tyr His
115 120 125
Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Thr
130 135 140
Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg Leu His Ser His His Thr Asp
145 150 155 160
Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser Val Gly Leu Arg Ala Glu Gly His
165 170 175
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225 230 235 240
Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro Thr Gly Asn Gly Ile Tyr Ile
245 250 255
Asn Gly Arg Gly His Leu Val
260
<210> 34
<211> 477
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 34
Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp Ala
1 5 10 15
Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Pro Asp Glu Gln Val Gly Gln
20 25 30
Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Pro Asn Glu Gly Ile Arg Glu Leu Ala
35 40 45
Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Asn Pro Ala Tyr Glu Asp
50 55 60
Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asp Pro Leu Asp Gly Ser Val
65 70 75 80
Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys Arg
85 90 95
Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Met Arg Leu Arg
100 105 110
Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Pro Leu Glu
115 120 125
Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Gln Ser
145 150 155 160
Ser Arg Ser Phe Thr His Pro Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu Phe
165 170 175
His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys Val
180 185 190
Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Arg Arg Ile Thr His Thr Leu
195 200 205
Gln Val Ala Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln
210 215 220
Asn Leu Trp Gln Val Gly Arg Glu Gly Ala Thr Leu Lys Cys Leu Ser
225 230 235 240
Glu Gly Gln Pro Pro Pro Lys Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro
245 250 255
Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Lys Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro
260 265 270
Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Val Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu
275 280 285
Leu Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Glu Val Leu Asp Pro Glu
290 295 300
Asp Pro Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Ile Ile Val
305 310 315 320
Gly Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val
325 330 335
Leu Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln Lys
340 345 350
Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg Leu
355 360 365
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370 375 380
Leu Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser Ser Cys
385 390 395 400
Ser Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu Thr
405 410 415
Thr Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly Ser
420 425 430
Gly Arg Thr Glu Glu Asp Asp Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys Gln Ala
435 440 445
Met Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro Thr
450 455 460
Gly Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val
465 470 475
<210> 35
<211> 508
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 35
Met Pro Leu Ser Leu Gly Ala Glu Met Trp Gly Pro Glu Ala Trp Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ser Phe Thr Gly Arg Tyr Ser Ala Gly Glu
20 25 30
Leu Glu Thr Ser Asp Leu Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp Ala Lys
35 40 45
Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Pro Asp Glu Gln Val Gly Gln Val
50 55 60
Ala Trp Ala Arg Val Asp Pro Asn Glu Gly Thr Arg Glu Leu Ala Leu
65 70 75 80
Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu Asp Arg
85 90 95
Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asp Pro Leu Asp Gly Ser Ile Leu
100 105 110
Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys Arg Val
115 120 125
Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Met Arg Leu Arg Val
130 135 140
Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Pro Leu Glu Glu
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly Ser Pro
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys Val Val
210 215 220
Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Thr Leu Gln
225 230 235 240
Val Ala Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln Asn
245 250 255
Leu Trp His Val Gly Arg Glu Gly Ala Thr Leu Lys Cys Leu Ser Glu
260 265 270
Gly Gln Pro Pro Pro Lys Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro Leu
275 280 285
Pro Ser Gly Val Arg Val Lys Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro Leu
290 295 300
Thr Thr Glu His Ser Gly Val Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu Leu
305 310 315 320
Ser Ser Arg Ala Ser Gln Val Thr Val Glu Val Leu Asp Pro Glu Asp
325 330 335
Pro Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Val Val Gly
340 345 350
Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Leu
355 360 365
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370 375 380
Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg Leu His
385 390 395 400
Ser His His Thr Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser Val Gly Leu
405 410 415
Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Thr
435 440 445
Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly Ser Gly
450 455 460
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Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro Thr Gly
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Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val
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<210> 36
<211> 479
<212> PRT
<213> 狼
<400> 36
Gly Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp
1 5 10 15
Ala Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly
20 25 30
Gln Val Ala Trp Ala Arg Ala Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu
35 40 45
Ala Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu
50 55 60
Gly Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser
65 70 75 80
Val Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys
85 90 95
Arg Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg Leu
100 105 110
Arg Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu
115 120 125
Glu Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly
130 135 140
Ser Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr
145 150 155 160
Ser Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu
165 170 175
Phe His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys
180 185 190
Val Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Ile
195 200 205
Leu His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp
210 215 220
Gln Asn Leu Trp His Val Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu
225 230 235 240
Ser Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly
245 250 255
Pro Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro
260 265 270
Pro Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn
275 280 285
Glu Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro
290 295 300
Gln Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val
305 310 315 320
Val Val Gly Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val
325 330 335
Val Val Leu Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr
340 345 350
Gln Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg
355 360 365
Arg Leu His Ser His His Thr Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser
370 375 380
Val Gly Leu Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser
385 390 395 400
Ser Cys Ser Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr
405 410 415
Leu Thr Thr Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro
420 425 430
Gly Ser Gly Arg Thr Glu Glu Glu Glu Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys
435 440 445
Gln Ala Met Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys
450 455 460
Pro Thr Gly Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val
465 470 475
<210> 37
<211> 514
<212> PRT
<213> 人类
<400> 37
Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu Ala Leu Gly
1 5 10 15
Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Val His Ser Gln Val Val Gln Val
20 25 30
Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp Val Val Leu His Cys
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50 55 60
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Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg Leu Ser Arg Leu Glu
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115 120 125
Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Ala Lys Pro Thr
130 135 140
Asn Trp Ile Glu Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys Lys Gly Gln
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Asp Asp Lys Val Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn Gly Lys Pro
165 170 175
Pro Ser Val Val Ser Trp Glu Thr Arg Leu Lys Gly Glu Ala Glu Tyr
180 185 190
Gln Glu Ile Arg Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val Ile Ser Arg Tyr
195 200 205
Arg Leu Val Pro Ser Arg Glu Ala His Gln Gln Ser Leu Ala Cys Ile
210 215 220
Val Asn Tyr His Met Asp Arg Phe Lys Glu Ser Leu Thr Leu Asn Val
225 230 235 240
Gln Tyr Glu Pro Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe Asp Gly Asn Trp Tyr
245 250 255
Leu Gln Arg Met Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp Ala Asn Pro
260 265 270
Pro Ala Thr Glu Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Pro Lys
275 280 285
Gly Val Glu Ala Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Lys Gly Pro Ile Asn
290 295 300
Tyr Ser Leu Ala Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Asn Pro Ile Gly
305 310 315 320
Thr Arg Ser Gly Gln Val Glu Val Asn Ile Thr Glu Phe Pro Tyr Thr
325 330 335
Pro Ser Pro Pro Glu His Gly Arg Arg Ala Gly Pro Val Pro Thr Ala
340 345 350
Ile Ile Gly Gly Val Ala Gly Ser Ile Leu Leu Val Leu Ile Val Val
355 360 365
Gly Gly Ile Val Val Ala Leu Arg Arg Arg Arg His Thr Phe Lys Gly
370 375 380
Asp Tyr Ser Thr Lys Lys His Val Tyr Gly Asn Gly Tyr Ser Lys Ala
385 390 395 400
Gly Ile Pro Gln His His Pro Pro Met Ala Gln Asn Leu Gln Tyr Pro
405 410 415
Asp Asp Ser Asp Asp Glu Lys Lys Ala Gly Pro Leu Gly Gly Ser Ser
420 425 430
Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Glu Arg
435 440 445
Lys Val Gly Gly Pro His Pro Lys Tyr Asp Glu Asp Ala Lys Arg Pro
450 455 460
Tyr Phe Thr Val Asp Glu Ala Glu Ala Arg Gln Asp Gly Tyr Gly Asp
465 470 475 480
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Asn Met Val Ser Gln Asn Asp Gly Ser Phe Ile Ser Lys Lys Glu Trp
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<210> 38
<211> 538
<212> PRT
<213> 人类
<400> 38
Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro
1 5 10 15
Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gln
20 25 30
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
35 40 45
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50 55 60
Ile Ser Leu Val Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gln
65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His
115 120 125
Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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260 265 270
Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn
275 280 285
Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro
290 295 300
Thr Ser Ala Val Ala Gln Gly Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val Asp
305 310 315 320
Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly
325 330 335
Met Gly Arg Ala Glu Gln Val Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr
340 345 350
Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ile Ile Gly Gly Ile Ile Ala Ala
355 360 365
Ile Ile Ala Thr Ala Val Ala Ala Thr Gly Ile Leu Ile Cys Arg Gln
370 375 380
Gln Arg Lys Glu Gln Thr Leu Gln Gly Ala Glu Glu Asp Glu Asp Leu
385 390 395 400
Glu Gly Pro Pro Ser Tyr Lys Pro Pro Thr Pro Lys Ala Lys Leu Glu
405 410 415
Ala Gln Glu Met Pro Ser Gln Leu Phe Thr Leu Gly Ala Ser Glu His
420 425 430
Ser Pro Leu Lys Thr Pro Tyr Phe Asp Ala Gly Ala Ser Cys Thr Glu
435 440 445
Gln Glu Met Pro Arg Tyr His Glu Leu Pro Thr Leu Glu Glu Arg Ser
450 455 460
Gly Pro Leu His Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly Ser Pro Ile Pro Val
465 470 475 480
Pro Pro Gly Pro Pro Ala Val Glu Asp Val Ser Leu Asp Leu Glu Asp
485 490 495
Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Leu Asp Lys Ile Asn Pro Ile
500 505 510
Tyr Asp Ala Leu Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Asp Ser Tyr Gln Gly Lys
515 520 525
Gly Phe Val Met Ser Arg Ala Met Tyr Val
530 535
<210> 39
<211> 549
<212> PRT
<213> 人类
<400> 39
Met Ala Arg Thr Leu Arg Pro Ser Pro Leu Cys Pro Gly Gly Gly Lys
1 5 10 15
Ala Gln Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Pro Pro Thr Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Leu Leu
35 40 45
Phe Ser Arg Leu Cys Gly Ala Leu Ala Gly Pro Ile Ile Val Glu Pro
50 55 60
His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile
65 70 75 80
Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile Ser Trp Glu Lys Ile His Gly
85 90 95
Lys Ser Ser Gln Thr Val Ala Val His His Pro Gln Tyr Gly Phe Ser
100 105 110
Val Gln Gly Glu Tyr Gln Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu
115 120 125
Asn Asp Ala Thr Ile Thr Leu His Asn Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly
130 135 140
Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gln Ser
145 150 155 160
Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu Ile Lys
165 170 175
Gly Pro Asp Ser Leu Ile Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala Ile
180 185 190
Cys Ile Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Ala His Ile Asp Trp Glu Gly
195 200 205
Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr
210 215 220
Ala Thr Ile Ile Ser Gln Tyr Lys Leu Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg
225 230 235 240
Gly Arg Arg Ile Thr Cys Val Val Lys His Pro Ala Leu Glu Lys Asp
245 250 255
Ile Arg Tyr Ser Phe Ile Leu Asp Ile Gln Tyr Ala Pro Glu Val Ser
260 265 270
Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe Val Gly Arg Lys Gly Val Asn
275 280 285
Leu Lys Cys Asn Ala Asp Ala Asn Pro Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp
290 295 300
Ser Arg Leu Asp Gly Gln Trp Pro Asp Gly Leu Leu Ala Ser Asp Asn
305 310 315 320
Thr Leu His Phe Val His Pro Leu Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr
325 330 335
Ile Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly Gln Arg Ser Asp Gln Lys Val
340 345 350
Ile Tyr Ile Ser Asp Pro Pro Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Thr Ile
355 360 365
Gln Trp His Pro Ser Thr Ala Asp Ile Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro
370 375 380
Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Lys Asp Asp
385 390 395 400
Thr Ile Ala Thr Ile Ile Ala Ser Val Val Gly Gly Ala Leu Phe Ile
405 410 415
Val Leu Val Ser Val Leu Ala Gly Ile Phe Cys Tyr Arg Arg Arg Arg
420 425 430
Thr Phe Arg Gly Asp Tyr Phe Ala Lys Asn Tyr Ile Pro Pro Ser Asp
435 440 445
Met Gln Lys Glu Ser Gln Ile Asp Val Leu Gln Gln Asp Glu Leu Asp
450 455 460
Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys Lys Glu Asn Lys Asn Pro Val Asn Asn
465 470 475 480
Leu Ile Arg Lys Asp Tyr Leu Glu Glu Pro Glu Lys Thr Gln Trp Asn
485 490 495
Asn Val Glu Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Pro Met Asp Tyr Tyr Glu
500 505 510
Asp Leu Lys Met Gly Met Lys Phe Val Ser Asp Glu His Tyr Asp Glu
515 520 525
Asn Glu Asp Asp Leu Val Ser His Val Asp Gly Ser Val Ile Ser Arg
530 535 540
Arg Glu Trp Tyr Val
545
<210> 40
<211> 390
<212> PRT
<213> 人类
<400> 40
Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr
20 25 30
His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met
35 40 45
Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg
50 55 60
Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser
65 70 75 80
Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
100 105 110
Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln
115 120 125
Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly
130 135 140
Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro
145 150 155 160
Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr
165 170 175
Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val
180 185 190
Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr
195 200 205
Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr
210 215 220
Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp
225 230 235 240
Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met
245 250 255
Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile
260 265 270
Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr
275 280 285
Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu
290 295 300
Gly Pro Pro Ser Glu His Ser Gly Ile Ser Arg Asn Ala Ile Ile Phe
305 310 315 320
Leu Val Leu Gly Ile Leu Val Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Ile
325 330 335
Tyr Phe Tyr Trp Ser Lys Cys Ser Arg Glu Val Leu Trp His Cys His
340 345 350
Leu Cys Pro Ser Ser Thr Glu His Ala Ser Ala Ser Ala Asn Gly His
355 360 365
Val Ser Tyr Ser Ala Val Ser Arg Glu Asn Ser Ser Ser Gln Asp Pro
370 375 380
Gln Thr Glu Gly Thr Arg
385 390
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 41
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 42
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Asn His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Lys Asn Gly Asp Ile Ile His Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Cys Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 43
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Val Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Thr Pro
20 25 30
Arg Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 44
Glu Tyr Thr Ile His
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 45
Arg Ile Asn Pro Lys Asn Gly Asp Ile Ile His Asn Gln Asn Phe Met
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 46
Ser Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 47
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Thr Pro Arg Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 48
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 49
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 50
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Ser Ala Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro His Phe Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 52
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 53
Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 54
Ser Gly Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 55
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 56
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 57
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5

Claims (70)

1.一种用于制备抗体-药物缀合物(ADC)的方法，任选地其中所述ADC用于治疗癌症，所述方法包括将细胞毒性剂(Z)与抗Nectin-4抗体缀合，其中所述抗Nectin-4抗体结合人Nectin-4多肽的VC1桥接结构域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括提供结合人Nectin-4多肽的VC1桥接结构域的抗Nectin-4抗体，使所述抗Nectin-4抗体与细胞毒性剂(Z)在适合形成抗体药物缀合物的条件下接触和/或反应，以及分离所述抗体药物缀合物。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其中所述抗Nectin-4抗体通过连接所述抗体(Ab)和细胞毒性剂(Z)的接头(X)与所述细胞毒性剂缀合。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其中所述细胞毒性剂(Z)为喜树碱，任选地是五环喜树碱类似物，任选地是六环喜树碱类似物，任选地是依喜替康、SN-38或Dxd。
5.一种在有需要的个体中治疗癌症、杀死肿瘤细胞和/或使肿瘤对细胞毒性剂敏化的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的结合人Nectin-4多肽的VC1桥接结构域的抗Nectin-4抗体与细胞毒性剂的组合，任选地其中所述细胞毒性剂在同一天或不同天单独施用。
6.一种在有需要的个体中治疗癌症、杀死肿瘤细胞和/或将细胞毒性剂递送至肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含通过接头与细胞毒性剂(Z)缀合的抗Nectin-4抗体，其中所述抗体结合人Nectin-4多肽的VC1桥接结构域。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体结合Nectin-4的Ig样V结构域和Ig样C1 2型结构域。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体结合Nectin-4的包含氨基酸残基K197和/或S199(参考SEQ ID NO:1)的表位，并且/或者其中相对于所述抗体与包含SEQID NO:1的氨基酸序列的野生型Nectin-4多肽之间的结合，所述抗体与包含残基K197和/或S199处的突变的突变体Nectin-4多肽的结合降低。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体诱导所述抗体-Nectin-4复合物的细胞内内化。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体与包含抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的重链和轻链CDR或重链和轻链可变区的抗体竞争结合SEQ ID NO:1的Nectin-4多肽上的表位。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的功能保守变体。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体结合具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的膜锚定人Nectin-4蛋白，结合具有SEQID NO:32的氨基酸序列的膜锚定人Nectin-4蛋白；任选地进一步，其中所述抗体不结合具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的膜锚定人Nectin-4蛋白，并且/或者任选地进一步，其中所述抗体不结合具有SEQ ID NO:37-40的氨基酸序列的任何Nectin家族蛋白。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体包含抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的重链和轻链CDR1、2和3。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：
(a)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3；
(b)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3；
(c)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3；或
(d)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：
(a)HCDR1，所述HCDR1包含氨基酸序列：SYWMH(SEQ ID NO:8)；HCDR2，所述HCDR2包含氨基酸序列：EIDPSDSYTNYNQKFKG(SEQ ID NO:9)；HCDR3，所述HCDR3包含氨基酸序列：GYGNYGDY(SEQ ID NO:10)；LCDR1，所述LCDR1包含氨基酸序列：RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ IDNO:11)；LCDR2区，所述LCDR2区包含氨基酸序列：QMSNLAS(SEQ ID NO:12)；和LCDR3区，所述LCDR3区包含氨基酸序列：AQNLELPWT(SEQ ID NO:13)；
(b)HCDR1，所述HCDR1包含氨基酸序列：EYTIH(SEQ ID NO:44)；HCDR2，所述HCDR2包含氨基酸序列：RINPKNGDIIHNQNFMG(SEQ ID NO:45)；HCDR3，所述HCDR3包含氨基酸序列：SGYGSSYGFAY(SEQ ID NO:46)；LCDR1，所述LCDR1包含氨基酸序列：RASQSVTTPRYSYMH(SEQID NO:47)；LCDR2区，所述LCDR2区包含氨基酸序列：YASNLES(SEQ ID NO:48)；和
LCDR3区，所述LCDR3区包含氨基酸序列：QHSWEIPYT(SEQ ID NO:49)；或
(c)HCDR1，所述HCDR1包含氨基酸序列：SYWMH(SEQ ID NO:52)；HCDR2，所述HCDR2包含氨基酸序列：EIDPSDSYTNYNQKFKG(SEQ ID NO:53)；HCDR3，所述HCDR3包含氨基酸序列：SGNYDAMDY(SEQ ID NO:54)；LCDR1，所述LCDR1包含氨基酸序列：RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ IDNO:55)；LCDR2区，所述LCDR2区包含氨基酸序列：QMSNLAS(SEQ ID NO:56)；和LCDR3区，所述LCDR3区包含氨基酸序列：AQNLELPWT(SEQ ID NO:57)。
16.根据权利要求6-15中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂(Z)为喜树碱，任选地是五环喜树碱类似物，任选地是六环喜树碱类似物，任选地是依喜替康、SN-38或Dxd。
17.根据权利要求5-16中任一项所述的方法，其中所述个体患有在用与澳瑞他汀缀合的Nectin-4结合剂治疗后已经复发和/或进展的癌症，任选地其中所述与澳瑞他汀缀合的Nectin-4结合剂是维汀-恩弗妥单抗。
18.根据权利要求5-16中任一项所述的方法，其中(Z)具有化合物1的结构，并且所述个体患有在用与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的Nectin-4结合剂治疗后已经复发和/或进展的癌症，任选地其中所述能够被Pgp转运的细胞毒性剂具有化合物13的结构。
19.根据权利要求5-16中任一项所述的方法，其中所述个体在使用结合HER2的抗体、任选地与细胞毒性剂缀合的结合HER2的抗体、任选地与喜树碱类似物缀合的结合HER2的剂治疗后已经复发和/或进展，任选地其中所述抗体包含曲妥珠单抗的CDR和/或可变区。
20.根据权利要求5-19中任一项所述的方法，其中所述个体患有Nectin-4表达性癌症，所述Nectin-4表达性癌症的特征在于肿瘤细胞上的低或中等Nectin-4表达，任选地如通过免疫组织化学所确定的。
21.根据权利要求5-20中任一项所述的方法，其中所述个体患有Nectin-4和HER2表达性癌症。
22.根据权利要求5-21中任一项所述的方法，其中所述治疗与结合人HER2多肽的剂组合，任选地其中所述结合人HER2多肽的剂由下式表示：
AbHER2–(XHER2–(ZHER2))
其中
AbHER2是特异性结合人HER2多肽的多肽、肽或抗体，
XHER2是连接AbHER2和ZHER2的分子，其中XHER2包含可切割部分，例如在生理条件下可切割部分，任选地在胞内条件下可切割部分，任选地是蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，并且ZHER2是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地是五环喜树碱类似物，任选地是六环喜树碱类似物，任选地是依喜替康、SN-38或Dxd。
23.一种在有需要的个体中治疗癌症、杀死肿瘤细胞和/或将细胞毒性剂递送至肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用包含通过接头与细胞毒性剂缀合的抗Nectin-4抗体的抗体-药物缀合物与包含通过接头与细胞毒性剂缀合的抗HER2抗体的抗体-药物缀合物的组合，其中所述抗Nectin-4和所述抗HER2中的至少一者由下式表示：
Ab–(X–(Z))
其中
Ab是分别特异性结合人Nectin-4多肽或人HER2多肽的多肽、肽或抗体，
X是连接Ab和Z的分子，其中X包含可切割部分，例如在生理条件下可切割部分，任选地在胞内条件下可切割部分，任选地是蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，并且
Z是依喜替康。
24.根据权利要求5-23中任一项所述的方法，其中所述个体患有以肿瘤细胞表面处表达低或中等水平的HER2蛋白的肿瘤细胞为特征的癌症。
25.根据权利要求5-23中任一项所述的方法，其中所述个体患有以肿瘤细胞表面处表达高水平的HER2蛋白的肿瘤细胞为特征的癌症。
26.根据权利要求5-25中任一项所述的方法，其中所述个体患有尿路上皮癌，任选地晚期复发或转移性尿路上皮癌，乳腺癌，非小细胞肺癌，胰腺癌，卵巢癌，头颈部鳞状细胞癌或食道癌。
27.根据权利要求5-26中任一项所述的方法，其中所述个体已经接受过使用化疗剂、任选地被P-糖蛋白(Pgp)转运的化疗剂、铂剂或紫杉烷的先前治疗。
28.根据权利要求5-19或21-27中任一项所述的方法，其中所述个体患有癌症，所述癌症的特征在于肿瘤细胞上的高Nectin-4表达，任选地如通过免疫组织化学所确定的。
29.根据权利要求5-28中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定所述个体是否具有表达Nectin-4的肿瘤细胞的初步步骤。
30.根据权利要求5-28中任一项所述的方法，其中所述方法不依赖于评估或检测肿瘤中的Nectin-4表达水平。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物是由式(I)表示的免疫缀合物：
Ab–(X–(Z))式(I)
其中，
Ab是特异性结合人Nectin-4多肽的VC1桥接结构域的抗体；
X是连接Ab和Z的接头分子，其中X包含在生理条件下可切割部分，任选地在胞内条件下可切割部分，任选地是蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽；并且
Z包含细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地是五环喜树碱类似物，任选地是六环喜树碱类似物，任选地是依喜替康、SN-38或Dxd。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽包含缬氨酸-瓜氨酸或缬氨酸-丙氨酸。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽包含甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸。
34.一种结合人Nectin-4多肽的免疫缀合物，所述免疫缀合物由式(I)表示：
Ab–(X–(Z))式(I)
其中，
Ab是特异性结合人Nectin-4多肽的VC1桥接结构域的多肽、肽或抗体；
X是连接Ab和Z的分子，其中X包含可切割部分，例如在生理条件下可切割部分，任选地在胞内条件下可切割部分，任选地是蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽；并且
Z包含细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地是五环喜树碱类似物，任选地是六环喜树碱类似物，任选地是依喜替康、SN-38或Dxd。
35.根据权利要求34所述的免疫缀合物，其中免疫缀合物由下式表示：
Ab–(Y)–(X)–(Y’)–(Z)
其中，
Ab是特异性结合人Nectin-4多肽的VC1桥接结构域的多肽、肽或抗体；
Y任选地不存在或者是间隔子，任选地为经取代或未经取代的烷基或杂烷基链，任选地其中一个或多个原子可能不是碳，例如是氧、硫、氮或其它原子，任选地其中链的任何碳被烷氧基、羟基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代，其中Y具有2-100个原子的链长，任选地进一步其中Y包括反应性基团与所述抗体的氨基酸的侧链反应的残基；
X是或包括被细胞内肽酶或蛋白酶切割的肽基接头；
Y'任选地不存在或者是间隔子，任选地包含自消除间隔子或非自消除间隔子；并且
Z包含细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地是五环喜树碱类似物，任选地是六环喜树碱类似物，任选地是依喜替康、SN-38或Dxd。
36.根据权利要求34或35所述的免疫缀合物，其中所述蛋白酶可切割的肽或肽基接头包含缬氨酸-瓜氨酸或缬氨酸-丙氨酸。
37.根据权利要求34或35所述的免疫缀合物，其中所述蛋白酶可切割的肽或肽基接头包含甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸。
38.根据权利要求34或35所述的组合物，其中X包含val-cit、val-ala或val-phe二肽，并且Y'是自消除间隔子，任选地其中Y'是对氨基苄基单元。
39.根据权利要求34或35所述的组合物，其中X包含gly-gly-phe-gly肽，并且Y'是非自消除间隔子。
40.根据权利要求34-39中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体与包含抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的重链和轻链CDR或重链和轻链可变区的抗体竞争结合SEQ ID NO:1的Nectin-4多肽上的表位。
41.根据权利要求34-40中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体是抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的功能保守变体。
42.根据权利要求34-41中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体结合具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的膜锚定人Nectin-4蛋白，结合具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的膜锚定人Nectin-4蛋白，但不结合具有SEQ ID NO:37-40的氨基酸序列的任何Nectin家族蛋白。
43.根据权利要求34-42中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含抗体5E7、10B12、6C11B或6A7的重链和轻链CDR1、2和3。
44.根据权利要求34-43中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：
(a)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3；
(b)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3；
(c)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3；或
(d)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3。
45.根据权利要求34-44中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体包含：
(a)HCDR1，所述HCDR1包含氨基酸序列：SYWMH(SEQ ID NO:8)；HCDR2，所述HCDR2包含氨基酸序列：EIDPSDSYTNYNQKFKG(SEQ ID NO:9)；HCDR3，所述HCDR3包含氨基酸序列：GYGNYGDY(SEQ ID NO:10)；LCDR1，所述LCDR1包含氨基酸序列：RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ IDNO:11)；LCDR2区，所述LCDR2区包含氨基酸序列：QMSNLAS(SEQ ID NO:12)；和LCDR3区，所述LCDR3区包含氨基酸序列：AQNLELPWT(SEQ ID NO:13)；
(b)HCDR1，所述HCDR1包含氨基酸序列：EYTIH(SEQ ID NO:44)；HCDR2，所述HCDR2包含氨基酸序列：RINPKNGDIIHNQNFMG(SEQ ID NO:45)；HCDR3，所述HCDR3包含氨基酸序列：SGYGSSYGFAY(SEQ ID NO:46)；LCDR1，所述LCDR1包含氨基酸序列：RASQSVTTPRYSYMH(SEQID NO:47)；LCDR2区，所述LCDR2区包含氨基酸序列：YASNLES(SEQ ID NO:48)；和
LCDR3区，所述LCDR3区包含氨基酸序列：QHSWEIPYT(SEQ ID NO:49)；或
(c)HCDR1，所述HCDR1包含氨基酸序列：SYWMH(SEQ ID NO:52)；HCDR2，所述HCDR2包含氨基酸序列：EIDPSDSYTNYNQKFKG(SEQ ID NO:53)；HCDR3，所述HCDR3包含氨基酸序列：SGNYDAMDY(SEQ ID NO:54)；LCDR1，所述LCDR1包含氨基酸序列：RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ IDNO:55)；LCDR2区，所述LCDR2区包含氨基酸序列：QMSNLAS(SEQ ID NO:56)；和LCDR3区，所述LCDR3区包含氨基酸序列：AQNLELPWT(SEQ ID NO:57)。
46.一种根据权利要求34-45中任一项所述的免疫缀合物的组合物，其中样品中至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的所述免疫缀合物具有每个抗体至少2个、4个、6个或8个氨基酸残基，所述氨基酸残基用(–(Y)–(X)–(Y’)–(Z))单元官能化。
47.一种结合人Nectin-4多肽的抗体，其中所述抗体结合Nectin-4的包含氨基酸残基K197和/或S199(参考SEQ ID NO:1)的表位。
48.一种结合人Nectin-4多肽的抗体，其中相对于所述抗体与包含SEQID NO:1的氨基酸序列的野生型Nectin-4多肽之间的结合，所述抗体与包含残基K197和/或S199处的突变的突变体Nectin-4多肽的结合降低。
49.一种结合人Nectin-4多肽的抗体，其中所述抗体包含以下氨基酸序列：
(a)SYWMH(SEQ ID NO:8)；EIDPSDSYTNYNQKFKG(SEQID NO:9)；GYGNYGDY(SEQ ID NO:10)；
RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:11)；QMSNLAS(SEQID NO:12)；和AQNLELPWT(SEQ IDNO:13)；
(b)EYTIH(SEQ ID NO:44)；RINPKNGDIIHNQNFMG(SEQ ID NO:45)；SGYGSSYGFAY(SEQ IDNO:46)；
RASQSVTTPRYSYMH(SEQ ID NO:47)；YASNLES(SEQID NO:48)；和QHSWEIPYT(SEQ ID NO:49)；或
(c)SYWMH(SEQ ID NO:52)；EIDPSDSYTNYNQKFKG(SEQID NO:53)；SGNYDAMDY(SEQ IDNO:54)；
RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:55)；QMSNLAS(SEQID NO:56)；和AQNLELPWT(SEQ IDNO:57)。
50.一种结合人Nectin-4多肽的抗体，其中所述抗体包含：
(a)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQID NO:6的重链可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO:7的轻链可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3；
(b)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3；
(c)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3；或
(d)VH和VL，所述VH包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区的Kabat CDR1、CDR2和/或CDR3，并且所述VL包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区的KabatCDR1、CDR2和/或CDR3。
51.根据权利要求47-50所述的抗体，其中所述抗体包含人重链和轻链框架区。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自以下的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双功能抗体、单链抗体片段或包含多个不同的抗体片段的多特异性抗体。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合Nectin-4的Ig样V结构域和Ig样C1 2型结构域。
54.根据权利要求49-53中任一项所述的抗体，其中相对于所述抗体与包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型Nectin-4多肽之间的结合，所述抗体与包含残基K197和/或S199处的突变的突变体Nectin-4多肽的结合降低。
55.根据权利要求47-54中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够抑制Nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成和/或非锚定依赖性生长，如体外确定的。
56.根据权利要求47-55中任一项所述的抗体，其中所述抗体与细胞毒性剂共价结合，任选地其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：紫杉烷类、蒽环类、喜树碱类、埃博霉素类、丝裂霉素类、康普瑞汀类、长春花生物碱类、氮芥类、美登木素类、倍癌霉素类、微管溶素类、尾海兔素类和澳瑞他汀类、烯二炔类、吡咯并苯二氮卓类、鹅膏毒素类和乙烯亚胺类。
57.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求47-56中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
58.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求47-55中任一项所述的抗体，任选地进一步包含特异性识别所述抗体的经标记的二级抗体。
59.一种核酸或核酸组，所述核酸或核酸组编码根据权利要求47-55中任一项所述的抗体的重链和/或轻链。
60.一种杂交瘤或重组宿主细胞，所述杂交瘤或重组宿主细胞产生根据权利要求47-55中任一项所述的抗体。
61.一种人Nectin-4多肽，所述人Nectin-4多肽相对于抗体与野生型人Nectin-4多肽之间的结合，包含残基K197和/或S199处的突变。
62.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞产生根据权利要求61所述的多肽。
63.一种在有需要的个体中治疗癌症、杀死肿瘤细胞和/或将细胞毒性剂递送至肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含通过可切割接头(和任选地自消除间隔子)与化合物1的依喜替康缀合的抗Nectin-4抗体，并且其中所述个体患有在用结合剂(任选地Nectin-4结合剂或HER2结合剂)治疗后已经复发和/或进展的癌症，所述结合剂通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述能够被Pgp转运的细胞毒性剂是除依喜替康以外的喜树碱类似物，任选地其中所述能够被Pgp转运的细胞毒性剂是五环喜树碱类似物、六环喜树碱或Dxd。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述通过接头与能够被Pgp转运的细胞毒性剂缀合的结合剂包含通过可切割接头与具有化合物13(Dxd)结构的化合物缀合的结合Nectin-4的抗体。
66.根据权利要求63-65所述的方法，其中所述包含通过可切割接头与化合物1的依喜替康缀合的抗Nectin-4抗体的抗体-药物缀合物包含根据权利要求47-56所述的抗Nectin-4抗体。
67.根据权利要求64-66所述的方法，其中所述包含通过可切割接头与化合物1的依喜替康缀合的抗Nectin-4抗体的抗体-药物缀合物是根据权利要求34-46所述的免疫缀合物，其中Z是依喜替康。
68.一种制备、鉴定或测试Nectin-4结合抗体或包含此种Nectin-4结合抗体的抗体药物缀合物的方法，所述方法包括使所述抗体或抗体药物缀合物与根据权利要求61所述的多肽或根据权利要求62所述的细胞接触，以及评估所述抗体与所述突变体Nectin-4多肽之间的结合，任选地相对于所述抗体与不具有残基K197和/或S199处的所述突变的Nectin-4多肽之间的结合。
69.一种制备、鉴定或测试Nectin-4结合抗体或包含此种Nectin-4结合抗体的抗体药物缀合物的方法，所述方法包括使抗体或抗体药物缀合物(或来自其生产批次的样品)与在细胞表面处表达Nectin-4、任选地野生型Nectin-4多肽的细胞接触，所述抗体或抗体药物缀合物相对于所述抗体和野生型Nectin-4多肽之间的结合，展现出与包含残基K197和/或S199处的突变的突变体Nectin-4多肽的结合降低，以及评估所述抗体或抗体药物缀合物经历细胞内内化、诱导抗体-Nectin-4复合物的细胞内内化和/或引起所述细胞的死亡的能力。
70.一种测试结合Nectin-4的VC1桥接结构域的抗体的方法，所述方法包括：(i)在细胞毒性剂的存在下使所述抗体与在细胞表面处表达Nectin-4的细胞接触，任选地其中所述细胞表达Pgp，任选地其中所述抗体与所述细胞毒性剂缀合，和(ii)评估所述抗体或缀合抗体引起所述细胞的死亡的能力，任选地评估与在单独的细胞毒性剂的存在下观察到的细胞死亡相比，所述抗体或缀合抗体在细胞毒性剂的存在下是否增加细胞死亡。
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