BR112012019780A2 - conjugados de fármaco e anticorpo (adc) que ligam a proteínas 161p2f10b - Google Patents

conjugados de fármaco e anticorpo (adc) que ligam a proteínas 161p2f10b Download PDF

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Abstract

  CONJUGADOS DE FÁRMACO E ANTICORPO (ADC) QUE SE LIGAM A PROTEÍNAS 161P2F10B. A presente invenção refere-se a conjugados de fármaco e anticorpo (ADC's) que se ligam a proteína 161P2F10B, que são descritos aqui. 161P2F10B apresenta expressão tecidual específica em tecido adulto normal, e é expresso de modo aberrante nos cânceres listados na Tabela I. Consequentemente, os conjugados de fármaco e anticorpo da invenção proporcionam uma composição terapêutica para o tratamento de câncer.

Description

- 1/133 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGA- DOS DE FÁRMACO E ANTICORPO (ADC) QUE SE LIGAM A PROTEÍNAS 161P2F10B".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS Este requerimento reivindica o benefídio do Requerimento Provi- sório de Patente dos Estados Unidos Nº 61/302.489, arquivado em 8 de fe- vereiro de 2010. Os conteúdos deste requerimento são por este incorporado por meio de referência em sua totalidade.
DECLARAÇÃO DE DIREITOS A INVENÇÕES PRODUZIDAS SEGUNDO
PESQUISA PATROCINADA PELA FEDERAÇÃO Não se aplica. Y REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA VIA EFS-WEB Tr Todo o conteúdo da submissão eletrônica que se segue da lista- ro gem de sequências através do servidor USPTO EFS-WEB, conforme autori- Ê 15 zadoe estipulado na MPEP $1730 Il.B.2(a)(C), é incorporado aqui, por meio : de referência em sua totalidade para todos os fins. A listagem de sequências . é identificada no arquivo texto arquivado eletronicamente como se segue:
CAMPO DA INVENÇÃO A invenção descrita aqui, se refere a conjugados de fármaco e anticorpo (ADCs) dos mesmos que ligam proteínas, denominadas 161P2F10B. A invenção adicionalmente se refere a métodos de prognóstico, profiláticos e terapêuticos e composições úteis no tratamento de cânceres.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O câncer é a segunda causa principal de morte humana em se- —guidaa doença coronária. Mundialmente, milhões de pessoas morrem de câncer a cada ano. Nos Estados Unidos somente, conforme reportado pela American Cancer Society, o câncer provoca a morte de bem mais de meio milhão de pessoas anualmente, com mais de 1,2 milhão de novos casos di- agnosticados por ano. Enquanto as mortes por doença cardíaca têm decli- nado significativamemte, as resultantes de câncer de modo geral estão em
- 21133 crescimento. Na parte inicial do século seguinte, está previsto que o câncer se tornará a causa principal de morte.
Mundialmente, vários tipos de cânceres se destacam como a principal causa de morte. Com muito poucas exceções, a doença metastáti- codeum carcinoma é fatal. Além disso, mesmo para os pacientes com cân- cer que inicialmente sobrevivem a seus cânceres primários, a experiência comum mostrou que suas vidas são dramaticamente alteradas. Muitos paci- entes com câncer experimentam fortes ansiedades originadas pela ciência do potencial de recidiva ou fracasso do tratamento. Muitos pacientes com câncer experimentam debilitações físicas depois do tratamento. Além disso, muitos pacientes com câncer experimentam uma recidiva. - Apesar de marcadores previamente identificados tais como PSA, . PSM, PCTA e 161P2F10B terem facilitados os esforços para diagnosticar e : o tratar o câncer de próstata, existe a necessidade de identificação de-alvos ! 15 terapêuticos e marcadores adicionais para cânceres de próstata e cânceres , relacionados de modo a aprimorar mais o diagnóstico e a terapia.
. O câncer de células renais (RCC) atualmente está classificado como décima causa principal de morte por câncer nos Estados Unidos. Uma estimativa de 51.190 pessoas serão diagnosticadas anualmente com carci- —noma de células renais nos Estados Unidos e aproximadamente 12.890 mor- reram da doença em 2007 (American Cancer Society). Historicamente, o tratamento tem sido focalizado essencialmente na nefrectomia, seguida por imunoterapia inespecífica, e algumas vezes terapia de radiação (Hauke, 2006). A imunoterapia inespecífica inclui tratamento com as citocinas inter- leucina-2 ou interferon-a quer como agentes únicos ou em combinação. De- pois de excisão cirúrgica, 20 a 30% dos pacientes vão desenvolver doença metastática dentro de 1 a 3 anos, frequentemente no pulmão (Motzer, et al., 2006). A sobrevida média para pacientes com doença metastática é de a- proximadamente 13 meses (Cohen and McGovern, 2005).
Desde 2005, seis (6) agentes foram aprovados pela agência FDA para o tratamento de câncer de células renais avançado. Estes avan- ços incluem vários agentes que têm por alvo os caminhos específicos impli-
cados no câncer de células renais. Estes agentes incluem sorafenib (Nexa- varO, aprovado pela agência FDA em dezembro de 2005), sunitinib (Su- tentO, aprovado pela agência FDA em janeiro de 2006), tensirolimus (Tori- selO, aprovado pela agência FDA em maio de 2007), everolimus (AffinitorO, —FDA approved in March, 2009), bevacizumab (Avastin& em combinação com alfa interferon, aprovado pela agência FDA em agosto de 2009) e pazopanib (Votrient& aprovado pela agência FDA em outubro de 2009). No entanto, apesar dos adanços no tratamento, o câncer de células renais metastático permanece incurável e somente o tensirolimus foi aprovadom com base em uma vantagem na sobrevida geral. Adicionalmente, o carcinoma hepatocelular (isto é, câncer do fi- . gado) é responsável por 80 a 90% de todos os cânceres do fígado. Este tipo - de câncer do fígado ocorre mais frequentemente em homens do que em mu- . lheres. Geralmente é visto em pessoas com idades de 50 a 60 anos. De mo- É 15 dogeral, o tratamento do câncer do fígado é cirurgia agressiva ou um trans- 7 plante de fígado o qual pode tratar com sucessfo tumores pequenos ou de crescimento lento se eles forem diagnosticados precocemente. No entanto, Ú poucos pacientes são diagnosticados precocemente. Geralmente tratamen- tos de quimioterapia e radiação não são eficazes. No entanto, estas terapias são usadas para encolher os tumores de modo a que a cirurgia tenha uma maior probabildiade de sucesso. Tosilato de sorafenib (NexavarO) está ago- ra disponível para pacientes com câncer do fígado. O prognóstivo para paci- entes com câncer do fígado geralmente é pobre, uma vez que somente 10 a 20% dos carcinomas hepatocelulares podem ser removidos usando cirurgia. Por conseguinte, existe a necessidade de desenvolver um agente a ser usa- do para tratar câncer do fígado.
A utilitade terapêutica de anticorpos monoclonais (mAbs) (G. Kohler and C. Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)) está sendo percebida. Os anticorpos monoclonais foram agora aprovados como terapias em trans- plante, câncer, doença infecciosa, doença cardiovascular e inflamação. Dife- rentes isótipos têm diferentes funções efetoras. As diferenças em função referidas são refletidas em estruturas tridimensionais distintas para os vários
- 4/133 isótipos de imunoglobulinas (P.M. Alzari, et al, Annual Rev. Immunol,, 6: 56555-580 (1988)). Como os camundongos são convenientes para imunização e re- conhecem a maioria dos antígenos humanos como estranhos, mAbs contra- alvos humanos com potencial terapêutico têm sido tipicamente de origem murina. No entanto, os mAbs murinos têm desvantagens inerentes como terapêuticos humanos. Eles necessitam de dosagem mais frequente uma vez que os mAbs têm uma meia-vida circulante mais curta em humanos do que anticorpos humanos. De modo mais crucial, a repetida administração de anticorpos murinos ao sistema imune humano faz com que o sistema imune humano responda reconhecendo a proteína de camundongo como uma pro- . teina estranha e produzindo uma reação de anticorpo humano anti- - camundongo (HAMA). Uma reação HAMA semelhante pode resultar em rea- . ção alérgica e no rápido clearing do anticorpo murino do sistema deste modo : 15 tornando o tratamento por anticorpo murino inútila. Para evitar os efeitos re- 7 feridos, têm sido tentados esforços de criar sistemas imunes humanos den- tro de camundongos. : As tentativas iniciais esperaram criar camundongos transgênicos capazes de responder a antígenos com anticorpos tendo sequências huma- nas (Vide Bruggemann, etal., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 6709-6713 (1989)), mas foram limitadas pela quantidade de DNA que podia ser mantido de modo estável pelos veículos de clonagem disponíveis. O uso de vetores de clonagem de cromossoma artificial de levedura (YAC) levou ao modo pa- ra introdução de grandes fragmentos de linhagem germinativa de lócus de Ig humana em mamíferos transgênicos. Essencialmente uma maioria dos ge- nes das regiões humanas V, D, e J dispostos com o mesmo espaçamento encontrado no genoma humano e as regiões constantes humanas foram introduzidos em camundongos usando YACs. Uma raça de camundongo transgênico semelhante é conhecida como camundongos XenoMouse€& e está disponível comercialmente na Amgen Fremont, Inc. (Fremont CA).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona conjugados de fármaco e anticorpo
- 5/1338 (ADCs) que ligam a proteínas 161P2F10B. Em determinadas modalidades, a invenção compreende anticorpos totalmente humanos conjugados com um agente terapêutico. A invenção adicionalmente proporciona várias composições i- — munogênicas ou terapêuticas, tais como conjugados de fármaco e anticorpo, e estratégias para tratamento de cânceres tais como cânceres de tecidos listados na Tabela |. A presente invenção se refere a:
[1] Um conjugado de fármaco e anticorpo compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que liga especifica- mente a uma proteína 161P2F10B compreendendo a sequência de aminoá- . cidos de SEQ ID NO: 2, e em que o anticorpo compreende a sequência de - aminoácidos da região V, de SEQ ID NO: 7, de 20 a 142 e da região V, de ? SEQ ID NO: 8, de 20 a 127 e em que o referido anticorpo é conjugado a mo- ' 15 —nometila auristatina F (MMAF). . [2] O conjugado de fármaco e anticorpo de [1], em que o frag- BR mento de ligação antigênica é um fragmento Fab, F(ab1)2 ou Fv
[3] O conjugado de fármaco e anticorpo de [1], em que o anticor- po é um anticorpo totalmente humano.
[4] O conjugado de fármaco e anticorpo de [1], o qual é produzi- do de modo recombinante.
[5] Uma composição farmacêutica que compreende o conjugado de fármaco e anticorpo de [1] em uma forma de unidade de dose humana.
[6] A composição farmacêutica de [5], em que a composição é paratratamento do câncer.
[7] A composição farmacêutica de [6], em que o câncer é câncer renal ou câncer hepático.
[8] Um método de inibir o crescimento de células cancerosas em um sujeito, compreendendo: administrar ao referido sujeito um conjugado de fármaco e anti- corpo de [1].
[9] Um método de liberação de um agente citotóxico ou um a-
- 6/133 gente de diagnóstico a uma célula, compreendendo: proporcionar MMAF(s) conjugados a um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que liga especificamente a uma proteína 161P2F10B compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, eemqueo anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da região V, de SEQ ID NO: 7, de 20 a 142 e da região V, de SEQ ID NO: 8, de 20 a 127, para formar um conjugado de fármaco e anticorpo; e, expor a célula ao conjugado de anticorpo e fármaco ou de frag- mento e fármaco.
[10] Um método para tratar tamor em um mamífero compreen- dendo tratar o mamífero com uma quantidade eficaz de um conjugado de . fármaco e anticorpo de [1]. - [11] Um método para reduzir o crescimento tumoral em um ma- . mífero compreendendo tratar o mamífero com uma quantidade eficaz de uma combinação de um conjugado de fármaco e anticorpo de [1] e radiação. . [12] Um método para reduzir o crescimento tumoral em um ma- R mífero compreendendo tratar o mamífero com uma quantidade eficaz de uma combinação de um conjugado de fármaco e anticorpo de [1] e um agen- te quimioterápico.
[13] Um método para reduzir o crescimento tumoral em um ma- mífero compreendendo tratar o mamífero com uma quantidade eficaz de uma combinação de um conjugado de fármaco e anticorpo de [1] e um fár- maco ou terapia biologicamente ativa.
[14] Um método para tratar câncer em um mamífero, compreen- —dendotrataro mamífero com uma quantidade eficaz de uma combinação de um conjugado de fármaco e anticorpo de [1] e um agente quimioterápico.
[15] Um conjugado de fármaco e anticorpo (ADC), em que o con- jugado de fármaco e anticorpo tendo a fórmula L- (LU-D)p, em que: (a) Lé o anticorpo compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica domesmo que liga especificamente a uma proteína 161P2F10B compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e em que o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da região V,, de SEQ ID NO: 7, de
- 7/1338 20 a 142 e da região V, de SEQ ID NO: 8, de 20 a 127; (b) LU é um ligante; (c) D é uma porção de fármaco em que o fármaco é monometila auristatina F (MMAF); (d) p é 1, 2, 3, 4, 5,6,7,8, 9,10, 11 ou 12.
[16] Um conjugado de fármaco e anticorpo (ADC), em que o con- —jugado de fármaco e anticorpo tendo a seguinte fórmula, em que Ab-S é o anticorpo compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo que liga especificamente a uma proteína 161P2F10B compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e em que o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da região V, de SEQ ID NO: 7, de 20a142edaregião V, de SEQ ID NO: 8, de 20 a 127; pé 1,2,3,4,5,6,7, 8,9, 10, 11 ou 12. - Ab-S. o . o o : [17] Um conjugado de fármaco e anticorpo compreendendo um - anticorpo que liga especificamente a uma proteína 161P2F10B compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e em que o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, de 20 a 468 e da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, de 20 a 233 e em que o anticorpo referido é conjugado a monometila auristatina F (MMAF).
[18] Um conjugado de fármaco e anticorpo (ADC), em que o ADC tendo a fórmula L-(LU-D)p, em que: (a) L é o anticorpo compreendendo um anticorpo que liga especificamente a uma proteína 161P2F10B compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e em que o anticor- po compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, de 20 a 468 e a cadeia leve de SEQ ID NO: 8, de 20 a 233; (b) LU é um ligante; (c) D é uma porção de fármaco em que o fármaco é monometila auristatina F (MMAF); (d) p é 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ou 12.
[19] Um conjugado de fármaco e anticorpo (ADC), em que o ADC tendo a fórmula que se segue, em que Ab-S é o anticorpo compreen- dendo um anticorpo que liga especificamente a uma proteína 161P2F10B
. 8/133 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e em que o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, de 20 a 468 e a cadeia leve de SEQ ID NO: 8, de 20 a 233; p é 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ou 12. Ab-S. o o HZ H RAIAS) o º o A dAo h, —BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. A sequência de cDNA e de aminoácido de 161P2F10B é mostrada na Figura 1. O frame de leitura aberta se estende do ácido nucle- 7 ico 44 a 2671 incluindo o códon de parada. Figura 2. Sequências de Ácido Nucleico e de Aminoácido de an- 2 10 ticorposantii61P2F10B. Figura 2A. A sequência de cDNA e de aminoácido da cadeia pe- ! sada de H16-7.8. Sublinhada está a sequência lider e duplamente sublinha- - da está a região variável de cadeia pesada. O sublinhado pontilhado mostra a região constante da IgG2 humana.
Figura 2B. A sequência de cDNA e de aminoácido da cadeia le- ve de H16-7.8. Sublinhada está a sequência lider e duplamente sublinhada está a região variável de cadeia leve. O sublinhado pontilhado mostra a regi- ão constante da capa lg humana.
Figura 3. Sequências de aminoácidos de anticorpos anti 161P2F10B.
Figura 3A. A sequência de aminoácido de cadeia pesada de H16-7.8. Sublinhada está a sequência lider e duplamente sublinhada está a região variável de cadeia pesada. O sublinhado pontilhado mostra a região constante da IgG2 humana.
Figura 3B. A sequência de aminoácido de cadeia leve de H16-
7.8. Sublinhada está a sequência lider e duplamente sublinhada está a regi- ão variável de cadeia leve. O sublinhado pontilhado mostra a região constan- te da capa lg humana.
- 9/133 Figura 4. Alinhamento de anticorpos de H16-7.8 a linhagem germinativa humana.
Figura 4A.
Alinhamento da cadeia pesada de H16-7.8 a linha- gem germinativa humana VH4-31/D5-12/JH6. Figura 4B.
Alinhamento da cadeia leve de H16-7.8 a linhagem germinativa humana A26/JK1. Figura 5. Expressão Recombinante de H16-7.8 em Células CHO.
Sequências de cadeias pesada e leve de H16-7.8 foram clonadas em vetores de expressão.
Vetores foram transfectados para células CHO.
Célu- las 3T3-controle e 3T3-161P2F10B foram coradas com H16-7.8 quer de hi- bridoma ou de células CHO.
A ligação foi detectada por citometria de fluxo. - Os resultados mostram que H16-7.8 expressado de modo recombinante em . células CHO é secretado e liga especificamente a 161P2F10B da superfície f celular.
Figura 6. Ligação Celular e Afinidade de H16-7.8 e H16- õ 7.8mMcMMAF.
H16-7.8 e H16-7.8mMcMMAF foram testadas para a afinidade . de ligação sobre 161P2F10B expressadas endogenamente sobre células Ku812. Em resumo, onze (11) diluições de H16-7.8 ou H16-7.8mMcMMAF foram incubadas com células Ku812 (50.000 células por cavidade) de um dia parao outroa4C em uma concentração final de 160 nM a 0,0001 nM.
Ao final da incubação, as células foram lavadas e incubadas com anticorpo de detecção anti-higG-PE por 45 min at 4ºC.
Depois de lavar os anticorpos de detecção não ligados, as células foram analisadas por FACS.
São obtidos os valores da Intensidade de Florescência Média (MFI) (Vide a Tabela IV). Os —valoresdeMFI foram introduzidos no software Graphpad Prisim e analisados usando a equação de ligação de um sítio (hipérbole) de Y=Bmax"X/(Kd+X) para gerar as curvas de saturação de H16-7.8 ou H16-7.8mMcMMAF mostra- das na Figura 6. Bmax é o valor de MFI em ligação máxima de H16-7.8 ou H16-7.8McMMAF a 161P2F10B; Kd é a afinidade de ligação de H16-7.8 ou H16-7.8McMMAF a qual é a concentração de H16-7.8 ou H16-7.8.McMMAF necessária para atingir a ligação meia-máxima.
A afinidade calculada (Kd) de H16-7.8 e H16-7.8mMcMMAF é de 0,06 nM e 0,19 nM, respectivamente
. 10/133 sobre 161P2F10B expressadas endogenamente sobre a superfície de célu- las Ku812.
Figura 7. Ligação de H16-7.8 e H16-7.8mMcMMAF a Células de Câncer Renal. Células UGK-3 humanas (câncer renal de células claras deri- —vadas de pacientes) e células RXF-393 (câncer renal de células claras) fo- ram coradas com 10 pg/ml de H16-7.8 nativa, H16-7.8mMcMMAF, ou um isó- tipo de I9G2 humana de controle e foram avaliadas por FACS. Os resultados na Figura 7 (painéis à esquerda) demonstram forte coloração das duas célu- las de tumores renais diferentes com H16-7.8 (linhas cinzentas), mas não como MaAb controle (histogramas preenchidos). Os painéis à direita de- monstram uma forte coloração similar das mesmas células de tumores re- - nais com H16-7.8mMcMMAF (linhas cinzentas). (Figura 7; painéis à direita). - Estes resultados mostram que tanto H16-7.8 quanto H16-7.8mMcMMAF ligam E antígeno 161P2F10B nativo expressado sobre a superfície de células cance- ' 15 rosas humanas. A conjugação de H16-7.8 nativa para gerar o H16-7.8mcMMAF : não alterou sua ligação superficial celular a antígeno 161P2F10B nativo ex- pressado sobre células cancerosas humanas. Figura 8. Citotoxicidade Celular por H16-7.8mMcMMAF. 2000 cé- lulas KU812 viáveis foram laminadas em triplicata no Dia O e deixadas para recuperar de um dia para o outro. No dia seguinte, diluições seriais a 1:4 de diferentes lotes de H16-7.8mMcMMAF ou um MAb controle conjugado com MCMMAF foram acrescentadas para produzir as concentrações finais. As células foram deixadas para incubar por seis (6) dias em cujo momento 20 ul de azul Alamar foi acrescentado a cada cavidade. As lâminas foram incuba- dasporum adicional de quatro (4) horas e a intensidade de fluorescência foi lida em uma leitora de lâmina fluorescente usando um comprimento de onda de excitação de 540 nM e um comprimento de onda de emissão de 620 nM. Os resultados mostram que ambos os lotes de H16-7.8.mMcMMAF inibiram potentemente a proliferação de células KU812. Foi determinado que a IC 50 erade0,2nM e de 0,1nM para os Lotes (1) e o Lote (2) respectivamente. Um MAb Controle totalmente humano que não liga células KU812 foi conju- gado com mcMMAF para produzir uma DAR de 3,9 (+/- 0,2). O ADC Contro-
- 11/1338 le (mcF Controle) não inibiu a proliferação de células KU812 demonstrando adicionalmente a especificidade da citotoxicidade. Portanto, estes resultados indicam que H16-7.8mMcMMAF pode liberar seletivamente um fármaco citotó- xico para células expressando 161P2F10B, levando a sua destruição. Figura 9. Eficácia de H16-7.8mMcMMAF em xenoenxerto de cân- cer renal humano estabelecido por via subcutânea UG-K3 em camundongos SCID. Neste experimento, xenoenxerto de câncer renal humano UG-K3 deri- vado de paciente foi mantido por passagens seriais em camundongos SCID. Tumores de estoque foram colhidos de modo estéril e triturados até pedaços pequenos. Os pedaços de tumor foram digeridos enzimaticamente para sus- pensões celulares únicas usando Liberase Blendzyme (Roche Applied Sci- : ence, Indianapolis, IN). 1,5x 10º células foram injetadas nos flancos de ca- - mundongos SCID individuais e os tumores foram deixados crescer sem tra- E tamento até eles terem atingido um volume aproximado de 1000 mm?. Os ? 15 animais foram atribuídos aleatoriamente para os grupos que se seguem: um ç grupo tratado com H16-7.8mMcMMAF, um controle de H16-7.8 e um controle de Dextrose a 5%. H16-7.8mMcMMAF e H16-7.8 foram dosados a 10 mg/kg uma vez no dia 0 por injeção de bolo intravenoso. A quantidade de H16-
7.8mMcMMAF e de H16-7.8 administrada foi baseada no peso corporal indivi- dualde cada animal obtido imediatamente antes da dosagem. O controle de Dextrose a 5% foi dosado a 150 yuL por animal. O crescimento tumoral foi monitorado usando medições por calibrador a cada 3 a 4 dias até o final do estudo. O volume do tumor é calculado como Largura? x Extensão/2, onde largura é a menor dimensão e extensão é a maior. Os animais nos grupos de controle foram sacrificados humanitariamente quando os tumores atingi- ram aproximadamente 1000 mmº?. Os animais no grupo tratado com H16-
7.8mcMMAF foram monitorados por um adicional de duas semanas antes do sacrifício. Foi realizada análise estatística no último ponto do tempo quando os dados de ambos os grupos de controle estavam disponíveis, usando teste de Kruskal-Wallis com a=0,05.
Os resultados demonstraram que o tratamento de tumores de xenoenxerto de células claras renais UG-K3 com H16-7.8.8mMcMMAF em todas
- 12/133 as doses e esquemas examinados resultou em significativa inibição do cres- cimento tumoral em camundongos SCID.
Figura 10. Inibição do Crescimento de Xenoenxertos de UG-K3 Ortotópicos Estabelecidos por H16-7.8mMcMMAF. A capacidade de H16-
7.8mMcMMAF para inibir o crescimento de tumores renais estabelecidos cres- cendo ortotopicamente foi avaliada usando xenoenxertos de tumores UG-K3 derivados de pacientes. Em resumo, estoques de tumores UG-K3 foram di- geridos enzimaticamente e 1,5 milhões de células viáveis foram implantadas cirurgicamente dentro dos rins de camundongos SCID machos no Dia 0. Os tumores foram deixados para crescer por 7 dias em cujo tempo os animais foram randomizados para 4 grupos de tratamento diferentes (n = 10 por gru- . po). Os animais randomizados para o Grupo A receberam ADC Controle a - 5 mpk, para o Grupo B receberam H16-7.8mcMMAF a 3 mg/kg e para o o Grupo C receberam H16-7.8mMcMMAF a 5 mg/kg administrados a cada 4 í 15 dias para um total de 4 doses. O Grupo D receber H16-7.8mMcMMAF a 10 mg/kg uma vez. Ao final do estudo (Dia 41) os animais foram sacrificados e os rins direito e esquerdo foram pesados sobre uma balança eletrônica. Os pesos dos tumores plotados sobre o gráfico foram determinados subtraindo o peso do rim contralateral livre de tumor do peso do rim direito portando tumor.
Os resultados demonstraram que o tratamento de tumores de xenoenxerto de células claras renal UG-K3 com H16-7.8mMcMMAF em todas as doses e esquemas examinados resultou em dramática inibição do cres- cimento tumoral. Os pesos dos tumores em todos os grupos de tratamento comH16-7.8mcMMAF (B, C, e D) foram menores do que 1% dos pesos dos tumor no grupo tratado com Controle. Estas diferenças estatisticamente fo- ram altamente significativas (p< 0,0001, ANOVA).
Figura 11. Eficácia de H16-7.8.mMcMMAF em xenoenxerto de câncer renal humano RXF-393 estabelecido por via subcutânea em camun- — dongos SCID. Neste experimento, células de câncer renal humano RXF-393 (0,5 x 10º células por camundongo) foram injetadas nos flancos de camun- dongos individuais e os tumores foram deixados crescer sem tratamento até
- 13/133 que atingissem um volume aproximado de 100 mmº. Em seguida os animais foram atribuídos aleatoriamente para os grupos que se seguem: um grupo tratado com H16-7.8mMcMMAF, um grupo tratado com H16-7.8 e um controle de Dextrose a 5%. H16-7.8mMcMMAF e H16-7.8 foram dosados a 10 mg/kg uma vezporsemana para um total de duas doses por injeção de bolo intra- venoso. A quantidade de H16-7.8mMcMMAF e de H16-7.8 administrada foi baseada no peso corporal individual de cada animal obtido imediatamente antes da dosagem. O controle de Dextrose a 5% foi dosado a 150 ul por animal. O crescimento tumoral foi monitorado usando medições por calibra- doracada3a4dias até o final do estudo. O volume do tumor é calculado como Largura? x Extensão/2, onde largura é a menor dimensão e extensão é . a maior. Os animais no grupo de controle foram sacrificados humanitaria- . mente quando os tumores atingiram aproximadamente 1000 mmMº?. Os ani- . 2 mais no grupo tratado com H16-7.8mMcMMAF foram monitorados por um adi- : 15 cional de duas semanas antes do sacrifício.
r Os resultados demonstraram que o tratamento de tumores de - xenoenxerto de câncer renal humano RFX-393 com H16-7.8McMMAF em todas as doses e esquemas examinados resultou em significativa inibição do crescimento tumoral em camundongos SCID. Foi realizada análise estatísti- cano último ponto do tempo quando os dados em ambos os grupos de con- trole estavam disponíveis, usando o teste de Kruskal-Wallis com a=0,05. Figura 12. Estudo da Eficácia de H16-7.8 comparado com H16-
7.8McMMAF em câncer renal humano SKRC-01 estabelecido por via subcu- tânea em camundongos SCID. Células de câncer renal humano SKRC-01 (08x 10º células por camundongo) foram injetadas nos flancis de camun- dongos individuais. Os tumores foram deixados crescer sem tratamento até eles terem atingido um volume aproximado de 100 mmMº. No dia 0 quando os tumores atingiram 100 mmº, os animais foram atribuídos aleatoriamente pa- ra os grupos que se seguem: um grupo tratado com H16-7.8mcMMAF, um grupo tratado com H16-7.8 e um controle de Dextrose a 5%. H16-
7.8mMcMMAF e H16-7.8 foram dosados a 4 mg/kg a cada quatro dias para um total de quatro doses por injeção de bolo intravenoso. A quantidade de
- 14/133 H16-7.8mMcMMAF e de H16-7.8 administrada foi baseada no peso corporal individual de cada animal obtido imediatamente antes da dosagem. O con- trole de Dextrose a 5% foi dosado a 150 ul. por animal. O crescimento tumo- ral foi monitorado usando medições por calibrador a cada 3 a 4 dias. O vo- lume do tumor foi calculado como Largura? x Extensão/2, onde largura é a menor dimensão e extensão é a maior. Os resultados mostram que o ADC H16-7.8mMcMMAF inibiu signi- ficativamente o crescimento da formação de tumor SKRC-01 ao passo que o MAb nu H16-7.8 não teve nenhum efeito. Portanto, o ADC H16-7.8mcMMAF teve um efeito significativamente mais proeminente do que o anticorpo nu H16-7.8. - Figura 13. Estudo da Eficácia de H16-7.8mMcMMAF comparado . com conjugados de fármaco e anticorpo 161P2F10B (ADCs) diversos em O. UG-K3 estabelecido por via subcutânea em camundongos SCID. Em outro À 15 experimento, células de câncer renal humano UG-K3 (1,5 x 10º células por . camundongo) foram injetadas nos flancos de camundongos individuais. Os tumores foram deixados crescer sem tratamento até eles terem atingido um ! volume aproximado de 100 mmº. No dia O quando os tumores atingiram 100 mm?, os animais foram atribuídos aleatoriamente para os grupos que se seguem: um grupo tratado com H16-7.8mMcMMAF, um grupo tratado com H16-7.8vcMMAE, e um grupo tratado com H16-1.11mMcMMAF, e um grupo tratado com H16-1.11vcMMAE, um grupo tratado com PBS controle, e um grupo tratado com MAb-vcMMAE controle. Todos os conjugados de fármaco e anticorpo (ADCs) foram dosados a 10 mg/kg uma vez ao dia no dia 0. À — quantidade de cada ADC administrado foi baseada no peso corporal indivi- dual de cada animal obtido imediatamente antes da dosagem. O controle de PBS foi dosado a 150u/L por animal. O crescimento tumoral foi monitorado usando medições por calibrador a cada 3 a 4 dias. O volume do tumor foi calculado como Largura? x Extensão/2, onde largura é a menor dimensão e extensãoéamaior. Os resultados mostram que os ADCs H16-7.8vcMMAE e H16-
1.11vcMMAE não inibiram o crescimento da formação de tumor. Adicional-
> 15/133 mente, tanto H16-7.8.McMMAF quanto H16-1.1 IMcMMAF inibiram significa- tivamente o crescimento da formação de tumor UG-K3 durante os primeiros trinta (30) dias. Depois do dia trinta (30) o H16-7.8mMcMMAF teve um efeito significativamente mais proeminente em comparação com H16-1.1 ImcMMAF. Figura 14. Mapas de Peptídeos de H16-7.8mcMMAF e H16-7.8. os H16-7.8.2mMcMMAF e H16-7.8 obtidos foram tratados com ditiotreitol (DTT) para reduzir as ligações de dissulfeto, seguido por alquilação das cisteinas livres resultantes. Guanidina foi usada nesta etapa para garantir a completa desnaturação da proteína. Depois de diálise para remover a guanidina, as amostras foram digetidas com uma endoproteinase específica, Lys-C. Lys-C cliva as ligações de peptídeos sobre o lado C-terminal dos resíduos lisina. - Os peptídeos resultantes foram analisados por cromatografia de fase rever- e. sa acoplada a espectrometria de massa. Os tempos de retenção de fase e. reversa e a massa observada para proporções de carga dos picos foram ' 15 comparadas entre H16-7.8McMMAF e H16-7.8. Foi realizada análise por LC- MS (cromatografia líquida — espectrometria de massa) usando um WATERS . Acquity UPLC acoplado a um espectrômetro de massa WATERS Q-TOFp. A amostra digerida foi aplicada a coluna de YMC C18 e elutriada com um gra- diente de acetonitrilo contendo ácido trifluoroacético. Os resultados mostram queas intensidades de picos indicadas pelo asterisco foram reduzidas no anticorpo conjugado em comparação com o anticorpo nativo. Os picos mar- cados com uma seta representam novos picos que apareceram sobre o ma- pa de peptídeos de anticorpo conjugado. Especificamente, acredita-se que os picos marcados com quer um asterisco ou com uma seta são um pepti- —deo destinado para conjugação e o peptídeo conjugado resultante, respecti- vamente.
Figura 15. Espectros de massa do (*) pico. Os resultados mos- tram uma porção dos espectros de massa do pico marcado com um asteris- co na Figura 14. O valor de massa do sinal que se alterou durante a conju- gação é indicado pelo sinal de “mais”. Este peptídeo com uma m/z aproxi- mada de 970,4 (estado de carga +3) foi identificado como C225-K250 que se originou da região de articulação da cadeia pesada e contém os sítios de
. 16/133 conjugação esperados.
Figura 16. Cromatogramas iônicos extraídos (XIC) de MSE so- bre mapas de peptídeos para H16-7.8mcMMAF e H16-7.8 em m/z de 619,4. De modo a identificar os picos que apareceram recentemente os quais se acredita que sejam peptídeo conjugado na Figura 14 acima, foi conduzida análise por LC-MS usando a técnica de aquisição de dados de elevada- energia (MSE). Esta Figura mostra os cromatogramas iônicos extraídos (XIC) para mapas de peptídeos de H16-7.8mMcMMAF e H16-7.8 usando a m/z de 619,4. Este íon corresponde a um íon de fragmento da porção de fármaco. Os picos observados no XIC a 619,4 são quase idênticos aos picos marcados com uma seta na Figura 14. Além disso, não foram detectados : picos semelhantes no cromatograma do anticorpo nativo. Estas observações - sugerem que os picos detectados no XIC em m/z de 619,4 foram aparente- nr mente peptídeos conjugados a fármacos e são identificados por seus valores | 15 de massa intacta. O resultado foi resumido na Tabela V. Estes resultados . sugerem que no caso do conjugado, peptídeos predominantes são aqueles conjugados a 2 fármacos sobre a região de articulação de cadeia pesada. ] Estes dados são consistentes com os dados obtidos pela outra ortogonal tal como uma análise DAR. Figura 17. Exemplo de espectros mostrando perfis de massa de ADC H16-7.8mcMMAF desqglicosilado. A massa total do H16-7.8mcMMAF desglicosilado foi determinada por espectrometria de massa por ionização por eletrospray em tempo de vôo (ESI-TOF). As amostras de teste foram diluídas por 250 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,5 e em seguida —incubadas de um dia para o outro a 37ºC com glicopeptidase F. As amostras foram injetadas sobre uma coluna PLRPTM (Varian Technology), equilibrada a 90ºC, e elutriadas com um gradiente de acetonitrilo / água. Os picos das amostras foram analisados por um sistema de UPLC Acquity acoplado a um espectrômetro de massa WATERS Synapt (Waters) e as massas foram re- construídas a partir dos dados brutos por um software MaxEnt1. É mostrado um exemplo de perfil espectral de massa para o H16-7.8mMcMMAF desglico- silado. O anticorpo conjugado a fármaco predominante foi uma espécie de
. 17/133 carga de 4 fármacos. Esta observação incluindo uma abundância do anticor- po não conjugado em H16-7.8mcMMAF foi consistente com os resultados obtudos pelos outros métodos ortogonais, tais como DAR por RP-HPLC, mapeamento de peptídeos, e teste de HIC.
Figura 18. Perfil da Proporção de Fármaco Anticorpo (DAR) de H16-7.8mMcMMAF. Foi conduzida análise DAR para determinação por HPLC quantitativa da quantidade relativa de carga de fármaco em cada Cadeia leve e Cadeia pesada. As análises DAR foram realizadas usando uma colu- na analítica PLRP-S, 2,1 mm x 50 mm, com fase móvel A consistindo em 2,0% de ácido fórmico e fase móvel B consistindo em 2,0% de ácido fórmico mais 90% de acetonitrila. É mostrado um perfil da proporção DAR represen- - tativo para H16-7.8mcMMAF. O valor da proporção DAR é 4,0. A amostra foi - submetida à análise por LC-MS usando as mesmas condições de HPLC m. deste método para identificar o pico observado. Os resultados estão resumi- É 15 dosna Tabela VI. A identificação do pico dos resultados da DAR obtidos du- . rante a qualificação deste método foi confirmada ortogonalmente por LC-MS. ' DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Resumo das Seções 1) Definições 1) Anticorpos anti 161P2F10B uL) Conjugados de fármaco e anticorpo de modo geral UN(A). Auristatinas e Dolostatinas IV.) Conjugados de fármaco e anticorpo which Bind 161P2F10B V.) Unidades de Ligante Vl) A Unidade de Estirador VII) A Unidade de Aminoácido VIII.) A Unidade de Espaçador XX.) A Unidade de Fármaco XxX) Carga de Fármaco Oo x) Métodos de Determinação do Efeito Citotóxico dos ADCs XIl.) Tratamento de Câncer(s) XIII) 161P2F10B como um alvo para Terapia à base de Anticorpo
: 18/133 XIV.) Coquetéis de 161P2F10B ADC XV.) “Combinação de Terapias XVI.) KITS/Artigos de Manufatura
1.) Definições: A menos que definido de modo diverso, todos os termos da téc- nica, notações e outros termos científicos ou terminologia usados aqui, pre- tendem ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica à qual esta invenção diz respeito. Em alguns casos, termos com sig- nificados comumente entendidos são definidos aqui, para clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de semelhantes definições aqui, não deve necessariamente ser considerada como representando uma diferença subs- ' tancial em relação ao que é entendido de modo geral na técnica. Muitas das O técnicas e dos procedimentos descritos ou referidos aqui, são entendidos de .. modo geral e empregados comumente usando metodologia convencional por aqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, as metodologias . de clonagem molecular amplamente utilizadas descritas em Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold S- 7 pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Conforme apropria- do, procedimentos envolvendo o uso de kits e reagentes disponíveis comer- cialmente são geralmente realizados de acordo com protocolos e/ou parâ- metros definidos pelos fabricantes a menos que mencionado de modo diver- so.
Quando um nome comercial é usado aqui, a referência ao nome comercial também se refere à formulação do produto, ao fármaco genérico, eaoumourmais ingredientes farmacêuticos ativos do produto do nome co- mercial, a menos que indicado de modo diverso pelo contexto. Os termos “câncer avançado”, “câncer localmente avançado”, “doença avançada” e “doença localmente avançada” significam cânceres que tenham se estendidos através da cápsula tecidual relevante, e preten- dem incluir doença em estágio C segundo o sistema da Associação Urológi- ca Americana (AUA, American Urological Association), doença estágio C1 - C2 segundo o sistema de Whitmore-Jewett, e doença do estágio T3 - T4 e
. 19/133 N+ segundo o sistema TNM (tumor, nódulo, metástase). Em geral, não é recomendada cirurgia para pacientes com doença localmente avançada, e estes pacientes têm substancialmente desfechos menos favoráveis compa- rados com pacientes tendo câncer clinicamente localizado (confinado ao ór- gão).
A abreviação “AFP” se refere a dimetilvalina-valina-dolaisoleui- na- dolaproina-fenilalanina-p-fenilenodiamina (vide a Fórmula XVI infra).
A abreviação “MMAE” se refere a monometila auristatina E (vide a Fórmula XI infra).
A abreviação “AEB” se refere a um éster produzido por reação de auristatina E com ácido paraacetila benzóico (vide a Fórmula XX infra). . A abreviação “AEVB” se refere a um éster produzido por reação A de auristatina E com ácido benzoilvalérico (vide a Fórmula XXI infra). .. A abreviação “MMAF” se refere a dovalina-valina-dolaisoleuina- ” 15 dolaproina-fenilalanina (vide a Fórmula XVIV infra). . A menos que observado de modo diverso, o termo “alquila” se refere a um hidrocarboneto saturado reto ou ramificado tendo a partir de cer- = ca de 1 até cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combinações e sub- combinações de faixas e números específicos de átomos de carbono neste), coma partir de cerca de 1 até cerca de 8 átomos de carbono sendo prefe- renciais. Exemplos de grupos alquila são metila, etila, n-propila, iso-propila, n-butila, iso-butila, sec-butila, ferc-butila, n-pentila, 2-pentila, 3-pentila, 2- metil-2-butila, n-hexila, n-heptila, n-octila, n-nonila, n-decila, 3-metil-2-butila, 3-metil-1-butila, 2-metil-1-butila, 1-hexila, 2-hexila, 3-hexila, 2-metil-2-pentila, 3-metil-P-pentila, 4-metil-2-pentila, 3-metil-3-pentila, 2-metil-3-pentila, 2,3- dimetil-2-butila, e 3,3-dimetil-2-butila.
Grupos alquila, quer isolados ou como parte de outro grupo, po- dem ser opcionalmente substituídos com um ou mais grupos, preferencial mente 1 a 3 grupos (e quaisquer substituintes adicionais selecionados entre —halogeneto), incluindo, mas não limitados a, -halogeneto, -O-(C1-Cs alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-C;g alquinila), -arila, -C(O)R', -OC(OJR', -C(0)OR', -C(O)NH>2, -C(O)INHR', -C(O)N(R')2, -NHC(OJR', -SR', -SOsR',
: 20/133 -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH>, -NH(R'), -N(R')2 e -CN, em que cada R' é selecionado de modo independente entre -H, -C1-C;3 alquila, -C2-C; al- quenila, -C2-C; alquinita, ou -arila, e em que os referidos grupos -O-(C1-Cg alquila), -O-(C27-C;g alquenita), -O-(C2-Cs alquinila), -arila, -C;-Cg alquila, -C2- Csalquenila, e -C7Cs alquinila podem ser opcionalmente adicionalmente substituídos com um ou mais grupos incluindo, mas não limitados a, -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Csg alquinila, -halogeneto, -O-(C1-Cs alquila), -O- (C2-C;g alquenila), -O-(C27-C; alquinila), -arila, -C(O)R”, -OC(O)R”, -C(O)OR”, -C(O)NH2, -C(O)NHR”, -C(O)N(R")2, -NHC(O)R”, -SR”, -SO3R”, -S(O0)2R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH>, -NH(R”), -N(R")> e -CN, em que cada R” é selecio- nado de modo independente entre -H, -C,-Cs alquila, -C2-Cg alquenila, -C2- BR C; alquinila, ou -arila.
o. A menos que observado de modo diverso, os termos “alquenila” .. e “alquinila” se referem a cadeias de carbono retas e ramificadas tendo a : 15 partir de cerca de 2 até cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combi- r nações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono nesse), com a partir de cerca de 2 até cerca de 8 átomos de carbo- = no sendo preferenciais. Uma cadeia alquenila tem no mínimo uma ligação dupla na cadeia e uma cadeia alquinila tem no mínimo uma ligação tripla na cadeia. Exemplos de grupos alquenila incluem, mas não estão limitados a, etileno ou vinila, allila, -1-butenila, -2-butenila, -isobutilenila, -1-pentenila, -2-pentenila, -3-metil-1-butenila, -2-metil-2-butenila, e -2,3-dimetil-2- butenila. Exemplos de grupos alquinila incluem, mas não estão limitados a, acetilêni- co, propargila, acetilenila, propinila, -1-butinila, -2-butinila, -1-pentinila, -2-pentinila, e -3-metil-1 butinila.
Grupos alquenila e alquinila, quer isolados ou como parte de ou- tro grupo, podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais grupos, preferencialmente 1 a 3 grupos (e quaisquer substituintes adicionais selecio- nados entre halogeneto), incluindo, mas não limitados a, -halogeneto, -O- (CrCs alquila), -O-(C;-Cs alquenila), -O-(C2-C;g alquinila), -arila, -C(O)JR', “OC(OJR', -C(O0)OR', -C(O)NH>, -C(O)INHR', -C(O)IN(R')2, -NHC(OJR', -SR', -SOsR', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH>2, -NH(R'), -N(R'), e -CN, em
. 21/1133 que cada R' é selecionado de modo independente entre -H, -C;-Cs alquila, -C2-Crgalquenila, -C2-Cg alquinila, ou -arila e em que os referidos grupos -O- (C1-Cgalquila), -O-(C2-Csg alquenila), -O-(C2-Cg alquinila), -arila, -C-Csg alqui- la, -C7-Cg alquenila, e -C2-C; alquinila podem ser opcionalmente adicional- mente substituídos com um ou mais substituintes incluindo, mas não limita- dos a, -C1-Cg alquila, -C2-Ca alquenila, -C2-Cs alquinila, -halogeneto, -O-(C1- Cealquila), -O-(C>-C; alquenila), -O(C2-Cs alquinila), -arila,y -C(O)JR”, -OC(O)R”, -C(O0)OR”, -C(O)JNH2, -C(O)NHR”, -C(O)N(R"), -NHC(OJ)R", -SR”, -SO3R”, -S(O)R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH2, -NH(R”), -N(R”)2 e -CN, emque cada R"”é selecionado de modo independente entre -H, -C1-C; alqui-
la, -C2-C; alquenila, -C2-C; alquinila, ou -arila.
A menos que observado de modo diverso, o termo “alquileno” se e. refere a um radical hidrocarboneto saturado de cadeia reta ou ramificado .. tendo a partir de cerca de 1 até cerca de 20 átomos de carbono (e todas as ' 15 combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos r de carbono nesse), com a partir de cerca de 1 até cerca de 8 átomos de car- bono sendo preferenciais e tendo dois centros de radical monovalente deri- 7 vados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcano de origem.
Alquilenos típicos incluem, mas não estão limitados a, metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno, decaleno, 1,4-ciclo- hexileno, e semelhantes.
Grupos alquileno, quer isolados ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais grupos, preferencialmente 1 a 3 grupos (e quaisquer substituintes adicionais selecio- —nados entre halogeneto), incluindo, mas não limitados a, -halogeneto, -O- (C1-Cg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-C3 alquinila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O0)OR', -C(O)NH>2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(OJR', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')) e -CN, em que cada R' é selecionado de modo independente entre -H, -C1-C; alquila, -C2>C; alquenila, -C2>-Cg alquinila, ou -arila e em que os referidos grupos -O- (C1-Cg alquila), -O-(C2-Cg alquenita), -O-(C2-C; alquinila), -arita, -C1-Cg alqui- la, -C2-C;g alquenila, e -C7-Cs alquinila podem ser adicionalmente opcional-
. 22/1338 mente substituídos com um ou mais substituintes incluindo, mas não limita- dos a, -C1-C;g alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila, -halogeneto, -O-(C1- Cealquila), -O-(C>-Cs alquenila), -O-(Cz-C; alquinila), -arila, -C(O)R”, -OC(OJR”, -C(O)OR", -C(OINH2, -C(O)NHR”, -C(O)N(R")2, -NHC(OJ)R", 5º -SR”, -SO3R”, -S(O)2R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH2, -NH(R”), -N(R”), e -CN, em que cada R” é selecionado de modo independente entre -H, -C;-C; alqui- la, -C2-C; alquenila, -C2-C; alquinila, ou -arila.
A menos que observado de modo diverso, o termo “alquenileno” se refere a um grupo alquileno opcionalmente substituído contendo no míni- mo uma ligação dupla carbono-carbono. Exemplos de grupos alquenileno incluem, por exemplo, etenileno (-CH=CH-) e propenileno -CH=CHCH;72-). . A menos que observado de modo diverso, o termo “alquinileno” -. se refere a um groupo alquileno opcionalmente substituído contendo no mi- .. nimo uma ligação dupla carbono-carbono. Exemplos de grupos alquinileno ' 15 incluem, por exemplo, acetileno (-CDC-), propargil (CH2COC-), e 4-pentinil ” (CHICH2CH2C=CH-). A menos que observado de modo diverso, o termo “arila” se re- : fere a um radical hidrocarboneto aromático monovalente de 6 a 20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e núme- ros específicos de átomos de carbono therein) derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático de origem. Alguns grupos arila são representados nas estruturas de exemplo como “Ar”. Grupos arila típicos incluem, mas não estão limitados a, radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, fenila, naftaleno, an- traceno, bifenila, e semelhantes.
Um grupo arila, quer isolado ou como parte de outro grupo, pode ser opcionalmente substituído com um ou mais, preferencialmente 1 a 5, ou ainda 1 a 2 grupos incluindo, mas não limitados a, -halogeneto, -C1-C; alqui- la, -C2-Cg alquenila, -C2-C; alquinila, -O-(C;-C; alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(CC; alquinila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)JOR', -C(O)NH>, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(OJR', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -NO,>, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R'), e -CN, em que cada R' é selecionado de
. 23/133 modo independente entre -H, -C,-Cs alquila, -C2-C;g alquenila, -C2-Cg alquini- la, ou -arila e em que os referidos grupos -C;-C; alquita, -C2-Cg alquenila, -C2-C;g alquinila, O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-C;3 alquinita), e -arila podem ser adicionalmente opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes incluindo, mas não limitados a, -C1-Cs alquila, -C2-Cg al- quenila, -C2-C;g alquinila, -halogeneto, -O-(C1-C; alquila), -O-(C2-Csg alqueni- la), -O-(C2-Cg alquinila), -arila, -C(O)R”, -OC(O)R", -C(0)OR”, -C(O)NH>, -C(O)NHR”, -C(OIN(R")2, -NHC(O)R”, -SR”, -SOsR”, -S(O).R", -S(O)R”, -OH, -N3, -NH2, -NH(R”), -N(R”)2 e -CN, em que cada R” é selecionado de modo independente entre -H, -C,-C; alquila, -C2-C; alquenila, -C2-Cg alquini- la, ou -arila. : A menos que observado de modo diverso, o termo “arileno” se e. refere a um grupo arila opcionalmente substituído o qual é divalente (isto é, o derivado pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um sistema de anel aromático de origem) e - pode estar nas configurações orto, meta, ou para conforme mostrado nas estruturas que se seguem com fenila como o grupo arila de exemplo.
Pa EN Ot FO FO grupos “-(C;-Cs alquileno)arila,” “-(C2-Cg alquenileno)arila”, “e -(C2-Cs alquini- leno)arila” típicos incluem, mas não estão limitados a, benzila, 2-feniletan-1- ila,2-fenileten-1-ila, naftilmetila, 2-naftiletan-1-ila, 2-naftileten-1-ila, naftoben- zila, 2-naftofeniletan-1-ila e semelhantes.
A menos que observado de modo diverso, o termo “heterociclo,” se refere a um sistema de anel monocíclico, bicíclico, ou policíclico tendo de 3 a 14 átomos do anel (também referidos como membros do anel) em que —nomínimo um átomo do anel em no mínimo um anel é um heteroátomo se- lecionado entre N, O, P, ou S (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono e heteroátomos the- rein). O heterociclo pode ter de 1 a 4 heteroátomos do anel selecionados de
> 24/133 modo independente entre N, O, P, ou S. Um ou mais átomos de N, C, ou S em um heterociclo podem ser oxidados. Um heterociclo monocíclico prefe- rencialmente tem 3 a 7 membros do anel (por exemplo, 2 a 6 átomos de car- bono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de modo independente entre N, O, P,ouS) eum heterociclo bicíclico preferencialmente tem 5 a 10 membros do anel (por exemplo, 4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos sele- cionados de modo independente entre N, O, P, ou S). O anel que inclui o heteroátomo pode ser aromático ou não- aromático. A menos que observado de modo diverso, o heterociclo é anexado ao seu grupo pendente em qual- quer heteroátomo ou átomo de carbono que resulta em uma estrutura está- vel.
. Heterociclos são descritos em Paquette, “Principles of Modern o Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularmente ... nos Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, e 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, 7 15 A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 até o presen- -” te), em particular os Volumes 13, 14, 16, 19, e 28, e J. Am. Chem. Soc.
82:5566 (1960). h Exemplos de grupos “heterociclo” incluem a título de exemplo e não de limitação piridila, di-hidropiridila, tetra-hidropiridil (piperidila), tiazolila, pirimidinila, furanila, tienila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tetrazolila, benzo- furanila, tianaftalenila, indolila, indolenila, quinolinila, isoquinolinila, benzimi- dazolila, piperidinila, 4-piperidonila, pirrolidinila, 2-pirrolidonila, pirrolinila, te- tra-hidrofuranila, bis-tetra-hidrofuranila, tetra-hidropiranila, bis-tetra-hidropi- ranila, tetra-hidroquinolinila, tetra-hidroisoquinolinila, deca-hidroquinolinila, — octa-hidroisoquinolinila, azocinila, triazinila, 6H-1,2,5-tiadiazinila, 2H,6H- 1,5,2-ditiazinila, tienila, tiantrenila, piranila, isobenzofuranila, chromenila, xantenila, fenoxatinila, 2H-pirrolila, isotiazolila, isoxazolila, pirazinila, piridazi- nila, indolizinila, isoindolila, 3H-indolila, 1H-indazolita, purinila, 4H-quinoli- zinila, ftalazinila, naftiridinila, quinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, pteridinila, A4H-carbazolila, carbazolila, B-carbolinila, fenantridinila, acridinila, pirimidinila, fenantrolinita, fenazinila, fenotiazinila, furazanila, fenoxazinila, isocromanila, cromanila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pirazolinila, piperazini-
: 25/133 la, indolinita, isoindolinila, quinuclidinila, morfolinila, oxazolidinila, benzotria- zolila, benzisoxazolila, oxindolila, benzoxazolinila, e isatinoíla. Grupos “hete- rociclo” preferenciais incluem, mas não estão limitados a, benzofuranila, benzotiofenila, indolita, benzopirazolila, coumarinila, isoquinolinila, pirrolila, tiofenila, furanila, tiazolila, imidazolila, pirazolila, triazolila, quinolinila, pirimi- dinila, piridinila, piridonila, pirazinila, piridazinila, isotiazolila, isoxazolila e te- trazolila.
Um grupo heterociclo, quer isolado ou como parte de outro gru- po, pode ser opcionalmente substituído com um ou mais grupos, preferenci- almente 1 a 2 grupos, incluindo mas não limitados a, -C,-Cs alquila, -C2-Csg alquenila, -C2-Cs alquinila, -halogeneto, -O-(C,-Cs alquila), -O-(C2-Cs alqueni- . la), -O(Cz-Cg alquinila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(OJ)NH>, O -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(OJR', -SR', -SOsR', -S(O).R', -S(O)R', -OH, -. -N3, -NHo, -NH(R'), -N(R')2 e -CN, em que cada R' é selecionado de modo independente entre -H, -C;-Cs alquila, -C2-C; alquenila, -C2-Cs alquinila, ou - 7 arila e em que os referidos grupos -O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-C;g alquenila), -O-(C2-C; alquinila), -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cs alquinila, e -arila ã podem ser adicionalmente opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes incluindo, mas não limitados a, -C1-C; alquila, -C2-Cg alquenila, -C7C; alquinila, -halogeneto, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-C;g alquenila), -O-(C2- Cs alquinita), -arila, -C(O)R”, -OC(O)R”, -C(0)OR”, -C(O)NH>2, -C(O)NHR”, -C(O)IN(R")2, -NHC(O)R”, -SR”, -SO3R”, -S(O)2R”, -S(O)R”, -OH, -N3, -NH;, -NH(R”), -N(R”), e -CN, em que cada R” é selecionado de modo indepen- dente entre -H, -C1-C; alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila, ou arila. A título de exemplo e não de limitação, heterociclos ligados por carbono podem ser ligados nas posições que se seguem: posição 2, 3, 4, 5, ou 6 de uma piridina; posição 3, 4, 5, ou 6 de uma pridazina; posição 2, 4,5, ou 6 de uma pirimidina; posição 2, 3, 5, ou 6 de uma pirazina; posição 2, 3, 4, ou 5 de um furano, tetra-hidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetra- —hidropirrol; posição 2, 4, ou 5 de um oxazol|, imidazol ou thiazol; posição 3, 4, ou 5 de um isoxazol, pirazol, ou isotiazol; posição 2 ou 3 de uma aziridina; posição 2, 3, ou 4 de uma azetidina; posição 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 de uma
. 26/133 quinolina; ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 de uma isoquinolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados por carbono incluem 2-piridila, 3-piridila, 4- pirídila, 5-pirídila, 6-piridila, 3-piridazinila, 4-piridazinila, S-piridazinila, 6-piri- dazinila, 2-pirimidinila, 4-pirimidinila, 5-pirimidinila, 6-pirimidinila, 2-pirazinila, 3-pirazinila, S-pirazinila, 6-pirazinila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, ou 5-tiazolila. A título de exemplo e não de limitação, heterociclos ligados por nitrogênio podem ser ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3- imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, pipera- zina,indol, indolina, ou 1H-indazol; posição 2 de um isoindol, ou de uma iso- indolina; posição 4 de uma morfolina; e posição 9 de um carbazol, ou de : uma B-carbolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados por nitrogênio o incluem 1-azirídila, 1-azetedila, 1-pirrolila, 1-imidazolila, 1-pirazolila, e 1-pipe- + ridinila.
r 15 A menos que observado de modo diverso, o termo “carbociíclo,” z se refere a um sistema de anel saturado ou insaturado não-aromático mono- cíclico, bicíclico, ou policíclico tendo de 3 a 14 átomos do anel (e todas as T combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono therein) em que todos os átomos do anel são átomos de carbo- no. Carbociclos monocíclicos preferencialmente têm 3 a 6 átomos do anel, ainda mais preferencialmente 5 ou 6 átomos do anel. Carbociclos bicíclicos preferencialmente têm 7 a 12 átomos do anel, por exemplo, arranjados como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], ou 9 ou 10 átomos do anel ar- ranjados como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6]. O termo “carbociclo” inclui, por exemplo, um anel carbociclo monocíclico fundido a um anel arila (por exemplo, um anel carbociclo monocíclico fundido a um anel benzeno). Car- bociclos preferencialmente têm 3 a 8 átomos de carbono do anel. Grupos carbociclo, quer isolados ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos com, por exemplo, um ou mais gru- pos, preferencialmente 1 ou 2 grupos (e quaisquer substituintes adicionais selecionados entre halogeneto), incluindo, mas não limitados a, -halogeneto, -C,-Cg alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila, -O-(C1-Cg alquila), -0-(C2-
. 27/133 Csalquenila), -O-(C2-Cg alquinila), -arila, -C(O)R', -OC(O)JR', -C(O)OR”, -C(O)NH>2, -C(OINHR', -C(O)N(R')2, -NHC(OJR', -SR', -SOsR', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NHa, -NH(R'), -N(R'), e -CN, em que cada R' é sele- cionado de modo independente entre -H, -C;-Cg alquila, -C27-Cg alquenila, -C>Cs alquinila, ou -arila e em que os referidos grupos -C1-Cs alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-C; alquinila, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-C; alquenila), -0-(C2-Cs alquinila), e -arila podem ser adicionalmente opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes incluindo, mas não limitados a, -C1-C; alquila, -C2- Cs alquenila, -C2-Cg alquinila, -halogeneto, -O-(C1-C; alquila), -O-(C2-C; al- quenila)) -O-(CzCs alquinila), -arilay -C(O)R”, -OC(O)R”, -C(O)JOR", -C(O)NH2, -C(O)INHR”, -C(OIN(R”)2, -NHC(OJR"”, -SR”, -SOsR”, -S(O)2R", . -S(O)R”, -OH, -N3, -NH>2, -NH(R”), -N(R”)> e -CN, em que cada R” é selecio- e. nado de modo independente entre -H, -C1-Cs alquila, -C2-Cg alquenila, -C2- r. Cealquinila, ou -arila. 7 15 Exemplos de substituintes carbocílicos monocíclicos incluem f -ciclopropila, -ciclobutila, -ciclopentila, -1-ciclopent-1-enila, -1-ciclopent-2- enila, -1-ciclopent-3-enila, ciclo-hexila, -1-ciclo-hex-1-enila, -1-ciclo-hex-2- z enila, -1-ciclo-hex-3-enila, -ciclo-heptila, -ciclo-octila, -1,3-ciclo-hexadienila, -1 4-ciclo-hexadienila, -1,3-ciclo-heptadienila, -1,3,5-ciclo-heptatrienila, e -ciclo-octadienila.
Um “carbociclo,” quer usado isolado ou como parte de outro gru- po, se refere a um grupo carbociclo opcionalmente substituído conforme de- finido acima que é divalente (isto é, derivado pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um —sistemade anel carbocíclico de origem).
A menos que indicado de modo diverso pelo contexto, um hífen (O) designa o ponto de fixação à molécula pendente. Por conseguinte, o ter- mo “-(C1-C; alquileno)arila” ou “-C1-C; alquileno(arila)” se refere a um radical C1-Cs alquileno conforme definido aqui, em que o radical alquileno é anexa- doà molécula pendente em qualquer um dos átomos de carbono do radical alquileno e um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono do radical alquileno é substituído com um radical arila conforme definido aqui.
.- 28/133 Quando um grupo em particular é “substituído”, este grupo pode ter um ou mais substituintes, preferencialmente a partir de um até cinco substituintes, mais preferencialmente a partir de um até três substituintes, o mais preferencialmente a partir de um até dois substituintes, selecionados de modo independente entre a lista de substituintes. No entanto, o grupo pode ter geralmente qualquer número de substituintes selecionados entre haloge- neto. Grupos que são substituídos são portanto indicados. Pretende-se que a definição de qualquer substituinte ou variável em uma localização em particular em uma molécula seja independente de suas definições alhures nesta molécula. Entende-se que substituintes e pa- drões de substituição dos compostos desta invenção podem ser seleciona- e dos por uma pessoa com conhecimento regular da técnica de modo a pro- O porcionar compostos que sejam quimicamente estáveis e que possam ser . prontamente sintetizados por meio de técnicas conhecidas na arte bem co- 7 15 moos métodos estipulados aqui.
r Grupos de proteção conforme usado aqui, se referem a grupos os quais seletivamente bloqueiam, quer temporariamente ou permanente- 7 mente, um sítio reativo em um composto multifuncional. Grupos de proteção hidróxi adequados para aplicação na presente invenção são farmaceutica- mente aceitáveis e podem precisar ou não ser clivados do composto de ori- gem depois da administração a um sujeito de modo ao composto ser ativo. A clivagem é através de processos metabólicos normais dentro do corpo. Gru- pos de proteção hidróxi são de conhecimento geral na técnia, vide, Protecti- ve Groups in Organic Synthesis por T. W. Greene e P. G. M. Wuts (John Wi- lev&sons, 3" Edition) incorporado aqui, por meio de referência em sua tota- lidade e para todos os fins e incluem, por exemplo, grupos de proteção de éter (por exemplo, éteres de alquila e éteres silílicos incluindo, por exemplo, éter silílico de dialquila, éter silílico de trialquila, éter alcoxissilílico de dialqui- la), éster, carbonato, carbamatos, sulfonato, e fosfato. Exemplos de grupos de proteção hidróxi incluem, mas não estão limitados a, éter metílico; éter metoximetílico, éter metiltiometílico, éter(fenildimetilsili)metoximetílico, éter benziloximetílico, éter p-metoxibenziloximetílico, éter p-nitrobenziloximetílico,
.- 29/133 éter o-nitrobenziloximetílico, éter (4-metoxifenóxi)metílico, éter guaiacolmeti- lico, éter t-butoximetílico, éter4-penteniloximetílico, éter siloximetílico, éter 2- metoxietoximetílico, éter 2,2,2-tricloroetoximetílico, éter bis(2-cloroetóxi)mne- tílico, éter 2-(trimetilsilil)etoximetílico, éter metoximetílico, éter tetra-hidropi- ranílico, éter I-metoxiciclo-hexílico, éter 4-metoxitetra-hidrotiopiranílico, S,S- Dióxido de éter 4-metoxitetra-hidrotiopiranílico, éter 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]- 4-metoxipiperidin-4-ílico, éter 1-(2-fluorofeneil)-4-metoxipiperidin-4-ílico, éter 1,4-dioxan-2-ílico, éter tetra-hidrofuranílico, éter tetra-hidrotiofuranílico; éte- res etílicos substituídos tais como éter 1-etoxietílico, éter 1-(2-cloroetóxi)eti- lico, éter 1-[2-(trimetilsili etóxiletílico, éter 1-metil-1-metoxietílico, éter 1- metil-1-benziloxietílico, éter 1-metil-1-benzilóxi-2-fluoroetílico, éter 1-metil- . 1fenoxietílico, éter 2-trimetilsilílico, éter t-butílico, éter alílico, éteres propargi- e. licos, éter p-clorofenílico, éter p-metoxifenílico, éter benzílico, éter p-meto- CU xibenzílico, éter 3,4-dimetoxibenzílico, éter trimetilsilílico, éter trietilsilílico, ' 15 éter tripropilsililico, éter dimetilisopropilsilílico, éter dietilisopropilsilílico, éter dimetilhexilsílílico, éter t-butildimetilsilílico, éter difenilmetilsilílico, éster de - benzoilformiato, éster de acetato, éster de cloroacetato, éster de dicloroace- n tato, éster de tricloroacetato, éster de trifluoroacetato, éster de metoxiaceta- to, éster de trifenilmetoxiacetato, éster de fenilacetato, éster de benzoato, —metil carbonato de alquila, 9-fluorenilmetil carbonato de alquila, etil carbona- to de alquila, 2,2,2,-tricloroetil carbonato de alquila, 1,1,-dimetil-2,2,2-triclo- roetil carbonato, sulfonato de alquila, metanossulfonato, benzilsulfonato, tosi- lato, metileno acetal, etilideno acetal, e t-butilmetilideno cetal.
Grupos de pro- teção preferenciais são representados pelas fórmulas -Rº, -SI(Rº)(Rº)(Rº), -C(O)Rº, -C(O)JORº, -C(O)NH(Rº), -S(O).Rº, -S(0)-OH, P(O)OH), e -P(O)(OH)OR?, em que Rº? is C1-C2, alquila, Ca-C25 alquenila, C2-C20 alquini- la, -C1-C20 alquileno(carbociclo), -C2-C25 alquenileno(carbociclo), -C2-C2, al- quinileno(carbociclo), -CÊ-C19 arila, -C1-C29 alquiteno(arila), -C2-C25 alqueni- leno(arila), -C2-C25 alquinileno(arila), -C1-C29 alquileno(heterociclo), -C2-C2o —alquenileno(heterociclo), ou -C2-C2,5 alquinileno(heterociclo) em que os refe- ridos radicais alquila, alguenila, alquinila, alquileno, alquenileno, alquinileno, arila, carbociclo, e heterociclo quer isolados ou como parte de outro grupo
. 30/133 são opcionalmente substituídos.
A “alteração do padrão de glicosilação nativo” é pretendida para fins aqui, significando eliminação de uma ou mais porções de carboidrato encontradas na sequência nativa 161P2F10B (quer por remoção do sítio de —glicosilação subjacente ou por eliminação da glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou acréscimo de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes na sequência nativa 161P2F10B. Além disso, a expres- são inclui alterações qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, en- volvendo uma alteração na natureza e nas proporções das várias porções de carboidrato presentes. O termo “análogo” se refere a uma molécula a qual é estrutural- - mente similar ou partilha atributos similares ou correspondentes com outra O molécula (por exemplo, uma proteína relacionada com 161P2F10B). Por e- 1º xemplo, um análogo de uma proteína 161P2F10B pode ser especificamente : 15 ligado por um anticorpo ou uma célula T que liga especificamente a : 161P2F10B.
o O termo “anticorpo” é usado no sentido mais amplo a menos que ' claramente indicado de modo diverso. Portanto, um “anticorpo” pode ser produzido naturalmente ou sintético tais como anticorpos monocionais pro- duzidos por tecnologia de hibridoma convencional. Anticorpos anti 161P2F10B compreendem anticorpos monoclonais e policlonais bem como fragmentos contendo o domínio de ligação de antigênica e/ou uma ou mais regiões determinantes de complementaridade destes anticorpos. Conforme usado aqui, o termo “anticorpo” se refere a qualquer forma de anticorpo ou fragmento do mesmo que liga especificamente 161P2F10B e/ou apresenta a atividade biológica desejada e especificamente cobre anticorpos monocio- nais (incluindo anticorpos monoclonais de extensão total), anticorpos policlo- nais, anticorpos multi-específicos (por exemplo, anticorpos bi-específicos), e fragmentos de anticorpos na medida que eles ligam especificamente 161P2F10B e/ou apresentam a atividade biológica desejada. Qualquer anti- corpo específico pode ser usado nos métodos e nas composições propor- cionados aqui. Portanto, em uma modalidade o termo “anticorpo” engloba
. 31/133 uma molécula compreendendo no mínimo uma região variável de uma molé- cula de imunoglobulina de cadeia leve e no mínimo uma região variável de uma molécula de cadeia pesada que em combinação formam um sítio de ligação específico para o antígeno-alvo.
Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgG.
Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo de I19G1, 19G2, I9G3, ou IgG4. Os anticorpos úteis nos presentes métodos e nas pre- sentes composições podem ser produzidos em cultura celular, em fago, ou em vários animais, incluindo mas não limitados a vacas, coelhos, cabras, camundongos, ratos, hamsters, porcos-da-índia, carneiro, cães, gatos, ma- cacos, chimpanzés, símios.
Portanto, em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo de mamífero.
Técnicas de fagos podem - ser usadas para isolar um anticorpo inicial ou para produzir variantes com -. características alteradas de especificidade ou avidez.
As técnicas referidas o" são de rotina e são de conhecimento geral na arte.
Em uma modalidade, o ! 15 anticorpo é produzido por meios recombinantes de conhecimento geral na T arte.
Por exemplo, um anticorpo recombinante pode ser produzido por trans- " fecção de uma célula hospedeira com um vetor compreendendo uma se- , quência de DNA codificando o anticorpo.
Um ou mais vetores podem ser usados para transfectar a sequência de DNA expressando no mínimo uma região VL e uma região VH na célula hospedeira.
Exemplos de descrições de meios recombinantes de geração e produção de anticorpos incluem Del- ves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000); Goding, Mo- noclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic Press, 1993); Current —Protocols In Immunology (John Wiley & Sons, edição mais recente). Um an- ticorpo da presente invenção pode ser modificado por meios recombinantes para aumentar a eficácia do anticorpo na mediação da função desejada.
Deste modo, está dentro do âmbito da invenção que anticorpos podem ser modificados por substituições usando meios recombinantes.
Tipicamente, as substituições serão substituições conservadoras.
Por exemplo, no mínimo um aminoácido na região constante do anticorpo pode ser substituído com um resíduo diferente.
Vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos
. 32/133 No. 5.624.821, a Patente dos Estados Unidos No. 6.194.551, o Requerimen- to de Patente Internacional No. WO 9958572; e Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). A modificação nos aminoácidos inclui eliminações, adi- ções, e substituições de aminoácidos. Em alguns casos, as alterações refe- ridas são feitas para reduzir atividades indesejadas, por exemplo, citotoxici- dade dependente do complemento. Frequentemente, os anticorpos são mar- cados unindo, quer de modo covalente ou de modo não-covalente, uma substância a qual proporciona um sinal detectável. São conhecidas uma ampla variedade de etiquetas e de técnicas de conjugação e são reportadas extensivamente tanto na literatura científica quanto na literatura de patentes. Estes anticorpos podem ser triados para ligação a 161P2F10B normal ou . defeituosa. Vide por exemplo, Antibody Engineering: A Practical Approach - (Oxford University Press, 1996). Anticorpos adequados com as atividades * biológicas desejadas podem ser identificados pelos seguintes testes in vitro ! 15 incluindo, mas não limitados a: proliferação, migração, adesão, crescimento & em ágar macio, angiogênese, comunicação intercelular, apoptose, transpor- - te, transdução de sinal, liternalização, destruição secundária mediada por : anticorpo, e pelos seguintes testes in vivo tais como a inibição de crescimen- to tumoral. O anticorpo proporcionado aqui, pode ser útil como um interme- diáriode ADC. Os anticorpos proporcionados aqui, também podem ser úteis em aplicações de diagnóstico. Como anticorpos de captura ou não- neutralizantes, eles podem ser triados para a capacidade para ligar ao antí- geno específico sem inibir a atividade biológica do antígeno ou de ligação de receptor. Como anticorpos neutralizantes, os anticorpos podem ser úteis em provas de ligação competitiva. Eles também podem ser usados para quanti- ficar o 161P2F10B ou seu receptor.
O termo “porção de ligação antigênica” ou “fragmento de anti- corpo” de um anticorpo (ou simplesmente “porção de anticorpo”), conforme usado aqui, se refere a qualquer um ou mais fragmentos de um anticorpo —anti161P2F10B que conserva a capacidade para ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, 161P2F10B; Figura 1). Foi demonstrado que a fun- ção de ligação antigênica de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos
- 33/133 de um anticorpo de extensão total.
Exemplos de fragmentos de ligação en- globados dentro do termo “porção de ligação antigênica” de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios Vi, Vu, Ci e Cu; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab encadeados por uma ponte de dissul- feto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios Vu e Cu; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios V, e Vx4 de um bra- ço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546), o qual consiste em um domínio Vu; e (vi) uma região deter- minante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, V, e Vu, sejam codificados por genes separados, : eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sin- O tético que possibilita que eles sejam produzidos como uma única cadeia de e proteína na qual as regiões V, e Vx pareiam para formar moléculas monova- ' 15 lentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); vide, por exemplo, Bird, ç et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston, et al. (1988) Proc.
Natl.
Acad. . Sci.
USA 85: 5879-5883). Os anticorpos de cadeia única referidos também : se pretende que sejam englobados dentro do termo “porção de ligação anti- gênica” de um anticorpo.
Estes fragmentos de anticorpos são obtidos usan- do técnicas convencionais de conhecimento geral daqueles versados na ar- te, e os fragmentos são triados para utilidade na mesma maneira que os an-
ticorpos intactos.
Conforme usado aqui, qualquer forma do “antígeno” pode ser usada para gerar um anticorpo que seja específico para 161P2F10B.
Deste —modo,o antígeno de indução pode ser um único epitopo, múltiplos epitopos, ou a proteína inteira isolada ou em combinação com um ou mais agentes de reforço da imunogenicidade conhecidos na técnica.
O antígeno de indução pode ser uma proteína de extensão total isolada, uma proteína da superfície celular (por exemplo, imunizando com células transfectadas com no mínimo uma porção do antígeno), ou uma proteína solúvel (por exemplo, imunizando com somente a porção do domínio extracelular da proteína). O antígeno po- de ser produzido em uma célula modificada geneticamente.
O DNA codifi-
. 34/133 cando o antígeno pode ser genômico ou não- genômico (por exemplo, cD- NA) e codifica no mínimo uma porção do domínio extracelular. Conforme usado aqui, o termo “porção” se refere ao número mínimo de aminoácidos ou ácidos nucleicos, conforme apropriado, para constituir um epitopo imuno- gênicodo antígeno de interesse. Podem ser empregados quaisquer vetores genéticos adequados para transformação das células de interesse, incluindo, mas não limitados a vetores adenovirais, plasmídeos, e vetores não virais, tais como lipídeos catiônicos. Em uma modalidade, o anticorpo dos métodos e das composições aqui, liga especificamente no mínimo uma porção do domínio extracelular do 161P2F10B de interesse.
Os anticorpos ou fragmentos de ligação antigênica dos mesmos -. proporcionados aqui, podem ser conjugados a um “agente bioativo.” Con- .. forme usado aqui, o termo “agente bioativo” se refere a qualguer composto e sintético ou que ocorre naturalmente que liga o antígeno e/ou reforça ou me- ' 15 diaum efeito biológico desejado para reforçar toxinas de destruição celular. ç Em uma modalidade, os fragmentos de ligação úteis na presente invenção . são fragmentos biologicamente ativos. Conforme usado aqui, o termo “biolo- : gicamente ativo” se refere a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que tem a capacidade de ligar o epitopo antigênico desejado e exercer direta- mente ou indiretamente um efeito biológico. Efeitos diretos incluem, mas não estão limitados à modulação, à estimulação, e/ ou à inibição de um sinal de crescimento, à modulação, à estimulação, e/ ou à inibição de um sinal anti- apoptótico, à modulação, à estimulação, e/ ou à inibição de um sinal apoptó- tico ou necrótico, à modulação, à estimulação, e/ ou à inibição da cascata ADCC,eàmodulação, à estimulação, e/ ou à inibição da cascata CDC.
Os anticorpos monocionais aqui, incluem especificamente anti- corpos “quiméricos” nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, ao passo que o restante da cadeia ou das cadeias é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anti- corpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou sub-
. 35/133 classe de anticorpo, bem como fragmentos de semelhantes anticorpos, na medida que eles ligam especificamente ao antígeno-alvo e/ou apresentam a atividade biológica desejada (Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567; e Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).
O termo “Agente Quimioterápico” se refere a todos os compos- tos químicos que são eficazes para inibir o crescimento tumoral. Exemplos não-limitantes de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes; por exemplo, mostardas de nitrogênio, compostos de etilenoimina e sulfonatos de alquila; antimetabólitos, por exemplo, ácido fólico, antagonistas da purina ouda pirimidina; inibidores mitóticos, por exemplo, agentes anti-tubulina tais como vinca alcalóides, auristatinas e derivados de podofilotoxina; antibióti- .- cos citotóxicos; compostos que danificam ou interferem com a expressão ou ) a replicação de DNA, por exemplo, ligantes de sulco menor de DNA; e anta- e gonistas de receptores de fatores de crescimento. Além disso, agentes qui- : 15 —mioterápicos incluem agentes citotóxicos (conforme definido aqui, neste re- 1 querimento de patente), anticorpos, moléculas biológicas e moléculas pe- . quenas.
, O termo “composto” se refere a e engloba o próprio composto químico bem como, quer determinado explicitamente ou não, e a menos que ocontextotorna claro que os seguintes devem ser excluídos: foramas amor- fas e cristalinas do composto, incluindo formas polimórficas, onde estas for- mas podem ser parte de uma mistura ou em isolamento; formas de ácido livre e de base livre do composto, as quais são tipicamente as formas mos- tradas nas estruturas proporcionadas aqui, neste requerimento de patente; isômeros do composto, os quais se referem a isômeros óticos, e isômeros tautoméricos, onde isômeros óticos incluem enantiomers e diastereomers, isômeros quirais e isômeros não- quirais, e os isômeros óticos incluem isô- meros óticos isolados bem como misturas de isômeros óticos incluindo mis- turas racêmicas e não racêmicas; onde um isômero pode estar em forma isolada ou em uma mistura com um ou mais isômeros diversos; isótopos do composto, incluindo compostos contendo deutério e contendo trítio, e inclu- indo compostos contendo radioisótopos, incluindo radioisótopos terapeuti-
- 96/1383 camente e diagnosticamente eficazes; formas multiméricas do composto, incluindo formas diméricas, triméricas, etc.; sais do composto, preferencial mente sais farmaceuticamente aceitáveis, incluindo sais de adição de ácido e sais de adição de base, incluindo sais tendo contra-íons orgânicos e con- tra-íons inorgânicos, e incluindo formas zviterônicas, onde ser um composto for associado com dois ou mais contra-íons, os dois ou mais contra-íons po- dem ser os mesmos ou diferentes; e solvatos do composto, incluindo hemi- solvatos, mono-solvatos, di-solvatos, etc., incluindo solvatos orgânicos e sol- vatos inorgânicos, os referidos solvatos inorgânicos incluindo hidratos; onde serum composto for associado com duas ou mais moléculas de solvente, as duas ou mais moléculas de solvente podem ser as mesmas ou diferentes. . Em alguns casos, a referência feita aqui, a um composto da invenção inclui- . rá uma referência explícita a uma ou mais das formas acima, por exemplo, ro sais e/ou solvatos, no entanto, esta referência é somente para fins de ênfa- : 15 se, e não deve ser considerada como excluindo outras das formas acima É conforme identificado acima. a O termo “agente citotóxico” se refere a uma substância que inibe ' ou evita a atividade de expressão de células, a função de células e/ou pro- voca a destruição de células.
O termo pretende incluir isótopos radioativos, agentes quimioterápicos, e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes das mesmas.
Exemplos de a- gentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a auristatinas (por e- xemplo, auristatina e, auristatina f, MMAE e MMAF), auromicinas, maitansi- —nóides,ricina, cadeia A de ricina, combretastatina, duocarmicinas, dolastati- nas, doxorrubicina, daunorrubicina, taxóis, cisplatina, cc1065, brometo de etídio, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchici- na, di-hidróxi antracina diona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadeia A de abrina, cadeia A de mo- — deccin, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomici- na, curicina, crotina, caliqueamicina, inibidor da Saponaria officinalis, e glico- corticóide e agentes quimioterápicos diversos, bem como radioisótopos tais
. 37/133 como AB!!, 1131, (125, yº, Ret, Re", sm'*, Bi? ou 21º, P*? e isótopos ra- dioativos de Lu incluindo Lu'”?. Anticorpos também podem ser conjugados a uma enzima ativadora de pró-droga anti-cancerígena capaz de converter a pró-droga para sua forma ativa.
O termo “depletar,” no contexto do efeito de um agente de liga- ção de 161P2F10B sobre células que expressam 161P2F10B, se refere a uma redução no número de ou eliminação das células que expressam 161P2F10B.
O “produto genético” é usado aqui, para indicar um peptídeo / proteina ou MRNA.
Por exemplo, um “produto genético da invenção” algu- mas vezes é referido aqui, como uma “sequência de aminoácido de um cân- . cer”, “proteína de um câncer”, “proteína de um câncer listado na Tabela |”, o um “mRNA de um câncer”, “MRNA de um câncer listado na Tabela |”, etc.
CU Em uma modalidade, a proteína de um câncer é codificada por um ácido t 15 —nucleico da Figura 1. A proteína de um câncer pode ser um fragmento, ou alternativamente, pode ser a proteína de extensão total codificada por ácidos E nucleicos da Figura 1. Em uma modalidade, uma sequência de aminoácido ' de um câncer é usada para determinar identidade ou similaridade de se- quência.
Em outra modalidade, as sequências são variantes alélicas que ocorrem naturalmente de uma proteína codificada por um ácido nucleico da Figura 1. Em outra modalidade, as sequências são variantes de sequências conforme descrito posteriormente aqui.
Anticorpos “heteroconjugados” são úteis nos presentes métodos e composições.
Conforme usado aqui, o termo “anticorpo heteroconjugado” serefere a dois anticorpos unidos de modo covalente.
Os anticorpos referi- dos podem ser preparados usando métodos conhecidos na química de pro- teínas sintéticas, incluindo o uso de agentes de reticulação.
Vide, por exem- plo, a Patente dos Estados Unidos No. 4.676.980. O termo “homólogo” se refere a uma molécula a qual apresenta —homologia com outra molécula, por exemplo, por ter sequências de resíduos químicos que são os mesmos ou similares em posições correspondentes.
Em uma modalidade, o anticorpo proporcionado aqui, é um “an-
- 38/133 ticorpo humano.” Conforme usado aqui, o termo “anticorpo humano” se refe- re a um anticorpo no qual essencialmente as sequências inteiras das se- quências de cadeia leve e de cadeia pesada, incluindo as regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs), são de genes humanos. Em uma modalidade, anticorpos monoclonais humanos são preparados pela técnica de trioma, a técnica de células B humanas (vide, por exemplo, Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983), técnica de transformação de EBV (vide, por exemplo, Cole, et al. Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy 77-96 (1985)), ou usando display de fago (vide, por exemplo, Marks, et al., J. Mol. Biol 222: 581 (1991)). Em uma modalidade específica, o anticorpo humano é gerado em um camundongo transgênico. Técnicas para produzir os anti- - corpos parcialmente a totalmente humanos referidos são conhecidas na arte o e pode ser usada qualquer uma destas técncias. De acordo com uma moda- o lidade particularmente preferencial, sequências de anticorpos totalmente : 15 humanos são produzidas em um camundongo transgênico manipulado para 7 expressar genes de anticorpos de cadeias pesada e leve humanos. Um e- - xemplo de descrição de preparação de camundongos transgênicos que pro- Ú duzem anticorpos humanos é encontrado no Requerimento de Patente In- ternacional No. WO02/43478 e na Patente dos Estados Unidos No.
6.657.103 (Abgenix) e sua progênis. Células B de camundongos transgêni- cos que produzem o anticorpo desejado podem ser então fundidas para pro- duzir linhagens celulares de hibridoma para produção contínua do anticorpo. Vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.569.825;
5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; e 5.545.806; e Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev 31:33-42 (1998); Green, etal., J. Exp. Med. 188: 483-95 (1998).
Os termos “inibir” ou “inibição de” conforme usado aqui, signifi- cam reduzir por uma quantidade mensurável, ou prevenit inteiramente. “Etiquetas” adequadas incluem radionuclídeos, enzimas, subs- tratos, cofatores, inibidores, porções fluorescentes, porções quimilumines- centes, partículas magnéticas, e semelhantes. Patentes ensinando a aplica- ção de semelhantes etiquetas incluem as Patentes dos Estados Unidos Nos.
3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; e
. 39/133 ,
4.366.241. Além disso, os anticorpos proporcionados aqui, podem ser úteis como o componente de ligação antigênica de fluorobodies. Vide por exem- plo, Zeytun, et al., Nat. Biotechnol. 21: 1473-79 (2003). Os termos “câncer metastático” e “doença metastática” significa cânceres que se disseminaram para linfonodos regionais ou para sítios dis- tantes, e pretendem incluir doença em estágio D sob o sistema AUA e está- gio TxXNxM+ sob o sistema TNM. Os termos “modulador” ou “composto de teste” ou “candidato a fármaco” ou equivalentes gramaticais conforme usado aqui, descrevem qualquer molécula, por exemplo, proteína, oligopeptídeo, molécula orgânica pequena, polissacarídeo, polinucleotídeo, etc., a ser testado para a capaci- . dade de alterar diretamente ou indiretamente o fenótipo cancerígeno ou a : à expressão de uma sequência cancerígena, por exemplo, algumas sequên- "o. cias de ácido nucleico ou de proteína, ou efeitos de sequências canceríge- Y 15 nas (por exemplo, sinalização, expressão genética, interação de proteínas, Í etc.) Em um aspecto, um modulador neutralizará o efeito de uma proteína - cancerígena da invenção. Por “neutralizar” se indica que uma atividade de É uma proteína é inibida ou bloqueada, junto com o efeito consequente sobre a célula. Em outro aspecto, um modulador neutralizará o efeito de um gene, esua proteína correspondente, da invenção por normalização dos níveis da proteína referida. Em modalidades preferenciais, os moduladores alteram os perfis de expressão, ou ácidos nucleicos ou proteínas dos perfis de expres- são proporcionados aqui, ou caminhos efetores a jusante. Em uma modali- dade, o modulador suprime um fenótipo cancerígeno, por exemplo, para umadigital tecidual normal. Em outra modalidade, um modulador induziu um fenótipo cancerígeno. De modo geral, uma pluralidade de misturas de testes é realizada em paralelo com diferentes concentrações de agentes para obter uma reação diferencial às várias concentrações. Tipicamente, uma destas concentrações serve como um controle negativo, isto é, em concentração zeroou abaixo do nível de detecção. Moduladores, candidatos a fármaco, ou compostos de teste en- globam numerosas classes químicas, embora tipicamente sejam moléculas
. 40/133 orgânicas, preferencialmente compostos orgânicos pequenos tendo um peso molecular de mais de 100 e menos de cerca de 2.500 Daltons.
Moléculas pequenas preferenciais têm menos de 2000, ou menos de 1500 ou menos de 1000 ou menos de 500 D.
Agentes candidatos compreendem grupos fun- 5 cionaisnecessparuis para interação estrutural com proteínas, particularmen- te ligação de hidrogênio, e tipicamente incluem no mínimo um grupo amina, carbonila, hidroxila ou carboxila, preferencialmente no mínimo dois dos gru- pos químicos funcionais.
Os agentes candidatos frequentemente compreen- dem estruturas heterocíclicas ou cíclicas de carbono e/ou estruturas aromá- ticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima.
Moduladores também compreendem biomoléculas tais como peptí- . deos, sacarídeos, ácidos graxos, esteróides, purinas, pirimidinas, derivados, o. análogos estruturais ou combinações dos mesmos.
Peptídeos são particu- » larmente preferenciais.
Uma classe de moduladores são peptídeos, por e- : 15 xemplo de a partir de cerca de cinco até cerca de 35 aminoácidos, com a . partir de cerca de cinco até cerca de 20 aminoácidos sendo preferenciais, e . a partir de cerca de 7 até cerca de 15 sendo particularmente preferenciais. : Preferencialmente, a proteína moduladora de câncer é solúvel, inclui uma região não-transmembrana, e/ou, tem uma Cys N-terminal para auxiliar na solubilidade.
Em uma modalidade, o C-término do fragmento é mantido co- mo um ácido livre e o N-término é uma amina livre para auxiliar na ligação, isto é, a cisteina.
Em uma modalidade, uma proteína de câncer da invenção é conjugada a um agente imunogênico conforme discutido aqui.
Em uma modalidade, a proteína de câncer é conjugada a BSA.
Os peptídeos da in- venção, por exemplo, de extensões preferenciais, podem ser encadeados uns aos outros ou a outros aminoácidos para criar um peptídeo mais longo / uma proteína mais longa.
Os peptídeos moduladores podem ser digestos de proteínas que ocorrem naturalmente conforme é resumido acima, peptídeos aleatórios, ou peptídeos aleatórios “parciais”. Em uma modalidade preferen- cial, moduladores à base de peptídeo / proteína são anticorpos, e fragmen- tos dos mesmos, conforme definido aqui.
O termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado aqui, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancial- mente homogênea, isto é, os anticorpos individuais de que consiste a popu- lação são idênticos exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmen- te que podem estar presentes em menores quantidades. Anticorpos mono- — clonaissão altamente específicos, sendo direcionados contra um único epi- topo antigênico. Em contraste, preparações de anticorpos convencionais (policlonais) tipicamente incluem uma multitude de anticorpos direcionados contra (ou específicos para) diferentes epitopos. Em uma modalidade, o an- ticorpo policlonal contém uma pluralidade de anticorpos monoclonais com diferentes especificidades, afinidades, ou avidezes de epitopos dentro de um único antígeno que contém múltiplos epitopos antigênicos. O modificador .: “monoclional” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de o uma população de anticorpos substancialmente homogênea, e não deve ser mo considerado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de : acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hi- . bridoma descrito pela primeira vez por Kohler, et al., Nature 256: 495 (1975), À ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (vide, por e- xemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567). Os “anticorpos mo- —noclonais"” também podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos usando as técnicas descritas em Clackson, et al., Nature 352: 624-628 (1991) e Marks, et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por exem- plo. Estes anticorpos monoclonais de modo geral ligarão com no mínimo um Kd de cerca de 1 uM, mais geralmente no mínimo cerca de 300 nM, tipica- mente no mínimo cerca de 30 nM, preferencialmente no mínimo cerca de 10 nM, mais preferencialmente no mínimo cerca de 3 nM ou melhor, geral- mente determinado por ELISA. Um “excipiente farmacêutico” compreende um material tal como um adjuvante, um veículo, agentes de ajuste do pH e de tamponamento, agentes de ajuste da tonicidade, agentes umectantes, preservante, e seme- lhantes.
“Farmaceuticamente aceitável” se refere a uma composição não-
tóxica, inerte, e/ou que é fisiologicamente compatível com humanos ou ou- tros mamíferos.
O termo “polinucleotídeo” significa uma forma polimérica de nu- cleotídeos de no mínimo 10 bases ou pares de bases de extensão, quer ri- —bonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo, e pretende incluir formas de filamento único e de fila- mento duplo de DNA e/ou RNA.
Na técnica, este termo frequentemente é usado de modo intercambiável com “oligonucleotídeo”. Um polinucleotídeo pode compreendedr uma sequência de nucleotídeo revelada aqui, em que timidina (T), conforme mostrado por exemplo na Figura 1, também pode ser uracila (U); esta definição diz respeito às diferenças entre as estruturas qui- . micas do DNA e do RNA, em particular a observação de que uma das quatro . bases principais no RNA é uracila (U) ao invés de timidina (T). *. O termo “polipeptídeo” significa um polímero de no mínimo cerca Ú 15 ded4 5,6,7,ou8 aminoácidos.
Do início ao fim da especificação, são usa- T das designações para aminoácidos de rotina de três letras ou de única letra. - Na técnica, este termo é frequentemente usado de modo intercambiável com À “peptídeo” ou “proteína”. Uma molécula de DNA ou RNA “recombinante” é uma molécula debDNA ou RNA que tenha sido submetida a manipulação molecular in vitro.
Conforme usado aqui, os termos “específico”, “especificamente liga" e “liga especificamente” se referem à ligação seletiva do anticorpo ao epitopo do antígeno-alvo.
Anticorpos podem ser testados para especificidade de ligação por comparação da ligação a antígeno apropriado com ligação a antígeno irrelevante ou mistura de antígenos sob uma dada série de condi- ções.
Se o anticorpo ligar ao antígeno apropriado no mínimo 2, 5, 7, e prefe- rencialmente 10 vezes mais do que ao antígeno irrelevante ou à mistura de antígenos então é considerado como sendo específico.
Em uma modalidade, um anticorpo específico é um anticorpo que liga ao antígeno relacionado com 161P2F10B (particularmente 161P2F10B), mas não liga ao antígeno irrelevante.
Conforme usado aqui, “tratar” ou “terapêutico” e termos gramati-
calmente relacionados, se referem a qualquer melhora de qualquer conse- quência de doença, tal como sobrevida prolongada, menos morbidez, e/ou uma redução de efeitos colaterais os quais são os subprodutos de uma mo- dalidade terapêutica alternativa; conforme é prontamente reconhecido na técnica, a erradicação total da doença é preferencial porém não é um requi- sito para uma ação de tratamento.
As “proteínas relacionadas com 161P2F10B” incluem aquelas identificadas especificamente aqui, (vide, a Figura 1), bem como variantes alélicas, variantes de substituições conservadoras, análogos e homólogos que podem ser isolados / gerados e caracterizados sem indevida experimen- tação seguindo os métodos delineados aqui, ou prontamente disponíveis na : técnica. Também são incluídas proteínas de fusão que combinam partes de .. diferentes proteinas 161P2F10B ou fragmentos das mesmas, bem como proteínas de fusão de uma proteina 161P2F10B e um polipeptídeo heterólo- : 15 go. As proteinas 161P2F10B referidas são referidas coletivamente como as proteínas relacionadas com 161P2F10B, as proteínas da invenção, ou : 161P2F10B. O termo “proteína relacionada com 161P2F10B” se refere a um À fragmento de polipeptídeo ou a uma sequência de proteina 161P2F10B de 4,5,6,7,8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, oumaisde 25 aminoácidos; ou, de no mínimo 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 ou mais aminoácidos.
11.) Anticorpos anti 161P2F10B Anticorpos para ADCs da invenção especificamente ligam a uma proteina 161P2F10B e não ligam (ou ligam fracamente) a peptídeos ou pro- teinas que não são proteínas relacionadas com 161P2F10B sob condições fisiológicas.
Vários métodos para a preparação de anticorpos, especiífica- mente anticorpos monoclonais, são de conhecimento geral na técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser preparados por imunização de um hospedei- ro mamífero adequado usando uma proteína relacionada com 161P2F10B,
peptídeo, ou fragmento dos mesmos, em forma isolada ou imunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Além dis- so, também podem ser usadas proteínas de fusão de 161P2F10B, tais como uma proteina de fusão de 161P2F10B GST. Em uma modalidade particular, é produzida uma proteína de fusão de GST compreendendo toda ou a maior parte da sequência de aminoácidos da Figura 1, e em seguida usada como um imunogênio para gerar anticorpos apropriados. Em outra modalidade, uma proteína relacionada com 161P2F10B é sintetizada e usada como um imunogênio. Além disso, técnicas de imunização de DNA nu conhecidas na - arte são usadas (com ou sem proteína relacionada com 161P2F10B purifi- o cada ou células expressando 161P2F10B) para gerar uma reação imune .. para o imunogênio codificado (para revisão, vide Donnelly, et al., 1997, Ann.
' 15. Rev. Immunol. 15: 617-648).
: A sequência de aminoácidos de uma proteína 161P2F10B con- - forme demonstrado na Figura 1 pode ser analisada par selecionar regiões : específicas da proteina 161P2F10B para gerar anticorpos. Por exemplo, a- nálises da hidrofobicidade e da hidrofilicidade de uma sequência de aminoá- cidos161P2F10B são usadas para identificar regiões hidrofílicas na estrutu- ra de 161P2F10B. As regiões de uma proteina 161P2F10B que apresentam estrutura imunogênica, bem como outras regiões e domínios, podem ser prontamente identificadas usando vários outros métodos conhecidos na téc- nica, tais como as análises de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte- —Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz ou Jameson-Wolf. Perfis de hidrofilici- dade podem ser gerados usando o método de Hopp, T.P. e Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828. Perfis de hidropaticidade podem ser gerados usando o método de Kyte, J. e Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. Perfis da percentagem (%) de resíduos acessíveis — podem ser gerados usando o método de Janin J., 1979, Nature 277:491-492. Perfis da Flexibilidade média podem ser gerados usando o método de Bhas- karan R., Ponnuswamy P.K., 1988, /nt. J. Pept. Protein Res. 32:242-255.
Perfis de Beta-turn podem ser gerados usando o método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Portanto, cada região identifi- cada por qualquer um destes programas ou métodos está dentro do âmbito da presente invenção.
Métodos preferenciais para a geração de anticorpos 161P2F10B são adicionalmente ilustrados por meio dos exemplos propor- cionados aqui.
Métodos para preparar uma proteína ou um polipeptídeo para uso como um imunogênio são de conhecimento geral na arte.
Também são de conhecimento geral na arte métodos para preparar conjugados imunogê- nicos de uma proteína com um veículo, tais como BSA, KLH ou outra proteí- na de veículo.
Em algumas circunstâncias, conjugação direta usando, por exemplo, reagentes de carbodiimida são usados; em outros casos reagentes de ligação tais como aqueles supridos pela Pierce Chemical Co., Rockford, o ILA, são eficazes.
A administração de um imunogênio 161P2F10B é frequen- CU temente conduzida por injeção por um período de tempo adequado e com ' 15 usode um adjuvante adequado, conforme é entendido na arte.
Durante o Í esquema de imunização, os títulos de anticorpos podem ser tomados para
- determinar a adequação da formação de anticorpos. ' Em uma modalidade preferencial, um MAb 161P2F10B para os conjugados de fármaco e anticorpo da invenção compreende regiões variá- veisde cadeias pesada e leve de um anticorpo designado H16-7.8 (Vide a Figura 3), ou regiões variáveis de cadeias pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências de aminoáci- dos das regiões variáveis de cadeias pesada e leve de H16-7.8, e em que os anticorpos conservam as propriedades funcionais desejadas (particularmen- te atividade de ligação a 161P2F10B) dos MAbs 161P2F10B da invenção.
À região variável de cadeia pesada de H16-7.8 consiste da sequência de ami- noácidos variando do 20º resíduo Q ao 142º resíduo S da SEQ ID NO: 7, e a região variável de cadeia leve de H16-7.8 consiste da sequência de ami- noácidos variando do 20º: resíduo E ao 127º resíduo R da SEQ ID NO: 8. Como a região constante do anticorpo da invenção, pode ser escolhida qualquer subclasse de região constante.
Preferencialmente, podem ser usa- das a região constante da I9G2 humana como a região constante de cadeia pesada e a região constante kappa da Ig humana como a região constante de cadeia leve. A reatividade (atividade de ligação) dos MAbs 161P2F10B com uma proteína 161P2F10B pode ser estabelecida por uma série de mei- os de conhecimenyo geral, incluindo análises por Western blot, imunopreci- —pitação, ELISA, e FACS usando proteínas 161P2F10B, células que expres- sam 161P2F10B ou extratos das mesmas.
Em uma modalidade, a região de articulação de CH1 é modifica- da de tal! modo que o número de resíduos cisteína na região de articulação é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Patente dos Estados Unidos No. 5.677.425 por Bodmer, et al. O número de resíduos cisteína na região de articulação de CH1 é alte- r rado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou e para aumentar ou diminuir a estabilidade do MAb 161P2F10B. CO Em outra modalidade, a região de articulação Fc de um anticor- : 15 poé mutada para diminuir a meia-vida biológica do MAb 161P2F10B. Mais õ especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas o na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de articulação-Fc | de tal modo que o anticorpo tenha conferido ligação da proteína A de Estafi- lococos (SpA) em relação à ligação de SpA do domínio de articulação-Fc nativo. Esta abordagem é descrita em mais detalhes na Patente dos Estados Unidos No. 6.165.745 por Ward, et al.
Em outra modalidade, o MAb 161P2F10B é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. São possíveis várias abordagens. Por exemplo, podem ser introduzidas mutações conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No. 6.277.375 para Ward. Alternativamente, para au- mentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epitopo de ligação de receptor selvagem tirado de dois loops de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.869.046 e 6.121.022 por Presta,ela Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada por substi- tuição de no mínimo um resíduo aminoácido com um resíduo aminoácido diferente para alterar a função ou as funções efetoras do MAb 161P2F10B. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados entre resíduos aminoá- cidos específicos podem ser substituídos com um resíduo aminoácido dife- rente de tal modo a que o anticorpo tenha uma afinidade alterada por um ligante efetor mas retenha a capacidade de ligação antigênica do anticorpo de origem. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita em maiores detalhes nas Patentes dos Estados Uni- dos Nos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter, et al.
Em uma modalidade, o anticorpo para ADC da presente inven- ção é produzido por meios recombinantes de conhecimento geral na técnica. - Por exemplo, um anticorpo recombinante pode ser produzido por transfec- e ção de uma célula hospedeira com um vetor compreendendo uma sequência ro de DNA codificando o anticorpo. Um ou mais vetores podem ser usados pa- i 15 ratransfectar a sequência de DNA expressando no mínimo uma região VL e : uma região VH na célula hospedeira. Exemplos de descrições de meios re- - combinantes de geração e produção de anticorpos incluem Delves, ANTI À BODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000); Goding, Mo- —noclonal Antibodies: Principles And Practice (Academic Press, 1993); Cur- rent Protocols In Immunology (John Wiley & Sons, edição mais recente).
O anticorpo para ADC da presente invenção pode ser facilmente preparado por aqueles versados na téncica com base na informação de se- quência sobre a região variável de cadeia pesada e a região variável de ca- deia leve do mesmo reveladas aqui, usando um método de conhecimento geral na técnica. Especificamente, são preparados um fragmento genético da região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de bases que co- difica o aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo para ADC da presente invenção (SEQ ID NO: 7, de 20 a 142), e um fragmento genético da região variável de cadeia leve tendo uma sequência de bases que codifica o aminoácido da região variável de cadeia leve do anticorpo para ADC da presente invenção (SEQ ID NO: 8, de 20 a 127). Em seguida,
os genes das regiões variáveis são unidos a um gene de região constante em uma classe apropriada de anticorpo humano para preparar um gene de anticorpo. Em seguida, este gene de anticorpo é unido a um vetor de ex- pressão apropriado, e introduzido em uma célula cultivada. Finalmente, esta célula cultivada é cultivada, em que o anticorpo pode ser obtido a partir do sobrenadante da cultura. Cada um dos fragmentos genéticos de regiões variáveis descri- tos acima que codificam os aminoácidos de região variável de cadeia pesa- da e de cadeia leve do anticorpo da presente invenção (SEQ ID NO: 7, de 20 a1l42eSEQID NO: 8, de 20 a 127) pode ser preparado com base nas se- quências de bases designadas com base nas sequências de aminoácidos . das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve (SEQ ID NO: 7, de = 20 a 142 e SEQ ID NO: 8, de 20 a 127), ou com base nas sequências de = bases das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo : 15 da presente invenção, mostradas pela SEQ ID NO: 4, de 91 a 459 e pela : SEQ ID NO: 6, de 100 a 423, usando um método de síntese genética de co- - nhecimento geral na técnica. Como um método de síntese genética seme- E lhante, podem ser usados vários métodos óbvios para aqueles versados na técnica, tais como o método de síntese genética de anticorpo descrito na publicação do requerimento de patente internacional No. WO90/07861. Em seguida, os fragmentos genéticos de região variável descritos acima e o ge- ne de região constante do anticorpo humano são unidos para preparar um gene de anticorpo. Embora qualquer subclasse de região constante possa ser escolhida como a região constante do anticorpo humano usado, podem ser preferencialmente usadas Iglgama]l2 humana como a região constante de cadeia pesada, e lglkappa] humana como a região constante de cadeia leve.
Como o gene de cadeia pesada de anticorpo preferencial do an- ticorpo para ADC da presente invenção, obtido por união do gene de região variável de cadeia pesada mostrado pela SEQ ID NO: 7, de 20 a 142 e o gene de região constante de cadeia pesada de Iglgama]l2 humana, podem ser mencionados um gene compreendendo uma sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 7, de 20 a 468, mais preferencialmente um gene compreendendo a sequência de ba- ses mostrada pela SEQ ID NO: 4, de 91 a 1437. Como o gene de cadeia leve de anticorpo preferencial do anticorpo para ADC da presente invenção, obtido por união do gene de região variável de cadeia leve mostrado pela SEQ ID NO: 8, de 20 a 127 e o gene de região constante de cadeia leve de lglkappa] humana, podem ser mencionados um gene compreendendo uma sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 8, de 20 a 233, mais preferencialmente um gene compreenden- doa sequência de bases mostrada pela SEQ ID NO: 6, de 100 a 741. Como o anticorpo para ADC da presente invenção, codificado por um gene de ca- deia pesada compreendendo a sequência de bases mostrada pela SEQ ID e. NO: 4, de 91 a 1437 e um gene de cadeia leve compreendendo a sequência CU de bases mostrada pela SEQ ID NO: 6, de 100 a 741, H16-7.8, descrito em : 15 um Exemplo abaixo, podem ser mencionados.
" Em seguida à preparação deste gene de anticorpo, a introdução - do gene de anticorpo a um vetor de expressão, a introdução do vetor de ex- | pressão em células cultivadas, a cultura das células cultivadas, a purificação do anticorpo e semelhantes podem ser realizadas usando vários métodos de conhecimento geral na técnica. O vetor de expressão não é sujeito a limita- ção, na medida que seja capaz de expressar o gene de anticorpo. É prefe- rencial utilizar um vetor de expressão já tendo um gene de região constante de Ig humana tal como AG-[gamma]2 ou AG-[kappal], porque iria se tornar um vetor de expressão tendo o gene de anticorpo simplesmente quando o gene de região variável de anticorpo for inserido no mesmo. O vetor de expressão descrito acima é introduzido em células cultivadas, por exemplo, pelo método do fosfato de cálcio e semelhantes. Como exemplos das células cultivadas nas quais o vetor de expressão é introduzido, podem ser usadas células cultivadas tais como células CHO, e as células podem ser cultivadas por um método convencional. Depois da cultura descrita acima, o anticorpo acumulado no sobrenadante da cultura pode ser purificado, por exemplo, por várias cromatografias usando uma co-
luna de Proteína A.
A reatividade (atividade de ligação) de anticorpos contra 161P2F10B obtidos deste modo com uma proteína 161P2F10B pode ser estabelecida por uma série de meios de conhecimento geral, incluindo anás- lisepor Western blot, por imunoprecipitação, por ELISA, e por FACS usando, conforme apropriado, proteina 161P2F10B, células que expressam 161P2F10B ou extratos das mesmas. O anticorpo obtido deste modo ou um fragmento de anticorpo conservando uma atividade devida ao anticorpo de- pois de ser adicionalmente purificado conforme requerido, pode ser prepara- do como um anticorpo para ADC. Um anticorpo contra 161P2F10B ou frag- mento do mesmo pode ser etiquetado com um marcador detectável ou con- - jugado a uma segunda molécula. Marcadores detectáveis adequados inclu- o em, mas não estão limitados a, um radioisótopo, um composto fluorescente, CU um composto bioluminescente, composto quimiuminescente, um quelador de ' 15 —metalouuma enzima. Além disso, anticorpos bi-específicos específicos para õ dois ou mais epitopos de 161P2F10B são gerados usando métodos conhe- e cidos de modo geral na técnica. Anticorpos homodiméricos também podem Ú ser gerados por técnicas de reticulação conhecidas na arte (por exemplo, Wolff, et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).
Em ainda outra modalidade preferencial, o MAb 161P2F10B pa- ra ADCs da invenção é um anticorpo compreendendo cadeia pesada e leve de um anticorpo designado H16-7.8. A cadeia pesada de H16-7.8 consiste da sequência de aminoácidos variando a partir do 20º resíduo Q até o 468º resíduo K da SEQ ID NO: 7 e a cadeia leve de H16-7.8 consiste da sequên- —ciade aminoácidos variando a partir do 20º E resíduo até o 233º resíduo C da sequência de SEQ ID NO: 8. A sequência das quais é estipulada na Figu- ra 2 e na Figura 3. Em uma modalidade preferencial, H16-7.8 é conjugado a um agente citotóxico.
IL.) Conjugados de anticorpo e fármaco de modo geral Em outro aspecto, a invenção proporciona conjugados de anti- corpo e fármaco (ADCs), compreendendo um anticorpo conjugado a um a- gente citotóxico tal como MMAF. Em outro aspecto, a invenção adicional-
mente proporciona métodos de usar os ADCs. Em um aspecto, um ADC compreende qualquer um dos MAbs 161P2F10B acima anexado de modo covalente a um agente citotóxico. O uso de conjugados de anticorpo e fármaco para a liberação —localde agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, fármacos para destruir ou inibir células tumorais no tratamento de câncer (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; patente dos Estados Unidos No.
4.975.278) permite a liberação direcionada da porção de fármaco para tumo- res ea acumulação intracelular nos mesmos, em que a administração sis- têmica destes agentes de fármacos não conjugados pode resultar em níveis - inaceitáveis de toxicidade para as células normais bem como as células tu- o morais que se deseja eliminar (Baldwin, et a/., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, - 1986): 603-05; Thorpe, (1985) “Antibody Carriers Of Citotoxic Agents In ! 15 Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies '84: Biological and ' Clinical Applications, A. Pinchera, et al. (ed.s), pp. 475-506). Máxima eficácia d com mínima toxicidade é buscada deste modo. Tanto anticorpos policlonais ' quanto anticorpos monoclonais têm sido reportados como úteis nestas estra- tégias (Rowland, ef al. (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Fármacos usados nestes métodos incluem daunomicina, doxorrubicina, me- totrexato, e vindesina (Rowland, ef al., (1986) supra). Toxinas usadas em conjugados de anticorpos e toxinas incluem toxinas bacterianas tais como toxina diftérica, toxinas de plantas tais como ricina, toxinas de molécula pe- quena tais como geldanamicina (Mandler, et al. (2000) Jour. of the Nat. Can- cerinst 92(19):1573-1581; Mandler, et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler, et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786- 791), maitansinoides (EP 1391213; Liu, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), e caliqueamicina (Lode, ef al. (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman, et a/. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). As toxinas podem realizar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos incluindo liga- ção de tubulina, ligação de DNA, ou inibição da topoisomerase. Alguns fár- macos citotóxicos tendem a ser inativos ou menos ativos quando conjugados a grandes anticorpos ou ligantes de receptores de proteínas.
Exemplos de conjugados de fármaco e anticorpo são ZEVALINI (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) o qual é um conjugado de anticorpo e radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal de kappa IgG1 murino direcionado contra o antígeno CD20 encontrado sobre a superfície de linfóci- tos B normais e malignos e radioisótopo 1h ou ºY ligado por um ligante- quelador de tiouréia (Wiseman, et al. (2000) Eur.
Jour.
Nucl.
Med. 27(7): 766-77; Wiseman, et al. (2002) Blood 99(12): 4336-42; Witzig, ef al. (2002) J.
Clin.
Oncol. 20(10): 2453-63; Witzig, et al. (2002) J.
Clin.
Oncol. 20(15): 3262-69). Adicionalmente, MYLOTARG"" (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth - Pharmaceuticals), um conjugado de fármaco e anticorpo composto de um O anticorpo hu CD33 encadeado a caliqueamícina, foi aprovado em 2000 para = o tratamento de leucemia mielóide aguda por injeção (Drugs of the Future À 15 (2000) 25(7): 686; Patentes dos Estados Unidos Nos. 4970198; 5079233; ; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; e 5773001). . Além disso, Cantuzumab mertansine (Immunogen, Inc.), um con- ' jugado de fármaco e anticorpo composto do anticorpo huC242 encadeado através do ligante de dissulfeto SPP à porção do fármaco de maitansinoide, DMI, está avançando para testes Fase || para o tratamento de cânceres que expressam CanAg, tais como cânceres do colon, pancreático, gástrico, e outros.
Adicionalmente, MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um conjugado de fármaco e anticorpo composto do anti- corpo monoclonal anti- antígeno de membrana específico da próstata (PS- MA) encadeado à porção do fármaco maitansinoide, DM1, está em desen- volvimento para o tratamento potencial de tumores da próstata.
Finalmente, os peptídeos de auristatina, auristatina E (AE) e monometila auristatina (MMAE), análogos sintéticos da dolastatina, foram — conjugados a anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y em carcinomas) e cAC10 (específicos para CD30 em malignidades hematológicas) (Doronin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)
e estão em desenvolvimento terapêutico. III(A). Auristatinas e Dolostatinas Foi demonstrado que as dolastatinas e auristatinas interferem com a dinâmica dos microtúbulos, hidrólise de GTP e a divisão nuclear e celular (Woyke, et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) e tem atividade cancerígena (US 5663149) e atividade antifúngi- ca (Pettit, ef al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965). À porção do fármaco de dolastatina ou auristatina pode ser anexada ao anti- corpo através do término N (amino) ou ao término C (carboxila) da porção do fármaco peptídico (publicação de patente internacional No. WO 02/088172). Modalidades de auristatina exemplares incluem as porções DE e - DF do fármaco de monometila auristatina encadeadas ao N-término, revela- o das em Senter, et al, “Proceedings of the American Association for Cancer e Research,” Volume 45, Abstract Number 623, e apresentado em 28 de mar- ' 15 çode2004, cuja revelação é expressamente incorporada por meio de refe- ? rência em sua totalidade. . Uma modalidade de auristatina exemplar é MMAE (em que a li- : nha ondulada indica a fixação covalente a um ligante (L) de um conjugado de fármaco e anticorpo). o nu OH
NA RITO N " N | O O ! O O O O
MMAE Outra modalidade de auristatina exemplar é MMAF, em que a li- nha ondulada indica a fixação covalente a um ligante (L) de um conjugado de fármaco e anticorpo (Patente dos Estados Unidos No. 2005/0238649): Ô. DO À IO SALA N “ N e. C tio o O O LO
MMAF
Modalidades adicionais exemplares compreendendo MMAE ou MMAF e vários componentes ligantes (descritos adicionalmente aqui, neste requerimento de patente) têm as estruturas e abreviações que se seguem (em que Ab significa anticorpo e p é 1 até cerca de 12): “Re o AAA Raia o Pe é it! ), Ab-MC-vce-PAB-MMAF La TERESA) Novato o 9.º dó ó p ro Ab-MC-ve-PAB-MMAE o ASS o Ro . o H " Pp P SANS EO ), ? Ab-MC-MMAF s ADCs da presente invenção incluem MMAF.
A modalidade pre- ferencial, os ADCs da presente invenção incluem maleimidocaproíla (mc) como um ligante e MMAF como um fármaco.
IV.) Compostos de conjugados de anticorpo e fármaco os quais ligam 161P2F10B A presente invenção proporciona, entre outros, compostos de conjugados de anticorpo e fármaco para liberação direcionada de fármacos.
Os inventores descobriram que os compostos de conjugados de anticorpo e fármaco têm potente atividade citotóxica e/ou citostática contra células que expressam 161P2F10B.
Os compostos de conjugados de anticorpo e fárma- co compreendem uma unidade de Anticorpo encadeada de modo covalente a no mínimo uma unidade de Fármaco.
As unidades de Fármacos podem ser encadeadas de modo covalente diretamente ou através de uma unidade ligante (-LU-).
Em determinadas modalidades, o conjugado de fármaco e anti- corpo composto tem a fórmula que se segue: L-(LU-D), 0) ou um sal ou solvato do mesmo farmaceuticamente aceitável; em que: L é a unidade de Anticorpo, por exemplo, MAb 161P2F10B da presente invenção, e (LU-D) é uma unidade ligante-unidade de porção de Fármaco, em que: LU- é uma unidade ligante, e -D é uma unidade de fármaco tendo atividade citostática ou cito- tóxica contra uma célula-alvo; e : p é um inteiro de 1 a 20. e Em determinadas modalidades, p varia de 1 a 12, de 1 a 10, de CU 1a9,de 1a8,de 1 a7,de 1 a6,de 1a5,de1a4, de 1a3,oude 1a2 : 15 Em determinadas modalidades, p varia de 2 a 10, de 2a 9, de 2a 8, de õ 2a7,de2a6,de2as5,de2ad4oude2a3. Em outras modalidades, p é 1, - 2,3,4,5 ou 6. Em determinadas modalidades, p é 2 ou 4. " Em determinadas modalidades, o conjugado de fármaco e anti- corpo composto tem a fórmula que se segue: L- (AsWwy"Yy-D) (1) ou um sal ou solvato do mesmo farmaceuticamente aceitável, em que: L é a unidade de Anticorpo, por exemplo, MAb 161P2F10B; e -As-WyYy- é uma unidade ligante (LU), em que: -A- é uma unidade de Estirador, aéooul, cada -W- é de modo independente uma unidade de Aminoácido, w é um inteiro variando de O to 12, -Y- é uma unidade de espaçador auto-imolativo, yéO 1ou2; So -D é algumas unidades de fármaco tendo atividade citostática ou citotóxica contra a célula-alvo; e p é um inteiro de 1 a 20.
Em determinadas modalidades, a é O ou 1, wé 0 ou 1,eyé 0,1 ou 2. Em determinadas modalidades, a é O ou 1, w é O0ou1,eyéOoul Em determinadas modalidades, p varia de 1a 12,de 1a 10,de 1a9,de1a 8, de 1a7,de 1 a 6,de 1 a 5, de 1a 4, de 1 a 3, ou de 1 a 2. Em determi- —nadasmodalidades,p variade2a8,de2a7,de2a 6, de 2a 5, de 2a 4 ou de 2 a 3. Em outras modalidades, p é 1,2, 3,4, 5 ou 6. Em determinadas modalidades, p é 2 ou 4. Em determinadas modalidades, quando w não é zero, y é 1 ou 2. Em determinadas modalidades, quando w é 1 a 12, y é 1 ou
2. Em determinadas modalidades, w é 2a 12e yé 1 ou 2. Em determinadas modalidades, aé leweysão0. Para composições compreendendo uma pluralidade de anticor- Ê pos, a carga de fármaco é representada por p, o número médio de molécu- e las de fármaco por Anticorpo. A carga de fármaco pode variar de 1 a 12 fár- e macos (D) por Anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo na preparação de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios : convencionais tais como espectroscopia de mass, ensaio ELISA, e HPLC. - Também pode ser determinada a distribuição quantitativa de Conjugados de , Anticorpo e Fármaco em termos de p. Em alguns casos, separação, purífica- ção, e caracterização de Conjugados de Anticorpo e Fármaco homogêneos ondepé um valor determinado de Conjugados de Anticorpo e Fármaco com outras cargas de fármaco podem ser obtidas por meios tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese. Em modalidades exemplares, p éde2aB. A geração de Compostos de conjugados de anticorpo e fármaco pode ser realizada por qualquer técnica de conhecimento do técnico versa- do. Em resumo, os Compostos de conjugados de anticorpo e fármaco com- preendem MAb 161P2F10B como a unidade de Anticorpo, um fármaco, e opcionalmente um ligante que une o fármaco e o agente de ligação. Em uma modalidade preferencial, o Anticorpo é MAb 161P2F10B compreendendo regiões variáveis de cadeias pesada e leve de um anticorpo designado H16-
7.8 descrito acima. Em modalidade mais preferencial, o Anticorpo é MAb 161P2F10B compreendendo cadeia pesada e leve de um anticorpo desig- nado H16-7.8 descrito acima. Uma série de reações diferentes está disponí-
vel para fixação covalente de fármacos e/ou ligantes os agentes de ligação. Isto é frequentemente realizado por reação dos resíduos aminoácidos do agente de ligação, por exemplo, anticorpo molécula, incluindo os grupos a- mina de lisina, os grupos ácido carboxílico livre de ácido glutâmico e ácido aspártico, os grupos sulfidrila de cisteína e as várias porções dos aminoáci- dos aromáticos. Um dos métodos inespecíficos de fixação covalente mais comumente usado é a reação de carbodiimida para encadear um grupo car- bóxi (ou amino) de um composto a grupos amino (ou carbóxi) do anticorpo. Adicionalmente, agentes bifuncionais tais como dialdeídos ou imidoésteres têm sido usados para ligar o grupo amino de um composto a grupos amino de uma molécula de anticorpo. Também disponíveis para fixação de fárma- cos a agentes de ligação é a reação da base de Schiff. Este método envolve o a oxidação por periodato de um fármaco que contém grupos glicol ou hidróxi, O formando deste modo um aldeído o qual é em seguida reagido com o agente r 15 deligação.A fixação ocorre através da formação de uma base de Schiff com - grupos amino do agente de ligação. Isotiocianatos também podem ser usa- SJ dos como agentes de acoplamento para anexar de modo covalente fárma- . cos a agentes de ligação. Outras técnias são de conhecimento do técnico versado e estão dentro do âmbito da presente invenção. Em determinadas modalidades, um intermediário, o qual é o precursor do ligante, é reagido com o fármaco sob condições apropriadas. Em determinadas modalidades, grupos reativos são usados sobre o fármaco elou o intermediário. O produto da reação entre o fármaco e o intermediário, ou o fármaco derivado, é em seguida reagido com o MAb 161P2F10B sob condições apropriadas.
Cada uma das unidades particulares dos compostos de conju- gados de anticorpo e fármaco é descrita em mais detalhes aqui. A síntese e a estrutura de exemplos de unidades ligantes, unidades de estiradores, uni- dades de aminoácidos, unidade de espaçador auto-imolativo, e unidades de fármacos também são descritas na Publicação dos Requerimentos de Pa- tentes dos Estados Unidos Nos. 2003-0083263, 2005-0238649 e 2005- 0009751, cada um dos quais é incorporado aqui, por meio de referência em sua totalidade e para todos os fins. V.) Unidades de LiganteLigantes Tipicamente, os compostos de conjugados de anticorpo e fárma- co compreendem uma região ligante entre a unidade de fármaco e a unidade dede anticorpo. Em determinadas modalidades, o ligante é clivável sob condições intracelulares, de tal modo que a clivagem do ligante libera a uni- dade de fármaco do anticorpo no ambiente intracelular. Em ainda outras modalidades, a unidade ligante não é clivável e o fármaco é liberardo, por exemplo, por degradação de anticorpo.
Em determinadas modalidades, o ligante é clivável por um agen- te de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossoma ou endossoma ou cavéolas). O ligante pode ser, por =) exemplo, um ligante de peptidil que é clivado por uma enzima protease ou ! O. peptidase intracelular, incluindo, mas não limitada a, uma protease lisossô- . 15 mica ou endossômica. Em determinadas modalidades, o ligante de peptidil - tem no mínimo dois aminoácidos de extensão ou no mínimo três aminoáci- í dos de extensão. Agentes de clivagem podem incluir catepsinas B e D e - plasmina, todas as quais são conhecidas para hidrolisar derivados de fárma- cos de dipeptídeos resultando na liberação de fármaco ativo dentro de célu- las-alvo (vide, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Os mais típicos são ligantes de peptidil que são cliváveis por enzimas que estão presentes em células que expressam 161P2F10B. Por exemplo, um ligante de peptidil que é clivável pela protease catepsina-B tiol- dependente, a qual é altamente expressada em tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um ligante de Phe-Leu ou um ligante de Gly-Phe-Leu- Gly (SEQ ID NO: 9). Outro exemplos de semelhantes ligantes são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. 6.214.345, incorporada aqui, por meio de referência em sua totalidade e para todos os fins. Em uma modalidade específica, o ligante de peptidil clivável por uma protease intra- — celularé um ligante de Val-Cit ou um ligante de Phe-Lys (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 6.214.345, a qual descreve a síntese de doxorrubicina com o ligante de val-cit). Uma vantagem de usar liberação pro-
teolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é tipicamente ate- nuado quando conjugado e as estabilidades séricas dos conjugados são tipi- camente elevadas. Em outras modalidades, o ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensívela hidrólise em determinados valores de pH. Tipicamente, o ligan- te sensível ao pH é hidrolisável sob condições acidíferas. Por exemplo, pode ser usado um ligante lábil em ácido que é hidrolisável no lisossoma (por e- xemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tio-semicarbazona, amida cis- aconítica, ortoéster, acetal, cetal, ou semelhantes). (Vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Du- bowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville, et al, 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661.) Os ligantes referidos são relativamen- o ! te estáveis sob condições de pH neutro, tais como aquelas no sangue, mas o. são instáveis em pH abaixo de 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossoma. * 15 Em determinadas modalidades, o ligante hidrolisável é um ligante de tioéter - (tal como, por exemplo, um tioéter anexado ao agente terapêutico através de . uma ligação de acilhidrazona (vide, por exemplo, a Patente dos Estados U- . nidos No. 5.622.929).
Em ainda outras modalidades, o ligante é clivável sob condições redutoras (por exemplo, um ligante de dissulfeto). Uma variedade ligantes de dissulfeto é conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que po- dem ser formados usando SATA (N-succinimidil-S-acetilticacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridil- ditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonol-alfa-metil-alfa-(2-piridil- —ditio)tolueno), SPDB e SMPT (Vide, por exemplo, Thorpe, ef al., 1987, Can- cer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak, et al., In Inmunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Vide também a Patente dos Estados Unidos No. 4.880.935.) Em ainda outras modalidades específicas, o ligante é um ligante de malonato (Johnson, et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), um malei- midobenzoy! ligante (Lau, et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), ou um 3'-N-amide análogo (Lau, ef a/., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-
12). Em ainda outras modalidades, a unidade ligante não é clivável e o fármaco é liberado por degradação de anticorpo. (Vide a Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. 2005/0238649 incorpora- da pormeio de referência aqui, em sua totalidade e para todos os fins). Em modalidade preferencial, a unidade ligante é maleimidocaproíla (mo).
Tipicamente, o ligante não é substancialmente sensível ao am- biente extracelular. Conforme usado aqui, “não substancialmente sensível ao ambiente extracelular,” no contexto de um ligante, significa que não mais de cercade 20%, tipicamente não mais de cerca de 15%, mais tipicamente não mais de cerca de 10%, e ainda mais tipicamente não mais de cerca de 5%, . não mais de cerca de 3%, ou não mais de cerca de 1% dos ligantes, em a uma amostra de composto de conjugado de anticorpo e fármaco, são cliva- o. dos quando o composto de conjugado de anticorpo e fármaco está presente ' 15 em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma). Pode ser determi- : nado se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelu- SÍ lar, por exemplo, incubando com plasma o composto de conjugado de anti- r corpo e fármaco por um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16, ou 24 horas) e em seguida quantificando a quantidade de fármaco livre presente no plasma.
Em outras modalidades não-mutuamente exclusivas, o ligante promove internalização celular. Em determinadas modalidades, o ligante promove internalização celular quando conjugado ao agente terapêutico (isto é, no meio da porção ligante- agente terapêutico do composto de conjugado de anticorpo e fármaco conforme descrito aqui, neste requerimento de pa- tente). Em ainda outras modalidades, o ligante promove internalização celu- lar quando conjugado tanto ao composto de auristatina quanto ao MAb 161P2F10B.
Uma variedade ligantes exemplares que podem ser usados com as presentes composições e métodos é descrita na Publicação do Requeri- mento de Patente Internacional No. WO2004-010957, na Publicação do Re- | querimento de Patente dos Estados Unidos No. 20060074008, na Publica-
ção do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. 20050238649, e na Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. 20060024317 (cada uma das quais é incorporada por meio de referência aqui, em sua totalidade e para todos os fins).
Uma “unidade de Ligante” (LU) é um composto bifuncional que pode ser usado para ligar uma unidade de Fármaco e uma unidade de Anti- corpo para formar um composto de conjugado de anticorpo e fármaco. Em determinadas modalidades, a unidade ligante tem a fórmula: -AMWYy emque:A-é uma unidade de Estirador, aéboul, . cada -W- é de modo independente uma unidade de Aminoácido, O w é um inteiro variando de O a 12, O -Y- é uma unidade de Espaçador auto-imolativo, e : 15 yé0oO, 1ou2. - Em determinadas modalidades, a é 0 ou 1, wé O ou 1 ey60, 1 - ou 2. Em determinadas modalidades, a é 0 ou 1, wé 0 ou 1,e y é O ou 1. ' Em determinadas modalidades, quando w é 1 a 12, y é 1 ou 2. Em determi- nadas modalidades, w é 2 a 12 e y é 1 ou 2. Em determinadas modalidades, aéleweysão0O.
VI.) A Unidade de Estirador A unidade de Estirador ( A ), quando presente, é capaz de ligar uma unidade de Anticorpo a uma unidade de Aminoácido (-W-), caso pre- sente, a uma unidade de Espaçador (-Y-), caso presente; ou a uma unidade de Fármaco(-D). Grupos funcionais úteis que podem estar presentes sobre um MAb 161P2F10B (por exemplo, H16-7.8), quer naturalmente ou através de manipulação química incluem, mas não estão limitados a, sulfidrila, ami- no, hidroxila, o grupo hidroxila anomérico de um carboidrato, e carboxila. Grupos funcionais adequados são sulfidrila e amino. Em um exemplo, gru- pos sulfdrila podem ser gerados por redução das ligações de dissulfeto in- tramoleculares de um MAb 161P2F10B. Em outra modalidade, grupos suifi- drila podem ser gerados por reação de um grupo amino de uma porção lisina de um MAb 161P2F10B com 2-iminotiolano (reagente de Traut) ou outros reagentes de produção de sulfidrila. Em determinadas modalidades, o MAb 161P2F10B é um anticorpo recombinante e é manipulado para carregar uma ou mais lisinas. Em algumas outras modalidades, o MAb 161P2F10B re- combinante é manipulado para carregar grupos sulfidrila adicionais, por e- xemplo, cisteínas adicionais.
Em uma modalidade, a unidade de Estirador forma uma ligação com um átomo de enxofre da unidade de Anticorpo. O átomo de enxofre po- de ser derivado de um grupo sulfidrila de um anticorpo. Unidades de Estira- dores representativas desta modalidade são representadas dentro de col- chetes das Fórmulas llla e Illb, em que L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme . definidos acima, e R'” é selecionado entre -C1-C1o alquileno-, -C1-Cio alque- 2 nileno-, -C1-C19 alquinitleno-, carbociclo-, -O-(C1-Cs alquileno)-, O-(C1-C; al- a quenileno)-, -O-(C,-Csgalquinileno)-, -arileno-, -Cr-Capalquileno-arileno-, -C2- * 15 Cioalquenileno-arileno, -C2-C1o alquinileno-arileno, -arileno-C1-C1o alquileno-, - -arileno-C2-C1o alquenileno-, -arileno-C2-C19 alquinileno-, -Cy-C1o alquileno- " (carbociclo)-, -C2-Croalquenileno-(carbociclo)-, -C2-Cioalquinileno-(carboci- F clo)-, -(carbociclo)-C1-C19 alquileno-, -(carbociclo)-C2-C1o9 alquenileno-, -(car- bociclo)-C2-C1o alquinileno, -heterocíclo-, -C1-C1o alquileno-(heterociclo)-, -C>Ci alquenileno-(heterociclo)-, -C2-C1o alquinileno-(heterociclo)-, -(hetero- ciclo)-C1-C19 alquileno-, -(heterociclo)-C2-C10 alquenileno-, -(heterociclo)-C1- C1o alquinileno-, -(CHXCH2O)-, ou -(CH2CH20)--CH>2-, e r é um inteiro varian- do de 1 a 10, em que os radicais alquila, alquenila, alquinila, alquileno, al- quenileno, alquinileno, arila, carbociclo, carbociclo, heterociclo, e arileno re- feridos, quer isolados ou como parte de outro grupo, são opcionalmente substituídos. Em determinadas modalidades, os radicais alquila, alquenila, | alquinila, alquileno, alquenileno, alquiniteno, arila, carbocilo, carbociclo, hete- rociclo, e arileno referidos, quer isolados ou como parte de outro grupo, são não substituídos. Em determinadas modalidades, R”” é selecionado entre -Cr-Cio alquileno-, -carbociclo-, -O-(C1-Cg alquileno)-, -arileno-, -C1-C15 alqui- leno-arileno-, -arileno-C1-Coalquileno-, -C1-C1o alquileno-(carbociclo)-, -(car- bociclo)-C1-C1o alquileno-, -C3-Cg heterociclo-, -C1-C1o alquileno-(heteroci-
clo)-, -( heterociclo)-C1-C1o alquileno-, -(CH2CH2O)r, e -(CH2CH20)--CH72-; e r é um inteiro variando de 1 a 10, em que os grupos alquileno referidos são não substituídos e o restante dos grupos são opcionalmente substituídos. Deve ser entendido a partir de todas as modalidades exemplares —quemesmo onde não denotado expressamente, a partir de 1 até 12 porções de fármacos podem ser encadeadas a um Anticorpo ( p = 1 a 12). o
E NRÍ7-C(O)>HW,—Y,y7D
O : Ma : efen-contRtmeo- tino : nb Uma unidade de Estirador ilustrativa é a unidade de Estirador de f Fórmula Illa em que R' é -(CH>2)s-:
O : OD
O o : Outra unidade de Estirador ilustrativa é a unidade de Estirador de Fórmula llla em que R” é -(CHXCH20)-CH7-; e r é 2:
O
GANA o: o Uma unidade de Estirador ilustrativa é a unidade de Estirador de Fórmula lIlla em que R"? é -arileno- ou arileno-C1-C10 alquileno-. Em determi-
nadas modalidades, o grupo arila é um grupo fenila não substituído. Ainda outra unidade de Estirador ilustrativa é a unidade de Esti- rador de Fórmula Illb em que R*? é -(CH2)s-: O >
É AN Oo Em determinadas modalidades, a unidade de Estirador é enca- —deadaà unidade de Anticorpo através de uma ligação de dissulfeto entre um átomo de enxofre da unidade de Anticorpo e um átomo de enxofre da unida- de de Estirador. Uma unidade de Estirador representativa desta modalidade .. é representada dentro dos colchetes da Fórmula IV, em que RL, W-,-Y-, o -D, w e y são conforme definidos acima. . esfera |O . nv Deve ser observado que do início ao fim deste requerimento, a porção S na fórmula abaixo se refere a um átomo de enxofre da unidade de Anticorpo, menos que indicado de modo diverso pelo contexto. — se Em ainda outras modalidades, o Estirador contém um sítio reati- vo que pode formar uma ligação com um grupo amino primário ou secundá- riodeum Anticorpo. Exemplos destes sítios reativos incluem, mas não estão limitados a, ésteres ativados tais como ésteres de succinimida, ésteres de 4- nitrofenila, ésteres de pentafluorofenila, ésteres de tetrafluorofenila, anidri- dos, cloretos ácidos, cloretos de sulfonila, isocianatos e isotiocianatos. Uni- dades de Estiradores representativas desta modalidade são representadas dentrodos colchetes das Fórmulas Va e Vb, em que -R-, Lo, MV, Y-, -D, w e y são conforme definidos acima; e om" corbmr- D Va ú LH-CNH-RIT-C(O)FW,—Y,y7D Vb Em determinadas modalidades, o Estirador contém um sítio rea- , tivo que é reativo para um grupo de carboidrato modificado (-CHO) que pode o estar presente sobre um Anticorpo. Por exemplo, um carboidrato pode ser r 5 — oxidado brandamente usando um reagente tal como periodato de sódio e a - unidade resultante -CHO) do carboidrato oxidado pode ser condensada com . um Estirador que contém uma funcionalidade tal como uma hidrazida, uma - oxima, uma amina primária ou secundária, uma hidrazina, uma tio-semicar- bazona, um carboxilato de hidrazina, e uma arilhidrazida tal como aquelas descritas por Kaneko, ef al., 1991, Bioconjugate Chem. 2:133-41. Unidades de Estiradores representativas desta modalidade são representadas dentro dos colchetes das Fórmulas Vla, Vlb, e Vlc, em que RW -YS-DW e y são conforme definidos acima. L uniarco men VIa L noso
VID
L N-NH—C—R!7-C(O)FW,Y,-D Vic. VIL) A Unidade de Aminoácido A unidade de Aminoácido (-W-), quando presente, liga a unidade de Estirador à unidade de Espaçador se a unidade de Espaçador estiver presente, liga a unidade de Estirador à porção de Fármaco se a unidade de — Espaçador estiver ausente, e liga a unidade de Anticorpo à unidade de Fár- maco se a unidade de Estirador e a unidade de Espaçador estiverem ausen- tes. : Wh- pode ser, por exemplo, uma unidade de monopeptídeo, de O dipeptídeo, de tripeptídeo, de tetrapeptídeo, de pentapeptídeo, de hexapep- - 10 tídeo, de heptapeptídeo, de octapeptídeo, de nonapeptídeo, de decapeptí- ' deo, de undecapeptídeo ou de dodecapeptídeo. Cada unidade -W- de modo ? independente tem a fórmula denotada abaixo dentro dos colchetes, e w é um : inteiro variando de O a 12: : CH; o | o
MNE CO Rº Rº ; ou emqueR" é hidrogênio, metila, isopropila, isobutila, sec-butila, benzila, p-hidroxibenzila, -CH2OH, -CH(OH)CH;s, -CHCHSCH;s, -CHxCONH;, -CH;COOH, -CH;CH.CONH>2, -CHCHCOOH, -(CH2);NHC(=NH)NH;, (CH2)3NH2, -(CH);:NHCOCHs, -(CH2);NHCHO, -(CH2)ANHC(=NH)NH>, -(CH2)aNH>2, -(CHo)ANHCOCHs, -(CH2) NHCHO, -(CH2);NHCONH>, CH2)NHCONH;>, -CHsCH.CH(OH)CH2NH>, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4- piridilmetil-, fenila, ciclo-hexila,
O i 2 LOO LO
N O GQ + O AD É : o Em determinadas modalidades, a unidade de Aminoácido pode Õ ser clivada enzimaticamente por uma ou mais enzimas, incluindo uma prote- ase associada a tumor ou câncer, para liberar a unidade de Fármaco (-D), a . qual em uma modalidade é protonada in vivo quando da libeação para pro- * 5 porcionarum Fármaco (D).
Em determinadas modalidades, a unidade de Aminoácido pode compreender aminoácidos naturais. Em outras modalidades, a unidade de Aminoácido pode compreender aminoácidos não naturais. Unidades Ww ilustrativas são representadas pelas fórmulas (VII) a (IX): o R21 Ú A» R2º o (VI) emqueR” e R?* são como se segue: Rs a E TR a entao O RAMAL metila (CH2)aNH;>; isopropila (CH2)aNH>2;
ROO ee A a rata a a e e e e e eae Eee, isopropila (CH2);:NHCONH;>; benzila (CH2);NHCONH>; isobutila (CH2);:NHCONH>; sec-butila (CH2);NHCONH;; A) (CH2);:NHCONH;; 21
N
H benzila metila; benzila (CH2);NHC(=NH)NH>; o R2 o
N N o 2 N O R2º o RM (VI - : em que RR R2' e R? são como se segue: . Rº R2 ça = r benzla — —benzila (CHa)aNH>; - isopropila benzila (CH2)aNH;>2; e H benzila (CH2)aNH2; o R21 o R23
H H < N “ N Pr, & H 2 R2º o R o () em que R2?, R?', R? e R?* são como se segue: a ERA Rs ge o a o Er La pera pe H benzila isobutila He metila isobutila metila isobutila. Exemplos de unidades de Aminoácidos incluem, mas não estão limitados a, unidade de fórmula VIl em que: Rº é benzila e Rº é - (CH)aNHo; R2º é isopropila e Rº* é -(CH2). NH; ou R2 é isopropila e RM é - (CHo);:NHCONH>. Outro exemplo de unidade de Aminoácido é uma unidade de fórmula VIII em que R2º é benzila, Rº é benzila, e R?* é -(CH2). NH.
Unidades -W,,- úteis podem ser designadas e otimizadas em sua seletividade apra clivagem enzimática por uma enzima em particular, por exemplo, uma protease associada a tumor.
Em uma modalidade, uma uni- dade -W, - é aquela cuja clivagem é catalisada por catepsina B, C e D, ou uma proteasede plasmina.
Em uma modalidade, -Wy- é um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo.
Quando Rºº, R2, R2, Rº ou R* é dife- rente de hidrogênio, o átomo de carbono ao qual R”º, R2º, R2 RE ou RP é anexado é quiral.
Cada átomo de carbono ao qual R'º, R2º, R?', R? ou R?º é ane- xado está de modo independente na configuração (S) ou (R). . Em um aspecto da unidade de Aminoácido, a unidade de Ami- O noácido é valina-citrulina (vc ou val-cit). Em outro aspecto, a unidade de A- - minoácido é fenilalanina-lisina (isto é, fk). Em ainda outro aspecto da unida- dede Aminoácido, a unidade de Aminoácido é N-metilvalina-citrulina.
Em " ainda outro aspecto, a unidade de Aminoácido é ácido 5-aminovalérico, ho- : mo fenilalanina lisina, tetraisoquinolinacarboxilato lisina, ciclo-hexilalanina . lisina, ácido isonepecótico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glu- tamina e ácido isonepecótico.
VIII) A Unidade de Espaçador A unidade de Espaçador (-Y-), quando presente, liga uma unida- de de Aminoácido à unidade de Fármaco quando uma unidade de Aminoá- cido está presente.
Alternativamente, a unidade de Espaçador liga a unidade de Estirador à unidade de Fármaco quando a unidade de Aminoácido está ausente.
A unidade de Espaçador também liga a unidade de Fármaco à uni- dade de Anticorpo quando tanto a unidade de Aminoácido quanto a unidade de Estirador estão ausentes.
As Unidades de Espaçadores são de dois tipos gerais: não auto- imolativos ou auto-imolativos.
Uma unidade de Espaçador não auto-imolativo é uma unidade de Espaçador na qual parte ou toda a unidade de Espaçador permanece ligada à porção de Fármaco depois da clivagem, particularmente enzimática, de uma unidade de Aminoácido do conjugado de anticorpo e fármaco. Exemplos de uma unidade de Espaçador não auto-imolativo inclu- em, mas não estão limitados a uma unidade de Espaçador de (glicina- glicina) e uma unidade de Espaçador de glicina (ambas representadas no Esquema 1) (abaixo). Quando um conjugado contendo uma unidade de Es- — paçador de glicina-glicina ou uma unidade de Espaçador de glicina sofre cli- vagem enzimática através de uma enzima (por exemplo, uma protease as- sociada a células tumorais, uma protease associada a células cancerosas ou uma protease associada a linfócitos), uma glicina-glicina-porção de Fármaco ou uma glicina-porção de Fármaco é clivada de L-Aa-Ww-. Em uma modali- dade, ocorre uma reação de hidrólise independente dentro da célula-alvo, clivando a ligação de glicina-porção de Fármaco e liberando o Fármaco.
. Esquema 1 L-harws-oyD] Eta W.Gh-Gp]-D 7 clivagem - | clivagem * | . enzimática enzimática o GIy-D Gly-Gly-D , hidrólise | hidrólise. | Fármaco Fármaco Em determinadas modalidades, uma unidade de Espaçador não —auto-imolativo (Y-) é -Gly-. Em determinadas modalidades, uma unidade de Espaçador não auto-imolativo (-Y-) é -Gly-Gly-.
Em uma modalidade, um conjugado de Fármaco-Ligante é pro- porcionado no qual a unidade de Espaçador está ausente (y=0), ou um sal ou solvato do mesmo farmaceuticamente aceitável.
Alternativamente, um conjugado contendo uma unidade de Es- paçador auto-imolativo pode liberar -D. Conforme usado aqui, o termo “Es- paçador auto-imolativo” se refere a uma porção química bifuncional que é capaz de ligar juntas de modo covalente duas porções químicas espaçadas em uma molécula tripartite estável. Este vai se separar espontaneamente da segunda porção química se sua ligação à primeira porção for clivada.
Em determinadas modalidades, -Y,- é uma unidade de álcool! p- aminobenzíilico (PAB) (vide os Esquemas 2 e 3) cuja porção de fenileno é substituída com Qm, em que Q é -C1-Cg alquila, -C1-Cg alquenila, -C1-Cs al- quinila, -O-(C1-Csg alquila), -O-(C1-Cg alquenila), -O-(C1-Cg alquinila), -halo- —geneto,-nitro ou -ciano; em é um inteiro variando de 0 a 4. Os grupos alqui- la, alquenila e alquinila, quer isolados ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos.
Em determinadas modalidades, -Y- é um grupo PAB que é liga- do a -W, — através do átomo de nitrogênio do amino do grupo PAB, e conec- tadodiretamente a -D através de um grupo de carbonato, carbamato ou éter.
Sem ser limitado por qualquer teoria ou mecanismo em particular, o Esque- . ma 2 representa um mecanismo possível de liberação de Fármaco de um — grupo PAB o qual é anexado diretamente a -D através de um grupo de car- o bamato ou carbonato conforme descrito por Toki et al., 2002, J.
Org.
Chem.
À 15 67: 1865-18/2. & Esquema 2 " Qm fe mr) 6 Pp | clivagem enzimática Qm | nEXODAs (- | & OG D o | 1,6-eliminação
Fármaco No Esquema 2, Q é -C;-C;g alquila, -C1-Cg alquenila, -Cy-Cs al quinila, -O-(C1-Cs alquila), -O-(C1-Cs alquenila), -O-(C1-C; alquinila), -haloge- neto, -nitro ou -ciano; m é um inteiro variando de 0 a 4; e p varia a partir de 1 até cerca de 12. Os grupos alquila, alquenila e alquinila, quer isolados ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos. Sem ser limitado por qualquer teoria ou mecanismo em particu- lar, o Esquema 3 representa um mecanismo possível de liberação de Fár- —macode um grupo PAB o qual é anexado diretamente a -D através de uma ligação de éter ou amina, em que D inclui o grupo de oxigênio ou nitrogênio que é parte da unidade de Fármaco. Esquema 3 Am
E ANINHA DA
D . p o clivagem e enzimática - Qm EO, . 2 Nº : 7» | 1,6-eliminação Am nu=D= + —Fármaco No Esquema 3, Q é -C1-Cg alquila, -C1-Cs alquenila, -C1-C; al- quinila, -O-(C1-C; alquila), -O-(C1-Cg alquenila), -O-(C1-Cs alquinila), -haloge- neto, -nitro ou -ciano; m é um inteiro variando de O a 4; e p varia a partir de 1 até cerca de 12. Os grupos alquila, alquenila e alquinila, quer isolados ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos. Outros exemplos de espaçadores auto-imolativos incluem, mas não estão limitados a, compostos aromáticos que são eletronicamente simi-
lares ao grupo PAB tais como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay, et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e orto ou para-aminobenzil- acetais. Podem ser usados espaçadores que sofrem ciclização depois de hidrólise da ligação de amida, tais como amidas ácidas 4-aminobutíricas substituídas e não substituídas (Rodrigues, et a/., 1995, Chemistry Biology 2: 223), sistemas de anéis biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] adequadamente substi- tuídos (Storm, et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas de ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry, et al., 1990, J. Org. Chem. 55: 5867). À eliminação de fármacos contendo amina que são substituídas na posição a de glicina (Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27: 1447) também são e- xemplos de espaçadores auto-imolativos. à. Em uma modalidade, a unidade de Espaçador é uma unidade de O bis(hidroximetil)-estireno ramíficada (BHMS) conforme representado no Es- CU quema 4, a qual pode ser usada para incorporar e liberar múltiplos fármacos.
Esquema4 o Qm — CHAO(C(O))-D t E Luc E S/c Pp clivagem | enzimática 2 Fármacos No Esquema 4, Q é -Cy-C; alquila, -C1-Cs alquenila, -C1-C; al- quinila, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C1-C; alquenila), -O-(C1-Cs alquinila), -haloge- neto, -nitro ou -ciano; m é um inteiro variando de O a 4; né O ou 1; e faixas de p variando a partir de 1 até cerca de 12. Os grupos alquila, alquenila e —alquinila, quer isolados ou como parte de outro grupo, podem ser opcional- mente substituídos. Em determinadas modalidades, as porções -D são as mesmas. Em ainda outra modalidade, as porções -D são diferentes. Em um aspecto, unidades de Espaçadores (-Yy) são represen- tadas pelas Fórmulas (X) a (XII):
H Om Ed ás ” o Oo x em que Q é -C1-Cs alquila, -C1-Cg alquenila, -C1-Cg alquinila, -0-(C;-Cg alqui- la), -O-(C1-Cg alquenila), -O-(C1-C; alquinila), -halogeneto, -nitro ou -ciano; e m é um inteiro variando de O a 4. Os grupos alquila, alquenila e alquinila, quer isolados ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente subs- tituídos. IHNCHCOS — x e e. inHerH2e(o) NHeHZeto)- .: x. o Modalidades da Fórmula | e !l compreendendo compostos de À conjugados de anticorpo e fármaco podem incluir: ç O e NT e pe MW, = — D AX o" 9 p em que w e y são cada 0, 1 ou 2, e, o NOM =D LAS Oo e p emqueweysãocada0O, o
N L—1-AQ=HN a O ? p
NH oc NH?
L <A. 2 AAA A — o " N o = n " P Pp
S o<x NH> e o els e o KA o iona
NA NA d ETs . 2 & a p=. . NH? . IX.) A Unidade de Fármaco . A porção de Fármaco (D) pode ser qualquer citotóxico, citostáti- õ co ou imunomodulador (por exemplo, imunossupressor) ou fármaco. D é uma unidade de Fármaco (porção) tendo um átomo que pode formar uma ligação com a unidade de Espaçador, com a unidade de Aminoácido, com a unidade de Estirador ou com a unidade de Anticorpo. Em determinadas mo- dalidades, a unidade de Fármaco D tem um átomo de nitrogênio que pode formar uma ligação com a unidade de Espaçador. Conforme usado aqui, os termos “unidade de fármaco” e “porção de fármaco” são sinônimos e são usados de modo intercambiável.
Classes úteis de agentes citotóxicos ou imunomoduladores in- cluem, por exemplo, agentes antitubulina, ligantes de sulco menor de DNA, inibidores de replicação de DNA, e agentes alquilantes.
Em determinadas modalidades, o Fármaco é uma auristatina, tal como auristatina E (também conhecida na técnica como um derivado de do- lastatina-10) ou um derivado da mesma. A auristatina pode ser, por exemplo, um éster formado entre auristatina E e um ceto ácido. Por exemplo, aurista- tina E pode ser reagida com ácido paraacetil benzóico ou ácido benzoilvalé-
rico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outras auristatinas típicas incluem AFP, MMAF, e MMAE. A síntese e a estrutura de auristatinas exem- plares são descritas na Publicação do Requerimento de Patente dos Esta- dos Unidos Nos. 2003-0083263, 2005-0238649 e 2005-0009751; na Publi- — caçãodo Requerimento de Patente Internacional No. WOO04/010957, na Pu- blicação do Requerimento de Patente Internacional No. WO02/088172, e nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065;
5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725;
5.530.097: 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.979,
4.086.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; e 4.486.414, cada uma das quais é incorporada por meio de referência aqui, em sua totalidade e para > todos os fins. O Foi demonstrado que as auristatinas interferem com a dinâmica o dos microtúbulos e a divisão nuclear e celular e têm atividade anticanceríge- T 15 na MMAF ligam tubulina e podem exercer um efeito citotóxico ou citostático 7 sobre uma célula que expressa 161P2F10B. Existe uma série de diferentes SÍ testes, conhecidos na técnica, os quais podem ser usados apra determinar & se uma auristatina ou conjugado de anticorpo e fármaco resultante exerce um efeito citostático ou citotóxico sobre uma linhagem celular desejada.
Métodos para determinar se um composto liga tubulina são co- nhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Muller, et al., Anal. Chem 2006, 78, 4390-4397; Hamel, etal., Molecular Pharmacology, 1995 47: 965-976; e Hamel, et al, The Joumal of Biological Chemistry, 1990 265: 28, 17141-
17149. Para os da presente invenção, pode ser determinada a afinidade re- lativa de um composto para tubulina. Algumas auristatinas preferenciais da presente invenção ligam tubulina com uma afinidade variando de 10 vezes inferior (afinidade mais fraca) do que a afinidade de ligação de MMAE a tu- bulina até 10 vezes, 20 vezes ou mesmo 100 vezes superior (afinidade mai- or) do que a afinidade de ligação de MMAE a tublina.
Em determinadas modalidades, -D é uma auristatina da fórmula De ou Dr:
R " o R RRS
ASA LA AE À | Ro RO, RT AR ARO o De RR o RR . DO: AA home N N N N 2-R Re o RH RR O TC RO 240 Dr ou uma forma de sal ou solvato da mesma farmaceuticamente aceitável; em que, de modo independente em cada localização: r a linha ondulada indica uma ligação; -s . R? é -C1-Ca9 alquila, -C2-C29 alquenila, ou -C2-C25 alquinila; o Ss Rº é -H, -C1-Cao alquila, -C2-C20 alquenila, -C2-C2o alquinila, -car- bociclo, -C1-Cao alquileno (carbociclo), -C2-C2o alquenileno(carbociclo), -C2- : . Cao alquinileno(carbociclo), -arila, -C1-C2o alquileno(arila), -C2-C25 alquenile- ' no(arita), -C2-C25 alquinileno(arila), heterociclo, -C1-C29 alquileno(hetero- ' ciclo), -C2-C29 alquenileno(heterociclo), ou -C2-C2,5 alquinileno(heterociclo); Rº é -H, -C1-C20 alquila, -C2-Ca9 alquenila, -C2-C29 alquinila, car- bociclo, -C1-C2o alquileno (carbociclo), -C2-C20 alquenileno(carbociclo), -C2- Cao alquinileno(carbociclo), arila, -C1-C2o alquileno(arila), -C2-C29 alquenile- no(arita), -C2-C20 alquinileno(arila), -heterociclo, -C1-C2o alquileno(hetero- ciclo), -C2-C2, alquenileno(heterociclo), ou -C2-C2o alquinileno(heterociclo); Rº é -H ou -C1-C; alquila; ou Rº e Rº conjuntamente formam um anel carbocíclico e têm a fórmula -(CRºRº).- em que Rº e Rº são de modo independente -H, -C1-C2 alquila, -C2-C29 alquenila, -C2-C29 alquinila, ou -carbociclo e s é 2, 3,4,5 ou | 6, R$ é -H, -C1-Cao alquila, -C2-C2, alquenila, ou -C2-C2, alquinila; R” é -H, -C1-Ca, alquila, -C2-C2,9 alquenila, -C2-C2, alquinila, car- bociclo, -C1-C2o alquileno (carbociclo), -C2-C29 alquenileno(carbociclo), -C2- Co alquinileno(carbociclo), -arila, -C1-C20 alquileno(arila), -C2-C2o alquenile-
no(arila), -C2-C20 alquinileno(arila), heterociclo, -C1-C29 alquileno(heteroci- clo), -C2-C2o alquenileno(heterociclo), ou -C2-C20 alquinileno(heterociclo); cada R$ é de modo independente -H, -OH, -C1-C2,9 alquila, -C2- Cao alquenila, -C2-Ca, alquinila, -O-(C1-C29 alquila), -0-(C2-C20 alquenila), -O- (Ci-Coo alquinila), ou -carbociclo; Rº é -H, -C1-C20 alquila, -C2-C29 alquenita, ou -C2-C2o alquinila; R?* é -arila, -heterociclo, ou -carbociclo; Rº é -H, Ci-Cao alquila, -C2-C2o alquenila, -C2-C2o alquinila, -carbociclo, -O-(C1-C2o alquila), -O-(C2-C29 alquenila), -O-(C2-C2o alquinila), ouOR"* em que R** é -H, um grupo de proteção de hidroxila, ou uma ligação direta em que OR"* representa =O; , R?S é -H, -C1-C2o alquila, -C2-C29 alquenila, ou -C2-C2, alquinila, o -arila, -heterociclo, ou -carbociclo; Sl R*º é -arila ou -heterociclo; : 15 Zé-O,-S,-NH, ou -NR”?, em que R'? é -C1-Cao alquila, -C2-C20 7 alquenila, ou -C2-C2, alquinila; : R" é -H, -C1-Cay alquila, -C2-C29 alquenila, -C2-C25 alquinila, : -arila, -heterociclo, -(RSO)In-R"*, ou -(R?O).n-CH(R*)2; m é um inteiro variando de 1 a 1000; R* é -C2-C20 alquileno, -C2-C209 alquenileno, ou -C2-C25 alquinile- no; R** é -H, -C1-C2o alquila, -C2-C2, alquenita, ou -C2-C2, alquinila; cada ocorrência de R** é de modo independente -H, -COOH, F(CHo)-N(R)2, (CH2a)1-SO3H, (CHa)N-SO3-C1-C2o alquila, (CH2)1-SO3-C2-C20 —alquenila, ou (CH2))-SO3-C2-C2o alquinila; cada ocorrência de R'* é de modo independente -H, -C1-C20 al- quila, -C2-C2,9 alquenila, -C2-C29 alquinila ou (CH2))-COOH; e n é um inteiro variando de 0 a 6; em que os referidos radicais alquila, alquenila, alquinila, alquile- no, alquenileno, alquinileno, arila, carbociclo, e heterociclo, quer isolados ou como parte de outro grupo, são opcionalmente substituídos.
Auristatinas da fórmula De incluem aquelas em que os referidos radicais alquila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno, alquinileno, arila, carbociclo, e heterociclo são não substituídos.
Auristatinas da fórmula De incluem aquelas em que os grupos de R2, Rº, R$, Ró, R$, R7, R$, e Rº são não substituídos e os grupos de RR, Rº eR” são opcionalmente substituídos conforme descrito aqui.
Auristatinas da fórmula De incluem aquelas em que R? é C1-C; alquila; Rº, Rº e Rº são selecionados de modo independente entre -H, -C1-C2, alquila, -C2-C205 alquenila, -C2-Ca5 alquinila, monocíclico C3-Cs carbo- ciclo, -Cr-Cax alquileno(monocíclico C3-Cs carbociclo), -C2-C2o alquenile- no(monocíclico C3-C6 carbociclo), -C2-C209 alquinileno(monocíclico C3-Cs car- . bociclo), Cs-C1o arila, -C1-C20 alquileno(Ce-C19 arita), -C2-C2o alquenileno(Cs- o Ci arila), -Co-C2ao alquinileno(Ce-C1o arila), heterociclo, -Cy-C26 alquile- o no(heterociclo), -C2-C20 alquenileno(heterociclo), ou -C2-C2, alquinileno(hete- ' 15 rociclo); em que os referidos radicais alquila, alquenita, alquinila, alquileno, . alquenileno, alquinileno, carbociclo, arila e heterociclo são opcionalmente : substituídos; : Ré-H; Rº é -C1-C; alquila; cada R$ é selecionado de modo independente entre -OH, -O-(C1- Co alquila), -O-(C2-C205 alquenilta), ou -O-(C2-C2, alquinila) em que os referi- dos radicais alquila, alquenila, e alquinila são opcionalmente substituídos; Rº é -H ou -C1-C; alquila; R?º é -fenila opcionalmente substituído; Rº é -OR**; em que R** é H, um grupo de proteção de hidroxila, ou uma ligação direta em que OR'* representa =O; R2? é selecionado entre -H, -C1-Ca9 alquila, -C2-C25 alquenila, -C2-C2, alquinila, ou -carbociclo; em que os referidos radicais alquila, alque- nila, alquinila e carbociclo são opcionalmente substituídos; ou uma forma de —salousolvato das mesmas farmaceuticamente aceitável.
Auristatinas da fórmula De incluem aquelas em que R? é metila;
Rº é -H, -C1-C;s alquila, -C2-Cg alquenila, ou C2-Cg alquinila, em que os referidos radicais alquila, alguenila e alquinila são opcionalmente substituídos; Rº é -H, -C1-C; alquila, -C2-Cs alquenila, -C27-Cs alquinila, mono- cíclico C3-Cs carbociclo, -Cs-C1o arila, -C1-Cg alquileno(Cs-C1o arila), -C2-Cg alquenileno(Cs-C19 arila), -C2-Ca alquinileno(Ce-Ci1o arila), -C1-Cg alquileno (monocíclico C3-Cs carbociclo), -C2-Cg alquenileno (monocíclico C3-Cs car- bociclo), -C2-Cs alquinileno(monocíclico C3-Ce carbociclo); em que os referi- dos radicais alquila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno, alquinileno, arila e carbociclo quer isolados ou como parte de outro grupo são opcional- mente substituídos; . Ré-H o Rº é metila; . : R” é -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila ou -C2-Cg alquinila; f 15 cada Rº é metóxi; . Rº é -H ou -C1-C; alquila; . R* é fenila; ã R?º é -OR**; em que R** é H, um grupo de proteção de hidroxila, ou uma ligação direta em que OR? representa =O; R* é metila; ou uma forma de sal farmaceuticamente aceitável das mesmas.
Auristatinas da fórmula De incluem alquelas em que: R? é metila; Rº é -H ou -C1-C;3 alquila; Rº é -C1-Cs alquila; Rº é -H; R$ é metila; R é isopropila ou sec-butila; Rº é metóxi; Rº é -H ou -C1-Cs —alquila; R?º é fenila, Rº é -OR'*; em que R'* é -H, um grupo de proteção de hidroxila, ou uma ligação direta em que OR'* representa =O; e R** é metila; ou uma forma de sal ou solvato das mesmas farmaceuticamente aceitável.
Auristatinas da fórmula De incluem aquelas em que: R? é metila ou C1-C;3 alquila, Rº é -H ou -C1-C; alquila; R* é -C1-Cs alquila; RéH
R$ é C1-C3 alquila; R' é -C1-Cs alquila; Rº é -C1-C; alcóxi; Rº é -H ou -C1-C; alquila; R* é fenila; R2? é -OR"?; em que R** é -H, um grupo de proteção de hidroxi- la, ou uma ligação direta em que OR? representa =O; e R?º é -C1-C; alquila; ou uma forma de sal farmaceuticamente aceitável das mesmas.
Auristatinas da fórmula Dr incluem aquelas em que R? é metila; R,Rhe R são selecionados de modo independente entre -H, o -C1-C2o alquila, -C2-C2,5 alquenila, -C2-C29 alquinita, monocíclico C3-Cs carbo- — ciclo, -C1-C29 alquileno(monocíclico C3-Cs carbociclo), -C2-C2o alquenile- : 15 — no(monocíclico C3-Cs carbociclo), -C2-C20 alquinileno(monocíclico C3-Cs car- r bociclo), -C6-C1o arila, -C1-C20 alquileno(Ce-C1o arita), -C2-C20 alquenileno(Ce- : Cio arila), -C2-Cao alquinileno(Cs-C1o arila), heterociclo, -C1-C2xo alquile- 7 no(heterociclo), -C2-C2o —alquenileno(heterociclo), ou -C2-C2x —alquinile- no(heterociclo); em que os referidos radicais alquila, alquenila, alquinila, al-
—quileno, alquenileno, alquinileno, carbociclo, arila e heterociclo quer iosaldos ou como parte de outro grupo são opcionalmente substituídos; Ríé-H Rº é metila; cada Rº é metóxi;
Rº é -H, -C1-Cao alquila, -C2-C29 alquenila, ou -C2-C29 alquinita; em que os referidos radicais alquila, alquenila e alquinila são opcionalmente substituídos;
R*º é arila opcionalmente substituído ou heterociclo opcional- mente substituído;
Zé —O-, -S-, -NH-, ou -NR”?, em que R"? é -C1-C2o alquila, -C2- Cao alquenila, ou -C2-C2, alquinila, cada um dos quais é opcionalmente subs- tituído;
R" é -H, -Cr-Ca9 alquila, -C2-Cao alquenita, -C2-C2,9 alquinila, arila, -heterociclo, -(R!O)n-R'*, ou -(RPO)I-CH(R'*)2, em que os referidos radicais alquila, alguenila, alquinila, arila e heterociclo são opcionalmente substituídos; m é um inteiro variando de 1 a 1000 ou m = O; R* é -C2-C2o alquileno, -C2-C2o alquenileno, ou -C2-C29 alquinile- no, cada um dos quais é opcionalmente substituídos; R** é -H, -C1-Ca, alquita, -C2-C29 alquenila, ou -C2-C25 alquinila em que os referidos radicais alquila, alquenila e alquinila são opcionalmente substituídos; cada ocorrência de R'* é de modo independente -H, -COOH, “(CH2)J-N(R')2, (CHo)N)-SO3H, (CHa)N$-SO3-C1-C2o alquila, (CH2)-SO3-C2-C2o O alquenila, ou (CH2)-SO3-C2-C20 alquinila em que os referidos radicais alqui- ! . à la, alquenila e alquinila são opcionalmente substituídos; * 15 cada ocorrência de R'* é de modo independente -H, -C;-C2, al- - quila, -C2-C2, alquenila, -C2-C20 alquinila ou (CH»).-COOH em que os referi- e. dos radicais alquila, alquenila e alquinila são opcionalmente substituídos; - n é um inteiro variando de O a 6; ou um sal farmaceuticamente aceitável das mesmas.
Em algumas destas modalidades, R'*º é fenila opcionalmente substituído.
Auristatinas da fórmula Dr incluem aquelas em que os grupos de R2, Rº, R$, Ré, Rº, R/, Rº, e Rº são não substituídos e os grupos de RºeR" são conforme descritos aqui.
Auristatinas da fórmula Dr incluem aquelas em que os referidos radicais alquila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno, alquinileno, arila, carbociclo, e heterociclo são não substituídos.
Auristatinas da fórmula Dr incluem aquelas em que R? é -C1-C;3 alquila; Rº é -H ou -C1-C; alquila; Rº é -C1-Cs alquila; R$é-H;Rºé-CrC;alquita; Ré -C-Cs alquila; Rº é -C1-C; alcóxi; Rº é -H ou -C1-C;g alquila; R"º é opcionalmente substituídos fenila; Z é -O-, -S-, ou -NH-; R*º é conforme definido aqui, neste requerimento de patente; ou um sal farmaceuticamente aceitável das mesmas.
Auristatinas da fórmula Dre incluem aquelas em que R? é metila; Rº é -H ou -C1-C;3 alquila; Rº é -C1-C;s alquila; Rº é -H; R$ é metila; R é isopropila ou sec-butila; Rº é metóxi; Rº é -H ou -C1-Cs alquila; R'º é fenila opcionalmente substituído; Z é -O-, -S-, ou -NH-; e Ré conforme definido aqui, neste requerimento de patente; ou um sal farmaceu- ticamente aceitável das mesmas.
Auristatinas da fórmula Dr incluem aquelas em que R? é metila; Rº é -H ou -C1-C; alquila; Rº é -C1-Cs alquila; R é -H;R$é metila; Rº é isopropila ou sec-butila; Rº é metóxi; Rº é -H ou C1-Cs alquila; R*º é fenila; e Z é -O- ou —-NH- e R é conforme definido aqui, prefe- . rencialmente hidrogênio; ou uma forma de sal farmaceuticamente aceitável das mesma. .: j Auristatinas da fórmula Dr incluem aquelas em que : 15 R? é -C1-C; alquila; R? é -H ou -C1-C; alquila; Rº é -C1-Cs alquila; h Rº é -H; R$ é -C1-C; alquita; R7 é -C,-Cs alquila; Rº é -C1-C3 alcóxi; Rº é -H : ou -C1-Cg alquila; R”º é fenila; e Z é -O- ou —-NH- e R"* é conforme definido : aqui, preferencialmente hidrogênio; ou uma forma de sal farmaceuticamente aceitável das mesmas. Auristatinas da fórmula De ou Dr incluem aquelas em que Rº, Rº e R” são de modo independente isopropila ou sec-butilae Rº é -H. Em uma modalidade exemplar, Rº e Rº são cada um isopropila, Rº é H, e R' é sec- butila. O restante dos substituintes é conforme definidos aqui.
Auristatinas da fórmula De ou Dr incluem aquelas em que Re R$ são cada um metila, e Rº é H. O restante dos substituintes são conforme definidos aqui.
Auristatinas da fórmula De ou De incluem aquelas em que cada ocorrência de Rº é -OCH;. O restante dos substituintes é conforme definidos aqui.
Auristatinas da fórmula De ou Dre incluem aquelas em que Re Rº são cada um isopropila, R? e Rº são cada um metila, Rº é H, R é sec- butila, cada ocorrência de Rº é -OCH3, e Rº é H. O restante dos substituintes é conforme definidos aqui. Auristatinas da fórmula Dre incluem aquelas em que Z é -O- ou -NH-. O restante dos substituintes é conforme definidos aqui. Auristatinas da fórmula Dr incluem aquelas em que R'* é arila. O restante dos substituintes é conforme definidos aqui. Auristatinas da fórmula De incluem aquelas em que R"º é -fenila. O restante dos substituintes é conforme definidos aqui. Auristatinas da fórmula De incluem aquelas em que Z é -O-, e R* é H, metilaou t-butila. O restante dos substituintes é conforme definidos aqui Auristatinas da fórmula Dr incluem aquelas em que, quando Z é . —NH-, RU é (RPO)I-CH(R'*)2, em que R** é -(CHo)-N(R'*)2, e R'* é -C1-Cg E alquila ou -(CH2),.-COOH. O restante dos substituintes é conforme definidos o aqui. : 15 Auristatinas da fórmula Dr incluem aquelas em que quando Z é . -NH-, RU é (RPO)Mm-CH(R'*), em que R** é -(CH2).-SO3H. O restante dos . substituintes é conforme definidos aqui ” Em modalidades preferenciais, quando D é uma auristatina de fórmula De, w é um inteiro variando de 1 a 12, preferencialmente 2 a 12, y é 1ou2,eaé preferencialmente 1. Em determinadas modalidades, em que D é uma auristatina de fórmula Dr, a é 1eweysão0O. Unidades ilustrativas de Fármacos (-D) incluem as unidades de fármacos tendo as estruturas que se seguem:
N N Ps x | omo — ocro TO o "oH
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ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos dos mesmos. Em um aspecto, grupos hidrofílicos, tais como mas não limitados a ésteres de trietileno glicol (TEG) podem ser anexados à Unidade de Fár- maco em R'*'. Sem ser limitado pela teoria, os grupos hidrofílicos ajudam na internalização e na não-aglomeração da Unidade de Fármaco. Em determinadas modalidades, a unidade de Fármaco não é TZT-1027. Em determinadas modalidades, a unidade de Fármaco não é au- ristatina E, dolastatina 10, ou auristatina PE. Em modalidade preferencial, compostos de conjugados de anti- corpo e fármaco têm as estruturas que se seguem em que “L” ou “mAb-s-” representa um MAb 161P2F10B designado H16-7.8 estipulado aqui, neste : requerimento de patente:
AE ECO a . eng a E ae POA mo cao dd, - P Pp : AX RIO AAA 1 NETO e armam Pu ado a demão — oco ? P
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AO TATA ES ÇO 1 Í bem Ao " mo oo, mas o o" o À ? ur ox e L-MC-vc-PAB-MMAF ou o se: Mo, q ALA, LÃ 9 o ON 9 II Vira To
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L-MC-vc-PAB-MMAF ou o o o Hs
AE NEATES EE IÇO >? ou L-MC-MMAF ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
Em determinadas modalidades, a Unidade de Fármaco é uma caliqueamicina, camptotecina, um maitansinoide, ou uma antraciclina. Em determinadas modalidades o fármaco é um taxano, um inibidor da topoiso- merase, um vinca alcaloide, ou semelhantes.
: . 10 Em algumas modalidades típicas, agentes citotóxicos adequa- É dos incluem, por exemplo, ligantes de sulco menor de DNA (por exemplo, - enediinas e lexitropsinas, um composto de CBI; vide também a Patente dos e Estados Unidos No. 6.130.237), duocarmicinas, taxanos (por exemplo, pacli- - taxel e docetaxel), puromicinas, e vinca alcaloides. Outros agentes citotóxi- cos incluem, por exemplo, CC-1065, SN-38, topotecan, morfolino-doxorru- bicina, rizoxin, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilone A e B, estramustina, criptofisinas, cemadotin, maitansi- noides, discodermolide, eleuterobin, e mitoxantrone.
Em determinadas modalidades, o Fármaco é um agente anti- tubulina. Exemplos de agentes anti-tubulina incluem auristatinas, taxanos (por exemplo, TaxolO (paclitaxel), Taxotere& (docetaxel)), T67 (Tularik) e vinca alquilóides (por exemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, e vinorelbi- na). Outros agentes antitubulina incluem, por exemplo, derivados de bacati- na, análogos do taxano (por exemplo, epotilone A e B), nocodazol, colchicina e colcimid, estramustina, criptoficinas, cemadotin, maitansinoides, combre- tastatinas, discodermolide, e eleuterobin.
Em determinadas modalidades, o agente citotóxico é um mai- tansinoide, outro grupo de agentes anti-tubulina. Por exemplo, em modalida-
des específicas, o maitansinoide é maitansina ou DM-1 (ImmunoGen, Inc.; vide também Chari et al!., 1992, Cancer Res. 52: 127-131). Em determinadas modalidades, o agente citotóxico ou citostático é uma dolastatina. Em determinadas modalidades, o agente citotóxico ou citostático é da classe das auristatinas. Deste modo, em uma modalidade específica, o agente citotóxico ou citostático é MMAE (Fórmula XI). Em outra modalidade específica, o agente citotóxico ou citostático é AFP (Fórmula XVI). CH. H3C. Pe o. a O H CH; N, HN ú N N . CH; O CH; OCH; O H : HC “CH; OCH; O - XI) Em determinadas modalidades, o agente citotóxico ou citostático .10 é um composto de fórmulas XIl a XXI ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos: . . PP us a o. > eo N N as | o ! OCH; O H OCH; O (XI) o
H No, o E S ! o | OCH; O H -. OCH; O EU)
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CH; HC. o CH; H CH; No N HN " N IN & o &s OCH; O o | Í é É CH; 3 OCH; O 17 CH; (XIV) no HEX.
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H Na, . Y -. - H - pes. ocH, O , x) : o o O” x o O.
N 7 NW 1 1 Y H, O e dee: ocH, O EX) p é 1 a 12. Em modalidade mais preferencial, compostos de con- jugados de anticorpo e fármaco têm as estruturas que se seguem em que “mAb-s-” representa um MAb 161P2F10B designado H16-7.8 estipulado aqui,epé4: FA A A o N. No, NH. sl CEO! ro o ocHO oro do, Pp
Em uma modalidade específica, o agente citotóxico ou citostáti- co é MMAF (Fórmula XVIV).
X.) Carga de Fármaco A carga de fármaco é representada por p e é o número médio de porções de fármacos por anticorpo em uma molécula. A carga de fármaco pode variar de 1 a 20 porções de fármacos (D) por anticorpo. Os ADCs da invenção incluem coleções de anticorpos conjugados com uma gama de porções de fármacos, a partir de 1 até 20. O número médio de porções de fármacos por anticorpo em preparações de ADC das reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espectroscopia de massa e, ensaio ELISA. A distribuição quantitativa de ADC em termos de - p também pode ser determinada. Em alguns casos, pode ser realizada a A separação, a purificação, e a caracterização de ADC homogêneo onde p é : um determinado valor de ADC com outras cargas de fármaco por meios tais ' 15 como eletroforese.
: Para alguns conjugados de anticorpo e fármaco, p pode ser limi- O tado pelo número de sítios de fixação sobre o anticorpo. Por exemplo, onde a fixação é um tiol da cisteína, como nas modalidades exemplares acima, um anticorpo pode ter somente um ou vários grupos tiol da cisteína, ou pode ter somente um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um ligante pode ser anexado. Em determinadas modalidades, mario carga de fármaco, por exemplo, p >5, pode provocar agregação, insolubili- dade, toxicidade, ou perda da permeabilidade celular de alguns conjugados de anticorpo e fármaco. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco paraum ADC da invenção varia a partir de 1 até cerca de 12; a partir de 1 até cerca de 8; a partir de cerca de 2 até cerca de 6; a partir de cerca de 3 até cerca de 5; a partir de cerca de 3 até cerca de 4; a partir de cerca de 3.1 até cerca de 3.9; a partir de cerca de 3.2 até cerca de 3.8; a partir de cerca de 3.2 até cerca de 3.7; a partir de cerca de 3.2 até cerca de 3.6; a partir de cercade 3.3 até cerca de 3.8; ou a partir de cerca de 3.3 até cerca de 3.7. Na verdade, foi demonstrado que para alguns ADCs, a proporção ótima de porções de fármacos por anticorpo pode ser de menos de 8, e pode ser cer-
ca de 2 até cerca de 5. Vide o requerimento de patente dos Estados Unidos No. US 2005-0238649 A1 (incorporado aqui, por meio de referência em sua totalidade). Em determinadas modalidades, menos do que o máximo teórico de porções de fármacos são conjugados a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos lisina que não reagem com o fármaco- ligante intermediário ou reagente ligante, con- forme discutido abaixo. De modo geral, anticorpos não contêm muitos gru- pos tiol da cisteína livres e reativos os quais podem ser encadeados a uma porção do fármaco; na verdade a maioria dos resítuos tiol da cisteína nos anticorpos existem como pontes de dissulfeto. Em determinadas modalida- o des, um anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor tal como ditio- 2 treitol (DTT) ou tricarboniletitfosfina (TCEP), sob condições redutoras parci- BR ais ou totais, para gerar grupos tiol da cisteína reativos. Em determinadas ' 15 modalidades, um anticorpo é submetido a condições desnaturantes para . revelar grupos nucleofílicos reativos tais como lisina ou cisteína.
' A carga (proporção de fármaco / anticorpo) de um ADC pode ser . controlada de diferentes modos, por exemplo, por: (i) limitação do excesso molar de fármaco- ligante intermediário ou reagente ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou da temperatura da reação de conjuga- ção, (iii) condições redutivas parciais ou limitantes para modificação do tiol da cisteína, (iv) manipulação por técnicas recombinantes da sequência de aminoácidos do anticorpo de tal modo que o número e a posição dos resí- duos cisteína são modificados para controle do número e/ou da posição das fixações ligante-fármaco (tais como tioMab ou tioFab preparados conforme revelado aqui, e na publicação de patente internacional No. WO2006/034488 (incorporada aqui, por meio de referência em sua totalidade)). Deve ser entendido que onde mais de um grupo nucleofílico re- age com um fármaco- ligante intermediário ou reagente ligante seguido por reagente de porção de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos de ADCs com uma distribuição de uma ou mais porções de fár- macos anexadas a um anticorpo. O número médio de fármacos por anticor-
po pode ser calculado a partir da mistura por um duplo ensaio de anticorpo ELISA, o qual é específico para o anticorpo e específico para o fármaco.
Mo- léculas de conjugados de anticorpo e fármaco individuais podem ser identifi- cadas na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia por interação hidrofóbica (vide, por exemplo, Ham- blett, K.J., et al. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokine- tics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,” Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27- 31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al “Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,” Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March O 2004). Em determinadas modalidades, um conjugado de anticorpo e fármaco . homogêneo com um único valor de carga pode ser isolado da mistura de f 15 conjugação por eletroforese ou por cromatografia. : XI.) Métodos de Determinação do efeito Citotóxico dos ADCs
: São conhecidos métodos para determinar se um fármaco ou , conjugado de anticorpo e fármaco exerce um efeito citostático e/ou citotóxico sobre uma célula.
De modo geral, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado de fármaco e anticorpo pode ser medida por: exposição de célu- las de mamífero expressando uma proteína-alvo do conjugado de fármaco e anticorpo em um meio de cultura celular; cultura das células por um período a partir de cerca de 6 horas até cerca de 5 dias; e medição da viabilidade celular.
Podem ser usados ensaios celulares in vitro para medir a viabilidade (proliferação), a citotoxicidade, e a indução de apoptose (ativação de caspa-
se) dos ADCs.
Para determinar se um conjugado de fármaco e anticorpo exerce um efeito citostático, pode ser usado um teste de incorporação de timidina.
Por exemplo, células cancerosas que expressam um antígeno-alvo em uma densidade de 5.000 células/ cavidade de uma lâmina de 96 cavidades po- dem ser cultivadas por um período de 72 horas e expostas a 0,5 yCi de OE timidina durante as 8 horas finais do período de 72 horas.
A incorporação de
?H-timidina nas células da cultura é medida na presença e na ausência do Conjugado de fármaco e anticorpo. Para determinar a citotoxicidade, pode ser medida a necrose ou a apoptose (morte celular programada). A necrose é tipicamente acompa- —nhada por aumento da permeabilidade da membrana plasmática; dilatação da célula, e ruptura da membrana plasmática. A apoptose é tipicamente ca- racterizada por formação de vesículas da membrana, condensação do cito- plasma, e pela ativação de endonucleases endógenas. A determinação de qualquer um destes efeitos sobre células cancerosas indica que um conju- gado de fármaco e anticorpo é útil no tratamento de cânceres.
A viabilidade celular pode ser medida por determinação em uma célula da captação de um corante tal como vermelho neutro, azul de tripano, . . ou azul ALAMARTY (vide, por exemplo, Page, et a/., 1993, Intl. J. Oncology . 3: 473-476). Em um teste semelhante, as células são incubadas em meios ! 15 contendo o corante, as células são lavadas, e o corante remanescente, refle- " tindo a captação celular do corante, é medido por espectrofotometria. O co- : rante de ligação de proteína sulforrodamina B (SRB) também pode ser usa- do para medir a citotoxicidade (Skehan, ef al., 1990, J. Natl. Câncer Inst. 82: 1107-12).
Alternativamente, um sal de tetrazólio, tal como MTT, é usado em um ensaio colorimétrico quantitativo para sobrevida e proliferação de células de mamífero por detecção de células vivas, mas não mortas (vide, por exemplo, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63).
A apoptose pode ser quantificada medindo, por exemplo, a fragmentação de DNA. Estão disponíveis métodos fotométricos comerciais para a determinação quantitativa in vitro da fragmentação de DNA. Exem- plos de semelhantes testes, incluindo TUNEL (o qual detecta a incorporação de nucleotídeos marcados em DNA fragmentado) e ensaios à base de ELI- SA, são descritos em Biochemica, 1999, No. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular —Biochemicals).
A apoptose também pode ser determinada medindo alterações morfológicas em uma célula. Por exemplo, assim como com necrose, a per-
da de integridade da membrana plasmática pode ser determinada medindo a captação de determinados corantes (por exemplo, um corante fluorescente tal como, por exemplo, laranja de acridina ou brometo de etídio). Um método para medir o número de células apoptóticas foi descrito por Duke e Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-
3.17.16). As células também podem ser etiquetadas com um corante de DNA (por exemplo, laranja de acridina, brometo de etídio, ou iodeto de pro- pídio) e as células podem ser observadas para condensação de cromatina e marginação ao longo da membrana nuclear interna. Outras alterações mor- fológicas que podem ser medidas para determinar a apoptose incluem, por exemplo, condensação citoplasmática, aumento da formação de vesículas de membrana, e encolhimento celular. ú A presença de células apoptóticas pode ser medida tanto nos . compartimentos anexados quanto “flutuantes” das culturas. Por exemplo, : 15 ambos os compartimentos podem ser coletados por remoção do sobrena- r dante, por tripsinação das células anexadas, combinando as preparações ' depois de uma etapa de lavagem por centrifugação (por exemplo, 10 minu- . tos a 2000 rpm), e detectando a apoptose (por exemplo, medindo a fragmen- tação do DNA). (Vide, por exemplo, Piazza, et al., 1995, Câncer Research 55:3110-16).
In vivo, o efeito de uma composição terapêutica de 161P2F10B pode ser avaliado em um modelo animal adequado. Por exemplo, podem ser usados modelos de câncer xenogênico, em que explantes de câncer ou teci- dos de xenoenxerto passados são introduzidos em animais imuno compro- metidos, tais como camundongos nude ou SCID (Klein, et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por exemplo, o Requerimento de Patente Internacio- nal PCT No. WOS98/16628 e a Patente dos Estados Unidos No. 6.107.540 descrevem vários modelos de xenoenxertos de cânceres de próstata huma- na capazes de recapitular o desenvolvimento de tumores primários, micro- metástase, e a formação de metástases osteoblásticas características de doença em estágio final. A eficácia pode ser prevista usando testes que me- dem a inibição da formação tumoral, a regressão do tumor ou metástase, e semelhantes.
Testes in vivo que avaliam a promoção de apoptose são úteis na avaliação das composições terapêuticas. Em uma modalidade, xenoenxertos de camundongos portando tumor tratados com a composição terapêutica podem ser examinados para a presença de focos apoptóticos e comparados com camundongos portando xenoenxertos controles não tratados. A exten- são na qual são encontrados focos apoptóticos nos tumores dos camundon- gos tratados proporciona uma indicação da eficácia terapêutica da composi- ção.
As composições terapêuticas usadas na prática dos métodos precedentes podem ser formuladas em composições farmacêuticas compre- endendo um veículo adequado para o método de liberação desejado. Veícu- ' los adequados incluem qualquer material que quando combinado com a . composição terapêutica conservam a função anti-tumoral da composição Y 15 terapêutica e de modo geral é não-reativo com o sistema imune do paciente. s Exemplos incluem, mas não estão limitados a, qualquer um de uma série de ' veículos farmacêuticos de rotina tais como soluções salinas tamponadas r com fosfato estéreis, água bacteriostática, e semelhantes (vide, de modo geral, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed, 1980) As formulações terapêuticas podem ser solubilizadas e adminis- tradas através de qualquer via capaz de liberar a composição terapêutica no sítio do tumor. Vias de administração potencialmente eficazes incluem, mas não estão limitadas a, intravenosas, parenterais, intraperitoneais, intramus- culares, intratumorais, intradérmcias, intraorgânicas, ortotópicas, e seme- lhantes. Uma formulação preferencial para injeção intravenosa compreende a composição terapêutica em uma solução de água bacteriostática preser- vada, água não preservada estérila, e/ou diluída em bolsas de polivinilcloreto ou polietileno contendo 0,9% de Cloreto de sódio estéril para Injeção, USP.
As preparações terapêuticas de proteína podem ser liofilizadas e armazena- das como pós estéreis, preferencialmente sob vácuo, e em seguida reconsti- tuídas em água bacteriostática (contendo por exemplo, preservante de álcool!
benzílico) ou em água estéril antes da injeção.
Os protocolos de dosagens e administração para o tratamento de cânceres usando os métodos precedentes vão variar com o método e o câncer-alvo, e de modo geral dependerão de uma série de outros fatores — reconhecidos na arte.
XII.) Tratamento de Câncer(es; A identificação de 161P2F10B como uma proteína que é expres- sada normalmente em uma série restrita de tecidos, mas a qual também é expressada em cânceres tais como aqueles listados na Tabela |, abre uma série de abordagens terapêuticas para o tratamento de semelhantes cânce- res.
Digno de nota, terapias antitumorais direcionadas têm sido úteis o mesmo quando a proteína-alvo é expressada sobre tecidos normais, mesmo . tecidos de órgãos normais vitais.
Um órgão vital é órgão que é necessário para sustentar a vida, tal como o coração ou o colon.
Um órgão não-vital é r um órgão que pode ser removido após o que o indivíduo ainda é capaz de : sobreviver.
Exemplos de órgãos não vitais são ovário, mama, e próstata. . A expressão de uma proteína-alvo em tecido normal, mesmo te- cido normal vital, não anula a utilidade de um agente de direcionamento para a proteina como um terapêutico para determinados tumores nos quais a pro- teina também é superexpressada.
Por exemplo, a expressão em órgãos vi- tais não é prejudicial em si própria e de si própria.
Além disso, órgãos consi- derados como dispensáveis, tais como a próstata e os ovários, podem ser removidos sem afetar a mortalidade.
Finalmente, alguns órgãos vitais não são afetados por expressão em órgãos normais devido a um imunoprivilégio.
Órgãos imunoprivilegiados são órgãos que são protegidos contra o sangue por uma barreira sanguínea-orgânica e portanto não são acessíveis a imuno- terapia.
Exemplos de órgãos imunoprivilegiados são o cérebro e os testícu- los.
Por conseguinte, abordagens terapêuticas que inibem a ativida- de de uma proteína 161P2F10B são úteis para pacientes que sofrem de um câncer que expressa 161P2F10B.
Estas abordagens terapêuticas se encai-
xam de modo geral em três classes.
A primeira classe modula a função de 161P2F10B uma vez que se refere a crescimento de células tumorais levan- do a inibição ou o atraso do crescimento de células tumorais ou induzindo sua destruição.
Esta segunda classe compreende vários métodos para inibir aligaçãooua associação de uma proteína 161P2F10B com seu parceiro de ligação ou com outras proteínas.
A terceira classe compreende uma varie- dade de métodos para inibir a transcrição de um gene 161P2F10B ou a translação de MRNA de 161P2F10B.
Por conseguinte, pacientes com câncer podem ser avaliados pa- raa presença e o nível de expressão de 161P2F10B, preferencialmente u- sando avaliações imunohistoquímicas do tecido tumoral, estudo por imagens quantitativas de 161P2F10B, ou outras técnicas que indicam de modo confi- —! ável a presença e o grau de expressão de 161P2F10B.
A análise imunohis- BR toquímica de biópsias tumorais ou de amostras cirúrgicas é preferencial para Y 15 estefim.
Métodos para análise imunohistoquímica de tecidos tumorais são
. de conhecimento geral na técnica. : XIII.) 161P2F10B como um alvo para Terapia à base de Anticorpo + 161P2F10B é um alvo atraente para estratégias terapêuticas à base de anticorpo.
Uma série de estratégias de anticorpos é conhecida na técnica para direcionamento tanto de estratégias extracelulares quanto intra- celulares (vide, por exemplo, destruição mediada pelo complemento e por ADCC bem como o uso de intrabodies). Como 161P2F10B é expressada por células cancerosas de várias linhagens em relação às células normais cor- respondentes, são preparadas composições imunorreativas com 161P2F10B para administração sistêmica que apresentam excelente sensibilidade sem efeitos tóxicos, inespecíficos e/ou não-alvo provocados pela ligação da com- posição imunorreativa a órgãos e tecidos não-alvo.
Anticorpos especifica- mente reativos com domínios de 161P2F10B são úteis para tratar cânceres (preferencialmente câncer da Tabela |, mais preferencialmente câncer renal e/ou hepático) sistemicamente, preferencialmente como conjugados de fár- maco e anticorpo (isto é, ADCs) em que o conjugado é com uma toxina ou um agente terapêutico.
Os versados na técnica entendem que podem ser usados anti- corpos para especificamente visar e ligar moléculas imunogênicas tais como uma região imunogênica de uma sequência 161P2F10B mostrada na Figura
1. Além disso, os técnicos versados entendem que é rotina conjugar anticor- posa agentes citotóxicos (vide, por exemplo, Slevers, et al., Blood 93: 11 3678-3684 (June 1, 1999)). Quando agentes citotóxicos e/ou terapêuticos são liberados diretamente a células, tal como por conjugação dos mesmos a anticorpos específicos para uma molécula expressada por aquela célula (por exemplo, 161P2F10B), o agente citotóxico exercerá seu efeito biológico co- nhecido (isto é, citotoxicidade) sobre aquelas células. Uma ampla variedade de composições e métodos para usar conjugados de anticorpos e agentes citotóxicos para destruir células é co- nhecida na técnica. No contexto de cânceres, métodos típicos acarretam : . administrar a um mamífero que tem um tumor uma quantidade biologica- : 15 mente eficaz de um conjugado compreendendo um agente citotóxico e/ou 7 terapêutico selecionado encadeado a um agente de direcionamento (por e- ] xemplo, um MAb 161P2F10B, preferencialmente H16-7.8) que liga a um an- - tígeno (por exemplo, 161P2F10B) expressado, acessível a ligação ou locali- zado sobre as superfícies celulares. Uma modalidade típica é um método de liberar um agente citotóxico e/ou terapêutico para uma célula expressando 161P2F10B, compreendendo conjugar o agente citotóxico a um anticorpo que liga imunoespecificamente a um epitopo de 161P2F10B, e, expor a célu- la ao conjugado de fármaco e anticorpo (ADC). Outra modalidade ilustrativa é um método de tratamento de um indivíduo suspeito de sofrer de câncer —metastizado, compreendendo uma etapa de administração ao referido indi- víduo, por via parenteral, de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conjugado a um agente citotóxico e/ou terapêutico.
A imunoterapia contra câncer usando anticorpos contra 161P2F10B pode ser feita de acordo com várias abordagens que têm sido empregadas com sucesso no tratamento de outros tipos de câncer, incluindo mas não limitados a câncer de colon (Arlen, et al., 1998, Crit. Rev. Immunol.
18:133-138), mieloma múltiplo (Ozaki, etal., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari, et al., 1997, Blood 90:2437-2444), câncer gástrico (Kasprzyk, et al., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi, et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leukemia (Zhong,etal. 1996, Leuk. Res. 20:581-589), câncer colorretal (Moun, et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders, etal.,, 1995, Cancer Res. 55:4398-4403), e câncer de mama (Shepard, et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Algumas abordagens terapêuticas envolvem a conjugação de anticorpo nu a uma toxina ou a um radioisótopo, tal como a conjugação de Y” oul'* a anticorpos anti-CD20 (por exemplo, ZevalinTM, IDEC Pharma- ceuticals Corp. ou Bexxar"“, Coulter Pharmaceuticals) respectivamente, ao passo que outras envolvem a co-administração de anticorpos e outros agen- : tes terapêuticos, tais como Herceptin"Y (trastuzumab) com paclitaxel (Ge- Õ . nentech, Inc.). ' 15 Em uma modalidade preferencial, os anticorpos serão conjuga- r dos a um agente citotóxico, acima, preferencialmente um derivado de auris- ' tatina designado MMAF (Seattle Genetics). - Anticorpos monoclonais preferenciais usados nos métodos tera- pêuticos da invenção são aqueles que são cada totalmente humanos e que ligam especificamente ao antígeno de 161P2F10B-alvo com elevada afini- dade.
XIV.) Coquetéis de ADC de 161P2F10B Os métodos terapêuticos da invenção contemplam a administra- ção de 161P2F10B ADCs únicos bem como combinações, ou coquetéis, de diferentes MAbs (isto é, MAbs 161P2F10B ou Mabs que ligam outra proteí- na). Os coquetéis de MAbs referidos podem ter algumas vantagens desde que eles contenham MAbs que tenham por alvo diferentes epitopos, explo- rem diferentes mecanismos efetores ou combinem MAbs citotóxicos direta- mente com MAbs que se baseiam em funcionalidade imuno efetora. Os refe- ridos MAbs em combinação podem apresentar efeitos terapêuticos sinérgi- cos. Além disso, MAbs 161P2F10B podem ser administrados concomitante- mente com outras modalidades terapêuticas, incluindo mas não limitadas a vários agentes quimioterápicos e biológicos, bloqueadores androgênicos, imuno moduladores (por exemplo, I1L-2, GM-CSF), cirurgia ou radiação. Em uma modalidade preferencial, os MAbs 161P2F10B são administrados em forma conjugada.
As formulações de ADCs de 161P2F10B são administradas a- través de qualquer via capaz de liberar os anticorpos para uma célula tumo- ral. As vias de administração incluem, mas não estão limitadas a, intraveno- sa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, e semelhantes. O tratamento de modo geral envolve a administração repetida da preparação de ADCs de 161P2F10B, através de uma via de administração aceitável tal como injeção intravenosa (IV), tipicamente em uma dose na faixa, incluindo mas não limitada a, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,2, 3,4, 5,6, 7, Í 8, 9, 10, 15, 20, ou 25 mg/kg de peso corporal. Em geral, doses na faixa de . 10 a 1000 mg de MAb por semana são eficazes e bem toleradas. Com base na experiência clínica com o HerceptinO& (trastuzu- " mab) no tratamento de câncer de mama metastático, uma carga de dose ] inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal do paciente IV, segui- : da por doses semanais de cerca de 2 mg/kg IV da preparação de MAb re- presenta um regime de dosagem aceitável. Preferencialmente, a carga de dose inicial é administrada como uma infusão por 90 minutos ou mais longa. A dose de manutenção periódica é administrada como uma infusão por 30 minutos ou mais longa, contanto que a dose inicial tenha sido bem tolerada. Conforme será reconhecido por aqueles versados na técnica, vários fatores podem influenciar o regime de dose ideal em um caso particular. Os fatores referidos incluem, por exemplo, a afinidade de ligação e a meia-vida dos MAbs usados, o grau de expressão de 161P2F10B no paciente, a extensão do antígeno 161P2F10B disseminado circulante, o nível de concentração de anticorpo em estado estacionário desejado, a frequência de tratamento, e a influência do quimioterápico ou de outros agentes usados em combinação como método de tratamento da invenção, bem como o estado de saúde de um paciente em particular. Opcionalmente, os pacientes seriam avaliados para os níveis de
161P2F10B em uma dada amostra (por exemplo, os níveis de antígeno 161P2F10B circulante e/ou células expressando 161P2F10B) de modo a auxiliar na determinação do regime de dosagem mais eficaz, etc. As avalia- ções referidas também são usadas para monitoração dos propósitos do iní- cioaofim da terapia, e são úteis para calibrar o sucesso terapêutico em combinação com a avaliação de outros parâmetros (por exemplo, citologia urinária e/ou níveis de ImmunoCyt na terapia de câncer de bexiga, ou por analogia, os níveis séricos de PSA na terapia do câncer de próstata). Um objeto da presente invenção é proporcionar ADCs de 161P2F10B, os quais inibem ou retardam o crescimento de células tumorais, preferencialmente células de tumores da Tabela |. Um objeto adicional desta invenção é proporcionar métodos para inibir a angiogênese e outras funções a biológicas e deste modo reduzir o crescimento tumoral em mamíferos, prefe- - rencialmente humanos, usando os ADCs de 161P2F10B referidos, e em par- ticular usando os ADCs de 161P2F10B referidos combinados com outros S fármacos ou tratamentos imunologicamente ativos. XV.) Terapia de Combinação r Em uma modalidade, há sinergia quando tumores, inclusive tu- mores humanos, são tratados com 161P2F10B ADCs em combinação com agentes quimioterápicos ou radiação ou combinações dos mesmos. Em ou- tras palavras, a inibição do crescimento tumoral por um 161P2F10B ADC é reforçada mais do que o esperado quando combinada com agentes quimio- terápicos ou radiação ou combinações dos mesmos. Pode ser mostrada si- nergis, por exemplo, por maior inibição do crescimento tumoral com trata- mento combinado do que seria esperada por um tratamento de somente 161P2F10B ADC ou pelo efeito aditivo do tratamento com um 161P2F10B ADC e um agente quimioterápico ou radiação. Preferencialmente, é demons- trada sinergia por remissão do câncer onde a remissão não é esperada pelo tratamento quer por um 161P2F10B ADC ou com tratamento usando uma combinação aditiva de um 161P2F10B ADC e um agente quimioterápico ou radiação.
O método para inibir o crescimento de células tumorais usando um 161P2F10B ADC e uma combinação de quimioterapia ou radiação ou ambas compreende administrar o 161P2F10B ADC antes, durante, ou de- pois de começar a terapia de quimioterapia e/ou radiação, bem como qual- quer combinação dos mesmos (isto é, antes e durante, antes e depois, du- rante e depois, ou antes, durante, e depois de começar a terapia de quimio- terapia e/ou radiação). Por exemplo, o 161P2F10B ADC é tipicamente admi- nistrado entre 1 e 60 dias, preferencialmente entre 3 e 40 dias, mais prefe- rencialmente entre 5 e 12 dias antes de começar a terapia de radiação e/ou quimioterapia. No entanto, dependendo do protocolo de tratamento e das necessidades específicas do paciente, o método é realizado em uma manei- ra que proporcionará o tratamento mais eficaz e essencialmente prolongará a vida do paciente.
: A administração de agentes quimioterápicos pode ser realizada : em uma varietade de modos inclusive sistemicamente pelas vias parenteral : 15 eenteral. Em uma modalidade, os 161P2F10B ADCs e os agente quimiote- . rápico são administrados como moléculas separadas. Exemplos particulares ! de agentes quimioterápicos ou quimioterapia include em cisplatina, dacarba- - zina (DTIC), dactinomicina, mecoretamina (mostarda de nitrogênio), estrep- tozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubi- cina (adriamicina), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, eto- posídeo, metotrexato, 5-fluorouracila, vinblastina, vincristina, bleomicina, pa- clitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginase, bussulfan, carboplatina, cladribina, dacarbazina, floxuríidina, fludarabina, hidroxiuréia, ifosfamida, alfa interferon, leuprolida, megestrol, melfalan, mercaptopurina, —plicamicina, mitotane, pegaspargase, pentostatina, pipobroman, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, teniposídeo, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracila, vinorelbina, clorambucila, taxol e combinações dos mesmos.
A fonte de radiação, usada em combinação com um 161P2F10B ADC, pode ser quer externa ou interna ao paciente que está sendo tratado.
Quando a fonte é externa ao paciente, a terapia é conhecida como terapia de radiação de feixe externo (EBRT). Quando a fonte de radiação é interna ao paciente, o tratamento é denominado braquiterapia (BT).
Os regimes terapêuticos descritos acima podem ser adicional- mente combinados com agentes e/ou regimes de tratamento de câncer adi- cionais, por exemplo quimioterapia adicional, vacinas contra câncer, inibido- resdetransdução de sinal, agentes uteis no tratamento de crescimento celu- lar anormal ou anticorpos contra (por exemplo, anticorpos anti-CTLA- con- forme descrito na publicação de patente internacional No. WO2005/092380 (Pfizer)) ou outros ligantes que inibem o crescimento tumoral por ligação a IGF-1R, e citocinas.
Quando o mamífero é submetido a quimioterapia adicional, po- dem ser usados os agentes quimioterápicos descritos acima. Adicionalmen- te, podem ser usados inibidores de fatores de crescimento, modificadores da . " resposta biológica, terapia anti-hormonal, moduladores de receptores estro- É gênicos seletivos (SERMs), inibidores da angiogênese, e anti-androgênios.
' 15 Por exemplo, podem ser usados anti-hormônios, por exemplo anti- : estrogênios tais como Nolvadex (tamoxifeno) ou, anti-androgênios tais como ' Casodex (4'-ciano-3-(4-fluorofenilsulfonil)-2-hidróxi-2-metil-3-"-(trifluorometil) propionanilida).
As abordagens terapêuticas acima podem ser combinadas com qualquer um de uma ampla variedade de cirurgia, quimioterapia ou regimes de terapia por radiação. As abordagens terapêuticas da invenção podem possibilitar o uso de dosagens reduzidas de quimioterapia (ou outras terapi- as) e/ou administração menos frequente, uma vantagem para todos os paci- entes e particularmente para aqueles que não toleram bem a toxicidade do agente quimioterápico.
XVI.) Kits/Artigos de Manufatura Para uso nas aplicações laboratoriais, de prognóstico, profiláti- cas, de diagnóstico e terapêuticas descritas aqui, os kits estão dentro do âmbito da invenção. Os kits referidos podem compreender um veículo, em- —balagem, ou recipiente qye é compartimentalizado para receber um ou mais recipientes tais como frascos, tubos, e semelhantes, cada um dos recipien- te(s) compreendendo um dos elementos separados a serem usados no mé-
todo, junto com um rótulo ou bula compreendendo instruções para aplicação, tal como uma aplicação descrita aqui.
Por exemplo, o um ou mais recipien- tes podem compreender um anticorpo que é ou pode ser etiquetado de mo- do detectável.
Os kits podem compreender um recipiente compreendendo uma Unidade de Fármaco.
O kit pode incluir todas ou parte das sequências de aminoácidos na Figura 2, ou na Figura 3 ou análogos das mesmas, ou uma molécula de ácido nucleico que codifica as sequências de aminoácidos referidas.
O kit da invenção tipicamente compreenderá o recipiente descri- toacimae um ou mais recipientes diversos associados com este que com- preendem materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas; veículo, embalagem, T recipiente, rótulos de frascos e/ou tubos listando os conteúdos e/ou instru- : ções para aplicação, e bulas com instruções para aplicação.
Y 15 Um rótulo pode estar presente sobre ou com o recipiente para r indicar que a composição é usada para uma terapia específica ou aplica- : ção não terapêutica, tal como uma aplicação de prognóstico, profilática, de - diagnóstico ou laboratorial, e também pode indicar instruções — para apli- cação quer in vivo ou in vitro, tais como aquelas descritas aqui.
Instruções e ou outras informações também podem ser incluídas em uma bula(s) ou rótulo(s) que são incluídos com ou sobre o kit.
O rótulo pode estar sobre ou associado com o recipiente.
Um rótulo a pode estar sobre um recipiente quando letras, números ou outros caracteres formando o rótulo são molda- dos ou gravados no próprio recipiente; um rótulo pode ser associado com um recipiente quando está presente dentro de um receptáculo ou veículo que também encerra o recipiente, por exemplo, como uma bula.
O rótulo pode indicar que a composição é usada para diagnosticar, tratar, profilaxia ou prognóstico de uma condição, tal como um câncer de um tecido estipu- lado na Tabela |. Os termos “kit” e “artigo de manufatura” podem ser usados como sinônimos.
Em outra modalidade da invenção, é proporcionado um artigo(s)
de manufatura contendo composições, tais como conjugados de fármaco e anticorpo (ADCs), por exemplo, materiais úteis para o diagnóstico, prognós- tico, profilaxia e/ou tratamento de cânceres de tecidos tais como aqueles estipulados na Tabela |. O artigo de manufatura tipicamente compreende no mínimo um recipiente e no mínimo um rótulo. Recipientes adequados inclu- em, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, e tubos de teste. Os recipien- tes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro, me- tal ou plástico. O recipiente pode encerrar uma ou mais sequências de ami- noácidos, uma ou mais moléculas pequenas, uma ou mais sequências de ácidos nucleicos, uma ou mais populações celulares e/ou um ou mais anti- corpos. Em outra modalidade um recipiente também compreende um anti- corpo, fragmento de ligação do mesmo ou proteína de ligação específica - para aplicação na avaliação da expressão da proteína de 161P2F10B em : células e tecidos, ou para propósitos laboratoriais, de prognóstico, de diag- : 15 nóstico, profiláticos e terapêuticos relevantes; indicações e/ou instruções o para as aplicações referidas podem ser incluídas sobre ou com o recipiente ' referido, assim como reagentes e outras composições ou ferramentas usa- . das para estes fins.
O recipiente pode encerrar alternativamente uma composição que é eficaz para tratamento, diagnóstico, prognóstico ou profilaxia de uma condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Os agentes ativos na composição podem ser um conjugado de fármaco e anticorpo ligando espe- cificamente a 161P2F10B, O artigo de manufatura pode compreender adicionalmente um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitá- vel, tal como solução salina tamponada de fostato, Ringer's solução e/ou dextrose solução. Pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluen- tes, filtros, stirrers, agulhas, seringas, e/ou bulas com indicações e/ou instru- ções para aplicação.
EXEMPLOS: Vários aspectos da invenção são adicionalmente descritos e ilus- trados por meio dos vários exemplos que se seguem, nenhum dos quais se pretende que limite o âmbito da invenção.
Exemplo1 O Antígeno 161P2F10B A sequência genética 161P2F10B foi descoberta usando méto- dos de Hibridização Subtrativa de Supressão (SSH) conhecidos na técnica. A sequência de SSH 161P2F10B de 182 bp foi identificada a partir de CONA derivado de pacientes com câncer renal usando métodos de rotina. Um clo- ne d ecDNA de extensão total para 161P2F10B foi isolado a partir de amos- tras de pacientes com câncer renal. O cDNA tem 3858 bp de extensão e co- ' É difica um ORF de 875 aminoácidos (Vide a Figura 1). 161P2F10B apresen- . tou homologia com ENPP3 (Vide, Buhring, et. al., Blood 97: 3303-3305 ' 15 (2001). Mapas de 161P2F10B para cromossoma 6922 usando métodos de F rotina conhecidos na arte. Para referência adicional, vide a Patente dos Es- ! tados Unidos No. 7.279.556 (Agensys, Inc., Santa Monica, CA), a Patente - dos Estados Unidos No. 7.405.290 (Agensys, Inc., Santa Monica, CA), a Pa- tente dos Estados Unidos No. 7.067.130 (Agensys, Inc., Santa Monica, CA), eaPatente dos Estados Unidos No. 7.226.594 (Agensys, Inc., Santa Moni- ca, CA).
Exemplo 2 Geração de Anticorpos Monoclonais (MAbs) para 161P2F10B Em uma modalidade, Anticorpos Monoclonais (“MAbs”) terapêu- ticos para 161P2F10B compreendem aqueles que reagem com epitopos es- pecíficos para proteína que ligariam, internalizariam, romperiam ou modula- riam a função biológica de 161P2F10B, por exemplo, aqueles que romperi- am a interação com ligantes, substratos, e parceiros de ligação. Imunogê- nios para geração de semelhantes MAbs incluem aqueles designados para codificar ou conter os domínios extracelulares ou a sequência de proteína 161P2F10B inteira, e regiões previstas para conterem motivos funcionais previstos para serem antigênicos por análise computadorizada da sequência de aminoácidos. Imunogênios incluem peptídeos e proteínas recombinantes tais como tag5-161P2F10B, uma proteína com etiqueta de His derivada de células de mamífero purificadas. Além disso, células manipuladas através de transdução retroviral para expressar altos níveis de 161P2F10B, tais como —RAT1I-161P2F10B, são usadas para imunizar camundongos. MAbs para 161P2F10B foram gerados usando a tecnologia Xe- noMouse* (Amgen Fremont) em que os loci murinos de cadeias pesada e leve kappa foram inativados e uma maioria dos loci humanos de imunoglio- bulina de cadeias pesada e leve kappa foram inseridos. O MAb designado H16-7.8foigerado a partir de imunização com XenoMice produtores de y2 humanas com células Tag5-161P2F10B. O MAb 161P2F10B H16-7.8 liga especificamente a células ex- . 7 pressando 161P2F10B recombinante (SEQ ID NO: 2) e 161P2F10B da su- . perfície celular endógena expressadas em células de xenoenxerto de cân- : 15 cer O Sequências codificantes de DNA para MAb 161P2F10B H16-7.8 À foram determinadsa depois de isolar mRNA a partir das células de hibridoma respectivas com reagente TRizolº (Life Technologies, Gibco BRL). Sequências de ácido nucleico variável de cadeias pesada e leve anti161P2F10B H16-7.8 foram sequenciadas a partir das células de hibri- doma usando o seguinte protocolo. Células de hibridoma secretando H16-
7.8 foram lisadas com reagente TRizolº (Life Technologies, Gibco BRL). RNA total foi purificado e quantificado. Primeiro filamento de cDNAs foi ge- rado a partir de RNA total com oligo (dT) 12-18 priming usando o sistema da Gibco”-BRL Superscript Preamplification. Primeiro filamento de cDNA foi amplificado usando primers de cadeia pesada variável de imunoglobulina humana, e primers de cadeia leve variável de imunoglobulina humana. Os produtos de PCR foram sequenciados e as regiões variáveis de cadeias pe- sada e leve foram determinadas. As sequências de ácido nucleico e de aminoácido das regiões variáveis de cadeias pesada e leve estão listadas na Figura 2 e na Figura 3. A região variável de cadeia pesada de H16-7.8 consiste da sequência de aminoácidos variando a partir do 20º resíduo Q até o 142º resíduo S da SEQ ID NO: 7, e a região variável de cadeia leve de H16-7.8 consiste da sequência de amincácidos variando a partir do 20º resíduo E até o 127º resíduo R da SEQ ID NO: 8. A cadeia pesada de H16-7.8 consiste da se- —quênciade aminoácidos variando a partir do 20º resíduo Q até o 468º resí- duo K da SEQ ID NO: 7 e a cadeia leve de H16-7.8 consiste da sequência de aminoácidos variando a partir do 20º resíduo E até o 233º resíduo C da SEQ ID NO: 8. O alinhamento de H16-7.8 à linhagem germinativa humana VH4-31/D5-12/JH6 e à linhagem germinativa humana A26/JK1 é determina- donarFigura4Aad4B.
Exemplo 3 Expressão de H16-7.8 usando Métodos de DNA Recombinante . " Para expressar H16-7.8 de modo recombinante em células : transfectadas, sequências de cadeias pesada e leve de H16-7.8 (SEQ ID : 15 NO:7,de20a468e a cadeia leve de SEQ ID NO: 8, de 20 a 233) foram Y clonadas em vetores de expressão.
Os cassetes completos de cadeias pe- : sadas e de cadeia leve de H16-7.8 humano foram clonados a jusante do - promotor / reforçador de CMV em um vetor de clonagem.
Um sítio de polia- denilação foi incluído a jusante da sequência codificante de MAb.
Os cons- tructos expressando H16-7.8 recombinantes foram transfectados em células CHO e H16-7.8 recombinantes foram secretados por células CHO.
Os títulos de IgG foram medidos por ELISA.
Os resultados confirmaram expressão de IgG e boa co-expressão das cadeias pesada e leve.
H16-7.8 recombinantes foram avaliados para ligação a 161P2F10B da superfície celular por citome- tria de fluxo (Figura 5). Células 3T3-controle e 3T3-161P2F10B foram cora- das com H16-7.8 recombinantes quer de células de hibridoma ou de células CHO transfectadas com constructos de vetores de cadeias pesada e leve de H16-7.8. A ligação foi detectada por citometria de fluxo.
Os resultados mostram que o H16-7.8 expressado de modo recombinante em células CHO é secretado e liga especificamente a 161P2F10B da superfície celular. (Figu- ra5).
H16-7.8 recombinante foi caracterizado com respeito a sua se- quência de peptídeo. A análise por mapeamento de peptídeo de H16-7.8 confirmou que a sequência de aminoácidos deduzida de H16-7.8 é correta versus a sequência determinada usando digestão por Lys-C com LC- MS/MS, digestão por Asp-N com LC-MS/MS, e sequência N-terminal por degradação de Edman. Exemplo 4 Conjugação a Anticorpo e Fármaco de H16-7.8 O H16-7.8 (Figura 2) foi conjugado a um dolavalina-valina- dolaisoleucina-dolaproina-fenilalanina (derivado de aurastatina) designado MMAF (Fórmula XVIV; monometila auristatina F) usando um ligante não- clivável de maleimidocaproíla (mc) estipulado abaixo: o o
À O . O .
A síntese do ligante não-clivável de maleimidocaproíla (mc) ao MMAF (Seattle Genetics, Seattle, WA) foi completada (SAFC, Madison, WI) usando o método de síntese estipulado na Tabela VI para criar o mcCMMAF citotóxico.
Em seguida, o conjugado de fármaco e anticorpo (ADC) da in- venção designado H16-7.8mcMMAF foi produzido usando os protocolos que se seguem.
Em resumo, 10 mg/mL de uma solução do H16-7.8 em 10 mM de succinato, em pH 4,5 foi permutado com tampão por diafiltração. A finali- dade da permuta com tampão é remover os componentes de tampão da formulação de H16-7.8 e substituí-lo com um tampão mais compatível que é otimizado para a etapa de “redução” subsequente. O anticorpo foi diafiltrado contra6 diavolumes (DV) de tampão de borato de sódio e concentrado até 10 +1 mg/ml, lavado do sistema, diluído até 7,5 mg/ml e filtrado a 0,2 um.
Em seguida, EDTA foi adicionado para 5 mM de concentração final na mistura da reação. Depois disso, as ligações de dissulfeto do H16-
7.8 foram parcialmente reduzidas com hidrocloreto de tris-(2-carboxietil)- fosfina (TCEP) para formar tióis livres (SH). Este processo é realizado a 37ºC. EDTA estava presente em 5 mM de concentração durante esta reação para quelar quaisquer cátions de metais divalentes que pudessem provocar re-oxidação por SH indesejada. Ao final da etapa de redução, a temperatura da solução da reação foi reduzida para 20ºC e analisada para determinar a proporção molar de SH livre e para assegurar que 23,9 SH por MAb tinha sido gerado. Para conjugação, o fármaco-ligante MCMMAF foi ponderado no isolador e dissolvido em DMSO até uma concentração de 5,5 mg/ml. Os grupos SH sobre o H16-7.8 parcialmente reduzido foram re- agidos com fármaco-ligante McMMAF para formar o conjugado, H16- : * 7.8mMcMMAF. O mcMMAF em DMSO foi adicionado em um conjunto molar : equivalente de fármaco para anticorpo. Esta etapa foi realizada a 20ºC. De- : 15 —poisde um período de incubação 1 h qualquer excesso do fármaco-ligante " na reação foi extinto com N-Acetil- cisteína, deste modo eliminanmdo qual- : quer fármaco-ligante reativo e transformando este em aducto que é mais - fácil de remover e de detectar por métodos analíticos. A mistura é em segui- da agitada por quinze (15) minutos adicionais depois da adição de um (1) equivalente molar de N-Acetil-Cisteína relativo a mcMMAF.
Em seguida, é realizada ultrafiltração / dialfitração de modo a remover DMSO, impurezas do process, e permuta de tampão do ADC no tampão da formulação.
O excesso de mcMMAF extinto são deste modo removidos por ultrafitrtação/diafiltração do conjugado de fármaco e anticorpo (ADC) com 8 diavolumes de histidina a 20 mM, tampão da formulação de pH 5,2. Depois do completamento do 8º: diavolume, a solução é recirculada e avaliada para concentração de proteína.
O conjugado é ajustado para seis (6) + 0,5 mg/ml com 20 mM de Histidina, 10% de trhalose, tampão de pH 5,2. Polissorbato 20 é em seguida adicionado, misturado até homogeneidade, e filtrado asseticamente através de um filtro de 0,2 um.
O conjugado de fármaco e anticorpo (ADC) resultante é desig- nado H16-7.8mcMMAF e tem a fórmula que se segue: ADS. o o no AO ) 9 ". as O SAO p em que MAb é H16-7.8 (Figura 2 e Figura 3) e pé de 1 a 12. Exemplo 5 Caracterização de H16-7.8 e H16-7.8.8McMMAF O H16-7.8 foi gerado usando os procedimentos estipulados no exemplo intitulado Exemplo 2 “Geração de Anticorpos Monoclonais (MAbs) . para 161P2F10B”. Adicionalmente, os Conjugados de fármaco e anticorpo . que ligam 161P2F10B foram gerados usando os procedimentos estipulados o. 10 no exemplo intitulado “Conjugação a Anticorpo e Fármaco de H16-7.8"”. Os H16-7.8 e H16-7.8mcMMAF ADC foram triados, identificados, e caracteriza- - dos usando uma combinação de testes conhecidos na arte. A. Ligação Celular e Determinação de Afinidade por FACS | H16-7.8 e H16-7.8mMcMMAF foram testados para a afinidade de ligação a 161P2F10B expressado endogenamente sobre células Ku812. Em resumo, onze (11) diluições de H16-7.8 ou H16-7.8mcMMAF são incubadas com células Ku812 (50.000 células por cavidade) de um dia para o outro a 4ºC em uma concentração final de 160 nM até 0,0001 nM. Ao final da incu- bação, as células são lavadas e incubadas com anticorpo de detecção anti- hlgG-PE por 45 min a 4ºC. Depois de lavar os anticorpos de detecção não ligados, as células são analisadas por FACS. São obtidos valores da Inten- sidade de Florescência Média (MFI) (Vide a Tabela IV). Os valores da MFI foram introduzidos no software Graphpad Prisim e analisados usando a e- quação de ligação de um sítio (hipérbole) de Y=-Bmax"X/(Kd+X) para gerar ascurvasde saturação de H16-7.8 ou H16-7.8McMMAF mostradas na Figu- ra 6. Bmax é o valor de MFI em ligação máxima de H16-7.8 ou H16-
7.8mMcMMAF para 161P2F10B; Kd é afinidade de ligação de H16-7.8 ou H16-7.8mMcMMAF a qual é a concentração de H16-7.8 ou H16-7.8.mMcMMAF necessária para atingir ligação meia-máxima.
A afinidade calculada (Kd) de H16-7.8 e H16-7.8mMcMMAF é 0,06nNM e 019nM, respectivamente obre proteína relacionada com 161P2F10B expressada endogenamente sobre a superfície de células Kusi2.
Para determinar a ligação de H16-7.8 e H16-7.8mMcMMAF a pro- teína relacionada com 161P2F10B endógena expressada sobre a superfície de células de câncer renal humano, células UGK-3 (câncer renal de células claras derivadas de pacientes) e células RXF-393 (câncer renal de células claras) foram coradas com 10 pg/ml de H16-7.8 nativo, H16-7.8mMcMMAF, ou um isótipo de IgG2 humana controle e avaliadas por FACS.
Os resultados na Figure 7 (painéis à esquerda) demonstram for- te coloração das células de dois tumores renais diferentes com H16-7.8 (li- . nhas cinzentas), mas não com o MAb controle (histogramas preenchidos). 1 15 Os painéis à direita demonstram uma forte coloração similar das células do mesmo tumor renal com H16-7.8mcMMAF (linhas cinzentas). (Figura 7; pai- ' néis à direita). Estes resultados mostram que tanto H16-7.8 quanto H16- - 7.8mcMMAF ligam antígeno de 161P2F10B nativo expressado sobre a su- perfície de células cancerosas humanas. A conjugação de H16-7.8 nativo para gerar o H16-7.8McMMAF não alterou sua ligação superficial celular a antígeno 161P2F10B nativo expressado sobre células cancerosas humanas. Exemplo 6 Citotoxicidade Celular Mediada por H16-7.8mcMMAF. A capacidade de H16-7.8mMcMMAF para mediar citotoxicidade 161P2F10B-dependente foi avaliada em células KU812 manipuladas para expressar 161P2F10B. Para este teste, 2000 células KU812 viáveis foram laminadas em triplicata no Dia O e deixadas para recuperar de um dia para o outro. No dia seguinte, diluições seriais a 1:4 de diferentes lotes de H16-
7.8mMcMMAF ou um MAb controle conjugado com mMcMMAF foi adicionado para produzir as concentrações finais indicadas na Figura 8. As células fo- ram deixadas para incubar por seis (6) dias ocasião na qual 20 ul de azul de Alamar foi adicionado a cada cavidade. As lâminas foram incubadas por um adicional de quatro (4) horas e a intensidade de fluorescência foi lida em uma leitora de lâmina fluorescente usando um comprimento de onda de exci- tação de 540 nM e um comprimento de onda de emissão de 620 nM.
Os resultados na Figura 8 mostram que ambos os lotes de H16-
7.8mcMMAF inibiram potentemente a proliferação de células KU812. A IC50 foi determinada como sendo 0,2 nM e 0,1 nM para o Lote (1) e o Lote (2) respectivamente. Um MAb Controle totalmente humano que não liga células KUB812 foi conjugado com mcMMAF para produzir uma DAR de 3,9 (+/- 0,2). O ADC Controle não inibiu a proliferação de células KU812 demonstrando adicionalmente a especificidade da citotoxicidade. Deste modo, estes resul- tados indicam que H16-7.8mMcMMAF pode liberar seletivamente um fármaco citotóxico para células expressando 161P2F10B levando a sua destruição.
r Exemplo 7 | H16-7.8mMcMMAF Inibiu o Crescimento de Tumores /n Vivo o 15 A significativa expressão de 161P2F10B sobre a superfície celu- lar de tecidos tumorais, junto com sua expressão restritiva em tecidos nor- ' mais faz de 161P2F10B um bom alvo para terapia de anticorpo e de modo - similar, terapia através de ADC. Deste modo, a eficácia terapêutica de H16-
7.8McMMAF em modelos de camundongo xenoenxerto de câncer de rim humano é avaliada.
A eficácia de conjugado de fármaco e anticorpo sobre o cresci- mento tumoral e a formação de metástases é estudada em modelos de xe- noenxerto de câncer de camundongos (por exemplo, subcutâneos e ortoto- picamente).
Tumores subcutâneos (s.c.) são gerados por injeção de 5 x 10*- 10º células cancerosas mistas em uma diluição de 1:1 com Matrigel (Colla- borative Research) no flanco direito de camundongos SCID machos. Para testar a eficácia do ADC sobre a formação de tumor, isto é, injeções de ADC são iniciadas no mesmo dia como injeções de células tumorais. Como um — controle, os camundongos são injetados quer com IgG humana purificada ou PBS; ou com um MAb purificado que reconhece um antígeno irrelevante não expressado em células humanas. Em estudos preliminares, não foi vista di-
ferença entre IgG controle ou PBS sobre o crescimento tumoral. As medidas dos tumores são determinadas por medições por calibrador, e o volume tu- moral é calculado como extensão x largura x altura. Camundongos com tu- mores subcutâneos maiores do que 1,5 cm de diâmetro são sacrificados.
O desenvolvimento de tumores renais em camundongos é reali- zado por injeção de 1,5 milhões a 2 milhões de células implantadas subcu- taneamente em camundongos SCID machos. Os camundongos são monito- rados para saúde geral, atividade física, e aparência até se tornarem mori- bundos. Por ocasião do sacrifício, os camundongos podem ser examinados para determinar a carga tumoral e outros órgãos podem ser colhidos para avaliar metástases para sítios distantes. Alternativamente, o óbito pode ser usado como um ponto de desfecho. Os camundongos são em seguida se- ; à gregados em grupos para os tratamentos apropriados, com 161P2F10B ou . MAbs controles sendo administrados através de injeção i.v..
Uma vantagem de modelos de cânceres de xenoenxertos é a capacidade de estudar a neovascularização e a angiogênese. O crescimento É tumoral é parcialmente dependente do desenvolvimento de novos vasos - sanguíneos. Embora o sistema capilar e o desenvolvimento da rede sanguíi- nea sejam de origem do hospedeiro, a iniciação e a arquitetura da neovascu- laturasão reguladas pelo tumor do xenoenxerto (Davidoff, et al., Clin Cancer Res. (2001) 7: 2870; Solesvik, et al, Eur J Cancer Clin Oncol. (1984) 20: 1295). O efeito do anticorpo e da molécula pequena sobre a neovasculariza- ção é estudado de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como por análise por IHC dos tecidos tumorais e seu microambiente circun- dante.
H16-7.8mcMMAF inibe a formação de xenoenxertos de câncer renal. Estes resultados indicam a utilidade de H16-7.8mMcMMAF no tratamen- to de estágios locais e avançados de câncer e preferencialmente aqueles cânceres estipulados na Tabela |.
161P2F10B ADCs: Anticorpos monoclonais foram cultivados contra 161P2F10B conforme descrito no Exemplo intitulado “Geração de Anticorpos Monoclio-
nais para 161P2F10B (MAbs).” Adicionalmente os MAbs são conjugados a uma toxina conforme descrito no Exemplo intitulado “Conjugação de Anticor- po e Fármaco de H16-7.8” para formar H16-7.8McMMAF. O H16-
7.8mcMMAF é caracterizado por FACS, e por outros métodos conhecidos na arte para determinar sua capacidade para ligar 161P2F10B. Linhagens Celulares e Xenoenxertos: As células RFX-393 são mantidas em RPMI, suplementado com L-glutamina e 10% de FBS. Xenoenxertos de UG-K3 e SKRC-01 são manti- dos por propagação serial em camundongos SCID. Eficácia de H16-7.8McMMAF em xenoenxerto de câncer renal humano UG- K3 estabelecido por via subcutânea em camundongos SCID. Neste experimento, xenoenxerto de câncer renal humano UG-K3 f derivado de paciente foi mantido por passagens seriais em camundongos SCID. Tumores de estoque foram colhidos de modo estéril e triturados até to 15 pedaços pequenos. Os pedaços de tumor foram digeridos enzimaticamente para suspensões celulares únicas usando Liberase Blendzyme (Roche Ap- : plied Science, Indianapolis, IN). 1,5x 10º células foram injetadas nos flancos . de camundongos SCID individuais e os tumores foram deixados crescer sem tratamento até eles terem atingido um volume aproximado de 100 mmº. Os animais foram atribuídos aleatoriamente para os grupos que se seguem: um grupo tratado com H16-7.8mMcMMAF, um controle de H16-7.8 e um controle de Dextrose a 5%. H16-7.8mMcMMAF e H16-7.8 foram dosados a 10 mg/kg uma vez no dia 0 por injeção de bolus intravenoso. A quantidade de H16-
7.8mcMMAF e de H16-7.8 administrada foi baseada no peso corporal indivi- —dualde cada animal obtido imediatamente antes da dosagem. O controle de Dextrose a 5% foi dosado a 150 ul por animal. O crescimento tumoral foi monitorado usando medições por calibrador a cada 3 a 4 dias até o fim do estudo. O volume tumoral é calculado como Largura? x Extensão/2, onde largura é a menor dimensão e extensão é a maior. Os animais nos grupos de controle foram sacrificados humanitariamente quandos os tumores atingi- ram aproximadamente 1000 mm?. Os animais no grupo tratado com H16-
7.8mcMMAF foram monitorados por um adicional de duas semanas antes do sacrifício. Foi realizada análise estatística no último ponto do tempo quando os dados para ambos os grupos de controle estavam disponíveis, usando teste de Kruskal-Wallis com a=0,05.
Os resultados demonstraram que o tratamento dos tumores de xenoenxerto de células claras renais UG-K3 com H16-7.8McMMAF em todas as doses e esquemas examinados resultou em inibição significariva do cres- cimento tumoral em camundongos SCID. (Figura 9). Inibição do Crescimento de Xenoenxertos de UG-K3 Ortotópicos Estabeleci- dos por H16-7.8.mMcMMAF Neste experimento, a capacidade de H16-7.8mcMMAF para ini- bir o crescimento de tumores renais estabelecidos crescendo ortotopicamen- te foi avaliada usando, xenoenxertos de tumor UG-K3 derivado de paciente. Y Em resumo, estoques de tumores UG-K3 foram digeridos enzimaticamente e : : 1,5 milhões de células viáveis foram implantadas cirurgicamente nos rins de : 15 camundongos SCID machos no Dia 0. Os tumores foram deixados para crescer por 7 dias ocasião na qual os animais foram randomizados para 4 É grupos de tratamento diferentes (n= 10 por grupo). Os animais randomiza- - dos para o Grupo A receberam ADC Controle a 5 mpk, para o Grupo B rece- beram H16-7.8mMcMMAF a 3mg/kg e para o Grupo C receberam H16-
7.8mMcMMAF a 5 mg/kg administrado a cada 4 dias por um total de 4 doses. O Grupo D recebeu H16-7.8mMcMMAF a 10 mg/kg uma vez. Ao fim do estudo (Dia 41) os animais foram sacrificados e os rins direito e esquerdo foram pe- sados sobre uma balança eletrônica. Os pesos dos tumores plotados sobre o gráfico foram determinados subtraindo o peso do rim contralateral livre de tumordo peso do rim direito carregando tumor.
Os resultados demonstraram que o tratamento de tumores de xenoenxerto de células claras renais UG-K3 com H16-7.8mMcMMAF em todas as doses e esquemas examinados resultou em dramática inibição do cres- cimento tumoral (Figura 10). Os pesos dos tumores em todos os trupos de tratamento com H16-7.8mMcMMAF (B, C, e D) foram menores do que 1% dos pesos dos tumores no grupo tratado com Controle. Estas diferenças foram altamente estatisticamente significativas (p< 0,0001, ANOVA).
Eficácia de H16-7.8.2mMcMMAF em xenoenxerto de câncer renal humano RXF- 393 estabelecido por via subcutânea em camundongos SCID. Neste experimento, células de câncer renal humano RXF-393 (0,5 x 10º células por camundongo) foram injetadas nos flancos de camun- —dongos individuais e os tumores foram deixados crescer sem tratamento até eles terem atingido um volume aproximado de 100 mmº?. Em seguida os a- nimais foram atribuídos aleatoriamente para os grupos que se seguem: um grupo tratado com H16-7.8mMcMMAF, um grupo tratado com H16-7.8 e um controle de Dextrose a 5%. H16-7.8mMcMMAF e H16-7.8 foram dosados a 10mg/kg uma vez por semana por um total de duas doses por injeção de bolus intravenoso. A quantidade de H16-7.8mMcMMAF e de H16-7.8 adminis- trada foi baseada no peso corporal individual de cada animal obtido imedia- t tamente antes da dosagem. O controle de Dextrose a 5% foi dosado a 150 . uL por animal. O crescimento tumoral foi monitorado usando medições por ! 15 calibrador a cada 3 a 4 dias até o fim do estudo. O volume tumoral é calcu- lado como Largura? x Extensão/2, onde largura é a menor dimensão e ex- ' tensão é a maior. Os animais nos grupos de controle foram sacrificados hu- - manitariamente quando os tumores atingiram aproximadamente 1000 mm?. Os animais no grupo tratado com H16-7.8mMcMMAF foram monitorados por um adicionalde duas semanas antes do sacrifício.
Os resultados demonstraram que o tratamento de tumores de xenoenxerto de câncer renal humano RFX-393 com H16-7.8mMcMMAF em todas as doses e esquemas examinados (inclusive dose única) resultou em significativa inibição do crescimento tumoral em camundongos SCID. Foi realizada análise estatística no último ponto do tempo quando os dados em ambos os grupos de controle estavam disponíveis, usando teste de Kruskal- Wallis com a=0,05. (Figura 11).
Estudo da Eficácia de H16-7.8 em comparação com H16-7.8mcMMAF em câncer renal humano SKRC-01 estabelecido por via subcutânea em Camun- — dongos SCID Em outro experimento, células de câncer renal humano SKRC- 01 (0,8 x 10º células por camundongo) foram injetadas nos flancos de ca-
mundongos individuais. Os tumores foram deixados crescer sem tratamento até eles terem atingido um volume aproximado de 100 mmº?. No dia O quan- do os tumores atingiram 100 mmº, os animais foram atribuídos aleatoriamen- te para os grupos que se seguem: um grupo tratado com H16-7.8mMcMMAF, um grupo tratado com H16-7.8 e um controle de Dextrose a 5%. H16-
7.8mMcMMAF e H16-7.8 foram dosados a 4 mg/kg a cada quatro dias para um total de quatro doses por injeção de bolus intravenoso. A quantidade de H16-7.8mMcMMAF e de H16-7.8 administrada foi baseada no peso corporal individual de cada animal obtido imediatamente antes da dosagem. O con- trole de Dextrose a 5% foi dosado a 150 ul por animal. O crescimento tumo- ral foi monitorado usando medições por calibrador a cada 3 a 4 dias. O vo- lume do tumor foi calculado como Largura? x Extensão/2, onde largura é a : ' menor dimensão e extensão é a maior. . Os resultados mostram que o ADC H16-7.8mcMMAF inibiu signi- : 15 ficativamente o crescimento da formação de tumor SKRC-01 em todas as doses (incluindo dose única), ao passo que o MAb H16-7.8 nu não teve ne- : nhum efeito. Deste modo, o ADC H16-7.8mcMMAF teve um efeito significati- - vamente mais proeminente do que o anticorpo nu H16-7.8. (Figura 12).
Estudo da Eficácia de H16-7.8mMcMMAF em comparação com outros Conju- gados de fármaco e anticorpo (ADCs) 161P2F10B em UG-K3 estabelecido subcutaneamente em camundongos SCID Em outro experimento, células de câncer renal humano UG-K3 (15x 10º células por camundongo) foram injetadas nos flancos de camun- dongos individuais. Os tumores foram deixados crescer sem tratamento até eles terem atingido um volume aproximado de 100 mmº?. No dia O quando os tumores atingiram 100 mm?, os animais foram atribuídos aleatoriamente para os grupos que se seguem: um grupo tratado com H16-7.8mMcMMAF, um grupo tratado com H16-7.8vcMMAE, e grupo tratado com H16-
1.11mMcMMAF, e grupo tratado com H16-1.11vcMMAE, um grupo tratado com controle de PBS, e um grupo tratado com controle de MAb-vcMMAE. TOdos os conjugados de fármaco e anticorpo (ADCs) foram dosados a 10 mg/kg uma vez no dia 0. A quantidade de cada ADC administrada foi ba-
seada no peso corporal individual de cada animal obtido imediatamente an- tes da dosagem. O controle de PBS foi dosado a 150 u/L por animal. O cres- cimento tumoral foi monitorado usando medições por calibrador a cada 3 a 4 dias. O volume do tumor foi calculado como Largura? x Extensão/2, onde larguraé a menor dimensão e extensão é a maior.
Os resultados mostram que os ADCs H16-7.8vcMMAE e H16-
1.11vcMMAE não inibiram o crescimento da formação tumoral. Adicional- mente, tanto o H16-7.8mMcMMAF quanto o H16-1.11mMcMMAF inibiram signi- ficativamente o crescimento da formação de tumor UG-K3 durante os primei- ros trinta (30) dias. Depois do dia trinta (30) o H16-7.8mMcMMAF teve um efeito significativamente mais proeminente em comparação com H16-
1.11mcMMAF. (Figura 13).
a Exemplo 8 . Testes Clínicos Humanos para o Tratamento e o Diagnóstico de Carcinomas Humanos através do uso de 161P2F10B ADCs 161P2F10B ADCs são usados de acordo com a presente inven- ' ção os quais ligam especificamente a 161P2F10B, e são usados no trata- - mento de determinados tumores, preferencialmente aqueles listados na Ta- bela |. Em conexão com cada uma destas indicações, duas abordagens clí- —nicassão perseguidas com sucesso, |.) Terapia auxiliar: Na terapia auxiliar, os pacientes são tratados com 161P2F10B ADCs em combinação com um agente quimioterápico ou anti-neoplásico e/ou terapia de radiação ou uma combinação dos mesmos.- alvos de cânceres primários, tais como aqueles listados na Tabela |, são tra- tados sob protocolos de rotina pela adição de 161P2F10B ADCs a terapia de primeira linha e de segunda linha de rotina. Os modelos do protocolo visam a eficácia conforme avaliado pelos exemplos que se seguem, incluindo mas não limitados a, redução na massa tumoral de lesões primárias ou metastá- ticas, aumento da sobrevida livre de progressão, sobrevida global, melhora da saúde dos pacientes, estabilização da doença, bem como a capacidade para reduzir as doses usuais da quimioterapia de rotina e de outros agentes biológicos. Estas reduções das dosagens possibilitam terapia adicional e/ou prolongada por redução da toxicidade dose-relacionada do agente quimiote- rápico ou biológico. 161P2F10B ADCs são utilizados em vários testes clíni- cos auxiliares em combinação com os agentes quimioterápicos ou anti- neoplásicos.
11.) Monoterapia: Em conexão com o uso dos 161P2F10B ADCs em monoterapia de tumores, os 161P2F10B ADCs são administrados a pa- cientes sem um agente quimioterápico ou anti-neoplásico. Em uma modali- dade, a monoterapia é conduzida clinicamente em pacientes com câncer em estágio terminadl com doença metastática extensiva. Os modelos do proto- colo visam a eficácia conforme avaliado pelos exemplos que se seguem, incluindo mas não limitados a, redução na massa tumoral de lesões primá- rias ou metastáticas, aumento da sobrevida livre de progressão, sobrevida .: " global, melhora da saúde dos pacientes, estabilização da doença, bem como a capacidade para reduzir as doses usuais da quimioterapia de rotina e de outros agentes biológicos. Dosagem ' Os regimes de dosagens podem ser ajustados para proporcionar - a resposta ótima desejada. Por exemplo, um único bolo pode ser adminis- trado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indi- cado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma da unidade de dosagem, conforme usado aqui, se refere a unidades fisicamente distin- tas convenientes como dosagens unitárias para os sujeitos mamíferos a se- rem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em as- sociação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidades de dosagems da invenção são ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do anticorpo e do efeito tera- pêutico ou profilático em particular a ser obtido, e (b) as limitações inerentes na arte de combinação de um composto ativo semelhante para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.
Uma faixa exemplar e não limitante para uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um conjugado de fármaco e anticorpo 161P2F10B administrado em combinação de acordo com a invenção é cerca de 0,5 até cercade10 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 5 mg/kg, no mínimo 1 mg/kg, no mínimo 2 mg/kg, no mínimo 3 mg/kg, ou no mínimo 4 mg/kg. Outras faixas exemplares e não-limitantes são, por exemplo cerca de 0,5 até cerca de 5 mg/kg, ou por exemplo cerca de 0,8 até cerca de 5 mg/kg, ou por exemplo cerca de 1 até cerca de 7,5 mg/kg. A modalidade de dose elevada da inven- ção se refere a uma dosagem de mais de 10 mg/kg. Deve ser observado que os valores das dosagens podem variar com o tipo e a gravidade da con- dição a ser aliviada, e podem incluir doses únicas ou múltiplas. Deve ser en- . 7 tendido adicionalmente que para qualquer sujeito em particular, os regimes : de dosagens específicos devem ser ajustados com o tempo de acordo com ' 15 a necessidade individual e com o critério profissional da pessoa que estiver administrando ou supervisionando a administração das composições, e que : as faixas de dosagens estipuladas aqui, são somente exemplares e não se . pretende que limitem o âmbito ou a prática da composição reivindicada. Plano de Desenvolvimento Clínico (CDP) O CDP segue e desenvolve tratamentos de ADCs de 161P2F10B em conexão com monoterapia ou terapia acessória. Inicialmen- te, são realizados estudos de toxicologia pré-clínicos em sujeitos não- humanos (por exemplo, camundongos, macacos, etc.) usando protocolos de rotina de conhecimento na arte. Foi demonstrado que a H16-7.8mMcMMAF é bem tolerada nos estudos de toxicologia não-humana. As Provas Clínica humanas inicialmente demonstram segurança e depois disso confirmam efi- cácia em doses de repetição. Os testes são não cegos comparando quimio- terapia de rotina com terapia de rotina mais ADCs de 161P2F10B. Conforme será reconhecido, um critério não-limitante que pode ser utilizado em cone- xão como registro de pacientes são os níveis de expressão de 161P2F10B em seus tumores conforme determinado por biópsia.
Como com qualquer terapêutica à base de infusão de proteína ou anticorpo, as preocupações de segurança se referem essencialmente (i) à síndrome de liberação de citocina, isto é, hipotensão, febre, tremor, ca- lafrios; (ii) ao desenvolvimento de uma reação imunogênica ao material (isto é, desenvolvimento de anticorpos humanos pelo paciente para o terapêutico de anticorpo, ou reação HAHA); e, (iii) à toxicidade para células normais que expressem 161P2F10B.
Testes de rotina e seguimento são utilizados para monitorar cada uma destas preocupações de segurança.
MAbs 161P2F10B são considerados seguros após administração humana.
Exemplo9 Conjugação de Anticorpo Fármaco de Caracterização de MAb H16-7.8 1) Mapeamento de Peptídeo por Espectrometria de Massa r Foi conduzida análise de mapeamento de peptídeo.
Este método | é usado para confirmar a identidade de H16-7.8mMcMMAF e distinguir anti- o 15 corpo nativo (H16-7.8). Os H16-7.8.mcMMAF e H16-7.8 obtidos foram trata- dos com ditiotreitol (DTT) para reduzir as ligações de dissulfeto, seguido por : alquilação das cisteínas livres resultantes.
Guanidina foi usada nesta etapa .- para assegurar a completa desnaturação da proteína.
Depois de diálise para remover a guanidina, as amostras foram digeridas com uma endoproteinase específica, Lys-C.
Lys-C cliva ligações de peptídeo sobre o lado C-terminal dos resíduos lisina.
Os peptídeos resultantes foram analisados por cromato- grafia de fase reversa acoplada a espectrometria de massa.
Os tempos de retenção de fase reversa e as proporções de massa para carga observadas dos picos foram comparadas entre H16-7.8mMcMMAF e H16-7.8. Foi realiza- da análise por LC-MS (cromatografia líquida — espectrometria de massa) usando uma UPLC WATERS Acquity acoplada a um espectrômetro de mas- sa WATERS Q-TOFp.
A amostra digerida foi aplicada a coluna de C18 YMC e elutriada com um gradiente de acetonitrilo contendo ácido trifluoroacético.
Mapas de peptídeo representativos para H16-7.82mMcMMAF e H16-7.8 são mostrados na Figura 14. Todos os três cromatogramas na Figura 14 parecem ser idênti- cos exceto pelos picos indicados por asterisco e seta.
Conforme pode ser visto na Figura, as intensidades dos picos indicadas por asterisco estavam reduzidas no anticorpo conjugado comparado com o anticorpo nativo. Os picos marcados com uma seta representam novos picos que apareceram sobre o mapa de peptídeo do anticorpo conjugado. Especificamente, acredi- ta-se que os picos marcados com quer um asterisco ou com uma seta são um peptídeo destinado para conjugação e o peptídeo conjugado resultante, respectivamente. A Figura 15 mostra uma porção dos espectros de massa do pico marcado com um asterisco. O valor de massa do sinal que se alterou durante a conjugação é indicado pelo sinal de “mais”. Este peptídeo com um m/z aproximado de 970,4 (estado de carga +3) foi identificado como C225- K250 que se originou da região de articulação da cadeia pesada e contém os sítios de conjugação esperados.
Y De modo a identificar os picos que apareceram recentemente os : : quais se acredita que sejam peptídeo conjugado na Figura 14, foi conduzida : 15 análise por LC-MS usando a técnica de aquisição de dados de elevada- energia (MSE). A Figura 16 msotra os cromatogramas iônicos extraídos j (XIC) para mapas de peptídeo de H16-7.8mcMMAF e H16-7.8 usando o m/z de 619,4. Este íon corresponde a um íon de fragmento da porção de fárma- co. Os picos observados em XIC a 619,4 são quase idênticos aos picos marcados com uma seta na Figura 14. Além disso, não foram detectados picos semelhantes no cromatograma do anticorpo nativo. Estas observações sugerem que os picos detectados no XIC a m/z de 619,4 foram aparente- mente peptídeos conjugados a fármaco e são identificados por seus valores de massa intacta. O resultado foi resumido na Tabela V. Estes resultados sugerem que no caso do conjugado, peptídeos predominantes são aqueles conjugados a 2 fármacos sobre a região de articulação de cadeia pesada. Estes dados são consistentes com os dados obtidos pela outra análise orto- gonal tal como uma análise DAR. 11) Análise de Massa Intacta por LC-MS A massa total do H16-7.8mMcMMAF desglicosilado foi determina- da por espectrometria massa por ionização por eletrospray em tempo de vôo (ESI-TOF). Esta técnica proporciona informação direta sobre o valor da pro-
porção de fármaco para anticorpo (DAR). As amostras de teste foram diluí- das por 250 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,5 e em seguida incu- badas de um dia para o outro a 37ºC com Glicopeptidase F. As amostras foram injetadas sobre uma coluna PLRPTM (Varian Technology), equilibrada a9goC, e elutriadas com um gradiente de acetonitrilo / água. Os picos das amostras foram analisados por um sistema Acquity UPLC acoplado a um espectrômetro de massa WATERS Synapt (Waters) e as massas foram re- construídas a partir dos dados brutos por um software MaxEnt1i. Um perfil espectral de massa de exemplo para o H16-7.8mMcMMAF desglicosilado é mostrado na Figure 17. O anticorpo conjugado a fármaco predominante foi uma espécie de carga de 4 fármacos. Esta observação incluindo uma abun- dância do anticorpo não conjugado em H16-7.8mcMMAF foi consistente com Y os resultados obtidos pelos outros métodos ortogonais, tais como DAR por ! . RP-HPLC, mapeamento de peptídeo e prova de HIC. : 15 IN) Análise da Proporção de Fármaco para Anticorpo (DAR) por RP-HPLC Foi conduzida Análise da Proporção de Fármaco para Anticorpo : (DAR) para determinação por HPLC quantitativa da quantidade relativa de : carga de fármaco em cada Cadeia leve e Cadeia pesada. As análise de DAR foram realizadas usando uma coluna analítica PLRP-S, 2,1 mm x 50 mm, com fase móvel A consistindo em 2,0% de ácido fórmico e fase móvel B consistindo em 2,0% de ácido fórmico mais 90% de acetonitrila. Para prepa- ração das amostras, o anticorpo conjugado a fármaco foi completamente reduzido por DTT e em seguida separado para a cadeia L, a cadeia L conju- gada a fármaco, a cadeia H e as cadeias H conjugadas a fármaco com base na quantidade da carga de fármaco. 50 ug da amostra foi elutriado usando uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min, com detecção a 280 nm. A proporção molar da proporção de fármaco para anticorpo (DAR) é definida pela equação que se segue.
abs ( AE inn 491 E tr ml«2 E AUC Hal Leve à AUCrotal Pesada —) onde
DAR — proporção molar de fármaco para anticorpo n-— número de fármacos mcMMAF por cadeia de Ab AUCLeve,n, AUCPesada,n — área sob a curva para a cadeia de anticorpo leve ou pesada com n fármacos, respectivamente; AUCTotal, Leve (Pesada) — pico da área sob a curva da cadeia leve ou pesada.
Este método foi qualificado usando material de H16-
7.8mMcMMAF. Os parâmetros avaliados incluíram especificidade, acurácia, reprodutibilidade, precisão intermediária. Um perfil de DAR representativo apraH16-7.8McMMAF é mostrado na Figura 18. O valor de DAR é 4,0. A amostra foi submetida a análise por LC-MS usando as mesmas condições de HPLC deste método para identificar o pico observado. Os resultados es- f tão resumidos na Tabela VI. A identificação de picos dos resultados de DAR .: obtidos durante a qualificação deste método foi confirmada ortogonalmente porLC-MS. IV) Afinidade de Ligação Õ H16-7.8 e H16-7.8mcMMAF foram testadas para sua afinidade - de ligação a 161P2F10B expressadas sobre células KU812 (células de leu- cemia mielogênica crônica humana, ATCC). Em resumo, doze (12) diluições de H16-7.8 ou H16-7.8mMcMMAF foram incubadas com células KU812 (50.000 células por cavidade) de um dia para o outro a 4ºC em uma concen- tração final de 160 nM a 0,004 nM. Ao final da incubação, as células foram lavadas e incubadas com anticorpo de detecção anti-hlgG-PE por 45 min at 4ºC. Depois de lavar os anticorpos de detecção não ligados, as células fo- ram analisadas por FACS.
Os valores de MF! foram introduzidos no software Graphpad Pri- sim e analisados usando a equação de ligação de um sítio (hipérbole) de Y=Bmax*X/(Kd+X) para gerar as curvas de saturação de H16-7.8 e H16-
7.8mMcMMAF. Bmax é o valor de MFI em ligação máxima de H16-7.8 ou H16-
7.8mMcMMAF a KU812; Kd é a afinidade de ligação de H16-7.8 ou H16-
7.8mMcMMAF a qual é a concentração de H16-7.8 ou H16-7.8mMcMMAF ne- cessária para atingir a ligação meia-máxima. A afinidade calculada (Kd) de
H16-7.8 e H16-7.8.mMcMMAF é de 0,08 nM e de 0,25 nM sobre 161P2F10B expressadas sobre a superfície de células KU812, respectivamente. (n=4). M) Citotoxicidade Os H16-7.8, H16-7.8.8mMcMMAF e um ADC de controle negativo foram separadamente diluídos serialmente e adicionados a uma lâmina de 96 cavidades contendo células KU812, as quais expressam endogenamente 161P2F10B sobre a superfície celular. Depois de seis dias de incubação, reagente Alamar Blue é adicionaod à mistura de células e anticorpo. Ala- marBlue& é um indicador da viabilidade celular que usa a potência de redu- ção natural de células vivas para converter resazurin para a molécula fluo- rescente, resorufin. Resazurin é reduzido para resorufin, o qual produz fluo- rescência vermelha muito brilhante. As células viáveis convertem continua- mente resazurin para resorufin, deste modo gerando uma medida quantitati- : va da viabilidade - e da citotoxicidade. A percentagem de citotoxicidade de I 15 H16-7.8McMMAF é avaliada usando unidades de fluorescência obtidas es- pectrofotometricamente usando a leitora Synergy 4 Hybrid Multi-Mode Mi- | croplate (540/35, 620/40 nm). A faixa linear do teste é de aproximadamente : 3,9 a 1000 ng/ml. Há 9 pontos na curva padrão: a maior concentração de H16-7.8McMMAF é 1000 ng/ml seguida por oito diluições seriais de 1 para 2 eumavazia(0O).
Calcular a Percentagem de Sobrevida usando a fórmula abaixo: % de Sobrevida = (X — Vazio) / (Não tratadas — Vazio) x 100 Atividade de citotoxicidade específica de H16-7.8mMcMMAF sobre células KU812: IC50 de 0,15 nM.
H16-7.8 e ADC controle (anticorpo(não-anticorpo anti 161P2F10B)-mcMMAF) não têm atividade de citotoxicidade sobre células KU812.
Do início ao fim deste requerimento, são referidos conteúdos de dados de vários websites, publicações, requerimentos de patentes e paten- tes. (Websites são referidos por sua URL, ou Uniform Resource Locator, en- dereços na Internet (World Wide Web.)) As revelações de cada uma destas referências são por este incorporadas por meio de referência aqui, em suas totalidades.
A presente invenção não deve ser limitada em seu âmbito pelas modalidades reveladas aqui, as quais se pretende que sejam simples ilus- trações de aspectos individuais da invenção, e quaisquer que sejam funcio- —nalmente equivalentes estão dentro do âmbito da invenção. Várias modifica- ções dos modelos e métodos da invenção, além daqueles descritos aqui, se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição e dos ensinamentos precedentes, e de modo similar se pretende que estejam dentro do âmbito da invenção. As modificações referidas ou modalidades diversas podem ser praticadas sem se afastar do verdadeiro âmbito e espíri- to da invenção. Tabelas É Tabela |: Tecidos que expressam 161P2F10B quando malignos. " Rim | 15 Cólon Pulmão À Ovário - Mama Linfoma Osso Útero Pâncreas Fígado Próstata Tabela Il: Abreviações de Aminoácidos [or me O emana Lo emo
Tabela ll: continuação
ÚNICA LETRA TRÊS LETRAS NOME COMPLETO Lorem a A a A e saeuera | EN a merona 7 v : a A anna | - [OD As | assoaspanoo | Tabela Ill: Matriz de Substituições de Aminoácidos Adaptada da matriz de substituições de aminoácidos do GCG Software 9.0 BLOSUM6?2 (matriz de substituição em bloco). Quanto maior o valor, mais provável uma substituição ser encontrada em proteínas naturais, relacionadas. ACD EF GH IKI MNPFQR ST TVVNW | |. 4 0-2-1-2 0-2-1-1-1-1-2-1-1-1 1 0 0-3-2A 9 -3-4-2-3-3-1-3-1-1-3-3-3-3-1-1-1-2-2C0 6 2-3-1-1-3-1-4-3 1-1 0-2 0-1-3-4-3D 5 -.3-> Q-3 1-3-D O-l 9 DO O-l-D-3-DE 6-3-1 0-3 O 0-3-4-3-3-2-2-1 1 3F 6-2-4-2-4-3 0-2-2-2 0-2-3-2-3G 8-3-1-3-2 1-2 O 0-1-2-3-2 2H 4-3 2 1-3-3-3-3-2-1 3-3-11 S-221 0-1 1 2 O-l->-3-2X 4 2-3-3-2-2-2-1 1-2-11L 5-2-2 0-1-1-1 1-1-1M 6-2 0 0 1 0-3-<-2% 7-1-2-1-1-2-4-3P 5 1 0-1-2-2-10 5-1 -1-3-3-2R 4 1-2-3-258 5 0-2-27T 43-10 1 2W
Tabela IV: Valores da Intensidade de Florescência Média (MFI) analisada por FACS sobre células Ku812 ER AoA [Dm e
AA [AT [RT o so | Ea : [mm | Ts [ams | [om | Ts ema | os
Tabela V.. Sumário dos resultados do pico de identificação sobre os peptí- deos conjugados a fármaco, sítios de conjugação potenciais (re- síduos cisteína) são determinados em negrito e sublinhados. 1º do | M: domi- | M: it Nº do | Massa predomi- lassa Tentativa de Identificação Identificação Pico | nante observada | Calculada da Sequência 1754,81 1736,51 | SasFNRGEG2tIMEMMAFtHO. | scg ID NO: 9 Cadeia leve rasto S2oeFNRGEC214+ IMCMMAF, Cadeia leve
CVECPPCPAPPVGPSVFLFPP Gas CVFGPPE! í SEQ ID NO: 3 4679,29 4643,72 |KPK25+2MeMMAF+2H,0, Cadeia o pesada CoxsCVECPPCPAPPVGPSVFLFPP Seu CVEGPPGPADPVGPS SEQ ID NO: 4 4661,29 4643,72 |KPK2as+2MCMMAF+H20, Cadeia o : pesada . C2osCVECPPCPAPPVGPSVFLFPP | SEQD NO: 2 a4643,72 | EE . $ feie-so KPK245+2McMMAF, Cadeia pesada Cas CVECPPCPAPPVGPSVFLFPP | SEQID NO: A, BASTO IEA o 3 fico KPK249+2MCMMAF, Cadeia pesada . Cas CVECPPCPAPPVGPSVFLFPP | SEQID NO: ' Inqnitos 4643.12 |KPKzu*2MCMMAF, Cadeia pesada 10 ' C2osCVECPPCP, 22 CVECPPCPAPPVGPSVFLFPP | 250 17 No. 4626,27 4643,72 |KPK245+2MCMMAF-H,O, Cadeia O pesada Tabela VI: Resultados da identificação de pico da análise de DAR por LC-MS Nº do Massa Diferença de massa de Atribuições Pico Observada pico não conjugado 23596,1055 Cadeia L não conjungada 245217031 925,6 Cadeia L conjungada a 1 fármaco 50304,9102 Cadeia H não conjungada H1 51230,3984 925,5 Cadeia H conjungada a 1 fármaco H2 52155,9023 1851,0 Cadeia H conjungada a 2 fármacos 53085,2813 2780,4 Cadeia H conjungada a 3 fármacos 54006,7422 3701,8 Cadeia H conjungada a 4 fármacos 54929,6002 4624,7 Cadeia H conjungada a 5 fármacos
Tabela VII: Esquema Sintético de MmcCMMAF oe nor Hm otBu Ss Me OMeO FiociaN o oe
1. ZVelOH, CMP! Etapa 1 | 2 Pe Elone | 3. pTSA, MTBE, MeOH e, OH | A Bit aers t Etapa 3 Mô o DMFU EIOAS
AR msn mao Om PTSA. Ha! Me OMeO S O e PP” rol *. DO) mo &
1. Fmoc-MeVal-OH OMe Etapa 2 | TETU DIPEA ElOAC RS) 2, Hei dioxano 3 DCHA, ELO? TEME AA, Z : Fmoe, KR. o & e nº. 1. EGNH, DCM . Me O À Me OMeO Etapa 4
2. TBTU, DIPEA, EtOAc o o -OMe : ms AA AA do Me O AM : É À Me OMeO Mô OQ À : e CcYrTOTOXIC d o oste e me KA AI AN AA LO “pen Dou 1 REA A ARENIOET te E A de dub tod Ac Etapas "te O A Ne Om FNE erroroxc erroroxtc A p A. , . : Lt, E AAA TU ATER OU de 6 A do dub mo É - iene o Etapa 6 CrroTtoxIC

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado de fármaco e anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma proteína 161P2F10B compreen- dendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que o anticorpo ou fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região V, de SEQ ID NO: 7, de resíduos 20 a 142, e a sequência de aminoácidos da região V, de SEQ ID NO: 8, de resíduos 20 a 127 e em que o anticorpo referido ou frag- mento é conjugado a monometila auristatina F (MMAF). É 10
2. Conjugado de fármaco e anticorpo de acordo com a reivindi- . cação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação de antígeno é um fragmento Fab, F(ab')z ou Fv. -
3. Conjugado de fármaco e anticorpo de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo totalmen- : 15 te humano.
4. Conjugado de fármaco e anticorpo de acordo com a reivin- " dicação 1, caracterizado pelo fato de ser produzido de modo recombinan- - te.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado de fármaco e anticorpo, como definido na reivindi- cação 1, em uma forma de dose unitária humana.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de câncer.
7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o câncer é câncer renal ou câncer hepáti- co.
8. Método de inibir o crescimento de células cancerosas em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao sujeito referido um conjugado de fármaco e anti- corpo, como definido na reivindicação 1.
9. Método de liberação de um agente citotóxico ou um de agente de diagnóstico a uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende:
fornecer MMAF(s) conjugados a um anticorpo ou fragmento do mesmo que se ligue especificamente a uma proteína 161P2F10B compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que o anticorpo ou fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região V, de SEQ IDNO:7,de resíduo 20 a 142 e a sequência de aminoácidos da região V, de SEOQ ID NO: 8, de resíduo 20 a 127, para formar um conjugado de anticorpo e fármaco ou de fragmento e fármaco; e expor a célula ao conjugado de anticorpo e fármaco ou de frag- mento e fármaco. : 10 10. Método para tratar tumor em um mamífero, caracterizado . pelo fato de que compreende tratar o mamífero com uma quantidade efi- caz de um conjugado de fármaco e anticorpo, como definido na reivindi- - cação 1.
11. Método para reduzir o crescimento tumoral em um mamífero, É 15 caracterizado pelo fato de que compreende tratar o mamífero com uma quantidade eficaz de uma combinação de um conjugado de fármaco e anti- ' corpo, como definido na reivindicação 1, e radiação. .
12. Método para reduzir o crescimento tumoral em um mamí- fero, caracterizado pelo fato de que compreende tratar o mamífero com uma quantidade eficaz de uma combinação de um conjugado de fármaco e anticorpo, como definido na reivindicação 1, e um agente quimioterápi- co.
13. Método para reduzir o crescimento tumoral em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende tratar o mamífero com uma quantidade eficaz de uma combinação de um conjugado de fármaco e anti- corpo, como definido na reivindicação 1, e um fármaco ou terapia biologica- mente ativa.
14. Método para tratar câncer em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende tratar o mamífero com uma quantidade eficaz deuma combinação de um conjugado de fármaco e anticorpo, como definido na reivindicação 1, e um agente quimioterápico.
15. Uso de um conjugado de fármaco e anticorpo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para inibir o crescimento de células cancerosas em um indiví- duo ou tratar tumor em um mamífero.
16. Uso de uma quantidade eficaz de uma combinação de um conjugado de fármaco e anticorpo como definido na reivindicação 1, com um agente quimioterápico, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para reduzir o crescimento tumoral em um mamífero ou tratar câncer em um mamífero.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6046494B2 (ja) * 2010-02-08 2016-12-14 アジェンシス，インコーポレイテッド １６１ｐ２ｆ１０ｂタンパク質に結合する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
US20130116404A1 (en) 2011-11-08 2013-05-09 Case Western Reserve University Targeted non-invasive imaging probes of egfr expressing cells
JP6181089B2 (ja) 2012-03-08 2017-08-16 ハロザイム インコーポレイテッド 条件依存活性抗上皮細胞増殖因子受容体抗体およびその使用方法
EP2850059A4 (en) 2012-05-15 2016-06-29 Concortis Biosystems Corp CONJUGATES OF MEDICATION, METHODS OF CONJUGATION AND USE THEREOF
TWI606063B (zh) * 2012-08-23 2017-11-21 艾澤西公司 結合至１５８ｐ１ｄ７蛋白之抗體藥物結合物（ａｄｃ）
EP3044236A2 (en) 2013-09-12 2016-07-20 Halozyme, Inc. Modified anti-epidermal growth factor receptor antibodies and methods of use thereof
KR102645430B1 (ko) 2013-10-15 2024-03-11 씨젠 인크. 개선된 리간드-약물 컨쥬게이트 약물동력학을 위한 peg화된 약물-링커
US10836821B2 (en) 2013-10-15 2020-11-17 Sorrento Therapeutics, Inc. Drug-conjugates with a targeting molecule and two different drugs
WO2015069794A2 (en) * 2013-11-06 2015-05-14 Stem Centrx, Inc. Novel anti-claudin antibodies and methods of use
US9239324B2 (en) * 2013-12-06 2016-01-19 Gang Chen Antibody-binding protein-drug conjugate and methods of use
US10590165B2 (en) 2015-01-28 2020-03-17 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody drug conjugates
CA3006000A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Seattle Genetics, Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
WO2017161206A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Halozyme, Inc. Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use
KR102626498B1 (ko) 2016-03-25 2024-01-19 씨젠 인크. 페길화된 약물-링커 및 그의 중간체의 제조를 위한 공정
WO2018119314A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Ardeagen Corporation Anti-ror1 antibody and conjugates thereof
JP2020512312A (ja) 2017-03-24 2020-04-23 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド グルクロニド薬物−リンカーの調製のためのプロセスおよびその中間体
US11207420B2 (en) 2017-04-19 2021-12-28 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. Cytotoxin and conjugate, uses of same and preparation method therefor
CN113698414A (zh) 2017-12-15 2021-11-26 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 生物活性物偶联物及其制备方法和用途
MA51184A (fr) 2017-12-15 2020-10-21 Juno Therapeutics Inc Molécules de liaison à l'anti-cct5 et procédés d'utilisation associés
WO2019183633A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Case Western Reserve Univeristy Psma targeted conjugate compounds and uses thereof
MX2021008537A (es) 2019-01-15 2021-11-12 Janssen Biotech Inc Composiciones de anticuerpos anti-tnf y métodos para el tratamiento de la artritis idiopática juvenil.
KR20230143605A (ko) 2020-11-24 2023-10-12 노파르티스 아게 Bcl-xl 억제제 항체-약물 접합체 및 그의 사용 방법
WO2023223097A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Novartis Ag Antibody drug conjugates
WO2023225359A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Novartis Ag Antibody-drug conjugates of antineoplastic compounds and methods of use thereof

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
US5001225A (en) * 1986-12-08 1991-03-19 Georgetown University Monoclonal antibodies to a pan-malarial antigen
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
IL89220A (en) 1988-02-11 1994-02-27 Bristol Myers Squibb Co Immunoconjugates of anthracycline, their production and pharmaceutical preparations containing them
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
ES2195036T3 (es) 1995-12-22 2003-12-01 Bristol Myers Squibb Co Conectores de hidrazona ramificados.
US6130237A (en) 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
AU4818997A (en) 1996-10-15 1998-05-11 Regents Of The University Of California, The Animal models of human prostate cancer progression
DE69832158T2 (de) 1997-02-25 2006-08-10 Arizona Board Of Regents, Tempe Isolierung und strukturelle aufklärung der kryostatischen linearen und cyclo-depsipeptide dolastatin 16, dolastatin 17, und dolastatin 18
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6323321B1 (en) * 1997-03-05 2001-11-27 Eberhard-Karls-Universitat Tubingen Universitatsklinikum Antibody 97A6
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU4004699A (en) 1998-05-15 1999-12-06 Quark Biotech, Inc. Mechanical stress induced genes, expression products therefrom, and uses thereof
AU1208100A (en) 1998-10-15 2000-05-01 Genetics Institute Inc. Secreted expressed sequence tags (sests)
US20020137139A1 (en) * 1999-01-12 2002-09-26 Byatt John C Nucleic acid and other molecules associated with lactation and muscle and fat deposition
ATE269357T1 (de) * 1999-04-28 2004-07-15 Univ Texas Zusammensetzungen und verfahren zur krebsbehandlung durch die selektive hemmung von vegf
JP3759412B2 (ja) * 1999-05-19 2006-03-22 エベルハルト‐カルルス‐ウニベアジテート、テュービンゲン、ウニベアジテートスクリニクム 好塩基球および／もしくはマスト細胞、ならびに／またはこれらの前駆体細胞、ならびに／またはこれらの表面構造の検出および／または定量および／または単離のための抗体の使用
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
WO2001057251A2 (en) 2000-02-04 2001-08-09 Aeomica, Inc. Methods and apparatus for predicting, confirming, and displaying functional information derived from genomic sequence
AU2001241541A1 (en) 2000-02-17 2001-08-27 Millennium Predictive Medicine, Inc. Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of human prostate cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
WO2002079411A2 (en) 2001-03-29 2002-10-10 Van Andel Institute Microarray gene expression profiling in clear cell renal cell carcinoma: prognosis and drug target identification
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
AU2002318112B2 (en) * 2001-04-10 2007-12-06 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins useful in the detection and treatment of various cancers
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20050055733A1 (en) * 2001-07-06 2005-03-10 Zairen Sun Small intestine and colon genes
WO2003016475A2 (en) 2001-08-14 2003-02-27 The General Hospital Corporation Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
IL161268A0 (en) * 2001-11-07 2004-09-27 Agensys Inc Nucleic acid and corresponding protein entitled 161p2f10b and pharmaceutical and diagnostic compositions containing the same
DE10160921B4 (de) 2001-12-06 2005-09-22 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Verfahren zum Nachweis von Allergien und Verwendung eines Antikörpers zum Nachweis von Allergien
EP1545613B9 (en) 2002-07-31 2012-01-25 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7662387B2 (en) * 2003-02-20 2010-02-16 Seattle Genetics Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
EP1732600A2 (en) 2004-03-26 2006-12-20 Pfizer Products Incorporated Uses of anti-ctla-4 antibodies
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
SI1791565T1 (sl) 2004-09-23 2016-08-31 Genentech, Inc. Cisteinsko konstruirana protitelesa in konjugati
CN101500590A (zh) * 2005-03-31 2009-08-05 阿根西斯公司 与161p2f10b蛋白结合的抗体和相关分子
US8350009B2 (en) * 2005-03-31 2013-01-08 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
BRPI0609655A2 (pt) * 2005-03-31 2010-03-16 Agensys Inc anticorpos e moléculas relacionadas que ligam-se às proteìnas 161p2f10b
WO2007002222A2 (en) * 2005-06-20 2007-01-04 Psma Development Company, Llc Psma antibody-drug conjugates
AU2006287416A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Medimmune, Llc Toxin conjugated Eph receptor antibodies
AR065271A1 (es) * 2007-02-09 2009-05-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-robo4 y sus usos
KR101641345B1 (ko) * 2007-10-12 2016-07-20 시애틀 지네틱스, 인크. 항체-약물 접합체를 이용한 병용 요법
PT2211904T (pt) * 2007-10-19 2016-11-02 Seattle Genetics Inc Agentes de ligação a cd19 e seus usos
JP6046494B2 (ja) * 2010-02-08 2016-12-14 アジェンシス，インコーポレイテッド １６１ｐ２ｆ１０ｂタンパク質に結合する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）

Also Published As

Publication number Publication date
US20190328898A1 (en) 2019-10-31
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