CN106975082A - 结合于161p2f10b蛋白的抗体药物偶联物(adc) - Google Patents

结合于161p2f10b蛋白的抗体药物偶联物(adc) Download PDF

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Abstract

在此说明了结合于161P2F10B蛋白的抗体药物偶联物(ADC)。161P2F10B在正常成年人组织中显示组织特异性表达并且在表I中列出的癌症中在异常表达的。因此，本发明的ADC提供了用于治疗癌症的一种治疗性组合物。

Description

结合于161P2F10B蛋白的抗体药物偶联物(ADC)
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2011/024055，国际申请日为2011年2月8日，进入中国国家阶段的申请号为“201180008612.X”，发明名称为“结合于161P2F10B蛋白的抗体药物偶联物(ADC)”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的引用
本申请书要求于2010年2月8日提交的美国临时申请号61/302,489的权益。该申请书的内容通过引用以其全部内容结合在此。
对于在联邦资助研究下完成发明的权利声明
不适用。
参考通过EFS-Web提交的序列表
出于所有的目的，下面通过USPTO EFS-WEB服务器电子提交序列表的全部内容(在MPEP§1730 II.B.2(a)(C)中批准和提出)通过引用以其全部内容结合在此。在如下的电子提交的文本文件上对该序列表进行鉴别。
文件名 产生日期 大小(字节)
511582006274Seqlist 2011年1月27日 43,630字节
技术领域
在此所述的发明涉及结合称为161P2F10B蛋白的其抗体药物偶联物(ADC)。本发明进一步涉及用于治疗癌症的预测、预防和治疗方法以及组合物。
背景技术
癌症是在冠状动脉疾病之后的人类死亡的第二主要原因。全世界每年有数百万人死于癌症。仅在美国，如美国癌症协会报告的，每年癌症造成超过50万人死亡，每年有超过120万新诊断的病例。虽然源于心脏病的死亡正在显著地降低，总体上癌症引起的死亡不断升高。在下个世纪的早期，癌症被预测为死亡的主要原因。
在世界范围内，几种癌症显著地成为主要杀手。很少例外地，源于癌的转移性疾病是致命的。此外，甚至对于最初从他们原发癌症幸存的那些癌症病人，通常的经验显示他们的生活被显著地改变。许多癌症病人经受由知晓复发可能性或治疗失败驱使的严重焦虑。许多癌症病人在治疗之后经历身体虚弱。此外，许多癌症病人经历复发。
当前面鉴定的标志物例如PSA、PSM、PCTA以及161P2F10B有助于诊断和治疗前列腺癌的努力时，对于鉴别前列腺和相关癌症另外的标志物以及治疗目标从而进一步改善诊断和治疗存在需要。
目前在美国肾细胞癌(RCC)是排在第10位癌症死亡的主要原因。在美国估计每年可以诊断出51,190人患有肾细胞癌并且在2007年约12,890人死于该疾病(美国癌症协会)。历史地看，治疗主要集中在肾切除术，紧接着是非特异性免疫疗法，以及有时放射疗法(Hauke,2006)。非特异性免疫疗法包括用细胞因子白介素-2或干扰素-α作为单剂亦或联合地进行治疗。在手术切除之后，在1-3年内20-30％的病人将发展出转移性疾病，通常在肺部(Motzer等人，2006)。患有转移性疾病病人的生存中值是约13个月(Cohen and McGovern,2005)。
从2005年以来，FDA已经批准六(6)种试剂用于治疗晚期肾细胞癌。这些进步包括靶向暗含在肾细胞癌中特定途径的几种试剂。这些试剂包括索拉非尼(于2005年12月获FDA批准)、舒尼替尼(于2006年1月获FDA批准)、temsirolimus(于2007年5月获FDA批准)、依维莫司(于2009年3月获FDA批准)、贝伐单抗(与干扰素α联合，于2009年8月获FDA批准)以及帕唑帕尼(于2009年10月或FDA批准)。然而，虽然在治疗方面有了进步，转移性肾细胞癌仍然是不可治愈的并且基于总存活率的优点仅temsirolimus获得批准。
另外地，肝细胞癌(即，癌的癌症)占全部肝癌的80-90％。与女人相比较，这种类型的肝癌更常见地出现在男人体内。它通常见于50-60岁年龄人体内。通常地，肝癌的治疗是大胆的手术或可以成功地治疗小型或慢速生长肿瘤(如果它们被早期诊断的话)的肝移植。然而，很少有病人被早期诊断。化学治疗和放射治疗通常不是有效的。然而，使用这些治疗来使肿瘤收缩使得手术具有更大的成功可能性。现在甲苯磺酸索拉非尼可用于患有肝癌的病人。肝癌病人的预后通常是较差的，因为仅10-20％肝细胞癌可以使用手术去除。因此，对于开发用于治疗肝癌的试剂存在需要。
单克隆抗体(mAb)的治疗实用性得以实现(G.Kohler and C.Milstein,Nature256:495-497(1975))。现在单克隆抗体已经批准作为移植、癌、传染病、心血管疾病以及炎症中的治疗。不同的同种型具有不同的效应子功能。功能上的这类差异反映在不同免疫球蛋白同种型截然不同的3维结构中(P.M.Alzari,et al.,Annual Rev.Immunol.,6:555-580(1988))。
因为小鼠可方便地用于免疫并且将大多数人类抗原识别为外来物，抗具有治疗潜力的人类靶物质的mAb典型地具有鼠类起源。然而，作为人类治疗剂鼠类mAb具有固有的缺点。因为与人类抗体相比较，在人体中mAb具有更短的循环半衰期，它们需要更频繁地给药。更关键地，将鼠类抗体反复施用到人类免疫系统中通过将小鼠蛋白识别为外来物并且产生人抗小鼠抗体(HAMA)应答引起人类免疫系统产生应答。这类HAMA应答可以导致变态反应以及从系统中快速清除鼠类抗体由此通过无用的鼠类抗体给予治疗。为了避免这类影响，已经尝试了在小鼠体内产生人免疫系统的多种尝试。
最初的尝试希望产生能够用具有人序列的抗体对抗原进行应答的转基因小鼠(参见Bruggemann,et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86:6709-6713(1989))，但是受通过可用于克隆载体可以稳定地维持的DNA数量限制。酵母人工染色体(YAC)克隆载体的使用引导了将人Ig基因座较大种系片段引入到转基因哺乳动物体内的途径。基本上地，使用YAC将在人类基因组和人类恒定区中找到的以相同间隔安排的大部分人类V、D、和J区基因引入到小鼠体内。一种这样的转基因小鼠品系称为小鼠，并且可从Amgen Fremont公司(Fremont CA)商购。
发明内容
本发明提供了结合到161P2F10B蛋白上的抗体药物偶联物(ADC)。在一些实施方案中，本发明包括与治疗剂偶联的完全人类抗体。
本发明进一步提供了不同的免疫原性或治疗性组合物，例如抗体药物偶联物，以及用于治疗癌症(例如在表I中列出的组织癌症)的策略。
本发明涉及：
[1]包括特异性地结合于包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白的抗体或其抗原结合片段的一种抗体药物偶联物，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列：SEQ IDNO:7的VH区，从20至142，以及SEQ ID NO:8的VL区，从20至127并且其中所述抗体偶联到单甲基auristatin F上(MMAF)。
[2][1]的抗体药物偶联物，其中该抗原结合片段是一种Fab、F(ab′)2或Fv片段。
[3][1]的抗体药物偶联物，其中该抗体是一种完全人类抗体。
[4][1]的抗体药物偶联物，它是重组地生产的。
[5]处于人类单位剂量形式的包括[1]的抗体药物偶联物的一种药物组合物。
[6][5]的药物组合物，其中该组合物是用于癌症治疗。
[7][6]的药物组合物，其中该癌症是肾癌或肝癌。
[8]抑制受试者体内癌细胞生长的一种方法，包括：
将[1]的抗体药物偶联物施用到所述受试者体内。
[9]将细胞毒性剂或诊断剂递送到细胞中的一种方法，包括：
提供偶联到特异性地结合于包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白的抗体或其抗原结合片段上的MMAF，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:7的VH区，从20至142，以及SEQ ID NO:8的VL区，从20至127，从而形成一种抗体药物偶联物；以及
将该细胞暴露于该抗体药物或片段药物偶联物。
[10]一种用于治疗哺乳动物体内肿瘤的方法，包括用有效数量的[1]的抗体药物偶联物来治疗该哺乳动物。
[11]一种用于降低哺乳动物体内肿瘤生长的方法，包括用有效数量的[1]的抗体药物偶联物与辐射的组合来治疗该哺乳动物。
[12]用于降低哺乳动物体内肿瘤生长的一种方法，包括用有效数量的[1]的抗体药物偶联物与一种化学治疗剂的组合来治疗该哺乳动物。
[13]用于降低哺乳动物体内肿瘤生长的一种方法，包括用有效数量的[1]的一种抗体药物偶联物和一种药物或生物活性治疗的组合来治疗该哺乳动物。
[14]用于治疗哺乳动物体内癌症的一种方法，包括用有效数量的[1]的一种抗体药物偶联物和一种化学治疗剂的组合来治疗该哺乳动物。
[15]一种抗体药物偶联物(ADC)，其中该ADC具有式L-(LU-D)p，其中：(a)L是包括特异性地结合到包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白上的一种抗体或其抗原结合片段的抗体，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:7的VH区，从20至142，以及SEQ ID NO:8的VL区，从20至127；(b)LU是一种接头；(c)D是要求药物部分，其中该药物是单甲基auristatin F(MMAF)；(d)p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
[16]一种抗体药物偶联物(ADC)，其中该ADC具有下式，其中Ab-S是包括特异性地结合到包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白上的一种抗体或其抗原结合片段的抗体，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:7的VH区，从20至142以及SEQ IDNO:8的VL区，从20至127；p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
[17]包括特异性地结合于包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白的抗体的一种抗体药物偶联物，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:7的重链，从20至468，以及SEQ ID NO:8的轻链，从20至233，并且其中所述抗体偶联到单甲基auristatin F(MMAF)上。
[18]一种抗体药物偶联物(ADC)，其中该ADC具有式L-(LU-D)p，其中：(a)L是包括特异性地结合到包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白上的一种抗体的抗体，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:7的重链，从20至468以及SEQ ID NO:8的轻链，从20至233；(b)LU是一种接头；(c)D是一种药物部分，其中该药物是单甲基auristatinF(MMAF)；(d)p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
[19]一种抗体药物偶联物(ADC)，其中该ADC具有下式，其中Ab-S是包括特异性地结合到包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白上的一种抗体的抗体，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:7的重链，从20至468以及SEQ ID NO:8的轻链，从20至233；p是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
附图说明
图1. 161P2F10B的cDNA和氨基酸序列示于图1中。开放阅读框从核酸44-271延伸，包括终止密码子。
图2. 161P2F10B抗体的核酸和氨基酸序列。
图2A.H16-7.8重链的cDNA和氨基酸序列。加下划线的是前导序列并且加双下划线的是重链可变区。虚下划线显示人IgG2恒定区。
图2B.H16-7.8轻链的cDNA和氨基酸序列。加下划线的是前导序列并且加双下划线的是轻链可变区。虚线下划线显示人Igκ恒定区。
图3. 161P2F10B抗体的氨基酸序列。
图3A.H16-7.8重链的氨基酸序列。加下划线的是前导序列并且加双下划线的是重链可变区。虚线下划线显示人IgG2恒定区。
图3B.H16-7.8轻链的氨基酸序列。加下划线的是前导序列并且加双下划线的是轻链可变区。虚线下划线显示人Igκ恒定区。
图4.H16-7.8抗体与人类种系的比对。
图4A.H16-7.8重链与人类种系VH4-31/D5-12/JH6的比对
图4B.H16-7.8轻链与人类种系A26/JK1的比对
图5.在CHO细胞中H16-7.8的重组表达。将H16-7.8重链和轻链序列克隆到表达载体中。将这些载体转染到CHO细胞中。用来自杂交瘤亦或来自CHO细胞的H16-7.8将3T3-对照和3T3-161P2F10B细胞染色。通过流式细胞术来检测结合。结果显示在CHO细胞中重组地表达的H16-7.8被分泌并且特异性地结合到细胞表面161P2F10B上。
图6.H16-7.8和H16-7.8mcMMAF的细胞结合和亲合性。针对与在Ku812细胞上内源性地表达的161P2F10B的结合亲合性对H16-7.8和H16-7.8mcMMAF进行测试。简言之，在4℃下在160nM至0.0001nM的终浓度下使H16-7.8或H16-7.8mcMMAF的十一(11)个稀释物与Ku812细胞(50,000个细胞/孔)一起孵化过夜。在孵化结束时，在4℃将细胞洗涤并且与抗-hIgG-PE检测抗体一起孵化45分钟。在洗涤未结合的检测抗体之后，通过FACS对这些细胞进行分析。获得平均荧光强度(MFI)值(参见表IV)。将MFI值输入到Graphpad Prisim软件中并且使用Y＝Bmax*X/(Kd+X)的单位点结合(双曲线)等式进行分析从而产生H16-7.8或H16-7.8mcMMAF饱和曲线(示于图6中)。Bmax是H16-7.8或H16-7.8mcMMAF最大地结合到161P2F10B上的MFI值；Kd是H16-7.8或H16-7.8mcMMAF结合亲合性，它是达到半最大结合所需要的H16-7.8或H16-7.8mcMMAF的浓度。在Ku812细胞表面上内源性地表达的161P2F10B上H16-7.8和H16-7.8mcMMAF计算的亲和性(Kd)对应地是0.06nM和0.19nM。
图7.将H16-7.8和H16-7.8mcMMAF结合到肾癌细胞上。用10μg/ml天然H16-7.8、H16-7.8mcMMAF、或同种型对照人IgG2对人UGK-3细胞(病人衍生的透明细胞肾癌)和RXF-393细胞(透明细胞肾癌)进行染色，并且通过FACS进行评估。图7中(左图)的结果证明用H16-7.8对两种不同肾肿瘤细胞的强染色(灰色线)，但是使用对照MAb则没有(填充的直方图)。右侧图证明用H16-7.8mcMMAF对相同肾肿瘤细胞类似的强染色(灰色线)(图7，右图)。这些结果显示H16-7.8和H16-7.8mcMMAF两者结合在人癌细胞表面上表达的天然161P2F10B抗原。偶联天然H16-7.8从而产生H16-7.8mcMMAF不改变它细胞表面结合到在人癌细胞上表达的天然161P2F10B抗原上。
图8.通过H16-7.8mcMMAF得到的细胞毒性。在第0天将2000个有活力的KU812细胞一式三份地铺板并且允许恢复过夜。第二天，添加H16-7.8mcMMAF或与mcMMAF结合的对照MAb的不同批次的1:4连续稀释物从而产生终浓度。这些细胞允许孵化六(6)天，这时将20μl阿尔玛蓝添加到各孔中。将这些孔板孵化另外四(4)小时并且使用540nM激发波长和620nM发射波长在荧光酶标仪上读取荧光强度。这些结果显示H16-7.8mcMMAF的两个批次都有效地抑制KU812细胞的增殖。针对批次(1)和批次(2)确定IC 50对应地是0.2nM和0.1nM。未结合KU812细胞的完全人类对照MAb与mcMMAF相偶联从而产生3.9(+/-0.2)的DAR。对照ADC(对照mcF)未抑制KU812细胞增殖，进一步证明细胞毒性的特异性。因此，这些结果表明H16-7.8mcMMAF可以选择性地将细胞毒性药物递送到表达161P2F10B的细胞中，导致将它们杀死。
图9.在SCID小鼠体内皮下建立的人肾癌异种移植物UG-K3中H16-7.8mcMMAF的疗 效。在这个实验中，通过在SCID小鼠体内连续地传代来维持病人衍生的人肾癌异种移植物UG-K3。无菌地收获大块肿瘤并且切碎成小块。使用Liberase Blendzyme(Roche AppliedScience,Indianapolis,IN)将这些肿瘤块酶消化成单细胞悬浮液。将1.5×106个细胞注射到个体SCID小鼠的侧腹中并且允许肿瘤未处理地生长直至它们达到100mm3的大致体积。将动物随机地分配到下面同龄组中：H16-7.8mcMMAF治疗组、H16-7.8对照以及5％右旋糖对照。通过静脉推注在第0天以10mg/kg剂量将H16-7.8mcMMAF和H16-7.8给药一次。所施用的H16-7.8mcMMAF和H16-7.8的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150μL的剂量施用5％右旋糖对照。每3至4天使用测径器测量对肿瘤生长进行监测直至研究结束。将肿瘤体积计算为宽度2×长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。当肿瘤达到约1000mm3时，将对照组动物人道地安乐处死。在处死之前对H16-7.8mcMMAF治疗组动物进行监测持续另外两周。当两个对照组的数据可供使用时在最后时间点使用具有α＝0.05的克鲁斯凯-沃利斯检验进行统计分析。结果证明在所检查的所有剂量和方案下用H16-7.8mcMMAF治疗UG-K3肾透明细胞异种移植肿瘤导致对SCID小鼠体内肿瘤生长的显著抑制。
图10.通过H16-7.8mcMMAF实现建立的正位UG-K3异种移植物的生长抑制。使用病人衍生的UG-K3肿瘤异种移植物对H16-7.8mcMMAF抑制建立的正位生长的肾肿瘤生长的能力进行评估。简言之，的第0天对大块的UG-K3肿瘤进行酶消化并且以手术方式将150万活细胞植入到雄性SCID小鼠的肾中。这些肿瘤允许生长7天，这时将动物随机分成4个不同治疗组(n＝10/组)。随机分到组A的动物接受5mpk的对照ADC。组B接受3mg/kg的H16-7.8mcMMAF并且组C接受5mg/kg的H16-7.8mcMMAF，每4天进行给药持续共4个剂量。组D接受10mg/kg的H16-7.8mcMMAF一次。在研究结束时(第41天)，将动物处死并且在电子天平上对右肾和左肾进行称重。通过从携带肿瘤的右肾重量中减去无肿瘤对侧肾的重量来确定在图上绘制的肿瘤重量。
这些结果证明在所检查的所有剂量和方案下用H16-7.8mcMMAF治疗UG-K3肾透明细胞异种移植肿瘤导致肿瘤生长的显著抑制。在所有H16-7.8mcMMAF治疗组中肿瘤重量(B、C、以及D)比对照治疗组中肿瘤重量少1％。这些差异是高度统计显著的(p<0.0001,ANOVA)。
图11.在SCID小鼠体内皮下建立的人肾癌异种移植物RXF-393中H16-7.8mcMMAF的 疗效。在这个实验中，将人肾癌细胞RXF-393(0.5×106个细胞/小鼠)注入个体小鼠的侧腹中并且这些肿瘤允许未处理地生长直至它们达到100mm3的大致体积。然后将动物随机地分配到下面同龄组中：H16-7.8mcMMAF治疗组、H16-7.8治疗组以及5％右旋糖对照。通过静脉推注以10mg/kg的剂量每周一次地施用H16-7.8mcMMAF和H16-7.8持续共两个剂量。所施用的H16-7.8mcMMAF和H16-7.8的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150μL的剂量施用5％右旋糖对照。每3至4天使用测径器测量对肿瘤生长进行监测直至研究结束。将肿瘤体积计算为宽度×长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。当肿瘤达到约1000mm3时，将对照组动物人道地安乐处死。在处死之前对H16-7.8mcMMAF治疗组动物进行监测持续另外两周。
这些结果证明在所检查的所有剂量和方案下用H16-7.8mcMMAF治疗RFX-393人肾癌异种移植肿瘤导致SCID小鼠体内肿瘤生长的显著抑制。当两个对照组中的数据可供使用时在最后时间点使用具有α＝0.05的克鲁斯凯-沃利斯检验进行统计分析
图12.在SCID小鼠体内皮下建立的人肾癌SKRC-01中与H16-7.8mcMMAF相比较H16- 7.8的疗效研究。将人肾癌细胞SKRC-01(0.8×106个细胞/小鼠)注射到个体小鼠的侧腹中。这些肿瘤允许未处理地生长直至它们达到100mm3的大致体积。在第0天当肿瘤达到100mm3时，将动物随机地分配到下面同龄组中：H16-7.8mcMMAF治疗组、H16-7.8治疗组以及5％右旋糖对照。通过静脉推注每四天以4mg/kg的剂量施用H16-7.8mcMMAF和H16-7.8持续共四个剂量。所施用的H16-7.8mcMMAF和H16-7.8的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150μL的剂量施用5％右旋糖对照。每3至4天使用测径器测量来监测肿瘤生长。将肿瘤体积计算为宽度2×长度/2，其中宽度是最小的尺寸并且长度是最大的。
这些结果显示ADC H16-7.8mcMMAF显著地抑制了SKRC-01肿瘤形成的生长而裸MAbH16-7.8没有影响。因此，与裸抗体H16-7.8相比较，ADC H16-7.8mcMMAF具有显著地更突出的影响。
图13.在SCID小鼠体内皮下建立的UG-K3中与其他161P2F10B抗体药物偶联物 (ADC)相比较H16-7.8mcMMAF的疗效研究。在另一个实验中，将人肾癌细胞UG-K3(1.5×106个细胞/小鼠)注射到个体小鼠的侧腹中。这些肿瘤允许未处理地生长直至它们达到100mm3的大致体积。在第0天当肿瘤达到100mm3时，将动物随机地分配到下面同龄组中：H16-7.8mcMMAF、H16-7.8vcMMAE、以及H16-1.11mcMMAF、以及H16-1.11vcMMAE、PBS对照、以及对照MAb-vcMMAE治疗组中。在第0天以10mg/kg剂量将所有抗体药物偶联物(ADC)施用一次。所施用的每种ADC的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150μ/L的剂量施用PBS对照。每3至4天使用测径器测量对肿瘤生长进行监测。将肿瘤体积计算为宽度2×长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。
这些结果显示这些ADC H16-7.8vcMMAE和H16-1.11vcMMAE未抑制肿瘤形成生长。另外地，在第一个三十(30)天期间H16-7.8mcMMAF和H16-1.11mcMMAF两者都显著地抑制UG-K3肿瘤形成的生长。在第三十(30)天之后，当与H16-1.11mcMMAF相比较时，H16-7.8mcMMAF具有显著地更突出的影响。
图14.H16-7.8mcMMAF和H16-7.8的肽图。用二硫苏糖醇对得到的H16-7.8mcMMAF和H16-7.8进行处理用来还原二硫键，紧接着将得到的游离半胱氨酸烷基化。在这个步骤中使用胍来确保该蛋白完全变性。在透析以便去除胍之后，用特异性蛋白内切酶Lys-C对样品进行消化。Lys-C切割赖氨酸残基C端侧上的肽键。通过结合质谱法的反相层析法对得到的肽进行分析。在H16-7.8mcMMAF与H16-7.8之间对峰的反相保留时间和观察到的质核比进行比较。使用偶联到WATERS Q-TOFp质谱仪上的WATERS Acquity UPLC进行LC-MS(液相层析法-质谱法)分析。将消化的样品应用到YMC C18柱上并且用包含三氟乙酸的乙腈梯度进行洗脱。这些结果显示与天然抗体相比较在偶联的抗体中通过星号指示的峰强度是减少的。用箭头标记的峰表示在偶联的抗体肽图上出现的新峰。尤其地，用星号亦或用箭头标记的峰被认为对应地是指定用于偶联的肽以及得到的偶联肽。
图15.(*)峰的质谱图。这些结果显示在图14中用星号标记的峰的质谱图的一部分。在偶联期间改变的信号的质量值是通过“加号”符号指示的。具有大致m/z 970.4的这种肽(+3电荷状态)被鉴定为C225-K250，它是源于重链的铰链区并且包含预期的结合位点。
图16.在619.4m/z下在H16-7.8mcMMAF和H16-7.8的肽图上MSE的提取离子层析图 (XIC)。为了鉴别这些新出现的峰(这些峰被认为是上面图14中的偶联肽)，使用升高能量(MSE)数据采集技术来进行LC-MS分析。该图显示使用m/z 619.4针对H16-7.8mcMMAF和H16-7.8肽图的提取离子层析图(XIC)。该离子相应于药物部分的碎片离子。对于在图14中用箭头标记的峰而言在619.4下在XIC中观察到的峰几乎是完全相同的。此外，在天然抗体的层析图中未检测出这类峰。这些观察结果表明在m/z619.4下在XIC中检测的峰明显地是药物偶联肽并且是通过它完整的质量值来鉴别的。该结果汇总于表V中。这些结果表明在偶联物的情况下，主要的肽是在重链的铰链区上结合到2种药物上的那些。这些数据与通过其他正交例如DAR分析获得的数据相一致。
图17.示出了脱糖基化的H16-7.8mcMMAF ADC的质量图谱的实例谱图。通过电喷射离子化作用飞行时间(ESI-TOF)质谱术来确定脱糖基化的H16-7.8mcMMAF的完全质量。测试样品通过250mM磷酸钠缓冲液，pH7.5进行稀释，并且然后在37℃下与糖肽酶F一起孵化过夜。将样品注射到PLRPTM柱(Varian Technology)上，在90℃下平衡，并且用乙腈/水梯度进行洗脱。通过偶联到WATERS Synapt质谱仪(Waters)上的Acquity UPLC系统对样品峰进行分析，并且通过MaxEnt1软件从原始数据对质量进行重构。显示了针对脱糖基化的H16-7.8mcMMAF的一个实例的质谱谱图。主要的药物偶联的抗体是一种加载4-药物种类。包括在H16-7.8mcMMAF中富集未结合抗体的这种观察是与通过其他正交方法(例如，通过RP-HPLC得到DAR，肽谱、以及HIC测定法)获得的结果相一致的。
图18.H16-7.8mcMMAF的药物抗体比率(DAR)谱图。进行DAR分析用于定量HPLC确定每个轻链和重链中药物负荷的相对数量。使用PLRP-S分析柱，2.1mm×50mm，使用由2.0％甲酸组成的流动相A以及由2.0％甲酸加上90％乙腈组成的流动相B来进行DAR分析。显示了针对H16-7.8mcMMAF的代表性的DAR谱图。DAR值是4.0。使用本方法的相同HPLC条件对样品进行LC-MS分析用来鉴别观察到的峰。结果汇总于表VI中。通过LC-MS正交地证实了在该方法鉴定期间获得的DAR结果的峰识别。
具体实施方式
章节概要
I.)定义
II.)161P2F10B抗体
III.)通常的抗体药物偶联物
III(A).Auristatin和Dolostatin
IV.)结合161P2F10B的抗体药物偶联物
V.)接头单元
VI.)延伸物单元
VII.)氨基酸单元
VIII.)间隔物单元
IX.)药物单元
X.)药物加载
XI.)确定ADC的细胞毒性作用的方法
XII.)一种或多种癌症的治疗
XIII.)作为基于抗体治疗靶的161P2F10B
XIV.)161P2F10B ADC混合物
XV.)联合治疗
XVI.)制造试剂盒/物品
I.)定义：
除非另外定义，在此使用的所有技术术语、注释以及其他科学术语或科学术语是旨在具有本发明涉及领域普通技术人员所通常理解的含义。在一些情况中，为了清楚和/或为了便于引用在此定义了具有通常理解含义的术语，并且在此包括这类定义不必解释成表示与本领域通常理解的具有显著差异。在此说明或引用的许多技术和步骤被本领域普通技术人员良好地理解并且使用常规方法(例如在Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y中说明的广泛使用的分子克隆方法)一般性地使用。当适当时，除非另外说明，通常地根据制造商限定的实验方案和/或参数来执行涉及使用可商购的试剂盒和试剂的步骤。
当在此使用商品名称时，除非上下文另外指出，对商品名称的引用还涉及该商品名称产品的产品配方、属类药物、以及一种或多种活性药物成分。
术语“晚期癌症”、“局部晚期癌症”、“晚期疾病”以及“局部晚期疾病”是指延伸穿过相关组织被膜的癌症，并且是指包括在美国泌尿学会(AUA)系统下的阶段C疾病，在Whitmore-Jewett系统下的阶段C1-C2疾病，以及在TNM(肿瘤、结节、转移)系统下的阶段T3-T4和N+疾病。通常地，对于患有疾病晚期疾病的病人不推荐手术治疗，并且与具有临床局部化(器官限制)癌的病人相比较这些病人具有显著地更少有利的结果。
缩写“AFP”是指二甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸-对苯二胺(参见下文式XVI)。
缩写“MMAE”是指单甲基auristatin E(参见下文式XI)。
缩写“AEB”是指通过使auristatin E与对乙酰基苯甲酸进行反应所生产的一种酯(参见下文式XX)。
缩写“AEVB”是指通过使auristatin E与苯甲酰基缬草酸进行反应所生产的一种酯(参见下文式XXI)。
缩写“MMAF”是指多拉缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸(参见下文式XVIV)。
除外另外说明，术语“烷基”是指具有从约1至约20个碳原子(以及其中碳原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)的一种饱和的直链或支链烃，其中从约1至约8个碳原子是优选的。烷基基团的实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、以及3,3-二甲基-2-丁基。
烷基基团，无论单独地或作为另一个基团的一部分，可以用一个或多个基团，优选地1至3个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)可选地取代，包括但不限于-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2以及-CN，其中每个R’是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基，并且其中所述的-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、以及-C2-C8炔基基团可以用一个或多个基团可选地进一步取代，这些基团包括但不限于-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2以及-CN，其中每个R”是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。
除非另外说明，术语“烯基”和“炔基”是指具有从约2至约20个碳原子(以及其中碳原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)的直链或支链的碳链，其中从约2至约8个碳原子是优选的。烯基链在该链中具有至少一个双键并且炔基链在该链中具有至少一个三键。烯基基团的实例包括但不限于亚乙基或乙烯基、烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、以及-2,3-二甲基-2-丁烯基。炔基基团的实例包括但不限于炔性的、炔丙基、乙炔基、丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、以及-3-甲基-1丁炔基。
烯基和炔基基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，可以用一个或多个基团，优选地1至3个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)可选地取代，这些基团包括但不限于-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R’)2以及-CN，其中每个R’是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基，并且其中所述的-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、以及-C2-C8炔基基团可以用一个或多个取代基可选地进一步取代，这些基团包括但不限于-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2以及-CN，其中每个R”是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。
除非另外说明，术语“亚烷基”是指具有从约1至约20个碳原子的(以及其中碳原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)一种饱和的支链或直链烃基，其中从1至约8个碳原子在优选的并且具有通过从母体烷的同一个或两个不同碳原子中去除两个氢原子而得到的两个单价基团中心。典型的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、1,4-环亚己基等。亚烷基基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，可以用一个或多个基团，优选地1至3个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)可选地取代，这些基团包括但不限于-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2以及-CN，其中每个R’是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基，并且其中所述的-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、以及-C2-C8炔基基团可以用一个或多个取代基进一步可选地取代，这些取代基包括但不限于-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2以及-CN，其中每个R”是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。
除非另外说明，术语“亚烯基”是指包括至少一个碳-碳双键的一种任选取代的亚烷基基团。示例性的亚烯基基团包括例如亚乙烯基(-CH＝CH-)和亚丙烯基(-CH＝CHCH2-)。
除非另外说明，术语“亚炔基”是指包含至少一个碳-碳三键的一种任选取代的亚烷基基团。示例性的亚炔基基团包括例如亚乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)、以及4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡CH-)。
除非另外说明，术语“芳基”是指通过从母体芳环系统的一个单个碳原子中去除一个氢原子而得到的具有6-20个碳原子(以及其中碳原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)的一种单价芳香族烃基。在示例性结构中一些芳基基团表示为“Ar”。典型的芳基基团包括但不限于从苯、取代的苯、苯基、萘、蒽、联苯等衍生的基团。
芳基基团，无论单独地还是作为另一个具体的一部分，可以用一个或多个，优选地1至5个，或甚至1至2个基团可选地取代，这些基团包括但不限于-卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-NO2、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2以及-CN，其中每个R’是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基并且其中所述的-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、以及-芳基基团可以用一个或多个取代基进一步可选地取代，这些取代基包括但不限于-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2以及-CN，其中每个R”是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。
除非另外说明，术语“亚芳基”是指一种任选取代的芳基基团，该芳基基团是二价的(即，通过从母体芳环系统的同一个或两个不同碳原子中去除两个氢原子而衍生的)并且可以处于如下面结构中所示的邻、间、或对构象(使用苯基作为示例性芳基基团)。
典型的“-(C1-C8亚烷基)芳基”、“-(C2-C8亚烯基)芳基”、以及“-(C2-C8亚炔基)芳基”基团包括但不限于苄基、2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙烷-1-基等。
除非另外说明，术语“杂环”是指具有从3至14个环原子的(也称为环元件)(以及其中碳原子和杂原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)一种单环、二环、或多环的环系统，其中在至少一个环中至少一个环原子是选自N、O、P、或S的一种杂原子。该杂环可以具有从1至4个独立地选自N、O、P、或S的环杂原子。可以将杂环中的一个或多个N、C、或S原子氧化。单环杂环优选地具有3至7个环元件(例如，2至6个碳原子以及1至3个独立地选自N、O、P、或S的杂原子)，并且二环杂环优选地具有5至10个环元件(例如，4至9个碳原子以及1至3个独立地选自N、O、P、或S的杂原子)。包括该杂原子的环可以是芳香族的或非芳香族的。除非另外说明，该杂环在任何杂原子或导致稳定结构的碳原子处附连到它的悬垂基团上。
这些杂环在Paquette,“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968),particularly Chapters 1,3,4,6,7,and 9；“The Chemistry ofHeterocyclic Compounds,A series of Monographs”(John Wiley&Sons,New York,1950to present),特别是Volumes 13,14,16,19,and 28；andJ.Am.Chem.Soc.82:5566(1960)中进行说明
“杂环”基团的实例通过举例方式但非限制地包括吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、二氢吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、氮杂环辛基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、氧杂蒽基、吩恶噻、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹噁啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4H-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋吖基、吩噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、氧吲哚基、苯并噁唑啉基、以及靛红酰基。优选的“杂环”基团包括但不限于苯并呋喃基、苯并苯硫基、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、苯硫基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基以及四唑基。
杂环基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，可以用一个或多个基团，优选地1至2个基团可选地取代，这些基团包括但不限于-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2以及-CN，其中每个R’的独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基并且其中所述-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、以及-芳基基团可以用一个或多个取代基进一步可选地取代，这些取代基包括但不限于-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2以及-CN，其中每个R”的独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基。
作为举例但非限制地，碳结合杂环可以结合在下面位置处：吡啶的位置2、3、4、5、或6；哒嗪的位置3、4、5、或6；嘧啶的位置2、4、5、或6；吡嗪的位置2、3、5、或6；呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的位置2、3、4、或5；噁唑、咪唑或噻唑的位置2、4、或5；异噁唑、吡唑、或异噻唑的位置3、4、或5；氮丙啶的位置2或3；吖丁啶的位置2、3、或4；喹啉的位置2、3、4、5、6、7、或8；或异喹啉的位置1、3、4、5、6、7、或8。又更典型地，碳结合的杂化包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基、或5-噻唑基。
作为举例并且非限制地，氮结合的杂化可以结合在氮丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、或1H-吲唑的位置1；异吲哚或异二氢吲哚的位置2；吗啉的位置4；以及咔唑或β-咔啉的位置9。又更典型地，氮结合的杂化包括1-氮杂环丙基、1-氮杂环丁基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基、以及1-哌啶基。
除非另外说明，术语“碳环”是指具有从3至14个环原子(以及其中碳原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)一种饱和或不饱和的非芳香族单环、二环、或多环的环系统，其中这些环原子都是碳原子。这些单环碳环优选地具有3至6个环原子，又更优选5或6个环原子。二环碳环优选地具有例如安排为二环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统的7至12个环原子，或安排为二环[5,6]或[6,6]系统的9或10个环原子。术语“碳环”包括例如稠合到芳环上的单环碳环(例如，稠合到苯环上的单环碳环)。碳环优选地具有3至8个碳环原子。
这些碳环基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，可以用例如一个或多个基团，优选地1或2个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)可选地取代，这些基团包括但不限于-卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2以及-CN，其中每个R’是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基并且其中所述的-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、以及-芳基基团可以用一个或多个取代基进一步可选地取代，这些取代基包括但不限于-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-N3、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2以及-CN，其中每个R”是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。
单环碳环取代基的实例包括-环丙基、-环丁基、-环戊基、-1-环戊-1-烯基、-1-环戊-2-烯基、-1-环戊-3-烯基、环己基、-1-环己-1-烯基、-1-环己-2-烯基、-1-环己-3-烯基、-环庚基、-环辛基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环更三烯基、以及–环辛二烯基。
“碳环”，无论单独地还是作为另一个基团的部分使用，是指如上面定义的一种任选取代的碳环基团，该基团是二价的(即，通过从母体碳环系统的同一个或两个不同碳原子中去除两个氢原子而衍生的)。
除非上下文另外指出，短线(-)指示附连到悬垂分子上的点。因此，术语“-(C1-C8亚烷基)芳基”或“-C1-C8亚烷基(芳基)”是指如在此定义的一种C1-C8亚烷基，其中该亚烷基在该亚烷基碳原子的任何一个处附连到悬垂分子上并且结合到该亚烷基碳原子上的这些氢原子之一是用如在此定义的芳基替换的。
当一个特定的基团被“取代”时，该基团可以具有一个或多个取代基，优选地从一至五个取代基，更优选地从一只三个取代基，最优选地从一至两个取代基(独立地选自取代基列表)。然而，该基团通常可以具有任何数量选自卤素的取代基。还指示了被取代的基团。
所预期的是在分子中特定位置处任何取代基或变量的定义是独立于在该分子中别处的它的定义。应当理解的是本领域普通技术人员可以选择在本发明化合物上的取代基和取代模式从而提供化学稳定的并且可以通过本领域已知的技术以及在此列出的那些方法容易地合成的化合物。
如在此使用的保护基团是指选择性地阻断(临时地或永久地)多官能化合物中一个反应位点的基团。用于本发明的适当的羟基保护基团是药学上可接受的并且在施用到受试者体内之后可能需要或不需要从母体化合物上切割从而使该化合物有活性。切割是通过体内正常代谢过程。羟基保护基团是本领域熟知的，参见Protective Groups in Organic Synthesis by T.W.Greene and P.G.M.Wuts(John Wiley&sons,3rd Edition)(通过引用以其全部内容并且出于所有目的结合在此)，并且包括例如醚(例如，烷基醚类和甲硅烷基醚类包括例如二烷基甲硅烷基醚、三烷基甲硅烷基醚、二烷基烷氧基甲硅烷基醚)、酯、碳酸酯、氨基甲酸酯类、磺酸酯以及和磷酸酯保护基团。羟基保护基团的实例包括但不限于甲醚、甲氧基甲基醚、甲硫甲基醚、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基醚、苄氧甲基醚、对-甲氧基苄氧甲基醚、对-硝基苄氧甲基醚、邻-硝基苄氧甲基醚、(4-甲氧基苯氧基)甲基醚、愈创木酚甲基醚、叔-丁氧基甲基醚、4-戊烯基氧甲基醚、硅氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、2,2,2-三氯乙氧基甲基醚、双(2-氯乙氧基)甲基醚、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基醚、甲氧基甲基醚、四氢吡喃基醚、1-甲氧基环己基醚、4-甲氧基四氢硫吡喃基醚、4-甲氧基四氢硫吡喃基醚S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基醚、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基醚、1,4-二噁烷-2-基醚、四氢呋喃基醚、四氢硫呋喃基醚、取代的乙基醚类例如1-乙氧基乙基醚、1-(2-氯乙氧基)乙基醚、1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基醚、1-甲基-1-甲氧基乙基醚、1-甲基-1-苄氧乙基醚、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基醚、1-甲基-1-苯氧乙基醚、2-三甲基甲硅烷基醚、叔丁基醚、烯丙基醚、炔丙基醚类、对氯苯基醚、对甲氧基苯基醚、苄基醚、对甲氧基苄基醚、3,4-二甲氧基苄基醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、三丙基甲硅烷基醚、二甲基异丙基甲硅烷基醚、二乙基异丙基甲硅烷基醚、二甲基己基甲硅烷基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、二苯基甲基甲硅烷基醚、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯基乙酸酯、苯甲酸酯、烷基甲基碳酸酯、烷基9-芴基甲基碳酸酯、烷基乙基碳酸酯、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯、1,1,-二甲基-2,2,2-三氯乙基碳酸酯、烷基磺酸酯、甲磺酸酯、苄基磺酸酯、甲苯磺酸酯、亚甲基乙缩醛、亚乙基乙缩醛、乙基叔丁基亚甲基缩酮。优选的保护基团是通过下式表示的：-Ra、-Si(Ra)(Ra)(Ra)、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)NH(Ra)、-S(O)2Ra、-S(O)2OH、P(O)(OH)2、以及-P(O)(OH)ORa，其中Ra是C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-C6-C10芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)、或-C2-C20亚炔基(杂环)其中所述的烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、乙基杂环基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，是可选地取代的。
出于在此所述的目的“改变天然糖基化模式”旨在指删除一个或多个在天然序列161P2F10B中发现的碳水化合物部分(通过去除潜在的糖基化位点亦或通过用化学的和/或酶的手段来删除糖基化作用)，和/或添加一个或多个在天然序列161P2F10B中不存在的糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白糖基化中定性改变，涉及存在的不同碳水化合物部分的特性和比例的改变。
术语“类似物”是指在结构上是类似的或与另一个分子(例如，一种161P2F10B相关蛋白)共享类似的或对应的属性的分子。例如，可以通过特异性地结合到161P2F10B上的抗体或T细胞来特异性地结合161P2F10B蛋白的类似物。
除非另外清楚地指出，术语“抗体”是以最广义含义使用的。因此，“抗体”可以是天然发生的或人造的例如通过常规杂交瘤技术生产的单克隆抗体。161P2F10B抗体包括单克隆和多克隆抗体以及包含这些抗体的抗原结合域和/或一个或多个互补决定区的片段。如在此使用的，术语“抗体”是指特异性地结合161P2F10B和/或展示希望的生物活性的任何形式的抗体或其片段，并且尤其地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、乙基抗体片段，只要它们特异性地结合161P2F10B和/或展示希望的生物活性。在此提供的方法和组合物中可以使用任何特异性抗体。因此，在一个实施方案中术语“抗体”包括包含来自轻链免疫球蛋白分子的至少一个可变区以及来自重链分子至少一个可变区(它们结合地形成针对靶抗原的一个特异性结合位点)的一种分子。在一个实施方案中，该抗体是一种IgG抗体。例如该抗体是一种IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体。用于本方法和组合物的抗体可以在细胞培养物中，在噬菌体中，或在不同动物中产生，包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴、黑猩猩、猿。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体是一种哺乳动物抗体。噬菌体技术可以用于分离初始抗体或用于产生具有改变的特异性或亲和力特征的变异体。这类技术是常规的并且是本领域熟知的。在一个实施方案中，通过本领域已知的重组手段来生产该抗体。例如，可以通过用包含对抗体进行编码的DNA序列的载体转染宿主细胞来生产重组抗体。可以用一种或多种载体将表达至少一个VL和一个VH区的DNA序列转染到宿主细胞中。抗体产生和生产重组手段的示例性说明包括Delves,Antibody Production:Essential Techniques(Wiley,1997)；Shephard,et al.,Monoclonal Antibodies(Oxford University Press,2000)；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles And Practice(Academic Press,1993)；Current Protocols In Immunology(John Wiley&Sons,most recent edition)。可以通过重组手段来修饰本发明抗体用来在调节希望的功能中增加抗体疗效。因此，可以使用重组手段通过取代来修饰这些抗体是在本发明的范围内。典型地，这些取代可以是保守取代。例如，可以用不同残基来替换该抗体恒定区中至少一个氨基酸。参见，例如美国专利号5,624,821、美国专利号6,194,551、申请号WO 9958572、乙基Angal,et al.,Mol.Immunol.30:105-08(1993)。氨基酸中的修饰包括氨基酸的缺失、添加、以及取代。在一些情况中，可以制造这类改变用来减少不希望的活性，例如补体依赖性细胞毒性。常见地，通过共价地异或非共价地连接提供可检出信号的物质来对抗体进行标记。广泛多样的标记和结合技术是已知的并且广泛地报告于科学以及专利文献两者中。可以针对结合到正常的或缺陷的161P2F10B对这些抗体进行筛选。参见例如Antibody Engineering:A Practical Approach(OxfordUniversity Press,1996)。可以用下面体外测定法(包括但不限于：增殖、迁移、附着、软琼脂生长、血管发生、细胞-细胞通讯、凋亡、运输、信号转导、内化作用、抗体介导的二次杀伤)以及下面的体内测定法(例如抑制肿瘤生长)鉴别出具有希望的生物活性的适当抗体。在此提供的抗体可以用作ADC的中间体。在此提供的抗体还可以用于诊断应用。关于捕获或非中和性抗体，可以针对结合到特异性抗体上而不抑制抗原的受体结合或生物活性的能力对它们进行筛选。关于中和性抗体，这些抗体可以用于竞争性结合测定中。它们还可以用于定量161P2F10B或它的受体。
如在此使用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗体片段”(或简单地“抗体部分”)是指保留特异性地结合到抗原(例如，161P2F10B；图1)上的能力的161P2F10B抗体的一个或多个片段。已经显示的是可以通过全长抗体的片段来实现抗体的抗原结合功能。包括在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)一个Fab片段、由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的一个单价片段；(ii)一个F(ab')2片段、包括在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的一个二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的一个Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的一个Fv片段；(v)一个dAb片段(Ward,et al.(1989)Nature 341:544-546)，该片段由VH结构域组成；以及(vi)一个分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH，是针对分离的基因编码的，它们可以使用重组方法通过使它们能够制造成单个蛋白链的合成接头进行连接，其中该VL和VH区配对从而形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird,et al.(1988)Science 242:423-426；以及Huston,et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这类单链抗体还旨在包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内。使用本领域普通技术人员已知的常规技术来获得这些抗体片段，并且为了以与完整抗体同样方式进行使用对这些片段进行筛选。
如在此使用的，可以使用任何形式的“抗原”来产生对161P2F10B具有特异性的抗体。因此，提出的抗原可以是一个单个表位、多表位、或单独地整个蛋白或与本领域已知的一个或多个免疫原性增强剂相结合。提出的抗原可以是一种分离的全长蛋白、一种细胞表面蛋白(例如，用转染有该抗原至少一部分的细胞进行免疫)、或可溶性蛋白(例如，仅用该蛋白的细胞外结构域部分进行免疫)。可以在基因修饰的细胞中生产该抗原。编码该抗原的DNA抗原是基因组的或非基因组的(例如，cDNA)并且编码该细胞外结构域的至少一部分。如在此使用的，术语“部分”是指当适当时用于构成感兴趣抗原的免疫原性表位的最小数量的氨基酸或核酸。可以使用适合用于转化感兴趣细胞的任何遗传载体，包括但不限于腺病毒载体、质粒、以及非病毒载体，例如阳离子脂类。在一个实施方案中，在此所述的方法和组合物的抗体特异性地结合感兴趣的161P2F10B的细胞外结构域的至少一部分。
在此提供的抗体或其抗原结合片段可以结合到一种“生物活性剂”上。如在此使用的，术语“生物活性剂”是指结合该抗原和/或增强或调节用来增强杀死细胞毒素的希望的生物学作用的任何合成的或天然发生的化合物。在一个实施方案中，用于本发明的结合片段是生物学活性的片段。如在此使用的，术语“生物学活性”是指能够结合希望的抗原表位以及直接地或间接地发挥生物学作用的抗体或抗体片段。直接的作用包括但不限于调节、刺激、和/或抑制生长信号；调节、刺激、和/或抑制抗凋亡信号；调节、刺激、和/或抑制凋亡或坏死信号；调节、刺激、和/或抑制ADCC级联；以及调节、刺激、和/或抑制CDC级联。
在此所述的单克隆抗体尤其地包括“嵌合体”抗体，其中该重链和/或轻链的一部分与从特定种类得到的抗体中相应序列是完全相同的或同源的或属于特定的抗体类别或亚类，而该一个或多个链的剩余部分与从另一个种类中得到的抗体中相应序列是完全相同的或同源的或属于另一个抗体类别或亚类，以及这类抗体的片段，只要它们特异性地结合靶抗原和/或展示希望的生物活性(美国专利号4,816,567；以及Morrison,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
术语“化学治疗剂”是指在抑制肿瘤生长中有效的所有化合物。化学治疗剂的非限制性实例包括烷基化剂类；例如，氮芥、乙烯亚胺化合物类以及烷基磺酸酯类；抗代谢物类，例如，叶酸、嘌呤或，嘧啶拮抗剂类；有丝分裂抑制剂类，例如，抗微管蛋白剂类例如长春花生物碱类、auristatin类以及鬼臼毒素的衍生物类；细胞毒性抗生素类；损害或干扰DNA表达或复制的化合物类，例如DNA小沟结合剂类；以及生长因子受体拮抗剂类。另外地，化学治疗剂类包括细胞毒性剂类(如在此定义的)、抗体类、生物分子类、以及小分子类。
术语“化合物”是指并且包括该化合物本身以及下面那些，无论明确地说明与否，并且除非上下文清楚地表明将下面各项排除在外：化合物的无定形和结晶形式，包括多态性形式，其中这些形式可以是混合物的部分或处于分离形式；该化合物的游离酸和游离碱形式，它们典型地是以在此提供的结构显示的形式；给化合物是同分异构体，它是指光学异构体、以及互变异构体，其中光学异构体包括对映异构体和非对映异构体，手性异构体和非手性异构体，并且这些光学异构体包括分离的光学异构体以及包括消旋和非消旋混合物的光学异构体的混合物；其中同分异构体可以处于分离形式或处于与一个或多种其他同分异构体的混合物形式；该化合物的同位素类，包括包含氘核氚的化合物，并且包括包含放射性同位素的化合物，包括治疗和诊断有效的放射性同位素；该化合物的多体形式，包括二体、三体、等形式；该化合物的盐类，优选药学上可接受的盐类、包括酸加成盐类和碱加成盐类，包括具有有机反粒子和无机反离子的盐类，并且包括两性离子形式，其中如果化合物与一种或多种反离子相结合，该两个或更多个反离子可以是相同的或不同的；以及该化合物的溶剂化物类，包括半溶剂化物类、单溶剂化物类、二溶剂化物类等，包括有机溶剂化物类和无机溶剂化物类，所述无机溶剂化物类包括水合物类；其中如果化合物与两种或更多种溶剂分子相结合，该两种或更多种溶剂分子可以是相同的或不同的。在一些实例中，在此提及的本发明的化合物可以包括明确地提及上述形式的一种或多种，例如盐类和/或溶剂化物类，然而这种提及仅用于强调，并不应解释为将上面鉴定的其他上述形式排除在外。
术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞表达活性、细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素类、化学治疗剂类、以及毒素类例如细菌、真菌、植物或动物起源的小分子毒素类或酶活性毒素类，包括它们的片段和/或变异体。细胞毒性剂类的实例包括但不限于auristatin类(例如，auristatin e、auristatin f、MMAE和MMAF)、金霉素类、类美坦辛类、蓖麻蛋白、蓖麻蛋白A链、考布他汀、多卡米星类、多拉司他汀类、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇类、顺铂、cc1065、溴乙啶、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、白树毒素、丝裂吉霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、加利车霉素、肥皂草抑制剂、以及糖皮质激素和其他化学治疗剂类，以及放射性同位素类例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32以及Lu的放射性同位素包括Lu177。这些抗体还可以结合到能够将该药物前体转化成其活性形式的抗癌性药物前体活性酶上。
在161P2F10B结合剂对表达161P2F10B细胞影响的背景中，术语“去除”是指减少表达161P2F10B细胞的数量或消除这些细胞。
在此使用“基因产物”是指一种肽/蛋白或mRNA。例如，“本发明的基因产物”有时在此是指“癌氨基酸序列”、“癌蛋白”、“表I中列出癌症的蛋白”、“癌mRNA”、“表I中列出癌的mRNA”等。在一个实施方案中，该癌蛋白是通过图1的核酸来编码的。该癌蛋白可以是一种片段，或可替代地，是通过图1的核酸编码的全长蛋白。在一个实施方案中，使用癌氨基酸序列来确定序列一致性或相似性。在另一个实施方案中，这些序列是通过图1的核酸编码蛋白的天然发生的等位基因变异体。在另一个实施方案中，这些序列是如在此进一步说明的序列变异体。
这些“杂偶联”抗体用于本发明方法和组合物中。如在此使用的，术语“杂偶联抗体”是指两个共价连接的抗体。可以使用合成蛋白化学中已知方法来制备这类抗体，包括使用交联剂类。参见例如美国专利号4,676,980。
术语“同系物”是指展示与另一种分子同源性的分子，通过举例，它具有在对应的位置上是相同的或类似的化学残基的序列。
在一个实施方案中，在此提供的抗体是一种“人类抗体”。如在此使用的，术语“人类抗体”是指一种抗体，其中该轻链和重链序列的基本上整个序列，包括互补决定区(CDR)，是来自人类基因。在一个实施方案中，通过三源杂交瘤技术，人类B细胞技术(参见例如，Kozbor,et al.,Immunol.Today 4:72(1983),EBV transformation technique(see,e.g.,Cole,et al.Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy 77-96(1985))，或使用噬菌体展示(参见例如，Marks,et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))来制备这些人类单克隆抗体。在一个具体实施方案中，在转基因小鼠体内来产生该人类抗体。用于制造这类部分地至全部地人类抗体的技术是本领域已知的并且可以使用任何这类技术。根据一个特别优选的实施方案，在被工程化用于表达人类重链和轻链抗体基因的转基因小鼠体内制造完全的人类抗体序列。制备生产人类抗体的转基因小鼠的示例性说明发现于申请号WO02/43478以及美国专利6,657,103(Abgenix)和它的子代专利中。然后可以将来自生产希望抗体的转基因小鼠的B细胞融合用来制造用于连续生产该抗体的杂交瘤细胞系。参见例如，美国专利号5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、和5,545,806；以及Jakobovits,Adv.DrugDel.Rev.31:33-42(1998)；Green,et al.,J.Exp.Med.188:483-95(1998)。
如在此使用的术语“抑制”或“抑制作用”是指降低可测量数量，或是指完全阻止。
适当的“标签类”包括放射性核素类、酶类、底物类、辅因子类、抑制剂类、荧光部分类、化学发光部分类、磁性颗粒类等。传授这类标签用途的专利包括美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149、以及4,366,241。此外，在此提供的抗体可以用作荧光体的抗原结合部分。参见例如，Zeytun,et al.,Nat.Biotechnol.21:1473-79(2003)。
术语“转移癌症”和“转移性疾病”是指已经扩展到局部淋巴结或扩展至远侧位点的癌症，并且旨在包括在AUA系统下的阶段D疾病和在TNM系统下的阶段TxNxM+。
如在此使用的术语“调节剂”或“测试化合物”或“药物候选物”或“语法上的等效物”说明用于测试直接地或间接地改变癌症表型或癌症序列(例如核酸或蛋白序列)表达的能力、或癌症序列作用(例如，信号传导、基因表达、蛋白相互作用等)的任何分子，例如蛋白、寡肽、小有机分子、多糖、多核苷酸等。一方面，调节剂可以中和本发明癌蛋白的作用。“中和”一词是指连同细胞上最终作用一起抑制或阻断蛋白活性。另一方面，调节剂可以通过使所述蛋白水平正常化来中和本发明的基因、及其相应蛋白的作用。在优选实施方案中，这些调节剂改变表达谱、或在此提供的核酸或蛋白的表达谱，或下游效应子途径。在一个实施方案中，该调节剂抑制癌症表型例如至正常组织指纹。在另一个实施方案中，调剂剂诱导癌症表型。总体上，与不同试剂浓度平行地运行多个测定混合物用来获得对不同浓度的不同应答。典型地，这些浓度之一用作阴性对照，即在零浓度下或低于检测水平。
这些调节剂、药物候选物、或测试化合物包括多个化学类别，虽然典型地它们是有机分子，优选地具有大于100并且小于约2,500道尔顿分子量的小型有机分子。优选的小分子是小于2000、或小于1500或小于1000或小于500D。这些候选剂包括对于与蛋白结构性相互作用(具体地是氢键)所必需的官能团，并且典型地包括至少一个胺、羰基、羟基、或羧基基团，优选这些功能性化学基团的至少两个。这些候选剂通常包括用一种或多种上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳香族或多芳香族结构。这些调节剂还包括生物分子类例如肽类、糖类、脂肪酸类、类固醇类、嘌呤类、嘧啶类、衍生物类、结构类似物类或它们的组合。特别优选的是肽类。一类调节剂是例如具有从约5至约35个氨基酸的肽类，其中从约5至约20个氨基酸是优选的，并且从约7至约15是特别优选的。优选地，癌调节蛋白是可溶的，包括非跨膜区，和/或使N端Cys来有助于溶解度。在一个实施方案中，该片段的C端以游离酸的形式来保持并且N端是游离胺用来有助于偶联到例如半胱氨酸上。在一个实施方案中，本发明的癌蛋白偶联到在此讨论的免疫原性剂上。在一个实施方案中，该癌蛋白偶联到BSA上。本发明的肽类(例如具有优选长度)可以连接到彼此上或连接到其他氨基酸上用来产生更长的肽/蛋白。这些调节肽类可以是上面列出的天然发生的蛋白的消化物类、随机肽类、或“偏置的”随机肽类。在一个优选实施方案中，这些基于肽/蛋白的调节剂是如在此定义的抗体类、以及它们的片段。
如在此使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的一个群体获得的抗体，即包括该群体的单独抗体是完全相同的除了能够以少量存在的可能的天然发生的突变之外。单克隆抗体是高度特异性的，是针对单个抗原表位。相反地，常规的(多克隆)抗体制剂典型地包括针对不同表位(或对其具有特异性)的多种抗体。在一个实施方案中，该多克隆抗体包含在包含多个抗原性表位的单个抗原中具有不同表位特异性、亲和性、或亲和力的多个单克隆抗体。修饰语“单克隆的”是指如从抗体的基本上均质群体中获得的抗体特征，并且不应解释成要求通过任何特定方法来生产该抗体。例如，根据本发明有待使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler,et al.,Nature 256:495(1975)说明的杂交瘤方法来制造，或可以通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)来制造。还可以使用例如在Clackson,et al.,Nature 352:624-628(1991)和Marks,et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中说明的技术从噬菌体抗体文库中分离这些“单克隆抗体”。这些单克隆抗体通常地可以以至少约1μM的Kd，更通常地至少约300nM，典型地至少约30nM，优选地至少约10nM，更优选地至少约3nM或更好地进行结合(通常地通过ELISA进行确定)。
“药用赋形剂”包括一种材料，例如一种佐剂、一种载体、pH调节和缓冲剂类、张力调节剂类、湿润剂类、防腐剂等。
“药学上可接受的”是指一种无毒物、惰性物、和/或与人类或其他哺乳动物生理相容的组合物。
术语“多核苷酸”是指具有至少10个碱基或碱基对长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸亦或脱氧核苷酸或两种核苷酸之一类型的修饰形式，并且是指包括DNA和/或RNA的单链或双链形式。在本领域中，该术语通常可与“寡核苷酸”互换地使用。多核苷酸可以包括在此披露的核苷酸序列，其中胸苷(T)(例如在图1中所示)还可以是尿嘧啶(U)；这个定义与DAN和RNA化学结构之间的差异相关，特别是观察到RNA中四种主要碱基之一是尿嘧啶(U)而不是胸苷(T)。
术语“多肽”是指具有至少约4、5、6、7、或8个氨基酸的聚合物。贯穿本说明书，使用氨基酸的标准三字母或单字母命名。在本领域中，该术语通常与“肽”或“蛋白”可互换地使用。
“重组体”DNA或RNA分子是在体外经受分子操纵的DNA或RNA分子。
如在此使用的，术语“特异性”、“特异性地结合”以及“特异地结合”是指该抗体选择性地结合到靶抗原表位上。可以通过将在一组给定的条件下结合到适当抗原上与结合到无关抗原或抗原混合物上进行比较，针对结合特异性对抗体进行测试。如果该抗体比无关抗原或抗原混合物高至少2、5、7、以及优选地10倍地结合到适当抗原上，则它被认为是特异性的。在一个实施方案中，特异性抗体是结合该161P2F10B相关抗原(具体地161P2F10B)，但是不结合到无关抗原上的抗体。
如在此使用的，“用于治疗”或“治疗的”以及语法上相关的术语，是指疾病任何结果的任何改进，例如延长的存活率、更低的发病率、和/或减轻副作用(这些副作用是可替代的治疗形式的副产物)，如本领域中容易理解的，完全消除疾病是优选的尽管对于治疗活动不是必要的。
“161P2F10B相关的蛋白”包括在此具体指出的那些(参见，图1)，以及等位基因变异体、保守取代的变异体、已经分离/产生并且不是按照在此列出的或本领域可容易地得到的方法用不适当的实验表征的类似物和同系物。还包括结合了不同161P2F10B蛋白的多个部分或它们片段的融合蛋白，以及161P2F10B蛋白和异源多肽的融合蛋白。这类161P2F10B蛋白统称为161P2F10B相关蛋白，本发明的蛋白，或161P2F10B。术语“161P2F10B相关蛋白”是指具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或多于25个氨基酸；或至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、330、335、339或更多氨基酸的多肽片段或161P2F10B蛋白序列。
II.)161P2F10B抗体
本发明用于ADC的抗体在生理条件下特异性地结合到161P2F10B蛋白上并且不结合(或较弱地结合)到不是161P2F10B相关蛋白的肽或蛋白上。
用于制备抗体(尤其是单克隆抗体)的不同方法是本领域熟知的。例如，可以通过用处于分离的或免疫偶联形式的161P2F10B相关蛋白、肽、或其片段免疫适当的哺乳动物宿主来制备这些抗体(Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press,Eds.,Harlow,andLane(1988)；Harlow,Antibodies,Cold Spring Harbor Press,NY(1989))。此外，还可以使用161P2F10B的融合蛋白，例如161P2F10B GST-融合蛋白。在一个具体实施方案中，生产出包括所有或大多数图1氨基酸序列的GST融合蛋白，并且然后用作免疫原用来产生适当的抗体。在另一个实施方案中，合成一种161P2F10B相关蛋白并且用作免疫原。
此外，使用本领域已知的裸DNA免疫技术(使用或不使用纯化的161P2F10B相关蛋白或表达161P2F10B的细胞)用来产生对编码的免疫原的免疫应答(关于综述，参见Donnelly,et al.,1997,Ann.Rev.Immunol.15:617-648)。
可以对图1中所示的161P2F10B蛋白的氨基酸序列进行分析用来选择用于产生抗体的161P2F10B蛋白的特异性区域。例如，使用161P2F10B氨基酸序列的疏水性和亲水性分析来鉴别161P2F10B结构中的亲水性区域。可以使用本领域已知的多种其他方法例如Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf分析容易地鉴别显示免疫原性结构的161P2F10B蛋白的区域以及其他区域和结构域。可以使用Hopp,T.P.and Woods,K.R.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824-3828的方法来产生亲水性谱图。可以使用Kyte,J.and Doolittle,R.F.,1982,J.Mol.Biol.157:105-132的方法来产生亲水性谱图。可以使用Janin J.,1979,Nature 277:491-492的方法来产生可接触残基百分比(％)谱图。可以使用Bhaskaran R.,Ponnuswamy P.K.,1988,Int.J.Pept.Protein Res.32:242-255的方法来产生平均柔性谱图。可以使用Deleage,G.,Roux B.,1987,Protein Engineering 1:289-294的方法来产生β折叠谱图。因此，通过这些程序或方法的任何一种鉴别的每个区域都在本发明的范围内。通过在此提供的实例进一步说明了用于产生161P2F10B抗体的优选方法。用于制备用作免疫原的蛋白或多肽的方法是本领域熟知的。本领域还熟知的是用于制备蛋白与载体(例如BSA、KLH或其他载体蛋白)的免疫原性偶联物的方法。在一些情况中，使用直接偶联(例如使用碳二亚胺试剂)；在其他情况中连接剂例如通过Pierce Chemical Co.,Rockford,IL提供的那些是有效的。如本领域应当理解的，通过在适当时间期间内进行注射并且通过使用适当佐剂来进行161P2F10B免疫原的施用。在免疫方案期间，可以取得抗体滴度用来确定足够抗体形成。
在一个优选的实施方案中，用于本发明ADC的161P2F10B MAb包括命名为H16-7.8的抗体的重链和轻链可变区(参见图3)，或包含与H16-7.8的重链和轻链可变区的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链或轻链可变区，并且其中这些抗体保留本发明161P2F10B MAb的希望的功能特性(特别是与161P2F10B的结合活性)。H16-7.8的重链可变区由SEQ ID NO:7的范围从第20位Q残基至第142位残基的氨基酸序列组成，并且H16-7.8的轻链可变区由SEQ ID NO:8的范围从第20位E残基至第127位R残基的氨基酸序列组成。关于本发明抗体的恒定区，可以选择恒定区的任何亚类。优选地，可以使用人类IgG2恒定区作为该重链恒定区并且人类Igκ恒定区作为该轻链恒定区。可以使用161P2F10B蛋白、表达161P2F10B的细胞或它们的提取物，通过多种熟知手段(包括蛋白质印迹、免疫沉淀法、ELISA、以及FASC分析)来建立161P2F10B MAb与61P2F10B蛋白的反应性(结合活性)。
在一个实施方案中，CH1的铰链区被修饰使得该铰链区中的半胱氨酸残基的数量得以改变，例如增加或减少。在美国专利号5,677,425中由Bodmer等人对这种方法进行进一步说明。将CH1铰链区中半胱氨酸数量改变用来例如有助于组装轻链和重链，或用来增加或降低161P2F10B MAb的稳定性。
在另一个实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变用来降低161P2F10B MAb的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc–铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中使得该抗体具有相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合受损的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合。在授予Ward等人的美国专利号6,165,745中对该方法进行进一步详细说明。
在另一个实施方案中，对161P2F10B MAb进行修饰用来增加其生物半衰期。不同的方法是可能的。例如，可以如授予Ward的美国专利号6,277,375中所述引入突变。可替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区域中对抗体进行改变用来包含从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环取得的拯救受体结合表位(如授予Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述)。
在其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基对Fc区进行改变用来改变161P2F10B MAb的一个或多个效应物功能。例如，可以用不同氨基酸残基来替换选自氨基酸特异性残基的一个或多个氨基酸使得该抗体对于效应物配体具有改变的亲和性但是保留母体抗体的抗原结合能力。其亲和性被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。在美国专利号5,624,821和5,648,260(两者都授予Winter等人)中对这种方法进行进一步详细说明。
在一个实施方案中，通过本领域已知的重组手段来生产用于本发明ADC的抗体。例如，可以通过用包含对该抗体进行编码的DNA序列的载体转染宿主细胞来生产重组体抗体。可以使用一种或多种载体来将表达至少一个VL和一个VH区的DNA序列转染到该宿主细胞中。抗体产生和生产的重组体手段的示例性说明包括Delves,ANTIBODY PRODUCTION:ESSENTIAL TECHNIQUES(Wiley,1997)；Shephard,et al.,Monoclonal Antibodies(OxfordUniversity Press,2000)；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles And Practice(Academic Press,1993)；Current Protocols In Immunology(John Wiley&Sons,mostrecent edition)。
可以使用本领域通常已知的方法，基于在此频率的它们的重链可变区和轻链可变区上的序列信息，由本领域普通技术人员容易地制备用于本发明ADC的抗体。具体地，制备出具有对本发明ADC抗体的重链可变区氨基酸进行编码的碱基序列的重链可变区基因片段(SEQ ID NO:7，从20至142)，以及具有对本发明ADC抗体的轻链可变区氨基酸进行编码的碱基序列的轻链可变区基因片段(SEQ ID NO:8，从20至127)。然后，将这些可变区基因连接到处于适当种类人类抗体中的恒定区基因上用来制备抗体基因。接着，将该抗体基因连接到适当的表达载体上，并且引入到培养细胞中。最后，对这种培养细胞进行培养，由此可以从培养物上清液中获得该抗体。
可以使用本领域通常已知的基因合成方法，通过基于在重链和轻链可变区氨基酸序列的基础上(SEQ ID NO:7，从20至142以及SEQ ID NO:8，从20至127)或在本发明抗体的重链和轻链可变区碱基序列的基础上(通过SEQ ID NO:4，从91至459以及SEQ ID NO:6，从100至423显示的)设计的碱基序列来制备对本发明抗体的重链和轻链可变区氨基酸进行编码的上述可变区基因片段的每一个(SEQ ID NO:7，从20至142以及SEQ ID NO:8，从20至127)。因为这样一种基因合成方法，多种方法对于本领域普通技术人员而言是明显的，可以使用例如在WO90/07861中说明的抗体基因合成方法。接下来，将上述可变区基因片段和人类抗体的恒定区基因连接用来制备一种抗体基因。虽然可以选择任何亚类的恒定区作为所使用的人类抗体的恒定区，可以优选地使用人类Ig[γ]2作为重链恒定区，并且人类Ig[κ]作为轻链恒定区。
关于通过连接重链可变区基因(通过SEQ ID NO:7显示的，从20至142)和人类Ig[γ]2重链恒定区基因而获得的针对本发明ADC的抗体的优选抗体重链基因，可以提及包括对通过SEQ ID NO:7，从20至468显示的氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因，更优选地包括通过SEQ ID NO:4从91至1437显示的碱基序列的基因。关于通过连接轻链可变区基因(通过SEQ ID NO:8显示的，从20至127)和人类Ig[κ]轻链恒定区基因而获得的针对本发明ADC抗体的优选抗体轻链基因，可以提及包括对通过SEQ ID NO:8，从20至233显示的氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因，更优选地包括通过SEQ ID NO:6，从100至741显示的碱基序列的基因。关于通过包括通过SEQ ID NO:4，从91至1437显示的碱基序列的重链基因和包括通过SEQ ID NO:6，从100至741显示的碱基序列的轻链基因编码的针对本发明ADC的抗体，可以提及在下面实例中所述的H16-7.8。
在制备这种抗体基因之后，可以通过使用本领域通常已知的不同方法来完成将该抗体基因引入到表达载体中，将该表达载体引入到培养细胞中，对这些培养细胞进行培养，对抗体进行纯化等。该表达载体不受限制，只要它能够表达该抗体基因即可。优选的是使用已经具有人类Ig恒定区基因例如AG-[γ]2或AG-[κ]的表达载体，因为当将抗体可变区基因插入其中时它可以容易地变成具有抗体基因的表达载体。
通过例如磷酸钙方法等将上述表达载体引入扫培养细胞中。作为表达载体引入其中的培养细胞的举例，基团是使用多种培养细胞例如CHO细胞，并且它们可以通过常规方法进行培养。在上述培养之后，在培养物上清液中累积的抗体可以使用蛋白A柱通过例如不同层析法进行纯化。
可以使用(适当时)161P2F10B蛋白、表达161P2F10B的细胞或它们的提取物，通过多种熟知手段(包括蛋白质印迹、免疫沉淀法、ELISA、以及FACS分析)来建立使用161P2F10B蛋白这样获得的161P2F10B抗体的反应性(结合活性)。这样获得的抗体或由于该抗体根据需要被进一步纯化之后保留活性的抗体片段可以制备成针对ADC的抗体。161P2F10B抗体或其片段可以标记有一种可检出标志物或偶联到一个第二分子上。适当的可检出标志物包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。进一步地，使用本领域通常已知的方法来产生对两个或更多个161P2F10B表位具有特异性的抗体。还可以通过本领域已知的交联技术来产生同源二聚体抗体(例如，Wolff,et al.,Cancer Res.53:2560-2565)。
在又另一个优选实施方案中，用于本发明ADC的161P2F10B MAb是包括命名为H16-7.8的抗体的重链和轻链的抗体。H16-7.8的重链由SEQ ID NO:7的范围从第20位Q残基至第468位K残基的氨基酸序列组成并且H16-7.8的轻链由SEQ ID NO:8序列的范围从第20位E残基至第233位C残基的氨基酸序列组成。它们的序列在图2和图3中列出。在一个优选实施方案中，H16-7.8偶联到一种细胞毒性剂上。
III.)通常的抗体-药物偶联物
另一方面，本发明提供抗体-药物偶联物(ADC)，这些偶联物包括偶联到细胞毒性剂例如MMAF上的抗体。另一方面，本发明进一步提供了使用这些ADC的方法。一方面，ADC包括共价地附连到细胞毒性剂上的上述161P2F10B MAb中任何一种。
这些抗体-药物偶联物用于局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂(即，用来杀死或抑制肿瘤细胞用来治疗癌症的药物(Syrigos and Epenetos(1999)Anticancer Research19:605-614；Niculescu-Duvaz and Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26:151-172；美国专利4,975,278))的用途允许将药物部分靶向递送到肿瘤中，并且细胞内累积于其中，其中全身性施用这些未偶联药剂可能导致对于正常细胞以及寻找以被消除的肿瘤细胞不可接受水平的毒性(Baldwin,et al.,(1986)Lancet pp.(Mar.15,1986):603-05；Thorpe,(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,”inMonoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera,etal.(ed.s),pp.475-506)。由此寻找具有最小毒性的最大疗效。已经报道多克隆抗体和单克隆抗体两者在这些策略中是有用的(Rowland,et al.(1986)CancerImmunol.Immunother.,21:183-87)。在这些方法中使用的药物包括道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、以及长春地辛(Rowland,et al.,(1986)所述)。在抗体-毒素偶联物中使用的毒素包括细菌毒素类例如白喉毒素，植物毒素类例如蓖麻蛋白，小分子毒素类例如格尔德霉素(Mandler,et al.(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler,etal.(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler,et al.(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791),类美坦辛类(EP 1391213；Liu,et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623),以及加利车霉素(Lode,et al.(1998)CancerRes.58:2928；Hinman,et al.(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。这些毒素可以通过多种机理(包括微管蛋白结合、DNA结合、或拓扑异构酶抑制)来影响它们的细胞毒性和细胞抑制性作用。当偶联到较大抗体或蛋白受体配体上时一些细胞毒性药物倾向于失活或具有更少活性。
抗体药物偶联物的实例是(替伊莫单抗，Biogen/Idec)，它是一种抗体-放射性同位素偶联物，包括针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上找到的CD20抗原和通过硫脲连接剂-螯合剂结合的111In或90Y放射性同位素的一种鼠类IgG1κ单克隆抗体(Wiseman,et al.(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77；Wiseman,et al.(2002)Blood 99(12):4336-42；Witzig,et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(10):2453-63；Witzig,et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(15):3262-69)。
另外地，在2000年已经批准MYLOTARGTM(吉姆单抗奥佐米星，WyethPharmaceuticals)(一种抗体药物偶联物，包括连接到加利车霉素上的一种hu CD33抗体)用于通过注射来治疗急性髓样白血病(Drugs of the Future(2000)25(7):686；美国专利号4970198、5079233、5585089、5606040、5693762、5739116、5767285、以及5773001)。
此外，莫坎妥珠单抗(Immunogen,Inc.)(由通过二硫键SPP连接到类美坦辛药物部分(DM1)上的huC242抗体组成的抗体药物偶联物)正进入用于治疗表达CanAg的癌症(例如，结肠、胰、胃以及其他)的II期试验。
此外，MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)(一种抗体药物偶联物，包括连接到类美坦辛药物部分(DM1)上的抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体)处于用于潜在治疗前列腺肿瘤的开发中。
最后，这些auristatin肽，auristatin E(AE)以及单甲基auristatin(MMAE)、多拉司他汀的合成类似物偶联到嵌合体单克隆抗体cBR96(对于癌上的路易斯Y具有特异性)和cAC10(对于血液性恶性肿瘤具有特异性)上(Doronin,et al.(2003)NatureBiotechnology 21(7):778-784)并且处于治疗研发中。
III(A).Auristatin和多拉司他汀
多拉司他汀类和auristatin类已经显示干扰微管动力性、GTP水解、以及细胞核和细胞分裂(Woyke,et al.(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌症(US 5663149)和抗真菌活性(Pettit,et al.(1998)Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965)。该多拉司他汀或auristatin药物部分可以通过该肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端附连到该抗体上(WO 02/088172)。
示例性的auristatin实施方案包括在Senter,et al,“Proceedings of theAmerican Association for Cancer Research,”Volume 45,Abstract Number 623,andpresented March 28,2004中披露的N端连接的单甲基auristatin药物部分DE和DF，其披露的内容通过引用全部明确地结合在此、
示例性的auristatin实施方案是MMAE(其中波浪线指示共价附连到抗体药物偶联物的接头(L)上)。
另一个示例性auristatin实施方案是MMAF，其中波浪线指示共价附连到抗体药物偶联物的接头(L)上(US 2005/0238649)：
包括MMAE或MMAF以及多种接头组分(在此进一步说明的)另外的示例性实施方案具有下面结构和缩写(其中Ab是指抗体并且p是1至约12)：
本发明的ADC包括MMAF。在优选实施方案中，本发明的ADC包括作为接头的马来亚胺己酰基(mc)和作为药物的MMAF。
IV.)结合161P2F10B的抗体-药物偶联物化合物
除了别的之外，本发明提供了用于靶向递送药物的抗体-药物偶联物化合物。诸位发明人已经发现这些抗体-药物偶联物化合物具有针对表达161P2F10B细胞的潜在的细胞毒性和/或细胞抑制活性。这些抗体-药物偶联物化合物包括共价地连接到至少一个药物单元上的一个抗体单元。这些药物单元可以直接地或通过一个接头单元(-LU-)共价地连接。
在一些实施方案中，该抗体药物偶联物化合物具有下式：
L-(LU-D)p (I)
或其一种药学上可接受的盐或溶剂化物；其中：
L是抗体单元，例如本发明的161P2F10B MAb，并且
(LU-D)是一种接头单元-药物单元部分，其中：
LU-是一个接头单元，并且
-D是针对靶细胞具有细胞抑制或细胞毒性活性的药物单元；并且
P是从1至20的整数。
在一些实施方案中，p范围从1至12，1至10，1至9，1至8，1至7，1至6，1至5，1至4，1至3，或1至2。在一些实施方案中，p范围从2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3。在其他实施方案中，p是1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，p是2或4。
在一些实施方案中，该抗体药物偶联物化合物具有下式：
L-(Aa-Ww-Yy-D)p (II)
或其一种药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
L是抗体单元，例如，161P2F10B MAb；并且
-Aa-Ww-Yy-是一个接头单元(LU)，其中：
-A-是一个延伸物单元，
a是0或1，
每个-W-独立地是一个氨基酸单元，
w是范围从0至12的整数，
-Y-是一种自消耗的间隔物单元，
y是0、1或2；
-D是针对靶细胞具有细胞抑制或细胞毒性活性的药物单元；并且
p是从1至20的整数。
在一些实施方案中，a是0或1，w是0或1，并且y是0、1或2。在一些实施方案中，a是0或1、w是0或1、并且y是0或1。在一些实施方案中，p范围从1至12、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2。在一些实施方案中，p范围从2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3。在其他实施方案中，p是1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，p是2或4。在一些实施方案中，当w不是0时，y是1或2。在一些实施方案中，当w是1至12时，y是1或2。在一些实施方案中，w是2至12并且y是1或2。在一些实施方案中，a是1并且w和y是0。
对于包括多种抗体的组合物，抗体负荷是通过p(每个抗体药物分子的平均数)表示的。药物负荷可以范围从1至12药物(D)/抗体。可以通过常规方法例如质谱、ELISA测定、以及HPLC来表征在偶联反应的制剂中抗体平均数/抗体。还可以确定关于p的抗体-药物偶联物的定量分布。在一些情况中，可以通过多种手段(例如反相HPLC或电泳法)来实现均质抗体-药物偶联物的分离、纯化、以及表征(其中p是来自具有其他药物负荷的抗体-药物偶联物的某一数值)。在示例性实施方案中，p是从2至8
可以通过本领域技术人员已知的任何技术来实现抗体-药物偶联物化合物的产物。简言之，这些抗体-药物偶联物化合物包括作为抗体单元的161P2F10B MAb，一种药物，以及可选地连接该药物和结合剂的一种接头。在一个优选实施方案中，该抗体是包括命名为上述H16-7.8的抗体的重链和轻链可变区的161P2F10B MAb。在更优选的实施方案中，该抗体是包括命名为上述H16-7.8的抗体的重链和轻链的161P2F10B MAb。可使用多个不同反应将药物和/或接头共价地附连到结合剂上。这通常是通过使结合剂(例如抗体分子)的氨基酸残基(包括赖氨酸的氨基基团、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的巯基基团以及芳香族氨基酸的不同部分)发生反应来实现的。共价附连的最常用的非特异性方法之一是用于将一种化合物的羧基(或氨基)基团连接到抗体的氨基(或羧基)基团上的碳二亚胺反应。此外，已经使用双官能试剂例如二醛类或酰亚胺酯类来将一种化合物的氨基基团连接到一种抗体分子的氨基酸基团上。而且可用于将药物附连到结合剂上的是希夫碱反应。这种方法涉及包含二醇或羟基基团的药物的高碘酸盐氧化反应，因此形成了一种醛，然后该醛与结合剂进行反应。通过与结合剂的氨基基团形成希夫碱来发生附连。还可以使用异硫氰酸盐作为偶联剂来将药物共价地附连到结合剂上。其他技术是熟练业内人士已知的并且在本发明的范围内。
在某些实施方案中，在适当条件下使一种中间体(该中间体是该接头的前体)与该药物进行反应。在某些实施方案中，这些反应基团用在该药物和/或该中间体上。随后在适当条件下该药物和中间产物，或衍生的药物之间的反应产物与161P2F10B MAb进行反应。
在此对这些抗体-药物偶联物化合物特定单元的每一项进行更详细地说明。在美国专利申请号2003-0083263、2005-0238649和2005-0009751中还对示例性接头单元、延伸物单元、氨基酸单元、自身消化间隔物单元、以及药物单元的合成和结构进行了说明，它们每一个都通过引用并且出于所有目的以其全部内容结合在此。
V.)接头单元
典型地，这些抗体-药物偶联物化合物包括该药物单元与抗体单元之间的一个接头区。在一些实施方案中，该接头在细胞内条件下是可切割的，使得该接头的切割将药物单元从抗体中释放到细胞内环境中。在又其他实施方案中，该接头单元是不可切割的并且例如通过抗体降解来释放药物。
在一些实施方案中，可通过存在于细胞内环境中的切割剂来切割该接头(例如在溶酶体或内体或胞质微囊体内)。该接头可以是例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶)切割的一种肽基接头。在一些实施方案中，该肽基接头是至少两个氨基酸长度或至少三个氨基酸长度。切割剂可以包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，它们都已知用来水解二肽药物衍生物类，导致将活性药物释放到靶细胞内部(参见例如Dubowchikand Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。最典型的是可通过在表达161P2F10B的细胞这个存在的酶切割的肽基接头。例如，可以使用可通过巯基依赖性蛋白酶组织蛋白酶B(它在癌组织中高度表达)切割的肽基基团(例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly接头(SEQID NO:9))。例如在美国专利号6,214,345中对这类接头的其他实例进行说明，通过引用并且出于所有目的将它以其全部内容结合在此。在一个具体实施方案中，可通过细胞内蛋白酶切割的肽基接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见例如美国专利6,214,345，它说明了用val-cit接头来合成多柔比星)。使用细胞内蛋白水解释放治疗剂的一个优点是当偶联时典型地减弱了该试剂并且偶联物的血清稳定性是典型地较高的。
在其他实施方案中，该可切割的接头是pH敏感的，即在某些pH值下对水解敏感。典型地，该pH敏感型接头可在酸性条件下水解。例如，可以使用酸敏感性接头，该接头可在溶酶体中水解(例如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮、或类似物)。(参见美国专利号5,122,368、5,824,805、5,622,929；Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville,et al.,1989,Biol.Chem.264:14653-14661.)在中性pH条件下，这类接头是相对稳定的(例如在血液中的那些)，但是在低于pH 5.5或5.0下(溶酶体的大致pH)是不稳定的。在某些实施方案中，该可水解的接头是一种硫醚接头(像例如通过酰基腙键附连到治疗剂上的硫醚(参见例如美国专利号5,622,929))。
在其他实施方案中，该接头是在还原条件下可切割的(例如，二硫键接头)。多种二硫键接头是本领域已知的，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺酰-S-乙酰基硫代乙酸盐)、SPDP(N-琥珀酰亚胺酰-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸盐)、SPDB(N-琥珀酰亚胺酰-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸盐)以及SMPT(N-琥珀酰亚胺酰-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些。(参见例如，Thorpe,et al.,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak,et al.,In Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel ed.,Oxford U.Press,1987。还参见美国专利号4,880,935.)
在其他具体实施方案中，该接头是一种丙二酸盐接头(Johnson,et al.,1995,Anticancer Res.15:1387-93)、一种马来酰亚胺苯酰基接头(Lau,et al.,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)、或一种3’-N-酰胺类似物(Lau,et al.,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
在又其他实施方案中，该接头单元是不可切割的并且该药物通过抗体降解来释放(参见美国公开号2005/0238649，通过引用并且处于所以目的以其全部内容结合在此)。在优选的实施方案中，接头单元是马来酰亚胺己酰基(mc)。
典型地，该接头对于细胞外环境不是显著敏感的。如在此使用的，在接头的背景中“对于细胞外环境不是显著敏感的”是指当该抗体-药物偶联物化合物存在于细胞外环境中(例如在血浆中)时，在抗体-药物偶联物化合物的样品中，不大于约20％，典型地不大于约15％，更典型地不大于约10％，并且甚至更典型地不大于约5％，不大于约3％，或不大于约1％的接头被切割。例如可以通过将抗体-药物偶联物化合物与血浆一起孵化持续预定的时间期间(例如，2、4、8、16、或24小时)来确定接头是否是对细胞外环境不是显著不敏感的并且然后对在血浆中存在的游离药物的数量进行定量。
在其他的，非彼此互斥的实施方案中，该接头促进了细胞内化作用。在某些实施方案中，当偶联到治疗剂上时(即，在如在此所述的抗体-药物偶联物化合物的接头-治疗剂部分的环境中)该接头促进细胞内化作用。在又其他实施方案中，当偶联到auristatin化合物和161P2F10B MAb两者上时该接头促进细胞内化作用。
在WO2004-010957、美国专利号20060074008、美国公开号20050238649、以及美国公开号20060024317(它们的每一个都通过引用并且处于所有目的以其全部内容结合在此)中说明了多种可以与本发明组合物和方法一起使用的示例性接头。
“接头单元”(LU)是可以用于连接药物单元和抗体单元从而形成抗体-药物偶联物化合物的一种双功能化合物。在一些实施方案中，该接头单元具有下式：
-Aa-Ww-Yy-
其中：-A-是一种延伸物单元，
a是0或1，
每个-W-独立地是一个氨基酸单元，
w是范围从0至12的整数，
-Y-是一种自消除的间隔物单元，并且
y是0、1或2。
在一些实施方案中，a是0或1，w是0或1，并且y是0、1或2。在一些实施方案中，a是0或1，w是0或1，并且y是0或1。在一些实施方案中，当w是1至12时，y是1或2。在一些实施方案中，w是2至12并且y是1或2。在一些实施方案中，a是1并且w和y是0。
VI.)延伸物单元
当存在时，该延伸物单元(A)能够将一个抗体单元连接到一个氨基酸单元(-W-)(如果存在的话)上、连接到间隔物单元(-Y-)上(如果存在的话)；或连接到一个药物单元(-D)上。天然地或通过化学操纵地可以在161P2F10B MAb(例如H16-7.8)上存在的有用的官能团包括但不限于巯基、氨基、羟基、碳水化合物的异头羟基基团、以及羧基。适当的官能团是巯基和氨基。在一个实施方案中，可以通过还原161P2F10B MAb的分子内二硫键来产生巯基基团。在另一个实施方案中，可以通过使161P2F10B MAb的赖氨酸部分的氨基基团与2-亚氨基硫烷(Traut剂)或其他巯基产生试剂进行反应来产生巯基基团。在某些实施方案中，该161P2F10B MAb是一种重组抗体并且被工程化用来携带一个或多个赖氨酸。在某些其他实施方案中，该重组体161P2F10B MAb被工程化用来携带额外的巯基基团，例如额外的半胱氨酸。
在一个实施方案中，该延伸物单元与抗体单元的硫原子形成一个键。该硫原子可以衍生自抗体的巯基基团。在式IIIa和IIIb的方括号中对本实施方案的代表性的延伸物单元进行说明，其中L-、-W-、-Y-、-D、w和y是如上定义的，并且R17是选自-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烯基-、-C1-C10亚炔基-、碳环-、-O-(C1-C8亚烷基)-、O-(C1-C8亚烯基)-、-O-(C1-C8亚炔基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-C2-C10亚烯基-亚芳基、-C2-C10亚炔基-亚芳基、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-亚芳基-C2-C10亚烯基-、-亚芳基-C2-C10亚炔基-、-C1-C10亚烷基-(碳环)-、-C2-C10亚烯基-(碳环)-、-C2-C10亚炔基-(碳环)-、-(碳环)-C1-C10亚烷基-、-(碳环)-C2-C10亚烯基-、-(碳环)-C2-C10亚炔基、-杂环-、-C1-C10亚烷基-(杂环)-、-C2-C10亚烯基-(杂环)-、-C2-C10亚炔基-(杂环)-、-(杂环)-C1-C10亚烷基-、-(杂环)-C2-C10亚烯基-、-(杂环)-C1-C10亚炔基-、-(CH2CH2O)r-、或-(CH2CH2O)r-CH2-，并且r是范围从1-10的整数，其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、碳环基、杂环剂、以及亚芳基基团，无论单独地或作为另一个基团的一部分，是可选地取代的。在一些实施方案中，所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、碳环基、杂环基、以及亚芳基基团，无论单独地或作为另一个基团的一部分，是未取代的。在一些实施方案中，R17是选自-C1-C10亚烷基-、-碳环-、-O-(C1-C8亚烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(碳环)-、-(碳环)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10亚烷基-(杂环)-、-(杂环)-C1-C10亚烷基-、-(CH2CH2O)r-、以及-(CH2CH2O)r-CH2-；并且r是范围从1-10的整数，其中所述亚烷基基团是未取代的并且这些基团的剩余部分是可选地取代的。
从所有这些示例性实例中应当理解的是甚至当未明确地指示时，从1至12个药物部分可以连接到一个抗体上(p＝1-12)。
一个示例性延伸物单元是具有式IIIa的单元，其中R17是-(CH2)5-：
另一个示例性延伸物单元是具有式IIIa的单元，其中R17是-(CH2CH2O)r-CH2-；并且r是2：
一个示例性延伸物单元是具有式IIIa的单元，其中R17是-亚芳基-或亚芳基-C1-C10亚烷基-。在一些实施方案中，该芳基基团是一种未取代的苯基基团。
又另一个示例性延伸物单元是具有式IIIb的单元，其中R17是-(CH2)5-：
在某些实施方案中，该延伸物单元通过在抗体单元的一个硫原子与该延伸物单元的一个硫原子之间的二硫键连接到该抗体单元上。在式IV的方括号中对本实施方案的代表性延伸物单元进行说明，其中R17、L-、-W-、-Y-、-D、w和y是如上定义的。
应当注意的是贯彻本说明书，除非上下文另外指出，在下式中的S部分是指抗体单元的硫原子。
在又另外的实施方案中，该延伸物包含可以与抗体的伯胺或仲胺基团形成键的一个反应位点。这些反应位点的实例包括但不限于活化的脂类例如琥珀酰亚胺脂类、4硝基苯基脂类、五氟苯基脂类、四氟苯基脂类、酸酐类、酰基氯类、磺酰氯类、异氰酸盐类以及异硫氰酸盐类。在式Va和Vb的方括号中对本实例的代表性延伸物单元进行说明，其中-R17-、L-、-W-、-Y-、-D、w和y是如上定义的；
在一些实施方案中，该延伸物包含与可能在抗体上存在的修饰的碳水化合物的(-CHO)基团进行反应的一个反应位点。例如，可以使用一种试剂(例如高碘化钠)对碳水化合物进行温和地氧化并且氧化的碳水化合物的得到的(-CHO)单元可以与包含一种官能度的延伸物(例如酰肼、肟、伯胺或仲胺、肼、缩氨基硫脲、肼羧化物、以及芳基酰肼)进行缩合(例如通过Kaneko,et al.,1991,Bioconjugate Chem.2:133-41说明的那些)。在式Via、VIb、和Vic的方括号内对这个实施方案的代表性延伸物单元进行说明，其中-R17-、L-、-W-、-Y-、-D、w和y是如上定义的。
VII.)氨基酸单元
该氨基酸单元(-W-)(当存在时)将该延伸物单元连接到该间隔物单元上(如果该间隔物单元存在的话)，将该延伸物单元连接到该药物部分上(如果该间隔物单元不存在的话)，并且将该抗体单元连接到该药物单元上(如果该延伸物单元和间隔物单元不存在的话)。
Ww-可以是例如一个单肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。每个-W-单元独立地具有在下面方括号中指示的式，并且w范围是从0至12的整数：
其中R19是氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基、
在一些实施方案中，该氨基酸单元可以通过一种或多种酶(包括癌或肿瘤相关的蛋白酶)进行酶切割从而释放该药物单元(-D)，在一个实施方案中，当释放时该药物单元在体内被质子化从而提供一种药物(D)。
在某些实施方案中，该氨基酸单元可以包括天然氨基酸。在其他实施方案中，该氨基酸单元可以包括非天然氨基酸。通过式(VII)-(IX)来表示说明性的Ww单元：
其中R20和R21是如下：
其中R20、R21和R22是如下：
其中R20、R21、R22和R23是如下：
这些示例性氨基酸单元包括但不限于式VII的单元，其中：R20是苄基并且R21是-(CH2)4NH2；R20是异丙基并且R21是-(CH2)4NH2；或R20是异丙基并且R21是-(CH2)3NHCONH2。另一个示例性氨基酸单元是式VIII的单元，其中R20是苄基，R21是苄基，并且R22是-(CH2)4NH2。
可以通过特定的酶(例如，肿瘤相关蛋白酶)在它们酶切割选择性方面对有用的-Ww-单元进行设计和优化。在一个实施方案中，-Ww–单元是其切割是被组织蛋白酶B、C和D、或纤溶酶蛋白酶催化的单元。
在一个实施方案中，-Ww-是一种二肽、三肽、四肽或五肽。当R19、R20、R21、R22或R23不是氢时，R19、R20、R21、R22或R23附连到其上的碳原子是手性的。
R19、R20、R21、R22或R23附连到其上的每个碳原子独立地是处于(S)或(R)构型。
该氨基酸单元的一个方面，该氨基酸单元是缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)。在另一个方面，该氨基酸单元是苯丙氨酸-赖氨酸(即，fk)。在该氨基酸单元的又另一个方面，该氨基酸单元是N-甲基缬氨酸-瓜氨酸。在又另一个方面，该氨基酸单元是5-氨基戊酸、高苯丙氨酸赖氨酸、四异喹啉羧酸盐赖氨酸、环己基丙氨酸赖氨酸、异烟酸(isonepecoticacid)赖氨酸、β-丙氨酸赖氨酸、甘氨酸丝氨酸缬氨酸谷氨酰胺以及异烟酸。
VIII.)间隔物单元
间隔物单元(-Y-)(当存在时)将一个氨基酸单元连接到药物单元上(当氨基酸单元存在时)。可替代地，该间隔物单元将延伸物单元连接到药物单元上(当氨基酸单元不存在时)。该间隔物单元还将药物单元连接到抗体单元上(当氨基酸单元和延伸物单元两者都不存在时)。
间隔物单元具有两者一般形式：非自消化型或自消化型。非自消化型间隔物单元是其中在从抗体-药物偶联物中切割(具体地酶切割)氨基酸单元之后部分或所有的间隔物单元保持结合到药物部分上的一种单元。非自消化间隔单元的实例包括但不限于(甘氨酸-甘氨酸)间隔物单元和甘氨酸间隔物单元(两者都描述与方案1中)(下文)。当包含甘氨酸-甘氨酸间隔物单元或甘氨酸间隔物单元的偶联物通过一种酶(例如，肿瘤细胞相关蛋白酶、癌细胞相关蛋白酶或淋巴细胞相关蛋白酶)经历酶切割时，从L-Aa-Ww-中切割一个甘氨酸-甘氨酸-药物部分或一个甘氨酸-药物部分。在一个实施方案中，在靶细胞内发生一个独立水解反应，切割该甘氨酸-药物部分结合并且释放该药物。
方案1
在一些实施方案中，一种非自消化间隔物单元(-Y-)是-Gly-。在一些实施方案中，一种非自消化间隔物单元(-Y-)是-Gly-Gly-。
在一个实施方案中，提供了一种药物-接头偶联物，其中该间隔物单元是不存在(y＝0)、或其一种药学上可接受的盐或溶剂化物。
可替代地，包括一个自消化间隔物单元的偶联物可以释放-D。如在此使用的，术语“自消化的间隔物”是指一种双功能化学部分，它能够将两个隔开的化学部分同价地连接到一起成为一个稳定的三联分子。如果它与第一部分的键被切开时，它将自发地与该第二化学部分分开。
在一些实施方案中，-Yy-一个对氨基苯甲醇(PAB)单元(参见方案2和3)，它的亚苯基部分用Qm进行取代，其中Q是-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；并且m是范围从0-4的整数。该烷基、烯基和炔基基团，无论单独地或作为另一个基团的一部分，可以是任选取代的。
在一些实施方案中，-Y-是一个PAB基团，该基团通过PAB基团的氨基氮原子连接到-Ww–上，并且通过碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基团直接地连接到–D上。不受任何特定理论或机理束缚，如通过Toki et al.,2002,J.Org.Chem.67:1866-1872说明的，方案2描述了PAB基团药物释放的一种可能的机理，该基团通过氨基甲酸酯或碳酸酯基团直接附连到-D上。
方案2
在方案2中，Q是-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；m是范围从0-4的整数；并且p范围从1至约12。该烷基、烯基和炔基基团，无论单独地或作为另一个基团的一部分，可以是任选取代的。
不受任何特定理论或机理束缚，方案3描述了PAB基团药物释放的一种可能机理，该基团通过一个醚键或胺键直接附连到-D，其中D包括作为该药物单元一部分的氧或氮基团。
方案3
在方案3中，Q是-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；m是范围从0-4的整数；并且p范围从1至约12。该烷基、烯基和炔基基团，无论单独地或作为另一个基团的一部分，可以是任选取代的。
自消化间隔物的其他实例包括但不限于与PAB基团电子类似的芳香族化合物例如2-氨基咪唑基-5-甲醇衍生物类(Hay,et al.,1999,Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)以及邻或对氨基苄基缩醛类。可以使用当酰胺键水解时经历环化反应的间隔物，取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺类(Rodrigues,et al.,1995,Chemistry Biology 2:223)，适当取代的二环[2.2.1]和二环[2.2.2]环系统(Storm,et al.,1972,J.Amer.Chem.Soc.94:5815)以及2-氨基苯基丙酸酰胺类(Amsberry,et al.,1990,J.Org.Chem.55:5867)。在甘氨酸α-位置取代的包含胺药物的消除反应(Kingsbury et al.,1984,J.Med.Chem.27:1447)也是自消化间隔物的实例。
在一个实施方案中，该间隔物单元是如方案4中描述的分支的双(羟甲基)-苯乙烯(BHMS)单元，它可以用于结合和释放多种药物。
方案4
在方案4中，Q是-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；m是范围从0-4的整数；n是0或1；并且p范围是范围从1至约12。该烷基、烯基、和炔基基团，无论单独地或作为另一个基团的一部分，可以是可选地取代的。
在一些实施方案中，该-D部分是相同的。在又另一个实施方案中，该-D部分是不同的。
一方面，通过式(X)-(XII)来表示间隔物单元(-Yy-)：
其中Q是-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-卤素、-硝基或-氰基；并且m是范围从0-4的整数。该烷基、烯基、和炔基基团，无论单独地或作为另一个基团的一部分，可以是可选地取代的。
和
包括抗体-药物偶联物化合物的式I和II的实施方案可以包括：
其中w和y各自是0、1或2，并且，
其中w和y各自是0，
以及
IX.)药物单元
药物部分(D)可以是任何细胞毒性剂、细胞抑制剂或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)或药物。D是具有可以与间隔物单元、与氨基酸单元、与延伸物单元或与抗体单元形成键的一个原子的药物单元(部分)。在一些实施方案中，该药物单元D具有可以与间隔物单元形成键的一个氮原子。如在此使用的，术语“药物单元”和“药物部分”是同义的并且可互换地使用。
细胞毒性剂或免疫调节剂的有用类别包括例如抗微管蛋白剂类、DNA小沟结合剂类、DNA复制抑制剂类、以及烷基化剂类。
在一些实施方案中，该药物是一种auristatin，例如auristatin E(本领域中也称为多拉司他汀-10的衍生物)或其一种衍生物。该auristatin可以是例如在auristatin E与酮酸之间形成的酯。例如，可以使auristatin E与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸进行反应用来对应地生产AEB和AEVB。其他典型的auristatin包括AFP、MMAF、和MMAE。示例性auristatin的合成和结构在美国专利申请公开号2003-0083263、2005-0238649和2005-0009751；国际专利公开号WO04/010957、国际专利公开号WO02/088172、以及美国专利号6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444、以及4,486,414中进行说明，它们的每一项都通过引用并且出于所有目的以其全部内容结合在此。
Auristatin已经显示干扰微管动力学以及细胞核和细胞分裂并且具有抗癌活性。MMAF结合微管蛋白并且可以在表达161P2F10B的细胞上产生细胞毒性或细胞抑制作用。存在本领域已知的多种不同的测定法，它们可以用于确定auristatin或得到的抗体-药物偶联物是否在希望的细胞系上产生细胞抑制或细胞毒性作用。
用于确定化合物是否结合微管蛋白的方法是本领域已知的。参见例如Muller,etal.,Anal.Chem 2006,78,4390-4397；Hamel,et al.,Molecular Pharmacology,1995 47:965-976；以及Hamel,et al.,The Journal of Biological Chemistry,1990 265:28,17141-17149。为了本发明的目的，可以确定化合物与微管蛋白的相对亲和性。本发明的一些优选的auristatin以范围从比MMAE与微观蛋白的结合亲和性低10倍(更弱的亲和性)至比MMAE与微管蛋白的结合亲和性高10倍、20倍、或甚至100倍(更高的亲和性)的亲和性结合微管蛋白。
在一些实施方案中，-D是式DE或DF的auristatin：
或其一种药学上可接受的盐或溶剂化物形式；
其中，独立地在每个位置处：
波浪线表示一个键；
R2是-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、或-C2-C20炔基；
R3是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-碳环、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)、或-C2-C20亚炔基(杂环)；
R4是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、碳环、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、-杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)、或-C2-C20亚炔基(杂环)；
R5是-H或-C1-C8烷基；
或R4和R5共同地形成一个碳环并且具有式-(CRaRb)s-，其中Ra和Rb独立地是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、或-碳环并且s是2、3、4、5或6；
R6是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、或-C2-C20炔基；
R7是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、碳环、-C1-C20亚烷基(碳环)、-C2-C20亚烯基(碳环)、-C2-C20亚炔基(碳环)、-芳基、-C1-C20亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)、或-C2-C20亚炔基(杂环)；
每个R8独立地是-H、-OH、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)、-O-(C1-C20炔基)、或-碳环；
R9是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、或-C2-C20炔基；
R24是-芳基、-杂环、或-碳环；
R25是-H、C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-碳环、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)、-O-(C2-C20炔基)、或OR18，其中R18是-H、一种羟基保护基团、或一种直键其中OR18表示＝O；
R26是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、或-C2-C20炔基、-芳基、-杂环、或-碳环；
R10是-芳基或-杂环；
Z是-O、-S、-NH、或-NR12，其中R12是-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、或-C2-C20炔基；
R11是-H、-C1-C20烷基、--C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-芳基、-杂环、-(R13O)m-R14、或-(R13O)m-CH(R15)2；
M是范围从1-1000的整数；
R13是-C2-C20亚烷基、-C2-C20亚烯基、或-C2-C20亚炔基；
R14是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、或-C2-C20炔基；
每个出现的R15独立地是-H、-COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H、-(CH2)n-SO3-C1-C20烷基、-(CH2)n-SO3-C2-C20烯基、或-(CH2)n-SO3-C2-C20炔基；
每个出现的R16独立地是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-(CH2)n-COOH；并且
n是范围从0至6的整数；
其中所述的烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、以及杂环基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，是可选地取代的。
式DE的Auristatin包括以下那些，其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、以及杂环基团是未取代的。
式DE的Auristatin包括以下那些，其中基团R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、和R9是未取代的并且基团R19、R20和R21是如在此所述可选地取代的。
式DE的Auristatin包括下面那些，其中
R2是C1-C8烷基；
R3、R4和R7是独立地选自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、单环C3-C6碳环、-C1-C20亚烷基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚烯基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚炔基(单环C3-C6碳环)、C6-C10芳基、-C1-C20亚烷基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚烯基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚炔基(C6-C10芳基)、杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)、或-C2-C20亚炔基(杂环)；其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环、芳基和杂环基团是可选地取代的；
R5是-H；
R6是-C1-C8烷基；
每个R8是独立地选自-OH、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)、或-O-(C2-C20炔基)，其中所述烷基、烯基、和炔基基团是可选地取代的；
R9是-H或-C1-C8烷基；
R24是可选地取代的-苯基；
R25是-OR18；其中R18是H、一个羟基保护基团、或一个直键其中OR18表示＝O；
R26是选自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、或-碳环；其中所述烷基、烯基、炔基和碳环基团是可选地取代的；或其一种药学上可接受的盐或溶剂化物形式。
式DE的Auristatin包括下面那些，其中
R2是甲基；
R3是-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、或C2-C8炔基，其中所述烷基、烯基、和炔基基团是可选地取代的；
R4是-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、单环C3-C6碳环、-C6-C10芳基、-C1-C8亚烷基(C6-C10芳基)、-C2-C8亚烯基(C6-C10芳基)、-C2-C8亚炔基(C6-C10芳基)、-C1-C8亚烷基(单环C3-C6碳环)、-C2-C8亚烯基(单环C3-C6碳环)、-C2-C8亚炔基(单环C3-C6碳环)；其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基和碳环基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，是可选地取代的；
R5是-H；
R6是甲基；
R7是-C1-C8烷基、-C2-C8烯基或-C2-C8炔基；
每个R8是甲氧基；
R9是-H或-C1-C8烷基；
R24是-苯基；
R25是-OR18；其中R18是H、一个羟基保护基团、或一个直键其中OR18表示＝O；
R26是甲基；
或其一种药学上可接受的盐形式。
式DE的Auristatin包括下面那些，其中：
R2是甲基；R3是-H或-C1-C3烷基；R4是-C1-C5烷基；R5是-H；R6是甲基；R7是异丙基或仲丁基；R8是甲氧基；R9是-H或-C1-C8烷基；R24是苯基；R25是-OR18；其中R18是-H、一个羟基保护基团、或一个直键其中OR18表示＝O；并且R26是甲基；或其一种药学上可接受的盐或溶剂化物形式。
式DE的Auristatin包括下面那些，其中：
R2是甲基或C1-C3烷基；
R3是–H或–C1-C3烷基；
R4是–C1-C5烷基；
R5是H；
R6是C1-C3烷基；
R7是-C1-C5烷基；
R8是-C1-C3烷氧基；
R9是–H或-C1-C8烷基；
R24是苯基；
R25是-OR18；其中R18是-H、一个羟基保护基团、或一个直键其中OR18表示＝O；并且
R26是-C1-C3烷基；
或其一种药学上可接受的盐形式。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中：
R2是甲基；
R3、R4、和R7是独立地选自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、单环C3-C6碳环、-C1-C20亚烷基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚烯基(单环C3-C6碳环)、-C2-C20亚炔基(单环C3-C6碳环)、-C6-C10芳基、-C1-C20亚烷基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚烯基(C6-C10芳基)、-C2-C20亚炔基(C6-C10芳基)、杂环、-C1-C20亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)、或-C2-C20亚炔基(杂环)；其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环、芳基和杂环基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，是可选地取代的；
R5是-H；
R6是甲基；
每个R8是甲氧基；
R9是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、或-C2-C20炔基；其中所述烷基、烯基、和炔基基团是可选地取代的；
R10是任选取代的芳基或任选取代的杂环；
Z是–O-、-S-、-NH-、或-NR12，其中R12是-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、或-C2-C20炔基，它们每一个是可选地取代的；
R11是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-芳基、-杂环、-(R13O)m-R14、或-(R13O)m-CH(R15)2，其中所述烷基、烯基、炔基、芳基和杂环基团是可选地取代的；
m是范围从1-1000的整数或m＝0；
R13是-C2-C20亚烷基、-C2-C20亚烯基、或-C2-C20亚炔基，它们的每一个是可选地取代的；
R14是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、或-C2-C20炔基，其中所述烷基、烯基、和炔基基团是可选地取代的；
每个出现的R15独立地是-H、-COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H、-(CH2)n-SO3-C1-C20烷基、-(CH2)n-SO3-C2-C20烯基、或-(CH2)n-SO3-C2-C20炔基，其中所述烷基、烯基、和炔基基团是可选地取代的；
每个出现的R16独立地是-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-(CH2)n-COOH，其中所述烷基、烯基和炔基基团是可选地取代的；
n是范围从0至6的整数；
或其一种药学上可接受的盐。
在这些实施方案的某些中，R10是任选取代的苯基。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中基团R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、和R9是未取代的并且基团R10和R11是如在此所述的。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环、和杂环基团是未取代的。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中：
R2是-C1-C3烷基；R3是-H或-C1-C3烷基；R4是-C1-C5烷基；R5是-H；R6是-C1-C3烷基；R7是-C1-C5烷基；R8是-C1-C3烷氧基；R9是-H或-C1-C8烷基；R10是任选取代的苯基；Z是–O-、-S-、或–NH-；R11是如在此定义的；或其一种药学上可接受的盐。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中：
R2是甲基；R3是-H或-C1-C3烷基；R4是-C1-C5烷基；R5是-H；R6是甲基；R7是异丙基或仲丁基；R8是甲氧基；R9是-H或-C1-C8烷基；R10是任选取代的苯基；Z是–O-、-S-、或–NH-；并且R11是如在此定义的；或其一种药学上可接受的盐。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中：
R2是甲基；R3是-H或-C1-C3烷基；R4是-C1-C5烷基；R5是-H；R6是甲基；R7是异丙基或仲丁基；R8是甲氧基；R9是-H或C1-C8烷基；R10是苯基；并且Z是–O-或–NH-并且R11是如在此定义的，优选氢；或其一种药学上可接受的盐形式。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中：
R2是-C1-C3烷基；R3是-H或-C1-C3烷基；R4是-C1-C5烷基；R5是-H；R6是-C1-C3烷基；R7是-C1-C5烷基；R8是-C1-C3烷氧基；R9是-H或-C1-C8烷基；R10是苯基；并且Z是–O-或–NH-并且R11是如在此定义的，优选氢；或其一种药学上可接受的盐形式。
式DE或DF的Auristatin包括下面那些，其中R3、R4和R7独立地是异丙基或仲丁基并且R5是-H。在一个示例性实施方案中，R3和R4各自是异丙基，R5是H，并且R7是仲丁基。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
式DE或DF的Auristatin包括下面那些，其中R2和R6各自是甲基，并且R9是H。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
式DE或DF的Auristatin包括下面那些，其中每个出现的R8是-OCH3。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
式DE或DF的Auristatin包括下面那些，其中R3和R4各自是异丙基，R2和R6各自是甲基，R5是H，R7是仲丁基，每个出现的R8是-OCH3，并且R9是H。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中Z是-O-或–NH-。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中R10是芳基。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中R10是-苯基。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中Z是-O-，并且R11是H、甲基或叔丁基。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中，当Z是–NH-时，R11是-(R13O)m-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-N(R16)2，并且R16是-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
式DF的Auristatin包括下面那些，其中当Z是–NH-时，R11是-(R13O)m-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-SO3H。这些取代基的剩余部分是如在此定义的。
在优选的实施方案中，当D是一个式DE的auristatin时，w是范围从1至12的整数，优选2至12，y是1或2，并且a优选地是1。
在一些实施方案中，其中D是一个式DF的auristatin，a是1并且w和y是0。
示例性的药物单元(-D)包括具有下面结构的药物单元：
以及
或其药学上可接受的盐类或溶剂化物类。
一方面，可以将亲水性基团，例如但不限于三乙二醇酯类(TEG)在R11处附连到该药物单元上。不受理论束缚，这些亲水性基团有助于该药物单元的内化作用和非团聚作用。
在一些实施方案中，该药物单元不是TZT-1027。在一些实施方案中，该药物单位不是auristatin E、多拉司他汀10、或auristatin PE。
在优选的实施方案中，这些抗体-药物偶联物化合物具有下面结构，其中“L”或“mAb-s-”表示在此列出的一个161P2F10B MAb(命名为H16-7.8)：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，该药物单元是加利车霉素、喜树碱、美坦辛类似物、或蒽环类抗生素。在一些实施方案中，该药物是紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或类似物。
在一些典型的实施方案中，适当的生物毒性剂包括例如DNA小沟结合剂(例如，烯二炔类和来红霉素类，一种CBI化合物；也参见美国专利号6,130,237)、多卡米星类、紫杉烷类(例如，紫杉酚和多西紫杉醇)、嘌呤霉素类、以及长春花生物碱类。其他细胞毒性剂包括例如CC-1065、SN-38、托泊替坎、吗啉代-多柔比星、根霉素、氰基吗啉代-多柔比星、棘霉素、考布他汀、纺缍菌素、埃博霉素A和B、雌氮芥、隐芽植物素、西马多丁、类美坦辛类、替斯利得、和米托蒽醌。
在一些实施方案中，该药物是一种抗微管蛋白剂。这些抗微管蛋白剂的实例包括auristatin类、紫杉烷类(例如，(紫杉酚)、(多西紫杉醇))、T67(Tularik)以及长春花生物碱类(例如，长春新碱、长春碱、长春地辛、以及长春瑞滨)。其他抗微管蛋白剂包括例如，浆果赤霉素衍生物类、紫杉烷类似物类(例如，埃博霉素A和B)、诺考达唑、秋水仙碱和秋水仙酰胺、雌氮芥、隐芽植物素类、西马多丁、类美坦辛类、考布他汀类、替斯利得类、以及红葱滨。
在某些实施方案中，该细胞毒性剂是一种类美坦辛，另一组抗微管蛋白剂类。例如，在具体实施方案中，该类美坦辛是美坦辛或DM-1(ImmunoGen,Inc.；也参见Chari etal.,1992,Cancer Res.52:127-131)。
在某些实施方案中，该细胞毒性或细胞抑制剂是一种多拉司他汀。在某些实施方案中，该细胞毒性或细胞抑制剂属于auristatin类别。因此，在一个具体实施方案中，该细胞毒性或细胞抑制剂是MMAE(式XI)。在另一个具体实施方案中，该细胞毒性或细胞抑制剂是AFP(式XVI)。
在某些实施方案中，该细胞毒性或细胞抑制剂是式XII-XXI的一种化合物或其药学上可接受的盐：
p是1至12。在更优选的实施方案中，这些抗体-药物偶联物化合物具有下面结构，其中“mAb-s-”表示在此列出的命名为H16-7.8的一种161P2F10B MAb，并且p是4：
在一个具体实施方案中，该细胞毒性或细胞抑制剂是MMAF(式XVIV)。
药物负荷是通过p表示的并且是分子中每个抗体药物部分的平均数。药物负荷可以范围从1至20个药物部分(D)/抗体。本发明的ADC包括与范围从1至20的药物部分偶联的抗体集合。来自偶联反应的ADC制剂中药物部分的平均数量/抗体可以通过常规手段例如质谱和ELISA测定法来表征。还可以确定关于p的ADC的定量分布。在一些情况中，可以通过多种手段例如电泳来实现均质ADC的分离、纯化、以及表征(其中p是来自具有其他药物负荷的ADC的某一数值)。
对于一些抗体-药物偶联物而言，p可以受抗体上附连位点数量限制。例如，当附连是半胱氨酸巯基时(如在上述示例性实施方案中)，抗体可以具有仅一个或数个半胱氨酸巯基基团，或可以具有仅一个或数个接头可以通过其附连的足够反应性的巯基基团。在某些实施方案中，更高的药物负荷(例如p>5)可以引起聚集、不溶性、毒性、或丧失某些抗体-药物偶联物的细胞渗透性。在某些实施方案中，针对本发明ADC的药物负荷范围从1至约12、从1至约8、从约2至约6、从约3至约5、从约3至约4、从约3.1至约3.9、从约3.2至约3.8、从约3.2至约3.7、从约3.2至约3.6、从约3.3至约3.8、或从约3.3至约3.7。实际上，已经显示的是对于某些ADC，药物部分/抗体的最佳比率可以是小于8，并且可以是约2至约5。参见US 2005-0238649A1(通过引用以其全部内容结合在此)。
在某些实施方案中，在偶联反应期间小于理论最大值的药物部分偶联到抗体上。抗体可以包含例如不与药物-接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基(如下面讨论的)。总体上，这些抗体不包含多个游离的和反应性的可以连接到药物部分上的半胱氨酸巯基基团；实际上在这些抗体中大多数半胱氨酸巯基基团以二硫桥键的形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原条件下用还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)将抗体还原从而产生反应性半胱氨酸巯基基团。在某些实施方案中，使抗体经受变性条件用来揭示反应性亲核基团例如赖氨酸或半胱氨酸。
可以用不同途径例如通过下面各项来控制ADC的负荷(药物/抗体比率)：(i)限制药物-接头中间体和接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应时间或温度，(iii)部分地或限制用于半胱氨酸巯基修饰的还原条件，(iv)通过重组技术将抗体的氨基酸序列工程化使得半胱氨酸残基的数量和位置被改变用来控制接头-药物附连的数量和/或位置(例如如在此和在WO2006/034488(通过引用以其全部内容结合在此)中披露制备的thioMab或thioFab)。
应当理解的是当多于一个亲核性基团与药物-接头中间体或接头试剂，紧接着与药物部分试剂反应时，则得到的产物是具有附连到抗体上的一种或多种药物部分的分布的ADC化合物的混合物。可以通过二重ELISA抗体测定法(它对抗体具有特异性并且对药物具有特异性)从该混合物中计算出药物的平均数量/抗体。可以通过质谱在混合物中鉴别出单个ADC分子并且通过HPLC进行分离，例如疏水性相互作用层析法(参见例如Hamblett,K.J.,et al.“Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,andtoxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,”Abstract No.624,AmericanAssociation for Cancer Research,2004 Annual Meeting,March 27-31,2004,Proceedings of the AACR,Volume 45,March 2004；Alley,S.C.,et al.“Controllingthe location of drug attachment in antibody-drug conjugates,”Abstract No.627,American Association for Cancer Research,2004Annual Meeting,March 27-31,2004,Proceedings of the AACR,Volume 45,March 2004)。在某些实施方案中，可以通过电泳或层析法从偶联混合物中分离出具有单一负荷值的均质ADC。
XI.)确定ADC的细胞毒性作用的方法
确定药物或抗体-药物偶联物是否在细胞上发挥细胞抑制和/或细胞毒性作用的方法是已知的。通常地，可以通过下面各项来测量抗体药物偶联物的细胞毒性或细胞抑制活性：将表达抗体药物偶联物靶蛋白的哺乳动物细胞暴露于细胞培养基中；培养这些细胞持续从6小时至约5天的时间期间；并且对细胞活力进行测量。可以使用基于细胞的体外测定法来测量抗体药物偶联物的活力(增殖)、细胞毒性、以及凋亡的诱导(caspase活化)。
为了确定抗体药物偶联物是否发挥了细胞抑制作用，可以使用胸苷结合测定。例如可以将以5,000个细胞/96孔板的孔的密度表达靶抗原的癌细胞培养持续72小时时间期间并且在该72小时时间期间的最后8小时期间暴露于0.5μCi3H-胸苷。在抗体药物偶联物的存在和不存在下对3H-胸苷结合到培养物的细胞中进行测量。
为了确定细胞毒性、可以对坏死或凋亡(程序性细胞死亡)进行测量。坏死典型地伴随有质膜渗透性增加；细胞膨胀、以及质膜破裂。凋亡典型地特征为膜起泡、细胞质凝聚、以及内源性核酸内切酶的活化。在癌细胞上确定这些效应的任何一项指示一种抗原药物偶联物在治疗癌症中是有用的。
可以通过确定细胞中染料(例如中性红、锥虫蓝、或ALAMARTM蓝(参见例如Page,etal.,1993,Intl.J.Oncology 3:473-476))的摄取来测量细胞活力。在这样的一个测定中，将细胞孵化于包含该染料的培养基中，对细胞进行洗涤，并且以分光光度测量的方式对剩余的染料(反映染料的细胞摄取)进行测量。还可以使用蛋白结合染料磺酰罗丹明B(SRB)来测量细胞毒性(Skehan,et al.,1990,J.Natl.Cancer Inst.82:1107-12)。
可替代地，通过检测活的而不是死的细胞将四唑盐(例如MTT)用于针对哺乳动物细胞存活以及增殖的定量的比色测定中(参见例如Mosmann,1983,J.Immunol.Methods 65:55-63)。
可以通过测量例如DNA片段化对凋亡进行定量。用于体外定量确定DNA片段化的商业光度测量方法是可供使用的。这类测定(包括TUNEL(它检测标记的核苷酸结合到片段化的DNA中)和基于ELISA的测定)的实例在Biochemica,1999,No.2,pp.34-37(RocheMolecular Biochemicals)中进行说明。
还可以通过测量细胞中形态改变来确定凋亡。例如，与坏死一样，可以通过测量某些染料(例如，荧光染料像例如吖啶橙或溴乙啶)的摄取来确定质膜完整性的丧失。通过Duke and Cohen,Current Protocols in Immunology(Coligan et al.eds.,1992,pp.3.17.1-3.17.16)说明了用于测量凋亡细胞数量的方法。这些细胞还可以标记有DNA染料(例如，吖啶橙、溴乙啶、或碘化丙啶)并且针对染色质凝聚和沿着内部核膜的边集对细胞进行观察。为了确定凋亡可以测量的其他形态改变包括例如细胞质凝聚，膜起泡增加、以及细胞收缩。
可以在培养物的贴壁和“漂浮”区室两者中对凋亡细胞的存在进行测量。例如，可以通过下面各项对两个区室进行收集：去除上清液，对贴壁细胞进行胰蛋白酶作用，在离心洗涤步骤之后(例如，在2000rpm下10分钟)将配制品合并，并且对凋亡进行检测(例如，通过测量DNA片段化作用)(参见例如Piazza,et al.,1995,Cancer Research 55:3110-16)。
在体内方面，可以在适当的动物模型中对161P2F10B治疗性组合物的作用进行评估。例如，可以使用异种癌症模型，其中将癌外植体或传代的异种移植组织引入到缺乏免疫的动物体内，例如裸鼠或SCID小鼠(Klein,et al.,1997,Nature Medicine 3:402-408)。例如，PCT专利申请WO98/16628和美国专利6,107,540说明了能够再现原发肿瘤发育、微转移、以及特征为晚期疾病的成骨性转移形成的人前列腺癌的多种异种移植模型。可以使用对肿瘤形成、肿瘤消退或转移等的抑制作用进行测量的测定法来预测疗效。
在体内测定中，对凋亡促进作用进行评估是在评估治疗性组合物中有用的。在一个实施方案中，来自用该治疗性组合物治疗的荷瘤小鼠的异种移植物可以针对凋亡病灶存在进行检查并且与未治疗的对照异种移植物携带小鼠进行比较。在治疗小鼠的肿瘤中发现凋亡病灶的程度提供了该组合物疗效的指示。
可以将在前面方法的实践中使用的治疗性组合物配制成包括适合于希望的递送方法的载体的药物组合物。适当的载体包括当与该药物组合物结合时保留该治疗组合物的抗肿瘤功能并且通常地不与病人免疫系统发生反应的任何物质。这些实例包括但不限于多种标准药物载体的任何一种例如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水等(通常地参见Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th Edition,A.Osal.,Ed.,1980)。
可以溶解并且通过能够将该治疗组合物递送到肿瘤位点的任何途径来施用这些治疗配制品。给药的潜在有效途径包括但不限于静脉内、肠胃外、腹膜内、肌内、皮内、器官内、正位的，等等。用于静脉注射的优选配制品包括处于保存的抑菌水、无菌的非保存水、和/或在包含0.9％注射用无菌氯化钠(USP)的聚氯乙烯或聚乙烯袋中稀释的溶液中的治疗性组合物。治疗性蛋白制剂可以冻干并且存储为无菌粉末(优选地在真空下)，并且然后在注射之前在抑菌水(包含例如苯甲醇防腐剂)中或在无菌水中进行重构。
使用上述方法用于治疗癌症的剂量和给药方案可以随方法和模板癌症而改变，并且通常地将依赖于本领域所理解的大量的其他因素。
XII.)一种或多种癌症的治疗
将161P2F10B鉴定为在限定集合的组织中正常表达的，但是在癌症(例如在表I中列出的那些)中也表达的蛋白，开启了用于治疗这类癌症的多种治疗途径。
总所周知地，靶向抗肿瘤治疗甚至当该靶向蛋白表达于正常组织，甚至致命的正常器官组织上时也是有用的。致命的器官是维持生命所必需的一种器官，例如心脏或结肠。非致命的器官是可以被去除而从个体仍然能够存活的一种器官。非致命性器官的实例是卵巢、乳房、以及前列腺。
在正常组织，甚至致命的正常组织中靶蛋白的表达未破坏将针对该蛋白的靶向剂用作针对其中该蛋白也过表达的某些肿瘤的治疗剂。例如，在致命器官中的表达不处于或具有自身有害性。另外地，被认为可有可无的器官例如前列腺和卵巢可以被去除而不影响死亡率。最后，因为免疫豁免一些致命器官不受正常器官表达的影响。免疫豁免的器官是通过血-器官屏障避免血液而进行保护并且因此不能用于免疫治疗的器官。免疫豁免器官的实例是脑和睾丸。
因此，抑制161P2F10B蛋白活性的治疗途径对于患有表达161P2F10B的癌症的病人是有用的。这些治疗途径通常落在三个类别中。第一类别调节161P2F10B功能，因为它涉及肿瘤细胞生长，这导致了抑制或延迟肿瘤细胞生长或诱导它的杀伤作用。第二类别包括用于抑制161P2F10B蛋白与它的结合配偶体或与其他蛋白的连接或结合的多种方法。第三类别包括用于抑制161P2F10B基因的转录或161P2F10B mRNA的翻译的多种方法。
因此，优选地使用肿瘤组织的免疫组织化学评估，161P2F10B定量成像、或可靠地指示161P2F10B表达的存在和程度的其他技术，可以针对161P2F10B表达的存在和水平对癌症病人进行评估。为了这个目的优选肿瘤活组织检查或手术样品的免疫组织化学分析。用于肿瘤组织免疫组织化学分析的方法是本领域熟知的。
XIII.)161P2F10B作为基于抗体治疗的靶物质
161P2F10B是用于基于抗体治疗策略的一种吸引人的靶物质。用于靶向细胞外和细胞内分子两者的多种抗体策略是本领域已知的(参见例如补体和ADCC介导的杀伤作用以及使用细胞内抗体)。因为161P2F10B是由相对于相应正常细胞不同谱系的癌细胞表达的，制备全身性施用161P2F10B免疫反应性组合物，它们展示优秀的选择性而没有通过将免疫反应性组合物结合到非靶向器官和组织上而引起的毒性、非特异性和/或非靶向作用。与161P2F10B的结构域特异性反应的抗体用于全身性地治疗癌症(优选地表I的癌症，更优选地肾癌和/或肝癌)，优选地以抗体药物偶联物(即ADC)形式，其中该偶联物具有一种毒素或治疗剂。
本领域普通技术人员应当理解的是可以使用这些抗体来特异性地靶向和结合免疫原性分子例如图1中所示的161P2F10B序列的免疫原性区。此外，熟练业内人士应当理解的是将这些抗体偶联到细胞毒性剂上是常规的(参见例如Slevers,et al.,Blood 93:113678-3684(June 1,1999))。当将细胞毒性剂和/或治疗剂直接地递送到细胞中时(例如通过将它们偶联到对由该细胞表达的分子具有特异性的抗体上(例如，161P2F10B))，细胞毒性剂可以在这些细胞上发挥它已知的生物作用(即，细胞毒性)。
使用抗体-细胞毒性剂偶联物来杀死细胞的广泛多样的组合物和方法是本领域已知的。在癌症的背景中，典型的方法要求将生物有效数量的包括连接到结合到表达于、易于结合或定位到细胞表面上的抗原(例如，161P2F10B)上的靶向剂(例如161P2F10B MAb，优选地H16-7.8)上的选择的细胞毒性剂和/或治疗剂的偶联物施用到具有肿瘤的哺乳动物体内。一个典型的实施方案是将细胞毒性剂和/或治疗剂递送到表达161P2F10B的细胞中方法，包括将细胞毒性剂偶联到免疫特异性地结合到161P2F10B表位上的抗体上，并且将细胞暴露于该抗体药物偶联物(ADC)。另一个说明性实施方案是治疗怀疑患有转移癌症的个体的一种方法，包括将包括治疗有效数量的结合到细胞毒性剂和/或治疗剂上的抗体的药物组合物胃肠外地施用到所述个体体内一个步骤。
使用161P2F10B抗体的癌症免疫治疗可以根据在治疗其他类型癌症(包括但不限于结肠癌(Arlen,et al.,1998,Crit.Rev.Immunol.18:133-138)、多发性骨髓瘤(Ozaki,etal.,1997,Blood 90:3179-3186,Tsunenari,et al.,1997,Blood 90:2437-2444)、胃癌(Kasprzyk,et al.,1992,Cancer Res.52:2771-2776)、B细胞淋巴瘤(Funakoshi,et al.,1996,J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19:93-101)、白血病(Zhong,et al.,1996,Leuk.Res.20:581-589)、结直肠癌(Moun,et al.,1994,Cancer Res.54:6160-6166；Velders,et al.,1995,Cancer Res.55:4398-4403)、以及乳腺癌(Shepard,et al.,1991,J.Clin.Immunol.11:117-127))中已经成功地使用的多种途径来实现。一些治疗途径涉及将裸抗体偶联到一种毒素或放射性同位素上，例如将Y91或I131对应地偶联到抗CD20抗体上(例如，ZevalinTM,IDEC Pharmaceuticals Corp.或BexxarTM,Coulter Pharmaceuticals)，而其他的涉及抗体和其他治疗剂例如HerceptinTM(曲妥珠单抗)与紫杉酚(Genentech,Inc.)一起的共同给药。
在一个优选的实施方案中，这些抗体可以偶联一种细胞毒性剂(上述)，优选地命名为MMAF(Seattle Genetics)的一种auristatin衍生物。
在本发明治疗方法中使用的优选的单克隆抗体是全人类的以及以高亲和性特异性地结合到靶物质161P2F10B抗原上的那些。
XIV.)161P2F10B ADC混合物
本发明的治疗方法考虑了单个的161P2F10B ADC以及不同MAb(即，161P2F10B MAb或结合另一个蛋白的Mab)的组合，或混合物的施用。这类MAb混合物可以具有某些优点，因为它们包含靶向不同表位的MAb，利用不同效应物机理或直接地使细胞毒性MAb与依赖免疫效应物官能度的MAb相结合。这类MAb以结合方式可以展示协同的疗效。此外，161P2F10BMAb可以与其他治疗形式相伴地给药，包括但不限于多种化学治疗剂和生物试剂、雄激素阻断剂、免疫调节剂(例如，IL-2、GM-CSF)、手术或辐射。在一个优选的实施方案中，这些161P2F10B MAb以偶联的形式施用。
通过能够将这些抗体递送到肿瘤细胞的任何途径来施用这些161P2F10B ADC配制品。给药途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、肿瘤内、皮内、等等。治疗通常涉及通过可接受的给药途径(例如静脉注射(IV)，典型地以该范围内的一个剂量，包括但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或25mg/kg体重)反复施用161P2F10B ADC制剂。总体上，10-1000mg MAb/周范围内的剂量是有效的并且是良好耐受的。
基于在治疗转移性乳腺癌中使用(曲妥珠单抗)的临床经历，约4mg/kg病人体重IV的初始负荷剂量，紧接着约2mg/kg IV MAb制剂的每周剂量代表了可接受的给药方案。优选地，当90分钟或更长时间输注时施用初始负荷剂量。当30分钟或更长时间输注时，施用定期维持剂量，其条件是该初始剂量是良好耐受的。如本领域普通技术人员所理解的，在具体情况中多种因素可能影响理想的给药方案。这类因素包括例如所使用的MAb的结合亲和性和半衰期、在病人体内161P2F10B表达程度、循环脱落的161P2F10B抗原的程度、希望的稳态抗体浓度水平、治疗频率、以及与本发明治疗方法一起结合使用的化学治疗剂或其他试剂的影响，以及特定病人的健康情况。
可选地，可以针对给定样品中161P2F10B的水平(例如，循环的161P2F10B抗原和/或161P2F10B表达细胞的水平)对这些病人进行评估从而协助确定最有效的给药方案等。这类评估还用于贯穿治疗的监测目的，并且与其他参数(例如，在膀胱癌治疗中尿细胞学和/或ImmunoCyt水平，或通过类比前列腺癌治疗中血清PSA水平)的评估相结合用于精确计量治疗的成功。
本发明的一个目的是提供161P2F10B ADC，它们抑制或延迟了肿瘤细胞(优选表I中的肿瘤细胞)的生长。本发明一个另外的目的是提供使用这类161P2F10B ADC，并且具体地使用与其他药物或免疫活性治疗相结合的这类161P2F10B ADC来抑制血管发生以及其他生物功能并且由此减少哺乳动物体内(优选人类)肿瘤生长的方法。
XV.)联合治疗
在一个实施方案中，当用161P2F10B ADC与化学治疗剂或辐射或它们的组合相结合来治疗肿瘤(包括人类肿瘤)时存在协同作用。换言之，当与化学治疗剂或辐射或它们的组合结合时，通过161P2F10B ADC抑制肿瘤生长得以增强超过预期。例如可以通过与从仅161P2F10B ADC的治疗可以预期的相比较使用联合治疗更大地抑制肿瘤生长或用161P2F10B ADC和化学治疗剂或辐射治疗的叠加作用显示了协同作用。优选地，通过缓解癌症证明了协同作用，其中缓解不是从来自161P2F10B ADC的治疗亦或使用161P2F10B ADC和化学治疗剂或治疗的加性组合的治疗中预期的。
使用161P2F10B ADC以及化学治疗或辐射或两者的组合用于抑制肿瘤细胞生长的方法包括在开始化学治疗或辐射治疗，以及它们的任何组合(即，在开始化学治疗和/或放射治疗之前和其间、之前和之后、其间和之后、或之前、其间、以及之后)之前、其间、或之后施用161P2F10B ADC。例如，典型地在开始放射治疗和/或化学治疗之前1天至60天之间，优选地在3天至40天之间，更优选地在5天至12天之间，施用161P2F10B ADC。然而，依赖于治疗方案和具体病人需要，以可以提供最有效治疗并且最终延长病人生命的方式来执行该方法。
化学治疗剂的施用能够以多种方式实现包括全身性地通过肠胃外和肠内途径。在一个实施方案中，这些161P2F10B ADC和化学治疗剂是以单独分子的形式施用的。化学治疗剂或化学治疗的具体实例包括顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、氮芥(mechlorethamine)(氮芥(nitrogen mustard))、链脲菌素、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(doxorubicin)(多柔比星(adriamycin))、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊甙、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉酚(紫杉醇)、多西紫杉醇(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、普利霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普利霉素、链脲菌素、他莫昔芬、替尼泊甙、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、紫杉醇以及它们的混合物。
与161P2F10B ADC相结合使用的辐射源对于有待治疗的病人而言可以是外部的亦或内部的。当该来源对于该病人而言是外部的时，该治疗称为外线束放射治疗(EBRT)。当该辐射源对于该病人而言是内部的时，该治疗称为近距离放射治疗(BT)。
上述治疗方案可以进一步与另外的癌症治疗剂和/或方案相结合，例如另外的化学治疗、癌症疫苗、信号转导抑制剂类、用于治疗异常细胞生长或癌症的试剂类、抗体类(例如，如WO2005/092380(Pfizer)中所述的抗-CTLA-4抗体)或通过结合到IGF-1R上抑制肿瘤生长的其他配体类、以及细胞因子类。
当该哺乳动物经受另外的化学治疗时，可以使用上述的化学治疗剂。另外地，可以使用生长因子抑制剂类、生物应答调节剂类、抗激素治疗、选择性雌性激素受体调节剂类(SERM)、抗血管生成抑制剂类、以及抗雄性激素类。例如，可以使用抗激素类，例如抗雌激素类例如诺瓦得士(他莫昔芬)或抗雄激素类例如康士得(4'-氰基-3-(4-氟苯基磺酰基)-2-羟基-2-甲基-3-'--(三氟甲基)地恩丙胺)。
上述治疗途径可以与广泛多样的手术、化学治疗或放射治疗方案中任何一种相结合。本发明的治疗途径可以能够使用减少剂量的化学治疗(或其他治疗)和/或更少频繁的给药，对于所有病人而言并且尤其地对于不能良好地耐受化学治疗剂的毒性的那些人而言这是一个优点
XVI.)制造的试剂盒/物品
为了用于在此所述的实验室、预测、预防、诊断以及治疗应用中，这些试剂盒是在本发明范围内的。这类试剂盒可以包括一个载体、包装、或被区室化用来接受一个或多个例如小瓶、管等等这类容器的一个容器，该一个或多个容器的每一个包含有待用于本方法中的这些分离元件中的一个，连同包括使用指导(例如在此所述的用途)的标签或插入物一起。例如该一个或多个容器可以包括一种抗体，该抗体是或可以是可检出地标记的。这些试剂盒可以包括包括一个药物单元(Drug Unit)的容器。该试剂盒可以包括全部或部分的图2、或图3中的氨基酸序列或它们的类似物，或编码这类氨基酸序列的核酸分子。
本发明的试剂盒典型地可以包括上述容器以及一个或多个与其相关联的其他容器，这些其他容器包括从商业以及使用者观点看令人希望的材料，包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器；载体、包装、容器、小管和/或管、列出内容和/或使用指导的标签、以及具有使用指导的包装插入物。
标签可以存在与该容器上或与其一起存在用来指示该组合物是用于特异性治疗或非治疗性应用，例如预测的、预防的、诊断的、或实验室的应用，并且还可以指示用于体内或体外使用的指导，例如在此所述的那些。这些指导和/或其他信息还可以包括在一个或多个插入物或标签上，该一个或多个插入物或标签与该试剂盒一起包括或包括在其上。该标签可以在该容器上或与其相关联。当形成标签的字母、数字或其他字符被模制或蚀刻到该容器本身中时，标签可以是在容器上的；当标签存在于也保持该容器的容器或载体中时(例如，以包装插入物的形式)，该标签可以是与容器相关联的。该标签可以指示该组合物是用于诊断、治疗、预防或预测一种病症，例如在表I中列出的组织癌症。
术语“试剂盒”和“制造物品”可以作为同义词使用。
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含组合物例如抗体药物偶联物(ADC)的制造的一个或多个物品(例如，用于诊断、预测、预防和/或治疗组织癌症(例如表I中列出的那些)的材料)。该制造的物品典型地包括至少一个容器以及至少一个标签。适当的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、以及试管。这些容器可以从多种材料(例如玻璃、金属或塑料)形成。该容器可以容纳一种或多种氨基酸序列、一种或多种小分子、一种或多种核酸序列、一种或多种细胞群和/或一种或多种抗体。在另一个实施方案中，容器还包括用于评估在细胞或组织中161P2F10B的蛋白表达，或用于相关实验室、预测、诊断、预防和治疗目的的一种抗体，其结合片段或特异性结合蛋白；这类用途的指示和/或指导可以包括在这类容器上或与其一起，用于这些目的的试剂和其他组合物或工具也可以如此。
可替代地该容器可以容纳有效地治疗、诊断、预测或预防病症的组合物并且可以具有无菌进入端口(例如，该容器可以是一种静脉注射溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿塞子的小瓶)。该组合物中的活性剂可以是特异性地结合到161P2F10B上的一种抗体药物偶联物。
该制造的物品可以进一步包括一个第二容器，该第二容器包括一种药学上可接受的缓冲剂例如磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和/或右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和使用者观点看令人希望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、搅拌器、针、注射器、和/或具有使用指示和/或指导的包装插入物。
实施例
通过下面几个实例对本发明不同方面进行进一步说明和展示，这些实例不旨在限制本发明的范围。
实施例1
161P2F10B抗原
使用本领域已知的抑制消减杂交法(SSH)发现该161P2F10B基因序列。使用标准方法从由肾癌病人体内得到的cDNA鉴别182bp的161P2F10B SSH序列。从肾癌病人样品中分离161P2F10B的全长cDNA克隆。cDNA是3858bp长度并且编码一个875氨基酸ORF(参见，图1)。161P2F10B显示与ENPP3的同源性(参见,Buhring等人，《血液》97:3303-3305(2001)。使用本领域已知的标准方法针对染色体6q22绘制161P2F10B基因图。对于进一步参考，参见美国专利号7,279,556(Agensys公司,圣塔莫尼卡市,加利福尼亚州)、美国专利号7,405,290(Agensys公司，圣塔莫尼卡市，加利福尼亚州)、美国专利号7,067,130(Agensys公司，圣塔莫尼卡市，加利福尼亚州)，以及美国专利号7,226,594(Agensys公司，圣塔莫尼卡市，加利福尼亚州)。
实施例2
161P2F10B单克隆抗体(MAb)的产生
在一个实施方案中，针对161P2F10B的治疗性单克隆抗体(“MAb”)包括与可以结合、内化、破坏或调节161P2F10B生物功能的蛋白特异性表位进行反应的那些，例如可以破坏与配体、底物、以及结合配偶子相互作用的那些。用于产生这类MAb的免疫原包括设计成编码或包含细胞外结构域或全部161P2F10B蛋白序列的那些，以及预测为包含从氨基酸序列的计算机分析预测具有抗原性的功能性基序的区域。这些免疫原包括肽类和重组蛋白类例如标记5-161P2F10B(一种纯化的哺乳动物细胞衍生的His标记的蛋白)。此外，使用通过逆转录病毒转导用来表达高水平161P2F10B而工程化的细胞，例如RAT1-161P2F10B，来免疫小鼠。
使用技术(Amgen Fremont)来产生针对161P2F10B的MAb，其中该鼠类的重链和κ轻链基因座已经被失活并且大部分人类重链和κ轻链免疫球蛋白基因座已经被插入。命名为H16-7.8的MAb是从免疫具有标签5-161P2F10B细胞的生产人γ2的XenoMice来产生的。
该161P2F10B MAb H16-7.8特异性地结合到表达重组161P2F10B(SEQ ID NO:2)的细胞以及在癌症异种移植细胞中表达的内源性细胞表面161P2F10B上。
在用试剂(Life Technologies,Gibco BRL)从对应的杂交瘤细胞中分离mRNA之后，对161P2F10B MAb H16-7.8的DNA编码序列进行确定。
使用下面实验方案从杂交瘤细胞对抗-161P2F10B H16-7.8重链和轻链可变核酸序列进行测序。用试剂(Life Technologies,Gibco BRL)将分泌H16-7.8的杂交瘤细胞溶解。将总RNA纯化并且定量。使用Superscript Preamplification系统用寡聚(dT)12-18引物从总RNA产生第一链cDNA。使用人免疫球蛋白可变重链引物，以及人免疫球蛋白可变轻链引物来扩增第一链cDNA。对这些PCR产物进行测序并且对可变重链和轻链区进行确定。
可变重链和轻链区的核酸和氨基酸序列列于图2和图3中。该H16-7.8的重链可变区是由范围从SEQ ID NO:7的第20位置Q残基至第142位置的S残基的氨基酸序列组成的，并且H16-7.8的轻链可变区是由范围从SEQ ID NO:8的第20位置E残基至第127位置R残基的氨基酸序列组成的。该H16-7.8的重链是由范围从SEQ ID NO:7的第20位置Q残基至第468位置K残基的氨基酸序列组成的并且该H16-7.8的轻链是由范围从SEQ ID NO:8的第20位置E残基至第233位置C残基的氨基酸序列组成的。H16-7.8与人VH4-31/D5-12/JH6种系和人A26/JK1种系的比对列于图4A-4B中。
实施例3
使用重组DNA方法表达H16-7.8
为了在转染的细胞中重组地表达H16-7.8，将H16-7.8重链和轻链序列(SEQ IDNO:7,从20至468，并且轻链为SEQ ID NO:8，从20至233)克隆到表达载体中。将完整的H16-7.8人重链和轻链盒克隆到克隆载体中CMV启动子/增强子的下游。将聚腺苷酸化作用位点包括在该MAb编码序列的下游。将表达重组体H16-7.8的构建体转染到CHO细胞中并且从这些CHO细胞中分泌重组体H16-7.8。通过ELISA来测量IgG滴度。这些结果证实IgG以及该重链和轻链的表达和良好的共表达。通过流式细胞术针对结合到细胞表面161P2F10B上对重组体H16-7.8进行评估(图5)。用来自杂交瘤亦或来自用H16-7.8重链和轻链载体构建体转染的CHO细胞的重组体H16-7.8对3T3-对照和3T3-161P2F10B细胞进行染色。
通过流式细胞术来检测结合。结果显示在CHO细胞中重组表达的H16-7.8被分泌并且特异性地结合到细胞表面161P2F10B上(图5)。
在其肽序列方面，对重组体H16-7.8进行表征。H16-7.8的肽谱分析证实相对于使用下面各项确定的序列：Lys-C消化(用LC-MS/MS)、Asp-N消化(用LC-MS/MS)、以及N端序列(通过埃德曼降解)，H16-7.8推论的氨基酸序列是正确的
实施例4
H16-7.8的抗体药物偶联
使用下面列出的马来酰亚胺己酰基(mc)不可切割的接头将H16-7.8(图2)偶联到命名为MMAF(式XVIV；单甲基auristatin F)的多拉缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸上(aurastatin衍生物)：
使用表VI中列出的合成方法来完成(SAFC,Madison,WI)将马来酰亚胺己酰胺(mc)不可切割的接头合成到该MMAF(Seattle Genetics,Seattle,WA)上从而产生细胞毒性的mcMMAF。
然后，使用下面实验方案来制造命名为H16-7.8mcMMAF的本发明抗体药物偶联物(ADC)。
简言之，通过透析过滤对处于10mM琥珀酸盐，pH 4.5中的10mg/mL H16-7.8溶液进行缓冲液交换。该缓冲剂交换的目的是去除H16-7.8配制品缓冲剂组分并且用针对随后的“还原”步骤优化的更适合的缓冲剂对它进行替换。对抗6透析体积(DV)的硼酸钠缓冲剂对抗体进行透析过滤并且浓缩至10±1mg/ml，从该系统冲洗，稀释至7.5mg/ml并且进行0.2μm过滤。
随后，添加EDTA至在该反应混合物中5mM终浓度。然后，用tris-(2-羧乙基)-膦盐酸盐(TCEP)将H16-7.8的二硫键部分地还原从而形成游离的巯基(SH)。在37℃下完成该过程。在该反应期间EDTA以5mM浓度存在从而螯合可能引起不希望的SH再氧化的任何二价金属阳离子。在该还原步骤结束时，将该反应溶液的温度降低至20℃并且进行分析用来确定游离SH的摩尔比率并且用来确保产生每个MAb≥3.9SH。为了偶联，在隔离器中称出药物-接头mcMMAF并且溶于DMSO中至5.5mg/ml的浓度。
使该部分还原的H16-7.8上的SH基团与药物-接头mcMMAF进行反应从而形成该偶联物(H16-7.8mcMMAF)。以设定的药物对抗体的摩尔当量添加处于DMSO中的mcMMAF。在20℃下实现这个步骤。在1h孵化期之后，用N-乙酰基-半胱氨酸来淬灭反应中的任何过量的药物-接头，因此消除了任何反应性药物-接头，并且将它转化成更易于去除和通过分析方法检测的加合物。然后，在添加相对于mcMMAF一(1)摩尔当量的N-乙酰基-半胱氨酸之后将该混合物搅拌另外十五(15)分钟。
然后，进行超滤/透析过滤用来去除DMSO，处理杂质，并且对该ADC进行缓冲剂交换成为配置品缓冲剂。
因此通过用8透析体积的20mM组氨酸，pH 5.2配制品缓冲剂超滤/透析过滤该抗体药物偶联物(ADC)来去除过量淬灭的mcMMAF。在完成第8透析体积之后，将溶液再循环并且针对蛋白质浓度进行测定。
用20mM组氨酸，10％海藻糖，pH 5.2的缓冲剂将该偶联物调节到六(6)±0.5mg/ml。然后添加聚山梨酯20，混合至均匀，并且通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。
得到的抗体药物偶联物(ADC)被命名为H16-7.8mcMMAF并且具有下式：
其中MAb是H16-7.8(图2和图3)并且p是从1至12。
实施例5
H16-7.8和H16-7.8mcMMAF的表征
使用在名称为实例2“产生161P2F10B单克隆抗体(MAb)”的实例中列出的步骤产生H16-7.8。另外地，使用在名称为“H16-7.8的抗体药物偶联”的实例中列出的步骤产生结合161P2F10B的抗体药物偶联物。使用本领域已知测定方法的组合对H16-7.8和H16-7.8mcMMAF ADC进行筛选、鉴别，以及表征。
A.通过FACS确定细胞结合以及亲和力
针对对于在Ku812细胞上内源性表达的161P2F10B的结合亲和力对H16-7.8和H16-7.8mcMMAF进行测试。简言之，在4℃下在160nM至0.0001nM的终浓度下将H16-7.8或H16-7.8mcMMAF的十一(11)个稀释物与Ku812细胞(50,000个细胞/孔)一起进行孵化过夜。在孵化结束时，在4℃下对细胞进行洗涤并且与抗-hIgG-PE检测抗体一起孵化45min。在洗涤未结合的检测抗体之后，通过FACS对细胞进行分析。获得了平均荧光强度(MFI)值(参见，表IV)。将MFI值输入到Graphpad Prisim软件中并且使用Y＝Bmax*X/(Kd+X)的单位点结合(双曲线)等式进行分析从而产生图6中所示的H16-7.8或H16-7.8mcMMAF饱和曲线。Bmax是在H16-7.8或H16-7.8mcMMAF最大地结合到161P2F10B上的MFI值；Kd是H16-7.8或H16-7.8mcMMAF结合亲和力，它是达到半最大结合所需要的H16-7.8或H16-7.8mcMMAF的浓度。
在Ku812细胞表面上内源性地表达的161P2F10B相关蛋白上，H16-7.8和H16-7.8mcMMAF计算的亲和力(Kd)对应地是0.06nM和0.19nM。
为了确定H16-7.8和H16-7.8mcMMAF结合到在肾癌细胞表面上表达的内源性161P2F10B相关蛋白上，用10μg/ml天然H16-7.8、H16-7.8mcMMAF、或同种型对照人IgG2对人UGK-3细胞(病人衍生的透明细胞肾癌)和RXF-393细胞(透明细胞肾癌)进行染色并且通过FACS进行评估。
图7中的结果(左图)证明了用H16-7.8对两种不同肾肿瘤细胞进行强染色(灰色线)，但是用对照MAb则没有这种情况(填充的直方图)。右侧图证明用H16-7.8mcMMAF对相同的肾肿瘤细胞进行类似的强染色(灰色线)(图7；右图)。这些结果表明H16-7.8和H16-7.8mcMMAF两者都结合在人癌细胞表面上表达的天然161P2F10B抗原。偶联天然H16-7.8从而产生H16-7.8mcMMAF未改变它的细胞表面结合到在人癌细胞上表达的天然161P2F10B抗原上。
实施例6
通过H16-7.8mcMMAF介导的细胞毒性
在工程化用来表达161P2F10B的KU812细胞中对H16-7.8mcMMAF介导161P2F10B依赖性细胞毒性的能力进行评估。对于这个测定，在第0天将2000个活性KU812细胞一式三份地铺板并且运行恢复过夜。第二天，添加与mcMMAF偶联的H16-7.8mcMMAF或对照MAb的不同批次的1:4连续稀释物从而产生图8中指示的终浓度。允许将这些细胞孵化六(6)天，这时将20μl阿尔玛蓝添加到各孔中。将这些孔板孵化另外四(4)小时并且使用540nM激发波长和620nM发射波长在荧光酶标仪上读取荧光强度。
图8中的结果表明H16-7.8mcMMAF的两个批次都有效地抑制KU812细胞的增殖。对应地，针对批次(1)和批次(2)，经确定IC 50为0.2nM和0.1nM。使未结合KU812细胞的完全人类对照MAb与mcMMAF偶联从而产生3.9(+/-0.2)的DAR。该对照ADC未抑制KU812细胞增殖进一步证明细胞毒性的特异性。因此，这些结果表明H16-7.8mcMMAF可以选择性地将细胞毒性药物递送到表达161P2F10B的细胞中，导致将它们杀死。
实施例7
H16-7.8mcMMAF抑制体内肿瘤生长
在肿瘤组织细胞表面上161P2F10B的显著表达，连同在正常组织中它的限制性表达一起，使161P2F10B成为用于抗体治疗以及类似地通过ADC进行治疗的良好目标。因此，在人肾癌异种移植小鼠模型中对H16-7.8mcMMAF的治疗效果进行评估。
在小鼠癌异种移植模型中对肿瘤生长和转移形成上抗体药物偶联物疗效进行研究(例如，皮下的并且正位地)。
在雄性SCID小鼠的右侧腹中通过注射与基质胶(Collaborative Research)以1:1稀释混合的5x104-106个癌细胞来产生皮下(s.c.)肿瘤。为了测试在肿瘤形成方面ADC的疗效，即，在肿瘤细胞注射的同一天开始ADC注射。作为对照，用纯化的人IgG或PBS亦或识别在人细胞中未表达的无关抗原的纯化的MAb来注射小鼠。在初步研究中，在肿瘤生长方面在对照IgG或PBS之间未发现差异。通过测径器测量来确定肿瘤尺寸，并且将肿瘤体积计算为长x宽x高。将具有直径大于1.5cm皮下肿瘤的小鼠处死。
通过注射皮下植入雄性SCID小鼠体内的150万至200万个细胞来实现小鼠体内肾肿瘤的生长。针对一般性健康情况、身体活性、以及直至它们即将死亡的外观对小鼠进行监测。在处死时，可以对小鼠进行检查用来确定肿瘤负荷并且收获其他器官用来评估转移到远侧位点。可替代地，可以使用死亡作为终点。然后将这些小鼠分成用于适当治疗的组，通过静脉注射来施用161P2F10B或对照MAb。
异种移植癌症模型的一个优点是能够研究新生血管形成以及血管发生。肿瘤生长部分地依赖于新血管发育。虽然毛细血管系统和发展血液网络具有宿主起源，通过异种移植肿瘤对新血管系统的创建和构造进行调节(Davidoff,et al.,Clin Cancer Res.(2001)7:2870；Solesvik,et al.,Eur J Cancer Clin Oncol.(1984)20:1295)。根据本领域已知的步骤(例如通过肿瘤组织及其周围微环境的IHC分析)对抗体和小分子对新生血管形成的作用进行研究。
H16-7.8mcMMAF抑制了肾癌异种移植物的形成。这些结果表明利用H16-7.8mcMMAF来治疗局部和晚期癌症，以及优选地在表I中列出的那些癌症。
161P2F10B ADC：
如在名称为“产生161P2F10B单克隆抗体(MAb)”的实例中所述产生抗161P2F10B的单克隆抗体。进一步地，如名称为“H16-7.8的抗体药物偶联”的实例中所述将这些MAb偶联到毒素上从而形成H16-7.8mcMMAF。通过FACS以及本领域已知的其他方法来表征该H16-7.8mcMMAF用来确定它结合161P2F10B的能力。
细胞系和异种移植物：
在补充有L-谷氨酰胺和10％FBS的RPMI中维持这些RFX-393细胞。通过在SCID小鼠体内连续增殖来维持这些UG-K3和SKRC-01异种移植物。
在SCID小鼠体内皮下建立的人肾癌异种移植物UG-K3中H16-7.8mcMMAF的疗效
在这个实验中，通过在SCID小鼠体内连续传代来维持病人衍生的人肾癌异种移植物UG-K3。无菌地收获大块肿瘤并且切碎成小块。使用Liberase Blendzyme(Roche AppliedScience,Indianapolis,IN)将这些肿瘤块酶消化成单细胞悬浮液。将1.5×106个细胞注入单个SCID小鼠的侧腹中并且允许这些肿瘤未处理地生长直至它们达到100mm3的适当体积。将这些动物随机地分配到下面同龄组中：H16-7.8mcMMAF治疗组，H16-7.8对照以及5％右旋糖对照。通过静脉推注在第0天以10mg/kg将H16-7.8mcMMAF和H16-7.8给药一次。施用的H16-7.8mcMMAF和H16-7.8的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150μL施用5％右旋糖对照。每3至4天使用测径器测量对肿瘤生长进行监测直至研究结束。将肿瘤体积计算为宽度2×长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。当肿瘤达到约1000mm3时，将对照组动物人道地安乐处死。在处死之前对H16-7.8mcMMAF治疗组的动物进行监测持续另外两周。当可获得两个对照组的数据时，在最后的时间点使用具有α＝0.05的克鲁斯凯-沃利斯检验进行统计分析。
这些结果证明在所检查的全部剂量和用方案下H16-7.8mcMMAF治疗UG-K3肾透明细胞异种移植肿瘤导致了SCID小鼠体内肿瘤生长的显著抑制(图9)。
通过H16-7.8mcMMAF建立的正位UG-K3异种移植物的生长抑制
在这个实验中，使用病人衍生的UG-K3肿瘤异种移植物对H16-7.8mcMMAF抑制正位生长的建立的肾肿瘤生长的能力进行评估。简言之，在第0天对大块的UG-K3肿瘤进行酶消化并且将150万个活细胞以手术方式植入到雄性SCID小鼠的肾脏中。允许这些肿瘤生长7天，这时将这些动物随机化到4个不同治疗组中(n＝10/组)。随机化到组A的动物接受5mpk的对照ADC，组B接受3mg/kg的H16-7.8mcMMAF并且组C接受5mg/kg的H16-7.8mcMMAF，每4天进行给药持续共4个剂量。组D接受10mg/kg的H16-7.8mcMMAF一次。在研究结束时(第41天)，将动物处死并且在电子天平上对右肾和左肾进行称量。通过从携带肿瘤的右肾重量中减去无肿瘤对侧肾的重量来确定在曲线图上绘制的肿瘤重量。
这些结果证明在所检查的所有剂量和方案下用H16-7.8mcMMAF治疗UG-K3肾透明细胞移植物肿瘤导致显著地抑制肿瘤生长(图10)。在所有H16-7.8mcMMAF治疗组(B、C、以及D)中肿瘤重量小于对照治疗组中肿瘤重量的1％。这些差异是高度统计显著的(p<0.0001,ANOVA)。
在SCID小鼠体内皮下建立的人肾癌异种移植物RXF-393中H16-7.8mcMMAF的疗效
在这个实验中，将人肾癌细胞RXF-393(0.5×106个细胞/小鼠)注射到单个小鼠的侧腹中并且允许这些肿瘤未处理地生长直至它们达到100mm3的适当体积。然后将这些动物随机地分配到下面同龄组中：H16-7.8mcMMAF治疗组，H16-7.8治疗组以及5％右旋糖对照。通过静脉推注每周一次地以10mg/kg剂量施用H16-7.8mcMMAF和H16-7.8持续共2个剂量。施用的H16-7.8mcMMAF和H16-7.8的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150μL的剂量施用5％右旋糖对照。每3至4天使用测径器测量来监测肿瘤生长直至研究结束。将肿瘤体积计算为宽度2×长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。当肿瘤达到约1000mm3时，将对照组的动物人道地安乐处死。在处死之前对H16-7.8mcMMAF治疗组的动物进行监测持续另外两周。
这些结果证明在所检查的所有剂量和方案下(包括单剂量)用H16-7.8mcMMAF治疗RFX-393人肾癌异种移植肿瘤导致显著地抑制SCID小鼠体内肿瘤生长。当可以获得两个对照组中的数据时在最后时间点使用具有α＝0.05的克鲁斯凯-沃利斯检验进行统计分析(图11)。
在SCID小鼠体内皮下建立的人肾癌SKRC-01中H16-7.8对比H16-7.8mcMMAF的疗效 研究
在另一个实验中，将人肾癌细胞SKRC-01(0.8×106细胞/小鼠)注射到单个小鼠的侧腹中。允许这些细胞未处理地生长直至它们达到100mm3的适当体积。在第0天当肿瘤达到100mm3时，将这些动物随机地分配到下面同龄组中：H16-7.8mcMMAF治疗组、H16-7.8治疗组以及5％右旋糖对照。通过静脉推注每四天以4mg/kg剂量施用H16-7.8mcMMAF和H16-7.8持续共4个剂量。施用的H16-7.8mcMMAF和H16-7.8的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150μL的剂量施用5％右旋糖对照。每3至4天使用测径器测量来监测肿瘤生长。将肿瘤体积计算为宽度2×长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。
这些结果表明在所有剂量下(包括单剂量)该ADC H16-7.8mcMMAF显著地抑制了SKRC-01肿瘤形成的生长，而裸MAb H16-7.8没有影响。因此，与裸抗体H16-7.8相比较ADCH16-7.8mcMMAF具有显著地更突出的影响(图12)。
在SCID小鼠体内皮下建立的UG-K3中H16-7.8mcMMAF对比其他161P2F10B抗体药物 偶联物(ADC)的疗效研究
在另一个实验中，将人肾癌细胞UG-K3(1.5×106个细胞/小鼠)注射到个体小鼠的侧腹中。允许这些肿瘤未处理地生长直至它们达到100mm3的适当体积。在第0天当肿瘤达到100mm3时，将这些动物随机地分配到下面同龄组中：H16-7.8mcMMAF、H16-7.8vcMMAE、以及H16-1.11mcMMAF、以及H16-1.11vcMMAE、PBS对照、以及对照MAb-vcMMAE治疗组。在第0天以10mg/kg剂量将所有抗体药物偶联物(ADC)给药一次。所施用的每个ADC的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150μ/L的剂量施用该PBS对照。每3至4天使用测径器测量来监测肿瘤生长。将肿瘤体积计算为宽度2×长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。
这些结果表明ADC H16-7.8vcMMAE和H16-1.11vcMMAE未抑制肿瘤形成生长。另外地，是第一个三十(30)天期间H16-7.8mcMMAF和H16-1.11mcMMAF两者都显著地抑制UG-K3肿瘤形成的生长。在第三十(30)天之后，当与H16-1.11mcMMAF相比较时，该H16-7.8mcMMAF具有显著地更突出的影响(图13)。
实施例8
通过使用161P2F10B ADC来治疗和诊断人类癌的人类临床试验
根据本发明使用特异性地结合到161P2F10B上的161P2F10B ADC，并且用于治疗某些肿瘤，优选地在表I中列出的那些。与这些指示的每一项相结合，成功地进行两种临床方法。
I.)辅助疗法：在辅助治疗中，用161P2F10B ADC与化学治疗或抗肿瘤剂和/或放射治疗或它们的组合相结合来治疗病人。通过将161P2F10B ADC添加到标准的第一和第二线疗法中，在标准实验方案下对原发癌目标(例如在表I中列出的那些)进行治疗。实验方案设计着手解决通过下面实例评估的效率，包括但不限于原发或转移损害的肿瘤质量减少，无进展存活率的增加，总存活率，病人健康的改善，疾病稳定性，以及降低标准化学治疗剂和其他生物剂的常规剂量的能力。这些剂量减少允许通过减少化学治疗或生物剂的剂量相关毒性进行另外的和/或延长的治疗。这些161P2F10B ADC与化学治疗剂或抗肿瘤剂相结合用于几个辅助临床试验中。
II.)单一疗法：在肿瘤单一疗法中与使用161P2F10B ADC相结合，在无化学治疗剂或抗肿瘤剂下将161P2F10B ADC施用到病人体内。在一个实施方案中，在具有广泛转移性疾病的末期癌症病人体内临床地进行单一疗法。实验方案设计着手解决如通过下面实例评估的效率，这些实例包括但不限于原发或转移性损害的肿瘤质量的减少，无进展存活率的增加，总存活率，病人健康的改善，疾病稳定性，以及减少标准化学质量剂和其他生物剂的常规剂量的能力。
剂量
可以调节给药方案用来提供最希望的反应。例如，可以施用一个单一推注，可以随时间施用几个分开的剂量或可以如通过治疗情况的紧急性指示的按比例地减少或增加剂量。特别有利的是以易于施用和剂量均匀的剂量单位形式配制肠胃外组合物。如在此使用的剂量单位形式是指以单一剂量方式适合于有待治疗的哺乳动物受试者的物理上分离的单位；每个单位包含计算为与需要的药物载体相结合产生希望疗效的预定数量的活性化合物。本发明剂量单位形式的说明通过下面指示并且直接地依赖于(a)抗体和有待实现的具体治疗或预防效果的独特特征，以及(b)混合这种活性化合物用来治疗个体体内敏感性的本领域固有限制。
根据本发明联合施用的161P2F10B ADC的治疗有效数量的示例性的，非限制性的范围是约0.5至约10mg/kg，约1至约5mg/kg，至少1mg/kg，至少2mg/kg，至少3mg/kg，或至少4mg/kg。其他示例性的非限制性范围是例如约0.5至约5mg/kg，或例如约0.8至约5mg/kg，或例如约1至约7.5mg/kg。本发明的高剂量实施方案涉及大于10mg/kg的剂量。应当注意的是剂量值可以随有待缓解病症的类型和严重性而改变，并且可以包括单剂量或多剂量。应当进一步理解的是对于任何特定的受试者，具体的给药方案可以根据个体需要以及管理或监督组合物给药的人员的专业判断随时间调节，并且在此列出的剂量范围仅是示例性的并且不旨在限制要求权利的组合物的范围或实践。
临床开发计划(CDP)
CDP遵循并且开发了与辅助治疗或单一疗法相结合的161P2F10B ADC治疗。最初地，使用本领域已知的标准实验方案在非人类受试者体内(例如，小鼠、猴等)进行临床前毒理学研究。在这些非人类毒理学研究中The H16-7.8mcMMAF证明是耐受良好的。最初地，以重复剂量的方式人类临床试验证明了安全性并且此后证实了效率。将标准化学治疗与标准治疗加上161P2F10B ADC进行比较，对这些试验进行开放标记。如应当理解的，可以与招募病人相结合利用的一个非限制性指标是在如通过活组织检查确定的他们肿瘤中161P2F10B的表达水平。
当使用任何基于蛋白或抗体注入的治疗时，安全性考虑主要地涉及(i)细胞因子释放综合征，例如低血压、发热、抖动、寒战；(ii)针对该物质发展免疫原性反应(例如，针对抗体治疗通过病人发展人类抗体，或HAHA反应)；以及(iii)针对表达161P2F10B的正常细胞的毒性。利用标准测试和随访来监测这些安全考虑的每一项。当人类给药时发现61P2F10BMAb是安全的。
实施例9
H16-7.8MAb的抗体药物偶联的表征
I)通过质谱绘制肽图
进行肽图分析。使用这种方法来证实H16-7.8mcMMAF的身份并且区别天然抗体(H16-7.8)。用二硫苏糖醇(DTT)对得到的H16-7.8mcMMAF和H16-7.8进行处理用来还原二硫键，紧接着对得到的游离半胱氨酸进行烷基化作用。在这个步骤中使用胍来确保该蛋白完全变性。在透析以便去除胍之后，用特异性蛋白内切酶Lys-C对样品进行消化。Lys-C切割赖氨酸残基C端侧上的肽键。通过反相层析法结合质谱法对得到的肽进行分析。在H16-7.8mcMMAF与H16-7.8之间对反相保留时间和这些峰观察到的质核比进行比较。使用偶联到WATERS Q-TOFp质谱仪上的WATERS Acquity UPLC进行LC-MS(液相层析法-质谱法)分析。将消化的样品应用到YMC C18柱上并且用包含三氟乙酸的乙腈梯度进行洗脱。针对H16-7.8mcMMAF和H16-7.8代表性的肽图示于图14中。
在图14中所有三个色谱图看起来是相同的除了通过星号和箭头指示的峰之外。如在该图中可以看到的，与天然抗体相比较，在偶联的抗体中通过星号指示的峰强度是减少的。用箭头标记的峰表示在偶联抗体肽图上出现的新峰。特别地，用星号异或用箭头标记的峰被认为对应地是指定用于偶联的肽以及得到的偶联肽。图15显示用星号标记的峰的质谱图的一部分。在偶联期间改变的信号质量值是通过“加号”符号指示的。具有适当的m/z970.4(+3电荷状态)的这种肽被鉴定为C225-K250，它源于重链的铰链区并且包含预期的偶联位点。
为了鉴别新出现的峰(在图14中这些峰被认为是偶联的肽)，使用升高的能量(MSE)数据获取技术进行LC-MS分析。图16显示使用619.4的m/z针对H16-7.8mcMMAF和H16-7.8肽图提取的离子层析图(XIC)。这个离子相应于该药物部分的碎片离子。在图14中在619.4处在XIC中观察到的峰与用箭头标记的峰几乎是完全相同的。此外，在天然抗体的层析图中未检测出这类峰。这些观察表明在619.4的m/z下在XIC中检出的峰明显地是药物偶联的肽并且通过它的完整质量值进行鉴别。该结果汇总与表V中。这些结果表明在偶联物的情况下，主要的肽类是在重链铰链区上偶联到2种药物上的那些。这些数据与通过其他正交例如DAR分析获得的数据相一致。
II)通过LC-MS进行完整质量分析
通过电喷射离子化飞行时间(ESI-TOF)质谱来确定脱糖基化的H16-7.8mcMMAF的完全质量。这种技术提供了关于药物对抗体比率(DAR)数值的直接信息。这些测试样品通过250mM磷酸钠缓冲剂，pH 7.5进行稀释，然后在37℃下与糖肽酶F一起孵化过夜。将样品注射到PLRPTM柱(Varian Technology)上，在90℃下平衡，并且用乙腈/水梯度进行洗脱。通过偶联到WATERS Synapt质谱仪(Waters)上的Acquity UPLC系统对样品峰进行分析并且通过MaxEnt1软件从原始数据对质量进行重构。脱糖基化的H16-7.8mcMMAF的示例性质谱图示于图17中。主要的药物偶联抗体是一种加载4-药物种类。包括在H16-7.8mcMMAF中富含未偶联抗体的这种观察是与通过其他正交方法(例如通过RP-HPLC的DAR，肽图以及HIC测定法)获得的结果相一致的。
III)通过RP-HPLC进行药物对抗体比率(DAR)分析
为了定量HPLC确定每个轻链和重链中药物负荷的相对数量进行药物对抗体比率(DAR)分析。使用PLRP-S分析柱，2.1mm×50mm，使用由2.0％甲酸组成的移动相A和由2.0％甲酸加上90％乙腈组成的移动相B进行DAR分析。为了制备样品，通过DTT将药物偶联的抗体完全还原并且然后基于药物负荷数量分成L链、药物偶联的L链、H链以及药物偶联的H链。使用0.5ml/min的流量对50μg样品进行洗脱，在280nm下进行检测。通过下面等式来定义药物对抗体比率(DAR)的摩尔比率。
其中
DAR–药物对抗体的摩尔比率
n–每个Ab链mcMMAF药物的数量
AUC轻链,n,AUC重链,n–对应地，具有n种药物的轻或重抗体链曲线下的面积；
AUC总和,轻链(重链)–轻或重链曲线下的峰面积。
使用来自H16-7.8mcMMAF的材料对这种方法进行认证。所评估的参数包括特异性、准确性、可重复性、中间精确性。针对H16-7.8mcMMAF代表性的DAR曲线图示于图18中。DAR值是4.0。使用这种方法相同的HPLC条件使样品经受LC-MS分析用来鉴别观察到的峰。结果汇总于表VI中。通过LC-MS正交地证实在本方法的定量期间获得的DAR结果的峰识别。
IV)结合亲和性
针对H16-7.8和H16-7.8mcMMAF对在KU812细胞上(人类慢性髓性白血病细胞，ATCC)表达的161P2F10B的结合亲和性对它们进行测试。简言之，在4℃下在160nM至0.004nM的终浓度下将H16-7.8或H16-7.8mcMMAF的十二个(12)稀释物与KU812细胞(50,000个细胞/孔)一起孵化过夜。在孵化结束时，在4℃下对细胞进行洗涤并且与抗-hIgG-PE检测抗体一起孵化45分钟。在洗涤未结合的检测抗体之后，通过FACS对细胞进行分析。
将MFI值输入到Graphpad Prisim软件中并且使用Y＝Bmax*X/(Kd+X)的单位点结合(双曲线)等式进行分析从而产生H16-7.8和H16-7.8mcMMAF饱和曲线。Bmax是H16-7.8或H16-7.8mcMMAF最大地结合到KU812上的MFI值；Kd是H16-7.8或H16-7.8mcMMAF的结合亲和性，它们是达到半最大结合所需要的H16-7.8或H16-7.8mcMMAF的浓度。在KU812细胞表面上表达的161P2F10B上H16-7.8和H16-7.8mcMMAF计算的亲和性(Kd)对应地是0.08nM和0.25nM(n＝4)。
V)细胞毒性
将H16-7.8、H16-7.8mcMMAF以及一种阴性对照ADC分别地连续稀释并且添加到包含KU812细胞的96孔板中，这些细胞在细胞表面上内源性地表达161P2F10B。在孵化六天之后，将阿尔玛试剂添加到该抗体-细胞混合物中。阿尔玛是一种细胞活力指示剂，该指示剂使用活细胞的天然还原力将刃天青转化成荧光分子试卤灵。刃天青被还原成试卤灵，这产生非常亮的红色荧光。活细胞连续地将刃天青转化成试卤灵，由此产生活力和细胞毒性的定量测量。使用Synergy 4混合多模式酶标仪(540/35,620/40nm)使用以分光光度测量方式获得的荧光单位对H16-7.8mcMMAF的百分比细胞毒性进行评估。该测定的线性范围是约3.9至1000ng/ml。在标准曲线中存在9个点：H16-7.8mcMMAF的最高浓度是1000ng/ml，紧接着八个1比2的连续稀释以及一个空白(0)。
使用下式计算％存活率：
％存活率＝(X–空白)/(未处理的–空白)×100
在KU812细胞上H16-7.8mcMMAF的特异性细胞毒性活性：IC500.15nM。
在KU812细胞上H16-7.8和ADC对照(抗体(非-抗-161P2F10B抗体)-mcMMAF)不具有细胞毒性活性。
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本发明不被在此披露的实施方案限制于范围内，这些实施方案旨在作为本发明单个方面的单个说明，并且在功能上等价的任何事物都在本发明范围内。除了在此说明的那些之外，对本发明模型和方法的不同修饰对于本领域熟练人士而言从前面的说明和传授内容将是清楚的，并且类似地旨在落在本发明的范围内。可以实践这类修饰或其他实施方案而不偏离本发明的真正范围和精神。
表格
表I:当恶性时表达161P2F10B的组织。
肾
结肠
肺
卵巢
乳房
淋巴瘤
骨
子宫
胰腺
肝
前列腺
表II:氨基酸缩写
单字母 三字母 全称
F Phe 苯丙氨酸
L Leu 亮氨酸
S Ser 丝氨酸
Y Tyr 酪氨酸
C Cys 半胱氨酸
W Trp 色氨酸
P Pro 脯氨酸
H His 组氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
R Arg 精氨酸
I Ile 异亮氨酸
M Met 甲硫氨酸
T Thr 苏氨酸
N Asn 天冬酰胺
K Lys 赖氨酸
V Val 缬氨酸
A Ala 丙氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
G Gly 甘氨酸
表III:氨基酸取代矩阵
从GCG软件9.0适配BLOSUM62氨基酸取代矩阵(块取代矩阵)。数值越高，越有可能在相关的天然蛋白中找到取代。
表IV:在Ku812细胞上FACS MFI数值
表V:在药物偶联的肽上峰鉴别结果的汇总，潜在的偶联位点(半胱氨酸残基)以粗体字型列出并且加下划线。
表VI:通过LC-MS得到的DAR分析的峰鉴别结果
表VII:mcMMAF的合成方案
序列表
<110> 艾更斯司股份有限公司(AGENSYS, INC.)
M·托尔戈夫(TORGOV, Michael)
R·K·莫里森(MORRISON, Robert Kendall)
A·雅各波维茨(JAKOBOVITS, Aya)
J·古达斯(GUDAS, Jean)
Z·安(AN, Zili)
<120> 结合于161P2F10B蛋白的抗体药物偶联物(ADC)
<130> 511582006274
<140> PCT/US2011/024055
<141> 2011-02-08
<150> US 61/302,489
<151> 2010-02-08
<160> 12
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 3858
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(3858)
<223> 161P2F10B变异体2
<220>
<221> CDS
<222> (44)...(2671)
<400> 1
ctactttatt ctgataaaac aggtctatgc agctaccagg aca atg gaa tct acg 55
Met Glu Ser Thr
1
ttg act tta gca acg gaa caa cct gtt aag aag aac act ctt aag aaa 103
Leu Thr Leu Ala Thr Glu Gln Pro Val Lys Lys Asn Thr Leu Lys Lys
5 10 15 20
tat aaa ata gct tgc att gtt ctt ctt gct ttg ctg gtg atc atg tca 151
Tyr Lys Ile Ala Cys Ile Val Leu Leu Ala Leu Leu Val Ile Met Ser
25 30 35
ctt gga tta ggc ctg ggg ctt gga ctc agg aaa ctg gaa aag caa ggc 199
Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys Leu Glu Lys Gln Gly
40 45 50
agc tgc agg aag aag tgc ttt gat gca tca ttt aga gga ctg gag aac 247
Ser Cys Arg Lys Lys Cys Phe Asp Ala Ser Phe Arg Gly Leu Glu Asn
55 60 65
tgc cgg tgt gat gtg gca tgt aaa gac cga ggt gat tgc tgc tgg gat 295
Cys Arg Cys Asp Val Ala Cys Lys Asp Arg Gly Asp Cys Cys Trp Asp
70 75 80
ttt gaa gac acc tgt gtg gaa tca act cga ata tgg atg tgc aat aaa 343
Phe Glu Asp Thr Cys Val Glu Ser Thr Arg Ile Trp Met Cys Asn Lys
85 90 95 100
ttt cgt tgt gga gag acc aga tta gag gcc agc ctt tgc tct tgt tca 391
Phe Arg Cys Gly Glu Thr Arg Leu Glu Ala Ser Leu Cys Ser Cys Ser
105 110 115
gat gac tgt ttg cag agg aaa gat tgc tgt gct gac tat aag agt gtt 439
Asp Asp Cys Leu Gln Arg Lys Asp Cys Cys Ala Asp Tyr Lys Ser Val
120 125 130
tgc caa gga gaa acc tca tgg ctg gaa gaa aac tgt gac aca gcc cag 487
Cys Gln Gly Glu Thr Ser Trp Leu Glu Glu Asn Cys Asp Thr Ala Gln
135 140 145
cag tct cag tgc cca gaa ggg ttt gac ctg cca cca gtt atc ttg ttt 535
Gln Ser Gln Cys Pro Glu Gly Phe Asp Leu Pro Pro Val Ile Leu Phe
150 155 160
tct atg gat gga ttt aga gct gaa tat tta tac aca tgg gat act tta 583
Ser Met Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu Tyr Thr Trp Asp Thr Leu
165 170 175 180
atg cca aat atc aat aaa ctg aaa aca tgt gga att cat tca aaa tac 631
Met Pro Asn Ile Asn Lys Leu Lys Thr Cys Gly Ile His Ser Lys Tyr
185 190 195
atg aga gct atg tat cct acc aaa acc ttc cca aat cat tac acc att 679
Met Arg Ala Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Thr Ile
200 205 210
gtc acg ggc ttg tat cca gag tca cat ggc atc att gac aat aat atg 727
Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Asn Met
215 220 225
tat gat gta aat ctc aac aag aat ttt tca ctt tct tca aag gaa caa 775
Tyr Asp Val Asn Leu Asn Lys Asn Phe Ser Leu Ser Ser Lys Glu Gln
230 235 240
aat aat cca gcc tgg tgg cat ggg caa cca atg tgg ctg aca gca atg 823
Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp Leu Thr Ala Met
245 250 255 260
tat caa ggt tta aaa gcc gct acc tac ttt tgg ccc gga tca gaa gtg 871
Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Ala Thr Tyr Phe Trp Pro Gly Ser Glu Val
265 270 275
gct ata aat ggc tcc ttt cct tcc ata tac atg cct tac aac gga agt 919
Ala Ile Asn Gly Ser Phe Pro Ser Ile Tyr Met Pro Tyr Asn Gly Ser
280 285 290
gtc cca ttt gaa gag agg att tct aca ctg tta aaa tgg ctg gac ctg 967
Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Ser Thr Leu Leu Lys Trp Leu Asp Leu
295 300 305
ccc aaa gct gaa aga ccc agg ttt tat acc atg tat ttt gaa gaa cct 1015
Pro Lys Ala Glu Arg Pro Arg Phe Tyr Thr Met Tyr Phe Glu Glu Pro
310 315 320
gat tcc tct gga cat gca ggt gga cca gtc agt gcc aga gta att aaa 1063
Asp Ser Ser Gly His Ala Gly Gly Pro Val Ser Ala Arg Val Ile Lys
325 330 335 340
gcc tta cag gta gta gat cat gct ttt ggg atg ttg atg gaa ggc ctg 1111
Ala Leu Gln Val Val Asp His Ala Phe Gly Met Leu Met Glu Gly Leu
345 350 355
aag cag cgg aat ttg cac aac tgt gtc aat atc atc ctt ctg gct gac 1159
Lys Gln Arg Asn Leu His Asn Cys Val Asn Ile Ile Leu Leu Ala Asp
360 365 370
cat gga atg gac cag act tat tgt aac aag atg gaa tac atg act gat 1207
His Gly Met Asp Gln Thr Tyr Cys Asn Lys Met Glu Tyr Met Thr Asp
375 380 385
tat ttt ccc aga ata aac ttc ttc tac atg tac gaa ggg cct gcc ccc 1255
Tyr Phe Pro Arg Ile Asn Phe Phe Tyr Met Tyr Glu Gly Pro Ala Pro
390 395 400
cgc atc cga gct cat aat ata cct cat gac ttt ttt agt ttt aat tct 1303
Arg Ile Arg Ala His Asn Ile Pro His Asp Phe Phe Ser Phe Asn Ser
405 410 415 420
gag gaa att gtt aga aac ctc agt tgc cga aaa cct gat cag cat ttc 1351
Glu Glu Ile Val Arg Asn Leu Ser Cys Arg Lys Pro Asp Gln His Phe
425 430 435
aag ccc tat ttg act cct gat ttg cca aag cga ctg cac tat gcc aag 1399
Lys Pro Tyr Leu Thr Pro Asp Leu Pro Lys Arg Leu His Tyr Ala Lys
440 445 450
aac gtc aga atc gac aaa gtt cat ctc ttt gtg gat caa cag tgg ctg 1447
Asn Val Arg Ile Asp Lys Val His Leu Phe Val Asp Gln Gln Trp Leu
455 460 465
gct gtt agg agt aaa tca aat aca aat tgt gga gga ggc aac cat ggt 1495
Ala Val Arg Ser Lys Ser Asn Thr Asn Cys Gly Gly Gly Asn His Gly
470 475 480
tat aac aat gag ttt agg agc atg gag gct atc ttt ctg gca cat gga 1543
Tyr Asn Asn Glu Phe Arg Ser Met Glu Ala Ile Phe Leu Ala His Gly
485 490 495 500
ccc agt ttt aaa gag aag act gaa gtt gaa cca ttt gaa aat att gaa 1591
Pro Ser Phe Lys Glu Lys Thr Glu Val Glu Pro Phe Glu Asn Ile Glu
505 510 515
gtc tat aac cta atg tgt gat ctt cta cgc att caa cca gca cca aac 1639
Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Arg Ile Gln Pro Ala Pro Asn
520 525 530
aat gga acc cat ggt agt tta aac cat ctt ctg aag gtg cct ttt tat 1687
Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Val Pro Phe Tyr
535 540 545
gag cca tcc cat gca gag gag gtg tca aag ttt tct gtt tgt ggc ttt 1735
Glu Pro Ser His Ala Glu Glu Val Ser Lys Phe Ser Val Cys Gly Phe
550 555 560
gct aat cca ttg ccc aca gag tct ctt gac tgt ttc tgc cct cac cta 1783
Ala Asn Pro Leu Pro Thr Glu Ser Leu Asp Cys Phe Cys Pro His Leu
565 570 575 580
caa aat agt act cag ctg gaa caa gtg aat cag atg cta aat ctc acc 1831
Gln Asn Ser Thr Gln Leu Glu Gln Val Asn Gln Met Leu Asn Leu Thr
585 590 595
caa gaa gaa ata aca gca aca gtg aaa gta aat ttg cca ttt ggg agg 1879
Gln Glu Glu Ile Thr Ala Thr Val Lys Val Asn Leu Pro Phe Gly Arg
600 605 610
cct agg gta ctg cag aag aac gtg gac cac tgt ctc ctt tac cac agg 1927
Pro Arg Val Leu Gln Lys Asn Val Asp His Cys Leu Leu Tyr His Arg
615 620 625
gaa tat gtc agt gga ttt gga aaa gct atg agg atg ccc atg tgg agt 1975
Glu Tyr Val Ser Gly Phe Gly Lys Ala Met Arg Met Pro Met Trp Ser
630 635 640
tca tac aca gtc ccc cag ttg gga gac aca tcg cct ctg cct ccc act 2023
Ser Tyr Thr Val Pro Gln Leu Gly Asp Thr Ser Pro Leu Pro Pro Thr
645 650 655 660
gtc cca gac tgt ctg cgg gct gat gtc agg gtt cct cct tct gag agc 2071
Val Pro Asp Cys Leu Arg Ala Asp Val Arg Val Pro Pro Ser Glu Ser
665 670 675
caa aaa tgt tcc ttc tat tta gca gac aag aat atc acc cac ggc ttc 2119
Gln Lys Cys Ser Phe Tyr Leu Ala Asp Lys Asn Ile Thr His Gly Phe
680 685 690
ctc tat cct cct gcc agc aat aga aca tca gat agc caa tat gat gct 2167
Leu Tyr Pro Pro Ala Ser Asn Arg Thr Ser Asp Ser Gln Tyr Asp Ala
695 700 705
tta att act agc aat ttg gta cct atg tat gaa gaa ttc aga aaa atg 2215
Leu Ile Thr Ser Asn Leu Val Pro Met Tyr Glu Glu Phe Arg Lys Met
710 715 720
tgg gac tac ttc cac agt gtt ctt ctt ata aaa cat gcc aca gaa aga 2263
Trp Asp Tyr Phe His Ser Val Leu Leu Ile Lys His Ala Thr Glu Arg
725 730 735 740
aat gga gta aat gtg gtt agt gga cca ata ttt gat tat aat tat gat 2311
Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Ile Phe Asp Tyr Asn Tyr Asp
745 750 755
ggc cat ttt gat gct cca gat gaa att acc aaa cat tta gcc aac act 2359
Gly His Phe Asp Ala Pro Asp Glu Ile Thr Lys His Leu Ala Asn Thr
760 765 770
gat gtt ccc atc cca aca cac tac ttt gtg gtg ctg acc agt tgt aaa 2407
Asp Val Pro Ile Pro Thr His Tyr Phe Val Val Leu Thr Ser Cys Lys
775 780 785
aac aag agc cac aca ccg gaa aac tgc cct ggg tgg ctg gat gtc cta 2455
Asn Lys Ser His Thr Pro Glu Asn Cys Pro Gly Trp Leu Asp Val Leu
790 795 800
ccc ttt atc atc cct cac cga cct acc aac gtg gag agc tgt cct gaa 2503
Pro Phe Ile Ile Pro His Arg Pro Thr Asn Val Glu Ser Cys Pro Glu
805 810 815 820
ggt aaa cca gaa gct ctt tgg gtt gaa gaa aga ttt aca gct cac att 2551
Gly Lys Pro Glu Ala Leu Trp Val Glu Glu Arg Phe Thr Ala His Ile
825 830 835
gcc cgg gtc cgt gat gta gaa ctt ctc act ggg ctt gac ttc tat cag 2599
Ala Arg Val Arg Asp Val Glu Leu Leu Thr Gly Leu Asp Phe Tyr Gln
840 845 850
gat aaa gtg cag cct gtc tct gaa att ttg caa cta aag aca tat tta 2647
Asp Lys Val Gln Pro Val Ser Glu Ile Leu Gln Leu Lys Thr Tyr Leu
855 860 865
cca aca ttt gaa acc act att taa cttaataatg tctacttaat atataattta 2701
Pro Thr Phe Glu Thr Thr Ile
870 875
ctgtataaag taattttggc aaaatataag tgattttttc tggagaattg taaaataaag 2761
ttttctattt ttccttaaaa aaaaaaccgg aattccgggc ttgggaggct gaggcaggag 2821
actcgcttga acccgggagg cagaggttgc agtgagccaa gattgcgcca ttgcactcca 2881
gagcctgggt gacagagcaa gactacatct caaaaaataa ataaataaaa taaaagtaac 2941
aataaaaata aaaagaacag cagagagaat gagcaaggag aaatgtcaca aactattgca 3001
aaatactgtt acactgggtt ggctctccaa gaagatactg gaatctcttc agccatttgc 3061
ttttcagaag tagaaaccag caaaccacct ctaagcggag aacatacgat tctttattaa 3121
gtagctctgg ggaaggaaag aataaaagtt gatagctccc tgattgggaa aaaatgcaca 3181
attaataaag aatgaagatg aaagaaagca tgcttatgtt gtaacacaaa aaaaattcac 3241
aaacgttggt ggaaggaaaa cagtatagaa aacattactt taactaaaag ctggaaaaat 3301
tttcagttgg gatgcgactg acaaaaagaa cgggatttcc aggcataaag ttggcgtgag 3361
ctacagaggg caccatgtgg ctcagtggaa gacccttcaa gattcaaagt tccatttgac 3421
agagcaaagg cacttcgcaa ggagaagggt ttaaattatg ggtccaaaag ccaagtggta 3481
aagcgagcaa tttgcagcat aactgcttct cctagacagg gctgagtggg caaaatacga 3541
cagtacacac agtgactatt agccactgcc agaaacaggc tgaacagccc tgggagacaa 3601
gggaaggcag gtggtgggag ttgttcatgg agagaaagga gagttttaga accagcacat 3661
ccactggaga tgctgggcca ccagacccct cccagtcaat aaagtctggt gcctcatttg 3721
atctcagcct catcatgacc ctggagagac cctgatacca tctgccagtc cccgacagct 3781
taggcactcc ttgccatcaa cctgaccccc cgagtggttc tccaggctcc ctgccccacc 3841
cattcaggcc ggaattc 3858
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Met Glu Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Glu Gln Pro Val Lys Lys Asn
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Thr Leu Lys Lys Tyr Lys Ile Ala Cys Ile Val Leu Leu Ala Leu Leu
20 25 30
Val Ile Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys Leu
35 40 45
Glu Lys Gln Gly Ser Cys Arg Lys Lys Cys Phe Asp Ala Ser Phe Arg
50 55 60
Gly Leu Glu Asn Cys Arg Cys Asp Val Ala Cys Lys Asp Arg Gly Asp
65 70 75 80
Cys Cys Trp Asp Phe Glu Asp Thr Cys Val Glu Ser Thr Arg Ile Trp
85 90 95
Met Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Thr Arg Leu Glu Ala Ser Leu
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Asp Asp Cys Leu Gln Arg Lys Asp Cys Cys Ala Asp
115 120 125
Tyr Lys Ser Val Cys Gln Gly Glu Thr Ser Trp Leu Glu Glu Asn Cys
130 135 140
Asp Thr Ala Gln Gln Ser Gln Cys Pro Glu Gly Phe Asp Leu Pro Pro
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Val Ile Leu Phe Ser Met Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu Tyr Thr
165 170 175
Trp Asp Thr Leu Met Pro Asn Ile Asn Lys Leu Lys Thr Cys Gly Ile
180 185 190
His Ser Lys Tyr Met Arg Ala Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn
195 200 205
His Tyr Thr Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile
210 215 220
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Ser Lys Glu Gln Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp
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His Tyr Ala Lys Asn Val Arg Ile Asp Lys Val His Leu Phe Val Asp
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Gly Asn His Gly Tyr Asn Asn Glu Phe Arg Ser Met Glu Ala Ile Phe
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acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt ggt tac tac tgg 198
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atc tat tac agt ggg agc acc tac tac aac ccg tcc ctc aag agt cga 294
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg
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gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aac cag ttc tcc ctg aag ctg 342
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gct ata gtg act acg atc ccg ggc ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg 438
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acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc 486
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Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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aac tca ggc gct ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc cca gct gtc cta 630
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cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc 678
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Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
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agc aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag cgc aaa tgt tgt gtc gag 774
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tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg tca gtc ttc ctc 822
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
300 305 310
cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc 1014
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
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acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag 1062
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1110
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1158
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Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr
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Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
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Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
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115 120 125
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
145 150 155 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
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Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
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Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
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Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 8
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(233)
<223> H16-7.8轻链
<400> 8
Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala
1 5 10 15
Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val
20 25 30
Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
35 40 45
Gly Ile Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser
85 90 95
Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Arg Ser
100 105 110
Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成地构建的轻链肽
<400> 9
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成地构建的重链肽
<400> 10
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25
<210> 11
<211> 369
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(369)
<223> H16-7.8重链可变区
<400> 11
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggatcatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgaactctgt gactgccgcg gacacggccg tgttttactg tgcgagagtg 300
gctatagtga ctacgatccc gggcggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 12
<211> 452
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(452)
<223> H16-7.8轻链可变区
<400> 12
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60
atcacctgcc gggccagtca gagcattggt attagcttac actggtacca gcagaaacca 120
gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240
gaagatgctg caacgtatta ctgtcatcag agtaggagtt tcccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg ga 452

Claims (15)

1.一种抗体药物偶联物，其包括：
特异性结合于包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白的一种抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段包括以下氨基酸序列：由SEQ ID NO:7的残基20至142的氨基酸序列组成的重链可变区，以及由SEQ ID NO:8的残基20至127的氨基酸序列组成的轻链可变区，并且其中所述抗体或抗原结合片段偶联到单甲基auristatin F(MMAF)上。
2.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中该抗原结合片段是Fab、F(ab′)2或Fv片段。
3.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中该抗体是一种完全人类抗体。
4.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，该抗体或抗原结合片段是以重组方式生产的。
5.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗体或抗原结合片段通过接头与MMAF偶联。
6.一种抗体药物偶联物，其通过包括如下步骤的方法获得：使得抗体或其抗原结合片段与单甲基auristatin F(MMAF)通过接头偶联，其中所述抗体或其抗原结合片段由宿主细胞表达，所述宿主细胞包含编码含重链可变区的氨基酸序列的核酸序列和编码含轻链可变区的氨基酸序列的核酸序列，所述重链可变区由SEQ ID NO:7的残基20至142的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由SEQ ID NO:8的残基20至127的氨基酸序列组成，由此产生所述抗体药物偶联物。
7.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗体药物偶联物具有如下的结构：
其中，mAb-S是特异性结合包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的161P2F10B蛋白的抗体或抗原结合片段，且p为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
8.一种药物组合物，包括人类单位剂量形式的如权利要求1所述的抗体药物偶联物。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中该组合物是用于癌症治疗。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中该癌症是肾癌或肝癌。
11.如权利要求1所述的抗体药物偶联物在制备抑制对象体内癌细胞生长的药物中的应用。
12.偶联于特异性地结合于包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白的抗体或其片段的一种或多种MMAF在制备将细胞毒性剂或诊断剂递送至细胞的抗体药物或片段药物偶联物中的应用，其中该抗体或片段包括以下氨基酸序列：由SEQ ID NO:7的残基20至142的氨基酸序列组成的重链可变区，以及由SEQ ID NO:8的残基20至127的氨基酸序列组成的轻链可变区
13.如权利要求1所述的抗体药物偶联物在制备用于治疗哺乳动物体内肿瘤的药物中的应用。
14.如权利要求1所述的抗体药物偶联物在制备用于与辐射、化学治疗剂、药物或生物活性治疗组合来降低哺乳动物体内肿瘤生长的药物中的应用。
15.如权利要求1所述的抗体药物偶联物在制备用于与化学治疗剂组合来治疗哺乳动物体内癌症的药物中的应用。
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