BRPI0609655A2 - anticorpos e moléculas relacionadas que ligam-se às proteìnas 161p2f10b - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS E MOLéCULAS RELACIONADAS QUE LIGAM-SE àS PROTEìNAS 161 P2F10B. A presente invenção refere-se a anticorpos e moléculas derivadas deles que ligam-se à proteína 161P2F10B e variantes desta, são descritos em que 161P2F10B exibe a expressão específica de tecido em tecido adulto normal, e é aberrantemente expressa nos cânceres listados na Tabela 1. Consequentemente, 161P2F10B fornece um alvo diagnóstico, prognóstico, profilático e/ou terapêutico para o câncer. O gene 161P2F10B ou fragmento deste, ou sua proteína codificada, ou variantes desta, ou um fragmento desta, podem ser usado para eliciar uma resposta imene humoral ou celular; anticorpos ou células T reativas com 161P2F10B podem ser usadas em imunização ativa ou passiva.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS E MOLÉCULAS RELACIONADAS QUE LIGAM-SE ÀS PROTEÍNAS 161P2F10B".

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção descrita aqui refere-se a anticorpos, bem como fragmentos de ligação destes e moléculas construídas destes, aquelas proteínas de ligação, denominadas 161P2F10B. A invenção também refere-se a métodos diagnósticos, prognósticos, profiláticos e terapêuticos e composições úteis no tratamento de cânceres que expressam 161P2F10B.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Câncer é a segunda causa indutora de morte humana após doença coronariana. Mundialmente, milhões de pessoas morrem de câncer todo ano. Nos Estados Unidos apenas, como reportado pela Sociedade de Câncer Americana, o câncer causa a morte de bem acima de meio milhão de pessoas anualmente, com acima de 1,2 milhão de novos casos diagnosticados por ano. Enquanto mortes de doença cardíaca têm sido declinadas significantemente, aquelas resultantes de câncer geralmente estão em aumento. Na primeira parte do próximo século, o câncer é prognosticado a tornar-se a causa indutora de morte.

Mundialmente, diversos cânceres sobressaem-se como assassinos indutores. Em particular, carcinomas do pulmão, próstata, mama, cólon, pâncreas, ovário, e bexiga representam as causas primárias de morte de câncer. Estes e virtualmente todos os outros carcinomas compartilham um aspecto letal comum. Com muito poucas exceções, doença metastática deum carcinoma é fatal. Além disso, mesmo para aqueles pacientes de câncer que inicialmente sobrevivem de seus cânceres primários, experiência comum tem mostrado que suas vidas são dramaticamente alteradas. Muitos pacientes de câncer experimentam fortes ansiedades controladas por consciência do potencial para recorrência ou falha de tratamento. Muitos paciehtes de câncer experimentam debilitações seguindo tratamento. Além disso, muitos pacientes de câncer experimentam uma recorrência.

Mundialmente, o câncer de próstata é o quarto câncer mais pre-dominante em homens. Na América do Norte e Europa Setentrional, é por grande diferença o câncer mais comum em machos e é a segunda causa indutora de morte de câncer em homens. Nos Estados Unidos apenas, bem acima de 30.000 homens morrem anualmente desta doença - segundo apenas de câncer de pulmão. A despeito da magnitude destas figuras, não existe ainda nenhum tratamento eficaz para câncer de próstata metastático. A prostatactomia cirúrgica, terapia de radiação, terapia de ablação de hormônio, castração cirúrgica e quimioterapia continuam a ser as principais modalidades de tratamento.

Infelizmente, estes tratamentos são ineficazes para muitos e são freqüentemente associados com conseqüências indesejáveis.

No primeiro diagnóstico, a falta de um marcador de tumor de próstata que pode precisamente detectar o estágio precoce, os tumores localizados permanecem uma limitação significante na diagnose e controle desta doença. Embora o ensaio de antígeno específico de próstata de soro (PSA) tenha sido uma ferramenta muito útil, entretanto sua especificidade e utilidade geral são amplamente consideradas como deficientes em diversos aspectos importantes.

Progresso em identificação de marcadores específicos adicionais para câncer de próstata foi melhorado pela geração de xenoenxertos de câncer de próstata que podem recapitular diferentes estágios da doença em camundongos. Os xenoenxertos de LAPC (Los Angeles Próstata Câncer) são xenoenxertos de câncer de próstata que têm passagem sobrevivida em camundongos imunodeficientes combinados severos (SCID) e têm exibido a capacidade de imitar a transição de dependência de androgênio para independência de androgênio (Klein e outro, 1997, Nat. Med. 3:402). Mais recentemente identificados os marcadores de câncer de próstata identificados incluem PCTA-I (Su e outro, 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 7252), antígeno de membrana específica de próstata (PSM) (Pinto e outro, Clin Câncer Res, 2 de setembro de 1996 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, e outro, Pròc Natl Acad Sei U S A., 7 de dezembro de 1999; 96(25): 14523-8) e antígeno de célula tronco de próstata (161P2F10B) (Reiter e outro, 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 1735).Enquanto que marcadores previamente identificados tais como PSA, PSM, PCTA e 161P2F10B têm facilitado esforços para diagnóstico e tratamento de câncer de próstata, existe necessidade da identificação de marcadores adicionais e alvos terapêuticos para próstata e cânceres relacionados a fim de melhorar o diagnóstico e terapia.

O carcinoma de célula renal (RCC) é responsável por aproxima-damene 3 por cento de malignidades de adulto. Visto que os adenomas a-tingem um diâmetro de 2 a 3 cm, existe potencial maligno. No adulto, os dois principais tumores renais malignos são adenocarcinoma de célula renal e carcinoma de célula transicional da pelvis renal ou ureter. A incidência de adenocarcinoma de célula renal é estimada em mais do que 29.000 casos nos Estados Unidos, e mais do que 11.600 pacientes morreram desta doença em 1998. O carcinoma de célula transicional é menos freqüente, com uma incidência de aproximadamente 500 casos por ano nos Estados Unidos.

A cirurgia tem sido a terapia primária para adenocarcinoma de célula renal durante muitas décadas. Até recentemente, a doença metastáti-ca foi refratária em qualquer terapia sistêmica. Com recentes desenvolvimentos em terapias sistêmicas, particularmente as imunoterapias, carcinoma de célula renal metastática pode ser abordado agressivamente em pacientes apropriados com uma possibilidade de respostas duráveis. Todavia, existe uma necessidade subsistente de terapias eficazes para estes pacientes.

De todos os novos casos de câncer nos Estados Unidos, o câncer de bexiga representa aproximadamente 5 por cento em homens (quinto mais comum neoplasma) e 3 por cento em mulheres (oitavo mais comum neoplasma). A incidência é lentamente crescente, concorrente com uma população mais velha crescente. Em 1998, houve uma estimativa de 54.500 casos, incluindo 39.500 em homens e 15.000 em mulheres. A incidência a-justada à idade nos Estados Unidos é de 32 por 100.000 para homens e oito por 100.000 em mulheres. A relação de macho/fêmea histórica de 3: 1 pode ser decrescente com relação aos padrões de fumo em mulheres. Houve uma estimativa de 11.000 mortes de câncer de bexiga em 1998 (7.800 em ho-mens e 3.900 em mulheres). A incidência de câncer de bexiga e mortalidade fortemente aumentam com a idade e serão um problema crescente conforme a população toma-se mais idosa.

A maioria dos cânceres de bexiga recorrem na bexiga. O câncer de bexiga é controlado com uma combinação de ressecção transuretral da bexiga (TUR) e quimioterapia intravesical ou imunoterapia. A natureza multi-focal e recorrente de câncer de bexiga mostra as limitações de TUR. A maioria dos cânceres invasivos musculares não é curada por TUR sozinha. A custectomia radical e diversão urinaria são os métodos mais eficazes para eliminar o câncer, porém trazem um impacto incontestável sobre a função urinaria e sexual. Continua a existir uma significante necessidade de modalidades de tratamento que são benéficas para pacientes de câncer de bexiga.

Uma estimativa de 130.200 casos de câncer colorretal que ocorreram em 2000 nos Estados Unidos, incluindo 93.800 casos de câncer de cólon e 36.400 de câncer retal. Os cânceres colorretais são o terceiro mais comum dos cânceres em homens e mulheres. As taxas de incidência declinaram significantemente durante 1992-1996 (-2,1% por ano). As pesquisas sugerem que estes declínios foram devido à triagem aumentada e remoção de pólipo, prevenindo a progressão de pólipos para câncer invasivos. Houve uma estimativa de 56.300 mortes (47.700 de câncer de cólon, 8.600 de câncer retal) em 2000, responsável por cerca de 11% de todas as mortes de câncer dos Estados Unidos.

No momento, a cirurgia é a forma mais comum de terapia para câncer colorretal, e para cânceres que não se disseminam, é freqüentemente curativo. Quimioterapia, ou quimioterapia mais radiação, é administrada antes ou após a cirurgia a maioria dos pacientes cujo câncer perfurou pro-fundamene a parede do intestino ou disseminou-se para os linfonodos. Uma colostomia permanente (criação de uma abertura abdominal para eliminação de excreções corporais) é ocasionalmente necessária para câncer de cólon e é raramene requerida para câncer retal. Continua a existir uma necessidade de modalidades de diagnóstico e de tratamento eficazes para câncer colorretal.Houve uma estimativa de 164.100 novos casos de câncer de pulmão e brônquico em 2000, responsáveis por 14% de todos os diagnósticos de câncer nos Estados Unidos. A taxa de incidência de câncer de pulmão e brônquico está declinando significantemente em homens, de um auge de 86,5 por 100.000 em 1984 a 70,0 em 1996. Nos anos 1990, a taxa de aumento entre mulheres começou a diminuir a marcha. Em 1996, a taxa de incidência em mulheres foi de 42,3 por 100.000.

O câncer de pulmão e brônquico causou uma estimativa de 156.900 mortes em 2000, sendo responsável por 28% de todas as mortes por câncer. Durante 1992-1996, a mortalidade de câncer de pulmão declinou significantemente entre homens (-1,7% por ano), enquanto as taxas para mulheres foram ainda significantemente crescentes (0,9% por ano). Desde 1987, mais mulheres morreram a cada ano de câncer de pulmão do que câncer de mama, que, durante mais de 40 anos, foi a maior causa de morte de câncer em mulheres. A incidência de câncer de pulmão e taxas de mortalidade mais provavelmente resultaram de taxas de fumo diminuídas durante os anteriores 30 anos; entretanto, o decréscimo dos padrões de fumo entre mulheres ficam atrás daqueles dos homens. De interesse, embora os declínios em uso de tabaco adulto tenham reduzido, o uso de tabaco em jovem está crescendo novamente.

As opções de tratamento para câncer de pulmão e brônquico são determinadas pelo tipo e estágio do câncer e incluem cirurgia, terapia de radiação, e quimioterapia. Para muitos cânceres localizados, a cirurgia é u-sualmente o tratamento de escolha. Porque a doença tem geralmente se disseminado pelo tempo em que é descoberto, a terapia de radiação e quimioterapia são freqüentemente necessárias em combinação com cirurgia. Quimioterapia sozinha ou combinada com radiação é o tratamento de escolha para câncer de pulmão de célula pequena; neste regime, um grande percentual de pacientes experimenta remissão, que em alguns casos é de longa duração. Existe entretanto, uma necessidade crescente de tratamento e métodos diagnósticos eficazes para cânceres de pulmão e brônquico.

Uma estimativa de que 182.800 novos casos invasivos de cân-cer de mama foram supostos ocorrer entre mulheres nos Estados Unidos durante 2000. Adicionalmente, cerca de 1.400 novos casos de câncer de mama foram supostos serem diagnosticados em homens em 2000. Após aumentar 4% por ano nos anos 1980, as taxas de incidência de câncer de mama em mulheres desnivelaram-se nos anos 1990 para cerca de 110,6 casos por 100,000.

Nos Estados Unidos apenas, houve uma estimativa de 4.1.200 mortes (40.800 mulheres, 400 homens) em 2000 devido ao câncer de mama. O câncer de mama está em segundo lugar entre as mortes de câncer em mulheres. De acordo com os mais recentes dados, as taxas de mortalidade declinaram significantemente durante 1992-1996 com os maiores decréscimos em mulheres mais jovens, tanto brancas quanto negras. Estes decréscimos foram provavelmente o resultado da detecção precoce e tratamento melhorado.

Levando em consideração as circunstâncias médicas e as preferências do paciente, tratamento de câncer de mama pode envolver lumpec-tomia (remoção local do tumor) e remoção dos linfonodos sob o braço; mastectomia (remoção cirúrgica da mama) e remoção do linfonodos sob o braço; terapia de radiação; quimioterapia; ou terapia de hormônio. Freqüentemente,dois ou mais métodos são usados em combinação. Numerosos estudos têm mostrado que, para doença em estágio precoce, taxas de sobrevivência a longo prazo após lumpectomia mais radioterapia são similares às taxas de sobrevivência após mastectomia radical modificada. Significantes avanços em técnicas de reconstrução fornecem diversas opções para reconstrução de mama após mastectomia. Recentemente, tal reconstrução foi feita ao mesmo tempo que a mastectomia.

Incisão local de carcinoma dutal in situ (DCIS) com quantidades adequadas de tecido de mama normal circundante pode prevenir a recorrência local do DCIS. A radiação para a mama e/ou tamosifeno pode reduzir a chance de DCIS ocorrer no tecido de mama restante. Isto é importante porque DCIS, se deixado não tratado, pode desenvolver-se em câncer de mama invasivo. Todavia, existem sérios efeitos colaterais ou seqüelas para es-tes tratamentos. Existe, portanto, uma necessidade de tratamentos de câncer de mama eficazes.

Houve uma estimativa de 23.100 novos casos de câncer de ová-rio nos Estados Unidos em 2000. Ele é responsável por 4% de todos os cânceres entre mulheres e ocupa o segundo lugar entre os cânceres ginecológi-cos. Durante 1992-1996, a incidência de câncer de ovário foi significante-mente declinando. Com relação ao câncer de ovário, houve uma estimativa de 14.000 mortes em 2000. O câncer de ovário causa mais mortes do que qualquer outro câncer do sistema reprodutivo feminino.

Cirurgia, terapia de radiação, e quimioterapia são opções de tratamento para câncer de ovário. A cirurgia geralmente inclui a remoção de um ou ambos os ovários, tubas de falópio (salpingo- ooforectomia), e o útero (histerectomia). Em alguns tumores muito precoces, apenas o ovário envolvido será removido, especialmente em mulheres jovens que desejam ter filhos. Em doença avançada, uma tentativa é feita para remover toda a doença intra-abdominal para realçar o efeito de quimioterapia. Continua a existir uma importante necessidade de opções de tratamento eficaz para câncer de ovário.

Houve uma estimativa de 28.300 novos casos de câncer pancreático nos Estados Unidos em 2000. Durante os últimos 20 anos, taxas de câncer pancreatico declinaram em homens. As taxas entre as mulheres permaneceram aproximadamente constante, porém podem estar começando a declinar. O câncer pancreatico causou uma estimativa de 28.200 mortes em 2000 nos Estados Unidos. Durante os últimos 20 anos, houve um ligeiro, porém significante decréscimo em taxas de mortalidade entre os homens (cerca de - 0,9% por ano), enquanto que as taxas aumentaram ligeiramente entre as mulheres.

Cirurgia, terapia de radiação, e quimioterapia são opções de tratamento para câncer pancreatico. Estas opções de tratamento podem estender a sobrevivência e/ou aliviar os sintomas em muitos pacientes, porém não são prováveis de produzir uma cura em geral. Existe uma significante necessidade de opções terapêuticas e diagnosticas adicionais para cânceres.Estas incluem o uso de antibióticos, vacinas, e pequenas moléculas como modalidades de tratamento. Adicionalmente, existe também uma necessidade de uso destas modalidades como ferramentas de pesquisa para diagnóstico, detectar, monitorar, e também o estado da técnica em todass as áreas de tratamento e estudos de câncer.

A utilidade terapêutica de anticorpos monoclonais (mAbs) (G. Kohler e C. Milstein, Nature 256:495-497 (1975)) está sendo realizada. Anticorpos monoclonais foram atualmente aprovados como terapias em transplante, câncer, doença infecciosa, doença cardiovascular e inflamação. Diferentes isótipos têm diferentes funções efetoras. Tais diferenças em função são refletidas em estruturas tridimensionais distintas para os vários isótipos distintos de imunoglobulina (P.M. Alzari e outro, Annual Rev. Immunol., 6:555-580(1988)).

Porque os camundongos são convenientes para a imunização e reconhecem a maioria dos antígenos humanos como estranhos, mAbs contra alvos humanos com potencial terapêutico têm sido tipicamente de origem murina. Entretanto, os mAbs murinos têm desvantagens inerentes como terapêuticos humanos. Eles requerem dosagem mais freqüente quando mAbs têm uma meia-vida circulante mais curta em seres humanos do que anticorpos humanos. Mais criticamente, a administração repetida de anticorpos murinos ao sistema imune humano causa o sistema imune humano responder reconhecendo a proteína de camundongo como uma estranha e gerando uma resposta de anticorpo anticamundongo humano (HAMA). Uma tal resposta de HAMA pode resultar em reação alérgica e a rápida depuração do anticorpo murino do sistema, desse modo tornando o tratamento por anticorpo murino inútil. Para evitar tais efeitos, tentativas para criar sistemas imunes humanos dentro de camundongos foram realizadas.

As tentativas iniciais esperaram criar camundongos transgênicos capazes de responder aos antígenos com anticorpos tendo seqüências humanas (Veja Bruggemann e outro, Proc. Nafl. Acad. Sei. USA 86:6709-6713 (1989)), porém foram limitados pela quantidade de DNA que pode ser estavelmente mantida por veículos de clonagem disponíveis. O uso de veto-res de clonagem de cromossoma artificial de levedura (YAC) induziu ao meio de introduzir grandes fragmentos de linha germinativa de locos Ig humanos em mamíferos transgênicos. Essencialmente uma maioria dos genes de região V, D, e J humanas dispostos com o mesmo espaçamento encontrado no genoma humano e as regiões constantes humanas foram introduzidas em camundongos usando YACs. Uma tal linhagem de camundongo trans-gênica é conhecida como camundongos XenoMouse® e é comercialmente disponível de Abgenix, Inc. (Fremont CA).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção fornece anticorpos bem como fragmentos de ligaçãodestes e moléculas construídas destes, que ligam-se às proteínas 161P2F10B e fragmentos de polipeptídeo de proteínas 161P2F10B. A invenção compreende anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos muri-nos e outros mamíferos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e totalmente humanos, e anticorpos rotulados com um marcador detectável ou agente terapêutico. Em certas modalidades, existe uma condição de que a seqüência de ácido nucléico inteira da Figura 3 não é codificada e/ou a seqüência de aminoácido inteira da Figura 2 não é preparada. Em certas modalidades, a seqüência de ácido nucléico inteira da Figura 3 é codificada e/ou a seqüência de aminoácido inteira da Figura 2 é preparada, quaisquer das quais está nas formas de dose unitária humana respectivas.

A invenção também fornece métodos para detectar a presença e estado de polinucleotídeos e proteínas 161P2F10B em várias amostras biológicas, bem como métodos para identificar células que expressam 161P2F10B. Uma modalidade desta invenção fornece métodos para monitorar os produtos de gene 161P2F10B em uma amostra de tecido ou hematologia tendo ou suspeita de ter alguma forma de desregulação de crescimento, tal como câncer.

A invenção também fornece várias composições imunogênicas ou terapêuticas e estratégias para tratar cânceres que expressam 161P2F10B tal como cânceres de tecidos listados na Tabela I, incluindo terapias alvejadas na inibição da transcrição, translação, processo ou funçãode 161P2F10B, bem como vacinas de câncer. Em um aspecto, a invenção fornece composições, e métodos compreendendo-as, para tratar um câncer que expressa 161P2F10B em um indivíduo humano que composição em que a composição compreende a veículo adequado para uso humano e uma dose unitária humana de um ou mais do que um agente que inibe a produção ou função de 161P2F10B. Preferivelmente, o veículo é um veículo unicamente humano. Em outro aspecto da invenção, o agente é uma porção que é imunorreativa com a proteína 161P2F10B. Exemplos não-limitantes de tais porções incluem, porém não estão limitados a, anticorpos (tais como anti-corpos de cadeia única, monoclonal, policlonal, humanizado, quimérico, ou humano), equivalentes funcionais destes (se de ocorrência natural ou sintética), e combinações destes. Os anticorpos podem ser conjugados a uma porção diagnostica ou terapêutica. Em outro aspecto, o agente é uma molécula pequena como aqui definido.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1

Figura 1A A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:1) e aminoácido (SEQ ID NO:2) da variante 1 de 161P2F10B (também chamada "161P2F10B v.1" ou "161P2F10B variant 1") é mostrada na Figura 1A. A seqüência de nucleotido 3858 de variante 1 de

161P2F10B é mostrada. A metionina de partida é sublinhada. A estrutura de leitura aberta estende-se de ácido nucléico 44-2671 incluindo o códon de interrupção. Figura 1B A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:3) e aminoácido (SEQ ID NO:4) da variante 2 de 161P2F10B (também chamada "161P2F10B v.2") é mostrada na Figura 1B. A seqüência e nucleotido 3858 da variante 2 de 161P2F10B é mostrada. O códon para a metionina de partida é sublinhado. A estrutura de leitura aberta estende-se de ácido nucléico 44-2671 incluindo o códon de interrupção.

Figura 1C A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:5) e aminoácido (SEQ ID N0:6) de variante 3 de 161P2F10B (também chamada"161P2F10B v.3") é mostrada na Figura 1C. A seqüência de nu-cleotido 3858 de variante 3 de 161P2F10B e mostrada. O códon para a metionina de partida é sublinhado. A estrutura de leitura aberta de ácido nucléico 44-2671 incluindo o códon de interrupção.

Figura 1D A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:7) e aminoácido (SEQ ID NO:8) de variante 4 de 161P2F10B (também chamada "161P2F10B v.4") é mostrada na Figura 1D. A seqüência de nu-cleotido 3858 de variante 4 de 161P2F10B é mostrada.

O códon para a metionina de partida é sublinhado. A estrutura de leituraaberta estende-se de ácido nucléico 44-2671 incluindo o códon de partida.

Figura 1E A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:9) e aminoácido (SEQ ID NO: 10) de variante 5 de 161P2F10B (também chamada "161P2F10B v.5") é mostrada na Figura 1E. A seqüência de nucleotido 3858 de variante 5 de 161P2F10B é mostrada. O códon para a metionina de partida é sublinhado. A estrutura de leitura aberta estende-se de ácido nucléico 44-2671 incluindo o códon de partida.

Figura 1F A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 11) e aminoácido (SEQ ID NO: 12) de variante t de 161P2F10B (também chamada "161P2F10B v.6") é mostrada na Figura 1F. A seqüência de nu-cleotido 3165 de variante 6 de 161P2F10B é mostrada.

O códon para a metionina de partida é sublinhado. A estrutura de leitura aberta estende-se de ácido nucléico 84-2711 incluindo o códon de partida.

Figura 1G A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:13) e aminoácido (SEQ ID NO: 14) de variante 7 de 161P2F10B (também chamada "161P2F10B v.7") é mostrada na Figura 1G. A seqüência de nucleotido 3988 de variante 7 de 161P2F10B é mostrada.

O códon para a metionina de partida é sublinhado. A estrutura de leitura aberta estende-se de ácido nucléico 276-2801 incluindo o códonde partida.

Figura 2

Seqüências de Ácido Nucléico e Aminoácido de anticorpos de 161P2F10b

Figura 2A Seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 15) e aminoácido (SEQ ID NO:16) de H16-7.213 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2B A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 17) e aminoácido (SEQ ID NO: 18) de H16-7.213 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2C A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 19) e aminoácido (SEQ ID NO:20) de H16-9.69 VH. Duplo-sublinhado é a seqüência líder, e sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2D A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:21) e aminoácido (SEQ ID NO:22) de H16-9.69 VL. O duplo sublinhado é a seqüência líder, e sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2E A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:23) e aminoácido (SEQ ID NO:24) de H16-1.52 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada. Figura 2F A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:25) e aminoácido (SEQ ID NO:26) de H16-1.52 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2G A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:27) e aminoácido (SEQ ID NO:28) de Ha16-1 (1)23 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2H A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:29) e aminoácido (SEQ ID NO:30) de Ha16-1 (1)23 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2 I A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:31) e aminoácido (SEQ ID NO:32) de Ha16- 9.44 VH. O sublinhado é uma porção da re-gião constante de cadeia pesada.

Figura 2J A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:33) e aminoácido (SEQ ID NO:34) de H16-9.44 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2K A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:35) e aminoácido (SEQ ID NO:36)deH16-1.67VH.

Figura 2L A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:37) e aminoácido (SEQ ID NO:38) de H16-1.67 VL. O sublinhado é a região constante de cadeia leve.

Figura 2M A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:39) e aminoácido (SEQ ID NO:40) de Ha16-1 (3,5)36 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2N A seqüência cDNA (SEQ ID NO:41) e aminoácido (SEQ ID NO:42) de Ha16-1 (3,5)36 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 20 A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:43) e aminoácido (SEQ ID NO:44) de H16-1.86 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2P A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:45) e aminoácido (SEQ ID 20 NO:46) de H16-1.86 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2Q A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:47) e aminoácido (SEQ ID NO:48) de Ha16-9.10 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2R A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:49) e aminoácido (SEQ ID NO:50) de H16-9.10 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2S A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:51) e aminoácido (SEQ ID NO:52) de H16-9.33 VH. O sublinhado é uma porção da regiãoconstante de cadeia pesada.

Figura 2T A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:53) e aminoácido (SEQ ID NO:54) de H 16-9.33 VL. O sublinhado é uma porção da regiãoconstante de cadeia leve.

Figura 2U A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:55) e aminoácido (SEQ ID NO:56) de H16-1.68 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2V A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:57) e aminoácido (SEQ ID NO:58) de H16-1.68 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2W A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:59) e aminoácido (SEQ ID NO:60) de Ha16-1 (1)11 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2X A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:61) e aminoácido (SEQ ID NO:62) de Ha16-1(1)11 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2Y A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:63) e aminoácido (SEQ ID 15 NO:64) de Ha16-1 (3,5)18 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2Z A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:65) e aminoácido (SEQ ID NO:66) de Ha16-1(3,5)18 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AA A seqüência de cDNA (SEQ ID NQ:67) e aminoácido (SEQ ID NO:68) de Ha16-1 (2,4)4 VH.

Figura 2AB A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:69) e aminoácido (SEQ ID NO:70) de Ha16-1 (2,4)4 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AC A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:71) e aminoácido (SEQ ID NO:72) de Ha16-1 (3,5)56 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AD A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:73) e aminoácido (SEQ ID NO:74) de Ha16-1 (3,5)56 VL. O sublinhado é uma porção da 30 região constante de cadeia leve.

Figura 2AE A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:75) e aminoácido (SEQ ID NO:76) de H16-1.93 VH. O sublinhado duplo é a seqüência lí-der, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AF A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:77) e aminoacido (SEQ ID NO:78) de H16-1.93 VL. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AG A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:79) e aminoacido (SEQ ID NO:80) de H16-7.8 VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AH A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:81) e aminoacido (SEQ ID NO:82) de H16-7.8 VL. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AI A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:83) e aminoacido (SEQ ID NO:84) de Ha16-1 (3,5)27.1 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AJ A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:85) e aminoacido (SEQ ID NO:86) de Ha16-1 (3,5)27 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AK A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:87) e aminoacido (SEQ ID NO:88) de H16-1.61 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AL A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:89) e aminoacido (SEQ ID NO:90) de H16-1.61 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AM A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:91) e aminoacido (SEQ ID NO:92) de H16-1(3,5)5 VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AN A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:93) e aminoacido (SEQ ID NO:94) de H16-1(3, 5)5 VL. Sublinhado duplo é parte da se-qüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AO A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:95) e aminoácido (SEQ ID NO:96) de H16-7.200 VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AP A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:97) e aminoácido (SEQ ID NO:98) de H16-7.200 VL. Sublinhado duplo é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AQ A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:99) e aminoácido (SEQ ID NO: 100) de Ha16-1 (3,5)42 VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AR A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 101) e aminoácido (SEQ ID NO: 102) de Ha16-1 (3,5)42 VL. O sublinhado duplo é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AS A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 103) e aminoácido (SEQ ID NO: 104) de H16-9.65 VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AT A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 105) e aminoácido (SEQ ID NO: 106) de H16-9.65 VL. Sublinhado duplo é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AU A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 107) e aminoácido (SEQ ID NO: 108) de H16-1.29 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AV A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 109) e aminoácido (SEQ ID NO:110) de H16-3.4 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.Figura 2AW A seqüência de cDNA (SEQ ID N0:111) e aminoacido (SEQID NO:112) de H16-1.92 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 2AX A seqüência de cDNA(SEQ ID NO: 113) e aminoacido (SEQ ID NO: 114) de Ha16-1 (3,5)19 VL O sublinhado duplo é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da regiãoconstante de cadeia leve.

Figura 2AY A seqüência de cDNA(SEQ ID NO:169) e aminoacido (SEQ ID NO:170) de Ha16-1 (3,5)19 VH. O sublinhado duplo é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AZ A seqüência de cDNA(SEQ ID NO:171) e aminoacido (SEQ ID NO:172) de Ha16-1.80 VH. O sublinhado duplo é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 2AAA A seqüência de cDNA (SEQ ID NO:173) e aminoacido (SEQ ID NO: 174) de Ha16-1.80 VL. O sublinhado duplo é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3

As seqüências de aminoacido de anticorpos de 161P2F10B.

Figura 3A A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:115) de H16-7.213 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3B A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:116) de H16-7.213 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3C A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:117) de H16-9.69 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3D A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:118) de H16-9.69 VL.

O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia le-ve.

Figura 3E A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:119) de H16-1.52 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3F A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 120) de H16-1.52 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3G A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 121) de Ha16-1(1)23 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3H A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 122) de Ha16-1 (1)23 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3 I A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:123) de H16-9.44 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3J A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 124) de H16-9.44 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3K A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:125) de H16-1.67 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3L A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:126) de H16-1.67 VL.

0 sublinhado é a região constante de cadeia leve.

Figura 3M A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 127) de Ha16-1 (3,5)36 VH. O sublinhado é uma porção da região constantede cadeia pesada.

Figura 3N A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:128) de Ha16-1 (3,5)36 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 30 A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:129) de H16-1.86VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeiapesada.

Figura 3P A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:130) de H16-1.86 VLO sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3Q A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:131) de H16-9.10 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3R A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:132) de H16-9.10 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3S A seqüência de aminoácido (SEQ ID N0.133) de H16-9.33 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3T A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:134) de H16-9.33 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3U A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:135) de H16-1.68 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3V A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:136) de H16-1.68 VL O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3W A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:137) de Ha16-1 (1)11 VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3X A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:138) de Ha16-1 (1)11 VL. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3Y A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:139) de Ha16-1(3,5)18 VH. O sublinhado é uma porção da região constantede cadeia pesada.

Figura 3Z A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:140) de Ha16-1(3,5)18 VL. O sublinhado é uma porção da região constantede cadeia leve.

Figura 3AA A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 141) de Ha16-1 (2,4)4 VH.

Figura 3AB A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:142) de Ha16-1(2,4)4 VL. O sublinhado é uma porção da região constante decadeia leve.

Figura 3AC A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:143) de Ha16-1(3,5)56 VH.

Figura 3AD A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:144) de Ha16-1 (3,5)56 VL. O sublinhado é uma porção da região constantede cadeia leve.

Figura 3AE A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:145) de H16-7.8 VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AF A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:146) de H16-7.8 VL.O sublinhado duplo é a seqüência líder. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AG A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 147) de H16-1.93 VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AH A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:148) de H16-1.93 VL. O duplo sublinhado é parte da seqüência líder. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AI A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 149) de Ha16-1(3,5)27.1 VH. O sublinhado duplo é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3AJ A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:150) de Ha16-1 (3,5)27 VL. O sublinhado é uma porção da região constantede cadeia leve.

Figura 3AK A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:151) de H16-1.61VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeiapesada.

Figura 3AL A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:152) de H16-1.61 VLO sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AM A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 153) de H16-1 (3,5)5VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado éuma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3AN A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:154) de H16-1(3,5)5VL. O duplo sublinhado é parte da seqüência líder, e o subli-nhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AO A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:155) de H16-7.200VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado éuma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3AP A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:156) de H16-7.200VL. O duplo sublinhado é parte da seqüência líder, e o subli-nhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AQ A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:157) de Ha16-1(3,5)42 VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sub-linhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3AR A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 158) de Ha16-1(3,5)42 VL. Sublinhado duplo é parte da seqüência líder, e osublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AS A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 159) de H16-9.65VH. O sublinhado duplo é a seqüência líder, e o sublinhado éuma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3AT A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 160) de Hl 6-9.65VL. O duplo sublinhado é parte da seqüência líder, e o subli-nhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AU A seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 161) de Hl 6-1.29VH. O duplo sublinhado é parte da seqüência líder, e o subli-nhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.Figura 3AV A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:162) de H16-3.4 VH.

O sublinhado é uma porção da região constante de cadeia pesada.

Figura 3AW A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:163) de H16-1.92VH. O sublinhado é uma porção da região constante de cadeiapesada.

Figura 3AX A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:164) de Ha16-1(3,5)19 VL. O sublinhado duplo é parte da seqüência líder, eo sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AY A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:175) de Ha16-1(3,5)19 VH. O sublinhado duplo é parte da seqüência líder, eo sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AZ A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:176) de Ha16-1.80VL. O duplo sublinhado é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 3AAA A seqüência de aminoacido (SEQ ID NO:177) de Ha16-1.80VH. O duplo sublinhado é parte da seqüência líder, e o sublinhado é uma porção da região constante de cadeia leve.

Figura 4 Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de anticor-pos de 161P2F10B às Seqüências de linha germinativa V-D-J.

Figura 4A Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-7.213 à linha germinativa humana VH1-2/D3-9/JH4.

Figura 4B Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H 16-9.69à linha germinativa humana VH1-8/D3-10/JH4.

Figura 4C Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-1.52à linha germinativa humana VH3-23/6-19/JH4.

Figura 4D Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha16-1 (1 )23 à linha germinativa humana VH3-33/D3-10/JH6.

Figura 4E Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-9.44à linha germinativa humana VH4-4/D3-22/JH4.

Figura 4F Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-1.67à linha germinativa humana VH4-31/D3-10/JH6.

Figura 4G Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha16-1(3,5)36 à linha germinativa humana VH4-39/D6-19/JH4.

Figura 4H Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-1.86à linha germinativa humana VH4-59/D1-26/JH6.

Figura 4 I Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-9.10à linha germinativa humana VH6-1/D6-19/JH5.

Figura 4J Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H 16-9.33à linha germinativa humana VH6-1/D6-19/JH5.

Figura 4K Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha16-1(1)11 à linha germinativa humana VH4-59/D4-23/JH6.

Figura 4L Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha16-1 (3,5)18 à linha germinativa humana VH4-4/D4-17/JH6.

Figura 4M Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha16-1(2.4) 4 à linha germinativa humana VH3-33/D1-26/JH6.

Figura 4N Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha16-1 (3,5)56 à linha germinativa humana VH5-51/D1-26/JH6.

Figura 4 O Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-7.8 àlinha germinativa humana VH4-31/D5-12/JH6.

Figura 4P Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-1.68à linha germinativa humana VH3-33/D3-3/JH6.

Figura 4Q Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-1.93à linha germinativa humana VHI-18/D6-13/JH6.

Figura 4R Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha16-1(3,5)27 à linha germinativa humana VH5-51/D4-4/JH6.

Figura 4S Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha 16-1.61 à linha germinativa humana VH3-33/D3-3/JH6.

Figura 4T Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha16-1(3.5) 5 à linha germinativa humana VH5-51/D3-10/JH6.

Figura 4U Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-7.200 à linha germinativa humana VH4-31/D4-23/JH4.

Figura 4V Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de Ha16-1 (3,5)42 à linha germinativa humana VH5-51/D4-11/JH6.

Figura 4W Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-9.65 à linha germinativa humana VH3-33/D1-26/JH4.

Figura 4X Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-1.29 à linha germinativa humana VH1-2/D5-12/JH6.

Figura 4Y Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-3.4 à linha germinativa humana VH4-31/D5-12/JH4.

Figura 4Z Alinhamento de Região Variável de Cadeia Pesada de H16-1.92 à linha germinativa humana VH4-39/D4-11/JH3.

Figura 5

Alinhamento de anticorpos de Região Variável de Cadeia Leve de 161P2F10B às seqüências de linha germinativa V-D-J.

Figura 5A Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve de H16-7.213 à linha germinativa humana VK-02/JK4.

Figura 5B Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H16-9.69 à linha germinativa humana VK-B3/JK1.

Figura 5C Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve de H16-1.52 à linha germinativa humana B3/JK2.

Figura 5D Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve de Ha16-1 (1 )23 à linha germinativa humana V1-20/JL2.

Figura 5E Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve de H16-9.44 à linha germinativa humana L1/JK3.

Figura 5F Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H16-1.67 à linha germinativa humana 02/JK1.

Figura 5G Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve Ha16-1(3, 5)36 à linha germinativa humana V1-16/JL2.

Figura 5H Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H16-1.86 à linha germinativa humana 02/JK1.

Figura 5 I Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H16-9.10 à linha germinativa humana L5/JK4.Figura 5J Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H 16-9.33 à li-nha germinativa humana L5/JK4.

Figura 5K Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve Ha16-1 (1)11 àlinha germinativa humana 02/JK3.

Figura 5L Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve Ha16-1(3, 5)18à linha germinativa humana V1-19/JL2.

Figura 5M Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve Ha16-1 (2,4)4 àlinha germinativa humana V2-1/JL2.

Figura 5N Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve Ha16-1 (3,5)56à linha germinativa humana V1 -4/JL2.

Figura 50 Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H16-7.8 à linhagerminativa humana A26/JK1.

Figura 5P Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H16-1.68 à li-nha germinativa humana 02/JK4.

Figura 5Q Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H16-1.93 à li-nha germinativa humana A20/JK3.

Figura 5R Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve Ha16-1(3, 5)27à linha germinativa humana V1-4/JL2.

Figura 5S Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H16-1.61 à li-nha germinativa humana 012/JK3.

Figura 5T Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve Ha16-1 (3, 5)5 àlinha germinativa humana V1-4/JL2.

Figura 5U Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H 16-7.200 àlinha germinativa humana A19/JK5.

Figura 5V Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve Ha16-1(3, 5)42à linha germinativa humana V1-4/JL2.

Figura 5W Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve H16-9.65 à li-nha germinativa humana A19/JK5.

Figura 5X Alinhamento de Região Variável de Cadeia Leve Ha16-1 (3,5)19à linha germinativa humana V1-4/JL2.

Figurão

MAbs 161P2F10B liga-se às células bind to CAKI-161P2F10Bpor FACS. A análise FACS foi realizada empregando-se CAKI-neo como umcontrole negativo. Os resultados mostram que mAbs 161P2F10B especificamente liga-se a humanas 161P2F1OB em células CAKI-161P2F1OB.

Figura 7

Mabs 161P2F1 OB liga-se às células UG-K3 por FACS. A análisede FACS foi realizada empregando-se CAKj-neo como um controle negativo.Os resultados mostram que mAbs 161P2F10B especificamente liga-se a161P2F10B humano em células UG-K3.

Figura 8

Agrupamento de Epítopo de Mab 161P2F10B usando célulasUG-K3. A ligação de cada Mabs 161P2F10B biotinilado nas células UG-K3foi competida com quantidade em excesso de cada dos anticorpos, anticorpos biotinilados foram detectados por estreptavidina-PE. As células foram analisadas empregando-se FACScan. Os valores MFI de FACS foram usados para análise de dados. Como mostrado na tabela, as células são realçadas para indicar autocompetição (100% de competição), o valor de MFI nestas células são controle de base para cada anticorpo biotinilado. Adicionalmente, células sem nenhuma cor indicam que os dois anticorpos competem entre si (baixo MFI), células realçadas em cinza (elevado MFI) indicam que os dois anticorpos ligam-se a dois epítopos distintos. Os resultados mostram os anticorpos que têm o mesmo padrão de ligação ligam-se ao mesmo epítopo entre os anticorpos e que existem 16 grupos de epítopo dentro dos anticorpos testados.

Figura 9

O mapeamento do domínio de MAbs 161P2F10B por imunoprecipitação. Os construtos de expressão de Tag5 codificando ou o domínio extracelular total (ECD) de 161P2F10B (aminoácidos 46-875), o domínio semelhante à somatomedina-b (aminoácidos 46-157), o domínio catalítico (aminoácidos 158-558), ou o domínio catalítico e de nuclease (aminoácidos 158-875) foram transfectadas em células 293T e lisados celulares foram feitos. Estes lisados foram então usados para imunoprecipitação com os MAbs de 161P2F10B ou MAb de controle de H3-1.5 indicados (10 \lq de MAb e100-200 fig de lisado celular). O western blotting dos imunoprecipitados foientão realizado usando um Ab policlonal anti-His que reconhece o rótulo deepítopo His presente em cada proteína recombinante. A faixa de peso mole-cular específico de cada proteína recombinante foi identificada por westernblotting linear dos lisados (mancha linear superior) e é indicada por uma se-ta. MAbs que liga-se ao ECD de tamanho natural e ao domínio semelhante àsomatomedina-b mapeiam para o domínio semelhante à somatomedina-b.MAbs que ligam-se ao ECD de tamanho natural e ao domínio cataiítico, po-rém não ao domínio catalítico+nuclease, traçam o mapa para o domínio ca-talítico. Os MAbs que ligam-se ao ECD de tamanho natural e ao domíniocatalítico+nuclease, porém não ao domínio catalítico, mapeiam para o domí-nio de nuclease. As faixas mostradas na Figura representam: faixa 1. Vetor,faixa 2. ECD de tamanho natural de 161 P2F10b WT de pTagS, faixa 3. Do-mínio semelhante à somatomedina-b de 161P2F10b (46-157) de pTag5, fai-xa 4. Domínio catalítico de 161P2F10b (158-558) de pTtag5, e faixa 5. Do-mínio catalítico + nuclease de 161P2F10b (158-875) de pTag5. Os resulta-dos mostram que esta técnica possibilita o mapeamento de MAbs de161P2F10B para regiões distintas do domínio extracelular.

Figura 10

Mapeamento do domínio de Mab de 161P2F10B. Apresentado àdireita é uma tabela sumário de MAbs de 161P2F10B selecionados, sua afi-nidade relativa como determinado por análise BiaCore sobre ECD de tama-nho natural (aminoácidos 46-875), seu grupo de epítopo como determinadopor um ensaio de competição de MAb com base em FACS, e seu domíniode epítopo como determinado por ensaio de imunoprecipitação empregandolisados celulares contendo ou o ECD de tamanho natural, o domínio seme-lhante à somatomedina-b (aminoácidos 46-157), o domínio catalítico (ami-noácidos 158-558), ou o domínio catalítico e de nuclease (aminoácidos 158-875). Apresentado à esquerda está um esquema da proteína 161P2F10B edesignação dos grupos MAbs. A presença de MAbs dentro de um grupo foiinferida por um ensaio de competição BiaCore em que a capacidade dosMAbs ligarem-se simultaneamente à proteína 161P2F10B é analisada. Aincapacidade de ligar-se simultaneamente sugere que os MAbs comparti-lham o mesmo ou um epítopo de sobreposição. A ligação simultânea sugereque os MAbs empregados pertencem a diferentes grupos de epítopo e reco-nhecem regiões distintas ou de não-sobreposição. A localização de gruposMAb dentro de cada domínio no esquema é arbitrária; entretanto, a coloca-ção de grupos de Nuclease c, d, e, e o grupo catalítico próximo e a proximi-dade de sobreposição entre si foi inferida de dados de competição BiaCoreem que MAbs presentes em diferentes grupos competem com MAbs anali-sados de um painel maior. Estes resultados mostram que os MAbs161P2F10B mapeiam para regiões distintas do domínio extracelular.

Figura 11

Reatividade cruzada de MAbs humanos sobre 161P2F10B decamundongo. As células 161P2F10B de camundongo 293T e 293T-neo fo-ram usadas para testar a reatividade cruzada de mAbs humanos com161P2F10B e camundongo por FACS. 50 ul de MAbs a 2 ug/ml foram incu-bados com células 161P2F10B de camundongo 293T ou 293T-neo (50.000células/100 ul). Anticorpos ligados sobre as células foram detectados em-pregando-se anti-hlgG- PE e analisados em FACS. Os dados foram analisa-dos empregando-se o software CelIQuest Pro. A linha púrpura sólida refere-se a dados de células de controle negativas. A linha verde é de células161P2F10B-positivas. Estes resultados mostram que os MAbs 161P2F10Bligam-se à proteína de camundongo 161P2F10B sobre a superfície celular.

Figura 12

MAbs para 161P2F10B mediam a morte dependente de sapori-na em células KU-812. As células KU-812 são uma linhagem de célula CMLque expressa níveis elevados de 161P2F10B endógeno. As células KU-812(3000 células/cavidade) foram semeadas em uma placa de 96 cavidades nodia 1. No dia seguinte um volume igual de meio contendo concentração de2x do anticorpo primário indicado juntamente com um excesso de 2 vezes deanticorpo policlonal anti-humano (Hum-Zap) conjugado com toxina de sapo-rina (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) foi adicionado a cadacavidade. As células foram deixadas incubar durante 5 dias a 37 graus C. Aofinal do período de incubação, MTS (Promega) foi adicionado a cada cavida-de e a incubação continuou durante mais 4 horas. A densidade ótica a 450nM foi então determinada. Os resultados mostram que os MAbs de161P2F10B MAbs, HA16-9.69, HA16-1.18 e HA16-1.93 mediaram a citotoxi-cidade dependente de saporina em células KU-812 enquanto que um IgGIhumano não específico, de controle, (H3-1.4), e outro Mab de 161P2F10B(HAI 6-7.200) não teve nenhum efeito.Figura 13

Os MAbs de 161P2F10B inibem o crescimento de carcinoma decélula renal. As células de tumor UG-K3 de câncer renal humanas (2,0 x 106células) foram injetadas subcutaneamente nos camundongos SCID machos.Os camundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 em cada grupo) e otratamento iniciou intraperitonealmente (i.p). no dia 0 com os MAbs de trata-mento ou controle de MAb de isótipo como indicado. Os animais foram trata-dos duas vezes por semana durante um total de 8 doses a 750 ng/dose atéo dia 27 de estudo. O crescimento de tumor foi monitorado usando mediçõesde compasso de calibre a cada 3 a 4 dias como indicado. Os resultadosmostram os MAbs 161P2F10B H16-1.29.1.1, Ha16-1 (3,5)27.1, H16-9.69 eHa16-1 (1)11 estatisticamente e significantemente inibiram o crescimento dexenoenxerto de câncer renal humano UG-K3 implantado subcutaneamenteem camundongos SCID (p< 0,05).

Figura 14

Os MAbs 161P2F10B inibem o crescimento de células UG-K3em camundongos SCID. As células de tumor UG-K3 de câncer renal (2,0 x106 células) foram injetadas subcutaneamente em camundongos SCID ma-chos. Os camundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 camundongosem cada grupo) e o tratamento iniciou intraperitonealmente (i.p). no Dia 0com MAbs de tratamento ou controle de MAb de isótipo como indicado. Osanimais foram tratados duas vezes semanalmente durante um total de 6 do-ses até o dia 20 de estudo. O crescimento de tumor foi monitorado usandomedições de compasso de calibre a cada 3 a 4 dias, como indicado. Os re-sultados mostram os MAbs de 161P2F10B MAbs Ha16-11(3,5)27 e Ha16-1(3,5)18 estatisticamente e significantemente inibiram o crescimento de xe-noenxerto de câncer renal humano UG-K3 implantado subcutaneamente noscamundongos SCID (P < 0,05).

Figura 15

Os Mabs de 161P2F10B inibem o xenoenxerto de câncer renalhumano. As células de tumor RXF-393 de câncer renal humano (2,0 x 106células) foram injetadas subcutaneamente nos camundongos SCID machos.

Os camundongos foram aleatorizados nos grupos (n=10 em ca-da grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmente (i.p). no dia 0 comMAbs de tratamento ou controle de MAb de isótipo como indicado. Os ani-mais foram tratados duas vezes por semana durante um total de 7 doses a400 u.g/dose até o dia de estudo 22. O crescimento de tumor foi monitoradoempregando medições de compasso de calibre a cada 3 a 4 dias como indi-cado. Os resultados mostram os MAbs 161P2F10B Ha16-1 (3,5)18 (P<0,01),H16-1.68 (P<0,05) e H16-9.44 (P<0,05) estatisticamente e significantementeinibiram o crescimento de xenoenxerto de câncer renal humano RXF-393implantado subcutaneamente em camundongos SCID.

Figura 16

Os MAbs de 161P2F10B inibem o crescimento de SKRC-01 decâncer renal humano em camundongos SCID. As células de tumor SKRC-01de câncer renal humano (2,5 x 106 células) foram injetadas subcutaneamen-te em camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizadosem grupos (n=10 em cada grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmen-te (i.p). no dia 0 com MAbs de tratamento ou controle de MAb de isótipo co-mo indicado. Os animais foram tratados duas vezes semanalmente duranteum total de 7 doses em 250 u.g/dose até o dia 22 de estudo. O crescimentode tumor foi monitorado usando-se medições de compasso de calibre a cada3 a 4 dias como indicado. Os resultados mostram os MAbs de 161P2F10BH16-1,68 (P<0,05), H16-7.8 (P<0,05), H16-9.44 (P<0,05) e H16-3.4 (P<0,01)estatisticamente e significantemente inibiu o crescimento de xenoenxerto decâncer renal humano SKRC-0I implantado subcutaneamente em camundon-gos SCID.Figura 17

Os MAbs 161P2F10B inibem o crescimento de UG-K3 de câncerrenal humano em camundongos SCID. As células de tumor UG-K3 de câncer renal humanas (2,0 x 106 células) foram injetadas subcutaneamente nos camundongos SCID masculinos. Os camundongos foram aleatorizados emgrupos (n=10 em cada grupo) e o tratamento iniciou intraperitonealmente(i.p). no dia 0 com MAbs de tratamento ou controle de MAb de isótipo comoindicado. Os animais foram tratados duas vezes semanalmente durante umtotal de 6 doses a 750 ^g/dose até o dia 19 de estudo. O crescimento de tumor foi monitorado usando medições de compasso de calibre a cada 3 a 4dias como indicado. Os resultados mostram os MAbs de 161P2F10B H16-1.29.1.1 (P<0,05), Ha16-1(3,5)56 (P<0,01) e Ha16-1(2,4)4 (P<0,05) estatisticamente e significantemente inibiu o crescimento de xenoenxerto de câncer renal humano UG-K3 implantado subcutaneamente em camundongos SCID.

Figura 18

Os MAbs de 161P2F10B inibiram o crescimento de câncer renalhumano UG-K3 em camundongos SCID. As células de câncer renal humanoUG-K3 (2,0 x 106 células) foram injetadas subcutaneamente em camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 em cada grupo) e o tratamento iniciou intraperitonealmente (i.p). no dia 0 osMAbs de tratamento ou controle de MAb de isótipo como indicado. Os animais foram tratados duas vezes semanalmente durante um total de 7 doses a 500 ug/dose até o dia 22 de estudo. O crescimento de tumor foi monitorado usando medições de compasso de calibre a cada 3 a 4 dias como indicado. Os resultados mostram os MAbs de 161P2F10B H16-1.93 e Ha16-1(3,5)18 estatisticamente e significantemente inibiram o crescimento de xenoenxerto de câncer renal humano UG-K3 implantado subcutaneamente em camundongos SCID (P<0,05).

Figura 19

Os MAbs de 161P2F10B inibem o crescimento de câncer renalhumano Ug- K3 em camundongos SCID. As células de tumor UG-K3 decâncer renal humano (2,0 x 106 células) foram injetadas subcutaneamenteem camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizados emgrupos (n=10 em cada grupo) e o tratamento iniciou intraperitonealmente(i.p). no dia 0 como indicado. Para o tratamento de MAb de 161P2F1OB, trêsMAbs a 200 |ig cada foram agrupados entre si em cada dosagem. Os ani-mais foram tratados duas vezes semanalmente durante um total de 7 dosesaté o dia 27 de estudo 27. O crescimento de tumor foi monitorado usandomedições de compasso de calibre a cada 3 a 4 dias como indicado. Os re-sultados mostram que o tratamento e combinação com um coquetel deMAbs de 161P2F10B estatisticamente e significantemente inibiu o cresci-mento de xenoenxerto de câncer renal humano UG-K3 implantado subcuta-neamente em camundongos SCID (P<0.05).

Figura 20

Combinação de MAbs de 161P2F10B com Avastin® (bevacizu-mab). As células de tumor UG-K3 de câncer renal humano (2,0 x 106 célu-las) foram injetadas subcutaneamente em camundongos SCID machos. Oscamundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 camundongos em cadagrupo) e o tratamento iniciou intraperitonealmente (i.p). no dia 0 com osMAbs de tratamento, Avastin® (bevacizumab), ou controle de MAb de isótipocomo indicado. Os animais foram tratados duas vezes por semana para umtotal de 6 doses até o dia de estudo 18. O crescimento de tumor foi monito-rado usando medições de compasso de calibre a cada 3 a 4 dias como indi-cado. Os resultados mostram que os MAbs de 161P2F10B H16-1.93 eHa16-1(3, 5)18.1, quando combinados com Avastina, estatisticamente e sig-nificantemente inibiram o crescimento de xenoenxerto de câncer renal hu-mano UG-K3 implantado subcutaneamente em camundongos SCID (p<0,01).

Figura 21

A validação do dúplex de siRNA de 161P2F10B Qa em célulasHepG2. 2x105 células foram semeadas em placas de 6 cavidades emDMEM mais 10% FBS O.N. e subseqüentemente tratadas com 20 nM decada dúplex de siRNA indicado (CT1 ou 161P2F10B Qa) complexado com 1ug/ml de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) durante 72 horas a 37°C. Em se-guida, as células foram colhidas com 10 mM de EDTA e a superfície celularmanchada com 1/100 de diluição final de anti-161P2F10B conjugado a PE,97A6 MAb de Imunotech Cat#PNIM3575 (perfis cinza abertos e preto aber-tos) ou IgG de controle (perfil cinza sólido) e analisadas por FACS (21 A).Além disso, as células replicadas foram lisadas e quantidades iguais de cadalisado celular foram analisadas por SDS-PAGE, transferidas para membra-nas PVDF e tratadas com Western blot com uma mistura de MAbs de161P2F10B específica (H16-1.52, H16-1.68 e H16-1.92) a 1 jig/ml cada (to-po) ou MAb anti-actina, Sigma Cat#A5060 (base). Os dados indicam que osníveis de antígeno 161P2F10B são sub-regulados na superfície celular ecomo proteína total, especificamente pelo dúplex de siRNA de 161P2F10BQa em células HepG2.

Figura 22

O silenciamento de RNAi de 161P2F10B inibe o crescimentocelular. As células endogenamente expressando o antígeno 161P2F10B(HepG2) ou não expressando 161P2F10B (UMUC3) foram tratadas com osdúplexes de siRNA e concentrações indicados. As células foram preparadascomo estabelecido na Figura 22 e substituídas por um ensasio de incorpora-ção de 3H-Timidina padrão (22A) ou um ensaio de crescimento de colônia(22B). Em síntese, para o ensaio de incorporação de 3H-Timidina, 2000 cé-lulas foram substituídas em triplicata em DMEM mais 10% FBS, e 3H-Timidina foi adicionada durante 6 horas após o que as amostras foram colhi-das e a incorporação de radioatividade foi contada. Os dados são normali-zados para controlar as células tratadas com siRNA de CTI em cada concen-tração de oligo. Para o ensaio de crescimento de colônia, 400 células foramsubstituídas em placas de 12 cavidades e deixadas desenvolver durante 14dias após o que as colônias foram fixadas com metanol e manchadas comvioleta cristal antes das fotografias serem tiradas. A expressão de161P2F10B é indicada nos diagramas de FACS adjacentes mostrando aexpressão de 161P2F10B em células HepG2 (linha preta grossa) porém nãoem UMUC3 (linha preta grossa). Estes dados indicam que o silenciamentode 161P2F10B sobre a superfície celular de células HepG2, porém não emcélulas UMUC3 deficientes de 161P2F10B, inibe o crescimento celular e pro-liferação.

Figura 23

O silenciamento de 161P2F10B com RNAi inibe a migração ce-lular e a trilha de transdução de sinal Rho. 2x105 células foram semeadasem placas de 6 cavidades replicadas em DMEM mais 10% FBS O.N. e sub-seqüentemente tratadas com 10 nM de cada dúplex de siRNA indicadocomplexado com 1 jxg/ml de Lipofectamina 2000 durante 72 horas a 37°C.As células foram colhidas com 10 mM de EDTA e substituídas em DMEMcontendo 0,1% de FBS na câmara de topo de câmaras de migração Boydenpré-revestidas com colágeno I (tamanho de poro e 8 fim). Dez (10) por centode meios de DMEM contendo FBS foram usados como quimioatraentes nacâmara inferior. As células foram deixadas migrar durante 18 horas, em se-guida manchadas com Calceína AM e fotografadas em magnificação de 4x(23 A). Em paralelo, as células replicadas foram manchadas na superfíciecelular para medir o nível de silenciamento de 161P2F10B (23B, painel es-querdo). As células replicadas foram também separadamente subjugadaspela fome em DMEM mais 0,1% FBS O.N. e subseqüentemente estimuladas(ou não) com 20 ng/ml HGF durante 15 minutos antes dos lisados celularestotais serem preparados. Quantidades equivalentes de cada lisado celularforam incubadas com contas de Rhotekin-agarose para "diminuir" as proteí-nas Rho ligadas a GTP (Rho em conformação ativa) seguindo as especifica-ções do fabricante (Upstate Biotechnology). As reduções de Active Rho ou ototal de lisado celular total (para controlar a carga de proteína) foram anali-sadas por SDS-PAGE, transferidas para membranas PVDF e tratadas porWestern blot com um anticorpo RhoB específico. De modo geral, os dadosindicam que o silenciamento de superfície celular de 161P2F10B reduz acapacidade das células migrarem, correlacionando-se com uma sub-regulação significante em ativação de Rho B.

Figura 24

A expressão relativa e atividade enzimática de mutantes de161P2F10b em células de câncer de rim de Caki. As células de câncer derim de Caki foram infectadas com retrovírus contendo ou cDNA de161P2F10B do tipo silvestre, ou cDNAs mutantes de ponto codificando ouuma mutação de treonina em serina (T/S) no aminoácido 205, uma mutaçãode treonina em alanina (T/A) no aminoácido 205, ou uma mutação de ácidoaspártico em ácido glutâmico (D/E) no aminoácido 80. As linhagens celula-res de expressão estável foram analisadas quanto à expressão de161P2F10B por citometria de fluxo com 97 A6 (CD203c) MAb (25A) e quantoà atividade enzimática com o substrato de p-nTMP (25B). Os resultadosmostram que a mutação de treonina 205 em ácido aspártico ou alanina abo-le a capacidade de clivar o substrato, demonstrando que a treonina 205 écrítica para a atividade enzimática de 161P2F10B.

Figura 25

A superexpressão de 161P2F10B suprime as oscilações deCa2+ intracelulares induzidas por ATP em células Caki-1. As células Caki-1carregadas por Fura-2 superexpressando ou o 161P2F10B tipo silvestre(wt), um mutante cataliticamente inativo (T205A), ou apenas um gene deresistência de neomicina de controle (neo), foram testadas quanto a suaresposta de mobilização de Ca2+ intracelular em tempo prolongado aos li-gandos de purina ATP (25A), ATPy-S (análogo de ATP não-hidrolisável)(25B), AMP (25C), e adenosina (25D) usando imageamento mi-croscópico fluorescente de única célula. 5.000 células de cada linhagem ce-lular foram semeadas sobre lâminas de vidro de múltiplas câmaras revesti-das por colágeno e deixadas aderir durante a noite. Após montagem daslâminas no sistema de imageamento microscópico e iniciando a aquisição deimagem (alternando 340 nm e 38 nM excitação), a reação foi iniciada adicio-nando-se o composto indicado (seta) em uma concentração final de 100 |xM.São mostrados em cada painel aproximadamente 15-30 340/380 nm traçosde relação de fluorescência representando células individuais em um campomicroscópico. A variação entre os painéis em iniciação da resposta de Ca2+na adição de ligando foi devido às variações no tempo necessário para oligando difundir-se para a localização das células dentro do campo. As on-das oscilatórias de Ca2+ induzidas por ATP em ambas as células mutantescataliticamente inativas de 161P2F10B Cak1-neo e Caki-1. Entretanto, aresposta em células wt 161P2F10B Caki-1 foi aquela de um fluxo inicial deCa2+ que gradualmente decai em tempo prolongado com ondas oscilatóriasmínimas de menor freqüência e maior duração. O ATPy-S análogo de ATPnão-hidrolisável induziu ondas de Ca2+ oscilatórias em todas as linhagenscelulares. Adenosina e AMP não induziram a resposta a Ca2+ em qualquerdas linhagens, sugerindo que a resposta mediada por ATP é devido à sinali-zação através de receptores ATP purinérgicos de P2Y e não através de re-ceptores para adenosina ou AMP, metabólitos potenciais de ATP. Tomadosjuntos estes dados sugerem que é a remoção de ATP no meio extracelularpor clivagem enzimática mediada por 161P2F10B que causa o efeito su-pressor. Este ensaio possibilita a triagem de compostos, fármacos, anticor-pos, e proteínas que rompem a atividade de pirofosfatase/fosfodiesterase de161P2F10B e alteram a ATP e outras respostas de Ca2+ mediada por nu-cleotido de purina em células e tecidos expressando 161P2F1OB.

Figura 26

ECD de 161P2F10B induz a formação de tubo de HUVEC. Ascélulas endoteliais de veia umbilical humana primárias (HUVEC) foram se-meadas nos meios de crescimento endotelial (EGM) sobre 200 |jJ de Matri-gel® semi-sólido na presença de 0,1% FBS sozinho, 10% FBS sozinho, 0,1%de FBS + ECD de 161P2F10B (1 ug/ml) ou 0,1% de FBS + ECD de controle(1 ug/ml). As células foram deixadas formar redes de tubo durante 7 horas eem seguida fotografadas. As redes de tubo fechado forma quantificadas emcada cavidade. Os resultados indicam que o domínio extracelular (ECD) de161P2F10B induz a formação das redes de tubo em células endoteliais pri-márias quando semeadas em Matrigel®.

Figura 27

O requisito de atividade de fosfodiesterase de 161P2F10B paraformação de tubo de HUVEC. As células endoteliais de veia umbelical hu-manas primárias (HUVEC) foram semeadas em meios de crescimento endo-telial (EGM) sobre 200 pi de Matrigel® semi-sólido na presença de 0,1% FBSsozinho, 10% FBS sozinho, 0,1% FBS + VEGF (50 ng/ml), 0,1% FBS + ECDde 161P2F10B WT tipo silvrestre (0,1, 1 ou 5 ng/ml), 0,1% FBS + ECD de161P2F10B D80E mutante não-catalítico (DE) (0,1, 1 ou 5 (xg/ml), ou 0,1%FBS + ECD DE 161P2F10B mutante catalítico (TA) (0,1, 1 ou 5 )ig/ml). Ascélulas foram deixadas formar redes de tubo durante 7 horas e em seguidafotografadas. As redes de tubo fechado foram quantificadas em cada cavi-dade. Os resultados mostram que a atividade de fosfodiesterase de161P2F10B é crítica para a atividade do ECD na indução da formação deredes de tubo em células endoteliais primárias quando semeadas em Matri-gel®. Além disso, o domínio de RGD do ECD de 161P2F10B é também par-cialmente crítico para a formação de redes de tubo em células endoteliaisprimárias quando semeadas em Matrigel®.

Figura 28

MAbs de 161P2F10B inibem a formação de tubo de HUVEC. Ascélulas endoteliais de veia umbilial humana primária (HUVEC) foram semea-das em meios de crescimento endotelial (EGM) sobre 200 ul de Matrigel®semi-sólido na presença de FBS a 0,1% sozinho, FBS a 5% sozinho, ou FBSa 0,1% + ECD de 161P2F10B (1 jig/ml) com ou sem MAbs de 161P2F10B(20 |ig/ml). As células foram deixadas formar redes de tubo durante 18 horase em seguida fotografadas. As redes de tubo fechado foram quantificado emcada cavidade. A inibição percentual foi calculada com base nas cavidadesde controle representando 100% de formação de tubo. Os resultados indi-cam que os MAbs de 161P2F10B inibem a formação de redes de tudo emcélulas endoteliais primárias quando semeadas em Matrigel®.

Figura 29

ECD de 161P2F10B induz a migração de HUVEC. Células endo-teliais de veia umbilical humanas primárias (HUVEC) foram desenvolvidasem meios de crescimento endotelial (EGM) e rotuladas com a tinta fluores-cente Calcien AM. As células foram incubadas com BSA a 0,1%, FBS a10%, BSA a 0,1% + VEGF (20 ng/ml), BSA a 0,1% + 161P2F10B ECD (1,5ou 10 ng/ml) ou BSA a 0,1% + ECD de control (1, 5 ou 10 ^g/ml) e em se-guida semeadas sobre o suplemento superior de câmaras Boyden. As célu-las foram deixadas migrar através das câmaras durante 20 horas e em se-guida quantificadas usando microscopia e Software MetaMorph. Os resulta-dos mostram que o ECD de 161P2F10B induz a migração de células endote-liais de uma maneira dependente da dose.

Figura 30

Os MAbs de 161P2F10B inibem a proliferação de células decâncer SK-RC-01 (célula clara renal). As células SK-RC-01 foram incubadascom 20 |u,g/ml de MAbs e em seguida desenvolvidas durante 3 a 5 dias emcultura com FBS a 10%. Um pulso de 6 horas de 3H-Timidina foi adicionadoàs culturas e as células foram então processadas para incorporação de 3H-Timidina. O nível de inibição indicado foi calculado usando o MAb de contro-le como as contagens máximas totais incorporadas. Os resultados mostramque os MAbs para 161P2F10B inibem a proliberação de células de câncerclaras renais SK-RC-01 (45 - 76%) com relação ao MAb de controle.

Figura 31

O efeito de MAbs de 161P2F10B sobre a proliferação de célula ecâncer dos rins, sobrevivência e apoptose. As células de câncer renal RFX-393 foram incubadas com 20 ug/ml de MAbs como indicado (ou 5 ug/ml deEGFR MAb M225) e em seguida desenvolvidas durante 6 dias em culturacom FBS a 10%. Um pulso de 6 horas de 3H-Timidina foi adicionado às cul-turas e as células foram processadas para incorporação de 3H-Timidina. Onível de inibição indicado foi calculado usando o MAb de controle como ascontagens totais máximas incorporadas. Para o ensaio de sobrevivência(MTS), uma pequena quantidade do Reagente de Solução do kit foi adicio-nada diretamente às cavidades de cultura celular, seguido por incubaçãodurante 1 a 4 horas, em seguida registrando a absorvência a 490 nm comuma leitora de placa de 96 cavidades. A quantidade de produto de formaza-no colorido quando medida pela quantidade de 490 nm de absorvência édiretamente proporcional à atividade mitocondrial e/ou o número de célulasvivas em cultura. O percentual de inibição foi calculado com relação a umMAb de controle. Para o ensaio de apoptose, os mesmos lisados celularespreparados para o ensaio de MTS foram usados em um ensaio de liberaçãode nucleossoma (ELISA de morte celular). O nível de apoptose é registradocomo o % de indução com relação ao MAb de controle. Os MAbs mais po-tentes afetam todos os três ensaios nos graus mais elevados. Os resultadosindicam que os MAbs para 161P2F10B inibem a proliferação de células cla-ras de câncer renal RXF-393, reduzem sua capacidade de sobrevivênciacelular e induzem o programa apoptótico.

Figura 32

Os MAbs de 161P2F10B dependentemente da dose inibem aformação de tubo de HUVEC. As células endoteliais de veia umbilical huma-nas primárias (HUVEC) foram semeadas em meios de crescimento endoteli-al (EGM) sobre 200 |il de Matrigel® semi-sólido na presença de FBS a 0,1%FBS sozinho, FBS a 5% sozinho, ou FBS a 0,1% + ECD de 161P2F10B (1jig/ml) com ou sem MAbs de 161P2F10B (nas concentrações indicadas). Ascélulas foram deixadas formar redes de tubo durante 18 horas e em seguidafotografadas. As redes de tubo fechado foram quantificadas em cada cavi-dade. A inibição percentual foi calculada com base nas cavidades de contro-le representando 100% de formação de tubo. Os resultados indicam que osMAbs de 161P2F10B dependentemente da dose inibem a formação de re-des de tubo em células endoteliais primárias quando semeadas em Matri-gel®.

Figura 33

Os MAbs de 161P2F10B inibem a migração de célula de câncerde figado HepG2. As células de câncer de fígado HepG2 (Fig. 33A) foramdesenvolvidas em FBS a 10%, rotuladas com tinta fluorescente Calcien AM,e 2 x 104 células foram incubadas com ou MAb de controle ou um lago deMAbs de 161P2F10B (25 |ig/ml cada) e semeadas sobre os suplementossuperiores de câmaras Boyden na ausência ou presença de 8 ng/ml de Fatorde Crescimento de Hepatócito (HGF). As células foram deixadas migrar a-través das câmaras durante 24 horas e foram então fotografadas e quantifi-cadas usando o Software MetaMorph. Os resultados mostram que os MAbsde 161P2F10B inibem a migração de células HepG2, e que o tratamento dascélulas com Fator de Crescimento de Hepatócito potência a migração celularque é sensível à inibição com MAbs para 161P2F10B. Os resultados sãograficamente mostrados na Figura 33B.

Figura 34

Os MAbs de 161P2F10B inibem a migração de célula clara renalA-704. As células de câncer A-704 (célula clara renal) (Fig. 34A) foram de-senvolvidas em FBS a 10%, rotuladas com tinta fluorescente de Calcein AM,e 2 x 104 células foram incubadas com ou MAb de controle ou um lago deMAbs de 161P2F10B (25 ug/ml cada) e semeadas sobre os suplementossuperiores de câmaras Boyden na ausência ou presença de 8 ng/ml de Fatorde Crescimento de Hepatócito (HGF). As células foram deixadas migrar a-través de câmaras durante 24 horas e foram em seguida fotografadas equantificadas usando o Software MetaMorph. Os resultados indicam que osMAbs de 161P2F10B inibem a migração de células A-704, e que o tratamen-to das células com Fator de Crescimento de Hepatócito potência a migraçãocelular que é sensível à inibição com MAbs para 161P2F10B. Os resultadossão graficamente mostrados na Figura 34B.

Figura 35

Os MAbs de 161P2F10B inibem a invasão de célula clara renalA-704. As células de câncer A-704 (célula clara renal) (Fig. 35A) foram de-senvolvidas em FBS a 10%, rotuladas com tinta fluorescente de CalceínaAM, e 2 x 104 células foram incubadas com ou MAb de controle ou um lagode MAbs 161P2F10B MAbs (25 ug/ml cada) e semeadas sobre os suple-mentos superiores de câmaras Boyden revestidas com Matrigel® na ausên-cia ou presença de 8 ng/ml de Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF).As células foram eixadas invadir através das câmaras durante 44 horas eforam então fotografadas e quantificadas usando o Software MetaMorph. Osresultados mostram que HGF estimula a invasão de células A-704, e que osMAbs de 161P2F10B (H16-1.93) inibem a invasão celular em ambas as cé-lulas tratadas HGF e as células não tratadas. Os resultados demonstram queMAbs de 161P2F10B inibem a invasão de células A-704 através Matrigel®, eque o tratamento das células com Fator de Crescimento de Hepatócito po-tência a invasão celular que é sensível à inibição com MAbs de 161P2F10B.Os resultados são graficamente mostrados na Figura 35B.Figura 36

A dimerização de 161P2F10B em células KU-812. As célulasKU-812 (2 x 105) foram incubadas com concentrações crescentes debis[succinimidilsuccinato] de etileno glicol (EGS) em PBS como indicado du-rante 30 minutos em temperatura ambiente. As células foram lisadas emtampão de RIP A (1% NP-40), submetidas a 4-12% de SDS-PAGE não-redutor de gradiente, e em seguida tratadas com Western blot para161P2F10B usando uma mistura de 1 ug/ml MAb (H16-1.52, H16-1.68 eH16-1.92). Os resultados indicam que 161P2F10B é dimérico sobre a super-fície celular, e que esta propriedade pode ser requerida para atividade enzi-mática total e outras atividades funcionais de 161P2F10B quando expressassobre a superfície de células de tumor.

Figura 37

A detecção de proteína 161P2F10B em espécimes de pacientede câncer por IHC. Em síntese, os tecidos congelados foram cortados emseções de 6 mícrons e montados sobre lâminas de vidro. As seções foramsecadas durante 2 horas em temperatura ambiente, fixadas durante 8 minu-tos em acetona e subseqüentemente deixadas secar. As secções foram en-tão incubadas em anticorpo de 161P2F10B, M16-41 (3)50, durante 3 horasem temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes em tampãoe também incubadas com anticorpo secundário de imunoglobulina antica-mundongo conjugado à DAKO EnVision+® peroxidase (DAKO Corporation,Carpenteria, CA) durante 1 hora. As seções foram então lavadas em tam-pão, desenvolvidas empregando-se um kit DAB (SIGMA Chemicals), contra-manchadas usando hematoxilina, e analisadas por microscopia de campobrilhoso. Os resultados mostram a expressão de 161P2F10B nas células detumor de carcinoma hepatocelular (37A e 37B) como indicado pela coloraçãomarrom das células. As seções seriais sem nenhuma incubação em M16-41(3)50 não tiveram nenhum manchamento (37C e 37D). Estes resultados in-dicam que 161P2F10B é expresso em cânceres de fígado humano e que osanticorpos direcionados a este antígeno são úteis como reagentes diagnósti-cos.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esboço das Seções

I) Definições

II) Polinucleotídeos de 161P2F1OB

ILA) Usos de Polinucleotídeos de 161P2F1 OB

11.A. 1) Monitoramento de Anormalidades Genéticas

II.A.2) Mobalidades Anti-sentido

II.A.3) Iniciadores e Pares de Iniciadores

II.A.4) Isolamento de Moléculas de Ácido Nucléico Codificando161P2F10B

II. A.5) Moléculas de Ácido Nucléico Recombinante e Sistemas deVetor-Hospedeiro

III) Proteínas relacionadas com 161P2F10B

III. A) Modalidades de Proteína transportando motivo

III.B) Expressão de Proteínas relacionadas com 161P2F10B

III.C) Modificações de Proteínas relacionadas com 161P2F1 OB

III.D) Usos de Proteínas relacionadas com 161P2F10B

IV) Anticorpos de 161P2F10B

V) 161 P2F10B Respostas Imunes Celulares

VI) 161P2F10B Animais Transgênicos

VII) Métodos para a Detecção de 161P2F10B

VIII) Métodos para Monitorar o Estado de Genes relacionados com161P2F1 OB e Seus Produtos

IX) Identificação de Moléculas Que Interagem com 161P2F10B

X) Métodos e Composições Terapêuticos

X.A) Vacinas Anticâncer

X.B) 161P2F10B como um Alvo para Terapia Com Base em Anti-corpo

X.C) 161P2F1 OB como um Alvo para Respostas Imunes Celulares

X.C.1. Vacinas de Minigene

X.C.2. Combinações de Peptídeos CTL com Peptídeos AuxiliaresX.C.3. Combinações de Peptídeos CTL com Agentes de Im-primação de Célula T

X.C.4. Composições de Vacina Compreendendo DC Pulsadascom CTL e/ou Peptídeos HTL

X.D) Imunoterapia Adotiva

X.E) Administração de Vacinas para os Propósitos Terapêuticos ouProfiláticos

XI) Modalidades Diagnosticas e Prognósticas de 161P2F1OB.

XII) Inibição de Função de Proteína 161P2F1 OB

XII.A) Inibição de 161P2F1 OB Com Anticorpos Intracelulares

XILB) Inibição de 161P2F1 OB com Proteínas Recombinantes

XILC) Inibição de Transcrição ou Translação de 161P2F1 OB

XII.D) Considerações Gerais para Estratégias Terapêuticas

XIII) Identificação, Caracterização e Uso de Moduladores de 161P2F10B

XIV) RNAi e Uso Terapêutico de RNA de pequena interferência (siRNAs)

XV) K/TS/Artigos de Fabricação

I). Definições:

A menos que de outro modo definido, todos os termos de técni-ca, notações e outros termos científicos ou terminologia usada aqui são des-tinados a ter os significados comumente entendidos por aqueles versados natécnica à qual esta invenção pertence. Em alguns casos, os termos com ossignificados comumente entendidos são definidos asqui para clareza e/oupara pronta referência, e a inclusão de tais definições inclusas devem nãonecessariamente ser construídas para representar uma diferença substanci-al sobre o que é geralmente entendido na técnica. Muitas das técnicas eprocedimentos descritos ou referenciados aqui são bem entendidos e co-mumente empregados usando metodologia convencional por aqueles versa-dos na técnica, tal como, por exemplo, as metodologias de clonagem mole-cular utilizadas amplamente em Sambrook e outro, Molecular Cloning: A La-boratory Manual 2- edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y. Quando apropriado, os procedimentos envolvendo o usode kits e reagentes comercialmente disponíveis são geralmente realizadosde acordo com os protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante amenos que de outro modo mencionado.

Os termos "câncer avançado", "câncer localmente avançado","doença avançada" e "doença localmente avançada" significa cânceres queestenderam-se através da cápsula de tecido concernente, e entende-se in-cluir doença de estágio C sob o sistema da American Urological Association(AUA), doença de estágio C1 - C2 sob o sistema Whitmore-Jewett, e doençade estágio T3 - T4 e N+ sob o sistema TNM (tumor, nodo, metástase). Emgeral, a cirurgia não é recomendada para pacientes com doença localmenteavançada, e estes pacientes têm resultados substancialmente menos favo-ráveis em comparação com pacientes tendo câncer clinicamente localizado(confinado no órgão).

"Alterando o padrão de glicosilação nativo" é entendido para ospropósitos inclusos, significar deletar uma ou mais porções de carboidratoencontradas em 161P2F10B de seqüência nativa (ou por remoção do sítiode glicosilação subjacente ou por deleção da glicosilação por métodos quí-micos e/ou enzimáticos), e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilaçãoque não estão presente na seqüência nativa 161P2F10B. Além disso, a fra-se inclui mudanças qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, envol-vendo uma mudança na natureza e proporções das várias porções de car-boidrato presentes.

O termo "análogo" refere-se a uma molécula que é estrutural-mente similar ou compartilha atributos similares ou correspondentes comoutra molécula (por exemplo, uma proteína relacionada com a 161P2F10B).Por exemplo, um análogo de uma proteína 161P2F10B pode ser especifica-mente ligado por um anticorpo ou célula T que especificamente liga-se a 161P2F10B.

O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo, a menosque claramente indicado de outro modo. Portanto, um "anticorpo" pode serde ocorrência natural ou feito pelo homem tal como anticorpos monoclonaisproduzidos por tecnologia de hibridoma convencional. Os anticorpos anti-161P2F10B compreendem anticorpos monoclonais e policlonais, bem comofragmentos contendo o domínio de ligação de antígeno e/ou uma ou maisregiões de determinação de complementaridade destes anticorpos. Comousado aqui, o termo "anticorpo" refere-se a qualquer forma de anticorpo oufragmento deste que especificamente liga-se a 161P2F10B e/ou exibe a ati-vidade biológica desejada e especificamente abrange anticorpos monoclo-nais (incluindo anticorpos monoclonais de tamanho natural), anticorpos poli-clonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos),e fragmentos de anticorpo contanto que eles especificamente liguem-se a161P2F10B e/ou exibam a atividade biológica desejada. Qualquer anticorpoespecífico pode ser usado nos métodos e composições fornecidos aqui.Desse modo, em uma modalidade o termo "anticorpo" abrange uma molécu-la compreendendo pelo menos uma região variável de uma molécula de i-munoglobulina de cadeia leve e pelo menos uma região variável de uma mo-lécula de cadeia pesada que em combinação forme um sítio de ligação es-pecífico para o antígeno alvo. Em uma modalidade, o anticorpo é um anti-corpo IgG. Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo IgGI, lgG2, lgG3, oulgG4. Os anticorpos úteis nos presentes métodos e composições podem sergerados em cultura celular, em fago, ou em vários animais, incluindo porémnão limitados a vacas, coelhos, cabras, camundongos, ratos, hamsters, co-baias, ovelhas, cães, gatos, macacos, chimpanzés, símios. Portanto, emuma modalidade, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo mamí-fero. As técnicas de fago podem ser usadas para isolar um anticorpo inicialou para gerar variantes com especificidade alterada ou características deavidez. Tais técnicas são rotina e bem conhecidas na técnica. Em uma mo-dalidade, o anticorpo é produzido por métodos recombinantes conhecidos natécnica. Por exemplo, um anticorpo recombinante pode ser produzido trans-ferindo-se uma célula hospedeira com vetor compreendendo uma seqüênciade DNA codificando o anticorpo. Um ou mais vetores podem ser usados pa-ra transfectar a seqüência de DNA expressando pelo menos uma região VLe uma VH na célula hospedeira. As descrições exemplares de métodos re-combinantes de geração e produção de anticorpo incluem Delves, ANTI-BODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shefard, eoutro, MONOCLONAL ANTICORPOS (Oxford University Press, 2000); Go-ding, MONOCLONAL ANTICORPOS: PRINCIPLES e PRACTICE (AcademicPress, 1993); CURRENT PROTOCOLS IN IMUNOLOGY (John Wiley &Sons, most recent edition). um anticorpo da presente invenção pode ser mo-dificado por métodos recombinantes para aumentar a maior eficácia de umanticorpo na mediação da função desejada. Desse modo, inclui-se no esco-po da invenção aqueles anticorpos que podem ser modificados por substitui-ções empregando-se métodos recombinantes. Tipicamente, as substituiçõesserão substituições conservativas. Por exemplo, pelo menos um aminoácidona região constante do anticorpo pode ser substituído com um resíduo dife-rente. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos ns 5.624.821, Patentedos Estados Unidos n9 6.194.551, Pedido nQ WO 9958572; e Angal, e outro,Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). A modificação em aminoácidos inclui dele-ções, adições, substituições de aminoácidos. Em alguns casos, tais mudan-ças são feitas para reduzir as atividades indesejadas, por exemplo, citotoxi-cidade dependente de complemento. Freqüentemente, os anticorpos sãorotulados por união, covalentemente ou não-covalentemente, de uma subs-tância que prove um sinal detectável. Uma ampla variedade de rótulos e téc-nicas de conjugação são conhecidos e são extensivamente reportados tantona literatura científica quanto de patente. Estes anticorpos podem ser anali-sados quanto à ligação a 161P2F10B normal ou defectivo. Veja, por exem-plo, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford Uni-versity Press, 1996). Anticorpos adequados com as atividades biológicasdesejadas:podem ser identificados nos seguintes ensaios in vitro incluindo,porém não limitado a: proliferação, migração, adesão, crescimento de ágarmacio, angiogênese, comunicação de célula-célula, apoptose, transporte,transdução de sinal, e os seguintes ensaios in vivo tais como a inibição decrescimento de tumor. Os anticorpos fornecidos aqui podem também serúteis em aplicações diagnosticas. Como anticorpos de captura ou não-neutralizantes, eles podem ser analisados quanto à capacidade de ligar-seao antígeno específico sem inibir a ligação ao receptor ou atividade biológicado antígeno. Como anticorpos neutralizantes, os anticorpos podem ser úteisem ensaios de ligação competitivos. Eles podem também ser usados paraquantificar o 161P2F10B ou seu receptor.

Um "fragmento de anticorpo" é definido como pelo menos umaporção da região variável da molécula de imunoglobulina que liga-se a seualvo, isto é, a região de ligação de antígeno. Em uma modalidade ela especi-ficamente abrange anticorpos anti-161P2F10B únicos e clones destes (inclu-indo agonista, antagonista e anticorpos neutralizantes) e composições deanticorpo anti-161P2F10B com especificidade poliepitópica. O anticorpo dospresentes métodos e composições podem ser monoclonais ou policlonais.

Um anticorpo pode ser na forma de um fragmento de anticorpo de ligação aantígeno incluindo um fragmento Fab, fragmento F(ab')2, uma região variávelde cadeia única, e os semelhantes. Os fragmentos de moléculas intactaspodem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica e incluemdigestão enzimática e métodos recombinantes.

Como aqui usado, qualquer forma do "antígeno" pode ser usadapara gerar um anticorpo que é específico para 161P2F10B. Desse modo, oantígeno de evocação pode ser um epítopo único, epítopos múltiplos, ou aproteína inteira sozinha ou em combinação com um ou mais agentes de re-alce de imunogenicidade conhecidos na técnica. O antígeno de evocaçãopode ser uma proteína de tamanho natural isolada, uma proteína de superfí-cie celular (por exemplo, imunização com células transfectadas com pelomenos uma porção do antígeno), ou uma proteína solúvel (por exemplo, i-munização com apenas a porção de domínio extracelular da proteína). Oantígeno pode ser produzido em uma célula geneticamente modificada. ODNA codificando o antígeno pode ser genômico ou não-genômico (por e-xemplo, cDNA) e codifica pelo menos uma porção do domínio extracelular.Como aqui usado, o termo "porção" refere-se ao número mínimo de aminoá-cidos ou ácidos nucléicos, como apropriado, para constituir um epítopo imu-nogênico do antígeno de interesse. Quaisquer vetores genéticos adequadospara a transformação das células de interesse podem ser empregados, in-cluindo, porém não limitado a vetores adenovirais, plasmideos, e vetoresnão-virais, tais como lipideos cationicos. Em uma modalidade, o anticorpodos métodos e composições inclusos ligam-se especificamente a pelo me-nos uma porção do domínio extracelular do 161P2F10B de interesse.

Os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes for-necidos aqui podem ser conjugados a um "agente bioativo". Como aqui usa-do, o termo "agente bioativo" refere-se a qualquer composto sintético ou deocorrência natural que liga-se ao antígeno e/ou realça ou medeia um efeitobiológico desejado para realçar as toxinas exterminadoras celulares.

Em uma modalidade, os fragmentos de ligação úteis na presenteinvenção são fragmentos biologicamente ativos. Como aqui usado, o termo"biologicamente ativo" refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpoque é capaz de ligar-se ao epítopo antigênico desejado ou diretamente ouindiretamente exercendo um efeito biológico. Os efeitos diretos incluem, po-rém não estão limitados à modulação, estimulação, e/ou inibição de um sinalde crescimento, a modulação, estimulação, e/ou inibição de um sinal antia-poptótico, a modulação, estimulação e/ou inibição de um sinal apoptótico ounecrótico, modulação, estimulação, e/ou inibição da cascata de ADCC, emodulação, estimulação, e/ou inibição da cascata de CDC.

Os anticorpos "biespecíficos" são também úteis nos presentesmétodos e composições. Como aqui usado, o termo "anticorpo biespecífico"refere-se a um anticorpo, tipicamente um anticorpo monoclonal, tendo espe-cificidades de ligação durante pelo menos dois epítopos antigênicos diferen-tes. Em uma modalidade, os epítopos são do mesmo antígeno. Em outramodalidade, os epítopos são de dois diferentes antígenos. Métodos parapreparar anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Por exemplo,anticorpos biespecíficos podem ser produzidos recombinantemente usandoa co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobu-lina. Veja, por exemplo, Milstein e outro, Nature 305:537-39 (1983). Alterna-tivamente, os anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligaçãoquímica. Veja, por exemplo, Brennan, e outro, Science 229:81 (1985). Osanticorpos biespecíficos incluem fragmentos de anticorpo biespecífico. Veja,por exemplo, Hollinger, e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:6444-48(1993), Gruber, e outro, J. Immunol. 152:5368 (1994).Os anticorpos monoclonais inclusos especificamente incluemanticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve éidêntica com ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorposderivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou sub-classe de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idênticocom ou homólogo às seqüências correspondentes em anticorpos derivadosde outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasses de anticor-po, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles liguem-seespecificamente ao antígeno alvo e/ou exibam a atividade biológica deseja-da (Patente dos Estados Unidos ns 4.816.567; e Morrison e outro, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 81: 6851 -6855 (1984)).

O termo "Agente Quimioterapêutico" refere-se a todos os com-postos químicos que são eficazes na inibição de crescimento de tumor. E-xemplos não-limitantes de atentes quimioterapêuticos incluem agentes dealquilação; por exemplo, mostarda de nitrogênio, compostos de etilenoiminae sulfonatos de alquila; antimetabólitos; por exemplo, ácido fólico, purina ouantagonistas de pirimidina; inibidores mitóticos; por exemplo, alcalóides vin-ca e derivados de podofilotoxina, antibióticos citotóxicos, compostos que da-nificam ou interferem com a expressão de DNA, e antagonistas receptoresde fator de crescimento. Além disso, os agentes quimioterapêuticos incluemagentes citotóxicos (como aqui definido), anticorpos, moléculas biológicas epequenas moléculas.

O termo "seqüências otimizadas de códon" refere-se às seqüên-cias de nucleotido que foram otimizadas para uma espécie hospedeira parti-cular substituindo quaisquer códons tendo uma freqüência de uso menor doque cerca de 20%. As seqüências de nucleotido que foram otimizadas paraa expressão em uma determinada espécie de hospedeiro por eliminação deseqüências de poliadenilação espúrias, eliminação de sinais de união deéxon/íntron, eliminação de repetições semelhantes ao transposon e/ou oti-mização de teor de GC em adição à otimização de códon são referidas aquicomo uma "seqüência realçada de expressão".

Uma "biblioteca combinatória" é uma coleção de diversos com-postos químicos gerados por síntese química ou síntese biológica combi-nando diversos "blocos de construção" químicos tais como reagentes. Porexemplo, uma biblioteca química combinatorial linear, tal como uma bibliote-ca de polipeptídeo (por exemplo, muteína), é formada combinando-se umgrupo de blocos de construção química chamados aminoácidos de cadamaneira possível para um determinado comprimento de composto (isto é, onúmero de aminoácidos em um composto de polipeptídeo). Numerososcompostos químicos são sintetizados através de tais mistura combinatorialde blocos de construção química (Gallop e outro, J. Med. Chem. 37(9):1233-1251 (1994)).

A preparação e triagem de bibliotecas combinatoriais é bem co-nhecida por aqueles versados na técnica. Tais bibliotecas químicas combi-natoriais incluem, porém não estão limitadas a, bibliotecas de peptídeo (Ve-ja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos ns 5.010.175, Furka, Pept.Prot. Res. 37:487-493 (1991), Houghton e outro, Nature, 354:84-88 (1991)),peptóides (Publicação PCT nQ WO 91/19735), peptídeos codificados (Publi-cação PCT WO 93/20242), bio-oligômeros aleatórios (Publicação PCT WO92/00091), benzodiazepinas (Patente dos Estados Unidos ng 5.288.514),diversômeros tais como hidantoínas, benzodiazepinas e dipeptídeos (Hobbse outro, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 90:6909-6913 (1993)), polipeptídeos viní-logos (Hagihara e outro, J. Amer. Chem. Soe. 114:6568 (1992)), peptidomi-méticos não peptidais com um andaime de Beta-D-Glucose (Hirschmann eoutro, J. Amer. Chem. Soe. 114:9217-9218 (1992)), síntese orgânica análo-ga de pequenas bibliotecas de composto (Chen e outro, J. Amer. Chem.Soe. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho, e outro, Science 261:1303(1993) ), e/ou fosfonatos de peptidila (Campbell e outro, J. Org. Chem.59:658 (1994)). Veja, geralmente, Gordon e outro, J. Med. Chem. 37:1385(1994) , bibliotecas de ácido nucleico (Veja, por exemplo, Stratagene, Corp).,bibliotecas de ácido nucleico de peptídeo (Veja, por exemplo, Patente dosEstados Unidos nQ 5.539.083), bibliotecas de anticorpo (Veja, por exemplo,Vaughn e outro, Nature Biotechnology 14(3): 309-314 (1996), ePCT/US96/10287), bibliotecas de carboidrato (Veja, por exemplo, Liang eoutro, Science 274:1520-1522 (1996), e Patente dos Estados Unidos nQ5.593.853), e bibliotecas de molécula orgânica pequena (Veja, por exemplo,benzodiazepinas, Baum, C&EN, 18 de janeiro, página 33 (1993); isoprenói-des, Patente dos Estados Unidos n9 5.569.588; tiazolidinonas e metatiaza-nonas, Patente dos Estados Unidos nQ 5.549.974; pirrolidinas, Patente dosEstados Unidos n— 5.525.735 e 5.519.134; compostos de morfolino, Patentedos Estados Unidos n9 5.506.337; benzodiazepinas, Patente dos EstadosUnidos n9 5.288.514; e semelhantes).

Os aparelhos para a preparação de bibliotecas combinatoriaissão comercialmente disponíveis (Veja, por exemplo, 357 NIPS, 390 NIPS,Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symfony, Rainin, Wobum, MA; 433A,Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NIA).Diversos sistemas robóticos bem conhecidos foram também desenvolvidospara químicas de fase de solução. Estes sistemas incluem estações de tra-balho automatizadas tais como o aparelho de síntese automatizada desen-volvido por Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japan) e muitos sis-temas robóticos utilizando braços robóticos arms (Zymate H, Zymark Corpo-ration, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Paio Alto, Calif)., que imi-tam as operações sintéticas manuais realizadas por uma química. Qualquerdos aparelhos acima são adequados para uso com a presente invenção. Anatureza e implementação de modificações destes aparelhos (se existirem),de modo que eles possam operar como aqui descrito, serão evidentes parapessoas versadas na técnica concernente. Além disso, numerosas bibliote-cas combinatoriais são em si comercialmente disponíveis (Veja, por exem-pio, ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St. Louis,MO; ChemStar, Ltd, Moscow, RU; 3D Farmaceuticals, Exton, PA; MartekBiosciences, Columbia, MD; etc)..

Como aqui usado, O termo "substituição conservativa" refere-sea substituições de aminoácidos que são conhecidas por aqueles versadosnesta técnica e podem ser geralmente feitas sem alterar a atividade biológi-ca da molécula resultante. Aqueles versados nesta técnica reconhecem que,em geral, substituições de único aminoacido em regiões não-essenciais deum polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (Veja,por exemplo, Watson, e outro, MOLECULAR BIOLOGY de THE GENE, TheBenjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a Edição 1987)). Tais substituiçõesexemplares são preferivelmente feitas de acordo com aquelas mencionadasnas Tabela(s) lll(a-b). Por exemplo, tais alterações incluem substituir quais-quer dentre isoleucina (I), valina (V), e leucina (L) para qualquer outro destesaminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) para ácido glutâmico (E) e vi-ce-versa; glutamina (Q) para asparagina (N) e vice-versa; e serina (S) paratreonina (T) e vice-versa. Outras substituições podem também ser conside-radas conservativas, dependendo do ambiente do aminoácido particular eseu papel na estrutura tri-dimensional da proteína. Por exemplo, glicina (G) ealanina (A) podem freqüentemente ser alternáveis, como pode a alanina (A)e valina (V). A metionina (M), que é relativamente hidrofóbica, pode freqüen-temente ser alternada com a leucina e isoleucina, e algumas vezes com va-lina. A lisina (K) e arginina (R) são freqüentemente alternáveis em localiza-ções em que o aspecto significante do resíduo de aminoácido é sua carga eos pK's divergentes destes dois resíduos de aminoácido não são significan-tes. Todavia, outras alterações podem ser consideradas "conservativas" emambientes particulares (Veja, por exemplo, Tabela lll(a) inclusa; páginas 13-15 "Biochemistry" 2a ED. Lubert Stiyer ed (Stanford University); Henikoff eoutro, PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei e outro, J Biol Chem 19 de maiode 199; 270(20): 11882-6). Outras substituições são também permissíveis eodem ser determinadas empiricalmente ou de acordo com substituiçõesconservativas conhecidas.

O termo "agente citotóxico" refere-se a uma substância que inibeou previne a atividade de expressão de células, função de células e/ou cau-sa destruição de células. O termo destinado a incluir isótopos radioativos,agentes quimioterapêuticos, e toxinas, tais como toxinas de molécula pe-quena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, deplanta ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destes. Exemplos deagentes citotóxicos incluem, porém não estão limitados a auristatinas, auris-tatina e, auromicinas, maitansinoides, ítrio, bismuto, ricina, cadeia de ricinaA, combrestatina, duocarmicinas, dolostatinas, doxorrubicina, daunorrubici-na, taxol, cisplatina, ccl065, brometo de etídio, mitomicina, etoposida, teno-posida, vincristina, vinblastina, colquicina, diona de antracina de diidróxi, ac-tinomicina, toxina da difteria, Exotoxina Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina,cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina,retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inibi-dor de sapaonaria officinalis, e glucocorticóide e outros agentes quimiotera-pêuticos, bem como radioisótopos tais como At211, 1131, 1125, Y90, Re186,Re188, Sm153, Bi212 ou 213, P32 e isótopos radioativos de Lu incluindo Lu177. Osanticorpos podem também ser conjugados a uma enzima de ativação depró-fármaco anticâncer capaz de converter o pró-fármaco em sua forma ativa.

Como aqui usado, o termo "diacorpos" refere-se a pequenosfragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno, cujos frag-mentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conecta-do a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptí-deo (VH-VL). Empregando-se um ligador que é bastante curto para permitir opareamento entre os dois domínios da mesma cadeia, os domínios são for-çados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criamdois sítios de ligação de antígeno. Os diacorpos são descritos mais total-mente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger e outro,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-48 (1993).

O "produto de gene" é usado aqui para indicar um peptí-deo/proteína ou mRNA. Por exemplo, um "produto de gene da invenção" éalgumas vezes referido aqui como uma "seqüência de aminoácido de cân-cer", "proteína de câncer", "proteína de um câncer listado na Tabela I", um"mRNA de câncer", "mRNA de um câncer listado na Tabela I", etc. Em umamodalidade, a proteína de câncer é codificada por um ácido nucléico de Fi-gura 1. A proteína de câncer pode ser um fragmento, ou alternativamente,ser a proteína de tamanho natural codificada por ácidos nucléicos de Figura1. Em uma modalidade, uma seqüência de aminoácido de câncer é usadapara determinar a similaridade ou identidade de seqüência. Em outra moda-lidade, as seqüências são variantes alélicas de ocorrência natural de umaproteína codificada por um ácido nucléico de Figura 1. Em outra modalidade,as seqüências, são variantes de seqüência como também descrito aqui.

Anticorpos "heteroconjugados" são úteis nos presentes métodose composições. Como aqui usado, o termo "anticorpo heteroconjugado" refe-re-se a dois anticorpos covalentemente ligados. Tais anticorpos podem serpreparados empregando-se métodos conhecidos em química de proteínasintética, incluindo o uso de agentes de reticulação. Veja, por exemplo, aPatente dos Estados Unidos nQ 4.676.980.

Os ensaios de "Triagem de alta produtividade" quanto à presen-ça, ausência, quantificação, ou outras propriedades de ácidos nucléicos par-ticulares ou produtos de proteína são conhecidos por aqueles versados natécnica. Similarmente, ensaios de ligação e ensaios de gene repórter sãosimilarmente bem conhecidos. Desse modo, por exemplo, a Patente dos Es-tados Unidos nQ 5.559.410 descreve métodos de triagem de alta produtivida-de para proteínas; A Patente dos Estados Unidos nQ 5.585.639 descrevemétodos de triagem de alta produtividade para ligação de ácido nucléico (is-to é, em disposições); enquanto as Patentes dos Estados Unidos n-5.576.220 e 5.541.061 descrevem métodos de alta produtividade de triagempara ligação de ligando/anticorpo.

Além disso, sistemas de triagem de alta produtividade são co-mercialmente disponíveis (Veja, por exemplo, Amersham Biosciences, Pis-cataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor,OH; Beckman Instruments, Lie. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Na-tick, MA; etc).. Estes sistemas tipicamente automatizam procedimentos intei-ros, incluindo todas as amostras e pipetagem de reagente, dispensamentode líquido, incubações cronometradas, e leituras finais da microplaca emdetector(es) apropriados para o ensaio. Estes sistemas configuráveis forne-cem alta produtividade e partida rápida, bem como um alto grau de flexibili-dade e customização. Os fabricantes de tais sistemas fornecem protocolosdetalhados para vários sistemas de alta produtividade. Desse modo, por e-xemplo, Zymark Corp. fornece boletins técnicos descrevendo sistemas detriagem para detectar a modulação de transcrição de gene, ligação de ligan-do, e semelhantes.

O termo "homólogo" refere-se a uma molécula que exibe homo-logia com outra molécula, por exemplo, tendo seqüências de resíduos quí-micos que são os mesmos ou similares em posições correspondentes.

Em uma modalidade, o anticorpo fornecido aqui é um "anticorpohumano". Como aqui usado, o termo "anticorpo humano" refere-se a um an-ticorpo em que essencialmente as seqüências inteiras das seqüências decadeia leve e cadeia pesada, incluindo as regiões de determinação de com-plementaridade (CDRs), são de genes humanos. Em uma modalidade, anti-corpos monoclonais humanos são preparados pela técnica de trioma, a téc-nica de célula B humana (Veja, por exemplo, Kozbor, e outro, Immunol. To-day 4: 72 (1983), técnica de transformação de EBV (Veja, por exemplo, Colee outro, MONOCLONAL ANTICORPOS e CÂNCER THERAPY' 77-96(1985)), ou usando exibição de fago (Veja, por exemplo, Marks e outro, J.Mol. Biol. 222:581 (1991)). Em uma modalidade específica, o anticorpo hu-mano é gerado em um camundongo transgênico. Técnicas para preparartais anticorpos parcialmente ou totalmente humanos são conhecidos na téc-nica e quaisquer tais técnicas podem ser usadas. De acordo com uma mo-dalidade particularmente preferida, seqüências de anticorpo totalmente hu-manas são feitas em um camundongo transgênico construído para expres-sar genes de anticorpo de cadeia pesada e leve humanos. Uma descriçãoexemplar de preparação de camundongos transgênicos que produzem anti-corpos humanos encontrados no Pedido nQ WO 02/43478 e Patente dos Es-tados Unidos n° 6.657.103 (Abgenix) e sua progênie. As células B de ca-mundongos transgênicos que produzem o anticorpo desejado podem entãoser fundidas para preparar linhagens de célula de hibridoma para a produçãocontínua do anticorpo. Veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n—5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, e 5.545.806; e Jakobovits, Adv.Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green, e outro, J. Exp. Med. 188:483-95(1998).

"Antígeno de Leucócito Humano" ou "HLA" é uma proteína deComplexo de Histocompatibilidade Maior de classe I ou classe II humana(MHC) (Veja, por exemplo, Stites, e outro, IMUNOLOGY, 8TH ED., LangePublishing, Los Altos, CA (1994).

Como aqui usado, o termo "anticorpo humanizado" refere-se aformas de anticorpos que contêm seqüências de anticorpos não-humanos(por exemplo, murino) bem como anticorpos humanos. Tais anticorpos sãoanticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglo-bulina não-humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá subs-tancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variá-veis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis cor-respondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana e todas ou subs-tancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de imuno-globulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compre-enderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina(Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Veja, por exemplo,Patente dos Estados Unidos Cabilly nQ 4,816,567; Queen e outro (1989)Proc. Nafl Acad. Sei. USA 86:10029-10033; e ANTIBODY ENGINEEFSING:A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996).

Os termos "hibridizam", "hibridização", "hibridiza" e os semelhan-tes, usados no contexto de polinucleotídeos, são entendidos referir-se àscondições de hibridização convencionais, preferivelmente tal como hibridiza-ção em 50% de formamida/6XSSC/0,1% de SDS/100 ng/ml de ssDNA, emque as temperaturas para hibridização estão acima de 37 graus C e as tem-peraturas para lavagem em 0,1XSSC/0,1% de SDS são acima de 55 graus C.

As frases "isolado" ou "biologicamente puro" referem-se ao ma-terial que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes quenormalmente acompanham o material como ele é encontrado em seu estadonativo. Desse modo, os peptídeos isolados de acordo com a invenção prefe-rivelmente não contêm materiais normalmente associados com os peptídeosem seu ambiente in situ. Por exemplo, um polinucleotídeo é dito ser "isolado"quando ele é substancilmente separado de polinucleotídeos contaminantesque correspondem ou são complementares aos genes exceto os genes de161P2F10B ou que codificam polipeptídeos exceto o produto de gene de161P2F10B ou fragmentos deste. Um técnico versado pode facilmente em-pregar procedimentos de isolamento de ácido nucléico para obter um polinu-cleotídeo de 161P2F10B isolado. Uma proteína é dita ser "isolada," por e-xemplo, quando métodos físicos, mecânicos ou químicos são empregadospara remover as proteínas 161P2F10B de constituintes celulares que sãonormalmente associados com a proteína. Um técnico versado pode facil-mente empregar métodos de purificação padrão para obter uma proteína de161P2F10B isolada. Alternativamente, uma proteína isolada pode ser prepa-rada por métodos químicos.

"Rótulos" adequados incluem radionuclídeos, enzimas, substra-tos, co-fatores, inibidores, porções fluorescentes, porções quimioluminescen-tes, partículas magnéticas, e os semelhantes. Patentes ensinando o uso detais rótulos incluem as Patentes dos Estados Unidos n— 3.817.837,3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149, e 4.366.241. Alémdisso, os anticorpos fornecidos aqui podem ser úteis como o componente deligação de antígeno de fluorocorpos. Veja, por exemplo, Zeytun e outro, Nat.Biotechnol. 21:1473-79 (2003).

O termo "mamífero" refere-se a qualquer organismo classificadocomo um mamífero, incluindo camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos,vacas, cavalos e seres humanos. Em uma modalidade da invenção, o mamí-fero é um camundongo. Em outra modalidade da invenção, o mamífero é umser humano.

Os termos "câncer metastático" e "doença metastática" signifi-cam cânceres que se disseminaram para linfonodos regionais ou para sítiosdistantes, e destinam-se a incluir doença em estágio D sob o sistema AUA eestágio TxNxM+ sob o sistema TNM.

O termo "modulador" ou "composto teste" ou "fármaco candida-to" ou equivalentes gramaticais como aqui usado descreve qualquer molécu-la, por exemplo, proteína, oligopeptídeo, pequena molécula orgânica, polis-sacarídeo, polinucleotídeo, etc, a ser testada quanto à capacidade de dire-tamente ou indiretamente alterar o fenótipo de câncer ou a expressão deuma seqüência de câncer, por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico ouproteína, ou efeitos de seqüências de câncer (por exemplo, sinalização, ex-pressão de gene, interação de proteína, etc).. Em um aspecto, um modula-dor neutralizará o efeito de uma proteína de câncer da invenção. Por "neu-tralizam" entende-se que uma atividade de uma proteína é inibida ou blo-queada, juntamente com o Conseqüente efeito sobre a célula. Em outro as-pecto, um modulador neutralizará o efeito de um gene, e sua correspondenteproteína, da invenção por níveis normalizantes da referida proteína. Em mo-dalidades preferidas, moduladores alteram os perfis de expressão, ou ácidosnucléicos ou proteínas de perfil de expressão fornecidos aqui, ou trilhas efe-toras a jusante. Em uma modalidade, o modulador suprime um fenótipo decâncer, por exemplo, para uma impressão digital de tecido normal. Em outramodalidade, um modulador induziu um fenótico de câncer. Geralmente, umapluralidade de misturas de ensaio é desenvolvida em paralelo com diferentesconcentrações de agente para obter uma resposta diferencial para as váriasconcentrações. Tipicamente, uma destas concentrações serve como umcontrole negativo, isto é, em concentração zero ou abaixo do nível de detecção.

Moduladores, fármacos condidatos ou compostos teste abran-gem numerosas classes químicas, embora tipicamesnte eles sejam molécu-las orgânicas, preferivelmente compostos orgânicos pequenos tendo um pe-so molecular de mais do que 100 e menos do que cerca de 2.500 Dáltons.As moléculas pequenas preferidas são menores do que 2000, ou menos doque 1500 ou menos do que 1000 ou menos do que 500 D. Os agentes can-didato compreendem grupos funcionais necessários para interação estruturalcom proteínas, particularmente ligação de hidrogênio, e tipicamente incluempelo menos uma amina, carbonila, hidroxila ou grupo carboxila, preferivel-mente pelo mens dois dos grupos químicos funcionais. Os agentes candida-to freqüentemente compreendem carbono cíclico ou estruturas heterocíclicase/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou maisdos grupos funcionais acima. Os moduladores também compreendem bio-moléculas tais como peptídeos, sacarídeos, ácidos graxos, esteróides, puri-nas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou combinações destes.Particularmente preferidos são os peptídeos. Uma classe de moduladoressão os peptídeos, por exemplo, de cerca de cinco a cerca de 35 aminoáci-dos, com de cerca de cinco a cerca de 20 aminoácidos sendo preferido, e decerca de 7 a cerca de 15 sendo particularmente preferido. Preferivelmente, aproteína moduladora de câncer é solúvel, inclui uma região de não-transmembrana, e/ou, tem um Cys de terminal N para auxiliar na solubilida-de. Em uma modalidade, o terminal C do fragmento é mantido como um áci-do live e o terminal N é uma amina livre para auxiliar no acoplamento, isto é,à cisteína. Em uma modalidade, uma proteína de câncer da invenção é con-jugada a um agente imunogênico como aqui descrito. Em uma modalidade,a proteína de câncer é conjugada a BSA. Os peptídeos da invenção, por e-xemplo, de comprimentos preferidos, podem ser ligados entre si ou a outrosaminoácidos para criar um mais longo peptídeo/proteína. Os peptídeos mo-duladores podem ser digestos de proteínas de ocorrência natural como édelineado acima, peptídeos aleatórios, ou peptídeos aleatórios "polarizados".Em uma modalidade preferida, moduladores com base em peptídeo/proteínasão anticorpos, e fragmentos destes, como aqui definido.

Os moduladores de câncer podem ser ácidos nucléicos. Os a-gentes moduladores de ácido nucléico podem ser ácidos nucléicos de ocor-rência natural, ácidos nucléicos aleatórios, ou ácidos nucléicos aleatórios"polarizados". Por exemplo, digestos de genomas procarióticos ou eucarióti-cos podem ser usados em um método análogo àquele delineado acima paraproteínas.

O termo "anticorpo monoclonal", como aqui usado, refere-se aum anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente ho-mogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população sãoidênticos exceto para mutações de ocorrência natural possível que podemestar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais sãoaltamene específicos, sendo direcionados contra um único epítopo antigêni-co. Ao contrário, preparações de anticorpo convencionais (policlonais) tipi-camente incluem uma multidão de anticorpos direcionados contra (ou espe-cíficos para) diferentes epítopos. Em uma modalidade, o anticorpo policlonalcontém uma pluralidade de anticorpos monoclonais com diferentes especifi-cidades de epítopo, afinidades, ou avidez dentro de um único antígeno quecontém múltiplos epítopos antigênicos. O modificador "monoclonal" indica ocaráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpossubstancialmente homogêneos, e não deve ser construído como requerendoa produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, osanticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invençãopodem ser feitos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler eoutro, Nature 256: 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA re-combinante (Veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos nQ4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados debibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson eoutro, Nature 352: 624- 628 (1991) e Marks e outro, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por exemplo, Estes anticorpos monoclonais usualmente ligar-se-ão com pelo menos um Kd de cerca de 1 |iM, mais usualmente pelo menoscerca de 300 nM, tipicamente pelo menos cerca de 30 nM, preferivelmentepelo menos cerca de 10 nM, mais preferivelmente pelo menos cerca de 3 nMou melhor, usualmene determinado por ELISA.

Um "motivo, como um motivo biológico de uma proteína relacio-nada com a 161P2F10B, refere-se a qualquer padrão de aminoácidos fa-zendo parte da seqüência primária de uma proteína, que está associadacom uma função particular (por exemplo, interação de proteína-proteína, in-teração de proteína-DNA, etc) ou modificação (por exemplo, que é fosforila-do, glicosilado ou amidado), ou localização (por exemplo, seqüência secretó-ria, seqüência de localização nuclear, etc), ou uma seqüência que é correla-cionada com ser imunogênica, ou imoralmente ou celularmente. Um motivopode ser ou contíguo ou capaz de ser alinhado em certas posições que sãogeralmente correlacionadas com uma certa função ou propriedade. No con-texto de motivos de HLA, "motivo refere-se ao padrão de resíduos em umpeptídeo de comprimento definido, usualmente um peptídeo de cerca de 8 acerca de 13 aminoácidos para um motivo de HLA de classe I e de cerca de 6a cerca de 25 aminoácidos para o motivo de HLA de classe II, que é reco-nhecido por uma molécula de HLA particular. Os motivos de peptídeo paraligação e HLA são tipicamente diferentes para cada proteína codificada porcada alelo de HLA humano e diferem no padrão dos resíduos de âncora pri-mários e secundários. Os motivos de ocorrência freqüente são mencionadosna Tabela V.

Um "excipiente farmacêutico" compreende um material tal comoum adjuvante, um veículo, agentes de ajuste de pH e de tamponamento,agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes, conservante, e ossemelhantes.

"Farmaceuticamente aceitável" refere-se a uma composiçãonão-tóxica, inerte, e/ou composição que é fisiologicamente compatível commamíferos humanos ou similares.

O termo "polinucleotídeo" significa uma forma polimérica de nu-cleotídeos de pelo menos 10 bases ou pares de base de comprimento, ouribonucleotídeos ou deoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquertipo de nucleotido, e é entendido incluir formas de filamento único ou duplode DNA e/ou RNA. Na técnica, este termo é freqüentemente usado alterna-damente com "oligonucleotídeo". Um polinucleotídeo pode compreenderuma seqüência de nucleotido descrita aqui onde Timidina (T), como mostra-do, por exemplo, na Figura 1, pode também ser uracila (U); esta definição érelativa às diferenças entre as estruturas químicas de DNA e RNA. Em parti-cular, a observação de que uma das quatro maiores bases em RNA é uracila(U) em lugar de Timidina (T).

O termo "polipeptídeo" significa um polímero de pelo menos cer-ca de 4, 5, 6, 7, ou 8 aminoácidos. Em toda a especificação, as designaçõesde três letras ou única letra padrão para aminoácidos são usadas. Na técni-ca, este termo é freqüentemente usado alternadamente com "peptídeo" ou"proteína".

Um "resíduo de âncora primário" de HLA é um aminoácido emuma posição específica ao longo de uma seqüência de peptídeo que é en-tendida fornecer um ponto de contato entre o peptídeo imunogênico e a mo-lécula de HLA. Um a três, usualmente dois, resíduos de âncora primáriosdentro de um peptídeo de comprimento definido geralmente define um "mo-tivo para um peptídeo imunogênico. Estes resíduos são entendidos ajusta-rem-se em contato íntimo com ranhura de ligação de peptídeo de uma molé-cula HLA, com suas cadeias laterais sepultadas em cavidades específicasda ranhura de ligação. Em uma modalidade, por exemplo, os resíduos ânco-ra primários para uma molécula de classe I de HLA são localizados na posi-ção 2 (da posição de terminal amino) e na posição terminal carboxila de umepítopo de peptídeo de 8, 9, 10, 11, ou 12 resíduos de acordo com a inven-ção. Alternativamente, em outra modalidade, os resíduos de âncora primá-rios de um peptídeo que liga uma molécula classe II de HLA são espaçadoscom relação um ao outro, em vez de aos terminais de um peptídeo, onde opeptídeo é geralmente de pelo menos 9 aminoácidos de comprimento. Asposições âncora primárias para cada motivo e sivpemiotivo são menciona-das na Tabela IV(a). Por exemplo, os peptídeos análogos podem ser criadosalterando-se a presença ou ausência de resíduos particulares nas posiçõesâncora primárias e/ou secundárias mostradas na Tabela IV. Tais análogossão usados para modular a afinidade de ligação e/ou cobertura de popula-ção de um peptídeo compreendendo um motivo ou si/pemiotivo de HLA par-ticular.

"Radioisótopos" incluem, porém não estão limitados aos seguin-tes (usos exemplares não-limitantes são também mencionados na TabelaIV(I)).

Por equivalentes "aleatorizados" ou gramaticais como aqui apli-cado aos ácidos nucléicos e proteínas entende-se que cada ácido nucléico epeptídeo consiste em nucleotídeos essencialmente aleatórios e aminoáci-dos, respectivamente. Estes peptídeos aleatórios (ou ácidos nucléicos, des-critos aqui) podem incorporar qualquer nucleotido ou aminoácido em qual-quer posição. O processo sintético pode ser designado para gerar proteínasaleatorizadas ou ácidos nucléicos, para permitir a formação de todos ou amaioria das possíveis combinações sobre o comprimento da seqüência,desse modo formando uma biblioteca de agentes proteinaceos bioativoscandidato aleatorizados.

Em uma modalidade, uma biblioteca é "totalmente aleatorizada,"sem nenhuma preferência de seqüência ou constantes em qualquer posição.Em outra modalidade, a biblioteca é uma biblioteca "aleatória polarizada".Isto é, algumas posições dentro da seqüência ou são mantidas constante, ousão selecionadas de um número limitado de possibilidades. Por exemplo, osresíduos de nucleotídeos ou aminoácido são aleatorizadas dentro de umaclasse definida, por exemplo, de aminoácidos hidrofóbicos, resíduos hidrofí-licos, resíduos estericamente polarizados (pequenos ou grandes) para a cri-ação de domínios de ligação de ácido nucléico, a criação de cisteínas, parareticulação, prolinas para os domínios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas ouhistidinas para sítios de fosforilação, etc, ou para purinas, etc.

Uma molécula de DNA ou RNA "recombinante" é uma moléculade DNA ou RNA que foi submetida à manipulação molecular in vitro.

Como aqui usado, o termo anticorpo "Fv de cadeia única" ou"scFv" ou "cadeia única" refere-se a fragmentos de anticorpo compreenden-do os domínios VH e VL de anticorpo, onde estes domínios estão presenteem uma cadeia de polipeptídeo única. Geralmente, o polipeptídeo Fv tam-bém compreende um ligador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL quepossibilitam o sFv formar a estrutura desejada para a ligação de antígeno.Para uma revisão de sFv, veja Pluckthun, THE FARMACOLOGY de MO-NOCLONAL ANTICORPOS, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).

Exemplos não-limitantes de "moléculas pequenas" incluem com-postos que ligam-se ou interagem com 161P2F10B, ligandos incluindo hor-mônios, neuropeptídeos, quimiocinas, odorantes, fosfolipídeos, e equivalen-tes funcionais destes que ligam-se e preferivelmente inibem a função da pro-teína 161P2F10B. Tais moléculas pequenas não-limitantes preferivelmentetêm um peso molecular menor do que cerca de 10 kDa, mais preferivelmenteabaixo de cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5 ou cer-ca de 4 kDa. Em certas modalidades, pequenas moléculas fisicamente as-sociam-se com, ou ligam, proteína 161P2F10B; não são encontradas emtrilhas metabólicas de ocorrência natural; e/ou são mais solúveis em solu-ções aquosas do que não-aquosas.

Como aqui usado, o termo "específico" refere-se à ligação sele-tiva do anticorpo ao epítopo de antígen alvo. Os anticorpos podem ser testa-dos quanto a especificidade de ligação comparando-se a ligação ao apropri-ado à ligação à antígeno irrelevante ou mistura de antígeno sob um determi-nado grupo de condições. Se o anticorpo liga-se ao antígeno apropriado pelomenos 2, 5, 7, e preferivelmente 10 vezes mais do que ao antígeno irrele-vante ou mistura de antígeno, então ele é considerado ser específico. Emuma modalidade, um anticorpo específico é aquele que apenas liga-se aoantígeno 161P2F10B, porém não liga-se ao antígeno irrelevante. Em outramodalidade, um anticorpo específico é aquele que liga antígeno 161P2F10Bhumano, porém não liga um antígeno 161P2F10B não humano com 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oumaior homologia de aminoácido com o antígeno 161P2F10B. Em outra mo-dalidade, um anticorpo específico é aquele que liga antígeno 161P2F10Bhumano e liga antígeno 161P2F10B murino, porém com um grau maior deligação o antígeno humano. Em outra modalidade, um anticorpo específico éaquele que liga antígeno 161P2F10B humano e liga antígeno 161P2F10Bprimata, porém com um maior grau de ligação o antígeno humano. Em outramodalidade, o anticorpo específico liga-se ao antígeno 161P2F10B humanoe qualquer antígeno 161P2F10B não-humano, porém com um maior grau deligação o antígeno humano ou qualquer combinação deste.

"Rigorosidade" de reações de hibridização é facilmente determi-nável por alguém versado na técnica, e geralmente é um cálculo empíricodependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem, e concen-tração de sal. Em geral, as sondas mais longas requerem temperaturas maiselevadas para recozimento apropriado, enquanto que as sondas mais curtasnecessitam temperaturas mais baixas. A hibridização geralmente dependeda capacidade de seqüências de ácido nucleico desnaturadass para novorecozimento quando filamentos complementares estão presentes em umambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de ho-mologia desejado entre a sonda e a seqüência hibridizável, maior a tempera-tura relativa que pode ser usada. Como um resultado, segue que temperatu-ras relativas maiores tendem a tornar as condições de reação mais rigoro-sas, enquanto que temperaturas menores menos então. Para detalhes adi-cionais e explanação da rigorosidade de reações de hibridização, veja Au-subel e outro, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Pu-blishers, (1995).

"Condições Rigorosas" ou "condições de alta rigorosidade ", co-mo aqui definido, são identificadas por, porém não-limitadas àquelas que: (1)empregam baixa resistência iônica e temperatura elevada para lavagem, porexemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% sul-fato de dodecila de sódio a 50°C; (2) empregam durante hibridização umagente de desnaturação, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) for-mamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de poli-vinilpirrolidona/50 mM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5 com 750mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) empregam50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCI, 0,075 M de citrato de sódio),50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solu-ção de Denhardt, DNA de esperma de salmon sonicado (50 ng/ml), 0,1% deSDS, e 10% de sulfato de dextrana a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 xSSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55°C, seguidopor uma lavagem de alta rigorosidade consistindo em 0,1 x SSC contendoEDTA a 55°C. "Condições moderadamente rigorosas" são descritas por, po-rém não-limitadas, àquelas em Sambrook e outro, Molecular Cloning: A La-boratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem ouso de solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, tem-peratura, resistência iônica e %SDS) menos rigorosass do que aquelas des-critas acima. Um exemplo de condições moderadamente rigorosas é a incu-bação durante a noite a 65°C em uma solução compreendendo: 1% de al-bumina de soro bovino, 0,5 M de fosfato de sódio pH 7,5, 1,25 mM de ED-TA5 e 7% de SDS 5 x SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato de trissódio),seguido por lavagem dos filtros em 2 x SSC/1% SDS a 50°C e 0,2 XSSC/0,1% de SDS a 50°C. O técnico versado reconhecerá como ajustar atemperatura, resistência iônica, etc. como necessário para acomodar fatorestais como comprimento de sonda e os semelhantes.

Um "supe/motivo" de HLA é uma especificidade de ligação depeptídeo compartilhada por moléculas de HLA codificadas por dois ou maisalelos de HLA. As freqüências fenotípicas gerais de supertipos de HLA emdiferentes populações etínicas são mencionadas na Tabela IV (f). Os consti-tuintes não-limitantes de vários supertipos são como segue:

A2: A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A* 0205, A*0206, A*6802,A*6901, A*0207

A3: A3, Ali, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A*1101, A*3101B7: B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502,B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602

B44: B*3701, BM402, BM403, B*60 (BM001), B61 (BM006)A1: A*0102, A*2604, A*3601, AM301, A*8001A24: A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003B27: B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801-02,

B*3901, B*3902, B*3903-04, BM801-02, B*7301, B*2701-08B58: B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58B62: B*4601, B52, B*1501 (B62), B*1502 (B75), B*1513 (B77)Cobertura de população calculada fornecida por diferentes combinações desuper tipo de HLA, é mencionada na Tabela IV(g).

Como aqui usado "para tratar" ou "terapêutico" e termos grama-ticamente relacionados, referem-se a qualquer melhora de qualquer conse-qüência de doença, tal como sobrevivência prolongada, menos morbidez,e/ou uma redução dos efeitos colaterais que são os subprodutos de umamodalidade terapêutica alternativa; como é facilmente apreciado na técnica,erradicação total da doença é uma preferência, embora não um requisitopara a ação de tratamento.

Um "animal transgênico" (por exemplo, um camundongo ou rato)é um animal tendo células que contêm um transgene, cujo transgene foi in-traduzido no animal ou um antepassado do animal em um estágio pré-natal,por exemplo, um estágio embriônico. Um "transgene" é um DNA que é inte-grado no genoma de uma célula da qual um animal transgênico desenvolve-se.

Como aqui usado, um HLA ou resposa imune celular "vacina" éuma composição que contém ou codifica um ou mais peptídeos da invenção.Existem numerosas modalidades de tais vacinas, tal como um coquetel deum ou mais peptídeos individuais; um ou mais peptídeos da invenção com-preendidos por um peptídeo poliepitópico; ou ácidos nucléicos que codificamtais peptídeos ou polipeptídeos individuais, por exemplo, um minigene quecodifica um peptídeo poliepitópico. O "um ou mais peptídeos" pode incluirqualquer númro inteiro de unidade total de 1-150 ou mais, por exemplo, pelomenos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105,110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, ou 150 ou mais peptídeos da inven-ção. Os peptídeos ou polipeptídeos podem opcionalmente ser modificados,tal como por lipidação, adição de alvejamento ou outras seqüências. Os pep-tídeos de HLA classe I da invenção podem ser misturados com, ou ligados a,peptídeos de HLA classe II, para facilitar a ativação de ambos os linfócitos Tcitotóxicos e linfócitos T auxiliares. As vacinas de HLA podem também com-preender células apresentando antígeno pulsado por peptídeo, por exemplo,células dendríticas.

O termo "variante" refere-se a uma molécula que exibe uma va-riação de um tipo descrito ou norma, tal como uma proteína que tem um oumais resíduos de aminoácido diferente na(s) posição(ões) correspondentesde uma proteína especificamente descrita (por exemplo, a proteína161P2F10B mostrada na Figura 1). Um análogo é um exemplo de uma pro-teína variante. As isoformas de união e polimorfismos de nucleotídeos úni-cos (SNPs) são outros exemplos de variantes.

As "proteínas relacionadas com 161P2F10B" da invenção inclu-em aquelas especificamente identificadas aqui, bem como variantes alélicas,variantes de substituição conservativa, análogos e homólogos que podemser isolados/gerados e caracterizados sem experimentação indevida seguin-do os métodos delineados aqui ou facilmente disponíveis na técnica. As pro-teínas de fusão que combinam partes de diferentes proteínas de 161P2F10Bou fragmentos destas, bem como proteínas de fusão de uma proteína161P2F10B e um polipeptídeo heterólogo são também incluídos. Tais prote-ínas de 161P2F10B são coletivamente referidas como as proteínas relacio-nadas a 161P2F10B, as proteínas da invenção, ou 161P2F10B. O termo"proteína relacionada com 161P2F10B" refere-se a um fragmento de poli-peptídeo ou uma seqüência de proteína 161P2F10B de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23, 24, 25, ou mais do que 25aminoácidos; ou, pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90,95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165,170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 oumais aminoácidos.

II). Polinucleotídeos 161P2F10B

Um aspecto da invenção fornece polinucleotídeos corresponden-tes ou complementares a todo ou parte de um gene de 161P2F10B, mRNA,e/ou seqüência de codificação, preferivelmente em forma isolada, incluindopolinucleotídeos codificando uma proteína relacionada com um 161P2F10Be fragmentos deste, DNA, RNA, DNA/RNA híbrido, e moléculas relaciona-das, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos complementares a um gene161P2F10B ou seqüência de mRNA ou uma parte desta, e polinucleotídeosou oligonucleotídeos que hibridizam para um gene 161P2F10B, mRNA, oupara um polinucleotídeo codificando 161P2F10B (coletivamente, "polinucleo-tídeos 161P2F10B"). Em todos os casos quando referido nesta seção, T po-de também ser U na Figura 1.

As modalidades de um polinucleotídeo 161P2F10B incluem: umpolinucleotídeo 161P2F10B tendo a seqüência mostrada na Figura 1, a se-qüência de nucleotido de 161P2F10B como mostrado na Figura 1 onde T éU; pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo tendo a se-qüência como mostrado na Figura 1; ou, pelo menos 10 nucleotídeos contí-guos de um polinucleotídeo tendo a seqüência como mostrado na Figura 1onde T é U.

Polinucleotídeos codificando porções relativamente longas deuma proteína 161P2F10B incluem-se também no escopo da invenção. Porexemplo, polinucleotídeos codificando de cerca de aminoácido 1 (ou 20 ou30 ou 40 etc), a cerca de aminoácido 20, (ou 30, ou 40 ou 50 etc), da proteí-na 161P2F10B "ou variante" mostrada na Figura 1 ou Figura 3 podem sergerados por uma variedade de técnicas bem conhecidas na técnica. Estesfragmentos de polinucleotídeo podem incluir qualquer porção da seqüênciade 161P2F10B como mostrado na Figura 1.

ILA). Usos de Polinucleotídeos 161P2F10B

ILA.1. Monitoração de Anormalidades Genéticas

Os polinucleotídeos dos parágrafos precedentes têm diversosusos específicos diferentes. O gene de 161P2F10B humano mapeia paa alocalização cromossômica mencionada no Exemplo intitulado "MapeamentoCromossômico de 161P2F10B". Por exemplo, por que o gene de161P2F10B mapeia para este cromossoma, os polinucleotídeos que codifi-cam diferentes regiões das proteínas 161P2F10B são usados para caracte-rizar anormalidades citogeneticas deste local cromossômico, tais como a-normalidades que são identificadas como sendo associadas com vários cân-ceres. Em certos genes, uma variedade de anormalidades cromossômicasincluindo redisposições foi identificada como freqüentes anormalidades cito-geneticas em diversos cânceres diferentes (Veja, por exemplo, Krajinovic eoutro, Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson e outro, Blood 86(10):3905-3914 (1995) e Finger e outro, P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)).Desse modo, os polinucleotídeos codificando regiões específicas das proteí-nas 161P2F10B fornecem novas ferramentas que podem ser usadas paradelinear, com maior precisão do que previamente possível, anormalidadescitogeneticas na região cromossômica que codifica 161P2F10B que podecontribuir para o fenótipo maligno. Neste contexto, estes polinucleotídeossatisfazem uma necessidade na técnica de expandir a sensibilidade de tria-gem cromossômica a fim de identificar anormalidades cromossômicas maissutis e menos comuns (Veja, por exemplo, Evans e outro, Am. J. Obstet.Gynecol 171 (4): 1055-1057 (1994)).

Além disso, como 161P2F10B foi mostrado ser altamente ex-presso em cânceres de próstata e outros, os polinucleotídeos de 161P2F10Bsão usados em métodos avaliando o estado de produtos de gene de161P2F10B em tecidos normais versus canceroso. Tipicamente, polinucleo-tídeos que codificam regiões específicas das proteínas 161P2F10B são usa-dos para avaliar a presença de perturbações (tais como deleções, inserções,mutações de ponto, ou alterações resultando em uma perda de um antígenoetc), em regiões específicas do gene 161P2F10B, tal como regiões contendoum ou mais motivos. Ensaios exemplares incluem tanto ensaios de RT-PCRbem como análise de polimorfismo de conformação de filamento único(SSCP) (Veja, por exemplo, Marrogi e outro, J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378(1999), ambos os quais utilizam polinucleotídeos codificando regiões especí-ficas de uma proteína para examinar estas regiões dentro da proteína.

II.A.2. Modalidades Anti-sentido

Outras modalidades relacionadas com ácido nucléico especifi-camente contempladas da invenção descritas aqui são DNA genômico, cD-NAs, ribozimas, e moléculas anti-sentido, bem como moléculas de ácido nu-cléico com base em uma cadeia principal alternativa, ou incluindo bases al-ternativas, se derivadas de fontes naturais ou sintetizadas, e incluem molé-culas capazes de inibir o RNA ou expressão de proteína de 161P2F10B. Porexemplo, moléculas anti-sentido podem ser RNAs ou outras moléculas, in-cluindo ácidos nucléicos de peptídeo (PNAs) ou moléculas de ácido não nu-cléico tais como derivados de fosforotioato que ligam-se especificamente aDNA ou RNA de uma maneira dependente do par de base. Um técnico ver-sado pode facilmente obter estas classes de moléculas de ácido nucléicousando os polinucleotídeos de 161P2F10B e seqüências de polinucleotídeodescritas aqui.

Tecnologia anti-sentido vincula a administração de oligonucleotí-deos exógenos que ligam-se a um polinucleotídeo alvo localizado dentro dascélulas. O termo "anti-sentido" refere-se ao fato de que tais oligonucleotí-deos são complementares a seus alvos intracelulares, por exemplo,161P2F10B. Veja, por exemplo, Jack Cohen, Oligodeoxynucleotídeos, Antisense Inhibitors de Gene Expressão, CRC Press, 1989; e Synthesis 1:1-5(1988). Os oligonucleotídeos anti-sentido de 161P2F10B da presente invenção incluem derivados tais como S-oligonucleotídeos (derivados de fosforotioato ou S-oligos, Veja, Jack Cohen, supra), que exibem ação inibidora decrescimento de célula de câncer realçada. S-oligos (fosforotioatos de nucleosídeo) são análogos isoeletrônicos de um oligonucleotídeo (O-oligo) em que um átomo de oxigênio não em ponte do grupo de fosfato é substituído por um átomo de enxofre. Os S-oligos da presente invenção podem ser preparados por tratamento dos correspondentes O-oligos com 3H-1.2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido, que é um reagente de transferência de enxofre. Veja, por exemplo, lyer, R. P. e outro, J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); e lyer, R. P. e outro, J. Am. Chem. Soe. 112:1253- 1254 (1990).

Os oligonucleotídeos anti-sentido de 161P2F10B adicionais da presente invenção incluem oligonucleotídeos anti-sentido conhecidos na técnica (Veja, por exemplo, Partridge e outro, 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development6: 169-175).

Os oligonucleotídeos anti-sentido de 161P2F10B da presenteinvenção tipicamente podem ser RNA ou DNA que é complementar a, e hibridiza estavelmente com os primeiros 100 códons 5' ou os últimos 100 códons 3' de uma seqüência genômica de 161P2F10B ou o mRNA correspondente. A complementaridade absoluta não é requerida, embora graus elevados de complementaridade sejam preferidos. Uso de um oligonucleotídeo complementar a esta região prove a hibridização seletiva para mRNA de161P2F10B e não para mRNA especificando outras subunidades reguladoras de proteína cinase. Em uma modalidade, oligonucleotídeos anti-sentido de 161P2F10B da presente invenção são fragmentos de 15 a 30-meros damolécula de DNA anti-sentido que têm uma seqüência que hibridiza para mRNA de 161P2F10B. Opcionalmente, oligonucleotídeo anti-sentido de161P2F10B é um oligonucleotídeo de 30-mero que é complementar a umaregião nos primeiros 10 códons 5' ou os últimos 10 códons 3' de161P2F10B. Alternativamente, as moléculas anti-sentido são modificadaspara empregar ribozimas na inibição de expressão de 161P2F10B, veja, porexemplo, L A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).

II.A.3. Iniciadores e Pares de Iniciador

Outras modalidades específicas destes nucleotídeos da inven-ção incluem iniciadores e pares de iniciador, que permitem a amplificaçãoespecífica de polinucleotídeos da invenção ou de quaisquer partes específi-cas destes, e sondas que seletivamente ou especificamente hibridizam paramoléculas de ácido nucléico da invenção ou para qualquer parte destas. Assondas podem ser rotuladas com um marcador detectável, tal como, por e-xemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente,um composto quimioluminescente, quelante de metal ou enzima. Tais son-das e iniciadores são usados para detectar a presença de um polinucleotí-deo de 161P2F10B em uma amostra e como um método para detectar umacélula expressando uma proteína 161P2F10B.

Exemplos de tais sondas incluem polipeptídeos compreendendotoda ou parte de seqüência de cDNA 161P2F10B humana mostrada na Figu-ra 1. Exemplos de pares de iniciador capazes de especificamente amplifi-cando 161P2F10B mRNAs são também descritos nos Exemplos. Como seráentendido pelo versado na técnica um grande número de diferentes iniciado-res e sondas podem ser preparados baseado nas seqüências providas aquie usadas efetivamente para amplificar e/ou detectar um 161P2F10B mRNA.

• Os polinucleotídeos de 161P2F10B da invenção são úteis parauma variedade de propósitos, incluindo porém não limitado a seu uso comosondas e iniciadores para a amplificação e/ou detecção do(s) gene(s) de161P2F10B, imRNA(s), ou fragmentos destes; como reagentes para o diag-nóstico e/ou prognóstico de câncer de próstata e outros cânceres; como se-qüências de codificação capazes de direcionar a expressão de polipepideos161P2F10B; como ferramentas para modular ou inibir a expressão do(s) ge-ne(s) de 161P2F10B e/ou translação das transcrições de 161P2F10B; e co-mo agentes terapêuticos.A presente invenção inclui o uso de qualquer sonda como aquidescrito para identificar e isolar uma seqüência de ácido nucléico relaciona-da a 161P2F10B ou 161P2F10B de uma fonte de ocorrência natural, tal co-mo humanos ou outros mamíferos, bem como a própria seqüência de ácidonucléico isolada, que compreende todas ou a maioria das seqüências encon-tradas na sonda usada.

II.A.4. Isolamento de Moléculas de Ácido Nucléico Codificando 161P2F10B

As seqüências de cDNA de 161P2F10B descritas aqui possibili-tam o isolamento de outros polinucleotídeos codificando o(s) produto(s) degene 161P2F10B, bem como o isolamento de polinucleotídeos codificandoos homólogos de produto de gene 161P2F10B, alternativamente isoformasunidas, variantes alélicas, e formas mutantes de um produto de gene de161P2F10B bem como polinucleotídeos que codificam análogos de proteí-nas relacionadas com 161P2F10B. Vários métodos de clonagem molecularque podem ser empregados para isolar cDNAs de tamanho natural codifi-cando um gene 161P2F10B são bem conhecidos (Veja, por exemplo, Sam-brook, J. e outro, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- edição, ColdSpring Harbor Press, Nova Iorque, 1989; Current Protocols in Molecular Bio-logy. Ausubel e outro, Eds., Wiley e Sons, 1995). Por exemplo, metodologiasde clonagem de fago lambda podem ser convenientemente empregadas,usando sistemas de clonagem comercialmente disponíveis (por exemplo,Lambda ZAP Express, Stratagene). Os clones de fago contendo cDNAs de-gene 161P2F10B podem ser identificados por sondagem com um cDNA de161P2F10B rotulado ou um fragmento deste. Por exemplo, em uma modali-dade, um cDNA de 161P2F10B (por exemplo, Figura 1) ou uma porção des-te pode ser sintetizado e usado como uma sonda para recuperar os cDNAsde sobreposição e de tamanho natural correspondentes a um gene de 161P2F10B. Um gene de 161P2F10B propriamente dito pode ser isolado portriagem de bibliotecas de DNA genômico, bibliotecas de cromossoma artifici-al bacteriano (BACs), bibliotecas de cromossoma artificial de levedura(YACs), e os semelhantes, com sondas e iniciadores de DNA de161P2F10B.ILA.5. Moléculas de Ácido Nucléico Recombinante e Sistemas de Vetor-Hospedeiro

A invenção também fornece moléculas de DNA ou RNA recom-binantes contendo um polinucleotídeo de 161P2F10B, um fragmento, análo-go ou homólogo deste, incluindo, porém não limitado a fagos, plasmídeos,fagemídeos, cosmídeos, YACs, BACs, bem como vários vetores virais enão-virais bem conhecidos na técnica, e células transformadas ou transfec-tadas com tais moléculas de DNA ou RNA recombinantes. Métodos paragerar tais moléculas são bem conhecidos (Veja, por exemplo, Sambrook eoutro, 1989, supra).

A invenção também fornece um sistema vetor-hospedeiro com-preendendo uma molécula de DNA recombinante contendo um polinucleotí-deo de 161P2F10B, fragmento, análogo ou homólogo deste, dentro de umacélula hospedeira procariótica ou eucariótica adequada. Exemplos de célulashospedeiras eucarióticas adequadas incluem uma célula de levedura, umacélulade plasnta, ou uma célula animal, tal como uma célula mamífera ouuma célula de inseto (por exemplo, uma célula infectível por baculovírus talcomo uma célula Sf9 ou HighFive cell). Exemplos de células mamíferas a-dequadas incluem várias linhagens de célula de câncer da próstata tais co-mo DU 145 e TsuPrl, outras linhagens de célula de câncer de próstata trans-feríveis ou transduzíveis, células primárias (PrEC), bem como diversas célu-las mamíferas rotineiramente usadas para a expressão de proteínas recom-binantes (por exemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Mais particularmen-te, um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de codificação de161P2F10B ou um fragmento, análogo ou homólogo deste pode ser usadopara gerar proteínas 161P2F10B ou fragmentos destes usando qualquernúmero de sistemas de vetor-hospedeiro rotineiramente usados e ampla-mente conhecidos na técnica.

Uma ampla faixa de sistemas de vetor-hospedeiro adequadospara a expressão de proteínas 161P2F10B ou fragmentos desta está dispo-nível, veja, por exemplo, Sambrook e outro, 1989, supra; Current Protocolsin Molecular Biology, 1995, supra). Vetores preferidos para a expressão demamíferos incluem, porém não estão limitados a rótulo myc-His de pcDNA3.1 (Invitrogen) e o vetor retroviral pSR tkneo (Muller e outro, 1991, MCB11:1785). Usando estes vetores de expressão, 161P2F10B pode ser expresso em diversas linhagens de célula de câncer de próstata e não-próstata,incluindo, por exemplo, 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 e TsuPrl. Os sistemas devetor-hospedeiro da invenção são úteis para a produção de uma proteína161P2F10B ou fragmento desta. Tais sistemas vetor-hospedeiro podem serempregados para estudar as propriedades funcionais de 161P2F10B e mutações ou análogos de 161P2F10B.

Proteína 161P2F10B humana recombinante ou um análogo ouhomólogo desta pode ser produzida por células mamíferas transfectadascom um constructo codificando um nucleotido relacionado com 161P2F10B.Por exemplo, as células 293T podem ser transfectadas com um plasmídeode expressão codificando 161P2F10B ou fragmento, análogo ou homólogodeste, uma proteína relacionada com um 161P2F10B é expressa nas células293T, e a proteína 161P2F10B recombinante é isolada usando métodos depurificação padrão (por exemplo, purificação de afinidade usando anticorposanti-161P2F10B). Em outra modalidade, uma seqüência de codificação de161P2F10B é subclonada no vetor retroviral pSRaMSVtkneo e usada para infectar várias linhagens de célula mamífera, tais como NIH 3T3, TsuPrl,293 e rat-1 a fim de estabelecer linhagens de célula expressando161P2F10B. Vários outros sistemas de expressão bem conhecidos na técnica podem também ser empregados. Constructos de expressão codificandoum peptídeo líder ligado em estrutura a uma seqüência de codificação de161P2F10B podem ser usadas para a geração de uma forma secretada deproteína 161P2F10B recombinante.

Como aqui descrito, redundância no código genético permitevariação em seqüências de gene 161P2F10B. Em particular, é conhecido natécnica que espécies hospedeiras específicas freqüentemente têm preferências de códon específicas, e desse modo alguém pode adaptar a seqüênciadescrita como preferida para um hospedeiro desejado. Por exemplo, seqüências de códon análogas preferidas tipicamente têm códons raros (isto é,códons tendo uma freqüência de uso menor do que cerca de 20% em se-qüências conhecidas do hospedeiro desejado) substituídos com códons defreqüência maiores. Preferências de códon para uma espécie específica sãocalculadas, por exemplo, utilizando tabelas de uso de códon disponíveis naINTERNET tal como em URL dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html.

Modificações de seqüência adicional são conhecidas realçar aexpressão de proteína em um hospedeiro celular. Estas incluem a elimina-ção de seqüências codificando sinais de poliadenilação espúrios, sinais desítio de união de éxon/íntron, repetições semelhantes a transposon, e/ououtras seqüências bem caracterizadas que são deletérias para a expressãode gene. O conteúdo de GC da seqüência é ajustada para a média dos ní-veis para um determinado hospedeiro celular, como calculado por referênciapara genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Onde possível, aseqüência é modificada para evitar as estruturas de mRNA secundárias degrampo de cabelo preditas. Outras modificações úteis incluem a adição deuma seqüência de consenso de iniciação translacional no início da estruturade leitura aberta, como descrito em Kozak, Mol. Cell Biol., 9:5073- 5080(1989). Técnicos experientes entendem que a norma geral de que os ribos-somas eucarióticos iniciam a translação exclusivamente no códon AUG 5'proximal é ab-rogada apenas sob condições raras (Veja, por exemplo, KozakPNAS 92(7): 2662-2666, (1995) e Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).

III). Proteínas relacionadas com 161P2F10B

Outro aspecto da presente invenção fornece proteínas relacio-nadas com 161P2F10B. Modalidades específicas de proteínas 161P2F10Bcompreendem um polipeptídeo tendo toda ou parte de uma seqüência deaminoacido de 161P2F10B humano como mostrado na Figura 1, preferivel-mente Figura 1A. Alternativamente, as modalidades de proteínas161P2F10B compreendem polipeptídeos variantes, homólogos ou análogosque têm alterações na seqüência de aminoacido de 161P2F10B mostradana Figura 1.

Modalidades de um polipeptídeo de 161P2F10B incluem: umpolipeptídeo de 161P2F10B tendo uma seqüência mostrada na Figura 1, umpeptídeo codificado por uma seqüência de polinucleotídeo de uma161P2F10B como mostrado na Figura 1 onde T é U; pelo menos 10 nucleotídeos contíguos codificando um polipeptídeo tendo a seqüência como mostrado na Figura 1; ou, pelo menos 10 peptídeos contíguos codificados porum polinucleotídeo tendo a seqüência como mostrado na Figura 1 onde T é U.

As abreviações de aminoácido são fornecidas na Tabela II.Substituições de aminoácido conservativas podem freqüentemente ser feitasem uma proteína sem alterar ou a conformação ou a função da proteína. Asproteínas da invenção podem compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15 substituições conservativas.

Modalidades da invenção descritas aqui incluem uma ampla variedade de variantes ou análogos aceitos na técnica de proteínas 161P2F10B tais como polipeptídeos tendo inserções, deleções e substituições de aminoácido. As variantes de 161P2F10B podem ser feitas empregando-se métodos conhecidos na técnica tal como mutagênese direcionadaao sítio, varredura de alanina, e mutagênese de PCR. Mutagênese direcionada ao sítio (Carter e outro, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller e outro, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagênese de cassete (Wells e outro, Gene, 34:315 (1985)), mutagênese de seleção de restrição (Wells e outro, Philos. Trans. R. Soe. London SerA, 317:415 (1986)) ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir o DNA variante de 161P2F10B.

Análise de aminoácido de varredura pode também ser empregada para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma seqüência contígua que está envolvida em uma atividade biológica específica tal comouma interação proteína-proteína. Entre os aminoácidos de varredura preferidos estão os aminoácidos neutros, relativamente pequenos. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina, e cisteína. A alanina é tipicamente um aminoácido de varredura preferido entre este grupo, por que ele elimina acadeia lateral além do carbono beta e é menos provável de alterar a conformação de cadeia principal da variante. A alanina é também tipicamente pre-ferida por que ela é o aminoácido mais comum. Além disso, ela é freqüen-temente encontrada em ambas as posições escondida e exposta (Creighton,The proteínas, (W.H. Freeman & Co., N.Y).; Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)). Se a substituição de alanina não produz quantidades de variante,um aminoácido isostérico pode ser usado.

Como aqui definido, variantes, análogos ou homólogos de161P2F10B, têm o atributo diferenciação de ter pelo menos um epítopo queé "inter-reativo" com uma proteína 161P2F10B tendo uma seqüência de a-minoácido de Figura 1. Como usado nesta sentença, "inter-reativo" significaque um anticorpo ou célula T que especificamente liga-se a uma variante de161P2F10B também liga-se especificamente a uma proteína 161P2F10Btendo uma seqüência de aminoácido mencionada na Figura 1. Um polipeptí-deo deixa de ser uma variante de uma proteína mostrada na Figura 1, quan-do ele não mais contém um epítopo capaz de ser reconhecido por um anti-corpo ou célula T que especificamente liga-se à proteína 161P2F10B de par-tida. Aqueles versados na técnica entendem que anticorpos que reconhecemproteínas ligam-se a epítopos de tamanho variável, e um agrupamento daordem de cerca de quatro ou cinco aminoácidos, contíguos ou não, é consi-derado como um número típico de aminoácidos em um epítopo mínimo. Ve-ja, por exemplo, Nair e outro, J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbese outro, Mol Immunol (1989) 26(9):865-73; Schwartz e outro, J Immunol(1985) 135(4):2598-608.

Outras classes de variantes de proteína relacionada com161P2F10B compartilham 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais simila-ridade com uma seqüência de aminoácido de Figura 1, ou um fragmentodeste. Outra classe específica de variantes ou análogos de proteína161P2F10B compreende um ou mais dos motivos biológicos de 161P2F10Bdescritos aqui ou atualmente conhecidos na técnica. Desse modo, abrangi-dos pela presente invenção estão os análogos de fragmentos de 161P2F10B(nucleico ou aminoácido) que têm propriedades funcionais alteradas (porexemplo, imunogênicas) com relação ao fragmento de partida. Deve ser a-preciado que os presentes motivos ou que tornam-se parte da técnica de-vem ser aplicados às seqüências de ácido nucléico ou aminoácido de Figura 1.

Como descrito aqui, modalidades da invenção reivindicada incluem polipeptídeos contendo menos do que a seqüência de aminoácido completa de uma proteína 161P2F10B mostrada na Figura 1. Por exemplo,as modalidades representativas da invenção compreendem peptídeos/proteínas tendo quaisquer 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de uma proteína 161P2F10B mostrada na Figura 1.

As proteínas relacionadas com 161P2F10B são geradas empregando-se tecnologia de síntese de peptídeo padrão ou usando métodos de clivagem química bem conhecidos na técnica. Alternativamente, métodosrecombinantes podem ser usados para gerar moléculas de ácido nucléicoque codificam uma proteína relacionada com 161P2F10B. Em uma modalidade, moléculas de ácido nucléico fornecem um método para gerar fragmentos definidos de uma proteína 161P2F10B (ou variantes, homólogos ou análogos destes).

III.A). Modalidades de Proteína Transportando Motivo

Modalidades ilustrativas adicionais da invenção descritas aquiincluem polipeptídeos de 161P2F10B compreendendo os resíduos de aminoácido de um ou mais dos motivos biológicos contidos em uma seqüência de polipeptídeo de 161P2F10B mencionada na Figura 1. Vários motivos sãoconhecidos na técnica, e uma proteína pode ser avaliada quanto à presençade tais motivos por diversos sites de INTERNET publicamente disponíveis tais como BIMAS.

Subseqüências transportando motivo de todas as proteínas variantes 161P2F10B foram previamente descritas.

A Tabela IV(h) menciona diversos motivos de ocorrência freqüente com base em pesquisas pfam (veja endereço URL pfam.wustl.edu/).

As colunas de Tabela IV(h) listam (1) abreviação de nome de motivo, (2)percentual de identidade encontrado entre os diferentes membros da famíliamotivo, (3) no ou descrição do motivo e (4) função mais comum; informaçãode localização é incluída se o motivo for relevante para a localização.Polipeptídeos compreendendo um ou mais dos motivos161P2F10B descritos acima são úteis na elucidação das características es-pecíficas de um fenótipo maligno em vista da observação de que os motivosde 161P2F10B descritos acima estão associados com desregulação decrescimento e por que 161P2F10B é supreexpresso em certos cânceres(Veja, por exemplo, Tabela I). Caseína cinase II, cAMP e proteína cinasedependente de camp, e Proteína Cinase C, por exemplo, são enzimas co-nhecidas estarem associadas com o desenvolvimento do fenótipo maligno(Veja, por exemplo, Chen e outro, Lab Invest, 78(2): 165-174 (1998); Gaid-don e outro, Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall e outro, NucleicAcids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel e outro, Oncogene18(46): 6322- 6329 (1999) e 0'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). A-lém disso, tanto a glicosilação quanto miristoilação são modificações de pro-teína também associadas Com câncer e progressão de câncer (Veja, porexemplo, Dennis e outro, Biochem. Biophys. Acta 1473(1 ):21-34 (1999); Ra-ju e outro, Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)). Amidação é outra modifi-cação de proteína também associada com câncer e progressão de câncer(Veja, por exemplo, Treston e outro, J. Natl. Câncer Inst. Monogr. (13): 169-175(1992)).

Em outra modalidade, as proteínas da invenção compreendemum ou mais dos epítopos imunorreativos identificados de acordo com os mé-todos aceitos na técnica, tais como peptídeos previamente descritos. Os epí-topos CTL podem ser determinados empregando-se algoritmos específicospara identificar peptídeos dentro de uma proteína 161P2F10B que são capa-zes de idealmente ligar-se aos alelos de HLA especificados (por exemplo,Table IV; Epimatrix® e Epimer®, Brown University; e BIMAS). Além disso,processos para identificar peptídeos que têm suficiente afinidade de ligaçãopara moléculas de HLA e que são correlacionados com ser epítopos imuno-gênicos, são bem conhecidos na técnica, e são realizados sem experimen-tação indevida. Além disso, processos para identificar peptídeos que sãoepítopos imunogênicos, são bem conhecidos na técnica, e são realizadossem experimentação indevida ou in vitro ou in vivo.Também conhecidos na técnica são os princípios para criar análogos de tais epítopos a fim de modular a imunogenicidade.

Por exemplo, alguém começa com um epítopo que transporta um motivo CTL ou HTL (Veja, por exemplo, os motivos/supe/motivos de HLA Classe I e HLA Classe II de Tabela IV). O epítopo é análogo por substituição de um aminoácido emuma das posições especificadas, e substituindo-o com outro aminoácido especificado para aquela posição. Por exemplo, com base nos resíduos definidos na Tabela IV, alguém pode substituir um resíduo deletério em favor dequalquer outro resíduo, tal como um resíduo preferido; substitui um resíduomenos preferido com um resíduos preferido; ou substitui um resíduo preferido de ocorrência original com outro resíduo preferido. Substituições podem ocorrer em posições de âncora primárias ou em outras posições em um peptídeo; Veja, por exemplo, Tabela IV.

Uma variedade de referências reflete a técnica considerando aidentificação e geração de epítopos em uma proteína de interesse, bem como análogos destes. Veja, por exemplo, WO 97/33602 de Chesnut e outro; Sette, J. Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette e outro, J. Immunol.2001 166(2): 1389-1397; Sidney e outro, Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20;Kondo e outro, Imunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney e outro, J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; e Falk e outro, Nature 351: 290-6 (1991); Hunt e outro, Science 255:1261-3 (1992); Parker e outro, J. Immunol. 149:3580-7(1992); Parker e outro, J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast e outro, 1994152(8): 3904- 12; Borras-Cuesta e outro, Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander e outro, J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander e outro, PMID: 7895164, Ul: 95202582; 0'Sullivan e outro, J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander e outro, Immunity 1994 1(9): 751- 761 e Alexander e outro, Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.

As modalidades relacionadas da invenção incluem polipeptídeoscompreendendo combinações dos diferentes motivos mencionados nas Tabela(s) IV(a), IV(b), IV(c), IV(d), e IV(h), e/ou, um ou mais dos epítopos de CTL preditos de previamente descritos, e/ou, um ou mais dos motivos deligação de célula T conhecidos na técnica. Modalidades preferidas não con-têm nenhuma inserção, deleção ou substituições ou dentro dos motivos oudentro das seqüências intermediárias dos polipeptídeos. Além disso, modali-dades que incluem diversos resíduos de aminoácido N-terminal e/ou C-terminal em qualquer dos lados destes motivos podem ser desejáveis (para,por exemplo, incluir uma porção maior da arquitetura de polipeptídeo em queo motivo é localizado). Tipicamente, o número de resíduos de aminoácido N-terminal e/ou C-terminal em qualquer lado de um motivo é emtre cerca de 1a cerca de 100 resíduos de aminoácido, preferivelmente 5 a cerca de 50 re-síduos de aminoácido.

Proteínas relacionadas com 161P2F10B são representadas demuitas formas, preferivelmente em forma isolada. Uma proteína purificadade molécula de 161P2F10B será substancialmente livre de outras proteínasou moléculas que prejudicam a ligação de 161P2F10B ao anticorpo, célula Tou outro ligando. A natureza e grau de isolamento e purificação dependerãodo uso pretendido. Modalidades de uma proteína relacionada com as161P2F10Bs incluem proteínas relacionadas com 161P2F10B purificadas efuncionais, proteínas relacionadas com 161P2F10B solúveis. Em uma moda-lidade, uma proteína 161P2F10B solúvel, funcional ou fragmento desta re-tém a capacidade de ser ligada por anticorpo, célula T ou outro ligando.

A invenção também fornece proteínas 161P2F10B compreen-dendo fragmentos biologicamente ativos de uma seqüência de aminoácidode 161P2F10B mostrada na Figura 1. Tais proteínas exibem propriedadesda proteína 161P2F10B de partida, tais como a capacidade de eliciar a ge-ração de anticorpos que especificamente ligam-se a um epítopo associadocom a proteína 161P2F10B de partida; para ser ligada por tais anticorpos;para eliciar a ativação de HTL ou CTL; e/ou, para ser reconhecida por HTLou CTL que também especificamente liga-se à proteína de partida.

Polipeptídeos relacionados com a 161P2F10B que contêm estru-turas particularmente interessantes podem ser preditos e/ou identificadosempregando várias técnicas analíticas bem conhecidas na técnica, incluindo,por exemplo, os métodos de análise Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus- Schultz ou Jameson- Wolf, ou com base emimunogenicidade. Fragmentos que contêm tais estruturas são particularmen-te úteis na geração de anticorpos anti-161P2F10B específicos de subunida-de ou células T ou na identificação de fatores celulares que ligam-se a161P2F10B. Por exemplo, os perfis de hidrofilicidade podem ser gerados, eos fragmentos de peptíeo imunogênico identificados, empregando-se o mé-todo de Hopp, T.P. e Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.78:3824-3828. Os perfis de hidropaticidade podem ser gerados, e os frag-mentos de peptídeo imunogênicos identificados, empregando-se o métodode Kyte, J. e Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. Percentual (%)de perfis de Resíduos Acessíveis podem ser gerados, e os fragmentos depeptídeo imunogênio identificados, empregando-se o método de Janin J.,1979, Nature 277:491-492. Perfis de Flexibilidade Média podem ser gerados,e os fragmentos de peptídeo imunogênico identificados, empregando-se ométodo de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. proteínaRes. 32:242-255. Os perfis de ciclos beta podem ser gerados, e fragmentosde peptídeo imunogênico identificados, empregando-se o método de Delea-ge, G., Roux B., 1987, proteína Engineering 1:289-294.

Os epítopos de CTL podem ser determinados empregando-sealgoritmos específicos para identificar peptídeos dentro de uma proteína161P2F10B que são capazes de idealmente ligar-se aos alelos de HLA es-pecíficos tais como BIMAS e SYFPEITHI. Ilustrando isto, epítopos de peptí-deo de 161P2F10B que são apresentados no contexto de moléculas huma-nas MHC Classe I, por exemplo, HLA-AI, A2, A3, Al 1, A24, B7 e B35 forampreditas. Especificamente, a seqüência de aminoácido completa da proteína161P2F10B e porções relevantes de outras variantes, isto é, para as predi-ções de HLA Classe I, 9 resíduos de flanqueamento sobre qualquer lado deuma mutação de ponto ou junção de éxon, e para predições de HLA ClasseII, 14 resíduos de flanqueamento sobre qualquer lado de uma mutação deponto ou junção de éxon correspondente àquela variante, foram introduzidosno algoritmo de Pesquisa de Motif de Peptídeo de HLA encontrado na SeçãoAnálise de Bioinformáticos e Molecular.

O algoritmo de pesquisa de motif de peptídeo de HLA foi desen-volvido por Dr. Ken Parker com base na ligação de seqüências de peptídeoespecífico na ranhura de moléculas de HLA Classe I, em particular, HLA- A2(veja, por exemplo, Falk e outro, Nature 351: 290-6 (1991); Hunt e outro,Science 255:1261-3 (1992); Parker e outro, J. Immunol. 149:3580-7 (1992);Parker e outro, J. Immunol. 152:163-75 (1994)). Este algoritmo permite alocalização e posição de peptídeos de 8-mero, 9-mero, e 10-mero de umaseqüência de proteína completa para ligação predita a HLA- A2 bem comonumerosas outras moléculas de HLA Classe I. Muitos peptídeos de ligaçãode HLA classe I são de 8-, 9-, 10 ou 11-meros. Por exemplo, para HLA-A2Classe I, os epítopos preferivelmente contêm uma leucina (L) ou metionina(M) na posição 2 e uma valina (V) ou leucina (L) no terminal C (veja, por e-xemplo, Parker e outro, J. Immunol. 149:3580-7 (1992)). Os resultados sele-cionados de peptídeos de ligação predita de 161P2F10B foram mostrados.O escore de ligação corresponde à metade do tempo de dissociação esti-mado de complexos contendo o peptídeo a 37°C em pH 6,5. Os peptídeoscom o escore de ligação mais elevado são preditos serem os mais firme-mente ligados ao HLA Classe I na superfície celular durante o maior períodode tempo, e desse modo representam os alvos melhor imunogênicos parareconhecimento de célula T.

Ligação real de Peptídeos a um alelo de HLA pode ser avaliadapor estabilização de expressão de HLA na linhagem de célula T2 defectivade processamento de antígeno (veja, por exemplo, Xue e outro, Próstata30:73-8 (1997) e Peshwa e outro, Próstata 36:129-38 (1998)). Imunogenici-dade de peptídeos específicos pode ser avaliada in vitro por estimulação delinfócitos T citotóxicos CD8+ (CTL) na presença de células apresentandoantígeno tais como células dendríticas.

Deve ser apreciado que todo epítopo predito pelo site BIMAS,sites Epimer® e Epimatrix®, ou especificados pelos motivos de HLA classe Iou classe II disponíveis na técnica ou que tornam-se parte da técnica tal co-mo mencionado na Tabela IV sejam "aplicados" a uma proteína 161P2F10Bde acordo com a invenção. Como usado neste contexto "aplicado" significaque uma proteína 161P2F10B é avaliada, por exemplo, visualmente ou pormétodos de descoberta de padrões com base no computador, como apreciado por aqueles versados na técnica concernente. Toda subseqüência de uma proteína 161P2F10B de 8, 9, 10, ou 11 resíduos de aminoácido quetransportam um motivo de HLA Classe I, ou uma subseqüência de 9 ou maisresíduos de aminoácido que transportam um motivo de HLA Classe II incluise no escopo da invenção.

III.B). Expressão de Proteínas Relacionadas com 161 P2F10B

Em uma modalidade descrita nos Exemplos que seguem,161P2F10B pode ser convenientemente expressa em células (tais como células 293T) transfectadas com um vetor de expressão comercialmente disponível tal como um vetor de expressão impulsionado por CMV codificando161P2F10B com um rótulo 6XHis e MYC de terminal C (pcDNA3.1/mycHIS,Invitrogen ou Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN). O vetor Tag5fornece um sinal de secreção de IgGK que pode ser usado para facilitar aprodução de uma proteína 161P2F10B secretada em células transfectadas.A 161P2F10B rotulada por HIS secretada nos meios de cultura pode ser purificada, por exemplo, usando uma coluna de níquel empregando técnicas padrão.

III.C). Modificações de Proteínas Relacionadas com 161P2F10B

Modificações de proteínas relacionadas com 161P2F10B taiscomo modificações covalentes são incluídas no escopo desta invenção. Umtipo de modificação covalente inclui reagir resíduos de aminoácido alvejadosde um polipeptídeo de 161P2F10B com um agente de derivatização orgânica que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos de terminal N ou C de uma proteína 161P2F10B. Outro tipo de modificaçãocovalentede um polipeptídeo de 161P2F10B incluído no escopo desta invenção comprende alterar o padrão de glicosilação nativa de uma proteína da invenção. Outro tipo de modificação covalente de 161P2F10B compreendeligar um polipeptídeo 161P2F10B a uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, da maneira mencionada nas Patentes dos Estados Unidos n—4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou 4.179.337.As proteínas relacionadas a 161P2F10B da presente invençãopodem também ser modificadas para formar uma molécula quimerica com-preendendo 161P2F10B fundida à outra, polipeptídeo heterólogo ou se-qüência de aminoácido. Uma tal molécula quimerica pode ser sintetizadaquimicamente ou recombinantemente. Uma molécula quimerica pode teruma proteína da invenção fundida à outro antígeno associado com tumor oufragmento deste. Alternativamente, uma proteína de acordo com a invençãopode compreender uma fusão de fragmentos de uma seqüência de161P2F10B (ácido nucléico ou amino) tal que uma molécula é criada, quenão é, através de seu comprimento, diretamente homóloga às seqüências deácido nucléico ou amino mostradas na Figura 1. Uma tal molécula quimericapode compreender múltiplos da mesma subseqüência de 161P2F10B. Umamolécula quimerica pode compreender uma fusão de uma proteína relacio-nada com a 161P2F10B com um rótulo de epítopo de poli-histidina, que for-nece um epítopo ao qual níquel imobilizado pode seletivamente ligar-se, comcitocinas ou com fatores de crescimento. O rótulo de epítopo é geralmentecolocado no terminal de amino ou carboxila de uma proteína 161P2F10B.Em uma modalidade alternativa, a molécula quimerica pode compreenderuma fusão de uma proteína relacionada com a 161P2F10B com um imuno-globulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma formabivalente da molécula quimerica (também referida como uma "imunoadesi-na"), uma tal fusão pode ser à região Fc de uma molécula IgG. As fusões deIg preferivelmente incluem a substituição de uma forma solúvel (domínio detransmembrana deletado ou inativado) de um polipeptídeo de 161P2F10Bem lugar de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula Ig. Emuma modalidade preferida, a fusão de imunoglobulina inclui a articulação,CH2 e CH3, ou a articulação, regiões CHI, CH2 e CH3 de uma molécula deIgGI. Para a produção de fusões de imunoglobulina, veja, por exemplo, Pa-tente dos Estados Unidos ne 5.428.130 emitida em 27 de junho de 1995.

III.D). Usos de Proteínas Relacionadas com 161P2F10B

As proteínas da invenção têm um número de diferentes usosespecíficos. Como a 161P2F10B é altamente expressa em câncer de prósta-ta e outros, as proteínas relacionadas com 161P2F10B são usadas em mé-todos que avaliam o estado dos produtos de gene de 161P2F10B em tecidosnormais versus cancerosos, desse modo elucidando o fenótipo maligno. Ti-picamente, os polipeptídeos de regiões específicas de uma proteína161P2F10B são usados para avaliar a presença de perturbações (tais comodeleções, inserções, mutações de ponto etc), naquelas regiões (tais comoregiões contendo um ou mais motivos). Ensaios exemplares utilizam proteí-nas relacionadas com 161P2F10B alvejando anticorpos ou células T com-preendendo os resíduos de aminoácido de um ou mais dos motivos biológi-cos contidos em uma seqüência de polipeptídeo de 161P2F10B a fim de a-valiar as características desta região em tecidos normais versus cancerososou para eliciar uma resposta imune ao epítopo. Alternativamente, proteínasrelacionadas com 161P2F10B que contêm os resíduos de aminoácido de umou mais dos motivos biológicos em uma proteína 161P2F10B são usadaspara avaliar quanto aos fatores que interagem com aquela região de161P2F10B.

Subseqüências/fragmentos de proteína 161P2F10B são particu-larmente úteis na geração e caracterização de anticorpos específicos dodomínio (por exemplo, anticorpos que reconhecem um epítopo extracelularou intracelular de uma proteína 161P2F10B), para identificar agentes ou fa-tores celulares que ligam-se a 161P2F10B ou um domínio estrutural particu-lar desta, e em vários contextos terapêuticos e diagnósticos, incluindo, po-rém não limitado a ensaios diagnósticos, vacinas de câncer e métodos depreparação de tais vacinas.

Proteínas codificadas pelos genes 161P2F10B, ou por análogos,homólogos ou fragmentos destes, têm uma variedade de usos, incluindo,porém não limitados a geração de anticorpos e em métodos para identificarligandos e outros agentes e constituintes celulares que ligam-se a um produ-to de gene 161P2F10B. Anticorpos foram construídos contra uma proteína161P2F10B ou fragmento desta são úteis em ensaios diagnósticos e prog-nósticos, e metodologias de imageamento no controle de cânceres humanoscaracterizados pela expressão de proteína 161P2F10B, tal como aqueleslistados na Tabela I. Tais anticorpos podem ser expressos intracelularmentee usados em métodos de tratar pacientes com tais cânceres. Proteínas ouácidos nucléicos relacionados com 161P2F10B são também usados na ge-ração de respostas a HTL ou CTL.

Vários ensaios imunológicos úteis para a detecção de proteínas161P2F10B são usados, incluindo porém não limitados a vários tipos de rá-dio-imunoensaios, ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA), en-saios imunofluorescentes ligados à enzima (ELIFA), métodos imunocitoquí-micos, e os semelhantes. Anticorpos podem ser rotulados e usados comoreagentes de imageamento imunológico capazes de detectar células expres-sando 161P2F10B (por exemplo, em métodos de imageamento radiocintigrá-fico). Proteínas 161P2F10B são também particularmente úteis na geraçãode vacinas de câncer, como também descrito aqui.

IV). Anticorpos 161P2F10B

Outro aspecto da invenção fornece anticorpos que ligam-se aproteínas relacionadas com 161P2F10B. Anticorpos preferidos especifica-mente ligam-se a uma proteína relacionada com 161P2F10B e e não ligam-se (ou ligam-se fracamente) a peptídeos ou proteínas que não são proteínasrelacionadas com 161P2F10B sob condições fisiológicas. Neste contexto,Exemplos de condições fisiológicas incluem: 1) salina tamponada por fosfa-to; 2) Salina tamponada por Tris contendo 25 mM de Tris e 150 mM de NaCI;ou salina normal (0,9% de NaCI); 4) soro animal tal como soro humano; ou,5) uma combinação de qualquer de 1) a 4); estas reações preferivelmenteocorrem em pH 7,5, alternativamente em uma faixa de pH 7,0 a 8,0, ou al-ternativamente em uma faixa de pH 6,5 a 8,5; além disso, estas reações o-correm em uma temperatura entre 4°C a 37°C. Por exemplo, anticorpos queligam-se a 161 P2F10B podem ligar-se à proteínas relacionadas com161P2F10B tal como os homólogos ou análogos destas.

Anticorpos de 161P2F10B da invenção são particularmente úteisem ensaios diagnósticos e prognósticos de câncer (Veja, por exemplo, Tabe-la I), e metodologias de imageamento. Similarmente, tais anticorpos são ú-teis no tratamento, diagnóstico, e/ou prognóstico de próstata e outros cânce-res, na extensão em que 161P2F10B é também expresso ou superexpressonestes outros cânceres. Além disso, anticorpos intracelularmente expressos(por exemplo, anticorpos de cadeia única) são terapeuticamente úteis emtratamento de cânceres em que a expressão de 161P2F10B está envolvida,tal como cânceres de próstata avançados ou metastáticos ou ou outros cânceres avançados ou metastáticos.

A invenção também fornece vários ensaios imunológicos úteispara a detecção e quantificação de 161P2F10B e proteínas mutantes relacionadas com 161P2F10B. Tais ensaios podem compreender um ou maisanticorpos de 161P2F10B capazes de reconhecer e ligar uma proteína relacionada com 161P2F10B, como apropriado. Estes ensaios são realizados em vários formatos de ensaio imunológico bem conhecidos na técnica, incluindo porém não limitados a vários tipos de rádio-imunoensaios, ensaios imunoabsorvente ligados à enzima (ELISA), ensaios imunofluorescente ligadosà enzima (ELIFA), e os semelhantes.

Ensaios de não-anticorpo imunológico da invenção tambémcompreendem Ensaios de imunogenicidade de célula T (inibidores ou estimuladores) bem como ensaios de ligação de complexo de maior histocompatibilidade (MHC).

Além disso, métodos de imageamento imunológico capazes dedetectar câncer de rim e outros cânceres expressando 161P2F10B são também fornecidos por uma invenção, incluindo, porém não limitados a métodos de imageamento radiocintigráfico usando anticorpos rotulados 161P2F10B.

Tais ensaios são clinicamente úteis na detecção, monitoração, e prognósticode 161P2F10B expressando cânceres tal como câncer de rim.

Anticorpos de 161P2F10B são também usados em métodos para purificar uma proteína relacionada com 161P2F10B e para isolar homólogos de 161P2F10B e moléculas relacionadas. Por exemplo, um método depurificar uma proteína relacionada com a 161P2F10B compreende incubarum anticorpo de 161P2F10B, que foi acoplado a uma matriz sólida, com umlisado ou outra solução contendo uma proteína relacionada com 161P2F10Bsob condições que permitem o anticorpo de 161P2F10B ligar-se à proteínarelacionada com 161P2F10B; lavar a matriz sólida para eliminar impurezas;e eluir a proteína relacionada com 161P2F10B do anticorpo acoplado. Ou-tros usos de anticorpos de 161P2F10B de acordo com a invenção incluemgerar anticorpos antiidiotípicos que imitam uma proteína 161P2F10B.

Vários métodos para a preparação de anticorpos são bem co-nhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser preparados imuni-zando-se um hospedeiro mamífero adequado empregando-se uma proteínarelacionada com a 161P2F10B, peptídeo, ou fragmento, em forma isolada ouimunoconjugada (Anticorpos: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Har-low, e Lane (1988); Harlow, Anticorpos, Cold Spring Harbor Press, NY(1989)). Além disso, as proteínas de fusão de 161P2F10B podem tambémser usadas, tal como a proteína de fusão de GST de 161P2F10B. Em umamodalidade particular, uma proteína de fusão de GST compreendendo todaou a maior parte da seqüência de aminoácido de Figura 1 é produzida, emseguida usada como um imunógeno para gerar anticorpos apropriados. Emoutra modalidade, uma proteína relacionada com a 161P2F10B é sintetizadae usada como um imunógeno.

Além disso, técnicas de imunização de DNA nu conhecidas natécnica são usadas (com ou sem proteína purificada relacionada com161P2F10B ou células expressando 161P2F10B) para gerar uma respostaimune ao imunógeno codificado (para revisão/veja Donnelly e outro, 1997,Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).

A seqüência de aminoácido de uma proteína 161P2F10B comomostrado na Figura 1 pode ser analisada para selecionar regiões específicasda proteína 161P2F10B para gerar anticorpos. Por exemplo, análises de hi-drofobicidade e hidrofilicidade de uma seqüência de aminoácido de161P2F10B são usadas para identificar regiões hidrofílicas na estrutura de161P2F10B. Regiões de uma proteína 161P2F10B que mostram estruturaimunogenica, bem como outras regiões e domínios, podem facilmente seridentificadas empregando vários outros métodos conhecidos na técnica, talcomo análise Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte- Doolittle, Eisenberg,Karplus-Schultz ou Jameson- Wolf. Os perfis de hidrofilicidade podem sergerados empregando-se o método de Hopp, T.P. e Woods, K.R., 1981, Proc.Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824-3828. Hidropathicity profiles can be genera-ted using the método de Kyte, J. e Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol.157:105-132. Percent (%) Accessible Residues profiles can be generatedusing the método de Janin J., 1979, Nature 277:491-492. Average Flexibilityprofiles can be generated using the método de Bhaskaran R„ PonnuswamyP.K., 1988, Int. J. Pept. proteína Res. 32:242-255. Beta-turn profiles can begenerated using the método de Deleage, G., Roux B., 1987, proteína Engi-neering 1:289-294. Desse modo, cada região identificada por qualquer des-tes programas ou métodos inclui-se no escopo da presente invenção. Osmétodos preferidos para a geração de anticorpos 161P2F10B são tambémilustrados por meio dos exemplos fornecidos aqui. Métodos para prepararuma proteína ou polipeptídeo para uso como um imunógeno são bem co-nhecidos na técnica. Também bem conhecidos na técnica são métodos parapreparar conjugados imunogênicos de uma proteína com um veículo, tal co-mo BSA, KXH ou outra proteína veículo. Em algumas circunstâncias, conju-gação direta empregando, por exemplo, reagentes de carbodiimida são usa-dos; em outros casos reagentes de ligação tal como aqueles fornecidos porPierce Chemical Co., Rockford, IL, são eficazes. A administração de um i-munógeno 161P2F10B é freqüentemente conduzida por injeção durante umperíodo de tempo adequado e com uso de um adjuvante adequado, como éentendido na técnica. Durante à escala de imunização, títulos de anticorpospodem ser tirados para determinar a adequação de formação de anticorpo.

Os anticorpos monoclonais de 161P2F10B podem ser produzi-dos por vários métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, linhagensde célula imortalizadas que secretam um anticorpo monoclonal desejado sãopreparadas usando tecnologia de hibridoma padrão de Kohler e Milstein oumodificações que imortalizam as células B produtoras de anticorpo, como éde modo geral conhecido. As linhagens de celulares imortalizadas que se-cretam os anticorpos desejados são analisados por imunoensaio em que oantígeno é uma proteína relacionada com 161P2F10B. Quando a cultura decélula imortalizada apropriada é identificada, as células podem ser expandi-das e os anticorpos produzidos de culturas in vitro ou de fluído de ascites.

Os anticorpos ou fragmentos da invenção podem também serproduzidos, por métodos recombinantes. As regiões que ligam-se especificamente às regiões desejadas de uma proteína 161P2F10B podem também ser produzidas no contexto de anticorpos enxertados de região de determinação de complementaridade (CDR) ou quimérica de origem de múltiplasespécies. Anticorpos humanizados ou humanos de 161P2F10B podem também ser produzidos, e são preferidos para uso em contextos terapêuticos.

Métodos para humanizar anticorpos de murino e outros não-humanos, substituindo uma ou mais das CDRs de anticorpo não-humano para seqüências de anticorpo humano correspondente, são bem conhecidos (Veja, por exemplo, Jones e outro, 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann e outro, 1988,Nature 332: 323-327; Verhoeyen e outro, 1988, Science 239: 1534-1536).Veja, além disso, Carter e outro, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285 eSims e outro, 1993, J. Immunol. 151: 2296.

Métodos para produzir anticorpos monoclonais totalmente humanos incluem métodos de exibição de fago e métodos transgênicos (para revisão, veja Vaughan e outro, 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539).Anticorpos monoclonais de 161P2F10B totalmente humanos podem ser gerados empregando-se tecnologias de clonagem empregandose bibliotecas combinatoriais de gene Ig humano grande (isto é, exibição e fago) (Griffiths eHoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibody from fagedisplay libraries. In: proteína Engineering de Antibody moléculas for Prophylactic e Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed)., Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton e Barbas, Human Antibody from combinatorial libraries. Id., pp 65-82). Os anticorpos monoclonais de 161P2F10B totalmente humanos podem também ser produzidos empregando-se camundon-gos transgênicos construídos para conter locos de gene de imunoglobulinahumana descritos no Pedido de Patente PCT W098/24893, Kucherlapati eJakobovits e outro, publicado em 3 de dezembro de 1997 (veja, além disso,Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; Patentes dos Estados Unidos n- 6.162.963 emitida em 19 de dezembro de 2000; 6.150.584emitida em 12 de novembro de 2000; e, 6.114.598 emitida em 5 de setembrode 2000). Este método evita a manipulação in vitro requerida com tecnologiade exibição de fago e eficientemente produz anticorpos humanos autênticosde afinidade elevada.

A reatividade de anticorpos de 161P2F10B com uma proteínarelacionada com a 161P2F10B pode ser estabelecida por diversos métodosbem conhecidos, incluindo Western blotting, imunoprecipitação, ELISA, eanálises FACS usando, como apropriado, proteínas relacionadas com161P2F10B, células expressando 161P2F10B ou extratos destas. Um anti-corpo de 161P2F10B ou fragmento deste pode ser rotulado com um marcador detectável ou conjugado a uma segunda molécula. Os marcadores detectáveis adequados incluem, porém não estão limitados a, um radioisótopo,um composto fluorescente, um composto bioluminescente, composto quimioluminescente, um quelante de metal ou uma enzima.

Além disso, anticorpos biespecíficos para dois ou mais epítopos de 161P2F10B são gerados empregando-se métodos geralmente conhecidos na técnica. Anticorpos homodiméricos podem também ser gerados por técnicas de reticulação conhecidas na técnica (por exemplo, Wolff e outro, Câncer Res. 53: 2560-2565).

Em uma modalidade, a invenção prove anticorpos monoclonais identificados como Ha16-1 (3,5)18, Ha16-1 (1)11, 1-116-1,93, H16-9,69 foramenviados (via Expressa Federal) para a American Type Culture Collection(ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 em 28 de março de 2006 edesignados números de Acessão PTA- __e PTA-_ e PTA-_e PTA-_respectivamente.

V). Respostas Imunes Celulares de 161P2F10B

O mecanismo pelo qual as células T reconhecem antígenos foidelineado. Composições de vacina de epítopo de peptídeo eficazes da invenção induzem uma resposta imune terapêutica ou profilática em segmentos muito amplos da população mundial. Para um entendimento do valor eeficácia de composições da invenção que induzem respostas imunes celulares, uma breve revisão de tecnologia relacionada com a imunologia é fornecida.Um complexo de uma molécula de HLA e um antígeno peptídicoatua como o ligando reconhecido por células T restritas ao HLA (Buus, S. eoutro, Cell 47:1071, 1986; Babbitt, B. P. e outro, Nature 317:359, 1985;Townsend, A. e Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993). Através do estudo de análogos deantígeno substituído único aminoácido e o seqüenciamento de peptídeosendogenamente ligados, naturalmente processados, resíduos críticos quecorrespondem aos motivos requeridos para ligação específica às moléculasde antígeno de HLA foram identificados e são mencionados na Tabela IV(veja, além disso, por exemplo, Southwood, e outro, J. Immunol. 160:3363,1998; Rammensee, e outro, Imunogenetics 41:178, 1995; Rammensee eoutro, SYFPEITHI, acesso por meio da World Wide Web em URL(134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm); Sette, A. e Sidney, J. Curr.Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. e Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F.e Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppert e outro, Cell 74:929-937, 1993;Kondo e outro, J. Immunol. 155:4307-4312, 1995; Sidney e outro, J. Immu-nol. 157:3480-3490, 1996; Sidney e outro, Human Immunol. 45:79-93, 1996;Sette, A. e Sidney, J. Imunogenetics 1999 Nov; 50(3-4):201-12, Review).

Além disso, análises cristalográficas de raio x de complexos deHLA-peptídeo têm revelado bolsas dentro da fenda de ligação de peptídeo/ranhura de moléculas de HLA que acomodam, em um modo específico de alelo, resíduos transportados por ligandos de peptídeo; estes resíduospor sua vez determinai a capacidade de ligação de HLA dos peptídeos emque eles estão presente. (Veja, por exemplo, Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol. 13:587, 1995; Smith, e outro, Immunity 4:203, 1996; Fremont e outro,Immunity 8:305, 1998; Stern e outro, Structure 2:245, 1994; Jones, E. Y.Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J. H. e outro, Nature 364:33, 1993;Guo, H. C. e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:8053, 1993; Guo, H. C. eoutro, Nature 360:364, 1992; Silver, M. L. e outro, Nature 360:367, 1992;Matsumura, M. e outro, Science 257:927, 1992; Madden e outro, Cell70:1035, 1992; Fremont, D. H. e outro, Science 257:919, 1992; Saper, M. A.,Bjorkman, P. J. e Wiley, D. C, J. Mol. Biol. 219:277, 1991).

Conseqüentemente, a definição de motivos de ligação de HLAespecíficos de alelo classe I e classe II, supermotivos de classe I ou classe IIpermitem a identificação de regiões dentro de uma proteína, que estão cor-relacionadas com a ligação ao(s) antígeno(s) de HLA particulares.

Desse modo, por um processo de identificação de motif de HLA,candidatos para vacinas com base em epítopo foram identificados; tais candidatos podem ser avaliados por ensaios de ligação de peptídeo de HLA para determinar a afinidade de ligação e/ou o período de tempo de associaçãodo epítopo e sua molécula de HLA correspondente. Trabalho confirmatorioadicional pode ser realizado para selecionar, entre estes candidatos de vacina, epítopos com características preferidas em termos de cobertura de população e/ou imunogenicidade.

Vários estratégias podem ser utilizadas para avaliar a imunogenicidde celular, incluindo:

1) Triagem de culturas de célula T primárias de indivíduos normais (veja, por exemplo, Wentworth, P. A. e outro, Mol. Immunol. 32:603,1995; Celis, E. e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:2105, 1994; Tsai, V. eoutro, J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. e outro, Human immunol.59:1, 1998). Este procedimento envolve a estimulação de linfócitos de sangue periférico (PBL) de indivíduos normais com um peptídeo teste na presença de células apresentando antígeno in vitro durante um período de diversas semanas. As células T específicas para o peptídeo tornam-se ativadas durante este tempo e são detectadas usando, por exemplo, um ensaio de liberação de linfocina ou 51 Cr envolvente células alvo sensibilizadas de peptídeo.

2) Imunização de camundongos transgênicos de HLA (veja, porexemplo, Wentworth, P. A. e outro, J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P.A. e outro, Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. e outro, J. Immunol. 159:4753, 1997). Por exemplo, em tais métodos os peptídeos em adjuvantede Freud incompleto são administrados subcutaneamente aos camundongostransgênicos de HLA. Diversas semanas seguindo a imunização, esplenóci-tos são removidos e cultivados in vitro na presença de peptídeo de teste para aproximadamente uma semana. Células T específicas de peptídeo sãodetectadas empregando-se, por exemplo, um ensaio de liberação de 51 Crenvolvendo células alvo sensibilizadas por peptídeo e células alvo expressando antígeno endogenamente gerado.

3) Demonstração de respostas de célula T de recordação deindivíduos imunes que foram ou eficazmente vacinados e/ou de pacientescronicamente enfermos (veja, por exemplo, Rehermann, B. e outro, J. Exp.Med. 181:1047, 1995; Doolan, D. L. e outro, Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R.e outro, J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S. C. e outro, J. Immunol.159:1648, 1997; Diepolder, H. M. e outro, J. Virol. 71:6011, 1997). Conseqüentemente, respostas de recordaão são detectadas cultivando-se PBL deindivíduos que foram expostos ao antígeno, devido à doença e, desse modo,geraram uma resposta imune "naturalmente", ou de pacientes que foramvacinados contra o antígeno. PBL de indivíduos são cultivados in vitro durante 1 a 2 semanas na presença de peptídeo teste mais células apresentandoantígeno (APC) para permitir a ativação de células T de "memória", comocomparado às células T "naive". Ao final do período de cultura, a atividadede célula T é detectada usando ensaios incluindo alvos sensibilizados porpeptídeo envolvendo a liberação de 51 Cr, proliferação de célula T, ou liberação de linfocina.

VI). Animais Transgênicos de 161P2F10B

Ácidos nucléicos que codificam uma proteína relacionada com a161P2F10B podem também ser usados para gerar animais transgênicos ouanimais "nocaute" que, por sua vez, são úteis no desenvolvimento e triagemde reagentes terapeuticamente úteis. De acordo com técnicas estabelecidas,cDNA codificando 161P2F10B pode ser usado para clonar DNA genômicoque codifica 161P2F10B. Seqüências genômicas clonadas podem então serusados para gerar animais transgênicos contendo células que expressam DNA que codifica 161P2F10B. Métodos para gerar animais transgênicos,particularmente animais tais como camundongos ou ratos, tornaram-se convencionais na técnica e são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Esta-dos Unidos n- 4.736.866 emitida em 12 de abril de 1988, e 4.870.009 emitida em 26 de setembro de 1989. Tipicamente, células particulares seriamalvejadas por incorporação de transgene de 161P2F10B com realçadoresespecíficos do tecido.

Animais transgênicos que incluem uma cópia de uma161P2F10B codificando transgene podem ser usados para examinar o efeitode expressão aumentada de DNA que codifica 161P2F10B. Tais animaispodem ser usados como animais de teste para reagentes supostos conferirem proteção de, por exemplo, condições patológicas associadas com sua superexpressão. De acordo com este aspecto da invenção, um animal é tratado com um reagente e uma incidência reduzida de uma condição patológica, comparado aos animais não-tratados que transportam o transgene, indicaria uma intervenção terapêutica potencial para a condição patológica.

Alternativamente, homólogos não-humanos de 161P2F10B podem ser usasdos para construir um animal "nocaute" de 161P2F10B quetem um gene defectivo ou alterado codificando 161P2F10B como um resultado de recombinação homóloga entre o gene endógeno codificando 161P2F10B e DNA genômico alterado codificando 161P2F10B introduzidaem uma célula embriônica do animal. Por exemplo, o cDNA que codifica 161P2F10B pode ser usado para clonar DNA genômico DNA codificando161P2F10B de acordo com técnicas estabelecidas. Uma porção do DNAgenômico codificando 161P2F10B pode serdeletada ou substituída com outro gene, tal como um gene codificando um marcador selecionável que pode ser usado para monitorar a integração. Tipicamente, diversas quilobases de DNA de flanqueamento inalterado (ambos nas extremidades 5' e 3') são incluídos no vetor (veja, por exemplo, Thomas e Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para uma descrição de vetores de recombinação homólogos). O vetor é introduzido em uma linhagem de célula tronco embriônica (por exemplo, poreletroporação) e células em que o DNA introduzido foi homologamente recombinado com o DNA endógeno são selecionadas (veja, por exemplo, Li eoutro, Cell, 69:915 (1992)). As células selecionadas são então injetadas emum blastocisto de um animal (por exemplo, um camundongo ou rato) paraformar quimeras de agregação (veja, por exemplo, Bradley, in Teratocarcinomas e Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed.(IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). Um embrião quimérico pode então serimplantado em um animal de criação fêmea pseudográvido adequado, e oembrião levado a termo para criar um animal "nocaute". A progênio alojandoo DNA homologamente recombinado em suas células germinativas pode seridentificado por técnicas padrão e usado para reproduzir animais em quetodas as células do animal contêm o DNA homologamente recombinado.Animais nocaute podem ser caracterizados, por exemplo, quanto a sua capacidade de defender-se contra certas condições patológicas ou quanto aseu desenvolvimento de condições patológicas devido à ausência de umpolipeptídeo de 161P2F10B.VII). Métodos para a Detecção de 161P2F10B

Outro aspecto da presente invenção refere-se a métodos paradetectar polinucleotídeos de 161P2F10B e proteínas relacionadas com161P2F10B, bem como métodos para identificar uma célula que expressa161P2F10B. O perfil de expressão de 161P2F10B torna-o um marcador di-agnóstico para doença metastatizada. Conseqüentemente, o estado de produtos de gene de 161P2F10B fornece informação útil para predizer uma variedade de fatores incluindo suscetibilidade à doença em estágio avançado,taxa de progressão, e/ou agressividade de tumor. Como descrito em detalhes aqui, o estado de produtos de gene de 161P2F10B em amostras depaciente pode ser analisado por uma variedade de protocolos que são bemconhecidos na técnica incluindo análise de imuno-histoquímica, a variedade de técnicas de Manchamento do Norte incluindo hibridização in situ, análisede RT-PCR (por exemplo em amostras micro-dissecadas de captura a leiser), análise de Western blot e análise de disposição de tecido.

Mais particularmente, a invenção fornece ensaios para a detecção de polinucleotídeos 161P2F10B em uma amostra biológica, tal como soro, osso, próstata, e outros tecidos, urina, sêmen, preparações celulares, eos semelhantes. Detectable 161P2F10B polinucleotídeos include, por exemplo, a gene 161P2F10B ou fragmento do mesmo, mRNA de 161P2F10B,variante de mRNA de 161P2F10B de união alternativa, e moléculas de DNAou RNA recombinante que contêm um polinucleotídeo de 161P2F10B. Di-versos métodos para amplificar e/ou detectar a presença de polinucleotídeosde 161P2F10B são bem conhecidos na técnica e podem ser empregados naprática deste aspecto da invenção.

Em uma modalidade, o método para detectar um mRNA161P2F10B em uma amostra biológica compreende produzir cDNA da amostra por transcrição reversa usando pelo menos um iniciador; amplificando o cDNA desse modo produzido empregando-se um polinucleotídeo de 161P2F10B como iniciadores de sentido e anti-sentido para amplificar cD-NAs de 161P2F10B inclusos; e detectar a presença do cDNA 161P2F10Bamplificado. Opcionalmente, a seqüência do cDNA de 161P2F10B amplificada pode ser determinada.

Em outra modalidade, um método de detectar um gene de 161P2F10B em uma amostra biológica compreende primeiro isolar o DNAgenômico da amostra; amplificando o DNA genômico isolado usando polinucleotídeos de 161P2F10B como iniciadores de sentido e anti-sentido; e detectar a presença do gene 161P2F10B amplificado. Qualquer número decombinações de sonda de sentido e anti-sentido pode ser designado de umaseqüência de nucleotido de 161P2F10B (veja, por exemplo, Figura 1) e empregado para este propósito.

A invenção também fornece ensaios para detectar a presençade uma proteína 161P2F10B em um tecido ou outra amostra biológica talcomo sero, sêmen, osso, próstata, urina, preparações celulares, e similares.

Métodos para detectar uma proteína relacionada com a 161P2F10B sãotambém bem conhecidos e incluem, por exemplo, imunoprecipitação, análiseimuno-histoquímica, análise de Western blot, ensaios de ligação molecular,ELISA, ELIFA e similares. Por exemplo, um método de detectar a presençade uma proteína relacionada com a 161P2F10B em uma amostra biológica compreende primeiro contatar uma amostra com um anticorpo de161P2F10B, um fragmento reativo de 161P2F10B, ou uma proteína recombinante contendo uma região de ligação de antígeno de um anticorpo de161P2F10B; e em seguida detectando uma ligação de proteína relacionadacom 161P2F10B na amostra.

Métodos para identificar uma célula que expressa expressa161P2F10B incluem-se também no escopo da invenção. Em uma modalidade, um ensaio para identificar uma célula que expressa um gene 161P2F10B compreende detectar a presença de mRNA de 161P2F10B na célula. Métodos para a detecção de mRNAs particulares em células são bem conhecidose incluem, por exemplo, ensaios de hibridização usando sondas de DNAcomplementares (tais como hibridização in situ usando ribossondas de 161P2F10B rotuladas, Mancha do Norte e técnicas relacionadas) e váriosensaios de amplificação de ácido nucléico (tal como RT-PCR usando iniciadores complementares específicos para 161P2F10B, e outro método de detecção do tipo amplificação, tal como, por exemplo, DNA ramificado, SISBA,TMA e similares). Alternativamente, um ensaio para identificar uma célula que expressa um gene 161P2F10B compreende detectar a presença de proteína relacionada com 161P2F10B na célula ou secretada pela célula. Váriosmétodos para a detecção de proteínas são bem conhecidos na técnica e sãoempregados para a detecção de proteínas relacionadas com 161P2F10B ecélulas que expressam proteínas relacionadas com 161P2F10B.

Análise de expressão de 161P2F10B é também útil como umaferramenta para identificar e avaliar agentes que modulam a expressão degene de 161P2F10B. Por exemplo, a expressão de 161P2F10B é significantemente super-regulada em câncer de rim, e é expressa em cânceres dostecidos listados na Tabela I. A identificação de uma molécula ou agente biológico que inibe a expressão ou superexpressão de 161P2F10B em células de câncer é de valor terapêutico. Por exemplo, um tal agente pode ser identificado empregando-se uma triagem que quantifica a expressão de161P2F10B RT-PCR, hibridização de ácido nucléico ou ligação de anticorpo.VIII). Métodos para Monitorar o Estado de Genes Relacionados com161P2F10B e Seus Produtos.

A oncogênese é conhecida ser um processo de múltiplas etapasonde o crescimento celular torna-se progressivamente desregulado e as cé-lulas progridem de um estado fisiológico normal para pré-canceroso, e emseguida o canceroso começa (veja, por exemplo, Alers e outro, Lab Invest.77(5): 437-438 (1997) e Isaacs e outro, Câncer Surv. 23: 19-32 (1995)). Neste contexto, o exame de uma amostra biológica quanto à evidência de crescimento celular desregulado (tal como expressão de 161P2F10B aberranteem cânceres) prove a detecção precoce de tal fisiologia aberrante, antges deum estado patológico tal como o câncer ter progredido para um estágio emque as opções terapêuticas são mais limitadas ee/ou o prognóstico é pior.Em tais exames, o estado de 161P2F10B em uma amostra biológica de interesse pode ser comparado, por exemplo, ao estado de 161P2F10B em umaamostra normal correspondente (por exemplo, uma amostra daquele indivíduo ou alternativamente outro indivíduo que não está afetado por uma patologia). Uma alteração no estado de 161P2F10B na amostra biológica (quando comparado à amostra normal) fornece evidência de crescimento celular desregulado. Além de usar uma amostra biológica que não está afetada poruma patologia como uma amostra normal, alguém pode também usar umvalor normativo predeterminado tal como um nível normal predeterminado deexpressão de mRNA (veja, por exemplo, Grever e outro, J. Comp. Neurol.1996 Dec 9; 376(2): 306-14 e Patente dos Estados Unidos ne 5.837.501)para comparar o estado de 161P2F10B em uma amostra.

O termo "estado" neste contexto é usado de acordo com seusignificado aceito na técnica e refere-se à condição ou estado de um gene eseus produtos. Tipicamente, técnicos versados empregam diversos parâmetros para avaliar a condição ou estado de um gene e seus produtos. Estes incluem, porém não estão limitados à localização de produtos de gene expressos (incluindo a localização de células expressando 161P2F10B) bemcomo o nível, e atividade biológica de produtos de gene expressos (tais como mRNA de 161P2F10B, polinucleotídeos e polipeptídeos). Tipicamente,uma alteração no estado de 161P2F10B compreende uma mudança na localização de 161P2F10B e/ou células expressando 161P2F10B e/ou um aumento em mRNA de 161P2F10B e/ou expressão de proteína.

O estado de 161P2F10B em uma amostra pode ser analisadopor diversos métodos bem conhecidos na técnica, incluindo sem limitação,análise imuno-histoquímica, hibridização in situ, análise de RT-PCR em amostras micro-dissecadas por captura a leiser, análise de Western blot, eanálise de disposição de tecido. Os protocolos típicos para avaliar o estadode um gene de 161P2F10B e produtos de gene são encontrados, por exemplo, em Ausubel e outro eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology,Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Imunoblotting) e 18 (PCR Analysis). Desse modo, o estado de 161P2F10B em uma amostra biológica é avaliado por vários métodos utilizados por técnicos versados incluindo, porém não limitados à análise do Sul genômica (para examinar, por exemplo, perturbações em um gene de 161P2F10B), análise do Norte e/ou análise de PCR de mRNA de 161P2F10B (para examinar, por exemplo, alterações nas seqüências de polinucleotídeo ou níveis de expressão de mR-NAs 161P2F10B), e, análise do Oeste e/ou imuno-histoquímica (para examinar, por exemplo, alterações em seqüências de polipeptídeo, alterações emlocalização de polipeptídeo dentro de uma amostra, alterações em níveis deexpressão de proteínas 161P2F10B e/ou associações de proteínas161P2F10B com parceiros de ligação de polipeptídeo). Os polinucleotídeosde 161P2F10B detectáveis incluem, por exemplo, um gene de 161P2F10B ou fragmento deste, mRNA de 161P2F10B, variantes de união alternativa,mRNAs de 161P2F10B, e moléculas de DNA ou RNA recombinantes contendo um polinucleotídeo 161P2F10B.

O perfil de expressão de 161P2F10B torna-o um marcador diagnóstico para doença local e/ou metastatizada, e fornece informação sobre o crescimento ou potencial oncogênico de uma amostra biológica. Em particular, o estado de 161P2F10B fornece informação útil para predizer suscetibilidade a estágios de doença particular, progressão, e/ou agressividade detumor. A invenção fornece métodos e ensaios para determinar o estado de161P2F10B e diagnosticar cânceres que expressam 161P2F10B, tal comocânceres dos tecidos listados na Tabela I. Por exemplo, por que o mRNA de161P2F10B é tão altamente expresso em câncer de rim e outros câncerescom relação a tecido de rim normal, ensaios que avaliam os níveis de trans-crições de mRNA de 161P2F10B ou proteínas em uma amostra biológicapodem ser usados para diagnosticar uma doença associada com a desregulação de 161P2F10B, e podem fornecer informação prognostica útil na definição de opções terapêuticas apropriadas.

O estado de expressão de 161P2F10B fornece informação incluindo a presença, estágio e localização de células displásicas, pré-cancerosas e cancerosas, predizendo suscetibilidade a vários estágios dedoença, e/ou para estimar a agressividade do tumor. Além disso, o perfil daexpressão torna-a útil como um reagente de imageamento para doença metastatizada. Conseqüentemente, um aspecto da invenção é direcionado a vários métodos de prognóstico e diagnóstico molecular para examinar o estado de 161P2F10B ém amostras biológicas tal como aquelas de indivíduossofrendo de, ou suspeitos de sofrer de uma patologia caracterizada porcrescimento celular desregulado, tal como câncer.

Como acima descrito, o estado de 161P2F10B em uma amostrabiológica pode ser examinado por diversos procedimentos bem conhecidosna técnica. Por exemplo, o estado de 161P2F10B em uma amostra biológicatirada de uma localização específica no corpo pode ser examinado avaliando-se a amostra quanto à presença ou ausência de células expresando 161P2F10B (por exemplo, aquelas que expressam mRNAs de 161P2F10Bou proteínas). Este exame pode fornecer evidência de crescimento celulardesregulado, por exemplo, quando células expressando 161P2F10B sãoencontradas em uma amostra biológica que normalmente não contém taiscélulas (tais como linfonodos), por que tais alterações no estado de161P2F10B em uma amostra biológica são freqüentemente associadas comcrescimento celular desregulado. Especificamente, um indicador de crescimento celular desregulado é a metástase de células de câncer de um órgãode origem (tal como a próstata) para uma área diferente do corpo (tal comoum linfonodo). Neste contexto, evidência de crescimento celular desreguladoé importante, por exemplo, por que metástases de linfonodo ocultas podemser detectadas em uma proporção substancial de pacientes com câncer depróstata, e tais metástases são associadas com preditores conhecidos deprogressão de doença (Veja, por exemplo, Murphy e outro, Prostate 42(4):315-317 (2000); Su e outro, Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) e Freeman e outro, J Urol 1995 Aug 154(2 Pt l):474-8).

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para monitorarprodutos de gene de 161P2F10B determinando o estado de produtos de gene de 161P2F10B expressos por células de um indivíduo suspeito de ter uma doença associada com crescimento celular desregulado (tal como hiperplasia ou câncer) e em seguida comparando o estado desse modo determinado ao estado dos produtos de gene de 161P2F10B em uma amostra normal correspondente. A presença de produtos de gene de 161P2F10Baberrante na amostra de teste com relação à amostra normal fornece umaindicação da presença de crescimento celular desregulado dentro das células do indivíduo.

Em outro aspecto, a invenção fornece ensaios úteis na determinação da presença de câncer em um indivíduo, compreendendo detectar um aumento significante em mRNA de 161P2F10B ou expressão de proteínaem uma célula de teste ou amostra de tecido com relação aos níveis de expressão na célula ou tecido normal correspondente. A presença de mRNA de 161P2F10B pode, por exemplo, ser avaliada em tecidos incluindo porém não limitados àqueles listados na Tabela I. A presença de significante expressão de 161P2F10B em qualquer destes tecidos é útil para indicar a emergência, presença e/ou severidade de um câncer, visto que os tecidosnormais correspondentes não expressam o mRNA de 161P2F10B ou o expressam em níveis menores.

Em uma modalidade relacionada, o estado de 161P2F10B é determinado no nível de proteína em vez de no nível de ácido nucléico. Por exemplo, um tal método compreende determinar o nível de proteína161P2F10B expressa por células em uma amostra de tecido de teste e comparando-se o nível desse modo determinado ao nível de 161P2F10B expresso em uma amostra normal correspondente. Em uma modalidade, apresença de proteína 161P2F10B é avaliada, por exemplo, empregando-semétodos imunoistoquímico. Anticorpos de 161P2F10B ou parceiros de liga-ção capazes de detectar a expressão de proteína 161P2F10B são usadosem uma variedade de formatos de ensaio bem conhecidos na técnica paraeste propósito.

Em uma outra modalidade, alguém pode avaliar o estado de seqüências de nucleotido e aminoácido de 161P2F10B em uma amostra biológica a fim de identificar perturbações na estrutura destas moléculas. Estasperturbaçõs podem incluir inserções, deleções, substituições e os semelhantes. Tais triagens são úteis por que perturbações nas seqüências de nucleotido e aminoácido são observadas em um grande número de proteínas associadas com um fenótipio desregulado (Veja, por exemplo, Marrogi e outro,1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378). Por exemplo, uma mutação na seqüência de 161P2F10B pode ser indicativa da presença ou promoção de um tumor. Tais ensaios, portanto, têm valor diagnóstico e preditivo, onde umamutação em 161P2F10B indica uma perda potencial de função ou aumento em crescimento de tumor.

Uma ampla variedade de ensaios para observar perturbaçõesem seqüências de nucleotido e aminoácido é bem conhecida na técnica. Porexemplo, o tamanho e estrutura de seqüências de ácido nucléico ou amino-ácido de produtos de gene de 161P2F10B são observados pelos protocolos de seqüenciamento do Norte, Sul, Oeste, PCR e DNA descritos aqui. Alémdisso, outros métodos para observar perturbações em seqüências de nucleotido e aminoácido tal como análise de polimorfismo de conformação de filamento único são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patentedos Estados Unidos n— 5.382.510 emitida em 7 de setembro de 1999, e 5.952.170 emitida em 17 de janeiro de 1995).

Adicionalmente, alguém pode examinar o estado de metilaçãode um gene 161P2F10B em uma amostra biológica. Desmetilação aberrantee/ou hipermetilaçao de ilhas de CpG em regiões reguladoras 5' de gene freqüentemente ocorre em células imortalizadas e transformadas, e pode resultar em expressão alterada de vários genes. Por exemplo, hipermetilaçao depromoter da glutationa S-transferase classe-pi (uma proteína expressa empróstata normal porém não expressa em >90% de carcinomas de próstata)parece permanentemente silenciar a transcrição destes gene e é a alteraçãogenômica mais freqüentemente detectada em carcinomas de próstata (DeMarzo e outro, Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Além disso, estaalteração está presente em pelo menos 70% de casos de neoplasia intra-epitelial prostática de grau elevado (PIN) (Brooks e outro, Câncer Epidemiol.

Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). Em outro exemplo, a expressão do gene específico de tumor LAGE-I (que não é expresso em próstata normal, porém é expresso em 25 a 50% de cânceres de próstata) é induzida por de-óxi-azacitidina em células linfoblastóides, sugerindo que a expressão tumoralé devido à desmetilação (Lethe e outro, Int. J. Câncer 76(6): 903-908(1998)). Uma variedade de ensaios para examinar o estado de metilação deum gene é bem conhecida na técnica. Por exemplo, alguém pode utilizar, emmétodos de hibridização do Sul, enzimas de restrição sensíveis à metilaçãoque não podem clivar seqüências que contêm sítios CpG metilados para avaliar o estado de metilação de ilhas de CpG. Além disso, MSP (PCR específico de metilação) pode rapidamente traçar o perfil do estado de metilaçãode todos os sítios de CpG presentes em uma ilha de CpG de um determinado gene. Este procedimento envolve modificação inicial de DNA por bissulfito de sódio (que converterá todas as citosinas não metiladas em uracila) seguido por amplificação usando iniciadores específicos para DNA metiladoversus não metilado. Protocolos envolvendo interferência de metilação podem também ser encontrados, por exemplo, em Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel e outro, eds., 1995.

: A amplificação de gene é um método adicional para avaliar oestado de 161P2F10B. A amplificação de gene é medida em uma amostradiretamente, por exemplo, por manchamento do Sul ou manchamento doNorte para quantificar a transcrição de mRNA (Thomas, 1980, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 77:5201 5205), manchamento de ponto (análise de DNA),ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente rotulada, combase nas seqüências fornecidas aqui. Alternativamente, são empregadosanticorpos que reconhecem duplexes específicos, incluindo duplexes deDNA, duplexes de RNA, e duplexes híbridos de DNA RNA ou duplexes deproteína de DNA. Os anticorpos por sua vez são rotulados e o ensaio realizado onde o dúplex é ligado a uma superfície, de modo que na formação de dúplex sobra a superfície, a presença de anticorpo ligado ao dúplex pode ser detectada.

O tecido biopsiado ou sangue pode ser convenientemente ensaiado quanto à presença de células de câncer empregando, por exemplo, análise de Mancha do Norte, por ponto, ou RT-PCR para detectar a expressão de 161P2F10B. A presença de mRNA de 161P2F10B amplificável por RT-PCR, fornece uma indicação da presença de câncer. Os ensaios de RT-PCR são bem conhecidos na técnica. Os ensaios de detecção por RT-PCRpara células de tumor em sangue periférico estão atualmente sendo avaliadas para uso no diagnóstico e controle de diversos tumores sólidos humanos. No campo de câncer de próstata, estes incluem ensaios de RT- PCRpara a detecção de células expressando PSA e PSM (Verkaik e outro, 1997, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein e outro, 1995, J. Clin. Oncol. 13:1195-2000;Heston e outro, 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688).

Um outro aspecto da invenção é uma triagem da suscetibilidadeque um indivíduo tem para desenvolver câncer. Em uma modalidade, ummétodo para predizer a suscetibilidade ao câncer compreende detectar mR-NA de 161P2F10B ou proteína 161P2F10B em uma amostra de tecido, suapresença indicando suscetibilidade ao câncer, onde o grau de expressão demRNA de 161P2F10B correlaciona-se com o grau de suscetibilidade. Emuma modalidade específica, a presença de 161P2F10B em próstata ou outrotecido é examinada, com a presença de 161P2F10B na amostra fornecendouma indicação de suscetibilidade de câncer de próstata (ou a emergência ouexistência de um tumor de próstata). Similarmente, alguém pode avaliar aintegridade de seqüências de aminoácido e nucleotido de 161P2F10B emuma amostra biológica, a fim de identificar as perturbações na estrutura destas moléculas tal como inserções, deleções, substituições e os semelhantes.

A presença de uma ou mais perturbações em produtos de gene 161P2F10Bna amostra é uma indicação de suscetibilidade ao câncer (ou a emergênciaou existência de a tumor).A invenção também compreende métodos para medir a agressividade do tumor. Em uma modalidade, um método para medir a agressividade de um tumor compreende determinar o nível de mRNA de 161P2F10B ouproteína 161P2F10B expresso por células tumor, comparando o nível desse modo determinado ao nível de mRNA de 161P2F10B ou proteína161P2F10B expressa em um tecido normal correspondente tirado do mesmoindivíduo ou uma amostra de referência de tecido normal, em que o grau deexpressão de mRNA de 161P2F10B ou proteína 161P2F10B na amostra detumor com relação à amostra normal indica o grau de agressividade.

Em uma modalidade específica, agressividade de um tumor é avaliada determinando-se a extensão na qual 161P2F10B é expressa nas células de tumor,com maiores níveis de expressão indicando tumores mais agressivos. Outramodalidade é a triagem da integridade de seqüências de aminoácido e nucleotido de 161P2F10B em uma amostra biológica, a fim de identificar perturbações na estrutura destas moléculas tal como inserções, deleções, substituições e os semelhantes. A presença de uma ou mais perturbações indicatumores mais agressivos.

Outra modalidade da invenção é direcionada a métodos paraobservar a progressão de uma malignidade em um indivíduo em tempo prolongado. Em uma modalidade, métodos para observar a progressão de uma malignidade em um indivíduo em tempo prolongado compreendem determinar o nível de mRNA de 161P2F10B ou proteína 161P2F10B expresso pelascélulas em uma amostra do tumor, comparando o nível desse modo determinado ao nível de mRNA de 161P2F10B ou proteína 161P2F10B expressa em uma amostra de tecido equivalente tirada do mesmo indivíduo em ummomento diferente, em que o grau de expressão de mRNA de 161P2F10Bou proteína 161P2F10B na amostra de tumor em tempo prolongado forneceinformação sobre a progressão do câncer. Em uma modalidade específica, aprogressão de um câncer é avaliada determinando-se a expressão de161P2F10B nas células de tumor em tempo prolongado, onde a expressãoaumentada em tempo prolongado indica uma progressão do câncer. Alémdisso, alguém pode avaliar a integridade de seqüências de aminoácido enucleotido de 161P2F10B em uma amostra biológica a fim de identificar per-turbações na estrutura destas moléculas tal como inserções, deleções, subs-tituições e os semelhantes, onde a presença de uma ou mais perturbaçõesindica uma progressão do câncer.

Os métodos diagnósticos acima podem ser combinados comqualquer um de uma variedade de protocolos prognósticos e diagnósticosconhecidos na técnica. Por exemplo, outra modalidade da invenção é dire-cionada a métodos para observar uma coincidência entre a expressão degene de 161P2F10B e produtos de gene de 161P2F10B (ou perturbaçõesem gene de 161P2F10B e gene de 161P2F10B products) e um fator queestá associado com malignidade, como um recurso para diagnosticar eprognosticar o estado de uma amostra de tecido. Uma ampla variedade defatores associados com malignidade pode ser utilizada, tal como a expres-são de genes associado com malignidade bem como observações citológi-cas gerais (Veja, por exemplo, Bocking e outro, 1984, Anal. Quant. Cytol.6(2):74- 88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson e outro, 1998,Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden e outro, 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Métodos para observar uma coincidência entre a expressão degene de 161P2F10B e produtos de gene de 161P2F10B (ou perturbaçõesem gene 161P2F10B e produtos de gene de 161P2F10B) e outro fator queestá associado com malignidade são úteis, por exemplo, por que a presençade um grupo de fatores específicos que coincidem com a doença, forneceinformação crucial para diagnosticar e prognosticar o estado de uma amos-tra de tecido.

Métodos para detectar e quantificar a expressão de mRNA de161P2F10B ou proteína são descritos aqui, e tecnologias de detecção equantificação de ácido nucléico e proteína padrão são bem conhecidos natécnica. Métodos padrão para a detecção e quantificação de mRNA de161P2F10B incluem hibridização in situ usando ribossondas de 161P2F10Brotuladas, técnicas de Mancha do Norte e relacionadas usando sondas depolinucleotídeo de 161P2F10B, análise de RT-PCR usando iniciadores es-pecíficos para 161P2F10B, e outros métodos de detecção do tipo amplifica-ção, tal como, por exemplo, DNA ramificado,SISBA, TMA e os semelhantes.Em uma modalidade específica, RT-PCR semi-quantitativo é usado paradetectar e quantificar a expressão mRNA de 161P2F10B. Qualquer númerode iniciadores capazes de amplificar 161P2F10B pode ser usado para este propósito, incluindo, porém não limitado aos vários grupos de iniciador especificamente descritos aqui. Em uma modalidade específica, anticorpos policlonais ou monoclonais especificamente reativos com a proteína 161P2F10Btipo silvestre podem ser usados em um ensaio imunoistoquímico de tecido biopsiado.

IX). Identificação de Moléculas que Interagem com 161P2F10B

As seqüências de ácido nucléico e proteína 161P2F10B descritas aqui permitem um técnico experiente identificar proteínas, pequenas moléculas e outros agentes que interagem com 161P2F10B, bem como trilhasativadas por 161P2F10B por meio de qualquer um de uma variedade de protocolos aceitos na técnica. Por exemplo, alguém pode utilizar um dos assimchamados sistemas de armadilha de interação (também referidos como o"ensaio de duplo-híbrido"). Em tais sistemas, moléculas interagem e reconstituem um fator de transcrição que direciona a expressão de um gene repórter, onde a expressão do gene repórter é ensaiado. Outros sistemas paraidentificar interações de proteína-proteína in vivo através da reconstituiçãode um ativador transcricional eucariótico, veja, por exemplo, a Patente dosEstados Unidos nQ 5.955.280 emitida em 21 de setembro de 1999, 5.925.523emitida em 20 de julho de 1999, 5.846.722 emitida em 8 de dezembro de1998 e 6.004.746 emitida em 21 de dezembro de 1999. Algoritmos são tam bém disponíveis na técnica para predições com base em genoma de função de proteína (Veja, por exemplo, Marcotte, e outro, Nature 402: 4 de novemberde 1999, 83-86).

Alternativamente alguém pode avaliar bibliotecas de peptídeopara identificar moléculas que interagem com as seqüências de proteína 161P2F10B. Em tais métodos, peptídeos que ligam-se a 161P2F10B sãoidentificados por bibliotecas de triagem que codificam uma coleção aleatóriaou controlada de aminoácidos. Peptídeos codificados pelas bibliotecas sãoexpressos como as proteínas de fusão de proteínas de revestimento de bacteriófago, as partículas de bacteriófago são então analisadas contra a(s) proteína^) 161P2F10B.

Conseqüentemente, os peptídeos tendo uma ampla variedadede usos, tal como reagentes terapêuticos, prognósticos ou diagnóstico, sãodesse modo identificados sem qualquer informação anterior sobre a estrutura do ligando esperado ou molécula receptora. As bibliotecas de peptídeotípicas e os métodos de triagem que podem ser usados para identificar moléculas que interagem com as seqüências de proteína 161P2F10B são descritos por Exemplo nas Patentes dos Estados Unidos n— 5.723.286 emitidaem 3 de março de 1998 e 5.733.731 emitida em 31 de março de 1998.

Alternativamente, as linhagens celulares que expressam161P2F10B são usadas para identificar as interações de proteína-proteínamediadas por 161P2F10B. Tais interações podem ser examinadas empregando-se técnicas de imunoprecipitação (veja, por exemplo, Hamilton BJ., eoutro Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). A proteína161P2F10B pode ser imunoprecipitada de linhagens celulares expressando161P2F10B empregando antianticorpos 161P2F10B. Alternativamente, osanticorpos contra rótulo His podem ser usados em uma linhagem celularconstruída para expressar fusões de 161P2F10B e um rótulo His (vetoresmencionados acima). O complexo imunoprecipitado pode ser examinado porassociação de proteína por procedimentos tal como western blotting, rotulagem de metionina-35S de proteínas, microseqüenciamento de proteína, manchamento de prata e eletroforese de gel bidimensional.

Pequenas moléculas e ligandos que interagem com 161P2F10Bpodem ser identificadas através de modalidades relacionadas de tais ensaios de triagem. Por exemplo, pequenas moléculas podem ser identificadasque interferem com a função da proteína, incluindo moléculas que interferemcom a capacidade da 161P2F10B para mediar a fosforilação e desfosforilação, interação com moléculas de DNA ou RNA como uma indicação de regulação de ciclos celulares, segundo sinalização de mensageiro ou tumorigênese. Similarmente, pequenas moléculas que modulam o canal de íon rela-cionado com 161P2F10B, bomba de proteína, ou funções de comunicaçãocelular são identificados e usados para tratar pacientes que têm um câncerque expressa 161P2F10B (Veja, por exemplo, Hille, B., lonic Channels deExcitable Membranes, 2- Ed., Sinauer Assoc, Sunderland, MA, 1992). Alémdisso, ligandos que regulam a função de 161P2F10B podem ser identifica-dos com base em sua capacidade de ligar-se a 161P2F10B e ativar umconstructo repórter. Métodos típicos são descritos por exemplo, na Patentedos Estados Unidos nQ 5.928.868 emitida em 27 de julho de 1999, e incluemmétodos para formar ligandos híbridos em que pelo menos um ligando éuma molécula pequena. Em uma modalidade ilustrativa, células construídaspara expressar uma proteína de fusão 161P2F10B e uma proteína de liga-ção de DNA são usadas para co-expressar uma proteína de fusão de umligando híbrido/molécula pequena e uma proteína ativadora transcricional debiblioteca de cDNA. As células também contêm um gene repórter, a expres-são do qual está condicionada na proximidade da primeira e segunda proteí-nas de fusão entre si, um evento que ocorre apenas se o ligando híbrido li-ga-se aos sítios alvo sobre ambas as proteínas híbridas. Aquelas célulasque expressam o gene repórter são selecionadas e a molécula pequenadesconhecida ou o ligando desconhecido é identificado. Este método forne-ce um método de identificar moduladores, que ativam ou inibem a161P2F10B.

Uma modalidade desta invenção compreende um método deavaliar quano a uma molécula que interage com a seqüência de aminoácidode 161P2F10B mostrada na Figura 1, compreendendo as etapas de contataruma população de moléculas com uma seqüência de aminoácido de161P2F10B, permitindo a população de moléculas e a seqüência de amino-ácido de 161P2F10B interagir sob condições que facilitem uma interação,determinando a presença de uma molécula que interage com a seqüênciade aminoácido de 161P2F10B, e em seguida separando as moléculas quenão interagem com a seqüência de aminoácido de 161P2F10B, de molécu-las que interagem. Em uma modalidade específica, o método também com-preende purificar, caracterizar e identifica uma molécula que interage com aseqüência de aminoácido de 161P2F10B. A molécula identificada pode serusada para modular uma função realizada por 161P2F10B. Em uma modalidade preferida, a seqüência de aminoácido de 161P2F10B é contatada com a biblioteca de peptídeos.

X). Métodos e Composições Terapêuticos

A identificação de 161P2F10B como uma proteína que é normalmente expressa em um grupo restrito de tecidos, porém que é também expressa em cânceres tal como aqueles listados na Tabela I, abre diversosmétodos terapêuticos ao tratamento de tais cânceres.

De nota, terapias antitumor alvejadas têm sido úteis mesmoquando a proteína alvejada é expressa em tecidos normais, mesmo tecidosde órgão normal vitais. Um órgão vital é aquele que é necessário para sustentar a vida, tal como coração ou cólon. Um órgão não-vital é aquele que pode ser removido quando o indivíduo é ainda capaz de sobreviver. Exempios de órgãos nãovitais são ovário, mama, e próstata.

Por exemplo, Herceptin® é um produto farmacêutico aprovadopelo FDA, que consiste em um anticorpo que é imunorreativo com a proteínavariadamente conhecida como HER2, HER2/neu, e erb-b-2. Ele é comercializado pela Genentech e tem sido comercialmente bem-sucedido agente antitumor. As vendas de Herceptin® atingiram quase $400 milhões em 2002.Herceptin® é um tratamento para câncer de mama metastático positivo deHER2. Entretanto, a expressão de HER2 não está limitada a tais tumores. Amesma proteína é expressa em diversos tecidos normais. Em particular, éconhecido que o HER2/neu está presente em rim e coração normal, dessemodo estes tecidos estão presente em todos os recipientes humanos deHerceptina. A presença de HER2/neu em rim normal é também confirmadopelo Latif, Z., e outro, B.J.U. International (2002) 89:5-9. Como mostradoneste artigo (que avaliou se o carcinoma de célula renal deve ser uma indicação preferida para anticorpos anti-HER2 tal como Herceptina) tanto a proteína quanto o mRNA são produzidos em tecidos renais benignos. Notavelmente, a proteína HER2/neu foi fortemente superexpressa em tecido renal benigno.A despeito do fato de que HER2/neu é expresso em tais tecidosvitais como o coração e o rim, Herceptina é um fármaco muito útil, aprovadopelo FDA, e comercialmente bem-sucedido. O efeito de Herceptina sobre otecido cardíaco, isto é, "cardiotoxicidade," foi o único efeito colateral ao tra-tamento. Quando pacientes foram tratados com Herceptina sozinha, signifi-cante cardiotoxicidade ocorreu em uma perçentagem muito baixa de pacien-tes. Para minimizar a cardiotoxicidade existe um requisito de entrada maisrigoroso para o tratamento com HER2/neu. Fatores tais como predisposiçãoà condição cardíaca são avaliados antes que o tratamento possa ocorrer.

De nota particular, embora o tecido dos rins seja indicado exibirexpressão normal, possivelmente expressão ainda maior do que o tecidocardíaco, os rins não têm nenhum efeito colateral de Herceptina apreciávelqualquer que seja. Além disso, da disposição diversa de tecidos normais emque HER2 é expresso, existe ocorrência muito pequena de qualquer efeitocolateral. Apenas o tecido cardíaco de modo algum manifestou qualquer e-feito colateral apreciável. Um tecido tal como os rins, onde a expressão deHER2/neu é especialmente notável, não foi a base para qualquer efeito cola-teral.

Além disso, efeitos terapêuticos favoráveis foam descobertospara terapias antitumor que alvejam o receptor de fator de crescimento epi-dérmico (EGFR); Erbitux (ImClone). EGFR é também expresso em numero-sos tecidos normais. Tem havido efeitos colaterais muito limitados em teci-dos normais seguindo o uso de produtos terapêuticos anti-EGFR. Um efeitocolateral geral que ocorre com o tratamento de EGFR é uma brotoeja de pe-le severa observada em 100% dos pacientes sofrendo tratamento.

Desse modo, a expressão de uma proteína alvo em tecido nor-mal, mesmo tecido normal vital, não derrota a utilidade de um agente de al-vejamento para a proteína como um produto terapêutico para certos tumoresem que a proteína é também superexpressa. Por exemplo, a expressão emórgãos vitais não é em si própria prejudicial. Além disso, os órgãos conside-rados como dispensáveis, tal como a próstata e ovário, que podem ser re-movidos sem causar a mortalidade. Finalmente, alguns órgãos vitais não sãoafetados por expressão de órgão normal por causa de um imunoprevilégio.Órgãos imunoprevilegiados são órgãos que são protegidos de sangue poruma barreira sangue-órgão e desse modo não são acessíveis à imunoterapia. Exemplos de órgãos imunoprevilegiados são o cérebro e testículos.

Conseqüentemente, métodos terapêuticos que inibem a atividade de uma proteína 161P2F10B são úteis para pacientes sofrendo de um câncer que expressa 161P2F10B. Estes métodos terapêuticos geralmenteincluem três classes. A primeira classe modula a função de 161P2F10Bquando ela refere-se ao crescimento de célula de tumor induzindo à inibiçãoou retardo de crescimento de célula de tumor ou induzindo sua morte. A segunda classe compreende vários métodos para inibir a ligação ou associação de uma proteína 161P2F10B com seu parceiro de ligação ou com outrasproteínas. A terceira classe compreende uma variedade de métodos parainibir a transcrição de um gene de 161P2F10B ou translação de mRNA de 161P2F10B mRNA.

X. A). Vacinas Anticâncer

A invenção fornece vacinas de câncer compreendendo uma proteína relacionada com a 161P2F10B ou ácido nucléico relacionado com 161 P2F10B. Em vista da expressão de 161 P2F10B, vacinas de câncer previnem e/ou tratam cânceres expressando 161P2F10B com o mínimo ou nenhum efeito sobre os tecidos não-alvo. O uso de um antígeno de tumor emuma vacina que gera respostas imunes humorais mediadas por célula comoterapia anticâncer é bem conhecido na técnica e tem sido empregado emcâncer de próstata usando PSMA humano e imunógenos de PAP de roedor(Hodge e outro, 1995, Int. J. Câncer 63:231-237; Vong e outro, 1997, J. Immunol. 159:3113-3117).

Tais métodos podem ser facilmente praticados empregando-seuma proteína relacionada com a 161P2F10B, ou uma molécula de ácido nucléico codificando 161P2F10B e vetores recombinantes capazes de expressar e apresentar o imunógeno de 161P2F10B (que tipicamente compreendediversos epítopos de célula T ou anticorpo). Técnicos experientes entendemque uma ampla variedade de sistemas de vacina para liberação de epítoposimunorreativos são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Heryln e outro,Ann Med 1999 Feb 31(l):66-78; Maruyama e outro, Câncer Immunol Imunother 2000 Jun 49(3): 123-32). Em síntese, tais métodos de geração de umaresposta imune (por exemplo, mediada por célula e/ou humoral) em um mamífero, compreendem as etapas de: exposição do sistema imune do animala um epítopo imunorreativo (por exemplo, um epítopo presente em uma proteína 161P2F10B mostrada na Figura 1 ou análogo ou homólogo desta) demodo que o mamífero gere uma resposta imune que é específica para aquele epítopo (por exemplo, gera anticorpos que especificamente reconhecem aquele epítopo).

A proteína 161P2F10B inteira, regiões imunogênicas ou epítopos desta podem ser combinados e liberados por vário métodos. Tais composições de vacina podem incluir, por exemplo, lipopeptídeos (por exemplo,Vitiello, A. e outro, J. Clin. Invest. 95:341, 1995), composições de peptídeoencapsuladas em poli(DL-lactídeo-co-glicolídeo) ("PLG") microesferas (Veja,por exemplo, Eldridge, e outro, Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso eoutro, Vaccine 12:299-306, 1994; Jones e outro, Vaccine 13:675-681, 1995),composições de peptídeo contidas em complexos de estimulação imune(ISCOMS) (veja, por exemplo, Takahashi e outro, Nature 344:873-875, 1990;Hu e outro, Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998), sistemas de peptídeo deantígeno múltiplo (MAPs) (veja, por exemplo, Tarn, J. P., Proc. Natl. Acad.Sei. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Métodos 196:17-32,1996), peptídeos formulados como peptídeos multivalentes; peptídeos parauso em sistemas de liberação balística, tipicamente peptídeos cristalizados, vetores de liberação viral (Perkus, M. E. e outro, In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. e outro, Nature 320:535, 1986;

Hu, S. L. e outro, Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. e outro,AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F. H. e outro, J. Infect. Dis. 124:148,1971; Chanda, P. K. e outro, Virology 175:535, 1990), partículas de origemviral ou sintética (por exemplo, Kofler, N. e outro, J. Immunol. Métodos.192:25, 1996; Eldridge, J. H. e outro, Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L.D., Jr. e outro, Nature Med. 7:649, 1995), adjuvantes (Warren, H. S., Vogel,F. R., e Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R. K. e outro,Vaccine 11:293, 1993), lipossomas (Reddy, R. e outro, J. Immunol.148:1585, 1992; Rock, K. L, Immunol. Today 17:131, 1996), ou, cDNA nu ouabsorvido por partícula (Ulmer, J. B. e outro, Science 259:1745, 1993; Ro-binson, H. L, Hunt, L. A., e Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J.W. e outro, In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p.423, 1996; Cease, K. B., e Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12:923,1994 e Eldridge, J. H. e outro, Sem. Hematol. 30:16, 1993). Tecnologias deliberação alvejada or toxina, também conhecidas como alvejamento mediadopor receptor, tal como aquelas de Avant Imunotherapeutics, Inc. (Needham,Massachusetts) podem ser também usadas.

Em pacientes com câncer associado com 16TP2F10B, a vacinae as composições de anticorpo da invenção podem também ser usadas emconjunto com outros tratamentos usados para câncer, por exemplo, cirurgia,quimioterapia, terapias de fármaco, terapias de radiação, etc. incluindo usoem combinação com adjuvantes imunes tais como IL-2, IL- 12, GM-CSF, eos semelhantes.

Vacinas Celulares:

Epítopos de CTL podem ser determinados empregando-se algo-ritmos específicos para identificar peptídeos dentro da proteína 161P2F10Bque ligam-se aos alelos de HLA correspondentes (por exemplo, Brown Uni-versity, BIMAS, e SYFPEITHI. Em uma modalidade preferida, um imunogenode 161P2F10B contém uma ou mais seqüências de aminoácido identificadasempregando-se técnicas bem conhecidas na técnica, tal como as seqüên-cias mostradas nas Tabelas previamente descritas ou um peptídeo de 8, 9,10 ou 11 aminoácidos especificados por um motivo/supe/motivo de HLA deClasse I (por exemplo, Tabela IV (A), Tabela IV (D), ou Tabela IV (E)) e/ouum peptídeo de pelo menos 9 aminoácidos que compreende um mo-tif/supermotif de HLA Classe II (por exemplo, Tabela IV (B) ou Tabela IV(C)). Como é apreciado na técnica, a ranhura de ligação de HLA Classe I éessencialmente de extremidade fechada de modo que os peptídeos de ape-nas uma faixa de tamanho particular podem ajustar-se dentro da ranhura eser ligados, geralmente os epítopos de HLA Classe I são de 8, 9, 10, ou 11aminoácidos de comprimento. Ao contrário, a ranhura de ligação do HLAClasse II é essencialmente de extremidade aberta; portanto um peptídeo decerca de 9 ou mais aminoácidos pode ser ligado por uma molécula de HLAClasse II. Devido às diferenças de ranhura de ligação entre HLA Classe I eII, os motivos de HLA Classe I são específicos de comprimento, isto é, a posição dois de um motivo de Classe I é o segundo aminoácido em uma direção de amino para carboxila do peptídeo. As posições de aminoácido em ummotivo de Classe II são relativas apenas uma à outra, não o peptídeo total,isto é, aminoácidos adicionais podem ser ligados aos terminais de aminoe/ou carboxila de uma seqüência transportando motivo. Os epítopos de HLAClasse II são freqüentemente de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos de comprimento, ou mais compridos doque 25 aminoácidos.

Uma ampla variedade de métodos para gerar uma resposta imune em um mamífero é conhecida na técnica (por Exemplo, como a primeira etapa na geraão de hibridomas). Métodos de geração de uma respostaimune em um mamífero compreendem expor o sistema imune do mamífero a um epítopo imunogênico em uma proteína (por exemplo, uma proteína161P2F10B) de modo que uma resposta imune seja gerada. Uma modalidade típica consiste em um método para gerar uma resposta imune à 161P2F10B em um hospedeiro, contatando-se o hospedeiro com uma quantidade suficiente de pelo menos uma célula B de 161P2F10B ou epítopo de célula T citotóxica ou análogo desta; e pelo menos um intervalo periódicoapós recontactar o hospedeiro com o epítopo de célula T citotóxica ou célulaB de 161P2F10B ou análogo deste. Uma modalidade específica consiste emum método de gerar uma resposta imune contra uma proteína relacionadacom a 161P2F10B ou um peptídeo multiepitópico feito pelo homem compreendendo: administrar o imunógeno de 161P2F10B (por exemplo, uma proteína 161P2F10B ou um fragmento de peptídeo desta, uma proteína de fusão161P2F10B ou análogo etc), em uma preparação de vacina a um mamíferoou outro mamífero. Tipicamente, tais preparações de vacina também contêmum adjuvante adequado (veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidosne 6.146.635) ou um epítopo auxiliar universal tal como um peptídeo PADRETM (Epimmune Inc., San Diego, CA; veja, por exemplo, Alexander e outro, J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander e outro, Immunity 1994 1(9): 751-761 e Alexander e outro, Immunol. Res. 1998 18(2):79-92). Um método alternativo compreende gerar uma resposta imune emum indivíduo contra um imunógeno de 161P2F10B por: administração in vivoao músculo ou pele do corpo do indivíduo de uma molécula de DNA quecompreende uma seqüência de DNA que codifica um imunógeno de161P2F10B, a seqüência de DNA operativamente ligada às seqüências reguladoras que controlam a expressão da seqüência de DNA; em que a molécula de DNA é capturada pelas células, a seqüência de DNA é expressanas células e uma imune é gerada contra o imunógeno (veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n9 5.962.428). Opcionalmente um facilitador devacina genética tal como lipídeos aniônicos; saponinas; lectinas; compostosestrogênicos; alquilas inferiores hidroxiladas; sulfóxido de dimetila; e a uréiaé também administrada. Além disso, um anticorpo antiidiotípico pode seradministrado que imita 161P2F10B, a fim de gerar uma resposta ao antígeno alvo.

Vacinas de Ácido Nucléico:

As composições de vacina da invenção incluem modalidadesmediadas por ácido nucléico. DNA ou RNA que codifica proteína(s) da invenção pode ser administrado ao paciente. Métodos de imunização genética podem ser empregados para gerar respostas imunes celulares e humoraisprofiláticas e terapêuticas direcionadas contra as células de câncer expressando 161P2F10B. Construtos compreendendo DNA codificando uma proteína relacionada com a 161P2F10B/imunógeno e seqüências reguladorasapropriadas podem ser injetadas diretamente no músculo ou pele de um indivíduo, tal que as células do músculo ou pele capturem o construto e expressem o imunógeno/proteína 161P2F10B codificada. Alternativamente, avacina compreende uma proteína relacionada com a 161P2F10B. A expres-são do imunógeno de proteína relacionada com 161P2F10B resulta a gera-ção de imunidade celular e humoral profilática ou terapêutica contra célulasque transportam uma proteína 161P2F10B. Várias técnicas de imunizaçãogenética profilática e terapêutica conhecidas na técnica podem ser usadas.A liberação com base em ácido nucléico é descrita, por exemplo, em Wolff eoutro, Science 247:1465 (1990) bem como Patentes dos Estados Unidos n-5.580.859, 5.589.466, 5.804.566, 5.739.118, 5.736.524, 5.679.647, WO98/04720. Exemplos de tecnologias de liberação com base em DNA incluem"DNA nu", liberação facilitada (bupivicaína, polímeros, mediada por peptí-deo), complexos de lipídeo catiônico, e liberação mediada por partícula ("pis-tola de gene") ou liberação mediada por pressão (veja, por exemplo, a Pa-tente dos Estados Unidos n5 5.922.687).

Para os propósitos de imunização terapêutica ou profilática, asproteínas da invenção podem ser expressas por meio de vetores virais oubacterianos. Vários sistemas de liberação de gene viral que podem ser usa-dos na prática da invenção incluem, porém não estão limitados a, vaccínia,vírus do epitelioma contagioso, varíola dos canários, adenovírus, influenza,poliovírus, vírus adenoassociado, lentivírus, e vírus sindbis (veja, por exem-plo, Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663; Tsang e outro J. Natl.Câncer Inst. 87:982-990 (1995)). Sistemas de liberação não-viral podemtambém ser empregados introduzindo-se DNA nu codificando uma proteínarelacionada com 161P2F10B no paciente (por exemplo, intramuscularmenteou intradermicamente) para induzir uma resposta antitumor.

O vírus da vaccínia é usado, por exemplo, como um vetor paraexpressar seqüências de nucleotido que codificam os peptídeos da inven-ção. Na introdução em um hospedeiro, o vírus da vaccínia recombinante ex-pressa o peptídeo imunogênico de proteína, e desse modo elicia uma res-posta imune de hospedeiro. Os vetores de vaccínia e métodos úteis em pro-tocolos de imunização são descritos, por exemplo, na Patente dos EstadosUnidos n9 4.722.848. Outro vetor é o BCG (Bacille Calmette Guerin). Os ve-tores de BCG são descritos em Stover e outro, Nature 351:456-460 (1991).Uma ampla variedade de outros vetores úteis para administração terapêuticaou imunização dos peptídeos da invenção, por exemplo, vetores de vírusadeno e adenoassociado, vetores retrovirais, vetores de Salmonella typhi,vetores de toxina do antraz destoxificada, e os semelhantes, serão evidentespara aqueles versados na técnica da descrição inclusa.

Desse modo, os sistemas de liberação de gene são usados paraliberar uma molécula de ácido nucléico relacionada 161P2F10B. Em umamodalidade, o cDNA 161P2F1OB humano de tamanho natural é empregado.Em outra modalidade, moléculas de ácido nucléico de 161P2F10B codificando linfócito T citotóxico específico (CTL) e/ou epítopos de anticorpo são empregadas.

Vacinas Ex Vivo

Várias estratégias ex vivo podem também ser empregadas paragerar uma resposta imune. Um método envolve o uso de células apresentando antígeno (APCs) tal como células dendríticas (DC) para apresentar antígeno de 161P2F10B a um sistema imune do patient. As células dendríticas expressão moléculas MHC class I e II, co-estimulador B7, e IL-12, e sãodesse modo células apresentando antígeno altamente especializados. Emcâncer de próstata, células dendríticas autólogas pulsadas com peptídeos doantígeno de membrana específica de próstata (PSMA) estão sendo usadasem uma experiência clínica de Fase I para estimular os sistemas imunes dospacientes de câncer da próstata (Tjoa e outro, 1996, Próstata 28:65-69;Murphy e outro, 1996, Próstata 29:371-380). Desse modo, as células dendríticas podem ser usadas para apresentar peptídeos de 161P2F10B para as células T no contexto de moléculas MHC classe I ou II. Em uma modalidade, células dendríticas autólogas são pulsadas com peptídeos 161P2F10B capazes de ligação às moléculas de MHC classe I e/ou classe II. Em outra modalidade, as células dendríticas são pulsadas com a proteína 161P2F10Bcompleta. Ainda outra modalidade envolve o construto da superexpressaode um gene de 161P2F10B em células dendríticas usando vários vetores deimplementação conhecidos na técnica, tal como adenovírus (Arthur e outro,1997, Câncer Gene Ther. 4:17-25), retrovírus (Henderson e outro, 1996,Câncer Res. 56:3763-3770), lentivírus, vírus adenoassociado, transfecçãode DNA (Ribas e outro, 1997, Câncer Res. 57:2865-2869), ou transfecção deRNA derivado de tumor (Ashley e outro, 1997, J. Exp. Med. 186:1177-1182).Células que expressam 161P2F10B podem também ser construídas paraexpressar moduladores imunes, tal como GM-CSF, e usados como agentesde imunização.

X.B ). 161 P2F10B como um Alvo para Terapia com base em Anticorpo161P2F10B é o alvo atrativo para estratégias terapêuticas combase em anticorpo. Várias estratégias de anticorpo são conhecidas na técnica para alvejar ambas as moléculas extracelulares e intracelulares (veja, por exemplo, morte mediata por ADCC e complemento, bem como o uso de anticorpos). Por que 161P2F10B é expresso por células de câncer de váriaslinhagens com relação às células normais correspondentes, administraçãosistêmica de composições imunorreativas de 161P2F10B são preparadas,que exibem excelente sensibilidade sem efeitos tóxicos, não-específicos e/ou não alvo causados por ligação da composição de imunorreativos a órgãos e tecidos não-alvo. Anticorpos especificamente reativos com domíniosde 161P2F10B são úteis para tratar cânceres expressando 161P2F10B sistemicamente, ou como conjugados com uma toxina ou agente terapêutico,ou como anticorpos nus capazes de inibir a proliferação ou função celular.

Anticorpos de 161P2F10B podem ser introduzidos em um paciente tal que o anticorpo ligue-se a 161P2F10B e module uma função, tal como uma interação com um parceiro de ligação, e Conseqüentemente medie a destruição de células de tumor e/ou inibe o crescimento de células detumor. Mecanismos pelos quais tais anticorpos exercem um efeito terapêutico podem incluir citólise mediada por complemento, citotoxicidade celulardependente de anticorpo, modulação da função fisiológica de 161P2F10B,inibição de ligação de ligando ou trilhas de transdução de sinal, modulaçãode diferenciação de célula de tumor, alteração de perfis de fator de angiogênese de tumor, e/ou apoptose.

Aqueles versados na técnica entendem que anticorpos podemser usados para especificamene alvejar e ligar moléculas imunogênicas talcomo uma região imunogênica de uma seqüência de 161P2F10B mostradana Figura 1. Além disso, os técnicos experientes entendem que é rotina con-jugar anticorpos aos agentes citotóxicos (veja, por exemplo, Slevers e outroBlood 93:11 3678-3684 (1 de junho de 1999)). Quando agentes citotóxicose/ou terapêuticos são liberados diretamente para as células, tal como conju-gando-as aos anticorpos específicos para uma molécula expressa por aque-la célula (por exemplo, 161P2F10B), o agente citotóxico exercerá seu efeitobiológico conhecido (isto é, citotoxicidade) sobre aquelas células.

Uma ampla variedade de composições e métodos para usarconjugados de anticorpo - agente citotóxico para matar células é conhecidana técnica. No contexto de cânceres, métodos típicos vinculam a administra-ção a um animal tendo um tumor à quantidade biologicamente eficaz de umconjugado compreendendo a um agente citotóxico e/ou terapêutico selecio-nado ligado a um agente de alvejamento (por exemplo, um anticorpo anti-161P2F10B) que liga-se a um marcador (por exemplo, 161P2F10B) expres-so, acessível à ligação ou localizado sobre as superfícies celulares. Umamodalidade típica é um método de liberar um agente citotóxico e/ou terapêu-tico para uma célula expressando 161P2F10B, compreendendo conjugar oagente citotóxico a um anticorpo que imunoespecificamente liga-se a umepítope de 161P2F10B, e, expondo a célula ao conjugado de anticorpo-agente. Outra modalidade ilustrativa é um método de tratar um indivíduosuspeito de sofrer de câncer metastatizado, compreendendo uma etapa deadministrar parenteralmente ao referido indivíduo composição farmacêuticacompreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpoconjugado a um agente citotóxico e/ou terapêutico.

A imunoterapia de câncer usando antianticorpos 161P2F10Bpode ser feita de acordo com vários métodos que foram bem-sucedidamenteempregados no tratamento de outros tipos de câncer, incluindo porém nãolimitados a câncer de cólon (Arlen e outro, 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiplo (Ozaki e outro, 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenarie outro, 1997, Blood 90:2437-2444), câncer gástrico (Kasprzyk e outro,1992, Câncer Res. 52:2771-2776), linfoma de célula B (Funakoshi e outro,1996, J. Imunother. Emfasis Tumor Immunol. 19:93-101), leucemia (Zhong eoutro, 1996, Leuk. Res. 20:581-589), câncer colorretal (Moun e outro, 1994,Câncer Res. 54:6160-6166; Velders e outro, 1995, Câncer Res. 55:4398-4403), e câncer de mama (Shepard e outro, 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Alguns métodos terapêuticos envolvem a conjugação de anticorpo nu auma toxina ou radioisótopo, tal como a conjugação de Y91 ou 1131 aos anti-corpos anti-CD20 (por exemplo, ZevalinTM, IDEC Farmaceuticals Corp. ouBexxar®, Coulter Farmaceuticals) respectivamente, enquanto outros envol-vem a co-administração de anticorpos e outros agentes terapêuticos, tal co-mo HerceptinTM (trastuzu MAb) com paclitaxel (Genentech, Inc).. Os anti-corpos podem ser conjugados com um agente terapêutico. Para tratar cân-cer de rim, por exemplo, anticorpos de 161P2F10B podem ser administradosem conjunto com radiação, quimioterapia ou ablação de hormônio. Além dis-so, os anticorpos podem ser conjugados a uma toxina tal como caliqueami-cina (por exemplo, Mylotarg®, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ, um anticorpo lgG4kappa humanizado recombinante conjugado ao antibiótico antitumor cali-queamicina) ou um maitansinóide (por exemplo, Pró-fármaco Ativado deTumor com base em taxano, TAP, plataforma, Imunógeno, Cambridge, MA,also Veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 5.416.064) ou Au-ristatina E (Nat Biotechnol. julho de 2003; 21 (7):778-84. (Seattle Genetics)).

Embora a terapia de anticorpo de 161P2F10B seja útil para to-dos os estágios de câncer, a terapia de anticorpo pode ser particularmenteapropriada em cânceres avançados ou metastáticos. Tratamento com a te-rapia de anticorpo da invenção é indicada para pacientes que receberam umou mais ciclos de quimioterapia. Alternativamente, a terapia de anticorpo dainvenção é combinada com um regime quimioterapeutico ou de radiaçãopara pacientes que não receberam tratamento quimioterapeutico. Adicional-mente, a terapia de anticorpo pode possibilitar o uso de dosagens reduzidasde quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que não tole-ram a toxicidade do agente quimioterapeutico muito bem. Fan e outro (Can-cer Res. 53:4637-4642, 1993), Prewett e outro (International J. de Onco.9:217-224, 1996), e Hancock e outro (Câncer Res. 51:4575-4580, 1991)descrevem o uso de vários anticorpos juntamente com agentes quimiotera-pêuticos.

Embora a terapia de anticorpo de 161P2F10B seja útil para todos os estágios de câncer, a terapia de anticorpo pode ser particularmente apropriada em cânceres avançados ou metastáticos. Tratamento com a terapia de anticorpo da invenção é indicada para patientes que receberam umou mais ciclos de quimioterapia. Alternativamente, a terapia de anticorpo dainvenção é combinada com um regime quimioterapêutico ou radiação parapacientes que não receberam tratamento quimioterapêutico. Adicionalmente,terapia de anticorpo pode possibilitar o uso de dosagens reduzidas de quimioterapia concomitante, particularmente paa pacientes que não toleram a toxicidade do agente quimioterapêutico muito bem.

Pacientes de câncer podem ser avaliados quanto à presença eníel de expressão de 161P2F10B, preferivelmente usando triagens imunohistoquímicas de tecido de tumor, imageamento de 161P2F10B quantitativo,ou outras técnicas que seguramente indicam a presença e grau de expressão de 161P2F10B. Análise imuno-histoquímica de biopsia de tumor ou espécimes cirúrgicas é preferida para este propósito. Métodos para análiseimuno-histoquímica de tecidos de tumor são bem conhecido na técnica.

Anticorpos monoclonais anti-161P2F10B que tratam cânceres depróstata e outros incluem aqueles que iniciam uma potente resposta imunecontra o tumor ou aqueles que são diretamente citotóxicos. Com relação aisto, anticorpos monoclonais anti-161P2F10B (MAbs) podem eliciar lise decélula de tumor por mecanismos de citotoxicidade celular mediada por complemento ou dependente de anticorpo (ADCC), ambas as quais requerem uma porção Fc intacta da molécula de imunoglobulina para interação comsítios receptoresde Fc de célula efetora em proteínas de complemento. Alémdisso, MAbs anti-161P2F10B que exercem um efeito biológico direto sobre ocrescimento de tumor são úteis para tratar cânceres que expressão161P2F10B. Mecanismos pelos quais diretamente os MAbs citotóxicos agemincluem: inibição de crescimento celular, modulação de diferenciação celular,modulação de perfis de fator de angiogênese de tumor, e a indução de apoptose. O(s) mecanismo(s) pelos quais um MAb anti-161P2F10B particular e-xerce um efeito antitumor são avaliados usando qualquer número de ensaiosin vitro que avaliam a morte celular tal como ADCC, ADMMC, lise de célulamediada por complemento, e assim em diante, como é geralmente conheci-do na técnica.

Em alguns pacientes, o uso de anticorpos monoclonais de muri-no ou outro não-humano, ou MAbs quimércos humanos/camundongo podeinduzir a moderadas a fortes respostas imunes entra o ancicorpo não-humano. Isto pode resultar em remoção do anticorpo da circulação e eficáciareduzida. Nos casos mais severos, uma tal resposta imune pode induzir àformação extensiva de complexos imunes que, potencialmente, podem cau-sar dano renal. Conseqüentemente, os anticorpos monoclonais preferidosusados nos métodos terapêuticos da invenção são aqueles que são ou to-talmente humano ou humanizado e que ligam-se especificamente ao antíge-no 161P2F10B alvo com alta afinidade, porém exibem baixa ou nenhumaantigenicidade no paciente.

Os métodos terapêuticos da invenção contemplam a administra-ção de Mabs anti-161P2F10B único, bem como combinações, ou coquetéis,de diferentes de MAbs (isto é, MAbs de 161P2F10B ou MAbs que ligam-se aoutra proteína). Tais coquetéis de MAb podem ter certas vantagens visto queeles contêm MAbs que alvejam epítopos diferentes, exploram diferentes me-canismos efetores ou combinam diretamente MAbs citotóxico com MAbscontam com a funcionaliade efetora imune. Tais MAbs em combinação po-dem exibir efeitos terapêuticos sinergicos. Além disso, MAbs de 161P2F10Bpodem ser administrados concomitantemente com outras modalidades tera-pêuticas, incluindo porém não limitados a vários agentes quimioterapêuticose biológicoss, bloqueadores de androgênio, moduladores imunes (por exem-plo, IL-2, GM-CSF), cirurgia ou radiação. Os MAbs 161P2F10B são adminis-trados em sua forma "nua" ou não conjugada, ou podem ter um agente tera-pêutico(s) conjugado a eles.

Formulações de Mab de 161P2F10B são administradas por meiode qualquer rotina capaz de liberar os anticorpos para uma célula de tumor.Rotinas de administração incluem, porém não são limitadas a, intravenosa,intraperitoneal, intramuscular, intratumor, intradérmica, e os semelhantes. Otratamento geralmente envolve administração repetida da preparação deMab de 161P2F10B, por meio de uma rotina aceitável de administração talcomo injeção intravenosa (IV), tipicamente em uma dose na faixa, incluindoporém não-limitada a, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 15, 20, ou 25 mg/kg de peso corporal. Em geral, doses na faixade 10-1000 mg de MAb por semana são eficazes e bem toleradas.

Com base na experiência clínica com o Herceptin® (Trastuzu-mab) no tratamento de câncer de mama metastático, uma dose de sobre-carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal do paciente IV,seguida por doses semanais de cerca de 2 mg/kg IV da preparação' de MAbrepresenta um regime de dosagem aceitável. Preferivelmente, a dose desobrecarga inicial é administrada como uma infusão de 90 minutos ou pormais tempo. A dose de manutenção periódica é administrada como uma in-fusão de 30 minutos ou por mais tempo, contanto que a dose inicial sejabem tolerada. Como apreciado por aqueles versados na técnica, vários fato-res podem influenciar o regime de dose ideal em um caso particular. Taisfatores incluem, por exemplo, a afinidade de ligação e meia-vida dos MAbsusados, o grau de expressão de 161P2F10B no paciente, a extensão de an-tígeno de 161P2F10B derramado circulante, o nível de concentração de an-ticorpo em estado estável desejado, freqüência de tratamento, e a influênciade quimioterapêuticos ou outros agentes usados em combinação com o mé-todo de tratamento da invenção, bem como o estado de saúde de um paci-ente particular.

Opcionalmente, os pacientes devem ser avaliados quanto aosníveis de 161P2F10B em uma determinada amostra (por exemplo, os níveisde antígeno de 161P2F10B circulante e/ou células expressando161P2F10B) a fim de ajudar na determinação do regime de dosagem maiseficaz etc. Tais triagens são também usadas para propósitos de monitoraçãodurante toda terapia, e são úteis para estimar o sucesso terapêutico emcombinação com a triagem de outros parâmetros (por exemplo, citologia deurina e/ou níveis de imunócito em terapia de câncer de bexiga, ou por analo-gia, níveis de PSA de soro em terapia de câncer de próstata).

Anticorpos anti-161P2F10B antiidiotípicos podem também serusados em terapia anticâncer como uma vacina para induzir uma respostaimune às células expressando uma proteína relacionada com o 161P2F10B.

Em particular, a geração de anticorpos antiidiotípicos é bem conhecida natécnica; esta metodologia pode facilmente ser adaptada para gerar anticorpos anti-161P2F10B antiidiotípicos que imitam um epítopo em uma proteína relacionada com o 161P2F10B (Veja, por exemplo, Wagner e outro, 1997,Hybridoma 16: 33-40; Foon e outro, 1995, J. Clin. Invest. 96:334-342; Herlyn e outro, 1996, Câncer Immunol, Imunotner. 43:65-76). Tal anticorpo antiidiotípico pode ser usado em estratégias de vacina de câncer.

Um objetivo da presente invenção é fornecer Mabs de161P2F10B, que inibem ou retardam o crescimento de células de tumor expressando 161P2F10B. Um outro objetivo desta invenção é fornecer métodos para inibir angiogênese e outras funções biológicas e desse modo reduzir o crescimento de tumor em mamíferos, preferivelmente humanos, empregando-se tais Mabs de 161P2F10B, e em particular, empregando-se taisMabs de 161P2F10B combinados com outros fármacos ou tratamentos imunologicamente ativos, incluindo porém não limitados a: Avastin® (bevacizumab), Sutent® (malato de sunitinib), Nexavar® (tosilato de Sorafinib), Taxotere® (docetaxel), lnterleucina-2 (a.k.a. Proleukin®, IL-2, ou Aldesleukin), ouInterferon Alfa (Interferon- Alpha-2a, ou Interferon- Alfa-2b) e outros conhecidos na técnica para tratar câncer renal e outros cânceres.

■ Em uma modalidade, existe sinergia quando tumores, incluindotumores humanos, são tratados com anticorpos de 161P2F10B em conjuntocom agentes quimioterapêuticos ou radiação ou combinações destes. Emoutras palavras, a inibição do crescimento de tumor por um anticorpo de161P2F10B é realçada mais do que esperado quando combinada com agentes quimioterapêuticos ou radiação ou combinações destes. A sinergia pode ser mostrada, por exemplo, por maior inibição do crescimento de tumor comtratamento combinado do que seria esperado de um tratamento de apenasanticorpos de 161P2F10B ou do efeito aditivo do tratamento com um anti-corpo de 161P2F10B e um agente quimioterapêutico ou radiação. Preferi-velmente, a sinergia é demonstrada por remissão do câncer onde a remis-são não é esperada de tratamento ou de um anticorpo de 161P2F10B nu oucom tratamento empregando-se uma combinação de aditivo de um anticorpode 161P2F1OB e um agente quimioterapêutico ou radiação.

O método para inibição do crescimento de células de tumor em-pregando-se um anticorpo de 161P2F10B e uma combinação de quimiotera-pia ou radiação ou ambas compreende administração do anticorpo de161P2F10B antes, durante, ou após o início da terapia de quimioterapia ouradiação, bem como qualquer combinação destas (isto é, antes e durante,antes e após, durante e após, ou antes, durante, e após o início da terapiade quimioterapia e/ou radiação). Por exemplo, o anticorpo de 161P2F10B étipicamente administrado entre 1 e 60 dias, preferivelmente entre 3 e 40 di-as, mais preferivelmente entre 5 e 12 dias antes do início da terapia de radi-ação e/ou quimioterapia. Entretanto, dependendo do protocolo de tratamentoe das necessidades do paciente específico, o método é realizado de umamaneira que fornecerá o tratamento mais eficaz e finalmente prolongará avida do paciente.

A administração de agentes quimioterapêuticos pode ser reali-zada em uma variedade de métodos incluindo sistemicamente pelas rotinasparenteral e enteral. Em uma modalidade, o anticorpo de 161P2F10B e oagente quimioterapêutico são administrados como moléculas separadas. Emoutra modalidade, o anticorpo de 161P2F10B é ligado, por exemplo, por con-jugação, a um agente quimioterapêutico. (Veja o Exemplo intitulado "HumanClinicai Trials for the Treatment e Diagnosis of Human Carcinomas throughuse de Mabs de 161P2F10B"). Exemplos particulares de agentes quimiote-rapêuticos ou quimioterapia incluem cisplatina, dacarbazina (DTIC), dacti-nomicina, mecloretarnina (mostarda de nitrogênio), estreptozocina, ciclofos-famida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina),daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposida, metotrexato,5-fluorouracil, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel(taxotero), aldesleucina, asparaginase, bussulfano, carboplatina, cladribina,dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiuréia, ifosfamida, interferem alfa,leuprolida, megestrol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pe-gaspargase, pentostatina, pipobromano, plicamicina, estreptozoeina, tamoxi-feno, teniposida, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracila, vino-relbina, clorambucil, taxol e combinações dos mesmos.

A fonte de radiação, usada em combinação com um Mab de161P2F10B, pode ser externa ou interna ao paciente a ser tratado. Quandoa fonte é externa ao paciente, a terapia é conhecida como terapia de radia-ção de emissão externa (EBRT). Quando a fonte de radiação é interna aopaciente, o tratamento é chamado braquiterapia (BT).

Os regimes terapêuticos descritos acima podem ser tambémcombinados com regimes e/ou agentes de tratamento de câncer adicionais,por exemplo, quimioterapia adicional, vacinas de câncer, inibidores de trans-dução de sinal, agentes úteis no tratamento de crescimento celular anormalou câncer, anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-CTLA-4 como descritono WO/2005/092380 (Pfizer)) ou outros ligandos que inibem o crescimentode tumor por ligação a IGF-IR, e citocinas.

Quando o mamífero é submetido à quimioterapia adicional, a-gentes quimioterapêuticos descritos acima podem ser usados. Adicional-mente, os inibidores de fator de crescimento, modificadores de resposta bio-lógica, terapia anti-hormonal, moduladores de receptor estrogênio seletivos(SERMs), inibidores de angiogênese, e antiandrogênios podem ser usados.Por exemplo, anti-hormônios, por exemplo, antiestrogênios tais como Nolva-dex (tamoxifeno) ou, antiandrogênios tais como Casodex (4'-ciano-3-(4-fluorofenilsulfonil)-2-hidróxi-2-metil-3- '-(trifluorometil)propionanilida) podemser usados.

Em certas modalidades da invenção, os métodos descritos aci-ma são combinados com uma vacina de câncer. Vacinas úteis podem ser,sem limitação, aquelas compreendidas de antígenos associados ao câncer(por exemplo, BAGE, antígeno carcinoembriônico (CEA), EBV, GAGE,gp100 (incluindo gp100:209-217 e gp100:280-288, entre outros), HBV, HER-2/neu, HPV, HCV, MAGE, mamaglobina, MART-1/Melan-A, Mucin-1, NY-ESO-I, proteinase-3, PSA, RAGE, TRP-1, TRP-2, Tirosinase (por exemplo,Tirosinase: 368-376), WT-1), DNA de GM-CSF e vacinas com base na célu-la, vacinas de célula dendrítica, vacinas virais recombinantes (por exemplo,vírus vaccínia), e vacinas de proteína de choque térmico (HSP). Vacinas ú-teis também incluem vacinas de tumor, tais como aquelas formadas de célu-las de melanoma, e podem ser autólogas ou alogenéicas. As vacinas podemser, por exemplo, peptídeo, DNA ou com base na célula. Estes vários agen-tes podem ser combinados de modo que uma combinação compreendendo,entre outros, peptídeos gp100, Tirosinase e MART-1 possa ser administradacom o anticorpo.

As vacinas podem ser administradas antes de, ou subseqüenteao, transplante de célula tronco, e quando a quimioterapia é parte do regime,uma vacina pode ser administrada antes da quimioterapia. Em certas moda-lidades, o anticorpo da invenção pode também ser administrado antes daquimioterapia. A vacina pode também ser administrada após o transplantede célula tronco e em certas modalidades concomitantemente com o anti-corpo.

Os tratamentos descritos acima podem também ser usados cominibidores de transdução de sinal, tais como agentes que podem inibir res-postas de EGFR (receptor de fator de crescimento epidérmico), tais comoanticorpos de EGFR, anticorpos de EGF, e moléculas que são inibidores deEGFR; inibidores de VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), taiscomo receptores de VEGF e moléculas que podem inibir VEGF; e inibidoresde receptor erbB2, tais como moléculas orgânicas ou anticorpos que se li-gam ao receptor erbB2.

Inibidores de EGFR são descritos em, por exemplo, no WO95/19970 (publicado em 27 de julho de 1995), WO 98/14451 (publicado em 9de abril de 1998), WO 98/02434 (publicado em 22 de janeiro de 1998), e Pa-tente dos Estados Unidos n9 5,747,498 (emitido em 5 de maio de 1998), etais substâncias podem ser usadas na presente invenção como descrito a-qui. Agentes de inibição de EGFR incluem, porém não são limitados a, osanticorpos monoclonais ERBITUX (ImClone Systems Incorporated de NovaIorque, N. Y)., e ABX-EGF (Abgenix Inc. de Fremont, Calif)., os compostosZD-1839 (AstraZeneca), BIBX- 1382 (Boehringer Ingelheim), MDX-447 (Medarex Inc. de Annandale, Nova Jersey), e OLX- 103 (Merck & Co. de Whitehouse Station, N. J)., VRCTC-310 (Ventech Research) e toxina de fusão deEGF (Seragen Inc. de Hopkinton, Mass).. Estes e outros agentes de inibição de EGFR podem ser usados na presente invenção.

Inibidores de VEGF, por exemplo, SU-5416 e SU-6668 (SugenInc. de South San Francisco, Calif)., podem também ser empregados emcombinação com o anticorpo. Inibidores de VEGF são descritos, por exempio, no WO 99/24440 (publicado em 20 de maio de 1999), Pedido Internacional PCT PCT/IB99/00797 (depositado em 3 de maio de 1999), no WO95/21613 (publicado em 17 de agosto de 1995), WO 99/61422 (publicadoem 2 de dezembro de 1999), Patente dos Estados Unidos n9 5.834.504 (emitido em 10 de novembro de 1998), WO 98/50356 (publicado em 12 de novembro de 1998), Patente dos Estados Unidos nQ 5.883.113 (emitido em 16de março de 1999), Patente dos Estados Unidos n9 5.886.020 (emitido em23 de março de 1999), Patente dos Estados Unidos n9 5.792.783 (emitidoem 11 de agosto de 1998), WO 99/10349 (publicado em 4 de março de1999), WO 97/32856 (publicado em 12 de setembro de 1997), WO 97/22596(publicado em 26 de junho de 1997), WO 98/54093 (publicado em 3 de dezembro de 1998), WO 98/02438 (publicado em 22 de janeiro de 1998), WO 99/16755 (publicado em 8 de abril de 1999), e WO 98/02437 (publicado em22 de janeiro de 1998). Outros exemplos de alguns inibidores de VEGF específicos úteis na presente invenção são IM862 (Cytran Inc. de Kirkland,

Wash).; anticorpo IMC-1C11 Imclone e angiozima, uma ribozima sintética deRibozyme (Boulder, Colo), e Chiron (Emeryville, Calif)..

Inibidores de receptor erbB2, tais como GW-282974 (Glaxo Wellcome), e os anticorpos monoclonais AR-209 (Aronex Farmaceuticals Inc. de The Woodlands, Tex). e 2B-1 (Chiron), podem além disso ser combinados com o anticorpo, por exemplo, aqueles indicados no WO 98/02434 (publicado em 22 de janeiro de 1998), WO 99/35146 (publicado em 15 de julho de1999), WO 99/35132 (publicado em 15 de julho de 1999), WO 98/02437(publicado em 22 de janeiro de 1998), WO 97/13760 (publicado em 17 deabril de 1997), WO 95/19970 (publicado em 27 de julho de 1995), Patentedos Estados Unidos ne 5.587.458 (emitido em 24 de dezembro de 1996), ePatente dos Estados Unidos nQ 5.877.305 (emitido em 2 de março de 1999).Inibidores de receptor erbB2 úteis na presente invenção são também descri-tos em EP1029853 (publicado em 23 de agosto de 2000) e no WO00/44728, (publicado em 3 de agosto de 2000). As substâncias e compostosinibidores de receptor erbB2 descritos nos pedidos PCT anteriormente men-cionados, Patentes dos Estados Unidos, e Pedidos Provisórios dos EstadosUnidos, bem como outros compostos e substâncias que inibem o receptorerbB2, podem ser usados com o anticorpo de acordo com a presente invenção.

Os presentes regimes de tratamento podem também ser combi-nados com anticorpos ou outros ligandos que inibem o crescimento de tumorpor ligação a IGF-1R (receptor fator 1 de crescimento similar à insulina). An-ticorpos anti-IGF-1R específicos que podem ser usados na presente inven-ção incluem aqueles descritos no pedido PCT PCT/USOI/51113, depositadoem 20 de dezembro de 2001 e publicado como WO02/053596.

Os regimes de tratamento descritos aqui podem ser combinadoscom agentes antiangiogênese, tais como inibidores de MMP-2 (matriz-metaloproteinase 2), inibidores de MMP-9 (matriz-metaloproteinase 9), e ini-bidores de COX-II (ciclooxigenase II), podem ser usados em conjunto com oanticorpo no método da invenção. Exemplos de inibidores de COX-II úteisincluem CELEBREX (celecoxib), valdecoxib, e rofecoxib. X.C). 161P2F10Bcomo um Alvo para Respostas Imunes Celulares

Vacinas e métodos de preparação de vacinas que contêm umaquantidade imunogenicamente eficaz de um ou mais peptídeos de ligaçãode HLA como descrito aqui são também modalidades da invenção. Alémdisso, vacinas de acordo com a invenção abrangem composições de um oumais dos peptídeos reivindicados. Um peptídeo pode estar presente em umavacina individualmente. Alternativamente, o peptídeo pode existir como umhomopolímero compreendendo cópias múltiplas do mesmo peptídeo, ou co-mo um heteropolímero de vários peptídeos. Os polímeros têm a vantagemde reação imunológica aumentada e, onde epítopos de peptídeo diferentessão usados para preparar o polímero, têm a capacidade adicional de induziranticorpos e/ou CTLs que reagem com determinantes antigênicos diferentesdo organismo patogênico ou peptídeo relacionado com tumor alvejado parauma resposta imune. A composição pode ser uma região de ocorrência natu-ral de um antígeno ou pode ser preparada, por exemplo, recombinantementeou por síntese química.

Veículos que podem ser usados com vacinas da invenção sãobem conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, tiroglobulina, albuminastais como albumina de soro humano, toxóide tetânico, poliaminoácidos taiscomo poli L-lisina, ácido poli L-glutâmico, influenza, proteína de núcleo devírus da hepatite B, e os semelhantes. As vacinas podem conter um diluentefisiologicamente tolerável (isto é, aceitável) tal como água, ou salina, preferi-velmente salina tamponada por fosfato. As vacinas também tipicamente in-cluem um adjuvante. Adjuvantes tais como adjuvante de Freund incompleto,fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, ou alume são exemplos de mate-riais bem conhecidos na técnica. Adicionalmente, como descrito aqui, res-postas de CTL podem ser iniciadas por conjugação dos peptídeos da inven-ção aos lipídeos, tais como tripalmitoil-S-glicerilcisteinlisseril- serina(P3CSS). Além disso, um adjuvante tal como oligonucleotídeos contendoguanina fosforotiolada de citosina (CpG) sintética foi descoberto aumentarrespostas de CTL 10 a 100 vezes (Veja, por exemplo, Davila e Celis, J. Im-munol. 165:539-547(2000)).

Na imunização com uma composição de peptídeo de acordocom a invenção, por meio de injeção, aerossol, oral, transdérmica, transmu-cosal, intrapleural, intratecal, ou outras rotinas adequadas, o sistema imunedo hospedeiro responde à vacina por produção de grandes quantidades deCTLs e/ou HTLs específicos para o antígeno desejado. Conseqüentemente,o hospedeiro torna-se pelo menos parcialmente imune ao desenvolvimentotardio de células que expressam ou superexpressam o antígeno de161P2F10B, ou deriva pelo menos algum benefício terapêutico quando oantígeno foi associado ao tumor.

Em algumas modalidades, pode ser desejável combinar os componentes de peptídeo class I com componentes que induzem ou facilitam a neutralização das respostas de anticorpo e/ou célula T auxiliar direcionadas ao antígeno alvo. Uma modalidade preferida de uma tal composição compreende epítopos classe I e classe II de acordo com a invenção. Uma modalidade alternativa de uma tal composição compreende um epítopo classe Ie/ou classe II de acordo com a invenção, juntamente com um epítopo deHTL reativo cruzado tal como molécula de PADRE® (Epimmune, San Diego, CA) (descrito por exemplo, na Patente dos Estados Unidos Número 5.736.142).

Uma vacina da invenção pode também incluir células de apresentação de antígeno (APC), tais como células dendríticas (DC), como um veículo para apresentar peptídeos da invenção. Composições de vacina podem ser criadas in vitro, seguindo a coleta e mobilização de célula dendrítica, por meio da qual o carregamento das células dendríticas ocorre in vitro.Por exemplo, as células dendríticas são transfectadas, por exemplo, com umminigene de acordo com a invenção, ou são pulsadas com peptídeos. A célula dendrítica pode então ser administrada a um paciente para eliciar respostas imune in vivo. Composições de vacina, com base em DNA ou peptídeo, podem também ser administradas in vivo em combinação com mobilização de célula dendrítica por meio da qual o carregamento das célulasdendríticas ocorre in vivo.

Preferivelmente, os seguintes princípios são utilizados quandoseleciona-se uma série de epítopos para inclusão em uma composição poli-epitópica para uso em uma vacina, ou selecionamse epítopos distintos para serem inclusos em uma vacina e/ou para serem codificados por ácidos nucléicos tal como um minigene. É preferido que cada dos seguintes princípiosseja equilibrado a fim de realizar a seleção. Os múltiplos epítopos a serem incorporados em uma determinada composição de vacina podem ser, porémnão necessitam ser, contíguos em seqüência no antígeno natural do qual osepítopos são derivados.1) Epítopos são selecionados os quais, na administração, imitam respos-tas imunes que foram observadas estarem correlacionadas com remo-ção de tumor. Para HLA Classe I isto inclui 3 a 4 epítopos que se origi-nam de pelo menos um antígeno associado ao tumor (TAA). Para HLAClasse II uma razão similar é empregada; novamente 3 a 4 epítopossão selecionados de pelo menos um TAA (Veja, por exemplo, Rosen-berg e outro, Science 278:1447-1450). Epítopos de um TAA podem serusados em combinação com epítopos de um ou mais TAAs adicionaispara produzir uma vacina que alveja tumores com padrões de expres-são variantes de TAAs freqüentemente expressos.

2) Epítopos são selecionados que tenham o requisito afinidade de ligaçãoestabelecido estar correlacionado com imunogenicidade: para HLAClasse I um IC5o de 500 nM ou menos, freqüentemente 200 nM ou me-nos; e para Class II um IC50 de 1000 nM ou menos.

3) Peptídeos transportando supe/motivo suficientes, ou uma disposiçãosuficiente de peptídeos transportando motivo específico de alelo, sãoselecionados para fornecer ampla cobertura da população. Por exem-plo, é preferível ter pelo menos 80% de cobertura da população. Umaanálise Monte Cario, uma triagem estatística conhecida na técnica, po-de ser empregada para avaliar a amplitude, ou redundância da cobertu-ra da população.

4) Quando seleciona-se epítopos de antígenos relacionados com câncer éfreqüentemente útil selecionar análogos porque o paciente pode ter de-senvolvido tolerância ao epítopo natural.

5) De particular relevância são os epítopos referidos como "epítopos emninho". Epítopos em ninho ocorrem onde pelo menos dois epítopos so-brepõem-se em uma determinada seqüência de peptídeo. Uma se-qüência de peptídeo em ninho pode compreender epítopos de célula B,HLA class I e/ou HLA class II. Quando fornecendo epítopos em ninho,um objetivo geral é fornecer o maior número de epítopos por seqüên-cia. Desse modo, um aspecto é evitar o fornecimento de um peptídeoque seja mais longo do que o terminal amino do epítopo de terminalamino e o terminal carboxila do epítopo de terminal carboxila no peptí-deo. Quando fornecendo uma seqüência multiepitópica, tal como umaseqüência compreendendo epítopos em ninho, é geralmente importan-te avaliar a seqüência a fim de assegurar que ela não tem propriedadespatológicas ou outras biológicas deletérias.

6) Se uma proteína poliepitópica é criada, ou quando cria-se um minige-ne, um objetivo é gerar o menor peptídeo que abrange os epítopos deinteresse. Este princípio é similar, se não o mesmo como aquele em-pregado quando seleciona-se um peptídeo compreendendo epítoposem ninho. Entretanto, com um peptídeo poliepitópico artificial, o objeti-vo de minimização de tamanho é equilibrado contra a necessidade deintegrar quaisquer seqüências espaçadoras entre epítopos na proteínapoliepitópica. Resíduos de aminoácido espaçador podem, por exemplo,ser introduzidos para evitar epítopos juncionais (um epítopo reconheci-do pelo sistema imune, não presente no antígeno alvo, e somente cria-do pela justaposição de epítopos feita pelo homem), ou para facilitar aclivagem entre epítopos e desse modo realçar a apresentação de epí-topo. Epítopos juncionais devem geralmente ser evitados porque o re-cipiente pode gerar uma responsta imune para aquele epítopo não na-tural. De particular interesse é um epítopo juncional que é um "epítopodominante". Um epítopo dominante pode levar a uma tal resposta zelo-sa de modo que as respostas imunes a outros epítopos são diminuídasou suprimidas.

7) Onde as seqüências de múltiplas variantes da mesma proteína alvoestão presentes, epítopos de peptídeo potenciais podem também serselecionados com base em sua conservação. Por exemplo, um critériopara conservação pode definir que a seqüência inteira de um peptídeode ligação de HLA class I ou o núcleo 9-mero inteiro de um peptídeo deligação class II seja conservada em uma porcentagem designada dasseqüências avaliadas para um antígeno de proteína específico.

X.C.1. Vacinas de Minigene

Vários métodos diferentes estão disponíveis os quais permitemliberação simultânea de múltiplos epítopos. Ácidos nucléicos codificando ospeptídeos da invenção são uma modalidade particularmente útil da inven-ção. Epítopos para inclusão em um minigene são preferivelmente seleciona-dos de acordo com as normas mencionadas na seção anterior. Um métodopreferido de administração de ácidos nucléicos codificando os peptídeos dainvenção usa construtos de minigene codificando um peptídeo compreen-dendo um ou múltiplos epítopos da invenção.

O uso de minigenes de multiepítopos é descrito abaixo e em,Ishioka e outro, J. Immunol. 162:3915-3925, 1999; An, L. e Whitton, J. L, J.Virol. 71:2292, 1997; Thomson, S. A. e outro, J. Immunol. 157:822, 1996;Whitton, J. L. e outro, J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. e outro, Vaccine16:426, 1998. Por exemplo, um plasmídeo de DNA de multiepítopos codifi-cando epítopos transportando stvpemiotivo e/ou motivo derivados de161P2F10B, o epítopo de célula T auxiliar universal PADRE® ou múltiplosepítopos de HTL de 161P1F10B, e uma seqüência de sinal de translocaçãode retículo endoplasmático podem ser construídos. Uma vacina pode tam-bém compreender epítopos que são derivados de outros TA As.

A imunogenicidade de um minigene multiepitópico pode ser con-firmada em camundongos transgênicos para avaliar a magnitude de respos-tas de indução de CTL contra os epítopos testados. Além disso, a imunoge-nicidade de epítopos codificados por DNA in vivo pode ser correlacionadacom as respostas in vitro de linhagens de CTL específicas contra célulasalvo transfectadas com o plasmídeo de DNA. Desse modo, esses experi-mentos podem mostrar que o minigene serve para ambos: 1). gerar umaresposta de CTL e 2). que os CTLs induzidos reconheceram células expres-sando os epítopos codificados.

Por exemplo, para criar uma seqüência de DNA codificando osepítopos selecionados (minigene) para expressão em células humanas, asseqüências de aminoácido dos epítopos podem ser transladadas ao contrá-rio. Uma tabela de uso de códon humano pode ser usada para guiar a esco-lha do códon para cada aminoácido. Essas seqüências de DNA codificandoepítopo podem ser diretamente unidas, de modo que, quando transladadas,uma seqüência de polipeptídeo contínua seja criada. Para otimizar a expressão e/ou imunogenicidade, elementos adicionais podem ser incorporados noprojeto de minigene. Exemplos de seqüências de aminoácido que podem sertransladadas ao contrário e incluídas na seqüência de minigene incluem:epítopos HLA classe I, epítopos HLA classe II, epítopos de anticorpo, umaseqüência de sinal de ubiquitinação, e/ou um sinal de alvejamento de retículo endoplasmático. Além disso, apresentação de HLA de epítopos de CTL eHTL pode ser melhorada incluindo-se seqüências de flanqueamento de ocorrência natural ou sintéticas (por exemplo, polialanina) adjacentes aos epítopos de CTL ou HTL; esses peptídeos maiores compreendendo os epítopo(s)são incluídos no escopo da invenção.

A seqüência de minigene pode ser convertida em DNA por agrupamento de oligonucleotídeos que codificam os filamentos positivo e negativo do minigene. Oligonucleotídeos de sobreposição (30-100 bases de comprimento) podem ser sintetizados, fosforilados, purificados e anelados sobcondições apropriadas empregando-se técnicas bem conhecidas. As extremidades dos oligonucleotídeos podem ser unidas, por exemplo, empregando-se T4 DNA ligase. Este minigene sintético, codificando o polipeptídeo deepítopo, pode então ser clonado em um vetor de expressão desejado.

Seqüências regulatórias padrão bem conhecidas por aquelesversados na técnica são preferivelmente incluídas no vetor para garantir expressão nas células alvo. Vários elementos de vetor são desejáveis: umpromotor com um sítio de clonagem a jusante para inserção de minigene;um sinal de poliadenilação para terminação de transcrição eficiente; uma origem de E. coli de replicação; e um marcador selecionáveis de E. coli (porexemplo, resistência à ampicilina ou canamicina). Numerosos promotorespodem ser usados para este propósito, por exemplo, o promotor de citomegalovírus humano (hCMV). Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos N9 5.580.859 e 5.589.466 para outras seqüências de promotor adequadas.

Modificações de vetor adicionais podem ser desejadas para otimizar a expressão e imunogenicidade de minigene. Em alguns casos, íntrons são requeridos para expressão de gene eficiente, e um ou mais íntronsde ocorrência natural ou sintéticos podem ser incorporados na região trans-crita do minigene. A inclusão de seqüências de estabilização de mRNA eseqüências para replicação em células de mamífero podem também serconsideradas para aumentar a expressão de minigene.

Assim que um vetor de expressão é selecionado, o minigene éclonado na região poliligadora a jusante do promotor. Este plasmídeo étransformado em um filamento de E. coli apropriado, e o DNA é preparadoempregando-se técnicas padrão. A seqüência de DNA e orientação do mini-gene, bem como todos os outros elementos incluídos no vetor, são confir-mados empregando-se mapeamento de restrição e análise de seqüência deDNA. Células bacterianas alojando o plasmídeo correto podem ser armaze-nadas como um banco de célula principal e um banco de célula de trabalho.

Além disso, seqüências imunoestimulatórias (ISSs ou CpGs)parecem desempenhar um papel na imunogenicidade de vacinas de DNA.

Essas seqüências podem ser incluídas no vetor, fora da seqüência de codifi-cação de minigene, se desejado para realçar a imunogenicidade.

Em algumas modalidades, um vetor de expressão bi-cistrônicoque permite produção de ambos os epítopos codificados por minigene e umasegunda proteína (incluída para realçar ou diminuir a imunogenicidade) po-dem ser usados. Exemplos de proteínas ou polipeptídeos que podem bene-ficialmente realçar a resposta imune se co-expressos incluem citocinas (porexemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), moléculas de indução de citocina (por e-xemplo, LeIF), moléculas co-estimulatórias, ou para respostas de HTL, pro-teínas de ligação de pan-DR (PADRE®, Epimmune, San Diego, CA). Epíto-pos Auxiliares (HTL) podem ser unidos aos sinais de alvejamento intracelulare expressos separadamente de epítopos de CTL expressos; isto permite adireção dos epítopos de HTL para um compartimento celular diferente da-quele dos epítopos de CTL. Se requerido, isto poderia facilitar entrada maiseficiente de epítopos de HTL na trilha de HLA classe II, desse modo melho-rando a indução de HTL. Em contraste à indução de HTL ou CTL, especifi-camente diminuição da resposta imune por co-expressão de moléculas imu-nossupressoras (por exemplo TGF-(3) pode ser benéfica em certas doenças.Quantidades terapêuticas de DNA plasmídeo podem ser produ-zidas por exemplo, por fermentação em E. coli, seguida por purificação. Alí-quotas do banco de célula de trabalho são usadas para inocular meio decrescimento, e desenvolvidas para saturação em frascos agitadores ou umbioreator de acordo com técnicas bem conhecidas. DNA plasmídeo pode serpurificado empregando-se tecnologias de bioseparação padrão tais comoresinas de permuta de ânion de fase sólida fornecidas por QIAGEN, Inc. (Va-lencia, Califórnia). Se requerido, DNA superespiralado pode ser isolado dasformas linear e circular aberta empregando-se eletroforese de gel ou outrosmétodos.

DNA plasmídeo purificado pode ser preparado por injeção em-pregando-se uma variedade de formulações. O mais simples destes é a re-constituição de DNA liofilizado em salina de tampão de fosfato estéril (PBS).Este método, conhecido como "DNA nu," está atualmente sendo usado poradministração intramuscular (IM) em experiências clínicas. Para maximizaros efeitos imunoterapêuticos de vacinas de DNA de minigene, um métodoalternativo para formulação de DNA plasmídeo purificado pode ser desejá-vel. Uma variedade de métodos foram descritos, e novas técnicas podemtornar-se disponíveis. Lipídeos catiônicos, glicolipídeos, e lipossomas fuso-gênicas podem também ser usados na formulação (veja, por exemplo, comodescrito por WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7):682 (1988); Patente dos Estados Unidos N9 5.279.833; WO 91/06309; eFelgner, e outro, Proc. Nafl Acad. Sei. USA 84:7413 (1987). Além disso,peptídeos e compostos referidos coletivamente como compostos protetores,interativos, não condensados (PINC) podem também ser complexados emDNA plasmídeo purificado para influenciar variáveis tais como estabilidade,dispersão intramuscular, ou tráfico para órgãos específicos ou tipos celula-res.

A sensibilização de célula alvo pode ser usada como um ensaiofuncional para expressão e apresentação de HLA classe I de epítopos deCTL codificados por minigene. Por exemplo, o DNA plasmídeo é introduzidoem uma linhagem de célula de mamífero que é adequada como um alvo pa-ra ensaios de liberação de crômio de CTL padrão. O método de transfecçãousado será dependente da formulação final. Eletroporação pode ser usadopara DNA "nu", visto que lipídeos catiônicos permitem transfecção in vitrodireta. Um plasmídeo expressando proteína verde fluorescente (GFP) podeser co-transfectado para permitir enriquecimento de células transfectadasempregando-se classificação de célula ativada fluorescente (FACS). Essascélulas são então rotuladas por crômio 51 (51Cr) e usadas como células alvopara linhagens de CTL específicas de epítopo; citólise, detectada por libera-ção de 51Cr, indica igualmente produção de, e apresentação de HLA de, epí-topos de CTL codificados por minigene. Expressão de epítopos de HTL podeser avaliada de uma maneira análoga empregando-se ensaios para avaliaratividade de HTL.

Imunogenicidade in vivo é um segundo método para teste fun-cional de formulações de DNA de minigene. Camundongos transgênicosexpressando proteínas de HLA humanas apropriadas são imunizados com oproduto de DNA. A dose e rotina de administração são dependentes da for-mulação (por exemplo, IM para DNA em PBS, intraperitoneal (i.p). para DNAde complexo de lipídeo). Vinte e um dias após imunização, esplenócitos sãocoletados e reestimulados durante uma semana na presença de peptídeoscodificando cada epítopo sendo testado. Por conseqüinte, para células efeto-ras de CTL, os ensaios são conduzidos para citólise de carga de peptídeo,células alvo rotuladas por 51Cr empregando-se técnicas padrão. Lise de cé-lulas alvo que foram sensibilizadas por carga de HLA com epítopos de pep-tídeo, correspondentes aos epítopos codificados por minigene, demonstra afunção de vacina de DNA para indução in vivo de CTLs. Imunogenicidade deepítopos de HTL é confirmada em camundongos transgênicos de uma ma-neira análoga.

Alternativamente, os ácidos nucléicos podem ser administradosempregando-se liberação balística como descrito, por exemplo, na Patentedos Estados Unidos N9 5.204.253. Empregando-se esta técnica, as partícu-las compreendidas somente de DNA são administradas. Em uma outra mo-dalidade alternativa, o DNA pode ser aderido às partículas, tais como parti-cuias de ouro.

Os minigenes podem também ser liberados empregando-se outros sistemas de liberação bacteriano ou viral bem conhecidos na técnica, por exemplo, um constructo de expressão codificando epítopos da invençãopode ser incorporada em um vetor viral tal como vaccínia.

X.C.2. Combinações de Peptídeos de CTL com Peptídeos Auxiliares

Composições de vacina compreendendo peptídeos de CTL dainvenção podem ser modificadas, por exemplo, analogadas, para forneceratributos desejados, tais como meia-vida de soro melhorada, cobertura depopulação ampliada ou imunogenicidade realçada.

Por exemplo, a capacidade de um peptídeo induzir atividade deCTL pode ser realçada por ligação do peptídeo a uma seqüência que contém pelo menos um epítopo que é capaz de induzir uma resposta de célula auxiliar T. Embora um peptídeo de CTL possa ser diretamente ligado a umpeptídeo auxiliar T, freqüentemente conjugados de epítopo de CTL/ epítopode HTL são ligados por uma molécula espaçadora. O espaçador é tipicamente compreendido de moléculas neutras, relativamente pequenas, tais como aminoácidos ou miméticos de aminoácido, que são substancialmentenão-carregados sob condições fisiológicas. Os espaçadores são tipicamente selecionados de, por exemplo, Ala, Gly, ou outros espaçadores neutros deaminoácidos não polares ou aminoácidos polares neutros. Será entendidoque o espaçador opcionalmente presente não necessita ser compreendidodos mesmos resíduos e desse modo pode ser um hetero- ou homo-oligômero. Quando presente, o espaçador usualmente será pelo menos um ou dois resíduos, mais usualmente três a seis resíduos e algumas vezes 10ou mais resíduos. O epítopo de peptídeo de CTL pode ser ligado ao epítopode peptídeo auxiliar T ou diretamente ou por meio de um espaçador no terminal amina ou carbóxi do peptídeo de CTL. O terminal amina do peptídeo imunogênico ou do peptídeo auxiliar T pode ser acilado.

Epítopos de peptídeo de HTL podem também ser modificadospara alterar suas propriedades biológicas. Por exemplo, eles podem ser modificados para incluir D-aminoácidos para aumentar sua resistência às prote-ases e desse modo estender sua meia vida de soro, ou eles podem ser con-jugados a outras moléculas tais como lipídeos, proteínas, carboidratos, esimilares para aumentar sua atividade biológica. Por exemplo, um peptídeoauxiliar T pode ser conjugado a uma ou mais cadeias de ácido palmitico nosterminais amino ou carboxila.

X.C.3. Combinações de Peptídeos de CTL com Agentes de Provimento deCélula T

Em algumas modalidades pode ser desejável incluir nas compo-sições farmacêuticas da invenção pelo menos um componente que provelinfócitos B ou linfócitos T. Os lipídeos foram identificados como agentes ca-pazes de prover CTL in vivo. Por exemplo, resíduos de ácido palmitico po-dem ser ligados aos grupos e- e a- amino de um resíduo de lisina e em se-guida ligados, por exemplo, por meio de um ou mais resíduos de ligação taiscomo Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, ou similares, a um peptídeo imunogênico.

O peptídeo lipidado pode então ser administrado ou diretamente em umamicela ou partícula, incorporado em uma lipossoma, ou emulsificado em umadjuvante, por exemplo, adjuvante de Freund incompleto. Em uma modali-dade preferida, uma composição imunogênica particularmente eficaz com-preende ácido palmitico ligado aos grupos e- e a- amino de Lys, que é unidopor meio de ligação, por exemplo, Ser- Ser, ao terminal amino do peptídeoimunogênico.

Como outro exemplo de provimento de lipídeo de respostas deCTL, lipoproteínas de E. coli, tais como tripalmitoil-S-glicerilcisteinlisseril-serina (P3CSS) podem ser usadas para prover CTL específico de vírusquando covalentemente ligadas a um peptídeo apropriado (veja, por exem-plo, Deres, e outro, Nature 342:561, 1989). Peptídeos da invenção podemser acoplados a P3CSS, por exemplo, e o lipopeptídeo administrado a umindivíduo para prover especificamente uma resposta imune ao antígeno alvo.Além disso, porque a indução de anticorpos de neutralização pode tambémser provida com epítopos conjugados à P3CSS, duas tais composições po-dem ser combinadas para mais eficazmente evocar igualmente respostashumoral e mediadas por célula.X.C.4. Composições de Vacina Compreendendo DC Pulsado com Peptídeosde CTL e/ou HTL

Uma modalidade de uma composição de vacina de acordo coma invenção compreende administração ex vivo de um coquetel de peptídeostransportando epítopo para PBMC, ou DC isolado dele, do sangue do paci-ente. Um produto farmacêutico para facilitar a colheita de DC pode ser usa-do, tal como Progenipoietin® (Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO) ou GM-CSF/IL-4. Após pulsação do DC com peptídeos e antes da reinfusão em pa-cientes, o DC são lavados para remover peptídeos soltos. Nesta modalida-de, uma vacina compreende DCs pulsados por peptídeo que apresentam osepítopos de peptídeo pulsado complexados com moléculas de HLA em suassuperfícies.

O DC pode ser pulsado ex vivo com um coquetel de peptídeos,alguns dos quais estimulam respostas de CTL a 161P2F10B. Opcionalmen-te, um peptídeo de célula T auxiliar (HTL), tal como um peptídeo HLA ClasseII frouxamente restrito natural ou artificial, pode ser incluído para facilitar aresposta de CTL. Desse modo, uma vacina de acordo com a invenção é u-sada para tratar um câncer que expressa ou superexpressa 161P2F10B.

X.D). Imunoterapia Adotiva

Peptídeos relacionados com 161P2F10B antigênicos são usadospara evocar uma resposta de CTL e/ou HTL ex vivo, também. As células deCTL ou HTL resultantes, podem ser usadas para tratar tumores em pacien-tes que não respondem a outras formas convencionais de terapia, ou nãoresponderão a um ácido nucléico ou peptídeo de vacina terapêutica de acor-do com a invenção. Respostas de CTL ou HTL ex vivo a um antígeno parti-cular são induzidas por incubação em cultura de tecido do paciente, ou ge-neticamente compatível, células precursoras de CTL ou HTL juntamentecom uma fonte de células que apresentam antígeno (APC), tais como célu-las dendríticas, e o peptídeo imunogênico apropriado. Após um tempo deincubação apropriado (tipicamente cerca de 7-28 dias), em que as célulasprecursoras são ativadas e expandidas em células efetoras, as células sãoinfundidas novamente no paciente, onde elas destruirão (CTL) ou facilitarãoa destruição (HTL) de sua célula alvo específica (por exemplo, uma célula detumor). Células dendríticas transfectadas podem também ser usadas comocélulas que apresentam antígeno.

X.E). Administração de Vacinas para Propósitos Terapêuticos ou Profiláticos

Composições de vacina e farmacêuticas da invenção são tipi-camente usadas para tratar e/ou prevenir um câncer que expressa ou su-perexpressa 161P2F10B. Em aplicações terapêuticas, composições de pep-tídeo e/ou ácido nucléico são administradas a um paciente em uma quanti-dade suficiente para evocar uma resposta eficaz de célula B, CTL e/ou HTLao antígeno e para curar ou pelo menos parcialmente interromper ou retar-dar os sintomas e/ou complicações. Uma quantidade adequada para execu-tar isto é definida como "dose terapeuticamente eficaz". Quantidades efica-zes para este uso dependerão, por exemplo, da composição particular admi-nistrada, da maneira de administração, do estágio e da severidade da doen-ça sendo tratada, do peso e estado geral de saúde do paciente, e do diag-nóstico do médico prescrevente.

Para composições farmacêuticas, os peptídeos imunogênicos dainvenção, ou DNA que os codifica, são geralmente administrados a um indi-víduo já sofrendo de um tumor que expressa 161P2F10B. Os peptídeos ouDNA que os codifica podem ser administrados individualmente ou como fu-são de uma ou mais seqüências de peptídeo. Os pacientes podem ser trata-dos com os peptídeos imunogênicos separadamente ou em conjunto comoutros tratamentos, tais como cirurgia, quando apropriado.

Para uso terapêutico, a administração deve geralmente começarno primeiro diagnóstico de câncer associado a 161P2F10B. Isto é seguidopor doses de reforço até pelo menos os sintomas serem substancialmentereduzidos e durante um período por conseguinte. A modalidade da composi-ção da vacina (isto é, incluindo, porém não-limitada às modalidades tais co-mo coquetéis de peptídeo, polipeptídeos poliepitópicos, minigenes, ou CTLsespecíficos de TAA ou células dendríticas pulsadas) distribuída ao pacientepode variar de acordo com o estágio da doença ou o estado de saúde dopaciente. Por exemplo, em um paciente com um tumor que expressa161P2F10B, uma vacina compreendendo CTL específico de 161P2F10Bpode ser mais eficaz na morte de células de tumor em paciente com doençaavançada do que modalidades alternativas.

É geralmente importante fornecer uma quantidade do epítopo depeptídeo distribuída por um modo de administração suficiente para estimulareficazmente uma resposta de célula T citotóxica; composições que estimulam respostas de célula T auxiliar podem também ser administradas de acordo com esta modalidade da invenção.

A dosagem para uma imunização terapêutica inicial geralmenteocorre em uma faixa de dosagem de unidade onde o menor valor é cerca de1, 5, 50, 500, ou 1.000 |ig e o maior valor é cerca de 10.000; 20.000; 30.000;ou 50.000 |ig. Valores de dosagem para uma faixa tipicamente humana decerca de 500 ^ig a cerca de 50.000 jug por 70 quilogramas do paciente. Dosagens de reforço entre cerca de 1,0 u.g a cerca de 50.000 \xg de peptídeode acordo com um regime de reforço durante semanas a meses podem seradministradas dependendo da condição e resposta do paciente como determinado por triagem da atividade específica de CTL e HTL obtido do sangue do paciente. A administração deve continuar até pelo menos os sintomasclínicos ou testes laboratoriais indicarem que a neoplasia, foi eliminada ou reduzida e durante um período por conseguinte. As dosagens, vias de administração, e escalas de dose são ajustadas de acordo com metodologias conhecidas na técnica.

Em certas modalidades, os peptídeos e composições da presente invenção são empregados em estados de doença graves, isto é, situações ameaçadoras da vida ou potencialmente ameaçadoras da vida. Em tais casos, como um resultado das quantidades mínimas de substâncias estranhas e da natureza não-tóxica relativa dos peptídeos em composições preferidasda invenção, é possível e pode ser achado desejável pelo tratamento médicoadministrar excessos substanciais dessas composições de peptídeo relativas a essas quantidades de dosagem estabelecidas.

As composições de vacina da invenção podem também ser usadas puramente como agentes profiláticos. Geralmente a dosagem para umaimunização profilática inicial geralmente ocorre em uma faixa de dosagem deunidade onde o menor valor é cerca de 1, 5, 50, 500, ou 1000 |a,g e o maiorvalor é cerca de 10.000; 20.000; 30.000; ou 50.000 jxg. Valores de dosagempara uma faixa tipicamente humana de cerca de 500 ug a cerca de 50.000ug por 70 quilogramas do paciente. Isto é seguido por dosagens de reforçoentre cerca de 1,0 (xg a cerca de 50.000 ug de peptídeo administradas emintervalos definidos de cerca de quatro semanas a seis meses após a admi-nistração inicial de vacina. A imunogenicidade da vacina pode ser estimadapor triagem da atividade específica de CTL e HTL obtida de uma amostra dosangue do paciente.

As composições farmacêuticas para tratamento terapêutico sãopretendidas para administração parenteral, tópica, oral, nasal, intratecal, oulocal (por exemplo como um creme ou ungüento tópico). Preferivelmente, ascomposições farmacêuticas são administradas parenteralmente, por exem-pio, intravenosamente, subcutaneamente, intradermicamente, ou intramus-cularmente. Desse modo, a invenção fornece composições para administra-ção parenteral que compreende uma solução dos peptídeos imunogênicosdissolvidos ou suspensos em um veículo aceitável, preferivelmente um veí-culo aquoso.

Uma variedade de veículos aquosos pode ser usada, por exem-plo, água, água tamponada, 0,8% de solução salina, 0,3% de glicina, ácidohialurônico e similares. Essas composições podem ser esterilizadas por téc-nicas de esterilização bem conhecidas, convencionais, ou podem ser esté-reis filtradas. As soluções aquosas resultantes podem ser empacotadas parauso como são, ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada comuma solução estéril antes da administração.

As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceu-ticamente aceitáveis como requerido para aproximar das condições fisiológi-cas, tais como agentes de tamponamento e ajuste de pH, agentes de ajustede tonicidade, agentes de umectáção, conservantes, e similares, por exem-plo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio,cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina etc.A concentração de peptídeos da invenção nas formulações farmacêuticas pode variar amplamente, isto é, de menos do que cerca de 0,1%, usualmente em ou pelo menos cerca de 2% a tanto quanto 20% a50% ou mais em peso, e será selecionada primeiramente por volumes defluido, viscosidades etc, de acordo com o modo particular de administraçãoselecionado.

Uma forma de dose única humana de uma composição é tipicamente incluída na composição farmacêutica que compreende uma dose única humana de um veículo aceitável, em uma modalidade um veículo aquoso, e é administrada em um volume/quantidade que é conhecido por aquelesversados na técnica para ser usado para administração de tais composiçõesa seres humanos (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences,Mà Edição, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania,1985). Por exemplo uma dose de peptídeo para imunização inicial pode ser de cerca de 1 a cerca de 50.000 [lq, geralmente 100-5.000 \ig, para um paciente de 70 kg. Por exemplo, para ácidos nucléicos uma imunização inicialpode ser realizada empregando-se um vetor de expressão na forma de ácidonucléico nu administrado IM (ou SC ou ID) nas quantidades de 0,5-5 mg emsítios múltiplos. O ácido nucléico (0,1 a 1000 fig) pode também ser administrado empregando-se uma arma de gene. Seguindo um período de incubação de 3-4 semanas, uma dose reforçada é em seguida administrada. O reforço pode ser vírus do epitelioma contagioso recombinante administrado emuma dose de 5-107 a 5x109 pfu.

Para anticorpos, um tratamento geralmente envolve administração repetida da preparação de anticorpo anti-161P2F10B, por meio de uma rotina aceitável de administração tal como injeção intravenosa (IV), tipicamente em uma dose na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de pesocorporal. Em geral, doses na faixa de 10-500 mg de MAb por semana sãoeficazes e bem toleradas. Além disso, uma dose de carga inicial de aproxi madamente 4 mg/kg de peso corporal do paciente IV, seguida por dosessemanais de cerca de 2 mg/kg IV da preparação de MAb anti-161P2F10Brepresenta um regime de dosagem aceitável. Como apreciado por aquelesversados na técnica, vários fatores podem influenciar a dose ideal em umcaso particular. Tais fatores incluem, por exemplo, meia vida de uma composição, a afinidade de ligação de um Ab, a imunogenicidade de uma substância, o grau de expressão de 161P2F10B no paciente, a extensão de antígeno 161P2F10B derramado circulante, o nível de concentração de estadoconstante desejado, freqüência de tratamento, e a influência de agentesquimioterapêuticos ou outros usados em combinação com o método de tratamento da invenção, bem como o estado de saúde de um paciente particular. Doses únicas humanas preferidas não-limitantes são, por exemplo, 500|ig - 1 mg, 1 mg - 50 mg, 50 mg - 100 mg, 100 mg - 200 mg, 200 mg - 300mg, 400 mg - 500 mg, 500 mg - 600 mg, 600 mg - 700 mg, 700 mg - 800 mg,800 mg - 900 mg, 900 mg - 1 g, ou 1 mg - 700 mg. Em certas modalidades, adose está em uma faixa de 2-5 mg/kg de peso corporal, por exemplo, continuando com doses semanais de 1-3 mg/kg; 0,5 mg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 mg/kg de peso corporal seguidas, por exemplo, em duas, três ou quatrosemanas por doses semanais; 0,5 - 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo, seguidas em duas, três ou quatro semanas por doses semanais; 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 mg por m2 de área corporal semanalmente; 1 -600 mg por m2 de área corporal semanalmente; 225 - 400mg por m2de área corporal semanalmente; estas podem ser seguidas por doses semanais durante 2, 3,4,5, 6, 7, 8, 9,19, 11, 12 ou mais semanas.

Em uma modalidade, formas de dose única humana de polinucleotídeos compreendem uma faixa de dosagem adequada ou quantidadeeficaz que fornece qualquer efeito terapêutico. Como apreciado por alguém versado na técnica, um efeito terapêutico depende de vários fatores, incluindo a seqüência do polinucleotídeo, peso molecular do polinucleotídeo e rotina de administração. As dosagens são geralmente selecionadas pelo médico ou outro profissional de cuidado de saúde de acordo com uma variedadede parâmetros conhecidos na técnica, tais como severidade dos sintomas,história do paciente e similares. Geralmente, para um polinucleotídeo decerca de 20 bases, uma faixa de dosagem pode ser selecionada de, por exemplo, um limite inferior independentemente selecionado tal como cerca de0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400ou 500 mg/kg até um limite superior independentemente selecionado, maiordo que o limite inferior, de cerca de 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750,1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 ou 10.000mg/kg. Por exemplo, uma dose pode ser em torno de quaisquer das seguin-tes: 0,1 a 100 mg/kg, 0,1 a 50 mg/kg, 0,1 a 25 mg/kg, 0,1 a 10 mg/kg, 1 a500 mg/kg, 100 a 400 mg/kg, 200 a 300 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 100 a 200mg/kg, 300 a 400 mg/kg, 400 a 500 mg/kg, 500 a 1000 mg/kg, 500 a 5000mg/kg, ou 500 a 10.000 mg/kg. Geralmente, vias parenterais de administra-ção podem requerer doses maiores de polinucleotídeo comparadas à aplica-ção mais direta do nucleotido ao tecido doente, como feito para os polinucle-otídeos de comprimento crescente.

Em uma modalidade, formas de dose única humana de células Tcompreendem uma faixa de dosagem adequada ou quantidade eficaz quefornece qualquer efeito terapêutico. Como apreciado por alguém versado natécnica, um efeito terapêutico depende de vários fatores. As dosagens sãogeralmente selecionadas pelo médico ou outro profissional de cuidado desaúde de acordo com uma variedade de parâmetros conhecidos na técnica,tais como severidade dos sintomas, história do paciente e similares. Umadose pode ser cerca de 104 células a cerca de 106 células, cerca de 106 cé-lulas a cerca de 108 células, cerca de 108 a cerca de 1011 células, ou cercade 108 a cerca de 5 x 1010 células. Uma dose pode também ser cerca de 106células/m2 a cerca de 1010 células/m2, ou cerca de 106 células/m2 a cerca de108 células/m2.

As proteína(s) da invenção, e/ou ácidos nucléicos codificando asproteína(s), podem também ser administradas por meio de lipossomas, quepodem também servir para: 1) alvejar as proteína(s) para um tecido particu-lar, tal como tecido linfóide; 2) alvejar seletivamente para células doentes;ou, 3) aumentar a meia-vida da composição de peptídeo. Lipossomas inclu-em emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos,dispersões de fosfolipídeo, camadas lamelares e similares. Nestas prepara-ções, o peptídeo a ser distribuído é incorporado como parte de uma lipos-soma, sozinho ou em conjunto com uma molécula que se liga a um receptorpredominante entre as células linfoides (tais como anticorpos monoclonaisque se ligam ao antígeno CD45) ou com outras composições terapêuticas ouimunogênicas. Desse modo, as lipossomas ou carregadas ou decoradascom um peptídeo desejado da invenção podem ser direcionadas ao sítio decélulas linfoides, onde as lipossomas em seguida liberam as composiçõesde peptídeo. As lipossomas para uso de acordo com a invenção são formadas a partir de lipídeos de formação de vesícula padrão, que geralmente incluem fosfolipídeos negativamente carregados e neutros e um esterol, taiscomo colesterol. A seleção de lipídeos é geralmente guiada por consideração de, por exemplo, tamanho da lipossoma, labilidade ao ácido e estabilidade das lipossomas na corrente sangüínea. Uma variedade de métodosestá disponível para preparação de lipossomas, como descrito em, por exemplo, Szoka, e outro, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), e Patente dos Estados Unidos N— 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028, e 5.019.369.

Para células de alvejamento do sistema imune, um ligando a serincorporado na lipossoma pode incluir, por exemplo, anticorpos ou fragmentos destes específicos para determinantes da superfície celular das células do sistema imune desejadas. Uma suspensão de lipossoma contendo um peptídeo pode ser administrada intravenosamente, localmente, topicamenteetc. em uma dose que varia de acordo com, entre outras coisas, a maneirade administração, o peptídeo a ser distribuído, e o estágio da doença a sertratada.

Para composições sólidas, veículos sólidos não tóxicos convencionais podem ser usados os quais incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio,talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio, e similares. Paraadministração oral, uma composição não-tóxica farmaceuticamente aceitávelé formada por incorporação de quaisquer dos excipientes normalmente empregados, tais como aqueles veículos previamente listados, e geralmente10-95% de ingrediente ativo, isto é, um ou mais peptídeos da invenção, emais preferivelmente em uma concentração de 25%-75%.Para administração por aerossol, peptídeos imunogênicos sãopreferivelmente fornecidos em forma bem dividida juntamente com um tensoativo e propelente. Porcentagens típicas de peptídeos são cerca de0,01%-20% em peso, preferivelmente cerca de 1 %-10%. O tensoativo deve,evidentemente, ser não tóxico, e preferivelmente solúvel no propelente. Representativos de tais agentes são os ésteres ou ésteres parciais de ácidos graxos contendo de cerca de 6 a 22 átomos de carbono, tais CQmo ácidoscapróico, octanóico, láurico, palmítico, esteárico, linoléico, linolênico, olestérico e oléico com um álcool poliídrico alifático ou seus anidridos cíclicos. Ésteres misturados, tais como glicerídeos misturados ou naturais podem serempregados. O tensoativo pode constituir cerca de 0,1%-20% em peso dacomposição, preferivelmente cerca de 0,25- 5%. O equilíbrio da composiçãoé ordinariamente propelente. Um veículo pode também ser incluído, comodesejado, como com, por exemplo, lecitina para distribuição intranasal.

XI). Modalidades Diagnosticas e Prognósticas de 161P2F10B

Como descrito aqui, polinucleotídeos 161P2F10B, polipeptídeos,células T citotóxicas reativas (CTL), células T auxiliares reativas (HTL) e anticorpos antipolipeptídeo são usados em ensaios diagnósticos, prognósticose terapêuticos bem conhecidos que examinam condições associadas comcrescimento celular desregulado tal como câncer, em particular, os câncereslistados na Tabela I (veja, por exemplo, igualmente seu padrão específico deexpressão de tecido bem como sua superexpressão em certos câncerescomo descrito, por exemplo, no Exemplo intitulado "Análise de expressão de161P2F10B em tecidos normais, e espécimens de paciente").161P2F10B pode ser análogo a um PSA de antígeno associadoà próstata, o marcador arqueotipal que foi usado por práticos médicos durantes anos para identificar e monitorar a presença de câncer de próstata (veja,por exemplo, Merrill e outro, J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik e outro, J. Urol. Aug; 162(2):293-306 (1999) e Fortier e outro, J. Nat. Câncer Inst.

91(19): 1635- 1640(1999)). Uma variedade de outros marcadores diagnósticos são também usados em contextos similares incluindo p53 e K-ras (veja,por exemplo, Tulchinsky e outro, Int J Mol Med 1999 M 4(l):99-102 e Minimo-to e outro, Câncer Detect Prev 2000;24(l):l-12). Portanto, esta descrição depolipeptídeos e polinucleotídeos de 161P2F10B (bem como sondas de polinucleotídeo de 161P2F10B e anticorpos anti-161P2F10B usados para identificar a presença dessas moléculas) e suas propriedades permitem técnicosexperientes utilizarem essas moléculas em métodos que são análogos àqueles usados, por exemplo, em uma variedade de ensaios diagnósticos direcionados às condições de exame associadas ao câncer.

Modalidades típicas de métodos diagnósticos que utilizam ospolinucleotídeos de 161P2F10B, polipeptídeos, células T reativas e anticorpos são análogos àqueles métodos de ensaios diagnósticos bem estabelecidos, que empregam, (por exemplo, polinucleotídeos de PSA, polipeptídeos,células T reativas e anticorpos) por exemplo, igualmente polinucleotídeos dePSA são usados como sondas (por exemplo em análise do Norte, veja, porexemplo, Sharief e outro, Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3):567- 74(1994)) e iniciadores (pôr exemplo em análise de PCR, veja, por exemplo, Okegawa eoutro, J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar a presença e/ou onível de mRNAs de PSA em métodos de monitoramento de superexpressãode PSA ou da metástase de cânceres de próstata, os polinucleotídeos de161P2F10B descritos aqui podem ser utilizados da mesma maneira paradetectar superexpressão de 161P2F10B ou da metástase de rim e outroscânceres expressando este gene. Alternativamente, igualmente polipeptídeos de PSA são usados para gerar anticorpos específicos para PSA quepodem então ser usados para observar a presença e/ou o nível de proteínasde PSA em métodos para monitorar superexpressão de proteína de PSA(veja, por exemplo, Stephan e outro, Urology 55(4):560-3 (2000)) ou a metástase de células da próstata (veja, por exemplo, Alanen e outro, Pathol.Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)), os polipeptídeos de 161P2F10B descritosaqui podem ser utilizados para gerar anticorpos para uso na detecção desuperexpressão de 161P2F10B ou da metástase de células renais e célulasde outros cânceres expressando este gene.

Especificamente, porque metástases envolvem o movimento decélulas de câncer de um órgão de origem (tal como o pulmão ou glândula depróstata etc), para uma área diferente do corpo (tal como um nodo de linfa),ensaios que examinam uma amostra biológica quanto à presença de célulasexpressando polinucleotídeos de 161P2F10B e/ou polipeptídeos podem serusados para fornecer evidência de metástase. Por exemplo, quando umaamostra biológica de tecido que normalmente não contém células expressando 161P2F10B é descoberta conter células expressando 161P2F10B,esta descoberta é indicativa de metástase.

Alternativamente polinucleotídeos de 161P2F10B e/ou polipeptídeos podem ser usados para fornecer evidência de câncer, por exemplo, quando células em uma amostra biológica que normalmente não expressam161P2F10B ou expressam 161P2F10B em um nível diferente são descobertas expressar 161P2F10B ou ter uma expressão aumentada de 161P2F10B (veja, por exemplo, a expressão de 161P2F10B nos cânceres listados naTabela I e em amostras de paciente etc. mostradas nas Figuras acompanhantes). Em tais ensaios, os técnicos podem também desejar gerar evidência suplementar de metástase por teste da amostra biológica quanto à presença de um segundo marcador restrito ao tecido (em adição ao 161P2F10B).

O uso de imuno-histoquímica para identificar a presença de um20 polipeptídeo de 161P2F10B dentro de uma secção de tecido pode indicarum estado alterado de certas células dentro daquele tecido. É bem entendido na técnica que a capacidade de um anticorpo de localizar um polipeptídeo que é expresso em células de câncer é uma maneira de diagnosticar apresença de doença, estágio de doença, progressão e/ou agressividade dotumor. Um tal anticorpo pode também detectar uma distribuição alterada dopolipeptídeo dentro das células de câncer, quando comparado ao tecido nãomaligno correspondente.

O polipeptídeo de 161P2F10B e composições imunogênicas sãotambém úteis em vista dos fenômenos de localização de proteína subcelular alterada em estados de doença. Alteração de células de estado normal adoente causa mudanças na morfologia celular e é freqüentemente associadacom mudanças na localização/distribuição de proteína subcelular. Por e-xemplo, proteínas de membrana celular que são expressas de uma maneirapolarizada em células normais podem ser alteradas em doença, resultandoem distribuição da proteína de uma maneira não polar sobre toda a superfície celular.

O fenômeno de localização de proteína subcelular alterada emum estado de doença foi demonstrado com MUC1 e expressão de proteínaHer2 por uso de métodos imunoistoquímicos. Células epiteliais normais têmuma distribuição apical típica de MUC1, em adição a alguma localização supranuclear da glicoproteína, enquanto lesões malignas freqüentemente demonstram um padrão de manchamento apoiar (Diaz e outro, The BreastJournal, 7; 40-45 (2001); Zhang e outro, Clinicai Câncer Research, 4; 2669-2676 (1998): Cao, e outro, The Journal of Histochemistry e Cytochemistry,45: 1547-1557 (1997)). Além disso, epitélio de mama normal é negativo paraproteína Her2 ou exibe somente uma distribuição basolateral enquanto céluIas malignas podem expressar a proteína sobre toda a superfície celular (De Potter, e outro, International Journal of Câncer, 44; 969-974 (1989): McCormick, e outro, 117; 935-943 (2002)). Alternativamente, a distribuição da proteína pode ser alterada de uma superfície única de localização para incluir expressão citoplásmica difusa no estado doente. Um tal exemplo pode serobservado com MUC1 (Diaz, e outro, The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)).

A alteração na localização/distribuição de uma proteína na célula, como detectado por métodos imunoistoquímicos, pode também fornecer informação valiosa com referência à facilidade de certas modalidades detratamento. Este último ponto é ilustrado por uma situação onde uma proteína pode ser intracelular em tecido normal, porém superfície celular em células malignas; a localização da superfície celular toma as células favoravelmente receptivas a diagnóstico com base em anticorpo e regimes de tratamento. Quando uma tal alteração de localização de proteína ocorre para 161P2F10B, a proteína 161P2F10B e respostas imunes relacionadas a ela são muito úteis. O uso das composições de 161P2F10B permite que aquelesversados na técnica façam importantes diagnóstico e decisões terapêuticas.

Reagentes imunoistoquímicos específicos para 161P2F10B sãotambém úteis para detectar metástases de tumores expressando161P2F10B quando o polipeptídeo aparece em tecidos onde 161P2F10Bnão é normalmente produzido.

Desse modo, polipeptídeos de 161P2F10B e anticorpos resultantes de respostas imunes a eles são úteis em uma variedade de importantes contextos tais como propósitos diagnósticos, prognósticos, preventivose/ou terapêuticos conhecidos por aqueles versados na técnica.

Adicionalmente, polinucleotídeos ou proteínas relacionadas com161P2F10B da invenção podem ser usados para tratar uma condição patológica caracterizada pela super-expressão de 161P2F10B. Por exemplo, aseqüência de aminoácido ou ácido nucléico de Figura 1, ou fragmentos deum dos dois, podem ser usados para gerar uma resposta imune a um antígeno 161P2F10B. Anticorpos ou outras moléculas que reagem com 161P2F10B podem ser usados para modular a função desta molécula, e desse modo fornecerem um benefício terapêutico.

XI.A). Inibição da Função da proteína 161P2F10B

A invenção inclui vários métodos e composições para inibição deuma ligação de 161P2F10B a seu parceiro de ligação ou sua associaçãocom outras proteína(s) bem como métodos para inibição da função de 161P2F10B.

XI.B). Inibição de 161P2F10B com Anticorpos Intracelulares

Em um método, um vetor recombinante que codifica anticorposde cadeia única que especificamente ligam-se a 161P2F10B é introduzidoem células de expressão de 161P2F10B por meio de tecnologias de transferência de gene. Conseqüentemente, o anticorpo anti-161P2F10B de cadeiaúnica codificada é expresso intracelularmente, liga-se à proteína161P2F10B, e desse modo inibe sua função. Métodos paro construto de taisanticorpos de cadeia única intracelular são bem conhecidos. Tais anticorposintracelulares, também conhecidos como "intracorpos", são especificamentealvejados para um compartimento particular dentro da célula, fornecendocontrole sobre o local onde a atividade inibitória do tratamento é focalizada.Esta tecnologia foi bem-sucedidamente aplicada na técnica (para revisão,veja Richardson e Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Intracorpos foram mostrados eliminar virtualmente a expressão de receptores de superfície celularabundante de outra maneira (veja, por exemplo, Richardson e outro, 1995,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 3137-3141; Beerli e outro, 1994, J. Biol.Chem. 289: 23931-23936; Deshane e outro, 1994, Gene Ther. 1: 332-337).

Anticorpos de cadeia única compreendem aos domínios variáveis da cadeia leve e pesada unidos por um polipeptídeo ligante flexível, e são expressos como um polipeptídeo único. Opcionalmente, anticorpos decadeia única são expressos como um fragmento de região variável de cadeia única unido à região constante de cadeia leve. Sinais de tráfico intracelular bem conhecidos são construídos em vetores de polinucleotídeo recombinantes codificando tais anticorpos de cadeia única a fim de alvejar precisamente o intracorpo para o compartimento intracelular desejado. Por exemplo, intracorpos alvejados para o retículo endoplasmático (ER) são construídos para incorporar um peptídeo líder e, opcionalmente, um sinal de retenção de ER de terminal C, tal como o motivo de aminoácido KD.EL. Intracorpos pretendidos para exercer a atividade no núcleo são construídos paraincluir um sinal de localização nuclear. Porções de lipídio são unidas aosintracorpos a fim de prender o intracorpo do lado citosólico da membranaplasmática. Intracorpos podem também ser alvejados para exercer a funçãono citosol. Por exemplo, intracorpos citosolicos são usados para seqüestraros fatores dentro do citosol, desse modo prevenindo-os de serem transportados para seu destino celular natural.

Em uma modalidade, intracorpos são usados para capturar161P2F10B no núcleo, desse modo prevenindo sua atividade dentro do núcleo. Sinais de alvejamento nuclear são construídos em tais intracorpos de 161P2F10B a fim de obter o alvejamento desejado. Tais intracorpos de 161P2F10B são destinados a ligarem-se especificamente a um domínio de 161P2F10B particular. Em outra modalidade, intracorpos citosolicos que especificamente ligam-se a uma proteína 161P2F10B são usados para prevenir 161P2F10B de ganhar acesso ao núcleo, desse modo prevenindo-o de exercer qualquer atividade biológica dentro do núcleo (por exemplo, prevê-nindo 161P2F10B de formar complexos de transcrição com outros fatores).XIC). Inibiçao de 161P2F10B com Proteínas Recombinantes

Em outro método, moléculas recombinantes ligam-se a161P2F10B e desse modo inibem a função de 161P2F10B. Por exemplo,essas moléculas recombinantes previnem ou inibem 161P2F10B de acessar/ligar-se aos seus parceiro(s) de ligação ou associação com outras proteína(s). Tais moléculas recombinantes podem, por exemplo, conter as parte(s) reativas de uma molécula de anticorpo específico para 161P2F10B.

Em uma modalidade particular, o domínio de ligação de 161P2F10B de um parceiro de ligação de 161P2F10B é construído em uma proteína de fusão dimérica, por meio do qual a proteína de fusão compreende dois domínios deligação de ligando a 161P2F10B ligados à porção Fc de uma IgG humana,tal como IgGi humana. Tal porção de IgG pode conter, por exemplo, os domínios de CH2 e CH3 e a região de articulação, porém não o domínio de CH-|. Tais proteínas de fusão diméricas são administradas em forma solúvelaos pacientes sofrendo de um câncer associado à expressão de161P2F10B, por meio do qual a proteína de fusão dimérica especificamenteliga-se a 161P2F10B e bloqueia a interação de 161P2F10B com um parceirode ligação. Tais proteínas de fusão diméricas são também combinadas emproteínas multiméricas empregando-se tecnologias de ligação de anticorpo conhecidas.

XI.D). Inibiçao de Translaçao ou Transcrição de 161P2F10B

A presente invenção também compreende vários métodos ecomposições para inibiçao da transcrição do gene 161P2F10B. Similarmente, a invenção também fornece métodos e composições para inibiçao da translaçao de mRNA de 161P2F10B na proteína.

Em um método, a inibiçao da transcrição do gene 161P2F10Bcompreende contactar o gene 161P2F10B com um polinucleotídeo antisentido de 161P2F10B, em outro método, a inibiçao de translaçao de mRNA de 161P2F10B compreende contactar um mRNA de 161P2F10B com umpolinucleotídeo anti-sentido. Em outro método, uma ribozima específica de161P2F10B é usada para clivar um 161P2F10B mensageiro, desse modoinibindo a translação. Tais métodos com base em anti-sentido e ribozimapodem também ser direcionados às regiões regulatórias do gene161P2F10B, tal como promotor de 161P2F10B e/ou elementos realçadores.Similarmente, proteínas capazes de inibir um fator de transcrição de gene de161P2F10B são usadas para inibir a transcrição de mRNA de 161P2F10B.Os vários polinucleotídeos e composições úteis nos métodos anteriormentemencionados foram descritos acima. O uso de moléculas anti-sentido e ribozima para inibir a transcrição e translação é bem conhecido na técnica.

Outros fatores que inibem a transcrição de 161P2F10B interferindo com a ativação transcricional de 161P2F10B são também úteis para tratar cânceres expressando 161P2F10B. Similarmente, fatores que interferem com processamento de 161P2F10B são úteis para tratar cânceres queexpressam 161P2F10B. Métodos de tratamento de câncer utilizando taisfatores são também inclusos no escopo da invenção.

XI.E). Considerações Gerais para Estratégias Terapêuticas

Tecnologias de terapia de gene e transferência de gene podemser usadas para liberar moléculas de polinucleotídeo terapêutico para células de tumor sintetizando 161P2F10B (isto é, anti-sentido, ribozima, polinucleotídeos codificando intracorpos e outras moléculas inibitórias de161P2F10B). Vários métodos de terapia de gene são conhecidos na técnica.Vetores recombinantes codificando polinucleotídeos anti-sentido de161P2F10B, ribozimas, fatores capazes de interferir com a transcrição de161P2F10B, e assim por diante, podem ser liberados para células de tumoralvo empregando-se tais métodos de terapia de gene.

Os métodos terapêuticos acima podem ser combinados comqualquer um de uma ampla variedade de regimes de terapia por cirurgia,quimioterapia ou radiação. Os métodos terapêuticos da invenção podempermitir o uso de dosagens reduzidas de quimioterapia (ou outras terapias)e/ou administração menos freqüente, uma vantagem para todos os pacientes e particularmente para aqueles que não toleram bem a toxicidade do agente quimioterapêutico.

A atividade antitumor de uma composição particular (por exem-pio, anti-sentido, ribozima, intracorpo), ou uma combinação de tais composições, pode ser avaliada empregando-se vários sistemas de ensaio in vitro ein vivo. Ensaios in vitro que avaliam a atividade terapêutica incluem ensaiosde crescimento celular, ensaios de ágar macio e outros ensaios indicativosde atividade de promoção de tumor, ensaios de ligação capazes de determinar a extensão na qual uma composição terapêutica inibirá a ligação de 161P2F10B a um parceiro de ligação etc.

In vivo, o efeito de uma composição terapêutica de 161P2F10Bpode ser avaliado em um modelo animal adequado. Por exemplo, modelosde câncer de rim xenogênico podem ser usados, onde explantes de câncerde próstata humano ou tecidos de xenoenxerto de transição são introduzidosem animais imuno comprometidos, tais como camundongos nus ou SCID(Klein e outro, 1991, Nature Medicine 3: 402- 408). Por exemplo, Pedido dePatente PCT W098/16628 e Patente dos Estados Unidos 6.107.540 descrevem vários modelos de xenoenxerto de câncer de próstata humano capazes de recapitular o desenvolvimento de tumores primários, micrometástase, e aformação de metástases osteoblásticas característica de doença em estágioavançado. A eficácia pode ser predita empregando-se ensaios que avaliam ainibição de formação de tumor, regressão de tumor ou metástase, e similares.

Ensaios in vivo que avaliam a promoção de apoptose são úteisna triagem de composições terapêuticas. Em uma modalidade, xenoenxertosde camundongos sofrendo de tumor tratados com a composição terapêuticapodem ser examinados quanto a presença de focos apoptoticos e comparados aos camundongos sofrendo de xenoenxerto de controle não-tratados. A extensão na qual os focos apoptoticos são encontrados nos tumores doscamundongos tratados fornece uma indicação da eficácia terapêutica da composição.

As composições terapêuticas usadas na prática dos métodosprecedentes podem ser formuladas em composições farmacêuticas compreendendo um veículo adequado para o método de liberação desejado. Veículos adequados incluem qualquer material que quando combinado com acomposição terapêutica retém a função antitumor da composição terapêuticae é geralmente não reativo com o sistema imune do paciente. Exemplos in-cluem, porém não são limitados a, quaisquer dos vários veículos farmacêuti-cos padrão tais como soluções de solução salina tamponada por fosfato es-téril, água bacteriostática, e similares (veja, geralmente, Remington's Phar-maceutical Sciences 16â Edição, A. Osal, Ed., 1980).

Formulações terapêuticas podem ser solubilizadas e administra-das por meio de qualquer rotina capaz de liberar a composição terapêuticano sítio de tumor. Vias de administração potencialmente eficazes incluem,porém não são limitadas a, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intra-muscular, intratumor, intradérmica, intraórgão, ortotópica, e similares. Umaformulação preferida para injeção intravenosa compreende a composiçãoterapêutica em uma solução de água bacteriostática preservada, água nãopreservada estéril, e/ou diluída em bolsas de polivinilcloreto ou polietilenocontendo cloreto de sódio estéril a 0,9% para injeção, USP. Preparações deproteína terapêuticas podem ser liofilizadas e armazenadas como pós esté-reis, preferivelmente sob vácuo, e em seguida reconstituídas em água bacte-riostática (contendo por exemplo, conservante de álcool de benzila) ou emágua estéril antes da injeção.

Protocolos de dosagens e administração para o tratamento decânceres empregando-se os métodos precedentes variarão com o método eo câncer alvo, e geralmente dependerá de vários outros fatores apreciadosna técnica.

XII). Identificação, Caracterização e Uso de Moduladores de 161P2F10B

Métodos para Identificar e Usar Moduladores

Em uma modalidade, a triagem é realizada para identificar mo-duladores que induzem ou suprimem um perfil de expressão particular, su-primem ou induzem trilhas específicas, preferivelmente gerando o fenótipoassociado desse modo. Em outra modalidade, tendo genes diferencialmenteexpressos identificados importantes em um estado particular; triagens sãorealizadas para identificar moduladores que alteram a expressão de genesindividuais, aumentando ou diminuindo. Em outra modalidade, a triagem érealizada para identificar moduladores que alteram uma função biológica doproduto de expressão de um gene diferencialmente expresso. Novamente,tendo identificado a importância de um gene em um estado particular, astriagens são realizadas para identificar agentes que se ligam e/ou modulama atividade biológica do produto de gene.

Além disso, as triagens são feitas para genes que são induzidosem resposta a um agente candidato. Após identificar um modulador (um quesuprimi um padrão de expressão de câncer induzindo a um padrão de ex-pressão normal, ou um modulador de um gene de câncer que induz à ex-pressão do gene como em tecido normal) uma a triagem é realizada paraidentificar genes que são especificamente modulados em resposta ao agen-te. A comparação de perfis de expressão entre tecido normal e tecido decâncer tratado por agente descreve genes que não são expressos em tecidonormal ou tecido de câncer, porém são expressos em tecido tratado por a-gente, e vice-versa. Essas seqüências específicas de agente são identifica-das e usadas por métodos descritos aqui para proteínas ou genes de cân-cer. Em particular, essas seqüências e as proteínas codificadas por eles sãousados na marcação ou identificação de células tratadas por agente. Alémdisso, os anticorpos são construídos contra as proteínas induzidas por agen-te e usados para alvejar novos produtos terapêuticos para a amostra de te-cido de câncer tratado.

Ensaios de Triagem e Identificação relacionados a Modulador:

Ensaios relacionados com Expressão de Gene

Proteínas, ácidos nucléicos, e anticorpos da invenção são usa-dos em ensaios de triagem. As proteínas associadas com câncer, anticor-pos, ácidos nucléicos, proteínas modificadas e células contendo essas se-qüências são usadas em ensaios de triagem, tais como triagem do efeito defármacos candidatos em um "perfil de expressão de gene", perfil de expres-são de polipeptídeos ou alteração de função biológica. Em uma modalidade,os perfis de expressão são usados, preferivelmente em conjunto com técni-cas de triagem de produtividade elevada para permitir o monitoramento paragenes de perfil de expressão após tratamento com um agente candidato (porexemplo, Davis, GF, e outro, J Biol Screen 7:69 (2002); Zlokarnik, e outro,Science 279:84-8 (1998); Heid, Genome Res 6:986-94,1996).

As proteínas de câncer, anticorpos, ácidos nucléicos, proteínasmodificadas e células contendo os genes ou proteínas de câncer modifica-das ou naturais são usados em ensaios de triagem. Isto é, a presente inven-ção compreende métodos para triagem para composições que modulam ofenótipo de câncer ou uma função fisiológica de uma proteína de câncer dainvenção. Isto é feito em um gene próprio ou por triagem do efeito de fárma-cos candidatos em um "perfil de expressão de gene" ou função biológica.Em uma modalidade, perfis de expressão são usados, preferivelmente emconjunto com técnicas de triagem de produtividade elevada para permitir omonitoramento após o tratamento com um agente candidato, veja Zlokarnik,supra.

Uma variedade de ensaios são executados direcionados aosgenes e proteínas da invenção. Os ensaios são executados em um nível deproteína ou ácido nucléico individual. Isto é, tendo identificado um gene par-ticular como super-regulado em câncer, compostos teste são avaliadosquanto à capacidade de modular a expressão de gene ou quanto à ligação àproteína de câncer da invenção. "Modulação" neste contexto inclui um au-mento ou uma diminuição em expressão de gene. A quantidade preferida demodulação dependerá da variação original da expressão de gene em tecidosofrendo de câncer versus normal, com variações de pelo menos 10%, pre-ferivelmente 50%, mais preferivelmente 100-300%, e em algumas modalida-des 300-1000% ou mais. Desse modo, se um gene exibe um aumento de 4vezes em tecido de câncer comparado ao tecido normal, uma diminuição decerca de quatro vezes é freqüentemente desejada; similarmente, uma dimi-nuição de 10 vezes em tecido de câncer comparada ao tecido normal, umvalor alvo de um aumento de 10 vezes em expressão pelo composto teste éfreqüentemente desejado. Moduladores que exacerbam o tipo de expressãode gene observada em câncer são também úteis, por exemplo, como umalvo super-regulado em outras análises.

A quantidade de expressão de gene é monitorada empregando-se sondas de ácido nucléico e a quantificação de níveis de expressão degene, ou, alternativamente, um produto de gene próprio é monitorado, porexemplo, através do uso de anticorpos para a proteína de câncer e imuno-ensaios padrão. Técnicas de separação e Proteômicas também provêm aquantificação de expressão.

Monitoramento de Expressão para Identificar Compostos que Modificam aExpressão de Gene

Em uma modalidade, o monitoramento de expressão de gene,isto é, um perfil de expressão, é monitorado simultaneamente em várias en-tidades. Tais perfis tipicamente envolverão um ou mais dos genes da Figura1. Nesta modalidade, por exemplo, sondas de ácido nucléico de câncer sãoligadas aos biochips para detectar e quantificar seqüências de câncer emuma célula particular. Alternativamente, PCR pode ser usado. Desse modo,uma série, por exemplo, cavidades de uma placa de microtítulo, pode serusada com iniciadores aplicados em cavidades desejadas. Uma reação dePCR pode então ser realizada e analisada para cada cavidade.

O monitoramento de expressão é realizado para identificar com-postos que modificam a expressão de uma ou mais seqüências associadasa câncer, por exemplo, uma seqüência de polinucleotídeo apresentada naFigura 1. Geralmente, um modulador teste é adicionado às células antes daanálise. Além disso, as triagens são também fornecidas para identificar a-gentes que modulam o câncer, modulam proteínas de câncer da invenção,ligam-se a uma proteína de câncer da invenção, ou interferem com a ligaçãode uma proteína de câncer da invenção e um anticorpo ou outro parceiro deligação.

Em uma modalidade, métodos de triagem de produtividade ele-vada envolvem o fornecimento de uma biblioteca contendo um grande nú-mero de compostos terapêuticos potenciais (compostos candidato). Tais "bi-bliotecas químicas combinatoriais" são então avaliadas em um ou mais en-saios para identificar aqueles membros da biblioteca (subclasses ou espé-cies químicas particulares) que exibem uma atividade característica deseja-da. Os compostos desse modo identificados podem servir como " compostosde chumbo" convencionais, como compostos para triagem, ou como produ-tos terapêuticos.

Em certas modalidades, bibliotecas combinatoriais de modulado-res potenciais são avaliadas quanto à capacidade de ligar-se a um polipeptí-deo de câncer ou de modular a atividade. Convencionalmente, novas enti-dades químicas com propriedades úteis são geradas por identificação de umcomposto químico (denominado "composto de chumbo") com alguma ativi-dade ou propriedade desejável, por exemplo, atividade de inibição, variantesde criação do composto de chumbo, e triagem da propriedade e atividadedaqueles compostos variantes. Freqüentemente, métodos de triagem daprodutividade elevada (HTS) são empregados para uma tal análise.

Como observado acima, o monitoramento de expressão de geneé convenientemente usado para moduladores candidatos teste (por exem-plo, proteína, ácido nucléico ou molécula pequena). Após o agente candidatoter sido adicionado e as células permitidas incubar durante um período, aamostra contendo uma seqüência alvo a ser analisada é, por exemplo, adi-cionada ao biochip.

Se requerido, a seqüência alvo é preparada empregando-se téc-nicas conhecidas. Por exemplo, uma amostra é tratada para lisar as células,empregando-se tampões de lise conhecidos, eletroporação etc, com purifi-cação e/ou amplificação tal como PCR realizado como apropriado. Por e-xemplo, uma transcrição in vitro com rótulos covalentemente ligados aosnucleotídeos é realizada. Geralmente, os ácidos nucléicos são rotuladoscom PE ou FITC de biotina, ou com cy3 ou cy5.

A seqüência alvo pode ser rotulada com, por exemplo, um fluo-rescente, um quimioluminescente, uma substância química, ou um sinal ra-dioativo, para fornecer um meio de detectar a ligação específica da seqüên-cia alvo a uma sonda. O rótulo também pode ser uma enzima, tal como alca-lino fosfatase ou rábano picante peroxidase, que quando fornecido com umsubstrato apropriado produz um produto que é detectado. Alternativamente,o rótulo é um composto rotulado ou molécula pequena, tal como um inibidorde enzima, que liga, porém não é catalisado ou alterado pela enzima. O rótu-lo também pode ser uma porção ou composto, tal como, um rótulo de epíto-po ou biotina que especificamente se liga a estreptavidina. Para o exemplode biotina, a estreptavidina é rotulada como descrito acima, desse modo,fornecendo um sinal de detectável para a seqüência alvo ligada. A estrepta-vidina rotulada não ligada é tipicamente removida antes da análise.

Como será apreciado por aqueles na técnica, estes ensaios po-dem ser ensaios de hibridação direta ou podem compreender "ensaios desanduíche", que incluem o uso de sondas múltiplas, como geralmente édescrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5. 681.702; 5.597.909;5.545.730; 5.594.117; 5.591.584; 5.571.670; 5.580.731; 5.571.670;5.591.584; 5.624.802; 5.635.352; 5.594.118; 5.359.100; 5.124. 246; e5.681.697. Nesta modalidade, em geral, o ácido nucléico alvo é preparadocomo descrito acima, e então adicionado ao biochip que compreende umapluralidade de sondas de ácido nucléico, sob as condições que permitem aformação de um complexo de hibridação.

Uma variedade de condições de hibridação é empregada napresente invenção, incluindo condições de rigorosidade altas, moderadas ebaixas como descrito acima. Os ensaios geralmente são realizados sob con-dições de rigorosidade que permitem a formação do complexo de hibridaçãode sonda de rótulo somente na presença do alvo. A rigorosidade pode sercontrolada alterando-se um parâmetro da etapa que é uma variável termodi-nâmica, incluindo, porém não limitado a, temperatura, concentração de for-mamida, concentração de sal, pH de concentração de sal caotrópico, con-centração de solvente orgânico, etc. Estes parâmetros também podem serempregados para controlar a ligação não-específica, como geralmente édescrito na Patente dos Estados Unidos No. 5.681.697. Desse modo, podeser desejável realizar certas etapas em condições de rigorosidade mais altaspara reduzir a ligação não-específica.

As reações descritas aqui podem ser realizadas em uma varie-dade de modos. Os componentes da reação podem ser adicionados simul-taneamente, ou seqüencialmente, em ordens diferentes, com as modalida-des preferidas descritas abaixo. Além disso, a reação pode incluir uma vari-edade de outros reagentes. Estes incluem sais, tampões, proteínas neutras,por exemplo, albumina, detergentes, etc. que podem ser empregados parafacilitar a detecção e hibridação ideal, e/ou reduzem as interações não-específicas ou de base. Os reagentes que de outro modo melhoram a efici-ência do ensaio, tal como inibidores de protease, inibidores de nuclease,agentes antimicrobianos, etc, também pode ser empregados como apropri-ado, dependendo dos métodos de preparação de amostra e pureza do alvo.Os dados do ensaio são analisados para determinar os níveis de expressãode genes individuais, e alterações nos níveis de expressão como entre esta-dos, formando um perfil de expressão de gene.

Ensaios Relacionados com a Atividade Biológica

A invenção fornece os métodos para identificar ou avaliar quantoa um composto que modula a atividade de um gene ou proteína relacionadocom câncer da invenção. Os métodos compreendem adicionar um compostode teste, como definido acima, a uma célula que compreende uma proteínade câncer da invenção. As células contêm um ácido nucléico recombinanteque codifica uma proteína de câncer da invenção. Em outra modalidade,uma biblioteca de agentes candidatos é testada em uma pluralidade de célu-las.

Em um aspecto, os ensaios são avaliados na presença ou au-sência ou exposição prévia ou subseqüente de sinais fisiológicos, por exem-plo, hormônios, anticorpos, peptídeos, antígenos, citocinas, fatores de cres-cimento, potenciais de ação, agentes farmacológicos incluindo quimiotera-pêuticos, radiação, carcinogênicos, ou outras células (isto é, contatos de cé-lula-célula). Em outro exemplo, as determinações são feitas em estágios di-ferentes do processo de ciclo da célula. Deste modo, os compostos que mo-dulam genes ou proteínas da invenção são identificados. Os compostos comatividade farmacológica são capazes de realçar ou interferir com a atividadeda proteína de câncer da invenção. Uma vez identificadas, estruturas simila-res são avaliadas para identificar as características estruturais críticas docomposto.

Em uma modalidade, um método para modular (por exemplo,inibir) a divisão de célula de câncer é fornecido; o método compreende aadministração de um modulador de câncer. Em outra modalidade, um méto-do de modulação (por exemplo, inibir) o câncer é fornecido; o método com-preende a administração de um modulador de câncer. Em uma outra moda-lidade, os métodos para tratar células ou indivíduos com câncer são forneci-dos; método compreende a administração de um modulador de câncer.

Em uma modalidade, um método para modular o estado de umacélula que expressa um gene da invenção é fornecido. Como empregadoaqui, o estado compreende tais parâmetros aceitos pela técnica tal comocrescimento, proliferação, sobrevivência, função, apoptose, senescência,local, atividade enzimática, transdução de sinal, etc. de uma célula. Em umamodalidade, um inibidor de câncer é um anticorpo como descrito acima. Emoutra modalidade, o inibidor de câncer é uma molécula de anti-sentido. Umavariedade de ensaios de crescimento, proliferação, e metástase de célula éconhecida por aqueles versados na técnica, como descrito aqui.

Triagem de Produção Elevada para Identificar os Moduladores

Os ensaios para identificar os moduladores adequados são res-ponsáveis pela triagem de produção elevada. Os ensaios preferidos dessemodo, detectam o realce ou inibição de transcrição de gene de câncer, inibi-ção ou realce de expressão de polipeptídeo, e inibição ou realce de atividadede polipeptídeo.

Em uma modalidade, os moduladores avaliados em métodos detriagem de produção elevada são proteínas, geralmente proteínas de ocor-rência natural ou fragmentos de proteínas de ocorrência natural. Desse mo-do, por exemplo, extratos celulares que contêm proteínas, ou digestos alea-tórios ou de extratos celulares proteináceos, são empregados. Deste modo,as bibliotecas de proteínas são feitas para triagem nos métodos da inven-ção. Particularmente preferidas nesta modalidade são as bibliotecas de pro-teínas bacterianas, fúngicas, viróticas, e mamíferas, com a última sendo pre-ferida, e proteínas humanas que são especialmente preferidas. Os compos-tos de teste particularmente úteis serão direcionados à classe de proteínasas quais o alvo pertence, por exemplo, substratos para enzimas, ou ligandose receptores.

Uso de Crescimento de Ágar Macio e Formação de Colônia para Identificar eCaracterizar os Moduladores

As células normais requerem um substrato sólido para se unir ecrescer. Quando as células são transformadas, elas perdem este fenótipo ecrescem separadas do substrato. Por exemplo, as células transformadaspodem crescer em cultura de suspensão agitada ou suspensa em meio se-mi-sólido, tal como ágar semi-sólido ou macio. As células transformadas,quando transfectadas com genes supressores de tumor, podem regenerar ofenótipo normal e mais uma vez requerer um substrato sólido para se unir ecrescer. O crescimento de ágar macio ou formação de colônia em ensaiossão empregados para identificar os moduladores de seqüências de câncer,que quando expressadas em células hospedeiras, inibem a transformação eproliferação celular anormal. Um modulador reduz ou elimina a capacidadedas células hospedeiras crescerem suspensas em meios sólidos ou semi-sólidos, tal como ágar.

As técnicas para crescimento de ágar macio ou formação decolônia em ensaios de suspensão são descritas em Freshney, Culture ofAnimal Cells a Manual of Basic Technique (3a edição, 1994). Veja também, aseção de métodos de Garkavtsev e outros (1996), supra.

Triagem da Limitação de Densidade de Crescimento e Inibicão de Contatopara Identificar e Caracterizar os Moduladores

As células normais tipicamente crescem em um padrão plano eorganizado em cultura de célula até que elas toquem outras células. Quandoas células tocam uma à outra, elas são inibidas de contato e param de cres-cer. As células transformadas, entretanto, não são inibidas de contato e con-tinuam a crescer a densidades elevadas em focos desorganizados. Dessemodo, as células transformadas crescem a uma densidade de saturaçãomais elevada do que as células normais correspondentes. Isto é detectadomorfologicamente pela formação de uma monocamada desorientada de cé-lulas ou células em focos. Alternativamente, o índice de rotulação com (3H)-timidina em densidade de saturação é empregado para medir a limitação dedensidade do crescimento, similarmente um MTT ou ensaio Alamar azul re-velará a capacidade de proliferação de células e a capacidade de modulado-res afetarem as mesmas. Veja Freshney (1994), supra. As células transfor-madas, quando transfectadas com genes supressores de tumor, podem re-generar um fenótipo normal e se tornarem inibidas de contato e cresceriam auma densidade mais baixa.

Neste ensaio, o índice de rotulação com (3H)-timidina a densida-de de saturação é um método preferido de medir a limitação de densidadede crescimento. As células hospedeiras transformadas são transfectadascom uma seqüência associada ao câncer, e são crescidas durante 24 horasa densidade de saturação em condições de meios não-limitantes. A porcen-tagem de células que rotulam com (3H)-timidina é determinada através decpm incorporado.

O crescimento independente do contato é empregado para iden-tificar moduladores de seqüências de câncer, que levaram à proliferação etransformação celular anormal. Um modulador reduz ou elimina crescimentoindependente do contato, e retorna as células a um fenótipo normal.Triagem de Fator de Crescimento ou Dependência de Soro para Identificar eCaracterizar os Moduladores

As células transformadas têm dependência de soro mais baixado que suas contrapartes normais (veja, por exemplo, Temin, J., Natl. Cân-cer Inst. 37:167-175 (1966); Eagle e outros, J., Exp. Med 131:836-879(1970)); Freshney, supra. Isto é, em parte, devido à liberação de vários fato-res de crescimento pelas células transformadas. O grau de dependência desoro ou de fator de crescimento de células hospedeiras transformadas podeser comparado com aquele de controle. Por exemplo, a dependência de soroou de fator de crescimento de uma célula é monitorada em métodos paraidentificar e caracterizar os compostos que modulam as seqüências associ-adas ao câncer da invenção.

Uso de Níveis de Marcador Específico de Tumor para Identificar e Caracterizar os Moduladores

As células de tumor liberam uma quantidade aumentada de cer-tos fatores (a seguir "marcadores específicos de tumor") do que suas con-trapartes normais. Por exemplo, ativador de plasminogênio (PA) é libertadode glioma humano a um nível mais alto do que de células cerebrais normais(veja, por exemplo, Gullino, Angiogenese, Tumor Vascularization, e PotentialInterference with Tumor Growth, in Biological Responses in Câncer, pp. 178-184 (Mihich (ed). 1985)). Similarmente, o Fator de Angiogenese de Tumor(TAF) é liberado a um nível mais alto em células de tumor do que suas con-trapartes normais. Veja, por exemplo, Folkman, Angiogenesis and Câncer,Sem. Câncer Biol. (1992)), ao mesmo tempo em que bFGF é liberado detumores endoteliais (Ensoli, B e outros).

Várias técnicas que medem a liberação destes fatores são des-critas em Freshney (1994), supra. Também, veja, Unkless e outros, J., Biol.Chem. 249:4295-4305 (1974); Strickland & Beers, J., Biol. Chem. 251:5694-5702 (1976); Whur e outros, Br. J. Câncer 42:305 312 (1980); Gullino, Angi-ogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with TumorGrowth, em Biological Responses in Câncer, pp. 178-184 (Mihich (ed).1985); Freshney, Anticancer Res. 5:111-130 (1985). Por exemplo, os níveisdo marcador específico de tumor são monitorados em métodos para identifi-car e caracterizar os compostos que modulam as seqüências associadas aocâncer da invenção.

Invasividade em Matrigel para Identificar e Caracterizar os Moduladores

O grau de invasividade em Matrigel ou um constituinte de matrizextracelular pode ser empregado como um ensaio para identificar e caracte-rizar os compostos que modulam as seqüências associadas ao câncer. Ascélulas de tumor exibem uma correlação positiva entre malignidade e invasi-vidade de células em Matrigel ou algum outro constituinte de matriz extrace-lular. Neste ensaio, as células tumorigênicas são tipicamente empregadascomo células hospedeiras. A expressão de um gene supressor de tumornestas células hospedeiras diminuiria a invasividade das células hospedei-ras. As técnicas descritas em Câncer Res. 1999; 59:6010; Freshney (1994),supra, podem ser empregadas. Brevemente, o nível de invasão de célulashospedeiras é medido empregando-se filtros revestidos com Matrigel ou al-gum outro constituinte de matriz extracelular. A penetração dentro do gel, ouatravés do lado distai do filtro, é avaliada como invasividade, e histologica-mente avaliada pelo número de células e distância movida, ou por pré-rotulação das células com 125l e contagem da radioatividade no lado distai dofiltro ou fundo do prato. Veja, por exemplo, Freshney (1984), supra.

Triagem do Crescimento de Tumor In Vivo para Identificar e Caracterizar osModuladores

Os efeitos de seqüências associadas ao câncer em crescimentode célula são testados em organismos transgênicos ou imunossuprimidos.

Os organismos transgênicos são preparados em uma variedade de modosaceitos na técnica. Por exemplo, os organismos transgênicos de nocaute,por exemplo, mamíferos tais como camundongos, são feitos, nos quais umgene de câncer é rompido ou nos quais um gene de câncer é inserido. Oscamundongos transgênicos de nocaute são feitos por inserção de um genemarcador ou outro gene heterólogo no sítio do gene de câncer endógeno nogenoma do camundongo por recombinação homóloga. Tais camundongostambém podem ser feitos substituindo-se o gene de câncer endógeno comuma versão mutada do gene de câncer, ou por mutação do gene de câncerendógeno, por exemplo, por exposição aos carcinógenos.

Para preparar os animais quiméricos transgênicos, por exemplo,camundongos, uma constructo de DNA é introduzido nos núcleos de células-tronco embriônicas. As células que contêm a lesão genética recentementecriada são injetadas em um embrião de camundongo hospedeiro, que é re-implantado em uma fêmea recipiente. Alguns destes embriões se desenvol-vem em camundongos quiméricos que possuem células de germe algumasdas quais são derivadas da linha de célula mutante. Então, criando-se oscamundongos quiméricos é possível obter uma nova linhagem de camun-dongos que contêm a lesão genética introduzida (veja, por exemplo, Capec-chi e outros, Science 244:1288 (1989)). Os camundongos quiméricos podemser derivados de acordo com a Patentes dos Estados Unidos 6.365.797, e-mitida em 2 de abril de 2002; Patente dos Estados Unidos 6.107.540 emitidaem 22 de agosto de 2000; Hogan e outros, Manipulating the Mouse Embryo:A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) e Teratocarci-nomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRLPress, Washington, D.C., (1987).

Alternativamente, vários animais hospedeiros imuno-deficientesou imunossuprimidos podem ser empregados. Por exemplo, um "camun-dongo nu" geneticamente atímico (veja, por exemplo, Giovanella e outros, J.,Natl. Câncer Inst. 52:921 (1974)), um camundongo SCID, um camundongotimectomizado, ou um camundongo irradiado (veja, por exemplo, Bradley eoutros, Br. J. Câncer 38:263 (1978); Selby e outros, Br. J. Câncer 41:52(1980)) podem ser empregados como um hospedeiro. As células transplan-táveis de tumor (tipicamente cerca de, 106 células) injetadas em hospedeirosisogênicos produzem tumores invasivos em uma proporção elevada de ca-sos, ao mesmo tempo em que as células normais de origem similar não pro-duzem. Em hospedeiros que desenvolveram tumores invasivos, as célulasque expressam seqüências associadas ao câncer são subcutaneamente ouortotopicamente injetadas. Os camundongos são então separados em gru-pos, incluindo grupos de controle e grupos experimentais tratados (por e-xemplo, tratado com um modulador). Após uma duração adequada de tem-po, preferivelmente 4-8 semanas, o crescimento do tumor é medido (por e-xemplo, em volume ou por suas duas dimensões maiores, ou peso) e com-parado ao controle. Os tumores que têm redução estatisticamente significan-te (empregando, por exemplo, o teste T de Student) são ditos terem cresci-mento inibido.

Ensaios In Vitro para Identificar e Caracterizar os Moduladores

Os ensaios para identificar os compostos com atividade de mo-dulação podem ser realizados in vitro. Por exemplo, um polipeptídeo de cân-cer é primeiro contatado com um modulador potencial e incubado duranteuma quantidade adequada de tempo, por exemplo, de 0,5 a 48 horas. Emuma modalidade, os níveis de polipeptídeo de câncer são determinados invitro medindo-se o nível de proteína ou mRNA. O nível de proteína é medidoempregando imunoensaios tal como western blotting, ELISA e outros comum anticorpo que seletivamente se liga ao polipeptídeo de câncer ou umfragmento deste. Para medição de mRNA, amplificação, por exemplo, em-pregando ensaios de PCR, LCR, ou hibridização, por exemplo, Hibridizaçãodo norte, a proteção de RNAse, manchamento de ponto, são preferidos. Onível de proteína ou mRNA é detectado empregando agentes de detecçãoindiretamente ou diretamente rotulados, por exemplo, ácidos nucléicos fluo-rescentemente ou radioativamente rotulados, anticorpos radioativamente ouenzimaticamente rotulados, e outros, como descrito aqui.

Alternativamente, um sistema de gene repórter pode ser plane-jado empregando um promotor de proteína de câncer operavelmente unido aum gene repórter tal como luciferase, proteína fluorescente verde, CAT, ouP-gal. O constructo repórter é tipicamente transfectada em uma célula. Apóso tratamento com um modulador potencial, a quantidade de transcrição degene repórter, translação, ou atividade é medida de acordo com as técnicaspadrões conhecidas por aqueles versados na técnica (Davis GF, supra;Gonzalez, J., & Negulescu, P., Curr. Opin. Biotechnol. 1998: 9:624).

Como descrito acima, as triagens in vitro são feitas em genesindividuais e produtos de gene. Isto é, depois de ter identificado um genediferencialmente expressado particular como importante em um estado parti-cular, a triagem de moduladores da expressão do gene ou o próprio produtode gene é realizada.

Em uma modalidade, a triagem para moduladores de expressãode gene(s) específico é realizada. Tipicamente, a expressão de somente umou alguns genes é avaliada. Em outra modalidade, as triagens são designa-das para primeiro encontrar os compostos que se ligam às proteínas dife-rencialmente expressadas. Estes compostos são então avaliados quanto àcapacidade de modular a atividade diferencialmente expressada. Além dis-so, uma vez que os compostos candidatos iniciais são identificados, as vari-antes podem ser também avaliadas para melhor avaliar as relações de ativi-dade da estrutura.

Ensaios de Ligação para Identificar e Caracterizar os Moduladores

Nos ensaios de ligação de acordo com a invenção, um produtode gene purificado ou isolado da invenção é geralmente empregado. Porexemplo, os anticorpos são gerados para uma proteína da invenção, e osimunoensaios são executados para determinar o local e/ou quantidade deproteína. Alternativamente, as células que compreendem as proteínas decâncer são empregadas nos ensaios.

Desse modo, os métodos compreendem combinar uma proteínade câncer da invenção e um composto candidato tal como um ligando, e de-terminar a ligação do composto à proteína de câncer da invenção. As moda-lidades preferidas utilizam a proteína de câncer humana; modelos animaisde doença humana podem também ser desenvolvido e são empregados.

Além disso, outras proteínas de mamífero análogas também podem ser em-pregadas quando apreciado por aqueles versados na técnica. Além disso,em algumas modalidades, as proteínas de câncer variantes de ou derivadassão empregadas.

Geralmente, a proteína de câncer da invenção, ou o ligando, énão difundivelmente ligado a um suporte insolúvel. O suporte pode, por e-xemplo, ser um tendo áreas receptoras de amostra isoladas (um placa demicrotítulo, uma disposição, etc).. Os suportes insolúveis podem ser feitosde qualquer composição a qual as composições podem estar ligadas, é fa-cilmente separado de material solúvel, e é de outro modo, compatível com ométodo total de triagem. A superfície de tal suporte pode ser sólida ou poro-sa e de qualquer forma conveniente.

Os exemplos de suportes insolúveis adequados incluem placasde microtítulo, disposições, membranas e contas. Estes são feitos tipicamen-te de vidro, plástico (por exemplo, poliestireno), polissacarídeo, náilon, nitro-celulose, ou Teflon®, etc. As placas de microtítulo e ordens são especialmen-te convenientes porque um número grande de ensaios pode ser realizadosimultaneamente, ao mesmo tempo em que empregando quantidades pe-quenas de reagentes e amostras. A maneira particular de ligação da compo-sição ao suporte não é crucial contanto que seja compatível com os reagen-tes e métodos totais da invenção, mantenha a atividade da composição eseja não difundível. Os métodos preferidos de ligação incluem o uso de anti-corpos que não estericamente bloqueiam ou o sítio de ligação do ligando oua seqüência de ativação ao prender a proteína ao suporte, ligação direta aossuportes iônicos ou "aderentes", reticulação química, síntese da proteína ouagente na superfície, etc. Seguinte a ligação da proteína ou ligando/agentede ligação ao suporte, o material não ligado em excesso é removido por la-vagem. As áreas receptoras da amostra podem então ser bloqueadas porincubação com albumina de soro bovina (BSA), caseína ou outra proteínainócua ou outro fração.

Uma vez uma proteína de câncer da invenção é ligada ao supor-te, e um composto de teste é adicionado ao ensaio. Alternativamente, o a-gente de ligação candidato é ligado ao suporte e a proteína de câncer dainvenção é então adicionada. Os agentes de ligação incluem anticorpos es-pecíficos, agentes de ligação não-naturais identificados nas triagens de bi-bliotecas químicas, análogos de peptídeo, etc.

De interesse particular são os ensaios para identificar os agen-tes que têm uma baixa toxicidade para células humanas. Uma ampla varie-dade de ensaios pode ser empregada para este propósito, incluindo ensaiosde proliferação, ensaios de AMPc, ensaios de ligação de proteína-proteína invitro rotulados, ensaios de troca de motilidade electroforética, imunoensaiospara ligação de proteína, ensaios funcionais (ensaios de fosforilação, etc), eoutros.

Uma determinação da ligação do composto de teste (ligando,agente de ligação, modulador, etc), a uma proteína de câncer da invençãopode ser feita de vários modos. O composto de teste pode ser rotulado, e aligação determinada diretamente, por exemplo, prendendo-se toda ou umaporção da proteína de câncer da invenção a um suporte sólido, adicionandoum composto candidato rotulado (por exemplo, um rótulo fluorescente), la-vagem do reagente em excesso, e determinando se o rótulo está presenteno suporte sólido. Várias etapas de lavagem e bloqueio podem ser utilizadascomo apropriado.

Em certas modalidades, somente um dos componentes é rotula-do, por exemplo, uma proteína da invenção ou ligandos rotulados. Alternati-vamente, mais do que um componente é rotulado com rótulos diferentes, porexemplo, I125, para as proteínas e um fluorofor para o composto. Os reagen-tes de proximidade, por exemplo, reagentes de transferência de energia eextinção também são úteis.

Ligação Competitiva para Identificar e Caracterizar os Moduladores

Em uma modalidade, a ligação do "composto de teste" é deter-minada através de ensaio de ligação competitivo com um "competidor". Ocompetidor é uma porção de ligação que se liga à molécula alvo (por exem-plo, uma proteína de câncer da invenção). Os competidores incluem com-postos tais como anticorpos, peptídeos, pares de ligação, ligandos, etc. Sobcertas circunstâncias, a ligação competitiva entre o composto de teste e ocompetidor desloca o composto de teste. Em uma modalidade, o compostode teste é rotulado. Ou o composto de teste, o competidor, ou ambos, é adi-cionado à proteína durante um tempo suficiente para permitir a ligação. Asincubações são realizadas a uma temperatura que facilita a atividade ideal,tipicamente entre quatro e 40°C. Os períodos de incubação são tipicamenteotimizados, por exemplo, para facilitar a triagem da produção elevada rápida;tipicamente entre zero e uma hora serão suficientes. Reagente em excessoé geralmente removido e lavado. O segundo componente é então adiciona-do, e a presença ou ausência do componente rotulado é seguida, para indi-car ligação.

Em uma modalidade, o competidor é adicionado primeiro, segui-do pelo composto de teste. O deslocamento do competidor é uma indicaçãoque o composto de teste está ligando-se à proteína de câncer e desse modoé capaz de se ligar a, e potencialmente modular, a atividade da proteína decâncer. Nesta modalidade, qualquer componente pode ser rotulado. Dessemodo, por exemplo, se o competidor estiver rotulado, uma presença de rótu-lo na solução de lavagem de composto pós-teste indica deslocamento pelocomposto de teste. Alternativamente, se o composto de teste está rotulado,uma presença do rótulo no suporte indica deslocamento.

Em uma modalidade alternativa, o composto de teste é adicio-nado primeiro, com incubação e lavagem, seguido pelo competidor. A au-sência de ligação pelo competidor indica que o composto de teste se liga àproteína de câncer com afinidade mais elevada do que o competidor. Dessemodo, se o composto de teste está rotulado, uma presença do rótulo no su-porte, juntou com uma falta de ligação do competidor, indica que o compostode teste se liga a e desse modo potencialmente modula a proteína de câncerda invenção.

Conseqüentemente, os métodos de ligação competitivos com-preendem triagem diferencial para identificar os agentes que são capazes demodular a atividade das proteínas de câncer da invenção. Nesta modalida-de, os métodos compreendem combinar uma proteína de câncer e um com-petidor em uma primeira amostra. Uma segunda amostra compreende umcomposto de teste, a proteína de câncer, e um competidor. A ligação docompetidor é determinada para ambas as amostras, e uma alteração, oudiferencia na ligação entre as duas amostras indica a presença de um agen-te capaz de se ligar à proteína de câncer e potencialmente modular sua ati-vidade. Isto é, se a ligação do competidor é diferente na segunda amostrarelativo à primeira amostra, o agente é capaz de ligação à proteína de cân-cer.

Alternativamente, a triagem diferencial é empregada para identi-ficar os candidatos de fármaco que se ligam à proteína de câncer nativa,porém não podem se ligar às proteínas de câncer modificadas. Por exemplo,a estrutura da proteína de câncer é modelada e empregada em desígnio defármaco racional para sintetizar os agentes que interagem com aquele local,os agentes que geralmente não se ligam às proteínas modificadas no local.Além disso, tais candidatos de fármaco que afetam a atividade de uma pro-teína de câncer nativa também são identificados avaliando-se os fármacosquanto à capacidade ou de realçar ou reduzir a atividade de tais proteínas.

Os controles positivos e controles negativos podem ser empre-gados nos ensaios. Preferivelmente as amostras de controle e teste são rea-lizadas pelo menos em triplicata para obter resultados estatisticamente signi-ficantes. A incubação de todas as amostras ocorre durante um tempo sufici-ente para permitir a ligação do agente à proteína. Seguinte à incubação, asamostras são lavadas livres de material não especificamente ligado e aquantidade de agente geralmente rotulado ligado, determinada. Por exem-plo, onde um radiorrótulo é empregado, as amostras podem ser contadasem um contador de cintilação para determinar a quantidade de compostoligado.

Uma variedade de outros reagentes pode ser incluída nos en-saios de triagem. Estes incluem reagentes como sais, proteínas neutras, porexemplo, albumina, detergentes, etc. que são empregados para facilitar aligação de proteína-proteína ideal e/ou reduzir as interações de base ou não-específicas. Também os reagentes que de outro modo melhoram a eficiênciado ensaio, tal como inibidores de protease, inibidores de nuclease, agentesantimicrobianos, etc, podem ser empregados. A mistura de componentes éadicionada em uma ordem que forneça a ligação requerida.

Uso de Polinucleotídeos para Infra-Reqular ou Inibir uma Proteína da Invenção.

Os moduladores de polinucleotídeo de câncer podem ser intro-duzidos em uma célula que contém a seqüência de nucleotido alvo atravésde formação de um conjugado com uma molécula de ligação de ligando,como descrito no WO 91/04753. As moléculas de ligação de ligando ade-quadas incluem, porém não estão limitados aos receptores de superfície decélula, fatores de crescimento, outras citocinas, ou outros ligandos que seligam aos receptores de superfície de célula. Preferivelmente, a conjugaçãoda molécula de ligação de ligando substancialmente não interfere com a ca-pacidade da molécula de ligação de ligando se ligar ao seu receptor ou mo-lécula correspondente, ou entrada de bloco do oligonucleotídeo de sentidoou anti-sentido ou sua versão conjugada na célula. Alternativamente, ummodulador de polinucleotídeo de um de câncer pode ser introduzido em umacélula que contém a seqüência de ácido nucléico alvo, por exemplo, por for-mação de um complexo de polinucleotídeo-lipídio, como descrito no WO90/10448. É entendido que o uso de moléculas de anti-sentido ou modelosde neutralização e ativação também possam ser empregados nos ensaiosde triagem como descrito acima, além dos métodos de tratamento.Nucleotídeos de Anti-sentido e InibidoresEm certas modalidades, a atividade de uma proteína associadaao câncer é infra-regulada, ou completamente inibida, pelo uso de polinucle-otídeo de anti-sentido ou RNA nuclear pequeno inibidor (snRNA), isto é, umácido nucléico complementar a, e que pode preferivelmente hibridizar espe-cificamente para, uma seqüência de ácido nucléico de mRNA de codificação,por exemplo, uma proteína de câncer da invenção, mRNA, ou uma subse-qüência desta. A ligação do polinucleotídeo de anti-sentido ao mRNA reduza estabilidade e/ou translação do mRNA.

No contexto desta invenção, os polinucleotídeos de anti-sentidopodem compreender nucleotídeos de ocorrência natural, ou espécies sintéti-cas formadas de subunidades de ocorrência natural ou seus homólogos pró-ximos. Os polinucleotídeos de anti-sentido também podem ter porções deaçúcar alteradas ou ligações inter-açúcar. Exemplares entre estes são osfosforotioato e outras espécies que contêm enxofre que são conhecidas pelouso na técnica. Os análogos são compreendidos por esta invenção contantoque eles funcionem efetivamente para hibridizar com nucleotídeos da inven-ção. Veja, por exemplo, Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc.,Natick, MA.

Tais polinucleotídeos de anti-sentido podem ser facilmente sinte-tizados empregando meios recombinantes, ou podem ser sintetizados in vi-tro. O equipamento para tal síntese é vendido por vários vendedores, inclu-indo Applied Biosystems. A preparação de outros oligonucleotídeos tal comofosforotioatos e derivados alquilados também é bem conhecida por aquelesversados na técnica.

As moléculas de anti-sentido como empregado aqui, incluemoligonucleotídeos de anti-sentido ou sentido. Os oligonucleotídeos de senti-do podem, por exemplo, ser empregado para bloquear a transcrição ligando-se à cepa de anti-sentido. O oligonucleotídeo de anti-sentido e sentido com-preende uma seqüência de ácido nucléico de filamento único (RNA ou DNA)capaz de ligação às seqüências de mRNA (sentido) ou DNA (anti-sentido)alvo para moléculas de câncer. Os oligonucleotídeos de anti-sentido ou sen-tido, de acordo com a presente invenção, compreendem um fragmento degeralmente pelo menos cerca de 12 nucleotídeos, preferivelmente de cercade 12 a 30 nucleotídeos. A capacidade de derivar um oligonucleotídeo deanti-sentido ou sentido, com base em uma seqüência de cDNA que codificauma determinada proteína é descrita em, por exemplo, Stein &Cohen (Cân-cer Res. 48:2659 (1988 e van der Krol e outros. (BioTechniques 6:958(1988)).

Ribozimas

Além de polinucleotídeos de anti-sentido, as ribozimas podemser empregadas para alvejar e inibir a transcrição de seqüências de nucleo-tido associadas ao câncer. Uma ribozima é uma molécula de RNA que cata-liticamente cliva outras moléculas de RNA. Tipos diferentes de ribozimasforam descritos, incluindo ribozimas do grupo I, ribozimas de cabeça de mar-telo, ribozimas de grampo, RNase P, e ribozimas axhead (veja, por exemplo,Castanotto e outros, Adv. em Pharmacology 25: 289-317 (1994) para umarevisão geral das propriedades de ribozimas diferentes).

As características gerais de ribozimas de grampo são descritas,por exemplo, em Hampel e outros, Nucl. Acids Res. 18:299-304 (1990); Pu-blicação de Patente Européia No. 0360257; Patente dos Estados Unidos No.5.254.678. Os métodos de preparação são bem conhecidos por aqueles ver-sados na técnica (veja, por exemplo, WO 94/26877; Ojwang e outros, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:6340-6344 (1993); Yamada e outros, Human GeneTherapy 1:39-45 (1994); Leavitt e outros, Proc. Natl. Acad Sei. USA 92:699 -703(1995);

Leavitt e outros, Human Gene Therapy 5: 1151-120 (1994); eYamada e outros, Virology 205: 121-126 (1994)).

Uso de Moduladores em Triagem Fenotípica

Em uma modalidade, um composto de teste é administrado auma população de células de câncer que tem um perfil de expressão decâncer associado. Por "administração" ou "contatação" aqui é significadoque o modulador é adicionado às células de tal maneira de modo a permitirque o modulador atue na célula, ou por captação e ação intracelular, ou poração na superfície da célula. Em algumas modalidades, um ácido nucléicoque codifica um agente proteináceo (isto é, um peptídeo) é posto em umconstructo viral, tal como um constructo adenoviral ou retroviral, e adiciona-do à célula, tal que a expressão do agente de peptídeo seja realizada, porexemplo, PCT US97/01019. Os sistemas reguláveis de terapia de gene,também podem ser empregados. Uma vez que o modulador foi administradoàs células, as células são lavadas se desejado e são permitidas incubar sobcondições preferivelmente fisiológicas durante algum período. As células sãoentão colhidas e um novo perfil de expressão de gene é gerado. Desse mo-do, por exemplo, o tecido de câncer é avaliado quanto aos agentes que mo-dulam, por exemplo, induzem ou suprimem o fenótipo de câncer. Uma mu-dança em pelo menos um gene, preferivelmente muitos, do perfil de expres-são indica que o agente tem um efeito sobre a atividade de câncer. Similar-mente, a alteração de uma função biológica ou uma via de sinalização é in-dicativo de atividade moduladora. Ao definir tal assinatura para o fenótipo decâncer, as triagens quanto aos novos fármacos que alteram o fenótipo sãoplanejadas. Com esta abordagem, o alvo de fármaco não necessita ser co-nhecido e não necessita ser representado na plataforma de triagem de ex-pressão de gene/proteína original, nem o nível de transcrição para a proteínaalvo precisa alterar. O modulador que inibe a função servirá como um mar-cador substituto.

Como descrito acima, as triagens são feitas para avaliar os ge-nes ou produtos de gene. Isto é, depois de ter identificado um gene diferen-cialmente expressado particular como importante em um estado particular, atriagem dos moduladores ou da expressão do gene ou do próprio produto degene é realizada.

Uso de Moduladores para Afetar os Peptídeos da Invenção

As medições da atividade de polipeptídeo de câncer, ou do fenó-tipo de câncer são realizadas empregando uma variedade de ensaios. Porexemplo, os efeitos de moduladores na função de um polipeptídeo(s) decâncer são medidos examinando-se os parâmetros descritos acima. Umaalteração fisiológica que afeta a atividade é empregada para avaliar a influ-ência de um composto de teste no polipeptídeo desta invenção. Quando osresultados funcionais são determinados empregando células intactas ou a-nimais, uma variedade de efeitos pode ser avaliada tal como, no caso de umcâncer associado com tumores sólidos, crescimento de tumor, metástase detumor, neovascularição, liberação de hormônio, alterações transcricionaispara ambos marcadores genéticos conhecidos e não caracterizados (porexemplo, através de manchas do Norte), alterações no metabolismo de célu-la tal como crescimento de célula ou alterações do pH, e alterações nosmensageiros secundários intracelulares tal como cGNIP.

Métodos de Identificação e Caracterização de Seqüências Associadas aoCâncer

A expressão de várias seqüências de gene está correlacionadacom o câncer. Conseqüentemente, os distúrbios com base em genes decâncer variantes ou mutantes são determinados. Em uma modalidade, a in-venção fornece métodos para identificar as células que contêm genes decâncer variantes, por exemplo, determinando a presença, toda ou parte, daseqüência de pelo menos um gene de câncer endógeno em uma cela. Isto éconcluído empregando qualquer número de técnicas de seqüenciamento. Ainvenção compreende métodos para identificar o genótipo de câncer de umindivíduo, por exemplo, determinando toda ou parte da seqüência de pelomenos um gene da invenção no indivíduo. Isto é geralmente feito em pelomenos um tecido do indivíduo, por exemplo, um tecido apresentado na Ta-bela I, e pode incluir a triagem de vários tecidos ou amostras diferentes domesmo tecido. O método pode incluir comparar a seqüência do gene se-qüenciado com um gene de câncer conhecido, isto é, um gene tipo silvestrepara determinar a presença os membros familiares, homologias, mutaçõesou variantes. A seqüência de todo ou parte do gene pode então ser compa-rada com a seqüência de um gene de câncer conhecido para determinar sequalquer diferença existe. Isto é feito empregando qualquer número de pro-grama de homologia conhecido, tal como BLAST, Bestfit, etc. A presença deuma diferença na seqüência entre o gene de câncer do paciente e o gene decâncer conhecido se correlaciona com um estado de doença ou uma ten-dência a um estado de doença, como descrito aqui.Em uma modalidade preferida, os genes de câncer são empre-gados como sondas para determinar o número de cópias do gene de câncerno genoma. Os genes de câncer são empregados como sondas para deter-minar a localização cromossômica dos genes de câncer. A informação talcomo localização cromossômica encontra uso no fornecimento de uma diag-nose ou prognose em particular quando as anormalidades cromossômicastal como translocações, e outros são identificados no lugar de gene de cân-cer.

XIIO. RNAi e Uso Terapêutico de RNA de Interferência Pequeno (siRNAs)

A presente invenção também está também voltada para oligonu-cleotídeos de siRNA, particularmente RN As de filamento duplo abrangendopelo menos um fragmento da região de codificação 161P2F10B ou regiões5" UTR, ou complemento, ou qualquer oligonucleotídeo de anti-sentido es-pecífico para a seqüência 161P2F10B. Em uma modalidade tais oligonucleo-tídeos são empregados para elucidar uma função de 161P2F10B, ou sãoempregados para examinar ou avaliar os moduladores de expressão ou fun-ção de 161P2F10B. Em outra modalidade, a expressão de gene de161P2F10B é reduzida empregando-se transfecção de siRNA e resulta emcapacidade proliferativa significantemente diminuída de células de câncertransformadas que endogenomente expressam o antígeno; as células trata-das com siRNAs de 161P2F10B específico mostram sobrevivência reduzidaquando medida, por exemplo, por uma leitura de dados metabólicos de viabi-lidade da célula, correlacionando-se com a capacidade proliferativa reduzida.Desse modo as composições de siRNA de 161P2F10B compreendem siR-NA (RNA-de filamento duplo) que correspondem à seqüência de ORF deácido nucléico da proteína 161P2F10B ou subseqüências desta; estas sub-seqüências geralmente são 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35 ou mais doque 35 nucleotídeos de RNA contíguos em comprimento e contêm seqüên-cias que são complementares e não complementares a pelo menos umaporção da seqüência de codificação de mRNA. Em uma modalidade preferi-da, as subseqüências são 19-25 nucleotídeos em comprimento, mais prefe-rivelmente 21-23 nucleotídeos em comprimento.

A interferência de RNA é uma nova abordagem para silenciar osgenes in vitro e in vivo, desse modo os RN As de filamento duplo pequenos(siRNAs) são agentes terapêuticos valiosos. O poder de siRNAs de silenciaras atividades de gene específicas atualmente tem sido levada para modelosde animais de doença e é empregado em seres humanos também. Por e-xemplo, a infusão hidrodinâmica de uma solução de siRNA em um camun-dongo com um siRNA contra um alvo particular foi provada ser terapeutica-mente efetiva.

O trabalho pioneiro de Song e outros, indica que um tipo de áci-do nucleico completamente natural, RNAs de interferência pequenos (siR-NAs), serviu como agentes terapêuticos mesmo sem modificação químicaadicional (Song, E., e outros "RNA interference targeting Fas protects micefrom fulminant hepatitis" Nat. Med. 9(3): 347-51(2003)). Este trabalho forne-ceu a primeira evidência in vivo que a infusão de siRNAs em um animal pu-desse aliviar a doença. Neste caso, os autores deram injeções aos camun-dongos de siRNA designado para silenciar a proteína de FAS (um receptorde morte de célula que quando sobre-ativado durante a resposta inflamatoriainduz hepatócitos e outras células a morte). No dia seguinte, aos animais foidado um anticorpo específico para Fas. Os camundongos de controle morre-ram de insuficiência renal aguda dentro de alguns dias, ao mesmo tempo emque mais de 80% dos camundongos tratados com siRNA permaneceramlivres de doenças sérias e sobreviveram. Cerca de 80% a 90% de suas célu-las do fígado incorporaram oligonucleotídeos de siRNA nus. Além disso, asmoléculas de RNA funcionaram durante 10 dias antes de perder o efeito a-pós 3 semanas.

Para uso em terapia humana, siRNA é liberado por sistemaseficientes que induzem a atividade de RNAi duradoura. Uma advertênciaprincipal para uso clínico é a liberação de siRNAs para as células apropria-das. Os hepatócitos parecem ser particularmente receptivos a RNA exóge-no. Hoje, os alvos localizados no fígado são atraentes porque o fígado é umórgão que pode ser facilmente alvejado por moléculas de ácido nucleico evetores viróticos. Entretanto, outros alvos de órgãos e tecido são preferidostambém.

As formulações de siRNAs com compostos que promovem otrânsito através das membranas de célula são empregadas para melhorar aadministração de siRNAs na terapia. Os SiRNAs sintéticos quimicamentemodificados, que são resistentes a nucleases e têm estabilidade de soro têmduração realçada concomitante de efeitos de RNAi, são uma modalidadeadicional.

Desse modo, a tecnologia de siRNA é um terapêutico para ma-lignidade humana por liberação de moléculas de siRNA direcionadas a161P2F10B para indivíduos com os cânceres, tal como aqueles listados naTabela 1. Tal administração de siRNAs leva ao crescimento reduzido de cé-lulas de câncer que expressam 161P2F10B, e fornecem uma terapia antitu-mor, reduzindo a mortalidade e/ou morbidez associada com a malignidade.

A eficácia desta modalidade de redução de produto de gene ésignificante quando medida in vitro ou in vivo. A eficácia in vitro é facilmentedemonstrável por aplicação de siRNAs às células em cultura (como descritoacima) ou às alíquotas de biópsias de pacientes com câncer quando os mé-todos in vitro são empregados para detectar a expressão reduzida de proteí-na161P2F10B.

XIV). K/fe/Artiqos de Fabricação

Para uso nas aplicações de laboratório, prognósticas, profiláti-cas, diagnosticas e terapêuticas descritas aqui, os kits estão no escopo dainvenção. Tais kits podem compreender um veículo, pacote ou recipienteque seja compartimentado para receber um ou mais recipientes tal comofrascos, tubos, e outros, cada um dos recipientes compreendendo um doselementos separados a ser empregado no método, junto com um rótulo ouinserção compreendendo instruções para uso, tal como um uso descrito a-qui. Por exemplo, o recipiente(s) pode compreender uma sonda que é oupode ser detectavelmente rotulada. Tal sonda pode ser um anticorpo ou po-linucleotídeo específico para uma proteína ou um gene ou mensagem dainvenção, respectivamente. Onde o método utiliza hibridação de ácido nu-cléico para detectar o ácido nucleico alvo, o kit também pode ter recipientesque contêm nucleotido(s) para amplificação da seqüência de ácido nucleicodesignada. Os kits podem compreender um recipiente que compreende umrepórter, tal como uma proteína de ligação de biotina, tal como avidina ouestreptavidina, ligado a uma molécula repórter, tal como um rótulo enzimáti-co, fluorescente, ou de radioisótopo; tal como um repórter pode ser empre-gado com, por exemplo, um ácido nucleico ou anticorpo. O kit pode incluirtodas ou parte das seqüências de aminoácido na Figura 1, Figura 2, ou Figu-ra 3 ou análogos destes, ou uma molécula de ácido nucleico que codificatais seqüências de aminoácido.

O kit da invenção tipicamente compreenderá o recipiente descri-to acima e um ou mais outros recipientes associados a este que compreen-de materiais desejáveis de um ponto de vista de usuário e comercial, inclu-indo rótulos de tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas; veículo, pacote,recipiente, e/ou frasco listando os teores e/ou instruções para uso, e inserções de embalagem com instruções para uso.

Um rótulo pode estar presente sobre ou com o recipiente paraindicar que a composição é empregada para uma terapia específica ou apli-cação não terapêutica, tal como uma aplicação de laboratório, prognostica,profilática, ou diagnostica, e também pode indicar direções para quaisquerdos dois usos in vivo ou in vitro, tal como aqueles descritos aqui. As direçõese ou outras informações também podem ser incluídas em uma inserção(s)ou rótulo(s) que é incluído com ou no kit. O rótulo pode estar sobre ou asso-ciado com o recipiente. Um rótulo a pode estar sobre um recipiente quandoletras, números ou outros caracteres que formam o rótulo são moldados ougravados com água forte no próprio recipiente; um rótulo pode ser associadocom um recipiente quando está presente dentro de um receptáculo ou veícu-lo que também seguram o recipiente, por exemplo, como uma inserção depacote. O rótulo pode indicar que a composição é empregada para diagnos-ticar, tratar, profilaxia ou prognosticar uma condição, tal como uma neoplasiade um tecido apresentado na Tabela 1.

Os termos "/c/f e "artigo de fabricação" podem ser empregadoscomo sinônimos.

Em outra modalidade da invenção, um artigo(s) de fabricaçãoque contém composições, tal como seqüência(s) de aminoácido, molécula(s)pequena, seqüência(s) de ácido nucléico e/ou anticorpo(s), por exemplo,materiais úteis para diagnose, prognose, profilaxia e/ou tratamento de neo-plasias de tecidos tal como aquelas apresentadas na Tabela I, é fornecido. Oartigo de fabricação tipicamente compreende pelo menos um recipiente epelo menos um rótulo. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, gar-rafas, frascos, seringas, e tubos de teste. Os recipientes podem ser forma-dos de uma variedade de materiais tal como vidro, metal ou plástico. O reci-piente pode manter a seqüência(s) de aminoácido, molécula(s) pequena,seqüência(s) de ácido nucléico, população(s) de células e/ou anticorpo (s).Em uma modalidade, o recipiente mantém um polinucleotídeo para uso e-xaminando o perfil de expressão de mRNA de uma célula, junto com reagen-tes empregados para este propósito. Em outra modalidade um recipientecompreende um anticorpo, fragmento de ligação deste ou proteína de liga-ção específica para uso na triagem da expressão de proteína de 161P2F10Bem células e tecidos, ou para propósitos de laboratório, prognósticos, diag-nósticos, profiláticos e terapêuticos relevantes; direções e/ou indicações pa-ra tais usos podem ser incluídas sobre ou com tal recipiente, como reagen-tes de lata e outras composições ou ferramentas empregadas para estespropósitos. Em outra modalidade, um recipiente compreende materiais paraeliciar uma resposta imune celular ou humoral, junto com direções e/ou indi-cações associadas. Em outra modalidade, um recipiente compreende mate-riais para imunoterapia adotiva, como células T citotóxicas (CTL) ou célulasT indutoras (HTL), junto com direções e/ou indicações associadas; os rea-gentes e outras composições ou ferramentas empregados para tal propósitotambém podem ser incluídos.

O recipiente pode alternativamente manter uma composição queé efetiva para tratamento, diagnose, prognose ou profilaxia de uma condiçãoe pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode seruma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfu-rável por uma agulha de injeção hipodérmica). Os agentes ativos na compo-sição podem ser anticorpos capazes de especificamente ligar 161P2F10B emodular a função de 161P2F10B.

O artigo de fabricação pode também compreender um segundorecipiente compreendendo um tampão tampão farmaceuticamente aceitável,tal como salina tamponada de fosfato, a solução de Ringer e/ou solução dedextrose. Pode também incluir outros materiais desejáveis de um ponto devista de usuário e comercial, incluindo outros tampões, diluente, filtros, agi-tadores, agulhas, seringas, e/ou inserções de embalagem com instruçõese/ou de indicações para uso.

EXEMPLOS:

Vários aspectos da invenção são também descritos e ilustradospor modo dos vários exemplos que seguem nenhum de qual é pretendidolimitar o escopo da invenção.

Exemplo 1

Análise de Expressão de Variantes de 161P2F10B em TecidosNormais e Espécimes de Paciente

Para comparar a expressão de variantes 161P2F10B e161P2F10B em tecidos de câncer de pacientes versus normal, as experiên-cias de RT-PCR foram realizadas empregando tecidos de câncer pacientese normais. O primeiro cDNA de filamento foi gerado de estômago normal,cérebro normal, coração normal, fígado normal, músculo de esqueleto nor-mal, testículo normal, próstata normal, bexiga normal, rim normal, cólonnormal, pulmão normal, pâncreas normal, e uma mistura de espécimes decâncer de pacientes de câncer prostático, pacientes de câncer de bexiga,pacientes de câncer de rim, pacientes de câncer de cólon, pacientes de cân-cer do pulmão, pacientes de câncer de pâncreas, uma mistura de xenoen-xertos de cânceres prostáticos (LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD e LAPC-9AI), e uma mistura de 2 metástase prostática de paciente para linfonodo. Anormalização foi realizada por PCR empregando iniciadores para actina. OPCR semi-quantitativo, empregando iniciadores para 161P2F10B, foi reali-zado em 26 e 30 ciclos de amplificação. As amostras foram realizadas emum gel de agarose, e os produtos de PCR foram quantificados empregandoo software de Alphalmager.

A expressão de 161P2F1OB em um painel de carcinoma de célula clara de câncer de rim, carcinoma papilar de câncer de rim, e em espécimes de câncer de pacientes de útero, foi mostrada anteriormente. O primeirocDNA de filamento foi preparado das espécimes de pacientes. A normalização foi realizada por PCR empregando iniciadores para actina. O PCR semiquantitativo, empregando iniciadores para 161P2F10B, foi realizado em 26 e30 ciclos de amplificação. As amostras foram executadas em um gel de agarose, e os produtos de PCR foram quantificados empregando o software de Alphalmager. Expressão foi registrada como ausente, baixa, média ou forte.Os resultados mostram expressão de 161P2F10B em 94,7% de carcinomarenal de célula clara, 62,5% de carcinoma de célula renal papilar, e em61,5% de câncer de útero.

A expressão restrita de 161P2F10B em tecidos normais e a supra-regulação detectada em câncer de rim, em metástase de câncer de rim, bem como em cânceres de próstata, bexiga, cólon, pulmão, pâncreas, osso,linfoma, útero, mama, e ovário, sugere que 161P2F10B seja um alvo terapêutico e um marcador diagnóstico para cânceres humanos.

Exemplo 2

Variantes de União de 161P2F1 OB

As variantes de transcrição são variantes de mRNA maduro domesmo gene, que surgem por transcrição alternativa ou união alternativa. Astranscrições alternativas são transcrições do mesmo gene, porém começam a transcrição em pontos diferentes. As variantes de união são variantes demRNA diferentemente juntadas da mesma transcrição. Em eucariotas,quando um gene de multi-éxon é transcrito de DNA genômico, o RNA inicialé juntado para produzir mRNA funcional, que tem somente exons e é empregado para translação em uma seqüência de aminoácido. Conseqüentemente, um determinado gene pode ter zero a muitas transcrições alternati-vas e cada transcrição pode ter zero a muitas variantes de união. Cada variante de transcrição tem uma única preparação de éxon, e pode ter porçõesde codificação e/ou não codificação diferentes (extremidade 5' ou 3'), datranscrição original. Os variantes de transcrição podem codificar para proteí-nas similares ou diferentes com a mesma função ou uma função similar oupodem codificar proteínas com funções diferentes, e podem ser expressadosno mesmo tecido ao mesmo tempo, ou em tecidos diferentes ao mesmotempo, ou no mesmo tecido a tempos diferentes, ou em tecidos diferentesem tempos diferentes. As proteínas codificadas por variantes de transcriçãopodem ter localizações celulares ou extracelulares similares ou diferentes,por exemplo, segregadas versus intracelulares.

As variantes de transcrição são identificadas por uma variedadede métodos aceitos na técnica. Por exemplo, as transcrições alternativas evariantes de união são identificadas através versados de clonagem de tama-nho natural, ou por uso de transcrição de tamanho natural e seqüênciasEST. Primeiro, todos ESTs humanos se agruparam em agrupamentos quemostram identidade direta ou indireta com cada outro. Segundo, ESTs nomesmo agrupamento foram também agrupados em sub-agrupamentos emontados em uma seqüência de consenso. A seqüência de gene original écomparada com a seqüência(s) de consenso ou outras seqüências de tama-nho natural. Cada seqüência de consenso é uma variante de união potencialpara aquele gene. Até mesmo quando uma variante é identificada a qual nãoé um clone de tamanho natural, aquela porção da variante é muito útil parageração de antígeno e para outra clonagem da variante de união de tama-nho natural, empregando técnicas conhecidas na técnica.

Além disso, os programas de computador estão disponíveis natécnica que identifica as variantes de transcrição com base nas seqüênciasgenômicas. Os programas de identificação de variantes de transcrição combase em genômicos incluem FgenesH (o A. Salamov e V. Solovyev," Ab ini-tio gene finding in Drosophila genomic DNA," Genome Research, abril de2000; 10(4):516-22); Grail e GenScan. Para uma descrição geral de protoco-los de identificação de variantes de união veja, por exemplo, Southan, C, Agenomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 8 de junho de 2001;498(2-3):214-8; de Souza, SJ., e outros, Identificação of human chromosome22 transcribed sequences with ORJF expresso sequence tags, Proc. NatlAcad Sei U S A. 7 de novembro de 2000; 97(23): 12690-3.

Para também confirmar os parâmetros de uma variante detranscrição, uma variedade de técnicas está disponível na técnica, tal comoclonagem de tamanho natural, validação proteômica, validação com baseem PCR, e validação RACE 5', etc. (veja, por exemplo, Validação Proteômi-ca: Brennan, S.O., e outros, Albumin banks península: a new terminationvariant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem BiophysActa. 17 de agosto de 1999; 1433(l-2):321-6; Ferranti P, e outros, Differentialsplicing of pre- messenger RNA produces multiple forms of mature caprinealpha(sl)-casein, Eur J Biochem. 1 de outubro de 1997; 249(l):1-7. Para vali-dação com base em PCR: Wellmann S, e outros, Specific reverse transcrip-tion- PCR quantification of vascular endothelial growth fator (VEGF) splicevariants by LightCycler technology, Clin Chem. abril de 2001; 47(4):654-60;Jia, H.P., e outros, Discovery of new human beta-defensins using a geno-mies-based approach, Gene. 24 de janeiro de 2001; 263(1 -2):211 -8.

Sabe-se na técnica que as regiões genômicas são moduladasem cânceres. Quando a região genômica à qual um mapa de gene é modu-lado em um câncer particular, as transcrições alternativas ou variantes deunião do gene são modulados também. É descrito aqui que 161P2F10B temum perfil de expressão particular relacionado ao câncer. As transcrições al-ternativas e variantes de união de 161P2F10B também estão envolvidas emcânceres nos mesmos tecidos ou tecidos diferentes, desse modo servindocomo marcadores/antígenos associados ao tumor.

As seqüências de ácido nucléico e aminoácido 161P2F10B sãoapresentadas em uma variante por base de variante na Figura 1.

Exemplo 3

Polimorfismo de Nucleotídeo Único de 161P2F10B

Um único Nucleotídeo de Polimorfismo (SNP) é uma única vari-ação de par de base em uma seqüência de nucleotido em um local específi-co. Em qualquer determinado ponto do genoma, há quatro possíveis paresde base de nucleotido: A/T, C/G, G/C e T/A. O genótipo refere-se à seqüên-cia de par de base específica de um ou mais locais no genoma de um indiví-duo. Haplótipo se refere à seqüência de par de base de mais do que um lo-cal na mesma molécula de DNA (ou o mesmo cromossomo em organismossuperiores), freqüentemente no contexto de um gene ou no contexto de vá-rios genes firmemente ligados. SNPs que ocorrem em um cDNA são cha-mados cSNPs. Estes cSNPs podem alterar os aminoácidos da proteína codi-ficada pelo gene e desse modo altera as funções da proteína. Alguns SNPscausam doenças hereditárias; outros contribuem com as variações quantita-tivas em fenótipo e reações aos fatores ambientais incluindo dieta e fárma-cos entre os indivíduos. Portanto, SNPs e/ou combinações de alelos (cha-mados haplótipos) têm muitas aplicações, incluindo diagnose de doençasherdadas, determinação de reações de fármaco e dosagem, identificação degenes responsáveis por doenças, e análise da relação genética entre os in-divíduos (P. Nowotny, J. M. Kwon and A. M. Goate," SNP analysis to dissecthuman traits," Curr. Opin. Neurobiol. outubro de 2001; 11 (5): 637-641; M.Pirmohamed e B. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions,"Trends Pharmacol. Sei. junho de 2001; 22(6):298-305; J. H. Riley, C. J. Al-lan, E. Lai and A. Roses, " The use of single nucleotido polimorfismos in theisolation of common disease genes," Pharmacogenomics. fevereiro de 2000;l(l):39-47; R. Judson, J. C. Stephens e A. Windemuth, "The predictive powerof haplotypes in clinicai response," Pharmacogenomics. fevereiro de 2000;l(l):15-26).

SNPs são identificados por uma variedade de métodos aceitospela técnica (P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery," Am.Clin. Lab. outubro-novembro de 2001; 20(9): 18-20; K. M. Weiss, "In searchof human variation," Genome Res. 1998 M; 8(7):691-697; M. M. She, "Ena-bling large- scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation de-tection and genotyping technologies," Clin. Chem. fevereiro de 2001;47(2): 164-172). Por exemplo, SNPs são identificados através de seqüencia-mento de fragmentos de DNA que mostra polimorfismo através de métodoscom base em gel tal como polimorfismo de comprimento de fragmento derestrição (RFLP) e eletroforese de gel de gradiente de desnaturação (DG-GE). Eles também podem ser descritos por seqüenciamento direto de amos-tras de DNA agrupadas de indivíduos diferentes ou comparando-se seqüên-cias de amostras de DNA diferentes. Com o acúmulo rápido dos dados daseqüência em bases de dados públicas e privadas, alguém pode descreverSNPs comparando-se as seqüências empregando programas de computa-dor (Z. Gu, L. Hillier e P. Y. Kwok, "Single nucleotido polymorphism huntingin cyberspace," Hum. Mutat. 1998; 12(4):221-225). SNPs podem ser verifi-cados e o genótipo ou haplótipo de um indivíduo pode ser determinado poruma variedade de métodos incluindo seqüenciamento direto e microdisposi-ções de produtividade elevada (P. Y. Kwok, "Methods for genotyping singlenucleotido polymorphisms," Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hinese A. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode sys-tem," Mol. Diagn. 2000 Dec; 5(4):329-340).

Empregando os métodos descritos acima, quatro SNPs foramidentificados na transcrição original, 161P2F10B v.1, nas posições 408(A/G), 2502 (A/G), 2663 (A/C) e 3233 (A/C). As transcrições ou proteínascom alelos alternativos foram designadas como variantes 161P2F10B v.2,v.3, v.4, e v.5, respectivamente. Estes alelos do SNPs, embora descritosseparadamente, podem ocorrer em combinações diferentes (haplótipos) eem qualquer uma das variantes de transcrição (tal como 161P2F10B v.7)que contém o contexto de seqüência dos SNPs.

As seqüências de ácido nucléico e aminoácido de 161P2F10Bsão apresentadas em uma variante através da base variante na Figura 1.

Exemplo 4

Produção de 161P2F10B Recombinant em Sistemas Procarióticos

Para expressar as variantes 161P2F10B e 161P2F10B recombi-nantes em células de procarióticas, as seqüências de cDNA de variantes de161P2F10B e 161P2F10B de comprimento total ou parcial são clonadas emqualquer um de uma variedade de vetores de expressão conhecido na técni-ca. Uma ou mais das seguintes regiões de variantes de 161P2F10B são ex-pressadas: a seqüência de comprimento total apresentada na Figura 1, ouqualquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos de 161P2F10B, variantes,ou análogos destes.

Constructos de Translacão e Transcrição In Vitro:

pCRIl: Para gerar sondas de RNA de sentido e anti-sentido de161P2F10B para investigações de RNA in situ, os constructos de pCRIl (In-vitrogen, Carlsbad CA) são gerados codificando ou todo ou fragmentos docDNA de 161P2F10B. O vetor de pCRIl tem promotores Sp6 e T7 que flan-queando a inserção para conduzir a transcrição de RNA de 161P2F10B parauso como sondas em RNA em experiências de hibridação in situ. Estas son-das são empregadas para analisar a expressão de tecido e célula de161P2F10B ao nível de RNA. O RNA de 161P2F10B transcrito que repre-senta a região de codificação de aminoácido de cDNA do gene de161P2F10B é empregado em sistemas de translacão in vitro tal como oTnT® Coupled Reticulolysate System (Promega, Corp., Madison, Wl) parasintetizar a proteína de 161P2F10B.

Constructos Bacterianos:

Constructos de pGEX: Para gerar proteínas de 161P2F10B re-combinante em bactérias que são fundidas à proteína de Glutationa de S-transferase (GST), toda ou partes da seqüência de codificação de proteínade cDNA de 161P2F10B são clonadas na família de pGEX de vetores defusão de GST (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estes cons-tructos permitem a expressão controlada de seqüências de proteína de161P2F10B recombinante com GST fundido na terminação amino e um epí-topo de seis histidinas (6X His) na terminação carboxila. Os rótulos de GSTe 6X His permitem a purificação da proteína de fusão recombinante de bac-térias induzidas com a matriz de afinidade apropriada e permitem o reconhe-cimento da proteína de fusão com anticorpos anti-GST e anti-His. O rótulo6X His é gerado adicionando-se 6 códons de histidina ao iniciador de clona-gem na terminação 3', por exemplo, da estrutura de leitura aberta (ORF). Umsítio de clivagem proteolítica, tal como o sítio de reconhecimento PreScis-sion® em pGEX-6P -1, pode ser empregado tal que permita a clivagem dorótulo de GST de proteína relacionada com 161P2F10B. O gene de resistên-cia à ampicilina e origem de pBR322 permite a seleção e conservação dosplasmídeos de pGEX em E. coli.

Constructos de pMALi: Para gerar, em bactérias, proteínas de161P2F10B recombinantes que são fundidas para proteína de ligação demaltose (MBP), toda ou partes da seqüência de codificação de proteína decDNA de 161P2F10B são fundidas ao gene de MBP clonando-se nos veto-res de pMAL-c2X e pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA). Estesconstructos permitem a expressão controlada de seqüências de proteína de161P2F10B recombinante com MBP fundido à terminação amino e um rótulode epítopo de 6X His na terminação carboxila. Os rótulos MBP e 6X Hispermitem a purificação da proteína recombinante de bactérias induzidas coma matriz de afinidade apropriada e permitem o reconhecimento da proteínade fusão com anticorpos anti-MBP e anti-His. O rótulo de epítopo de 6X Hisé gerado adicionando-se 6 códons de histidina ao iniciador de clonagem 3'.Um sítio de reconhecimento de fator Xa permite a clivagem do rótulo depMAL de 161P2F10B. Os vetores de pMAL-p2X e pMAL-c2X são otimizadospara expressar a proteína recombinante respectivamente no citoplasma ouperiplasma. A expressão de periplasma realça a duplicação de proteínascom ligações de dissulfeto.

Constructos de pET: Para expressar 161P2F10B em célulasbacterianas, toda ou partes da seqüência de codificação de proteína de cD-NA de 161P2F10B são clonadas na família pET de vetores (Novagen, Madi-son, Wl). Estes vetores permitem expressão firmemente controlada de prote-ína de 161P2F10B recombinante em bactérias com e sem fusão às proteí-nas que realçam a solubilidade, tal como NusA e tioredoxina (Trx), e rótulosde epítopo, tal como 6X His e S-Tag® que auxiliam na purificação e detecçãoda proteína recombinante. Por exemplo, os constructos são feitos utilizandosistema de fusão 43.1 de NusA de pET tal que as regiões da proteína de161P2F10B sejam expressadas como fusões de terminação amino ao NusA.

Constructos de Levedura

Constructos de pESC: Para expressar 161P2F10B nas espéciesde levedura Saccharomyces cerevisiae para geração de proteína recombi-nante e estudos funcionais, toda ou partes da seqüência de codificação deproteína de cDNA de 161P2F10B são clonadas na família de pESC de veto-res cada dos quais contêm 1 de 4 marcadores selecionáveis, HIS3, TRPI,LEU2, e URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Estes vetores ou permitem a ex-pressão controlada do mesmo plasmídeo até 2 genes diferentes ou seqüên-cias clonadas contendo rótulo de epítopo Myc ou Flag® na mesma célula delevedura. Este sistema é útil para confirmar as interações de proteína-proteína de 161P2F10B. Além disso, a expressão em levedura produz modi-ficações pós-translacionais similares, tal como glicosilações e fosforilaçõesque são constatadas quando expressadas em células eucarióticas.

Constructos de pESP: Para expressar 161P2F10B nas espéciesde levedura Saccharomyces pombe, toda ou partes da seqüência de codifi-cação de proteína de cDNA de 161P2F10B são clonadas na família de pESPde vetores. Estes vetores permitem nível elevado controlado de expressãode uma seqüência de proteína de 161P2F10B que é fundida em quaisquerdas terminações amino ou terminação carboxila para GST que auxilia napurificação da proteína recombinante. Um rótulo de epítopo de Flag® permitea detecção da proteína recombinante com anticorpo de Flag®.

Exemplo 5

Produção de 161P2F10B Recombinante em Sistemas Eucarióticos Superiores

A. Constructos de Mamífero:

Para expressar 161P2F10B recombinante em células eucarióti-cas, as seqüências de cDNA de 161P2F10B de comprimento total ou parcial,ou variantes destes, podem ser clonadas em qualquer um de uma variedadede vetores de expressão conhecidos na técnica. Uma ou mais das seguintesregiões de 161P2F10B são expressadas nestes constructos, aminoácidos 1a 875, ou qualquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos de 161P2F10B v.1,variantes de 161P2F10B, ou análogos destes.

Os constructos podem ser transfectados em qualquer uma deuma ampla variedade de células de mamífero tal como célula 293T. Os usa-dos de célula 293T transfectada podem ser sondados com o soro policlonalanti-161P2F1OB, descrito aqui.

Constructos de pcDNA4/HisMax:

Para expressar 161P2F10B em células de mamífero, um ORFde 161P2F10B, ou porções deste, de 161P2F10B são clonados em pcD-NA4/HisMax Versão A (Invitrogen, Carlsbad, CA). A expressão de proteína éconduzida do promotor de citomegalovírus (CMV) e do realçador translacio-nal SP 16. A proteína recombinante tem XpressTM e epítopos de seis histi-dinas (6X His) fundidos à terminação amina. O vetor de pcDNA4/HisMaxtambém contém o sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovi-no (BGH) e a seqüência de terminação de transcrição para realçar a estabi-lidade de mRNA junto com a origem de SV40 para réplica epissômica e sal-vamento de vetor simples em linhagens de célula expressando o antígeno Tgrande. O gene de resistência à zeocina permite a seleção de células demamífero que expressam a proteína e o gene de resistência à ampicilina e aorigem de ColE1 permite a seleção e conservação do plasmídeo em E. coli.

Constructos de cDNA3.1/MvcHis:

Para expressar 161P2F10B em células de mamífero, um ORFde 161P2F10B, ou porções deste, de 161P2F10B com um sítio de iniciaçãode translação de Kozak de consenso foi clonado em pcDNA3.1/MycHis Ver-são A (Invitrogen, Carlsbad, CA). Expressão de proteína é conduzida dopromotor de citomegalovírus (CMV). As proteínas recombinantes têm o epí-topo myc e epítopo de 6X His fundidos à terminação carboxila. O vetor depcDNA3.1/MycHis também contém o sinal de poliadenilação de hormônio decrescimento bovino (BGH) e seqüência de terminação de transcrição pararealçar a estabilidade de mRNA, junto com a origem de SV40 para réplicaepissômica e salvamento de vetor simples em linhagens de célula que ex-pressam o antígeno T grande. O gene de resistência à neomicina pode serempregado, uma vez que permite a seleção de células de mamífero que ex-pressam a proteína e o gene de resistência à ampicilina e a origem de ColE1permite a seleção e conservação do plasmídeo em E. coli.Constructo de pcDNA3.1/ CT-GFP-TOPO:

Para expressar 161P2F10B em células de mamífero e permitir adetecção das proteínas recombinantes empregando fluorescência, um ORFde 161P2F10B, ou porções deste, com um sítio de iniciação de translaçãode Kozak de consenso é clonado em pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen,CA). Expressão de proteína é conduzida do promotor de citomegalovírus(CMV). As proteínas recombinantes têm a Proteína Fluorescente Verde(GFP) fundida à terminação carboxila que facilita os estudos de biologia decélula e detecção in vivo, não-invasiva. O vetor pcDNA3.1CT- GFP-TOPOtambém contém o sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovi-no (BGH) e a seqüência de terminação de transcrição para realçar a estabi-lidade de mRNA junto com a origem de SV40 para replicação epissômica esalvamento de vetor simples em linhagens de célula expressando o antígenoT grande. O gene de resistência à neomicina permite a seleção de célulasde mamífero que expressam a proteína e o gene de resistência à ampicilinae a origem de ColE1 permite a seleção e conservação do plasmídeo em E.coli. Os constructos adicionais com uma fusão de GFP de terminação aminosão feitas em pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO abrangindo o comprimento total deuma proteína de 161P2F10B.

PAPtaq:

Um ORF de 161P2F10B, ou porções deste, é clonado em pAP-tag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Este constructo gera uma fusão dealcalina fosfatase à terminação carboxila de uma proteína 161P2F10B aomesmo tempo em que fundindo a seqüência de sinal IgGK à terminação a-mino. Os constructos também são gerados nas quais a alcalina fosfatasecom uma seqüência de sinal de IgGK amino terminal é fundida à terminaçãoamino de uma proteína 161P2F10B. As proteínas 161P2F10B recombinan-tes resultantes são otimizadas quanto à secreção nos meios de células demamífero transfectadas e podem ser empregadas para identificar as proteí-nas como ligandos ou receptores que interagem com as proteínas de161P2F10B. A expressão de proteína é conduzida do promotor de CMV, eas proteínas recombinantes também contêm epítopos myc e 6X His fundidosà terminação carboxila que facilita a detecção e purificação. O gene de resis-tência à zeocina presente no vetor permite a seleção de células de mamíferoque expressam a proteína recombinante e o gene de resistência à ampicilinapermite a seleção do plasmídeo em E. coli.

pTagõ: Um ORF de 161P2F10B, ou porções deste, foi clonadoem pTag-5. Este vetor é similar a pAPtag porém sem a fusão de alcalina fos-fatase. Este constructo gera proteína de 161P2F10B com uma seqüência desinal de IgGic amino terminal e rótulos de epítopo myc e 6X His na termina-ção carboxila que facilita a detecção e purificação de afinidade. A proteínade 161P2F10B recombinante resultante é otimizada quanto à secreção nosmeios de células de mamífero transfectadas, e é empregada como imunó-geno ou ligando para identificar as proteínas tal como ligandos ou receptoresque interagem com as proteínas de 161P2F10B. A expressão de proteína éconduzida do promotor de CMV. O gene de resistência à zeocina presenteno vetor permite a seleção de células de mamífero que expressam a proteí-na, e o gene de resistência à ampicilina permite a seleção do plasmídeo emE. coli.

PsecFc:

Um ORF de 161P2F10B, ou porções deste, foi clonado empsecFc. O vetor de psecFc foi montado clonando-se o Fc de imunoglobulinahumana G1 (IgG) (regiões da dobradiça, CH2, CH3) em pSecTag2 (Invitro-gen, Califórnia). Este constructo gera uma fusão de Fc de IgG! à terminaçãocarboxila das proteínas de 161P2F10B, ao mesmo tempo em que fundindo aseqüência de sinal de IgGK à terminação N. As fusões de 161P2F10B utili-zando a região de Fc de IgGI de camundongo também são empregadas. Asproteínas de 161P2F10B recombinantes resultantes são otimizadas quanto àsecreção nos meios de células de mamífero transfectadas, e podem ser em-pregadas como imunógenos ou para identificar as proteínas como ligandosou receptores que interagem com a proteína de 161P2F10B. A expressão deproteína é conduzida do promotor de CMV. O gene de resistência à higromi-cina presente no vetor permite a seleção de células de mamífero que ex-pressam a proteína recombinante, e o gene de resistência à ampicilina per-mite a seleção do plasmídeo em E. coli.Constructos de pSRa:

Para gerar linhagens de célula de mamífero que expressam161P2F10B constitutivamente, ORF de 161P2F10B, ou porções deste, de161P2F10B foram clonados em constructos de pSRa. Os retrovírus anfotró-picos e ecotrópicos foram gerados por transfecção de constructos de pSRana linha de embalagem 293T-10A1 ou co-transfecção de pSRa e um plas-mídeo auxiliar (contendo seqüências de embalagem deletadas) nas 293 cé-lulas, respectivamente. O retrovírus é empregado para infetar uma variedadede linhagens de célula de mamífero, resultando na integração do gene clo-nado, 161P2F10B, nas linhagens de célula hospedeira. A expressão de pro-teína é conduzida de uma repetição terminal longa (LTR). O gene de resis-tência à neomicina presente no vetor permite a seleção de células de mamí-fero que expressam a proteína, e o gene de resistência à ampicilina e origemde ColE1 permite a seleção e conservação do plasmídeo em E. coli. Os ve-tores retrovirais podem ser empregados, por conseguinte para infecção egeração de várias linhagens de célula empregando, por exemplo, célulasPC3, NIH 3T3, TsuPrl, 293 ou de camundongo.

Os constructos de pSRa adicionais são feitas as quais fundemum rótulo de epítopo tal como o rótulo FLAG® à terminação carboxila de se-qüências de 161P2F10B para permitir a detecção empregando os anticorposanti-Flag. Por exemplo, a seqüência FLAG® 5' GAT TAC AAG GAT GACGAC GAT AAG 3' (SEQ ID NO: 165) é adicionada ao iniciador de clonagemna terminação 3'do ORF. Os constructos de pSRa adicionais são feitos paraproduzir GFP tanto amino terminal quanto carboxila terminal e proteínas defusão myc/6X His das proteínas de tamanho natural de 161P2F10B.

Vetores Virais Adicionais:

Os constructos adicionais são feitas para liberação mediada porvírus e expressão de 161P2F10B. O título de vírus elevado levando à ex-pressão de nível elevado de 161P2F10B é obtido em sistemas de liberaçãoviral tal como vetores de adenovirais e vetores de amplicon de herpes. Umaseqüência de codificação de 161P2F10B ou fragmentos desta são amplifica-dos por PCR e subclonados no vetor de transporte AdEasy (Stratagene). Arecombinação e embalagem de vírus são realizadas de acordo com as ins-truções do fabricante para gerar vetores adenovirais. Alternativamente, asseqüências de codificação de 161P2F10B ou fragmentos destas são clona-das no vetor de HSV-I (Imgenex) para gerar vetores virais de herpes. Osvetores virais são, por conseguinte empregados para infecção de várias li-nhagens de célula tal como células PC3, NIH 3T3, 293 ou de camundongo-1.

Sistemas de Expressão Regulados:

Para controlar a expressão de 161P2F10B em células de mamí-fero, as seqüências de codificação de 161P2F10B, ou porções destas, sãoclonadas em sistemas de expressão de mamífero regulados tal como o Sis-tema T-Rex (Invitrogen), o Sistema de GeneSwitch (Invitrogen) e o Sistemade Ecdysone firmemente regulado (Sratagene). Estes sistemas permitem oestudo dos efeitos dependentes de concentração e temporais de161P2F10B recombinante. Estes vetores são posteriormente empregadospara controlar a expressão de 161P2F10B em várias linhagens de célula talcomo células PC3, NIH 3T3, 293 ou de camundongo-1.

B. Sistemas de Expressão de Baculovírus

Para gerar proteínas de 161P2F10B recombinantes em um sis-tema de expressão de baculovírus, ORF de 161P2F10B, ou porções deste,são clonados no vetor de transferência de baculovírus pBlueBac 4.5 (Invitro-gen), que fornece um His-tag na terminação N. Especificamente, pBlueBac-161P2F10B é co-transfectado com plasmídeo auxiliar pBac-N-Blue (Invitro-gen) em células de inseto SF9 (Spodoptera frugiperda) para gerar baculoví-rus recombinante (veja instrução de manual de Invitrogen para detalhes). Obaculovírus é então coletado de sobrenadante de célula e purificado por en-saio de placa.

A proteína de 161P2F10B recombinante é então gerada por in-fecção de células de inseto HighFive (Invitrogen) com baculovírus purificado.A proteína de 161P2F10B recombinante pode ser detectada empregandoanticorpo anti-161P2F10B ou anti-His-tag. A proteína 161P2F10B pode serpurificada e empregada em vários ensaios com base em célula ou como i-munógeno para gerar anticorpos policlonais e monoclonais específicos para161P2F10B.

Vetores de Expressão para Ortóloqos de 161P2F10B

Os ortólogos de macaco e rato de 161P2F10B foram clonadosem pcDNA3.1/MycHis Versão A (Invitrogen, Carlsbad, CA). A expressão deproteína é conduzida do promotor de citomegalovírus (CMV). As proteínasrecombinantes têm o epítopo de myc e epítopo de 6X His fundido à termina-ção carboxila. Estes vetores permitem a expressão de ortólogos de161P2F10B para ensaiar a reatividade cruzada de anticorpos de 161P2F10Banti-humanos monoclonais.

Os ortólogos de macaco e camundongo de 161P2F10B tambémforam clonados em constructos de pSRa. Os constructos de pSRa permitema geração de linhagens de célula de mamífero que expressam ortólogos de161P2F10B constitutivamente. A expressão de proteína é conduzida dopromotor de citomegalovírus (CMV). As proteínas recombinantes têm o epí-topo de myc e epítopo 6X His fundido à terminação carboxila. Estes vetorespermitem a expressão de ortólogos de 161P2F10B para ensaiar a reativida-de cruzada de anticorpos de 161P2F10B anti-humanos monoclonais e estu-dar a atividade funcional de ortólogos de 161P2F10B. Os retrovírus anfotró-picos e ecotropicos foram gerados por transfecção de constructo de pSRana linhagem de embalagem de 293T-10A1 ou co-transfecção de pSRa e umplasmídeo auxiliar (contendo seqüências de embalagem deletadas) nas 293células, respectivamente. O retrovírus é empregado para infectar uma varie-dade de linhagem de célula de mamífero, resultando na integração do geneclonado, ortólogo de 161P2F10B, nas linhagens de célula hospedeira.

Exemplo 6

Perfis de Antiqenicidade e Estrutura Secundária

Os perfis de aminoácido de variantes de 161P2F10B e161P2F10B foram encontrados acessando a website ProtScale no WorldWide Web no servidor de biologia molecular ExPasy.

Estes perfis: Hidrofilicidade, (Hopp T.P., Bosques K.R., 1981.Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:3824-3828); Hidropaticidade, (Kyte J., DoolittleR.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132); Porcentagem de Resíduos Acessíveis(Janin J., 1979 Nature 277:491-492); Flexibilidade Média, (Bhaskaran R., ePonnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Proteína Res. 32:242-255); ciclo Beta(Deleage, G., Roux B. 1987 Proteína Engineering 1:289-294); e opcional-mente outros disponíveis na técnica, tal como na website de ProtScale, fo-ram empregados para identificar regiões antigênicas de cada das proteínasvariantes de 161P2F10B. Cada um dos perfis de aminoácido acima de vari-antes de 161P2F10B foram gerados empregando os seguintes parâmetrosde ProtScale para análise: 1) Um tamanho de janela de 9; 2) 100% em pesodas extremidades de janela comparado ao centro da janela; e, 3) valores deperfil de aminoácido normalizados para situarem-se entre 0 e 1.

Os perfis de Hidrofilicidade, Hidropaticidade e Porcentagem deResíduos Acessíveis foram empregados para determinar as extensões deaminoácidos hidrofílicos (isto é, valores maiores do que 0,5 nos perfis deHidrofilicidade e Porcentagem de Resíduos Acessíveis, e valores menoresdo que 0,5 no perfil de Hidropaticidade). Tais regiões são prováveis de se-rem expostas ao ambiente aquoso, estarem presente na superfície da prote-ína, e desse modo disponíveis para reconhecimento imune, tal como poranticorpos.

Os perfis de Flexibilidade Média e Ciclo-Beta determinam as ex-tensões de aminoácidos (isto é, valores maiores do que 0,5 no perfil de Ci-clo-Beta e no perfil de Flexibilidade Média) que não são constrangidos emestruturas secundárias tal como beta folhas e alfa hélices. Tais regiões sãotambém mais prováveis de serem expostas na proteína e desse modo aces-síveis ao reconhecimento imune, tal como através de anticorpos.

As seqüências antigênicas das proteínas variantes de161P2F10B indicadas, por exemplo, pelos perfis descritos acima são em-pregadas para preparar imunógenos, peptídeos ou ácidos nucléico que oscodificam, para gerar anticorpos anti-161P2F10B terapêuticos e diagnósti-cos. O imunógeno pode ser qualquer 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais do que 50 ami-noácidos contíguos, ou os ácidos nucléicos correspondentes que os codifi-cam, das variantes de proteína de 161P2F10B listadas na Figura 1 da quaisos perfis de aminoácido podem ser deduzidos porque a variante contém aseqüência que é igual a uma variante descrita. Em particular, os imunógenosde peptídeo da invenção podem compreender, uma região de peptídeo depelo menos 5 aminoácidos da Figura 1 em qualquer incremento de númerointeiro que inclui uma posição de aminoácido tendo um valor maior do que0,5 no perfil de Hidrofilicidade; uma região de peptídeo de pelo menos 5 a-minoácidos da Figura 1 em qualquer incremento de número inteiro que incluiuma posição de aminoácido tendo um valor menor do que 0,5 no perfil deHidropaticidade; uma região de peptídeo de pelo menos 5 aminoácidos daFigura 1 em qualquer incremento de número inteiro que inclui uma posiçãode aminoácido tendo um valor maior do que 0,5 no perfil de Porcentagem deResíduos Acessíveis; uma região de peptídeo de pelo menos 5 aminoácidosda Figura 1 em qualquer incremento de número inteiro que inclui uma posi-ção de aminoácido tendo um valor maior do que 0,5 no perfil de FlexibilidadeMédia; e, uma região de peptídeo de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 1em qualquer incremento de número inteiro que inclui uma posição de amino-ácido tendo um valor maior do que 0,5 no perfil de Ciclo-Beta. Os imunóge-nos de peptídeo da invenção também podem compreender ácidos nucléicosque codificam qualquer dos anteriores.

Todos os imunógenos da invenção, peptídeo ou ácido nucléico,podem ser corporifiçados na forma de dose de unidade humana, ou compre-endidos por uma composição que inclui um excipiente farmacêutico compa-tível com a fisiologia humana.

A estrutura secundária de variantes de 161P2F10B e161P2F10B, isto é a presença e local preditos de alfa hélices, filamentosprolongados, e rolos aleatórios, é predita da seqüência de aminoácido primá-ria que usa o método de Rede Neural Hierárquico- HNN (NPS @: NetworkProtein Sequence Analysis TIBS março de 2000 Vol. 25, No 3 [291]: 147-150Combet C, Blanchet C, Geourjon C. e Deleage G., acessado do servidor debiologia molecular ExPasy localizou no World Wide Web. A análise indicaque a variante 161P2F10B 1 é composta de 31,31% de alfa hélice, 11,31%de filamento prolongado, e 57,37% de rolos aleatórios.

A análise quanto à presença potencial de domínios de trans-membrana nas proteínas variantes de 161P2F10B foi realizada empregandouma variedade de algoritmos de predição de transmembrana acessada doservidor de biologia molecular ExPasy localizado na World Wide Web.

Exemplo 7

Geração de Anticorpos Policlonais de 161P2F10B

Os anticorpos de policlonais podem ser aumentados em ummamífero, por exemplo, por uma ou mais injeções de um agente de imuniza-ção e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente de imunizaçãoe/ou adjuvante serão injetados no mamífero através de múltiplas injeçõessubcutâneas ou intraperitoneais. Além de imunizar com uma variante de pro-teína de 161P2F10B de tamanho natural, algoritmos de computador sãoempregados no desígnio de imunógenos que, com base em análise de se-qüência de aminoácido contêm características de ser antigênico e disponívelpara reconhecimento pelo sistema imune do hospedeiro imunizado (veja oExemplo intitulado "Perfis de Antigenicidade e Estrutura Secundária"). Taisregiões seriam preditas serem hidrofNicas, flexíveis, em conformações deciclo-beta, e seriam expostas na superfície da proteína.

Por exemplo, as proteínas de fusão bacterianas recombinantesou peptídeos que contêm regiões de ciclo-beta, hidrofílicas, flexíveis de vari-antes de proteína de 161P2F10B são empregados como antígenos para ge-rar anticorpos policlonais em coelhos Brancos da Nova Zelândia ou anticor-pos monoclonais como descrito no Exemplo intitulado "Geração de Anticor-pos de Monoclonais de 161P2F10B (MAbs)". Por exemplo, na variante161P2F10B1, tais regiões incluem, porém não estão limtadas a, aminoáci-dos 43-93, 100-134, 211-246, 567-492, 500-517 e aminoácidos 810-870.

Outras proteínas de fusão bacterianas recombinantes que po-dem ser empregadas incluem proteína de ligação de maltose, LacZ, tiorre-doxina, NusA, ou uma região constante de imunoglobulina (veja a seção inti-tulada "Production of 161P2F10B in Prokariotic Systems" e Protocolos Cor-rentes em Molecular Biology, Volume 2, Unidade 16, Frederick M. Ausubul eoutros, eds., 1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L, Da-mle, N., e Ledbetter, L.(1991) J.Exp. Med. 174, 561-566).

Além de proteínas de fusão derivadas bacterianas, os antígenosde proteína expressados de mamífero são também empregados. Estes antí-genos são expressados de vetores de expressão de mamífero tal como osvetores de fusão Tag5 e Fc (veja a seção intitulada "Produção de161P2F10B Recombinante em Sistemas Eucarióticos"), e retêm as modifi-cações pós-translacionais tal como glicosilações encontradas na proteínanativa. Em uma modalidade, os aminoácidos 45-875, são clonados no vetorde secreção mamífero Tag5. A proteína recombinante foi purificada atravésde cromatografia de quelado de metal de sobrenadantes de cultura de tecidode células 293T estavelmente expressando o vetor recombinante. A proteínade 161P2F10B Tag5 purificada foi então empregada como imunógeno.

Durante o protocolo de imunização, é útil misturar ou emulsificaro antígeno em adjuvantes que realçam a resposta imune do animal hospe-deiro. Os exemplos de adjuvantes incluem, porém não é limitado, o adjuvan-te de Freund completo (CFA) e adjuvante de MPL-TDM (Lipídio de monofos-forila A, dicorinomicolato de trealose sintético).

Em um protocolo típico, os coelhos são inicialmente imunizadossubcutaneamente com até 200 \ig, tipicamente 100-200 j^g, de proteína defusão ou peptídeo conjugado para KLH misturado em adjuvante de Freundcompleto (CFA). Os coelhos são então subcutaneamente injetados a cadaduas semanas com até 200 \ig, tipicamente 100-200 u,g, do imunógeno noadjuvante de Freund incompleto (IFA). Os sangues de teste são tomadosaproximadamente 7-10 dias seguintes a cada imunização e empregadospara monitorar o título do anti-soro por ELISA.

Para testar a reatividade e especificidade de soro imune, tal co-mo soro de coelho derivado de imunização com Tag5 161P2F10B codifican-do aminoácidos 58-538, o cDNA variante de 161P2F10B de tamanho naturalrespectivo é clonado em vetor de expressão pCDNA 3.1 myc-his (Invitrogen,veja o Exemplo intitulado "Produção de 161P2F10B Recombinante em Sis-temas de Eucarióticos"). Após a transfecção dos constructos nas células293T, os lisados de célula são sondados com o soro anti-variante e com an-ticorpo anti-His (Santa Cruz Biotecnologies) para determinar a reatividadeespecífica para proteína variante desnaturada empregando a técnica deWestern blot. Além disso, o soro imune é testado por microscopia de fluo-rescência, citometria de fluxo e imunoprecipitação contra 293T e outras célu-las de expressão de variante de 161P2F10B recombinante para determinar oreconhecimento específico de proteína nativa. As técnicas citométricas defluxo, Western blot, imunoprecipitação e microscopia fluorescente empre-gando as células que endogenamente expressam 161P2F10B também sãorealizadas para testar a atividade e especificidade.

O anti-soro do coelho imunizado por 161P2F10B Tag5 é purifi-cado por afinidade por passagem sobre uma coluna de proteína de GST co-valentemente acoplada à matriz AffiGel (BioRad). O anti-soro é então purifi-cado por afinidade por passagem sobre uma coluna composta de uma prote-ína de fusão de MBP-161P2F1 covalentemente acoplada à matriz de Affigel.O soro é então também purificado através de cromatografia de afinidade deproteína G para isolar a fração de IgG. Os soros de outros antígenos rotula-dos por His e coelhos imunizados por peptídeo bem como soros esvaziadosde pares de fusão são purificados por afinidade por passagem sobre umamatriz de coluna composta do imunógeno de proteína original ou peptídeolivre.

Exemplo 8

Geração de Anticorpos Monoclonais de 161P2F10B (MAbs)

Em uma modalidade, os Anticorpos Monoclonais terapêuticos("MAbs") para variantes 161P2F10B e 161P2F10B compreendem aquelesque reagem com epítopos específicos para cada proteína ou específicospara seqüências em comum entre as variantes que ligariam, internalizariam,romperiam ou modulariam a função biológica de variantes de 161P2F10B ou161P2F10B, por exemplo, aquelas que romperiam a interação com ligandos,substratos, e os pares de ligação. Os imunógenos para geração de taisMAbs incluem aqueles designados para codificar ou conter o domínio extra-celular ou a seqüência de proteína de 161P2F10B inteira, regiões preditaspara conter motivos funcionais, e regiões das variantes de proteína de161P2F10B preditas para serem antigênicas de análise de computador daseqüência de aminoácido. Os imunógenos incluem peptídeos e proteínasrecombinantes tal como tag5-161P2F10B uma proteína rotulada por His puri-ficada expressada de mamífero. Além disso, as células construídas atravésde transdução retroviral para expressar níveis elevados de variante 1 de161P2F10B, tal como RATI-161P2F10B são empregadas para imunizar ratos.

Para gerar MAbs para 161P2F10B, os camundongos são primeiro imunizados na almofada da pata (FP) com, tipicamente, 5-50 \ig de imu-nógeno de proteína ou entre 106 e 107 células de expressão de 161P2F10Bmisturadas em um adjuvante adequado. Os exemplos de adjuvantes ade-quados para imunizações de FP são TiterMax (Sigma) para a injeção de FPinicial e gel de alume para imunizações subseqüentes. Seguinte uma injeçãoinicial, os camundongos são imunizados duas vezes por semana até o tem-po que eles são sacrificados. No sacrifício, os linfonodos são removidos esuas células B são colhidas para fusão de eletro-célula.

No curso das imunizações os sangues de teste são tomadospara monitorar o título e especificidade da resposta imune. Na maioria doscasos, uma vez que a reatividade e especificidade apropriadas são obtidascomo determinado por ELISA, western blotting, imunoprecipitação, micros-copia de fluorescência ou análises citométricas de fluxo, geração de hibri-doma e fusão são então realizadas empregando fusão de eletro célula (BTX,ECM2000).

Em uma modalidade, a invenção fornece anticorpos monoclo-nais designados: Hal 6-1(3,5)18, Hal6-1(2,4)4, Hal6-1 (3,5)56, Hal6-I(l)ll, H16-1,68, Hl 6-1,93, H16-7,8, H16 - 9,10, Hl 6-9,44, H16-9,69, Hal6-I(l)23, Hal 6-1(3,5)36, H16-1.52, H16-1.67, H16-1.86, H16 - 7,213, H16-9,33, Hal6-1(3,5)27,1, H16-1.61.1, H16-1(3,5)5, H16-7.200, Hal 6-1(3,5)42, H16 - 9,65,H16-1.29.1.1, H16-3.4, H16-1.92.1.1, Hal 6 -1(3,5) 19, e H16-1.80.

Os anticorpos listados acima foram mostrados reagir e ligar-secom a superfície de célula 161P2F10B por citometria de fluxo ou imobiliza-ram 161P2F10B por ELISA.

MAbs de 161P2F10B foram gerados empregando XenoMousetechnology® onde os locos de cadeia leve capa e pesada de camundongosforam inativados e uma maioria dos locos de imunoglobulina cadeia leve ca-pa e pesada humana foi inserida. Os MAbs designados Hal6-I(3,5)18, Hal6-1(2,4)4, Hal 6 - 1(3, 5)56, Hal6-I(l)ll, Hal6-I(l)23, Hal6-1 (3,5)36, Hal6-1(3,5)27.1, Hal6-1 (3,5)42, e Hal 6-1(3, 5)19 foram gerados de imunização deXeno Camundongos de produção de gama 1 humano com células de RAT1-161P2F10B. Os MAbs designados H16-1.68, H16-1.93, H16 - 1.52, H16-1.67, Hl 6-1.86, H16-1.61.1, H16-l(3,5)5, H16-1.29.1.1, Hl 6-1.80, e Hl 6-1.92.1.1 foram gerados de imunização de Xeno Camundongos de produçãode gama 1 humano com 161P2F10B de tag5 purificado. Os MAbs designa-dos H16-7.8, H16-9.10, H16-9.44, H16-9.69, H16-7.213, H16-9.33, e H16-7.200 foram gerados de imunização com Xeno Camundongo de produção degama 2 humano com tag5-161P2F10B.

Os MAbs de 161P2F10B Hal 6-1(3,5)18, Hal 6-1(2,4)4, Hal 6-1(3,5)56, Hal 6-1(1)11, H16-1.68, H16-1.93, H16-7.8, H16-9.10, H16-9.44,H16-9.69, Hal 6-1(1)23, Hal6-1 (3,5)36, H16 - 1.52, H16-1.67, H16-1.86, H16-7.213, H16-9.33, Hal 6 - 1(3,5)27.1, H16-1.61.1, Hl 6-1(3,5)5, H16 - 7.200,Hal 6-1(3,5)42, H16-9.65, H16-1.29.1.1, H16-3.4, H16-1.92.1.1, e Hal6-1(3,5)19 especificamente se ligam às células de expressão de 161P2F10Brecombinantes e 161P2F10B de superfície de célula endógena expressadaem células de xenoenxerto de câncer (Figura 6 e Figura 7).

Os anticorpos designados Hal6-I(3,5)18, Hal 6-1(1)11, H16-1.93,H 16-9.69 foram enviados (por Expresso Federal) para American Type Cultu-re Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 em 28 de marçode 2006 e números de Acessão designados PTA -_, PTA -_,PTA-_, PTA -_, respectivamente.

As seqüências de codificação de DNA para MAbs de161P2F10B Hal6-I(3,5)18, Hal 6-1(2,4)4, Hal 6 - 1(3,5)56, Hal6-I(l)ll, H16-1.68, H16-1.93, H16-7.8, H16-9.10, Hl 6-9.44, H16-9.69, Hal 6 - 1(1)23, Hal6-1(3,5)36, H16-1.52, H16-1.67, H16-1.86, H16-7.213, H16-9.33, Hal 6-1(3,5)27.1, H16-1.61.1, H16-1(3,5)5, H16-7.200, Hal 6-1(3, 5)42, H16-9.65, H16-1.29.1.1, H16-3.4, H16 -1.92.1.1, Hal 6-1(3,5)19, e H16-1.80 foram determinadas após o isolamento de mRNA das células de hibridoma respectivas com reagente de Trizol (Life Tecnologies, Gibco BRL).

O RNA total foi purificado e quantificado. Primeiro os cDNAs de filamento foram gerados de RNA total com preparação de oligo (dT)12-18 empregando o sistema de Pré-amplificação Gibco BRL SuperScript. Primeiro o cDNA de filamento foi amplificado empregando iniciadores de cadeia pesada variáveis de imunoglobulina humana, e iniciadores de cadeia leve variáveis de imunoglobulina humana. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de pCRScript (Stratagene). Vários clones foram seqüenciados e as regiões de cadeia pesada e leve variáveis foram determinadas.

As seqüências de aminoácido e ácido nucléico das regiões de cadeia pesada e leve variáveis são listadas na Figura 2 e Figura 3. O alinhamento de anticorpos 161P2F10B às Seqüências V-D -J de linha germina-tiva é apresentado na Figura 4A - Figura 4Z e Figura 5A - Figura 5X.

Exemplo 9

Triagem. Identificação e Caracterização de MAbs de 161P2F10B

Os anticorpos gerados empregando os procedimentos apresentados no exemplo intitulados "Geração de Anticorpos Monoclonais de 161P2F10B (MAbs)" foi avaliado, identificado, e caracterizado empregando uma combinação de ensaios incluindo ELISA, FACS, classificação por afinidade através de Ressonância de Plasmônio Superfical (BlAcore) ("SPR"), agrupamento de epítopo, afinidade para 161P2F10B, e 161P2F10B recom-biante expressado na superfície de célula. A. Triagem de MAb de 161P2F10B humano por FACS.

A triagem do hibridoma primário quanto aos MAbs para 161P2F10B é realizada por análise de FACS. O protocolo é como segue: 50 ul/cavidade de sobrenadante de hibridoma (limpo) ou anticorpos purificados (em diluições seriais) são adicionados às placas FACS de 96 cavidades e misturado com células de expressão de 161P2F10B (endógeno ou recombi-nant, 50,000 células/cavidade). A mistura é incubada a 4°C durante duas horas. Ao término da incubação, as células são lavadas com Tampão FACS e incubadas com 100 jil de anticorpo de detecção (anti-hlgG-PE) durante 45 minutos a 4°C. Ao término da incubação, as células são lavadas com Tampão de FACS, fixadas com Formaldeído e analisadas empregando FACScan. Os dados são analisados empregando software CelIQuest Pro.

Os hibridomas positivos identificados de triagens primárias são transferidos para placas de 24 cavidades e os sobrenadantes coletados para triagens confirmatórias. As triagens confirmatórias incluíram análise deFACS em Caki-161P2F10B/Caki-neo, HepG2 (linhagem de célula de câncer de fígado humana), KU812 (linhagem de célula promieolcítica humana), S-KRC-UI (linhagem de célula de tumor renal humana), e ELISA empregando Rótulos-161P2F10B.

B. Triagem de MAb 161P2F10B humano por ELISA

MAbs de 161P2F10B foram avaliados por ELISA para determinar o isótipo de anticorpo. O protocolo empregado é como segue, as placas de ELISA foram revestidas com Tag5-161P2F10B-ECD ou anticorpo anti-hlgG. Vários grupos de anticorpos de teste foram adicionados nas placas e incubados durante 1 hora. Após a lavagem das placas para tirar os anticorpos não ligados, os anticorpos ligados foram detectados pelos seguintes anticorpos de detecção conjugados HRP: anti-hlgGI, anti-hlgG2, anti-hlgK, e anti-hlgL

C. Triagem de MAb humano de 161P2F10B por SPR.

: SPR permite a identificação e caracterização em tempo real dos cinéticos e afinidade de interações de proteína-proteína e, portanto é uma técnica útil na seleção e caracterização de MAbs para alvejar antígenos de interesse. A análise de SPR é empregada para avaliar e caracterizar os sobrenadantes de hibridoma e MAbs purificados para 161P2F10B. A triagem do hibridoma quanto aos MAbs para 161P2F10B através de biosensor de SPR (BlAcore 3000) é realizada como segue: 50 ui/cavidade de sobrena-dante de hibridoma (limpo) diluído a 1,5-2 |ig/ml com o tampão fluente (HBS-P, 10 ug/ml de BSA) são adicionados às placas de 96 cavidades (BlAcore) eos MAbs (20 uJ) são capturados em pAbs Fcy anti-humano de cabra covalen-temente imobilizado na superfície do chip sensor de CM5. Três (3) MAbs que contêm sobrenadantes de hibridoma são testados por percurso (ciclo) nos canais 2, 3 e 4 da célula de fluxo, onde o canal 1 é reservado como referência para ligação não-específica. Antes de medir a ligação de antígeno aos MAbs capturados em cada canal individual, 60 jll! de tampão fluente são injetados sobre a superfície do chip na taxa de fluxo de 20 ^il/min para servir como referência para direção em linha de referência de MAb capturado. Sessenta microlitros (60 fil) do 161P2F10B recombinante purificado em 150 nM são então injetados sobre a superfície do chip na mesma taxa de fluxo de 20 ul/min para medir a ligação de antígeno. Cada ciclo de ligação de antígeno a MAbs é seguido por regeneração de superfície com injeção de 100 mM de ácido fosfórico (durante 1 min) para extrair a superfície de qualquer MAb capturado.

As análises dos dados é realizada empregando BiaEvaluation4.1 e software CLAMP (Myszka e Morton, 1998). Após subtrair as referências e normalizar a resposta ao nível de MAb capturado, os dados são ajustados globalmente empregando um modelo de ligação 1:1.

As afinidades são calculadas das constantes de taxa de associação e dissociação. Como é evidente para alguém versado na técnica, as taxas de dissociação lentas geralmente indicam afinidade total mais elevada para MAbs. Os dados de afinidade preliminares e taxas de dissociação são empregados como uma base dos critérios de seleção para MAbs terapêuticos para 161P2F10B.

D. Agrupamento de Epítopo por FACS

Os anticorpos 161P2F10B foram agrupados de acordo com o epítopo avaliando-se seu padrão de ligação em UG-K3 (linhagem de célula de câncer renal humano), ou células KU812. Em resumo, uma quantidade pequena de cada dos anticorpos foi biotinilada; em seguida cada dos anti-corpos biotinilados foi incubado com KU812 na presença de quantidade em excesso (100 x) de anticorpos não biotinilados a 4°C durante 1 hora. Alguém versados ordinária na técnica entenderá que durante a incubação, umaquantidade em excesso de anticorpos competirá com os anticorpos biotinila-dos se eles ligarem-se ao mesmo epítopo. Ao término da incubação, as células foram lavadas e incubadas com Estreptavidina-PE durante 45 min a 4°C. Após tirar a estreptavidina-PE não ligada, as células foram analisadas empregando FACS. Os valores de MFI foram obtidos empregando software CelIQuest Pro e foram empregados para análise de dados. Como mostrado na Figura 8, vinte e cinco (25) MAbs de 161P2F10B foram agrupados em epítopo empregando células UG-K3. As células são realçadas para indicar autocompetição (100% de competição), o valor de MFI avaliam nestas céluIas são controle de base para cada anticorpo biotinilado. Adicionalmente, as células sem cor indicam que os dois anticorpos competem um com o outro

+ (MFI baixo), as células realçadas em cinza (MFI elevado) indicam que os dois anticorpos se ligam aos dois epítopos distintos. Os resultados mostram que os anticorpos que têm o mesmo padrão de ligação se ligam ao mesmoepítopo entre os anticorpos e que há 16 grupos de epítopos nos anticorpos testados.

E. Mapeamento de Domínio de MAbs de 161P2F10B

Para identificar as regiões da proteína de 161P2F10B que contêm o epítopo de ligação de MAbs, várias constructos foram criadas codificando as poções do domínio extracelular 161P2F10B e empregadas em experiências de imunoprecipitação. Os constructos de expressão de Tag5 codificando qualquer dos domínios extracelulares completos (ECD) de 161P2F10B (aminoácidos 46-875), o domínio tipo somatomedin-b (aminoá-cidos 46-157), o domínio catalítico (aminoácidos 158-558), ou o domínio de nuclease e catalítico (aminoácidos 158-875) foram transfectadas em células 293T e lisados celulares foram feitos. Estes lisados foram então empregados quanto à imunoprecipitação com os MAbs de 161P2F10B ou MAb de controle indicados. O western blotting dos imunoprecipitados foi então realizado empregando um MAb policlonal policlonal anti-His que reconhece o rótulo de epítopo His presente em cada proteína recombinante. A faixa de peso molecular específica de cada proteína recombinante foi identificado por western blotting linear dos lisados por western blotting dos lisados. O domínio quecontém o epítopo de ligação de cada MAb é determinado através de identificação do padrão de proteínas recombinantes imunoprecipitadas por cada MAb. Os MAbs que se ligam ao ECD de tamanho natural e ao mapa de domínio tipo somatomedin-b- para o domínio tipo somatomedin-b. Os MAbs que se ligam ao ECD de tamanho natural e ao domínio catalítico, porém não ao mapa de domínio catalítico +nuclease, para o domínio catalítico. Os MAbs que se ligam ao ECD de tamanho natural e ao domínio catalíti-co+nuclease, porém não ao mapa de domínio catalítico para o domínio de nuclease. Tal análise é apresentada na Figura 9. Tais dados quando combinados com os dados de competição de SPR são úteis em MAbs juntos em agrupamento que se ligam aos epítopos similares ou coincidentes como a-presentado na Figura 10.

F. Determinação de Afinidade por FACS

Um painel de 33 MAbs de 161P2F10B humano foi testado quanto à sua afinidade de ligação para 161P2F10B em várias linhagens de célula (HepG2, KU812, SKRC-01, e RXF393) que expressam 161P2F10B. Resumidamente, vinte e três (23) diluições 1:2 seriais de anticorpos purificados foram incubadas com células de expressão de 161P2F10B (50.000 células por cavidade) durante a noite a 4°C a uma concentração final de 167nM para 0,01 pM. Ao término da incubação, as células foram lavadas e incubadas com anticorpo de detecção anti-hlgG-PE durante 45 min a 4°C. Após a lavagem dos anticorpos de detecção não ligados, as células foram analisadas por FACS. Os valores de MFI de cada ponto foram obtidos empregando software CelIQuest Pro foram empregados para o cálculo de afinidade empregando software Graphpad Prisma e a equação de ligação de um sítio (hyperbola). Um resumo dos valores de afinidade de treze (13) anticorpos é apresentado na Tabela VI.

G. Determinação de Afinidade por SPR

Os painéis de MAbs de 161P2F10B anti-humano purificados foram testados quanto à sua afinidade de ligação ao 161P2F10B recombinan-te purificado por SPR. Resumidamente, cada MAb humano purificado é capturado em uma superfície de chip sensor CM5. Em média aproximadamente150 RUs de cada MAb é capturado em cada ciclo. Umas séries de 5-6 diluições de 161P2F10B recombinante que varia de 1 nM a 100 nM é injetadasobre tal superfície para gerar as curvas de ligação (sensogramas) que sãoglobalmente ajustadas a um modelo de interação de 1:1 empregando software CLAMP (Myszka e Morton, 1998). A afinidade de vários MAbs de 161P2F10B, expressada como KD, definida por constante de taxa de dissociação e constante de taxa de associação empregando a equação KD = kdiss/kassoc é mostrada na Tabela VII. Os dados de afinidade e taxas de dissociação junto com a análise de afinidade por FACS (Veja, parte F, acima) fizeram parte dos critérios de seleção para MAbs para 161P2F10B.

H. Reatividade Cruzada com 161P2F10B de Camundongo

+. Os MAbs foram avaliados e caracterizados quanto à sua capacidade de reagir com ortologia de 161P2F10B de camundongo. Esta propriedade é útil para entender as conseqüências do comprometimento de MAb de 161P2F10B em células e tecidos ao empregar modelos animais de camundongo. O gene de 161P2F10B de camundongo foi clonado em seguida transitoriamente transfectado em células 293T. Para testar a reatividade cruzadade MAbs de 161P2F10B com 161P2F10B de camundongo, os anticorposforam incubados com células 293-T que expressam 161P2F10B ou células293T que expressam gene the-neo somente como um controle negativo ecélulas de Ku812 foram empregadas como controles positivos para MAb ligando-se ao 161P2F10B humano. O reconhecimento específico foi determinado empregando anticorpo de detecção secundário anti-hlgG-PE. Um histograma representativo descrevendo inter-reatividade de espécies e ligação a 161P2F10B humano é apresentado na Figura 11. Os resultados mostramque oito (8) anticorpos inter-reagem com 161P2F10B de rato.

I. Inter-Reatividade com 161P2F10B de Macaco

MAbs de 161P2F10B são avaliados e caracterizados quanto àsua capacidade de reagir com 161P2F10B de origem de macaco. Esta propriedade é útil para entender a expressão de 161P2F10B em tecidos de espécies de macaco diferentes para propósitos toxicológicos. O gene de161P2F10B de macaco cinomólogo foi clonado e seqüenciado. A homologiapara 161P2F10B humano é 100%. A inter-reatividade de todos os MAbs de161P2F10B com tecidos de macaco que expressam 161P2F10B é equivalente àquelas de células e tecidos de origem humana que expressa 161P2F10B.

Exemplo 10

Citotoxicidade Mediada Imune de Anticorpo

ADCC (Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo) é umataque lítico mediado imune em células ligadas com anticorpo alvejado paraum antígeno de superfície de célula específico. As células imunes reconhecem a porção de Fc do anticorpo através da ligação aos receptores de Fcana superfície de leucócitos, monócitos, e células NK que ativam um ataquelítico que resulta na morte da célula. Resumidamente, as células Caki construídas para expressar o 161P2F10B de antígeno alvo são incubadas in vitro com 51 cromo durante 1 hr. Após a lavagem com meio fresco, as célulasrotuladas são incubadas com 2,5 mg/ml de MAbs humano voltado para16P2F10B e células mono nucleares de sangue periférico recentemente isoladas em diferentes de relações de célula efetora para alvo (Relação E:T).

Após 4 horas a 37°C, as células são suavemente centrifugadas e o sobrenadante que contêm 51 Cr liberado das células mortas é contado em um contador Beta.

Os resultados demonstram que a morte de célula dependente deanticorpo aumentou quando a relação de efetora para alvo (E.T) foi aumentada. Nas relações de E:T de 50:1 ou maior, HA16-1.80 e HA16-1.93 demonstraram morte específica de células Caki-AGS-16 ao mesmo tempo emque Hal 6-9.69, que tem um isótipo de g-2, não mostrou nenhuma atividadeno ensaio. A especificidade do ensaio foi determinada mostrando-se que umMAb de Controle de IgGI irrelevante (H3-1.4) e incubação de células alvo ecélulas efetoras na ausência de anticorpo (Células + PBMCs) não causa amorte de célula (Veja, Tabela VIII).

Exemplo 11

Morte Secundária Mediada por Anticorpo

MAbs para 161P2F10B mediam a morte dependente de sapori-na em células KU-812. As células KU-812 são uma linhagem de célula CMLque expressa níveis elevados de 161P2F10B endógeno. As células KU-812(3000 células/cavidade) foram semeadas em uma placa de 96 cavidades. Odia seguinte, um volume igual de meio que contém 2x de concentração doanticorpo primário indicado junto com um excesso de 2-dobras anticorpopoliclonal anti-humano (Hum-Zap) conjugado com toxina de saporina (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) foi adicionado a cada cavidade.

As células foram permitidas incubar durante 5 dias a 37 graus C. Ao términodo período de incubação, MTS (Promega) foi adicionado a cada cavidade ea incubação continuou durante um adicional de 4 horas. A densidade ópticaem 450 nM foi então determinada.

Os resultados na Figura 12 mostram que MAbs de 161P2F10BHA16-9.69, HA16-1.18 e HA16-1.93 mediaram a citotoxicidade dependentede saporina em células KU-812 ao mesmo tempo em que um controle, IgGI humano não específico (H3-1.4) e outro MAb de 161P2F10B (HA16-7.200)não teve nenhum efeito. Estes resultados indicam que os fármacos ou proteínas citotóxicas podem seletivamente ser liberados para KU-812 e outrascélulas de expressão de 161P2F10B empregando um MAb de 161P2F10Bapropriado.

Exemplo 12

Geração dos Fragmentos de F(Ab')2

A geração de fragmentos de F(Ab')2 de MAbs é útil para estudaros efeitos de moléculas de MAb que retêm seu sítio de ligação de antígenobivalente porém necessita do domínio Fc efetor imune em modelos terapêuticos in vitro e in vivo. Geralmente, o protocolo é como segue, 20 mgs deMAb em 20 mM de tampão de acetato de sódio pH 4,5 é incubado com esem pepsina imobilizada (Pierce. Rockford IL) durante os tempos indicados.MAb intacto e fragmentos de Fc digeridos são removidos por cromatografiade proteína A.

O reagente pode ser empregado para tratar animais que transportam tumores de expressão de 161P2F10B. A atividade antitumorobservada com este fragmento de anticorpo pode distinguir a atividade bio-lógica intrínseca da atividade mediada por mecanismos imuno-dependentes.Exemplo 13

Expressão de MAbs Humano Empregando Métodos de DNA Recombinante

Para expressar os MAbs de 161P2F10B recombinantemente emcélulas transfectadas, as seqüências de cadeia pesada e leve variáveis deMAb de 161P2F10B são clonadas a montante das regiões constantes deIgGI de cadeia pesada humana e Igic de cadeia leve respectivamente. Ocassetes completos de cadeia leve e cadeia pesada humana de MAb de161P2F10B são clonados a jusante do promotor/realçador de CMV em umvetor de clonagem. Um sítio de poliadenilação é incluído a jusante da seqüência de codificação de MAb. Os constructos de expressão de MAb de161P2F10B recombinante são transfectadas em células 293T, Cos e CHO.

Os MAbs de 161P2F10B segregados de células recombinantes são avaliados quanto à ligação ao 161P2F10B de superfície de célula.

Exemplo 14

Ensaio In Vivo para Promoção de Crescimento de Tumor de 161P2F10B

O efeito da proteína de 161P2F10B em crescimento de célula detumor é avaliado in vivo avaliando-se o desenvolvimento de tumor e crescimento de células expressando ou necessitando de 161P2F10B. Por exemplo, os camundongos SCID são injetados subcutaneamente em cada flanco com 1 x 106 de linhagens de célula de câncer do rim (por exemplo, UG-K3)contendo vetor vazio tkNeo ou 161P2F10B. Pelo menos duas estratégiaspodem ser usadas: (1) Expressão de 161P2F10B Constitutiva sob regulamento de um promotor tal como um promotor constitutivo obtido dos genomas de vírus tal como vírus de polioma, vírus de epitelioma contagioso (UK 2.211.504 publicado em 5 de julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus de hepatite-B e o Vírus Símio 40 (SV40), ou de promoto-res de mamífero heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, contanto que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de célula hospedeira, e (2) Expressão regulou sob controlede um sistema de vetor induzível, tal como ecdisona, tetraciclina, etc, contanto que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de célulahospedeira. O volume do tumor é então monitorado por medição de calibreao aparecimento de tumores palpáveis e seguido com o passar do tempopara determinar se as células de expressão de 161P2F10B crescem a umataxa mais rápida e se os tumores produzidos por células de expressão de 161P2F10B demonstram características de agressividade alterada (por exemplo, metástase realçada, vascularização, reação reduzida às fármacos quimioterapêuticas).

Adicionalmente, os camundongos podem ser implantados com 1x 105 das mesmas células ortotopicamente para determinar se 161P2F10B tem um efeito sobre o crescimento local no rim, e se 161P2F10B afeta a capacidade das células de metástase (Miki T e outros, Oncol Res. 2001; 12:209; Fu X e outros, Int, J Câncer. 1991, 49:938). O efeito de161P2F10B na formação e crescimento de tumor pode ser avaliado injetando-se células de tumor do rim ou fígado intratibialmente.

O ensaio é também útil para determinar o efeito inibidor de161P2F10B de composições terapêuticas candidatas, tal como, por exemplo, intracorpos de 161P2F10B, moléculas de anti-sentido de 161P2F10B e ribozimas.

Exemplo 15

Inibicão Mediada por Anticorpo Monoclonal 161P2F10B de Tumores In VivoA expressão significante de 161P2F10B na superfície de célulade tecidos de tumor, junto com sua expressão restritiva em tecidos normaistorna 161P2F10B um bom alvo para terapia de anticorpo. Similarmente,161P2F10B é um alvo para imunoterapia com base em célula T. Desse modo, a eficácia terapêutica de MAbs de 161P2F10B em modelos de camundongo de xenoenxerto de câncer de rim e modelos de camundongo de xenoenxerto de câncer de fígado humano, é avaliado empregando-se linhagens de célula tal como FtXF-393 e HepG2, bem como modelos de xenoenxerto de célula clara renal humana tal como UG-K3.

A eficácia de anticorpo em crescimento e formação de metástase de tumor é estudada, por exemplo, em um modelo de xenoenxerto de câncer de fígado ou rim ortotópico de camundongo. Os anticorpos podemser não conjugados, como descrito neste Exemplo, ou podem ser conjugados para uma modalidade terapêutica, como apreciado na técnica. Os MAbs de 161P2F10B inibem a formação de ambos xenoenxertos de câncer renal ehepático. Os MAbs de 161P2F10B também retardam o crescimento de tumores ortotópicos estabelecidos e sobrevivência prolongada de camundongos portando tumor. Estes resultados indicam a utilidade de MAbs de161P2F10B no tratamento de estágios locais e avançados de câncer de fígado e rim e aqueles cânceres apresentados na Tabela I.

A administração dos MAbs de 161P2F10B levou ao retardamento de crescimento de tumor ortotópico estabelecido e inibição de metástase a sítios distantes, resultando em uma prolongação significante na sobrevivência de camundongos portanto tumor. Estes estudos indicam que 161P2F10B é um alvo atrativo para imunoterapia e demonstram o potencialterapêutico de MAbs de 161P2F10B para o tratamento de câncer de fígado erim metastático e local. Este exemplo demonstra que MAbs de 161P2F10Bnão conjugados são efetivos para inibir o crescimento de xenoenxertos detumor de rim humano desenvolvido em camundongos SCID; Conseqüentemente uma combinação de tais MAbs eficaz também é efetiva.

Inibição de tumor empregando múltiplos MAbs de 161P2F10B

Materiais e Métodos

Anticorpos Monoclonais de 161P2F10B:

Os anticorpos monoclonais foram elevados contra 161P2F10Bcomo descrito no Exemplo intitulado "Geração de Anticorpos Monoclonais de161P2F10B (MAbs)". Os MAbs são caracterizados por ELISA, western blotting, FACS, e imunoprecipitação quanto à sua capacidade de se ligar ao161P2F10B. Os dados do mapeamento de epítopo para MAbs de0 161P2F10B, como determinado por ELISA e análise Ocidental, reconhece

* os epítopos na proteína de 161P2F10B. A análise imuno-histoquímica de

^ tecidos e células de câncer e normais com estes anticorpos é realizada.

Os MAbs são purificados de ascites ou sobrenadantes de culturade tecido de hibridoma por cromatografia de Sefarose de Proteína-G ou Proteína-A, dializados contra PBS, esterilizados em filtro, e armazenados a -20°C. As determinações de proteína são realizadas por um ensaio Bradford(Bio-Rad, Hercules, CA). Um MAb terapêutico ou um coquetel que compreende uma mistura de MAbs individuais, é preparado e empregado para otratamento de camundongos recebendo injeções subcutâneas ou ortotópicasde xenoenxertos de tumor de UG-K3 e RXF-393.Linhagens de Célula e Xenoenxertos

A linhagem de célula de câncer de rim RXF-393 e SKRCOI bemcomo a linhagem de célula de câncer de fígado HepG2 (American Type Culture Collection) são mantidas respectivamente em RPMI e DMEM, completados com L-glutamina e 10% de FBS.

O xenoenxerto de UG-K3 é inoculado em camundongos ICR-imunodeficientes combinados grave machos de 6 a 8 semanas de idade(SCID) (Taconic Farms) por implante de trocarte s.c. (Craft, N., e outros, NatMed. 1999, 5:280). As suspensões de célula única de células de tumor UGK3 são preparadas como descrito em Craft, e outros. Outras linhagens de célula são empregadas também.

Modelos de Camundonqo de Xenoenxerto.

Os tumores subcutâneos (s.c). são gerados por injeção de 1 x106 células de câncer misturadas a uma diluição de 1:1 com Matrigel (Collaborative Research) no flanco direito de camundongos SCID machos. Paratestar a eficácia de anticorpo na formação de tumor, isto é, as injeções deanticorpo são começadas no mesmo dia como as injeções de célula de tumor. Como um controle, os camundongos são injetados ou com IgG de camundongo purificado (ICN) ou PBS; ou um MAb purificado que reconheceum antígeno irrelevante não expressado em células humanas. Em estudospreliminares, nenhuma diferença é encontrada entre IgG de camundongo ouPBS no crescimento de tumor. Os tamanhos de tumor são determinadosatravés de medições de calibre, e o volume de tumor é calculado comocomprimento x largura x altura. Os camundongos com tumores subcutâneosmaiores do que 1.5 cm em diâmetro são sacrificados.

As injeções ortotópicas são realizadas sob anestesia empregando-se cetamina/xilazina. Para estudos ortotópicos do rim, uma incisão é feitapelo abdômen para expor o rim e células de tumor UG - K3 ou RXF-393 (2 x106) misturadas com Matrigel são injetadas na cápsula do rim em um volumede 10-jjü. Para monitorar o crescimento de tumor, os camundongos são apalpados. Os camundongos são segregados em grupos para os tratamentos apropriados, com MAbs de 161P2F10B ou de controle sendo injetados i.p.

MAbs de 161P2F10B Inibem o Crescimento de Tumores de Xenoenxerto de

Expressão de 161P2F10B

O efeito de MAbs de 161P2F10B na formação de tumor é testado empregando-se modelos ortotópicos de UG-K3 e RXF-393. Quandocomparado com o modelo de tumor s.c, o modelo ortotópico que requer injeção de células de tumor diretamente no rim de camundongo, resulta em um crescimento de tumor local, desenvolvimento de metástase em sítiosdistais, deterioração da saúde do camundongo, e morte subseqüente. Estascaracterísticas tornam o modelo ortotópico mais representativo de progressão de doença humana e permite seguir o efeito terapêutico de MAbs em pontos finais clinicamente pertinentes.

Conseqüentemente, as células de tumor são injetadas no rim docamundongo, e 2 dias depois, os camundongos são segregados em doisgrupos e tratados com qualquer um dos dois: a) 250-1000 [ig de MAb de161P2F10B, ou b) anticorpo de controle três vezes por semana durante duasa cinco semanas.

Uma vantagem principal dos modelos de câncer ortotópico é acapacidade de estudar o desenvolvimento de metástase. A formação de metástase em camundongos portando tumores ortotópicos estabelecidos é estudada por análise IHC em seções do tecido.

Outra vantagem de modelos de câncer de xenoenxerto é a capacidade de estudar a neovascularização e angiogênese. O crescimento de tumor é em parte dependente do novo desenvolvimento de vaso sangüíneo.

Embora o sistema capilar e rede de sangue em desenvolvimento sejam deorigem de hospedeiro, a iniciação e arquitetura da neovasculatura é regulada pelo tumor de xenoenxerto (Davidoff e outros, Clin Câncer Res. (2001)7:2870; Solesvik e outros, Eur J Câncer Clin Oncol. (1984) 20:1295). O efeitodo anticorpo e molécula pequena na neovascularização é estudado de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tal como por análise de IHC de tecidos de tumor e seu microambiente circunvizinho.

Os camundongos portando tumores de ortotópico estabelecidossão administrados com injeções de MAb de 161P2F10B ou anticorpo decontrole durante um período de 4 semanas. S camundongos em ambos osgrupos são permitidos estabelecer um fardo de tumor alto, para garantir umafreqüência elevada de formação de metástase nos pulmões do camundongo.

Os camundongos são então mortos e suas bexigas, fígados, osso e pulmõessão analisados quanto à presença de células de tumor por análise de IHC.Estes estudos demonstram uma ampla eficácia de antitumor de anticorposanti-161P2F10B na iniciação e progressão de câncer de rim em modelos decamundongo de xenoenxerto. Os anticorpos anti-161P2F10B inibem a formação de tumor de tumores bem como retardando o crescimento de tumores já estabelecidos e prolongam a sobrevivência dos camundongos tratados. Além disso, os MAbs de 161P2F10B demonstram um efeito inibidordramático na expansão de tumor de rim local para sítios distais, até mesmona presença de uma carga de tumor grande. Desse modo, os MAbs de161P2F10B são eficazes nos pontos finais clinicamente relevantes principais(crescimento de tumor), prolongação de sobrevivência, e saúde.

Efeito de MAbs de 161P2F10B no Crescimento de Carcinoma de Célula Renal Humana em Camundongos

O seguinte protocolo foi empregado. As células UG-K3 de câncer renal de célula clara derivada de paciente (2,0 x 106 células) foram injetadas subcutaneamente em camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 em cada grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmente (i.p). no dia 0 com MAbs de tratamento ou controlede MAb de isótipo como indicado. Os animais foram tratados duas vezessemanalmente para um total de 8 doses em 750 jig/dose até dia 27 de estudo. O crescimento de tumor foi monitorado empregando medições do calibrador a cada 3 a 4 dias como indicado. Os resultados mostram que MAbsde 161P2F10B H16-1.29.1.1, Hal 6-1(3,5)27.1, H16-9.69 e Hal 6-1(1)11 es-tatisticamente e significantemente inibiram o crescimento de UG-K3 de xenoenxerto de câncer renal humano implantado subcutaneamente em camundongos SCID (p < 0,05). (Figura 13).

Em outra experiência, as células de tumor UG-K3 de câncer renal humano (2,0 x 106 células) foram subcutaneamente injetadas em camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizados em grupos(n=10 camundongos em cada grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmente (i.p). no Dia 0 com MAbs de tratamento ou MAb de controle de isótipo como indicado. Os animais foram tratados duas vezes semanalmente para um total de 6 doses até o dia 20 de estudo. O crescimento de tumor foimonitorado empregando medições de calibre a cada 3 a 4 dias como indicado. Os resultados mostram que MAbs de 161P2F10B Hal 6-11(3,5)27 e Hal6-I(3,5)18 estatisticamente e significantemente inibiram o crescimento deUG-K3 de xenoenxerto de câncer renal humano implantado subcutaneamente em camundongos SCID (P < 0,05). (Figura 14).

Em outra experiência, as células de tumor RXF-393 de câncerrenal humano (2,0 x 106 células) foram subcutaneamente injetadas em camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 em cada grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmente (i.p). nodia 0 com MAbs de tratamento ou controle de MAb de isótipo como indicado.Os animais foram tratados duas vezes semanalmente para um total de 7doses em 400 ng/dose até o dia 22 do estudo. Crescimento de tumor foimonitorado empregando as medições de calibre a cada 3 a 4 dias como indicado. Os resultados mostram que MAbs de 161P2F10B Hal6-I(3,5)18 (PO,01), H16-1,68 (P < 0,05) e Hl 6-9,44 (P < 0,05) estatisticamente e significantemente inibiram o crescimento de RXF-393 de xenoenxerto de câncer renal humano implantado subcutaneamente em camundongos SCID. (Figura 15).

Em outra experiência, as células de tumor SKRC-01 de câncerrenal humano (2,5 x 106 células) foram subcutaneamente injetadas em camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 em cada grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmente (i.p). nodia O com MAbs de tratamento ou controle MAb de isótipo como indicado.Os animais foram tratados duas vezes semanalmente para um total de 7doses em 250 ^.g/dose até o dia 22 de estudo. O crescimento de tumor foimonitorado empregando medições de calibre a cada 3 a 4 dias como indicado. Os resultados mostram que MAbs de 161P2F10B Hl 6-1.68 (P<0,05), H 16-7.8 (P < 0,05), H 16-9.44 (P<0,05) e H 16-3.4 (P<0,01) estatisticamente esignificantemente inibiram o crescimento de SKRC-01 de xenoenxerto decâncer renal humano implantado subcutaneamente em camundongos SCID. (Figura 16).

Em outra experiência, as células de tumor UG-K3 de câncer renal humano (2,0 x 106 células) foram subcutaneamente injetadas em camundongos SCID machos. Os ratos foram aleatorizados em grupos (n=10em cada grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmente (i.p). no dia 0com MAbs de tratamento ou controle de MAb de isótipo como indicado. Osanimais foram tratados duas vezes semanalmente para um total de 6 dosesem 750 |ng/dose até o dia 19 de estudo. O crescimento de tumor foi monitorado empregando medições de calibre a cada 3 a 4 dias como indicado. Os resultados mostram que MAbs de 161P2F10B H16-1.29.1.1 (P < 0,05), Hal 6-1(3,5)56 (P < 0,01) e Hal 6-1(2,4)4 (P<0,05) estatisticamente e significantemente inibiram o crescimento de UG-K3 de xenoenxerto de câncer renalhumano implantado subcutaneamente em camundongos SCID. (Figura 17).

Em outra experiência, as células de tumor UG-K3 de câncer renal humano (2,0 x 106 células) foram subcutaneamente injetadas em camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 em cada grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmente (i.p). nodia 0 com MAbs de tratamento ou controle de MAb de isótipo como indicado.Os animais foram tratados duas vezes semanalmente para um total de 7doses em 500 |ig/dose até o dia 22 de estudo. O crescimento de tumor foimonitorado empregando medições do calibre a cada 3 a 4 dias como indicado. Os resultados mostram que MAbs de 161P2F10B H16-1.93 e Hal 6- 1(3,5)18 estatisticamente e significantemente inibiram o crescimento de UGK3 de xenoenxerto de câncer renal humano implantado subcutaneamenteem camundongos SCID (P<0,05). (Figura 18).

Efeito de um Coquetel de MAbs de 161P2F10B no Crescimento de CâncerRenal Humano em Camundongos

Nesta experiência, as células de tumor UG-K3 de câncer renalhumano (2,0 x 106 células) foram subcutaneamente injetadas em camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 em cada grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmente (i.p). nodia 0 como indicado. Para tratamento de MAb de 161P2F10B, três MAbs em200 ug cada foram misturados juntos em cada dosagem. Os animais foramtratados duas vezes semanalmente para um total de 7 doses até o dia 27 deestudo. O crescimento de tumor foi monitorado empregando as medições docalibre a cada 3 a 4 dias como indicado. Os resultados mostram que o tratamento de combinação com um coquetel de MAbs de 161P2F10B estatisticamente e significantemente inibiu o crescimento de UG-K3 de xenoenxertode câncer renal humano implantado subcutaneamente em camundongosSCID (P<0,05). (Figura 19).

Efeito de um tratamento de Combinação de MAbs de 161P2F10B e Avastin®(bevacizumab) no crescimento de xenoenxertos de câncer renal humano emcamundongos

Nesta experiência, as células de tumor UG-K3 de câncer renalhumano (2,0 x 106 células) foram subcutaneamente injetadas em camundongos SCID machos. Os camundongos foram aleatorizados em grupos (n=10 camundongos em cada grupo) e o tratamento iniciado intraperitonealmente (i.p). no Dia 0 com MAbs de tratamento, Avastina, ou controle de MAb de isótipo como indicado. Os animais foram tratados duas vezes semanalmente para um total de 6 doses até o dia 18 de estudo. O crescimento detumor foi monitorado empregando as medições do calibre a cada 3 a 4 dias como indicado.

Os resultados mostram que MAbs de 161P2F10B H16-1.93 eHal6-1(3, 5)18,1, quando combinado com Avastin® (bevacizumab), estatisticamente e significantemente inibiu o crescimento de UG-K3 de xenoenxerto de câncer renal humano implantado subcutaneamente em camundongosSCID (p< 0,01). (Figura 20).

Os resultados destas experiências mostram que MAbs de161P2F10B podem ser empregados para propósitos terapêuticos e diagnósticos para tratar e administrar os cânceres apresentados na tabela I.

Exemplo 16

Uso Terapêutico e Diagnóstico de Anticorpos Anti-161P2F10B em Humanos.

Os anticorpos monoclonais anti-161P2F10B são seguramente eefetivamente empregados propósitos diagnósticos, profiláticos, prognósticose/ou terapêuticos em seres humanos. O western blotting e análise imunohistoquímica de tecidos de câncer e xenoenxertos de câncer com MAb anti-161P2F10B mostram manchando extenso forte em carcinoma porém níveissignificantemente mais baixos ou indetectáveis em tecidos normais. A detecção de 161P2F10B em carcinoma e em doença metastática demonstra a utilidade do MAb como um indicador diagnóstico e/ou prognóstico.

Os anticorpos anti-161P2F10B são então empregados em aplicações diagnosticastal como imuno-histoquímica de espécimes de biópsia do rim para detectar o câncer de pacientes suspeitos.

Como determinado por citometria de fluxo, MAb anti-161P2F10Bespecificamente se liga às células de carcinoma. Desse modo, os anticorpos anti-161P2F10B são empregados em aplicações de imageamento de corpointeiro diagnosticas, tal como radioimunocintilografia e radioimunoterapia,(veja, por exemplo, Potamianos S., e outros. Anticâncer Res 20(2A):925-948(2000)) para a detecção de cânceres localizados e metastáticos que exibemexpressão;de 161P2F10B. O derramamento ou liberação de um domínioextracelular de 161P2F10B no ambiente extracelular, tal como aquele vistopara fosforodiesterase alcalina B10 (Meerson, N., R., Hepatology 27:563-568(1998)), permite a detecção de diagnóstico de 161P2F10B por anticorposanti-161P2F10B em amostras de urina e/ou soro de pacientes suspeitos.

Os anticorpos anti-161P2F10B que especificamente ligam161P2F10B são empregados em aplicações terapêuticas para o tratamentode cânceres que expressam 161P2F10B. Os anticorpos anti-161P2F10B sãoempregados como uma modalidade não conjugada e como forma conjuga-da, na qual os anticorpos estão ligados a umas das várias modalidades terapêuticas ou de imageamento bem conhecidas na técnica, tal como um pródrogas, enzimas ou radioisótopos. Em estudos pré-clínicos, os anticorposanti-161P2F10B não conjugados e conjugados são testados quanto à eficácia de prevenção de tumor e inibição de crescimento nos modelos de xeno-enxerto de câncer de camundongo SCID, por exemplo, modelos de câncerdo rim, (veja, por exemplo, o Exemplo intitulado "Inibição Mediada por Anticorpo Monoclonal de 161P2F10B de Tumores In Vivo"). Quaisquer dos anticorpos anti-161P2F10B conjugados e não conjugados são empregados como uma modalidade terapêutica em experiências clínicas humanas, ou sozinhos ou em combinação com outros tratamentos tal como descrito nos seguintes Exemplos.

Exemplo 17

Experiências Clínicas Humanas para o Tratamento e Diagnose de Carcinomas Humanos através do uso de MAbs de 161P2F10B

Os anticorpos são empregados de acordo com a presente invenção que reconhece um epítopo em 161P2F10B, e são empregados notratamento de certos tumores, preferivelmente aqueles listados na Tabela I.Com relação a cada uma destas indicações, três abordagens clínicas são prosperamente procuradas.

I). Terapia Adjuntiva: Na terapia adjuntiva, os pacientes são tratados com MAbs de 161P2F10B (ou nu ou conjugou a um agente) em combinação com um agente quimioterapêutico ou antineoplásico e/ou terapia deradiação ou uma combinação destes. Os alvos de câncer primários, tal comoaqueles listados na Tabela I, são tratados sob protocolos padrão pela adiçãode MAbs de 161P2F10B para terapia de primeira e segunda linha padrão.

Os desígnios de protocolo tratam a eficácia quando avaliada pelos seguintesexemplos, incluindo porém não limitado a, redução na massa de tumor delesões primárias ou metastáticas, sobrevivência livre de progressão aumentada, sobrevivência global, melhora de saúde dos pacientes, estabilização da doença, bem como capacidade de reduzir as doses habituais de quimioterapia padrão e outros agentes biológicos. Estas reduções de dosagempermitem terapia adicional e/ou prolongada reduzindo-se a toxicidade relacionada com a dose do agente quimioterapêutico ou biológico. MAbs de 161P2F10B são utilizados em várias experiências clínicas adjuntivas emcombinação com os agentes quimioterapêuticos ou antineoplásicos.

II). Monoterapia: Com relação ao uso dos MAbs de 161P2F10B(ou nu ou conjugado) em monoterapia de tumores, os anticorpos são administrados a pacientes sem um agente quimioterapêutico ou antineoplásico.

Em uma modalidade, a monoterapia é conduzida clinicamente em pacientesde câncer de estágio terminal com doença metastática extensa. Os desígnios do protocolo tratam a eficácia quando avaliada pelos seguintes exemplos, incluindo porém não limitado a, redução na massa de tumor de lesõesprimárias ou metastáticas, sobrevivência livre de progressão aumentada,sobrevivência global, melhora de saúde dos pacientes, estabilização da doença, bem como a capacidade de reduzir as doses habituais de quimioterapia padrão e outros agentes biológicos.

III). Agente de Imageamento: Através da ligação de um radionuclídeo (por exemplo, iodo ou ítrio (I131, Y90) aos MAbs de 161P2F10B, os anticorpos radiorrotulados são utilizados como um agente de imageamentoe/ou diagnóstico. Em uma tal função, os anticorpos rotulados localizam aambos os tumores sólidos, bem como, lesões metastáticas de células queexpressam 161P2F10B. Com relação ao uso do MAbs de 161P2F10B comoagentes de imageamento, os anticorpos são empregados como um adjuntoao tratamento cirúrgico de tumores sólidos, tanto como uma triagem précirúrgica bem como um seguimento pós-operativo para determinar que o tumor permanece e/ou retorna. Em uma modalidade, um anticorpo (111ln)-161P2F10B é empregado como um agente de imageamento em uma experiência clínica humana de Fase I em pacientes que têm um carcinoma que expressa 161P2F10B (por analogia veja, por exemplo, Divgi e outros J. Natl.

Câncer Inst. 83:97-104 (1991)). Os pacientes são seguidos com câmera gama anterior e posterior padrão. Os resultados indicam que as lesões primárias e lesões metastáticas são identificadas.

DosagemOs regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer aresposta desejada ideal. Por exemplo, um único bolo pode ser administrado,várias doses divididas podem ser administradas com o passar do tempo ou adose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicadopelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade dedosagem como empregado aqui se refere às unidades fisicamente discretasadequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a seremtratados; cada unidade que contém uma quantidade predeterminada decomposto ativo calculou produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico exigido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção é ditada por e diretamente dependente (a)das características únicas do anticorpo e do efeito terapêutico ou profiláctico particular a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes na técnica de compor tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Uma faixa não-limitante exemplar para uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo administrado em combinação de acordo com a invenção é pelo menos 1 mg/kg, pelo menos 5 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg, mais do que 10 mg/kg, ou pelo menos 15 mg/kg, por exemplo, 1-21 mg/kg, ou, por exemplo, 5-21 mg/kg, ou, por exemplo, 5-18 mg/kg, ou, porexemplo, 10-18 mg/kg, ou, por exemplo, 15 mg/kg. A modalidade de doseelevada da invenção se refere a uma dosagem de mais do que 10 mg/kg.Deve ser notado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviado, e pode incluir doses únicas ou múltiplas.

Deve ser também entendido que para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos deveriam ser ajustados com o passar do tempo de, acordo com a necessidade individual e de acordo com o julgamentoprofissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições, e que as faixas de dosagem, apresentadas aqui são exemplares somente e não é pretendido limitar o escopo ou prática da composição reivindicada.Plano de Desenvolvimento Clínico (CDP)

O CDP segue e desenvolve os tratamentos de MAbs de161P2F10B com relação a terapia adjuntiva, monoterapia, e/ou como umagente de imageamento. As tentativas inicialmente demonstram segurançae, portanto confirmam eficácia em doses repetidas. As experiências são rótu-lo aberto comparando a quimioterapia padrão com terapia padrão maisMAbs de 161P2F10B. Como será apreciado, um critério não-limitante quepode ser utilizado com relação a matrícula de pacientes é que os níveis deexpressão de 161P2F1OB em seus tumores como determinado por biópsia.

Como com qualquer proteína ou terapêutico com base em infu-são de anticorpo, preocupações de segurança estão principalmente relacio-nadas com (i) síndrome de liberação de citocina, isto é, hipotensão, febre,tremores, frios; (ii) o desenvolvimento de uma resposta imunogênica ao ma-terial (isto é, desenvolvimento de anticorpos humanos pelo paciente ao tera-pêutico de anticorpo, ou resposta de HAHA); e, (iii) toxicidade às célulasnormais que expressam 161P2F10B. Os testes padrões e de acompanha-mento são utilizados para monitorar cada destas preocupações de seguran-ça. Descobriu-se que os MAbs de 161P2F10B são seguros sob administração humana.

Exemplo 18

Estudos Funcionais de 161P2F10B

A. Interferência de RNA (RNAi)

RNAi é um mecanismo de silenciamento de gene pós-transcricional ativado por RNA de filamento duplo (dsRNA) que induz degra-dação de mRNA específica que leva às alterações na expressão de proteínae subseqüentemente na função de gene. A tecnologia de RNAi foi prospe-ramente empregada em células de mamífero para silenciar os genes preten-didos. Em células de mamífero, estes dsRNAs (chamados RNA ou siRNA deinterferência curta) ativam a via de RNAi, levando à degradação de mRNAsespecíficos de seqüência alvo. Veja, Elbashir S.M., e outros, Duplexes of 21-nucleotido RNAs Mediate RNA interíerence in Cultured Mammalian Cells,Nature 411 (6836):494-8 (2001).Conseqüentemente, o RNAi foi empregado para investigar afunção do antígeno de 161P2F10B. Para gerar siRNAs específicos para161P2F10B, algoritmos foram empregados para predizer oligonucleotídeosque exibem os parâmetros moleculares críticos (conteúdo de G:C, temperatura de fusão, etc), e têm a capacidade de reduzir os níveis de expressão da proteína de 161P2F10B significantemente quando introduzidos nas células.

De acordo com este Exemplo, as composições de siRNA de 161P2F10Bempregadas correspondem ao ORF de ácido nucléico, seqüências não trasladadas 5' ou 3' da proteína de 161P2F10B ou subseqüências destes. Desse modo, as subseqüências de siRNA empregadas desta maneira geralmentesão 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35 ou mais do que 35 nucleotídeos de RNAcontíguos no comprimento. Estas seqüências de siRNA são complementarese não complementar a pelo menos uma porção da seqüência de não codificação ou codificação de mRNA. Em uma modalidade preferida, as subseqüências são 19-25 nucleotídeos em comprimento, mais preferivelmente 21-23 nucleotídeos em comprimento. Em modalidades preferidas, este siRNAalcança uma redução substancial de células de antígeno de 161P2F10B queexpressam a proteína e têm o potencial de reverter um fenótipo encontrado em uma doença particular imitando-se a inibição do 161P2F10B alvo. Portanto, a correlação da redução do gene com fenótipo celular funcional é crítica para estabelecer as conclusões válidas e excluir a toxicidade ou outrosefeitos não específicos.

Para validar a abordagem, o nível de silenciamento de161P2F10B em transfecção de RNAi foi avaliado em células de câncer defígado HepG2 igualmente por manchamento de superfície de célula empregando um separador de célula ativado por fluorescência (FACS) e western blotting (WB). As seguintes amostras foram preparadas: LF2k (células tratadas com o reagente de transfecção LF2k somente), siRNA dúplex CTI de controle e Qa dúplex específico 161P2F10B (as seqüências estão descritas abaixo). As transfecções de siRNA de mamífero: O dia antes da transfecçãode siRNA, as linhagens de célula foram semeadas em meios (RPMI 1640com 10% de antibióticos FBS w/o) a 2x103 células/cavidade em 80 uJ (forma-to de placa de 96 cavidades). Em paralelo com o oligo siRNA específico de161P2F10B, as seguintes seqüências foram incluídas em cada experiênciacomo controle: um) células transfectadas Mock com Lipofectamine 2000 (In-5 vitrogen, Carlsbad, CA) e tampão de anelamento (LF2k); b) siRNA não es-pecífico de CTI (seqüência alvejada: 5'-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3')(SEQ ID NO: 166); c) siRNA específico de Eg5 (seqüência alvejada: 5'-AACTGAAGAGCTGAAGACAATAA-S) (SEQ ID NO: 167) e Qa de siRNAespecífico de 161P2F10B (seqüência alvejada 5'-AACCTCATGGCTGGAAGAAAA-3') (SEQ ID NO: 168). Os siRNAs foramempregados nas concentrações indicadas e 1 |ig/ml de concentração finalde Lipofectamine 2000.

O procedimento foi como segue: Os siRNAs foram diluídos pri-meiro em OPTIMEM (meio de transfecção sem soro, Invitrogen) em 0,1 jjJvl(concentrado em 10 dobras) e incubados 5-10 min RT. Lipofectamine 2000foi diluído em 10 jig/ml (concentrado em 10 dobras) para as transfecções denúmero total e incubado 5-10 minutos em temperatura ambiente (RT). Asquantidades apropriadas de Lipofectamine 2000 concentrado de 10 dobrasdiluído foram misturadas 1:1 com siRNA concentrado de 10 dobras diluído eincubado a RT durante 20-30" (solução de transfecção concentrada de 5dobras). Vinte (20) \ú das soluções de transfecção concentradas de 5 dobrasforam adicionados às respectivas amostras e incubados a 37°C durante 96horas antes da análise. Em cada caso, as células foram incubadas durante72h antes da análise por FACS com o MAb 97 A6 rotulado por PE específicode 1P2F10B (Beckman-Coulter) ou por WB. O Qa dúplex de siRNA de161P2F10B eficazmente infra-regulou o gene alvejado como detectado i-gualmente por FACS e por WB (Figura 21).

Outra modalidade da invenção é um método para analisar a fun-ção de 161 P2F10B em proliferação de célula. A perda de controle de proli-feração de célula é uma marca de células cancerosas; entretanto, a funçãodo silenciamento de proteína de 161P2F10B específica nos ensaios de proli-feração de célula foi tratado. A incorporação do precursor rotulado (isto é,3H-Timidina) em DNA é diretamente proporcional à quantidade de divisõesde célula que ocorrem na cultura. As células HepG2 foram tratadas comconcentrações diferentes (variando de 200nM a 20 pM) de duplexes de siR-NA de controle (CTI de controle negativo e Eg5 de controle positivo) bemcomo o Qa dúplex de siRNA de 161P2F10B, e o seu impacto sobre a prolife-ração de célula foi avaliado pelo ensaio de incorporação de 3H-Timidina. Osdados mostrados na Figura 22 A indicam que os níveis de superfície de célu-la de 161P2F10B (Figura 21) se correlacionam com a proliferação de célula,uma vez que a redução dos níveis de proteína de 161P2F10B correspondeua um impacto na capacidade das células de sintetizar o DNA sob estas condições.

Outro método empregado para medir a proliferação de célula é oensaio de formação clonogênica/colônia. Neste ensaio, um número definidode células é semeado sobre a matriz apropriada e o número e tamanho dascolônias formadas após um período de crescimento seguinte ao tratamentode siRNA é avaliado. As células HepG2 positivas de 161P2F10B ou célulasUMUC3 negativas de 161P2F10B foram tratadas com LF2k dos seguintesduplexes de siRNA: CTI, Eg5 e 161P2F10B Qa. Como mostrado na Figura22B, o dúplex 161P2F10B Qa reduziu igualmente o número e o tamanho dascolônias formadas somente nas células de expressão de 161P2F10B endo-geneamente e não teve nenhum efeito nas células negativas de UMUC3, secorrelacionando com o efeito na proliferação de célula previamente observa-do. Em geral, os dados indicam que a proliferação e crescimento de célula,que são as marcas principais do fenótipo de câncer, são regulados por ex-pressão do 161P2F10B em células de câncer.

A migração de célula desempenha um papel central em umaampla variedade de fenômenos biológicos. No organismo adulto, a migraçãode célula permanece proeminente em ambas as condições fisiológicas e pa-tológicas normais. Na metástase, as células de tumor migram da massa detumor inicial para localizar em outras áreas do corpo. A migração de célula éavaliada através de vários métodos diferentes, dos quais, o mais amplamen-te aceito é o ensaio de câmara de Boyden. Este ensaio usa uma câmaraalém da cavidade de plástico oco com uma membrana porosa (as membra-nas podem ser cobertas com uma matriz extra celular se necessário). Estacâmara é suspensa sobre uma cavidade maior que pode conter meios maisquimioatrativos. As células são colocadas dentro da câmara e permitidasmigrar através dos poros para o outro lado da membrana; as células migra-tórias são então manchadas e contadas. O papel potencial de 161P2F10Bna regulação da migração de célula foi motivado. O Qa duplice de161P2F10B selecionado foi testada em duas linhagens de célula endoge-namente expressando 161P2F10B (HepG2 e A-704) no ensaio de migraçãode câmara Boyden. Como mostrado na Figura 23, o silenciamento de161P2F10B com oligo Qa significantemente reduziu o nível de migração decélula nas inserções revestidas de colágeno I relativo ao oligo CT1 de con-trole em ambos os sistemas A-704 (câncer de célula clara renal) e HepG2(câncer mais ao vivo).

Para também apoiar o papel de 161P2F10B na migração de cé-lula, foi procurado investigar o mecanismo molecular sujeito a este fenótipo.Uma das principais redes de transdução de sinal conduzindo a motilidade decélula é a via de Rho/Rac/Cdc42. Rho é um membro de uma família de GT-Pases pequeno que regula a morfologia e motilidade de célula por reorgani-zação de citoesquelética de actina na resposta aos sinais extracelulares.Rho ativo aumenta a estabilidade de estruturas com base em actina tal comofibras de tensão e adesões focais. O desregramento de atividade de Rho foiligado às alterações igualmente na proliferação de célula e motilidade decélula reorganizando-se o controle de expressão de gene e citoesqueleto deactina. Foi avaliado se a expressão de 161P2F10B regula a atividade deRho empregando-se o ensaio destrutivo de Rhotekin que usa a proteína deRhotekin que especificamente se liga a e precipita GTP-Rho ativo, porémnão GDP-Rho inativo de lisados de célula. A Figura 23B mostra que o silen-ciamento de 161P2F10B significantemente reduz a expressão de superfíciede célula de 161P2F10B em células HepG2 e concomitantemente reduz aativação de Rho B induzida por Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF)(Rho B - GTP). Juntos, os resultados na Figura 23 indicam que 161P2F10Bdesempenha um papel na migração de célula de câncer por ativação daRho-família GTPases (Rho B), e é crítico para a metástase de células decâncer de expressão de 161P2F1OB durante tumorigênese.

Para o gene de 161P2F10B, os estudos de RNAi facilitam o entendimento da contribuição do produto de gene em vias de câncer. Tais moléculas de RNAi ativas têm uso identificando os ensaios para avaliar osMAbs que são terapêuticas de antitumor ativos. Além disso, os siRNA sãoadministrados como terapêuticas para pacientes de câncer para reduzir ocrescimento maligno de vários tipos de cânceres, incluindo aqueles listadosna Tabela 1. Quando 161P2F10B desempenha um papel na sobrevivênciade célula, a proliferação de célula, gênese de tumor, ou apoptose, é empregado como um alvo para propósitos diagnóstico, prognóstico, preventivo e/ou terapêuticos.

B. Ensaio de mobilização de Ca2+ induzido por ATP modulado por161P2F1 OB em celas expressando 161P2F1 OB.

161P2F10B é uma pirofosfatase/fosfodiesterase de superfície decélula (PDE) capaz de hidrolisar o ATP de nucleotido de purina. A mutaçãodo domínio catalítico de PDE a aminoácido 205 de treonina para alanina(T205A) elimina a atividade de PDE de 161P2F10B (Figura 24). Além de ATP, outros análogos com base em purina são conhecidos por serem substratos para a atividade enzimática de 161P2F10B. O ATP presente no ambiente extracelular modula uma variedade de respostas biológicas, algumasdas quais são mediadas por ligação e ativação de receptores acoplados deG-proteína P2Y (GPCR) que induz a transdução de sinal através da mobilização de Ca2+ de víveres intracelulares e por canais de Ca2+ de passagemde ligando P2X que modulam o fluxo de Ca2+ de fontes extracelulares (Veja,McLRNAon, J.G. (2005) o J. NeuroSci. Res. 81:349-356). Então o efeito deATP em mobilização de cálcio em células que expressam 161P2F10B foiinvestigado. A super-expressão de 161P2F10B na linhagem de célula Cakiresulta em diferenças notáveis na mobilização de cálcio citoplásmica emresposta ao tratamento com nucleotídeos de purina e análogos de nucleotidode purina. Foi empregado imageamento de célula única para registrar a mo-bilização de Ca2+ intracelular de células Caki-1 que expressam qualquerdos dois 161P2F10B tipo silvestre (wt), mutante de T205A de 16ÍP2F10Bdestituído de atividade de PDE, ou células de controle que expressam somente o gene de resistência a neomicina (neo) em resposta aos ligandos de purina ATP, ATPy-S (análogo de ATP não hidrolisável), AMP, e adenosina.Os resultados estão presentes na Figura 25.

As experiências foram realizadas como segue: as células mutantes Caki-1-neo, ou Caki-1 -161P2F10B, ou Caki-1 -161P2F10B T205A foram semeadas durante a noite sobre lamínulas de câmara pré-revestidas comcolágeno; as células foram lavadas em meios livres de soro e carregadascom tinta fura-2 (3 uM em meios livres de soro) durante 30 minutos a 37°Cseguido por lavagem e incubação adicional de 30 minutos em meios livresde soro a 37°C. Em seguida os meios foram substituídos com a solução deRingers (20 mM de HEPES, pH7,4, 130 mM de NaCI, 5 mM de KCI, 3mM deCaC2, 2 mM de MgCI2, 10 mM de glicose) e as células foram analisadas porimageamento ratiométrico de Ca2+ [Ca2+]i intracelular em um microscópioinvertido (Nikon 2000TS) equipado com um objetivo de 20X, filtros de excitação de 340/380 nm ajustado à roda do filtro LAMBDA-10B (Sutter), um filtro dicróico (fracionador de feixe) e filtro de emissão (CHROMA) ajustado a umcubo do filtro para medições de FURA-2. As imagens de relação foram obtidas adquirindo-se um par de imagens em comprimentos de onda alternados (340/380nm) empregando uma câmara ORCA-ER Hamamatsu CCD sob ocontrole de software de imageamento MetaFluor 6.2 (Molecular Devices Corp)..

Todos os compostos estudados foram preparados como 400uMde matéria-prima em solução de Ringer e adicionados a uma concentraçãofinal de 100 fiM em uma câmara com células. Ao mesmo tempo em que ATPeliciou uma resposta de mobilização de Ca2+ robusta em todas as três linhagens de células, os cinéticos e padrões desta resposta foram notoriamente diferentes entre eles: igualmente Neo e o mutante "morto" enzimáticode 161P2F10B demonstrou oscilações de cálcio com amplidão e freqüênciaelevadas, ao mesmo tempo em que as células expressando 161P2F10B tiposilvestre (wt) exibiram um fluxo de Ca2+ inicial que gradualmente caiu com opassar do tempo com ondas oscilatórias mínimas de freqüência mais baixa eduração mais longa. O análogo não hidrolisável de ATP, ATPyS, induziurespostas oscilatórias "tipo como" similares em todas as três linhagens decélula. Tomados juntos estes dados sugerem que a atividade enzimática depirofosfatase/pfosfodiesterase de 161P2F10B mediam a supressão de osci-lações de Ca2+ em células Caki-1 que expressam 161P2F10B por depleçãode ATP no meio extracelular através de clivagem em AMP e pirofosfato. A-lém disso, a adenosina e monofosfato de adenosina (AMP), metabólitos po-tenciais de ATP, não eliciam a resposta de cálcio em quaisquer das linha-gens de célula que sugerem que a resposta é mediada pela família de P2Yativada de ATP de GPCRs e não por receptores ativados por adenosina ouAMP.

O ensaio de mobilização de Ca2+ e monitorando de vias de sina-lização intracelulares ativadas através de receptores de P2Y possibilitam atriagem de compostos, fármacos, anticorpos, e proteínas que modulariam aatividade de PDE de 161P2F10B levando a supressão ou alteração de ATPe outras respostas de nucleotido de purina em células e tecidos expressando161P2F10B. A significação de oscilações de cálcio no mutante de161P2F10B ou células Neo versus aquele da resposta contínua estável em16P2F10B tipo selvagem é que uma resposta de cálcio resolvida normal secorrelaciona com uma capacidade proliferativa aumentada de células (Veja,Schreiber, R., 2005, J., Membrane Biol. 205:129-137). A mobilização de cál-cio leva à ativação de calmodulina e componentes proliferação célula Cam-Kll, que induz a estimulação do eixo Ras-Raf da via de crescimento de célu-la (Veja, Agell, N., Bachs, O., Rocamora, N., e Villalonga, P., 2002, CellularSignaling 14:649-654). Desse modo, o cálcio é um elemento crítico na esti-mulação do programa de crescimento de célula. A ativação mediada porATP de receptores de P2Y leva aos eventos de ativação de fosfolipase C etransdução de sinal a jusante (Veja, Communi, D., e outros, 2000, CellularSinaling 12: 351-360). O ATP extracelular desempenha um papel no forne-cimento de energia para enzimas dependentes de ATP extracelulares etransportadores, é um bloco de construção de DNA, e também estimula ascélulas a proliferar. Adicionalmente, a atividade de PDE de 161P2F10B podefornecer células de tumor com metabólitos de ATP (ADP, AMP, Adenosina,fosfato inorgânico) e outros nucleotídeos de purina que são nutrientes críti-cos para o crescimento de célula de tumor. Juntos, os resultados indicamque 161P2F10B fornece uma função reguladora para ATP extracelular queimpacta o crescimento e sobrevivência de células de tumor.

C. Anqioqênese realçada (formação de tubo) de células endoteliais de veiaumbilical humana através de domínio extracelular recombinante (ECD) de161P2F10B e modulação por MAb.

A angiogênese é um evento crítico na manutenção de tumoresquanto ao seu crescimento, nutrição e oxigenação. O crescimento e migra-ção de células endoteliais são uma marca de angiogênese, e a estimulaçãode tais células requer múltiplos fatores de crescimento de soro incluindo fatorde crescimento endotelial vascular (VEGF). Para tratar se 161P2F10B facili-ta a angiogênese de endotélio primário, um ensaio foi estabelecido para de-tectar o efeito do domínio extracelular (ECD) (aminoâcidos 46-875) de161P2F10B na formação de redes endoteliais (tubos) quando semeados emMatrigel®. As células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) ou célu-las endoteliais microvasculares pulmonares humanas (HMVEC) foram de-senvolvidas em 10% de FBS em meios para 70% de confluência (passagem2 - passagem 6). As células foram soltas em 1:1 de tripsina:PBS ou 10 mMde EDTA, lavadas e re-suspendas em EBM-0,1% de FBS. 161P2F10B ECDrecombinante (descrito no Exemplo intitulado "Produção de 161P2F10B Re-combinante em Sistemas Eucarióticos") foi adicionado às células e em se-guida incubado em uma camada de 200ul de Matrigel® durante 8-16 horas a37°C. A formação de tubo foi quantificada por microscopia e os dados captu-rados por fotografia. A Figura 26 mostra que o 161P2F10B ECD induziu aformação de tubos endoteliais similarmente como gerado por tratamentocom 10% de FBS, embora menos redes fechadas tenham sido observadasempregando 161P2F10B ECD, ao mesmo tempo em que o ECD de controlenão gerou tubos acima de 0,1% controle de FBS. A Figura 27 mostra que amutação de quaisquer dos domínios catalíticos de 161P2F10B (T205A) queinativa o 161P2F10B de atividade enzimática de PDE ou a seqüência deRGD de ligação de integrina putativa (D80E) resultou em formação de tuboreduzida. Estes dados indicam que a atividade de PDE de 161P2F10B é re-querida para a formação de tubo observada de HUVEC. Juntos estes resul-tados indicam que a proteína de 161P2F10B está envolvida na promoção deangiogênese por sua atividade de PDE que facilita o crescimento de tumor,invasão de célula de tumor e/ou ativação de endotélio para vascularizaçãode tumor.

D. Migração realçada de células endoteliais através de domínio extracelularrecombinante (ECD) de 161P2F10B.

A migração realçada é uma marca tanto de angiogênese quantode fenótipo de célula de câncer. Para tratar o efeito da proteína de161P2F10B na migração de células endoteliais normais, HUVEC foram tra-tados com o 161P2F10B ECD e ensaiados em condições livres de soro(0,1% de BSA). As células foram desenvolvidas durante a noite em 0,5% deFBS, lavadas e em seguida comparadas comas células tratadas com VEGF,10% de FBS ou 161P2F10B ECD. As células foram avaliadas para migraçãoem transwells pelo ensaio de câmara Boyden. Os resultados na Figura 29indicam que a migração de célula HUVEC foi aumentada pelo VEGF de fatorde crescimento endotelial ou 10% de FBS (controles positivos) bem comoconcentrações crescentes de 161P2F10B ECD recombinante. Estes resulta-dos indicam que as células HUVEC que são tratadas com proteína161P2F10B têm uma capacidade migratória realçada em baixas condiçõesde soro. Conseqüentemente, as células expressando 161P2F10B induzem opotencial aumentado para migração de endotélio in vivo.

E. Dimerizacão de 161P2F10B em células KU-812.

A proteína de 161P2F10B contém domínios extracelulares dife-rentes (por exemplo, o domínio tipo somatomedina B) que podem ser envol-vidos na homodimerização de proteína. Para investigar o estado diméricopotencial de 161P2F10B na superfície de célula, as células KU-812 que en-dogenamente expressam 161P2F10B foram tratadas com um agente de re-ticulação química, e bis[succinimidilsuccinato] de etileno glicol (EGS), a con-centrações diferentes durante 30 minutos. As células foram então lisadas, asproteínas de célula foram submetidas à SDS-CHAMAR e então manchadascom western blotting para 161P2F10B. Os resultados na Figura 36 indicamque com concentrações crescentes de tratamento de EGS, a forma mono-mérica de 161P2F10B (-100 kDa) foi diminuída ao mesmo tempo em queuma faixa nova a ~200-kDa foi observada. A faixa de 200-kDa se correlacio-na com uma forma dimérica da proteína 161P2F10B. O agente de EGS reti-culará as moléculas que estão dentro de 16.1 Angstrõms de distância entreum ao outro para formar os dímeros ou multímeros estáveis. Os dados indi-cam que as moléculas de 161P2F10B em células KU-812 estão em proximi-dade íntima, tal que elas já sejam dímeros na superfície de célula antes dareticulação química. A hipótese que 161P2F10B poderia aleatoriamente for-mar dímeros com outras proteínas é eliminada pela observação que somen-te uma espécie de peso molecular dimérico foi observada no western blottingespecífico, e não outras faixas de peso molecular. Em geral, os resultadosindicam que 161P2F10B é dimérico na superfície da célula, e que esta pro-priedade pode ser requerida para atividade enzimática completa e outrasatividades funcionais de 161P2F10B quando expressado na superfície decélulas de tumor.

Exemplo 19

Estudos de Inibicão de MAb de 161P2F10B

A. MAbs inibem a proliferação, sobrevivência e apoptose de célula em células expressando 161P2F10B.

A proliferação realçada e entrada em fase-S de células de tumorrelativo às células normais são as marcas do fenótipo de célula de câncer.Para tratar o efeito de modulação de 161P2F10B na taxa de proliferação decélulas, as linhagens de célula de câncer endogenamente expressando ogene 161P2F10B (linhagens de câncer de célula clara renal SK-RC-01 eRXF-393; HepG2 de linhagem de câncer de fígado; KU-812 de linhagempromielocítica) foram avaliadas em um ensaio de incorporação de 3H-timidina (ensaio de proliferação de célula) na ausência ou presença de MAbspara a proteína de 161P2F10B. As células foram desenvolvidas em 10% deFBS, incubadas com MAb e então avaliadas quanto à proliferação após 18-96 hr pós-tratamento por um ensaio de incorporação de 3H-timidina. Os re-sultados na Figura 30 mostram que MAbs inibiram a proliferação de célulasque expressam o antígeno 161P2F10B; ao mesmo tempo em que o MAb decontrole combinado com isótipo não afetou o crescimento da célula. Foramobtidos resultados similares para o 161P2F10B que expressa células decâncer RXF-393, HepG2 e KU-812. Além disso, as células RXF-393 de li-nhagem de célula clara renal foram avaliadas em um ensaio de sobrevivên-cia de MTS (Figura 31). O ensaio de MTS é um método colorimetrico paradeterminar o número de células viáveis em ensaios de proliferação, citotoxi-cidade ou quimiossensibilidade com base em um composto de tetrazólio [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio,sal interno; MTS(b)] e um reagente de acoplamento de elétron (etossulfatode fenazina; PES). Os ensaios foram realizados adicionando-se uma peque-na quantidade do Reagente de Solução diretamente para cultivar as cavida-des, incubando durante 1-4 horas e então registrando a absorbância em490nm com um leitor de placa de 96 cavidades. A quantidade de produto deformazan colorido como medido pela quantidade de 490nm de absorbânciaé diretamente proporcional à atividade mitocondrial e/ou o número de célulasvivas na cultura. Como mostrado na Figura 31, MAbs para 161P2F10B inibiua sobrevivência das células de RXF-393, que se correlacona com a inibiçãode proliferação de célula. Como um outro teste de modulação de MAb deviabilidade de célula, as células testadas no ensaio de sobrevivência de MTSforam lisadas e também testadas em um ELISA de morte de célula que me-de a apoptose celular. Um método para observar o DNA fragmentado emcélulas é a detecção imunológica de fragmentos de DNA de histona comple-xa por um imunoensaio (isto é, ELISA de detecção de morte de célula) quemede o enriquecimento de fragmentos de DNA de histona complexa (mono -e oligo-nucleossomas) no citoplasma de células apoptóticas. Na Figura 31,os mesmos MAbs que inibiram igualmente a proliferação e sobrevivênciatambém induziu apoptose aumentada. Estes resultados confirmam que ascélulas que expressam antígeno de 161P2F10B são moduladas por MAbpara proteína de 161P2F10B, resultando em capacidade e sobrevivênciaproliferativa reduzida em condições de soro elevado, e um programa apoptó-tico aumentado. Conseqüentemente, as células de câncer expressando161P2F10B com potencial para crescimento como células de tumor in vivopodem ser moduladas para crescimento por MAb para 161P2F10B.

B. MAbs inibem a anqiogênese realçada (formação de tubo) de células en-doteliais de veia umbilical humana estimuladas com domínio extracelularrecombinante (ECD) de 161P2F10B.

A Figura 28 mostra que a incubação de células HUVEC e ECDno ensaio de angiogênese in vitro (formação de tubo) com 20 ng/ml de MAbpara 161P2F10B resultou em 33-78% de inibição de formação de rede, de-pendendo do MAb empregado no ensaio. Um MAb de controle de isótipo namesma concentração não inibiu a formação de tubo. Além disso, como mos-trado na Figura 32, a inibição de angiogênese por MAbs de 161P2F10B édependente da dose. Juntos, estes resultados indicam que a proteína de161P2F10B é envolvida na promoção de angiogênese por sua atividade dePDE que facilita o crescimento de tumor, invasão de célula de tumor e/ouativação de endotélio para vascularização de tumor, e que os MAbs para161P2F10B inibem tal atividade.

C. Inibição de Migração de Célula e Invasão por 161P2F10B MAb

A migração e invasão aumentadas são marcas do fenótipo decélula de câncer. Para tratar o efeito de MAbs para 161P2F10B na migração,as células HepG2 (câncer de fígado) e células A-704 (câncer de célula clararenal) que endogenamente expressam a proteína de 161P2F10B foram ava-liadas em um ensaio de migração de além da cavidade. As células foramincubadas com um MAb de controle ou uma mistura de três MAbs (25 ug/mlcada) para 161P2F10B e permitidas migrar durante 24 horas por uma câma-ra de além da cavidade. Os resultados na Figura 33 indicam que a misturade MAb para 161P2F10B inibiu a migração de células HepG2, ao mesmotempo em que o MAb de controle não inibiu a migração. Como mostrado naFigura 34, a inibição de migração de célula clara renal A-704 também foi ob-servada. O realce de migração foi visto em ambas as linhagens de célula portratamento das células com 8 ng/ml de Fator de Crescimento de Hepatocito(HGF). Para ambas as linhagens de célula, a migração induzida por HGFrealçada foi inibida pelos MAbs para 161P2F10B (Figuras 33 e 34). Paratratar a capacidade das células de invadir na matriz extracelular, as célulasA-704 foram semeadas em câmaras além da cavidade que foram revestidascom Matrigel®. Este ensaio é fundamentalmente similar ao ensaio de migra-ção exceto que as células precisam migrar pelo Matrigel® para serem classi-ficadas como tendo movido no ensaio. Esta é uma propriedade de células detumor pelo fato de que elas expressam enzimas (isto é, metaloproteases dematriz tal orno MMPs, Adams, etc), que degradam as proteínas de matrizextracelulares no Matrigel® e facilitam a migração celular. Os resultados naFigura 35 demonstram que as células A-704 possuem a capacidade de in-vadir e que MAb H 16-1,93 exibe uma atividade inibidora neste fenótipo decélula. Além disso, o tratamento de HGF das células aumenta sua capacida-de de invadir no Matrigel® que é inibido por MAb H16-1.93.

Em geral, os resultados funcionais in vitro e estudos de inibiçãode MAb indicam que a proteína de 161P2F10B tem promoção de crescimen-to, potencialização de sobrevivência, realce de migração e invasão, e ativi-dades angiogênicas. Estas atividades quando avaliadas in vivo foram inibi-das por MAbs para 161P2F10B. Tais funções celulares e bioquímicas sãovitais para o estabelecimento e manutenção de tumores estimulando-se aformação de leito capilar através de células endoteliais (Veja, Ferrara, N., eKerbel, R., S., 2005 Nature 438: 967-974). Esta angiogênese aumentadafornece um meio de nutrição e oxigenação aumentadas de crescimento detumores, e proporciona uma estratégia de intervenção terapêutica para alve-jamento de 161P2F10B em malignidades. A proteína de 161P2F10B tam-bém desempenha um papel na migração e invasão de célula, particularmen-te para células que expressam a proteína, e também serve como um atrativopara células endoteliais e outras células que expressam seu ligando. A ativi-dade de fosfodiesterase/pirofosfatase (PDE) de proteína de 161P2F10B po-de ser crítica para alterar a concentração de ATP no microambiente de tu-mor para facilitar a angiogênese e fornecer uma vantagem nutricional. A mi-gração e invasão de célula são importantes para o potencial metastático decélulas de tumor, e facilitam sua orientação e recrutamento para tecidos re-motos. A expressão de proteína de 161P2F10B em metástase indica que ofenótipo migratório de células expressando 161P2F10B concede um poten-cial forte para tais células fazer metástase. Todas as funções ensaiadas de161P2F1OB in vitro são inibidas por MAbs.

Exemplo 20

Detecção de proteína de 161P2F10B em espécimes de pacientes de câncerpor IHC

A expressão de proteína de 161P2F10B em espécimes de tumorde pacientes de câncer de fígado foi detectada empregando o anticorpoM16-41 (3)50. Resumidamente, os tecidos congelados foram cortados emseções de 6 mícrons e montados em lâminas de vidro. As seções foram se-cadas durante 2 horas a temperatura ambiente, fixadas durante 8 minutosem acetona, e subseqüentemente permitidas secar. As outras seções foramentão incubadas em anticorpo de 161P2F10B, M16-41 (3)50, durante 3 horasa temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes em tampão etambém incubadas com anticorpo secundário de imunoglobulina anticamun-dongo de cabra conjugado por peroxidase DAKO EnVision+® (DAKO Corpo-ration, Carpenteria, CA) durante 1 hora. As seções foram então lavadas emtampão, desenvolvidas empregando um equipamento DAB (SIGMA Chemi-cals), contramanchadas empregando hematoxilina, e analisadas através demicroscopia de campo luminoso. Os resultados mostram a expressão de161P2F10B nas células de tumor de carcinoma hepatocelular (37 A e 37B)como indicado pela coloração marrom das células. As seções seriais semincubação em M16-41 (3)50 não tiveram nenhum manchamento (37C e 37D).Estes resultados indicam que 161P2F10B é expressado em cânceres defígado humanos e que os anticorpos direcionados para este antígeno sãoúteis I como reagentes diagnósticos (Figura 37).

Estes resultados indicam que 161P2F10B são um alvo para apli-cações diagnosticas, prognósticas e terapêuticas em câncer.Ao longo deste pedido, vários conteúdos de dados de site daWeb, publicações, pedidos de patente e patentes são referenciados. (Sitesda Web são referenciados por seu Uniform Resource Locator, ou URL, en-dereços no World Wide Web).. As descrições de cada destas referênciassão deste modo aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas mo-dalidades descritas aqui, as quais são pretendidas como únicas ilustraçõesde aspectos individuais da invenção, e quaisquer que sejam funcionalmenteequivalentes estão dentro do escopo da invenção. Várias modificações paraos modelos e métodos da invenção, além daqueles descritos aqui, se torna-rão evidentes para aqueles versados na técnica da descrição e ensinamen-tos precedentes, e são similarmente pretendidos incluírem-se dentro do es-copo da invenção. Tais modificações ou outras modalidades podem ser pra-ticadas sem afastar-se do verdadeiro escopo e espírito da invenção.

Tabelas

TABELA I: Tecidos que expressam 161P2F1OB quando maligno.

<table>table see original document page 249</column></row><table>

TABELA II: Abreviações de Aminoácido

<table>table see original document page 249</column></row><table><table>table see original document page 250</column></row><table>

TABELA III: Matriz de Substituição de Aminoácido

Adaptada da matriz de substituição de aminoácido de SoftwareGCG 9.0 BLOSUM62 (matriz de substituição de bloco). Quando maior o va-lor, mais provavelmente uma substituição é encontrada em proteínas natu-rais relacionadas.

A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y.

4 0-2 -1 -2 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -11 0 0 -3 -2 A

9 -3 -4 -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1-1 -2 -2 C

6 2-3 -1 -1 -3 -1 -4-3 1-1 0-2 0 -1.-3 -4 -3 D

5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -2 E

6-3-1 0-3 0 0-3 -4 -3 -3 -2-2-1 1 3 F

6 -2 -4 -2 -4 -3 0 -2 -2 -2 0 -2 -3 -2 -3 G<table>table see original document page 251</column></row><table>

TABELA IV:

Classe I de HLA/Motivos II /Supermotivos

TABELA IV (A): Supermotivos/Motivos de Classe I de HLA

Os resíduos em negrito são os preferidos, resíduos italizadossão menos preferidos: Um peptídeo é considerado transportando motif seele tiver âncoras primárias em cada posição de âncora primária para um motivo ou supeimotivo como especificado na tabela acima.

<table>table see original document page 251</column></row><table><table>table see original document page 252</column></row><table><table>table see original document page 253</column></row><table><table>table see original document page 254</column></row><table><table>table see original document page 255</column></row><table><table>table see original document page 256</column></row><table><table>table see original document page 257</column></row><table><table>table see original document page 258</column></row><table>TABELA IV (F):

Sumário de Supertipos de HLA

Freqüências Fenotípicas Totais de Supertipos de HLA em Diferentes Populações EtínicasPosição de Especificidade Freqüência Fenotípica

<table>table see original document page 259</column></row><table>TABELA IV (G):

Cobertura de população calculada fornecida por diferentes combinações desuper tipo de HLA

<table>table see original document page 260</column></row><table>

Os Motivos indicam os resíduos definindo especificidades de super tipo. Osmotivos incorporam resíduos determinados com base nos dados publicadosa serem reconhecidos por múltiplos alelos dentro do super tipo. Os resíduosdentro dos parênteses são resíduos adicionais também preditos serem toler-ados por múltiplos alelos dentro do super tipo.

TABELA V: Motivos de Ocorrência Freqüente

<table>table see original document page 260</column></row><table><table>table see original document page 261</column></row><table><table>table see original document page 262</column></row><table><table>table see original document page 263</column></row><table><table>table see original document page 264</column></row><table><table>table see original document page 265</column></row><table><table>table see original document page 266</column></row><table>266

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> AGENSYS, INC.

JAKOBOVITS, AyaKANNER, Steven B.CHALLITA-EXD, Pia M.PEREZ-VILLAR, JuanSATPAEV, DauletRAITANO, Arthur B.MORRISON, Robert KendallMORRISON, Karen Jane MeyrickJIA, Xiao-ChiGUDAS, Jean

<120> ANTICORPOS E MOLÉCULAS RELACIONADAS QUE LIGAM-SE ÀS PROTEÍNAS 161P2F10B

<130> 511582006246

<140> Ainda não determinado<141> Concurrently Herewith

<150> 10/291,241<151> 2002-11-07

<150> 10/005,480<151> 2001-11-07

<150> 60/667,588<151> 2005-03-31

<150> 60/700,975<151> 2005-07-20

<160> 177

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1

<211> 3858

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ctactttatt ctgataaaac aggtctatgc agctaccagg acaatggaat ctacgttgac 60tttagcaacg gaacaacctg ttaagaagaa cactcttaag aaatataaaa tagcttgcat 120tgttcttctt gctttgctgg tgatcatgtc acttggatta ggcctggggc ttggactcag 180gaaactggaa aagcaaggca gctgcaggaa gaagtgcttt gatgcatcat ttagaggact 240ggagaactgc cggtgtgatg tggcatgtaa agaccgaggt gattgctgct gggattttga 300agacacctgt gtggaatcaa ctcgaatatg gatgtgcaat aaatttcgtt gtggagagac 360cagattagag gccagccttt gctcttgttc agatgactgt ttgcagaaga aagattgctg 420tgctgactat aagagtgttt gccaaggaga aacctcatgg ctggaagaaa actgtgacac 480agcccagcag tctcagtgcc cagaagggtt tgacctgcca ccagttatct tgttttctat 540ggatggattt agagctgaat atttahacac atgggatact ttaatgccaa atatcaataa 600actgaaaaca tgtggaattc attcaaaata catgagagct atgtatccta ccaaaacctt 660cccaaatcat tacaccattg tcacgggctt gtatccagag tcacatggca tcattgacaa 720taatatgtat gatgtaaatc tcaacaagaa tttttcactt tcttcaaagg aacaaaataa 780tccagcctgg tggcatgggc aaccaatgtg gctgacagca atgtatcaag gtttaaaagc 840cgctacctac ttttggcccg gatcagaagt ggctataaat ggctcctttc cttccatata 900catgccttac aacggaagtg tcccatttga agagaggatt tctacactgt taaaatggct 960ggacctgccc aaagctgaaa gacccaggtt ttataccatg tattttgaag aacctgattc 1020ctctggacat gcaggtggac cagtcagtgc cagagtaatt aaagccttac aggtagtaga 1080tcatgctttt gggatgttga tggaaggcct gaagcagcgg aatttgcaca actgtgtcaa 1140tatcatcctt ctggctgacc atggaatgga ccagacttat tgtaacaaga tggaatacat 1200gactgattat tttcccagàa taaacttctt ctacatgtac gaagggcctg ccccccgcat 1260ccgagctcat aatatacctc atgacttttt tagttttaat tctgaggaaa ttgttagaaa 1320cctcagttgc cgaaaacctg atcagcattt caagccctat ttgactcctg atttgccaaa 1380gcgactgcac tatgccaaga acgtcagaat cgacaaagtt catctctttg tggatcaaca 1440gtggctggct gttaggagta aatcaaatac aaattgtgga ggaggcaacc atggttataa 1500caatgagttt aggagcatgg aggctatctt tctggcacat ggacccagfct ttaaagagaa 1560gactgaagtt gaaccatttg aaaatattga agtctataac ctaatgtgtg atcttctacg 1620cattcaacca gcaccaaaca atggaaccca tggtagttta aaccatcttc tgaaggtgcc 1680tttttatgag ccatcccatg cagaggaggt gtcaaagttt tctgtttgtg gctttgctaa 1740tccattgccc acagagtctc ttgactgttt ctgccctcac ctacaaaata gtactcagct 1800ggaacaagtg aatcagatgc taaatctcac ccaagaagaa ataacagcaa cagtgaaagt 1860aaatttgcca tttgggaggc ctagggtact gcagaagaac gtggaccact gtctccttta 1920ccacagggaa tatgtcagtg gatttggaaa agctatgagg atgcccatgt ggagfctcata 1980cacagtcccc cagttgggag acacatcgcc tctgcctccc actgtcccag actgtctgcg 2040ggctgatgtc agggttcctc .ciptctgagag ccaaaaatgt tccttctatt tagcagacaa 2100gaatatcacc cacggcttcc tètatcctcc tgccagcaat agaacatcag atagccaata 2160tgatgcttta attactagca atttggtacc tatgtatgaa gaattcagaa aaatgtggga 2220ctacttccac agtgttcttc ttataaaaca tgccacagaa agaaatggag taaatgtggt 2280tagtggacca atatttgatt ataattatga tggccatttt gatgctccag atgaaattac 2340caaacàttta gccaacactg atgttcccat cccaacacac tactttgtgg tgctgaccag 2400ttgtaaaaac aagagccaca caccggáaaa ctgccctggg tggctggatg tcctaccctt 2460tatcatccct caccgaccta ccaacgtgga gagctgtcct gaaggtaaac cagaagctct 2520ttgggttgaa gaaagattta cagctcacat tgcccgggtc cgtgatgtag aacttctcac 2580tgggcttgac ttctatcagg átaaagtgca gcctgtctct gaaattttgc aactaaagac 2640atatttacca acatttgaaa ccactattfca acttaataat gtctacttaa tatataattt 2700actgtataaa gtaattttgg caaaatataa gtgatttttt ctggagaatt gtaaaataaa 2760gttttctatt tttccttaaa aaaaaaaccg gaattccggg cttgggaggc tgaggcagga 2820gactcgcttg aacccgggag gcagaggttg cagtgagcca agattgcgcc attgcactcc 2880agagcctggg tgacagagca agactacatc tcaaaaaata aataaataaa ataaaagtaa 2940caataaaaat aaaaagaaca gcagagagaa tgagcaagga gaaatgtcac aaactattgc 3000aaaatactgt tacactgggt tggctctcca agaagatact ggaatctctt cagccatttg 3060cttttcagaa gtagaaacca gcaaaccacc tctaagcgga gaacatacga ttctttatta 3120agtagctctg gggaaggaaa gaataaaagt tgatagctcc ctgattggga aaaaatgcac 3180aattaataaa gaatgaagat gaaagaaagc atgcttatgt tgtaacacaa aaaaaattca 3240caaacgttgg tggaaggaaa ácagtataga aaacattact ttaactaaaa gctggaaaaa 3300ttttcagttg ggatgcgact gacaaaaaga acgggatttc caggcataaa gttggcgtga 3360gctacagagg gcaccatgtg gctcagtgga agacccttca agattcaaag ttccatttga 3420cagagcaaag gcacttcgca aggagaaggg tttaaattat gggtccaaaa gccaagtggt 3480aaagcgagca atttgcagca taactgcttc tcctagacag ggctgagtgg gcaaaatacg 3540acagtacaca cagtgactat tagccactgc cagaaacagg ctgaacagcc ctgggagaca 3600agggaaggca ggtggtggga gttgttcatg gagagaaagg agagttttag aaccagcaca 3660tccactggag atgctgggcc accagacccc tcccagtcaa taaagtctgg tgcctcattt 3720gatctcagcc tcatcatgac cctggagaga ccctgatacc atctgccagt ccccgacagc 3780ttaggcactc cttgccatca acctgacccc ccgagtggtt ctccaggctc cctgccccac 3840ccattcaggc cggaattc 3858

<210> 2

<211> 875

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Glu Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Glu Gln Pro Vai Lys Lys Asn

1 5 10 15

Thr Leu Lys Lys Tyr Lys Ile Ala Cys Ile Vai Leu Leu Ala Leu Leu

20 25 30

Vai Ile Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys Leu35 40 45Glu Lys Gln Gly Ser Cys Arg Lys Lys Cys Phe Asp Ala Ser Phe Arg

50 55 60

Gly Leu Glu Asn Cys Arg Cys Asp Vai Ala Cys Lys Asp Arg Gly Asp 65 70 75 80

Cys Cys Trp Asp Phe Glu Asp Thr Cys Vai Glu Ser Thr Arg lie Trp

85 90 95

Met Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Thr Arg Leu Glu Ala Ser Leu

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Asp Asp Cys Leu Gln Lys Lys Asp Cys Cys Ala Asp

115 120 125

Tyr Lys Ser Vai Cys Gln Gly Glu Thr Ser Trp Leu Glu Glu Asn Cys

130 135 140

Asp Thr Ala Gln Gln Ser Gln Cys Pro Glu Gly Phe Asp Leu Pro Pro

145 150 155 160

Vai lie Leu Phe Ser Met Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu Tyr Thr

165 170 175

Trp Asp Thr Leu Met Pro Asn lie Asn Lys Leu Lys Thr Cys Gly lie

180 185 190

His Ser Lys Tyr Met Arg Alâ Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn

195 200 205

His Tyr Thr lie Vai Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly lie lie

210 215 220

Asp Asn Asn Met Tyr Asp Vai Asn Leu Asn Lys Asn Phe Ser Leu Ser

225 230 235 240

Ser Lys Glu Gln Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp

245 250 255

Leu Thr Ala Met Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Ala Thr Tyr Phe Trp Pro

260 265 270

Gly Ser Glu Vai Ala lie Asn Gly Ser Phe Pro Ser lie Tyr Met Pro

275 280 285

Tyr Asn Gly Ser Vai Pro Phe Glu Glu Arg 11 e Ser Thr Leu Leu Lys

290 295 300

Trp Leu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Arg Pro Arg Phe Tyr Thr Met Tyr

305 310 315 320

Phe Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ala Gly Gly Pro Vai Ser Ala

325 330 335

Arg Vai lie Lys Ala Leu Gln Vai Vai Asp His Ala Phe Gly Met Leu

340 345 350

Met Glu Gly Leu Lys Gln Arg Asn Leu His Asn Cys Vai Asn lie lie

355 360 365

Leu Leu Ala Asp His Gly Met Asp Gln Thr Tyr Cys Asn Lys Met Glu

370 375 380

Tyr Met Thr Asp Tyr Phe Pro Arg lie Asn Phe Phe Tyr Met Tyr Glu

385 390 395 400

Gly Pro Ala Pro Arg lie Arg Ala His Asn lie Pro His Asp Phe Phe

405 410 415

Ser Phe Asn Ser Glu Glu lie Vai Arg Asn Leu Ser Cys Arg Lys Pro

420 425 430

Asp Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Thr Pro Asp Leu Pro Lys Arg Leu

435 440 445

His Tyr Ala Lys Asn Vai Arg lie Asp Lys Vai His Leu Phe Vai Asp

450 455 460

Gln Gln Trp Leu Ala Vai Arg Ser Lys Ser Asn Thr Asn Cys Gly Gly

465 470 475 480

Gly Asn His Gly Tyr Asn Asn Glu Phe Arg Ser Met Glu Ala lie Phe

485 490 495

Leu Ala His Gly Pro Ser Phe Lys Glu Lys Thr Glu Vai Glu Pro Phe

500 505 510

Glu Asn lie Glu Vai Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Arg lie Gln

515 520 525

Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys530

Vai Pro Phe Tyr

545

Vai Cys Gly Phe

Cys Pro His Leu

580

Leu Asn Leu Thr

595

Pro Phe Gly Arg

610

Leu Tyr His Arg

625

Pro Met Trp Ser

Leu Pro Pro Thr

660

Pro Ser Glu Ser

675

Thr His Gly Phe

690

Gln Tyr Asp Ala

705

Phe Arg Lys Met

Ala Thr Glu Arg

740

Tyr Asn Tyr Asp

755

Leu Ala Asn Thr.

770

Thr Ser Cys Lys

785

Leu Asp Vai Leu

Ser Cys Pro Glu

820

Thr Ala His lie

835

Asp Phe Tyr Gln

850

Lys Thr Tyr Leu

865

535

Glu Pro Ser His

550

Ala Asn Pro Leu

565

Gln Asn Ser Thr

Gln Glu Glu lie

600

Pro Arg Vai Leu

615

Glu Tyr Vai Ser

630

Ser Tyr Thr Vai

645

Vai Pro Asp Cys

Gln Lys Cys Ser

680

Leu Tyr Pro Pro

695

Leu lie Thr Ser

710

Trp Asp Tyr Phe

725

Asn Gly Vai Asn

Gly His Phe Asp

760

Asp Vai Pro lie

775

Asn Lys Ser His

790

Pro Phe lie lie

805

Gly Lys Pro Glu

Ala Arg; Vai Arg

840

Asp Lys Vai Gln

855

Pro Thr Phe Glu

870

540

Ala Glu Glu Vai

555

Pro Thr Glu Ser

570

Gln Leu Glu Gln

585

Thr Ala Thr Vai

Gln Lys Asn Vai

620

Gly Phe Gly Lys

635

Pro Gln Leu Gly

650

Leu Arg Ala Asp

665

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agctaccagg acaatggaat ctacgttgac 60cactcttaag aaatataaaa tagcttgcat 120acttggatta ggcctggggc ttggactcag 180gaagtgcttt gatgcatcat ttagaggact 240agaccgaggt gattgctgct gggattttga 300gatgtgcaat aaatttcgtt gtggagagac 360agatgactgt ttgcagaaga aagattgctg 420aacctcatgg ctggaagaaa actgtgacac 480tgacctgcca ccagttatct tgttttctat 540atgggatact ttaatgccaa atatcaataa 600catgagagct atgtatccta ccaaaacctt 660gtatccagag tcacatggca tcattgacaa 720tttttcactt tcttcaaagg aacaaaataa 7 80gctgacagca atgtatcaag gttfcaaaagc 840ggctataaat ggctcctttc cttccatata 900agagaggatt tctacactgt taaaatggct 960ttataccatg tattttgaag aacctgattc 1020cagagtaatt aaagccttac aggtagtaga 1080gaagcagcgg aatttgcaca actgtgtcaa 1140ccagacttat tgtaacaaga tggaatacat 1200ctacatgtac gaagggcctg ccccccgcat 1260tagttttaat tctgaggaaa ttgttagaaa 1320caagccctat ttgactcctg atttgccaaa 13 80cgacaaagtt catctctttg tggatcaaca 1440aaattgtgga ggaggcaacc atggttataa 1500tctggcacat ggacccagtt ttaaagagaa 1560agtctataac ctaatgtgtg atcttctacg 1620tggtagttta aaccatcttc tgaaggtgcc 1680gtcaaagttt tctgtttgtg gctttgctaa 1740ctgccctcac ctacaaaata gtactcagct 1800ccaagaagaa ataacagcaa cagtgaaagt 1860gcagaagaac gtggaccact gtctccttta 1920agctatgagg atgcccatgt ggagttcata 1980tctgcctccc actgtcccag actgtctgcg 2040ccaaaaatgt tccttctatt tagcagacaa 2100tgccagcaat agaacatcag atagccaata 2160tatgtatgaa gaattcagaa aaatgtggga 2220tgccacagaa agaaatggag taaatgtggt 2280tggccatttt gatgctccag atgaaattac 2340cccaacacac tactttgtgg tgctgaccag 2400ctgccctggg tggctggatg tcctaccctt 2460gagctgtcct gaaggtaaac cagaagctct 2520tgcccgggtc cgtgatgtag aacttctcac 2580gcctgtctct gaaattttgc aactaaagac 2640acttaataat gtctacttaa tatataattt 2700gtgatttttt ctggagaatt gtaaaataaa 2760gaattccggg cttgggaggc tgaggcagga 2820cagtgagcca agattgcgcc attgcactcc 2880tcaaaaaata aataaataaa ataaaagtaa 2940tgagcaagga gaaatgtcac aaactattgc 3000agaagatact ggaatctctt cagccabttg 3060tctaagcgga gaacatacga ttctttatta 3120tgatagctcc ctgattggga aaaaatgcac 3180atgcttatgt tgtaacacaa aaaaaattca 3240aaacattact ttaactaaaa gctggaaaaa 3300ttttcagttg ggatgcgact gacaaaaaga acgggatttc caggcataaa gttggcgtga 3360

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<213> Homo sapiens<400> 8

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Thr Leu Lys Lys Tyr Lys lie Ala Cys lie Vai Leu Leu Ala Leu Leu

20 25 30

Vai lie Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys Leu

35 40 45

Glu Lys Gln Gly Ser Cys Arg Lys Lys Cys Phe Asp Ala Ser Phe Arg

50 55 60

Gly Leu Glu Asn Cys Arg Cys Asp Vai Ala Cys Lys Asp Arg Gly Asp65 70 ! 75 80

Cys Cys Trp Asp Phe Glu Asp Thr Cys Vai Glu Ser Thr Arg lie Trp

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Met Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Thr Arg Leu Glu Ala Ser Leu

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Asp Asp Cys Leu Gln Lys Lys Asp Cys Cys Ala Asp

115 120 125

Tyr Lys Ser Vai Cys Gln Gly Glu Thr Ser Trp Leu Glu Glu Asn Cys

130 135 140

Asp Thr Ala Gln Gln Ser Gln Cys Pro Glu Gly Phe Asp Leu Pro Pro145 150, 155 160

Vai lie Leu Phe Ser Met Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu Tyr Thr

165 170 175

Trp Asp Thr Leu Met Pro Asn lie Asn Lys Leu Lys Thr Cys Gly lie

180 185 190

His Ser Lys Tyr Met Arg Ala Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn

195 200 205

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210 215 220

Asp Asn Asn Met Tyr Asp Vai Asn Leu Asn Lys Asn Phe Ser Leu Ser225 230 235 240

Ser Lys Glu Gln Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp

245 250 255

Leu Thr Ala Met Tyr Gln' Gly Leu Lys Ala Ala Thr Tyr Phe Trp Pro

260 265 270

Gly Ser Glu Vai Ala lie Asn Gly Ser Phe Pro Ser lie Tyr Met Pro

275 280 285

Tyr Asn Gly Ser Vai Pro Phe Glu Glu Arg lie Ser Thr Leu Leu Lys

290 295 300

Trp Leu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Arg Pro Arg Phe Tyr Thr Met Tyr305 310 315 320

Phe Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ala Gly Gly Pro Vai Ser Ala

325 330 335

Arg Vai lie Lys Ala Leu Gln Vai Vai Asp His Ala Phe Gly Met Leu340 345 350Met Glu Gly Leu Lys Gln Arg Asn Leu His Asn Cys Vai Asn lie lie

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Leu Leu Ala Asp His Gly Met Asp Gln Thr Tyr Cys Asn Lys Met Glu

370 375 380

Tyr Met Thr Asp Tyr Phe Pro Arg lie Asn Phe Phe Tyr Met Tyr Glu385 390 395 400

Gly Pro Ala Pro Arg lie Arg Ala His Asn lie Pro His Asp Phe Phe

405 410 415

Ser Phe Asn Ser Glu Glu lie Vai Arg Asn Leu Ser Cys Arg Lys Pro

420 425 430

Asp Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Thr Pro Asp Leu Pro Lys Arg Leu

435 440 445

His Tyr Ala Lys Asn Vai Arg lie Asp Lys Vai His Leu Phe Vai Asp

450 455 460

Gln Gln Trp Leu Ala Vai Arg Ser Lys Ser Asn Thr Asn Cys Gly Gly465 470 475 480

Gly Asn His Gly Tyr Asn Asn Glu Phe Arg Ser Met Glu Ala lie Phe

485 490 495

Leu Ala His Gly Pro Ser Phe Lys Glu Lys Thr Glu Vai Glu Pro Phe

500 505 510

Glu Asn lie Glu Vai Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Arg lie Gln

515 520 525

Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys

530 535 540

Vai Pro Phe Tyr Glu Pro Ser His Ala Glu Glu Vai Ser Lys Phe Ser545 550 555 560

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Cys Pro His Leu Gln Asn Ser Thr Gln Leu Glu Gln Vai Asn Gln Met

580 585 590

Leu Asn Leu Thr Gln Glu Glu lie Thr Ala Thr Vai Lys Vai Asn Leu

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Pro Phe Gly Arg Pro Arg Vai Leu Gln Lys Asn Vai Asp His Cys Leu

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Leu Tyr His Arg Glu Tyr Vai Ser Gly Phe Gly Lys Ala Met Arg Met625 630 635 640

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Pro Ser Glu Ser Gln Lys Cys Ser Phe Tyr Leu Ala Asp Lys Asn lie

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Phe Arg Lys Met Trp Asp Tyr Phe His Ser Vai Leu Leu lie Lys His

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Ala Thr Glu Arg Asn Gly Vai Asn Vai Vai Ser Gly Pro lie Phe Asp

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Tyr Asn Tyr Asp Gly His Phe Asp Ala Pro Asp Glu lie Thr Lys His

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Leu Ala Asn Thr Asp Vai Pro lie Pro Thr His Tyr Phe Vai Vai Leu

770 775 780

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<213> Honto sapiens

<400> 11

atacagtttc tctttgccag actagactaa agaaggagca ctactttatt ctgataaaac 60aggtctatgc agctaccagg acaatggaat ctacgttgac tttagcaacg gaacaacctg 120ttaagaagaa cactcttaag aaatataaaa tagcttgcat tgttcttctt gctttgctgg 180tgatcatgtc acttggatta ggcctggggc ttggactcag gaaactggaa aagcaaggca 240gctgcaggaa gaagtgcttt gatgcatcat ttagaggact ggagaactgc cggtgtgatg 300tggcatgtaa agaccgaggt gattgchgct gggattttga agacacctgt gtggaatcaa 360ctcgaatatg gatgtgcaat aaatttcgtt gtggagagac cagattagag gccagccttt 420gctcttgttc agatgactgt ttgcagagga aagattgctg tgctgactat aagagtgttt 480gccaaggaga aacctcatgg ctggaagaaa actgtgacac agcccagcag tctcagtgcc 540cagaagggtt tgacctgcca ccagttatct tgttttctat ggatggattt agagctgaat 600atttatacac atgggatact ttaatgccaa atatcaataa actgaaaaca tgtggaattc 660attcaaaata catgagagct atgtatccta ccaaaacctt cccaaatcat tacaccattg 720tcacgggctt gtatccggag tcacatggca tcattgacaa taatatgtat gatgtaaatc 780tcaacaagaa tttttcactt tcttcaaagg aacaaaataa tccagcctgg tggcatgggc 840aaccaatgtg gctgacagca atgtatcaag gtttaaaagc cgctacctac ttttggcccg 900gatcagaagt ggctataaat ggctcctttc cttccatata catgccttac aacggaagtg 960tcccatttga agagaggatt tctacactgt taaaatggct ggacctgccc aaagctgaga 1020gacccaggtt ttataccatg ttttttgaag aacctgattc ctctggacat gcaggtggac 1080cagtcagtgc cagagtaatt aaagccttac aggtagtaga tcatgctttt gggatgttga 1140tggaaggcct gaagcagcgg aatttgcaca actgtgtcaa tatcatcctt ctggctgacc 1200atggaatgga ccagacttat tgtaacaaga tggaatacat gactgattat tttcccagaa 1260taaacttctt ctacatgtac gaagggcctg ccccccgcgt ccgagctcat aatatacctc 1320atgacttttt tagttttaat tctgaggaaa ttgttagaaa cctcagttgc cgaaaacctg 1380atcagcattt caagccctat ttgactcctg atttgccaaa gcgactgcac tatgccaaga 1440acgtcagaat cgacaaagtt catctctttg tggatcaaca gtggctggct gttaggagta 1500aatcaaatac aaattgtgga ggaggcaacc atggttataa caatgagttt aggagcatgg 1560aggctatctt tctggcacat ggacccagtt ttaaagagaa gactgaagtt gaaccatttg 1620aaaatattga agtctataac ctaatgtgtg atcttctacg cattcaacca gcaccaaaca 1680atggaaocca tggtagttta aaccatcttc tgaaggtgcc tttttatgag ccatcccatg 1740cagaggaggt gtcaaagttt tctgtttgtg gctttgctaa tccattgccc acagagtctc 1800ttgactgttt ctgccctcac ctacaaaata gtactcagct ggaacaagtg aatcagatgc 1860taaatctcac ccaagaagaa ataacagcaa cagtgaaagt aaatttgcca tttgggaggc 1920ctagggtact gcagaagaac gtggaccact gtctccttta ccacagggaa tatgtcagtg 1980gatttggaaa agctatgagg atgcccatgt ggagttcata cacagtcccc cagttgggag 2040acacatcgcc tctgcctccc actgtcccag actgtctgcg ggcbgahgtc agggttcctc 2100cttctgagag ccaaaaatgt tccttctatt tagcagacaa gaatatcacc cacggcttcc 2160tctatcctcc tgccagcaat agaacatcag atagccaata tgatgcttta attactagca 2220atttggtacc tatgtatgaa gaattcagaa aaatgtggga ctacttccac agtgttcttc 2280ttataaaaca tgccacagaa agaaatggag taaatgtggt tagtggacca atatttgatt 2340ataattatga tggccatttt gatgctccag atgaaattac caaacattta gccaacactg 2400atgttcccat cccaacacac tactttgtgg tgctgaccag ttgtaaaaac aagagccaca 2460caccggaaaa ctgccctggg tggctggatg tcctaccctt tatcatccct caccgaccta 2 520ccaacgtgga gagctgtcct gaaggtaaac cagaagctct ttgggttgaa gaaagattta 2580cagctcacat tgcccgggtc cgtgatgtag aacttctcac tgggcttgac ttctatcagg 2640ataaagtgca gcctgtctct gaaattttgc aactaaagac atatttacca acatttgaaa 2700ccactattta acttaataat gtctacttaa tatataattt actgtataaa gtaattttgg 2760caaaatataa gtgatttttt tctggagaat tgtaaaataa agttttctat ttttccttaa 2820gtcccctaaa agccataatt tttattattc ctttttctct tttttcaatt ctatgaatat 2880gtattatttt aaagttatat ttttcacaca gagatgatgc tatattacac cttccctttt 2940ttgttggttt cttaaactct aatctcatga cagattatac cttccttatt acttgtttta 3000tcttactcag aatctttgaa tatatttttc tgcccagaat tatctaaaca aaagggagaa 3060caaaagaagt atgtctcact tgggaactga atcaactcta aatcagtttt gtcacaaaac 312 0tttttgtatt tgactggcaa tgctgattaa aattaaaaat gcaca 3165

<210> 12

<211> 875

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Glu Ser Thr Leu Thr, Leu Ala Thr Glu Gln Pro Vai Lys Lys Asn

1 5 10 15

Thr Leu Lys Lys Tyr Lys lie Ala Cys lie Vai Leu Leu Ala Leu Leu

20 25 30

Vâl lie Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys Leu

35 40 45

Glu Lys Gln Gly Ser Cys Arg Lys Lys Cys Phe Asp Ala Ser Phe Arg

50 55 60

Gly Leu Glu Asn Cys Arg Cys Asp Vai Ala Cys Lys Asp Arg Gly Asp65 70 75 80

Cys Cys Trp Asp Phe Glu Asp Thr Cys Vai Glu Ser Thr Arg lie Trp

85 90 95

Met Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Thr Arg Leu Glu Ala Ser Leu

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Asp Asp Cys Leu Gln Arg Lys Asp Cys Cys Ala Asp

115 120 125

Tyr Lys Ser Vai Cys Glri Gly Glu Thr Ser Trp Leu Glu Glu Asn Cys

130 135 140

Asp Thr Ala Gln Gln Ser Gln Cys Pro Glu Gly Phe Asp Leu Pro Pro145 150 155 160

Vai lie Leu Phe Ser Met Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu Tyr Thr

165 170 175

Trp Asp Thr Leu Met Pro Asn lie Asn Lys Leu Lys Thr Cys Gly lie

180 185 190

His Ser Lys Tyr Met Arg Ala Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn

195 200 205

His Tyr Thr lie Vai Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly lie lie

210 215 220

Asp Asn Asn Met Tyr Asp Vai Asn Leu Asn Lys Asn Phe Ser Leu Ser225 230 235 240

Ser Lys Glu Gln Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp

245 250 255

Leu Thr Ala Met Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Ala Thr Tyr Phe Trp Pro

260 265 270

Gly Ser Glu Vai Ala lie Asn Gly Ser Phe Pro Ser lie Tyr Met Pro

275 280 285

Tyr Asn Gly Ser Vai Pro Phe Glu Glu Arg lie Ser Thr Leu Leu Lys

290 295 300

Trp Leu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Arg Pro Arg Phe Tyr Thr Met Phe305 310 315 320<table>table see original document page 285</column></row><table>805 810 815

Ser Cys Pro Glu Gly Lys Pro Glu Ala Leu Trp Vai Glu Glu Arg Phe

820 825 830

Thr Ala His lie Ala Arg Vai Arg Asp Vai Glu Leu Leu Thr Gly Leu

835 840 845

Asp Phe Tyr Gln Asp Lys Vai Gln Pro Vai Ser Glu lie Leu Gln Leu

850 855 860

Lys Thr Tyr Leu Pro Thr Phe Glu Thr Thr lie865 . 870 875

<210> 13

<211> 3988

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

ctactttatt ctgataaaac aggtctatgctttagcaacg gaacaacçtg ttíaagaagaatacagggtct ctctcctttg ggatctcacctgatcctcct gcctcagcct cctgagtagcgctaagtttt tgttcttctt gctttgctggttggactcag gaaactggaa aagcaaggcattagaggact ggagaactgc cggtgtgatggggattttga agacacctgt gtggaatcaagtggagagac cagattagag gccagcctttaagattgctg tgctgactat a|agagtgtttactgtgacac agcccagcag tctcagtgcctgttttctat ggatggattt agagctgaatatatcaataa actgaaaaca tgtggaattcccaaaacctt cccaaatcat tacaccattgtcattgacaa taatatgtat gatgtaaatcaacaaaataa tccagcctgg tggcatgggcgtttaaaagc cgctacctac ttttggcccgcttccatata catgccttac aacggaagtgtaaaatggct ggacctgccc aaagctgaaaaacctgattc ctctggacat gcaggtggacaggtagtaga tcatgctttt gggatgttgaactgtgtcaa tatcatcctt ctggctgacctggaatacat gactgattat tttcccagaaccccccgcat ccgagctcat aatatacctcttgttagaaa cctcagttgc cgaaaacctgatttgccaaa gcgactgcac tatgccaagatggatcaaca gtggctggct gttaggagtaatggttataa caatgagttt aggagcatggttaaagagaa gactgaagtt gaaccatttgatcttctacg cattcaacca gcaccaaacatgaaggtgcc tttttatgag ccatcccatggctttgctaa tccattgccc acagagtctcgtactcagct ggaacaagtg aatcagatgccagtgaaagt aaatttgcca tttgggaggcgtctccttta ccacagggaa tatgtcagtgggagttcata cacagtcccc cagttgggagactgtctgcg ggctgatgtc agggttcctctagcagacaa gaatatcacc cacggcttccatagccaata tgatgcttta attactagcaaaatgtggga ctacttccac agtgttcttctaaatgtggt tagtggacca atatttgattatgaaattac caaacattta gccaacactgtgctgaccag ttgtaaaaac aagagccacatcctaccctt tatcatccct caccgaccta

agctaccagg acaatggaat ctacgttgac 60cactcttaag aaatataaaa tagcttgcat 120tcaccacaac ctctgtttcc caggctcaag 180ttggaccaca ggcacatgcc acaaggctca 240tgatcatgtc acttggatta ggcctggggc 300gctgcaggaa gaagtgcttt gatgcatcat 360tggcatgtaa agaccgaggt gattgctgct 420ctcgaatatg gatgtgcaat aaatttcgtt 480gctcttgttc agatgactgt ttgcagaaga 540gccaaggaga aacctcatgg ctggaagaaa 600cagaagggtt tgacctgcca ccagttatct 660atttatacac atgggatact ttaatgccaa 720attcaaaata catgagagct atgtatccta 780tcacgggctt gtatccagag tcacatggca 840tcaacaagaa tttttcactt tcttcaaagg 900aaccaatgtg gctgacagca atgtatcaag 960gatcagaagt ggctataaat ggctcctttc 1020tcccatttga agagaggatt tctacactgt 1080gacccaggtt ttataccatg tattttgaag 1140cagtcagtgc cagagtaatt aaagccttac 1200tggaaggcct gaagcagcgg aatttgcaca 1260atggaatgga ccagacttat tgtaacaaga 1320taaacttctt ctacatgtac gaagggcctg 1380atgacttttt tagttttaat tctgaggaaa 1440atcagcattt caagccctat ttgactcctg 1500acgtcagaat cgacaaagtt catctctttg 1560aatcaaatac aaattgtgga ggaggcaacc 1620aggctatctt tctggcacat ggacccagtt 1680aaaatattga agtctataac ctaatgtgtg 1740atggaaccca tggtagttta aaccatcttc 1800cagaggaggt gtcaaagttt tctgtttgtg 1860ttgactgttt ctgccctcac ctacaaaata 1920taaatctcac ccaagaagaa ataacagcaa 1980ctagggtact gcagaagaac gtggaccact 2040gatttggaaa agctatgagg atgcccatgt 2100acacatcgcc tctgcctccc actgtcccag 2160cttctgagag ccaaaaatgt tccttctatt 2220tctatcctcc tgccagcaat agaacatcag 2280atttggtacc tatgtatgaa gaattcagaa 2340ttataaaaca tgccacagaa agaaatggag 2400ataattatga tggccatttt gatgctccag 2460atgttcccat cccaacacac tactttgtgg 2520caccggaaaa ctgccctggg tggctggatg 2580ccaacgtgga gagctgtcct gaaggtaaac 2640cagaagctct ttgggttgaaaacttctcac tgggcttgacaactaaagac atatttaccatatataattt actgtataaagttaaaataaa gttttctatttgaggcagga gactcgcttgattgcactcc agagcctgggataaaagtaa caataaaaataaactattgc aaaatactgtcagccatttg cttttcagaattctttatta agtagctctgaaaaatgcac aattaataaaaaaaaattca caaacgttgggctggaaaaa ttttcagttggttggcgtga gctacagaggttccatttga cagagcaaaggccaagtggt aaagcgagcagcaaaatacg acagtacacactgggagaca agggaaggcaaacçagcaca tccactggagtgcctcattt gatctcagccccccgacagc ttaggcactccctgccccac ccattcaggc

<210> 14<211> 841<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Ser Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Arg Lys Leu Glu Lys

1 5 10 15

Gln Gly Ser Cys Arg Lys Lys Cys Phe Asp Ala Ser Phe Arg Gly Leu

20 25 30

Glu Asn Cys Arg Cys Asp Vai Ala Cys Lys Asp Arg Gly Asp Cys Cys

35 40 45

Trp Asp Phe Glu Asp Thr Cys Vai Glu Ser Thr Arg lie Trp Met Cys

50 55 60

Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Thr Arg Leu Glu Ala Ser Leu Cys Ser

65 70 75 80

Cys Ser Asp Asp Cys Leu Gln Lys Lys Asp Cys Cys Ala Asp Tyr Lys

85 90 95

Ser Vai Cys Gln Gly Glu Thr Ser Trp Leu Glu Glu Asn Cys Asp Thr

100 105 110

Ala Gln Gln Ser Gln Cys Pro Glu Gly Phe Asp Leu Pro Pro Vai lie

115 120 125

Leu Phe Ser Met Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu Tyr Thr Trp Asp

130 135 140

Thr Leu Met Pro Asn lie Asn Lys Leu Lys Thr Cys Gly lie His Ser

145 150 155 160

I>ys Tyr Met Arg Ala Met Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr

165 170 175

Thr lie Vai Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly lie lie Asp Asn

180 185 190

Asn Met Tyr Asp Vai Asn Leu Asn Lys Asn Phe Ser Leu Ser Ser Lys

195 200 205

Glu Gln Asn Asn Pro Ala Trp Trp His Gly Gln Pro Met Trp Leu Thr

210 215 220

Ala Met Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Ala Thr Tyr Phe Trp Pro Gly Ser

225 230 235 240

gaaagattta cagctcacat tgcccgggtc cgtgatgtag 2700ttctatcagg ataaagtgca gcctgtctct gaaattttgc 2760acatttgaaa ccactattta acttaataat gtctacttaa 2820gtaattttgg caaaatataa gtgatttttt ctggagaatt 2880tttccttaaa aaaaaaaccg gaattccggg cttgggaggc 2940aacccgggag gcagaggttg cagtgagcca agattgcgcc 3000tgacagagca agactacatc tcaaaaaata aataaataaa 3060aaaaagaaca gcagagagaa tgagcaagga gaaatgtcac 3120tacactgggt tggctctcca agaagatact ggaatctctt 3180gtagaaacca gcaaaccacc tctaagcgga gaacatacga 3240gggaaggaaa gaataaaagt tgatagctcc ctgattggga 3300gaatgaagat gaaagaaagc atgcttatgt tgtaacacaa 3360tggaaggaaa acagtataga aaacattact ttaactaaaa 3420ggatgcgact gacaaaaaga acgggatttc caggcataaa 3480gcaccatgtg gctcagtgga agacccttca agattcaaag 3540gcacttcgca aggagaaggg tttaaattat gggtccaaaa 3600atttgcagca taactgcttc tcctagacag ggctgagtgg 3660cagtgactat tagccactgc cagaaacagg ctgaacagcc 3720ggtggtggga gttgttcatg gagagaaagg agagttttag 3780atgctgggcc accagacccc tcccagtcaa taaagtctgg 3840tcatcatgac cctggagaga ccctgatacc atctgccagt 3900cttgccatca acctgacccc ccgagtggtt ctccaggctc 3960cggaattc 3988<table>table see original document page 288</column></row><table>725 730 735

Asn Thr Asp Vai 740 Pro lie Pro Thr His 745 Tyr Phe Vai Vai Leu 750 Thr Ser

Cys Lys Asn 755 Lys Ser His Thr Pro 760 Glu Asn Cys Pro Gly Trp 765 Leu Asp

Vai Leu 770 Pro Phe lie lie Pro 775 His Arg Pro Thr Asn 780 Vai Glu Ser Cys

Pro Glu Gly Lys Pro Glu Ala Leu Trp Vai Glu Glu Arg Phe Thr Ala

785 790 795 800

His lie Ala Arg Vai Arg Asp Vai Glu Leu Leu Thr Gly Leu Asp Phe

805 810 815

Tyr Gln Asp Lys 820 Vai Gln Pro Vai Ser 825 Glu lie Leu Gln Leu 830 Lys Thr

Tyr Leu Pro 835 Thr Phe Glu Thr Thr 840 lie

<210> 15

<211> 1266

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

ctggggcctc agtgaggtct cctgcaaggc ttctggatac accttcaccg gctactatat 60gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatgga tcaaccctaa 120cagtggtggc acaaactatg cacagaagtt tcagggcaga gtcaccatga ccàgggacac 180gtccatcagc acagcctaca tggagctgag caggctgaga tctgacgaca cggccgtgta 240ttactgtgcg cgagaattac gatattttgg ctggttatta tcctcccttg actactgggg 300ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct 360ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga 420ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gctctgacca gcggcgtgca 480caccttccca gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt 540gccctccagc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa 600caccaaggtg gacaagacag ttgagcgcaa atgttgtgtc gagtgcccac cgtgcccagc 660accacctgtg gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat 720gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccccga 780ggtccagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccacg 840ggaggagcag ttcaacagca cgttccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgttg tgcaccagga 900ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cagcccccat 960cgagaaaacc atctccaaaa ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc 1020cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt 1080ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa 1140gaccacacct cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc ctttacagca agctcaccgt 1200ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct 1260gcacaa 1266

<210> 16

<211> 421

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Trp Gly Leu Ser Glu Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

1 5 10 15

Gly Tyr Tyr Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

20 25 30

Trp Met Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln

35 40 45

Lys Phe Gln Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr

50 55 60

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr<table>table see original document page 290</column></row><table>aatctggaac tgcctctgtttacagtggaa ggtggataacaggacagcaa ggacagcaccacgagaaaca caaagtctaccaàagagctt caacagggga

<210> 18

<211> 226

<212> PRT

<213> Horoo sapiens

<400> 18

Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp lie

1 5 10 15

Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg

20 25 30

Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Ser Tyr Leu Asn

35 40 45

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala

50 55 60

Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Glu

65 70 75 80

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

85 90 95

Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe

100 105 110

Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser

115 120 125

Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala

130 135 140

Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai

145 150 155 160

Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

165 170 175

Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr

180 185 190

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys

195 200 205

Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn

210 215 220

Arg Gly225

gtgtgcctgc tgaataacttgccctccaat cgggtaactctacagcctca gcagcaccctgcctgcgaag tcacccatca

ctatcccaga gaggccaaag 480ccaggagagt gtcacagagc 540gacgctgagc aaagcagact 600gggcctgagc tcgcccgtca 660

680

<210> 19

<211> 1405

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Característica_misc

<222> 1351

<223> n = a, t, c, ou g.

<400> 19

ctcaacaacc acatctgtcc tctagagaaatggacctgga ggatcctctt cttggtggcactggtgcagt ctggggctga ggtgaagaaggcttctggat acaccttcac cagttatgatgggcttgagt ggatgggatg gatgaaccctttccagggca gagtcaccat gaccaggaac

accctgtgag cacagctcct caccatggac 60gcagctacaa gtgcccactc ccaggtgcag 120cctggggcct cagtgaaggt ctcctgcaag 180atccactggg tgcgacaggc cactggacaa 240aacagtggta acacagtcta tgcacagaag 300acctccataa gcacagccta catggagctg 360<table>table see original document page 292</column></row><table>245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

260 265 270

Pro Glu Vai 275 Thr Cys Vai Vai Vai 280 Asp Vai Ser His Glu 285 Asp Pro Glu

Vai Gln Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys

290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser

305 310 315 320

Vai Leu Thr Vai Vai His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

340 345 350

Ser Lys Thr 355 Lys Gly Gln Pro Arg 360 Glu Pro Gln Vai Tyr 365 Thr Leu Pro

Pro Ser 370 Arg Glu Glu Met Thr 375 Lys Asn Gln Vai Ser 380 Leu Thr Cys Leu

Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Glu Asn 405 Asn Tyr Lys Thr Thr 410 Pro Pro Met Leu Asp 415 Ser

Asp Gly Ser Phe 420 Phe Leu Tyr Ser Lys 425 Leu Thr Vai Asp Lys 430 Ser Arg

Xaa Gln Gln 435 Gly Asn Vai Phe Ser 440 Cys Ser Vai Met His 445 Glu Ala Leu

His Asn

450

<210> 21

<211> 685

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

tctggatctc tggtgcctac ggggacatcgtgtctctggg cgagagggcc accatcaactccaagaataa gaactactta gcttggtacctcatttactg ggcatctacc cgggaatccgctgggacaga tttcactctc accatcagcaactgtcagca atattatagt actcctccgttcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtctaatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgctacagtggaa ggtggataac gccctccaataggacagcaa ggacagcacc tacagcctcaacgagaaaca caaagtctac gcctgcgaagcaaagagctt caacagggga gagtg

tgatgaccca gtctccagac tccctggctg 60gcaagtccag ccagagtgtt ttatacagct 120agcagaaacc aggacagcct cctaagctgc 180gggtccctga ccgattcagt ggcagcgggt 240gcctgcaggc tgaagatgtg gcagtttatt 300ggacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa 360tcatcttccc gccatctgat gagcagttga 420tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag 480cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc 540gcagcaccct,gacgctgagc aaagcagact 600tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca 660

685

<210> 22

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Trp lie Ser Gly Ala Tyr Gly Asp

1 5Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly Glu20

Ser Gln Ser Vai Leu Tyr Ser Ser35 40

lie Vai Met Thr Gln Ser Pro Asp

10 15Arg Ala Thr IIe Asn Cys Lys Ser25 30

Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp45<table>table see original document page 294</column></row><table><table>table see original document page 295</column></row><table><210> 27

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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gtggagtctg ggggaggcgt ggtccagcct gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagcg 60tctggattca ccttcagaag ctatggcatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 120ctggagtggg tggcagttat atggtctgat ggaagtaata aatactatgc agactccgtg 180aagggccgat ttaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac 240agcctgagag ccgaggacac ggctgtgtat tactgtgcga gagaggggta ctatggttcg 300gggagttatt actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcc 408

<210> 28

<211> 136

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu

1 5 10 15

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly Met His Trp

20 25 30

Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Vai 11e Trp

35 40 45

Ser Asp Gly Ser Asn Lys; Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe

50 '". 55 60

Thr lie Ser Arg Âsp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly

85 90 95

Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser

130 ' 135

<210> 29

<211> 678

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 29

ctcctgaccc tcctcactca ctctgcagtgccctcggtgt ccaagggctt gagacagaccaatgttggca cccaaggagc agcttggctgctttcctaca ggaataacaa ccggccctcatcaggaaaca cagcctccct gaccattacttactgctcag catgggacag cagcctcagtaccgtcctag gtcagcccaa ggctgcccccgagcttcaag ccaacaaggc cacactggtggtgacagtgg cctggaaggc agatagcagcccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcgcagtggaagt cccacagaag ctacagctgcaagacagtgg cccctaca

tcagtggtcc aggcagggct gactcagcca 60gccacactca cctgcactgg gaacagcaac 120cagcagcacc agggccaccc tcccaaactc 180gggatctcag agagattatc tgcatccacg 240ggactccagc ctgaggacga ggctgactat 300gctgtggtat tcggcggagg gaccaagctg 360tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag 420tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc 480cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca 540gccagcagct atctgagcct gacgcctgag 600caggtcacgc atgaagggag caccgtggag 660

678

<210> 30<table>table see original document page 297</column></row><table><table>table see original document page 298</column></row><table><table>table see original document page 299</column></row><table><table>table see original document page 300</column></row><table><table>table see original document page 301</column></row><table><table>table see original document page 302</column></row><table><table>table see original document page 303</column></row><table><table>table see original document page 304</column></row><table><210> 48

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<212> PRT

<213> Honro sapiens

<400> 48

Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asn Ser Ala Ala

20 25 30

Trp Asn Trp lie Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Ala Tyr Ala vai Ser Vai

50 55 60

Lys Ser Arg Met Thr lie Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120

<210> 49

<211> 683

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 49

ctcagctcct ggggctcctg ctgctctggt tcccaggttc cagatgcgac atccagatga 60cccagtctcc atcttccgtg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgtcggg 120cgagtcaggg tattcgcagc tggttagcct ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta 180agctcctgat ctatgctgca tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagcggca 240gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa 300cttactattg tcaacaggct aacagtttcc ctcccacttt cggcggaggg accaaggtgg 360agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 420tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 480aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 540agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 600actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 660tcacaaagag cttcaacagg gga 683

<210> 50

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp

1 5 10 15

lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly Asp

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Arg Vai Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg Ser Trp Leu

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Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser65 70 75 80

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu85 90 95<table>table see original document page 306</column></row><table><212> DNA

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agctcctggg gctcctgctg ctctggttcc caggttccag atgcgacatc cagatgaccc 60agtctccatc ttccgtgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact tgtcgggcga 120atcagggtat taggagttgg ttagcctggt atcagcagaa accagggaaa gccccaaagc 180tcctgatcta tgctgcatcc agtttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc agcggcagtg 240gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcagcctgca gcctgaagat tttgcaactt 300actattgtca acaggctaac agtttccctc ccactttcgg cggagggacc aaggtggaga 360tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga 420aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag 480tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc 540aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact 600acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca 660caaagagctt caacagggg 679

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp lie

1 5 10 15

Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg

20 25 30

Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Asn Gln Gly lie Arg Ser Trp Leu Ala

35 40 45

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50 55 60

Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser

115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn210 215 220

Arg225

<210> 55

<211> 427

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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caggacagac agccagcatc acctggctct ggagataaat tgggggataa afcatgcttgc 60tggtatcagc agaagccagg ccagtcccct gtgctggtca tctatcaaga tagcaagcgg 120ccctcaggga tccctgagcg attctctggc tccaactctg ggaacacagc cactctgacc 180atcagcggga cccaggctat ggatgaggct gactattact gtcaggcgfcg ggacaacaga 240actgcggtat tcggcggagg gaccaagctg accgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc 300tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 360tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cctggaaggc agatagcagc 420cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 480gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc 540cag 543

<210> 70<211> 181<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 70

Gln Asp Arg Gln Pro Ala Ser Pro Gly Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp

15 10 15

Lys Tyr Ala Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Vai Leu

20 25 30

Vai lie Tyr Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe

35 40 45

Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr

50 55 60

Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Asn Arg65 70 75 80

Thr Ala Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gln Pro

85 90 95

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100 105 110

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Vai Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro

115 120 125

Gly Ala Vai Thr Vai Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Vai Lys Ala

130 135 140

Gly Vai Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala145 150 155 160

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

165 170 175

Ser Tyr Ser Cys Gln180

<210> 71<211> 401<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 71

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gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120atctatcctg gtgactctga taccagatac 180tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240accgccatgt attactgtgc gagaaaggac 300caagggacca cggtcaccgt ctcctcagcc 360gcaccctcct c 401

<210> 72<211> 133<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

Arg Cys Arg Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp lie Gly Trp Vai Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

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50 55 60

Gln Gly Gln Vai Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Arg Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Vai Met Asp Vai Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser130

<210> 73

<211> 591

<212> DKA

<213> Homo sapiens

<400> 73

gataccatct cctgcactgg aaccagcagt gacgttggta attataacta tgtctcctgg 60taccaacaac acccaggcaa agcccccaaa ctcatgattt atgcggtcaa taatcggccc 120tcaggggttt ctaatcgctt ctctggctcc aagtctggca acacggcctc cctgaccatc 180tctgggctcc aggctgagga cgaggctgat tattactgca gctcatatac aagcagcagg 240aatcttgtag ttttcggcgg cgggaccaag ctgaccgtcc taggtcagcc caaggctgcc 3 00ccctcggtca ctctgttccc gccctcotct gaggagcttc aagccaacaa ggccacactg 360gtgtgtctca taagtgactt ctacccgggã gccgtgacag tggcctggaa ggcagatagc 420agccccgtca aggcgggagt ggagaccacc acaccctcca aacaaagcaa caacaagtac 480gcggccagca gctatctgag cctgacgcct gagcagtgga agtcccacag aagctacagc 540tgccaggtca cgcatgaagg gagcaccgtg gagaagacag tggcccctac a 591

<210> 74

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74,

Asp Thr 11 e Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Vai Gly Asn Tyr Asn

1 5 10 15

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met

20 25 30

lie Tyr Ala Vai Asn Asn Arg Pro Ser Gly Vai Ser Asn Arg Phe Ser

35 40 45

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly Leu Gln

50 55 60

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Arg

65 70 75 80

Asn Leu Vai Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gln

85 90 95

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Vai Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

100 105 110Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Vai Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr

115 120 125

Pro Gly Ala Vai Thr Vai Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Vai Lys

130 135 140

Ala Gly Vai Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

145 150 155 160

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

165 170 175

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Vai Thr His Glu Gly Ser Thr Vai Glu Lys

180 185 190

Thr Vai Ala Pro Thr

195

<210> 75<211> 660<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 75

ggagcacgag gacactgaca tggactgaagttgggagaat cccctagatc acagctcctcttggtggcag cagcaacàgg tgcccactccgtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtcagctatggta tcagctgggt gcgacaggccatcagcgctt acaatggtaa cacatactataccacagaca catccacgag cacagcctacacggccgtgt attactgtgc gagagatgggtacggtatgg acgtctgggg ccaagggaccggcccatcgg tcttccccct ggcaccctccctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc

gagtagaaaa cccaaaaacc acacccctcc 60accatggact ggacctggag catccttttc 120caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag 180tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc 240cctggãcaag ggcttgagtg gatgggatgg 300gcacagaagc tccaggccag agtcaccatg 360atggagctga ggagcctgag atctgacgac 420tatagcagca gctggtccct cctgcactac 480acggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag 540tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 600gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcagcg 660

<210> 76

<211> 189

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7 6

Met Asp Trp Thr Trp Ser lie Leu Phe Leu Vai Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Gly lie Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Trp lie Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala65 70 75 80

Gln Lys Leu Gln Ala Arg Vai Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Leu Leu His

115 120 125

Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser

130 135 140

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp165 170 175Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Ala180 185

<210> 77

<211a- 651

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 77

tcagatacca gatgtgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta 60ggagacagaa tcaccatcac ttggcggtcg agtcagggca tttacaattc tttagcctgg 120tatcagcaga aaccagggaa agttcctaag ctcctgatct atgctgcatc cactttgcac 180tcaggggtcc catctcggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 240agcagcctgc agcctgaaga tgttgcaact tattactgfcc aaaaatataa cagtgcccca 300ttcactttcg gccctgggac caaagtggat atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420ctgaataact tctatoccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg a 651

<210> 78

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

Ser Asp Thr Arg Cys Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg lie Thr lie Thr Trp Arg Ser Ser Gln

20 25 30

Gly lie Tyr Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Vai

35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu His Ser Gly Vai Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr

85 90 95

Asn Ser Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp lie Lys

100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

210 215

<210> 79<211> 1396<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 79

tttctgagag tcctggacct cctgtgcaag aacatgaaac acctgtggtt cttcctcctg 60ctggtggcag ctcccagatg ggtcctgtcc caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga 120ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc 180agtggtggtt actactggag ctggatccgc cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt 240gggatcatct attacagtgg gagcacctac tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc 300atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc tccctgaagc tgaactctgt gactgccgcg 360gacacggccg tgttttactg tgcgagagtg gctatagtga ctacgatccc gggcggtatg 420gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg 480gtcttocccc tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc 540ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc 600agcggcgtgc acaccttccc agctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 660gtggtgaccg tgccctccag caacttcggc acccagacct acacctgcaa cgtagatcac 720aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca 780ccgtgcccag caccacctgt ggcaggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 840gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac 900gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 960acaaagccac gggaggagca gttcaacagc acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt 1020gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 1080ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaagggc agccccgaga accacaggtg 1140tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1200gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1260aacaactaca agaccacacc tcccatgctg gactccgacg gctccttctt cctttacagc 1320aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 13 80catgaggctc tgcaca 1396

<210> 80

<211> 454

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Vai Leu Ser Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser lie

35 40 45

Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln His Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp 11e Gly lie lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys

85 90 95

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Vai Phe Tyr Cys Ala Arg Vai Ala lie Vai Thr Thr lie Pro Gly Gly

115 120 125

Met Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

145 150 155 160

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

210 215 220

Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai

225 230 235 240

Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai

245 250 255

Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Vai Gln Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu

290 295 300

Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

305 310 315 320

Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

340 345 350

lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Vai

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His450

<210> 81

<211> 700

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 81

aggagtagaa aatgagcaaa actgacaagt caaggcagga agatgttgcc atcacaactc 60attgggtttc tgctgctctg ggttccagcc tccaggggtg aaattgtgct gactcagtct 120ccagactttc agtctgtgac tccaaaggag aaagtcacça tcacctgccg ggccagtcag 180agcattggta ttagcttaca ctggtaccag cagaaaccag atcagtctcc aaagctcctc 240atcaagtatg cttcccagtc cttctcaggg gtcccctcga ggttcagtgg cagtggatct 300gggacagatt tcaccctcac catcaatagc ctggaagctg aagatgctgc aacgtattac 360tgtcatcaga gtaggagttt cccgtggacg ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa 420cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 480ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 540tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 600agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 660aaacacaaag fctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc 700

<210> 82

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

Met Leu Pro Ser Gln Leu lie Gly Phe Leu Leu Leu Trp Vai Pro Ala1 5 10 15<table>table see original document page 319</column></row><table>Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai

100 105 110

Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Glu

115 120 125

Pro Ser Ser Lys130

<210> 85

<211> 570

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 85

ggccagtctg ccctgactca acctgcctccatctcctgca ctggaaccag cagtgacgttcagcacccag gccaagcccc caaactcctg

gtttctactc gcttctctgg ctccaagtct

ctccaggctg aggacgaggc cgattattat

gtggttttcg ccggagggac caaactgacc

gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag

ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg

gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc

agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag

<210> 86

<211> 190

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 86

Gly Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Vai Ser Gly Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Ser lie Thr lie Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Vai Gly Gly

20 25 30

Tyr Asn Tyr Vai Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gln Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu lie Tyr Gly Vai Asn lie Arg Pro Ser Gly Vai Ser Thr Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly

65 70 75 80

Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Arg

85 90 95

Ser Ser lie Leu Vai Vai Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Vai Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Vai Cys Leu lie Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Vai Thr Vai Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Vai Lys Ala Gly Vai Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln

180 185 190

gtgtctgggt ctcctggaca gtcgatcacc 60ggtggttata attatgtctc ctggtaccaa 120atttatgggg tcaatattcg gccctcaggg 180

ggcaacacgg cctccctgac catctctggg 240tgtagttcat atacaagaag cagcattctt 300gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420acagtggcct ggaaggcaga tagcagcccc 480tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540

570

<210> 87<211> 427<table>table see original document page 321</column></row><table>1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Ser Pro lie

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

13 0 135 140

Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155

<210> 91

<211> 594

<212> DWA

<213> Homo sapiens

<400> 91

agaagagtct ccctcactgc ccagctggga tctcagggct tcattttctg tcctccacca 60atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgag 120gtgcaactag tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggágtctct gaagatctcc 180tgtaagggtt ctggatacag gtttaccagc tactggatcg gctgggtgcg ccagatgccc 240gggaaaggcc tggàgtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac cagatacagc 300ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg 360cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaaggactac 420tactactaca ctatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 480accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agageacctc tgggggcaca 540gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcg 594

<210> 92

<211> 178

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 92

Met Gly Ser Thr Ala lie Leu Ala Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gln Gly

1 5 10 15

Vai Cys ■Ala Glu Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp lie Gly Trp Vai Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser

65 70 75 80

Pro Ser Phe Gln Gly Gln Vai Thr 11e Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Vai Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro<table>table see original document page 323</column></row><table><table>table see original document page 324</column></row><table><400> 97

tggatctctg gatccagtgg ggatattgtg

acccctggag agccggcctc catctcctgc

ggatacaact atthggattg gtacctgcag

tatttgggtt ctaatcgggc ctccggggtc

acagatttta cactgaaaat cagcagagtg

atgcaagctc tacaaactat caccttcggc

gtggctgcac catctgtctt catcttcccg

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc

gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc

gacagcacct acagcctcag cagcaccctg

aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcagaacaggggag a

atgactcagt ctccactctc cctgcccgtc 60aggtctagtc agagcctcct gcatagtaat 120aagccagggc agtctccaca gctcctgatc 180cctgacaggt tcagtggcag tggatcaggc 240gaggctgagg atgttggggt ttattactgc 300caagggacac gactggagat taaacgaact 360ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 420tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 480caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 540acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 600gscctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 660

671

<210> 98

<211> 223

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANT ~<222> 211

<223> Xaa = Àriy amino "acid.

<400> 9 8

Trp lie Ser Gly Ser Ser Gly Asp lie Vai Met Thr Gln Ser Pro Leu

1 5 10 15

Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser

20 25 30

Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr

35 40 45

Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser

50 55 60

Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

.65 70 75 80

Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly

85 90 95

Vai Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr lie Thr Phe Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai

130 135 140

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gln Trp Lys

145 150 155 160

Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Vai Thr Glu

165 170 175

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

180 185 190

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr

195 200 205

His Gln Xaa Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

210 215 220

<210> 99

<211> 604

<212> DNA

<213> Homo sapiens<table>table see original document page 326</column></row><table><table>table see original document page 327</column></row><table><table>table see original document page 328</column></row><table><table>table see original document page 329</column></row><table><table>table see original document page 330</column></row><table><table>table see original document page 331</column></row><table><table>table see original document page 332</column></row><table><table>table see original document page 333</column></row><table>Ser Tyr Asp lie His Trp Vai Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu

20 25 30

Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Vai Tyr Ala Gln

35 40 45

Lys Phe Gln Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser He Ser Thr

50 55 60

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr65 70 75 80

Tyr Cys Ala Arg Thr Vai Leu Leu Trp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

85 90 95

Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai

100 105 110

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser

130 135 140

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai145 150 155 160

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro

165 170 175

Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys

180 185 190

Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai

195 200 205

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe

210 215 220

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro225 230 235 240

Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai

245 250 255

Gln Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr

260 265 270

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai

275 280 285

Leu Thr Vai Vai His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

290 295 300

Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser305 310 315 320

Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr Thr Leu Pro Pro

325 330 335

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai

340 345 350

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly

355 360 365

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp

370 375 380

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg385 390 395

<210> 118<211> 227<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 118

Trp lie Ser Gly Ala Tyr Gly Asp

1 5Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly Glu20

Ser Gln Ser Vai Leu Tyr Ser Ser

lie Vai Met Thr Gln Ser- Pro Asp

10 15Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser25 30Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp<table>table see original document page 335</column></row><table><table>table see original document page 336</column></row><table><table>table see original document page 337</column></row><table><table>table see original document page 338</column></row><table>180

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr195 200Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215Arg Gly225

185 190Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys205

Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn220

<210> 125<211> 135<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 125

Vai Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu

1 5 10 15

Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser lie Asn Ser Phe Gly Tyr Tyr Trp

20 25 30

Ser Trp lie Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Phe

35 40 45

Leu Tyr 50 Phe Thr Gly Ser Thr 55 Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 60 Lys Ser Arg

Vai Thr lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu

65 70 75 80

Ser Ser Vai Thr Ala 85 Ala Asp Thr Ala Vai 90 Tyr Tyr Cys Ala Arg 95 Ala

Gly Thr Met Vai Arg Gly Ala His Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr 115 Thr Vai Thr Vai Ser 120 Ser Ala Ser Thr Lys 125 Gly Pro Ser

Vai Phe 130 Pro Leu Ala Pro Ser 135

<210> 126<211> 231<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 126

Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Gly Arg Cys Asp 1 5 10 15

lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp

20 25 30

Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Asn Tyr Leu

35 40 45

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

65 70 75 80

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu

85 90 95

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln lie Tyr Ser Thr Pro Pro Glu

100 105 110

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala

115 120 125

Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

130 135 140

Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

145 150 155 160Ala Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp165

Gln Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp180

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gln

210 215Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

170 175Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu185 190Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai205

Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys220

<210> 127<2U> 136<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 127

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp lie Gly Ser Met Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr His Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Vai lie lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg His Tyr lie Thr Vai Ala Gly lie Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

130 135

<210> 128<211> 226<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 128

Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys

1 5

Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser

20

lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Thr

35 40

Trp Tyr Gln Gln Vai Pro Gly Thr

50 55

Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Vai

65 70

Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala

85

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala

100

Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120

Ala Gly Ser Trp Ala Gln Ser Vai

10 15Gly Thr Pro Gly Gln Arg Ala Thr25 30Asn lie Gly Ser Thr lie Vai Asn45

Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys

75 80lie Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp

90 95Trp Asp Ala Ser Leu Asn Gly Pro105 110Thr Vai Leu Gly Gln Pro Lys Ala125<table>table see original document page 341</column></row><table>100

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai

115 120

Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro

130 135

Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu

145 150

Lys Vai Gln Trp Lys vai Asp Asn

165

Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser

180

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200

Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly

210 215

Phe Asn Arg Gly

225

105 110Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly140

Asn Asn -Phe Tyr Pro Arg Glu Ala155 160Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

170 175Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser185 190Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr205

Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser220

<210> 131l' <211> 121

<212> PRT<213> Homo sapiens

v

<400> 131

Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asn Ser Ala Ala

20 25 30

Trp Asn Trp 35 lie Arg Gln Ser Pro 40 Ser Arg Gly Leu Glu 45 Trp Leu Gly

Arg Thr 50 Tyr Tyr Arg Ser Lys 55 Trp Tyr Asn Ala Tyr Ala 60 Vai Ser Vai

Lys Ser Arg Met Thr lie Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Vai Thr Vai 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120 Lys

<210> 132<211> 227<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 132

Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu

1 .5lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser20

Arg Vai Thr IIe Thr Cys Arg Ala

35 40Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly65 70Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

Trp Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp10 15

Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly Asp25 30

Ser Gln Gly lie Arg Ser Trp Leu45

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr60

Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser75 80

Thr IIe Ser Ser Leu Gln Pro Glu85 90 95

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro Thr

100 105 110

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro

115 120 125

Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys145 150 155 160

Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

165 170 175

Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala

195 200 205

Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe

210 215 220

Asn Arg Gly225

<210> 133<211> 123<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 133

Glu Vai Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Tyr Tyr Asn Ala Tyr Pro

50 55 60

Vai Ser Vai Lys Ser Arg lie Thr lie Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr115 120

<210> 134<211> 225<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 134

Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20

Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Asn

35 40Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai65 70

Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp lie

10 15Vai Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg25 30Gln Gly lie Arg Ser Trp Leu Ala45

Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly75 80<table>table see original document page 344</column></row><table>50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Thr Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Ala Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Vai Phe 11e Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155

<210> 137<211> 130<212> PRT<213> Horao sapiens

<400> 137

Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr

1 5 10 15

Vai Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln

20 25 30

Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 11e Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly

35 40 45

Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr lie Ser Vai

50 55 60

Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala

65 70 75 80

Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Vai Ser Tyr Tyr Tyr

85 90 95

Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

115 120 125

Ser Thr130

<210> 138<211> 234<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 138

Vai Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala 1 5 10 15

Arg Cys Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

20 25 30

Vai Gly Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Thr lie Gln Asn lie Asn

35 40 45

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

50 55 60

Leu lie Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu

85 90 95

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr

100 105 110Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp lie Lys Arg Thr Vai

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Trp Leu Glu

225 230

<210> 139<211> 132<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 139

Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr

1 5 10 15

Vai Pro Gly Gly Ser lie Arg Ser Tyr Phe Trp Ser Trp lie Arg Gln

20 25 30

Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Arg Phe Tyr Phe Ser Gly

35 40 45

Ser Thr 50 Asn Tyr Asn Pro Ser 55 Leu Lys Ser Arg Vai 60 Thr Met Ser Vai

Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala

65 70 75 80

Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp His Tyr

85 90 95

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai

100 105 110

Ser Ser Ala 115 Ser Thr Lys Gly Pro 120 Ser Vai Phe Pro Leu 125 Ala Pro Ser

Ser Lys 130 Ser Thr

<210> 140<211> 211<212>:PRT<213> Homo sapiens

<400> 140

Vai Leu Thr Gln Pro

1 5Thr lie Ser Cys Ser20

Ser Trp Tyr Gln Gln35

Asp Asn Asn Lys Arg50

Lys Ser Gly Thr Ser65

Asp Glu Ala Asp Tyr

Pro Ser Vai Ser Ala Ala10

Gly Ser Ser Ser Asn IIe25

Phe Pro Gly Thr Ala Pro40

Ser Ser Gly lie Pro Asp55

Ala Thr Leu Gly lie Thr70 75Tyr Cys Gly Thr Trp Asp

Pro Gly Gln Lys Vai15

Gly Asn Asn Tyr Vai30

Lys Phe Leu lie Tyr45

Arg Phe Ser Gly Ser60

Gly Leu Gln Thr Gly80

Ser Ser Leu Ser Ala<table>table see original document page 347</column></row><table>Gly Ala Vai Thr Vai Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Vai Lys Ala

130 135 140

Gly Vai Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala145 150 155 160

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

165 170 175

Ser Tyr Ser Cys Gln180

<210> 143<211> 133<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 143

Arg Cys Arg Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Vai Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile 50 Ile Tyr Pro Gly Asp 55 Ser Asp Thr Arg Tyr 60 Ser Pro Ser Phe

Gln Gly Gln Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Arg Ser 85 Leu Lys Ala Ser Asp Thr 90 Ala Met Tyr Tyr 95 Cys

Ala Arg Lys Asp 100 Tyr Tyr Tyr Tyr Vai 105 Met Asp Vai Trp Gly Gln 110 Gly

Thr Thr Vai 115 Thr Vai Ser Ser Ala 120 Ser Thr Lys Gly Pro 125 Ser Vai Phe

Pro Leu 130 Ala Pro Ser

<210> 144<211> 197<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 144

Asp Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Vai Gly Asn Tyr Asn

1 5 10 15

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met

20 25 30

Ile Tyr Ala Vai Asn Asn Arg Pro Ser Gly Vai Ser Asn Arg Phe Ser

35 40 45

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln

50 55 60

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Arg

65 70 75 80

Asn Leu Vai Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gln

85 90 95

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Vai Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

100 105 110

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Vai Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

115 120 125

Pro Gly Ala Vai Thr Vai Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Vai Lys

130 135 140

Ala Gly Vai Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr145 150 155 160

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

165 170 175

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Vai Thr His Glu Gly Ser Thr Vai Glu Lys

180 185 190

Thr Vai Ala Pro Thr195

<210> 145

<211> 454

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 145

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp

15 10 15

Vai Leu Ser Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser lie

35 40 45

Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln His Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp lie Gly lie lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys

85 90 95

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Vai Phe Tyr Cys Ala Arg Vai Ala lie Vai Thr Thr lie Pro Gly Gly

115 120 125

Met Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr145 150 155 160

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

210 215 220

Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai225 230 235 240

Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai

245 250 255

Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Vai Gln Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu

290 295 300

Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr305 310 315 320

Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

340 345 350

lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln355 360 365Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg370 375

Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly385 390

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro405

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser420

Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln435 440

Met His Glu Ala Leu His450

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai380

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai395 400

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro410 415

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr425 430

Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai445

<210> 146

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 146

Met Leu Pro Ser Gln Leu lie Gly Phe Leu Leu Leu Trp Vai Pro Ala

1 5 10 15

Ser Arg Gly Glu lie Vai Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Vai

20 25 30

Thr Pro Lys Glu Lys Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie

35 40 45

Gly lie Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys

50 55 60

Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Vai Pro Ser Arg65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser

85 90 95

Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Arg Ser

100 105 110

Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr

115 120 125

Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly210 215

<210> 147

<211> 189

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 147

Met Asp Trp Thr Trp Ser lie Leu1 5

Ala His Ser Gln Vai Gln Leu Vai20

Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser

Phe Leu Vai Ala Ala Ala Thr Gly10 15

Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys25 30

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe<table>table see original document page 351</column></row><table><table>table see original document page 352</column></row><table>Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gln Pro Gly Arg

15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai

35 40 45

Ala Vai He Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Arg He Thr He Phe Gly Vai Vai His Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr130 135 140

<210> 152<211> 156<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 152

Asp Thr Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly

1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser He Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Ser Pro He

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp He Lys Arg Thr Vai Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Vai Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser145 150 155

<210> 153<211> 178<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 153

Met Gly Ser Thr Ala He Leu Ala

1 5Vai Cys Ala Glu Vai Gln Leu Vai20

Pro Gly Glu Ser Leu Lys He Ser

35 40Thr Ser Tyr Trp He Gly Trp Vai

Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gln Gly

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Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu<table>table see original document page 354</column></row><table><table>table see original document page 355</column></row><table>145 150 155 160

Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Vai Thr Glu

165 170 175

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

180 185 190

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr

195 200 205

His Gln Xaa Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly210 215 220

<210> 157<211> 182<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 157

Met Gly Ser Thr Ala lie Leu Ala Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gln Gly

15 10 15

Vai Cys Ala Glu Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp lie Gly Trp Vai Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser65 70 75 80

Pro Ser Phe Gln Gly Gln Vai Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Vai Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Ser Asp

165 170 175

Glu Cys Arg Glu Leu Ser180

<210> 158

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 158

Gly Leu Gly Gln Ser

1 5Pro Gly Gln Ser lie20

Gly Arg Phe Asn Tyr35

Pro Lys Leu Met IIe50

Asn Arg Phe Ser Gly65

Ser Gly Leu Gln Ala85

Ala Leu Thr Gln Pro Ala10

Thr lie Ser Cys Thr Gly25

Vai Ser Trp Tyr Gln Gln40

Tyr Ala Vai Asn lie Arg55

Ser Lys Ser Gly Asn Thr70 75Glu Asp Glu Ala Gly Tyr90

Ser Vai Ser Gly Ser15

Thr Ser Ser Asp Vai30

Arg Pro Gly Lys Ala45

Pro Ser Gly Vai Ser60

Ala Ser Leu Thr lie80

Tyr Cys Ser Ser Tyr95Thr Ser Ser Ser Thr Leu Leu Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

100 105 110

Vai Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Vai Thr Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Vai Cys Leu lie

130 135 140

Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Vai Thr Vai Ala Trp Lys Ala Asp Ser145 150 155 160

Ser Pro Vai Lys Ala Gly Vai Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser

165 170 175

Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln

180 185 190

Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Vai Thr His Glu Gly Ser

195 200 205

Thr Vai Glu Lys Thr Vai Ala Pro Thr210 215

<210> 159<211> 176<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 159

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Vai

1 5Vai Gln Cys Gln Vai Gln Leu Vai20

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser

35 40Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Vai

Phe Leu Vai Ala Leu Leu Arg Gly

10 15Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gln25 30Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe45

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Vai Ala Thr lie Trp Phe Asp Gly Ser Asn Gly Tyr Tyr Ala65 70 75 80

Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Gly Ser Tyr Asp His Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai165 170 175

<210> 160<211> 222<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 160

Asp Gln Trp Asp lie Vai Met Thr

1 5Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie20

Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Cys35 40

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai

10 15Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu25 30Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro45Gly Gln

50Gly Vai65

Leu Lys

Met Gln

Glu lie

Ser Asp130Asn Asn145

Ala Leu

Lys Asp

Asp Tyr

Leu Ser210

Ser Pro Gln LeuPro Asplie Ser

Ala Leu100Lys Arg115

Glu Gln

Phe Tyr

Gln Ser

Ser Thr180Glu Lys195

Ser Pro

Arg Phe

70Arg Vai85

Gln Thr

Thr Vai

Leu Lys

Pro Arg150Gly Asn165

Tyr SerHis LysVai Thr

Leu lie55

Ser Gly

Glu Ala

Pro lie

Ala Ala120Ser Gly135

Glu Ala

Ser Gln

Leu Ser

Vai Tyr200Lys Ser215

Tyr Leu

Ser Gly

Glu Asp

90Thr Phe105

Pro Ser

Thr Ala

Lys Vai

Glu Ser170Ser Thr185

Ala CysPhe Asn

Gly Ser60

Ser Gly75

Vai Gly

Gly Gln

Vai Phe

Ser Vai140Gln Trp155

Vai Thr

Leu Thr

Glu Vai

Arg Gly220

Asn Arg Ala SerThr AspVai Tyr

Gly Thr110lie Phe125

Vai Cys

Lys Vai

Glu Gln

Leu Ser190Thr His205

Glu Cys

Phe Thr

80Tyr Cys95

Arg Vai

Pro Pro

Leu Leu

Asp Asn160Asp Ser175

Lys AlaGln Gly

<2Í0> 161

<211> 145

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 161

Cys Arg Leu Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala Ser15 10 15

Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr

20 25 30

Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

35 40 45

Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly. Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

50 55 60

Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met65 70 75 80

Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Gln Vai Asp lie Vai Ala Thr Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser130 135 140

Thr145

<210> 162

<211> 132

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 162

Vai Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu1 5 10 15Thr Cys Thr

Ser Trp IIe35

lie Tyr Tyr50

Vai Thr lie65

Ser Ser Vai

Asp lie Vai

Thr Leu Vai115

Pro Leu Ala130

Vai Ser20

Arg Gln

Ser Gly

Ser Vai

Thr Ala

85Ala Thr100

Thr VaiPro

Gly Gly

His Pro

Ser Thr

55Asp Thr70

Ala Asplie ProSer Ser

Ser lie Ser25

Gly Lys Gly40

Tyr Tyr Asn

Ser Lys Asn

Thr Ala Vai90

Leu lie Phe

105Ala Ser Thr120

Ser Gly

Leu Glu

Pro Ser

60Gln Phe75

Tyr TyrAsp TyrLys Gly

Gly Tyr

30Trp lie45

Leu Lys

Ser Leu

Cys Ala

Trp Gly110Pro Ser125

Tyr Trp

Gly Tyr

Ser Arg

Lys Leu

80Arg Vai95

Gln GlyVai Phe

<210> 163<211> 135<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 163

Glu Vai Leu Leu Vai Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Phe Trp Gly Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp lie Gly Ser lie Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Arg Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser 85 Ser Vai Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala Vai Tyr 95 Cys

Cys Ala Ser Ala Thr Thr Vai Thr Thr Ala Phe Asp lie Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai

115 120 125

Phe Pro 130 Leu Ala Pro Ser Ser 135

<210> 164<211> 216<212>'PRT

<213> Homo sapiens

<400> 164

Leu Gly Gln Ser Ala

1 5Gly Gln Ser lie Thr20

Arg Tyr Asn Tyr Vai35

Lys Leu Met IIe Tyr50

Arg Phe Ser Gly Ser65

Gly Leu Gln Ala Glu

Leu Thr Gln Pro Ala Ser10

lie Ser Cys Thr Gly Thr25

Ser Trp Tyr Gln Gln His40

Gly lie Ser lie Arg Pro55

Lys Ser Gly Asn Thr Ala70 75Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

Vai Ser Gly Ser Pro15

Ser Ser Asp vai Gly30

Pro Gly Gln Ala Pro45

Ser Gly Vai Ser Pro60

Ser Leu Thr lie Ser80

Cys Ser Ser His Thr<table>table see original document page 360</column></row><table>aacctcatgg ctggaagaaa a 21

<210> 169<211> 552<212> DNA<213> Homo sapiens

<400> 169

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ctccctcact gcccagctgg gatctcaggg 60tcaaccgcca tcctcgccct cctcctggct 120ctggtgcagt ctggagcaga ggtgaaaaag 180ggttctggat acaggtttac cagctactgg 240ggcctggagt ggatggggat catctatcct 300ttccaaggcc aggtcaccat ctcagccgac 360agcagcctga aggcctcgga caccgccatg 420tacgctatgg acgtctgggg ccaagggacc 480ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 540

552

<210> 170<211> 156<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 170

Met Gly Ser Thr Ala lie Leu Ala Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gln Gly

1 5 10 15

Vai Cys Ala Glu Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp lie Gly Trp Vai Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Met Gly lie 11 e Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser

65 70 75 80

Pro Ser Phe Gln Gly Gln Vai Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Vai Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140

Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155

<210> 171<211> 589<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 171

aaaaactttt tgagagtcctcttctcctgg tggcagctccccaggactgg tgaagccttcatcagtagtt actactggaggggtatgtct atttcagtggatatcagtag acacgtccaagacacggccg tgtattactggtctggggcc aagggaccac

ggacctcctg tgcaagaacacagatgggtc ctgtcccaggggagaccctg tccctcacctctggatccgg cagcccccaggagcaccaac tacaacccctgaaccagttc tccctgaagctgcgagagct acaagagactggtcaccgtc tcctcagcct

tgaaacatct gtggttcttc 60tgcagctgca ggagtcgggc 120gcactgtctc tggtggctcc 180ggaagggact ggagtggatt 240ccctcaagag tcgagtcacc 300tgagctctgt gaccgctgcg 360actactacta cggtatggac 420ccaccaaggg cccatcggtc 480ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 540gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtggg aactcagcg 589

<210> 172<211> 183<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 172

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp

15 10 15

Vai Leu Ser Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser lie

35 40 45

Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp lie Gly Tyr Vai Tyr Phe Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro65 70 75 80

Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Ala Thr Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai

165 170 175

Thr Vai Ser Trp Glu Leu Ser180

<210> 173<211> 679<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 173

cagctcctgg ggctcctgct actctggctc cgaggtgcca gatgtgacat ccagatgacc 60cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccggaca 120agtcatgaca ttagtaacta tttaaattgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag 180ctcctgatct atgctgcatc cagtttgcaa agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt 240agatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 300tactactgtc aacagactta cagtaccctc ttcactttcg gccctgggac caaagtggat 360atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 420aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 480gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 540caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac 600tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 660acaaagagct tcaacaggg 679

<210> 174

<211> 226

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 174

Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp1 5 10 15

lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp

20 25 30

Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser His Asp lie Ser Asn Tyr Leu

35 40 45

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

65 70 75 80

Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu

85 90 95

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Leu Phe Thr

100 105 110

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp lie Lys Arg Thr vai Ala Ala Pro

115 120 125

Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

145 150 155 160

Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

165 170 175

Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Thr I>eu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala

195 200 205

Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe

210 215 220

Asn Arg

225

<210> 175

<211> 156

<212> PRT

<213> Homo , sapiens

<400> 175

Met Gly Ser Thr Ala lie Leu Ala

1 5

Vai Cys Ala Glu Vai Gln Leu Vai

20

Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser

35 40

Thr Ser Tyr Trp lie Gly Trp Vai 50 55

Glu Trp Met Gly lie lie Tyr Pro

65 70

Pro Ser Phe Gln Gly Gln Vai Thr

85

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser

100

Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Asp Tyr

115 120

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai

130 135

Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser

145 150

Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gln Gly

10 15Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys25 30Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe45

Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu60

Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser

75 80lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser

90 95Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met105 110Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Vai Trp125

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro140

Ser Lys Ser Thr155

<210> 176<211> 226<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 176

Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp 1 5 10 15

lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly Asp

20 25 30

Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser His Asp lie Ser Asn Tyr Leu

35 40 45

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

65 70 75 80

Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu

85 90 95

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Leu Phe Thr

100 105 110

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro

115 120 125

Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

145 150 155 160

Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

165 170 175

Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala

195 200 205

Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser phe

210 215 220

Asn Arg

225

<210> 177<211> 183<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 177

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Vai Leu Ser Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser He

35 40 45

Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp lie Gly Tyr Vai Tyr Phe Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro

65 70 75 80

Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Ala Thr Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai

165 170 175

Thr Vai Ser Trp Glu Leu Ser180

Claims (27)

1. Anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação de antíge-no deste compreendendo um sítio de ligação de antígeno que liga-se especi-ficamente a uma proteína 161P2F10B (SEQ ID NO:4), em que o anticorpomonoclonal é H16-7.213, H16-9.69, H16-1.52, Hal6-I(l)23, Hal 6- 9.44, H16--1.67. , Hal6-1 (3,5)36, H16-1.86, Hal 6- 9.10, H16-9.33, H16-1.68, Hal 6--1(1)11, Hal 6- 1(3,5)18, Hal 6- 1(2,4)4, Hal6-1 (3,5)56, H16-1.93, H16-7.8,Hal 6-1(3,5)27.1, H16-1.61, H16-l(3,5)5, H16-7.200, Hal 6-1(3,5)42, H16--9.65, H16-1.29, j-i 16-3.4, H16-1.92, Hal 6-1(3,5)19, ou Hal6-1.80 como mos-trado nas Figuras 2 e 3.

2. Anticorpo ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo é um anticorpo totalmente humano.

3. Anticorpo ou fragmento de acordo com a reivindicação 1 ou 2,em que o fragmento é um fragmento Fab, F(ab')2, Fv ou SfV .

4. Anticorpo ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que o anticorpo ou fragmento é acoplado a um marcador detectável,uma toxina, um agente terapêutico, ou um agente quimioterapêutico .

5. Anticorpo ou fragmento de acordo com a reivindicação 4, emque o marcador detectável é um radioisótopo, um quelante de metal, umaenzima, um composto fluorescente, um composto bioluminescente ou umcomposto quimioluminescente.

6. Anticorpo ou fragmento de acordo com a reivindicação 5, emque o radioisótopo compreende 212Bi, 131l, 131ln, 90Y, 186Re, 211At, 1251, 188Re,153Sm, 213Bi, 32P, ou Lu.

7. Anticorpo ou fragmento de acordo com a reivindicação 4, emque a toxina compreende ricina, cadeia de ricina A, doxorrubicina, daunorru-bicina, um maitansinóide, taxol, brometo de etídio, mitomicina, etoposida,tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, diona de antracina de diidróxi,actinomicina, toxina da difteria, Exotoxina Pseudomonas (PE) A, PE40, abri-na, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa sarcina, gelonina, mito-gelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamici-na, inibidor de sapaonaria officinalis, glicocorticóide, auristatina, auromicina,ítrio, bismuto, combrestatina, duocarmicinas, dolostatina, ccl065, ou umacisplatina.

8. Hibridoma que produz o anticorpo monoclonal como definidona reivindicação 1.

9. Vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando um anticorpo como definido na reivindicação 1 , 2, ou 3.

10. Vetor de acordo com a reivindicação 9, que é uma cadeiaúnica compreendendo domínios variáveis de cadeias pesada e leve.

11. Composição farmacêutica que compreende anticorpo oufragmento de acordo com a reivindicação 1, em uma forma de dose única humana.

12. Ensaio para detectar a presença de uma proteína 161P2F10B em uma amostra biológica compreendendo contatar a amostracom um anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, e detectar a ligação de proteína 161P2F10B (SEQ ID NO:4) na amostra .

13. Método de inibir o crescimento de células que expressam 161P2F10B (SEQ ID NO:4) em um paciente, compreendendo: administrar ao referido paciente um vetor codificando um anticorpo monoclonal de cadeia simples que compreende um anticorpo como definido na reivindicação 1, 2 ou 3 que especificamente liga-se a uma proteína 161P2F10B (SEQ IDNO:4), de modo que o vetor libere a seqüência de codificação de anticorpomonoclonal de cadeia simples para as células de câncer e o anticorpo decadeia simples codificado seja expresso intracelularmente nelas.

14. Método de liberar um agente citotóxico ou um agente diagnóstico para uma célula que expressa uma proteína 161P2F10B (SEQ ID NO:4), compreendendo: fornecer um agente citotóxico ou um agente diagnóstico conjugado ao anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido nareivindicação 1, 2 ou 3, para formar um agente de anticorpo ou conjugado deagente de fragmento; e, expor a célula ao agente de anticorpo ou conjugadode agente de fragmento.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o agentecitotóxico ou agente diagnóstico é selecionado do grupo consistindo em ummarcador detectável, uma toxina, e um agente terapêutico.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o marca-dor detectável é um radioisótopo, um quelante de metal, uma enzima, umcomposto fluorescente, um composto bioluminescente ou um composto qui-mioluminescente.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o radioi-sótopo compreende 212Bi, 131l, 131ln, 90Y, 186Re, 211At, 125l, 188Re, 153Sm, 213Bi, 32P, ou Lu.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a toxinacompreende ricina, cadeia de ricina A, doxorrubicina, daunorubicina, ummaitansinóide, taxol, brometo de etídio, mitomicina, etoposida, tenoposida,vincristina, vinblastina, colquicina, diona de antracina de diidróxi, actinomici-na, toxina da difteria, Exotoxina Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadeiade abrina A, cadeia de modecina A, alfa sarcina, gelonina, mitogelina, rets-trictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inibidorde sapaonaria officinalis, glicocorticóide, auristatins, auromicina, ítrio, bismu-to, combrestatina, duocarmicinas, dolostatina, ccl065, ou uma cisplatina.

19. Método para detectar uma proteína 161P2F10B (SEQ IDNO:4) em uma amostra biológica , compreendendo as etapas de: forneci-mento da amostra biológica e uma amostra de controle; contatar a amostrabiológica e a amostra de controle com o anticorpo de anticorpo como defini-do na reivindicação 1, 2 ou 3 que especificamente liga-se à proteína161P2F10B; e determinar uma quantidade de um complexo da substânciacom a proteína 161P2F10B e o anticorpo presente na amostra biológica e aamostra de controle.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, também compre-endendo: tirar a amostra biológica e a amostra de controle de um pacienteque tem ou que é suspeito de ter câncer de próstata, pâncreas, bexiga, rim,cólon, pulmão, ovário, ou de mama.

21. Composição compreendendo 161P2F10B siRNA (RNA defilamento duplo) que corresponde ao ácido nucléico que codifica uma proteí-na mencionada na Figura 2 (SEQ ID NO:4) ou uma subseqüência desta, emque a subseqüência é de 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos de RNAcontíguos de comprimento e contém seqüências que são complementares enão-complementares a pelo menos uma porção da seqüência de codificaçãode mRNA.

22. Método para identificar uma molécula que modula a proliferação celular, que compreende:(a) introduzir uma molécula em um sistema, em que a moléculaé uma composição compreendendo 161P2F10B siRNA (RNA de filamento duplo) que corresponde ao ácido nucléico que codifica uma proteína mencionada na Figura 2 ou uma subseqüência desta, onde a subseqüência é de 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos de RNA contíguo de comprimentoe contém seqüências que são complementares e não-complementares apelo menos uma porção da seqüência de codificação de mRNA; e(b) determinar a presença ou ausência de uma interação entre amolécula e a seqüência de nucleotídeo ou proteína, pela qual a presença deuma interação entre a molécula e a seqüência de nucleotídeo identifica amolécula como uma molécula que modula a proliferação celular.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o sistema é in vivo.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o sistema é in vitro.

25. Método para reduzir o crescimento de tumor de câncer depróstata, pâncreas, bexiga, rins, cólon, pulmão, ovário, ou mama em um mamífero compreendendo tratar o mamífero com uma quantidade eficaz deuma combinação de um anticorpo monoclonal ou fragmento deste como de-finido na reivindicação 1, 2 ou 3 que especificamente liga-se a 161P2F10B(SEQ ID NO:4) e radiação.

26. Método para reduzir o crescimento de tumor de câncer de depróstata, pâncreas, bexiga, rins, cólon, pulmão, ovário, ou mama em ummamífero compreendendo tratar o mamífero com uma quantidade eficaz deuma combinação de um anticorpo monoclonal ou fragmento deste como de-finido na reivindicação 1, 2 ou 3 que especificamente liga-se a 161P2F10B(SEQ ID NO:4) e um agente quimioterapêutico.

27. Uso de um anticorpo monoclonal ou fragmento deste comodefinido na reivindicação 1, 2 ou 3 para a preparação de um medicamentopara o tratamento de câncer de próstata, pâncreas, bexiga, rins, cólon, pul-mão, ovário, ou mama, em que o anticorpo monoclonal ou fragmento deste éadministrado em combinação com radiação ou um agente quimioterapêutico.