ES2424745T3 - Anticuerpos y moléculas relacionadas que se unen a las proteínas 24P4C12 - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se uneespecificamente a una proteina 24P4C12 que comprende una secuencia de aminoácidos dela SEC ID N°:2, en el que el anticuerpo monoclonal comprende una región VH que consta dela SEC ID N°:123, desde el residuo 1 al124 y una región VL que consta de la SEC ID N°:124,desde el residuo 15 a122.

Description

Anticuerpos y moléculas relacionadas que se unen a las proteínas 2434&12.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La invención descrita en el presente documento se relaciona con anticuerpos, así como a fragmentos ligados de los mismos y a moléculas creadas a partir de los mismos, que unen proteinas, denominadas 24P4C12. Además, la invención también se refiere a procedimientos de diagnóstico, de pronóstico, profilácticos o terapéuticos y composiciones útiles en el tratamiento de cánceres que expresan 24P4C12.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] El cáncer es la segunda causa más importante de muerte en seres humanos por detrás de las enfermedades coronarias. En todo el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. Sólo en Estados Unidos, según informa la Sociedad Estadounidense contra el Cáncer, el cáncer causa anualmente la muerte de más de medio millón de personas, con más de 1,2 millones de nuevos casos diagnosticados cada año. Mientras que las muertes por enfermedades cardíacas han disminuido de forma significativa, las provocadas por el cáncer, en general, están en aumento. En la primera parte del próximo siglo, se prevé que el cáncer se convierta en la principal causa de muerte.
[0003] En todo el mundo, destacan varios cánceres como las principales causas de mortalidad. En concreto, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas, ovario y vejiga representan las principales causas de muerte por cáncer. Éstos, y casi todos los otros carcinomas, comparten una característica letal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica producida por un carcinoma resulta letal. Además, incluso para aquellos pacientes con cáncer que sobreviven inicialmente al cáncer primario, la experiencia común ha demostrado que sus vidas se ven alteradas de forma drástica. Muchos pacientes de cáncer experimentan ansiedad instensa provocada por el conocimiento de la posibilidad de recurrencia o de fracaso del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan debilitación física después del tratamiento. Además, muchos sufren una recidiva
[0004] A nivel mundial, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en los hombres. En Norteamérica y el norte de Europa, es el cáncer más común con diferencia en el sexo masculino y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres. Sólo en Estados Unidos, más de 30.000 varones mueren de esta enfermedad cada año, en la segunda causa sólo tras el cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, todavía no existe un tratamiento eficaz para el cáncer de próstata metastásico. La prostatectomía quirúrgica, radioterapia, terapia de ablación hormonal, castración quirúrgica y quimioterapia continúan siendo las principales modalidades del tratamiento. Desafortunadamente, estos tratamientos no son eficaces en muchos pacientes y a menudo se asocian a consecuencias no deseables.
[0005] Con respecto al diagnóstico, la falta de un marcador tumoral de próstata que pueda detectar con exactitud tumores localizados en una fase temprana sigue siendo una limitación significativa en el diagnóstico y el tratamiento de esta enfermedad. Aunque el ensayo del antígeno prostático específico (PSA, en inglés) en suero ha sido un instrumento muy útil, a pesar de su especificidad y utilidad general, se considera de forma extendida como insuficiente en varios aspectos importantes.
[0006] El progreso en la identificación de marcadores específicos adicionales para el cáncer de próstata ha mejorado gracias a la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes etapas de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos del LAPC (Los Angeles Prostate Cancer) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido al pase en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID, en inglés) y que han mostrado la capacidad de imitar la transición de dependencia del andrógeno a independencia del andrógeno (Klein et al., 1997, Nat. Med. 3:402). Los marcadores de cáncer de próstata identificados más recientemente incluyen antígeno tumoral de cáncer de próstata-1, conocido como PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
93: 7252), antígeno de membrana especifico de próstata (PSMA, en inglés) (Pinto et al., Clin Cancer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51), antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata (STEAP, en inglés) (Hubert, et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 1999 Dic 7; 96 (25): 14523-8) y antígeno de células madre de próstata (PSCA, en inglés) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 95: 1735).
[0007] Aunque los marcadores identificados previamente tales como PSA, PSMA, PCTA y 24P4C12 han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, existe la necesidad de identificar marcadores y dianas terapéuticas adicionales para la próstata y cánceres relacionados con el fin de seguir mejorando el diagnóstico y la terapia. Se estima que en el año 2000 se diagnosticaron 130.200 casos de cáncer colorrectal en los Estados Unidos, que incluían 93.800 casos de cáncer de colon y
36.400 casos de cáncer rectal.
[0008] El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común en hombres y mujeres. De 1992 a 1996, las tasas de incidencia disminuyeron de forma significativa (-2,1% al año). Los estudios sugieren que estas disminuciones se deben a un aumento en la detección y extirpación de pólipos, previniendo la evolución de los pólipos en cánceres invasivos. En el año 2000, hubo un número estimado de 56.300 muertes
(47.700 por cáncer de colon, 8.600 por cáncer rectal), lo que se traduce en aproximadamente el 11% de todas las muertes por cáncer en Estados Unidos.
[0009] En la actualidad, la cirugía es la forma más común de terapia para el cáncer colorrectal y para cánceres que no se han expandido, y a menudo es curativa. La quimioterapia, o la quimioterapia más radiación, se administra antes o después de la cirugía a la mayoría de pacientes con cáncer que haya perforado profundamente la pared intestinal o se haya extendido a los ganglios linfáticos. En ocasiones, se necesita una colostomía permanente (creación de una abertura abdominal para la eliminación de deshechos del cuerpo) para el cáncer de colon, que es necesaria pocas veces para el cáncer rectal. Continúa existiendo una necesidad de modalidades de diagnóstico y de tratamiento eficaces para el cáncer colorrectal.
[0010] De todos los nuevos casos de cáncer en Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente el 5 por ciento en los hombres (la quinta neoplasia más común) y el 3 por ciento en las mujeres (la octava neoplasia más común). La incidencia está aumentando lentamente, al mismo tiempo que aumenta la población de personas mayores. En 1998, se calcularon aproximadamente 54.500 casos, incluyendo 39.500 en hombres y 15.000 en mujeres. En Estados Unidos, la incidencia según la edad es 32 por cada 100.000 hombres y ocho por cada 100.000 mujeres. La relación hombre/mujer histórica de 3:1 puede estar disminuyendo en relación con los índices de tabaquismo en las mujeres. Hubo un cálculo estimado de 11.000 muertes de cáncer de vejiga en 1998 (7.800 en hombres y 3.900 en mujeres). La incidencia y mortalidad del cáncer de vejiga irán aumentando considerablemente con la edad y serán un problema a medida que la población envejezca.
[0011] La mayoría de los cánceres de vejiga reaparecen en la vejiga. El cáncer de vejiga se trata con una combinación de resección transuretral (RTU) de la vejiga y quimioterapia intravesical o inmunoterapia. La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga destaca las limitaciones de la RTU. La mayoría de cánceres músculo-invasivos no se curan por RTU exclusivamente. La cistectomía radical y la derivación urinaria son los medios más eficaces para eliminar el cáncer, pero conllevan un impacto innegable en la función urinaria y sexual. Continúa existiendo una necesidad significativa de modalidades de tratamiento que sean beneficiosas para los pacientes con cáncer de vejiga.
[0012] En el año 2000, se produjeron 164.100 nuevos casos estimados de cáncer de pulmón y de bronquios, representando el 14% de todos los diagnósticos de cáncer de Estados Unidos. La tasa de incidencia de cáncer de pulmón y de bronquios está disminuyendo significativamente en varones, de un máximo de 86,5 por cada 100.000 en 1984 a un 70,0 en 1996. En los 90’, la tasa de aumento entre las mujeres empezó a ralentizarse. En 1996, la tasa de incidencia en mujeres fue de 42,3 por cada 100.000.
[0013] En el año 2000, el cáncer de pulmón y de bronquios causó un número estimado de 156.900 muertes, lo que representa el 28% de todas las muertes por cáncer. De 1992 a 1996, la mortalidad del cáncer de pulmón disminuyó de forma significativa entre hombres (-1,7% al año), mientras que las tasas de las mujeres fueron aumentando significativamente (0,9% al año). Desde el año 1987, han muerto más mujeres cada año de cáncer de pulmón que de cáncer de mama, lo que durante más de 40 años fue la causa principal de muerte por cáncer en mujeres. Las tasas de incidencia y mortalidad en disminución del cáncer de pulmón se produjeron probablemente por el descenso de las tasas de tabaquismo durante los 30 años anteriores. Sin embargo los índices de tabaquismo en disminución entre mujeres se quedaron por debajo en comparación con los hombres. Es una cuestión preocupante que, a pesar de que la disminución del consumo de tabaco en adultos se ha ralentizado, el tabaquismo en los jóvenes esté aumentando de nuevo.
[0014] Las opciones de tratamiento para el cáncer de pulmón y de bronquios se determinan según el tipo y el estadio del cáncer e incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía es normalmente el tratamiento elegido. Debido a que la enfermedad normalmente se ha extendido en el momento en que se diagnostica, a menudo son necesarias la radioterapia y quimioterapia en combinación con la cirugía. La quimioterapia sola o combinada con la radiación es el tratamiento elegido para el cáncer de pulmón de células pequeñas; con este tratamiento, un gran porcentaje de pacientes experimenta remisión, que en algunos casos es de larga duración. Sin embargo, existe una necesidad constante de enfoques eficaces de tratamiento y diagnóstico para los cánceres de pulmón y de bronquios.
[0015] Durante el año 2000, se esperaba que se produjera una estimación de 182.800 nuevos casos invasivos de cáncer de mama entre las mujeres de Estados Unidos. De modo adicional, se esperaba diagnosticar aproximadamente 1.400 nuevos casos de cáncer de mama en varones en el año 2000. Después de aumentar aproximadamente un 4% al año en la década de los 80, las tasas de incidencia de cáncer de mama en mujeres se habían estabilizado en los 90 en aproximadamente 110,6 casos por cada
100.000.
[0016] Sólo en Estados Unidos, se estimaron 41.200 muertes (40.800 mujeres, 400 hombres) en el año 2000 a causa del cáncer de mama. El cáncer de mama está clasificado como la segunda causa de muerte por cáncer en mujeres. De acuerdo con los datos más recientes, las tasas de mortalidad disminuyeron significativamente entre 1992 y 1996, siendo la mayor disminución en las mujeres más jóvenes, tanto de raza blanca como de raza negra. Estas disminuciones probablemente fueron el resultado de una detección cada vez más temprana y de la mejora del tratamiento.
[0017] Considerando las circunstancias médicas y las preferencias del paciente, el tratamiento de cáncer de mama puede implicar lumpectomía (extirpación local del tumor) y eliminación de los ganglios linfáticos de debajo del brazo; mastectomía (extirpación quirúrgica de la mama) y eliminación de los ganglios linfáticos de debajo del brazo, radioterapia; quimioterapia; o terapia hormonal. Con frecuencia, se usan dos o más procedimientos combinados. Numerosos estudios han demostrado que, durante los estadios tempranos de la enfermedad, las tasas de supervivencia a largo plazo tras lumpectomía más radioterapia son similares a las tasas de supervivencia después de mastectomía radical modificada. Los avances significativos en las técnicas de reconstrucción proporcionan diversas opciones para la reconstrucción de la mama después de la mastectomía. Recientemente, dicha reconstrucción se realiza a la vez que la mastectomía.
[0018] La escisión local del carcinoma ductual in situ (CDIS) con cantidades adecuadas de tejido de la mama normal circundante puede prevenir la recidiva local del CDIS. La radiación a la mama y/o tamoxifeno pueden reducir la probabilidad de que tenga lugar un CDIS en el tejido de mama restante. Esto es importante porque el CDIS, si no se trata, puede transformarse en un cáncer de mama invasivo. No obstante, existen efectos secundarios o secuelas graves de estos tratamientos. Por tanto, existe una necesidad de tratamientos eficaces contra el cáncer de mama.
[0019] En el año 2000, se estimaron 23.100 nuevos casos de cáncer de ovario en Estados Unidos. Lo que representa el 4% de todos los cánceres en mujeres y está clasificado como el segundo entre los cánceres ginecológicos. Ente 1992 y 1996, las tasas de incidencia de cáncer de ovario disminuyeron significativamente. Como consecuencia del cáncer de ovario, se produjeron unas 14.000 muertes en el año 2000. El cáncer de ovario causa más muertes que cualquier otro cáncer del sistema reproductor femenino.
[0020] La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer de ovario. La cirugía normalmente incluye la extirpación de uno o ambos ovarios, las trompas de Falopio (salpingoooforectomía) y del útero (histerectomía). En algunos tumores en estadios muy tempranos, sólo se extirpará el ovario afectado, especialmente en mujeres jóvenes que desean tener hijos. En caso de enfermedad avanzada, se intenta extirpar toda la enfermedad intraabdominal para potenciar el efecto de la quimioterapia. Continúa existiendo una necesidad importante de opciones de tratamiento eficaces para el cáncer de ovarios.
[0021] En el año 2000, se estimó que se diagnosticaron 28.300 nuevos casos de cáncer de páncreas en los Estados Unidos. Durante los últimos 20 años, las tasas de cáncer de páncreas han disminuido en varones. Las tasas en mujeres se han mantenido aproximadamente constantes, pero puede que estén empezando a disminuir. En el año 2000, el cáncer de páncreas causó un número estimado de 28.200 muertes en Estados Unidos. Durante los últimos 20 años, ha habido una disminución ligera, pero significativa, en las tasas de mortalidad en varones (aproximadamente -0,9% al año), mientras que las tasas en mujeres se han incrementado levemente.
[0022] La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer de páncreas. Estas opciones de tratamiento pueden prolongar la supervivencia y/o aliviar síntomas en muchos pacientes, pero no es probable que produzcan la cura para la mayoría. Existe una necesidadsignificativa de opciones adicionales de terapia y de diagnóstico para los cánceres. Éstas incluyen el uso de anticuerpos, vacunas y moléculas pequeñas como modalidades de tratamiento. Adicionalmente, existe también una necesidad de utilizar estas modalidades como herramientas de investigación para diagnosticar, detectar, monitorizar e impulsar la última tecnología en todas las áreas de tratamiento y estudios sobre el cáncer.
[0023] La utilidad terapéutica de los anticuerpos monoclonales (mAb, en inglés) (G. Kohler y C. Milstein, Nature 256:495-497 (1975)) se está desarrollando. Los anticuerpos monoclonales se han aprobado como terapias en el trasplante, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad cardiovascular e inflamación. Los diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras. Dichas diferencias en las funciones se reflejan en estructuras tridimensionales perceptibles para los diversos isotipos de inmunoglobulina (P.M. Alzari et al, Annual Rev. Immunol., 6:555-580 (1988)). WO 2004/050828 describe anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen a la proteína diana 24P4C12 útil en el tratamiento de cánceres que expresan la 24P4C12 sin indicar una secuencia de un anticuerpo dirigido conta cualquier proteína 24P4C12 o sus características de unión. La proteína 24P4C12 se utiliza para obtener una respuesta inmune humoral o celular, mientras que se afirma que los anticuerpos reactivos con 24P4C12 son útiles en la inmunización activa o pasiva. WO 00/61746 se refiere a la 24P4C12 como una diana de diagnóstico y/o terapéutico para la próstata y otros cánceres, y a los anticuerpos de anti-24P4C12, para su uso en el tratamiento de dichos cánceres en los que los anticuerpos monoclonales no se especifican más.
[0024] Puesto que los ratones son útiles para la inmunización y reconocen la mayoría de los antígenos humanos como extraños, los anticuerpos monoclonales frente a dianas humanas con potencial terapéutico típicamente han sido de origen murino. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales murinos tienen desventajas inherentes en la terapéutica humana. Estos necesitan una administración más frecuente de dosis, puesto que los mAb tienen una vida media circulante más corta en humanos que los anticuerpos humanos. Desde un punto de vista más crítico, la administración repetida de anticuerpos murinos al sistema inmunológico humano produce la respuesta del sistema inmunológico humano que reconoce la proteína de ratón como extraña y que genera una respuesta de anticuerpo humano antiratón (HAMA, en inglés). Dicha respuesta de HAMA puede resultar en una reacción alérgica y en la rápida desobstrucción del anticuerpo murino del sistema, de este modo inutiliza el tratamiento por anticuerpos murino. Con el fin de evitar dichos efectos, se ha tratado de crear sistemas inmunológicos humanos en los ratones.
[0025] Los intentos iniciales buscaban crear ratones transgénicos capaces de responder a los antígenos con anticuerpos que tienen secuencias humanas (véase: Bruggemann et al, Proc. Nat’l. Acad. Sci. EE.UU. 86:6709-6713 (1989)), pero se limitaron por la cantidad de ADN que podía mantenerse de manera estable mediante loa vehículos de clonación disponibles. El uso de vectores de clonación de cromosomas artificiales de levadura (Yeast Artificial Chromosomes, YAC) ha abierto el paso a la introducción de amplios fragmentos de la línea germinal de locus de Ig humana en mamíferos transgénicos. Esencialmente, una mayoría de los genes de la región V, D y J organizados con el mismo espacio encontrada en el genoma humano y las regiones constantes humanas se introdujeron en los ratones usando los cromosomas artificiales de levadura. Una cepa de ratón transgénico se conoce como ratón XenoMouse® y está disponible comercialmente en Amgen Fremont, Inc. (Fremont CA).
BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0026] La invención proporciona anticuerpos así como fragmentos de unión de los mismos y moléculas creadas a partir de los mismos, que se unen a proteínas 24P4C12 y fragmentos de polipéptidos de las proteínas 24P4C12. La invención comprende anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y totalmente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable o agentes terapéuticos. En ciertos modos de realización, hay una condición de que la secuencia de ácidos nucleicos entera de la Figura 3 no sea codificada y/o la secuencia de aminoácidos entera de la Figura 2 no sea preparada. En algunos modos de realización, la secuencia de ácidos nucleicos entera de la Figura 2 está codificada y/o la secuencia de aminoácidos entera de la Figura 2 se prepara, ambos casos se presentan en forma de dosis unitaria humanas respectivamente.
[0027] Además, la invención también proporciona métodos para detectar la presencia y el estado de proteinas y polinucleótidos de 24P4C12 en diversas muestras biológicas, así como métodos para identificar células que expresan 24P4C12. Un modo de realización de esta invención proporciona métodos para monitorizar productos de gen 24P4C12 en un tejido o una muestra de hematología que tiene o de la que se sospecha que tiene algún tipo de desregulación del crecimiento como cáncer.
[0028] Además, la invención proporciona diversas composiciones y estrategias inmunogénicas o terapéuticas para tratar cánceres que expresan 24P4C12 como cánceres de tejidos enumerados en la Tabla I, incluyendo terapias dirigidas a inhibir la transcripción, traducción, procesamiento y función de 24P4C12, así como las vacunas de cáncer. En un aspecto, la invención proporciona composiciones y métodos que los comprenden, para tratar un cáncer que expresa 24P4C12 en un sujeto humano en los que la composición comprende un vehículo adecuado para uso humano y una dosis unitaria humana de uno o más de un agente que inhibe la producción o la función de 24P4C12. Preferentemente, el portador es exclusivamente un vehículo humano. En otro aspecto de la invención, el agente es una porción que es inmunoreactiva con la proteína 24P4C12. Los ejemplos sin carácter limitativo de dichas partes incluyen, sin carácter limitativo, anticuerpos (como anticuerpos de cadena sencilla, monoclonales, policlonales, humanizados, quiméricos o humanos), equivalentes funcionales de los mismos (ya sean de origen natural o sintéticos) y combinaciones de los mismos. Los anticuerpos pueden conjugarse en una porción terapéutica o de diagnóstico. En otro aspecto, el agente es una molécula pequeña tal y como se describe en el presente documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0029] Figura 1. Figura 1A. La secuencia de aminoácidos y ADN complementario (ADNc) de la variante 1 de 24P4C12 (también llamada “24P4C12 v.1” o “24P4C12 variante 1”) se muestra en la Figura 1A. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 44 al 2671, incluyendo el codón de terminación.
[0030] Figura 1B. La secuencia de aminoácidos y ADNc de la variante 2 de 24P4C12 (también llamada “24P4C12 v.2”) se muestra en la Figura 1B. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 44 al 2671, incluyendo el codón de terminación.
[0031] Figura 1D. La secuencia de aminoácidos y ADNc de la variante 3 de 24P4C12 (también llamada “24P4C12 v.3”) se muestra en la Figura 1C. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 44 al 2671, incluyendo el codón de terminación.
[0032] Figura 1D. La secuencia de aminoácidos y ADNc de la variante 4 de 24P4C12 (también llamada “24P4C12 v.4”) se muestra en la Figura 1D. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 44 al 2671, incluyendo el codón de terminación.
[0033] Figura 1E. La secuencia de aminoácidos y ADNc de la variante 5 de 24P4C12 (también llamada “24P4C12 v.5”) se muestra en la Figura 1E. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 44 al 2671, incluyendo el codón de terminación.
[0034] Figura 1F. La secuencia de aminoácidos y ADNc de la variante 6 de 24P4C12 (también llamada “24P4C12 v.6”) se muestra en la Figura 1F. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 84 al 2711, incluyendo el codón de terminación.
[0035] Figura 1G. La secuencia de aminoácidos y ADNc de la variante 7 de 24P4C12 (también llamada “24P4C12 v.7”) se muestra en la Figura 1G. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 276 al 2801, incluyendo el codón de terminación.
[0036] Figura 1H. La secuencia de aminoácidos y ADNc de la variante 8 de 24P4C12 (también llamada “24P4C12 v.8”) se muestra en la Figura 1H. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 6 al 2174, incluyendo el codón de terminación.
[0037] Figura 1I. La secuencia de aminoácidos y ADNc de la variante 9 de 24P4C12 (también llamada “24P4C12 v.9”) se muestra en la Figura 1I. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 6 al 2144, incluyendo el codón de terminación.
[0038] Figura 2. La secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de los anticuerpos 24P4C12. Figura 2A La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-1(5)1 VH (región variable de la cadena pesada). Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0039] Figura 2B La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-1(5)1 VL (región variable de la cadena ligera). Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. Una porción de la secuencia guía está doble subrayada.
[0040] Figura 2C La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-1(5)2.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0041] Figura 2D La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-1(5)2.1 VL. La secuencia guía está doble subrayada, y una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0042] Figura 2E La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-3(1,4)2.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0043] Figura 2F La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-3(1,4)2.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. Una porción de la secuencia guía está doble subrayada.
[0044] Figura 2G La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-3(1,4)7.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0045] Figura 2H La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-3(1,4)7.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. Una porción de la secuencia guía está doble subrayada.
[0046] Figura 2I La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-3(3,5)37.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0047] Figura 2J La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-3(3,5)37.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0048] Figura 2K La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-4(2,5)13.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0049] Figura 2L La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-4(2,5)13.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. Una porción de la secuencia guía está doble subrayada.
[0050] Figura 2M La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-4(2,5)34.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0051] Figura 2N La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-4(2,5)34.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0052] Figura 2O La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd4.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0053] Figura 2P La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd4.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0054] Figura 2Q La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd20.1.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0055] Figura 2R La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd20.1.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0056] Figura 2S La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be31.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0057] Figura 2T La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be31.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0058] Figura 2U La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd10.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0059] Figura 2V La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd10.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0060] Figura 2W La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7aced13.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0061] Figura 2X La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd13.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0062] Figura 2Y La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd19.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0063] Figura 2Z La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd19.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada
[0064] Figura 2AA La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be37.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0065] Figura 2AB La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be37.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0066] Figura 2AC La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd16.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0067] Figura 2AD La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd16.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0068] Figura 2AE La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd7.1.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0069] Figura 2AF La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd7.1.1 VL. La secuencia guía está doble subrayada, y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0070] Figura 2AG La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be20.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0071] Figura 2AH La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be20.1 VL. La secuencia guía está doble subrayada y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0072] Figura 2AI La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd5.1.1 VH. Una porción de la región constante pesada está subrayada.
[0073] Figura 2AJ La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd5.1.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0074] Figura 2AK La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be34.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0075] Figura 2AL La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be34.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0076] Figura 2AM La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd3.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0077] Figura 2AN La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be3.1 VL. El doble subrayado forma parte de la secuencia guía y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0078] Figura 2AO La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd2.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0079] Figura 2AP La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7acd2.1 VL. El doble subrayado forma parte de la secuencia guía y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0080] Figura 2AQ La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-8ac4.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0081] Figura 2AR La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-8ac4.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0082] Figura 2AS La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-4(2,5)31.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0083] Figura 2AT La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-4(2,5)31.1 VL. El doble subrayado forma parte de la secuencia guía y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0084] Figura2AU La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-11a1.1.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0085] Figura2AV La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-11a1.1.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada. La secuencia guía está doble subrayada.
[0086] Figura2AW La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-11b1.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0087] Figura2AX La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-11b1.1 VL. El doble subrayado forma parte de la secuencia guía y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0088] Figura2AY La secuencia de aminoácidos y ADNc de Ha5-7be7.1 VH. El doble subrayado forma parte de la secuencia guía y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0089] Figura 3. Las secuencias de aminoácidos de anticuerpos de 24P4C12. Figura 3A La secuencia de aminoácidos de Ha5-1(5)1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0090] Figura 3B La secuencia de aminoácidos de Ha5-1(5)1 VL. Una porción de la región constante de cadena ligera está subrayada.
[0091] Figura 3C La secuencia de aminoácidos de Ha5-1(5)2.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0092] Figura 3D La secuencia de aminoácidos de Ha5-1(5)2,1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0093] Figura 3E La secuencia de aminoácidos de Ha5-3(1,4)2.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0094] Figura 3F La secuencia de aminoácidos de Ha5-3(1,4)2.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0095] Figura 3G La secuencia de aminoácidos de Ha5-3(1,4)7.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0096] Figura 3H La secuencia de aminoácidos de Ha5-3(1,4)7.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0097] Figura 3I La secuencia de aminoácidos de Ha5-3(3,5)37.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0098] Figura 3J La secuencia de aminoácidos de Ha5-3(3,5)37.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0099] Figura 3K La secuencia de aminoácidos de Ha5-4(2,5)13.1 VH. Una porción de la región
constante de la cadena pesada está subrayada. [0100] Figura 3L La secuencia de aminoácidos de Ha5-4(2,5)13.1 VL. La región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0101] Figura 3M La secuencia de aminoácidos de Ha5-4(2,5)34.1 VH. Una porción de la región
constante de la cadena pesada está subrayada. [0102] Figura 3N La secuencia de aminoácidos de Ha5-4 (2,5) 34.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0103] Figura 3O La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd4.1 VH. Una porción de la región constante
de la cadena pesada está subrayada. [0104] Figura 3P La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd4.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0105] Figura 3Q La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd20.1.1 VL. Una porción de la región
constante de la cadena pesada está subrayada. [0106] Figura 3R La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd20.1.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0107] Figura 3S La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be31.1 VH. Una porción de la región constante
de la cadena pesada está subrayada. [0108] Figura 3T La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be31.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0109] Figura 3U La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd10.1 VH. Una porción de la región
constante de la cadena pesada está subrayada. [0110] Figura 3V La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd10.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0111] Figura 3W La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd13.1 VH. Una porción de la región
constante de la cadena pesada está subrayada. [0112] Figura 3X La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd13.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0113] Figura 3Y La secuencia de aminoácidos de Ha5-Zacd19.1 VH. Una porción de la región
constante de la cadena pesada está subrayada. [0114] Figura 3Z La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be19.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0115] Figura 3AA La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be37.1 VH.
[0116] Figura 3AB La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be37.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. [0117] Figura 3AC La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd16.1 VH. [0118] Figura 3AD La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd16.1 VL. Una porción de la región
constante de la cadena ligera está subrayada.
[0119] Figura 3AE La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd7.1.1 VH. La secuencia guía está doble subrayada. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. [0120] Figura 3AF La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd7.1.1 VL. La secuencia guía está doble
subrayada. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. [0121] Figura 3AG La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be20.1 VH. El doble subrayado forma parte
de la secuencia guía. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada.
[0122] Figura 3AH La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be20.1 VL. El doble subrayado forma parte de la secuencia guía. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. [0123] Figura 3AI La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd5.1.1 VH. El doble subrayado forma parte
de la secuencia guía, y una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0124] Figura 3AJ La secuencia de aminoácido sde Ha5-7acd5.1.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. [0125] Figura 3AK La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be34.1 VH. Una porción de la región
constante de la cadena pesada está subrayada.
[0126] Figura 3AL La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be34.1 VL. Una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. [0127] Figura 3AM La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd3.1 VH. La secuencia guía está doble
subrayada y una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0128] Figura 3AN La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd3.1 VL. El doble subrayado forma parte de la secuencia guía y una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada. [0129] Figura 3AO La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd2.1 VH. La secuencia guía está doble
subrayada y una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0130] Figura 3AP La secuencia de aminoácidos de Ha5-7acd2.1 VL. La parte subrayada forma parte de la secuencia guía, y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. [0131] Figura 3AQ La secuencia de aminoácidos de Ha5-8ac4.1 VH. La secuencia guía está doble
subrayada y una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0132] Figura 3AR La secuencia de aminoácidos de Ha5-8ac4.1 VL. La parte subrayada forma parte de la secuencia guía, y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. [0133] Figura 3AS La secuencia de aminoácidos de Ha5-4(2,5) 31.1 VH. La secuencia guía está doble
subrayada, y una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada.
[0134] Figura 3AT La secuencia de aminoácidos de Ha5-4(2,5)31.1 VL. El doble subrayado forma parte de la secuencia guía, y una porción de la cadena ligera está subrayada. [0135] Figura 3AU La secuencia de aminoácidos de Ha5-11a1.1.1 VH. El doble subrayado forma parte
de la secuencia guía, y una porción de la cadena pesada está subrayada.
[0136] Figura 3AV La secuencia de aminoácidos de Ha5-11a1.1 VH. Una porción de la región constante de la cadena pesada está subrayada. [0137] Figura 3AW La secuencia de aminoácidos de Ha5-11b1.1 VH. Una porción de la región
constante de la cadena pesada está subrayada.
[0138] Figura 3AX La secuencia de aminoácidos de Ha5-11b1.1 VL. El doble subrayado forma parte de la secuencia guía, y una porción de la región constante de la cadena ligera está subrayada. [0139] Figura 3AY La secuencia de aminoácidos de Ha5-7be7.1 VH. Una porción de la región constante
de la cadena ligera está subrayada.
[0140] Figura 4. Alineamiento de anticuerpos de 24P4C12 con la línea germinal de Ig humana. Figura 4A Alineamiento de Ha5-1(5)1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0141] Figura 4B Alineamiento de Ha5-1(5)1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0142] Figura 4C Alineamiento de Ha5-1(5)2.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0143] Figura 4D Alineamiento de Ha5-1(5)2.1 VL con la línea germinal de Ig humana.
[0144] Figura 4E Alineamiento de Ha5-3(1,4)2.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0145] Figura 4F Alineamiento de Ha5-3(1,4)2.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0146] Figura 4G Alineamiento de Ha5-3 (1,4)7.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0147] Figura 4H Alineamiento de Ha5-3(1,4)7.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0148] Figura 4I Alineamiento de Ha5-3(3,5)37.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0149] Figura 4J Alineamiento de Ha5-3(3,5)37.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0150] Figura 4K Alineamiento de Ha5-4(2,5)13.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0151] Figura 4L Alineamiento de Ha5-4(2,5)13.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0152] Figura 4M Alineamiento de Ha5-4(2,5)34.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0153] Figura 4N Alineamiento de Ha5-4(2,5)34.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0154] Figura 4O Alineamiento de Ha5-7acd4.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0155] Figura 4P Alineamiento de Ha5-7acd4.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0156] Figura 4Q Alineamiento de Ha5-7acd20.1.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0157] Figura 4R Alineamiento de Ha5-7acd20.1.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0158] Figura 4S Alineamiento de Ha5-7be31.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0159] Figura 4T Alineamiento de Ha5-7be31.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0160] Figura 4U Alineamiento de Ha5-7acd10.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0161] Figura 4V Alineamiento de Ha5-7acd10.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0162] Figura 4W Alineamiento de Ha5-7acd13.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0163] Figura 4X Alineamiento de Ha5-7acd13.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0164] Figura 4Y Alineamiento de Ha5-7acd19.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0165] Figura 4Z Alineamiento de Ha5-7acd19.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0166] Figura 4AA Alineamiento de Ha5-7be37.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0167] Figura 4AB Alineamiento de Ha5-7be37.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0168] Figura 4AC Alineamiento de Ha5-7acd16.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0169] Figura 4AD Alineamiento de Ha5-7acd16.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0170] Figura 4AE Alineamiento de Ha5-7acd7.1.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0171] Figura 4AF Alineamiento de Ha5-7acd7.1.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0172] Figura 4AG Alineamiento de Ha5-7be20.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0173] Figura 4AH Alineamiento de Ha5-7be20.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0174] Figura 4AI Alineamiento de Ha5-7acd5.1.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0175] Figura 4AJ Alineamiento de Ha5-7acd5.1.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0176] Figura 4AK Alineamiento de Ha5-7be34.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0177] Figura 4AL Alineamiento de Ha5-7be34.1 VL con la línea germinal de Ig humana.
[0178] Figura 4AM Alineamiento de Ha5-7acd3.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0179] Figura 4AN Alineamiento de Ha5-7acd3.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0180] Figura 4AO Alineamiento de Ha5-7acd2.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0181] Figura 4AP Alineamiento de Ha5-7acd2.1 VL con la línea germinal de Ig humana.
5 [0182] Figura 4AQ Alineamiento de Ha5-8acd4.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0183] Figura 4AR Alineamiento de Ha5-8acd4.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0184] Figura 4AS Alineamiento de Ha5-4(2,5)31.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0185] Figura 4AT Alineamiento de Ha5-4(2,5)31.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0186] Figura 4AU Alineamiento de Ha5-11a1.1.1 VH con la línea germinal de Ig humana.
10 [0187] Figura 4AV Alineamiento de Ha5-11a1.1.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0188] Figura 4AW Alineamiento de Ha5-11b1.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0189] Figura 4AX Alineamiento de Ha5-11b1.1 VL con la línea germinal de Ig humana. [0190] Figura 4AY Alineamiento de Ha5-7be7.1 VH con la línea germinal de Ig humana. [0191] Figura 5. Análisis de la expresión de 24P4C12 en tejidos normales y muestras de los pacientes.
15 Figura 5A. Expresión de 24P4C12 en muestras de pacientes que padecen cáncer de ovario. Figura 5B. Expresión de 24P4C12 en muestras de pacientes que padecen cáncer de mama. Figura 5C. Expresión de 24P4C12 en muestras de pacientes que padecen cáncer pancreático.
[0192] Figura 6. Tinción de la superficie de múltiples modelos de la línea celular cancerosa con
anticuerpos monoclonales de 24P4C12. Figura 6A, 6B, 6C. Las líneas celulares cancerosas PC3
20 24P4C12, LNCaP, 22RV1, OVCaR-5, HT29, Calu-1 y CF-PAC (~1 millón de células) representando múltiples indicaciones de cáncer, se incubaron con 10ug/ml del indicado MAb de 24P4C12 de un día para otro a 4ºC. Después de lavar, se incubaron las células con conjugado PE-Ab secundario de IgG anti-humano, se enjuagaron, se fijaron y fueron sujetas al análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (conocido por sus siglas en inglés, FACS). Se muestran histogramas de los perfiles de
25 tinción de las células incubadas con MAbs de 24P4C12 (histograma de línea verde abierto) superpuestas sobre células incubadas con Mab de control irrelevante (histograma de línea morada sólido). La intensidad fluorescente alta de los histogramas de MAb de 24P4C12 comparada con el control indica la unión específica de los MAb con la proteína 24P4C12 presente en la superficie de las células. Estos datos indican la expresión y el reconocimiento específico de la proteína 24P4C12 por los MAbs en las
30 líneas celulares derivadas de indicaciones cancerosas de próstata, ovario, colon, pulmón y páncreas.
[0193] Figura 7. Alineamiento de la secuencia de la proteína 24P4C12 a ortólogos de mono Cynomolgus Se presenta el alineamiento de aminoácidos de la proteína 24P4C12 humana a la secuencia de cynomolgus. Existe el 98,6% de identidad. Las diferencias de aminoácidos entre las especies están resaltadas en blanco (no conservadora) y verde (conservadoras). Las secuencias extracelulares están
35 subrayadas.
[0194] Figura 8. La superficie de unión de los MAb de 24P4C12 al ortólogo cynomolgus de la proteína 24P4C12 expresada en células Rat1. Las células Rat1. Las células Rat1 pasaron por una transducción de manera estable con retrovirus codificando el homólogo de cynomolgus de 24P4C12. Estas células se tiñeron con 10 ug/ml de los MAb indicados durante 2 horas a 4ºC. Las células se lavaron y después se 40 incubaron con anticuerpo secundario de IgG anti-hombre conjugado con PE, enjuagadas, fijadas y sujetas al análisis FACS. Se presentan histogramas de perfiles con tinción de células de 24P4C12 de cynomolgus de Rat1 incubadas con MAbs 24P4C12 (histograma de línea verde abierto) superpuesto sobre neo células de control. La intensidad fluorescente alta de los histogramas de la célula de 24P4C12 de cynomolgus de Rat1 comparada con el control de neo células indica un enlace específico de los
45 MAbs a la proteína 24P4C12 de cynomolgus presente en la superficie de las células.
[0195] Figura 9. Los anticuerpos de 24P4C12 median la destrucción de células PC3-24P4C12 a través de un conjugado de toxina de saporina-Ab secundario. Los anticuerpos contra 24P4C12 median la
destrucción dependiente de saporina en células PC3-24P4C12. Las células PC3-24P4C12 o PC3-Neo (500 células/pocillo) se cultivaron en una placa de 96 pocillos en el día 1. Al día siguiente, se añadió a cada pocillo un volumen igual de medio que contenía 2X de la concentración del anticuerpo primario indicado junto con un exceso del doble de anticuerpos policlonales anti-humanos (Hu-Sap) o anti-cabra (Gt-Sap) con toxina saporina (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA). Se dejaron incubar las células durante 5 días a 37 ºC. Al final del período de incubación, se añadió el reactivo Alamar Blue a cada pocillo y continuó la incubación durante 4 horas adicionales. La fluorescencia de cada pocillo se determinó en un lector de placas utilizando una longitud de onda de excitación de 530nm y una longitud de onda de emisión de 590nm. Los resultados muestran que los anticuerpos de 24P4C12 HA5-1(5)1.1, HAS-1(5)2.1 y HA5-acd16.1 mediaron citotoxicidad dependiente de saporina en células PC3 que expresan 24P4C12 pero no en las células PC3 infectadas por el gen Neoo sólo. Para demostrar aún más la especifidad, los mismos anticuerpos de 24P4C12 primarios se incubaron con un exceso doble de anticuerpo policlonal de cabra conjugado con saporina. Estos resultados indican que los fármacos o proteínas citotóxicas pueden ser selectivamente administrados a células que expresan 24P4C12 utilizando un MAb anti-24P4C12 apropiado.
[0196] Figura 10. Secuencia de aminoácidos y topología de la membrana de 24P4C12. Se muestran las topologías de membrana y las secuencias de aminoácidos de 24P4C12. Las proteínas 24P4C12 y variantes de las mismas muestran topologías predichas de 10 dominios de transmembrana con 5 asas extracelulares de las que la primera es la más grande. Se muestran los sitios de glucosilación extracelular de asparagina en morado y los residuos de cisteína extracelular potenciales que podrían verse envueltos en enlaces de disulfuro en verde. También se muestran aminoácidos cargados que residen en el dominio transmembrana. En azul se muestran aminoácidos básicos como arginina (N), Histidina (H) y Lisina (K) y en rojo se muestra el residuo ácido de ácido glutámico (E). No hay ácido aspártico (D) presente en los dominios transmembrana de ambas proteínas.
[0197] Figura 11. Secuencia de aminoácidos y topología de la membrana de CTL1. Se ha demostrado que CTL1 transporta colina de una manera independiente de Na+, sin embargo, debido a las diferencias en la topología de transmembrana, presencia y espacio de los anteriores aminoácidos cargados en 24P4C12 comparado con CTL1, es probable que 24P4C12 pueda mediar el transporte de macromoléculas o iones diferentes de la colina.
[0198] Figura 12. Concentraciones altas de K+ extracelular intervienen en un descenso en fluorescencia de diacetato de fluoresceína clorometilo (CMFDA, en inglés) en células 24P4C12 de riñón canino Madin-Darby (MDCK) indicativo de pH intracelular reducido. Figura 12A: La 24P4C12-MDCK polarizada confluente (cuadrados) y células neo-MDCK se cargaron durante 1 hora a 37 ºC con el tinte fluorescente diacetato de 5-clorometil fluoresceína (CMFDA) sensible al pH. La fluorescencia de CMFDA disminuye con el aumento de la concentración de H+ (disminuyendo el pH). Después de enjuagar, las células se incubaron en el tampón Krebs-hepes (NaCl 130mM, KCl 4,7mM, MgSO4 1,2mM, KH 2PO4 1,2mM, D-glucosa 11,7mM, CaCl2 1,3mM, HEPES 10mM, pH 7,4, cuadrados y triángulos negros) o en el tampón alto Krebs-hepes K+ en el que cambian las concentraciones de KCl y NaCl (KCl 130mM y NaCl 4,7mM, cuadrados y triángulos rojos). Después, la fluorescencia se midió en un lector de placas para fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 485nm y una longitud de onda de emisión de 530nm tomando lecturas a intervalos de 20 segundos. Figura 12B: La 24P4C12-MDCK polarizada confluente (triángulos rojos) y células neo-MDCK (cuadrados negros) se incubaron inicialmente en el tampón Krebs-hepes estándar y después se añadió (flecha) KCl concentrado para elevar la K+ extracelular a 100mM.
[0199] Figura 13. Acidificación de medio con propionato de Na+ interviene en la fluorescencia de CMFDA disminuida en células 24P4C12-MDCK indicadoras de pH intracelular disminuido. La 24P4C12MDCK polarizada confluente y las células nuevas se marcaron con CMFDA tal y como describe la Figura 12 y se colocaron en el tampón Krebs-hepes estándar. Se obtuvo la fluorescencia de valor inicial y después se añadieron 100uM de propionato de sodio a las células en el momento indicado (flecha) para acidificar el medio extracelular. Después, la fluorescencia continuó monitorizándose. Las células de 24P4C12-MDCK (triángulos rojos), pero no las células neo (cuadrados negros) mostraron una disminución marcada en la fluorescencia demostrando una disminución en el pH intracelular.
[0200] Figura 14. Tamponado e internalización por MAb de 24P4C12. Los MAb Ha5-7acd19, Ha5-7be37 y Ha5-3(1,4)7 se marcaron con tinte de fluorescencia Alexa Fluor 488 siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células PC3-24P4C12 se incubaron con los MAb marcados durante dos horas a 4ºC. Después del lavado, las células bien se mantuvieron a 4ºC o bien se llevaron a 37ºC durante 2 horas. Después, las células se fijaron y examinaron con microscopio de fluorescencia. En la Figura 14A se muestran imágenes de fluorescencia de las células incubadas con MAb y mantenidas a 4ºC que muestran la tinción de la superficie de la célula de la proteína 24P4C12. La Figura 14B muestra imágenes de fluorescencia de células teñidas con MAb e incubadas después a 37ºC durante 2 horas. Estas células presentan una pérdida de la tinción de la superficie de la célula en forma de anillo y la aparición de puntos brillantes y fluorescencia puntiforme que demuestra que la internalización y tamponado de la proteína 24P4C12 mediados por MAb.
[0201] Figura 15A-B. Detección de proteína 24P4C12 mediante inmunohistoquímica en muestras de paciente con cáncer de ovario o pancreático. El tejido se obtuvo de pacientes con carcinoma pancreático y carcinoma de ovario. Los resultados mostraron la expresión de la 24P4C12 en las células tumorales del tejido de los pacientes de cáncer.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Descripción de secciones
[0202]
I.) Definiciones II.) Polinucleótidos de 24P4C12
II.A.) Usos de polinucleótidos de 24P4C12 II.A.1.) Monitorización de anomalías genéticas II.A.2) Modos de realización antisentido II.A.3) Cebadores y pares de cebadores II.A.4) Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican 24P4C12 II.A.5) Sistemas de vector-huésped y moléculas de ácido nucleico recombinantes
III.) Proteínas relacionadas con 24P4C12 III.A.) Modos de realización de la proteína portadora del motivo III.B.) Expresión de proteínas relacionadas con 24P4C12 III.C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con 24P4C12 III.D.) Usos de proteínas relacionadas con 24P4C12
IV.) Anticuerpos de 24P4C12 V.) Respuestas inmune celulares a 24P4C12 VI.) Animales transgénicos con 24P4C12 VII.) Métodos para la detección de 24P4C12 VIII.) Métodos para controlar el estado de los genes relacionados con 24P4C12 y sus productos IX.) Identificación de moléculas que interactúan con 24P4C12 X.) Composiciones y métodos terapéuticos
X.A.) Vacunas contra el cáncer X.B.) 24P4C12 como diana para la terapia basada en anticuerpos X.C.) 24P4C12 como diana para respuestas inmunes celulares
X.C.1. Vacunas de minigenes
X.C.2.
Combinaciones de péptidos CTL con péptidos auxiliares
X.C.3.
Combinaciones de péptidos CTL con agentes cebadores de células T
X.C.4.
Composiciones de vacuna que comprenden DC pulsadas con péptidos HTL y/o
CTL
X.D.)
Inmunoterapia adoptiva
X.E.)
Administración de vacunas con fines terapéuticos o profilácticos
XI.)
Modos de realización de diagnóstico y de pronóstico de 24P4C12
XII.)
Inhibición de la función de la proteína 24P4C12
XII.A.)
Inhibición de 24P4C12 con anticuerpos intracelulares
XII.B.)
Inhibición de 24P4C12 con proteínas recombinantes
XII.C.) Inhibición de la transcripción o de la traducción de 24P4C12
XII.D.) Consideraciones generales para estrategias terapéuticas
XIII.)
Identificación, caracterización y uso de moduladores de 24P4C12
XIV.)
ARNi y uso terapéutico del ARN de interferencia pequeño (ARNip)
XV.)
KITS/Artículos manufacturados
I.)
Definiciones:
[0203] A no ser que se definan de otro modo, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos o terminología científica usados en el presente documento tendrán el significado entendido comúnmente por los expertos en la materia a la que pertenece la invención. En algunos casos, se definen en el presente documento términos con significados entendidos comúnmente para mayor claridad y/o para su referencia rápida, y la inclusión de dichas definiciones en el presente documento no debería interpretarse necesariamente como que representa una diferencia sustancial respecto a lo que se entiende generalmente en la técnica. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o mencionados en el presente documento se entienden bien y se emplean de forma común al emplear metodología convencional por aquellos expertos en la materia como, por ejemplo, los procedimientos de clonación molecular ampliamente utilizados que se describen en Dambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor LAboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Según proceda, los procedimientos que conllevan el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado se llevan a cabo, generalmente, de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se indique lo contrario.
[0204] Los términos “cáncer avanzado”, “cáncer localmente avanzado”, “enfermedad avanzada” y “enfermedad localmente avanzada” se refieren a cánceres que se han extendido a través de la cápsula de tejido relevante, y se pretende que incluyan la enfermedad en estadio C según el sistema de la Asociación Americana de Urología (AUA), la enfermedad en los estadios C1 – C2 según el sistema de Whitmore-Jewett y la enfermedad en los estadios T3 – T4 y N+ según el sistema de TNM (tumor, ganglio linfáctico, metástasis). En general, no se recomienda la cirugía para pacientes con cáncer localmente avanzado, y estos pacientes obtienen unos resultados sustancialmente menos favorables en comparación con pacientes que tienen cáncer clínicamente localizado (confinado a un órgano).
[0205] Para los fines del presente documento, “alterar el patrón de glucosilación nativo” se refiere a eliminar una o más fracciones de carbohidratos que se encuentran en la secuencia nativa de 24P4C12 (mediante eliminación del sitio de glucosilación subyacente o supresión de la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa de 24P4C12. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, lo que implica un cambio en la naturaleza y proporciones de las diversas fracciones de carbohidratos presentes.
[0206] El término “análogo” se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o que se corresponden con otra molécula (p.ej.: una proteína relacionada con 24P4C12). Por ejemplo, un análogo de una proteína 24P4C12 puede ser enlazado específicamente mediante un anticuerpo o célula T que se une específicamente a 24P4C12.
[0207] El término “anticuerpo” se utiliza en el sentido más amplio a no ser que se indique claramente lo contrario. Por tanto, un “anticuerpo” puede ser de origen natural o fabricado por el hombre, como los anticuerpos monoclonales producidos mediante tecnología del hibridoma convencional. Los anticuerpos anti-24P4C12 comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o una o más regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos. Como se utiliza en este documento, el término “anticuerpo” se refiere a cualquier forma de anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a 24P4C12 y/o muestra la actividad biológica deseada y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud máxima), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p.ej.: anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos siempre que específicamente se unan a 24P4C12 y/o muestren la actividad biológica deseada. Cualquier anticuerpo específico puede utilizarse en los métodos y composiciones proporcionadas en el presente documento. De este modo, en un modo de realización, el término “anticuerpo” abarca una molécula que comprende al menos una región variable de una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera y al menos una región variable de una molécula de cadena pesada que en combinación forma un sitio de unión específico para el antígeno diana. En un modo de realización, el anticuerpo en un anticuerpo de IgG. Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Los anticuerpos útiles en los presentes métodos y composiciones pueden generarse en el cultivo celular, en fago, o en varios animales, incluidos, pero no limitados a, vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés y simios. Por consiguiente, en un modo de realización, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de mamífero. Las técnicas de fago pueden usarse para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de avidez o especificidad alterada. Dichas técnicas son usuales y bien conocidas en este campo. En un modo de realización, el anticuerpo se produce por medios recombinantes conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo recombinante puede producirse transfectando una célula huésped con un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo. Uno o más vectores pueden utilizarse para transfectar la secuencia de ADN que exprese al menos una región VL o una VH en la célula huésped. Descripciones modelo de medios recombinantes de generación y producción de anticuerpos incluyen: Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shepard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, la edición más reciente). Un anticuerpo de la presente invención puede modificarse por medios recombinantes con el fin de lograr mayor eficacia del anticuerpo en la mediación de la función deseada. De este modo, entre los objetivos de esta invención se incluye que los anticuerpos puedan ser modificados por sustituciones usando medios recombinantes. Normalmente, las sustituciones serán sustituciones conservadoras. Por ejemplo, al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo puede cambiarse por un residuo diferente. Véase, p.ej.: Patente de EE.UU. Nº 5.624.821, Patente de EE.UU. Nº 6.194.551, Solicitud Nº WO 9958572; y Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). La modificación en aminoácidos incluye eliminaciones, adiciones y substituciones de aminoácidos. En algunos casos, dichos cambios se llevan a cabo para reducir actividades no deseadas, p.ej.: citotoxicidad dependiente de complementos. Frecuentemente, los anticuerpos se marcan uniéndose, bien de modo covalente o no covalente, a una sustancia que mantiene una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de técnicas de conjugación y marcas y se presentan extensivamente tanto en documentos científicos como en patentes. Estos anticuerpos pueden examinarse para unirse a 24P4C12 normal o defectiva. Véase p.ej.: ANTIBODY ENGINEERINGS: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996). Pueden identificarse los anticuerpos adecuados con las actividades biologicas deseadas mediante los siguientes ensayos in vivo entre los que se incluyen sin carácter limitativo: proliferación, migración, adhesión, crecimiento de agar blando, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señales, y los siguiente ensayos in vivo como la inhibición del crecimiento del tumor. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, pueden examinarse en busca de la capacidad para unirse al antígeno específico sin inhibir la actividad biológica o de /uniónal receptor del antígeno. Como anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos pueden resultar útiles en ensayos de enlaces competitivos. También pueden utilizarse para cuantificar la 24P4C12 o su receptor.
[0208] El término “porción de unión al antígeno” o “fragmento de anticuerpo” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo”), como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de 24P4C12 que tienen la capacidad de ligarse a un antígeno (p.ej.: 24P4C12 y variantes, Figura 1). Se ha demostrado que la función de enlace al antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos ligados comprendidos en el término “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo incluyen: (i) un Fab, un fragmento monovalente que consta de dominios VL, VH, CL (región constante de la cadena ligera) y CHl (región constante de la cadena pesada); (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR, en inglés). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite producirse como una cadena de proteínas única en la que las regiones VL y VH se juntan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase p.ej.: Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla están también destinados a incluirse en el término “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo. Dichos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la materia, y los fragmentos se examinan para su comprobar su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.
[0209] Tal y como se utiliza en el presente documento, cualquier forma del “antígeno” puede usarse para generar un anticuerpo que es específico para 24P4C12. De este modo, el antígeno obtenido puede ser un epítopo único, múltiples epítopos, o la proteína entera sola o en combinación con uno o más agentes realzadores de la inmunogenicidad conocidos en la materia. El antígeno obtenido puede ser una proteína de longitud completa aislada, una proteína de superficie celular (p.ej.: inmunización con células transfectadas con al menos una porción del antígeno) o una proteína soluble (p.ej.: inmunización con solo una porción de dominio extracelular de la proteína). El antígeno puede producirse en una célula modificada genéticamente. El ADN que codifica el antígeno puede ser genómico o no genómico (p.ej.: ADNc) y codifica al menos una porción del dominio extracelular. Como se utiliza en este documento, el término “porción” se refiere al número mínimo de aminoácidos o ácidos nucleicos, según corresponda, para constituir un epítopo inmugénico del antígeno de interés. Puede emplearse cualquier vector genético adecuado para la transformación de las células de interés, incluyendo, sin carácter limitativo, vectores adenovíricos, plásmidos, y vectores no víricos, como lípidos catiónicos. En un modo de realización, los anticuerpos de los métodos y composiciones del presente documento se unen específicamente a al menos una porción de un dominio extracelular de la 24P4C12 de interés.
[0210] Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos proporcionados en el presente documentos pueden conjugarse a un “agente bioactivo”. Como se utiliza en el documento, el término “agente bioactivo” hace referencia a cualquier compuesto de origen natural o sintético que enlaza el antígeno y/o mejora o facilita un efecto biológico deseado para realzar las toxinas que destruyen células.
[0211] En un modo de realización, los fragmentos de unión útiles en la presente invención son fragmentos activos biológicamente. Como se utilizan en el presente documento, el término “activo biológicamente” se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene capacidad de unir el epítopo antigénico deseado y directa o indirectamente ejercer un efecto biológico. Los efectos directos incluyen, sin carácter limitativo, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal de crecimiento, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal anti-apoptosis, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal de apoptosis o de necrosis, modulación, estimulación y /o inhibición de la cascada de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, en inglés), y modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de citotoxicidad dependiente de complemento CDC.
[0212] Los anticuerpos “biespecíficos” son también útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo biespecífico” se refiere a un anticuerpo, normalmente a un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión para al menos dos epítopos antigénicos diferentes. En un modo de realización, los epítopos son del mismo antígeno. En otro modo de realización, los epítopos son de dos antígenos diferentes. Se conocen procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden producirse de modo recombinante utilizando la coexpresión de dos pares de cadena ligera/cadena pesada de inmunoglobulina. Véase, p.ej.: Milstein et al., Nature 305:537-39 (1983). Como alternativa, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlaces químicos. Véase, p.ej., Brennan et al., Science 229:81 (1985). Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpo biespecífico. Véase, p.ej.: Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:6444-48 (1993), Gruber, et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).
[0213] Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando enlacen específicamente el antígeno diana y/o muestren la actividad biológica deseada (Patente de EE.UU. Nº 4.816.567; y Morrison et al.¸ Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81: 6851-6855 (1984)).
[0214] El término “agente quimioterapéutico” se refiere a todos los componentes químicos que son eficaces en la inhibición del crecimiento tumoral. Ejemplos no limitantivos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes; por ejemplo, mostazas de nitrógeno, compuestos de etilenimina y sulfonatos de alquilo; antimetabolitos; por ejemplo, antagonistas del ácido fólico, purina o pirimidina; inhibidores mitóticos; por ejemplo, alcaloide de vinca y derivados de podofilotoxina, antibióticos citotóxicos, compuestos que dañan y obstaculizan la expresión de ADN y antagonistas receptores del factor de crecimiento. Además, los agentes quimioterapéuticos incluyen agentes citotóxicos (como se definen en el presente documento), anticuerpos, moléculas biológicas y moléculas pequeñas.
[0215] El término “secuencias de codones optimizadas” hace referencia a secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para una especie huésped concreta reemplazando cualquier codón que tenga una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20%. Se denominan en el presente documento “secuencias de expresión mejoradas” a las secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para expresión en una especie huésped dada mediante la eliminación de secuencias de poliadenilación falsas, eliminación de señales de corte y empalme de exón/intrón, eliminación de repeticiones de tipo transposón y/u optimización del contenido de GC, además de la optimización de codones.
[0216] Una “biblioteca combinatoria” es una colección de diversos compuestos químicos generados bien por síntesis química o bien por síntesis biológica combinando un número de “componentes básicos” químicos como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal, como una biblioteca de polipéptidos (p.ej.: muteína), se forma mediante la combinación de un conjunto de componentes químicos llamados aminoácidos de cualquier forma posible a lo largo de una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto de polipéptido). Numerosos compuestos químicos se sintetizan mediante dicha mezcla combinatoria de componentes químicos (Gallop et al., J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251 (1994)).
[0217] La preparación y exploración de bibliotecas combinatorias se conocen bien por los expertos en la materia. Dichas bibliotecas químicas combinatorias incluyen, sin carácter limitativo, bibliotecas de péptidos (véase, p.ej.: Patente de EE.UU. Nº 5.010.175, Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991), Houghton et al., Nature, 354:84-88 (1991)), peptoides (Publicación PCT Nº WO 91/19735), péptidos codificados (Publicación PCT WO 93/20242), bio-oligómeros aleatorios (Publicación PCT WO 92/00091), benzodiacepinas (Patente de EE.UU. Nº 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con una estructura Beta-D-Glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánica análoga de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbarnatos (Cho et al., Science 261:1303 (1993)), y/o peptidil fosfonatos (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)). Véase, en general, Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385 (1994), bibliotecas de ácidos nucleicos (véase, p.ej.: Stratagene, Corp.), bibliotecas de ácidos nucleicos péptidicos (véase, p.ej.: Patente de EE.UU. 5.539.083), bilbiotecas de anticuerpos (Vaughn et al., Nature Biotechnology 14(3): 309-314 (1996), y WO97/00271), bibliotecas de carbohidratos (véase, p.ej.: Liang et al., Science 274.1520-1522 (1996) y Patente de EE.UU. Nº 5.593.853), y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véase, p.ej.: benzodiazepinas, Baum, C&EN, 18 de enero, pág. 33 (1993); isoprenoides, Patente de EE.UU. Nº 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente de EE.UU. Nº 5.549.974, pirrolidinas, Patente de EE.UU. Nº 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, Patente de EE.UU. Nº 5.506.337; benzodiazepinas, Patente de EE.UU. Nº 5.288.514; y similares).
[0218] Están disponibles en el mercado dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias (véase, p.ej.: 357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville, KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NIA). También se han desarrollado varios sistemas robóticos bien conocidos para los procesos químicos en fase de solución. Estos sistemas incluyen estaciones de trabajo automatizadas como el aparato de síntesis automatizado desarrollado por Takeda Chemical Industries, LTD: (Osaka, Japón) y muchos sistemas robóticos que utilizan brazos robóticos (Zymate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass., Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.), que imitan las operaciones sintéticas manuales realizadas por un químico. Cualquiera de los dispositivos anteriores es adecuado para su uso en la presente invención. La naturaleza y ejecución de modificaciones sobre estos dispositivos (si se producen) de manera que pueden actuar como se ha tratado en el presente documento resultarán evidentes para los expertos en la técnica relevante. Además, están disponibles numerosas bibliotecas combinatorias en el mercado (véase, p.ej.: ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscú, RU; Tripos, Inc., San Luis, MO; ChemStar, Ltd, Moscú, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciencies, Columbia, MD; etc.).
[0219] Como se utiliza en el presente documento, el término “sustitución conservativa” se refiere a sustituciones de aminoácidos conocidas por los expertos en la técnica y pueden llevarse a cabo generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Aquellos expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos sencillos en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, p.ej.: Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4ª Edición 1987)). Dichas sustituciones ejemplares se llevan a cabo preferentemente de acuerdo con aquella(s) incluidas en las Tablas III (a-b) descrita(s). Por ejemplo, tales cambios incluyen la sustitución de cualquier isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina
(T) y viceversa. También puede considerarse conservativas otras sustituciones, dependiendo del entorno del aminoácido particular y su función en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) pueden intercambiarse frecuentemente, del mismo modo que la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, puede intercambiarse frecuentemente con leucina y isoleucina, y algunas veces con valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en posiciones en las que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y la pK diferente de estos dos residuos aminoácidos no son significativos. Todavía pueden considerarse más cambios como “conservativos” en entornos particulares (véase, p.ej.: Tabla III (a) del presente documento; páginas 13-15 “Biochemistry” 2ª Ed. Lubert Stryer ed (Stanford University); Henikoff et al., PNAS 1992 Vol. 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 19 mayo 1995; 270(20):11882-6). Otras sustituciones tambien son admisibles y pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservativas conocidas.
[0220] El término “agente citotóxico” hace referencia a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de células, función de células y/o causa la destrucción de células. Se pretende que el término incluya isótopos radioactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas con actividad enzimática de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, sin carácter limitativo, auristatinas, auristatina E, auristatina F, auromicinas, maitansinoides, itrio, bismuto, ricina, cadena A de ricina, combrestatina, duocarmicinas, dolostatinas, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, cisplatino, cc1065, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi antracenodiona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas (PE), PE40, abrina, cadena A de la abrina, cadena A de la modeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, calicheamicina, inhibidor de Sapaonaria officinalis y gluocorticoide y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos tales como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 o 213, P32 e isótopos radioactivos de Lu incluido Lu177. Los anticuerpos también pueden conjugarse a una enzima activadora del profármaco contra el cáncer capaz de transformar el profármaco a su forma activa.
[0221] Como se utiliza en el presente documento, el término “diacuerpo” se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos puntos de unión del antígeno, los fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos puntos de unión al antígeno. Los diacuerpos están descritos de un modo más detallado en, p.ej.: EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:6444-48 (1993).
[0222] El “producto génico” se utiliza en el presente documento para indicar un péptido/proteína o ARNm. Por ejemplo, a veces un “producto génico de la invención” se denomina en el presente documento como una “secuencia de aminoácidos de cáncer”, “proteína de cáncer”, “proteína de un cáncer enumerado en la Tabla I”, un “ARNm de cáncer”, “ARNm de un cáncer incluido en la Tabla I”, etc. En un modo de realización, la proteína de cáncer está codificada por un ácido nucleico de la Figura 1. La proteína de cáncer puede ser un fragmento, o alternativamente, la proteína completa del fragmento codificado por ácidos nucleicos de la Figura 1. En un modo de realización, se utiliza una secuencia de aminoácidos de cáncer para determinar la identidad de secuencia o similitud de la secuencia. En otro modo de realización, las secuencias son variantes alélicas de origen natural de una proteína codificada por un ácido nucleico de la Figura 1. En otro modo de realización, las secuencias son variantes de secuencias como se describe con más detalle en el presente documento.
[0223] Los anticuerpos “heteroconjugados” son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo heteroconjugado” se refiere a dos anticuerpos unidos de modo covalente. Dichos anticuerpos pueden prepararse usando métodos conocidos en la química de proteína sintética, incluido el uso de agentes de entrecruzamiento. Véase, p.ej.: Patente de EE.UU. Nº4.676.980.
[0224] Los ensayos de “cribado (screening) de alto rendimiento” para la presencia, ausencia, cuantificación u otras propiedades de ácidos nucleicos o productos de proteína concretos son muy conocidos por aquellos expertos en la técnica. Del mismo modo, los ensayos de unión y ensayos de gen reportero también son muy conocidos. Por tanto, p.ej.: la Patente de EE.UU. Nº 5.559.410 revela procedimientos de cribado de alto rendimiento para proteínas; la Patente de EE.UU. Nº 5.585.639 divulga procedimientos de cribado de alto rendimiento para la unión de ácido nucleico (i.e. en matrices); mientras que las Patentes de EE.UU. Nº 5.576.220 y Nº 5.541.061 divulgan procedimientos de alto rendimiento de cribado para la unión ligando/anticuerpo.
[0225] Además, los sistemas de cribado de alto rendimiento están disponibles en el mercado (véanse, p.ej.: Amersham Bioscience, Piscataway, NJ; Zymark Corp.; Hopkinton, MA; Air Technical Industries, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA; etc.). Normalmente, estos sistemas automatizan procedimientos completos, que incluyen todo el pipeteado de muestras y reactivos, dispensación de líquidos, incubaciones controladas y lecturas finales de la microplaca en detector(es) apropiado(s) para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan alto rendimiento y arranque rápido, así como un alto grado de flexibilidad y personalización. Los fabricantes de tales sistemas presentan protocolos detallados para diversos sistemas de alto rendimiento. Por tanto, p.ej.: Zymark Corp. proporciona boletines técnicos que describen sistemas de cribado para detectar la modulación de la transcripción génica, unión a ligando y similares.
[0226] El término “homólogo” se refiere a una molécula que presenta homología con otra molécula, por ejemplo, presentando secuencias de residuos químicos que son iguales o similares en posiciones correspondientes.
[0227] En un modo de realización, el anticuerpo que se presenta en este documento es un “anticuerpo humano”. Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo en el que esencialmente las secuencias completas de las secuencias de la cadena pesada y de la cadena ligera, incluidas las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), provienen de genes humanos. En un modo de realización, los anticuerpos monoclonales humanos se preparan mediante la técnica de trioma, la técnica de célula B humanas (véase, p.ej.: Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983), la técnica de transformación con EBV (véase, p.ej.: Cole et al.¸Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77-96 (1985)) o usando una expresión en fago (véase, p.ej.: Marks et al.,
J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). En un modo de realización específico, el anticuerpo humano se genera en un ratón transgénico. En la materia se conocen técnicas para realizar dichos anticuerpos de modo parcial a completo y cualquiera de dichas técnicas puede utilizarse. Según un modo de realización preferente en particular, las secuencias de anticuerpos humanos completamente se realizan en un ratón transgénico modificado genéticamente para expresar genes de anticuerpos de cadena ligera y pesada humanos. Una buena descripción para preparar ratones transgénicos que produzcan anticuerpos humanos se encuentra en la Solicitud Nº WO 02/43478 y en la Patente de Estados Unidos 6.657.103 (Abgenix) y su progenie. Las células B de ratones transgénicos que producen el anticuerpo deseado pueden fusionarse entonces para hacer líneas celulares de hibridoma para la producción continua del anticuerpo. Véase, p.ej.: Patentes de EE.UU. núms. 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; y 5.545.806; y Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Grenn, et al., J. Exp. Med. 188:483-95 (1998).
[0228] “Antígeno leucocitario humano” o “HLA” es una proteína del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I o clase II (véase, p.ej.: Stites, et al.; Immunology, 8ª Ed., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)).
[0229] Como se utiliza en el presente texto, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (p.ej.: murinos) así como de anticuerpos humanos. Dichos anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Véanse p.ej.: Cabilly Patente de EE.UU. Nº 4.816.567; Queen et al. (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. EE.UU. 86:10029-10033; y Antibody Engineering: a Practical Approach (Oxford University Press 1996).
[0230] Los términos “hibridar”, “hibridación, “que hibrida” y similares, utilizados en el contexto de los polinucleótidos, se refieren a condiciones de hibridación convencionales, preferentemente tales como hibridación en 50% de formamida/6XSSC/0,1% de SDS/100 µg/ml de ADN monocatenario, en las que las temperaturas para hibridación son superiores a 37 ºC y las temperaturas de lavado en 0,1XSSC/0,1% de SDS son superiores a 55 ºC.
[0231] Los términos “aislado” o “biológicamente puro” se refieren al material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material cuando se encuentra en su estado original. De este modo, los péptidos aislados según la invención preferiblemente no contienen materiales asociados normalmente con los péptidos en su entorno in situ. Por ejemplo, se afirma que un polinucleótido está “aislado” cuando está sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que se corresponden o son complementarios a genes distintos de los genes 24P4C12 o que codifican polipéptidos distintos de los productos de genes 24P4C12 o fragmentos de los mismos. Un experto puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de ácido nucleico para obtener un polinucleótido de 24P4C12 aislado. Se afirma que una proteína está “aislada”, por ejemplo, cuando se emplean procedimientos físicos, mecánicos o químicos para eliminar las proteínas 24P4C12 de los componentes celulares que están normalmente asociados a la proteína. Un experto puede emplar de forma sencilla procedimientos de purificación estándar para obtener una proteína 24P4C12 aislada. Como alternativa, puede prepararse una proteína por medios químicos.
[0232] Las “marcas” apropiadas incluyen radionucleidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, fracciones de fluorescencia, fracciones de quimioluminiscencia, partículas magnéticas y similares. Patentes que enseñan el uso de dichas marcas incluyen las Patentes núms. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350, 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. Además, los anticuerpos proporcionados en este documento pueden ser útiles como el componente de unión al antígeno de fluorocuerpos. Véase p.ej.: Zeytun et al.; Nat. Biotechnol. 21:1473-79 (2003).
[0233] El término “mamífero” se refiere a cualquier organismo clasificado como mamífero, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y seres humanos. En un modo de realización de la invención, el mamífero es un ratón. En otro modo de realización de la invención, el mamífero es un ser humano.
[0234] Los términos “cáncer metastásico” y “enfermedad metastásica” se refieren a cánceres que se han extendido a los ganglios linfáticos regionales o a sitios distantes, y se pretende que incluyan la enferemdad en estadio D según el sistema AUA y el estadio TxNxM+ según el sistema TNM.
[0235] El término “modulador” o “compuesto de prueba” o “candidato a fármaco” o equivalentes gramaticales como se usan en el presente documento describen cualquier molécula, por ejemplo, proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, etc., a probar para detectar su capacidad de alterar directa o indirectamente el fenotipo o la expresión de una secuencia cancerosa, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico o proteínas, o los efectos de las secuencias cancerosas (p.ej.: señalización, expresión génica, interacción de las proteínas, etc.). En un aspecto, un modulador neutralizará el efecto de una proteína cancerosa de la invención. Por “neutralizar” se indica que una actividad de una proteína se inhibe o bloquea, junto con el consiguiente efecto en la célula. En otro aspecto, un modulador neutralizará el efecto de un gen, y de la proteína correspondiente, de la invención mediante la normalización de los niveles de dicha proteína. En modos de realización preferentes, los moduladores alteran los perfiles de expresión, o las proteínas o ácidos nucleicos de perfiles de expresión proporcionados en el presente documento, o las vías efectoras corriente abajo. En un modo de realización, el modulador suprime un fenotipo de cáncer, p.ej., a una huella de tejido normal. En otro modo de realización, el modulador induce un fenotipo de cáncer. En general, se ejecuta una pluralidad de mezclas de ensayos en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a varias concentraciones. Normalmente, una de estas concentraciones sirve de control negativo, es decir, a concentración cero o por debajo del nivel de detección.
[0236] Los moduladores, candidatos a fármaco o compuestos de prueba engloban numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular superior a 100 e inferior a aproximadamente 2.500 Daltons. Las moléculas pequeñas preferentes son inferiores a 2.000, o inferiores a 1.500 o inferiores a 1.000 o inferiores a 500Da. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlace de hidrógeno, y normalmente incluyen al menos un grupo de amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos suelen comprender estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas por uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los moduladores también comprenden biomoléculas como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. En especial, se prefieren los péptidos. Una clase de moduladores son los péptidos de, por ejemplo, unos 5 a aproximadamente 35 aminoácidos, y se prefieren los de aproximadamente cinco a aproximadamente 20 aminoácidos y prefiriéndose en particular de aproximadamente 7 a aproximadamente 15. Preferentemente, la proteína moduladora de cáncer es soluble, incluye una región no transmembrana y/o tiene una Cys del extremo N-terminal para ayudar en la solubilidad. En un modo de realización, el extremo C-terminal del fragmento se mantiene como un ácido libre y el extremo N-terminal es una amina libre para ayudar al enlace, es decir, a la cisteína. En un modo de realización, una proteína de cáncer de la invención está conjugada a un agente inmunogénico como se trata en el presente documento. En un modo de realización, la proteína de cáncer se conjuga a BSA. Los péptidos de la invención, por ejemplo, de longitudes preferentes, pueden enlazarse unos a otros o a otros aminoácidos para crear un péptido/proteína más largo. Los péptidos moduladores pueden ser digestivos de proteínas de origen natural como se ha explicado anteriormente, péptidos aleatorios o péptidos aleatorios “sesgados”. En un modo de realización preferente, los moduladores basados en péptidos/proteínas son anticuerpos y fragmentos de los mismos, como se define en el presente documento.
[0237] Los moduladores de cáncer también pueden ser ácidos nucleicos. Los agentes moduladores de ácidos nucleicos pueden ser ácidos nucleicos de origen natural, ácidos nucleicos aleatorios o ácidos nucleicos aleatorios “sesgados”. Por ejemplo, pueden usarse digestivos de genomas procarióticos o eucarioóticos en un enfoque análogo al explicado anteriormente para las proteínas.
[0238] El término “anticuerpo monoclonal”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un epítopo antigénico sencillo. Por el contrario, las preparaciones de anticuerpo (policlonal) convencionales incluyen típicamente una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epítopos. En un modo de realización, el anticuerpo policlonal contiene una pluralidad de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades, afinidades o avidez de epítopo en un antígeno sencilo que contiene múltiples epítopos antigénicos. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo cuando se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como una producción requerida del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se emplean según la presente invención pueden realizarse mediante el procedimiento de hibridoma que fue descrito primero por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), o puede realizarse por métodos de ADN recombinante (véase, p.ej.: Patente de EE.UU. Nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse desde las bibliotecas de anticuerpos en fago usando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991). Estos anticuerpos monoclonales se unirán normalmente con al menos un Kd de aproximadamente 1µM, más normalmente al menos aproximadamente 300nM, típicamente al menos aproximadamente 30nM, preferiblemente al menos aproximadamente 10nM, más preferiblemente al menos aproximadamente 3nM o mejor, normalmente determinados por ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA, en inglés).
[0239] Un “motivo”, como en un motivo biológico de una proteína relacionada con 24P4C12, se refiere a cualquier patrón de aminoácidos que forma parte de la secuencia primaria de una proteína, que está asociada a una función particular (por ejemplo, interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, etc.) o modificación (p.ej.: que es fosforilada, glucosilada o amidada), o localización (p.ej.: secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que se relaciona con ser inmunogénica, de forma humoral o celular. Un motivo puede ser contiguo o capaz de ser alineado a ciertas posiciones que generalmente son correlativas con una función o propiedad determinada. En el contexto de los motivos HLA, “motivo” se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, normalmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo HLA de clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo HLA de clase II, que es reconocido por una molécula de HLA concreta. Los motivos peptídicos para la unión a HLA son normalmente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo HLA humano y difieren en el patrón de los residuos de anclaje primarios y secundarios. Frecuentemente, los motivos concurrentes se incluyen en la Tabla V.
[0240] Un “excipiente farmacéutico” comprende un material tal como un adyuvante, un vehículo, agentes reguladores de pH y de tamponado, agentes reguladores de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares.
[0241] “Farmacéuticamente aceptable” se refiere a no tóxico, inerte y/o a una composición que es fisiológicamente compatible con seres humanos u otros mamíferos.
[0242] El término “polinucleótido” hace referencia a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, ribonucleótidos o desoxinucleótidos, o a una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y se pretende que incluya formas monocatenarias y bicatenarias de ADN y/o ARN. En la técnica, este término se utiliza a menudo de forma intercambiable con “oligonucleótido”. Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento en la que la timidina (T), como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1, puede ser también uracilo (U); esta definición se refiere a las diferencias entre las estructuras químicas de ADN y ARN, en concreto a la observación de que una de las cuatro bases principales en el ARN es uracilo (U) en lugar de timidina (T).
[0243] El término “polipéptido” hace referencia a un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. A lo largo de la memoria descriptiva, se usan denominaciones convencionales de tres letras o de una sola letra para los aminoácidos. En la técnica, este término se utiliza con frecuencia de modo intercambiable con “péptido” o “proteína”.
[0244] Un “residuo de anclaje primario” de HLA es un aminoácido en una posición específica a lo largo de la secuencia de péptidos que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de HLA. De uno a tres, normalmente dos, residuos de anclaje primarios en un péptido de longitud definida generalmente definen un “motivo” para un péptido inmunogénico. Se entiende que estos residuos encajan en estrecho de contacto con el surco de unión al péptido de una molécula de HLA, con sus cadenas laterales alojadas en bolsillos específicos del surco de unión. En un modo de realización, por ejemplo, los residuos de anclaje primarios para una molécula de HLA de clase I se localizan en la posición 2 (desde la posición amino-terminal) y en la posición carboxilio-terminal de un epítopo peptídico de 8, 9, 10, 11 o 12 residuos según la invención. Como alternativa, en otro modo de realización, los residuos de anclaje primarios de un péptido que se unen a una molécula de HLA de clase II están espaciados unos con respecto al otro, en lugar de en relación con el extremo terminal de un péptido, siendo el péptido, generalmente, de al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones de anclaje primarias para cada motivo y supermotivo se muestran en la Tabla IV(a). Por ejemplo, pueden crearse péptidos análogos alterando la presencia o ausencia de residuos particulares en las posiciones de anclaje primarias y/o secundarias que se muestran en la Tabla IV. Dichos análogos se usan para modular la afinidad de unión y/o cobertura de la población de un péptido que comprende un motivo o supermotivo de HLA concreto.
[0245] Los “radioisótopos” incluyen, sin carácter limitativo, los siguientes (también se exponen usos de ejemplos no limitativos en la Tabla IV (I)).
[0246] Con “aleatorio” o equivalentes gramaticales como se aplican en el presente documento a ácidos nucleicos y proteínas se hace referencia a que cada ácido nucleico y péptido consta esencialmente de aminoácidos y nucleótidos aleatorios, respectivamente. Estos péptidos aleatorios (o ácidos nucleicos, analizados en el documento) pueden incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El proceso sintético puede diseñarse para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorios, para permitir la formación de todas o la mayoría de las combinaciones posibles a lo largo de la longitud de la secuencia, formando de ese modo una biblioteca de agentes proteínicos bioactivos candidatos aleatorios.
[0247] En un modo de realización, una biblioteca está “completamente aleatorizada”, sin preferencias ni constantes de secuencia en ninguna posición. En otro modo de realización, la biblioteca es una biblioteca “aleatoria sesgada”. Es decir, algunas posiciones en la secuencia se mantienen constantes, o se seleccionan de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos o nucleótidos se asignan de forma aleatoria en una clase definida, p.ej.: de aminoácidos hidrofóbicos, residuos hidrófilos, residuos sesgados estéricamente (pequeños o grandes), hacia la creación de dominios de unión al ácido nucleico, la creación de cisteínas, para enlace cruzado, prolinas para dominios SH-3·, serinas, treoninas, tirosinas o histidianas para sitios de fosforilación, etc., o a purinas, etc.
[0248] Una molécula de ADN o ARN “recombinante” es una molécula de ADN o ARN que ha sido sometida a manipulación molecular in vitro.
[0249] Como se utiliza en el presente texto, el término anticuerpo “Fv de cadena sencilla” o “scFv” o “de cadena sencilla” se refiere a los fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido sencilla. En general, el polipéptido Fv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que posibilita que el sFV forme la estructura deseada para un enlace al antígeno. Para repasar sFv, véase, Pluckthun, The Pharmology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenbourg y Moore, ed. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).
[0250] Los ejemplos no limitativos de “moléculas pequeñas” incluyen compuestos que se enlazan o interaccionan con 24P4C12, ligandos que incluyen hormonas, neuropéptidos, quimiocinas, odorantes, fosfolípidos, aminoácidos, poliaminas, carbohidratos, esteroides, minerales, vitaminas, ácidos grasos, nucleótidos, alcoholes y equivalentes funcionales o derivados de los mismos que se unen y preferiblemente inhiben la función de la proteína 24P4C12. Dichas moléculas pequeñas no limitativas tienen preferentemente un peso molecular inferior a aproximadamente 10 kDa, más preferiblemente inferior a aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5 o aproximadamente 4 kDa. En ciertos modos de realización, las moléculas pequeñas se asocian físicamente con o se unen a la proteína 24P4C12; no se encuentran en secuencias metabólicas de origen natural; y/o son más solubles en soluciones acuosas que en las soluciones no acuosas.
[0251] Como se utiliza en el presente documento, el término “específico” se refiere a un enlace selectivo del anticuerpo al epítopo de antígeno diana. Los anticuerpos pueden examinarse para detectar la especificidad del enlace comparando el enlace al antígeno apropiado con el enlace al antígeno irrelevante o a la mezcla de antígeno en unas condiciones dadas. Si el anticuerpo se une al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7 o preferiblemente 10 veces más que al antígeno irrelevante o a la mezcla de antígeno entonces se considera específico. En otro modo de realización, un anticuerpo específico es uno que se une al antígeno 24P4C12 humano pero no se une a un antígeno de 24P4C12 no humano con un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mejor homología de aminoácidos con el antígeno de 24P4C12. En otro modo de realización, un anticuerpo específico es uno que se une a antígenos de 24P4C12 humanos y que se une a antígenos de 24P4C12 murinos, pero con un grado más alto de unir antígenos humanos. En otro modo de realización, un anticuerpo específico es uno que se une al antígeno de 24P4C12 humano y que se une al antígeno de 24P4C12 de primate, pero con un mayor grado de unión a antígenos humanos. En otro modo de realización, el anticuerpo específico se une al antígeno de 24P4C12 humano y cualquier antígeno de 24P4C12 no humano, pero con un mayor grado de unión al antígeno humano o cualquier otra combinación de los mismos.
[0252] Un experto en la materia puede determinar fácilmente la “astringencia” de las reacciones de hibridación, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración salina. En general, las sondas más largas requieren temperaturas superiores para el correcto anillamiento, mientras que las sondas más cortas exigen temperaturas más bajas. Generalmente, la hibridación depende de la capacidad de las secuencias de ácidos nucleicos desnaturalizadas para reanillarse cuando se encuentran presentes cadenas complementarias en un ambiente con temperaturas por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto más alto es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta es la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas más bajas lo harían menos. Para obtener detalles adicionales y una explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al.¸ Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
[0253] “Condiciones astringentes” o “condiciones de alta astringencia”, como se definen en el presente documento, se identifican, sin carácter limitativo, mediante aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, 0,0015 M cloruro de sodio/0,0015 M citrato de sodio/ sulfato de sodio y dodecilo 0,1% a 50 ºC; (2) emplean durante la hidridación un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con 0,1% albúmina de suero bovino/ 0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/ 50mM de solución tampón de fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM citrato de sodio a 42 ºC; o (3) emplean 50% formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sodio, 5 x solución Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), 0,1% SDS, y 10% sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% formamida a 55 ºC, seguido de un lavado de alta astringencia que consta de 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 ºC. Las “condiciones moderadamente astringentes” se describen como, sin carácter limitativo, aquellas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (p.ej.: temperatura, fuerza iónica y % SDS) menos astringentes que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes consiste en la incubación durante toda la noche a 65 ºC en una solución que comprende: 1% de seroalbúmina bovina, 0,5M fosfato de sodio (pH 7,5), 1,25mM EDTA y 7% SDS 5 x SSX (150mM NaCl, 15mM citrato de trisodio), seguido de lavado de los filtros en 2 x SSC/1% SDS a 50 ºC y 0,2 x SSC/0,1% SDS a 50 ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para ajustar factores tales como longitud de sonda y similares.
[0254] Un “supermotivo” de HLA es una especificidad de unión al péptido compartida por moléculas de HLA codificadas por dos o más alelos HLA. Las frecuencias fenotípicas globales de los supertipos de HLA en diferentes poblaciones étnicas se exponen en la Tabla IV (f). Los componentes no limitativos de diversos supertipos son los siguientes:
A2: As*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A* 0205, A*0206, A*6802, A*6901, A*0207
A3: A3, A11, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A*1101, A*3101
B7: B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602
B44: B*3701, B*4402, B*4403, B*60 (B*4001), B61 (B*4006)
A1: A*0102, A*2604, A*3601, A*4301, A*8001
A24: A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003
B27: B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801-02, B*3901, B*3902, B*3903-04, B*4801-02, B*7301, B*2701-08
B58: B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58
B62: B*4601, B52, B*1501 (B62), B*1502 (B75), B*1513 (B77) En la Tabla IV (g) se expone la cobertura de población calculada permitida por las diferentes combinaciones de supertipos de HLA.
[0255] Según se usa en el presente documento, “tratar” o “terapéutico” y términos gramaticalmente relacionados hacen referencia a cualquier mejora de cualquier consecuencia de la enfermedad, como prolongación de la supervivencia, menos morbilidad y/o una disminución de los efectos secundarios que son los subproductos de una modalidad terapéutica alternativa; como se aprecia fácilmente en la materia, se prefiere la erradicación completa de la enfermedad, no obstante no es un requisito para el tratamiento.
[0256] Un “animal transgénico” (p.ej.: un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, que fue introducido en el animal o en un antepasado del animal en la etapa prenatal, por ejemplo, embrionaria. Un “transgén” es ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico.
[0257] De acuerdo con su uso en el presente documento, una “vacuna” de respuesta inmune celular o de HLA es una composición que contiene o codifica uno o más péptidos descritos en la invención. Existen numerosos modos de realización de dichas vacunas, como un cóctel de uno o más péptidos individuales; uno o más péptidos de la invención comprendidos por un péptido poliepitópico; o ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos o polipéptidos individuales, p. ej., un minigén que codifica un péptido poliepitópico. La expresión “uno o más péptidos” puede incluir cualquier unidad entera de 1 a 150 o más,
p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150, o más péptidos descritos en la invención. Los péptidos o polipéptidos pueden opcionalmente modificarse, por ejemplo, mediante lipidación, adición de secuencias diana u otras secuencias. Los péptidos de HLA de clase I de la invención pueden mezclarse o ligarse a péptidos de HLA de clase II para facilitar la activación tanto de linfocitos T citotóxicos como de linfocitos T auxiliares. Las vacunas de HLA también pueden comprender antígeno pulsado con péptido que presenta células, p. ej., células dendríticas.
[0258] El término “variante” se refiere a una molécula que exhibe una variación de un tipo o norma descrito, como una proteína que tiene uno o más residuos de aminoácidos diferentes en la posición o posiciones correspondientes de una proteína descrita de forma específica (p.ej.: la proteína 24P4C12 que se muestra en la Figura 1). Un análogo es un ejemplo de una proteína variante. Las isoformas de corte y los polimorfismos de un solo nucleótido (PSN) son ejemplos adicionales de variantes.
[0259] Las “proteínas relacionadas con 24P4C12” de la invención incluyen aquellas específicamente identificadas en el presente documento, así como las variantes alélicas, variantes de sustitución conservadoras, análogos y homólogos que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin la experimentación indebida siguiendo los procedimientos expuestos en el presente documento o fácilmente disponibles en la técnica. También se incluyen las proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas 24P4C12 o fragmentos de las mismas, así como proteínas de fusión de una proteína 24P4C12 y un polipéptido heterólogo. Dichas proteínas 24P4C12 se denominan en conjunto las proteínas relacionadas con 24P4C12, las proteínas de la invención o 24P4C12. El término “proteína relacionada con 24P4C12” hace referencia a un fragmento de polipéptido o a una secuencia de proteína 24P4C12 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos; o de al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos.
II.) Polinucleótidos de 24P4C12
[0260] Un aspecto de la invención proporciona polinucleótidos correspondientes o complementarios a la totalidad o parte de un gen 24P4C12, ARNm y/o secuencia de codificción, preferentemente en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican una proteína relacionada con 24P4C12 y fragmentos de la misma, ADN, ARN, híbrido ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a un gen 24P4C12 o secuencia de ARNm o una parte de la misma, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan con un gen24P4C12; ARNm o un polinucleótido que codifica 24P4C12 (en conjunto, “polinucleótidos de 24P4C12”). En todos los casos a los que se refiere a esta sección, T puede ser también U en la Figura 1.
[0261] Los modos de realización de un polinucleótido de 24P4C12 incluyen: un polinucleótido de 24P4C12 de que tiene la secuencia que se muestra en la Figura 1, la secuencia de nucleótidos de 24P4C12 como se muestra en la Figura 1 en la que T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 1; o, al menos, 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en la Figura 1 en la que T es U.
[0262] Los polinucleótidos que codifican partes relativamente largas de una proteína 24P4C12 también están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40 etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (o 30 o 40
o 50 etc.) de la proteína 24P4C12 “o variante” mostrada en la Figura 1 o en la Figura 3 pueden generarse gracias a una variedad de técnicas muy conocidas en la materia. Estos fragmentos de polinucleótidos pueden incluir cualquier parte de la secuencia de 24P4C12 como se muestra en la Figura
1.
II.A.) Usos de polinucleótidos de 24P4C12
II.A.1. Monitorización de anomalías genéticas
[0263] Los polinucleótidos de los párrafos anteriores presentan una variedad de usos específicos diferentes. El gen 24P4C12 humano traza un mapa de la localización cromosómica expuesta en el Ejemplo titulado “Mapeo cromosómico de 24P4C12.” Por ejemplo, debido a que el gen 24P4C12 mapea este cromosoma, se utilizan los polinucleótidos que codifican diferentes regiones de las proteínas 24P4C12 para caracterizar las anomalías citogenéticas de esta localización cromosómica, como anomalías que se identifican por estar asociadas a diversos cánceres. En ciertos genes, se ha identificado una diversidad de anomalías cromosómicas que incluyen reordenamiento como anomalías citogenéticas frecuentes en varios cánceres diferentes (véanse p.ej.: Krajinovic et al., Mutat. Res. 382(34): 81-83 (1998); Johansson et al., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) y Finger et al., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1998)). De este modo, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas 24P4C12 proporcionan nuevas herramientas que pueden usarse para definir, con mayor precisión de la que se podía lograr previamente, anomalías citogenéticas en la región cromosómica que codifica 24P4C12 que puede contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad en la técnica de expandir la sensibilidad de cribado cromosómico con el fin de identificar anomalías cromosómicas más sutiles y menos comunes (véase, por ejemplo, Evans et al., Am. J. Obstet. Gynecol 171(4): 1055-1057 (1994)).
[0264] Además, como se mostró que 24P4C12 se expresaba de forma elevada en cánceres de próstata y otros tipos de cáncer, los polinucleótidos 24P4C12 se usan en procedimientos que evalúan el estado de productos del gen 24P4C12 en tejidos normales frente a cancerosos. Normalmente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas 24P4C12 se utilizan para evaluar la presencia de perturbaciones (como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales o alteraciones que resultan en la pérdida de un antígeno, etc.) en regiones específicas del gen 24P4C12, como regiones que contienen uno o más motivos. Los buenos ejemplos de ensayos incluyen ensayos de RT-PCR (es decir, reacción en cadena de la polimerasa por transcriptasa inversa) así como análisis de polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP) (véanse, p.ej.: Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999), ambos utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones en la proteína.
II.A.2. Modos de realización antisentido
[0265] Otros modos de realización relacionados con ácidos nucleicos contemplados específicamente en la invención que se desvelan en el presente documento son ADN genómico, ADNc, ribozimas y moléculas antisentido, así como moléculas de ácido nucleico basadas en una cadena principal alternativa o que incluyen bases alternativas, ya sean derivadas de fuentes naturales como sintetizadas, e incluyen moléculas capaces de inhibir la expresión de 24P4C12 del ARN o proteina. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser ARN u otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA, en inglés) o moléculas de ácido no nucleico como derivados de fosforotioato que se unen específicamente a ADN o ARN de un modo dependiente del par de bases. Un profesional experto puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácido nucleico usando los polinucleótidos de 24P4C12 y secuencias de polinucleótido divulgadas en el presente documento.
[0266] La tecnología antisentido conlleva la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana localizado en las células. El término “antisentido” se refiere al hecho de que dichos oligonucleótidos son complementarios a sus dianas intracelulares, por ejemplo, 24P4C12. Véanse, por ejemplo, Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989 y Synthesis 1.1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de 24P4C12 descritos en la invención incluyen derivados como S-oligonucleótidos (derivados de fosforotiato o S-oligos, véase, Jack Cohen, supra), que muestran una acción inhibitoria del crecimiento de células cancerosas mejorada. Los S-oligos (nucleósido fosforotioatos) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en el que un átomo de oxígeno no enlazante del grupo fosfato es reemplazado por un átomo de azufre. Los Soligos de la presente invención pueden prepararse mediante tratamiento de los O-oligos correspondientes con 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véanse, por ejemplo, Iyer, R.P. et al., J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); y Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990). Otros oligonucleótidos antisentido de 24P4C12 de la presente invención incluyen oligonucleótidos antisentido de morfolino conocidos en la materia (véase, p.ej.: Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).
[0267] Los oligonucleótidos antisentido de 24P4C12 de la presente invención pueden ser, normalmente, ARN o ADN que es complementario e hibrida de forma estable con los primeros 100 codones 5’ o los últimos 100 codones 3’ de una secuencia genómica de 24P4C12 o el ARNm correspondiente. No se precisa una complementariedad absoluta, aunque se prefieren altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleótido complementario a esta región permite la hibridación selectiva a ARNm de 24P4C12 y no a ARNm que especifique otras subunidades reguladoras de la proteína kinasa. En un modo de realización, los oligonucleótidos antisentido de 24P4C12 de la presente invención son fragmentos de 15 a 30-mer (unidades méricas) de la molécula de ADN antisentido que tiene una secuencia que hibrida con ARNm de 24P4C12. Opcionalmente, el oligonucleótido antisentido de 24P4C12 es un oligonucleótido de 30-mer que es complementario a una región situada en los primeros 10 codones 5’ o los últimos 10 codones 3’ de 24P4C12. Como alternativa, las moléculas antisentido se modifican para emplear ribozimas en la inhibición de expresión de 24P4C12, véase, por ejemplo, L.A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).
II.A.3. Cebadores y pares de cebadores
[0268] Otros modos de realización específicos de estos nucleótidos descritos en la invención incluyen cebadores y pares de cebadores, que permiten la amplificación específica de polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que hibridan selectiva o específicamente con moléculas de ácido nucleico o con cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable, como, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o una enzima. Dichas sondas y cebadores se usan para detectar la presencia de un polinucleótido de 24P4C12 en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa una proteína 24P4C12.
[0269] Ejemplos de dichas sondas incluyen polipéptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de ADNc de 24P4C12 humana que se muestra en la Figura 1. Los ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente ARNm de 24P4C12 se describen también en los Ejemplos. Como entenderá un experto, puede prepararse una gran cantidad de cebadores y sondas diferentes basados en las secuencias proporcionadas en el presente documento y pueden usarse para amplificar y/o detectar de forma eficaz un ARNm de 24P4C12.
[0270] Los polinucleótidos de 24P4C12 descritos en la invención son útiles para diversos propósitos que incluyen, sin carácter limitativo, su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del gen o genes 24P4C12, ARNm o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de próstata y otros tipos de cáncer; como secuencias de codificación capaces de dirigir la expresión de polipéptidos de 24P4C12; como instrumentos para modular o inhibir la expresión del gen o los genes 24P4C12 y/o traducir el tránscrito o tránscritos de 24P4C12; y como agentes terapéuticos.
[0271] La presente invención incluye el uso de cualquier sonda como se describe en el presente documento para identificar y aislar 24P4C12 o una secuencia de ácido nucleico relacionada con 24P4C12 a partir de una fuente de origen natural, como seres humanos u otros mamíferos, así como la secuencia de ácido nucleico aislada por sí misma, que comprendería todas o la mayoría de las secuencias encontradas en la sonda utilizada.
II.A.4. Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican 24P4C12
[0272] Las secuencias de ADNc de 24P4C12 descritas en el presente documento posibilitan el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican el producto o productos génicos de 24P4C12, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos de los productos génicos de 24P4C12, isoformas empalmadas de manera alternativa, variantes alélicas y formas mutantes de un producto génico de 24P4C12, así como polinucleótidos que codifican análogos de proteínas relacionadas con 24P4C12. Pueden usarse diversos métodos de clonación molecular reconocidos para aislar los ADNc de longitud completa que codifican un gen 24P4C12 (véanse, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1989: Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Eds., Wiley and Sons, 1995). Por ejemplo, pueden emplearse de forma conveniente los procedimientos de clonación de fago lambda, usando sistemas de clonación disponibles en el mercado (p. ej.: Lambda ZAP Express, Stratagene). Pueden identificarse clones de fagos que contienen ADNc del gen 24P4C12 mediante sondeo con un ADNc de 24P4C12 marcado o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en un modo de realización, un ADNc de 24P4C12 (p.ej.: Figura 1) o una porción del mismo puede sintetizarse y utilizarse como sonda para recuperar ADNc de longitud completa y solapado que corresponde con un gen 24P4C12. Un gen 24P4C12 por si mismo puede aislarse mediante el cribado de bibliotecas de ADN genómico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BACs, por sus siglas en inglés), bibliotecas de cromosomas artificiales de levadura (YAC, en inglés) similares, con sondas y cebadores de ADN de 24P4C12.
II.A.5. Sistemas de vector-huésped y moléculas de ácido nucleico recombinantes
[0273] La invención también proporciona moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleótido de 24P4C12, un fragmento, un análogo u homólogo del mismo, incluyendo, sin carácter limitativo, fagos, plásmidos, fagómidos, cósmidos, YAC, BAC, así como diversos vectores víricos y no víricos bien conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con dichas moléculas de ADN o ARN recombinantes. Los métodos para generar dichas moléculas son muy conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
[0274] La invención también proporciona un sistema de vector huésped que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido de 24P4C12, fragmento, análogo u homólogo del mismo en una célula huésped procariótica o eucariótica adecuada. Ejemplos de células huésped eucarióticas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal, como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable por baculovirus tal como una célula Sf9 o HighFive). Los ejemplos de células de mamíferos adecuadas incluyen diversas líneas celulares de cáncer de próstata tales como DU145 y TsuPr1, otras líneas celulares de cáncer de próstata que se pueden transducir o transfectar, células primarias (PrEC), así como un gran número de células de mamífero que se usan de forma rutinaria para la expresión de proteínas recombinantes (p.ej.: células COS, CHO, 293, 293T). Más específicamente, puede usarse un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación de 24P4C12 o un fragmento, análogo u homólogo del mismo para generar proteínas 24P4C12 o fragmentos de las mismas para generar proteínas 24P4C12 o fragmentos de las mismas usando cualquier número de sistemas de vector huésped utilizados de forma rutinaria y ampliamente conocidos en la técnica.
[0275] Existe disponible una amplia gama de sistemas de vector huésped adecuados para la expresión de proteínas 24P4C12 o fragmentos de las mismas, véanse, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, supra). Los vectores preferentes para la expresión de mamíferos incluyen, sin carácter limitativo, pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retrovírico pSR tkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Mediante el uso de dichos vectores de expresión, 24P4C12 puede expresarse en diversas líneas celulares de cáncer de próstata y líneas celulares no prostáticas, que incluyen, por ejemplo, 293, 293T, rat-1, PC3, NIH 3T3 y TsuPr1. Los sistemas de vector huésped descritos en la invención son útiles en la producción de una proteína 24P4C12 o fragmento de la misma. Dichos sistemas de vector huésped pueden emplearse para estudiar las propiedades funcionales de 24P4C12 y mutaciones o análogos de 24P4C12.
[0276] La proteína 24P4C12 humana recombinante o un análogo u homólogo o fragmento de la misma puede producirse mediante células de mamífero transfectadas con una construcción que codifica un nucleótido relacionado con 24P4C12. Por ejemplo, las células 293T pueden transfectarse con un plásmido de expresión que codifica 24P4C12 o fragmento, análogo u homólogo del mismo; una proteína relacionada con 24P4C12 se expresa en las células 293T, y la proteína 24P4C12 recombinante se aísla usando procedimientos de purificación estándares (p.ej.: purificación de afinidad utilizando anticuerpos anti-24P4C12). En otro modo de realización, se subclona una secuencia codificante de 24P4C12 en el vector retrovírico pSRαMSVtkneo y se usa para infectar varias líneas celulares de mamíferos, tales como NIH 3T3, TsuPr1, PC3, 293 y rat-1 con el fin de establecer líneas celulares que expresen 24P4C12. También pueden emplearse otros sistemas de expresión muy conocidos en la técnica. Pueden usarse construcciones de expresión que codifican un péptido líder unido en el mismo marco a una secuencia que codifica 24P4C12 para la generación de una forma secretada de proteína 24P4C12 recombinante.
[0277] Como se ha tratado en el presente documento, la redundancia en el código genético permite la variación de las secuencias génicas de 24P4C12. En concreto, en la técnica se conoce que especies huésped específicas a menudo tienen preferencias por codones específicos y, de este modo, se puede adaptar la secuencia divulgada como se prefiera para un huésped deseado. Por ejemplo, las secuencias de codones análogas preferentes tienen normalmente codones pocos comunes (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20% en secuencias conocidas del huésped deseado) reemplazados por codones de mayor frecuencia. Las preferencias de codones por una especie específica se calculan, por ejemplo, usando tablas de uso de codones disponibles en INTERNET como en la URL www.kazusa.or.jp/codon/.
[0278] Se conocen modificaciones de secuencia adicionales que potencian la expresión proteica en unhuésped celular. Éstas incluyen eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitio de corte y empalme de exón/intrón, repeticiones de tipo transposón y/u otras secuencias bien caracterizadas que son nocivas para la expresión génica. El contenido GC de la secuencia se ajusta a niveles medios para un huésped celular dado, calculado mediante referencia a los genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia es modificada para evitar estructuras secundarias de ARNm de horquilla previstas. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia consenso de iniciación traduccional en el inicio del marco de lectura abierto, como se describe en Kozak, Mol.Cell Biol., 9:5073-5080 (1989). Los profesionales expertos entienden que la regla general de que los ribosomas eucarióticos inician la traducción exclusivamente en el codón AUG 5’próximal se anula sólo en condiciones poco comunes (véanse, por ejemplo, Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) y Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).
III.) Proteínas relacionadas con 24P4C12
[0279] Otro aspecto de la presente invención proporciona proteínas relacionadas con 24P4C12. Modos de realización específicos de proteínas 24P4C12 comprenden un polipéptido que tiene toda o parte de la secuencia de aminoácidos de 24P4C12 humana como se muestra en la Figura 1, preferentemente en la Figura 1A. Como alternativa, los modos de realización de proteínas 24P4C12 comprenden polipéptidos análogos, homólogos o variantes que presentan alteraciones en la secuencia de aminoácidos de 24P4C12 mostrada en la Figura 1.
[0280] Los modos de realización de un polipéptido de 24P4C12 incluyen: un polipéptido de 24P4C12 que tiene una secuencia mostrada en la Figura 1, un péptido codificado por una secuencia de polinucleótidos de 24P4C12 como se muestra en la Figura 1 en la que T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia mostrada en la Figura 1; o, al menos, 10 péptidos contiguos codificados por un polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en la Figura 1 en la que T es
U.
[0281] Las abreviaturas de aminoácidos se proporcionan en la Tabla II. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden realizarse, con frecuencia, en una proteína sin alterar la conformación ni la función de la proteína. Las proteínas de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservadoras.
[0282] Modos de realización de la invención divulgados en el presente documento incluyen una amplia variedad de variantes o análogos aceptados en la técnica de proteínas 24P4C12 como polipéptidos que tienen inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. Las variantes de 24P4C12 pueden prepararse utilizando métodos conocidos en la materia como mutagénesis dirigida al sitio, barrido de alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Cartes et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagénesis de cassette (Wells et al., Gene,
34:315 (1985)), mutagénesis mediante selección por restricción (Wells et al., Philos. Trans. R Soc. London SerA, 317:415 (1986)) u otras técnicas conocidas pueden realizarse en el ADN clonado para producir ADN de la variante de 24P4C12.
[0283] El análisis de aminoácidos mediante barrido también puede llevarse a cabo para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que participa en una actividad biológica específica como una interacción proteína-proteína. Entre los aminoácidos de barrido preferentes están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es habitualmente un aminoácido de barrido preferentes entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina es normalmente preferente porque es el aminoácido más común. Además, con frecuencia se encuentra tanto en posiciones ocultas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., NY); Clothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede usarse un aminoácido isostérico.
[0284] Tal como se definen en el presente documento, las variantes, análogos u homólogos de 24P4C12 tienen el atributo distintivo de tener al menos un epítopo que presenta “reacción cruzada” con una proteína 24P4C12 que tenga una secuencia de aminoácidos de la Figura 1. Como se utiliza en esta frase, “reactividad cruzada” significa que un anticuerpo o célula T que se une específicamente a una variante de 24P4C12 que también se une específicamente a una proteína 24P4C12 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la Figura 1. Un polipéptido deja de ser una variante de una proteína mostrada en la Figura 1 cuando ya no contiene ningún epítopo más capaz de ser reconocido por un anticuerpo o célula T que se une específicamente a la proteína 24P4C12 de inicio. Los expertos en la técnica entienden que los anticuerpos que reconocen proteínas se unen a epítopos de tamaño variable, y una agrupación del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, se considera como un número típico de aminoácidos en un epítopo mínimo. Véanse, por ejemplo, Nair et al.¸ J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol (1989) 26(9):865-73; Schwartz et al., J Immunol (1985) 135(4):2598-608.
[0285] Otras clases de variantes de proteínas relacionadas con 24P4C12 comparten un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de similitud con una secuencia de aminoácidos de la Figura 1 o un fragmento de la misma. Otra clase específica de variantes o análogos de proteína 24P4C12 comprende uno o más de los motivos biológicos de 24P4C12 que se describen en el presente documento o que son conocidos actualmente en la técnica. De este modo, también se incluyen en la presente invención análogos de fragmentos de 24P4C12 (ácidos nucleicos o aminoácidos) que tienen propiedades funcionales (por ejemplo, inmunogénicas) alteradas con relación al fragmento de inicio. Se aprecia que los motivos actuales o que se convierten en parte de la técnica se aplicarán a las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de la Figura 1.
[0286] Como se ha planteado en el presente documento, los modos de realización de la invención reivindicada incluyen polipéptidos que contienen menos de la secuencia de aminoácidos completa de una proteína 24P4C12 mostrada en la Figura 1. Por ejemplo, modos de realización representativos de la invención comprenden péptidos/proteínas que tienen 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos cualesquiera de una proteína 24P4C12 mostrada en la Figura 1.
[0287] Las proteínas relacionadas con 24P4C12 se generan usando tecnología de síntesis de péptidos estándar o usando procedimientos de escisión química bien conocidos en la técnica. Como alternativa, pueden usarse procedimientos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifiquen una proteína relacionada con 24P4C12. En un modo de realización, las moléculas de ácido nucleico proporcionan un medio para generar fragmentos definidos de una proteína 24P4C12 (o variantes, homólogos o análogos de la misma).
III.A.) Modos de realización de la proteína portadora del motivo
[0288] Modos de realización ilustrativos adicionales de la invención divulgados en el presente documento incluyen polipéptidos 24P4C12 que comprenden los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos en una secuencia de polipéptido 24P4C12 establecida en la Figura 1. Se conocen varios motivos en la técnica y una proteína puede evaluarse para detectar la presencia de dichos motivos mediante una variedad de páginas web disponibles al público como BIMAS.
[0289] Previamente se han divulgado las subsecuencias portadoras de motivos de todas las variantes de proteínas 24P4C12.
[0290] La Tabla IV(h) expone diversos motivos muy comunes basados en búsquedas pfam (véase la dirección URL pfam.wustl.edu/). Las columnas de la Tabla IV(h) incluyen (1) abreviatura del nombre del motivo, (2) porcentaje de identidad encontrado entre los miembros diferentes de la familia de motivos, (3) nombre o descripción de motivos y (4) función común más frecuente; se incluye información sobre la localización si el motivo es relevante para la localización.
[0291] Los polipéptidos que comprenden uno o más de los motivos de 24P4C12 que se han tratado anteriormente son útiles para dilucidar las características específicas de un fenotipo maligno en vista de la observación de que los motivos de 24P4C12 analizados anteriormente están asociados con la desregulación del crecimiento y porque 24P4C12 se sobreexpresa en determinados tipos de cáncer (véase, p.ej.: Tabla I). La caseína kinasa II, AMPc y proteína kinasa dependiente de AMPc y proteína kinasa C, por ejemplo, son enzimas conocidas por estar asociadas al desarrollo del fenotipo maligno (véanse, por ejemplo, Chen et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) y O’Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Además, tanto la glucosilación como la miristoilación son modificaciones de proteínas asociadas también al cáncer y a la progresión del cáncer (véanse, por ejemplo, Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta 1473(1): 21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)). La amidación es otra modificación proteica también del cáncer y de la progresión del cáncer (véase, por ejemplo, Treston et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)).
[0292] En otro modo de realización, las proteínas descritas en la invención pueden comprender uno o más de los epítopos inmunorreactivos identificados según los procedimientos aceptados en la técnica, como los péptidos divulgados anteriormente. Los epítopos de CTL pueden determinarse usando algoritmos específicos para identificar péptidos en una proteína 24P4C12 que es capaz de unirse de forma óptima a alelos HLA específicados (por ejemplo, Tabla IV; EpimatrixTM Y EpimerTM, Brown University, URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.). Además, los procesos para identificar péptidos que tienen una afinidad de unión suficiente para las moléculas de HLA y que están correlacionadas con ser epítopos inmunogénicos son bien conocidos en la técnica y se llevan a cabo sin experimentación indebida. Además, los procesos para identificar péptidos que son epítopos inmunogénicos son bien conocidos en la técnica, y se llevan a cabo sin experimentación indebida tanto in vitro como in vivo.
[0293] También se conocen en la técnica principios para crear análogos de dichos epítopos con el fin de modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se comienza con un epítopo que porta un motivo CTL o HTL (véanse, por ejemplo, los motivos/supermotivos de HLA de clase I y HLA de clase II de la Tabla IV). El epítopo se convierte en un análogo sustituyendo un aminoácido en una de las posiciones especificadas, y reemplazándolo con otro aminoácido especificado para dicha posición. Por ejemplo, basándose en los residuos definidos en la Tabla IV, se puede sustituir un residuo deletéreo por cualquier otro residuo, como un residuo preferente; sustituir un residuo menos preferente por un residuo preferente; o sustituir un residuo preferente original por otro residuo preferente. Las sustituciones pueden tener lugar en posiciones de anclaje primarias o en otras posiciones en un péptido; véase, p.ej., la Tabla IV.
[0294] Una variedad de referencias reflejan la técnica con respecto a la identificación y generación de epítopos en una proteína de interés, así como análogos de los mismos. Véanse, por ejemplo, WO 97/33602 a Chesnut et al.; Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Settle et al., J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et al., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney et al., J.Immunol. 1996 157(8): 3480-90; y Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; O’Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.
[0295] Modos de realización relacionados de la invención incluyen polipéptidos que comprenden combinaciones de diferentes motivos establecidos en la(s) Tabla(s) IV(a), IV(b), IV(c), IV(d) y IV(h) y/o uno o más de los epítopos de CTL previstos divulgados previamente, y/o uno o más de los motivos que se unen a células T conocidos en la técnica. Los modos de realización preferentes no contienen inserciones, deleciones ni sustituciones ni en los motivos ni en las secuencias que intervienen de los polipéptidos. Además, los modos de realización que incluyen una serie de residuos de aminoácidos de extremo N-terminales y/o C-terminales a ambos lados de estos motivos pueden ser deseables (por ejemplo, para incluir una porción mayor de la estructura del polipéptido en la que se localiza el motivo). Normalmente, el número de residuos de aminoácidos N-terminales y/o C-terminales en ambos lados de un motivo es de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, preferentemente de 5 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos.
[0296] Las proteínas relacionadas con 24P4C12 se materializan de muchas formas, preferentemente de forma aislada. Una molécula de proteína 24P4C12 purificada se encontrará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que deterioren la unión de 24P4C12 al anticuerpo, célula T u otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerá del uso previsto. Los modos de realización de proteínas relacionadas con 24P4C12 incluyen proteínas relacionadas con 24P4C12 purificadas y proteínas relacionadas con 24P4C12 solubles y funcionales. En un modo de realización, una proteína 24P4C12 soluble y funcional o fragmento de la misma conserva la capacidad de ser enlazada por un anticuerpo, célula T u otro ligando.
[0297] La invención también proporciona proteínas 24P4C12 que comprenden fragmentos biológicamente activos de una secuencia de aminoácidos de 24P4C12 mostrada en la Figura 1. Dichas proteínas muestran propiedades de la proteína 24P4C12 de inicio, como la capacidad de provocar la generación de anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo asociado a la proteína 24P4C12 de inicio; de ser enlazada por dichos anticuerpos, de provocar la activación de HTL o CTL; y/o de ser reconocidas por HTL o CTL que también se unen específicamente a la proteína de inicio.
[0298] Los polipéptidos relacionados con 24P4C12 que contienen estructuras de especial interés pueden predecirse y/o identificarse usando diversas técnicas analíticas bien conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, los procedimientos de análisis de Chou-Fasman, Garnier-Rosbon, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o basarse en la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen dichas estructuras son particularmente útiles para generar anticuerpos anti-24P4C12 específicos de subunidades, o células T o para identificar factores celulares que se unen a 24P4C12. Por ejemplo, pueden generarse perfiles de hidrofilicidad, e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el método de Hopp, T.P. y Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78:3824-3828. Pueden generarse perfiles de hidropaticidad e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos utilizando el método de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. Pueden generarse perfiles de porcentajes (%) de residuos accesibles e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el método de Janin, J., 1979, Nature 277:491-492. Pueden generarse perfiles de flexibilidad media e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Pueden generarse perfiles de giro-beta e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando los métodos de Deleage, G., Roux, B., 1987, Protein Engineering 1:289-294.
[0299] Pueden determinarse epítopos de CTL usando algoritmos específicos para identificar péptidos en una proteína 24P4C12 que sean capaces de unirse de manera óptima a alelos HLA especificados como BIMAS y SYFPEITHI. Ilustrando esto, se predijeron los epítopos peptídicos de 24P4C12 que están presentes en el contexto de las moléculas de MHC de clase I humanas, por ejemplo, HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 Y B35. Específicamente, la secuencia completa de aminoácidos de la proteína 24P4C12 y porciones relevantes de otras variantes, es decir, para predicciones de HLA de clase I 9 residuos flanqueantes en ambos lados de una mutación puntual o unión de exones, y para predicciones de HLA de clase II 14 residuos flanqueantes en cada lado de una mutación puntual o unión de exones correspondientes a esa variante, se introdujeron en el algoritmo de búsqueda de motivo de péptidos de HLA que se encuentra en la página web de Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS).
[0300] El algoritmo de búsqueda de motivo peptídico de HLA fue desarrollado por el Dr. Ken Parker basándose en la unión de secuencias de péptidos específicas en el surco de moléculas de HLA de clase I, en especial HLA-A2 (véanse, por ejemplo, Falk et al., Nature 351:290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 81992); Parker et al., J. Immunol. 152:163-75 (1994)). Este algoritmo permite la localización y clasificación de péptidos octaméricos, nonaméricos y decaméricos a partir de una secuencia de proteína completa para la unión prevista a HLA-A2 así como de otras muchas moléculas de clase I de HLA. Muchos péptidos de unión a HLA de clase I tienen 8, 9, 10 o 11 unidades méricas. Por ejemplo, para HLA-A2 de clase I, los epítopos preferentemente contienen una leucina (L) o metionina (M) en la posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en el extremo C-terminal (véase, por ejemplo, Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992)). Se han mostrado los resultados seleccionados de los péptidos de unión de 24P4C12 previstos. La puntuación de unión corresponde al tiempo medio estimado de disociación de complejos que contienen el péptido a 37 ºC a pH de 6,5. Los péptidos con la puntuación de unión más alta se estiman como los que se unen más estrechamente a HLA de clase I en la superficie celular durante el mayor periodo de tiempo y, de este modo, representan las mejores dianas inmunogénicas para el reconocimiento de células T.
[0301] La unión real de péptidos a un alelo HLA puede evaluarse mediante la estabilización de la expresión de HLA en la línea celular T2 defectuosa de procesamiento al antígeno (véanse, por ejemplo, Xue et al., Prostate 30:73-8 (1997) y Peshwa et al., Prostate 36:129-38 (1998)). Puede evaluarse la inmunogenicidad de péptidos específicos in vitro mediante estimulación de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ en presencia de células que presentan antígenos como las células dendríticas.
[0302] Se apreciará también que cada epítopo previsto por las páginas web BIMAS, EmpimerTM y EpimatrixTM, o especificado por los motivos HLA de clase I o de clase II disponibles en la técnica o que se convierten en parte de la técnica como los expuestos en la Tabla IV será “aplicado” a una proteína 24P4C12 según la invención. Tal y como se emplea en el presente contexto, “aplicado” significa que una proteína 24P4C12 es evaluada, por ejemplo, visualmente o mediante procedimientos para hallar patrones por ordenador, como se aprecia por aquellos expertos en la técnica relevante. Cada subsecuencia de una proteína 24P4C12 de 8, 9, 10 o 11 residuos de aminoácidos que porta un motivo HLA de clase I, o una subsecuencia de 9 o más residuos de aminoácidos que porta un motivo HLA de clase II forman parte del alcance de la presente invención.
III.B.) Expresión de proteínas relacionadas con 24P4C12.
[0303] En un modo de realización descrito en los ejemplos siguientes, 24P4C12 puede expresarse convenientemente en células (como células 293T) transfectadas con un vector de expresión disponible en el mercado como un vector de expresión accionado por CMV que codifica 24P4C12 con un marcador 6XHis y MYC del extremo C-terminal (pcDNA3.1/mycHIS, Invotrogen o Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN). El vector Tag5 proporciona una señal de secreción de IgGK que puede utilizarse para facilitar la producción de una proteína 24P4C12 secretada en células transfectadas. La 24P4C12 marcada con HIS secretada en el medio de cultivo puede purificarse usando, por ejemplo, una columna de níquel empleando técnicas estándares.
III.C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con 24P4C12.
[0304] Las modificaciones de proteínas relacionadas con 24P4C12 como modificaciones covalentes se incluyen en el alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácidos seleccionadas como diana de un polipéptido 24P4C12 con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos de extremo N-terminal o C-terminal de una proteína 24P4C12. Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido de 24P4C12 incluido en la finalidad de la presente invención comprende alterar el patrón de glucosilación nativo de una proteína descrita en la invención. Otro tipo de modificación covalente de 24P4C12 comprende unir un polipéptido de 24P4C12 a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, p. ej., polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de una forma establecida en las patentes de EE.UU. núms.: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144: 4.670.417;
4.791.192 o 4.179.337.
[0305] Las proteínas relacionadas con 24P4C12 descritas en la presente invención también pueden modificarse para formar una molécula quimérica que comprenda 24P4C12 fusionada a otra secuencia de aminoácidos o polipéptidos heteróloga. Dicha molécula quimérica puede sintetizarse de forma química o recombinante. Una molécula quimérica puede tener una proteína de la invención fusionada a otro antígeno asociado a un tumor o fragmento del mismo. Como alternativa, una proteína según la invención puede comprender una fusión de fragmentos de una secuencia de 24P4C12 (aminoácidos o ácidos nucleicos) de tal modo que se crea una molécula que no es, a lo largo de toda su longitud, directamente homóloga a las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos mostradas en la Figura 1. Dicha molécula quimérica puede comprender múltiplos de la misma subsecuencia de 24P4C12. Una molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con 24P4C12 con un marcador de epítopo de polihistidina, que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente níquel inmovilizado, con citocinas o con factores de crecimiento. El marcador de epítopo se sitúa generalmente en el extremo amino o carboxilo terminal de una proteína 24P4C12. En un modo de realización alternativo, la molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con 24P4C12 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada “inmunoadhesina”), dicha fusión podría ser a una región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o desactivado) de un polipéptido de 24P4C12 en lugar de al menos una región variable en una molécula de Ig. En un modo de realización preferente, la fusión con inmunoglobulina incluye la bisagra, CH2 y CH3, o las regiones bisagra, CHI, CH2 o CH3 de una molécula de IgGI. Para la producción de fusiones con inmunoglobulina véase, p. ej., la Patente de EE.UU. Nº 5.428.130 publicada el 27 de junio de 1995.
III.D.) Usos de proteínas relacionadas con 24P4C12
[0306] Las proteínas de la invención tienen una serie de usos específicos diferentes. Ya que 24P4C12 se expresa de forma elevada en el cáncer de próstata y otros tipos de cáncer, se utilizan las proteínas relacionadas con 24P4C12 en métodos que evalúan el estado de los productos de genes 24P4C12 en tejidos normales frente a tejidos cancerosos, elucidando de este modo el fenotipo maligno. Normalmente, los polipéptidos de regiones específicas de una proteína 24P4C12 se utilizan para evaluar la presencia de perturbaciones (como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) en aquellas regiones (como regiones que contienen uno o más motivos). Los ensayos ilustrativos utilizan anticuerpos o células T que seleccionan como diana a proteínas relacionadas con 24P4C12 que comprenden los residuos de aminoácidos de uno o más motivos biológicos contenidos en una secuencia de polipéptidos de 24P4C12 con el fin de evaluar las características de esta región en tejidos normales frente a tejidos cancerosos o de obtener una respuesta inmune al epítopo. Como alternativa, las proteínas relacionadas con 24P4C12 que contienen los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos en una proteína 24P4C12 se usan para detectar factores que interactúen con esa región de 24P4C12.
[0307] Los subsecuencias o fragmentos de proteína 24P4C12 son particularmente útiles para generar y caracterizar anticuerpos de dominio específico (p. ej., anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular
o intracelular de una proteína 24P4C12), para identificar agentes o factores celulares que se unen a 24P4C12 o a un dominio estructural específico del mismo, y en varios contextos terapéuticos y de diagnóstico, incluyendo, sin carácter limitativo, ensayos de diagnóstico, vacunas contra el cáncer y procedimientos para preparar dichas vacunas.
[0308] Las proteínas codificadas por los genes 24P4C12, o por análogos, homólogos o fragmentos de los mismos, tienen diversos usos, incluyendo, sin carácter limitativo, la generación de anticuerpos y en procedimientos para identificar ligandos y otros agentes y componentes celulares que se unen a un producto del gen 24P4C12. Los anticuerpos obtenidos contra una proteína 24P4C12 o fragmento de la misma son útiles en los ensayos de diagnóstico y pronóstico, y metodologías de diagnóstico por imágenes en la gestión de tipos de cáncer humanos caracterizados por la expresión de proteína 24P4C12, como los enumerados en la Tabla I. Dichos anticuerpos pueden expresarse intracelularmente y utilizarse en métodos de tratamiento de pacientes que padecen dichos tipos de cáncer. Las proteínas o ácidos nucleicos relacionados con 24P4C12 se usan también para generar respuestas de HTL o CTL.
[0309] Se usan diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas 24P4C12, incluyendo, sin carácter limitativo, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia enzimática (ELIFA), procedimienots inmunocitoquímicos y similares. Pueden marcarse y usarse anticuerpos como reactivos de imágenes inmunológicos capaces de detectar las células que expresan 24P4C12 (p. ej., métodos de diagnóstico por imágenes radioescintigráficos). Las proteínas 24P4C12 también son particularmente útiles en la generación de vacunas contra el cáncer, como se describe más adelante en el presente documento.
IV.) Anticuerpos de 24P4C12
[0310] Otro aspecto de la invención describe anticuerpos que se unen a proteínas relacionadas con 24P4C12 (véase la Figura 1). Los anticuerpos preferentes se unen específicamente a una proteína relacionada con 24P4C12 y no se unen (o se unen débilmente) a péptidos o proteínas que no son proteínas relacionadas con 24P4C12 en condiciones fisiológicas. En este contexto, ejemplos de condiciones fisiológicas incluyen: 1) solución salina tamponada con fosfato; 2) solución salina tamponada que contiene Tris 25mM y NaCl 150mM; 3) solución salina normal (NaCl 0,9%); 4) suero animal como suero humano; o 5) una combinación de cualquiera del 1) al 4); estas reacciones preferentemente que tengan lugar a pH 7,5, como alternativa, en la escala de pH 7.0 a 8,0; además, estas reacciones tienen lugar a una temperatura de entre 4 ºC y 37 ºC. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a 24P4C12 que puede unir proteínas relacionadas con 24P4C12 como variantes de 24P4C12 y los homólogos o análogos de la misma.
[0311] Los anticuerpos de la invención son particularmente útiles en los ensayos de diagnóstico y pronóstico del cáncer (véase, p.ej., la Tabla I) y en metodologías de diagnóstico por imágenes. De forma similar, dichos anticuerpos son útiles en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de colon y otros tipos de cáncer, en la medida en que también se exprese o sobreexprese 24P4C12 en estos otros tipos de cáncer. Además, los anticuerpos expresados intracelularmente (p.ej., anticuerpos monocatenarios) son terapéuticamente útiles en el tratamiento de cánceres en los que está implicada la expresión de 24P4C12, como cánceres de colon avanzado o metastásico u otros tipos de cánceres en estado avanzado o metastásico.
[0312] La invención también se refiere a diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de 24P4C12 y proteínas relacionadas con 24P4C12 variante. Dichos ensayos pueden comprender uno o más anticuerpos 24P4C12 capaces de reconocer y unirse a una proteína relacionada con 24P4C12, según proceda. Estos ensayos se realizan en varios formatos de ensayo inmunológico bien conocidos en la técnica, incluyendo, sin carácter limitativo, diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia ligada a enzimas (ELIFA) y similares.
[0313] Los ensayos inmunológicos que no son de anticuerpos también comprenden ensayos de inmunogenicidad de células T (de inhibición o estimulación), así como ensayos de unión al complejo de mayor histocompatibilidad (MHC, en inglés).
[0314] Además, también se describen en la invención de métodos de diagnóstico por imágenes inmunológicos capaces de detectar cáncer de próstata o de colon y otros tipos de cáncer que expresan 24P4C12, incluyendo, sin carácter limitativo, procedimientos de representación de imágenes radioescintigráficos usando anticuerpos monoclonales de 24P4C12 marcados. Dichos ensayos son clínicamente útiles en la detección, monitorización y pronóstico de cánceres que expresan 24P4C12 como el cáncer de colon.
[0315] Los anticuerpos 24P4C12 también se usan en procedimientos para purificar una proteína relacionada con 24P4C12 y para aislar homólogos de 24P4C12 y moléculas relacionadas con 24P4C12. Por ejemplo, un método para purificar una proteína relacionada con 24P4C12 comprende la incubación de un anticuerpo de 24P4C12, que ha sido acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene una proteína relacionada con 24P4C12 en condiciones que permitan al anticuerpo de 24P4C12 unirse a la proteína a la proteína relacionada con 24P4C12; el lavado de la matriz sólida para eliminar impurezas; y la elución de la proteína relacionada con 24P4C12 a partir del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos de 24P4C12 según la invención incluyen generar anticuerpos antiidiotípicos que imitan una proteína 24P4C12.
[0316] En la técnica se reconocen diversos procedimientos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos inmunizando un huésped de mamífero adecuado usando una proteína, un péptido o un fragmento relacionados con 24P4C12, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, las proteínas de fusión de 24P4C12 también pueden usarse como una proteína de fusión GST 24P4C12. En un modo de realización particular, se produce una proteína de fusión GST que comprende toda o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 1, usándose después como inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. En otro modo de realización, una proteína relacionada con 24P4C12 se sintetiza y se emplea como inmunógeno.
[0317] Además, se usan técnicas de inmunización de ADN desnudo conocidas en la técnica (con o sin proteína relacionada con 24P4C12 purificada o células que expresan 24P4C12) para generar una respuesta inmune al inmunógeno codificado (para revisión, véase Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).
[0318] La secuencia de aminoácidos de una proteína 24P4C12 como se muestra en la Figura 1 puede analizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína 24P4C12 para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de una secuencia de aminoácidos de 24P4C12 se utilizan para identificar regiones hidrofílicas en la estructura de 24P4C12. Pueden identificarse con facilidad regiones de una proteína 24P4C12 que muestra estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, usando otros métodos diferentes conocidos en la técnica, como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Los perfiles de hidrofilicidad pueden generarse usando el método de Hopp, T.P. y Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78:3824-3828. Los perfiles de hidropaticidad pueden generarse utilizando el método de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. Los perfiles de porcentajes (%) de residuos accesibles pueden generarse usando el procedimiento de Janin J., 1979, Nature 277:491-492. Les perfiles de flexibilidad media pueden generarse usando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept Protein Res. 32:242-255. Los perfiles de giro beta pueden generarse usando el procedimiento de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. De este modo, cada región identificada por cualquiera de estos programas o métodos forma parte de la finalidad de la presente invención. Los procedimientos preferentes para la generación de anticuerpos de 24P4C12 se ilustran con mayor detalle por medio de los ejemplos que se proporcionan en el presente documento. Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para su uso como inmunógeno son reconocidos en la técnica. También son muy conocidos en la técnica procedimientos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un vehículo, como BSA, KLH u otra proteína portadora. En algunas circunstancias, se usa la conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimidas; en otros ejemplos son eficaces reactivos de unión como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de 24P4C12 se realiza a menudo mediante inyección durante un periodo de tiempo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, como se entiende en la técnica. Durante el programa de inmunización, pueden tomarse títulos de anticuerpos para determinar la adecuación de la formación del anticuerpo.
[0319] Pueden producirse anticuerpos monoclonales de 24P4C12 por medio de varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se preparan líneas celulares inmortalizadas que segregan un anticuerpo monoclonal deseado usando la tecnología del hibridoma estándar de Kohler y Milstein o modificaciones que inmortalizan las células B productoras de anticuerpos, como se conoce en general. Las líneas celulares inmortalizadas que segregan los anticuerpos deseados se criban mediante inmunoensayo en el que el antígeno es una proteína relacionada con 24P4C12. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado, las células pueden expandirse y los anticuerpos pueden producirse a partir de cultivos in vitro o a partir de fluido ascítico.
[0320] Los anticuerpos o fragmentos de la invención también pueden producirse por medios recombinantes. También pueden producirse regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de una proteína 24P4C12 en el contexto de los anticuerpos con injerto de región determinante de complementariedad (CDR) o quimérico de múltiples especies originales. También pueden producirse anticuerpos de 24P4C12 humanos o humanizados, y se prefieren para su uso en contextos terapéuticos. Los procedimientos para humanizar anticuerpos murinos y otros no humanos, sustituyendo una o más de las CDR del anticuerpo no humano por las secuencias del anticuerpo humano correspondientes, son bien conocidos (véanse, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Véanse también, Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 4285 y Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.
[0321] En un modo de realización preferente, los anticuerpos de la presente invención comprenden anticuerpos de 24P4C12 totalmente humanos (MAbs de 24P4C12). Diversos procedimientos en la técnica proporcionan medios para producir anticuerpos monoclonales de 24P4C12 totalmente humanos. Por ejemplo, un modo de realización preferente estipula técnicas que usan ratones transgénicos, inactivados para la producción de anticuerpos, diseñados con loci de las cadenas ligeras y pesadas humanas denominados Xenomouse (Amgen Fremont, Inc.). Una descripción ilustrativa de preparación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se puede encontrar en la Patente de EE.UU. 6.657.103. Véanse también las Patente de EE.UU. núms. 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; y 5.545.806; y Mendez, et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1998); Kellerman, S.A. & Green, L.L., Curr. Opin. Biotechnol 13, 593-597 (2002).
[0322] Además, los anticuerpos humanos de la invención pueden generarse usando ratones HuMAb (Medarex, Inc.) que contienen minilocus de genes de inmunoglobulinas humanas que codifican las secuencias de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa y de la cadena pesada (mu y gamma) humanas sin reordenar, junto con las mutaciones seleccionadas como diana que inactivan los loci endógenos de la cadena mu y kappa de (véase, por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859).
[0323] En otro modo de realización, los anticuerpos totalmente humanos de la invención pueden generarse usando ratones que portan secuencias de inmunoglobulina humana en los transgenes y transcromosomas, como un ratón que porta un transgén de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Dichos ratones, denominados “ratones KM” en el presente documento se describen en Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97:722-727 y en la Publicación PCT WO 02/43478 de Tomizuka et al.
[0324] Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse usando procedimientos de presentación en fagos para cribar las bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Dichos procedimientos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos se establecen en la técnica. Véanse, por ejemplo: las Patentes de Estados Unidos núms 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al.; las Patentes de EE.UU. núms 5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; las Patentes de EE.UU. núms 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y las Patentes de EE.UU. núms 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.
[0325] Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse usando ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) en los que se han reconstituido células inmunológicas humanas de manera que se puede generar una respuesta de anticuerpo humano tras la inmunización. Dichos ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. núms 5.476.996 y
5.698.767 de Wilson et al.
[0326] Incluso en otro modo de realización, un anticuerpo monoclonal de 24P4C12 de la invención comprende regiones variables de la cadena ligera y de la cadena pesada que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferentes descritos en el presente documento (véase, Figura 3), y en el que los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los mAb de 24P4C12 de la invención.
[0327] Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o antígeno que se une a una porción del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variables de cadena ligera, en la que:
[0328] (a) la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homóloga a una secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 3;
[0329] (b) la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homóloga a una secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 3;
[0330] En otros modos de realización, las secuencias de aminoácidos de VH y VL pueden ser 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homólogas a las secuencias descritas en la Figura 3.
[0331] Los anticuerpos modificados genéticamente de la invención incluyen aquellos en los que las modificaciones se han llevado a cabo en los residuos de la región marco en la VH y VL (p.ej., para mejorar las propiedades del anticuerpo). Normalmente, dichas modificaciones de marco se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un procedimiento consiste en “retromutar” uno
o más residuos marco a su correspondiente secuencia de línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que ha sido sometido a mutación somática puede contener residuos marco que difieran de la secuencia de la línea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Dichos residuos pueden ser identificados comparando las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las que se deriva el anticuerpo. Con el fin de devolver las secuencias de la región marco a su configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas pueden ser “retromutadas” a la secuencia de línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR (p.ej.: “retromutadas” de leucina a metionina). Dichos anticuerpos “retromutados” también se incluirán en la invención.
[0332] Otro tipo de modificación de marco conlleva la mutación de uno o más residuos en la región marco, o incluso en una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de célula T para, de este modo, reducir la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se denomina “desinmunización” y se describe con mayor detalle en la publicación de la Patente de EE.UU. Nº 2003/0153043 de Carr et al.
[0333] Además de, o como alternativa a, las modificaciones realizadas en las regiones marco o CDR, los anticuerpos de la invención pueden ser modificados genéticamente para incluir modificaciones en la región Fc, típicamente para modificar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, como la vida media en suero, la fijación del complemento, la unión del receptor de Fc, y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Además, un anticuerpo monoclonal de la invención puede modificarse químicamente (p.ej., una o más fracciones químicas pueden fijarse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glucosilación, de nuevo para modificar una o más propiedades funcionales del MAb. Cada uno de estos modos de realización se describe con mayor detalle a continuación.
[0334] En un modo de realización, la región bisagra de CH1 se modifica de modo que se modifica el número de residuos de cisteína en la región bisagra, p.ej, aumenta o disminuye. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de EE.UU. Nº 5.677.425 de Bodmer et al. El número de residuos de císteina en la región bisagra de CH1 se modifica para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o reducir la estabilidad del anticuerpo monoclonal de 24P4C12.
[0335] En otro modo de realización, la región bisagra de la Fc de un anticuerpo se muta para reducir la vida media biológica del MAb de 24P4C12. Más específicamente, una o más mutaciones de aminoácidos se introducen en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra de la Fc de modo que el anticuerpo ha deteriorado la unión de la proteína Staphylococcyl A (SpA) en relación con la unión nativa de SpA al dominio de la región bisagra de la Fc.
[0336] En otro modo de realización, el MAb de 24P4C12 es modificado para aumentar su vida media biológica. Son posibles varios procedimientos. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 6.277.375 de Ward. Como alternativa, con el fin de aumentar la vida media biológica, el anticuerpo puede modificarse en la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor de salvamento extraído a partir de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de EE.UU. núms. 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al.
[0337] En otros modos de realización, la región Fc se modifica reemplazando al menos un residuo de aminoácidos por un residuo de aminoácidos diferente para modificar la función o funciones efectoras del MAb de 24P4C12. Por ejemplo, pueden reemplazarse uno o más aminoácidos seleccionados entre los residuos de aminoácidos específicos por un residuo de aminoácidos diferente de modo que el anticuerpo tiene una afinidad modificada para un ligando efector pero retiene la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo original. El ligando efector al que se le modifica la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con mayor detalle en las Patentes de EE.UU. núms. 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.
[0338] La reactividad de los anticuerpos de 24P4C12 con una proteína relacionada con 24P4C12 puede establecerse por un número de métodos bien conocidos, incluidos análisis de inmunotransferencia Western, inmunoprecipitación, ELISA, y FACS, utilizando, según proceda, proteínas relacionadas con 24P4C12, células que expresan 24P4C12 o extractos de las mismas. Un anticuerpo de 24P4C12 o fragmento del mismo puede marcarse con un marcador detectable o conjugarse a otra molécula. Entre los marcadores detectables adecuados se incluyen, sin carácter limitativo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o una enzima. Además, los anticuerpos biespecíficos específicos para dos o más epítopos de 24P4C12 se generan usando métodos conocidos comúnmente en la técnica. También pueden generarse anticuerpos homodiméricos mediante técnicas de entrecruzamiento conocidas en la técnica (p.ej., Wolff et al., Cancer res. 53: 2560-2565).
[0339] Los anticuerpos denominados Ha5-1(5)1, Ha5-1(5)2.1, Ha5-3(1,4)7.1, Ha5-7acd10.1, Ha57acd16.1 y Ha5-11b1.1 fueron enviados (vía Federal Express) a la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection, ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, Va 20108 el 8 de agosto de 2007 y les asignaron los números de acceso PTA-__, PTA-__, PTA-__, PTA-__, PTA-__, PTA-__, respectivamente.
IV.A.) Respuestas inmune celulares a 24P4C12
[0340] El mecanismo mediante el cual las células T reconocen antígenos ha sido definido. Las composiciones de la vacuna de epítopo peptídico eficaces de la invención inducen respuestas inmunes terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la población mundial. Para la comprensión del valor y eficacia de las composiciones de la invención que inducen respuestas inmunes celulares, se proporciona una breve revisión de tecnología relacionada con la inmunología.
[0341] Un complejo de una molécula HLA y un antígeno peptídico actúa como el ligando reconocido por células T restringidas por HLA (Buss, S. et al. Cell 47: 1071, 1986, Babbitt, B. P. et al., Nature 317:359. 1985; Townsend, A. y Bodmer, H., Annu, Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev.
Immunol. 11:403, 1993). A lo largo del estudio de análogos de antígeno sustituidos por un único aminoácido y la secuenciación de péptidos procesados de forma natural y unidos de forma endógena, se han identificado residuos críticos que se corresponden con motivos requeridos para el enlace específico de moléculas de antígeno de HLA y se exponen en la Tabla IV (véase también, p.ej., Southwood, et al., J.Immunol. 160:3363, 1998; Rammensee, et al, Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, acceso en la página de internet con URL (134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm); Settle, A. y Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478. 1998; Engelhard, V.H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994, Ruppert et al., Cell 74:929-937, 1993; Kondo et al. J. Immunol. 155:4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Immunol. 157:3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996; Settle, A. y Sidney, J. Immunogenetics 1999 Nov; 50(3-4):201-12, Review).
[0342] Además, los análisis de cristalografía de rayos x de complejos de péptido-HLA han revelado bolsillos dentro de la hendidura/surco de unión del péptido de moléculas HLA que acomoda, en un modo aleloespecífico, residuos portados por ligandos peptídicos; estos residuos a su vez determinan la capacidad de unión a HLA de los péptidos en los que están presentes. (Véanse, p.ej., Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol. 13:587, 1995; Smith, et al., Immunity 4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stem et al., Structure 2:245, 1995; Stem et al, Structure 2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J. H. et al., Nature 364:33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:8053, 1993; Guo, H. C. et al., Nature 360:364, 1992; Silver, M. L: et al.; Nature. 360:367, 1992; Matsumura, M et al., Science 257:927, 1992; Madden et al., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D. H. et al, Science 257:919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P.J. y Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219:277, 1991.)
[0343] En consecuencia, la definición de motivos que unen HLA aleloespecífico de clase I y de clase II o supermotivos de clase I o clase II permite la identificación de regiones en una proteína que están correlacionadas con el enlace a antígeno(s) HLA concreto(s).
[0344] Por tanto, mediante un proceso de identificación de motivo HLA, se han identificado candidatos para vacunas basadas en epítopos; dichos candidatos pueden evaluarse en mayor medida mediante ensayos de enlace péptido-HLA para determinar la afinidad de unión y/o el periodo de tiempo de asociación de epítopo y su molécula HLA correspondiente. Se puede llevar a cabo trabajo confirmatorio adicional para seleccionar, entre estos candidatos para vacunas, epítopos con características preferentes en términos de cobertura de población, y/o inmunogenicidad.
[0345] Pueden utilizarse diversas estrategias para evaluar la inmunogenicidad células, entre las que se incluyen:
1) Evaluación de cultivos de células T primarias de sujetos normales (véanse, p.ej., Wentworth,
P. A. et al., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. et al., Proc, Natl, Acad. Sci. EE.UU. 91:2105, 1994; Tsai, V. et al., J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol. 59:1, 1998). Este procedimiento conlleva la estimulación de linfocitos de sangre periférica (LSP) de sujetos normales con un péptido de prueba en presencia de células que presentan antígeno in vitro durante un periodo de varias semanas. Las células T específicas para el péptido se activan durante este tiempo y se detectan usando, p.ej., un ensayo de liberación de linfocinas o Cr51 que implica células diana sensibilizadas con péptidos.
2) Inmunización de ratones transgénicos HLA (véanse, p.ej., Wentworth, P. A. et al., J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth P. A. et al., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. et al., J. Immunol. 159:4753, 1997). Por ejemplo, en dichos métodos los péptidos en adyuvante de Freund incompleto se administran por vía subcutánea a ratones transgénicos HLA. Varias semanas después de la inmunización, se extraen los esplenocitos y se cultivan in vitro en presencia de péptido de prueba durante aproximadamente una semana. Se detectan células T específicas del péptido usando, p.ej., un ensayo de liberación de Cr51 que implica células diana sensibilizadas con péptido y células diana que expresan un antígeno endógenamente generado.
3) Demostración de respuestas de células T de memoria de sujetos inmunes que han sido vacunados de forma eficaz y/o de pacientes con enfermedad crónica (véanse, p.ej., Rehermann,
B. et al., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Doolan, D. L. et al., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. et al.,
J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S. C: et al., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H.
M. et al.; J. Virol. 71:6011, 1997). En consecuencia, las respuestas de memoria se detectan mediante cultivo LSP de sujetos que han estado expuestos al antígeno debido a la enfermedad y, de este modo, han generado una respuesta inmune “de forma natural”, o de pacientes que se vacunaron contra el antígeno. El LSP de sujetos se cultiva in vitro durante 1-2 semanas en presencia del péptido de prueba más células que presentan el ántigeno (CPA) para permitir la activación de las células T de “memoria”, en comparación con las células T “vírgenes”. Al final del periodo de cultivo, se detecta la actividad de células T usando ensayos que incluyen liberación de Cr51 que implica dianas sensibilizadas con péptido, proliferación de células T o liberación de linfocina.
V.) Animales transgénicos con 24P4C12
[0346] También pueden usarse ácidos nucleicos que codifican una proteína relacionada con 24P4C12 para generar animales transgénicos o “noqueados” que, a su vez, sirven para el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Según las técnicas establecidas, pueden usarse el ADNc que codifica 24P4C12 para clonar ADN que codifique 24P4C12. Las secuencias genómicas clonadas pueden usarse entonces para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica 24P4C12. Los métodos para generar animales transgénicos, concretamente animales como ratones o ratas, ya son convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. núms.
4.736.866 publicada el 12 de abril de 1988 y 4.870.009 publicada el 26 de septiembre de 1989. Normalmente, se dirigía a células concretas para la incorporación dell transgén de 24P4C12 con los potenciadores tisulares específicos.
[0347] Pueden emplearse animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica 24P4C12 para examinar el efecto de la expresión aumentada de ADN que codifica 24P4C12. Estos animales pueden usarse como animales de experimentación para reactivos pensados para conferir protección ante, por ejemplo, afecciones patológicas de su sobreexpresión. De acuerdo con este aspecto de la invención, se trata un animal con un reactivo de modo que una menor incidencia de una condición patológica, en comparación con animales no tratados que portan el transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica para la afección patológica.
[0348] Como alternativa, pueden usarse homólogos no humanos de 24P4C12 para construir un animal “noqueado” con 24P4C12 que tenga un gen defectuoso o modificado que codifica 24P4C12 a consecuencia de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica 24P4C12 y el ADN genómico modificado que codifica 24P4C12 introducidos en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede usarse el ADNc que codifica 24P4C12 para clonar ADN genómico que codifica 24P4C12 según las técnicas establecidas. Puede suprimirse o reemplazarse por otro gen una parte de ADN genómico que codifica 24P4C12, por ejemplo, por un gen que codifica un marcador de selección que puede usarse para controlar la integración. Normalmente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante no modificado (tanto en el extremo 5’ como en el 3’) (véase, p.ej., Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea celular de célula madre embrionaria (p.ej., por electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno (véase, p.ej., Li et al., Cell, 69:915 (1992)). Después, las células seleccionadas se inyectan en un blastocisto animal (p.ej., de ratón o rata) para formar quimeras por agregación (véase, p.ej., en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), págs. 113-152). Se puede implantar entonces un embrión quimérico en un animal colactáneo hembra pseudopreñada adecuaday el embrión se puede llevar a término para crear un animal “noqueado”. Los descendientes que albergan el ADN recombinado de modo homólogo en sus células germinales pueden identificarse mediante técnicas estándares y usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado. Los animales noqueados pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra determinadas afecciones patológicas o por el desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido de 24P4C12.
VI) Métodos para la detección de 24P4C12
[0349] Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para detectar polinucléotidos de 24P4C12 y proteínas relacionas con 24P4C12, así como métodos para identificar una célula que expresa 24P4C12. El perfil de expresión de 24P4C12 la convierte en un marcador de diagnóstico para una enfermedad metastásica. En consecuencia, el estado de los productos del gen 24P4C12 proporciona información útil para predecir una variedad de factores entre los que se incluyen la predisposición a una enfermedad en etapa avanzada, a la velocidad de progresión y/o la agresividad del tumor. Como se explica detalladamente en el presente documento, el estado de los productos génicos de 24P4C12 en muestras de pacientes puede analizarse según diversos protocoles que son bien conocidos en la técnica, incluido el análisis inmunohistoquímico, la variedad de técnicas de análisis Northern, incluida la hibridación in situ, análisis por RT-PCR (por ejemplo en muestras microdiseccionadas por captura con láser), análisis Western y análisis de diversos tejidos.
[0350] Más concretamente, la invención proporciona ensayos para la detección de los polinucleótidos de 24P4C12 en una muestra biológica, como suero, hueso, próstata, y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Entre los polinucleótidos de 24P4C12 detectables se incluyen, por ejemplo, un gen de 24P4C12 o un fragmento del mismo, ARNm de 24P4C12, ARNm de 24P4C12 de variante de corte y empalme y las moléculas de ARN o ADN recombinante que contienen un polinucleótido de 24P4C12. En la técnica se conocen diversos métodos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos de 24P4C12 y pueden emplearse en la práctica de este aspecto de la invención.
[0351] En un modo de realización, un procedimiento para detectar un ARNm de 24P4C12 en una muestra biológica comprende la producción de ADNc a partir de la muestra mediante transcripción inversa utilizando al menos un cebador; amplificando el ADNc producido de ese modo por medio de polinucleótidos de 24P4C12 como cebadores sentido y antisentido para amplificar los ADNc de 24P4C12 aquí; y la detección de la presencia del ADNc de 24P4C12 amplificado. Opcionalmente, puede determinarse la secuencia de ADNc de 24P4C12 amplificado.
[0352] En otro modo de realización, un procedimiento para detectar un gen 24P4C12 en una muestra biológica comprende el aislamiento en primer lugar del ADN genómico procedente de la misma muestra; la amplificación del ADN genómico aislado mediante polinucleótidos de 24P4C12 como cebadores sentido y antisentido; y la detección de la presencia del gen de 24P4C12 amplificado. Se puede diseñar una variedad de combinaciones de sondas sentido y antisentido adecuadas a partir de la secuencia de nucleótidos de 24P4C12 (véase, p.ej., la Figura 1) y usada con este propósito.
[0353] La invención también expone ensayos para detectar la presencia de una proteína 24P4C12 en un tejido o en otra muestra biológica como suero, semen, hueso, próstata, orina, preparaciones celulares y similares. Los procedimientos para detectar una proteína relacionada con 24P4C12 también son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis Western blot , ensayos de unión molecular, ELISA; ELIFA y similares. Por ejemplo, un procedimiento para detectar la presencia de una proteína relacionada con 24P4C12 en una muestra biológica comprende primero la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo de 24P4C12, un fragmento reactivo a 24P4C12 del mismo, o una proteína recombinante que contiene una región de unión al antígeno de un anticuerpo de 24P4C12; y después la detección de la unión de la proteína asociada a 24P4C12 en la muestra.
[0354] Los métodos para identificar una célula que expresa 24P4C12 se encuentran también dentro del alcance de la invención. En un modo de realización, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen 24P4C12 comprende la detección de la presencia del ARNm de 24P4C12 en la célula. Los procedimientos para la detención de los ARNm particulares en las células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación que emplean sondas de ADN complementario (por ejemplo, hibridación in situ usando ribosondas de 24P4C12 marcadas, Northern blot y técnicas relacionadas) y varios ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para 24P4C12, y otros métodos de detección del tipo amplificación como ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Como alternativa, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen 24P4C12 comprende detectar la presencia de proteína relacionada con 24P4C12 en la célula o secretada por la célula. En la técnica, se conocen diversos procedimientos para la detección de proteínas y éstos se emplean para la detección de proteínas relacionadas con 24P4C12 y de células que expresan proteínas relacionadas con 24P4C12.
[0355] El análisis de expresión 24P4C12 sirve también de herramienta para identificar y evaluar los agentes que modulan la expresión del gen 24P4C12. Por ejemplo, la expresión de 24P4C12 está significativamente aumentada en el cáncer de ovario, y se expresa en cánceres de los tejidos incluidos en la Tabla 1. La identificación de una molécula o de un agente biológico que inhiba la expresión o sobreexpresión de 24P4C12 en células cancerosas tiene valor terapéutico. Por ejemplo, dicho agente puede identificarse por medio de una pantalla que cuantifica la expresión de 24P4C12 por RT-PCR, hibridación del ácido nucleico o unión al anticuerpo.
VII.) Métodos para controlar el estado de los genes relacionados con 24P4C12 y sus productos.
[0356] La oncogénesis es conocida por ser un proceso de múltiples pasos en el que se desregula el crecimiento celular progresivamente y las células progresan desde un estado fisiológico normal hacia estados precancerosos y después cancerosos (véanse, p.ej., Alers et al., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) e Issacs et al., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). En este contexto, el examen de una muestra biológica para detectar indicios de un crecimiento celular desregulado (como la expresión aberrante de 24P4C12 en cánceres) permite la detección precoz de dicha fisiología aberrante, antes de que un estado patológico como el cáncer haya progresado a una etapa en la cual las opciones terapéuticas son más limitadas y/o el pronóstico es peor. En estos exámenes, el estado de 24P4C12 en una muestra biológica de interés puede compararse, por ejemplo, con el estado de 24P4C12 en una muestra normal correspondiente (p.ej., una muestra procedente del sujeto o alternativamente otro individuo que no esté afectado por una patología). Una alteración en el estado de 24P4C12 en la muestra biológica (en comparación con la muestra normal) proporciona indicios del crecimiento celular desregulado. Además de usar una muestra biológica que no esté afectada por una patología, como una muestra normal, también se puede utilizar un valor normalizado predeterminado, como un nivel normal predeterminado, de la expresión de ARNm (véanse, p.ej., Grever et al., J. Comp. Neurol. 9 de diciembre de 1996; 376(2): 306-14 y la Patente de EE.UU. Nº 5.837.501) para comparar el estado de 24P4C12 en una muestra.
[0357] El término “estado” en este contexto se utiliza según el significado aceptado en la técnica y se refiere a la condición o estado de un gen y sus productos. Normalmente, los expertos utilizan diversosparámetros para evaluar la condición o el estado de un gen y de sus productos. Éstos incluyen, sin carácter limitativo, la localización de los productos del gen expresado (incluido la localización de las células que expresan 24P4C12), así como el nivel y la actividad biológica de loa productos del gen expresado (como polinucleótidos, polipéptidos y ARNm de 24P4C12). Normalmente, una alteración en el estado de 24P4C12 comprende un cambio en la localización de 24P4C12 y/o de las células que expresan 24P4C12 y/o un aumento en el ARNm de 24P4C12 y/o expresión de la proteína.
[0358] El estado de 24P4C12 en una muestra puede analizarse por diversos medios bien conocidos en la técnica, que incluyen, sin carácter limitativo, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análisis RT-PCR en muestras microdiseccionadas por captura láser, análisis Western blot y diversos análisis tisulares. Los protocolos típicos para evaluar el estado de un gen y los productos génicos de 24P4C12 se encuentran, por ejemplo, en Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) y 18 (PCR Analysis). De este modo, el estado de 24P4C12 en una muestra biológica se evalúa mediante varios métodos utilizados por expertos, que incluyen, sin carácter limitativo, análisis genómico Southern (para examinar, por ejemplo, perturbaciones en el gen 24P4C12), análisis Northern y/o análisis PCR del ARNm de 24P4C12 (para examinar, por ejemplo, alteraciones en las secuencias de polinucleótidos o en los niveles de expresión de los ARNm de 24P4C12), y análisis Western y/o análisis inmunohistoquímico (por ejemplo, para examinar alteraciones en secuencias de polipéptidos, alteraciones en la localización de los polipéptidos en una muestra, alteraciones en los niveles de expresión de las proteínas 24P4C12 y/o asociaciones de las proteínas 24P4C12 con asociados polipeptídicos de unión). Entre los polinucleótidos detectables de 24P4C12 se incluyen, por ejemplo, un gen 24P4C12 o un fragmento del mismo, ARNm de 24P4C12, variantes de corte alternativo, ARNm de 24P4C12 y moléculas de ADN o ARN recombinante que contienen un polinucleótido de 24P4C12.
[0359] El perfil de expresión de 24P4C12 lo convierte en un marcador de diagnóstico para una enfermedad local y/o metastásica, y proporciona información sobre el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de 24P4C12 proporciona información útil para predecir la propensión a determinadados estadios de la enfermedad, progresión y/o agresividad del tumor. La invención también proporciona métodos y ensayos para determinar el estado de 24P4C12 y diagnosticar aquellos cánceres que expresan 24P4C12, como los cánceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. Por ejemplo, puesto que el ARNm de 24P4C12 se expresa tan altamente expresado en el cáncer de riñón y otros cánceres en relación con el tejido de riñón normal, pueden usarse ensayos que evalúan los niveles transcripción de ARNm de 24P4C12 o de proteínas en una muestra biológica, para diagnosticar una enfermedad asociada a la desregulación de 24P4C12, y puede proporcionar información de pronóstico útil en la definición de las opciones terapéuticas apropiadas.
[0360] El estado de expresión de 24P4C12 proporciona información que incluye la presencia, estadio y localización de células displásticas, precancerosas y cancerosas, previendo la propensión a ciertos estadios de la enfermedad, y/o para calcular la agresividad del tumor. Además, el perfil de expresión hace que sirva como reactivo de diagnóstico por imágenes para la enfermedad con metástasis. En consecuencia, un aspecto de la invención se dirige a varios métodos de diagnóstico y pronóstico molecular para examinar el estado de 24P4C12 en muestras biológicas como aquellas que provienen de sujetos que padecen, o de los que se sospecha que padecen, una patología caracterizada por un crecimiento celular desregulado, como cáncer.
[0361] Como se describe anteriormente, el estado de 24P4C12 en una muestra biológica puede examinarse mediante una gran variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el estado de 24P4C12 en una muestra biológica obtenida de una localización específica en el cuerpo puede examinarse mediante la evaluación de la muestra para detectar la presencia o ausencia de células que expresen 24P4C12 (p.ej., aquellas que expresan proteínas o ARNm de 24P4C12). Este análisis puede proporcionar pruebas del crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando se encuentran células que expresan 24P4C12 en una muestra biológica que no contiene normalmente dichas células (como un ganglio linfático), porque estas alteraciones en el estado de 24P4C12 en una muestra biológica se asocian a menudo al crecimiento celular desregulado. De forma específica, un indicador de crecimiento celular desregulado es la metástasis de las células cancerosas de un órgano de origen (como la próstata) a una zona diferente del cuerpo (como un ganglio linfático). En este contexto, las pruebas de crecimiento celular desregulado son importantes, por ejemplo, porque pueden detectarse metástasis ocultas del ganglio linfático en una proporción considerable de pacientes con cáncer de próstata, y dichas metástasis están asociadas a los indicadores del avance de la enfermedad (véanse, p.ej., Murphy et al., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) y Freeman et al., J Urol. Agosto de 1995 154(2 Pt 1):474-8).
[0362] En un aspecto, la invención se refiere a procedimientos para controlar los productos génicos de 24P4C12 mediante la determinación del estado de los productos génicos de 24P4C12 expresados por las células de un sujeto del que se sospecha tiene una enfermedad asociada al crecimiento celular desregulado (como hiperplasia o cáncer) y después comparando el estado así determinado con el estado de productos génicos de 24P4C12 en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos génicos aberrantes de 24P4C12 en la muestra de prueba comparada con la muestra normal proporciona una indicación de la presencia de crecimiento celular desregulado en las células del individuo.
[0363] En otro aspecto, la invención proporciona ensayos que sirven para determinar la presencia de cáncer en un sujeto, los cuales comprenden la detección de un aumento significativo en la expresión de la proteína o del ARNm de 24P4C12 en una célula de prueba o muestra de tejido en comparación con los niveles de expresión en el tejido o la célula normal correspondiente. La presencia del ARNm de 24P4C12 puede evaluarse, por ejemplo, en tejidos que incluyen, sin carácter limitativo, aquellos incluidos en la Tabla I. La presencia de una expresión significativa de 24P4C12 en cualquiera de estos tejidos sirve para indicar la aparición, presencia y/o gravedad de un cáncer, puesto que los tejidos normales correspondientes no expresan el ARNm de 24P4C12 o lo expresan a niveles inferiores.
[0364] En un modo de realización relacionado, el estado de 24P4C12 puede determinarse en el nivel de proteínas en lugar de en el nivel de ácido nucleico. Por ejemplo, dicho método comprende la determinación del nivel de proteína 24P4C12 expresada por las células en una muestra de tejido de prueba y la comparación del nivel así determinado con el nivel de 24P4C12 expresado en una muestra normal correspondiente. En un modo de realización, la presencia de la proteína 24P4C12 se evalúa, por ejemplo, usando métodos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos de 24P4C12 o asociados de unión capaces de detectar la expresión de proteínas 24P4C12 se usan en un gran número de formatos de ensayo bien conocidos en la técnica con este propósito.
[0365] En otro modo de realización, se puede evaluar el estado de secuencias de aminoácidos y nucleótidos de 24P4C12 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Dichas evaluaciones son útiles porque se observan perturbaciones en las secuencias de aminoácidos y nucleótidos en un gran número de proteínas asociadas a un fenotipo de crecimiento desregulado (véase, p.ej., Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378). Por ejemplo, una mutación en la secuencia de 24P4C12 puede ser indicadora de la presencia o promoción de un tumor. Por lo tanto, dichos ensayos tienen valor predictivo y de diagnóstico cuando una mutación en 24P4C12 indica una pérdida potencial de la función o un aumento del crecimiento del tumor.
[0366] Son bien conocidos en la técnica una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en las secuencias de aminoácidos y nucleótidos. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de los productos génicos de 24P4C12 se observan según los protocolos Northern, Southern, Western, PCR y de secuenciación de ADN expuestos en el presente documento. Además, se conocen bien en la técnica otros métodos para observar perturbaciones en secuencias de aminoácidos y nucleótidos, como el análisis de polimorfismos de conformación monocatenarios (véanse, p.ej., las Patentes de EE.UU. núms. 5.382.510 publicada el 7 de septiembre de 1999 y 5.952.170 publicada el 17 de enero de 1995).
[0367] Además, se puede examinar el estado de metilación de un gen 24P4C12 en una muestra biológica. Con frecuencia, se produce una desmetilación y/o hipermetilación aberrante de las islas CpG en las regiones reguladoras 5’ del gen en las células inmortalizadas y transformadas y pueden resultar en una alteración de varios genes. Por ejemplo, se ha detectado una hipermetilación del promotor de la glutatión de la clase pi S-transferasa (una proteína expresada en la próstata normal pero no en >90% de carcinomas de próstatas) parece silenciar de forma permanente la transcripción de este gen y es la alteración genómica detectada con más frecuencia en carcinomas de próstata (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos un 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN, en inglés) (Brooks et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). En otro ejemplo, la expresión de gen específico del tumor LAGE-I (que no se expresa en próstata normal pero se expresa en un 25-50% de los cánceres de próstata) es inducida por desoxiazacitidina en células linfoblastoides, lo que sugiere que la expresión tumoral se debe a la desmetilación (Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). Se conocen en la técnica una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, pueden utilizarse, en métodos de hibridación Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden segmentar las secuencias que contienen los sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de las islas CpG. Además, la MSP (PCR de metilación específica) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en islas CpG de determinado gen. Este procedimiento implica la modificación inicial del ADN con bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas no metiladas en uracilo), seguida de amplificación, usando cebadores específicos, del ADN metilado frente al no metilado. Los protocolos que implican una interferencia con la metilación pueden encontrarse también por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 12, Frederick M. Ausubel et al., eds 1995.
[0368] La amplificación génica es un método adicional para evaluar el estado de 24P4C12. La amplificación del gen se mide directamente en una muestra, por ejemplo, mediante Southern blotting o Northern blotting convencional, para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77:5201-5205), técnica dot-blot (análisis de ADN) o hibridación in situ utilizando una sonda marcada de forma apropiada, basada en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Como alternativa, se usan anticuerpos que reconocen dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbrido de ADN/ARN o dúplex de la proteína ADN. A su vez, los anticuerpos se marcan y se lleva a cabo el ensayo donde el dúplex está unido a una superficie, de manera que en la formación del dúplex en la superficie, puede detectarse la presencia del anticuerpo unido al dúplex.
[0369] Se puede someter a ensayo de forma conveniente tejido biopsiado o sangre periférica para detectar la presencia de células cancerosas usando, por ejemplo, análisis Northern, dot blot o RT-PCR para detectar la expresión de 24P4C12. La presencia de ARNm de 24P4C12 amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Los ensayos RT-PCR son conocidos en la técnica. En la actualidad, los ensayos de detección RT-PCR de células tumorales en sangre periférica están siendo evaluados para su uso en el diagnóstico y control de varios tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1995, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13:1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688).
[0370] Otro aspecto más de la invención es la valoración de la propensión que tiene un sujeto para desarrollar cáncer. En un modo de realización, un método para predecir la propensión al cáncer comprende la detección del ARNm de 24P4C12 o la proteína 24P4C12 en una muestra de tejido, su presencia indica la predisposición al cáncer, donde el grado de expresión de ARNm de 24P4C12 está correlacionado con el grado de predisponibilidad. En un modo de realización específico, la presencia de 24P4C12 en la próstata u otro tejido puede examinarse, con la presencia de 24P4C12 en la muestra, lo que proporciona una indicación de la propensión al cáncer (o la aparición o existencia de un tumor de próstata). De manera similar, puede evaluarse la integridad de las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de 24P4C12 en una muestra biológica, con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones en los productos génicos 24P4C12 en la muestra es un indicador de predisposición al cáncer (o a la aparición o existencia de un tumor).
[0371] La invención también comprende los métodos para determinar la agresividad del tumor. En un modo de realización, un procedimiento para calcular la agresividad de un tumor comprende determinar el nivel de ARNm de 24P4C12 o de proteína 24P4C12 expresado por células tumorales, comparando el nivel determinado de ese modo con el nivel de ARNm de 24P4C12 o de proteína 24P4C12 expresado en un tejido normal correspondiente tomado del mismo sujeto o en una muestra de referencia de tejido normal, donde el grado de expresión de ARNm de 24P4C12 o proteína 24P4C12 en la muestra del tumor, en comparación con una muestra normal, indica el grado de agresividad. En un modo de realización específico, la agresividad de un tumor se evalúa determinando el alcance en que se expresa 24P4C12 en células tumorales, los niveles de expresión más altos indican tumores más agresivos. Otro modo de realización es la evaluación de la integridad de las secuencias de aminoácidos y nucleótidos en una muestra biológica, con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones indica tumores más agresivos.
[0372] Otro modo de realización de la invención se refiere a procedimientos para observar la progresión de una neoplasia maligna en un sujeto con el paso del tiempo. En un modo de realización, los métodos para observar la progresión de una neoplasia maligna en un sujeto con el paso del tiempo comprenden determinar el nivel de ARNm de 24P4C12 o proteína 24P4C12 expresado por las células en una muestra del tumor, la comparación del nivel determinado de este modo con el nivel de ARNm de 24P4C12 o de la proteína 24P4C12 expresada en una muestra de tejido equivalente tomada del mismo sujeto en otro momento, donde el grado de expresión de ARNm de 24P4C12 o de la proteína 24P4C12 en la muestra de tumor con el paso del tiempo proporciona información sobre la progresión del cáncer. En un modo de realización específico, la progresión de un cáncer puede evaluarse mediante la determinación de la expresión de 24P4C12 en células tumorales con el paso del tiempo, donde el aumento de expresión con el tiempo indica una progresión del cáncer. Asimismo, puede evaluarse la integridad de las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de 24P4C12 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, donde la presencia de una o más perturbaciones indica una progresión del cáncer.
[0373] Las propuestas de diagnóstico anteriores pueden combinarse con cualquiera de una amplia variedad de protocolos de diagnóstico y pronóstico conocidos en la técnica. Por ejemplo, otro modo de realización de la invención se refiere a métodos para observar una coincidencia entra la expresión de gen 24P4C12 y los productos génicos de 24P4C12 (o perturbaciones en el gen 24P4C12 y los productos génicos de 24P4C12) y un factor que está asociado a la neoplasia maligna, como medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido. Pueden utilizarse una amplia variedad de factores asociados a la neoplasia maligna, como la expresión de genes asociados a la neoplasia maligna, así como a observaciones citológicas generales (véanse, por ejemplo, Bocking et al., 1984, Anal. Quant.. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8): 918-24). Los procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de 24P4C12 y los productos génicos de 24P4C12 (o las perturbaciones en el gen 24P4C12 y productos génicos de 24P4C12) y otro factor que se asocia a la neoplasia maligna son útiles, por ejemplo, porque la presencia de un conjunto de factores específicos que coinciden con la enfermedad proporciona información crucial para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido.
[0374] Los procedimientos para detectar y cuantificar la expresión de proteína o ARNm de 24P4C12 se describen en el presente documento, y se conocen bien en la técnica las tecnologías estándar de detección y cuantificaciones de proteína y ácido nucleico. Los métodos estándar para la detección y cuantificación del ARNm de 24P4C12 incluyen la hibridación in situ usando ribosondas de 24P4C12 marcadas, Northern blot y técnicas relacionas que usan sondas de polinucleótidos de 24P4C12, análisis RT-PCR con cebadores específicos de 24P4C12, y otros métodos de detección de tipo amplificación, como ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En un modo de realización específico, se usa RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de 24P4C12. Puede utilizarse cualquier cebador capaz de amplificar 24P4C12 para este propósito, incluyendo, sin carácter limitativo, los diversos grupos de cebadores descritos en el presente documento. En un modo de realización específico, los anticuerpos monoclonales y policlonales reactivos específicamente con la proteína 24P4C12 en estado natural pueden usarse en un ensayo inmunohistoquímico de tejido biopsiado.
VIII.) Identificación de moléculas que interactúan con 24P4C12
[0375] Las secuencias de ácidos nucleicos y de proteínas 24P4C12 divulgadas en el presente documento permiten a un experto identificar las proteínas, moléculas pequeñas y otros agentes que interactúan con 24P4C12, así como las vías de acceso activadas por 24P4C12, a través de cualquiera de entre diversos protocolos aceptados en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse una de los denominados sistemas de “trampa” de interacción (también denominados “ensayos de doble híbrido”). En dichos sistemas, las moléculas interactúan y reconstituyen un factor de transcripción que dirige la expresión de un gen indicador, donde se somete a ensayo la expresión del gen indicador. Otros sistemas identifican interacciones proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional eucariótico, véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. núms. 5.955.280 publicada el 21 de septiembre de 1999, 5.925.523 presentada el 20 de julio de 1999, 5.846.722 presentada el 8 de diciembre de 1998 y 6.004.746 publicada el 21 de diciembre de 1999. Los algoritmos también están disponibles en la técnica para predecir la función proteínica basada en el genoma (véase, p.ej., Marcotte, et al., Nature 402: 4 de noviembre de 1999, 83-86).
[0376] Como alternativa, se pueden cribar las bibliotecas de péptidos para identificar moléculas que interactúan con secuencias de proteínas 24P4C12. En dichos procedimientos, los péptidos que se unen a 24P4C12 se identifican mediante el cribado de bibliotecas que codifican una colección aleatoria o controlada de aminoácidos. Los péptidos codificados por las bibliotecas se expresan como proteínas de fusión de las proteínas de recubrimiento con bacteriófago, después las partículas de bacteriófagos se examinan frente a la proteína o las proteínas 24P4C12.
[0377] En consecuencia, los péptidos que tienen una amplia variedad de usos, como reactivos terapéuticos, de pronóstico o diagnóstico, de este modo se identifican sin ningún tipo de información previa sobre la estructura de la molécula receptora o del ligando esperado. Las bibliotecas de péptidos y métodos de cribado típicos que pueden usarse para identificar las moléculas que interactúan con las secuencias de proteínas 24P4C12 se divulgan, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. núms. 5.723.286 presentada el 3 de marzo de 1998 y 5.733.731 presentado el 31 de marzo de 1998.
[0378] Como alternativa, se utilizan líneas celulares que expresan 24P4C12 para identificar las interacciones proteína-proteína mediadas por 24P4C12. Dichas interacciones pueden examinarse usando técnicas de inmunoprecipitación (véase, p.ej., Hamilton B.J., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). La proteína 24P4C12 puede ser inmunoprecipitada desde las líneas celulares que expresan 24P4C12 utilizando anticuerpos anti-24P4C12. Como alternativa, pueden usarse los anticuerpos contra His-Tag en una línea celular modificada genéticamente para expresar las fusiones de 24P4C12 y un His-Tag (vectores mencionados anteriormente). El complejo inmunoprecipitado puede examinarse para buscar la asociación de proteínas por medio de procedimientos como el Western blot, marcado con S-metionina de proteínas, microsecuenciación de proteínas, tinción con plata y electroforesis bidimensional en gel.
[0379] Las moléculas pequeñas y ligandos que interactúan con 24P4C12 pueden identificarse a través de los modos de realización asociados a estos ensayos de cribado. Por ejemplo, pueden identificarse moléculas pequeñas que interfieren con la función de la proteína, incluidas aquellas que interfieren con la capacidad de 24P4C12 para mediar la fosforilación y desfosforilación, la interacción con moléculas de ADN o ARN como indicación de regulación de los ciclos celulares, señalización de segundos mensajeros
o tumorigénesis. De modo similar, se identifican moléculas pequeñas que modulan el canal iónico asociado a 24P4C12, el transportador, la bomba de proteínas o las funciones de comunicación celular, y se usan para tratar pacientes que tienen un cáncer que expresa 24P4C12 (véase, p.ej., Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, 2ª Ed., Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992). Además, los ligandos que regulan la función de 24P4C12 pueden identificarse basándose en su capacidad para unirse a 24P4C12 y activar un constructo indicador. Por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.928.868 presentada el 27 de julio de 1999, se presentan métodos típicos y se incluyen procedimientos para formar ligandos híbridos en los que al menos un ligando es una molécula pequeña. En un modo de realización ilustrativo, se utilizan células concebidas para expresar una proteína de fusión de 24P4C12 y una proteína de unión a ADN para coexpresar una proteína de fusión de una molécula pequeña o un ligando híbrido y una proteína activadora transcripcional de la biblioteca de ADNc. Las células contienen además un gen indicador, cuya expresión está condicionada por la proximidad entre sí de la primera y segunda proteína de fusión, un acontecimiento que se produce únicamente si el ligando híbrido se une a los sitios diana de ambas proteínas híbridas. Se seleccionan estas células que expresan el gen indicador y se identifica la molécula pequeña desconocida o el ligando desconocido. Este procedimiento proporciona un medio para identificar moduladores que activan o inhiben la 24P4C12.
[0380] Un modo de realización de la presente invención se refiere a un método de cribado para una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 24P4C12 mostrada en la Figura 1, que comprende las etapas de poner en contacto una población de moléculas con una secuencia de aminoácidos de 24P4C12, permitir que la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de 24P4C12 interactúen en condiciones que facilitan una interacción, determinar la presencia de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 24P4C12 y después separar las moléculas que no interacctúan con la secuencia de aminoácidos de 24P4C12 de las moléculas que sí lo hacen. En un modo de realización específico, el método comprende además la purificación, caracterización e identificación de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 24P4C12. La molécula identificada puede usarse para modular una función realizada por 24P4C12. En un modo de realización preferente, la secuencia de aminoácidos de 24P4C12 se poen en contacto con una biblioteca de péptidos.
IX.) Composiciones y métodos terapéuticos
[0381] La identificación de 24P4C12 como una proteína que se expresa normalmente en un grupo restringido de tejidos, pero que también se expresa en cánceres como aquellos enumerados en la Tabla I, abre una variedad de enfoques terapéuticos para el tratamiento de dichos cánceres.
[0382] Cabe destacar que las terapias antitumorales seleccionadas como diana han sido útiles incluso cuando la proteína seleccionada como diana se expresa en tejidos normales, incluso en tejidos de órganos vitales normales. Un órgano vital es necesario para permanecer en vida, como el corazón o el colon. Un órgano no vital es el que puede extirparse tras lo cual el sujeto todavía puede sobrevivir. Los ovarios, el pecho y la próstata son ejemplos de órganos no vitales.
[0383] Por ejemplo, Herceptin® es un fármaco aprobado por la asociación FDA que consiste en un anticuerpo que es inmunoreactivo con la proteína denominada de diversas maneras como HER2, HER2/neu y erb-b-2. Lo comercializa Genentech y ha sido un agente antitumoral con éxito comercial. Las ventas de Herceptin® alcanzaron casi los 400 millones de dólares en 2002. Herceptin® es un tratamiento para el cáncer de mama metastásico HER2 positivo. No obstante, la expresión de HER2 no se limita a dichos tumores. La misma proteína se expresa en una variedad de tejidos normales. En concreto, se sabe que HER2/neu está presente en el corazón y el riñón normales, de este modo estos tejidos están presentes en todos los receptores humanos de Herceptin. La presencia de HER2/neu en riñón normal está confirmada también por Latif, Z., et al., B.J.U. International (2002) 89:5-9. Como se muestra en este artículo (que evaluaba si el carcinoma de célula renal debería ser una indicación preferente para anticuerpos anti-HER2 como el Herceptin), se produce tanto proteína como ARNm en tejidos renales benignos. En concreto, la proteína HER2/neu se sobreexpresaba con fuerza en tejidos renales benignos.
[0384] A pesar de que HER2/neu se expresa en dichos tejidos vitales como en el corazón o el riñón, Herceptin es un medicamento muy útil aprobado por la FDA y exitoso en el mercado. El efecto de Herceptin en el tejido cardíaco, es decir, “cardiotoxicidad” ha sido un mero efecto secundario al tratamiento. Cuando se trataba a los pacientes únicamente con Herceptin, un porcentaje muy bajo de pacientes padeció cardiotoxicidad significativa. Con el fin de minimizar la cardiotoxicidad, hay ciertos requisitos de entrada astringentes para el tratamiento con HER2/neu. Antes de empezar con el tratamiento, se evalúan factores como la predisposición a la cardiopatía.
[0385] Cabe destacar que, aunque se indica que el tejido de riñón muestra la expresión normal, posiblemente incluso una expresión más alta que en el tejido cardíaco, en el riñón no se ha apreciado efecto secundario de ningún tipo al Herceptin. Además, de los numerosos y diversos tejidos normales enlos que se expresa HER2, existe muy poca incidencia de efectos secundarios. Únicamente el tejido cardiaco ha manifestado algún efecto secundario apreciable en lo más mínimo. Un tejido como el riñón, en el que la expresión de HER2/neu es especialmente importante, no ha padecido ningún efecto secundario.
[0386] Además, se han encontrado efectos terapéuticos favorables para las terapias antitumorales que seleccionan como diana el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, en inglés), Erbitux (ImClone). El EGFR también se expresa en abundantes tejidos normales. Existen efectos secundarios muy limitados en tejidos normales después del uso de terapia anti-EGFR. Un efecto secundario de carácter general que aparece con el tratamiento del EGFR es un sarpullido cutáneo severo que se ha observado en el 100% de los pacientes que se han sometido al tratamiento.
[0387] Por lo tanto, la expresión de una proteína diana en tejido normal, incluso en tejido normal vital, no significa un fracaso de la utilidad de un agente dirigido a la proteína como terapia para ciertos tumores en los que también se sobreexpresa la proteína. Por ejemplo, la expresión en órganos vitales no es en sí misma perjudicial. Además, se pueden extirpar órganos considerados prescindibles, como la próstata y los ovarios, sin afectar a la mortalidad. Finalmente, la expresión de órgano normal no afecta a algunos órganos vitales por un inmunoprivilegio. Los órganos inmunoprivilegiados son órganos que se protegen de la sangre mediante una barrera órgano-sangre y, de este modo, no es accesible a la inmunoterapia. El cerebro y los testículos son ejemplos de órganos inmunoprivilegiados.
[0388] En consecuencia, los enfoques terapéuticos que inhiben la actividad de una proteína 24P4C12 son útiles para pacientes de un cáncer que exprese 24P4C12. Estos tratamientos terapéuticos generalmente se clasifican en tres clases. La primera clase modula la función de 24P4C12, puesto que se refiere al crecimiento celular tumoral que provoca la inhibición o retraso del crecimiento celular del tumor o que induce su muerte. La segunda clase comprende varios métodos para inhibir la unión o asociación de una proteína 24P4C12 a su ligando o a otras proteínas. La tercera clase comprende una variedad de procedimientos para inhibir la transcripción de un gen 24P4C12 o la traducción de un ARNm de 24P4C12.
IX.A.) Vacunas contra el cáncer
[0389] La invención proporciona vacunas contra el cáncer que comprenden una proteína relacionada con 24P4C12 o un ácido nucleico relacionado con 24P4C12. Considerando la expresión de 24P4C12, las vacunas contra el cáncer previenen y/o tratan los cánceres que expresan 24P4C12 con efectos mínimos
o sin ningún efecto sobre los tejidos no diana. El uso de un antígeno tumoral es una vacuna que genera respuestas inmunes humorales mediadas por células,como terapia contra el cáncer, es conocido en la técnica y se ha empleado en el cáncer de próstata usando inmunógenos PAP de roedores y PSMA humano (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159:3113-3117).
[0390] Dichos procedimientos pueden practicarse fácilmente empleando una proteína relacionada con 24P4C12 o una molécula de ácido nucleico que codifica 24P4C12 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno 24P4C12 (que comprende típicamente una variedad de epítopos de células T o anticuerpo). Los expertos en este campo conocen una amplia variedad de sistemas de vacuna para la administración de epítopos inmunorreactivos (véanse, p.ej., Heryln et al., Ann Med 1999 Feb 31(1):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3):123-32). En resumen, dichos métodos para generar una respuesta inmune (p.ej., mediada por células y/o humoral) en un mamífero comprenden los pasos de: exponer el sistema inmunológico del mamífero a un epítopo inmunorreactivo (p.ej., un epítopo presente en una proteína 24P4C12 mostrada en la Figura 1 o un análogo u homólogo de la misma) de manera que el mamífero genere una respuesta inmune que sea específica de este epítopo (p.ej., genere anticuerpos que reconocen específicamente ese epítopo).
[0391] La proteína 24P4C12 completa, regiones inmunogénicas o epítopos de la misma pueden combinarse y administrarse por varios medios. Estas composiciones de vacunas pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (p.ej., Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), composiciones de péptidos encapsuladas en microesferas de poli(DL-láctido-co-glicólido) (“PLG”) (véanse, p.ej., Eldridge et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso et al., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13:675-681,1995), composiciones peptídicas contenidas en complejos inmunoestimulantes (ISCOMS) (véanse, p.ej., Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990, Hu et al., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998), sistemas de múltiples péptidos de antígenos (MAPs) (véanse, p.ej., Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para su uso en sistemas de administración balística, péptidos típicamente cristalizados, vectores virales de administración (Perkus, M. E. et al.,en: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535, 1986; Hu,
S.L. et al., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.P. et al., AIDS Biol Technology 4:790, 1986; Top, F.H. et al., J.Infect. Dis. 124:148, 1971; Chanda, P.K. et al., Virology 175:535, 1990), partículas de origen viral o sintético (p.ej., Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldridge, J.H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L.D., Jr. et al., Nature Med. 7:649, 1995), adyuvantes (Warren, H.S., Vogel, F.R., y Chedid, L.A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R.K. et al., Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K.L., Immunol. Today 17:131, 1996) o ADNc desnudo o de partículas absorbidas (Ulmer, J.B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H.L., Hunt, L.A., y Webster, R.G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J.W. et al., en: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996; Cease, K.B., y Berzofsky, J. ., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 y Elridge, J.H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993). También pueden usarse tecnologías de administración dirigida a toxinas, también conocidas como diana mediada por receptor, como aquellos de Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachussetts).
[0392] En los pacientes con cáncer asociado a 24P4C12, las composiciones de anticuerpo y de vacuna pueden usarse también junto con otros tratamientos contra el cáncer, p.ej., cirugía, quimioterapia, terapias con fármacos, radioterapias, etc., incluyendo el uso en combinación junto con adyuvantes inmunes como IL-2, IL-12, GM-CSF y similares.
Vacunas celulares:
[0393] Pueden determinarse epítopos de CTL usando algoritmos específicos para identificar péptidos en una proteína 24P4C12 que se unan a los alelos correspondientes de HLA (p.ej., Brown University, BIMAS, y SYFPEITHI). En un modo de realización preferente, un inmunógeno de 24P4C12 puede contener una o más secuencias de aminoácidos identificadas por técnicas bien conocidas en este campo, como las secuencias mostradas en las Tablas previamente divulgadas o un péptido de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos especificados por un motivo/supermotivo de HLA de Clase I (p.ej., Tabla IV (A), Tabla IV
(D)
o Tabla IV (E)) y/o un péptido de al menos 9 aminoácidos que comprenden un motivo/supermotivo de HLA de Clase II (p.ej., Tabla IV (B) o Tabla IV (C)). Como se aprecia en la técnica, el surco de unión de HLA de Clase I es esencialmente de extremo cerrado de modo que sólo los péptidos de un rango determinado de tamaño puedan encajar en el surco y unirse, generalmente los epítopos de HLA de Clase I tienen una longitud de 8, 9, ,10 u 11 aminoácidos de longitud. En cambio, el surco de unión de HLA de Clase II es esencialmente de extremo abierto; por lo tanto, un péptido de aproximadamente 9 o más aminoácidos puede ser unido por una molécula de HLA de clase II. Debido a las diferencias entre los surcos de unión de HLA de Clase I y de Clase II, los motivos de HLA de Clase I son de longitud específica, es decir que la posición dos de un motivo de Clase I es el segundo aminoácido en la dirección de amino a carboxilo del péptido. Las posiciones de los aminoácidos en un motivo de Classe II son relativas sólo la una con la otra, no del péptido total, i.e., pueden unir aminoácidos adicionales al extremo amino y/o carboxilo de una secuencia portadora de motivos. A menudo, los epítopos de HLA de Clase II son de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud o más largos que de 25 aminoácidos.
[0394] En la técnica son conocidos diversos métodos para generar una respuesta inmune en un mamífero (por ejemplo, como primer paso en la generación de hibridomas). Los métodos para generar una respuesta inmune en un mamífero consisten en exponer el sistema inmunológico del mamífero a un epítopo inmunogénico sobre una proteína (p.ej. una proteína 24P4C12) de modo que se genere una respuesta inmune. Un modo de realización típico consiste en un método para generar una respuesta inmune a 24P4C12 en un huésped, mediante el contacto del huésped con una cantidad suficiente de al menos una célula B de 24P4C12 o el epítopo de célula T citotóxica o análogo de la misma; y al menos un intervalo de tiempo tras el cual se vuelve a poner en contacto el huésped con la célula B de 24P4C12
o con el epítopo de célula T citotóxica o análogo de la misma. Un modo de realización específico consiste en un método para generar una respuesta inmune contra una proteína relacionada con 24P4C12 o contra un péptido multiepitópico artificial que comprende la administración del inmunógeno de 24P4C12 (p.ej., una proteína 24P4C12 o un fragmento de péptido de la misma, una proteína de fusión de 24P4C12 o análogo, etc.) en una preparación de vacuna a un humano u otro mamífero. Normalmente, dichas preparaciones de vacunas contienen además un adyuvante adecuado (véase, p.ej., la Patente de EE.UU. Nº 6.146.635) o un epítopo auxiliar universal como un péptido PADRETM (Epimmune Inc., San Diego, CA; véanse, p.ej., Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3):16251633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 7992). Un procedimiento alternativo consiste en generar una respuesta inmune en un sujeto contra un inmunógeno de 24P4C12 mediante: la administración in vivo en el músculo o en la piel del cuerpo del sujeto de una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un imnunógeno de 24P4C12, la secuencia de ADN unida operativamente a las secuencias reguladoras que controlan la
expresión de la secuencia de ADN; donde la molécula de ADN es recogida por las células, la secuencia de ADN se expresa en las células y se genera una respuesta inmune contra el inmunógeno (véase, p.ej., la Patente de EE.UU. Nº 5.962.428). Opcionalmente, también se administra un facilitador genético de vacuna como lípidos aniónicos; saponinas; lectinas; compuestos estrogénicos, alquilos inferiores hidroxilados; dimetilsulfóxido y urea. Además, se puede administrar un anticuerpo antiidiotípico que imite 24P4C12, con el fin de generar una respuesta al antígeno diana.
Vacunas de ácido nucleico
[0395] Las composiciones de vacuna descritas en la invención incluyen modalidades mediadas por ácidos nucleicos. Al paciente puede administrarse ADN o ARN que codifica la proteína o proteínas de la invención. Pueden emplearse procedimientos de inmunización genética para generar respuestas inmunes celulares y humorales terapéuticas o profilácticas dirigidas contra las células cancerosas que expresan 24P4C12. Pueden inyectarse directamente en los músculos o la piel de un individuo las construcciones que comprenden ADN que codifica una proteína/inmunógeno relacionados con 24P4C12 y secuencias reguladoras apropiadas, de modo que las células del músculo o de la piel absorban la construcción y expresen la proteína/inmunógeno codificado de 24P4C12. Como alternativa, una vacuna comprende una proteína relacionada con 24P4C12. La expresión del inmunógeno de la proteína relacionada con 24P4C12 da como resultado la generación de la inmunidad humoral y celular profiláctica
o terapéutica frente a las células que portan una proteína 24P4C12. Pueden usarse varias técnicas de inmunización genética profiláctica y terapéutica bien conocidas en la técnica. La administración basada en ácidos nucleicos se describe, por ejemplo, en Wolff et al., Science 247:1465 (1990) así como las Patentes de EE.UU. núms. 5.580.859, 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647: WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de administración basada en ADN incluyen el “ADN desnudo”, administración facilitada (bupivicaína, polímeros, mediada por péptidos), complejos de lípidos catiónicos y administración mediada por partículas (“pistola de genes”) o mediada por presión (véase, p.ej., la Patente de EE.UU. Nº 5.922.687).
[0396] Con fines de una inmunización profiláctica o terapéutica, las proteínas de la invención pueden expresarse a través de vectores víricos o bacterianos. Los diversos sistemas de administración de genes vírica que pueden usarse en la práctica de la presente invención incluyen, sin carácter limitativo, vaccinia, viruela aviar viruela del canario, adenovirus, gripe, poliovirus, virus adenoasociados, lentivirus y virus sindbis (véanse, p.ej., Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663, Tsang et al., J. Natl. Cancer Inst. 87:982-990 (1995)). También se pueden utilizar sistemas de administración no víricos introduciendo ADN desnudo que codifica una proteína relacionada con 24P4C12 en el paciente (p.ej., por vía ntramuscular o intradérmica) para inducir una respuesta antitumoral.
[0397] El virus vaccinia se utiliza, por ejemplo, como vector para expresar las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la invención. En la introducción en un huésped, el virus vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico de la proteína y, de este modo, provoca una respuesta inmune del huésped. Los vectores de vaccinia y métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.722.848. Otro vector es el BCG (Bacilo de Calmette-Guerin). Los vectores de BCG se describen en Stover et al., Nature 351:456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores que sirven para la administración o inmunización terapéutica de los péptidos de la invención, p.ej., vectores adenovíricos y víricos adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina del ántrax desintoxicada y similares, será evidente para los expertos en la técnica a partir de la presente descripción.
[0398] Por consiguiente, los sistemas de administración génica se utilizan para administrar una molécula de ácido nucleico relacionada con 24P4C12. En un modo de realización, se utiliza ADNc de 24P4C12 humano de longitud completa. En otro modo de realización, se emplean moléculas de ácido nucleico de 24P4C12 que codifican linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos y/o epítopos de anticuerpos.
Vacunas ex vivo
[0399] También pueden emplearse diversas estrategias ex vivo para generar una respuesta inmune. Una posibilidad implica el uso de células que presentan el antígeno (APC, en inglés) como células dendríticas (DC, en inglés), para presentar el antígeno de 24P4C12 al sistema inmunológico del paciente. Las células dendríticas expresan moléculas de MHC de clase I y II, el coestimulador de B7 e IL-12, y, por ello, son células altamente especializadas que presentan el antígeno. En el cáncer de próstata, se están utilizando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) en ensayos clínicos de Fase I para estimular los sistemas inmunológicos de pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28:65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29:371-380). Por lo tanto, pueden utilizarse células dendríticas para presentar péptidos de 24P4C12 a las células T en el contexto de las moléculas de MHC de Clase I o II. En un modo de realización, las células dendríticas autólogas pueden pulsarse con péptidos de 24P4C12 capaces de unirse a moléculas de MHC de clase I y/o clase II. En otro modo de realización, las células dendríticas se pulsan con la proteína 24P4C12 completa. En otro modo de realización, también se describe la modificación de la sobreexpresión de un gen de 24P4C12 en las células dendríticas mediante el uso de varios vectores de implementación conocidos en la técnica, como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer gene Ther. 4:1725), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer. Res. 56:3763-3770), lentivirus, virus adenoasociado, transfección de ADN (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869), o transfección de ARN derivado del tumor (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186:1177-1182). Las células que expresan 24P4C12 también pueden modificarse genéticamente para expresar moduladores inmunes, como GM-CSF y usarse como agentes inmunizadores.
IX.B.) 24P4C12 como diana para la terapia basada en anticuerpos.
[0400] 24P4C12 es una diana atractiva para las estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Se conoce en la técnica numerosas estrategias de anticuerpo para seleccionar como diana moléculas extracelulares e intracelulares (véase, p.ej., la muerte mediada por ADCC y su complemento, así como el uso de intracuerpos). Puesto que 24P4C12 es expresada por las células cancerosas de varios linajes en relación con las células normales correspondientes, se prepara la administración sistémica de composiciones inmunorreactivas a 24P4C12 que presenten una sensibilidad excelente sin efectos tóxicos, no específicos y/o no dirigidos a la diana provocados por la unión de la composición inmunorreactiva a órganos y tejidos no diana. Los anticuerpos específicamente reactivos con los dominios de 24P4C12 son útiles para tratar sistemáticamente los cánceres que expresan 24P4C12, bien como conjugados con una toxina o agente terapéutico, o bien como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la función o proliferación celular.
[0401] Los anticuerpos de 24P4C12 pueden introducirse en un paciente de forma que el anticuerpo se una a 24P4C12 y module una función, como una interacción con un asociado de unión y, por tanto, medie en la destrucción de las células tumorales y/o inhiba el crecimiento de células tumorales. Los mecanismos mediante los cuales estos anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir citolisis mediada por el complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, modulación de la función fisiológica de 24P4C12, inhibición de la unión del ligando o de las vías de transducción de señal, modulación de la diferenciación de células tumorales, alteración de los perfiles de factores de angiogénesis tumoral y/o apoptosis.
[0402] Aquellos expertos en la técnica entienden que pueden usarse anticuerpos para dirigirse y unir específicamente moléculas inmunogénicas como una región inmunogénica de una secuencia de 24P4C12 mostrada en la Figura 1. Además los expertos entienden que es rutinario conjugar los anticuerpos a los agentes citotóxicos (véase, p.ej., Slevers et al. Blood 93:11 3678-3684 (1 de junio de 1999)). Cuando se administran agentes terapéuticos o citotóxicos directamente a las células, como mediante su conjugación con los anticuerpos específicos de una molécula expresada por esta célula (p.ej., 24P4C12), el agente citotóxico ejercerá su efecto biológico conocido (es decir, la citotoxicidad) en aquellas células.
[0403] Se conoce en la técnica una amplia variedad de composiciones y métodos para usar conjugados de agente citotóxico/anticuerpo para matar células. En el contexto de los cánceres, los métodos típicos conllevan la administración a un animal que tiene un tumor de una cantidad biológicamente eficaz de un conjugado que comprende un agente terapéutico y/o citotóxico seleccionado unido a un agente seleccionado como diana (p.ej. un anticuerpo anti-24P4C12) que se une a un marcador (p.ej. 24P4C12) expresado, accesible a la unión o localizado sobre las superficies celulares. Un modo de realización típico de administración de un agente terapéutico y/o citotóxico a una célula que expresa 24P4C12, que comprende la conjugación del agente citotóxico a un anticuerpo que se une de forma inmunoespecífica a un epítopo de 24P4C12 y la exposición de la célula al conjugado anticuerpo-agente. Otro modo de realización ilustrativo es un método para tratar a un sujeto que se sospecha que padece cáncer con metástasis, que comprende el paso de administrar por vía parenteral a dicho sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado a un agente terapéutico y/o citotóxico.
[0404] La inmunoterapia del cáncer que usa anticuerpo anti 24P4C12 puede realizarse según varios estudios que se han empleado con éxito en el tratamiento de otros tipos de cáncer, incluyendo, sin carácter limitativo, el cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90:2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996,
J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581589), cáncer colorrectal (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166, Velders et al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403) y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Algunos enfoques terapéuticos implican la conjugación del anticuerpo desnudo a una toxina o radioisótopo, como la conjugación de Y91 o I131 a los anticuerpos anti-CD20 (p.ej., ZevalinTM, IDEC Pharmaceutical Corp. o BexxarTM, Coulter Pharmaceuticals), mientras otros implican la coadministración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, como HerceptinTM (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Los anticuerpos pueden conjugarse a un agente terapéutico. Para tratar el cáncer de próstata, por ejemplo, se pueden administrar anticuerpos de 24P4C12 junto con radiación, quimioterapia o ablación hormonal. Además, los anticuerpos pueden conjugarse con una toxina como calicheamicina (p.ej., MylotargTM, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ, un anticuerpos IGg4 kappa humanizado recombinante conjugado al antibiótico antitumoral calicheamicina) o un maitansinoide (p.ej., plataforma del profármaco activado en el tumor (TAP, en inglés) basado en taxano, InmunoGen, Cambridge, MA; véase también, p.ej., la Patente de EE.UU. 5.416.064) o Auristatina E (Nat. Biotechnol. 2003 Jul; 21(7):778-84. (Seattle Genetics)).
[0405] Aunque la terapia con anticuerpos de 24P4C12 es adecuada para todos los estadios del cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser especialmente apropiada en canceres avanzados o metastásicos. El tratamiento con terapia de anticuerpos de la invención está indicado para pacientes que han recibido una o más sesiones de quimioterapia. Como alternativa, la terapia con anticuerpos de la invención se combina con un régimen de radiación o quimioterapia para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Además, la terapia de anticuerpos puede permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, en concreto en pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico. Fan et al. (Cancer Res. 53:4637-4642, 1993), Prewett et al. (International J. of Onco. 9:217-224, 1996) y Hancock et al. (Cancer Res. 51:4575-4580, 1991) describen el uso de varios anticuerpos junto con agentes quimioterapéuticos.
[0406] Aunque la terapia con anticuerpos de 24P4C12 es útil para todos los estadios del cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser especialmente apropiada en cánceres avanzados o metastásicos. El tratamiento de terapia con anticuerpos descrito en la presente invención está indicado para pacientes que han recibido una o más sesiones de quimioterapia. Como alternativa, la terapia de anticuerpos de la invención se combina con un régimen de radiación o de quimioterapia para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Además, la terapia con anticuerpos puede permitir el uso de dosis de quimioterapia concomitante, en concreto en pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
[0407] Los pacientes de cáncer pueden ser evaluados para detectar la presencia y el nivel de expresión de 24P4C12, usando preferiblemente evaluaciones inmunohistoquíimicas de tejido tumoral, diagnóstico por imágenes de 24P4C12 cuantitativo, u otras técnicas que indican de forma fiable la presencia y grado de expresión de 24P4C12. Para este propósito, se prefiere el análisis inmunohistoquímico de biopsias tumorales o muestras quirúrgicas. Los métodos para el análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son bien conocidos en la técnica.
[0408] Entre los anticuerpos monoclonales anti-24P4C12 que tratan el cáncer de próstata y otros cánceres se incluyen aquellos que inician una potente respuesta inmune frente al tumor o aquellos que son directamente citotóxicos. En este sentido, los anticuerpos monoclonales (mAbs, en inglés) anti24P4C12 pueden provocar la lisis celular tumoral por medio de mecanismos de citotoxicidad mediada por el complemento o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), ambos requieren una porción Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con los sitios receptores Fc de las células efectoras en las proteínas del complemento. Además, los mAb anti-24P4C12 que ejercen un efecto biológico directo en el crecimiento del tumor sirven para tratar cánceres que expresan 24P4C12. Los mecanismos mediantes los cuales los mAb directamente citotóxicos actúan incluyen: inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles de factores por angiogénesis tumoral y la inducción de apoptosis. El mecanismo o mecanismos por los cuales un mAb anti-24P4C12 concreto ejerce un efecto antitumoral se evalúan usando cualquiera de los ensayos in vitro que evalúan la muerte celular, como la lisis celular mediada por el complemento, ADCC, ADMMC y otros, como se conocen generalmente en la técnica.
[0409] En algunos pacientes, el uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros no humanos, o mAb quiméricos humanos/ratón puede inducir respuestas inmunes de moderadas a fuertes frente al anticuerpo no humano. Esto puede resultar en la eliminación del anticuerpo de la circulación y una eficacia reducida. En los casos más graves, una respuesta inmune como ésta puede conducir a la formación extensiva de complejos inmunes que, potencialmente, pueden causar insuficiencia renal. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales preferentes usados en los métodos terapéuticos de la invención son aquellos que son totalmente humanos o humanizados y que se unen específicamente al antígeno de 24P4C12 diana con alta afinidad pero que presentan poca antigenicidad, o ninguna, en el paciente.
[0410] Los métodos terapéuticos de la invención contemplan la administración de mAb anti-24P4C12 sencillos así como combinaciones o cócteles de diferentes mAbs. Dichos cócteles de mAb pueden presentar ciertas ventajas, ya que contienen mAbs que eligen como diana a diferentes epítopos, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente los mAbs citotóxicos con los mAb que dependen de la funcionalidad efectora inmunológica. Estos mAbs combinados pueden presentar efectos terapéuticos sinérgicos. Además, pueden administrarse los mAbs anti-24P4C12 de modo concomitante con otras modalidades terapéuticas, incluyendo, sin carácter limitativo, varios agentes biológicos o quimioterapéuticos, bloqueadores de andrógenos, moduladores inmunitarios (p.ej., IL-2, GM-CSF), cirugía o radiación. Los mAbs de 24P4C12 se administran en su forma “desnuda” o no conjugada, o pueden tener un agente o agentes terapéuticos conjugados a los mismos.
[0411] Las formulaciones del mAb de 24P4C12 se administran por cualquier vía capaz de administrar los anticuerpos a una célula tumoral. Las vías de administración incluyen, sin carácter limitativo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica y similares. Generalmente, el tratamiento implica la administración repetida de la preparación de mAbs de 24P4C12 por cualquier vía de administración aceptable como la inyección intravenosa (IV), normalmente con una dosis en el rango, que incluye, sin carácter limitativo, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0;8; 0,9; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 15; 20 o 25 mg por kg de peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-1000mg de mAb por semana son eficaces y se toleran bien.
[0412] En base a la experiencia clínica con el Herceptin® (Trastuzumab) en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4mg/kg de peso corporal del paciente IV, seguido de dosis semanales de aproximadamente 2mg/kg IV de la preparación de mAb representa un régimen de dosis aceptable. Preferentemente, la dosis de carga inicial se administra vía infusión de unos 90 minutos o más. La dosis periódica de mantenimiento se administra como infusión de 30 minutos o más, siempre y cuando la dosis inicial se haya tolerado bien. Como pueden apreciar los expertos en la materia, diversos factores pueden influir en el régimen de dosis ideal en un caso particular. Estos factores incluyen, por ejemplo, la afinidad de unión y la vida media de los mAbs utilizados, el grado de expresión de 24P4C12 en el paciente, el alcance del antígeno circulante de 24P4C12, el nivel deseado de concentración de anticuerpo permanente, la frecuencia del tratamiento y la influencia de los agentes quimioterapéuticos u otros agentes usados en combinación con el método de tratamiento descrito en la invención, así como el estado de salud de un paciente concreto.
[0413] Opcionalmente, los pacientes deberían ser evaluados para determinar los niveles de 24P4C12 en una muestra determinada (p.ej., los niveles de antígeno circulante de 24P4C12 y/o células que expresan 24P4C12) con el fin de facilitar la determinación del régimen de dosis más efectivo, etc. Dichas evaluaciones se usan también con fines de control durante la terapia, y sirven para determinar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (por ejemplo, citología de orina y/o niveles de ImmunoCyt en la terapia del cáncer de vejiga o, por analogía, niveles séricos de PSA en la terapia del cáncer de próstata).
[0414] Los anticuerpos anti-24p4C12 antiidiotípicos también pueden usarse en la terapia contra el cáncer como vacuna para inducir una respuesta inmune en las células que expresan una proteína relacionada con 24P4C12. En concreto, se conoce bien en la técnica la generación de anticuerpos antiidiotípicos; esta metodología puede adaptarse fácilmente para generar anticuerpos anti-24P4C12 antiidiotípicos que imiten un epítopo en una proteína relacionada con 24P4C12 (véanse, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16:33-40; Foon et al. 1995, J. Clin. Invest. 96:334-342, Herelyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76). Un anticuerpo antiidiotípico puede utilizarse en estrategias de vacunas contra el cáncer.
[0415] Un objetivo de la presente invención es proporcionar mAbs de 24P4C12, que inhiben o retrasan el crecimiento de células tumorales que expresan 24P4C12. Otro propósito de la invención es proporcionar métodos para inhibir la angiogénesis y otras funciones biológicas y, de este modo, reducir el crecimiento tumoral en los mamíferos, preferentemente en humanos, usando dichos mAb de 24P4C12, y en concreto, usando dichos mAbs de 24P4C12 combinados con otros fármacos o tratamientos inmunológicamente activos, incluyendo, sin carácter limitativo: Avastin® (bevacizumab), Sutent® (malato de sunitinib), Nexavar® (tosilato de sorafinib), Taxotere® (docetaxel), Interleukin-2 (conocido como Proleukin®, IL-2 o Aldesleucina), Interferón Alfa (Interferón-Alfa-2a o Interferón-Alfa-2b), Paraplatin® (carboplatino) o Gemzar® (gemcitibina) y otros conocidos en la técnica para tratar diferentes tipos de cáncer.
[0416] En un modo de realización, existe sinergia cuando los tumores, incluidos los tumores humanos, se tratan con anticuerpos de 24P4C12 junto con agentes quimioterapéuticos, radiación o combinaciones de los mismos. En otras palabras, la inhibición del crecimiento tumoral por un anticuerpo de 24P4C12 mejora más de lo esperado cuando se combina con agentes quimioterapéuticos o radiación o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se mostrará sinergia por inhibición mayor de crecimiento del tumor con tratamiento combinado que la que se espera para un tratamiento únicamente de anticuerpos de 24P4C12 o el efecto aditivo del tratamiento con un anticuerpo de 24P4C12 y un agente quimioterapéutico o radiación. Preferentemente, la sinergia se muestra por remisión del cáncer en que no se espera reminisión del tratamiento ya sea de un anticuerpo de 24P4C12 desnudo o con tratamiento que usa una combinación aditiva de un anticuerpo de 24P4C12 y un agente quimioterapéutico o radiación.
[0417] El procedimiento para inhibir el crecimiento de células tumorales usando un anticuerpo de 24P4C12 y una combinación de quimioterapia o radiación o ambas consiste en la administración del anticuerpo 24P4C12 antes, durante y después de empezar la quimioterapia o radioterapia, así como cualquier combinación de las mismas, (es decir, antes y durante, antes y después, durante y después, o antes, durante y después de empezar la quimioterapia y/o radioterapia). Por ejemplo, normalmente se administra el anticuerpo de 24P4C12 entre 1 y 60 días, preferentemente entre 3 y 40 días, más preferentemente entre 5 y 12 días antes de empezar la radioterapia y/o quimioterapia. Sin embargo, dependiendo del protocolo de tratamiento y las necesidades específicas del paciente, el método se practica de un modo que proporciona el tratamiento más eficaz y que básicamente prolonga la vida del paciente.
[0418] La administración de agentes quimioterapéuticos puede llevarse a cabo de diferentes modos incluidos el sistemático por las vías parenteral y enteral. En un modo de realización, el anticuerpo de 24P4C12y el agente quimioterapéutico se administran como moléculas separadas. En otro modo de realización, se adjunta el anticuerpo 24P4C12, por ejemplo, mediante conjugación, a un agente quimioterapéutico. (Véase el Ejemplo titulado “Ensayos clínicos en seres humanos para el tratamiento y diagnóstico de carcinomas humanos mediante el uso de anticuerpos monoclonales de 24P4C12”). Ejemplos concretos de agentes quimioterapéuticos o de quimioterapia incluyen cisplatino, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina (mostaza de nitrógeno), estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, interferón alfa, leuprolida, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromano, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, clorambucilo, taxol y combinaciones de los mismos.
[0419] La fuente de radiación, usada en combinación con un mAb de 24P4C12, puede ser tanto externa como interna al paciente tratado. Cuando la fuente es externa al paciente, la terapia recibe el nombre de radioterapia de haz externo (EBRT, en inglés). Cuando la fuente de radiación es interna al paciente, el tratamiento se denomina braquiterapia (BT).
[0420] Los regímenes terapéuticos descritos anteriormente pueden además ser combinados con regímenes y/o agentes que tratan cáncer adicionales, por ejemplo, quimioterapia adicional, vacunas contra el cáncer, inhibidores de la transducción de señales, agentes útiles para el tratamiento de cáncer
o crecimiento celular anormal, anticuerpos (p.ej., anticuerpos anti-CTLA-4 como se describe en WO/2005/092380 (Pfizer)) u otros ligandos que inhiben el crecimiento tumoral mediante la unión a IGF1R y citocinas.
[0421] Cuando el mamífero está sometido a quimioterapia adicional, pueden usarse los agentes quimioterapéuticos señalados anteriormente. Además, pueden utilizarse inhibidores del factor de crecimiento, modificadores de la respuesta biológica, terapia antihormonal, moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERM, en inglés), inhibidores de la angiogénesis y antiandrógenos como Casodex (4’-ciano-3-(4-fluorofenilsulfonil)-2-hidroxi-2-metil-3-‘-(trifluorometil)propionanilida).
[0422] En determinados modos de realización de la invención, los procedimientos descritos anteriormente se combinan con una vacuna contra el cáncer. Las vacunas útiles pueden ser, sin carácter limitativo, aquellas compuestas de antígenos asociados al cáncer (p.ej. BAGE, antígeno carcinoembrionario (CEA), EBV, GACE, gp100 (incluidos gp100:209-217 y gp100:280-288, entre otros), HBV, HER-2/neu, HPV, HCV, MAGE, mamaglobina, MART-1/Melan-A, Mucina-1, NY-ESO-1, proteinasa3, PSA, RAGE, TRP-1, TRP-2, Tirosinasa (p.ej., Tirosinasa: 368-376), WT-1), ADN GM-CSF y vacunas basadas en células, vacunas de células dendríticas, vacunas con virales (p.ej., virus vaccinia) recombinantes y vacunas de proteínas de choque térmico (HSP). Entre las vacunas útiles también se incluyen vacunas tumorales, como las formadas de células del melanoma y pueden ser autólogas o alogénicas. Las vacunas pueden estar basadas, por ejemplo, en células, ADN o péptidos. Estos agentes pueden combinarse de modo que una combinación que comprenda, entre otros, péptidos gp100, Tirosinasa y MART-1 pueda ser administrada con el anticuerpo.
[0423] Se administrarán las vacunas antes, o tras, el trasplante de células madre y cuando la quimioterapia forma parte del régimen, puede administrarse una vacuna antes de la quimioterapia. En ciertos modos de realización, el anticuerpo de la invención también puede administrarse antes de la quimioterapia. También puede administrarse la vacuna después del trasplante de células madre y en ciertos modos de realización simultáneamente con el anticuerpo.
[0424] Los tratamientos descritos anteriormente también pueden usarse con inhibidores de la transducción de señales, como los agentes que pueden inhibir las respuestas del EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), como anticuerpos del EGFR, anticuerpos del EGF y moléculas que son inhibidores del EGFR; inhibidores del VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), como receptores del VEGF y moléculas que pueden inhibir el VEGF; e inhibidores del receptor de erbB2, como anticuerpos o moléculas orgánicas que se unen al receptor erbB2.
[0425] Los inhibidores del EGFR se describen, por ejemplo, en WO 95/19970 (publicada el 27 de julio de 1995), Wo 98/14451 (publicada el 9 de abril de 1998), WO 98/02434 (publicada el 22 de enero de 1998) y la Patente de EE.UU. Nº 5.747.498 (publicada el 5 de mayo de 1998), y dichas sustancias pueden usarse en la presente invención como se describe en este documento. Entre los agentes que inhiben el EGFR se incluyen, sin carácter limitativo, los anticuerpos monoclonales ERBITUX (ImClone Systems Incorporated de Nueva York, N.Y.), y VECTIBIX (AMGEN Fremont Inc. de Fremont, Calif.), los compuestos ZD-1839 (AstraZeneca), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), MDX-447 (Medarex Inc. de Annandale, Nueva Jersey), y OLX-103 (Merck & Co. de Whitehouse Station, N.J.), VRCTC-310 (Ventech Research) y toxina de fusión del EFG (Seragen Inc. de Hopkinton, Mass.). Estos y otros agentes que inhiben el EGFR pueden usarse en la presente invención.
[0426] Los inhibidores del VEGF, por ejemplo, SU-5413 y SU-6668 (Sugen Inc. de South San Francisco, Calif.) también pueden emplearse en combinación con el anticuerpo. Los inhibidores del VEGF se describen, por ejemplo, en WO 99/2440 (publicada el 20 de mayo de 1999), la solicitud internacional PCT WO 99/62890 (presentada el 3 de mayo de 1999), WO 95/21613 (publicada el 17 de agosto de 1995), WO 99/61422 (publicada el 2 de diciembre de 1999), la Patente de EE.UU. Nº 5.834.504 (publicada el 10 de noviembre de 1998); WO 98/50356 (publicada el 12 de noviembre de 1998), la Patente de EE.UU. Nº 5.883.113 (publicada el 16 de marzo de 1999), la Patente de EE.UU. Nº 5.886.020 (publicada el 23 de marzo de 1999), la Patente de EE.UU. Nº 5.792.783 (publicada el 11 de agosto de 1998), WO 99/10349 (publicada el 4 de marzo de 1999), WO 97/32856 (publicada el 12 de septiembre de 1997), WO 97/22596 (publicada el 26 de junio de 1997), WO 98/54093 (publicada el 3 de diciembre de 1998), WO 98/02438 (publicada el 22 de enero de 1998), WO 99/16755 (publicada el 8 de abril de 1999) y WO 98/02437 (publicada el 22 de enero de 1998). Otros ejemplos de algunos inhibidores del VEGF específicos útiles en la presente invención son IM862 (Cytran Inc. de Kirkland, Wash.); angiozima y anticuerpo IMC-1C11 Imclone, una ribozima sintética de Ribozyme (Boulder, Colo.) y Chiron (Emeryville, Calif.).
[0427] Los inhibidores del receptor ErbB2, como GW-282974 (Glaxo Wellcome) y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc. de The Woodlands, Tex.) y 2B-1 (Chiron), pueden combinarse además con el anticuerpo, por ejemplo, aquellos indicados en WO 98/02434 (publicada el 22 de enero de 1998), WO 99/35146 (publicada el 15 de julio de 1999), WO 99/35132 (publicada el 15 de julio de 1999), WO 98/02437 (publicada el 22 de enero de 1998), WO 97/13760 (publicada el 17 de abril de 1997), WO 95/19970 (publicada el 27 de julio de 1995), la Patente de EE.UU. Nº 5.587.458 (publicada el 24 de diciembre de 1996) y la Patente de EE.UU. Nº 5.877.305 (publicada el 2 de marzo de 1999). Los inhibidores del receptor erbB2 útiles en la presente invención también se describen en EP1029853 (publicada el 23 de agosto de 2000) y en WO 00/44728 (publicada el 3 de agosto de 2000). La sustancia y compuestos del inhibidor del receptor erbB2 descritas en las solicitudes de PCT, patentes estadounidenses y solicitudes provisionales de EE.UU. ya mencionadas, así como otros compuestos y sustancias que inhiben el receptor erbB2, pueden usarse con el anticuerpo según la presente invención.
[0428] Los presentes regímenes de tratamiento podrán combinarse también con anticuerpos u otros ligandos que inhiben el crecimiento tumoral mediante la unión a IGF-1R (receptor del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1). Los anticuerpos anti-IGF-1R específicos que pueden usarse en la presente invención incluyen los descritos en WO02/053596.
[0429] Los regímenes de tratamiento descritos en el presente documento pueden combinarse con agentes antiangiogénicos, como los inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2), inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9) e inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II), pueden usarse con el anticuerpo en el método de la invención. Entre los ejemplos de inhibidores COX-II útiles se incluyen CELEBREX (celecoxib), valdecoxib y rofecoxib.
[0430] IX.C.) 24P4C12 como diana para respuestas inmunes celulares
[0431] Las vacunas y métodos para preparar vacunas que contienen una cantidad inmunogénicamente eficaz de uno o más péptidos de unión a HLA como se describen en el documento son modos de realización adicionales de la invención. Además, las vacunas según la invención abarcan composiciones de uno o más de los péptidos reivindicados. Un péptido puede estar presente en una vacuna de forma individual. Como alternativa, el péptido puede existir como un homopolímero que comprende múltiples copias del mismo péptido o como un heteropolímero de varios péptidos. Los polímeros tienen la ventaja de una mayor reacción inmunológica y, cuando se usan diferentes epítopos de péptidos para formar el polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTLs que reaccionen con diferentes determinantes antigénicos del organismo patogénico o del péptido relacionado con el tumor dirigido una respuesta inmune. La composición puede ser una región de origen natural de un antígeno o puede prepararse, p.ej., de forma recombinante o mediante síntesis química.
[0432] Los vehículos que pueden utilizarse con las vacunas descritas en la invención se conocen bien en la técnica e incluyen, p.ej., tiroglobulina, albúminas como albúmina sérica humana, toxoide tetánico, poliaminoácidos como poli L-lisina, poli ácido L-glutámico, influenza, proteína del núcleo del virus de la hepatitis B y similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir, aceptable) como agua o solución salina, preferentemente solución salina tamponada con fosfato. Las vacunas también incluyen normalmente un adyuvante. Los adyuvantes como el adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre son ejemplos de materiales bien conocidos en la técnica. Además, como se ha divulgado en el presente documento, las respuestas de CTL pueden ser iniciadas conjugando péptidos de la invención a lípidos, como tripalmitoil-S-gliceril-cistenil-seril-serina (P3CSS). Además, se ha descubierto que un adyuvante como los oligonucleótidos que contienen una citosina-guanina fosforotiolada (CpG) sintética aumentan las respuestas de CLT de 10 a 100 veces (véase, p. ej., Davila y Celis, J. Immunol. 165:539-547 (2000)).
[0433] Al inmunizar con una composición peptídica según la invención, vía inyección, aerosol, oral, transdérmica, transmucosa, intrapleural, intratecal u otras vías adecuadas, el sistema inmunológico del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL y/o linfocitos T auxiliares (HTL) específicos del antígeno deseado. En consecuencia, el huésped se vuelve al menos parcialmente inmune al desarrollo posterior de células que expresen o sobreexpresen el antígeno de 24P4C12 o deriva al menos algún beneficio terapéutico cuando el antígeno estaba asociado al tumor.
[0434] En algunos modos de realización, puede resultar deseable combinar los componentes de péptidos de clase I con componentes que inducen o facilitan la neutralización del anticuerpo y/o las respuestas de las células T auxiliares dirigidas al antígeno diana. Un modo de realización preferente de esta composición comprende epítopos de clase I y de clase II según la invención. Un modo de realización alternativo de dicha composición comprende un epítopo de clase I y/o de clase II según la invención, junto con un epítopo de HTL que presenta reactividad cruzada como la molécula PADRETM (Epimmune, San Diego, CA) (descrita, p.ej., en la Patente de EE.UU. Nº 5.736.142).
[0435] Una vacuna de la invención también puede incluir células presentadoras de antígenos (APC), como células dendríticas (DC), como vehículo para presentar los péptidos descritos en la invención. Las composiciones de vacunas pueden crearse in vitro, tras la movilización y recolección de células dendríticas, con lo cual la carga de células dendríticas se produce in vitro. Por ejemplo, se transfectan las células dendríticas, p.ej., con un minigén según la invención, o son pulsadas con los péptidos. Después, la célula dendrítica puede administrarse a un paciente para obtener respuestas inmunes in vivo. Las composiciones de vacunas, basadas en ADN o en péptidos, pueden administrarse in vivo también en combinación con la movilización de células dendríticas, con lo que la carga de células dendríticas se produce in vivo.
[0436] Preferentemente, se utilizan los siguientes principios cuando se selecciona un conjunto de epítopos para su inclusión en una composición poliepitópica para su utilización en una vacuna, o para seleccionar epítopos discretos para incluirlos en una vacuna y/o para ser codificados por los ácidos nucleicos, como un minigén. Se prefiere que cada uno de los siguientes principios sea equilibrado para realizar la selección. Los epítopos múltiples que han de ser incorporarados en una composición de vacuna determinada pueden ser, pero no necesariamente, contiguos en secuencia en el antígeno nativo del que proceden los epítopos.
1.) Se eligen epítopos que, al administrarlos, imiten las respuestas inmunes que se haya observado que se correlacionan con la eliminación del humor. Para HLA de Clase I, esto incluye 3-4 epítopos que proceden al menos de un antígeno asociado al tumor (TAA, en inglés). Para HLA de Clase II se emplea un principio similar; de nuevo se seleccionan 3 o 4 epítopos procedentes de al menos un TAA (véase, p.ej., Rosenberg et al., Science 278:1447-1450). Los epítopos de un TAA pueden usarse en combinación con epítopos procedentes de uno o más TAAs adicionales para producir una vacuna que se dirige a tumores con perfiles de expresión variables de TAAs expresados frecuentemente.
2.) Se seleccionan epítopos que tienen la afinidad de unión requerida establecida para correlacionarse con la inmunogenicidad: para HLA de Clase I un CI50 de 500nM o menos, a menudo 200nM o menos; y para la Clase II un CI50 de 1000nM o menos.
3.) Se seleccionan suficientes péptidos portadores de supermotivos o una serie suficiente de péptidos portadores de motivos específicos de alelos, para dar una amplia cobertura de población. Por ejemplo, es preferible tener al menos un 80% de cobertura de población. Puede emplearse un análisis de Monte Carlo, evaluación estadística conocida en la técnica, para valorar la amplitud o la redundancia de cobertura de población.
4.) Cuando se seleccionan epítopos procedentes de antígenos relacionados con el cáncer, a menudo es útil seleccionar análogos porque el paciente puede haber desarrollado tolerancia al epítopo nativo.
5.) Tienen particular relevancia los epítopos denominados “epítopos anidados”. Los epítopos anidados se producen cuando al menos dos epítopos se superponen en una secuencia péptidica determinada. Una secuencia de péptidos anidados puede comprender células B, epítopos de HLA de clase I y/o de clase II. Cuando se proporcionan epítopos anidados, un objetivo general consiste en proporcionar el mayor número posible de epítopos por secuencia. Por lo tanto, un aspecto consiste en evitar proporcionar un péptido que sea algo más largo que el extremo amino del epítopo amino-terminal y el extremo carboxilo del epítopo carboxilo-terminal en el péptido. Cuando se proporciona una secuencia multiepitópica, dicha secuencia comprende epítopos anidados, generalmente es importante examinar la secuencia para asegurarse de que no presenta propiedades patológicas u otras propiedades biológicas perjudiciales.
6.) Cuando se crea una proteína poliepitópica, o cuando se crea un minigén, un objetivo es generar el péptido más pequeño que abarque los epítopos de interés. Este principio es similar, si no igual, al empleado al seleccionar un péptido que comprende epítopos anidados. No obstante, con un péptido poliepitópico artificial, el objetivo de minimización del tamaño es sopesado frente a la necesidad de integrar alguna secuencia espaciadora entre epítopos en la proteína poliepitópica. Pueden introducirse residuos de aminoácidos espaciadores, por ejemplo, para evitar epítopos de unión (un epítopo reconocido por el sistema inmunológico no presente en el antígeno diana, y creado sólo por la yuxtaposición artificial de epítopos), o para facilitar la segmentación entre los epítopos y mejorar así la presentación de los epítopos. Los epitopos de unión generalmente deben evitarse porque el receptor puede generar una respuesta inmune al epítopo no nativo. Resulta de particular interés un epítopo de unión que sea un “epítopo dominante”. Un epítopo dominante puede conducir a una respuesta tan entusiasta que las respuestas inmunes a otros epítopos disminuyan o sean suprimidas.
7.) Cuando están presentes las secuencias de múltiples variantes de la misma proteína diana, se pueden seleccionar tambien los epítopos de péptidos potenciales en base a su conservación. Por ejemplo, un criterio para la conservación puede definir que la totalidad de la secuencia de un péptido de unión a HLA clase I o la totalidad del núcleo nonamérico de un péptido de unión de clase II se conserve según un porcentaje indicado de las secuencias evaluado para un antígeno de proteína específico.
IX.C.1. Vacunas de minigenes
[0437] Existen diversas posibilidades que permiten la administración simultánea de múltiples epítopos. Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención son un modo de realización particularmente útil. Los epítopos a incluir en un minigén se seleccionan preferiblemente según las directrices de la sección anterior. Un medio preferido para la administración de ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención utiliza constructos de minigén que codifican un péptido que comprende uno o múltiples epítopos de la invención.
[0438] El uso de minigenes multiepitópicos se describe a continuación y en Ishioka et al., J.Immunol. 162:3915-3925, 1999; An, L. y Whitton, J. L., J. Virol. 71:2292, 1997; Thomson, S. A. et al., J. Immunol. 157:822, 1996; Whitton, J. L. et al., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16:426, 1998. Por ejemplo, se puede concebir un plásmido de ADN multiepítopo que codifica 24P4C12 procedente de epítopos portadores de motivos y/o supermotivos, el epítopo de célula T auxiliar universal PADRETM o múltiples epítopos de HTL procedentes de 24P4C12 y una secuencia de señal de translocación en el retículo endoplasmático. Una vacuna también puede comprender epítopos que proceden de otros TAA.
[0439] La inmunogenicidad de un minigén multiepitópico puede confirmarse en ratores transgénicos para evaluar la magnitud de las respuestas de inducción de CTL contra los epítopos probados. Además, la inmunogenicidad de los epítopos codificados por ADN in vivo puede tener correlación con las respuestas in vitro de las líneas específicas de CTL contra las células diana transfectadas con el plásmido de ADN. De este modo, estos experimentos pueden demostrar que el minigén sirve para: 1.) generar una respuesta de CTL y 2.) que las células reconocidas por los CTL inducidos expresan los epítopos codificados.
[0440] Por ejemplo, con el fin de crear una secuencia de ADN que codifica los epítopos seleccionados (minigén) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopos pueden traducirse de forma inversa. Se puede usar una tabla de uso de codones humanos para guiar la elección del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican epítopos pueden adjuntarse directamente, de forma que cuando se traduzcan, se cree una secuencia continua de polipéptido. Para optimizar la expresión y/o la inmunogenicidad, se pueden incorporar elementos adicionales en el diseño del minigén. Entre los ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden traducirse de forma inversa e incluirse en la secuencia de minigén se incluyen: epítopos de HLA de clase I, epítopos de HLA de clase II, epítopos de anticuerpos, una secuencia señal de ubiquitina y/o una señal dirigida del retículo endoplasmático. Además, la presentación de HLA de los epítopos de CTL y HTL puede mejorarse mediante la inclusión de secuencias flanqueantes de origen natural o sintéticas (p.ej., polialanina) adyacentes a los epítopos de CTL o HTL; estos péptidos más grandes que comprenden el epítopo o epítopos se encuentran dentro del objetivo de la invención.
[0441] La secuencia de minigén puede convertirse en ADN mediante la unión de los oligonucleótidos que codifican las cadenas positiva y negativa del minigén. Los oligonucleótidos que se solapan (30-100 bases de longitud) pueden sintetizarse, fosforilarse, purificarse y anillarse en las condiciones apropiadas conocidas en la técnica. Los extremos de los oligonucleótidos pueden unirse, por ejemplo, usando ADN ligasa T4. Este minigén sintético, que codifica el polipéptido del epítopo, puede clonarse entonces en un vector de expresión deseado.
[0442] Preferentemente, en el vector se incluyen secuencias reguladoras estándares conocidas por los especialistas en la técnica para asegurar la expresión en las células diana. Son deseables diversos elementos del vector: un promotor con un sitio de clonación secuencia abajo para la inserción del minigén; una señal de poliadenilación para la terminación de transcripción eficaz; un origen de replicación de E. coli; y un marcador seleccionable de E. coli (p.ej., resistencia a ampicilina o a kanamicina). Se pueden usar numerosos promotores para este fin, p.ej., el promotor del citomegalovirus humano (hCMV, en inglés). Véanse, p.ej., las Patentes de EE.UU. núms. 5.580.859 y 5.589.466 para otras secuencias promotoras adecuadas.
[0443] Se pueden desear modificaciones del vector adicionales para optimizar la expresión e inmunogenicidad del minigén. En algunos casos, son necesarios intrones para una expresión del gen eficaz y se pueden incorporar uno o más intrones de origen natural o sintético en la región transcrita del minigén. Se puede tener en cuenta también la inclusión de secuencias de estabilización de ARNm y de secuencias de replicación en las células de mamíferos para aumentar la expresión del minigén.
[0444] Una vez se ha elegido un vector de expresión, se clona el minigén en la región de poliunión secuencia abajo del promotor. Este plásmido se transforma en una hebra de E.coli apropiada y se prepara el ADN usando técnicas estándares. La orientación y la secuencia de ADN del minigén, así como otros elementos incluidos en el vector, se confirman usando mapeo de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Las células bacterianas que albergan el plásmido correcto pueden almacenarse como banco de células maestras y banco de células de trabajo.
[0445] Además, parece que las secuencias inmunoestimuladoras (ISSs o CpGs) desempeñan un papel en la inmunogenicidad de las vacunas de ADN. Estas secuencias pueden incluirse en el vector, fuera de la secuencia que codifica el minigén, si se desea, para mejorar la inmunogenicidad.
[0446] En algunos modos de realización, se puede emplear un vector de expresión bicistrónico que permite la producción tanto de epítopos codificados por el minigén como de una segunda proteína (incluida para aumentar o disminuir la inmunogenicidad). Entre los ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían mejorar de forma beneficiosa la respuesta inmune, si se coexpresan, se incluyen citocinas (p.ej., IL-2, IL-12, GM-CSF), moléculas que inducen las citocinas (p.ej., LelF), moléculas coestimuladoras
o para respuestas de HTL, proteínas de unión pan-DR (PADRETM, Epimmune, San Diego, CA). Pueden unirse epítopos auxiliares (HTL) a las señales intracelulares diana y expresarse por separado de los epítopos de CTL expresados; esto permite la dirección de los epítopos de HTL a un compartimento celular diferente al de los epítopos de CTL. Si fuera necesario, esto podría facilitar la entrada más eficaz de epítopos de HTL en la vía de HLA de clase II, mejorando así la inducción de HTL. En contraste con la inducción de HTL o CTL, la disminución específica de la respuesta inmune mediante la coexpresión de moléculas inmunosupresoras (p.ej. TGF-β) puede resultarr beneficiosa en ciertas enfermedades.
[0447] Se pueden producir cantidades terapéuticas de ADN de plásmido, por ejemplo, por fermentación en E. coli, seguida de purificación. Las alícuotas procedentes del banco de células de trabajo se utilizan para inocular el medio de crecimiento y se cultivan hasta la saturación en matraces agitadores o un biorreactor según técnicas bien conocidas. El ADN de plásmido puede purificarse usando tecnologías de bioseparación estándares, tales como resinas de intercambio aniónico en fase sólida suministradas por QIAGEN, Inc. (Valencia, California). Si fuera necesario, se puede aislar ADN superenrollado a partir de las formas lineales y circulares abiertas usando electroforesis en gel u otros métodos.
[0448] Puede prepararse ADN de plásmido purificado para inyección usando una variedad de formulaciones. La más sencilla de ellas es la reconstitución de ADN liofilizado en una solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Este método, conocido como “ADN desnudo”, se está utilizando actualmente para la administración intramuscular (IM) en ensayos clínicos. Para maximizar los efectos inmunoterapéuticos de las vacunas con ADN de minigenes, puede ser deseable un método alternativo para formular ADN de plásmido purificado. Se ha descrito una variedad de métodos y pueden aparecer nuevas técnicas. También pueden utilizarse en la formulación lípidos catiónicos, glicolípidos y liposomas fusogénicos (véanse, p.ej., lo descrito en la WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, Bio Techniques 6(7): 682 (1988); la Patente de EE.UU. Nº 5.279.833; WO 91/06309; y Felgner; et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. EE.UU. 84:7413 (1987)). Además, los péptidos y compuestos denominados colectivamente compuestos interactivos protectores y no de condensación (PINC, en inglés) podrían también unirse ADN de plásmido purificado para influir en las variables como la estabilidad, dispersión intramuscular o el tráfico a órganos específicos o tipos celulares.
[0449] Puede usarse la sensibilización de células diana como ensayo funcional para la expresión y presentación de HLA de clase I de epítopos de CTL codificados por el minigén. Por ejemplo, el ADN de plásmido se introduce en una línea celular de mamífero que es adecuada como diana para los ensayos de liberación estándar de cromo de CTL. El método de transfección utilizado dependerá de la formulación final. Puede usarse electroporación para ADN “desnudo”, mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección directa in vitro. Un plásmido que expresa una proteína fluorescente verde (GFP, en inglés) puede cotransfectarse para permitir el enriquecimiento de las células transfectadas usando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Después, se marcan estas células con cromo-51 (51Cr) y se usan como células diana para las líneas de CTL específicas del epítopo; la citolisis, detectada por la liberación de 51Cr, indica la producción y la presentación de HLA de epítopos de CTL codificados por el minigén. La expresión de epítopos de HTL puede evaluarse de una forma análoga usando ensayos para calcular la actividad de HTL.
[0450] La inmunogenicidad in vivo es un segundo enfoque para las pruebas funcionales de formulaciones de ADN de minigenes. Se inmunizan ratones transgénicos que expresan las proteínas de HLA humanas apropiadas con el producto de ADN. La dosis y la vía de administración dependen de la formulación (p.ej., IM para ADN en PBS, intraperitoneal (i.p.) para el ADN complejado con lípidos). Veintiún días después de la inmunización, se recogen los esplenocitos y se reestimulan durante una semana en presencia de péptidos que codifican cada epítopo que se ensaya. A continuación, en las células efectoras de CTL se llevan a cabo ensayos para detectar la citolisis de las células diana marcadas con 51Cr y cargadas con péptidos usando técnicas estándares. La lisis de las células diana que fueron sensibilizadas mediante HLA cargado de epítopos peptídicos, que se corresponden con los epítopos codificados por el minigén, demuestra la función de la vacuna de ADN para la inducción in vivo de CTL. Se confirma la inmunogenicidad de los epítopos de HTL en ratones transgénicos de forma análoga.
[0451] Como alternativa, pueden administrarse los ácidos nucleicos usando administración balística como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.204.253. Con el uso de esta técnica, se administran partículas compuestas sólo de ADN. En un modo de realización alternativo, el ADN puede adherirse a partículas, tales como partículas de oro.
[0452] Pueden administrarse también minigenes usando otros sistemas de administración virale o bacteriana bien conocidos en la técnica, p.ej., una construcción de expresión que codifica los epítopos de la invención puede incorporarse a un vector viral como la vaccinia.
IX.C.2. Combinaciones de péptidos CTL con péptidos auxiliares
[0453] Las composiciones de vacunas que comprenden los péptidos de CTL de la invención pueden ser modificadas, p.ej., analogadas, para proporcionar atributos deseados, tal como una mayor vida media en suero, cobertura de población ampliada o inmunogenicidad mejorada.
[0454] Por ejemplo, puede mejorarse la capacidad de un péptido para inducir la actividad de CTL mediante la unión del péptido a una secuencia que contiene al menos un epítopo que es capaz de inducir una respuesta de células T auxiliares. Aunque un péptido de CTL puede enlazarse directamente a un péptido auxiliar T, a menudo se enlazan conjugados de epítopo de CTL/epítopo de HTL mediante una molécula espaciadora. Un espaciador normalmente comprende moléculas neutrales relativamente pequeñas, como aminoácidos o análogos de aminoácidos, que están sustancialmente no cargados en condiciones fisiológicas. Los espaciadores se eligen típicamente de entre, p.ej. Ala, Gly u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el espaciador presente de forma opcional no ha de estar compuesto por los mimos residuos y, por lo tanto, puede ser un heterooligómero u homooligómero. Cuando está presente, el espaciador será de al menos uno o dos residuos, más comúnmente de tres a seis residuos y algunas veces de 10 o más residuos. El epítopo peptídico de CTL puede unirse al epítopo de péptido auxiliar T directamente o mediante un espaciador en el extremo amino o carboxi terminal del péptido CTL. El extremo amino del péptido inmunogénico o del péptido auxiliar T puede estar acilado.
[0455] Los epítopos de péptidos HTL también pueden modificarse para alterar sus propiedades biológicas. Por ejemplo, pueden modificarse para incluir D-aminoácidos para aumentar su resistencia a las proteasas y, de este modo, ampliar la vida media en suero, o pueden conjugarse a otras moléculas como lípidos, proteínas, carbohidratos y similares para aumentar su actividad biológica. Por ejemplo, un péptido auxiliar T puede conjugarse a una o más cadenas de ácido palmítico en el extremo aminoterminal o carboxilo-terminal.
IX.C.3. Combinaciones de péptidos CTL con agentes cebadores de células T
[0456] En algunos modos de realización, puede resultar deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención al menos un componente que cebe linfocitos B o linfocitos T. Los lípidos han sido identificados como agentes capaces de cebar CTL in vivo. Por ejemplo, pueden unirse residuos de ácido palmítico a los grupos amino ε y α de un residuo de lisina y unirse después, p.ej., mediante uno
o más residuos de unión, tales como Gly-, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser o similares, a un péptido inmunogénico. El péptido lipidado puede administrarse entonces directamente en una micela o partícula, incorporado en un liposoma o emulsionado en un adyuvante, p.ej., el adyuvante incompleto de Freund. En un modo de realización preferente, una composición inmunogénica especialmente eficaz puede comprender ácido palmítico unido a los grupos amino ε y α de Lys, que está unido a través de un enlace, p.ej., Ser-Ser, al extremo amino-terminal del péptido inmunogénico.
[0457] Otros ejemplos de cebadores de lípido de respuestas CTL son las lipoproteínas de E. coli, como tripalmitoil-S-gliceril-cistenil-seril-serina (P3CSS), que pueden usarse para cebar CTL específico del virus cuando se enlazan a un péptido apropiado (véase, p.ej., Deres, et al., Nature 342:561, 1989). Los péptidos de la invención pueden unirse a P3CSS, por ejemplo, y el lipopéptido puede administrarse a un sujeto para cebar de forma específica una respuesta inmune al antígeno diana. Además puesto que la inducción de anticuerpos neutralizantes también puede cebarse con epítopos conjugados a P3CSS, se pueden combinar dos de estas composiciones para obtener de forma más eficaz tanto respuestas humorales como mediadas por células.
IX.C.4. Composiciones de vacunas que comprenden DC pulsadas con péptidos HTL y/o CTL
[0458] Un modo de realización de una composición de vacuna según la invención comprende la administración ex vivo de un cóctel de péptidos portadores de epítopos a las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, en inglés) o DC aisladas del mismo, a partir de la sangre del paciente. Se puede usar un fármaco que facilite la recogida de DC como ProgenipoietinTM (Pharmacia-Monsanto, San Luis, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar las DC con péptidos y antes de la reinfusión a los pacientes, se lavan las DC para eliminar péptidos no unidos. En este modo de realización, una vacuna comprende las DC pulsadas con péptidos que presentan los epítopos peptídicos pulsados complejados con moléculas de HLA en las superficies.
[0459] Las DC pueden pulsarse ex vivo con un cóctel de péptidos, algunos de los cuales estimulan las respuestas CTL a 24P4C12. Opcionalmente, un péptido de células T auxiliares (HTL), como un péptido de HLA de Clase II de restricción débil artificial o natural, puede incluirse para facilitar la respuesta CTL. Así, se utiliza una vacuna de acuerdo con la invención para tratar un cáncer que expresa o sobreexpresa 24P4C12.
IX.D.) Inmunoterapia adoptiva
[0460] También se utilizan los péptidos relacionados con 24P4C12 antigénicos para obtener una respuesta CTL y/o HTL ex vivo. Las células CTL o HTL resultantes pueden usarse para tratar tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o que no responderán a un péptido o ácido nucleico de una vacuna terapéutica según la invención. Las respuestas CTL o HTL ex vivo a un antígeno concreto son inducidas mediante la incubación en un cultivo de tejido de células precursoras de HTL o CTL del paciente, o genéticamente compatibles, junto con una fuente de células presentadoras de antígeno (APC), tal como células dendríticas y el péptido inmunogénico apropiado. Tras un periodo de incubación apropiado (normalmente de 7 a 28 días aproximadamente), en el que las células precursoras se activan y expanden en células efectoras, las células se infunden de nuevo en el paciente, donde destruirán (CTL) o facilitarán la destrucción (HTL) de su célula diana específica (p.ej., una célula tumoral). Las células dendríticas transfectadas también pueden usarse como células presentadores del antígeno.
IX.E.) Administración de vacunas para fines terapéuticos y profilácticos
[0461] Las composiciones farmacéuticas y las vacunas de la invención se usan normalmente para tratar y/o prevenir un cáncer que expresa o sobreexpresa 24P4C12. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones de péptidos o los ácido nucleico se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta eficaz de las células B, CTL y/o HTL ante el antígeno y para curar, o al menos detener parcialmente o reducir síntomas y/o complicaciones. La cantidad adecuada para cumplir con esta aplicación, se define como “dosis terapéuticamente eficaz”. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de, p.ej., la composición concreta administrada, el modo de administración, el estadio y gravedad de la enfermedad que se está tratando, el peso y estado de salud general del paciente y la valoración del médico que las prescribe.
[0462] En las composiciones farmacéuticas, se administran generalmente los péptidos inmunogénicos de la invención, o el ADN que los codifica, a un sujeto que padece ya un tumor que expresa 24P4C12. Los péptidos, o el ADN que los codifica, puede administrarse individualmente o como fusiones de una o más secuencias peptídicas. Los pacientes pueden ser tratados con los péptidos inmunogénicos por separado o junto con otros tratamientos, como la cirugía, según sea apropiado.
[0463] Para el uso terapéutico, la administración debería comenzar por lo general en el primer diagnóstico de cáncer asociado a 24P4C12. A lo que le sigue una dosis de estímulo hasta que al menos los síntomas se reduzcan sustancialmente y durante un periodo posterior. El modo de realización de la composición de la vacuna (es decir, incluye, sin carácter limitativo, modos de realización como cócteles de péptidos, polipéptidos poliepitópicos, minigenes o CTL específicos de TAA o células dendríticas pulsadas) administrada al paciente puede variar según el estadio de la enfermedad o el estado de salud del paciente. Por ejemplo, en un paciente con un tumor que expresa 24P4C12, una vacuna que comprende el CTL específico de 24P4C12 puede ser más eficaz elimnando las células tumorales en pacientes con la enfermedad avanzada que los modos de realización alternativos.
[0464] En general, es importante proporcionar una cantidad suficiente del epítopo de péptido, suministrado por una vía de administración determinada, para estimular de forma eficaz una respuesta de células T citotóxicas; también pueden darse composiciones que estimulan respuestas de células T auxiliares según este modo de realización de la invención.
[0465] La dosis inicial en una inmunización terapéutica se produce generalmente en un intervalo de dosis unitaria donde el valor inferior es aproximadamente 1, 5, 50, 500 o 1.000 µg y el valor superior es aproximadamente 10.000, 20.000, 30.000 o 50.000 µg. Los valores de dosis para un ser humano oscilan normalmente entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 50.000 µg para un paciente de 70 kilos. Se pueden administrar dosis de refuerzo de entre aproximadamente 1,0 µg y aproximadamente
50.000 µg de péptido conforme a un régimen de refuerzo de semanas a meses dependiendo de la respuesta del paciente y su condición determinada mediante la medición de actividad específica de CTL y HTL, obtenidos de la sangre del paciente. La administración debería continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indiquen que la neoplasia ha sido eliminada o reducida y durante un período posterior. Las dosis, vías de administración y régimen de dosis se ajustan según las metodologías conocidas en la técnica.
[0466] En algunos modos de realización, los péptidos y las composiciones de la presente invención pueden emplearse en estadios de la enfermedad graves, es decir, situaciones que pongan en peligro la vida del paciente o que potencialmente puedan ponerla en peligro. En estos casos, cdebido a cantidades mínimas de sustancias extrañas y de la naturaleza relativamente no tóxica de los péptidos de modos de realización preferentes de la invención, es posible y puede ser deseable para el doctor administrar un exceso sustancial de estas composiciones de péptidos en comparación con estas cantidades de dosificación indicadas.
[0467] Las composiciones de vacuna de la invención pueden usarse también puramente como agentes profilácticos. En general, la dosis para una inmunización profiláctica inicial oscila generalemente en un intervalo de dosis unitaria donde el valor inferior es aproximadamente 1, 5, 50, 500 o 1.000 µg y el valor superior es aproximadamente 10.000, 20.000, 30.000 o 50.000 µg. Los valores de dosis para un ser humano típicamente oscilan entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 50.000 µg para un paciente de 70 kilos. A lo que le siguen dosis de refuerzo de entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 50.000 µg de péptido administrado a intervalos definidos de aproximadamente cuatro semanas hasta seis meses después de la administración inicial de la vacuna. La inmunogenicidad de la vacuna puede evaluarse midiendo la actividad específica de CTL y HTL obtenida a partir de una muestra de sangre del paciente.
[0468] Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico están destinadas a la administración parenteral, tópica, oral, nasal, intratecal o local (p.ej., como crema o pomada tópica). Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, p.ej., por vía intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. Por consiguiente, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferentemente un portador acuoso.
[0469] Puede usarse una variedad de portadores acuosos, p.ej. agua, agua tamponada, solución salina al 0,8%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales., bien conocidas, o pueden flitrarse de forma estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso, o liofilizarse, combinando la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración.
[0470] Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes tamponadores o reguladores del PH, agentes reguladores de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.
[0471] La concentración de péptidos de la invención en las formulaciones farmaceutcias puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,1%, normalmente a o al menos aproximadamente 2% hasta tanto un 20% a 50% o más por peso, y se seleccionará en primer lugar según los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo concreto de administración elegido.
[0472] Una forma de dosis unitaria humana de una composición se incluye normalmente en una composición farmacéutica que comprende una dosis unitaria humana de un portador aceptable, en un modo de realización un portador acuoso, y se administra en un volumen/cantidad que es conocido por los especialistas en la materia para utilizarse en la administración de dichas composiciones al ser humano (véase, p.ej., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17ª Edición, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, 1985). Por ejemplo, una dosis de péptido para la inmunización inicial puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 50000 µg, generalmente 100-5000 µg, para un paciente de 70kg. Por ejemplo, para los ácidos nucleicos, una inmunización inicial puede llevarse a cabo usando un vector de expresión en forma de ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en las cantidades de 0,5-5mg en múltiples lugares. El ácido nucleico (0,1 a 1000 µg) puede administrarse también utilizando una pistola de genes. Tras un periodo de incubación de 3-4 semanas, se administra entonces una dosis de refuerzo. El refuerzo puede ser virus de viruela aviar recombinante administrado a una dosis de 5-107 hasta 5x109 pfu (unidades formadoras de placas).
[0473] Para anticuerpos, un tratamiento generalmente implica la administración repetida de la preparación de anticuerpo anti-24P4C12, por una vía de administración aceptable, como la inyección intravenosa (IV), normalmente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-500 mg de mAb por semana son eficaces y se toleran bien. Además, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV, seguido de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación de mAb anti-24P4C12 representa un régimen de dosis aceptable. Tal y como aprecian los expertos en la materia, varios factores pueden influir la dosis ideal en un caso concreto. Dichos factores incluyen, por ejemplo, vida media de una composición, la afinidad de unión de un Ab, la inmunogenicidad de una sustancia, el grado de expresión de 24P4C12 en el paciente, el alcance de antígeno 24P4C12 circulante liberado, el nivel de concentración en estado estacionario deseado, la frecuencia de tratamiento y la influencia de los agentes quimioterapéuticos u otros agentes usados en combinación con el método de tratamiento de la invención, así como el estado de salud de un paciente particular. Las dosis unitarias humanas preferidas no limitativas son, por ejemplo, 500 µg – 1mg, 1mg – 50mg, 50mg – 100mg, 100mg
– 200mg, 200mg – 300mg, 400mg – 500 mg, 500 mg – 600mg, 600mg – 700mg, 700mg – 800mg, 800mg – 900mg, 900mg – 1g o 1mg – 700 mg. En ciertos modos de realización, la dosis es un intervalo de 2-5 mg/kg de peso corporal, p.ej., con continuación de dosis semanales de 1-3 mg/kg; 0,5mg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10mg/kg del peso corporal seguido, p.ej., en dos, tres o cuatro semanas por dosis semanales; 0,5-10mg/kg del peso corporal, pej, seguido en dos, tres o cuatro semanas por dosis semanales; 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400mg m2 de área corporal semanalmente; éstas pueden ir seguidas de dosis semanales durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12 o más semanas.
[0474] En un modo de realización, las formas de dosis unitaria humanas de polinucleótidos comprenden un intervalo de dosis adecuado o cantidad eficaz de que proporciona cualquier efecto terapéutico. Como pueden apreciar los especialistas en la materia, un efecto terapéutico depende de un número de factores, incluyendo la secuencia del polinucleótido, peso molecular del polinucleótido y vía de administración. Las dosificaciones se seleccionan generalmente por el médico u otro profesional sanitario según una variedad de parámetros conocidos en la técnica, como la gravedad de los síntomas, el historial del paciente y similares. En general, para un polinucleótido de aproximadamente 20 bases, el intervalo de dosificación puede elegirse de, por ejemplo, un límite inferior independientemente seleccionado como aproximadamente 0,1; 0,25, 0,5; 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 o 500 mg/kg hasta un límite superior independientemente seleccionado, mayor que el límite inferior, de aproximadamente 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, o 10000 mg/kg. Por ejemplo, una dosis puede ser aproximadamente cualquiera de las siguientes: 0,1 a 100 mg/kg, 0,1 a 50 mg/kg, 0,1 a 25 mg/kg, 0,1 a 10 mg/kg, 1 a 500 mg/kg, 100 a 400 mg/kg, 200 a 300 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 100 a 200 mg/kg, 300 a 400 mg/kg, 400 a 500 mg/kg, 500 a 1000 mg/kg, 500 a 5000 mg/kg o 500 a 10000 mg/kg. Por lo general, las vías de administración parenterales pueden necesitar dosis de polinucleótidos más altas en comparación con aplicaciones más directas al nucleótido al tejido enfermo, como hacen los polinucleótidos de longitud creciente.
[0475] En un modo de realización, las formas de dosis unitaria humanas de células T pueden comprender un intervalo de dosificación adecuado o una cantidad eficaz que proporciona cualquier efecto terapéutico. Como aprecian aquellos expertos en la técnica, un efecto terapéutico depende de un número de factores. El régimen de dosis se selecciona generalmente por el médico u otro profesional sanitario de acuerdo con una variedad de parámetros conocidos en la técnica, como la gravedad de los síntomas, el historial de paciente y similares. Una dosis puede ser de aproximadamente 104 células a 106 células, de aproximadamente 106 células a aproximadamente 108 células, de aproximadamente 108 células a aproximadamente 1011 células, o de aproximadamente 108 a aproximadamente 5 x 1010 células. Una dosis puede ser también de aproximadamente 106 células/m2 a aproximadamente 1010 células/m2, o de aproximadamente 106 células/m2 a aproximadamente 108 células/m2.
[0476] La proteína o proteínas de la invención y/o los ácidos nucleicos que codifican la(s) proteína(s), también pueden administrarse a través de liposomas, lo que también puede servir para: 1) dirigir la proteína o proteínas a un tejido concreto, como el tejido linfoide; 2) dirigirlas(s) selectivamente a células de enfermedades; o 3) aumentar la vida media de la composición de péptidos. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares. En estas preparaciones, el péptido que ha de administrarse se incorpora como parte de un liposoma, solo o junto con una molécula que se une a un receptor prevalente entre las células linfoides (como los anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45) o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. De este modo, los liposomas cargados o decorados con un péptido deseado pueden dirigirse al sitio de las células linfoides, en el que los liposomas administran entonces las composiciones peptídicas. Los liposomas para su uso de acuerdo con la invención se forman a partir de lípidos que forman una vesícula estándar, lo que en general incluye fosfolípidos con carga neutra y negativa y un esterol, tal como el colesterol. La selección de lípidos debe tener en cuenta p.ej., el tamaño del liposoma, la labilidad ácida y la estabilidad de los liposomas del torrente sanguíneo. Se dispone de una gran variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe en, p.ej., Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980) y en las Patentes de EE.UU. núms. 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.
[0477] Para las células que seleccionan dianas del sistema inmunológico, un ligando a incorporarse en el liposoma puede incluir, p.ej., anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos de los determinantes celulares superficiales de las células deseadas del sistema inmunológico. Una suspensión de liposomas que contiene un péptido puede administrarse por vía intravenosa, local, tópica, etc., en una dosis que varía según, entre otros, la manera de administración, el péptido que se está administrando y el estadio de la enfermedad que se está tratando.
[0478] Para las composiciones sólidas, pueden usarse portadores sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para la administración oral, se forma una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable mediante la incorporación de cualquiera de los excipientes normalmente empleados, como aquellos portadores enumerados anteriormente y, en general, un 10-95% de ingrediente activo, es decir, de uno o más péptidos de la invención, y más preferentemente a una concentración del 25%-75%.
[0479] Para la administración por aerosol, los péptidos inmunogénicos se suministran preferiblemente en una forma finamente divida junto con un tensoactivo y propulsor. Los porcentajes típicos de péptidos son aproximadamente del 0,01% -20% en peso, preferiblemente aproximadamente 1%-10%. El tensoactivo debe ser, por supuesto, no tóxico y preferiblemente soluble en el propulsor. Son indicadores de dichos agentes los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen desde aproximadamente 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Se pueden emplear ésteres mixtos, como glicéridos naturales o mixtos. El tensoactivo puede constituir aproximadamente del 0,1%-20% en peso de la composición, preferiblemente aproximadamente el 0,25%-5%. El resto de la composición es normalmente propulsor. Se puede incluir también un portador, si se desea, p.ej., lecitina para la administración intranasal.
X.) Modos de realización de diagnóstico y pronóstico de 24P4C12.
[0480] Como se divulga en el presente documento, los polinucleótidos, polipéptidos, células T citotóxicas reactivas (CTL), células T auxiliares reactivas (HTL) y anticuerpos antipolipéptido de 24P4C12 se utilizan en ensayos de diagnóstico, pronóstico y terapéuticos bien conocidos que examinan las afecciones asociadas con el crecimiento celular desregulado como el cáncer, en concreto los cánceres enumerados en la Tabla I (véase, p.ej., tanto su perfil específico de expresión en tejido como su sobreexpresión en ciertos cánceres como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo denominado “Análisis de la expresión de 24P4C12 en tejidos normales y muestras de pacientes”).
[0481] 24P4C12 puede utilizarse de forma análoga a un antígeno asociado a la próstata PSA, el marcador arquetípico que ha sido usado por médicos durante años para identificar y controlar la presencia de cáncer de próstata (véanse, p.ej., Merrill et al., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik et al, J.Urol. Agosto; 162(2):293-306 (1999) y Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635-1640 (1999)). También se usa una variedad de otros marcadores de diagnóstico en contextos similares incluyendo p53 y K-ras (véanse, p.ej., Tulchinsky et al., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1): 99-102 y Minimoto et al., Cancer Detect prev 2000; 24(1):1-12). Por tanto, este descubrimiento de polinucleótidos y polipéptidos de 24P4C12 (así como las sondas de polinucleótidos de 24P4C12 y anticuerpos anti-24P4C12 utilizados para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades permiten a los expertos utilizar estas moléculas en métodos que son análogos a los utilizados, por ejemplo, en una variedad de ensayos de diagnóstico dirigidos a examinar afecciones asociadas al cáncer.
[0482] Los modos de realización típicos de los métodos de diagnóstico que utilizan los polinucleótidos, polipéptidos, células T reactivas y anticuerpos de 24P4C12 son análogos a aquellos métodos de ensayos de diagnóstico consolidados, que emplean, p.ej., células T reactivas, polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos de PSA. Por ejemplo, al igual que se usan los polinucleótidos de PSA como sondas (por ejemplo, en el análisis Northern, véase, p.ej., Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3):567-74 (1994)) y cebadores (por ejemplo, en el análisis PCR, véase, p.ej., Okegawa et al., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de ARNm de PSA en los métodos de control de la sobreexpresión de PSA o de las metástasis de los cánceres de próstata, los polinucleótidos de 24P4C12 descritos en el presente documento pueden utilizarse del mismo modo para detectar la sobreexpresión de 24P4C12 o metástasis de cánceres de próstata u otros cánceres que expresan este gen. Como alternativa, del mismo modo que los polipéptidos de PSA se utilizan para generar anticuerpos específicos para PSA que pueden usarse después para observar la presencia y/o el nivel de proteínas de PSA en los métodos para controlar la sobreexpresión de la proteína PSA (véase, p.ej., Stephan et al., Urology 55(4):560-3 (2000)) o las metástasis de células de la próstata (véase, p.ej., Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)), los polipéptidos de 24P4C12 descritos en el presente documento pueden utilizarse para generar anticuerpos para su uso en la detección de sobreexpresión de 24P4C12 o la metástasis de células de la próstata y células de otros tipos de cáncer que expresan este gen.
[0483] Específicamente, puesto que las metástasis implican el movimiento de las células cancerosas desde un órgano de origen (como el pulmón o glándula prostática, etc.) a un área diferente del cuerpo (como un ganglio linfático), se pueden usar ensayos que examinan una muestra biológica para detectar la presencia de células que expresan los polipéptidos y/o polinucleótidos de 24P4C12 para proporcionar pruebas de las metástasis. Por ejemplo, cuando se descubre que una muestra biológica procedente de tejido que no contiene normalmente células que expresan 24P4C12 contiene células que expresan 24P4C12, este descubrimiento es indicativo de metástasis.
[0484] Como alternativa, pueden usarse los polinucleótidos y/o polipéptidos de 24P4C12 para proporcionar indicios de cáncer, por ejemplo, cuando se descubre que las células en una muestra biológica, que normalmente no expresan 24P4C12 o expresan 24P4C12 a un nivel diferente, expresan 24P4C12 o tienen una expresión aumentada de 24P4C12 (véase, p.ej., la expresión de 24P4C12 en los cánceres enumerados en la Tabla I y en muestras de pacientes, etc., mostradas en las Figuras adjuntas). En dichos ensayos, los expertos pueden desear además generar más indicios de metástasis mediante el ensayo de la muestra biológica en cuanto a la presencia de un segundo marcador restringido de tejido (además de 24P4C12).
[0485] El uso de la inmunohistoquímica para identificar la presencia de un polipéptido de 24P4C12 en una sección tisular puede indicar un estado alterado de determinadas células en ese tejido. En la técnica se considera que la capacidad de un anticuerpo para localizar a un polipéptido que se expresa en células cancerosas es un modo de diagnosticar la presencia de la enfermedad, estadio de la enfermedad, progresión y/o agresividad del tumor. Dicho anticuerpo también puede detectar una distribución alterada del polipéptido en las células cancerosas, respecto al tejido no maligno correspondiente.
[0486] Las composiciones inmunogénicas y el polipéptido de 24P4C12 sirven también en el ámbito del fenómeno de localización de proteína subcelular alterada en etapas de la enfermedad. La alteración de las células de su estado normal al estado enfermo provoca cambios en la morfología celular y a menudo se asocia con cambios en la localización/distribución de proteínas subcelulares. Por ejemplo, las proteínas de la membrana celular que se expresan de un modo polarizado en células normales pueden alterarse en la enfermedad, lo que resulta en la distribución de la proteína de un modo no polar en la superficie celular completa.
[0487] El fenómeno de la localización de proteínas subcelulares alteradas en una enfermedad se ha demostrado con la expresión de las proteínas Her2 y MUC1 mediante el uso de medios inmunohistoquímicos. Las células epiteliales normales tienen una distribución apical típica de MUC1, además de cierta localización supranuclear de la glicoproteína, mientras que las lesiones malignas a menudo muestran un perfil de tinción apolar (Diaz et al., The Breast Journal, 7; 40-45 (2001), Zhang et al., Clinical Cancer Research, 4; 2669-2676 (1998): Cao, et al., The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45: 1547-1557 (1997)). Además, el epitelio de mama normal es negativo para la proteína Her2 o muestra sólo una distribución basolateral mientras que las células malignas pueden expresar la proteína en la superficie celular completa (De Potter, et al., International Journal of Cancer, 44; 969-974 (1989): McCormick, et al., 117, 935-943 (2002)). Como alternativa, la distribución de la proteína puede alterarse de una localización solamente en superficie hasta incluir expresión citoplásmica difusa en el estado enfermo. Dicho ejemplo puede verse con MUC1 (Diaz, et al., The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)).
[0488] La modificación en la localización/distribución de una proteína en la célula, como se detecta por métodos inmunohistoquímicos, también puede proporcionar información importante sobre la conveniencia de determinadas modalidades de tratamiento. Este último punto se ilustra en la situación en la que una proteína puede ser intracelular en tejido normal, pero de superficie celular en células malignas; la localización en superficie celular convierte las células en favorablemente susceptibles a regímenes de tratamiento y diagnóstico basados en anticuerpos. Cuando dicha alteración de la localización de proteína tiene lugar en 24P4C12, la proteína 24P4C12 y las respuestas inmunes relacionadas con la misma son muy útiles. El uso de las composiciones de 24P4C12 permite a los expertos en la materia tomar importantes decisiones terapéuticas y de diagnóstico.
[0489] Los reactivos inmunohistoquímicos específicos para 24P4C12 también sirven para detectar las metástasis de tumores que expresan 24P4C12 cuando el polipéptido aparece en los tejidos en los que no se suele producir 24P4C12.
[0490] Por tanto, los anticuerpos y polipéptidos de 24P4C12 resultantes de las respuestas inmunes son útiles en una variedad de contextos importantes como objetivos terapéuticos, de diagnóstico, preventivos y/o de pronóstico.
[0491] Además, las proteínas o polinucleótidos relacionados con 24P4C12 de la invención pueden usarse para tratar una patología caracterizada por la sobreexpresión de 24P4C12. Por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de la Figura 1, o fragmentos de ambas, pueden utilizarse para generar una respuesta inmune al antígeno de 24P4C12. Los anticuerpos u otras moléculas que reaccionan con 24P4C12 pueden emplearse para modular la función de esta molécula y proporcionar de este modo un beneficio terapéutico.
X.A.) Inhibición de la función de la proteína 24P4C12 [0492] La invención incluye diversos procedimientos y composiciones para inhibir la unión de 24P4C12 a su asociado de unión o su asociación con otra proteína o proteínas, así como métodos para inhibir la función de 24P4C12.
X.B.) Inhibición de 24P4C12 con anticuerpos intracelulares
[0493] En un enfoque, un vector recombinante que codifica anticuerpos de de cadena sencilla que se unen específicamente a 24P4C12 se introduce en células que expresan 24P4C12 mediante tecnologías de transferencia génica. En consecuencia, el anticuerpo anti-24P4C12 de cadena sencilla codificado se expresa intracelularmente, se une a la proteína 24P4C12 e inhibe así su función. Los procedimientos para modificar genéticamente dichos anticuerpos de cadena sencilla intracelulares son muy conocidos. Dichos anticuerpos intracelulares, también conocidos como “intracuerpos”, están específicamente dirigidos a un compartimento concreto de la célula, proporcionando control donde se enfoca la actividad inhibitoria del tratamiento. Esta tecnología se ha aplicado con éxito en la técnica (para revisar, véase, Richardson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Se ha demostrado que los intracuerpos eliminan prácticamente la expresión de receptores de la superficie celular, de otro modo serían abundantes (véanse, p.ej., Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92:3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332-337).
[0494] Los anticuerpos de cadena sencilla comprenden dominios variables de las cadenas ligera y pesada unidas por un polipéptido de unión flexible y se expresan como un polipéptido sencillo. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena sencilla se expresan como un fragmento de la región variable de cadena sencilla unido a la región constante de la cadena ligera o a una región constante de la cadena pesada (scFv). Se modifican señales de tráfico intracelular bien conocidas en los vectores de polinucleótidos recombinantes que codifican dichos anticuerpos de cadena sencilla con el fin de dirigir con precisión el intracuerpo al compartimento intracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos al retículo endoplasmático (RE) se modifican para incorporar un péptido líder y, opcionalmente, una señal de retención de extremos C-terminal en el RE, como el motivo de aminoácidos KDEL. Los intracuerpos destinados a ejercer actividad en el núcleo se modifican para incluir una señal de localización nuclear. Las fracciones de lípidos se unen a los intracuerpos para fijar el intracuerpo al lado citosólico de la membrana plasmática. Se pueden dirigir también los intracuerpos para que ejerzan una función en el citosol. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos se utilizan para aislar factores en el citosol, de ese modo se evita que sean transportados a su destino celular natural.
[0495] En un modo de realización, los intracuerpos se usan para capturar 24P4C12 en el núcleo, evitando de este modo su actividad en el núcleo. Las señales dirigidas nucleares se modifican en dichos intracuerpos de 24P4C12 con el fin de lograr la dirección deseada. Dichos intracuerpos de 24P4C12 están diseñados para unirse específicamente a un dominio de 24P4C12 concreto. En otro modo de realización, los intracuerpos citosólicos que se unen específicamente a una proteína 24P4C12 se utilizan para evitar que 24P4C12 acceda al núcleo, evitando de este modo que ejerza cualquier actividad biológica en el núcleo (p.ej., evitando que 24P4C12 forme complejos de transcripción con otros factores).
X.C.) Inhibición de 24P4C12 con proteínas recombinantes
[0496] En otro enfoque, las moléculas recombinantes se unen a 24P4C12 y, de ese modo, inhiben la función de 24P4C12. Por ejemplo, estas moléculas recombinantes evitan o inhiben el acceso/enlace de 24P4C12 a su(s) asociado(s) o que se asocie con otra u otras proteínas. Dichas moléculas recombinantes pueden contener, por ejemplo, la parte o partes reactivas de una molécula de anticuerpo específica de 24P4C12. En un modo de realización concreto, el dominio de unión a 24P4C12 de un asociado de unión a 24P4C12 se modifica en una proteína de fusión dimérica, según lo cual la proteína de fusión comprende dos dominios de unión a ligandos de 24P4C12 unidos a la porción de Fc de una IgG humana, como IgG1 humana. Dicha parte de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 y la región bisagra, pero no el dominio CH1. Tales proteínas de fusión dimérica se administran en forma soluble a los pacientes que padecen un cáncer asociado a la expresión de 24P4C12, con lo que la proteína de fusión dimérica se une específicamente a 24P4C12 y bloquea la interacción de 24P4C12 con un asociado de enlace. Estas proteínas de fusión dimérica se combinan además en proteínas multiméricas usando tecnologías conocidas de unión de anticuerpos.
X.D.) Inhibición de la transcripción o de la traducción de 24P4C12
[0497] La presente invención también comprende varios métodos y composiciones para inhibir la transcripción del gen 24P4C12. De modo similar, se describen en la invención procedimientos y composiciones para inhibir la traducción del ARNm de 24P4C12 a proteína.
[0498] En un enfoque, un procedimiento para inhibir la transcripción del gen 24P4C12 comprende poner en contacto el gen 24P4C12 con un polinucleótido antisentido 24P4C12. En otro enfoque, un método para inhibir la traducción de ARNm de 24P4C12 comprende poner en contacto un ARNm de 24P4C12 con un polinucleótido antisentido. En otro enfoque, se usa una ribozima específica de 24P4C12 para escindir el mensaje de 24P4C12, inhibiendo así la traducción. Dichos procedimientos basados en la utilización de polinucleótidos antisentido y ribozimas también pueden dirigirse a las regiones reguladores del gen 24P4C12, como elementos promotores y/o potenciadores de 24P4C12. De modo similar, se usan las proteínas capaces de inhibir un factor de transcripción del gen 24P4C12 para inhibir la transcripción de ARNm de 24P4C12. Los diversos polinucleótidos y composiciones útiles en los procedimientos mencionados anteriormente ya se han descrito. El uso de moléculas antisentido y ribozimas para inhibir la transcripción y la traducción es bien conocido en la técnica.
[0499] Otros factores que inhiben la transcripción de 24P4C12 al interferir con la activación transcripcional de 24P4C12 son también útiles para tratar cánceres que expresan 24P4C12. Asímismo, los factores que interfieren con el proceso de 24P4C12 sirven para tratar los cánceres que expresan 24P4C12. Los métodos de tratamiento del cáncer que hacen uso de dichos factores también forman parte del objetivo de la presente invención.
X.E.) Consideraciones generales para estrategias terapéuticas
[0500] Las tecnologías de terapia génica y transferencia génica pueden usarse para administrar moléculas de polinucleótidos terapéuticos a células tumorales que sintetizan 24P4C12 (es decir, antisentido, ribozimas, polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas inhibitorias de 24P4C12). Se conocen varios métodos de terapias génicas en la técnica. Los vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido de 24P4C12, ribozimas, factores capaces de inerferir en la transcripción de 24P4C12, etc., pueden administrarse a las células tumorales diana utilizando dichos métodos de terapias génicas.
[0501] Los enfoques terapéuticos anteriores pueden combinarse con cualquiera de los regímenes quirúrgicos, de quimioterapia o radioterapia. Los métodos terapéuticos descritos en la invención hacen posible el uso de dosis reducidas de quimioterapia (u otras terapias) y/o una administración menos frecuente; lo que supone una ventaja para todos los pacientes y, especialmente, para aquellos que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
[0502] La actividad antitumoral de una determinada composición (p.ej., antisentido ribozima, intracuerpo)
o una combinación de dichas composiciones, puede evaluarse usando varios sistemas de ensayo in vitro e in vivo. Entre los ensayos in vitro que evalúan la actividad terapéutica se incluyen: ensayos del crecimiento celular, ensayos de agar blando y otros ensayos indicativos de actividad de estimulación tumoral, ensayos de unión capaces de determinar la medida en la que una composición terapéutica inhibirá la unión de 24P4C12 a un asociado de unión, etc.
[0503] In vivo, se puede evaluar el efecto de la composición terapéutica de 24P4C12 en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, pueden usarse modelos de cáncer de próstata xenogénicos, en los que los explantes de cáncer de próstata humanos o tejidos de xenoinjertos transferidos son introducidos en animales inmunocomprometidos, como ratones desnudos o con SCID (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, la solicitud de patente PCT WO98/16628 y la Patente de EE.UU.
6.107.540 describen varios modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata capaces de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación de metástasis osteoblásticas características de la enfermedad en etapas avanzadas. Se puede predecir la eficacia usando ensayos que miden la inhibición de la formación del tumor, regresión del tumor o metástasis y similares.
[0504] Los ensayos in vivo que evalúan la promoción de la apoptosis son útiles para la evaluación de las composiciones terapéuticas. En un modo de realización, los xenoinjertos de ratones que padecen tumores tratados con la composición terapéutica pueden examinarse para detectar la presencia de focos apoptóticos y compararse con ratones portadores de xenoinjertos de control no tratadas. La extensión de los focos apoptóticos en los tumores de ratones tratados proporciona indicios de la eficacia terapéutica de la composición.
[0505] Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los métodos anteriores pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un portador adecuado para el método de administración deseado. Entre los portadores adecuados se incluye cualquier material que, combinado con la composición terapéutica, conserve la función antitumoral de la composición terapéutica y que, generalmente, sea no reactivo con el sistema inmunológico del paciente. Los ejemplos incluyen, sin carácter limitativo, cualquiera de los portadores farmacéuticos convencionales, como: soluciones salinas tamponadas con fosfato estériles, agua bacteriostática y similares (véase, en general, Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª Edición, A. Osal., Ed., 1980).
[0506] Las formulaciones terapéuticas pueden solubilizarse y administrarse por cualquier vía capaz de liberar la composición terapéutica en el lugar del tumor. Entre las vías de administración potencialmente eficaces se incluyen, sin carácter limitativo, la intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica y similares. Una formulación preferente para inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática conservada, agua estéril no conservada y/o diluida en cloruro de polivinilo o bolsas de polietileno que contienen un 0,9% de cloruro sódico estéril para su inyección, USP. Los preparados de proteínas terapéuticos pueden liofilizarse y almacenarse como polvos estériles, preferiblemente al vacío, y después reconstituirse en agua bacteriostática (que contiene, por ejemplo, conservante de alcohol bencílico) o en agua estéril antes de la inyección.
[0507] Los protocolos de administración y dosificación para el tratamiento de cánceres mediante el uso de los métodos anteriores variarán según el método y el cáncer a tratar y dependerán, por lo general, de una serie de otros factores apreciados en la técnica.
XI.) Identificación, caracterización y uso de moduladores de 24P4C12.
Métodos para identificar y usar moduladores
[0508] En un modo de realización, se lleva a cabo el cribado con el objetivo de identificar moduladores que inducen o suprimen un perfil de expresión particular, suprimir o inducir vías específicas, preferentemente generando el fenotipo asociado de este modo. En otro modo de realización, habiendo identificado genes expresados de modo diferencial importantes en un estado concreto; los cribados se realizan para identificar moduladores que alteren la expresión de genes individuales, ya sea un aumento
o una disminución. En otro modo de realización, se lleva a cabo el cribado para identificar moduladores que alteran una función biológica del producto de la expresión de un gen expresado de modo diferencial. De nuevo, habiendo identificado la importancia de un gen en un estado conreto, se realizan los cribados para identificar agentes que unen y/o modulan la actividad biológica del producto del gen.
[0509] Además, se realizan cribados para localizar los genes que son inducidos en respuesta a un agente candidato. Después de identificar un modulador (uno que suprime un perfil de expresión de cáncer derivando en un perfil de expresión normal, o un modulador de un gen canceroso que dirige a la expresión del gen como en tejido normal), lleva a cabo un cribado para identificar genes que son específicamente modulados en respuesta al agente. Al comparar perfiles de expresión entre tejidos normales y tejidos cancerosos tratados con agente, encontramos genes que no se expresan en tejidos normales o tejidos cancerosos, pero se expresan en tejido tratado con agente, y viceversa. Estas secuencias específicas del agente son identificadas y usadas en procedimientos descritos en el presente documento para proteínas o genes cancerosos. En concreto, estas secuencias y las proteínas que éstas codifican se usan al marcar e identificar células tratadas con agentes. Además, los anticuerpos aumentan frente a las proteínas inducidas por agentes y se utilizan con el fin de dirigir tratamientos terapéuticos innovadores para la muestra de tejido canceroso tratada.
Ensayos de cribado e identificación relacionados con modulador
Ensayos relacionados con la expresión génica
[0510] Las proteínas, ácidos nucleicos y anticuerpos de la invención se utilizan en ensayos de cribado. Las proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos, proteínas modificadas y células asociados al cáncer que contienen estas secuencias se usan en ensayos de cribado, como en la evaluación del efecto de los candidatos a fármaco en un “perfil de expresión génica”, perfil de expresión de polipéptidos o alteración de función biológica. En un modo de realización, los perfiles de expresión se usan, preferentemente junto con técnicas de cribado de alto rendimiento para permitir la monitorización para localizar los genes con perfil de expresión después del tratamiento con un agente candidato (p.ej., Davis, GF, et al., J Biol Screen 7:69 (2002); Zlokarnik, et al., Science 279:84-8 (1998), Heid, Genome Res 6:986-94, 1996).
[0511] Las proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos, proteínas modificadas y células cancerosas que contienen genes o proteínas cancerosas originales o modificados se usan en ensayos de cribado. Es decir, esta invención presenta métodos para el cribado para encontrar composiciones que modulan el fenotipo de cáncer o una función fisiológica de una proteína cancerosa de la invención. Esto se lleva a cabo en el mismo gen o mediante la evaluación del efecto de los candidatos a fármacos en un “perfil de expresión génica” o función biológica. En un modo de realización, se utilizan los perfiles de expresión, preferentemente junto con técnicas de cribado de alto rendimiento para permitir la monitorización después del tratamiento con un agente candidato, véase Zlokamik, supra.
[0512] Una variedad de ensayos se llevan a cabo y se dirigen a los genes y proteínas descritos en la invención. Los ensayos se efectúan a nivel de proteína o ácido nucleico individual. Es decir, habiendo identificado un gen concreto que aumenta en el cáncer, los compuestos de prueba son examinados para comprobar la capacidad de modular la expresión génica o para unirse a la proteína cancerosa descrita en la invención. La “modulación” en este contexto se refiere a un aumento o una disminución en la expresión génica. La cantidad preferente de modulación dependerá del cambio original de la expresión génica en tejido normal frente a tejido que padece cáncer, con cambios de al menos el 10%, preferentemente del 50%, más preferentemente del 100-300% y, en algunos modos de realización del 300-1000% o de un porcentaje mayor. Por tanto, si un gen exhibe un aumento de 4 veces en el tejido canceroso comparado con el tejido normal, se desea a menudo una disminución de aproximadamente cuatro veces; de modo similar, una disminución de 10 veces en el tejido canceroso comparada con tejido normal, se desea con frecuencia un valor diana de un aumento de 10 veces en la expresión por el compuesto de prueba. Los moduladores que exacerban el tipo de expresión génica observada en el cáncer también son útiles, p.ej., como una diana aumentada en análisis adicionales.
[0513] La cantidad de expresión génica se controla usando sondas de ácido nucleico y la cuantificación de los niveles de expresión génica o, como alternativa, un mismo producto génico es monitorizado, p.ej., mediante el uso de anticuerpos para la proteína cancerosa e inmunoensayos estándares. La proteinómica y técnicas de separación también permiten la cuantificación de la expresión
Monitorización de la expresión para identificar compuestos que modifican la expresión génica
[0514] En un modo de realización, la monitorización de la expresión génica, es decir, un perfil de expresión, es controlada simultáneamente para localizar un número de entidades. Dichos perfiles normalmente supondrán uno o más de los genes de la Figura 1. En este modo de realización, p.ej., las sondas de ácido nucleico canceroso están unidas a biochips para detectar y cuantificar las secuencias cancerosas de una célula concreta. Como alternativa, puede utilizarse PCR. Por tanto, una serie, p.ej., pocillos de una placa de microvaloración, puede usarse con cebadores dispensados en pocillos deseados. Una reacción PCR puede entonces tener lugar y analizarse en cada pocillo
[0515] La monitorización de la expresión se efectúa para identificar compuestos que modifican la expresión de una o más secuencias asociadas al cáncer, p.ej., una secuencia de polinucleótidos mostrada en la Figura 1. En general, se añade un modulador de prueba a las células antes del análisis. Además, los cribados también se utilizan para identificar agentes que modulan cáncer, modulan proteínas cancerosas descritas en la invención, que se unen a una proteína cancerosa de la invención, o que interfieren con la unión de una proteína cancerosa de la invención y un anticuerpo u otro asociado de unión.
[0516] En un modo de realización, los métodos de cribado de alto rendimiento conllevan proveer una biblioteca que contiene un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos candidatos). Después, dichas “bibliotecas químicas combinatorias” se criban en uno o más ensayos para identificar aquellos miembros de la biblioteca (subclases o especies químicas concretas) que muestran una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden servir como “compuestos líderes” convencionales, como compuestos para cribado, o como tratamiento terapéutico.
[0517] En determinados modos de realización, las bibliotecas combinatorias de moduladores potenciales se examinan para en busca de la capacidad de unirse a un polipéptido canceroso o de modular la actividad. Convencionalmente, se generan nuevas entidades químicas con propiedades útiles mediante la identificación de un compuesto químico (llamado un “compuesto líder”) con alguna actividad o propiedad deseada, p.ej., inhibiendo la actividad, creando variantes del compuesto líder, y evaluando las propiedades y la actividad de aquellos compuestos de variante. Con frecuencia, se emplean los métodos de cribado de alto rendimiento (HTS, en inglés) para dicho análisis.
[0518] Como se ha señalado anteriormente, la monitorización de la expresión génica se utiliza convenientemente para examinar moduladores candidatos (p.ej., proteína, ácido nucleico o molécula pequeña). Después de haber añadido el agente candidato y haber permitido la incubación de las células durante un periodo, la muestra que contiene una secuencia diana para ser analizada, p.ej., se añade al biochip.
[0519] Si es necesario, se prepara la secuencia diana usando técnicas conocidas. Por ejemplo, se trata una muestra para lisar las células, usando tampones de lisis conocidos, electroporación, etc., con purificación y/o amplificación como PCR llevado a cabo, según el caso. Por ejemplo, se realiza una transcripción in vitro con marcadores unidos con enlace covalente a los nucleótidos. En general, los ácidos nucleicos se marcan con biotina-FITC o PE, o con cy3 o cy5.
[0520] La secuencia diana puede marcarse con, p.ej., una señal radioactiva, fluorescente, quimioluminiscente o química para ofrecer un medio de detección de la unión específica de la secuencia diana a una sonda. La marca también puede ser una enzima, como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante, que cuando se proporcionan con un sustrato apropiado produce un producto detectable. Como alternativa, la etiqueta es un compuesto marcado o una molécula pequeña, como un inhibidor de enzima, que une pero que no se cataliza ni altera por la enzima. La etiqueta también puede ser una fracción o un compuesto, como una etiqueta de epítopo o biotina que se une específicamente a estreptavidina. Para el ejemplo de la biotina, la estreptavidina se marca como se describe anteriormente, proporcionando de este modo una señal detectable para la secuencia diana unida. Normalmente, la estreptavidina marcada no ligada se eliminar antes del análisis.
[0521] Como apreciarán los expertos en la técnica, estos ensayos pueden ser ensayos de hibridación directa o pueden comprender “ensayos sándwich”, que incluyen el uso de mútiples sondas, como se presenta generalmente en las Patentes de EE.UU. núms 5.681.702; 5.597.909; 5.545.730; 5.594.117; 5.591.584; 5.571.670; 5.580.731; 5.571.670; 5.591.584; 5.624.802; 5.635.352; 5.594.118; 5.359.100;
5.124.246 y 5.681.697. En este modo de realización, en general, el ácido nucleico diana se prepara como se indica anteriormente, y después se añade al biochip que está compuesto de una pluralidad de sondas de ácido nucleico, en condiciones que permiten la formación de un complejo de hibridación.
[0522] En la presente invenció, se utilizan una variedad de condiciones de hibridación, incluidas condiciones bajas, moderadas y altas como se ha señalado con anterioridad. Los ensayos generalmente se llevan a cabo en condiciones de astringencia que permiten la formación del complejo de hibridación de sonda marcada sólo en la presencia de diana. La astringencia puede controlarse alterando un parámetro de etapa que es una variable termodinámica, incluidas, sin carácter limitativo, la termperatura, concentración de formamida, concentración de sal, pH de concentración en sal caotrópica, concentración solvente orgánica, etc. Estos parámetros también pueden usarse para controlar la unión no específica, como se presenta generalmente en la Patente de EE.UU. Nº 5.681.697. Por tanto, puede ser deseable llevar a cabo ciertos pasos en condiciones de astringencia superiorespara reducir la unión no específica.
[0523] Las reacciones descritas en el presente documento pueden lograrse de diferentes modos. Los componentes de la reacción pueden añadirse de modo simultáneo, o secuencial, en diferentes órdenes, con modos de realización preferentes descritos más adelante. Además, la reacción puede incluir una variedad de otros reactivos. Estos incluyen sales, tampones, proteínas neutras, p.ej., albúmina, detergentes, etc. que pueden usarse para facilitar la detección e hibridación óptima y/o reducir interacciones de fondo o no específicas. Los reactivos que mejoran de otros modos la eficacia del ensayo, como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc., también pueden usarse, según proceda, dependiendo de los métodos de preparación de muestras y pureza de la diana. Los datos de ensayo se analizan para determinar los niveles de expresión de genes individuales, y los cambios en los niveles de expresión como entre estados, que forman un perfil de expresión génica.
Ensayos relacionados con actividad biológica
[0524] La invención se refiere a métodos para identificar o detectar un componente que module la actividad de una proteína o gen relacionados con cáncer de la invención. Los métodos comprenden la adición de un compuesto de prueba, como se define anteriormente, a una célula que comprenda una proteína cancerosa descrita en la invención. Las células contienen un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína cancerosa de la invención. En otro modo de realización, se ensaya una biblioteca de agentes candidatos en una pluralidad de células.
[0525] En un aspecto, los ensayos se evalúan en presencia o ausencia o previa o posterior exposición de señales fisiológicas, p.ej, hormonas, anticuerpos, péptidos, antígenos, citocinas, factores de crecimiento, potenciales de la acción, agentes farmacológicos que incluyen quimioterapia, radiación, carcinogénicos u otras células (es decir, contacto célula-célula). En otro ejemplo, las determinaciones se toman en diferentes etapas del proceso de ciclo celular. De este modo, se identifican los compuestos que modulan genes o proteínas de la invención. Los compuestos con actividad farmacológica son capaces de mejorar o interferir la actividad de la proteína cancerosa de la invención. Una vez identificados, se evalúan estructuras similares para identificar características estructurales fundamentales del compuesto.
[0526] En un modo de realización, se ofrece un método de modular (p.ej., ide inhibir) la división celular cancerosa; el método comprende la administración de un modulador para el cáncer. En otro modo de realización, se proporciona un método de modular (p.ej., inhibir) el cáncer; el método comprende la administración de un modulador para el cáncer. En un modo de realización adicional, se proporcionan métodos para tratar células o sujetos con cáncer; el método comprende la administración de un modulador para el cáncer.
[0527] En un modo de realización, se proporciona un método para modular el estado de una célula que expresa un gen de la invención. Como se utiliza en el presente documento, el estado comprende dichos parámetros aceptados en la técnica como el crecimiento, proliferación, supervivencia, función, apoptosis, degradación, localización, actividad enzimática, transducción de señal, etc. de una célula. En un modo de realización, un inhibidor de cáncer es un anticuerpo como se ha descrito anteriormente. En otro modo de realización, el inhibidor de cáncer es una molécula antisentido, oligómero de ARNhc (administrado por ADN o por infección con un virus que incluye, sin carácter limitativo, adenovirus, virus asociados con adeno, lentivirus o retrovirus). Los expertos en la técnica conocen ensayos de metástasis, proliferación, crecimiento celular como se describen en el presente documento.
Cribado de alto rendimiento para identificar moduladores
[0528] Los ensayos para identificar los moduladores adecuados son susceptibles de cribado de alto rendimiento. Los ensayos preferentes detectan de este modo mejora o inhibición de transcripción de genes del cáncer, inhibición o mejora de la expresión polipeptídica e inhibición o mejora de la actividad polilpeptídica.
[0529] En un modo de realización, los moduladores evaluados en los métodos de cribado de alto rendimiento son proteínas, a menudo proteínas de origen natural o fragmentos de proteínas de origen natural. De esta manera, se utilizan, p.ej., extractos celulares que contienen proteínas o soluciones de digestión dirigidas o aleatorias de extractos celulares proteicos. De este modo, se realizan bibliotecas de proteínas para cribar en los métodos de la invención. En este modo de realización son particularmente preferidas las bibliotecas de proteínas bacterianas, fúngicas, virales o de mamíferos, éstas últimas más preferidas, y especialmente preferidas las proteínas humanas. El compuesto de prueba particularmente útil se dirigirá a la clase de proteínas a las que pertenece la diana, p.ej., sustratos para enzimas, o ligando y receptores.
Uso de crecimiento y formación de colonias en agar blando para identificar y caracterizar moduladores
[0530] Las células normales necesitan un sustrato sólido para unirse y crecer. Cuando las células se transforman, pierden este fenotipo y crecen desligadas del sustrato. Por ejemplo, las células transformadas pueden crecer en cultivo en suspensión mezclado o suspendidas en medio semi sólido, como el agar blando o semisólido. Las células transformadas, cuando han sido transfectadas con genes supresores tumorales, pueden regenerar fenotipo normal y una vez más necesitan un sustrato sólido al que ligarse y crecer. Los ensayos de formación de colonia y crecimiento en agar blando se utilizan para identificar moduladores de secuencias cancerosas, que cuando se expresan en células huésped, inhiben la transformación y proliferación celular anormal. Un modulador reduce o elimina la capacidad de las células huésped para crecer suspendidas en medio sólido o semisólido, como el agar.
[0531] Las técnicas para la formación de colonia o crecimiento en agar blando en ensayos de suspensión se describen en Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3ª ed., 1994). Véanse también el apartado sobre métodos de Garkavtsev et al. (1996), supra.
Evaluación de la inhibición de contacto y limitación de la densidad de crecimiento para identificar y caracterizar moduladores
[0532] Típicamente, las células normales crecen en un perfil organizado y liso en cultivo celular hasta que tocan otras células. Cuando las células tocan otra célula, se inhiben por el contacto y dejan de crecer. Por el contrario, las células transformadas no se inhiben por el contacto y continúan su crecimiento a densidades altas en focos desorganizados. Por lo tanto, las células transformadas crecen a una densidad de saturación más alta que las células normales correspondientes. Lo que se detecta morfológicamente por la formación de una monocapa desorientada de células o células en focos. Como alternativa, se utiliza el índice de marcado con (3H)-timidina en la densidad de saturación para medir la limitación de densidad de crecimiento, de modo similar un ensayo MTT o Alamar Blue demostrará la capacidad de proliferación de células y la capacidad de los moduladores para afectar al mismo. Véase Freshney (1994), supra. Las células transformadas, cuando han sido transfectadas con genes supresores tumorales, pueden regenerar un fenotipo normal e inhibirse por el contacto y crecerían en una densidad más baja.
[0533] En este ensayo, el índice de marcado con (3H)-timidina en la densidad de saturación es un método preferente para medir la limitación de densidad de crecimiento. Las células huésped transformadas se transfectan con una secuencia asociada a cáncer y se cultivan durante 24 horas en densidad de saturación en condiciones de medio no limitativas. El porcentaje de células que marcan con (3H)-timidina se determina por cpm incorporado.
[0534] El crecimiento independiente de contacto se utiliza para identificar moduladores de secuencias cancerosas, que han guiado a transformación y proliferación celular anormal. Un modulador reduce o elimina el crecimiento independiente de contacto y devuelve las células a un fenotipo normal.
Evaluación del factor de de crecimiento o dependencia del suero para identificar y caracterizar moduladores
[0535] Las células transformadas tienen dependencia de suero más baja que sus equivalentes normales (véanse, p.ej., Temin, J. Natl. Cancer Inst. 37:167-175 (1996); Eagle et al., J. Exp. Med 131:836-879 (1970)); Freshney, supra. Esto es en parte debido a la liberación de varios factores de crecimiento por las células transformadas. El grado de factor de crecimiento o dependencia de suero de células huésped transformadas puede compararse con el de las de control. Por ejemplo, el factor de crecimiento o dependencia de suero de una célula se monitoriza en procedimientos para identificar y caracterizar compuestos que modulan secuencias asociadas al cáncer descritas en la invención.
Uso de los niveles de marcador específico de tumor para identificar y caracterizar moduladores
[0536] Las células tumorales liberan una cantidad mayor de ciertos factores (de aquí en adelante “marcadores específicos tumorales”) que sus equivalentes normales. Por ejemplo, el activador del plasminógeno (PA, en inglés) se libera del glioma humano a un nivel más alto que de células cerebrales normales (véase, p.ej., Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, págs. 178-184 (Mihich (ed.) 1985)). De modo similar, el factor de angiogénesis tumoral (FAT) se libera a un nivel superior en células tumorales que en sus equivalentes normales. Véase, p.ej., Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem. Cancer Biol. (1992)), mientras que el FGFb (factor de crecimiento fibrolástico básico) se libera de tumores endoteliales (Ensoli,
B. et al.).
[0537] Diversas técnicas que miden la liberación de estos factores se describen en Freshney (1994), supra. Véanse, también, Unkless et al., J. Biol. Chem. 249:4295-4305 (1974); Strickland & Beers, J. Biol. Chem. 251:5694-5702 (1976); Whur et al., Br. J. Cancer 42:305 312 (1980); Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, págs. 178-184 (Mihich (ed.) 1985); Freshney, Anticancer Res. 5:111-130 (1985). Por ejemplo, los niveles de marcador específico tumoral se monitorizan en métodos para identificar y caracterizar compuestos que modulan secuencias asociadas a cáncer descritas en la invención.
Invasividad en Matrigel para identificar y caracterizar moduladores
[0538] El grado de invasividad en la Matrigel o un constituyente de la matriz extracelular puede usarse como un ensayo para identificar y caracterizar compuestos que modulan secuencias asociadas a cáncer. Las células tumorales muestran una correlación positiva entre la neoplasia maligna e invasividad de células en la Matrigel u otros constituyentes de la matriz extracelular. En este ensayo, las células tumorigénicas se utilizan normalmente como células huésped. La expresión de un gen supresor tumoral en estas células huésped disminuiría la invasividad de las células huésped. Pueden utilizarse las técnicas descritas en Cancer Res. 1999; 59:6010; Freshney (1994), supra. En resumen, el nivel de invasión de células huésped se mide mediante el uso de filtros revestidos con Matrigel o algún otro constituyente de matriz extracelular. La penetración en el gel, o a través del lado distal del filtro, se considera invasividad y se clasifica histológicamente por el número de células y distancia recorrida, o por la marca previa en las células con 1251 y el recuento de la radioactividad en el lado distal del filtro o final de la cubeta. Véase, p.ej., Freshney (1984), supra.
Evaluación del crecimiento del tumor in vivo para identificar y caracterizar moduladores
[0539] Los efectos de las secuencias asociadas a cáncer en el crecimiento celular se prueban en organismos inmunosuprimidos o transgénicos. Los organismos transgénicos se preparan de diferentes modos aceptados en la técnica. Por ejemplo, se hacen organismos transgénicos noqueados (knock-out), p.ej., mamíferos como los ratones, en los que se perturba un gen canceroso o se inserta un gen canceroso. Los ratones transgénicos noqueados se consiguen mediante inserción de un gen marcador u otro gen heterólogo en el sitio del gen canceroso endógeno en el genoma del ratón por una recombinación homóloga. Dichos ratones también pueden conseguirse sustituyendo el gen canceroso endógeno con una versión mutada del gen canceroso, o mutando el gen canceroso endógeno, p.ej., a través de la exposición a carcinógenos.
[0540] Para preparar animales quiméricos transgénicos, p.ej., ratones, se introduce un constructo de ADN en el núcleo de las células madre embrionarias. Las células que contienen la lesión genética recién manipulada se inyectan en un embrión de ratón huésped, que se reimplanta en una hembra recipiente. Algunos de estos embriones se convierten en ratones quiméricos que poseen células germinales, algunas de las cuales se derivan de la línea celular mutante. Por tanto, criando los ratones quiméricos es posible obtener una nueva línea de ratones que contenga la lesión genética introducida (véase, p.ej., Capecchi et al., Science 244:1288 (1989)). Los ratones quiméricos pueden obtenerse según la Patente de EE.UU. 6.365.797, publicada el 2 de abril de 2002; la Patente de EE.UU. 6.107.540 publicada el 22 de agosto de 2000; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., (1987).
[0541] Como alternativa, pueden usarse diversos animales huésped inmunodeficientes o inmunosupresores. Por ejemplo, puede usarse como huésped un ratón atímico “desnudo” genéticamente (véase, p.ej., Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 52:921 (1974)), un ratón con SCID, un ratón timectomizado o un ratón irradiado (véanse, p.ej., Bradley et al., Br. J. Cancer 38:263 (1978); Selby et al., Br. J. Cancer 41:52 (1980)). Las células tumorales transplantables (normalmente aproximadamente 106 células) inyectadas en huéspedes isogénicos producen tumores invasivos en una alta proporción de casos, mientras que las células normales de origen similar no lo harán. En huéspedes que desarrollaron tumores invasivos, las células que expresan secuencias asociadas a cáncer se inyectan de manera subcutánea u ortotópica. Después, los ratones se dividen en grupos, incluyendo grupos de control y grupos experimentales tratados (p.ej., tratados con un modulador). Transcurrido un periodo de tiempo adecuado, preferentemente 4-8 semanas, se mide el crecimiento tumoral (p.ej., por volumen o por sus dos dimensiones más grandes, o por el peso) y se compara con el control. Se afirma que los tumores que observan una reducción estadísticamente significativa (usando, p.ej., una prueba T de Student) han inhibido el crecimiento.
Ensayos in vitro para identificar y caracterizar moduladores
[0542] Pueden llevarse a cabo ensayos in vitro para identificar los compuestos con actividad moduladora. Por ejemplo, un polipéptido canceroso se pone en contacto en primer lugar con un modulador potencial y se incuba durante un periodo de tiempo adecuado, p.ej., de 0,5 a 48 horas. En un modo de realización, los niveles de polipéptido canceroso se determinan in vitro midiendo el nivel de proteína o ARNm. El nivel de proteína se mide usando inmunoensayos como la transferencia Western blot, ELISA y similares con un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido canceroso o a un fragmento del mismo. Para medir el ARNm, se prefieren la amplificación, p.ej., usando ensayos de hibradación, por PCR o LCR, o ensayor de hibridación p.ej., hibridación Northern, protección de ARNsa, técnica dot-blot. El nivel de proteína o ARNm se detecta usando agentes de detección marcados directa o indirectamente, p.ej., ácidos nucleicos marcados radioactivamente, anticuerpos marcados enzimática o radioactivamente y similares, como se describe en el presente documento.
[0543] Como alternativa, un sistema de gen indicador puede diseñarse usando un promotor de proteína cancerosa operablemente unido a un gen indicador como luciferasa, proteína fluorescente verde, CAT o P-gal. Normalmente, el constructo indicador se transfecta en una célula. Después del tratamiento con un modulador potencial, se mide la cantidad de actividad, traducción o transcripción génica indicadora según las técnicas estándares conocidas por los profesionales de la técnica (Davis GF, supra; Gonzalez,
J. & Negulescu, P. Curr. Opin. Biotechnol. 1998: 9:624).
[0544] Como se describe anteriormente, los cribados in vitro se llevan a cabo en genes individuales o productos génicos. Es decir, habiendo identificado un gen concreto expresado de modo diferencial como importante en un estado particular, se lleva a cabo el cribado de los moduladores de la expresión del gen
o producto del gen mismo.
[0545] En un modo de realización, se realiza el cribado para buscar moduladores de expresión de gen o genes específico(s). Normalmente, se evalúa la expresión de sólo uno o unos pocos genes. En otro modo de realización, los cribados están diseñados para, en primer lugar, encontrar compuestos que se unan a proteínas expresadas de modo diferencial. Después, estos compuestos se evalúan para comprobar la capacidad de modular la actividad expresada de modo diferencial. Además, una vez identificados los compuestos candidatos iniciales, pueden cribarse las variantes para evaluar mejor las relaciones de actividad estructural.
Ensayos de unión para identificar y caracterizar moduladores
[0546] En los ensayos de unión según la invención, se utiliza generalmente un producto génico asilado o purificado de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos son generados para una proteína de la invención, y se practican inmunoensayos para determinar la cantidad y/o localización de una proteína. Como alternativa, se utilizan las células que comprenden proteínas cancerosas en los ensayos.
[0547] Por tanto, los métodos consisten en combinar una proteína cancerosa de la invención y un compuesto candidato como un ligando, y determinar la unión de un compuesto a la proteína cancerosa descrita en la invención. Los modos de realización preferentes utilizan la proteína cancerosa humana; también pueden usarse y desarrollarse modelos animales de la enfermedad humana. Además, pueden usarse otras proteínas de mamíferos análogas como aprecian aquellos expertos en la técnica. Además, en algunos modos de realización se utilizan proteínas cancerosas derivadas o variantes.
[0548] En general, la proteína cancerosa descrita en la invención, o el ligando, está unida de modo no difusible a un soporte insoluble. El soporte puede ser, p.ej., uno que tenga áreas que reciben muestras aisladas (una placa de microvaloración, una matriz, etc.). Los soportes insolubles pueden realizarse de cualquier composición a la que pueden unirse las composiciones, es fácilmente separada de material soluble y es compatible de otros modos con los métodos de cribado en general. La superficie de dichos soportes puede ser sólida o porosa o de cualquier otra forma conveniente.
[0549] Ejemplos de soportes insolubles adecuados incluyen placas de microvaloración, matrices, membranas y microesferas. Normalmente, están hechos de vidrio, plástico (p.ej., poliestireno), polisacárido, nilón, nitrocelulosa, o TeflonTM, etc. Las placas de microvaloración y las matrices son especialmente convenientes porque pueden llevarse a cabo simultáneamente un gran número de ensayos, usando pequeñas cantidades de reactivos y de muestras. El modo particular de unión de la composición al soporte no es crucial siempre y cuando sea compatible con los reactivos y los métodos generales descritos en la invención, mantiene la actividad de la composición y no es difusible. Los métodos de unión preferentes incluyen el uso de anticuerpos que no bloquean estéricamente ni el sitio de unión al ligando ni la secuencia de activación al unir la proteína al soporte, unión directa a soportes iónicos o “cohesivos”, entrecruzamiento químico, la síntesis de la proteína o agente en la superficie, etc. Siguiendo a la unión de la proteína o ligando/agente de unión al soporte, se elimina el material no unido excedente mediante lavado. La muestra que recibe áreas puede bloquearse después por incubación con albúmina de suero bovino (BSA, en inglés), caseína u otras proteínas inocuas u otras fracciones.
[0550] Una vez que una proteína cancerosa de la invención está unida al soporte, se añade un compuesto de prueba al ensayo. Como alternativa, el agente de unión candidato está enlazado al soporte y entonces se añade la proteína cancerosa de la invención. Los agentes de unión incluyen anticuerpos específicos, agentes de unión no natural identificados en cribados de bibliotecas químicas, análogos peptídicos, etc.
[0551] Los ensayos para identificar agentes que tienen una toxicidad baja para células humanas son de gran interés. Pueden usarse una amplia variedad de ensayos con este propósito, incluidos ensayos de proliferación, ensayos de AMPc, ensayos de unión proteína-proteína in vitro marcados, ensayos de cambio de movilidad electroforética, inmunoensayos para la unión de proteínas, ensayos funcionales (ensayos de fosforilación, etc.) y similares.
[0552] Una estudio de unión del compuesto de prueba (ligando, agente de unión, modulador, etc.) a una proteína cancerosa de la invención puede llevarse a cabo de diferentes modos. El compuesto de prueba puede marcarse y determinar la unión directamente, p.ej., uniendo toda o una porción de la proteína cancerosa de la invención a un soporte sólido, uniendo un compuesto candidato marcado (p.ej, una marca fluorescente), lavando el reactivo excedente y determinando si la marca está presente en el soporte sólido. Diversos pasos de lavado y bloqueo pueden usarse según corresponda.
[0553] En ciertos modos de realización, sólo se marca uno de los componentes, p.ej., una proteína de la invención o ligandos marcados. Como alternativa, se marca más de un componente con diferentes etiquetas, p.ej., I125, para las proteínas y un fluoróforo para el compuesto. Los reactivos de proximidad, p.ej., reactivos de transferencia de energía o extinción también son útiles.
Unión competitiva para identificar y caracterizar moduladores
[0554] En un modo de realización, la unión del “compuesto de prueba” se determina por el ensayo de unión competitivo con un “competidor”. El competidor es un fragmento de unión que se une a la molécula diana (p.ej., una proteína cancerosa de la invención). Los competidores incluyen compuestos como anticuerpos, péptidos, asociados de unión, ligandos, etc. En determinadas circunstancias, la unión competitiva entre el compuesto de prueba y el competidor desplaza el compuesto de prueba. En un modo de realización, se marca el compuesto de prueba. Ya sea el compuesto de prueba, el competidor o ambos se añaden a la proteína durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir la unión. Las incubaciones se llevan a cabo a una temperatura que facilita la actividad óptima, normalmente entre cuatro y 40ºC. Normalmente, los periodos de incubación se optimizan, p.ej., para facilitar el cribado de alto rendimiento rápido; normalmente entre cero y una hora será suficiente. Generalmente, el reactivo excedente se elimina o se lava. Entonces, se añade el segundo componente y le sigue la presencia o ausencia del componente marcado para indicar la unión.
[0555] En un modo de realización, el competidor se añade en primer lugar, seguido por el componente de prueba. El desplazamiento del competidor indica que el compuesto de prueba está uniéndose a la proteína cancerosa y, por tanto, es capaz de unirse a, y potencialmente modular, la actividad de la proteína cancerosa. En este modo de realización, cualquier componente puede marcarse. En consecuencia, p.ej., si el competidor está marcado, la presencia de una etiqueta en la solución de lavado del componente de prueba posterior indica el desplazamiento por parte del compuesto de prueba. Como alternativa, si se marca el compuesto de prueba, la presencia de la marca en el soporte indica desplazamiento.
[0556] En un modo de realización alternativo, el compuesto de prueba se añade en primer lugar, con incubación y lavado, seguido por el competidor. La ausencia de unión por el competidor indica que el compuesto de prueba se une a la proteína cancerosa con afinidad más alta que el competidor. Por tanto, si el compuesto de prueba está marcado, la presencia de la etiqueta en el soporte, vinculada con la falta de unión del competidor, indica que el compuesto de prueba se une a y, de este modo, potencialmente modula la proteína cancerosa de la invención.
[0557] En consecuencia, los procedimientos de unión competitiva comprenden cribados diferenciales para identificar agentes que son capaces de modular la actividad de las proteínas cancerosas de la invención. En este modo de realización, los métodos comprenden la combinación de una proteína cancerosa y un competidor en una primera muestra. Una segunda muestra consiste de un compuesto de prueba, la proteína cancerosa y un competidor. La unión del competidor se determina por ambas muestras y un cambio o diferencia en la unión entre las dos muestras indica la presencia de un agente capaz de unirse a la proteína cancerosa y potencialmente modular su actividad. Es decir, si la unión del competidor es diferente en la segunda muestra en comparación con la primera muestra, el agente es capaz de unirse a la proteína cancerosa.
[0558] Como alternativa, se utiliza el cribado diferencial para identificar los candidatos a fármacos que se unen a la proteína cancerosa nativa, pero que no pueden unirse a proteínas cancerosas modificadas. Por ejemplo, la estructura de la proteína cancerosa se modela y utiliza en fármacos racionales diseñados para sintetizar agentes que interacción con ese lugar, agentes que generalmente no se unen a proteínas modificadas de sitio. Además, dichos candidatos a fármaco que afectan a la actividad de una proteína cancerosa nativa también se identifican mediante el cribado de fármacos para comprobar la capacidad tanto de aumentar como de reducir la actividad de dichas proteínas.
[0559] Pueden usarse controles positivos y controles negativos en los ensayos. Preferiblemente, las muestras de prueba y de control se toman al menos por triplicado para obtener resultados estadísticamente significativos. La incubación de todas las muestras tiene lugar durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión del agente a la proteína. Tras la incubación, se lavan las muestras para que queden libres de material de unión no específica y la cantidad de unión, generalmente determinadao por el agente marcado. Por ejemplo, cuando se emplea una radiomarca, se pueden contar las muestras en un contador de centelleo para determinar la cantidad de compuesto de unión.
[0560] Pueden incluirse una serie de otros reactivos en los ensayos de cribado. Estos incluyen reactivos como sales, proteínas neutras, p.ej., albúmina, detergentes, etc. que se utilizan para facilitar la unión proteína-proteína óptima y/o reducir interacciones anteriores o no específicas. También pueden usarse reactivos que mejoran de otro modo la eficacia del ensayo, como los inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc. La mezcla de componentes se añade siguiendo un orden que permite la unión necesaria.
Uso de polinucleótidos para regular por disminución o inhibir una proteína de la invención
[0561] Los moduladores de polinucleótidos de cáncer pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión al ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de unión al ligando adecuadas incluyen, sin carácter limitativo, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas u otros ligandos que se unen a receptores de superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de unión al ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión al ligando para unirse a su receptor o molécula correspondiente, o para bloquear la entrada del oligonucleótido antisentido o sentido o de su versión conjugada en la célula. Como alternativa, un modulador de polinucleótido de cáncer puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana, p.ej., por la formación de un complejo de polinucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. Se entiende que el uso de moléculas antisentido o modelos knock out y knock in también podría emplearse en ensayos de cribado como se ha descrito anteriormente, además de métodos de tratamiento.
Nucleótidos antisentido e inhibidores
[0562] En ciertos modos de realización, la actividad de una proteína asociada a cáncer es regulada por disminución, o completamente inhibida, por el uso de ARN nuclear pequeño (ARNnp) inhibidor o polinucleótidos antisentido, es decir, una proteína cancerosa de la invención, ARNm o una subsecuencia del mismo. La unión del polinucleótido antisentido al ARNm reduce la traducción y/o estabilidad del ARNm.
[0563] En el contexto de esta invención, los polinucleótidos antisentido pueden constar de nucleótidos de origen natural o especies sintéticas formadas a partir de subunidades de origen natural u homólogos próximos. Los polinucleótidos antisentido también pueden haber alterado las fracciones de azúcar o enlaces entre azúcares. Modelos ilustrativos son los fosforotioatos y otros sulfuros que contienen especies que se conocen por su uso en la técnica. Se incluyen en esta invención los análogos siempre y cuando funcionen con eficacia para hibridarse con nucleótidos de la invención. Véanse, p.ej., Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc., Natick, MA.
[0564] Dichos polinucleótidos antisentido pueden ser sintetizados fácilmente usando métodos recombinantes o sintetizados in vitro. El equipo para dicha síntesis puede adquirirse de varios vendedores, incluido Applied Biosystems. También es muy conocida por aquellos expertos en la técnica, la preparación de otros oligonucleótidos como fosforotioatos y derivados alquilados.
[0565] Las moléculas antisentido como se usan en la presente invención incluyen oligonucleótidos sentido y antisentido. Los oligonucleótidos sentido pueden usarse, p.ej., para bloquear la transcripción mediante la unión a una hebra antisentido. Los oligonucleótidos sentido y antisentido constan de una secuencia de ácidos nucleicos de una sola hebra (ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias diana de ARNm (sentido) o a ADN (antisentido) para moléculas de cáncer. Los oligonucleótidos sentido o antisentido, según la presente invención, constan de un fragmento generalmente de al menos aproximadamente 12 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 12 a 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido sentido o antisentido, basándose en una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe en, p.ej., Stein & Cohen (Cancer Res. 48:2659 (1998) y Van der Krol et al. (BioTechniques 6:958 (1998)).
Ribozimas
[0566] Además de los polinucleótidos antisentido, las ribozimas pueden usarse para dirigir e inhibir la transcripción de secuencias de nucleótidos asociados a cáncer. Una ribozima es una molécula de ARN que corta catalíticamente otras moléculas de ARN. Se han descrito diferentes tipos de ribozimas, incluyendo ribozimas de grupo I, ribozimas de cabeza de martillo, ribozimas horquilladas, ribonucleasa P y ribozimas de cabeza de hacha (véase, p.ej., Castanotto et al., Adv. in Pharmacology 25: 289-317 (1994) para una revisión general de las propiedades de diferentes ribozimas).
[0567] Las características generales de las ribozimas horquilladas se describen, por ejemplo, en Hampel et al., Nucl. Acids Res. 18:299-304 (1990); la publicación de la Patente Europea Nº 0360257; la Patente de EE.UU. Nº 5.254.678. Los procedimientos de preparación son bien conocidos para los profesionales de la técnica (véanse, p.ej., WO 94/26877; Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:6340-6344 (1993); Yamada et al, Human Gene Therapy 1:39-45 (1994); Leavitt et al, Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 92:699-703 (1995); Leavitt et al, Human Gene Therapy 5: 1151-120 (1995); y Yamada et al, Virology 205: 121-126 (1994)).
Uso de moduladores en el cribado fenotípico
[0568] En un modo de realización, se administra un compuesto de prueba a una población de células cancerosas, que tienen un perfil de expresión de cáncer asociado. En el presente documento, los términos “administración” o “poner en contacto” significan que se añade el modulador a las células de tal modo que permite que el modulador actúe sobre la célula, ya sea por acción intracelular y captación, o por acción en la superficie celular. En algunos modos de realización, se pone un ácido nucleico que codifica un agente proteico (es decir, un péptido) en un constructo viral como un constructo retroviral o adenoviral y se añade a la célula, de modo que se logra la expresión del agente peptídico, p.ej., WO9727212. También pueden usarse sistemas de terapia de gen regulable. Una vez administrado el modulador a las células, se lavan las células si se desea y se les permite incubar en condiciones fisiológicas preferentes durante algún periodo de tiempo. Después, se recogen las células y se genera un nuevo perfil de expresión génica. En consecuencia, p.ej., se analiza el tejido canceroso para encontrar agentes que modulan, p.ej., inducen o eliminan, el fenotipo canceroso. Un cambio en al menos un gen, preferentemente muchos, del perfil de expresión indica que el agente tiene un efecto en la actividad del cáncer. De modo similar, la alteración de una función biológica o una vía de señalización indica actividad del modulador. Con la definición de dicho distintivo para el fenotipo canceroso, se diseñan nuevos cribados para nuevos fármacos que alteran el fenotipo. Con este enfoque, la diana del medicamento no necesita ser conocida ni representarsda en la plataforma de cribado de la expresión proteína/gen original, tampoco necesita cambiar el nivel de transcripción para la proteína diana. El modulador que inhibe la función servirá como marcador indirecto.
[0569] Como se ha descrito anteriormente, los cribados se llevan a cabo para examinar genes o productos génicos. Es decir, habiendo identificado un gen concreto expresado de modo diferencial como importante en un estado particular, se realiza el cribado de moduladores tanto de la expresión del gen como del producto génico mismo.
Uso de moduladores para condicionar los péptidos de la invención
[0570] Las mediciones de actividad de polipéptido canceroso o del fenotipo canceroso se llevan a cabo usando una variedad de ensayos. Por ejemplo, los efectos de moduladores sobre la función de un polipéptido o polipéptidos cancerosos se miden por el control de los parámetros descritos anteriormente. Un cambio fisiológico que afecta a la actividad se utiliza para evaluar la influencia de un compuesto de prueba en los polipéptidos de esta invención. Cuando se determinan los resultados funcionales usando animales o células intactas, pueden evaluarse una variedad de efectos como, en el caso de un cáncer asociado con tumores sólidos, el crecimiento tumoral, metástasis tumoral, neovascularización, liberación de hormonas, cambios transcripcionales en marcadores genéticos tanto conocidos como desconocidos (p.ej., por análisis Northern blot), cambios en el metabolismo celular como el crecimiento celular o cambios en el pH y cambios en segundos mensajeros intracelulares como cGNIP
Métodos para identificar y caracterizar secuencias asociadas a cáncer
[0571] La expresión de diversas secuencias génicas se correlaciona con el cáncer. En consecuencia, se determinan los trastornos basados en genes cancerosos mutantes o variantes. En un modo de realización, la invención ofrece métodos para identificar células que contienen genes cancerosos variantes, p.ej., determinar la presencia de, toda o parte de, la secuencia de al menos un gen canceroso endógeno en una célula. Esto se logra usando cualquier número de técnicas de secuenciación. La invención proporciona métodos de identificación del genotipo canceroso de un sujeto, p.ej., determinando toda o parte de la secuencia de al menos un gen de la invención en el sujeto. En general, esto se realiza en al menos un tejido del sujeto, p.ej., un tejido indicado en la Tabla I, y puede incluir la evaluación de un número de tejidos o de diferentes muestras del mismo tejido. El método puede incluir la comparación de la secuencia del gen secuenciado con un gen canceroso conocido, p.ej., un gen tipo silvestre para determinar la presencia de miembros familiares, homologías, mutaciones o variantes. La secuencia de todo o parte del gen puede compararse entonces con la secuencia de un gen canceroso conocido para determinar si existen diferencias. Esto se realiza usando cualquier número de programas de homología conocidos, como BLAST, Bestfit, etc. La presencia de una diferencia en la secuencia entre el gen canceroso del paciente y el gen canceroso conocido se correlaciona con un estado de enfermedad o una tendencia a un estado de enfermedad, como se describe en el presente documento.
[0572] En un modo de realización preferente, se utilizan los genes cancerosos como sondas para determinar el número de copias de gen canceroso en el genoma. Los genes cancerosos se utilizan como sondas para determinar la localización cromosómica de los genes cancerosos. Lainformación como la localización cromosómica encuentra aplicación proporcionando un diagnóstico o pronóstico en concreto cuando se identifican anomalías cromosómicas como desplazamientos y similares en el locus del gen canceroso.
XII.) ARNi y uso terapéutico de ARN de interferencia pequeño (ARNip)
[0573] La presente invención también se refiere a oligonucleótidos de ARNip, en particular a los ARN de doble hebra que comprenden al menos un fragmento de la región que codifica 24P4C12 o región 5’ UTR,
o complemento, o cualquier oligonucleótido antisentido específico de la secuencia de 24P4C12. En un modo de realización dichos oligonucleótidos se usan para esclarecer una función de 24P4C12 o se usan para detectar o evaluar moduladores de la función o expresión de 24P4C12. En otro modo de realización, se reduce la expresión génica de 24P4C12 por el uso de transfección de ARNip y se traduce en una capacidad proliferativa significativamente disminuida de células cancerosas transformadas que expresan endógenamente el antígeno; las células tratadas con ARNip de 24P4C12 específico muestran una reducción en la supervivencia medida, p.ej., por una lectura metabólica de viabilidad celular correlacionado con la capacidad proliferativa reducida. En consecuencia, las composiciones de ARNip de 24P4C12 están compuestas de ARNip (ARN de doble hebra) que se corresponde con la secuencia de marco abierto de lectura (ORF, en inglés) de ácido nucleico de la proteína 24P4C12 o subsecuencias de la misma; estas subsecuencias son generalmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o más de 35 nucleótidos de ARN contiguos de longitud y contienen secuencias que son complementarias y no complementarias de al menos una porción de la secuencia que codifica ARNm. En un modo de realización preferente, las subsecuencias tienen 19-25 nucleótidos de longitud, más preferentemente 21-23 nucleótidos de longitud.
[0574] La interferencia por ARN es un enfoque innovador para silenciar genes in vitro e in vivo, por tanto los ARN de doble hebra pequeña (ARNip) son agentes terapéuticos valiosos. La capacidad de los ARNip para silenciar actividades génicas específicas se ha extendido a los modelos animales de enfermedad y se utiliza también en humanos. Por ejemplo, se ha demostrado que la infusión hidrodinámica de una solución de ARNip en un ratón con un ARNip frente a una diana concreta es terapéuticamente eficaz.
[0575] El trabajo pionero de Song et al. indica que un tipo de ácido nucleico completamente natural, ARN de interferencia pequeña (ARNip), sirvió como agente terapéutico incluso sin ninguna modificación química adicional (Song, E., et al. “RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis” Nat. Med. 9(3): 347-51 (2003)). Este trabajo divulgó la primera prueba in vivo de que la infusión de ARNip en un animal podría aliviar paliar la enfermedad. En ese caso, los autores introdujeron a los ratones inyecciones de ARNip diseñadas para silenciar la proteína FAS (un receptor muerto de células que cuando se sobreactiva durante la respuesta inflamatoria induce a hepatocitos y otras células a que mueran). Al día siguiente, los animales recibieron un anticuerpo específico de Fas. En unos días, los ratones controladodos murieron de fallo de hígado grave, mientras que más del 80% de los ratones tratados con ARNip no contrajeron la enfermedad grave y sobrevivieron. Entre el 80 % y el 90% de sus células de hígado incluyeron oligonucleótidos de ARNip desnudos. Además, las moléculas de ARN funcionaron durante 10 días antes de perder el efecto tras 3 semanas.
[0576] Para su uso en terapias humanas, ARNip se administra mediante sistemas eficaces que inducen actividad de ARNi perdurable. Hay que prestar una mayor precaución para su uso clínico para administrar ARNip en las células apropiadas. Parece que los hepatocitos son especialmente receptivos a ARN exógeno. En la actualidad, las dianas localizadas en el hígado son deseadas porque el hígado es un órgano que puede ser seleccionado como diana fácilmente por las moléculas de ácido nucleico y vectores virales. No obstante, también se prefieren otras dianas de tejido y órganos.
[0577] Se utilizan las formulaciones de ARNip con compuestos que promueven el tránsito a través de las membranas celulares para mejorar la administración de ARNip en la terapia. Los ARNip sintéticos modificados, que son inmunes a nucleasas y que tienen estabilidad de suero, tienen una duración mejorada concomitante de efectos de ARNi, son un modo de realización adicional.
[0578] Por tanto, la tecnología de ARNip es una terapia para la neoplasia maligna humana mediante la administración de moléculas de ARNip dirigidas a 24P4C12 a sujetos con cánceres, como los incluidos en la Tabla 1. Dicha administración de ARNip lleva a un crecimiento reducido de células cancerosas que expresan 24P4C12 y ofrece una terapia antitumoral, disminuyendo la morbidez y/o mortalidad asociadas con la neoplasia maligna. En otro modo de realización, el ARNip se administra por un virus como ARNhc (ARN de horquilla corta). Esta capacitación permite la expresión estable del ARNhc en células tanto in vitro como in vivo. El ARNhc puede administrarse mediante virus incluyendo, sin carácter limitativo, adenovirus, virus adenoasociado, lentivirus y retrovirus. Dichos sistemas permiten la transfección de ADN viral o partículas virales para infectar células para conseguir la expresión estable de ARNh y la eliminación estable de genes asociados con cáncer como 24P4C12.
[0579] La efectividad de esta modalidad de disminución de producto génico es significativa cuando se mide in vitro o in vivo. La efectividad in vitro es fácilmente demostrable a través de la aplicación de ARNip o ARNhc mediante virus o plásmido de ADN a células en cultivo (como se describe anteriormente) o a alícuotas de biopsias de pacientes con cáncer cuando se usan métodos in vitro para detectar la expresión reducida de proteína 24P4C12.
XIII.) KITS/Artículos manufacturados
[0580] El material necesario para el uso en el laboratorio y en las aplicaciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico y pronóstico descritas en el presente documento están dentro del alcance de la invención. Estos kits pueden comprender un vehículo, envase o recipiente que está compartimentado para recibir uno o más recipientes como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los recipientes uno de los elementos separados para usar en el procedimiento, junto con una etiqueta o prospecto que comprende las instrucciones para su uso, como un uso descrito en el presente documento. Por ejemplo, el recipiente o recipientes pueden contener una sonda que está o puede estar perceptiblemente marcada. Dicha sonda puede ser un anticuerpo o un polinucleótido específico para una proteína o un gen o mensaje de la invención, respectivamente. Cuando el método utiliza una hibridación de ácido nucleico para detectar el ácido nucleico diana, el kit también puede contener recipientes que contengan nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana. Los kits pueden comprender un recipiente que contenga un indicador, como una proteína de unión a la biotina, como avidina o estreptavidina, unida a una molécula indicadora, como un marcador enzimático, fluorescente o radioisótopo; puede usarse como un indicador con, p.ej., un ácido nucleico o anticuerpo. El kit puede incluir toda o parte de las secuencias de aminoácidos de la Figura 1, Figura 2 o Figura 3 o análogas de las mismas, o una molécula de ácido nucleico que codifica dichas secuencias de aminoácidos.
[0581] Normalmente, el material de la invención comprende el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes distintos asociados con el mismo que contienen materiales convenientes desde un punto de vista comercial y del usuario, entre los que se incluyen: tampones, diluyentes, flitros, agujas, jeringuillas, recipientes, envases, vehículos y/o los marcadores de tubo y viales que enumeran los contenidos y/o instrucciones de uso y prospectos con las instrucciones de uso.
[0582] El marcador puede estar presente en o con el recipiente para indicar que se utiliza la composición para una terapia específica o una aplicación no terapéutica, como una aplicación de laboratorio, diagnóstica, profiláctica o de pronóstico y también puede indicar instrucciones para su uso in vivo o in vitro, como las descritas en el presente documento. Las instrucciones y/u otra información también pueden incluirse en un(os) prospecto(s) o marcador(es) que se incluyen con o en el kit. El marcador puede estar en o asociarse con el recipiente. Un marcador puede estar en un recipiente en el que las letras, números u otros caracteres que forman el marcador están moldeados o grabados en el mismo recipiente; un marcador puede asociarse con un recipiente cuando está presente con un vehículo o receptáculo que también contiene el recipiente, p.ej., como un prospecto. El marcador puede indicar que la composición se utiliza para el diagnóstico, tratamiento, profilaxis o pronóstico de una afección, como una neoplasia de un tejido indicado en la Tabla I.
[0583] Los términos “kit” y “artículo manufacturado” pueden usarse como sinónimos.
[0584] En otro modo de realización de la invención, se proporciona un artículo o artículos manufacturados que contienen composiciones, como secuencia(s) de aminoácidos, molécula(s) pequeña(s), secuencia(s) de ácidos nucleicos y/o anticuerpo(s), p.ej., materiales útiles para la diagnosis, pronóstico, profilaxis y/o tratamiento de neoplasias de tejidos como los indicados en la Tabla I. El artículo manufacturado normalmente comprende al menos un recipiente y al menos un marcador. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden fabricarse de una diversidad de materiales como el vidrio, metal o plástico. El recipiente puede tener secuencia(s) de aminoácidos, molécula(s) pequeña(s), secuencia(s) de ácidos nucleicos, población(es) celular(es) y/o anticuerpo(s). En un modo de realización, el recipiente tiene un polinucleótido para usar al examinar el perfil de expresión de ARNm de una célula, junto con reactivos usados con este propósito. En otro modo de realización, un recipiente está compuesto de un anticuerpo, fragmento de unión del mismo o proteína de unión específica para usar en la evaluación de la expresión proteínica de 24P4C12 en células y tejidos, o para fines terapéuticos, profilácticos, de laboratorio, pronóstico y diagnóstico pertinentes. Las indicaciones y/o instrucciones para dichos usos pueden incluirse en o con dicho recipiente, del mismo modo que pueden usarse reactivos y otras composiciones o instrumentos con estos propósitos. En otro modo de realización, un recipiente contiene materiales para obtener una respuesta inmune humoral o celular, junto con indicaciones y/o instrucciones relacionadas. En otro modo de realización, un recipiente consta de materiales para inmunoterapia adoptiva, como células T citotóxicas (CTL) o células T auxiliares (HTL), junto con indicaciones y/o instrucciones relacionadas; también pueden incluirse reactivos y otras composiciones o herramientas utilizadas con dicho propósito.
[0585] El recipiente puede tener alternativamente una composición que es eficaz para el tratamiento, diagnóstico, pronóstico o profilaxis de una afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Los agentes activos en la composición pueden ser un anticuerpo capaz de unirse específicamente a 24P4C12 y modular la función de 24P4C12.
[0586] El artículo manufacturado puede constar además de un segundo recipiente que comprende un tampón terapéuticamente aceptable, como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y/o solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, mezcladores, agujas, jeringuillas y/o prospectos con indicaciones y/o instrucciones de uso.
EJEMPLOS:
[0587] A continuación, se describen e ilustran varios aspectos de la invención con mayor detalle mediante los siguientes ejemplos, ninguno de los cuales pretende limitar el alcancede la invención.
Ejemplo 1
Análisis de la expresión de variantes de 24P4C12 en tejidos normales y muestras de pacientes
[0588] La expresión de 24P4C12 se estudió en muestras de pacientes con cáncer de ovarios (Figura 5A). En resumen, se extrajo ARN de ovario normal, de tumores de pacientes con cáncer de ovario y de xenoinjertos LAPC-9AD de cáncer de próstata. Se realizó el análisis Norhtern blot con 10 ug de ARN total que se ensayaron con el fragmento de ADNc de 24P4C12. El tamaño de los patrones se indica en kilobases al lado. Los resultados mostraron la expresión de 24P4C12 en 13 o 16 muestras de pacientes de cáncer analizadas. No se observó expresión alguna en ovario normal.
[0589] La expresión de 24P4C12 en muestras de pacientes de cáncer de mama se muestra en la Figura 5B. El ARN se extrajo de mama normal, de tumores y líneas celulares de pacientes de cáncer de mama. El ensayo Northern blot con 10 ug de ARN total se analizó con el fragmento de ADNc de 24P4C12. Los tamaños estándares en kilobases se indican en un lado. Los resultados muestran la expresión de 24P4C12 en la mayoría de las muestras de pacientes de cáncer de mama analizadas y en las líneas celulares.
[0590] La figura 5C muestra los resultados de expresión de 24P4C12 en muestras de pacientes de cáncer de páncreas. Se extrajo ARN de páncreas normal, líneas celulares de cáncer de páncreas HPAC, CAPAN-1, CF-PAC-1 y muestras de tumor de pacientes de cáncer pancreático. El ensayo Northern blot con 10 ug de ARN total se analizó con el fragmento de ADNc de 24P4C12. Los tamaños estándares en kilobases se indican en un lado. Los resultados muestran la expresión de 24P4C12 en 6 o 7 muestras de pacientes de cáncer de páncreas analizadas y en 3 de 4 xenoinjertos de cáncer pancreático. Una expresión baja en relación con las muestras de cáncer pancreático se detectó en páncreas normales.
Ejemplo 2
Variante de corte y empalme de 24P4C12
[0591] Las variantes de tránscritos son variantes de ARNm maduro a partir del mismo gen que surgen por transcripción alternativa o corte y empalme alternativo. Los tránscritos alternativos son tránscritos del mismo gen pero que empiezan la transcripción en puntos diferentes. Las variantes de corte y empalme son variantes de ARNm cortado y empalmado de forma diferente a partir del mismo tránscrito. En eucariotas, cuando un gen multiexón se transcribe a partir de ADN genómimco, el ARN inicial se somete a corte y empalme para producir ARNm funcional, que sólo tiene exones y se utiliza para la traducción en una secuencia de aminoácidos. En consecuencia, un gen determinado puede tener de cero a muchos tránscritos alternativos y cada tránsito puede tener de cero a muchas variantes de corte y empalme. Cada variante de tránscrito tiene una composición de exones única y puede tener diferentes partes codificadoras y/o no codificadores (extremo 5’ o 3’), del tránscrito original. Las variantes de tránscrito pueden codificar proteínas similares o diferentes con la misma función o similar o pueden codificar proteínas con diferentes funciones, y puede expresarse en el mismo tejido al mismo tiempo, o en diferentes tejidos al mismo tiempo, o en el mismo tejido en momentos diferentes, o en diferentes tejidos en momentos diferentes. Las proteínas codificadas por las variantes de tránscritos pueden tener localizaciones celulares o extracelulares similares o diferentes, p.ej., intracelular frente a secretada.
[0592] Las variantes de tránscritos se identifican mediante una variedad de métodos aceptados en la técnica. Por ejemplo, los tránscritos alternativos y variantes de corte y empalme se identifican mediante experimento de clonación de longitud completa o mediante el uso del tránscrito de longitud completa y secuencias EST (marcador de secuencia expresada). En primer lugar, se agrupan todos los EST humanos en grupos que muestran identidad directa o indirecta unos con otros. En segundo lugar, los EST en el mismo grupo se agrupan de nuevo en subgrupos y se ensamblan en una secuencia consenso. La secuencia del gen original se compara con la secuencia o secuencias consenso y otras secuencias de longitud completa. Cada secuencia consenso es una variante de corte y empalme potencial para ese gen. Incluso cuando se identifica una variante que no es un clon de longitud completa, esa parte de la variante es muy útil para la generación de antígeno y para la clonación posterior de la variante de corte y empalme de longitud completa usando métodos conocidos en la técnica.
[0593] Además, están disponibles programas informáticos en la técnica que identifican variantes de tránscritos basados en secuencias genómicas. Los programas de identificación de variantes de tránscrito basados en genómica incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev, “Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA”, Genome Research. Abril del 2000; 10(4):516-22); Grail (URL compbio.ornl.gov/Grailbin/EmptyGrailForm) y GenScan (URL genes.mit.edu/GENSCAN.html). Para un análisis general de protocolos de identificación de variantes de corte y empalme véanse, p.ej., Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 8 de junio de 2001; 498(2-3):214-8; de Souza, S.J., et al., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc.Natl Acad Sci EE.UU. 7 de nocimebre de 2000; 97(23):12690-3.
[0594] Para confirmar en mayor medida los parámetros de una variante de tránscrito, existen disponibles una variedad de métodos en la técnica, como clonación de longitud completa, validación proteómica, validación basada en PCR y validación con RACE 5’, etc. (veánse, p.ej., validación proteómica: Brennan, S.O., et al., “Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry”, Biochem Biophys Acta. 17 de agosto de 1999;1433(1-2):321-6; Ferranti P, et al., “Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein”, Eur J Biochem. 1 de octubre de 1997; 249(1):1-7. Para la validación basada en PCR: Wellmann S, et al., “Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology”, Clin Chem. Abril de 2001; 47(4):654-60; Jia. H.P., et al., “Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach”, Gene. 24 de enero de 2001; 263(12):211-8. Para la validación basada en PCR y RACE 5’: Brigle, K.E., et al., ”Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms”, Biochem Biophys Acta. 7 de agosto de 1997; 1353(2): 191-8).
[0595] Se conoce en la técnica que las regiones genómicas están moduladas en los cánceres. Cuando la región genómica que mapea un gen está modulada en un cáncer concreto, los tránscritos alternativos
o variantes de corte y empalme del gen también están modulados. Se divulga en el presente documento que 24P4C12 tiene un perfil de expresión concreto relacionado con el cáncer. Los tránscritos alternativos y variantes de corte y empalme de 24P4C12 también pueden estar implicados en cánceres en el mismo
o en diferentes tejidos, de este modo sirven como antígenos/marcadores asociados al tumor. En consecuencia, los MAbs divulgados en el documento también se unen a las variantes de 24P4C12 que se presentan en la Figura 1.
Ejemplo 3
Polimorfismos de nucleótido único de 24P4C12
[0596] Un polimorfismo de nucleótido único (SNP, en inglés) es una variación de un par de bases sencilla en una secuencia de nucleótidos en una ubicación especifica. En cualquier punto dado del genoma, hay cuatro pares de bases de nucleótidos posibles: A/T, C/G Y T/A. El genotipo hace referencia a la secuencia de par de bases específica de una o más ubicaciones en el genoma de un sujeto. El haplotipo se refiere a la secuencia de par de bases de más de una ubicación en la misma molécula de ADN (o del mismo cromosoma en organismos superiores), a menudo en el contexto de un gen o en el contexto de varios genes unidos firmemente. Los SNP que suceden en un ADNc se denominan SNPc. Estos SNPc pueden cambiar aminoácidos de la proteína codificada por el gen y así cambiar las funciones de la proteína. Algunos SNP provocan enfermedades hereditarias; otros contribuyen a las variaciones cuantitativas en el fenotipo y reacciones a factores medioambientales incluyendo la dieta y fármacos entre sujetos. Por lo tanto, los SNP y/o combinaciones de alelos (llamadas haplotipos) tiene muchas aplicaciones, incluyendo el diagnóstico de enfermedades hereditarias, determinación de reacciones y dosis de fármacos, identificación de genes responsables de enfermedades y análisis de la relación genética entre sujetos (P. Nowotny, J.M., Kwon y A. M. Goate, “SNP analysis to dissect human traits”, Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Oct; 11(5):637-641; M. Pirmohamed y B. K. Park, “Genetic susceptibility to adverse drug reactions”, Trends Pharmacol. Sci. 2001 Jun; 22(6):298-305; J.H. Riley, C.
J. Allan, E. Lai y A. Roses, “The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes”, Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):39-47; R. Judson, J. C. Stephens y A. Windemuth, “The predictive power of haplotypes in clinical response”, Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):15-26).
[0597] Los SNP se identifican mediante una diversidad de métodos aceptados en la técnica (P. Bean, “The promising voyage of SNP target discovery”, Am. Clin. Lab. 2001 Oct-Nov; 20(9):18-20; K. M. Weiss, “In search of human variation”, Genome Res. 1988 Jul; 8(7):691-697; M. M. She, “Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies”, Clin. Chem. 2001 Feb; 47(2):164-172). Por ejemplo, los SNP se identifican secuenciando fragmentos de ADN que muestran polimorfismo mediante métodos basados en gen como polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, en inglés) y electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE, en inglés). También pueden descubrirse mediante la secuenciación directa de muestras de ADN acumuladas de diferentes sujetos o comparando secuencias en bases de datos públicas y privadas, pueden descubrirse SNP comparando las secuencias usando programas de ordenador (Z. Gu, L. Hillier y
P. Y. Kwok, “Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace”, Hum. Mutat. 1998; 12(4):221-225). Los SNP pueden verificarse y los genotipos o haplotipos de un sujeto pueden determinarse mediante una variedad de métodos que incluyen secuenciación directa y micromatrices de alto rendimiento (P. Y. Kwok, “Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms”, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines y A. Duesterhoeft, “High-throughput SNP genotyping with the Masscode system”, Mol. Diagn. 2000 Dec; 5(4):329-340).
Ejemplo 4
Producción de 24P4C12 recombinante en sistemas procarióticos
[0598] Para expresar 24P4C12 recombinante y variantes de 24P4C12 en células procarióticas, pueden clonarse secuencias de ADNc de 24P4C12 de longitud completa o parcial en cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos en la técnica. El ADNc de longitud completa o cualquiera 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de 24P4C12, variantes o análogos del mismo.
[0599] A. Construcciones de transcripción y traducción in vitro:
[0600] pCRII: Con el fin de generar sondas de ARN sentido y antisentido de 24P4C12 para investigaciones in situ de ARN, se generan construcciones pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA) que codifican todo o fragmentos del ADNc de 24P4C12. El vector pCRII tiene promotores Sp6 y T7 que flanquean el inserto para estimular la transcripción de ARN de 24P4C12 para su uso como sondas en experimentos de hibridación in situ de ARN. Estas sondas se utilizan para analizar la expresión celular y tisular de 24P4C12 a nivel del ARN. El ARN de 24P4C12 transcrito que representa la región de codificación de aminoácidos de ADNc del gen 24P4C12 se utiliza en los sistemas de traducción in vitro como el sistema TnTTM Coupled Reticulolysate System (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar la proteína 24P4C12.
[0601] B. Contrucciones bacterianas:
[0602] Construcciones pGEX: Para generar proteínas 24P4C12 recombinantes en bacterias que son fusionadas a la proteína Glutatión S-transgerasa (GST), todo o partes de ADNc o de variantes de 24P4C12 se clonan en el vector de fusión de GST de la familia de pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estas construcciones permiten la expresión controlada de las secuencias de proteína 24P4C12 recombinante con GST fusionado en el extremo amino y un epítopo de seis histidinas (6X His) en el extremo carboxilo. Los marcadores GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante a partir de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-GST y anti-His. El marcador 6X His se genera añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3’, p.ej., del marco de lectura abierto (ORF). Puede emplearse un sitio de escisión proteolítico, como el lugar de reconocimiento PreScissionTM en pGEX-6P-1, de forma que permita la escisión del marcador GST de la proteína relacionada con 24P4C12. El gen de resistencia a la ampicilina y el origen de pBR322 permiten la selección y mantenimiento de los plásmidos de pGEX en E. coli.
[0603] Construcciones pMAL: Para generar proteínas 24P4C12 recombinantes en bacterias que se fusionen a proteína de unión a maltosa (MBP, en inglés), toda o partes de la secuencia de codificación de proteína de ADNc de 24P4C12 se fusiona con el gen MBP mediante clonación en los vectores pMALc2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA). Estas construcciones permiten la expresión controlada de secuencias de proteína 24P4C12 recombinante con MBP fusionada en el extremo amino y un marcador de epítopo de seis histidinas en el extremo carboxilo terminal. Los marcadores MBP y 6X His permiten la purificación de la proteína recombinante a partir de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-MBP y anti-His. El marcador de epítopo 6X His se genera añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación 3’. El sitio de reconocimiento de factor Xa permite la escisión del marcador pMAL de 24P4C12. Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X son optimizados para expresar la proteína recombinante en el citoplasma o en el periplasma, respectivamente. La expresión del periplasma fomenta el plegado de las proteínas con enlaces disulfuro.
[0604] C. Construcciones de levadura:
[0605] Construcciones pESC: Para expresar 24P4C12 en la especie de levaduras Saccharomyces cerevisiae con el fin de generar proteína recombinante y para estudios funcionales, se clona toda o partes de la secuencia que codifica la proteína de ADNc de 24P4C12 en la familia pESC de vectores cada una de las cuales contienen 1 de los 4 marcadores seleccionables: HIS3, TRP1, LEU2 y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Estos vectores permiten la expresión controlada desde el mismo plásmido de hasta dos genes o secuencias clonadas diferentes que contengan los marcadores de epítopos FlagTM o Myc en la misma célula de levadura. Este sistema es útil para confirmar interacciones proteína-proteína de 24P4C12. Además, la expresión en levadura produce modificaciones postraduccionales similares, como glicosilaciones y fosforilaciones, cuando se expresan en en células eucarióticas.
[0606] Constructos pESP: Para expresar 24P4C12 en la especie de levaduras Saccharomyces pombe, se clona todo o partes de la secuencia de codificación de la proteína de ADNc de 24P4C12 en la familia pESP de vectores. Estos vectores permiten un alto nivel controlado de expresión de una secuencia de la proteína 24P4C12 que está fusionada bien en el extremo amino terminal o en el extremo carboxilo terminal a GST, lo que favorece la purificación de la proteína recombinante. Un marcador de epítopo FlagTM permite detectar la proteína recombinante con el anticuerpo anti-FlagTM.
Ejemplo 5
Producción de 24P4C12 recombinante en sistemas eucarióticos superiores
[0607] A. Construcciones de mamíferos:
[0608] Para expresar 24P4C12 recombinante en células eucarióticas, pueden clonarse secuencias de ADNc de longitud completa o parcial en cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos en la técnica. Una o más de las siguientes regiones de 24P4C12 se expresan en estas construcciones, aminoácidos del 1 al 710; o cualquier aminoácido 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o aminoácidos más contiguos a partir de 24P4C12 v.8, aminoácidos de 1 a 712 o 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos a partir de 24P4C12 v.9, variantes o análogos del mismo.
[0609] Las construcciones puede ser transfectadas en cualquiera de la amplia variedad de células de mamíferos, tales como células 293T o líneas celulares de cáncer de riñón. Se sondaron los lisados celulares de 293T transfectados con el suero policlonal anti-24P4C12, descrito en el presente documento.
[0610] Construcciones pcDNA3.1/MycHis: Para expresar 24P4C12 en células de mamíferos, un ORF de 24P4C12, o partes del mismo, de 24P4C12 con un sitio concenso de iniciación de traducción de Kozak fueron clonados en pcDNA3.11 MycHis Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de la proteína es estimulada por el promotor del citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen el epítopo myc y epítopo 6X His fusionado al extremo carboxilo terminal. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene la secuencia de terminación de la transcripción y señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (BGH, en inglés) para mejorar la estabilidad del ARNm, junto con el origen de SV40 para la replicación episomal y rescate de vectores simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. Puede usarse el gen de resistencia a la neomicina, puesto que permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina y origen de ColE1 permite la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.
[0611] Constructos pcDNA4/HisMax: Para expresar 24P4C12 en células de mamíferos, el ORF de 24P4C12, o partes del mismo, de 24P4C12 es clonado en pcDNA4/HisMax Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de la proteína es estimulada por el promotor del citomegalovirus (CMV) y el estimulador de traducción SP16. La proteína recombinante tiene XpressTM y seis epítopos de histidina (6X His) fusionados al extremo amino terminal. El vector pcDNA4/HisMax también contiene la secuencia de terminación de la transcripción y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) para mejorar la estabilidad de ARNm junto con el origen SV40 para la replicación episomal y rescate vectorial simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la zeocina permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.
[0612] Constructos de pcDNA3.1/Ct-GFP-TOPO: Para expresae 24P4C12 en células de mamíferos y permitir la detección de proteínas recombinantes usando fluorescencia, se clona el ORF de 24P4C12, o partes del mismo, con el sitio consenso de iniciación de traducción de Kozak en pcDNA3.1/CT.GFPTOPO (Invitrogen, CA). La expresión de la proteína es estimulada por el promotor del citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen la proteína de fluorescencia verde (GFP) fusionada al extremo carboxilo terminal, lo que facilita la detección no invasiva in vivo y estudios de biología celular. El vector pcDNA3.1CT-GFP-TOPO también contiene la secuencia de terminación de la transcripción y señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) para mejorar la estabilidad del ARNm junto con el origen SV40 para la replicación episomal y el rescate de vectores simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la neomicina permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli. Se realizan construcciones adicionales con una fusión de GFP en el extremo amino terminal en pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO abarcando la longitud completa de una proteína 24P4C12.
[0613] pTag5: Un ORF de 24P4C12, o partes del mismo, es clonado en pTag-5. Este vector es similar a pAPtag pero sin la fusión de fosfatasa alcalina. Esta construcción genera proteína 24P4C12 con una secuencia señal de IgGκ amino-terminal y marcadores de epítopo myc y 6X His en el extremo carboxiloterminal que facilitan la detección y purificación por afinidad. La proteína 24P4C12 recombinante resultante se optimizó para la secreción en el medio de células de mamíferos transfectadas y se puede utilizar como inmunógeno o ligando para identificar proteínas como ligandos o receptores que interactúan con las proteínas 24P4C12. La expresión de la proteína es estimulada desde el promotor del CMV. El gen de resistencia a la zeocina presente en el vector permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
[0614] PAPtag: Un ORF de 24P4C12, o partes del mismo, se clonaron en pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Esta construcción genera una fusión de fosfatasa alcalina en el extremo carboxilo terminal de una proteína 24P4C12 al tiempo que fusiona la secuencia señal de IgGκ al extremo amino terminal. También se generan construcciones en las que se fusiona fosfatasa alcalina con una secuencia señal IgGκ amino terminal al extremo amino terminal de una proteína 24P4C12. Las proteínas 24P4C12 recombinantes resultantes son optimizadas para la secreción en el medio de células de mamíferos transfectadas y pueden usarse para identificar proteínas, como ligandos o receptores, que interactúan con las proteínas 24P4C12. La expresión de la proteína es estimulada por el promotor del CMV y las proteínas recombinantes también contienen myc y los epitopos 6X His fusionados al extremo carboxilo terminal, lo que facilita la detección y purificación. El gen de resistencia a la zeocina presente en el vector permite la selección del plásmido en E. coli.
[0615] PsecFc: Un ORF de 24P4C12, o partes del mismo, también se clonaron en psecFc. El vector psecFc se ensambló clonando la Fc (regiones bisagra, CH2, CH3) de la inmunoglobulina humana G1 (IgG) en pSecTag2 (Invitrogen, California). Esta construcción genera una fusión de Fc de IgG1 en el extremo carboxilo terminal de las proteínas 24P4C12, mientras que fusiona la secuencia señal de IgGκ al extremo N-terminal. También se utilizan las fusiones de 24P4C12 que utilizan región Fc de IgG1 murina. Las proteínas 24P4C12 recombinantes resultantes se optimizan para la secreción en el medio de las células de mamíferos transfectadas y pueden usarse como inmunógenos o para identificar proteínas, como ligandos o receptores que interactúan con la proteína 24P4C12. La expresión de la proteína es estimulada por el promotor del CMV. El gen de resistencia a la higromicina presente en el vector permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína recombinante y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
[0616] Construcciones pSRα: Para generara líneas celulares de mamíferos que expresen 24P4C12 de forma constitutiva, el ORF de 24P4C12, o partes del mismo, de 24P4C12 se clonaron en construcciones pSRα. Se generaron retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos mediante transfección de construcciones pSRα en la línea de empaquetamiento 293T-10A1 o cotransfección de pSRα y un plásmido auxiliar (que contiene secuencias de empaquetamiento eliminadas) en las células 293, respectivamente. El retrovirus se usa para infectar varias líneas celulares de mamíferos, lo que da lugar a la integración del gen clonado, 24P4C12, en las líneas celulares huésped. La expresión de la proteína es estimulada desde una repetición terminal larga (LTR, en inglés). El gen de resistencia a la neomicina presente en el vector permite la selección de células de mamíferos que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E.coli. Los vectores retrovirales se utilizaron a partir de ese momento para infectar y generar varias líneas celulares usando, por ejemplo, células PC3, NIH 3T3, 293 o Rat-1.
[0617] Se generaron construcciones pSRα adicionales que fusionan un marcador de epítopo, tal como el marcador FLAGTM, al extremo carboxilo terminal de las secuencias de 24P4C12 para permitir la detección usando anticuerpos anti-Flag. Por ejemplo, la secuencia de FLAGTM 5’ gat tac aag gat gac gac gat aag 3’ (SEC ID Nº: 172) se añade al cebador de clonación en el extremo 3’ del ORF. Se generan construcciones de pSRα adicionales para producir proteínas de fusión GFP en el extremo amino terminal y carboxilo terminal y proteínas de fusión myc/6X His de proteínas 24P4C12 de longitud completa.
[0618] Vectores virales adicionales: Se realizan otras construcciones para la administración y la expresión de 24P4C12 mediada por virus. Se logra un alto título de virus que lleva a un nivel alto de expresión de 24P4C12 en los sistemas de administración de virus, tales como vectores adenovirales y vectores amplicón derivados del herpes. Las secuencias de codificación de 24P4C12 o fragmentos de las mismas son amplificadas por PCR y subclonadas en el vector lanzadera AdEasy (Stratagene). La recombinación y el empaquetamiento del virus se llevan a cabo según las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovirales. Como alternativa, las secuencias que codifican 24P4C12 o fragmentos de las mismas se clonan en el vector HSV-1 (Imgenex) para generar vectores virales del herpes. A partir de este momento, los vectores virales se usan para infectar varias líneas celulares como células PC3, NIH 3T3, 293 o rat-1.
[0619] Sistemas de expresión regulados: Para controlar la expresión de 24P4C12 en células de mamíferos, se clonan secuencias de codificación de 24P4C12, o partes de las mismas, en sistemas de expresión de mamíferos regulados como el sistema T-Rex (Invitrogen), el sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el sistema fuertemente regulado Ecdysone (Stratagene). Estos sistemas permiten el estudio de los efectos dependientes de la concentración y temporales de 24P4C12 recombinante. Estos vectores se usan después para controlar la expresión de 24P4C12 en varias líneas celulares como las células PC3, NIH 3T3, 293 o rat-1.
[0620] B. Sistemas de expresión de baculovirus
[0621] Para generar proteínas 24P4C12 recombinantes en un sistema de expresión de baculovirus, se clona ORF de 24P4C12, o partes del mismo, en el vector de transferencia del baculovirus pBlueBac 4.5
(Invitrogen), que presenta un marcador His en el extremo N-terminal. Concretamente, pBlueBac24P4C12 es cotransfectado con el plásmido auxiliar pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insectos SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinante (para más información, véase el manual de instrucciones de Invitrogen). Después, se recoge el baculovirus del sobrenadante celular y se purifica por ensayo de placa.
[0622] A continuación, la proteína 24P4C12 recombinante es generada por infección de células de insectos HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificado. La proteína 24P4C12 recombinante puede detectarse usando anticuerpo anti-24P4C12 o anti-marcador-His. La proteína 24P4C12 puede ser purificada y utilizada en varios ensayos basados en células o como inmunógeno para generar anticuerpos específicos policlonales y monoclonales para 24P4C12.
Ejemplo 6
Perfiles de antigenicidad y estructura secundaria
[0623] Para identificar las regiones antigénicas de la proteína 24P4C12, se utilizaron estos perfiles, hidrofilicidad (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78:3824-3828); hidropaticidad, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132); procentaje de residuos accesibles (Janin J., 1979 Nature 277:491-492); flexibilidad media (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255); giro-beta (Deleage, G., Roux, B. 1987 Protein Engineering 1:289-294); y opcionalmente otros disponibles en la técnica, comolos de la página web de ProtScale. Cada uno de los perfiles de aminoácidos anteriores de 24P4C12 se generó usando los siguientes parámetros de ProtScale para el análisis: 1) Tamaño de ventana de 9; 2) 100% del peso del marco de la ventana en comparación con el centro de la ventana; y 3) valores del perfil de aminoácidos normalizados para encontrarse entre 0 y 1.
[0624] Se usaron los perfiles de hidrofilicidad, hidropaticidad y porcentaje de residuos accesibles para determinar el alargamiento de los aminoácidos hidrofílicos (es decir, valores superiores a 0,5 en los perfiles de hidrofilicidad y porcentaje de residuos accesibles, y valores inferiores a 0,5 en el perfil de hidropaticidad). Es posible que dichas regiones sean expuestas a medios acuosos y estén presentes en la superficie de la proteína y, de este modo, pueda efectuarse un reconocimiento inmunológico, por ejemplo mediante anticuerpos.
[0625] Los perfiles de flexibilidad media y giro-beta determinan el alargamiento de los aminoácidos (es decir, valores superiores a 0,5 en los perfiles de giro-beta y de flexibilidad media) que no son restringidos en las estructuras secundarias, tales como láminas beta y hélices alfa. También es más probable que dichas regiones estén más expuestas en la proteína y que, de ese modo, se pueda efectuar un reconocimiento inmunológico, por ejemplo, mediante anticuerpos.
[0626] Las secuencias antigénicas de la proteína 24P4C12 y de las proteínas de variantes indicadas, p.ej., por los perfiles se emplean para preparar inmunógenos, péptidos o ácidos nucleicos que las codifican, para generar anticuerpos anti-24P4C12 terapéuticos y de diagnóstico. El inmunógeno puede ser cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de 50 aminoácidos contiguos, o los ácidos nucleicos correspondientes que las codifican, de las variantes de la proteína 24P4C12 enumeradas en la Figura 1. En concreto, los inmunógenos de péptidos de la invención pueden comprender, una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácidos con un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilicidad; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácidos con un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualquier incremento de número entero que incluyen una posición de aminoácido con un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácidos con un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad media; y una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualquier incremento de número entero con una posición de aminoácidos que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de giro-beta. Los inmunógenos de péptidos de la invención también pueden comprender ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anteriores.
[0627] Todos los inmunógenos de la invención, péptidos o ácidos nucleicos, pueden incluirse en forma de dosis unitaria humana o en una composición que incluye un excipiente farmacéutico compatible con la fisiología humana.
[0628] Se realizaron análisis para la presencia potencial de dominios transmembrana en variantes de 24P4C12 utilizando una variedad de algoritmos de predicción de transmembrana consultados en el servidor de biología molecular ExPasy.
Ejemplo 7
Generación de anticuerpos policlonales de 24P4C12
[0629] Se pueden producir anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Normalmente, el adyuvante y/o agente inmunizante se inyecta en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Además de inmunizar con la proteína 24P4C12 de longitud completa, se emplean algoritmos informáticos en el diseño de inmunógenos que, basándose en el análisis de secuencia de aminoácidos, contienen las características antigénicas y pueden ser reconocidas por el sistema inmunológico del huésped inmunizado (véase el Ejemplo titulado “Perfiles de antigenicidad”). Se esperaría que dichas regiones sean hidrofílicas, flexibles, en conformaciones giro-beta, y que estén expuestas en la superficie de la proteína.
[0630] Por ejemplo, las proteínas de fusión bacteriana recombinantes 24P4C12 o los péptidos que contienen regiones hidrofílicas, flexibles, giro-beta de proteínas de la variante de 24P4C12 se usan como antígenos para generar anticuerpos policlonales en conejos blancos de Nueva Zelanda. Por ejemplo, dichas regiones incluyen, sin carácter limitativo, los aminoácidos 1-34, los aminoácidos 118-135, los aminoácidos 194-224, los aminoácidos 280-290 y los aminoácidos 690-710, de las 24P4C12 variantes 1. Es útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida como inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, sin carácter limitativo, hemocianina de la lapa californiana (Megathura crenulata) (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina y el inhibidor de tripsina de soja. En un modo de realización, un péptido que codifica los aminoácidos 1-14 de 24P4C12 variante 1 se conjugó a KLH y se usó para inmunizar al conejo. Este antisuero exhibió un alto título al péptido (>10.000) y reconoció la 24P4C12 en células 293T transfectadas por Western blot y citometría de flujo (Figura 24) y en células PC3 recombinantes por Western blot e inmunohistoquímica (Figura 25). Como alternativa, el agente inmunizante puede incluir toda o partes de la proteína 24P4C12, análogos o proteínas de fusión de la misma. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de 24P4C12 variante 1 puede fusionarse usando técnicas de ADN recombinante a cualquiera de una variedad de parejas de proteínas de fusión que son bien conocidas en la técnica, como glutatión-S-transferasa (GST) y proteínas de fusión marcadas con HIS. Dichas proteínas de fusión son purificadas a partir de bacterias inducidas usando la matriz de afinidad apropiada.
[0631] En un modo de realización, se produce y purifica una proteína de fusión GST que codifica los aminoácidos 379-453, incluyendo el tercer bucle extracelular previsto de la variante 1 y dicha proteína se utiliza como inmunógeno. Entre otras proteínas de fusión bacterianas recombinantes que pueden emplearse se encuentran la proteína de unión a maltosa, LacZ, tiorredoxina, NusA o una región constante de inmunoglobulina (véase la sección titulada “Produccion de 24P4C12 en sistemas procarióticos” y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul et al., eds.1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N. y Ledbetter, L.(1991) J. Exp. Med. 174, 561-566).
[0632] Además de las proteínas de fusión derivadas de bacterias, también se utilizan antígenos de proteínas expresados en mamíferos. Estos antígenos se expresan a partir de vectores de expresión de mamíferos, como los vectores de fusión Fc y Tag5 (véase el Ejemplo titulado “Producción de 24P4C12 recombinante en sistemas eucarióticos”), y conservan modificaciones postraduccionales, como glicosilaciones halladas en la proteína nativa. Cada proteína recombinante se purifica entonces mediante cromatografía de quelatos metálicos a partir de sobrenadantes del cultivo tisular y/o lisados de células 293T que expresan de forma estable el vector recombinante. La proteína 24P4C12 de Tag5 purificado se usa entonces como inmunógeno.
[0633] Durante el protocolo de inmunización, es conveniente mezclar o emulsionar el antígeno en adyuvantes que mejoren la respuesta inmune del animal huésped. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, sin carácter limitativo, el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético).
[0634] En un protocolo característico, se inmuniza a los conejos inicialmente por vía subcutánea con hasta 200µg, normalmente 100-200 µg, de proteína de fusión o péptido conjugado a KHL mezclado conadyuvante completo de Freund (CFA). Después, se inyectan a los conejos cada dos semanas hasta 200µg, normalmente 100-200 µg, de inmunógeno en adyuvante de Freund incompleto (IFA). Se toman muestras de sangre aproximadamente 7-10 días después de cada inmunización y se usan para controlar la titulación del antisuero mediante ELISA.
[0635] El antisuero de conejos inmunizados con las proteínas de fusión de la variante de 24P4C12, como las proteínas de fusión MBP y GST, son purificados por depleción de anticuerpos reactivos a la secuencia de la pareja de fusión mediante su paso por una columna de afinidad que contiene la pareja de fusión sola o en el contexto de una proteína de fusión irrelevante. Por ejemplo, el antisuero derivado a partir de una proteína de fusión GST-24P4C12 que codifica los aminoácidos 379-453 de variante 1 se purifica primero por su paso a través de una columna de proteína GST acoplada de forma covalente a una matriz Affigel (BioRad, Hercules, Calif.). Después, el antisuero se purifica por afinidad mediantedul paso a través una columna compuesta de una proteína de fusión MBP que también codifica los aminoácidos 379-453 acoplados de forma covalente a una matriz Affigel. Después, el suero se purifica en mayor medida mediante cromatografía de afinidad con proteína G para aislar la fracción de IgG. Los sueros de otros conejos inmunizados con antígenos marcados con His y con péptido, así como los sueros reducidos de pareja de fusión son purificados por afinidad mediante su paso por una matriz de columna compuesta por inmunógeno de proteína original o péptido libre.
Ejemplo 8
Generación de anticuerpos monoclonales (mAbs) de 24P4C12
[0636] En un modo de realización, entre los anticuerpos monoclonales terapéuticos (en adelante, MAbs) para 24P4C12 y variantes de 24P4C12 se incluyen los que reaccionan con epítopos específicos para cada proteína o específicos a secuencias en común entre las variantes que se unirían a, internalizarían, interrumpirían o modularían la función biológica de 24P4C12 o de variantes de 24P4C12, por ejemplo, aquellos que interrumpirían su interacción con los ligandos, sustratos y asociados de unión. Entre los inmunógenos para la generación de dichos MAbs se incluyen aquellos diseñados para codificar o contener dominios extracelulares o la secuencia de la proteína 24P4C12 entera, regiones que se prevé que contengan motivos funcionales y regiones de las variantes de la proteína 24P4C12 que se prevé serán antigénicas a partir del análisis informático de la secuencia de aminoácidos. Entre los inmunógenos se incluyen: péptidos y proteínas recombinantes como Tag5-24P4C12, una célula de mamífero purificada derivada de proteína marcada con His. Además, se usan las células modificadas genéticamente para expresar niveles altos de 24P4C12, como RAT1-24P4C12 o 300.19-24P4C12, para inmunizar ratones.
[0637] Con el fin de generar MAbs para 24P4C12, primero se inmunizan los ratones con 1-50µg de inmunógeno de proteína o entre 106 y 107 de células que expresan 24P4C12 mezclados en un adyuvante adecuado. Algunos ejemplos de adyuvantes adecuados para inmunizaciones son: TiterMax (Sigma) y gel de alumbre. Tras una inyección inicial, los ratones son inmunizados dos veces a la semana hasta que están listos para ser seleccionados para fusiones. Cuando los ratones están listos para fusiones (véase más abajo), se recolectan las células B bien de los ganglios linfáticos o del bazo. Las células B recolectadas se mezclan con un apareja de fusión derivada de ratón estándar y se fusionan las células usando electro fusión celular (ECF, en inglés).
[0638] En el transcurso de las inmunización, se toman muestras de sangre para monitorizar el título y la especificidad de la respuesta inmune. En la mayoría de los casos, una vez obtenidas la reactividad y especificidad apropiadas mediante análisis de ELISA, Western blot, inmunoprecipitación, microscopia de fluorescencia o citometría de flujo, se llevan a cabo entonces la fusión y la generación de hibridomas usando electro fusión celular (ECF).
[0639] En un modo de realización, la invención presenta anticuerpos monoclonales denominados: Ha51(5)1, Ha5-1(5)2.1, Ha5-3(1,4)2.1, Ha5-3(1,4)7.1, Ha5-3(3,5)37.1, Ha5-4(2,5)13.1, Ha5-4(2,5)34.1, Ha57acd4.1, Ha5-7acd20.1.1, Ha5-7be31.1, Ha5-7acd10.1, Ha5-7acd13.1, Ha5-7acd19.1, Ha5-7be37.1, Ha5-7acd16.1, Ha5-7acd7.1.1, Ha5-7be20.1, Ha5-7acd5.1.1, Ha5-7be34.1, Ha5-7acd3.1, Ha5-7acd2.1, Ha5-8ac4.1, Ha5-4(2,5)31.1, Ha5-11a1.1.1, Ha5-11b1.1 y Ha5-7be7.1.
[0640] Los MAbs para 24P4C12 se generaron usando tecnología XenoMouse® (Amgem Fremont) en la que se han activado loci de cadena ligera kappa y de cadena pesada murinos y se han inserido una mayoría de loci de inmunoglobulina de cadena ligera kappa y pesada humanos. Los MAbs se han denominado: Ha5-3(1,4)2.1, Ha5-3(1,4)7.1, Ha5-3(3,5)37.1, Ha5-7acd4.1, Ha5-7acd20.1.1, Ha57be31.1, Ha5-7acd10.1, Ha5-7acd13.1, Ha5-7acd1.9.1, Ha5-7be37.1, Ha5-7acd16.1, Ha5-7acd7.1.1, Ha5-7be20.1, Ha5-7acd5.1.1, Ha5-7be34.1, Ha5-7acd3.1, Ha5-7acd2.1, Ha5-8ac4.1, Ha5-4(2,5)31.1, Ha5-11a1.1.1, Ha5-11b1.1 y Ha5-7be7.1, y se generaron a partir de inmunización de γl humana que produce XenoMice con células RAT(E)-24P4C12. Los MAbs denominados Ha5-1(5)1 y Ha5-1(5)2.1 se generaron a partir de inmunización de γ2 humana que produce XenoMice con células B300.19-24P4C12. Los MAbs denominados Ha5-4(2,5)13.1 y Ha5-4(2,5)34.1 se generaron a partir de inmunización con γ1 humana que produce XenoMice con tag5-24P4C12 purificada (aa 59-227).
[0641] Los MAbs de 24P4C12 Ha5-1(5)1, Ha5-1(5)2.1, Ha5-3(1,4)2.1, Ha5-3(1,4)7.1, Ha5-3(3,5)37.1, Ha5-7acd4.1, Ha5-7acd20.1.1, Ha5-7be31.1, Ha5-7acd10.1, Ha5-7acd13.1, Ha5-7acd19.1, Ha57be37.1, Ha5-7acd16.1, Ha5-7acd7.1.1, Ha5-7be20.1, Ha5-7acd5.1.1, Ha5-7be34.1, Ha5-7acd3.1, Ha57acd2.1, Ha5-8ac4.1 y Ha5-7be7.1 se unen específicamente a células que expresan 24P4C12 recombinante (PC3-24P4C12) y a múltiples líneas celulares cancerosas que expresan 24P4C12 (Figura 6).
[0642] Los anticuerpos denominados Ha5-1(5)1, Ha5-1(5)2.1, Ha5-3(1,4)7.1, Ha5-7acd10.1, Ha57acd16.1 y Ha5-11b1.1 se enviaron (por Federal Express) a la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 8 de agosto de 2007 y se les asignaron los números de acceso PTA-_____, PTA-_____, PTA-_____, PTA-_____, PTA-_____, PTA-_____, respectivamente.
[0643] Las secuencias de codificación de ADN para MAb de 24P4C12 Ha5-1(5)1, Ha5-1(5)2.1, Ha53(1,4)2.1, Ha5-3(1,4)7.1, Ha5-3(3,5)37.1, Ha5-4(2,5)13.1, Ha5-4(2,5)34.1, Ha5-7acd4.1, Ha57acd20.1.1, Ha5-7be31.1, Ha5-7acd10.1, Ha5-7acd13.1, Ha5-7acd19.1, Ha5-7be37.1, Ha5-7acd16.1, Ha5-7acd7.1.1, Ha5-7be20.1, Ha5-7acd5.1.1, Ha5-7be34.1, Ha5-7acd3.1, Ha5-7acd2.1, Ha5-8ac4.1, Ha5-4(2,5)31.1, Ha5-11a1.1.1, Ha5-11b1.1 y Ha5-7be7.1 se determinaron después de aislar ARNm de las células de hibridoma respectivas con reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL).
[0644] Las secuencias de ácido nucleico de la variable de cadena ligera y de cadena pesada de anti24P4C12 se secuenciaron a partir de las células de hibridoma usando el siguiente protocolo. Se lisaron las células de hibridoma que segregan anti-24P4C12 con reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL). Se purificó y cuantificó el ARN total. Se generó ADNc de primera cadena a partir del ARN total con cebadores oligo (dT) 12-18 usando el sistema de Superscript Preamplification de Gibcop-BRL. El ADNc de primera cadena se amplificó usando cebadores de cadena pesada variable de inmunoglobulina humana y cebadores de cadena ligera variable de inmunoglobulina humana. Se secuenciaron los productos de PCR y se determinaron las regiones de cadena ligera y pesada variables.
[0645] Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de las regiones variables de la cadena ligera y pesada se enumeran en la Figura 2 y en la Figura 3. El alineamiento de anticuerpos 24P4C12 a la línea germinal de Ig humana se presenta en la Figura 4A-4AY.
Ejemplo 9
Cribado, identificación y caracterización de MAbs de 24P4C12
[0646] Los anticuerpos generados usando los procedimientos nombrados en el ejemplo titulado “Generación de anticuerpos monoclonales (MAb) de 24P4C12” fueron cribados, identificados y caracterizados mediante una combinación de ensayos que incluyen ELISA, FACS, índice de afinidad mediante resonancia de plasmón superficial (BIAcore) (“SPR”), agrupación de epítopos, afinidad a 24P4C12 recombinante y 24P4C12 expresada en la superficie celular.
[0647] Cribado de MAb humano de 24P4C12 mediante FACS
[0648] El cribado de hibridoma primario para MAb a 24P4C12 se lleva a cabo por análisis FACS. El protocolo es el siguiente: se añaden 50µl/pocillo de sobrenadante de hibridoma (sin diluir) o anticuerpos purificados (en diluciones seriales) a placas FACS de 96 pocillos y se mezclan con células que expresan 24P4C12 (endógenas o recombinantes, 50.000 células/pocillo). La mezcla se incuba a 4ºC durante dos horas. Al final de la incubación, las células son lavadas con tampón FACS e incubadas con 100µl de anticuerpo para la detección (anti-hIgG-PE) durante 45 minutos a 4ºC. Al final de la incubación, las células son lavadas con tampón FACS, unidas con Formaldehyde y analizadas usando FACScan. Los datos se analizan usando soportes informáticos CellQuest Pro.
[0649] Los hibridomas positivos identificados a partir de cribados primarios se transferien a placas de 24pocillos y los sobrenadantes se recolectan para cribados de confirmación.
[0650] B. Cribado de MAb humano de 24P4C12 mediante ELISA
[0651] Los MAb se criban mediante ELISA para determinar el isotipo de anticuerpo. El protocolo usado es el siguiente, las placas ELISA están recubiertas con anticuerpo anti-hIgG o Tag5-24P4C12-ECD. Diversos sets de anticuerpos de prueba se añaden en las placas y se incuban durante 1 hora. Tras el lavado de las placas para lavar los anticuerpos no unidos, los anticuerpos enlazados se detectan por los anticuerpos de detección conjugados con HRP (peroxidasa de rábano): anti-hIgG1, anti-hIgG2, anti-hIgK y anti-hIgL.
[0652] C. Cribado de MAb humano de 24P4C12 mediante SPR
[0653] SPR (resonancia de plasmones de superficie) permite la identificación y la caracterización en tiempo real de la cinética y afinidad de las interacciones proteína-proteína y, por lo tanto, es una técnica útil para la selección y caracterización de MAbs para antígenos diana de interés (es decir, 24P4C12). El análisis SPR se utiliza para cribar y caracterizar sobrenadantes de hibridoma y MAbs purificados para 24P4C12. El cribado de hibridoma para encontrar MAbs para 24P4C12 mediante biosensor SPR (BIAcore 3000) se realiza del siguiente modo: 50µl/pocillos de sobrenadante de hibridoma (puro) diluido en 1,5-2 µg/ml con el tampón de corrida (HBS-P, 10ug/ml BSA) se añaden a una placa de 96 pocillos (BIAcore) y los MAbs (20µl) se capturan en pAbs Fcγ de cabra antihumano inmovilizado en la superficie del chip sensor CM5. Tres (3) MAbs que contienen sobrenadantes de hibridoma se evalúan por período (ciclo) en los canales 2, 3 y 4 de la celda de flujo, donde el canal 1 se reserva como referencia para unión no específica. Antes de medir la unión del antígeno a los MAbs capturados en cada canal individual, se inyectan 60µl de tampón de corrida sobre la superficie del chip en el índice de flujo de 20µl/min para servir como referencia para deriva en la línea de base de MAbs capturados. Entonces se inyectan sesenta microlitros (60µl) de 161P2F10B a 150nM sobre la superficie del chip en el mismo índice de flujo de 20µl/min para medir la unión a antígeno. A cada ciclo de antígeno que se une a MAbs le sigue regeneración de la superficie con inyección de 100mM de ácido fosfórico (durante 1min) para desprender cualquier MAb capturado de la superficie.
[0654] El análisis de los datos se realiza usando los programas informáticos BiaEvaluation 4.1 y CLAMP (Myszka y Morton, 1998). Después de eliminar las referencias y normalizar la respuesta al nivel de MAb capturado, los datos se encajan globalmente usando un modelo de enlace en una proporción 1:1.
[0655] Se calculan las afinidades a partir de las constantes de las tasas de disociación y asociación.
Como es lógico para profesionales de la técnica, las tasas de disociación lentas generalmente indican afinidad global más alta para los MAbs. Los datos de afinidad y tasas de disociación preliminares se usan como base de los criterios de selección para los MAbs terapéuticos para 24P4C12.
D. Agrupación de epítopos mediante FACS
[0656] Los anticuerpos de 24P4C12 se agruparon según el epítopo evaluando su perfil de unión usando células Rat1-24P4C12. En resumen, una pequeña cantidad de los anticuerpos fueron biotinilados; después se incubaron cada uno de los anticuerpos biotinilados con Rat1-24P4C12 en presencia de una cantidad excesiva (100 x) de anticuerpos no biotinilados a 4ºC durante 1 hora. Un entendido en la técnica entenderá que durante la incubación, una cantidad excesiva de anticuerpos competirá con anticuerpos biotinilados si se unen al mismo epítopo. Al final de la incubación, se lavaron las células e incubaron con estreptavidina-PE durante 45 minutos a 4ºC. Después de lavar la estreptavidina-PE no enlazada, se analizaron las células usando FACS. Los valoresde intensidad de fluorescencia media (MFI) se obtuvieron usando el programa informático CellQuest Pro y se usaron para el análisis de los datos. Como se describe, veintiocho (28) MAbs de 24P4C12 se agruparon al epítopo usando células Rat1-24P4C12. Los resultados muestran los anticuerpos que tienen el mismo perfil de unión al mismo epítopo entre los anticuerpos y que hay 17 grupos de epítopos entre los anticuerpos analizados. El listado de los MAbs de 24P4C12 y los grupos de epítopos respectivos se muestran en la Tabla IV.
[0657] E. Determinación de la afinidad mediante FACS
[0658] Un panel de 24 MAbs de 24P4C12 humanos se analizó para comprobar su afinidad de unión a 24P4C12 en células LNCaP. La afinidad con las células LNCaP fue determinada por FACS mediante un ensayo de unión del equilibrio de saturación. Los MAbs de 24P4C12 se diluyeron en serie en un tampón FACS y se incubaron con células LNCaP con una concentración final de 160 a 0,003nM a 4ºC durante 16 horas. Al finalizar la incubación, se lavaron las células con tampón FACS y se incubaron con 100ul de anticuerpo de detección (anti-hIgG-PE) durante 45 minutos a 4ºC, después se lavaron las células con tampón FACS, fijadas con 2% de Formaldehído y analizadas usando FACScan. Se analizaron los datos de FACS usando el programa informático CellQuest Pro para obtener un histograma y los valores de intensidad de fluorescencia media (MFI) de cada punto. Los valores de MFI se emplearon para calcular la afinidad de unión usando regresión no lineal utilizando el programa informático Prism4 (Graphpad Software Inc. San Diego California). Un resumen de los valores de afinidad de veinticuatro (24) anticuerpos se muestra en la Tabla IV.
[0659] F: Determinación de afinidad mediante SPR
[0660] Se analizan paneles de MAbs de 24P4C12 antihumanos purificados para comprobar su afinidad de unión a 24P4C12 recombinante purificado mediante SPR. En resumen, cada MAb humano purificado se captura en la superficie del chip sensor CM5. Se capturan de media aproximadamente 150 RU de cada MAb en todos los ciclos. Una serie de 5-6 dilución de 24P4C12 recombinante que va desde 1nM a 100nM se inyecta sobre dicha superficie para generar curvas de unión (sensogramas) que globalmente son aptas para un modelo de interacción en proporción 1:1 usando el programa informático CLAMP (Myszka y Morton, 1998). La afinidad de varios MAbs de 24P4C12, expresados como KD, definida se determina por constante de tasa de disociación y constante de tasa de asociación usando la ecuación KD = kdiss/kassoc.
G. Reactividad cruzada con 24P4C12 de mono cynomolgus
[0661] Los MAbs de 24P4C12 se analizan y caracterizan para comprobar su capacidad de reacción con 24P4C12 de origen de mono. Esta propiedad resulta útil para entender la expresión de 24P4C12 en tejidos de diferentes especies de monos con fines toxicológicos. El gen 24P4C12 de mono cynomolgus fue clonado y secuenciado. La homología con 24P4C12 humano es del 96,8% (Figura 7). Se muestra que los MAbs de 24P4C12 se unen específicamente a la proteína 24P4C12 de cynomolgus presente en la superficie de las células (Figura 8).
Ejemplo 10
Citotoxicidad inmunomediada por anticuerpo
[0662] La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, en inglés) es un episodio lítico inmunomediado en células unidas con un anticuerpo dirigido a un antígeno de superficie celular especifico. Las células inmunes reconocen la porción Fc del anticuerpo a través de la unión a receptores Fcã en la superficie de leucocitos, monocitos y células NK desencadenando la lisis que conlleva la muerte celular. En resumen, las células Caki modificadas para expresar el antígeno diana de 24P4C12 se incuban in vitro con cromo-51 durante 1 hora. Después del lavado con medio fresco, las células marcadas se incuban con 2,5 mg/ml de MAbs humanos dirigidos a 24P4C12 y las células mononucleares de sangre periférica recién aisladas en diferentes relaciones de células efectoras (E) y células diana (T) (E:T Ratio). Tras 4 horas a 37ºC, las células se centrifugan poco a poco y el sobrenadante que contiene 51Cr de las células muertas se cuenta con el contador Beta.
[0663] Los resultados demuestran que la destrucción de células dependientes de anticuerpo aumenta cuando la relación de células efectoras/diana (E:T) aumenta. La especificidad del ensayo se determina mostrando que un MAb de control de IgG1 irrelevante y la incubación de células diana y células efectoras en ausencia de anticuerpo (células + PBMC) no causan destrucción de células.
Ejemplo 11
Destrucción secundaria mediada por anticuerpo
[0664] Los anticuerpos para 24P4C12 median la destrucción dependiente de saporina en células PC324P4C12. En resumen, las células PC3-24P4C12 o PC3-Neo (500 células/pocillos) se cultivaron en una placa de 96 pocillos en el día 1. Al día siguiente, se añadió a cada pocillo un volumen equivalente de medio que contiene 2X la concentración del anticuerpo primario indicado junto con un exceso doble de anticuerpo policlonal anticabra (Gt-Sap) o antihumano (Hu-Sap) conjugado con toxina saporina (Advance Targeting Systems, San Diego, CA). Las células pudieron incubar durante 5 días a 37ºC. Tras el período de incubación, se añadió Alamar Blue a cada pocillo y la incubación continuó durante 4 horas adicionales. La fluorescencia de cada pocillo se determinó en un lector de placa usando una longitud de onda de excitación de 530nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm.
[0665] Los resultados muestran que los anticuerpos de 24P4C12 HA5-1(5)1.1, HA5-1(5)2.1 y HA5acd16.1 mediaron citotoxicidad dependiente de saporina en células PC3 que expresan 24P4C12, pero no en células infectadas con el gen Neo sólo. Para demostrar mejor la especificidad, los mismos anticuerpos de 24P4C12 primarios se incubaron con el doble de exceso de anticuerpo policlonal de cabra conjugado de saporina. Estos resultados indican que los fármacos o proteínas de citotoxicidad pueden administrarse selectivamente a células que expresan 24P4C12 usando un MAb anti-24P4C12 apropiado.
[0666] Ejemplo 12
Generación de fragmentos F(Ab’)2
[0667] La generación de fragmentos F(Ab’)2 de MAbs sirve para estudiar los efectos de moléculas de MAb que retienen su sitio de unión a antígeno bivalente, pero que les falta el dominio Fc inmunoefector en modelos terapéuticos in vitro e in vivo. En general, el protocolo es el siguiente, 20mg de MAb en 20mM de tampón de acetato de sodio pH 4,5 se incuba con o sin pepsina inmovilizada (Pierce. Rockford IL) durante los periodos de tiempo indicados. La cromatogradia de proteína A elimina los fragmentos Fc digeridos y el MAb intacto. El reactivo puede usarse para tratar animales portadores de tumores que expresan 24P4C12. La actividad antitumor observada con este fragmento de anticuerpo puede diferenciar la actividad biológica intrínseca de la actividad mediada por mecanismos inmunodependientes.
Ejemplo 13
Expresión de MAbs humanos usando métodos de ADN recombinante
[0668] Para expresar MAbs de 24P4C12 recombinantemente en células transfectadas, las secuencias variables de cadena ligera y pesada del MAb 24P4C12 se clonan secuencia arriba de las regiones constantes de Igk de cadena ligera y de IgG1 de cadena pesada humana respectivamente. Los casetes de cadena ligera y cadena pesada humanas de Mab de 24P4C12 completo se clonan secuencia abajo del promotor/potenciador de citomegalovirus (CMV) en un vector de clonación. Se incluye secuencia abajo un sitio de poliadenilación de la secuencia de codificación de MAb. Los MAbs de 24P4C12 recombinante que expresan construcciones son transfectados en las células 293T, Cos y CHO. Los MAbs de 24P4C12 secretados por células recombinantes se evalúan para unirse a la superficie celular
de 24P4C12.
Ejemplo 14
Ensayo in vivo para la estimulación del crecimiento tumoral de 24P4C12
[0669] El efecto de la proteína 24P4C12 en el crecimiento de células tumorales se evalúa in vivo evaluando el desarrollo y crecimiento de células que expresan o que carecen de 24P4C12. Por ejemplo, se inyecta a ratones con SCID por vía subcutánea en cada costado 1 x 106 de líneas celulares de cáncer de colon que contienen el vector vacio tkNeo o 24P4C12. Se pueden usar al menos dos estrategias: (1) la expresión de 24P4C12 constitutiva regulada por un promotor, tal como un promotor constitutivo obtenido de genomas de virus como el virus del polioma, virus de viruela aviar (UK 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y virus del simio 40 (SV40), o de promotores heterólogos de mamíferos, p. ej., el promotor de actina o de inmunoglobulina, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistema de las células huésped y (2) la expresión regulada bajo control de un sistema de vector inducible como: ecdisoma, tetraciclina, etc., siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped. Después, se controla el volumen tumoral mediante medición con pie de rey de la aparición de tumores palpables y se hace un seguimiento a lo largo del tiempo para determinar si las células que expresan 24P4C12 crecen a un ritmo más rápido y si los tumores producidos por células que expresan 24P4C12 muestran características de agresividad alterada (p.ej., aumento de metástasis, vascularización, menor capacidad de respuesta a los medicamentos quimioterapéuticos).
[0670] Además, se les puede implantar ortotópicamente a los ratones 1 x 105 de las mismas células para determinar si 24P4C12 tiene efecto de crecimiento local en el colon y en la capacidad de las células de metastatizar (Miki T et al., Oncol Res. 2001; 12:209; Fu X et al., Int J Cancer. 1991, 49:938). El efecto de 24P4C12 en la formación y crecimiento del tumor puede evaluarse mediante la inyección de células tumorales de colon por via intratibial.
[0671] El ensayo también es útil para determinar el efecto inhibidor de 24P4C12 de las composiciones terapéuticas candidatas, como por ejemplo, intracuerpos de 24P4C12, moléculas antisentido de 24P4C12 y ribozimas.
Ejemplo 15
Inhibición de tumores in vivo mediada por anticuerpos monoclonales de 24P4C12
[0672] La expresión significativa de 24P4C12 en la superficie celular de tejidos cancerosos, junto con su expresión reducida en tejidos normales, hace de 24P4C12 una diana excelente en la terapia con anticuerpos. Del mismo modo, 24P4C12 es una diana para inmunoterapia basada en células T. Por tanto, la eficacia terapéutica de MAbs de 24P4C12 en modelos de ratones de xenoinjertos de cáncer humano se evalúa usando múltiples líneas celulares cancerosas como PC3-24P4C12, LNCaP, LAPC29, 22RV1, OVCaR-5, HT29, Calu-1 y CF-PAC.
[0673] Se estudia la eficacia de anticuerpos en el crecimiento tumoral y la formación de metástasis, p.ej., en un modelo de xenoinjerto de cáncer ortotópico de ratón. Los anticuerpos pueden ser no conjugados, como se analiza en este Ejemplo, o pueden ser conjugados a una modalidad terapéutica, como se aprecia en la técnica. Los MAbs de 24P4C12 inhiben la formación de xenoinjertos de cáncer de colon. Los MAbs también retardan el crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y prolongan la supervivivencia en ratones portadores de tumores. Estos resultados indican la utilidad de MAbs de 24P4C12 en el tratamiento de las etapas avanzadas y locales de cáncer de colon y de los cánceres indicados en la Tabla I.
[0674] La administración de los MAb de 24P4C12 retarda el crecimiento del tumor ortotópico establecido e inhibe la metástasis de sitios distantes, lo que da lugar a una prolongación significativa en la supervivencia de ratones portadores del tumor. Estos estudios indican que 24P4C12 es una diana atractiva para la inmunoterapia y demuestra el potencial terapéutico de MAbs de 24P4C12 para el tratamiento de cáncer de colon local y metastásico. Este ejemplo demuestra que los anticuerpos monoclonales de 24P4C12 no conjugados inhiben eficazmente el crecimiento de xenoinjertos de tumor de colon humano en ratones con SCID; por consiguiente, una combinación de dichos MAbs eficaces también es eficaz.
[0675] Inhibición de tumores mediante el uso de múltiples MAbs de 24P4C12
[0676] Materiales y métodos
[0677] Anticuerpos monoclonales de 24P4C12:
[0678] Se aumentan los anticuerpos monoclonales en relación con 24P4C12, como se describe en el Ejemplo titulado “Generación de anticuerpos monoclonales (MAbs) de 24P4C12”. Se determina la capacidad de uniónde los anticuerpos por ELISA, Western blot, FACS e inmunoprecipitación. Los datos del mapeo de epítopos para los MAbs de 24P4C12, determinados por análisis ELISA y Western blot, reconocen epítopos en la proteína 24P4C12. Se efectúa el análisis inmunohistoquímico de células y tejidos normales y cancerosos con estos anticuerpos.
[0679] Los anticuerpos monoclonales se purifican a partir sobrenadantes de cultivo de tejidos de hibridoma o ascitis por cromatografía de Sefarosa con proteína-G o proteína-A, se dializan frente a PBS, se esterilizan por filtración y se almacenan a -20ºC. Se llevan a cabo determinaciones de proteínas por un ensayo Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Se prepara un anticuerpo monoclonal terapéutico o un cóctel que comprende una mezcla de MAbs individuales y se utiliza para tratar ratones que reciben inyecciones ortotópicas o subcutáneas de injertos de tumor UG-K3 y RXF-393.
[0680] Líneas celulares y xenoinjertos
[0681] Las líneas celulares cancerosas PC3-24P4C12, LNCaP, LAPC9, 22RV1, OVCaR-5, HT29, Calu-1 y CF-PAC se mantienen en los medios de cultivo RPMI y DMEM respectivamente, complementados con L-glutamina y 10% FBS.
[0682] El xenoinjerto se transmite a ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID, en inglés) macho de 6 a 8 semanas de edad (Taconic Farms) mediante implante por trocar subcutáneo (Craft, N., et al., Nat Med. 1999, 5:280). Se preparan suspensiones de una sola célula de células tumorales como se describe en Craft, et al. También se usan otras líneas celulares.
[0683] Modelos de xenoinjertos en ratones.
[0684] Se generan tumores subcutáneos (s.c.) mediante la inyección de 1 x 106 de células cancerosas mezcladas en una disolución con Matrigel en una proporción 1:1 (Collaborative Research) en el costado derecho de ratones macho con SCID. Para analizar la eficacia de los anticuerpos en la formación de tumores, se empieza, en concreto, con inyecciones de anticuerpos el mismo día de las inyecciones de células tumorales. Como control, se inyecta a ratones IgG purificada de ratón (ICN) o PBS; o un MAb purificado que reconoce un antígeno irrelevante no expresado en células humanas. En estudios preliminares, no se encuentran diferencias entre PBS o IgG de ratón en el crecimiento tumoral. Los tamaños del tumor se determinan mediante mediciones con pie de rey y se calcula el volumen del tumor como largo x ancho x alto. Los ratones con tumores subcutáneos mayores de 1,5 cm de diámetro son sacrificados.
[0685] Se llevan a cabo inyecciones ortotópicas con anestesia usando ketamina/xilazina. Para controlar el crecimiento del tumor, se palpan los ratones. Los ratones son divididos en grupos para un tratamiento adecuado, inyectando por vía intraperitoneal. MAbs de 24P4C12 o MAbs de control.
MAbs de 24P4C12 inhiben el crecimiento de tumores de xenoinjertos que expresan 24P4C12
[0686] El efecto de MAbs de 24P4C12 en la formación de tumores se ensaya usando modelos ortotópicos. En comparación con el modelo tumoral subcutáneo, el modelo ortotópico, que requiere la inyección de células tumorales directamente en el ratón, conlleva un crecimiento local del tumor, desarrollo de metástasis en lugares distales, deterioro de la salud del ratón y muerte posterior. Estas características hacen que el modelo ortotópico sea más representativo del avance de la enfermedad humano y permite el seguimiento del efecto terapéutico de los MAbs en los criterios de valoración finales clínicamente relevantes.
[0687] En consecuencia, se inyectan las células tumorales en la próstata o riñón del ratón y dos días más tarde, los ratones son separados en dos grupos y tratados con: a) 250-1000µg de MAb de 24P4C12, o b) control tres veces por semana durante un periodo de dos a cinco semanas.
[0688] Una importante ventaja de los modelos de cáncer ortotópicos es la capacidad de estudiar el desarrollo de las metástasis. La formación de metástasis en ratones que portan tumores ortotópicos establecidos se estudia mediante análisis IHC (inmunohistoquímico) en secciones de tejidos.
[0689] Otra ventaja de los modelos de cáncer de xenoinjertos es la capacidad de poder estudiar la neovascularización y la angiogénesis. El crecimiento tumoral es parcialmente dependiente del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Aunque el sistema capilar y la red sanguínea en desarrollo tienen origen huésped, la iniciación y la arquitectura de la neovasculatura están reguladas por el tumor de xenoinjerto (Davidoff et al., Clin Cancer res. (2001) 7:2870; Solesvik et al., Eur J Cancer Clin Oncol. (1984) 20:1295). El efecto del anticuerpo y la molécula pequeña en la neovascularización se estudia según procedimientos conocidos en la técnica, como por análisis IHC de tejidos tumorales y los microentornos que los rodean.
[0690] Se administran inyecciones tanto de MAb de 24P4C12 como de anticuerpos de control durante un periodo de 4 semanas a los ratones portadores de tumores ortotópicos establecidos. Se permite a los ratones de ambos grupos establecer una carga tumoral alta para asegurar una alta frecuencia de formación de metástasis en pulmones de ratón. A continuación, se mata a los ratones y se analizan sus vejigas, hígados, huesos y pulmones para detectar la presencia de células tumorales mediante análisis IHC. Estos estudios demuestran una amplia eficacia antitumoral de anticuerpos anti-24P4C12 en la iniciación y avance del cáncer de modelos de xenoinjertos en ratones. Los anticuerpos anti-24P4C12 inhiben la formación tumoral de tumores, también retrasan el crecimiento de los tumores ya existentes y prolongan la supervivencia de los ratones tratados. Además, los MAbs de 24P4C12 demuestran un drástico efecto inhibitorio en la extensión del tumor local a sitios distales, incluso en presencia de una alta carga tumoral. Por tanto, los mAbs de 24P4C12 son eficaces en la mayoría de los criterios de valoración finales clínicamente relevantes (crecimiento tumoral), prolongación de la supervivencia y salud.
[0691] Los resultados de estos experimentos muestran que los MAbs de 24P4C12 pueden usarse con fines terapéuticos y de diagnóstico para tratar y controlar los cánceres incluidos en la Tabla I.
Ejemplo 16
Uso terapéutico y de diagnóstico de anticuerpos anti-24P4C12 en seres humanos
[0692] Los anticuerpos monoclonales anti-24P4C12 se usan de forma segura y eficaz para fines de diagnóstico, profilácticos, de pronóstico y/o terapéuticos en seres humanos. Los análisis Western blot e inmunohistoquímicos de tejidos cancerosos y xenoinjertos de cáncer con MAb anti-24P4C12 muestran fuerte tinción extensiva en carcinoma pero niveles significativamente inferiores o indetectables en tejidos normales. La detección de 24P4C12 en carcinoma y en enfermedad metastásica demuestra la utilidad del MAb como indicador de diagnóstico y/o pronóstico. Por tanto, los anticuerpos anti-24P4C12 en aplicaciones de diagnóstico como inmunohistoquímica de muestras de biopsia de riñón para detectar cáncer en pacientes que se sospecha pueden padecerlo.
[0693] Según se determina mediante citometría de flujo, un MAb anti-24P4C12 se une específicamente a células de carcinoma. Por tanto, los anticuerpos anti-24P4C12 se utilizan en aplicaciones de diagnóstico por imágenes del cuerpo completo, como radioinmunoescintigrafía y radioinmunoterapia, (véase, p.ej., Potamianos S., et al., Anticancer Res 20(2A):925-948 (2000)) para la detección de cánceres localizados y metastásicos que presentan expresión de 24P4C12. La eliminación o liberación de un dominio extracelular de 24P4C12 en el entorno extracelular, como el visto para fosfodiesterasa alcalina B10 (Meerson, N. R., Hepatology 27:563-568 (1998)), permite la detección diagnóstica de 24P4C12 mediante anticuerpos anti-24P4C12 en muestras de orina y/o suero de pacientes que se sospecha que padecen cáncer.
[0694] Los anticuerpos anti-24P4C12 que se unen específicamente a 24P4C12 se utilizan en usos terapéuticos para el tratamiento de cánceres que expresan 24P4C12. Los anticuerpos anti-24P4C12 se usan como una modalidad no conjugada y como forma conjugada en la que los anticuerpos están unidos a una de las diversas terapias o modalidades por imágenes bien conocidas en la técnica, como profármacos, enzimas, toxinas o radioisótopos. En estudios preclínicos, se prueban anticuerpos anti24P4C12 conjugados y no conjugados para ver la eficacia de prevención de tumores e inhibición de crecimiento en modelos de xenoinjertos de cáncer de ratones con SCID, p.ej., modelos de cáncer de colon (véase, p.ej., el Ejemplo titulado “Inhibición de tumores mediada por anticuerpos monoclonales de 24P4C12 in vivo”). Se usan anticuerpos conjugados y no conjugados como modalidad terapéutica en ensayos clínicos en seres humanos bien solos o en combinación con otros tratamientos como los descritos en los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 17
Ensayos clínicos en seres humanos para el tratamiento y diagnóstico de carcinomas humanos mediante el uso de anticuerpos monoclonales de 24P4C12
[0695] Se usan anticuerpos según la presente invención que reconocen un epítopo en 24P4C12 y se usan en el tratamiento de determinados tumores, preferentemente aquellos incluidos en la Tabla I. En relación con cada una de estas indicaciones, se aplican con éxito tres enfoques clínicos:
[0696] I.) Terapia complementaria: En la terapia complementaria, se trata a los pacientes con MAbs de 24P4C12 (ya sea desnudos o conjugados a un agente) en combinación con un agente antineoplástico o quimioterapéutico y/o radioterapia o una combinación de los mismos. Las dianas de cáncer primario, como aquellos incluidos en la Tabla I, se tratan según protocolos estándares mediante la adición de MAbs de 24P4C12 para una terapia de primera y segunda línea estándares. Los diseños de protocolo abordan la eficacia como se evalúa mediante los siguientes ejemplos, sin carácter limitativo, reducción en la masa tumoral de lesiones primarias o metastásicas, progresión aumentada de supervivencia libre, supervivencia global, mejora de la salud de los pacientes, estabilización de la enfermedad, así como la capacidad de reducir las dosis normales de quimioterapia estándar y otros agentes biológicos. Estas reducciones de dosificación permiten la terapia prolongada y/o adicional mediante la reducción de la toxicidad relacionada con la dosis del agente biológico o quimioterapéutico. Los MAbs de 24P4C12 se utilizan en varios ensayos clínicos complementarios en combinación con los agentes antineoplásticos o quimioterapéuticos.
[0697] II.) Monoterapia: En relación con el uso de los MAbs de 24P4C12 (ya sea desnudos o conjugados a un agente) en monoterapia de tumores, se administran anticuerpos a pacientes sin un agente antineoplástico o quimioterapéutico. En un modo de realización, la monoterapia se realiza clínicamente en pacientes con cáncer en etapa terminal con enfermedad metastásica extensiva.
Los diseños de protocolo abordan la eficacia como se evalúa mediante los siguientes ejemplos, sin carácter limitativo, reducción en la masa tumoral de lesiones metastásicas o primarias, progresión aumentada de supervivencia libre, supervivencia global, mejora de la salud de los pacientes, estabilización de la enfermedad, así como la capacidad de reducir las dosis normales de quimioterapia estándar y otros agentes biológicos.
[0698] III.) Agente de formación de imágenes: Mediante el enlace de un radionucleido (p.ej. yodo o itrio (I131, Y90)) a Mabs de 24P4C12, los anticuerpos radiomarcados se utilizan como un agente de diagnóstico y/o de obtención de imágenes. En dicha función, los anticuerpos marcados localizan tumores sólidos, así como lesiones metastásicas de las células que expresan 24P4C12. En relación con el uso de MAbs de 24P4C12 como agentes de obtención de imágenes, los anticuerpos se emplean como un complemento al tratamiento quirúrgico de tumores sólidos, como exploración prequirúgica así como seguimiento postoperatorio para determinar qué tumor permanece y/o vuelve. En un modo de realización, un anticuerpo (111In)-24P4C12 se utiliza como agente de obtención de imágenes en un ensayo clínico humano de Fase I en pacientes que tienen un carcinoma que expresa 24P4C12 (por analogía, véase, p.ej., Divgi et al., J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)). Los pacientes se siguen con cámara gamma anterior y posterior estándar. Los resultados indican que se identifican las lesiones primarias y lesiones metastásicas.
[0699] Dosificación
[0700] Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, diversas dosis divididas pueden administrarse durante un periodo de tiempo o puede reducirse o aumentarse proporcionalmente la dosis como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para la facilidad en la administración y uniformidad de dosis. La forma de dosis unitaria como se utiliza en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos de mamíferos que serán tratados. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado junto con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitaria de la invención se dictan por y directamente dependientes de (a) las características únicas del anticuerpo y el efecto profiláctico o terapéutico concreto que se busca y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de componer dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en sujetos.
[0701] Según la inención, un intervalo ilustrativo no limitante para una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo administrado en combinación es al menos 1 mg/kg, al menos 5 mg/kg, al menos 10 mg/kg, más de 10 mg/kg, o al menos 15 mg/kg, por ejemplo de 1-21 mg/kg, o por ejemplo de 5-21 mg/kg, o por ejemplo de 5-18 mg/kg, o por ejemplo de 10-18 mg/kg o, por ejemplo, 15 mg/kg. El modo de realización de dosis alta de la invención se refiere a una dosis de más de 10 mg/kg. Debe observarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección a aliviar, y puede incluir dosis únicas o múltiples. Se debe entender además que para cualquier sujeto concreto, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo según las necesidades individuales y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación establecidos en el presente documento son sólo ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance o práctica de la composición reivindicada.
[0702] Plan de desarrollo clínico (CDP)
[0703] El CDP sigue y desarrolla tratamientos de MAbs de 24P4C12 en relación con la terapia complementaria, monoterapia y/o como agente de obtención de imágenes. Los ensayos demuestran inicialmente la seguridad y confirman después la eficacia en dosis repetidas. Los ensayos son de marca abierta comparando la quimioterapia estándar con la terapia estándar más MAbs de 24P4C12. Como se apreciará, un criterio no limitativo que puede utilizarse en relación con la inscripción de pacientes son los niveles de expresión de 24P4C12 en sus tumores determinados mediante biopsia.
[0704] Al igual que con cualquier otra terapia basada en la infusión de proteína o anticuerpo, las cuestiones sobre seguridad están relacionadas principalmente con:
(i)
el síndrome de liberación de citocina, es decir, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos;
(ii)
el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente a la terapia de anticuerpos o respuesta HAHA); y,
(iii) la toxicidad a las células normales que expresan 24P4C12. Las pruebas y seguimientos estándares se utilizan para monitorizar cada una de estas cuestiones sobre seguridad. Se descubre que los MAbs de 24P4C12 son seguros en la administración a seres humanos.
[0705] Ejemplo 18
[0706] Estudios funcionales de 24P4C12 y estudios de inhibición de MAb de 24P4C12
[0707] 24P4C12, una proteína de dominio 10-transmembrana, es un miembro de la familia transportadora de colina (CTL, en inglés) de las proteínas multitransmembrana y es el miembro 4 de la familia (CTL4). Esta familia ha sido nombrada por el Comité de nomenclatura genética HUGO como la familia 44 de portador soluto (SLC44) y 24P4C12 como SLC44A4 (familia 44 de portador soluto, miembro 4). Esta familia se identificó en su origen con los análisis de clonación y funcionales de CTL1. Se demostró que esta proteína expresada de manera ubicua, también conocida como CDw92, transporta colina de un modo independiente de sodio. La 24P4C12 es 26% homóloga a CTL1 al nivel de aminoácidos, por tanto, se deduce que 24P4C12 también funciona como un trasportador de iones o macromolécula. A modo de referencia, la topología de membrana de 24P4C12 y CTL1 respectivamente se muestra en la Figura 10 y en la Figura 11.
[0708] En morado se muestran los residuos potenciales de glicosilación enlazados a asparagina extracelular y en verde aparecen las cisteínas potenciales extracelulares usadas en enlaces disulfuros. También se muestran los aminoácidos cargados en los dominios transmembrana. Los residuos de aminoácidos básicos, arginina, histidina y lisina se muestran en azul y el ácido glutámico de residuo de ácido se presenta en rojo. Es probable que estos residuos cargados sean importantes para la función de transporte de la proteína a través de la mediación de la estructura terciaria apropiada de las hélices y/o movimiento de la macromolécula o del ion a través del canal o la estructura de poros formada por la proteína. Aunque se ha indicado que la CTL1 funciona como transportador de colina, debido a las diferencias en la topología de transmembrana y al número y espaciado de los aminoácidos cargados en 24P4C12 en relación con CTL1, es posible que 24P4C12 medie macromoléculas o iones de transporte distintos de colina.
[0709] 24P4C12 se expresa en las membranas apicales de diversos epitelios secretores glandulares, incluyendo próstata, colon, intestino delgado, bronquios del pulmón, páncreas y los carcinomas que surgen de estos tejidos. 24P4C12 tiene expresión prominente en membrana apical de próstata normal. La gran función biológica de la próstata es crear y secretar fluido prostático. Es concebible que 24P4C12, actuando como transportadora, regule la composición del fluido prostático. En un modo de realización, el sustrato de 24PC12 está presente en el fluido prostático. Los sustratos de 24P4C12 que están presentes en el líquido prostático están incluidos en la Tabla VII. La concentración de potasio se eleva en el líquido prostático (30-50 mM) en comparación con el suero (3-4 mM), por tanto, en otro modo de realización ,24P4C12 transporta potasio o utiliza potasio como contraión en el transporte de otra macromolécula.
[0710] Para confirmar la actividad de transporte de 24P4C12, las células MDCK-24P4C12 muestran una disminución en la fluorescencia de diacetato de fluoresceína clorometilo (CMFDA), un tinte fluorescente sensible a PH, comparado con el control de neocélulas cuando se exponen a concentraciones de potasio extracelular elevadas (K+). Este resultado indica una caída en el pH intracelular, que sugiere que la actividad de transporte de 24P4C12 no conlleva iónes H+ y/o K+. (Figura 12)
[0711] Además, el líquido prostático es ligeramente ácido, exhibiendo un intervalo de pH de 6,4 a 6,8, de esto modo 24P4C12 también puede regular la homeostasis del pH de células cuando se exponen a medio acidificado con propionato de sodio. Estos resultados sugieren que 24P4C12 puede regular la homeostasis de pH intracelular de células cuando se exponen a un entorno de pH bajo. (Figura 13).
[0712] En otro modo de realización, la actividad de transporte de 24P4C12 comprende regular el pH intracelular en respuesta a cambios del pH en el medio extracelular. Muchos de los iones y macromoléculas presentes en el líquido prostático también están presentes en el baño de fluidos o son secretados por epitelio apical de otros órganos que expresan 24P4C12. Dichos órganos incluyen, sin carácter limitativo, los bronquios del pulmón, colon, intestino delgado, páncreas y riñón. La actividad de transporte de 24P4C12 puede regular la homeostasis de los fluidos y secreciones en estos órganos. En la Tabla VII, se incluyen otros sustratos de la actividad de transporte de 24P4C12 basados en la composición de fluidos presentes en órganos que comprenden el tracto digestivo y los bronquios del pulmón.
[0713] Durante el proceso oncogénico de tejidos normales, las células tumorales pueden adaptar o aumentar las actividades de transporte que proporcionan nutrientes beneficiales, iones, macromoléculas
o vías de señalización que promueven el crecimiento tumoral o la metástasis. La actividad transportadora de 24P4C12 puede proporcionar dichos beneficios al tumor. Por lo tanto, los MAbs de 24P4C12 que bloquean o reducen la actividad de transporte de 24P4C12 proporcionarían beneficios terapéuticos mediante la inhibición del crecimiento tumoral o la mediación en la muerte celular. En un modo de realización, los MAb 24P4C12 se unen a la proteína 24P4C12 y bloquean estéricamente el canal o poro que media en la actividad de transporte. En otro modo de realización, los MAbs de 24P4C12 se unen a 24P4C12 causando cambios conformacionales que interrumpen la actividad de transporte. En otro modo de realización más, los MAbs de 24P4C12 median en el tamponado, internalización y disminución de 24P4C12 desde la superficie celular.
[0714] La Figura 14 muestra el tamponado y la internalización de la proteína 24P4C12 en las células PC3-24P4C12 cuando están relacionadas por MAbs de 24P4C12. En resumen, los MAbs Ha5-7acd19, Ha5-7be37 y Ha5-3(1,4)7 se etiquetaron con tinte fluorescente Alexa Fluor 488 como indican las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad CA). Las células PC3-24P4C12 se incubaron con los MAbs marcados durante 2 horas a 4ºC. Tras el lavado, las células bien se mantuvieron a 4ºC o bien se cambiaron a 37ºC durante 2 horas. Las células se fijaron entonces y se examinaron por microscopia fluorescente. La Figura 14A muestra imágenes fluorescentes de células incubadas con MAb y mantenidas a 4ºC que muestran la tinción de la superficie célular de la proteína 24P4C12. La Figura 14B muestra imágenes fluorescentes de células con tinción de MAb y que después se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Estas células muestran una pérdida de tinción de la superficie celular en forma de anillo y la aparición de puntos brillantes y fluorescencia punteada que muestra la internalización y el tamponado mediados por MAb de la proteína 24P4C12.
[0715] Dicho tamponado e internalización eliminan la actividad transportadora de 24P4C12 de la superficie celular, de este modo proporcionan un efecto inhibidor en la célula tumoral.
Ejemplo 19
Detección de la proteína 24P4C12 en las muestras de pacientes con cáncer mediante IHC
[0716] La expresión de la proteína 24P4C12 por inmunohistoquímica se analizó en muestras de tumor de cáncer de ovario y de páncreas. En resumen, una vez fijados con formalina, los tejidos incrustados en cera de parafina se cortaron en secciones de 4 micras y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se dejaron libres de cera, se rehidrataron y trataron con solución de tripsina (0,05% de tripsina (ICN, Aurora, Ohio) en 0,05% de cloruro de calcio, con pH ajustado a 7,8) a 37ºC durante 10 minutos. Después se trataron las secciones con 3% de solución de peróxido de hidrógeno para inactivar la actividad de la peroxidasa endógena. El bloque de proteína libre de suero (Dako, Carpenteria, CA) se utilizó para inhibir la unión no específica anterior a la incubación con anticuerpos monoclonales anti24P4C12 de ratón. Posteriormente, se trataron las secciones con el sistema de detección de peroxidasa de rábano (HRP, en inglés) de polímero Super SensitiveTM que consiste en una incubación con reactivo Super EnhancerTM seguida de una incubación con conjudado de anticuerpo secundario de HRP de polímero (BioGenex, San Ramon, CA). Después se desarrollaron las secciones utilizando el kit DAB (BioGenex, San Ramon, CA), los núcleos se tiñeron usando hematoxilina y se analizaron mediante microscopia de campo claro. Las células que contienen inmunoreactivo de antígeno con el anticuerpo 24P4C12 se tiñen de marrón.
[0717] Los resultados muestran la expresión de 24P4C12 en las células tumorales de tejido de cáncer de ovario humano y tejido de cáncer pancreático. Estos resultados indican que 24P4C12 se expresa en cánceres humanos y que los anticuerpos dirigidos a este antígeno son útiles para los fines terapéuticos y de diagnóstico. (Figura 15A y Figura 15B).
[0718] A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversos contenidos de datos de páginas web, publicaciones, solicitudes de patentes y patentes. (Las páginas web se citan por la direccion URL).
[0719] El alcance de la presente invención no está limitado por los modos de realización divulgados en el presente documento, que están destinados a ser simples ilustraciones de aspectos individuales de la invención, y cualesquiera que sean funcionalmente equivalentes se encuentran en el alcance de la invención. Diversas modificaciones de los modelos y métodos de la invención, además de los descritos en el presente documento, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción y las enseñanzas anteriores, y están destinadas de manera similar a clasificarse dentro del alcance de la invención.
Tablas
Tabla I: Tejidos que expresan 24P4C12 cuando son malignos
Colon
Páncreas
Ovario
Mama
Pulmón
Próstata
TABLA II: Abreviaturas de aminoácidos
UNA LETRA
TRES LETRAS NOMBRE COMPLETO
F
Phe fenilalanina
L
Leu leucina
S
Ser serina
Y
Tyr tirosina
C
Cys cisteína
W
Trp triptófano
P
Pro prolina
H
His histidina
Q
Gln glutamina
R
Arg arginina
I
Ile isoleucina
M
Met metionina
T
Thr treonina
N
Asn asparagina
K
Lys lisina
V
Val valina
A
Ala alanina
D
Asp ácido aspártico
E
Glu ácido glutámico
G
Gly glicina
TABLA III: Matriz de sustitución de aminoácidos
Adaptada de la matriz de sustitución de aminoácidos (matriz de sustitución de bloques) de GCG Software 9.0 BLOSUM62. Cuanto mayor sea el valor, más probabilidades hay de encontrar una sustitución en proteínas naturales relacionadas.
TABLA IV: Supermotivos/motivos de HLA Clase I/II [0720]
TABLA IV (A): Supermotivos/motivos de HLA Clase I
SUPERMOTIVO
POSICIÓN POSICIÓN POSICIÓN
2 (Anclaje primario)
3 (Anclaje primario) Extremo C terminal (Anclaje primario)
A1
TILVMS FWY
A2
LIVMATQ IVMATL
A3
VSMATLI RK
A24
YFWIVLMT FIYWLM
B7
P VILFMWYA
B27
RHK FYLWMIVA
B44
ED FWYLIMVA
B58
ATS FWYLIVMA
B62
QLIVMP FWYMIVLA
MOTIVOS
A1
TSM Y
A1
DEAS Y
A2.1
LMVQIAT VLIMAT
A3
LMVISATFCGD KYRHFA
A11
VTMLISAGNCDF KRYH
A24
YFWM FLIW
A*3101
MVTALIS RK
A*3301
MVALFIST RK
A*6801
AVTMSLI RK
B*0702
P LMFWYAIV
B*3501
P LMFWYIVA
B51
P LIVFWYAM
B*5301
P IMFWYALV
B*5401
P ATIVLMFWY
Se prefieren los residuos indicados en negrita, los indicados en cursiva son menos preferidos: Se considera que un péptido porta un motivo si tiene anclajes primarios en cada posición de anclaje primario para un motivo o supermotivo como se específica en la tabla anterior.
TABLA IV (B): Supermotivo de HLA de Clase II TABLA IV (C): Motivos de HLA Clase II
1
6 9
W, F, Y, V, I, L
A, V, I, L, P, C, S, T A, V, I, L, C, S, T, M, Y
TABLA IV (D): Supermotivos de HLA Clase I
Los residuos en cursiva indican residuos menos preferidos o “tolerados”
TABLA IV (E): Motivos de HLA Clase I
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Z
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C
Z
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C
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•
•
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TABLA IV IFl:
Resumen de supertipos de HlA Frecuencias fenotípicas globales de supertipos de HLA en diferentes poblaciones étnicas Especificidad Frecuencia fenotípica
Supertipo
Posición 2 Extremo ( Caucásico N.A Japonés Chino Hispano Media
terminal
negro
87
P AILMVFWY 43,2 55,1 57,1 43,0 49,3 49,5
A3
AILMVST RK 37.5 42,1 45,8 52,7 43,1 44,2
A2
AILMVT AILMVT 45,8 39,0 42,4 45,9 43,0 42,2
A24
YF FI (YWLM) 23,9 38,9 58,6 40,1 38,3 40,0
(WIVlMT)
844
E (D) FWYlIMVA 43,0 21,2 42,9 39,1 39,0 37,0
A1 827
TI (lVMS) RHK FWY FYL (WMI) 47,1 28,4 16,1 26,1 21,8 13,3 14,7 13,9 26,3 35,3 25,2 23,4
862
Ol (lVMP) FWY (MIV) 12,6 4,8 36,5 25,4 11,1 18,1
858
ATS FWY(lIV) 10,0 25,1 1,6 9,0 5,9 10,3
TABLA IV (G):
Cobertura de población calculada asociada a diferentes combinaciones de supertipos de HLA
Frecuencia fenotípica
Supertipos de HLA
Caucasico N.A. negro Japonés Chino Hispano Media A2. A3.y
83,0 86,1 87,5 88,4 86,3 86,2 87 99,5 98,1 100,0 99,5 99,4 99,3 A2.A3.87,A24,844 Y Al A2, A3. 99,9 99,6 100,0 99,8 99,9 99,8 B7.A24, 844.Al.B27,¡¡ij2. Y B58
los rr,otivos indican los residuos que definen espeCificidades del supertipo. Los motivos incorporan residuos determinados basándose en los datos publicados para ser reconocidos por múltiples alelas en el supertipo. los residuos entre parentesis 5011 residuos adicionales de los que también se predice que sean tolerados por múltiples alelas en el supertipo.
Tabla V: Motivos de origen frecuente Nombre media % identidad Descripción Función potencial proteína de unión al ácido nucleico funciona como factor de transcripción, probable localización zf-C2H2 34% Dedos de zinc, tipo C2H2 nuclear Citoeromo b( N-oxidasa unida a membrana genera citocromo_b_N 68% terminal)/b6/petB superóxido los dominios tienen una longitud de cien aminoácidos e incluyen un enlace de disulfuro en el Ig 19% Dominio de inmunoglobulina intradominio conservado repeticiones en tándem de aprox. 40 Dominio WD, repetición G-residuos, cada uno de los cuales WD40 18% beta contiene un motivo Trp-Asp. Función
de transducción de señales e interacción de proteínas
puede funcionar en la dirección de moléculas de señalización a sitios PDZ 23% Dominio PDZ submembranos
motivos de secuencia corta implicados en interacciones LRR 28% Repetición rica en leucina proteína-proteína núcleo catalítico conservado común
a ambas proteínas quinasas
setina/treonina y tirosina que Dominio de la proteína contiene un sitio de unión a ATP y
Pquinasa 23% quinasa un sitio catalítico homología pleckstrina implicada en la señalización intracelular o como
PH 16% Dominio pH constituyente del citoesqueleto 30-40 aminoácidos de longitud que se encuentran en el dominio extracelular de proteínas unidas a membrana o en proteínas EGF 34% Dominio tipo EGF secretadas Transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente del Rvt 49% ARN) Proteína citoplasmática, asocia proteínas integrales de membrana al Ank 25% Repetición Ank citoesqueleto NADH-asociado a membrana. Participa en Ubiquinona/plastoquinona la translocación protónica a través Oxidored q1 32% (complejo I). diversas cadenas de la membrana dominio de unión a calcio, consta de un bucle de 12 residuos flanqueados a ambos lados por un dominio alfa-Efhand 24% Mano EF helicoidal de 12 residuos proteasas de aspartilo o de ácido, Proteasa de aspartilo centradas en un residuo de aspartilo Rvp 79% retroviral catalítico proteínas estructurales extracelulares implicadas en la formación de tejido conectivo. La secuencia consta de la G-X-Y y las Repeticiones de tripe hélice cadenas de polipéptido forman una Colágeno 42% de colágeno (20 copias) triple hélice Situado en la región de unión al ligando extracelular de receptores y es de aproximadamente 200 residuos de aminoácidos de longitud Dominio de fibronectina tipo con dos pares de cisteínas Fn3 20% 111 implicadas en enlaces de disulfuro siete regiones transmembrana hidrofóbicas, con el extremo N-terminal situado de forma Receptor de transmembrana extracelular mientras que el 7tm 1 19% 7 (familia de rodopsina) extremo (-terminal es
citoplasmático. Señal a través de proteínas G.
Tabla VI' Afinidad de MAb de 24P4C12 mediante FACS en células LNCaP
Clon
Isotipo Afinidad LNCaP (nM)' GrupoY de epítopo
Ha5-1(5)1
y2 K 4,10 1
Ha5-1(5)2
y2 K 2,75 1
Ha5-3(1,4)7.1
y1 K 5,50 4
Ha5-3(3,5)37.1
y1 K 0,45 7
Ha5-7be20.1
y1 K 3,20 13
Ha5-7be34.1
y1 K 1,76 13
Ha5-7be37.1
y1 K 2,80 12
Ha5-7be31.1
y1 K 4,15 11
Ha5-7acd2.1
y1 K 1,95 13
Ha5-7acd3.1
y1 K 4,40 10
Ha5-7acd4.1
y1 K 0,99 10
Ha5-7acd10.1
y1 K 1,26 10
Ha5-7acd16.1
y1 K 0,70 13
Ha5-7acd19.1
y1 K 0,19 7
Ha5-7acd7.1.1
y1 K 1,85 13
Ha5-7acd20.1.1
y1 K 1,10 10
Ha5-8ac4.1
y1 K 0,07 SD
Ha5-11b1.1
y1 K 3,40 14
x: Afinidad determinada mediante curvas de unión de saturación de equilibrio por FACS
y: Grupo de epitopo determinado por unión de competición de equilibrio por FACS SD: Sin determinar
Thbla VII' sustratos de macromoléculas elementos e iones de 24P4C12 en fluido prostático
ácido ascórbico magnesio
antlgenos de grupo sanguíneo nitrógeno
calcio fósforo
cloro potasio
colesterol purina
colina pirimidina
ácido cítrico ácido pirúvico
creatina sodio
ácido desoxirribonucleico sorbitol
bases y azúcares de nucleótidos y nucleósidos espermidina
fructosa espermina glutatión urea hialuronidasa ácido úrico inositol vitamina B 12 ácido láctico zinc sodio pH 6,4-15,8
Tabla VII: Sustratos de macromoléculas, elementos e iones de 24P4C12 que presentan fluidos del tracto digestivo y de los bronquios del pulmón.
vitaminas A, 81, e, D, E, K, 81, 82, 86, 812 cloruro cobre yodo biotina hierro glicerol ácidos grasos de cadena corta monoglicéridos monosacáridos disacáridos aminoácidos dipéptidos lípidos
mucinas
bicarbonato
5 LISTAS DE SECUENCIAS
[0721]
< 11 O> Agensys, Inc. Arthur B. Raitano Kendall Morrison
10 Pia Challita-Eid Xiao-Chi Jia
Karen Jane Meyrick Morrison
Jean Gudas
Steven B. Kanner
15 Aya Jakobovits
<120> Anticuerpos y moléculas relacionadas que se unen a proteínas 24P4C 12
<130> 51158-20011.58
<160> 172
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211>2587
5
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (6) ...(2138)
10
<400> I
gagcc at.g ggg gga aag cag egg gae gag gat gae gag gcc tac ggg aag Met Gly Gly Lys Gln Arg Asp Glu Asp Asp GIl) Ala Tyr Gly Lys
50
l 5
cea gtc aaa tae gae eee tee ttt cga Pro Val Lys Tyr ASp Pro Ser Phe Arg 20
tge aea gat gtc ate tgc tge gte etc Cys Thr Asp Val Ile Cys Cys Val Leu 35 40
tac ate gtg gtg ggg att gtg gec tgg Tyr rle Val Val Gly ¡le Val Ala Trp 50 55
gte ete tae eee agg aae tet aet ggg Val Leu Tyr Pro Arg Asn Ser Thr Gly 65 70
aae aaa gat aag eeg tat etc etg tae Asn Lys Asp Lys Pro Tyr Leu Leu Tyr ao 85
etg tee age ¡:¡ac ate ate tea gtt gct Leu Ser Ser Asn !le Ile Ser Val Ala 100
aca cee cag gtg tgt gtg tcc tcc tgc
lO 15
gge eee ate aag aae aga age 98 Gly Pro Ue Lys Asn Arg Ser
25 30
tte etg ete tte att eta ggt 146
Phe Leu Leu Phe
ttg tat gga gae Leu Tyr Gly Asp 60
gee tae tgt gge
Ile Leu Gly 45
eee egg eaa 194 Pro Arg Gln
atg ggg gag 242
Ala Tyr Cys Gly Met Gly Glu 75
tte aae ate tte age tge ate 290 Phe Asn Ile Phe Ser Cys Ue 90 95
gag aae gge cta eag tge eee 338 Glu Asn Gly Leu Gln Cys Pro 105 110
eeg gag gae cea tgg aet gtg 386
Thr Pro Gln Val Cys Val" Ser Ser Cys I:'ro Glu ASp Pro rrp Ihr Val 115 120 125
gga aaa aac gag ttc tea caq act gtt ggg gaa gtc ttc tat aca aaa Gly Lys Asn Glu Phe Ser Gln Thr Val Gly Glu val Phe Tyr Thr Lys 130 135 140
aac agg aac ttt tgt ctg cea ggg gta cee tgg aat atg acg gtg ate 492 Asn Arg Asn Phe Cys Leu Pro Gly Val Pro Trp Asn Met Thr Val 11e 145 150 155
aca agc ctg caa cag gad etc tgc cee agt ttc etc etc cee tct gct 530
Thr Ser Leu Gln Gln Glu Leu cys Pro Ser Phe Leu Leu Pro Ser Ala
160 165 170 175
cea gct ctg ggg cqc tgc ttt cea tgg acc aac gtt act cea ccg gcg 578 Pro Ala Leu Gly Arg Cys Phe Pro lrp Thr Asn Val Thr Pro Pro Ala 190 185 190
etc cea ggg ate acc aat gac acc acc ata cag cag 999 ate agc ggt 626 Leu Pro Gly 11e The Asn Asp Thr Thr Ile Gln Gln Gly Tle Ser Gly195 200 205
ctt att gac agc etc aat gcc cga gac ate agt gtt aag ate ttt gaa 674 LE/u 1161 Asp Ser Leu A$n Ala Arg Asp lIé Ser Val Lys lle I?hé Glu 210 215 220
gat ttt gcc cag tce tgg lat 199 att ctt gtt gcc ctg ggg gtg gct 722 Asp I?he Ala Gln Ser Trp lyr Trp lle Leu Val Ala Leu Gly Val Ala 225 230 23,
etg gtc ttg agc eta etg ttt ate ttg ett etg cgc etg gtg get ggg 770
Leu Val Leu Ser Leu Leu Phe lle Leu Leu Leu ALg Leu Val Ala Gly
240 245 250 255
cee ctg gtg ctg gtg ctg Rtc ctg gga gtg ctg ggc gtg ctg gca tac 818 Pro LéU Val Leu Val Leu 11e Leu Gly Val Leu Gly Val Leu Ala Tyr260 265 270
gge ate tae tac tge tgg gag gag tac cga gtg ctg cgg gae aag gge 866 Gly lle Tyr Tyr Cys Trp Glu Glu Tyr Arg Val Leu Arg Asp Lys Gly 275 280 285
gcc tce ate tec cag etg ggt ttc aec acc aae etc agt gec tae cag 914 Ala Ser lle Ser Gln Leu Gly I?he Thr Thr Asn Leu Ser Ala lyr Gln 290 295 300
age gtg eag gag aee tgg ctg gce gee ctg ate gtg ttg geg gtg eLL 962 Ser Val Gln Glu Thr Trp Leu Ala Ala Leu lle Val Leu Ala Val Leu 305 310 315
gaa gee ate etg etg etg atg etc ate tte etg egg cag cgg att cgt 1010 Glu Ala 11e Leu Leu Leu Met Leu 11e Phe Leu Arg Gln Arg 1le Arg320 325 330 335
att gce ate gec etc ctg aag gag gec agc aag get gtg gga eag atg 1058 1le Ala 11e Ala Leu Leu Lys G1u Ala Ser Lys Ala Val Gly Gln Met 310 345 350
atg tct ace atg ttc tae cea etg gtc ace ttt gtc etc etc etc ate 1106 Met Ser Thr Met Phe Tyr Pro Leu Val Thr Phe Val Leu Leu Leu lle
355 360 365
tgc att gcc tae tgg gcc atg act gct ctg tae ctg gct aca tcg 999 1154 Cys Ile Ala Tyr Trp Ala Met Thr Ala Leu Tyr'Leu Ala Thr Ser Gly 370 375 380
caa cee cag tat gtg etc tgg gca tee aac ate agc tee cee ggc tgt 1202 Gln PrD Gln Tyr Val Leu Trp Ala Ser Asn 11e Ser Ser Pro Gly Cys385 390 395
gag aaa gtg cea ata aat aca tea tgc aac cee acg gcc cae ett gtg 1250 Glu Lys Val Pro Ile Asn Thr Ser Cys Asn Pro Thr Ala His Leu Val 400 405 410 415
aac tee tcg tgc cea 999 ctg atg tgc gtc ttc cag ggc tae tea tee 1298 Asn Ser Ser Cys Pro Gly Leu Met Cys Val Phe Gln Gly Tyr Ser Ser 420 425 430
aaa ggc cta ate caa cgt tet gtc ttc aat ctg caa ate tat ggg gtc 1346 Lys Gly Leu Ile Gln Arg ser Val ~he Asn Leu Gln Ile Tyr Gly Val 435 440 445
ctg 999 etc ttc tgg acc ett aac tgg gta ctg gcc ctg qgc caa tgc 1394 Leu Gly Leu Phe Trp Thr Leu Asn Trp Val Leu Ala Leu Gly Gln Cys 450 455 460
gte etc gct gga gee ttt gce tee ttc tae tgg gec tte cae aag cee 1442 Val 1.8'.1 Ala Gly Ala PhEl Ala SQr Phe Tyr Trp Ala Phe His Lys ?ro 465 470 475
cag gae ate cet aee tte cee tta ate tet gcc ttc ate cgc aca etc 1490 Gln ASp lle PrD Ihr Phé Pro Leu Ile Ser Ala Phe Ile Arg Thr Leu 480 485 490 495
egt tac cae aet ggg tea ttg gea ttt ggd gee etc ate etg aec ctt 1538 Arg Tyr His Thr Gly Ser Leu Ala Phe Gly Aja Leu Ile ~eu Ihr Leu 500 505 510
gtg cag ata gce cgg gtc ate ttg gag tat att gae cae aag etc aga 1586 VAl Gln l1e Ala Arg Val Ile Leu Glu Iyr lle ASp His Lys Leu Arg 515 520 525
gga gtg eag aae eet gta gee cge tgc ate atg tge tgt ttc aag tgc 1634 Gly Val Gln Asn PrD Val Ala Arg Cys lle Met Cys Cys Phe Lys Cys530 535 540
tgc etc tg~ tgt ctg gaa aaa ttt ate aag tte cta aae egc aat gca 1682 Cys Leu :rp Cys Leu Glu Lys Phe 11e Lys Phe Leu Asn Arg Asn Ala 545 550 555
tac ate atq ate gec ate tae ggg aag aat tte tgt gtc ~ca gee aaa 1730 Tyr 11e Met lle Ala lle Iyr Gly Lys Asn Phe Cys Val Ser Ala Lys560 565 570 575
aat gcg tte atq cta etc atg cga aae att gte agg gtg gtc gtc ctg 1778 Asn Ala Phe Met Leu Leu Met Arg Asn lle Val Arg Val Val Val Leu sao 585 590
gac .:lilil gtc aca gae ctg ctg ctg tte ttt ggg aag ctg ctg gtg gtc 1826 Asp Lys Val Thr Asp Leu Leu Leu Phe Phe Gly LyS Leu Leu Val Val
595 600 60S
gga gge gtg ggg gtc ctg tcc ttc ttt ttt ttc tec ggt cgc ate ceg 1874 Gly Gly Val Gly Val Leu Ser Phe Phe Phe Phe Ser Gly Arg Ile Pro 610 615 620
ggg ctg ggt aaa gac ttt aag agc cee cae etc aac tat tae tgg ctg 1922 Gly Leu Gly Lys Asp Phe Lys Ser Pro Mis Leu Asn Tyr Tyr Trp Leu 625 630 635
cee ate atg ace tcc ate ctg 999 gcc tat gtc ate gcc agc ggc ttc 1970 Pro 11e Met Thr Ser 11e Leu Gly Ala Tyr val 11e Ala Ser Gly Phe 640 645 650 655
ttc agc gtt ttc ggc atg tgt gtg gac acg etc ttc etc tgc ttc ctg 201B Phe Ser Val Phe Gly Met Cys Val Asp Thr Leu Phe Leu Cys Phe Leu 660 665 670
gaa qac ctg gag cgg aae aae ggc tcc ctg gac cgg cee tae tac atg 2066 Glu Asp Leu Glu Arg Asn Asn Gly Ser Leu Asp Arg Pro Tyr tyr Met 675 6BO 6B5
tec aag agc ctt cta aag att ctg ggc aag aag aae gag gct;J cee eec;¡ 2114 Ser Lys Ser Leu Leu Lys 11e Leu Gly Lys Lys Asn Glu Ala Pro E?ro 690 695 700
gac aac aag aag agg aag aag tga cagctccggc cctgatccag gactgcaccc 216B ASp Asn Lys Lys Arg Lys Lys 705 "110
cacccccacc gtccagccat ccaacctcac ttcgccttac aggtctccat tttgtggtaa 2228 aaaaaggttt taggccaggc gccgtggctc acgcctgtaa tccaacactt tgagaggctg 2288 aggcgggcgg atcacctgag tcaggagttc gagaccagcc tggccaacat ggtgaaacct 2348 ccgtctctat taaaaataca aaaattagcc gagagtggtg gcatgcacct gtcatcccag 240B ctactcggga ggctgaggca gqilgaatcgc ttgaacccgg gaggeagagg ttgcagtgag 2468 ccgagatcgc gccactgcac tccaacctgg gtgacagact ctgtctccaa aacaaaacaa 2528 acaaacaaaa agattttatt aaagatattt tgttaactca gtaaaaaaaa aaaaaaaaa 2587
<210>2
<211>710
<212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<400> 2 Met Gly Gly Lys Gln Arq ASp Glu Asp Asp Glu Ala Tyr Gly Lys Pro 1 5 10 15 Val Lys Tyr Asp Pro Ser Phe Arg Gly Pro 11e Lys Asn Arg Ser Cys 20 25 30 Thr ASp Val Ile Cys Cys Val Leu Phe Leu Leu Phe 11e Leu Gly Tyr 35 40 45 1le Val Val Gly 1le Val Ala Trp Leu Tyr Gly Asp Pro Arg Gln Val 50 55 60 Leu !yr Pro Arg Asn Ser Thr Gly Ala Tyr CyS Gly Met Gly Glu Asn 6510 75 80 Lys Asp Lys Pro Tyr Leu Leu Tyr Phe Asn 11e Phe Ser Cys 11e Leu 85 90 95 Ser Ser Asn Ile 1le Ser Val Ala Glu Asn Gly Leu Gln Cys Pro Thr 100 105 110 Pro·Gln Val Cys Val Ser Ser Cys Pro Glu Asp Pro Trp Thr Val Gly 115 120 125
Lys Asn Glu Phe Ser Gln Thr Val Gly Glu Val Phe Tyr Thr Lys Asn 130 135 140
Arg Asn Phe Cys Len Pro Gly Val Pro Trp Asn Met Thr Val 11e Thr 145 150 155 160 Ser Leu Gln Gln Glu Leu eys Pro Ser Phe Leu Leu Pro Ser Ala Pr~
165 170 175 Ala Leu Gly Arg Cys ?he Pro Trp Thr Asn Val Thr Pro ?ro Ala Leu 1BO 1B5 190 Pro Gly Ile Thr Asn ASp Thr rhr 11e Gln Gln Gly lle Ser Gly Leu 195 200 205 lle ASP Ser Leu Asn Ala Arg ASp :1e Ser val Lys lle Phe Glu Asp
210 215 220 Phe Ala Gln Ser Trp Tyr Tip lle Leu Val Ala Leu Gly Val Ala Leu 225 230 235 240 Val Leu Ser Leu Leu ?he 11e Leu Leu Leu Arg Leu Val Ala Gly Pro
245 250 255 Leu Val Leu Val Leu Ile Leu Gly Val Leu Gly Val Leu Ala Tyr Gly 26Q 265 270 lle Tyr Tyr Cys Trp Glu Glu Tyr Arg Val Leu Arg ASp Lys Gly Ala 275 280 285 Ser 1 le Ser Gln Leu Gly Phe Ihr Thr Asn Leu Ser Ala Tye Gln Ser
290 295 300 Val Gln Glu Thr Trp Leu Ala Ala Leu lle Val Leu Ala Val Leu Glu 305 310 315 320 Ala Ile Leu Leu Leu Met Leu lle Phe Leu Arg Gln Arg Ile Arq 11e
325 330 335 Ala Ile Ala Leu Leu Lys Glu Ala Ser Lys Ala Val Gly Gln Met Met 340 345 350 Ser Ihr Met Phe Tyr PrO L~u Val Thr Phe val Leu Leu Leu 11e Cys 355 360 3E5 11e Ala Tyr Trp Ala Met Thr Ala Leu Tyr Leu Ala Ttr Ser Gly Gln
370 375 380 Pro Gln Tyr Val Leu Trp Ala Ser Asn Ile Ser Ser Pro Gly Cys Glu 385 390 395 400 Lys Val Pro Ile Asn Thr Ser Cys Asn Pro Thr Ala His Leu Val Asn
405 410 415 Ser Ser Cys Pro Gly Leu Met Cys Val Phe Gln Gly Tyr Sp,r Ser Lys 420 42.5 43 O Gly Leu Ile Gln Arg Ser Val Phe Asn Leu Gln !le ':.'yr Gly Val Leu 435 440 445 Gly Leu Phe Trp Thr Leu Asn Trp Val Leu Ala Leu Gly Gln Cys Val
450 455 460 Leu Ala Gly Ala Phe Ala Ser Phe Tyr Trp Ala Phe His Lys Pro Gln 465 470 415 480 Asp 1le Pro Thr Phe PrO Leu 1le Ser Ala Phe 11e Arg Thr Leu Arg
4S5 490 49, Tyr His Thr Gly Ser Leu Ala Phe Gly Ala Leu Ile Leu Thr Leu Val 500 505 510 Gln Ile Ala Arg Val lle Leu Glu Tyr Ile A8p Hio Lys Leu Arg Gly 515 520 525 Val Gln Asn Pro Val Ala Arg Cys Ile Met cys Cys Phe Lys Cys Cys
530 .35 540 Leu Trp Cya Leu Glu Lys Phe Ile Lys Phe Leu A~n Arg Asn Ala Tyr 545 5,0 555 560 Ile Met 1le Ala Ile Tyr Gly Lys Asn Phe Cys Val Ser Ala Lys Asn
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<221> CDS
<222> (6) ... (2144)
<400> 17 gagcc atg ggg gga aag cag cgg gac gag gat gac gag qec tac 999 aag 50
Met Gly Gly Lys Gln Arg ASp Glu ASp ASp Glu Ala Tyr GIy Lys 1 5 10 15
cea gte aaa tac gac cee tcc ttt cga gge cee ate aag aac aga agc 98
Pro Val Lys Tyr ASp Pro Ser Phe Arg Gly Pro 11e Lys Asn Arg Sor 20 25 30
tgc aca gat gtc atc tgc tge gtc etc ttc ctg etc tte att eta ggt 146
Cys Thr Asp Val l1e Cys Cys Val Leu Phe Leu Leu Phe 11e Leu Gly 35 40 45
tac atc gtg gtg ggg att gtg gcc tg9 ttg tat 99a gac cee cgg caa 194 Tyr l1e Val Val Gly l1e Val Ala Trp Leu Tyr Gly ASp Pro Arg Gln
10 50 55 60
gtc etc tac cee agg aac tct act 999 gcc tac tgt ggc atg ggg gag 242 Val Leu Tyr Pro Arg Aso Ser Thr Gly Ala Tyr Cys Gly Met Gly Glu 65 70 75
aac aaa gat aag ccg tat etc ctg t~c ttc aac ate ttc agc tgc ate 290 Asn Lys Asp Lys Pro Tyr LelJ Leu Tyr Phe Asn 11e Phe Ser Cys l1e 80 85 90 95
ctg tcc agc aac ate ate tea gtt gct gag aac ggc cta cag tgc cee 338 Leu Ser Ser Asn 11e l1e Ser Val Ala Glu Asn Gly Leu Gln Cys Pro 100 105 110
aca cee cag gtg tgt gtg tcc tcc tgc ccg gag gac cea tgg act gtg 386 Thr Pro Gln Val Cys Val Ser Ser Cys Pro Glu ASp Pro Trp Thr Val 115 120 125
gga aaa aac gag ttc tea cag act gtt ggg gaa gtc ttc tat aca aaa 434 Gly Lys Asn Glu Phe Ser Gln Thr Val Gly Glu Val Phe Tyr Thr Lys 130 135 140
aae agg aac ttt tgt ctg cea 999 gta cee tgg aat atg acg gtg ate 482 Asn Arq Asn Phe Cys L9u Pro Gly Val Pro Trp Asn Met Thr Val Ile 145 150 155
aca agc ctg caa cag gaa etc tgc cee agt tte etc etc cee tct get 530 Thr Ser Leu Gln Gln Glu Leu Cys Pro Ser Phe Leu Leu Pro Ser Ala 160 165 170 175
cea get ctg 999 cgc tgc ttt cea tgg acc aac gtt act cea eeg geg 578 Pro Ala Leu Gly Arg Cys Phe Pro Trp Thr Asn Val Thr Pro Pro Ala 180 185 190
etc cea 999 ate acc ililt qile acc acc ata cag cag 999 ate agc ggt 626 Leu Pro Gly l1e Thr Asn ASp Thr Thr Ile Gln Gln Gly l1e Ser Gly195 200 205
ctt att gac agc ele aat gcc cga g<:lC ate agt gtt aag ate ttt gaa 674 Leu l1e ASp Ser Leu Asn Ala Arg Asp l1e Ser Val Lys l1e Phe Glu 210 215 220
gat ttt gcc cag tec tgg tat tgg att ctt gtt gcc ctg ggg gtg get 722 Asp Phe Ala GJn Ser Trp Tyr Trp 11e Leu Val Ala Leu Gly Val Ala 225 230 235
ctg gtc ttg agc cta ctg ttt ate ttg ctt ctg cgc ctg gtg get ggg 770 Leu val Leu Ser Leu Leu Phe Ile Leu Leu Leu Arg Leu Val Ala Gly240 245 250 255
cee ctg gtg ctg gtg ctg ate ctg gga gtg ctg ggc gtg ctg gca tae 818 PrO Leu Val Leu Val Leu 11e Leu Gly Val Leu Gly Val Leu Ala Tyr 260 265 270
gge ate tac tac tgc tgg gag gag tac cga gtg etg cgg gac aag ggc 866 Gly 11e Tyr Tyr Cys Trp Glu Glu Tyr Arg Val Leu Arg Asp Lys Gly 215 280 285
gcc tee ate tce cag ctg ggt tte ace ace aac etc agt gce tac cag 914 Ala Ser 11e Ser Gln Leu Gly Phe Thr Thr Asn Leu Ser Ala Tyr Gln
290 295 300
agc gtg cag gag acc tgg ctg gcc gcc ctg ate gtg ttg gcg gtg ctt 962 Ser Val Gln Glu Thr Trp Lau Ala Ala Leu Ile Val Leu Ala Val Leu JUS 310 315
gaa gcc ate ctg ctg ctg atg etc ate ttc ctg cgg cag cgg att egt 1010 GIu Ala Ile Leu Lau Len Met Leu Ile Phe Leu Arg Gln Arg l1e Arg 320 325 330 335
att gcc ate gcc etc ctg aag gag gcc agc aag get gtg 9ga cag atg 105S rle Ala lle Ala Leu Leu Lys GIu Ala Ser Lys Ala Val Gly Gln l-1et 340 345 350
atg tct acc atg ttc tac cea ctg gtc acc ttt gtc etc etc etc aLe 1106 IlJet Ser Thr Met Phe Tyr Pro Leu Val Thr Phe Val Leu Leu Lau 11e 355 360 365
tqc att gcc tac tgg gcc atg act gct ctg tat cet ctg cee acg cag 1154 Cys 1.1e Ala Tyr Trp Ala Met Thr ~la Leu Tyr PrO Leu Pro Thr Gln 370 3-/5 380
cea gcc aet ctt g9a tat gtg etc tgg gca tec aac ate agc tec cee 1202 Pro Ala Thr Leu Gly Tyr Val Leu Trp Ala Ser Asn 11e Ser Ser Pro 385 390 395
gge tgt gag aaa gtg cea ata aat aea tea tge aac cee aeg gee cae 1250 Gly Cys Glu Lys Val Pro Ile Asn Thr Ser Cys Asn Pro Thr Ala His 400 405 410 415
ctt gtg aac tee tcg tge cea ggg ctg atg tge gtc ttc eag gge tae 1298 Leu Val Asn Ser Ser Cys Pro Gly Leu Met Cys Val Phe Gln Gly Tyr 420 425 430
tea tec aaa gg:: cta ate caa cgt tct gte tte aat ctg eaa ate tat 1346 Ser Ser Lys Gly Leu :le G1n Arg Ser Val Phe Asn Leu Gln Ile Tyr 435 440 445
ggg gtc etg ggg etc ttc tgg acc ctt aae tgg gta etg gcc ctg Sgc 1394 Gly Val Leu Gly Leu Phe Trp Thr Leu Asn Trp Val Leu Ala Leu Gly 450 455 460
caa tge gtc etc get gga gce ttt gce tcc tte tae tgg gce tte cae 1442 Gln cys Val Leu Ala G1y Ala Phe Ala Ser Phe Tyr Trp Ala Phe His 465 470 475
aag cee eag gac ate cet acc ttc cee tta ate tct gcc ttc ate ege 1490 Lys Pro Gln ASp lle Pro 'l'hr Phe Pro Leu 1le Ser Ala Phe 1le Arg 480 485 490 495
aea etc cqt tae cae act ggg tea ttq gea ttt qga gee etc ate etg 1338 Thr Leu Arg Tyr His Thr Gly Ser Leu Ala Phe Gly Ala Leu 11. Leu 500 505 510
acc ett gtg cag ata gcc cgg gtc ate ttg gag tat att gae cae aag loS6 Ttr Leu Val ~ln Ile Ala Arg Val Ile Leu GIu Tyr Ile ASp His Lys
515 520 ;25
etc aga gga gtg cag aae cet gta gcc cgc tge ate atg tgc tgt tte 1634 Leu Arg Gly Val Gln Asn Pro Val Ala Arg Cys Ile Met Cys Cys Phe 530 535 540
aag tge tgc etc tgg tgt etg gaa aaa ttt ate aag ttc eta aac egc 1682
Lys Cys Cys Leu Trp Cys Leu Glu Lys Phe Ile Lys Phe Leu Asn Arg 545 550 555
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ate gcc ate tae 999 Ile Ala Ile Tyr Gly 565 aag aat ttc tgt gtc Lys Asn Phe Cys Val 570 tea Ser 575 1730
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tte Phe 580 atg cta etc Met Leu Leu atg cga aac att gtc aggMet Arg Asn 11e Val Arg 585 gtg Val 590 gte Val 1778
gtc ctg gac aaa gtc aca gac ctg ctg ctg ttc ttt ggg aag ctg ctg Val Leu ASp Lys Val Thr ASp Leu Leu Leu Phe Phe Gly Lys Leu Leu 595 600 605
1826
gtg gtc gga ggc gtg ggg gtc ctg tee ttc ttt ttt ttc tee ggt cgc Val Val Gly Gly Val Gly Val Leu Ser Phe Phe Phe Phe Ser Gly Arg 610 615 620
1874
ate ccg ggg ctg ggt aaa gac ttt aag agc cee cae etc aac tat tae 1922 11e Pro Gly Leu Gly Lys ASp Phe Lys Ser Pro His Leu Asn Tyr Tyr 625 630 635
tgg ctg cee ate atg acc Lec ate ctg 999 gce tat gtc ate gce age 1970 Trp Leu Pro 11e Met Thr Ser 11e Leu Gly Ala Tyr Val 11e Ala Ser 640 645 650 655
ggc tte tte age gtt ttc ggc atg tgt gtg gac aeg etc ttc etc tgc 2018 Gly Phe Phe Ser Val Phe Gly Mét Cys Val Asp Thr Leu Phe Leu Cys 660 665 670
tte etg gaa gac ctg gag cgg aae aae ggc tcc etg gac egg cee tac 2066 Phe Leu Glu ASp Leu Glu Arg Asn Asn Gly Ser Leu Asp Arg Pro Tyr 675 680 685
tae atg tee aag agc ctt cta aag att ctg ggc aag aag aae gag gcg 2114 Tyr Met Ser Lys Ser Leu Leu Lys Ile Leu Gly Lys Lys Asn Glu Ala 690 695 700
cee eeg gac aae aag aag agg aag aag tga eageteegge eetgateeag 2164 Pro Pro Asp Asn Lys Lys Arg Lys Lys
705 710
gactgcaccc caeeeceaee gtccagccat ceaaeetcac ttcgccttac aggtetccat 2224 tttgtggtaa aaaaaggttt taggccaggc gccgtggcte aegcetgtaa tccaacactt 2284 tgagaggctg aggcgggegg atcaectgag tcaggagttc gagaccagcc tggccaaeat 2344 ggtgaaaeet ccgtctetat taaaaataea aaaattagce gagagtggtg geatgeaect 2404 gtcateceag ctaeteggga ggetgaggea ggagaatcgc ttgaacccgg gaggcagagg 2464 ttgcagtg~g cegagatcge gccactgcac tccaacctgg gtgacagact ctgtctceaa 2524 aacaaaaeaa aeaaacaaaa aqattttatt aaagatattt tgttaactea gtaaaaaaaa 2584 aaaaaaaaa 2593
<210> 18
<211>712
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18 Met Gly Gly Lys Gln Arg ASp Glu Asp ASp Glu Ala Tyr Gly LyS Pro
1 5 10 15 Val Lys Tyr Asp Pro Ser Phe Arg Gly Pro l1e Lys Asn Arg Ser Cys
5
20 25 30 Thr Asp Val 11e Cys Cys Val Leu Phe LQU Leu ?he lle Leu Gly Tyr 35 40 45 11e Val Val Gly lle Val Ala Trp Leu Tyr Gly ASp Pro Arq Gln Val
50 55 60 Leu Tyr Pro Arg Aso Ser Ihr Gly Ala Tyr Cys Gly Met Gly Glu Asn 65 "10 75 80 Lys Asp Lys Pro Tyr Leu Leu Tyr Phe Asn IIQ Phe Ser Cys lle Leu
85 90 95 Ser S~r Asn 11e lle Ser Val Ala Glu Aso Gly Leu Gln Cys Pro rhe 100 105 110 Pro Gln Val Cys Val Ser Ser Cys Pro Glu Asp Pro Trp Thr Val Gly 115 120 125 Lys Aso Glu Phe Ser Gln Thr Val Gly Glu Val Phe Tyr The Lys Asn
130 135 140 Arg Asn ?he Cys Leu Pro Gly Val Pro Trp Asn Met Thr Val l1e The 145 150 155 160 Ser Leu Gln Gln Glu Leu Cys Pro Ser Phe Leu Lcu Pro Ser Ala Pro
165 170 175 Ala Leu Gly Arg Cys ?he Pro Trp The Asn Val Thr Pro Pro Ala Leu 180 185 190 Pro 31y 119 Thr Asn Asp The The l1e Gln Gln Gly lle Ser Gly Leu 195 200 205 11e ASP Ser Leu Asn Ala Arg Asp 11a Ser Val Lys lle Phe Glu ASp
210 215 220 Phe Ala Gln Ser Trp Tyr rrp lle Leu Val Ala Leu Gly Val Ala Leu 225 230 235 240 Val Leu Ser Le~ Leu Phe 1le Leu Leu Leu Arg Leu Val Ala Gly Pro
245 250 255 Leu Val Leu Val Leu 11e Leu Gly Val Leu Gly Val Leu Ala Tyr Gly 260 265 270 1le Tyr Tyr cys Trp Glu Glu Iyr Arg Val Leu Arg ASp Lys Gly Ala 275 280 285 Ser lle Ser Gln Leu Gly Phe rhr rhr Asn Leu Ser Al~ Tyr Gln Ser 290 295 300
Val Gln Glu Thr Trp Leu Ala Ala Leu l1e Val Leu Ala Val Leu Glu
305 310 315 320
Ala 1le Leu Leu Leu Met Leu lle Phe Leu Arg Gln Arq 11e Arg 11e 325 330 335 Ala 1le Ala Leu Leu Lys Glu Ala Ser Lys Ala V~l Gly Gln Met Met 340 345 350 Ser Thr Met Phe Tyr PrO Leu Val Thr Phe Val Leu Leu Leu lle cys 355 360 365 11e Ala Tyr Trp Ala Met rhr Ala Leu Tyr Pro Leu Pro rhr Gln Pro 370 375 380
Ala Thr Leu Gly ryr Val Leu Trp Ala Ser Aso 11e Ser Ser Pro Gly 385 390 395 400
cys Glu Lys Val Pro lle Asn rhr Ser Cys Asn Pro Thr Ala His Leu 405 410 415 Val Asn Ser Ser Cys Pro G1y Leu Met Cys Val Phe Gln Gly Tyr Sp.r 420 425 430 Ser Lys Gly Leu lle Gln Arg Ser Val Phe Asn Leu Gln 11e Tyr Gly 435 440 445 Val Leu Gly Leu Phe Trp Thr Leu Asn Trp val Leu Ala Leu Gly Gln 450 455 460
Cys Val Le".; Ala Gly Ala Phe Ala Ser Phe Tyr Trp Ala Phe His Lys
16, 4"10 4/5 480
Pro Gln Asp l1e Pro Thr Phe Pro Leu 11e Ser Ala Phe 11e Arg Thr 485 490 495 Leu Arg Tyr His Thr Gly Ser Leu Ala Phe Gly Ala Leu 11e Leu Thr 500 505 510
Leu Val Gln Ile Ala Arg val Ile Leu Glu Tyr 11e ASp His Lys Leu 515 520 525 Arg Gly val Gln Asn Pro Val Ala Arg Cys Ile Met Cys Cys Phe Lys 530 535 540 Cys eys Leu Trp Cys Leu Glu Lys Phe 11e Lys Phe Leu Asn Arg Asn 545 550 555 560 Ala Tyr lle Met Ile Ala Ile Tyr Gly Lys Asn Phe eys Val Ser Ala ,65 570 575 Lys Asn Ala Phe Met Leu Leu Met Arg Asn 11e Val Arg Val Val val 580 585 590 Leu Asp Lys Val Thr Asp Leu Leu Leu Phe Phe Gly Lys Leu Leu Val 595 600 605 Val Gly Gly Val Gly Val Leu Ser Phe Phe Phe Phe Ser Gly Arg lle 610 615 620 Pro Gly Leu Gly Lys Asp Phe Lys Ser Pro His Leu Asn Tyr Tyr Trp 625 630 635 640 Leu Pro lle Met Thr Ser Ile Leu Gly Ala Tyr Val Ile Ala Ser Gly 645 650 655 Phe Phe Ser Val Phe Gly Met Cys Val ASp Thr Leu Phe Leu eya Phe 660 665 670 Leu Glu Asp Leu Glu Arg Asn Asn Gly Ser Leu Asp Arg Pro Tyr Tyr 675 680 685 Met Ser Lys Ser Leu Leu Lys l1e Leu Gly Lys Lys Asn Glu Ala Pro 690 695 700 Pro Asp Asn Lys LyS Arg Lys Lys 705 710
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<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
<400> 19 caggtgcagc tggtggagtc t_gggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtggag cctctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg qgtgqcagtt atqtcatatg atggaagtaa aaaatactat 180 acagactccg tgaagggccq attcaccatc tccaqagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agttgaggac acqgctgtgt attactgtgc gagagatggg 300 ggtgactacg tccgctacta ctactacggt atggacgtct gggqccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcqgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420 agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtg 576
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<213> Horno sapiens
<400> 20 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly V~l Val Gln PrO Gly Arg 1 5 10 15 Ser Lau Arg Lau Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Met Sar Tyr ASp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg ASp Gly Gly Asp Tyr Val Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met ASp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 1"70 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190
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<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
<400> 21 ctcccagata ccagatgtga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 60 gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg gcgcqtcagg qcattaccta tCütttagcc 120 tggtatcagc agagaccggg gaaagttcct aaactcctga tctatqatac atcctctttg 180 caatcagggg tcccatctcg gttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcagcctga agatqttgca acttattact gtcaaaggtt taacagtgcc 300 ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaac qaactgtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 4BO caatcgggta actcccagga qaqtqtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcaqcaqca ccctgacgct gagcaaagca g~ctacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 qaaqtcaccc atcagggcct gagct 625
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10 <212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 22 Leu Pro Asp Thr Arg cys ASp lLe Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile "Thr Cys Arg Ala Arg 20 25 30 Gln Gly 1le Thr Tyr His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys 35 40 45 Val Pro Lys Leu Leu Ile Iyr Asp íhr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Le'.l Gln Pro GlU ASp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg 85 90 95 Phe Asn Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe 11e Phe Pro Pro Ser ASP 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln ASp Ser Lys ASp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205
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<212>ADN
<213> Horno sapiens
<400> 23 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctqqatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atgtcatatg atggaagtaa aaaattctat 180 acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaga.a cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatggg 300 9gtgactatg tccgctacca ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccct.ggcgcc ctgct.ccagg 420 agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc a 571
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<400> 24 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Met Ser Tyr Asp G1y Ser Lys Lys Phe Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phc Thr Ile Ser Arg ASp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 BO Leu G1n Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Asp Tyr Val Arg Tyr His Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe PrO Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys LeU val Lys ASp Iyr !?he Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Aso Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175
!?he Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 1B5 190
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<212>ADN
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<400> 25
ctcctgggac tcctgctgct ctggctccca gataccagat gtgacatcca gatqacccag 60
tctccatcca ccctgtctgc atctatagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcgagt 120
cagggcatta gctattattt agcctggtat cagcagaaac cggggaaaat tcctaagctc 180
ctgatctatg atacatcctc tttgcaatca ggggtcccat ctcgattcag tggcagtaga 240
tctgggacag atctctctct caccatcagc agcctgcagc ctgaagatgt tgcaacttat 300
tactqtcaaa ggtatgacag tgccccgctc actttcggcg gagggaccaa ggtggagatc 360
aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 420
tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 480
cagtggaagg t9gataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 540
gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcacCctga cgctgagcaa agcagactac 600
gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctqagctc gcccgtcaca 660
aaqagcttca acagggga 678
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Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Arg Cys Asp Ile
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Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Tyr lyr Leu Ala
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65 70 75 SO
Ser Gly Thr Asp Leu Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln PrO Glu ASp
S5 90 95
Val Ala Thr lyr Tyr Cys Gln Arg Tyr ASp Ser Ala Pro Leu Thr Phe
100 105 !lO
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 1le Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
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Val Phe I1e Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Le\] Lys Ser Gly Thr Ala
130 135 140
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe lyr Pro Arg Glu Ala Lys val
145 150 155 160
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
165 no 175
Val Thr GlU Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
180 185 190
Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
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tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagaaa taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattgg 300 ggagctacta tggcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttcagcc 360
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac 410
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<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 28 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 S 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val He Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Trp Gly Ala Thr Met Ala Phe ASp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 5 130 135
<210> 29
<211> 646
<212> ADN
<213> Horno sapiens
10 <400> 29
ctcctcaccc tcctcactca ctgtgcaggg t.cctgggccc aqtctgtgct'gactcaqcca 60
ccctcaqcgt ctaagacccc cgggcagagg gtcaccatct cttgttctgg aagcagctcc 120
aacatcggaa gtaatactgt caactggtac caacagctcc caggaacggc ccccaaactc 180
ctcatctttg gtaataatca gcggccctca ggggtccctg accgattctc tggctccaag 240
tctqgcacct cagcctccct qgccatcagt ggtctccagt ctgaggatga ggctgattat 300
tactgtgcaq catgggatga cagcctgaat tatgtcttcg gaactqggac caaggtcacc 360
gtcctaggtc aqcccaaggc caaccccact gtcactctgt tcccgccctc ctctqagqaq 420
ctccaagcca acaaggccac actagtgtgt ctgatcagtg acttctaccc gggagctgtg 480
acagtggcct ggaaggcaga tggcagcccc gtcaaggcgg gagtggagac caccaaaccc 540
tccaaacaga gcaacaacaa gtacgcggcc agcagctacc tgagcctgac gcccgagcag 600
tggaagtccc acagaagcta caqctgccag gtcacqcatg aaqgaq 646
<210> 30
<211>215
<212>PRT
15 <213> Horno sapiens
<400> 30 Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly Ser Trp Ala G1n Ser Val 1 5 10 15 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Lys Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 20 25 30 Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn 11e Gly Ser Asn Thr Val Asn 35 40 45
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe Gly
50 55 60 Aso Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 65 70 75 80 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp
85 90 95 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Tyr Val 100 105 110 Phe Gly !hr Gly Thr LY5 Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Ly3 Ala Aso 115 120 125 Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
130 135 140 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lle Ser ASp Phe Tyr PrO Gly Ala Val 145 150 155 160 Thr Val Ala Trp Lys Ala ASp Gly Ser Pro Val Ly5 Ala Gly Val Glu
165 170 175 Thr Thr Ly5 Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 180 185 190 Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser 195 200 205 Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215
<210>31
<211>416
<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
<400> 31 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 2~0 ctqcaaatga acagcctgag agccgaagac acggctgtct attactgtgc gagagatcga 300
tatagtggct acggttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctc 416
<210> 32
<211> 138
10 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 32 G1n Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 la 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys G1y Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Jle Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 6 O
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg ASp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 60 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gl~ Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 Ala Arg ASp Arg Tyr Ser Gly Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 ASp Val !rp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Ly5 Gly PrO Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
130 135
15 <210>33
<211> 651
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 33 ggtgccagat gtgacatcca gatgacccag tctccatcct cactgtctgc atctgtagga 60 gacagagtca ccatcacttg tcgggcgagt caggacatta gcaattattt agcctggttt 120 cagcagaaac cagggaaagc ccctaagtcc ctgatctatg ctgcatccag tttgcacagt 180 ggggtcccat caaagttcag cggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc 240 agcctgcagc ctgaagattt tgcaacttat tactgccaac agtatactat ttacccattc 300 actttcggcc cLgggaccaa agtggatatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccqtcaca aagagcttca acaggggaga 9 651
<210> 34
<211> 217
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 34 Gly Ala Arg Cys ASp Ile Gln Met Thr Gln Sor Pro Ser Ser L~u Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly ASp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln ASp 20 25 30 lle Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Ser Leu 11e Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 00 55 60 Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ihr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp ?he Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr 85 90 95 11e Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly !hr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val ASp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu Lys 180 185 190 Bis Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 210 215
<210>35
<211> 532
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 35
caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctqcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgaact ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agggtattac 300 tatggttcgg agagtccata cggtatggac gtctggggcc aaggqaccac ggtcaccgtc 360 tcctcagcct ccaccaagqg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc tg 532
<210> 36
<211> 177
<212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly G1y Ser !le Ser Ser Tyr20 25 30 Tyr Trp Ser Irp Ile Arg Gln Pro Pro Gly LyS Gly Leu Glu Trp 11e 35 10 45 Gly Tyr !le Iyr Iyr Ser G1y Ser Ihr Asn Tyr Aso Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr !le Ser Val Asp Thr Ser Lys Aso Glo Phe Ser Leu 65 70 ";, 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Iyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser G1u Ser Pro Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Ly" Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Aso Ser Gly Ala Leu Thr Ser G1y Val His Ihr Phe Pro
165 170 175 Ala
<210>37
<211>649
10 <212> DNA
<213> Horno sapieos
<400> 37 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcr.cgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gacacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacac ctcctgatct atttgggttc taatcgggac 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtqg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaqctct acaaattccg 300 tgcagttttg gccaggggac caagctggag atcaaacgaa ctgtggctqc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc aqggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagqg 649
<210> 38
<211>216
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 38 Asp Ile Val Met Thr Can Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser 11e Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly His Asn Tyr Leu ASp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro His Leu Leu 11e Ty'r Leu Gly Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 11e 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu ASp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln 11e Pro Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Ly. Leu Glu 11e Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala PrO Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser ASp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Ly. Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys ASp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr G1u 180 185 190 Lys Hi. Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hls Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205
Pro Val 'fhr Lys Ser Phe Asn Arg 210 215
<210> 39
<211>524
5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 39 caggtgcagc tggtggagtt tgggggaqgc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcaga agctatggca tgcactgggt ccgccag9c t 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat lBO gcagactccg tgaagggccg atccaccatc tccagagaca actccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agcc9aggac acggctqtgt attactgtgc gagagatggg 300 gtagcagtgg ctggtacaqa ctactttgac tactggggcc agggaaccct gqtcaccgtc 360 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaqgcgc cctgaccagc ggcgtgcaca cctt 524
<210> 40
10 <211> 174
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Glu Phe Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ly3 Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr 11e Ser Arg Asp Asn ser Ly5 Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val ryr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Val Ala Val Ala Gly Thr Asp ryr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly GIO Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala ser Thr Lys Gly Pro H5 120 125 Ser Val Phe ~ro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170
<210> 41
<211>639
<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
<400> 41 tctggctccg aggtgccaga tgtgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg 60 catctgtagg agacagagtc accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcagccatt 120 t.aaattggta tcagcagaaa ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gttgcatcca 180 gtttgcaaag tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc 240 tcaccatcag cagtctgcaa cctgaaqatt ttgcaactta ctactgtcaa cagagttaca 300 gtaccccgct cattttcggc ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac 360 catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg 420 tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg 480 ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacaqcacct 540 acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg 600 cctgcqaaqt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtca 639
<210> 42
<211> 212
10 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 42 Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys ASp 1le Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ASp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25 30 Ser Gln Ser Ile Ser Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu 1le Iyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly 50 55 60 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Thr ¡le Ser Ser Leu Gln Pro Glu ASp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 85 90 95 Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 11e Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
115 120 125 ASp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser val Val Cys Leu Leu Asn
130 135 140 Asn Phe !yr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys val Asp Asn Ala 145 150 155 160 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser val !hr Glu Gln Asp Ser Lys
165 170 175 ASp Ser !hr !yr Ser Leu Ser Ser Thr Leu ¡he Leu Ser Lys Ala ASp 180 185 190 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Val 210
<210> 43
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<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
<400> 43 gaggtgc.agc tgttggagtc tgggggagqc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctacatt cacctttaqc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct tttagtggtc gtggtggtag cacatactac 1BO gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagaaaga acacgctgtt tctgcaaatg 240 aacagcctga gagccqaqqa cacqqccqta tattactgtg cgaaagatag cagtggcccc 300 ctgctgggct acggtatqga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcagcc 360
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctggggqc 420 acaqcggccc tgqgctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgt 478
<210> 44
<211> 162
10 <212>PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44 Glu Val Gln Leu Len Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Phe Ser Gly Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr 11e Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 15 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Ser Gly Pro LCU Lcu Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Letl Gly Cys Lell Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160 Val Ser
<210> 45
15 <211>620
<212>ADN
<213> Horno sapiens
<400> 45
tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60 acctgctctg gagataaaqt qgqqgataaa tatgcttgtt ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtcccctg tact9gtcat ctatcaagat agcaagc9gc cctcB99gat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaattctgg aaacacaqcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgag9ct9 actattactg tcaggcgt99 gacagcagca cttatgtggt attcggcgga 300 gggaccaaac tgaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg 360 ccctcctctg aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc 420 tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480 gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg c99ccagcag ctatctgagc 540 ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg 600 agcaccgtgg aqaaqacagt 620
<210> 46
<211> 206
<212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<400> 46 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser ¡le Thr Cys Ser Gly Asp Lys Val Gly ASp Lys Tyr Ala 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lle Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Tyr Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala lUO 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 115 120 125 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 130 1]" 140 Val Thr Val Ala Trp Lys Ala ASp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 145 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr 180 185 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 195 200 205
<210> 47
<211>417
10 <212> ADN
<213> Horno sapiens
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ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcga 300
tatagtggct acgattacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcc 417
15 <210> 48
<211>139
<212>PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arq 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser CyS Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg ehe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Iyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 9; Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Gly Tyr Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pco Ser: Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135
<210> 49
<211>640
5 <212>ADN
<213> Horno sapiens
<400> 49 ctctgtttcc cagqtgccag atgtgacatc cagatgaccr: agtctccatc ctcactgtct 60 gcatctgtgg gagacagagt caccatcact tgtcgggcga gtcaggtcat ttacaattat 120 ttagcctggt ttcagcagaa accagggaaa qcccctaagt ccctgatcta tqgtgcatcc 180 agtttgcaca gtggggtccc atcaaagttc agcggcagtg gatctgggac agaattcact 240 ctcaccatca gcagcctgca gcctgaagat tttgcaactt attactgcca acaatatact 300 atttaccctt tctctttcgg ccctgqgacc aaagtggata tcaaacgaac tgtggctgca 360 ccatctgtct tCi3.tcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt 420 gtgtgcctqc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tac3glggaa ggtqgataac 480 gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc 540 tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac 600 gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca 640
<210> 50
10 <211> 213
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50 Leu Cys Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser ~ro 1 5 la 15 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 20 25 30 !\la Ser Gln Val Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys ~ro 35 40 45 Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu 11e Tyr Gly Ala Ser Ser Leu His Ser
50 55 60 Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 65 70 75 SO Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 9 O 95 Gln Gln Tyr Thr Ile Tyr Pro Phe Ser Pha Gly PrO Gly Thr Lys Val 100 105 11 O
ASp l1e Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 165 170 175 Lys Asp Ser Thr Iyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 190 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Iyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro Val 210
<210> 51
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<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
<400> 51 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggccgtt atatggtatg atggaagaaa taaatattat 180 gtagactccg tgaagqqccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa tacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtqt attactgtgc gagagatcgg 300 tatagtggct ccgattacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcaqCctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc 410
<210> 52
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10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr ASp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Val ASp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr I1e Ser Arg ASp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg ASp Arg Tyr Ser G1y Ser Asp Tyr Iyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 lOó 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 130 135
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<212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 53 tgctctgttt cccaggtgcc agatgtgaca ttcagatgac ccagtctcca tcctcactgt 60 ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggc atttacaatt 120 atttagcctg gtttcagcag aaaccaggga aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat 180 ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaagt tcagcggcag tggatctggg acagttttca 240 ctctcaccat cagcagcctg cagcctgaag attttgcaac ttattactgc caacagtata 300 ctgtttaccc attcactttc ggccctggga ccaaagtgga tttcaaacga actgtggctg 360 caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg 420 ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata 480 acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca 540
cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct 600 acgcctgcga agtcacccat caggqcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacagg 659
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<212> PRT
<213> Horno sapiens
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Leu Ser Ser Pro Val Thr Ly5 Ser Phe Asn Arg 210 215
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<212> ADN
<213> Horno sapiens
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caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacq gccgtgtatt tatggtgcgg ggagttacgg tatggacgtc tggggccaag tCilgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac
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<212>PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 56 Gln val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 1 5 lO Thr Leu ser Leu Thr Cys Ihr Val Ser Gly20 25 Iyr Trp Ser Irp !le Arg Gln Pro Pro Gly35 40 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn
50 55 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser 65 70 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
85 90 Arg Gly Tyr Tyr Iyr Gly Ala Gly Ser TyrIDO 105 Gln Gly Thr Ihr Val Ihr Val Ser Ser Ala 115 120 Val Phe Pro Leu Ala Pro 130
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<213> Horno sapiens
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gtactggatt caactatttg gattggtacc tgcagaagcc tgatctattt gggttctatt cgggcctccg gggtCcctga caggcacaga ttttacactg aaaatcagca gagtggagac actgcatgca aactctacaa actcccatca ccttcggcca aacgaactgt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg agagcttcaa cagggga
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<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 58
cttcggagac cctgtccctc 60 ggagctggat ccggcagccc 120 gtgggagcac caactacaac 180 ccaagaacca gttctccctg 240 actgtgcgag aggctattac 300 ggaccacggt caccgtctcc 360 ce 402
Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 Gly Ser Ile Ser Ser Iyr 30 Lys Gly Leu Glu Trp !le 45 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 60
Lys Asn Gln Phe Ser Leu
75 80
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 95 Gly Met Asp Val Trp Gly 110 Ser Thr Lys Gly Pro Ser 125
tcagtctcca ctctccctgc 60 tagtcagagc ctcctgcata 120 agggcagtct ccacagctcc IBO caggttcagt ggcagtggtt 240 tgaggatgtt ggggtttatt 300 agggacacga ctggagatta 360 atctgatgag cagttgaaat 420 tcccagagag gccaaagtac 480 ggagagtgtc acagagcagg 540 gctgagcaaa gcagactacg 600 cctgagctcg cccgtcacaa 660
Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp Ile val Met Ihr Gln Ser Pro
1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser IIe Ser Cys Arg 20 25 30 Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly Phe Asn Tyr Leu Asp Trp 35 40 45 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly 50 55 60 Ser Ile Arg Ala Ser Gly Val Pro ASp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70 75 80 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Val 85 90 95 Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Arg Leu Glu 11e Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 115 120 125 Phe 11e Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 130 135 140 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 145 150 155 160 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val 165 170 175 Thr Glu Gln ASp Ser 1ys ASp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 180 185 190 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 195 200 205 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg210 215 220 Gly G1y 225
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<212>ADN
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<213> Horno sapiens
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65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ihr Ala Val Tyr Tyr eys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Gly Iyr Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 ASp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 13 O 135 140
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<212> ADN
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<400> 61 tgctctgttt cccaggtgcc agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctcactgt 60 ctgcatctgt cggagacaga gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggc atttataatt 120 atttggcctg gtttcagcag aaaccaggga aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat 180 ccagtttgca cagtggggtc ccatcaaagt tcagc9gc99 tggttctggg acagatttca 240 ctctcaccat cagcagcctg cagcctgaag attttgcaac ttattactgc caacagtata 300 ctatttaccc attcactttc ggccctggga ccaaagtgga tatcaaacga actgtggctg 360 caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg 420 ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgq aaggtggata 480 acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca 540 cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct 600 acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg 660
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<213> Horno sapiens
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<212> ADN
<213> Horno sapiens
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tatggttcgg ggtacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 5 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct 400
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<212> PRT
<213> Horno sapiens
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<212>ADN
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aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaa 656
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Thr His Gln Gly Leu Ser Ser PrO Val Thr 210 215
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<212>ADN
<213> Horno sapiens
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ccagggaagg gactggagtg gattggattt atctattaca ctgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgaa cacgtattac 300 tatggttcgg ggtacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaa 407
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1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser G1y Gly Ser l1e Ser Ser Tyr
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145 150 155 160 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 165 170 175 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu G1n Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys195 200 205 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Asn Arg 225
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<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
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<213> Horno sapiens
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<212> ADN
<213> Horno sapiens
tatttggatt ggtacctgca gaagccaggg cagtctccac agctcctqat ctatttqgqt 180 tctaatcggg cctccggggt ccctgacagg ttcagtggca gtggatcagg cacagatttt 240 acactgaaga tcagcagagt ggaggctgag gatgttgggg tttgttactg catgcaagct 300 ctacaaactc ccalcacctt cggccaa999 acacqactgg agattaaacg aactgtggct 360 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatclgg aactgcctct 420 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaag9tggat 480 aacgccctcc aatcgggtao ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 540 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 600 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcqcccg tcacaaa 647
<210> 74
<211>215
<212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<400> 74 Gly Ser Ser Gly Asp Jle val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 1 5 10 15 val lhr Pro Gly Glu Pro Ala Ser 1le Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 20 25 30 Leu Leu His Ser Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu ASp Trp Tyr Leu Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu 1le Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala 50 55 60 Ser Gly Val Pro ASp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe 65 70 75 80 Thr Leu Lys 11e Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Cys Tyr 85 90 95 Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg 100 105 110 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 115 120 125 Pro Ser ASp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 7hr Ala Ser val val Cys Leu 130 135 140 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val ASp 145 150 155 160 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
165 170 175 Ser Lys Asp Ser Thr 7yr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
180 185 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 195 200 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 210 215
<210> 75
<211>410 10 <212>ADN
<213> Horno sapiens
<400> 75
190 Glu Val Thr His Gln 205
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agccatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 140
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatgca 300
tatagtggct acgattacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccqtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc 410
<210> 76
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<212> PRT
15
<213> Horno sapiens
<400> 76 Gln Val Gln Leu Val Glu Se~ Gly Gly Gly Val Val Gln P~Q Gly Arq 1 5 la 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val I1e Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr 11e Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 Ala Arg ASp Ala Iyr Ser Gly Tyr ASp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 ASp Val Irp Gly Gln Gly Ihe Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 130 135
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<212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 77 ggggctcctg ctgctctgtt tcccaggtgc cagatgtgac atccagatga cccagtctcc 60 atcctcactg tctgcatctg taggagacaq agtcaccatc acttgtcggg cgagtcaggg 120 catttacact tatttagcct ggtttc~gca gaaaccaggg aaagccccta agtccctgat 180 ctatggtgca tccagtctgc aaagtggggt cccatcaaag ttcagcggca gtggatctgg 240 gacagatttc actctcacca tcaccagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg 300 ccaacagtat actatttacc cattcagttt cggccctggg accaaagtgg atatcaaacg 360 aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg 420 aactgcctct gttgtgtgcc tgcegaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg 480 gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag 540 caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 600
acacaaagtc tacgcctgcg.aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag 660 cttcaacagg g 671
<210> 78
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<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 78 Gly Leu Leu Leu Leu Cy~ Phe Pro Gly Ala Arg Cys ASp Ile Gln Met 1 5 la 15 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ASp Arg Val Thr 20 25 30 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 11e Tyr Thr Tyr Leu Ala Trp Phe 35 40 45 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu 11e Tyr Gly Ala Ser 5D 55 60 Ser Lcu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
65 70 75 60 Thr Asp Phe Thr Leu Thr 11e Thr Ser Leu Gln PrO Glu Asp Phe Ala
85 90 95 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln ryr Ihr 11e Tyr Pro Phe Ser Phé Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Lys Val Asp lle Lys Arg ¡hr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 Ile Phe Pro PrO Ser ASp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Iyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 145 150 155 160 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Ihr Leu Thr 180 185 190 Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu LY8 His LY5 Val Tyr Ala Cys Glu Val 195 200 205 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Ihr Lys Ser Phe Asn Arg 210 215 220
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<212>ADN
<213> Horno sapiens
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acaatggtca ccgtgtcttc agcctcci3CC aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 420 tcct 42'4
<210> 80
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly L~u Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp 11e Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val ASp Thr Ser Lys Asn Gln Phc 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Tht" Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Iyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Ser Gly Tyr Cys Thr Asn Val Ala Cys Phe Pro ASp 100 lOS 110 Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Ihr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135 140
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
15
<400> 81 ctcctggggc tgctaatgct ctgggtctct ggatccagtg gggatgttgt gatgactcag 60 tctccattct ccctgcccgt cacccctgga gagccggcct ccatctcctg caggtctagt 120 cagagcctcc tgcatagtaa tggattcaac tttttggatt ggtacctgca gaagccaggg 180 cagtctccac agctcctgat ctatttgggt tctattcggg cctccggggt ccctgacagg 240 ttcagtggca gtggatcagg cacagatttt acactgaaaa tcagcagagt ggaggctgag 300 gatgttggag tttattactg catgcaagct ctacaaactc cactcacttt cggcggcggg 360 accagggtgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 460 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcucag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaa 677
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5 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 82 Leu Leu Gly Leu Leu Met. Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser G1y ASp Val 1 5 10 15 Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Pro Val Thr PrO Gly Glu Pro 20 25 30 Ala Ser 11e Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly 35 40 45 Phe Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Leu G1n Lys Pro G1y Gln Ser Pro Gln 50 55 60 Leu Leu 11e Tyr Leu Gly Ser Ile Arg Ala Ser Gly Val Pro ASp Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser G1y Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 11e Ser Arg 85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln 100 105 llO Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val G1u 11e Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser G1y 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr G1u Gln ASp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 160 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu Lys Hls 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln G1y Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220
Thr 225
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<212> ADN
<213> Horno sapiens
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tatggttcgg ggagttacgg cllggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctcca 409
<210> 84
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<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 84 Gln val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser tp.1J Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro PrO G1y Lys Gly Leu Glu Trp !le 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arq Val Thr !le Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser: Val. Inr lila Ala IISp Ihr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arq Gly Iyr Tyr Tyr G1y Ser G1y Ser Iyr Gly Leu Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ihr Ihr Val Thr Val Ser Ser lila Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135
<210> 85
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<212>ADN
10 <213> Horno sapiens
<400> 85 agctcctgqg gctgctaatg ctctgggtct ctggatccag tqgggatatt gtgatgactc 60 agtctccact ctccctgccc gtcacccctg gagagccggc ctccatctcc tgcaggtcta 120 gtcagagcct cctgcatagt actggataca actatttgga ttggtacctg cagaagccag lBO ggcagtctcc <.1caactc ctg atctatttgg gttctattcg ggcctccggg gtccctgaca 240 ggttcagtgg cagtggatca ggcacagatt ttacactgaa aatcagcaga gtggaggctg 300 aggatgttgg ggtttattac tgcatgcaag ctctacagac tcccatcacc ttcggccaag 360 ggacacgact ggagattaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat 420 ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttqtgtg cctgctgaat aacttctatc 480 ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg 540 agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc 600 tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc 660 tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggg 693
<210> 86
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15 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp Ile
\ 5 la 15 Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro 20 25 30 Ala Ser 11e Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser ~ro Gln 50 55 60 Leu Leu 11e Tyr Leu Gly Ser Ile Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln 100 105 110 Thr Pro 11e Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg l.eu Glu I1e Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe l1e Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val ASp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Ly5 Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ly5 Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Ihr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg 225 230
<210> 87
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<212> ADN
s <213> Horno sapiens
<400> 87 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg Lctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgaa cacgtattac 300 tatqgttcgg ggtacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 gcctcc 366
<210> 88
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10 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 88 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ihr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr lle Iyr Iyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Ihr Ile Ser Val ASp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 89 tctggatcca gtggggatat tgtgatgact cagtctccac tctccctgcc cgtcacccct 60 ggagagccgg cetecatete ctgcaggtct agtcagagcc tcctgcatag tactggacac 120 aactatttgg attggtacct gcagaagcca gggcagtctc cacagctcct gatctatttg 180 ggttctattc gggcctccgg ggtccctgac aggttcagtg gcagtggatc aggcacagat 240 tttacactga aaatcagcag agtggaggct gaggatgttg gggtttatta ctgcatgcaa 300 gctctacaaa ctatcacctt cggccaaggg acacgactgg agattaaacg aactgtggct 360 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 420 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 480 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 540 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 600
tacqcctqcq aagtcaccca tcaqqqcctq agctcqcCcq tcacaaaqag cttcaacagg 660 g 661
<210> 90
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<212>PRT
<213> Horno sapiens
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Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser 11e Ser Cys Arg Ser Ser Gln 20 25 30
Ser Leu Leu His Ser Thr Gly His Asn Tyr Leu ASp Trp Iyr Leu G10 35 40 45 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu 11e Tyr Leu Gly Ser tle Arg
50 55 60 Ala Ser G1y Val Pro Asp Arg Phc Ser Gly Ser Gly Ser G1y Thr Asp 65 70 75 80 Phe Thr Leu Lys 11e Ser Arg Val G1u Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
85 90 95 Tyr Cys Met Gln Ala Leu G10 Thr l1e Ihr Phe Gly Glo Gly Thr Arg 100 100 110 Leu Glu t1e Lys Arg Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe 11e Phe Pro 115 120 125 Pro Ser ASp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
130 135 140 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg G1u Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 145 150 155 160 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Glo ASp
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15
<212>ADN
<213> Hamo sapiens
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caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt tatggttcgg ggagttacgg tatggacgtc tggggccaag tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac
5 <210> 92
<211> 136
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 92 Gln Val G1n Leu Gln Glu Ser G1y Pro G1y 1 5 10 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser G1y 20 25 Tyr Trp Ser Trp 11e Arg Gln Pro Pro Gly 35 40 Gly Tyr 11e Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn 50 55 Ser Arg Val Thr 11e Ser Val Asp Thr Ser 65 70 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 85 90 Arg Gly Tyr Tyr Tyr G1y Ser Gly Ser Tyr 100 105 G1n Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 10 13 O 135
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<212> ADN
<213> Horno sapiens
15 <400> 93
gctcctgggg ctgctaatgc tctgggtctc tggatccagt gtctccactc tccctgcccg tcacccctgg agagccggcc tcagagcctc ctgcatagta ctggatacaa ctatttggat gcagtctcca cagctcctca tctatttggg ttctattcgg gttcagtggc agtggatcag gcacagattt tacactgaaa ggatgttgga atttattact gcatgcaagc tctacaaact gacacgactg gagattaaac gaactgtggc tgcaccatct tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc cagagaggcc aaagtacagt gg.aggtgg. taacqccctc gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag ggga
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<212> PRT
20 <213> Horno sapiens
cttcggagac cctgtccctc 60 ggagctggat ccg9cagccc 120 gtgggagcac caactacaaa 1BO ccaagaacca gttctccctg 240 actgtgcgag aggctattac 300 ggaccacqgt caccgtctcc 360 cctcctcca 409
Leu Val Lys Pro Ser G1u 15 Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 30 Lys Gly Leu Glu Trp 11e 45 Tyr Lys Pro Ser Leu Lys 60 Lys Asn Gln Phe Ser Leu 75 80 Ala Val Tvr TVr Cvs lila 95 G1y Met ASp Val Trp Gly 110 Ser Thr Lys Gly Pro Ser 125
ggggatattg tgatgactca 60 tccatctcct gcaggtctag 120 tggtacctgc agaagccagg 180 gcctccgggg tccctgacag 240 atcagcagag tggaggctga 300 cccatcacct tcggccaagg 360 gtcttcatct tcccgccatc 420 ctgctgaata acttctatcc 480 caatcqggta actcccagga 540 ctcagcagca ccctgacgct 600 gaagtcaccc at.cagggcct 660 694
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 225 230
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5 <212>ADN
<213> Homo sapiens
<400> 95 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctqtgcaq cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttggtatg atggaagtaa taaatactat 1BO acagactccq tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gcgagatcgg 300
tatagtggct acgattactt ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcqgtct tccccctggc accct 415
<210> 96
10 <211>138
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 96 G1n Val Gln t~eu Val Glu Ser Gly G1y Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 la 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val 11e Trp Tyr ASp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr 11e Ser Arg ASp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Sér Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Gly Tyr ASp Tyr Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 ASp Val Trp Gly Gln Gly Thr rhr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135
<210> 97
<211>636
<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
<400> 97 tgtttcccag gtgccagatg tqacatccag atgacccagt ctccatcctc actgtctgca 60 tctgtaggag acagagtcac catcacttgt cgggcgagtc agggcattta caattattta 120 gcctggtttc agcagaaacc cgggaaagcc cctaggtccc tgatctatgc tgcatccagt 180 ttgcacagtg gggtcccatc taagttcagc ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 240 accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacttatt actgccaaca atatactatt 300 tacccattca ctttcggccc tgggaccaaa gtggatatca aacgaactgt ggctgcacca 360 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 420 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 4BO ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg 4c3gcaagga cagcacctac 540
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 600 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtc 636
<210> 98
<211>212
10 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 98 Cys Phe Pro Gly Ala Arg Cys ASp rle Gln Met Thr Gln Ser PrO Ser 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ASp Arg Val Thr 11e Thr Cys Arg Ala 20 25 30 Ser Gln Gly l1e Tyr Asn Tyr Leu Ala Irp Phe Glo Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Arg Ser Leu 11e Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly 50 55 60 Val PrO Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ihr ASp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Thr rle Ser Ser Leu Glo Pro G1u ASp Phe Ala !hr Tyr Tyr Cys Gln 85 90 95 Gln Tyr Ihr 11e Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val ASp 100 105 110 I1e Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 11e Phe Pro Pro Ser 115 120 125 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 13 O 135 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val ASp Aso Ala 145 150 155 160
Leu Gln Ser Gly Asn Seo Gln Glu Ser Val 165 170 Asp Ser Thr Tyo Ser Leu Ser Ser Tho Leu
180 185 TF Glu Lys His Lys Val Tyo Ala Cys Glu 195 200 Ser Seo Poo Val 210
<210> 99
<211> 399
<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
<400> 99
caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca ccctccctca agagtcgagt cacCatatca gtagacacgt aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt tatggttcgg 9gtacqgtat ggacgtctgg ggccaaggga gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccc
<210> 100
<211>133
10 <212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 100 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly !> 10 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly20 25 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Poo Pro Gly 35 40 Gly Tyr He Tyr Tyr Ser G1y Ser Thr Asn 50 55 Ser Arq Val Thr Ile Ser Val ASp Thr Ser 65 70 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 85 90 Asn Thr Tyr Tyr Tyo Gly Ser Gly Tyr Gly100 105 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120
Phe Pro Leu Ala Pro 130
<210> 101
<211> 672
<212>ADN
<213> Horno sapiens
<400> 101
ctctgggtct ctggatccaq tggggatatt gtgatgactc gtcacccctg gagagccggc ctccatctcc tgcaggtcta actggacaca actatttgga ttggtacctg cagaagccag atctatttgg gttctattcg ggcctccggg gtccctgaca ggcacagatt ttacactgaa aatcaqcaga gtggaggctg
Thr Glu Gln Asp Ser Lys 175 Tho Leu Ser Lys Ala Asp 190 Val Ihr His Gln Gly Leu 205
cttcqgagac cctgtccctc 60 ggagctggat ccggcagccc 120 gtgggagcac caactacaaC 180 ccaagaacca gttctccctg 240 actgtgcgaa cacgtattac 300 ccacggtcac cgtctcctca 360
Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 G1y Ser He Seo Ser Tyr 30 Lys Gly Leu G1u Trp He 45 Tyr AOn Pro Ser Leu Lyo
60 Lys Asn Gln Phe Ser Leu 75 80 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
95 Met Asp Val Trp Gly Gln 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val 125
agtctccact ctccctgccc 60 gtcagagcct cctgcatagt 120 ggcagtctcc acagctcctg 180 ggttcagtgg cagtggatca 240 aggatgttgg ggtttattac 300
115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu l1e Ser Asp Phe
130 l35 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Irp Lys Ala ASp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Lcu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215
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<211> 406
<212> ADN
<213> Horno sapiens
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gtagcagtgg ctggtacaga ctactttgac tactggqgcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccct 406
<210> 108
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<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 108 Gln Val Gln I.eu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Irp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala ASp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg ASp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Lcu Gln Mct Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Iyr Iyr Cys
85 90 95 Ala Arg ASp Gly Val Ala Val Ala Gly Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala PrO l30 135
<210> 109
<211>638
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 109
tgcatgcaag ctctacaaac tatcaccttc ggccaaggga cacgactgga gattaaacga 360 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 420 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaata-ac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 480 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 540 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgaqaaa 600 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 660 ttcaacaggg ga 672
<210> 102
<211> 224
<212> PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 102 Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp lle Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu PrO Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20 25 30 Ser Sor Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly His Asn Tyr Leu Asp Trp 35 40 45 Tyr Leu Gln Ly5 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu LBU 11e Tyr Leu Gly 50 55 60 Ser Ile Arg Ala Ser Gly V~l Pro Asp Arg Phe Ser Gly Se~ Gly Ser 65 70 75 80 Gly Thr ASp Phe Thr Leu Lys lle Ser Arg Val Glu Ala Glu ASp Val 85 90 95 Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr 11e Thr Phe Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Arg Leu Glu 11e Lys Arg Th~ Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 l1e Phe Pro Pro Ser ASp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 130 135 140 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 145 150 155 160 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Tar 165 170 175 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 180 185 190 Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 210 215 220
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<211>398
10 <212>ADN
<213> Horno sapiens
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agcaatggct actggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcacc 398
<210> 104
15 <211>132
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 104
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser GJy Pro Gly Leu Val T.ys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp 11e Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Arg 11e 35 40 45 Gly Arg Ile !yr Thr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 7S 80 Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Trp Tyr Phe ASp Leu Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala 130
<210> 105
<211> 584
<212> ADN
5 <213> Horno sapiens
<400> 105 tgcccagtct gtgctgacgc agccgccctc agtgtctggg gccccagggc agagggtcac 60 catctcctgc actgggagca gctccaacat cggggcaggt tatgatgtac actggtacca 120 gcagcttcca ggaacagccc ccaaactcct catctatggt aacagcaatc ggccctcagg 180 ggtccctgac cgattctctg gctccaagtc tggcacctca gcctccctgg ccatcactgg 240 gctccaggct gaggatgagg ctgattatta ctgccagtcc tatgacagca gcctgagtgg 300 tgtggtattc ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt caqcccaagg ctgccccctc 360 ggtcactctg ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg 420 tctcataagt gacttctacc cgggagccgt caacaagtac gcggccagca gctatctgag 480 cctg.cgcct g.gcagtgga agtcccacag aagctacagc tgccaggtca cgcatgaagg ,40 gagcaccgtg gagaagacag tggcccctac agaatgttca taga 584
<210> 106
<211>217
10 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 106 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr lle Ser Cys rhr Gly Ser Ser Ser Asn lle Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro ASp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lle Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
ctggctccga ggtgccagat gtgacatcca gatgacccag tctccatcct ccctgtctac 60 atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaact cagagcatta gcagccattt 120 aaattggtat cagcagaaac cagggaaaqc ccctaagctc ctgatctatg ttgcatccag 180 tttgcaaagt ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga tctg998ca9 atttcactct 240 caccatcagc agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac tactgtcaac agagttacag 300 taccccgctc actttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc 360 atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gC8gttgaaa tctggaactg cctctgttgt 420 gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc 480 cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta 540 cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc 600 ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtca 638
<210> 110
<211>212
<212> PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 110 Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 1 S 10 15 Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25 30 The Gln Ser Ile Ser Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly SO 55 60
Val PrO Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu 65 ·/0 75 80 The Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala The Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95 Gln Ser Iyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110 l1e Lys Arg Ihr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 115 120 125 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
130 135 140 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Glo Trp Lys Val Asp Asn Ala 145 150 155 160 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
16ó 170 175 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp 180 185 190 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala eys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Val 210
<210> 111
<211>411
10 <212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> III caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 accagcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120 cagctcccag ggaagggcct ggagtgggtt gggtacatcc ataacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagatctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaggg 300
tattactatg gttcggggag cccctacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc e 411
<210> 112
<211> 137
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 112 Glo Val Glo Letl Glo Glu Sp.r Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glo 1 S 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Ser Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Gly Tyr Ile Hie Aso Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Aso Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr !le Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Glo Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phc Pro Leu Ala Pro 130 135
5 <210> 113
<211> 660
<212>ADN
<213> Horno sapiens
<400> 113 qctctqggtc tctggatcca gtggggatat tgtgatgact cagtctccac tctccctgcc 60 cgtcacccct ggagagacgg cc::tccatctc ctgca99tct agtcagagcc tcctgcaaag 120 taatggacac:: aactatttgg attggtacct gcagaagcca gggcagtccc cacagctcct 180 gatctatttg ggttcttatc gggaotecgg ggtccctgac aggtt.cagtg gcagtggatc 240 aggcacggat tttaccctga aaatcagc::ag agtggaggct gaggatgttg gggtctatta 300 ctgcatgcaa gctcttcaaa c::tcctcctac tttcggcgga gggaccaagt tggagatcaa 360 acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc 420 tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca 480 gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga 540 cagcaaggac agcacctaca gcc::tcagcag cacc::ctgacg ctgagcaaag cagactac::ga 600 gaaacac::aaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcac::aaa 660
<210> 114
<211> 219
<212>PRT
<213> Horno sapiens
15 <400> 114 Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp !le Val Met Thr Glo Ser Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Thr Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20 25 30 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser Aso Gly His Asn Tyr Leu Asp Irp 35 40 45 Tyr Leu Glo Lys Pro Gly Glo Ser pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly 50 55 60 Ser Tyr Arg ASp Ser Gly Val Pro ASp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
65 70 75 80 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp val 85 90 95 Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln lhr Pro Pro Thr Phe Gly 100 105 110 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr V~l Ala Ala Pro Ser Val 115 120 125 Phe Ile Phe Pro Pro Ser ASp Glo Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 145 150 155 160 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175 Thr Glu Gln Asp Ser Lys ASP Ser Thr Iyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 180 185 190 Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu Lys His Ly5 Val Tyr Ala Cys Glu 195 200 205 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 210 215
<210> 115
<211>416
<212>ADN
<213> Horno sapiens
<400> 11 S caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agtcatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcaa 300
t_atagtggct acgatctcta ctactactac ggtatggacq tctgggqcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctc 416
<210> 116
<211> 138
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 116
Gln Val Gln Leo Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu ~rp Val 35 40 45 Ala Val 11e Trp Tyr Asp G1y Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala ASp Ser Val
50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Aeg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 BO Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr ~yr Cys
B5 90 95 Ala Arg Asp Gln Tyr Ser Gly Tyr Asp Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 ASp Val Trp Gly Gln Gly The Thr Val The Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 13 O 13 5
<210> 117
<211> 690
<212> ADN
15
<213> Horno sapiens
<400> 117 tctgttgctc tggatctctg gtgcctacgg ggacatcgtg atgacccagt ctccagactc 60 cctggctgtg tctctgggcg agagggccac catcaactgc aagtccagcc agagtgtttt 120 atacagctcc aacaataaga actacttagc ttggtaccag cagaaaccag gacagcctcc 180 taagctgctc atttactggg catctaCccg ggaatccggg gtccctgacc gattcagtgg 240 cagcgggtct gggacagatt tcactctcac catcagcagc ctgcaggctg aagatgtggc 300 agtttattac tgtcagcaat attatagtac tcctcggacg ttcggccaag ggaccaaggt 360 ggaaatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca 420 gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc 480 caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac 540 agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc 600
agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc 660 cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg 690
<210> 118
5 <211>229
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 118 Leu Leu Leu Trp 11e Ser Gly Ala Tyr Gly ASp 11e Val Met Thr Gln 1 5 10 15 Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 11e Asn 20 25 30 Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 35 40 45 Leu Ala Trp ~yr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 11e 50 55 60 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro ASp Arg Phe Ser Gly 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 85 90 95 Glu ASp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg 100 105 110 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala 115 120 125 Pro Ser Val Phe 1le Phe Pro Pro Ser ASp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 130 135 140 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 145 150 155 160 Lys Val Gln Trp Lys Val ASp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 165 170 1"15 Glu Ser Val Thr Glu Gln ASp Ser Lys ASp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 195 200 205 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 210 215 220
Phe Asn Arg Gly Glu 225
<210> 119
<211> 399
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 119
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc teggtacagc ctggggggtc cctqagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agcaatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatgctac 180
gcagactccg tgaagqgccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagccccg 300
taccagctgc tgccatacta ttttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggca 399
<210> 120
<211> 133
<212> PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 120 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala 11e Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Cys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr l1e Ser Arg ASp Asn Ser Ly5 Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala PrO Tyr Gln Leu Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala 130
<210> 121
<211> 192
10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121 Gln Val Gln Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Le~ Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Met Ser Iyr Asp Gly Ser Lys ~ys Iyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ihr 11e Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Mee Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys
85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Asp Tyr Val Arg Tyr Tyr Iyr Tyr Gly Met ASp 100 105 110 Val Irp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly eyo Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 J60 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 1B5 190
<210> 122
<211>208
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122 Leu Pro Asp Thr Arq Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lle !hr Cys Arg Ala Ar9 20 25 30 Gln Gly lIs Ihr Tyr Hís Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arq Pro Gly Lys 35 40 45 Val Pro Lys Leu Leu lle Iyr Asp Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr. 65 70 75 80 I1e Ser Ser Leu Gln Pro Glu ASp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg 85 90 95 Phe Aso Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Ihr Lys Val Glu l1e 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe 11e Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys val ASP Aso Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln ASp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu val Thr His Gln Gly Leu Ser 5 195 200 205
<210> 123
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<212> PRT
<213> Horno sapiens
10 <400> 123 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 S 10 lS Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2S 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Met Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Phe Tyr Thr ASp Ser Val
"O 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr 11e Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 Ala A<g Asp Gly Gly Asp Tyr Val Arg Tyr His Tyr Ty< G1y Met ASp100 105 110 val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg ser Thr Ser Glu
130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 110 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190
<210> 124
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<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 124 Leu Leu Gly Lcu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Arg Cys Asp 11e 1 5 10 15 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser 11e Gly Asp Arg 20 25 30 Val Thr Ile lhr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 11e Ser Tyr Tyr Leu Ala 35 40 45 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 11e Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp 50 55 60 Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg 65 70 75 80 Ser Gly Thr Asp Leu Ser Leu Thr 1le Ser Ser Leu Gln Pro Glu ASp 85 90 95 Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Thr Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu l1e Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 115 120 125 val Phe Ile Phe Pro Pro Ser ASp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 130 135 140
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 145 150 155 160 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
165 170 175 Val Thr Glu Gln ASp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 180 185 190 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 195 200 205 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
210 215 220 Arg Gly 225
5 <210> 125
<211> 136
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 125 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Len St=!r Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val
10 35 40 45 Ala val 11e Trp Tyr ASp Gly Arg Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg ~he Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met .Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg ASp Trp Gly Ala Thr Met Ala Phe Asp 110 Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135
<210> 126
<211>215
<400> 126 Leu Leu Thr Leu Leu 7hr His Cys Ala Gly Ser Trp Ala Gln Ser Val 1 5 10 15 Leu Thr Gln Pra Pra Ser Ala Ser Lys Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 20 25 30 l1e Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn IIc Gly Ser Asn Thr Val Asn 35 40 45 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe Gly 50 55 60 Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 65 }O 75 80 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 85 90 95 Glu Ala ASp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp ASp Ser Leu As n Tyr Val 100 105 110 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn 115 120 125 Pro Thr val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn 130 135 140 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser ASp Phe Tyr Pro Gly Ala Val 145 150 155 160 Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu 165 170 175 Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 180 185 190 Tyr Leu Ser Lell Thr Pro G1u G1n Trp Lys Ser His Arg Ser Tyc Ser
195 200 205 Cys Gln Val Thr His Glu Gly
210 215
<210> 127
<211> 138
5 <212>PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser G1y Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly L9U Glu 7rp Val 35 40 45 Ala Val Ile Tcp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala ASp Ser Val 50 55 60 Lys G1y Arg Phe Thr Ile Ser Arg ASp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Gly Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr G1y Met 100 105 110 ASp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125
Lys G1y Pro Ser Val Phe Pro L9U Ala Pro 130 135
10 <210> 128
<211> 217
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 128
Gly Ala Arg Cys Asp 11e Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Asp Arq Val Ihr 11e Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 20 25 30 l1e Ser Asn Tyr Leu Ala Irp Phe Gln Gln Ly5 Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Ly8 Ser Leu 11e Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly Val PrO Ser
50 55 60 Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ihr ASp Phe Ihr Leu Thr 11e Ser 6~ 10 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr
85 9 O 95 11e Tyr Pro Phe Ihr Phe Gly Pro Gly Thr LY5 Val Asp 11e Ly5 Arg 100 105 110 Ihr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 11e Phe Pro Pro Ser ASp Glu Gln 115 120 125 Leu LY5 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Irp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys ASp Ser Ihr
165 170 175 Iyr Ser Leu Ser Ser rhr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Iyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg G1y Glu 210 215
<210> 129
<211> 177
<212> PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 129 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly G1y Ser lle Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Irp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 11e 35 40 45 Gly Iyr 11e Tyr Iyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Ihr 11e Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Ihr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Iyr Cys Ala 85 90 95 Arg G1y Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Ser Pro Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys G1y Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly cys Leu Val Lys ASp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Ihr Phe Pro
165 170 175 Ala
<210> 130
10 <211>216
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 130
Asp Ile Val Met rhr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr PrO Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly His Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro His Leu Lcu Ile ryr Leu Gly Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val PrO
50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu ASp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95 Leu Gln Ile Pro Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Fhe
130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gl~ Glu Ser Val rhr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser ~hr Leu rhr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 210 215
<210> 131
<211> 174
<212> PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 131 Gln Val Gln Leu Val Glu Phe Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe ~hr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val rle Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr 119 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 1,eu G in Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Val Ala Val Ala Gly Thr Asp ~yr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe ~ro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170
<210> 132
<211>212
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 132
Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys ~sp Ile Gln Met rhr Gln Ser Pro Ser 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp ~rg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25 30 Ser Gln Ser l1e Ser Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Lys ~la Pro Lys Leu Leu 11e Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly
50 55 6 O Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Thr l1e Ser Ser Leu Gln Pro Glu ~sp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95 Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu"Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110 118 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 11e Phe Pro Pro Ser 115 120 125 ASp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Aso
130 135 140 ASO Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val ASp Asn Ala 145 150 155 160 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln ASp Ser Lys
165 170 175 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala AsplBO 185 190 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Val
<210> 133
<211> 162
5 <212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 133 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glo Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Phe Thr Phe Ser Ser. Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Phe Ser Gly Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser AIg Asp Asn Ser Lys Aso Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Aso Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys B5 90 95 Ala Lys ASp Ser Ser Gly Pro Leu Leu Gly Tyr Gly Met ASp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser LyS Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys ASp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160 Val Ser
<210> 134
10 <211>206
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 134
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Val Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val lle Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly 11e Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr 11e Ser Gly Tnr Gln Ala Met Ó 5 70 75 80 ASp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Tyr Val
85 90 95 Val Phe G1y Gly Gly Tnr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 115 120 125 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 11e Ser ASp ?he Tyr Pro Gly Ala
130 135 140 Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 145 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
165 170 175
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr 180 185 190 Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 195 200 205
<210> 135
<211> 139
5 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 135 Gln Val Gln l,eu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser eys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp 'Iyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Iyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Aso Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg !yr Ser Gly !yr ASp Tyr Tyr Tyr Iyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135
<210> 136
10 <211>213
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 136
Leu Cys Phe Pro GIy Ala Arg Cys ASp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ASp Arg Val Thr Ile Thr CyS Arg 20 25 30 Ala Ser Gln Val Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro 35 40 45 Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu I1e Tyr Gly Ala Ser Ser Leu His Ser
50 55 60 Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 65 "lO 75 80 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln PrO Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95 Gln Gln Tyr Thr Ile Tyr Pro Phe Ser Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 100 105 110 Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val val Cys Leu Leu
130 135 140 Asn Asn Phe Iyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val ASp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
165 170 175 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ihr Leu Ser Lys Ala 180 185 190 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro Val 210
<210> 137
<211> 136
5 <212>PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ihr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Irp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val 11e Irp Tyr ASp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val ryr ryr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Gly Ser Asp Tyr Iyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Ihr Thr val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ihr 115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 130 135
<210> 138
<211> 219
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 138
Leu Cys Phe Pro Gly Ala Arg Cys ASp 1le Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ar9 Val Thr l1e Thr Cys Arg 20 25 30 Ala Ser Gln Gly lle Tyr Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro 35 40 45 Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu 11e Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
50 55 60 Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr 65 70 75 80 Leu Thr l1e Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95 Gln Gln Iyr Ihr Val Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 100 105 110 ASp Phe Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe lle Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val eys Leu Leu
130 135 140 Asn Asn Phe Iyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln ASp Ser
165 170 175 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 190 ASp Tyr Glu Lys His Lys Val Iyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro val Thr Lys Ser Pne Asn Arg 210 215
<210> 139
<211> 134
5 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 139 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val LyS Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Ihr eys Thr Val Ser Gly Gly Ser 11e Ser Ser Tyr 20 25 30 Iyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Iyr lle Tyr Tyr Ser Gly Ser Ihr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg val Thr Ile Ser val ASp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Iyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Iyr Tyr Gly Ala Gly Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 llO Gln Gly Thr Thr Val Thr val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro
<210>140
10 <211>225
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 140
Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp I1e Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser 11e Ser Cys Arg 20 25 30 Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly Phe Asn Iyr Leu Asp Trp 35 40 45 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu 11e Tyr Leu Gly
50 55 6 O Ser Ile Arg Ala Ser G1y Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70 75 SO Gly Thr ASp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Thr Glu ASp Val
S5 90 95 Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr Leu Gln Thr Pro 11e Thr Phe Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Arg Leu Glu I1e Lys Arg Thr Val Ala Ala Pt"Q Ser Val 115 120 125 Phe 11e Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140 Va] Val Cys Leu Leu Asn Aso Phe Tyt" Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 145 150 155 160 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175 Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 180 lS5 190 Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 195 200 205 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220 Gly 225
<210> 141
<211> 140
5 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 141 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly G1y Gly Val val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Hls Trp Val Arg G1n Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr ASp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Plle Thr 11e Ser Arg ASp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 SO Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr eya SS 90 95 Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Gly Tyr ASp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr G1y Met 100 105 110 ASp Val Trp Gly Gln G1y Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135 140
<210> 142
10 <211>219
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 142
Leu Cys Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp I1e Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ASp Arg Val Thr 11e Thr Cys Arg 20 25 30 Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala !rp Phe Gln Gln Lys Pro 35 40 45 Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu 11e Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser
50 55 60 Gly val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr 65 70 75 80 Leu Thr 11e Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95 GIn Gln 'Iyr Thr· Ile Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 100 105 11 O ASp I1e Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 7rp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
165 1"10 175 Lys ASp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ISO 185 190 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 210 215
<210> 143
<211> 133
5 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 143 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser 11e Ser Ser Tyr 2 O 25 JO Tyr Trp Ser Trp 11e Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr 11e Ser Val ASp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Thr Tyr 1yr Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly PrO Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro 130
<210> 144
10 <211>218
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 144
Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly ASp 11e Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser 11e Ser Cys Arg 20 25 30 Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly His Asn Tyr Leu ASp Trp 35 40 45 Tyr Leu Gln LyS Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu 11e Iyr Leu Gly
50 55 60 Ser lle Arg Ala Ser Gly Val Pro ASp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70 75 80 Gly Thr ASp Phe Thr Leu Lys l1e Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val
85 90 95 Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Arg Leu Glu 11e Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140 Val Cys Leu Leu Asn ASn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Ly5 Val Gln Trp 145 150 155 160 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val 'Ihr
165 170 175 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 180 185 190 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val !yr Ala Cys Glu Val 195 200 205 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 210 215
<210> 145
<211> 135
5 <212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 145 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 la 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr !rp Ser Trp Ile Arg Gln ~ro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly ?he Ile Tyr Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser 'Arg Val Thr 1 le Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln ?he Ser Leu 65 70 75 80 LyS Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr !yr Cys Ala 85 90 95 Asn Thr Tyr Iyr Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Met ASp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135
<210> 146
10 <211> 229
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 146
Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp 11e 1 5 10 15 val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro 20 25 30 Ala Ser rle Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly 35 40 45 Phe Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln
50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Arg Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phc Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu 1,Y5 lle Ser Arg
85 90 95 Val Glu Ala Glu ASp val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Glu 100 105 110 Thr lle Thr Phe Gly Gln Gly The Arg Leu Glu lle Lys Arg Thr Val 115 120 125 Ala Ala Pro Ser Val Phe lle Phe Pro Pro Ser ASp Glu Gln Leu Lys
130 135 140 Ser Gly !hr Ala Ser val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160 Glu ~a Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Se~ Gly Asn
165 170 175 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp $ec Lys Asp Ser Thr Iyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Ihr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Iyr Glu Lys His Lys 195 200 205 Val Tyr Ala Cys Glu Val Ihc His Gln Gly Leu Ser Ser P~o Val Th~
210 215 220 Lys Ser Phe Asn Arg 225
<210> 147
<211> 136
5 <212> PRT
<2 J3> Horno sapiens
<400> 147 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Ihr Leu Ser Leu Ihc Cys Ihr Val Ser Gly Gly Ser lle Ser Ser Iyr 20 25 30 Tyr Irp Ser Trp !le Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Irp lle 35 40 45 Gly Iyr ¡le Iyr Tyr Ser Gly Ser Ihr Asn Iyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Ihr Ile Ser Val Asp Ihr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Ihr Ala Ala Asp Ihr Ala Val Iyr Iyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Tyr Iyr Gly Ser Gly Ser Tyr Gly t1et Asp val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ihr Thr Val Ihr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro I.eu Ala Pro Ser Ser 130 135
<210> 148
10 <211> 215
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 148
Gly Ser Ser Gly Asp Tle VnJ Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 1 5 10 15 Val Ihr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 20 25 30 Leu Leu His Ser Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lle Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala
50 55 60 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 BO Thr Leu Lys lle Ser Arg val Glu Ala Glu ASp val Gly val Cys ryr
85 90 95 Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg 100 105 110 Leu Glu Ile Lys Arg Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 115 120 125 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser val Val cys Leu
130 135 140 Leu Asn Asn Phe lyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 145 150 155 160 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Aso Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln ASp
165 170 175 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 180 185 190 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Glo 195 200 205 Gly Leu Ser Ser Pro Val !hr 210 215
<210> 149
<211> 136
5 <212>PRT
<213> Homo sapiens
<400> 149 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly val val Glo Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val 1le Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Aso Ser Lys Aso Thr Leu lyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Aso Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Tyr Ser Gly Tyr ASp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val ~rp Gly Gln Gly Thr Thr val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125
Lys Gly Pro Ser val Phe Pro Leu llO 135
<210> 150
10 <211>223
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 150
Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe ~ro Gly Ala Arg Cys ASp Ile Gln Met 1 5 10 15 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ASp Arg Val Thr 20 25 30 11e Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Thr Tyr Leu Ala Trp Phe 35 40 45 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu 11e Tyr Gly Ala Ser
50 55 6 O
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
65 70 75 80
Thr ASp Phe Thr Leu Thr 1le Thr Ser Leu Gln Pro Glu ASp Phe Ala
85 90 95 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr T1e Tyr Pro Phe Ser Phe Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Lys Val A~p I1e Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 119 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 145 150 155 160 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asr],. -Ser. Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 180 185 190 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 195 200 205 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 210 215 220
<210> 151
<211> 141
5 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 151 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 1~ Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Iyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp 11e Gly Tyr 1le Tyr Iyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala ASP Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Ser Gly Tyr Cys Thr Asn Val Ala Cys Phe Pro ASp 100 105 110 Ala Phe ASp 11e Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125
Ser Ihr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135 140
<210> 152
<211> 225
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 152
Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly ASp Val 1 5 10 15 Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro 20 25 30 Ala Ser lle Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly 35 40 45 Phe Asn Phe Leu ASP Trp Tyr Le\,] Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln 50 55 60
Leu Leu l1e Tyr Leu Gly Ser Ile Arg Ala Ser Gly Val PrO ASp Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu Lys l1e Ser Arg
85 90 95 Val Glu Ala Glu ASp Val Gly val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln 100 105 110 Thr Pro Leu Thr Phc Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu 11e Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 11e Phe Pro Pro Ser ASp Glu Gln Leu 130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arq Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser G1y 165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr
<210> 153
<211> 136
5 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 153 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly PrO Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser 11e Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp 11e Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr 11e Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser val Asp Thr Ser Lys Asn Gln phe Ser Leu 65 70 75 BO Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 95 9 O 95 Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Leu ASp val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135
<210> 154
<211>230
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 154
Leu Leu Gly Leu Leu Met Ceu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp 11e 1 5 10 15 Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val rhr Pro Gly Glu Pro 20 25 30 Ala Ser 1le Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp ryr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln
50 55 6 O Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser 11e Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg 65 10 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg
85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Mct Gln Ala Leu Gln 100 105 110 Thr Pro Ile rhr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 11e Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140 LY5 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn ASfi Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg 225 230
<210> 155
<211> 122
5 <212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 155 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Lcu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lle Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp lle Arg Gln PrO Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln ?he Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120
<210> 156
10 <211> 220
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 156
Ser Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met lhr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 1 5 10 15 Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Leu Leu His Ser Thr Gly His Asn lyr Leu Asp Irp Tyr Leu Gln 35 40 45 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Ile Arg
50 55 6 O Ala Ser Gly Val Pro Asp'" Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp 65 70 75 BO Phe Ihr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Iyr
B5 90 95 Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Ihr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg IDO 105 110 Leu Glu I1e Lys Arg Thr Val Ala Ala PrO Ser Val Phe 11e Phe PrO 115 120 125 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly rhr Ala Ser Val Val Cys Leu
130 135 140 Leu Asn Asn Phe Iyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 145 150 155 160 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
165 170 175 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys lBO lBS 190 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 195 200 205 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 210 215 220
<210> 157
<211> 136
5 <212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 157 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lle Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp 11e Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu GIu lrp 11e 35 40 45 Gly Tyr 11e Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr 11e Ser Val Asp rhr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Iyr Cys Ala B 5 90 95 Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Iyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135
<210> 158
10 <211>231
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 158
Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp 11e 1 5 10 15 Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro 20 25 30 Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Lcu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln
50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Ile Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 11e Ser Arg
85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Iyr Iyr Cys Met Gln Ala Leu Gln 100 105 110 Thr Pra Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Iyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Sar Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Iyc Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thc Hls Gln Gly Leu Ser Sec Pro Val
210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 225 230
<210> 159
<211> 138
5 <212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 159 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Irp Val 35 40 45 Ala Val !le Tcp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Thc ASp Ser Val 50 55 6 O Lys Gly Arg Phe Thr 11e Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg ASp Arg Tyr Ser Gly Iyr ASp Tyr Phe Tyr Tyr Iyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135
<2\0> 160
<211>212
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 160 Cys Phe Pra Gly Ala Arg Cys Asp !le Gln Met Ihr Gln Ser Pro Ser
1 5 10 15 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ASp Arg Val Thr 11e Thr Cys Arg Ala
20 25 30 Ser Gln Gly l1e Tyr Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Arg Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly
50 55 60 Val Pro Ser Ly3 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Iyr Cys Gln
85 90 95 Gln Tyr Thr l1e Tyr Pro Phe The Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp 100 105 110 l1e Lys Arg Thr Val Ala Ala PrO Ser Val Phe lle Phe Pro PrO Ser 115 120 125 ASp Glu Gln Leu Ly5 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
130 135 140 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 145 150 155 160 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
165 170 175 ASp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala AsP 180 185 190 Tyr Glu LY5 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Val 210
<210> 161
<211>133
<212> PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 161 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Ihr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Tep Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp The Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Ly5 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Iyr Cys Ala 85 90 95 Asn Thr Tyr Tyr Tye Gly Ser Gly Tyr Gly Met ASp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr val Ser Ser Ala Ser Thr Ly5 Gly Pro Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro 130
<210> 162
<211> 224
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 162
Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Val Thr PrO Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 20 25 30 Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly His Asn Tyr Leu Asp Trp 35 40 45 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu tle Tyr Leu Gly
50 SS 60 Ser 11e Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70 75 80 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 11e Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp val
85 90 95 Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr l1e rhr Phe Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Arg Leu Glu 11e Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 1le p,he E'lro Pro Ser ASp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 145 150 155 160 Lys Val ASp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175 Glu Gln Asp Ser Lys ASp Ser Thr lyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 180 185 190 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 195 200 205 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 210 215 220
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<211> 132
<212> PRT
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<400> 163 Gln Val Glo Leu Glo Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ihr Val Ser Gly Gly Ser 11e Ser Arg Tyr 20 2, 30 Tyr Irp Ser Trp lle Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Arg lle 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr ASp Tyr Aso Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arq Val Thr Met Ser Val ASp Thr Ser Lys Aso Gln Phe Ser Leu 65 70 75 SO Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Iyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arq 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala 130
<210> 164
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 164
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15 Arg Val Thr l1e Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn 11e Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu 110 Tyr Gly Aso Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 11e Thr Gly Len 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95 Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 11e Ser ASp Phe
130 135 140 Tyc Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala ASp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Se~ Asn Asn Lys
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<212> PRT
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Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 13 O 135
<210> 166
<211>212
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 166
Trp Leu Arq Gly Ala Arg Cys ASp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 1 5 10 15 Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25 30 Thr Gln Ser Ile Ser Ser Hís Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11e Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly
50 55 60 Val Pro Ser Ar'g Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 BO Thr 11e Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95 Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110 lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe !le Phe Pro Pro Ser
115 120 125 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
130 135 140 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val ASp Asn Ala 145 150 155 160 Leu Gln Ser Gly Aso Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
165 no 175 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 180 185 190 Tyr Glu Lys His Lys val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Val 210
<210> 167
<211> 137
<212>PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 167 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Ser Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Gly Tyr Ile His Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg val Thr Ile Ser Val ASp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala ASp Thr Ala Val Tyr Tye 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr. Gly Ser Gly Ser Pro Tyr Gly Met ASp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val The Val Ser Ser Ala Ser The Lys 115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135
<210> 168
<211>219
<212>PRT
<213> Horno sapiens
<400> 168 Leu Trp Val Ser GIy Ser Ser Gly Asp Ile val Met Thr Gln Ser Pro 1 S 10 15 Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GIy Glu Thr Ala Ser ¡le Ser Cys Arg 20 25 30 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser Asn Gly His Asn Tyr Leu Asp Trp 35 40 45 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly
50 55 60 Ser Tyr Arg Asp Ser GIy Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70 75 80 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val
85 90 95 Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Lcu Gln Thr Pro Pro Thr Phe GIy 100 105 110 Gly Gly Thr Lys Leu Glu ¡le Lys Arg Ihr Val Ala Ala Pro Ser Val 115 120 125 Phe ¡le Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 145 150 155 160 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser G1y Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175 Ihr Glu Gln Asp Ser I.ys ASp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Ihr Leu 180 185 190 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 195 200 205 Val Ihr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Tnr 210 215
<210> 169
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<212> PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 169 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Irp Val 35 40 45 Ala Val Ile Irp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala ASp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Acq ASP Gln 7yr Ser Gly Tyr ASp Leu Tyr Tyr Tyr Iyr Gly Met 10D 105 110
ASp Val Irp Gly Gln Gly Ihr Thr Val Ihr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135
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<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 170 Leu Leu Leu Trp 1le Ser Gly Ala Tyr Gly Asp 1le Val Met Thr Gln 1 5 10 15 Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 11e AsO 20 25 30 Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Iyr 35 40 45 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro PrO Lys Leu Leu 1le
50 55 60 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro ASp Arg Phe Ser Gly 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
85 90 95 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg 100 105 110 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 115 120 125 Pro Ser val Phe 11e Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
130 135 140 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 145 150 155 160 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
165 170 17 5 Glu Ser Val Thr Glu Gln ASp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 195 200 205 Ala Cys Glu Val Thr His G1n Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
210 215 220 Phe Asn Arg Gly Glu 225
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<212>PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 171 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 3 O Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala 11e Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Cys Tyr Ala ASp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Pro Tyr Gln Leu Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr rrp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala 130
<210> 172
<211>24
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<220>
<223> Flag Tag

Claims (14)

  1. Reivindicaciones
    1.
    Un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une especificamente a una proteina 24P4C12 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:2, en el que el anticuerpo monoclonal comprende una región VH que consta de la SEC ID N°:123, desde el residuo 1 al124 y una región VL que consta de la SEC ID N°:124, desde el residuo 15 a122.
  2. 2.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende la misma secuencia de aminoácidos de la región VH y la región VL como la del anticuerpo producido por el hibridoma al que se le asignó el número de acceso 8602 de la American Type Culture Collection (ATTC)
  3. 3.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, en el que el fragmento es un fragmento Fab, F(ab')" Fvo Sfv.
  4. 4.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.
  5. 5.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, que se produce de modo recombinante.
  6. 6.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 5, en el que la proteina recombinante comprende la región de unión al antígeno.
  7. 7.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se enlaza a un marcador detectable, una toxina, un agente terapéutico o un agente quimioterapéutico.
  8. 8.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 7, en el que el marcador detectable es un radioisótopo, un quelante de metal, una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente o un compuesto quimioluminiscente.
  9. 9.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 8, en el que el radioisótopo comprende 212 Si, 32p o Lu
    131 1, 131 1n " 90y lsSRe, "'At" 1251 lSSRe, "3Sm " "3Si .
  10. 10.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 7, en el que la toxina comprende ricina, cadena A de ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, maitansinoide, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi antracenodiona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomnas (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de mOdeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, glucocorticoide, auristatinas, auromicina, itrio, bismuto, combrestatina, duocarmicina, dolostatina, cc1065 o un cisplatino.
  11. 11.
    Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1.
  12. 12.
    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 en forma de dosis unitaria humana.
  13. 13.
    Un anticuerpo o un fragmento de unión al anticuerpo de la reivindicación 1 o una composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de cánceres que
  14. 14.
    Un procedimiento para detectar una PJoteina 24P4C12 en una muestra biológica, que
    comprende las siguientes etapas:
    proporcionar la muestra biológica y una muestra de control; poner en contacto la muestra biológica y la muestra de control con el anticuerpo de la reivindicación 1 que se une específicamente a la proteína 24P4C12; y determinar una cantidad de un complejo de la sustancia con la proteína 24P4C12 y el anticuerpo presente en la muestra biológica y en la muestra de control, en el que la proteína 24P4C12 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N":2.
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