JP6181089B2 - 条件依存活性抗上皮細胞増殖因子受容体抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Description
優先権の利益を、2012年3月8日出願の“条件依存活性抗上皮細胞増殖因子受容体抗体およびその使用方法”なる表題の、米国仮出願番号61/685,089に基づいて主張する。
本出願はまた、2011年9月27日出願の“条件依存活性治療的タンパク質の評価および同定または進展のための方法”なる表題の、Lalitha Kodandapani、Louis Howard Bookbinder、Gregory I. Frost、Philip Lee Sheridan、Harold Michael Shepard、Ge WeiおよびLei Huangの米国出願番号13/200,666にも関連し、これは、2011年9月8日出願の、“条件依存活性治療的タンパク質の評価および同定または進展のための方法”なる表題のLalitha Kodandapani、Louis Howard Bookbinder、Gregory I. Frost、Philip Lee Sheridan、Harold Michael Shepard、Ge WeiおよびLei Huangの国際出願番号PCT/US11/50891の一部継続出願であり、これは、2010年9月8日出願の、“条件依存活性治療的タンパク質の評価および同定または進展のための方法および条件依存活性治療的タンパク質”なる表題のLalitha Kodandapani、Philip Lee Sheridan、Harold Michael Shepard、Louis H. BookbinderおよびGregory I. Frostの米国仮出願番号61/402,979に基づく優先権を主張する。
上記出願の各々の主題を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
配列表の電子版はこれと共に提出し、その内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる。電子ファイルは2013年3月8日に準備し、1237キロバイトサイズであり、名称3104seqPC1.txtである。
ここに提供されるのは、修飾抗EGFR抗体を含む条件依存活性抗EGFR抗体および修飾抗EGFR抗体を含む条件依存活性抗EGFR抗体をコードする核酸分子である。また提供されるのは、条件依存活性抗EGFR抗体を使用する処置方法である。
抗EGFR抗体は、ヒト疾患、例えば癌の処置および診断のために臨床の現場で使用される。例えば、治療用抗体の例はセツキシマブを含む。セツキシマブは、再発または転移性頭頸部癌、結腸直腸癌および他の疾患および状態の処置に対して承認されている。EGFRの過発現またはEGFRの異常シグナル伝達または活性化が関与する他の疾患または状態の処置にも使用できる。投与された抗EGFR抗体は、健常細胞および組織におけるEGFRと結合できる。これは、投与できる投与量を制限する。それゆえに、セツキシマブおよび他の抗EGFR抗体は、患者に投与するとき限界がある。従って、改善された抗EGFR抗体の提供が、とりわけ本発明における目的である。
提供されるのは、条件依存活性抗上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)抗体およびその抗原結合フラグメントである。抗体およびそのフラグメントは、例えば、約7〜7.2の中性pHを有する皮膚の基底層で生じるような、非標的組織、例えば非腫瘍組織環境よりも、酸性pHを有する標的組織、例えば腫瘍微小環境で大きな活性を示すように条件依存活性である。一般に、抗腫瘍治療剤として使用される抗EGFR抗体は、EGFR受容体と結合し、そのリガンドとの結合により起こるEGFR介在活性を阻害する。その結果、それらは腫瘍を阻害し、または処置できる。腫瘍以外の組織、例えば皮膚における組織がEGFRを発現するため、抗EGFR抗体はこれらの受容体の活性を阻害し、それにより望ましくない副作用を起こす。ここに提供される抗体は、条件依存活性ではない抗体と比較しておよび/または腫瘍微小環境におけるそれらの活性と比較して、非腫瘍微小環境(例えば中性pHを有する)で活性の低下を示す点で、条件依存活性である。腫瘍微小環境への選択性により、それらは望ましくない副作用が少なくまたは軽度でありおよび/または高投与量で投与できるために改善された効果を示す。
a) 配列番号495に示す可変重鎖または配列番号495に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
b) 配列番号1062に示す可変重鎖または配列番号1062に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
c) 配列番号1112に示す可変重鎖または配列番号1112に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
d) 配列番号1114に示す可変重鎖または配列番号1114に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
e) 配列番号1115に示す可変重鎖または配列番号1115に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
f) 配列番号1116に示す可変重鎖または配列番号1116に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
g) 配列番号1117に示す可変重鎖または配列番号1117に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
h) 配列番号1124に示す可変重鎖または配列番号1124に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
i) 配列番号1125に示す可変重鎖または配列番号1125に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
j) 配列番号1126に示す可変重鎖または配列番号1126に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
k) 配列番号1128に示す可変重鎖または配列番号1128に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
l) 配列番号1129に示す可変重鎖または配列番号1129に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
m) 配列番号1130に示す可変重鎖または配列番号1130に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
o) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1139に示す可変軽鎖または配列番号1139に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
p) 配列番号1135に示す可変重鎖または配列番号1135に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1138に示す可変軽鎖または配列番号1138に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
q) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1140に示す可変軽鎖または配列番号1140に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
r) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1141に示す可変軽鎖または配列番号1141に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
s) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1142に示す可変軽鎖または配列番号1142に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
t) 配列番号1135に示す可変重鎖または配列番号1135に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1142に示す可変軽鎖または配列番号1142に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
u) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1143に示す可変軽鎖または配列番号1143に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
v) 配列番号1136に示す可変重鎖または配列番号1136に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1142に示す可変軽鎖または配列番号1142に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
w) 配列番号1137に示す可変重鎖または配列番号1137に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1144に示す可変軽鎖または配列番号1144に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
x) 配列番号1136に示す可変重鎖または配列番号1136に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1144に示す可変軽鎖または配列番号1144に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
y) 配列番号1137に示す可変重鎖または配列番号1137に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1145に示す可変軽鎖または配列番号1145に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
z) 配列番号1136に示す可変重鎖または配列番号1136に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1145に示す可変軽鎖または配列番号1145に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
aa) 配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1153に示す可変軽鎖または配列番号1153に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
cc) 配列番号1148に示す可変重鎖または配列番号1148に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1154に示す可変軽鎖または配列番号1154に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
dd) 配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1154に示す可変軽鎖または配列番号1154に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
ee) 配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1155に示す可変軽鎖または配列番号1155に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
ff) 配列番号1151に示す可変重鎖または配列番号1151に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
gg) 配列番号1146に示す可変重鎖または1148または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列または1148および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
hh) 配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
ii) 配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
jj) 配列番号1152に示す可変重鎖または配列番号1152に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
kk) 配列番号1148に示す可変重鎖または配列番号1148に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
ll) 配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
mm) 配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
nn) 配列番号1152に示す可変重鎖または配列番号1152に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
oo) 配列番号1148に示す可変重鎖または配列番号1148に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
pp) 配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
qq) 配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1158に示す可変軽鎖または配列番号1158に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
rr) 配列番号1152に示す可変重鎖または配列番号1152に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1159に示す可変軽鎖または配列番号1159に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
ss) 配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1159に示す可変軽鎖または配列番号1159に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
tt) 配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
uu) 配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;および
vv) 配列番号1118に示す可変重鎖または配列番号1118に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号4または10に示す可変軽鎖または配列番号4または10に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列。
a) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1138に示す可変軽鎖または配列番号1138に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
b) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1139に示す可変軽鎖または配列番号1139に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
c) 配列番号1135に示す可変重鎖または配列番号1135に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1138に示す可変軽鎖または配列番号1138に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
d) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1140に示す可変軽鎖または配列番号1140に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
e) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1141に示す可変軽鎖または配列番号1141に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
f) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1142に示す可変軽鎖または配列番号1142に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
g) 配列番号1135に示す可変重鎖または配列番号1135に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1142に示す可変軽鎖または配列番号1142に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
h) 配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1143に示す可変軽鎖または配列番号1143に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
i) 配列番号1136に示す可変重鎖または配列番号1136に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1142に示す可変軽鎖または配列番号1142に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
j) 配列番号1137に示す可変重鎖または配列番号1137に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1144に示す可変軽鎖または配列番号1144に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
k) 配列番号1136に示す可変重鎖または配列番号1136に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1144に示す可変軽鎖または配列番号1144に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
l) 配列番号1137に示す可変重鎖または配列番号1137に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1145に示す可変軽鎖または配列番号1145に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
m) 配列番号1136に示す可変重鎖または配列番号1136に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1145に示す可変軽鎖または配列番号1145に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
n) 配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1153に示す可変軽鎖または配列番号1153に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
o) 配列番号1147に示す可変重鎖または配列番号1147に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1153に示す可変軽鎖または配列番号1153に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
q) 配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1154に示す可変軽鎖または配列番号1154に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
r) 配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1155に示す可変軽鎖または配列番号1155に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
s) 配列番号1151に示す可変重鎖または配列番号1151に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
t) 配列番号1146に示す可変重鎖または1148または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列または1148および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
u) 配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
v) 配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
w) 配列番号1152に示す可変重鎖または配列番号1152に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
x) 配列番号1148に示す可変重鎖または配列番号1148に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
y) 配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
z) 配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
aa) 配列番号1152に示す可変重鎖または配列番号1152に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
bb) 配列番号1148に示す可変重鎖または配列番号1148に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
cc) 配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
dd) 配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1158に示す可変軽鎖または配列番号1158に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
ee) 配列番号1152に示す可変重鎖または配列番号1152に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1159に示す可変軽鎖または配列番号1159に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
ff) 配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1159に示す可変軽鎖または配列番号1159に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
gg) 配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;and
hh) 配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列。
、E272L、E272F、E272M、E272W、E272P、E272G、K274D、K274N、K274S、K274H、K274V、K274I、K274F、K274M、K274W、K274P、K274G、F275L、N276D、N276T、N276H、N276V、N276I、N276F、N276M、N276W、N276P、N276G、Y278D、Y278N、Y278Q、Y278R、Y278S、Y278H、Y278V、Y278L、Y278I、Y278M、Y278P、Y278G、D280K、D280L、D280W、D280P、D280G、G281D、G281K、G281Y、G281P、V282E、V282K、V282Y、V282P、V282G、E283K、E283H、E283L、E283Y、E283P、E283G、V284E、V284N、V284T、V284L、V284Y、H285D、H285E、H285Q、H285K、H285Y、H285W、N286E、N286Y、N286P、N286G、K288D、K288E、K288Y、K290D、K290N、K290H、K290L、K290W、P291D、P291E、P291Q、P291T、P291H、P291I、P291G、R292D、R292E、R292T、R292Y、E293N、E293R、E293S、E293T、E293H、E293V、E293L、E293I、E293F、E293M、E293Y、E293W、E293P、E293G、E294K、E294R、E294S、E294T、E294H、E294V、E294L、E294I、E294F、E294M、E294Y、E294W、E294P、E294G、Q295D、Q295E、Q295N、Q295R、Q295S、Q295T、Q295H、Q295V、Q295I、Q295F、Q295M、Q295Y、Q295W、Q295P、Q295G、Y296K、Y296R、Y296A、Y296V、Y296M、Y296G、N297Q、N297K、N297R、N297T、N297H、N297V、N297L、N297I、N297F、N297M、N297Y、N297W、N297P、N297G、S298D、S298E、S298Q、S298K、S298R、S298I、S298F、S298M、S298Y、S298W、T299D、T299E、T299N、T299Q、T299K、T299R、T299L、T299F、T299M、T299Y、T299W、T299P、T299G、Y300D、Y300E、Y300N、Y300Q、Y300K、Y300R、Y300S、Y300T、Y300H、Y300A、Y300V、Y300M、Y300W、Y300P、Y300G、R301D、R301E、R301H、R301Y、V303D、V303E、V303Y、S304D、S304N、S304T、S304H、S304L、V305E、V305T、V305Y、K317E、K317Q、E318Q、E318H、E318L、E318Y、K320N、K320S、K320H、K320V、K320L、K320F、K320Y、K320W、K320P、K320G、K322D、K322S、K322V、K322I、K322F、K322Y、K322W、K322P、K322G、S324H、S324F、S324M、S324W、S324P、S324G、N325K、N325R、N325S、N325F、N325M、N325Y、N325W、N325P、N325G、K326P、A327E、A327K、A327R、A327H、A327V、A327I、A327F、A327M、A327Y、A327W、A327P、L328D、L328Q、L328K、L328R、L328S、L328T、L328V、L328I、L328Y、L328W、L328P、L328G、P329D、P329E、P329N、P329Q、P329K、P329R、P329S、P329T、P329H、P329V、P329L、P329I、P329M、P329Y、P329W、P329G、A330E、A330N、A330T、A330P、A330G、P331D、P331Q、P331R、P331T、P331L、P331I、P331F、P331M、P331Y、P331W、I332K、I332R、I332S、I332V、I332F、I332M、I332W、I332P、I332G、E333L、E333F、E333M、E333P、K334P、T335N、T335S、T335H、T335V、T335L、T335I、T335F、T335M、T335W、T335P、T335G、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337N、S337H、S298A、K326A、K326S、K326N、K326Q、K326D、K326E、K326W、K326Y、E333A、E333S、K334A、K334E、Y300I、Y300L、Q295K、E294N、S298N、S298V、S298D、D280H、K290S、D280Q、D280Y、K290G、K290T、K290Y、T250Q、T250E、M428L、M428F、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、V264I、V264T、V264Y、E272Y、K274E、Y278T、N297D、T299A、T299V、T299I、T299H、K326T、L328A、L328H、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332NおよびI332Qから選択される重鎖定常領域におけるアミノ酸置換から選択される、アミノ酸置換も含み得る。
AbはEGFRと結合する抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントであり;
LはAbを標的剤に結合するリンカーであり;
mは少なくとも1、例えば少なくとも1〜8であり;
qは0またはそれ以上、例えば、得られたコンジュゲートがEGFRに結合する限り、0〜8である);そして
得られたコンジュゲートはEGFRに結合する。
ノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含んでよく、その一部は抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含む。
概要
A. 定義
B. EGFRおよび抗EGFR抗体
1. EGFR
2. 抗EGFR抗体および副作用
3. セツキシマブ
a. 構造
b. 機能
C. 修飾抗EGFR抗体および条件依存活性抗EGFR抗体
1. 修飾抗EGFR抗体
a. 重鎖修飾
b. 軽鎖修飾
c. 修飾抗EGFR抗体およびそのフラグメントの例
2. ヒト化抗EGFR抗体
3. 付加的修飾
4. コンジュゲート
a. 標的剤
i. マイタンシノイド薬物部分
ii. オーリスタチンおよびドラスタチン薬物部分
iii. 細胞毒素部分
iv. 標的送達のための核酸
b. リンカー
i. ペプチドリンカー
ii. 化学的リンカー
D. 抗EGFR抗体特性および活性の同定および評価のための方法
1. 結合アッセイ
a. 固相支持体結合アッセイ
i. 表面プラズモン共鳴
ii. バイオレイヤー干渉法
iii. 免疫アッセイ
a)ELISA
b)免疫沈殿
c)ウェスタンブロット
d)免疫組織化学
e)放射免疫アッセイ
b. 溶液結合アッセイ
i. 等温滴定熱量測定(ITC)
ii. スペクトルアッセイ
2. 細胞アッセイ
3. 動物モデル
a. 副作用評価
4. 薬物動態および薬力学アッセイ
E. 抗EGFR抗体の同定、産生および製造のための方法
1. 条件依存治療的タンパク質の同定
2. 抗EGFR抗体の産生および製造
a. ベクター
b. 細胞および発現系
i. 原核生物発現
ii. 酵母
iii. 昆虫
iv. 哺乳動物細胞
v. 植物
3. 精製
F. 医薬組成物、製剤、キット、製品および組み合わせ剤
1. 医薬組成物および製剤
2. 製品/キット
3. 組み合わせ剤
G. 治療的使用
1. 疾患および状態の例
a. 癌
b. 非癌過増殖性疾患
c. 自己免疫性疾患または障害
d. 炎症性障害
e. 感染症
f. 他の疾患および状態
2. 治療対象
a. EGFRを過発現する対象の選択
b. EGFR関連多型性を示す対象の選択
c. 抗EGFR関連副作用を示す対象の同定
i. 皮膚毒性
ii. 低マグネシウム血症
d. 処置対象の選択または同定のための他の方法
3. 投与量
4. 投与経路
5. 組み合わせ治療
H. 実施例
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同一意味を有する。本明細書の全体にわたり記載されている全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、Genbank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公開された資料は、特に断らない限り、その全体を引用により本明細書に包含させる。ここでの用語について複数の定義が存在するならば、本章のものが優先する。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスが引用されているとき、このような識別子は変わることがあり、インターネット上の特定の情報は導入され、また削除され得るが、同等の情報をインターネットでの検索により取得することができる。それらの引用は、当該情報の利用可能性および公衆への流布を証するものである。
抗EGFR抗体は知られ、転移結腸直腸癌(MCRC)、頭頸部の扁平上皮細胞癌(SCCHN)および非小細胞性肺癌(NSCLC)を含む種々の適応症に承認されている。抗EGFR抗体は、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ、C225またはIMC-C225)、Zhuの11F8(WO2005/090407)、EMD 72000(マツズマブ)、ベクティビックスTM(パニツムマブ;ABX-EGF)、TheraCIM(ニモツズマブ)およびHu-Max-EGFR(ザルツムマブ)を含むが、これらに限定されない。しかしながら、対象に投与されたとき、これらの治療用抗体は対象に有害副作用をもたらす(Eng C. (2009) Nat. Rev. Clin. Oncol., 6:207-218)。これはその使用を制限する。例えば、抗EGFR抗体は、しばしば投与の中断および処置の中止に至る、皮膚毒性および消化器障害(悪心、嘔吐、下痢を含む)を含む顕著で、特徴的有害事象と関連する。例えば、EGFRは皮膚のプレケラチノサイトおよび基底細胞で高度に発現される。皮膚前駆体における抗EGFR抗体によるEGFRシグナル伝達遮断は、皮膚前駆体増殖阻害、アポトーシスおよび炎症に至る。これは皮膚毒性、例えば発疹および他の皮膚損傷をもたらし得る。
上皮細胞増殖因子受容体(Uniprot Accession No. P00533;配列番号6)は、170kDAI型糖タンパク質である。EGFRはHER2/c−neu(ErbB−2)、Her3(ErbB−3)およびHer4(ErbB−4)を含む受容体チロシンキナーゼ群のErbBファミリーのメンバーである。EGFRは細胞表面上に発現され、細胞外リガンド結合ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメインおよび膜貫通型親油性セグメントを含む3個のドメインを含む。腫瘍細胞への存在に加えて、上皮細胞増殖因子受容体は遍在性であり、造血細胞および上皮起源の細胞以外の正常細胞に無作為に分布している。
異常EGFRシグナル伝達を標的とし、阻害する治療剤は抗EGFR抗体を含む。抗EGFR抗体は、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)への結合により作用する。抗EGFR抗体は、リガンド、例えばEGFの、細胞外リガンド結合ドメインへの結合の競合および阻害により作用する。この結果は、細胞質ドメインリン酸化であり、得られたシグナル伝達事象が阻害される。それゆえに、抗EGFR抗体は、EGFR介在細胞シグナル伝達および細胞増殖の遮断により治療剤として有効であり得る。
ここに提供される条件依存活性抗EGFR抗体に含まれるのは、抗EGFR抗体セツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体と比較して、修飾されている修飾抗EGFR抗体である(例えばセツキシマブのヒト化形態、例えばHu225)。セツキシマブ(C225またはIMC−C225としても知られる)は、ヒト上皮細胞増殖因子受容体に結合するマウス/ヒトキメラ、IgG1モノクローナル抗体である。セツキシマブは、免疫原としてヒトA431類表皮癌細胞からEGFRを使用して同定されたM225に由来する(Gill et al. (1984) J Biol Chem 259:7755-7760; Sato et al., (1983) Mol Biol Med 1:511-529; Masui et al., (1984) Cancer Res 44:1002-1007; Kawamoto et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:1337-1341)。M225は上皮細胞増殖因子のEGF受容体への結合を阻害し、インビボでEGF刺激チロシンキナーゼ活性のアンタゴニストである(Gill et al. (1984) J Biol Chem 259:7755-7760)。
セツキシマブは完全長マウス/ヒトキメラIgG1抗体である。完全長抗体は、2個の同一重(H)鎖(各々通常約440アミノ酸含む)および2個の同一軽(L)鎖(各々約220アミノ酸を含む)の4個のポリペチド鎖を含む。軽鎖は、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2この異なる形態で存在する。各鎖は、免疫グロブリン(Ig)ドメインとして組織化される一連のドメインに組織化される。Igドメインは、各々ループにより結合されたアミノ酸の逆平行ベータ鎖を含む、2個のベータ−プリーツシートを含む、Ig折りたたみと呼ばれる構造を特徴とする。Ig折りたたみの2個のベータシートは、疎水性相互作用および保存鎖内ジスルフィド結合によりサンドイッチされている。抗体鎖の複数のIgドメインが可変(V)および定常(C)領域ドメインに組織化される。可変ドメインは、相補性決定領域(CDR)または超可変(HV)領域と呼ばれる3個の部分を介して、抗体に抗原特異性を付与する。CDR領域は厳密に規定され、抗体で普遍的に番号付けされる(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; AbM (Martin et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol 203:121-153; Pederson et al. (1992) Immunomethods 1:126参照)併せて、3個の重鎖CDRおよび3個の軽鎖CDRが抗体の抗原結合部位(抗体結合部位)を構成し、これは、同族抗原と物理的に相互作用し、抗体の特異性を付与する。定常領域は、補体およびエフェクター細胞の活性化を促進する。CDR領域と同様、定常領域は厳密に定義され、EUインデックスおよびKabatナンバリングスキームを使用して抗体において普遍的に番号付けされる(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)。軽鎖は、C領域(CL)およびV領域(VL)に対応する2個のドメインを有する。重鎖は、V領域(VH)およびC領域に3個または4個のドメイン(CH1、CH2、CH3およびCH4)、および、いくつかの例では、ヒンジ領域の4個のドメインを有する。各重鎖は、ジスルフィド結合により軽鎖と結合し、2個の重鎖は互いにジスルフィド結合により結合する。重鎖の結合は、ヒンジ領域として知られる重鎖の可動性領域が介在する。
セツキシマブは、正常細胞および腫瘍細胞の両者のEGFR上の細胞外ドメインと結合し、リガンド結合およびその後の活性化を阻止する(Li et al., (2005) Cancer Cell 7:301-311; Blick et al., (2007) Drugs 67(17):2585-2607)。セツキシマブは、上皮細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子アルファ(TGF−アルファ)の結合を競合的に阻害し、細胞増殖および転移拡散を阻止する。すなわち、セツキシマブの結合がチロシン−受容体キナーゼのリン酸化および活性化を遮断し、細胞増殖阻害、アポトーシス誘発、マトリックスメタロプロテアーゼ分泌減少および血管内皮細胞増殖因子産生減少に至る。セツキシマブはまた血管形成阻害を介して、抗腫瘍効果も誘発できる。セツキシマブは用量依存的方法で、高度に転移性のヒトTCC 253JB−V細胞におけるVEGF、IL−8およびbFGFの発現を阻害し、微小血管密度を低下させる(Perrotte et al. (1999), Clin. Cancer Res., 5:257-264)。セツキシマブはインビトロおよびインビボで腫瘍細胞におけるVEGF発現を下方制御できる(Petit et al. (1997), Am. J. Pathol., 151:1523-1530; Prewett et al. (1998), Clin. Cancer Res.4:2957-2966)。セツキシマブはまた抗体依存性細胞毒性(ADCC)および受容体内部移行にも関与する。
ここに提供されるのは、非病的または非腫瘍微小環境、例えば皮膚または皮膚の基底層よりも、腫瘍微小環境で高いまたは大きな活性を示す、条件依存活性抗EGFR抗体または抗原結合フラグメント、例えば修飾または変異体抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントである。このような抗体は非腫瘍微小環境において存在する条件下(例えば皮膚の基底層)と比較して、腫瘍環境において存在する条件下、ヒト上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)またはその可溶性フラグメントに対して高い結合活性を示すあらゆるものである。腫瘍微小環境で大きな結合活性を示すために、ここに提供する抗EGFR抗体は、腫瘍に対する選択的活性を示し、非腫瘍微小環境における細胞への結合活性が低い。条件依存結合活性により達成されるこのような選択性は、非腫瘍細胞、例えば皮膚の基底ケラチン生成細胞に対する望ましくない活性を最小化する。それゆえに、ここに提供する抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントは、対象に投与したとき、減少したまたは少ない副作用を提供する。
ここに提供されるのは、修飾または変異体抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントである。修飾抗EGFR抗体に包含されるのは、非病的環境、例えば皮膚または皮膚の基底層よりも、腫瘍微小環境において高いまたは大きな活性を示すような条件依存活性である抗体である。ここに提供される抗体は、抗EGFR抗体セツキシマブまたはその誘導体の変異体である。得られた抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体に集合したとき、最小限EGFR抗原(例えばヒトEGFR)またはその可溶性フラグメントと結合するのに十分な可変重鎖および可変軽鎖またはその一部を含むことは理解され、それにより可変重鎖または軽鎖の一方または両者は修飾されている。上記のとおり、このような修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントに包含されるのは、正確にまたは約pH7.0〜7.8のpH(例えば7.0〜7.4のpH)または正確にまたは約0.5mM〜5mMの乳酸濃度(例えば1mM〜4mM)の一方または両者を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約pH5.6〜6.8のpH(例えばpH6.0〜6.5)または正確にまたは約5mM〜20mMの乳酸濃度(例えば10mM〜20mM、例えば少なくとも16mM)の一方または両者を含む腫瘍微小環境において存在する条件下、高い結合活性でEGFR(特にヒトEGFR)と結合する抗体である。非腫瘍微小環境における条件下と比較して、腫瘍微小環境における条件下での高い結合活性は、少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0またはそれ以上の活性比であり得る。
ここに提供されるのは、配列番号3に示す可変重鎖を含むセツキシマブ抗体におけるアミノ酸残基に対応する、セツキシマブ抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体の可変重鎖に修飾、例えばアミノ酸置換を含む修飾抗EGFR抗体である。得られた修飾は、配列番号1、3、5、8または28またはそれと少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体に示すような、重鎖またはその一部であり得る。修飾は相補性決定領域(CDR)またはフレームワーク領域中であり得る。
ここに提供されるのは、配列番号4に示す可変軽鎖を含むセツキシマブ抗体におけるアミノ酸残基に対応する、セツキシマブ抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体の可変軽鎖において修飾、例えばアミノ酸置換を含む修飾抗EGFR抗体である。得られた修飾は、配列番号2、4、9、10または29に示す軽鎖またはそれと少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体においてであり得る。修飾は相補性決定領域(CDR)またはフレームワーク領域中であり得る。
ここに提供する修飾抗EGFR抗体、例えば上記のいずれかは、上記のとおり、抗体に集合したとき、最小限抗原と結合するのに十分な修飾可変重鎖および/または修飾可変軽鎖またはその一部を含む。ここに提供されるのは、配列番号30〜557、1062〜1064、1093、1098〜1107または1112〜1131のいずれかに示す修飾可変重鎖または配列番号30〜557、1062〜1064、1093、1098〜1107または1112〜1131のいずれかと少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示す配列;および配列番号4または10に示す可変軽鎖を含む修飾抗EGFR抗体である。他の例において、ここに提供されるのは、配列番号3に示す可変重鎖;および配列番号558〜1061または1065〜1068のいずれかに示す可変軽鎖または配列番号558〜1061または1065〜1068のいずれかと少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む修飾抗EGFR抗体である。
ここに提供されるのは、ヒトまたはヒト化抗EGFR抗体である。例えば、知られた抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれか、例えば上記セクション1に提供される修飾重鎖および/または修飾軽鎖を含む修飾抗EGFRのいずれかをヒト化できる。ヒト化の方法は当業者に周知である。抗体のヒト化は、マウスまたは他の非ヒト抗体をヒト抗体に進化させるために使用できる。得られた抗体はヒト配列が増加しており、マウスまたは非ヒト抗体配列が減少しているかまたはこれを含まないが、出発抗体と同等の結合親和性および特異性を維持する。
配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1138に示す可変軽鎖または配列番号1138に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1139に示す可変軽鎖または配列番号1139に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1135に示す可変重鎖または配列番号1135に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1138に示す可変軽鎖または配列番号1138に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1140に示す可変軽鎖または配列番号1140に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1141に示す可変軽鎖または配列番号1141に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1142に示す可変軽鎖または配列番号1142に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1135に示す可変重鎖または配列番号1135に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1142に示す可変軽鎖または配列番号1142に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1134に示す可変重鎖または配列番号1134に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1143に示す可変軽鎖または配列番号1143に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1136に示す可変重鎖または配列番号1136に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1142に示す可変軽鎖または配列番号1142に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1137に示す可変重鎖または配列番号1137に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1144に示す可変軽鎖または配列番号1144に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1136に示す可変重鎖または配列番号1136に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1144に示す可変軽鎖または配列番号1144に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1137に示す可変重鎖または配列番号1137に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1145に示す可変軽鎖または配列番号1145に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1136に示す可変重鎖または配列番号1136に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1145に示す可変軽鎖または配列番号1145に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1153に示す可変軽鎖または配列番号1153に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1147に示す可変重鎖または配列番号1147に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1153に示す可変軽鎖または配列番号1153に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1154に示す可変軽鎖または配列番号1154に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1155に示す可変軽鎖または配列番号1155に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1151に示す可変重鎖または配列番号1151に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1148に示す可変重鎖または配列番号1148に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1156に示す可変軽鎖または配列番号1156に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1152に示す可変重鎖または配列番号1152に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1148に示す可変重鎖または配列番号1148に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1152に示す可変重鎖または配列番号1152に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1148に示す可変重鎖または配列番号1148に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1149に示す可変重鎖または配列番号1149に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1150に示す可変重鎖または配列番号1150に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1158に示す可変軽鎖または配列番号1158に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1152に示す可変重鎖または配列番号1152に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1159に示す可変軽鎖または配列番号1159に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1159に示す可変軽鎖または配列番号1159に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;
配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1157に示す可変軽鎖または配列番号1157に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列;and
配列番号1146に示す可変重鎖または配列番号1146に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号1186に示す可変軽鎖または配列番号1186に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列。
ここに提供する修飾抗EGFR抗体のいずれも、1個以上の付加的修飾を含み得る。修飾(例えばアミノ酸置換)は、重鎖または軽鎖の可変領域または定常領域においてであり得る。ここに提供する修飾抗EGFR抗体に包含し得る付加的修飾の例は、米国特許番号7,657,380、7,930,107、7,060,808、7,723,484、米国特許公開番号2011014822、2005142133、2011117110、国際特許公開番号WO2012003995、WO2010080463、WO2012020059、WO2008152537およびLippow et al. (2007) Nat Biotechnol. 25(10):1171-1176により記載のものを含むが、これらに限定されない。ここに提供する抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかに包含できる、当分野で記載する例示的アミノ酸修飾の非限定的例は、
配列番号4に示すアミノ酸の配列における、1位のアスパラギン酸(D)のグルタミン酸(E)での置換、D1C、I2T、I2C、L3V、L3T、L3C、L4C、T5C、Q6C、S7C、P8C、V9C、V9A、V9D、V9G、V9P、V9S、I10T、I10S、I10F、I10C、L11Q、L11C、S12A、S12C、V13L、V13M、V13S、V13A、V13C、S14T、S14C、P15V、P15L、P15C、G16K、G16C、E17D、E17K、E17C、R18V、R18K、R18C、V19A、V19T、V19C、S20T、S20C、S20A、F21I、F21L、F21C、S22T、S22C、R24P、A25V、A25S、A25I、A25P、A25T、A25Y、A25C、A25F、A25M、A25L、A25W、S26D、Q27W、Q27E、Q27F、Q27Y、Q27T、Q27H、S28R、S28F、G30Y、G30C、G30H、G30K、G30Q、G30R、G30W、G30F、G30T、G30M、G30S、G30A、T31E、T31V、T31D、T31R、N32H、I33L、H34C、Q38K、R39K、T40P、T40S、N41G、N41D、G42Q、G42K、G42E、S43A、S43P、R45K、K49Y、K49F、Y50G、S53V、S60D、S60A、G64S、G64A、D70E、D70V、F71Y、S74T、N76S、N76T、S77R、S77G、V78L、E79Q、S80P、S80A、E81A、I83F、I83S、I83V、I83A、D85V、D85T、D85I、D85M、Y87S、Q89C、Q89H、Q90C、N91C、N91Q、N91L、N92C、N92L、N92R N92K、N92M、N92Y、N92H、N92E、N92F、N93A、N93D、N93E、N93V、N93K、N93C、W94F、W94Y、P95C、T96C、T96L、T96E、T97C、T97A、T97D、T97E、T97P、T97K、T97N、T97Q、T97I、T97G、T97L、T97H、T97R、T97S、G99A、A100G、A100Q、K103T、L104VおよびL106Iに対応する位置での可変軽鎖(VL)におけるアミノ酸交換(置換)を含む変異体;
ヒンジ、CH2およびCH3領域における、重鎖定常領域におけるアミノ酸交換(置換)を含む変異体を含む。
またここに提供されるのは、直接的にまたはリンカーを介して1個以上の標的剤と結合した、ここに提供する条件依存活性抗EGFR抗体を含むコンジュゲートである。これらのコンジュゲートは次の抗体(Ab)、(リンカー(L))q、(標的剤)mの要素を含み、式:Ab−(L)q−(標的剤)m(ここで、qは0またはそれ以上であり、mは少なくとも1である)で表される。それゆえに、ここで提供されるコンジュゲートは、腫瘍微小環境で条件依存活性または選択的であり、EGFRと結合する、ここに提供する抗体に共有結合により結合した、1個以上の標的剤を含む。
標的剤は、腫瘍細胞の選択集団への標的化送達が望ましい、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、治療部分または他の薬剤を含む。このような標的剤は、細胞毒性剤、DNAおよびRNAヌクレアーゼ類、毒素、薬物または他の薬剤を含むが、これらに限定されない。
マイタンシノイド薬物部分は、米国特許番号8,142,784に記載されている。マイタンシン化合物は、微小管タンパク質であるチューブリンの重合の阻害を介して、有糸分裂中の微小管形成を阻害することにより細胞増殖を阻害する(Remillard et al. (1975) Science 189:1002-1005;米国特許番号5,208,020)。マイタンシンおよびマイタンシノイド系は、高度に細胞毒性であるが、癌治療におけるそれらの臨床的使用は、主として腫瘍への低い選択性に起因する重篤な全身副作用により極めて制限されている。マイタンシンでの治験は、中枢神経系および消化器系に対する重篤な有害作用のために中止されている(Issel et al. (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207)。
オーリスタチンおよびドラスタチンは、公開米国出願番号US2011/0217321に記載されている。ドラスタチンおよびオーリスタチンは微小管動態、GTP加水分解および核および細胞分裂を妨害することが示されており、(Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)、抗真菌活性を有する(Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)。さらに、オーリスタチンは、極めて強力で、合成され、安定でかつリンカー結合を可能にするために化学的修飾しやすい(Senter (2009) Curr Opin Chem Biol 13:235-244)。
本方法および組成物に使用するのに適する細胞毒素は、小分子、例えばDNA開裂剤および細菌、真菌、植物、昆虫、ヘビおよびクモ毒素を含むが、これらに限定されないタンパク質性細胞毒素を含む。ここに提供されるコンジュゲートへの取り込みが意図される細胞毒素の例のアミノ酸配列を表11に示す。
本方法の実施に際して、キメラリガンド−毒素における細胞毒素として包含させるのに適切なDNA開裂剤の例は、アントラキノン−オリゴピロール−カルボキサミド、ベンゾイミダゾール、レイナマイシン;ジネマイシンA;エンジイン;ならびに生物学的に活性なその類似体または誘導体(すなわち、実質的に等価な生物学的活性を有するもの)を含むが、これらに限定されない。既知類似体および誘導体は、例えば、Islam et al., J. Med. Chem. 34 2954-61, 1991; Skibo et al., J. Med. Chem. 37:78-92, 1994; Behroozi et al., Biochemistry 35:1568-74, 1996; Helissey et al., Anticancer Drug Res. 11:527-51, 1996; Unno et al., Chem. Pharm. Bull. 45:125-33, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5:903-19, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5: 883-901, 1997; およびXu et al., Biochemistry 37:1890-7, 1998に開示されている。他の例は、エンジインキノンイミン類(米国特許番号5,622,958);2,2r−ビス(2−アミノエチル)−4−4’−ビチアゾール(Lee et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 40:151-7, 1996);エピリチシン(epilliticine)−サレン銅コンジュゲート(Routier et al., Bioconjug. Chem., 8:789-92, 1997)を含むが、これらに限定されない。
キメラリガンド−毒素の細胞毒素として包含させるのに有用な代謝拮抗剤の例は、5−フルオロウラシル、メトトレキサート、メルファラン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、窒素マスタードおよびマイトマイシンcを含むが、これらに限定されない。
本方法において使用するキメラリガンド−毒素に取り込むのに有用なタンパク質性細胞毒素の例は、タイプ1およびタイプ2リボソーム不活性化タンパク質(RIP)を含むが、これらに限定されない。有用なタイプ1植物RIPは、ジアンチン30、ジアンチン32、リクニン(lychnin)、サポリン1〜9、ヨウシュヤマゴボウ活性化タンパク質(PAP)、PAP II、PAP−R、PAP−S、PAP−C、マパルミン(mapalmin)、ドデカンドリン、ブリオジン−L、ブリオジン、コリシン1および2、ルフィン−A、ルフィン−B、ルフィン−S、19K−タンパク質合成阻害タンパク質(PSI)、15K−PSI、9K−PSI、アルファ−キリロウィン、ベータ−キリロウィン、ゲロニン、モモルジン、モモルジン−II、モモルジン−Ic、MAP−30、アルファ−モモルカリン、ベータ−モモルカリン、トリコサンチン、TAP−29、トリコキリン;オオムギRIP;アマRIP、トリチン、トウモロコシRIP、アスパリン(Asparin)1および2(Stirpe et al., Bio/Technology 10:405-12, 1992)を含むが、これらに限定されない。有用なタイプ2RIPは、ボルケンシン、リシン、ニグリン−b、CIP−29、アブリン、モデシン、エブリチン−α、エブリチン−β、エブリチン−γ、ヴィルクミン(vircumin)、ポレクチン(porrectin)、ならびにその生物学的に活性な酵素サブユニットを含むが、これらに限定されない(Stirpe et al., Bio/Technology 10:405-12, 1992; Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994; and Sandvig and Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996)。
細胞毒素として有用な細菌毒素の例は、志賀毒素および志賀毒素様毒素(すなわち同一活性または構造を有する毒素)、ならびにその触媒サブユニットおよび生物学的に機能的なフラグメントを含むが、これらに限定されない。これらの細菌毒素はまたタイプ2RIPでもある(Sandvig and Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996; Armstrong, J. Infect. Dis., 171:1042-5, 1995; Kim et al., Microbiol. Immunol. 41:805-8, 1997, and Skinner et al., Microb. Pathog. 24:117-22, 1998)。有用な細菌毒素の付加的例は、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素を含むが、これらに限定されない(Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; and Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994)。毒素酵素サブユニットの切断型および変異体も細胞毒素部分として使用できる(Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994; Mesri et al., J. Biol. Chem. 268:4853-62, 1993; Skinner et al., Microb. Pathog. 24:117-22, 1998;および米国特許番号5,082,927)。他の標的剤は、コリシンA、B、D、E1−9、クロアシンDF13および真菌RNase、α−サルシンを含む、34を超えるRNase毒素の記載されているコリシンファミリーを含むが、これらに限定されない(Ogawa et al. Science 283:2097-100, 1999; Smarda et al., FoliaMicrobiol (Praha) 43:563-82, 1998; Wool et al., Trends Biochem. Sci., 17:266-69, 1992)。
ポルフィリンは、タンパク質に容易に架橋できる周知の光活性化可能毒素である(例えば、米国特許番号5,257,970;米国特許番号5,252,720;米国特許番号5,238,940;米国特許番号5,192,788;米国特許番号5,171,749;米国特許番号5,149,708;米国特許番号5,202,317;米国特許番号5,217,966;米国特許番号5,053,423;米国特許番号5,109,016;米国特許番号5,087,636;米国特許番号5,028,594;米国特許番号5,093,349;米国特許番号4,968,715;米国特許番号4,920,143および国際出願WO93/02192参照)。
ここに提供するコンジュゲートはまた、核酸の標的細胞への送達に使用できる。核酸は、細胞のゲノムの修飾を意図し、それにより遺伝子治療を行うDNAならびにアンチセンス剤として使用するためのDNAおよびRNAを含む。核酸は、アンチセンス剤としての使用が意図されるアンチセンスRNA、DNA、リボザイムおよび他のオリゴヌクレオチドを含む。核酸はまたRNA輸送シグナル、例えばウイルスパッケージング配列も含み得る(例えば、Sullenger et al. (1994) Science 262:1566-1569参照)。核酸はまた無傷遺伝子または遺伝子治療への使用が意図されるタンパク質をコードするDNA分も含む。
アンチセンスヌクレオチドは、相補性配列を有するmRNAに特異的に結合し、それによりmRNAの翻訳を阻止するオリゴヌクレオチドである(例えば、ダンベルアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載するAltman et al.の米国特許番号5,168,053、Inouyeの米国特許番号5,190,931、Burchの米国特許番号5,135,917;Smithの米国特許番号5,087,617およびClusel et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21:3405-3411参照)。三重分子は、二本鎖DNAを標的とし、それにより転写を阻止する一DNA鎖をいう(例えば、二本鎖DNA上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドの製造法を記載する、Hogan et al. の米国特許番号5,176,996参照)。
リボザイムは、メッセンジャーRNAを特異的に開裂するRNA構築物である。RNA鎖の開裂および/またはライゲーションに関与することが知られている少なくとも5クラスのリボザイムがある。リボザイムは、RNA転写物のいずれかに標的化でき、このような転写物を触媒的に開裂できる(例えば、リボザイムおよびその産生方法を記載する米国特許番号5,272,262;米国特許番号5,144,019;およびCech et al. の米国特許番号5,168,053、5,180,818、5,116,742および5,093,246参照)。このようなリボソームのいずれかを、酸性条件下、EGFR関連細胞への送達のために条件依存活性抗EGFR抗体と結合できる。
とりわけ使用を意図する治療産物をコードするDNAは、EGFR関連腫瘍細胞に正確なコピー抗癌剤、例えば腫瘍壊死因子および細胞毒性剤、例えば志賀A1毒素またはサポリンをコードするDNAである。コンジュゲートは核移行配列(NTS)を含むべきである。コンジュゲートが、標的剤および結合したDNAが細胞質内で開裂されるように設計されるならば、NTSは、内部移行により、コンジュゲートが核に輸送されるように、DNAと結合したままであるリンカーの部分に包含されるべきである。核移行配列(NTS)は異種性配列であってよくまたは選択したケモカイン受容体標的剤由来であってよい。典型的コンセンサスNTS配列は、アミノ末端プロリンまたはグリシン、続く少なくとも3個の塩基性残基を、7〜9アミノ酸のアレイで含む(例えば、Dang et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:18019-18023, Dang et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:4048-4054参照)。
ここでの化学的コンジュゲーションを実施するために、標的剤を、核酸に直接的にまたは1個以上のリンカーを介して結合する。核酸を5’末端、3’末端および他のどこかでタンパク質のアミノおよびカルボキシル末端および他の部位とコンジュゲートする方法は当業者に知られる(レビューのために例えば、Goodchild, (1993) In: Perspectives in Bioconjugate Chemistry, Mears, Ed., American Chemical Society, Washington, D.C. pp. 77-99参照)。例えば、タンパク質は、核酸に紫外線照射(Sperling et al. (1978) Nucleic Acids Res. 5:2755-2773; Fiser et al. (1975) FEBS Lett. 52:281-283)、二機能性化学物質(Baeumert et al. (1978) Eur. J. Biochem. 89:353-359; and Oste et al. (1979) Mol. Gen. Genet. 168:81-86)および光化学的架橋(Vanin et al. (1981) FEBS Lett. 124:89-92; Rinke et al. (1980) J.Mol.Biol. 137:301-304; Millon et al. (1980) Eur. J. Biochem. 110:485-492)を使用して結合している。
リンカーLは、共有結合性結合を介して抗体を標的剤に結合する。リンカーは、1個以上の標的剤を抗EGFR抗体に結合し、抗体−薬物コンジュゲート(ADC)を形成するのに使用できる二官能性または多官能性部分である。ADCは、標的剤および抗EGFR抗体に結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して、容易に製造できる。抗EGFR抗体のシステインチオール基またはアミン基、例えば、N末端またはリシン側鎖は、リンカー剤、標的剤または標的剤−リンカー剤の官能基と結合を形成できる。
リンカーは、1個以上のアミノ酸単位を含むペプチド性であり得る。ペプチドリンカー剤は、固相または液相合成方法により製造でき(E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press)、これはペプチド化学の分野で周知であり、自動化合成機、例えばRainin Symphony Peptide Synthesizer(Protein Technologies, Inc.)またはモデル433(Applied Biosystems)上でのt−BOC化学(Geiser et al. “Automation of solid-phase peptide synthesis” in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218)およびFmoc/HBTU化学(Fields, G. and Noble, R. (1990) “Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids”, Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214)を含む。ペプチドベースのリンカーは、タンパク質分解が酵素的であり、酵素が腫瘍細胞内での優先的発現について選択可能であるため、加水分解的または還元的に不安定であるリンカーを超える利益を提供する。カテプシンB開裂可能ペプチドリンカー、バリン−シトルリン(Val−Cit)およびその修飾、例えばマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン(mc−vc)、フェニルアラニン−リシン、Ala−Leu−Ala−Ala(配列番号1201)、他のトリ/テトラペプチドが、ADCにおいて用いられているペプチドリンカーの例である(Dosio et al., (2010) Toxins 3:848-883; Doronina et al., (2006) Bioconjug Chem. 17:114-124; Doronina et al., (2003) Nat Biotechnol. 21:778-784; Sanderson et al., (2005) Clin Cancer Res 11:843-852; Ducry and Stump (2010) Bioconjug Chem. 21:5-13)。非開裂可能ペプチドリンカーの例は、N−メチル−バリン−シトルリンを含む。他のペプチドリンカーは、米国公開番号2011/0020343に記載されている。
ADCはまた、非開裂可能部分または化学的架橋剤であるリンカーを使用しても製造できる。非開裂可能リンカーの例は、アミドリンカーおよびアミド結合およびエステル結合とスクシネートスペーサーを含む(Dosio et al., (2010) Toxins 3:848-883)。化学的架橋リンカーの例は、SMCC(スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート)およびSIAB(スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート)を含む。SMCCは、中程度の長さのシクロヘキサン安定化スペーサーアームの逆末端にNHS−エステル反応基およびマレイミド反応基を含む、アミン−から−スルフヒドリルクロスリンカーである。SIABは短い、アミン−から−スルフヒドリルコンジュゲーションのためのNHS−エステルおよびヨードアセチルクロスリンカーである。架橋剤の他の例は、チオエーテルリンカー、化学的に不安定なヒドラゾンリンカー、4−メルカプト吉草酸、BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC−SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SMPB、SMPH、スルホ−EMCS、スルホ−GMBS、スルホ−KMUS、スルホ−MBS、スルホ−SIAB、スルホ−SMCCおよびスルホ−SMPBおよびSVSB(スクシンイミジル−(4−ビニルスルホン)ベンゾエート)およびビス−マレイミド剤、例えば市販のDTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3およびBM(PEO)4(Pierce Biotechnology, Inc.)を含むが、これらに限定されない。ビス−マレイミド剤は、抗体のシステイン残基の遊離チオール基の、チオール含有標的剤またはリンカー中間体への、連続的または同時的形式での結合を可能にする。他のチオール反応性官能基は、マレイミド以外に、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネートおよびイソチオシアネートを含む。他のリンカーの例および使用方法は、米国公開番号2005/0276812およびDucry and Stump (2010) Bioconjug Chem. 21:5-13に記載されている。
ここに提供される抗EGFR抗体は、非腫瘍微小環境と比較した、腫瘍微小環境における選択的およびゆえに条件依存活性の発現に基づき選択する。このような抗体は、2個の異なる腫瘍微小環境または非腫瘍微小環境において存在する条件を模倣または反映する条件下の、抗体の活性を比較するまたは抗体の採集をする、スクリーニング方法または他の方法により同定できる。同定された抗体またはその抗原結合フラグメントを、例えば、治療有効性、EGFRに対する親和性、毒性、副作用、薬物動態および薬力学のような臨床的特性を評価するために、当業者に知られる多様なアッセイでさらに特徴付けできる。
例えば、抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体を、EGFRに結合する能力についてアッセイできる。ここに提供する抗EGFR抗体は、当業者に知られるあらゆる方法により、EGFRと結合するそれらの能力を評価できる。アッセイの例をここで下に記載する。ある例において、EGFRのフラグメントまたは変異体をここに提供するアッセイに使用できる。例えば、EGFRは可溶性タンパク質として発現できる。例えば、ここに記載するアッセイで使用できる可溶性EGFRは、可溶性EGF受容体細胞外ドメイン(sECD)である。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の活性を評価するためのアッセイは、抗EGFR抗体のEGFRへの結合を一方または両者が固相支持体に結合する条件下で測定する結合アッセイを含む。例えば、溶液中の抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体を、固相支持体に固定したEGFRと相互作用させてよくまたは溶液中のEGFRを固相支持体に固定化した修飾抗EGFR抗体と相互作用させてよい。固相支持体結合アッセイは、固相への固定化が、結合抗EGFR抗体の未結合抗EGFR抗体からの分離を容易にするため、溶液結合アッセイと比較して有利であり得る。表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法およびELISAを含む、当業者に知られるあらゆる固相支持体結合アッセイがここに提供する方法における使用が意図される。
表面プラズモン共鳴(SPR)は、サンプル中の分析物分子の固定化分子への分子結合により起こる、屈折率変化の測定により、高度に感受性のアッセイにおいて未標識分子の結合を検出できる(Piliarik et al., (2009) Methods Mol Biol. 503:65-88)。SPRは、表面プラスモンが波打つときに起こり、これは、金属における電子の集団振動であり、金属/誘電体界面で励起する。SPRは、角度および波長の特異的組み合わせで、反射光強度を減少させる。分子結合は、金属フィルム上の極薄有機(誘電体)層の屈折率および厚さを変えることができ、これはSPR共鳴条件を変える。
ここに提供する修飾抗EGFR抗体の活性を、バイオレイヤー干渉法による抗体のEGFRへの結合の測定により評価できる。バイオレイヤー干渉法は、バイオセンサーチップ上の固定化生体分子層および内部参照層の2個の表面から反射される可視光の干渉パターンを測定することにより、生体分子相互作用を検出するための、無標識方法である。溶液での分子の固定化生体分子への結合は生体分子層の厚さを増加させ、これが波長シフトをもたらす。結合後、固定化生体分子を緩衝液溶液と接触させ、分子の解離を測定できる。固定化生体分子への結合はリアルタイムに測定でき、会合速度定数、解離速度定数、結合親和性および結合特異性を決定できる。例えば、ストレプトアビジンをバイオレイヤーに結合でき、ビオチニル化sEGFRをストレプトアビジンバイオレイヤーと結合できる。適切な緩衝液中の抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体をバイオレイヤーに添加し、sEGFRと接触させ得る。抗EGFR抗体の濃度を経験的にまたは当業者に知られた因子、例えば近接予測解離定数、抗体の溶解度、温度および緩衝液条件に基づき選択できる。sEGFRと抗EGFR抗体の結合は、光学層およびバイオレイヤーから反射された光から産生された干渉パターンの変化の測定により定量できる。結合動態は、結合速度定数の計算のために測定する。解離速度定数の測定のために、センサーを適切な緩衝液中でインキュベートし、抗EGFR抗体およびEGFRの解離を測定し得る。抗EGFR抗体の結合親和性を、動力学的解離速度定数と動力学的会合速度定数の比として計算できる。修飾抗EGFR抗体とEGFRの間の解離定数を測定するためのバイオレイヤー干渉法アッセイの例を実施例5に記載する。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の結合の分析に使用できる免疫アッセイは、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、メソスケールディスカバリー(MSD, Gaithersburg, Maryland)、“サンドイッチ”免疫アッセイ、免疫沈殿アッセイ、ELISPOT、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定化アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、タンパク質A免疫アッセイ、免疫組織化学または免疫電子顕微鏡のような、しかしこれらに限定されない技術を使用する、競合的および非競合的アッセイ系を含む。このようなアッセイは日常的であり、当分野で周知である(例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるAusubel et al., Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York参照)。他のアッセイ形式は、特異的分子(例えば、抗体)と結合し、被包試薬またはマーカーを放出するために設計されたリポソームを使用する、リポソーム免疫アッセイ(LIA)を含む。次いで、放出された化学物を標準技術に従い検出する(Monroe et al., (1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41参照)。限定することを意図しない免疫アッセイの例を、下に簡単に記載する。
抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体とEGFRの間の結合を、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)により検出できる。ELISAは、タンパク質/リガンド相互作用、例えば抗体/抗原相互作用検出のために使用できる免疫学的アッセイである。典型的に、ELISAにおいて、抗体/抗原相互作用を、抗体/抗原複合体に直接的または間接的に結合した酵素マーカーからのシグナルの測定により検出する。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の活性を、免疫沈殿によるEGFRへの結合の検出により評価できる。免疫沈殿プロトコルは、一般に溶解緩衝液、例えば1%NP-40 Alternative、20mM Tris(pH8.0)、137mM NaCl、10%グリセロール、2mM EDTA、1mM活性化オルトバナジン酸ナトリウム、10μg/mL アプロチニン、10μg/mL ロイペプチン;またはRIPA緩衝液(1%NP−40またはTriton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム、pH7.2、1%トラジロール)で細胞集団を溶解することを含む。溶解緩衝液は、タンパク質ホスファターゼおよび/またはプロテアーゼ阻害剤(例えば、EDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム)を補い得る。付加的工程は、修飾抗EGFR抗体の細胞ライセートへの添加、および一定時間(例えば、1〜4時間)、40℃でのインキュベーション、タンパク質Aおよび/またはタンパク質Gセファロースビーズの細胞ライセートへの添加、約1時間またはそれ以上、40℃でのインキュベーション、ビーズの溶解緩衝液での洗浄およびビーズのSDS/サンプル緩衝液への再懸濁を含む。修飾抗EGFR抗体がEGFRを免疫沈殿させる能力を、例えば、ウェスタンブロット分析により評価できる。当業者は、抗体の抗原への結合を高め、背景を下げるために修飾できるパラメータについて熟知している(例えば、細胞ライセートのセファロースビーズでの予洗)。免疫沈殿プロトコルに関するさらなる議論について、例えば、Ausubel et al., Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1参照。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の活性を、EGFRへの結合をウェスタンブロットで検出することにより評価できる。ウェスタンブロット分析は、一般に抽出物サンプルの調製(例えばEGFRを発現する組織または抗EGFR抗体の投与により処置できる疾患または障害、例えばここに記載する疾患または障害を有する対象または患者からの組織)を含む。付加的工程は、ポリアクリルアミドゲル(例えば、抗原分子量によって8%〜20%SDS−PAGE)または2−Dゲル電気泳動(例えば、WO04/043276参照)でのサンプルの電気泳動、サンプルのポリアクリルアミドゲルから膜、例えばニトロセルロース、PVDFまたはナイロンへの移動、膜のブロッキング溶液(例えば、3%BSAまたは脱脂乳含有PBS)でのブロッキング、膜の洗浄緩衝液(例えば、PBS−Tween 20)での洗浄、膜のブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体(すなわち目的の抗体)でのプロービング、膜の洗浄緩衝液での洗浄、膜の、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)または放射性分子(例えば、32Pまたは125I)とコンジュゲートした二次抗体(一次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体)でのプロービング、膜の洗浄緩衝液での洗浄および抗原の存在の検出を含む。当業者は、検出シグナルを高め、背景ノイズを下げるために修飾できるパラメータについて熟知している。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる議論について、例えば、Ausubel et al., Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1参照。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の活性は、EGFRへの結合の免疫組織化学による検出により評価できる。免疫組織化学は、一般に組織サンプルの調製(例えばEGFRを発現する組織または抗EGFR抗体の投与により処置できる疾患または障害、例えばここに記載する疾患または障害を有する対象または患者からの組織から)、タンパク質分子をその天然立体配座に保存するための組織の固定、組織を透過するためのサンプルの透過処理試薬(例えばTween、Nonidet P40)への入浴、サンプルのブロッキング溶液(例えば、3%BSAまたは脱脂乳含有PBS)でのブロッキング、サンプルの洗浄緩衝液(例えば、PBS−Tween 20)での洗浄、サンプルの、ブロッキング緩衝液で希釈した抗EGFR抗体(例えばここに記載する修飾抗EGFR抗体)でのプロービング、サンプルの洗浄緩衝液での洗浄、サンプルの、ブロッキング緩衝液で希釈した蛍光色素(例えばフルオレセインイソチオシアネート、Alexa fluor、ローダミン)とコンジュゲートした二次抗体(抗EGFR抗体を認識)でのプロービング、サンプルの洗浄緩衝液での洗浄および蛍光顕微鏡を介する抗原の存在の検出を含む。当業者は、検出シグナルを高め、背景ノイズを下げるために修飾できるパラメータについて熟知している。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の活性を、EGFRへの結合の放射免疫アッセイによる検出により評価できる。修飾抗EGFR抗体の抗原、例えばEGFRへの結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフ速度を、例えば、競合的結合アッセイにより決定できる。競合的結合アッセイの一例は、存在する未標識抗原の量を増やしながら、目的の抗体と標識抗原(例えば、3Hまたは125I)をインキュベーションし、標識抗原に結合した抗体を検出することを含む、放射免疫アッセイである。ここに提供する抗EGFR抗体のEGFRに対する親和性および結合オフ速度を、スキャッチャードプロット分析によりデータから決定できる。第二抗体との競合はまた放射免疫アッセイを使用しても決定できる。この場合、EGFR抗原、例えばEGFR可溶性フラグメントを、存在する未標識第二抗体の量を増やしながら、標識化合物(例えば、3Hまたは125I)とコンジュゲートしたここに提供する抗EGFR抗体とインキュベートする。
溶液結合アッセイを、ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の活性の測定に使用できる。ある例において、溶液結合アッセイを、抗EGFR抗体のEGFRまたはフラグメントまたはその変異体、例えば可溶性EGFRフラグメントへの結合の測定に使用する。当業者はここに提供する修飾抗EGFR抗体の結合を測定するために溶液結合アッセイを選択できる。以下は、使用できる溶液結合アッセイの例の簡単な記載である。しかしながら、これらは限定的であることを意味せず、当業者に知られるあらゆる溶液結合アッセイが、ここに提供する方法における使用のために意図され、平衡透析、競合的結合アッセイ(例えば、Myers et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、放射標識結合アッセイ(例えば、Feau et al., (2009) J. Biomol. Screen. 14(1):43-48)、熱量測定(等温滴定熱量測定(ITC)および示差走査熱量測定(例えば、Perozzo et al., (2004) J. Recept Signal. Transduct Res. 24(1-2):1-52; Holdgate (2001) Biotechniques 31(1):164-166, 168, 170), Celej et al. (2006) Anal. Biochem. 350(2):277-284)を含む)および蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを含むスペクトル蛍光アッセイを含む。結合活性を溶液で測定するときのここでの方法の条件は、本明細書の記載に基づき当業者が決定できる。例えば、条件は、固相支持体上で実施する結合アッセイについて上記した条件から適合できる。
抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の活性を、EGFRへの結合の等温滴定熱量測定(ITC)による検出により評価できる。ITCにおいて、一結合パートナーを、他の結合パートナーを含む溶液中に滴定し、それにより発熱または吸熱がおこり、これを熱量計で定量する。ITCは、ナノモルまたはそれ未満の量の反応物からの熱効果の検出に使用できる。例えば、等温滴定熱量測定アッセイを、治療的タンパク質の同族結合パートナーへの結合に関与する、結合の自由エネルギー(ΔG)、結合のエンタルピー(ΔH)およびエントロピー(ΔS)および熱容量変化(ΔCp)を含む、全熱力学的パラメータの測定に使用できる。これらの特性の分析は、修飾抗EGFR抗体とEGFRの間の結合の活性および熱力学的パラメータの解明を助ける(Perozzo et al., (2004) J. Recept. Signal. Transduct. Res. 24(1-2):1-52)。ITCを使用したEGFRへの結合の検出による抗EGFR抗体の活性の測定は当業者の能力の範囲内である(例えば、Alvarenga et al. (2012) Anal. Biochem 421(1):138-151参照)。
スペクトルアッセイを、ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の活性測定に使用できる。抗EGFR抗体およびEGFRの結合は、UV−visスペクトル技術、蛍光アッセイ例えば蛍光共鳴エネルギー移動アッセイおよび蛍光消光アッセイを含む、当業者に知られるあらゆるスペクトルアッセイにより検出できる(Wu et al. (2007), J. Pharm. Biomed. Anal.44(3):796-801)。例えば、抗EGFR抗体EGFRへの結合の結果としての蛍光またはUV/vis吸収の変化、例えば固有蛍光の消光を検出できる。ある例において、抗EGFR抗体および/またはEGFRを、蛍光標識またはUV/vis標識で標識できる。抗EGFR抗体の標識は当業者の能力の範囲内である(例えば、Gleysteen et al. (2008) Head & Neck 30(6):782-789; Rosenthal et al. (2007) Mol. Cancer Ther. 6:1230-1238参照)。スペクトルシグナル測定後、観察された結合定数を計算できる(例えば、Zhang et al. (2009) Spectrochim Acta A Biomol. Spectrosc. 72(3):621-626)。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の活性を測定するためのアッセイは、細胞アッセイを含む。使用できる細胞株は、文献に記載されたあらゆる細胞株または寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection(ATCC)から得ることができる細胞株を含む。当業者は、所望の特性の細胞株を選択できる。一般に、アッセイは、EGFRを発現することが知られた細胞株を使用して行う。このような細胞は当業者に知られる。例えば、細胞株を同定するために、ATCCカタログ(atcc.org)を参考とし得る。また、特定の細胞型が望ましいならば、このような細胞および/またはその直ちに入手可能な起源を得る手段は当業者に知られる。科学論文の分析は、EGFRを発現する細胞の適当な選択を容易に明らかにし得る。ここに提供する抗EGFR抗体をスクリーニングする細胞アッセイにおいて使用できるEGFRを発現する細胞株の例は、DiFiヒト結腸直腸癌細胞、A431細胞(ATCC CRL−1555)、Caco−2結腸直腸腺癌細胞(ATCC HTB−37)、HRT−18結腸直腸腺癌細胞(ATCC CCL−244)、HT−29結腸直腸腺癌細胞(ATCC HTB−38)、ヒト新生児ケラチン生成細胞およびMCF10A上皮性細胞(ATCC CRL−10317)を含む(例えば、Olive et al. (1993) In Vitro Cell Dev Biol. 29A(3 Pt 1):239-248; Wu et al. (1995) J. Clin. Invest. 95(4): 1897-1905参照)。ここに記載する細胞アッセイで使用できる細胞の例は、例えば、ここに記載されている腫瘍または癌細胞を含む、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる細胞を含む。
動物モデルを使用するインビボを、ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の治療活性を評価するために実施できる。抗EGFR抗体を、抗EGFR抗体、例えばここに提供する修飾抗EGFR抗体での治療が考慮される疾患および状態の動物モデルに投与し得る。このような動物モデルは当分野で知られ、ヒト癌外植片または継代された異種移植片組織が免疫無防備状態動物、例えばヌードまたはSCIDマウスに導入された異種間癌モデルを含むが、これに限定されない(例えば、Klein. et al. (1997) Nature Medicine 3:402-408参照)。有効性を、腫瘍形成、腫瘍収縮または転移の阻害を測定するアッセイを使用して、予測できる。動物モデルはまた、ここに提供する抗EGFR抗体の副作用の評価にも使用できる。
安全性および耐容性を評価するための試験も当業者に知られており、ここで使用できる。抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の投与後、あらゆる有害反応、例えばここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる有害反応をモニターできる。動物試験を、有害副作用、例えば標準的薬理学プロファイルで評価できないまたは修飾抗EGFR抗体の反復投与後にしか生じない副作用の評価のために実施できる。ある例において、このようなアッセイを2種 −− 例えば、齧歯類および非齧歯類 −− で行い、何らかの予期されない有害作用が見過ごされてないことを隔日にする。一般に、これらのモデルは、遺伝毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖/発生毒性、発癌性を含む多様な毒性を測定できる。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の薬物動態(PK)および薬力学(PD)アッセイを、ここに記載するまたは当分野で知られた方法を使用して実施できる(例えば、Klutchko, et al., (1998) J. Med. Chem. 41:3276-3292参照)。測定パラメータの例は、一般に投与後の最大(ピーク)血漿濃度(Cmax)、ピーク時間(すなわち最大血漿濃度が生じるとき;Tmax)、最小血漿濃度(すなわち投与間の最小血漿濃度;Cmin)、排出半減期(T1/2)および曲線下面積(すなわち時間対血漿濃度のプロットにより作成した曲線下面積;AUC)を含む。投与された修飾抗EGFR抗体の絶対バイオアベイラビリティを、皮下送達後の曲線下面積(AUCsc)と静脈内送達後のAUC(AUCiv)の比較により決定できる。絶対バイオアベイラビリティ(F)を式:F=([AUC]sc×投与量sc)/([AUC]iv×投与量iv)を使用して計算できる。投与後の血漿中の抗EGFR抗体の濃度を、血液サンプル中の抗体の濃度の評価に適する当分野で知られるあらゆる方法を使用して測定できる。方法の例は、ELISAおよび比濁分析を含むが、これらに限定されない。付加的測定パラメータは、i.v.投与後に得た濃度−時間データおよびバイオアベイラビリティのコンパートメント解析を含む。体内分布、線量測定(放射標識抗体またはFc融合物について)およびPK試験も、齧歯類モデルを含む、ここに記載するまたは当分野で知られる動物モデルを含む動物モデルで実施できる。このような試験は、投与されたいくつかのまたは全投与量の耐容性、局所組織への毒性、齧歯類異種移植片動物モデルへの優先的局在化および標的細胞(例えばCD20陽性細胞)の枯渇を評価できる。薬力学的試験は、特異的腫瘍細胞標的またはシグナル伝達機構ブロッキング、EGFR発現細胞またはシグナルの枯渇を含み得るが、これらに限定されない。
1. 条件依存性治療用タンパク質の同定
非病的微小環境(例えば健常または正常環境)よりも病的微小環境で活性である条件依存活性治療用タンパク質、例えば抗体、例えばここに提供する修飾抗EGFR抗体を、種々の環境において存在する条件下、活性の定量および評価を可能にするあらゆるアッセイにより同定できる。このようなアッセイは上のセクションDに記載する。活性を比較し、正常環境(または非病的または正常環境において存在する条件下)よりも病的微小環境(または病的環境において存在する条件下)で活性である治療用タンパク質を同定できる。結果は、望まない全身効果、例えば副作用または望まない活性が減少または最小化されるように、活性が病的微小環境に条件依存標的化されている治療用タンパク質の同定である。
抗EGFR抗体、例えばここに提供する修飾抗EGFR抗体を標準的細胞培養および当分野で知られる他の発現系で発現できる。ここに提供する方法において使用する前に、タンパク質を精製してよい。あるいは、全上清または希釈上清を、ここでの二重アッセイでスクリーニングしてよい。
ベクターの選択は所望の適用に依存し得る。抗EGFR抗体またはその一部、例えば抗原結合フラグメントの発現のために、多くの発現ベクターが利用可能であり、当業者に知られる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択に影響を受ける。このような選択は十分に当業者のレベルの範囲内である。一般に、発現ベクターは転写プロモーターおよび所望によりエンハンサー、翻訳シグナルおよび転写および翻訳終止シグナルを含み得る。安定な形質転換に使用する発現ベクターは、典型的に形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択可能マーカーを有する。いくつかの例では、複製起点を、細胞内のベクターのコピー数の増幅に使用できる。ベクターはまた一般にライゲートした核酸分子と列操作可能に結合した付加的ヌクレオチド配を含み得る(例えばHisタグ、Flagタグ)。抗体での適用のために、ベクターは、一般には、定常領域をコードする配列を含む。それゆえに、抗体またはその一部はまたタンパク質融合体として発現され得る。例えば、融合体を、ポリペチドに付加的機能性を付加するために産生できる。融合タンパク質の例は、シグナル配列、例えば局在化のための、エピトープタグ、例えばHis6タグまたはmycタグまたは精製のためのタグ、例えば、GST融合体およびタンパク質分泌および/または膜結合を指向する配列の融合体をい含むが、これらに限定されない。
一般に、異種性DNAを発現するように操作でき、分泌経路を有する細胞型のいずれかが、ここに提供する修飾抗EGFR抗体の発現に適する。発現宿主は、原核生物および真核生物、例えば細菌細胞(例えば大腸菌)、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞を含む動物細胞を含む。発現宿主は、タンパク質産生レベルならびに発現タンパク質上に存在する翻訳後修飾にタイプが異なり得る。さらに、発現宿の選択は、しばしば使用するベクターおよび転写および翻訳エレメントの選択に関連する。例えば、発現宿主の選択は、しばしば、しかし常にではないが、使用する前駆体配列の選択による。例えば、多くの異種性シグナル配列は、同一種の宿主細胞においてしか発現できない(すなわち、昆虫細胞シグナル配列は昆虫細胞中で至適に発現される)。対照的に、例えば、酵母、昆虫または哺乳動物宿主細胞で十分に作用するヒト血清アルブミン(hHSA)シグナル配列および昆虫および哺乳動物細胞で機能的であることが証明されている組織プラスミノーゲンアクティベータープレ/プロ配列のような、他のシグナル配列を異種性宿主で使用できる(Tan et al., (2002) Protein Eng. 15:337)。発現宿主の選択はこれらおよび他の因子、例えば制御および安全性考察、生産費用および精製の必要性および方法に基づきなし得る。それゆえに、ベクター系は、使用する宿主細胞と適合性でなければならない。
原核生物、特に大腸菌は、大量の修飾抗EGFR抗体またはその一部を産生するシステムを提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の単純かつ迅速な技術である。大腸菌の発現ベクターは、高レベルのタンパク質発現誘発および宿主細胞に幾分毒性であるの発現に有用である誘導型プロモーターを含む。誘導型プロモーターの例は、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6 RNAプロモーターおよび温度制御λPLプロモーターを含む。
酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウイア・リポリティカ、クルイベロミセス・ラクチスおよびピキア・パストリスは、組み換え抗体またはその一部のための有用な発現宿主である。酵母を、エピソーム複製ベクターでまたは相同組み換えによる安定な染色体組込みにより形質転換できる。典型的に、誘導型プロモーターを遺伝子発現制御に使用する。このようなプロモーターの例は、AOX1、GAL1、GAL7およびGAL5およびメタロチオネインプロモーター、例えばCUP1を含む。発現ベクターは、しばしば、形質転換DNAの選択および維持のための選択可能マーカー、例えばLEU2、TRP1、HIS3およびURA3を含む。酵母でのタンパク質発現は可溶性である。シャペロニン、例えばBipおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現は発現レベルおよび溶解度を改善できる。さらに、酵母でのタンパク質発現は、分泌シグナルペプチド融合体、例えばサッカロマイセス・セレビシエからの酵母接合型アルファ−因子分泌シグナルおよび酵母細胞表面タンパク質、例えばAga2p接合接着受容体またはArxula adeninivoransのグルコアミラーゼとの融合体を使用して、分泌を指示できる。例えばKex−2プロテアーゼのためのプロテアーゼ開裂部位を、分泌経路に存在するために、発現ポリペチドからの融合配列を除去するために操作できる。酵母はまたAsn−X−Ser/Thrモチーフでグリコシル化できる。
特にバキュロウイルス発現を使用する昆虫細胞は、修飾抗EGFR抗体またはその一部の発現に有用である。昆虫細胞は高レベルのタンパク質を発現し、高級真核生物で使用されるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、拘束性宿主範囲を有し、これは真核生物発現の安全性を高め、制御懸念を減らす。典型的発現ベクターは、高レベル発現のためのプロモーター、例えばバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターおよびp10プロモーターを使用する。一般に使用されるバキュロウイルス系は、バキュロウイルス、例えばキンウワバ科核多核体病ウイルス(AcNPV)およびカイコ核多核体病ウイルス(BmNPV)および昆虫細胞株例えばヨトウガ由来のSf9およびイラクサギンウワバ由来のTNを含む。高レベル発現のために、発現する分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンの直ぐ下流に融合できる。ヒト抗体を発現できるバキュロウイルス組み換え体の産生のために、デュアル発現伝達、例えばpAcUW51(Phar Mingen)を使用する。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞で的確に処理され、発現タンパク質の培養培地への分泌に使用できる。
哺乳動物発現系を、その抗原結合フラグメントを含む抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の発現に使用できる。発現構築物は、ウイルス感染、例えばアデノウイルスまたは直接DNA伝達、例えばリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストランおよび物理的手段、例えばエレクトロポレーションおよび微量注入により哺乳動物細胞に伝達される。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、典型的にmRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列(コザック・コンセンサス配列)およびポリアデニル化エレメントを含む。このようなベクターはしばしば高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばSV40プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスの末端反復配列(RSV)を含む。これらのプロモーター−エンハンサーは多くの細胞型で活性である。組織および細胞タイプ・プロモーターおよびエンハンサー領域も発現に使用できる。プロモーター/エンハンサー領域の例は、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ1抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御のような遺伝子由来のものを含むが、これらに限定されない。選択可能マーカーを使用して、発現構築物を有する細胞を選択および維持できる。選択可能マーカー遺伝子の例は、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。修飾抗EGFR抗体は、例えば、NEOR/G418系、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)系またはグルタミンシンテターゼ(GS)系を使用して産生できる。GSシステム使は、共同発現ベクター、例えばpEE12/pEE6を使用し、重鎖および軽鎖の両者を発現する。細胞表面シグナル伝達分子、例えばTCR−ζおよびFcεRI−γとの融合は、細胞表面上に活性状態のタンパク質の発現を指示できる。
トランスジェニック植物細胞および植物を、ここに記載されている抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体またはその一部の発現に使用できる。発現構築物は、典型的に直接DNA伝達、例えば微粒子銃およびプロトプラストへのPEG介在伝達およびアグロバクテリウム介在形質転換を使用して、植物に伝達される。発現ベクターはプロモーターおよびエンハンサー配列、転写終止エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常双子葉植物宿主、例えばアラビドプシス属およびタバコおよび単子葉植物宿主、例えばトウモロコシおよびイネを分ける。発現に使用する植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスCaMV 35Sプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターおよびメイズユビキチン−1(ubi−1)プロモータープロモーターを含む。選択可能マーカー、例えばハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼはしばしば形質転換細胞の選択および維持を促進するために使用される。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体(カルス組織)または全植物に再生されて培養に維持できる。トランスジェニック植物細胞はまたプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの産生のために操作された藻類を含む(例えば、Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442参照)。植物が哺乳動物細胞と異なるグリコシル化パターンを有するため、これは、これらの宿主で産生するタンパク質の選択に影響し得る。
抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体およびその抗原結合部分は、当業者に知られるまたはここに記載されているあらゆる方法により精製できる。タンパク質は、SDS−PAGE、サイズフラクションおよびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはカラムクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない、当分野で知られる標準的タンパク質精製技術を使用して、相当な純度まで精製できる。例えば、抗体は、カラムクロマトグラフィーにより精製できる。ここに提供する抗EGFR抗体を精製する方法の例は、カラムクロマトグラフィーを使用するものであって、ここで、固相支持体カラム物質が、免疫グロブリンと高親和性で結合する、ストレプトコッカス属の細胞表面関連タンパク質であるタンパク質Gに結合している。ある例において、抗EGFR抗体はカラムクロマトグラフィーにより精製でき、ここで、固相支持体カラム物質は、免疫グロブリン、例えばIgG抗体と高親和性で結合するスタフィロコッカス属の細胞表面関連タンパク質であるタンパク質Aと結合している(例えば、Liu et al. (2010) MAbs 2(5):480-499参照)。ここに提供する抗EGFR抗体の精製に使用できる他の免疫グロブリン結合細菌タンパク質は、タンパク質Aおよびタンパク質GのIgG結合ドメインを合わせた組み換え融合タンパク質であるタンパク質A/G;およびペプトストレプトコッカス属の表面タンパク質であるタンパク質Lを含む(Bjorck (1988) J. Immunol., 140(4):1194-1197; Kastern, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267(18):12820-12825; Eliasson et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:4323-4327)。
1. 医薬組成物および製剤
抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの医薬組成物が投与のためにここで提供される。薬学的に許容される組成物は、動物およびヒトにおける使用のための一般に認識されている薬局方に従い製造された、規制当局または他の機関の承認を考慮して製造される。典型的に、化合物は、当分野で周知の技術および方法を使用して、医薬組成物に製剤される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126参照)。
抗EGFR抗体または抗EGFR抗体またはその誘導体または生物学的に活性な一部をコードする核酸の医薬組成物は、パッケージング物質、抗EGFR抗体の投与により処置できる疾患または状態、例えばここに記載するまたは当分野で知られる疾患および状態の処置に有効である医薬組成物および抗体または核酸分子が感染、疾患または障害の処置に使用するものであることを示すラベルを含む製品として包装できる。医薬組成物は、一回投与量または多回投与量のための医薬組成物の一定量を含む単位投与形態で包装できる。包装された組成物は、投与前に再構成(例えば水または食塩水で)できる、提供される修飾抗EGFR抗体を含む医薬組成物の凍結乾燥粉末を含み得る。
提供されるのは、ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体および第二剤、例えば第二抗EGFR抗体または他の治療剤または診断剤の組み合わせ剤である。組み合わせ剤は、ここに提供する方法に従い治療を行うための任意の抗EGFR抗体または試薬を含み得る。例えば、組み合わせ剤は、任意の抗EGFR抗体および化学療法剤を含み得る。組み合わせ剤はまたここに提供する抗EGFR抗体と1種以上の付加的治療用抗体も含み得る。例えば、付加的治療剤は抗癌剤、例えばセクションGに記載するような化学療法剤である。提供される修飾抗EGFR抗体の組み合わせ剤は、ここに記載する抗EGFR抗体または抗EGFR抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を含む医薬組成物を含む。ここに提供する組み合わせ剤は、単一組成物または別々の組成物として製剤できる。
ここに提供する抗EGFR抗体またはそのフラグメントは、抗EGFR抗体の使用について当業者に知られるあらゆる目的のために使用できる。例えば、ここに記載する抗EGFR抗体は、治療、診断、産業および/または研究目的の一つ以上のために使用できる。特に、ここに提供する方法は、ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の治療的使用のための方法を含む。ある例において、ここに記載する抗EGFR抗体は、EGFRを含む標的細胞、例えば、例えば癌細胞を死滅させるために使用できる。ある例において、抗EGFR抗体はEGFRを遮断、アンタゴナイズまたはアゴナイズできる。このような活性により、ここに提供する抗EGFR抗体またはそのフラグメントは、腫瘍、癌または転移を含むが、これらに限定されない抗EGFR抗体での処置に応答性の状態のいずれかの処置のために、患者または対象に投与できる。治療的使用は、治療有効量の抗EGFR抗体の、単独または他の処置または薬剤と組み合わせた投与を含む。
ここに記載する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体は、抗体、例えば抗EGFR抗体を使用できる任意の治療的目的に使用できる(例えば、Reeves et al. (2011) Otolaryngol Head Neck Surg. 144(5):676-84; Adams et al. (2008) Expert Rev Anticancer Ther. 8(8):1237-45; Belda-Iniesta et al. (2006) Cancer Biol Ther. 5(8):912-4; Liu et al. (2010) Cancer Chemother Pharmacol. 65(5):849-61参照)。ある例において、抗EGFR抗体は、抗EGFR抗体で処置できる疾患または障害を有する患者に投与する。ある例において、疾患の処置は、疾患の症状に対抗するための、疾患の臨床的顕在化後のここに記載する抗EGFR抗体の投与を含む。ある例において、ここに記載する抗EGFR抗体の投与は、疾患根絶のために投与する。ここに記載する修飾抗EGFR抗体で処置できる疾患または障害の例は、自己免疫性および炎症性疾患、感染症および癌を含む。
EGFRは、多様なヒト悪性腫瘍、例えば肺癌、頭頸部癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌および神経膠腫における癌発生および進行と関連する。EGFR関連分子因子、例えばコピー数および遺伝子変異が、癌の予後および予測因子として同定されている(例えば、Bronte et al. (2011) Front Biosci. 3:879-887; Harding and Burtness (2005) Drugs Today 41(2):107-127参照)。例えば、高EGFR発現は、頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)の患者の予後不良と関連する(Szabo et al. (2011) Oral Oncol. 47(6):487-496)。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体および抗体そのフラグメントは、対象における非癌過増殖性疾患の処置に使用できる。EGFRは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、サイトカイン、受容体チロシンキナーゼおよびインテグリンから多様な細胞応答、例えばマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化、遺伝子転写および増殖へのシグナル伝達における重要な経路要素である。リガンドEGFRへの結合は、細胞質チロシン残基の自己リン酸化を誘発し、これは、細胞増殖に至る細胞経路を活性化できる。過発現および/または過刺激が超増殖を起こし得る。例えば、EGFRvIII変異により、EGFR受容体が構成的に活性なキナーゼ機能を有し、細胞増殖を刺激する。抗EGFR抗体が非癌過増殖性障害を処置できることは当分野で知られている。例えば、胃の希な、前悪性、非癌性、過増殖性障害であるメネトリエ病はセツキシマブで処置できる(Fiske et al. (2009) Sci Trasl. Med. 1(8): 8ra18; Myers et al.(2012) Mol. Cell. Proteomics 11:10.1074/mcp.M111.015222, 1-15)。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体および抗体そのフラグメントは、自己免疫性疾患または障害の処置に使用できる。ここに記載する抗EGFR抗体で処置できる自己免疫性疾患または障害の例は、同種異系間島移植拒絶反応、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、抗好中球細胞質自己抗体(ANCA)、副腎の自己免疫性疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性蕁麻疹、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン症候群、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群、慢性炎症性脱髄性ポリニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素疾患、クローン病、皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、必須混合型クリオグロブリン血症、第VIII因子不全、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、グッドパスチャー症候群、移植片−対−宿主疾患(GVHD)、橋本甲状腺炎、血友病A、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgAニューロパシー、IgM多発神経障害、免疫仲介血小板減少症、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合型結合組織疾患、多発性硬化症、I型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、ポリ腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、ポリ筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、固体臓器移植片拒絶、スティッフマン症候群、全身エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、例えば疱疹状皮膚炎、脈管炎、白斑症およびウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体および抗体そのフラグメントは、炎症性疾患または障害の処置に使用できる。ここに提供する修飾抗EGFR抗体により処置できる炎症性障害は、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、急性敗血症性関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性脈管炎、アレルギー、喘息、アテローム性動脈硬化症、慢性細菌またはウイルス感染による慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、冠動脈疾患、脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨溶解、急性および遅延性過敏症反応と関連する炎症、腫瘍と関連する炎症、末梢神経傷害または脱髄性疾患、組織外傷、例えば熱傷および虚血と関連する炎症、髄膜炎による炎症、多臓器傷害症候群、肺線維症、敗血症および敗血症性ショック、スティーブンス・ジョンソン症候群、未分化関節症および未分化脊椎関節症を含むが、これらに限定されない。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体および抗体そのフラグメントは、感染症の処置に使用できる。ここに記載する抗EGFR抗体で処置できる感染症は、病原体、例えばウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生虫が原因の疾患を含むが、これらに限定されない。感染症は、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、デング、エプスタイン・バー、ハンタ、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、I型単純ヘルペス、II型単純ヘルペス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、インフルエンザ、麻疹、ムンプス、パポーバウイルス、ポリオ、呼吸器多核体ウイルス、牛疫、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹、SARSウイルス、天然痘およびウイルス性髄膜炎を含むウイルスが原因であり得る。感染症はまた、バチルス・アントラシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・トラコマチス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・テタニ、ジフテリア、大腸菌、レジオネラ、ヘリコバクター・ピロリ、マイコバクテリウム・リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、百日咳、シュードモナス・エルジノーサ、シュードモナス・ニューモニア、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、ビブリオ・コレラエおよびエルシニア・ペスチスを含む細菌が原因でもある。感染症はまた真菌、例えばアスペルギルス・フミガーツス、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ・アルビカンス、コクシジオイデス・イミチス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツムおよびペニシリウム・マルネッフェイが原因でもあり得る。感染症はまた原虫および寄生虫、例えばクラミジア、コクシジウム(kokzidiose)、リーシュマニア、マラリア、リケッチアおよびトリパノソーマが原因であり得る。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体および抗体そのフラグメントは、EGFR発現と関連するおよび/または現存する抗EGFR抗体、例えばセツキシマブが処置することが知られている他の疾患および状態の処置に使用できる。ここに記載する抗EGFR抗体で処置できる他の疾患および状態は、心臓状態、例えば鬱血性心不全(CHF)、心筋炎および心筋の他の常態;皮膚状態、例えば酒さ、アクネおよび湿疹;骨および歯の状態、例えば骨喪失、骨粗鬆症、ページェット病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、歯周病、廃用性骨減少症、骨軟化症、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、骨転移、骨疼痛管理、液性悪性高カルシウム血症、歯周再建、脊髄傷害および骨折;代謝状態、例えばゴーシェ病;内分泌状態、例えばクッシング症候群;および神経学状態を含むが、これらに限定されない。
抗EGFR抗体、例えばここに提供する修飾抗EGFR抗体での治療の対象または候補は、抗EGFR抗体の投与により処置できる疾患または状態、例えばここに記載するまたは当分野で知られる疾患または状態を有する対象、例えばヒト患者を含むが、これらに限定されない。
ある例において、治療の対象または候補を、例えば膜上のウェスタンブロッティング(WB)および全ホモジネートおよび組織マイクロアレイ上の免疫組織化学(IHC)のような、当分野で知られる方法を使用するEGFR発現の陽性の証拠について試験する。さらに、リン酸化EGFR(pEGFR)を、膜上のウェスタンブロッティングにより測定できる(例えば、Thariat et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1313参照)。EGFR評価を、例えば、EGFRPHARMDXスコアリング・ガイドライン(Dako, Glostrup, Denmark)を使用して評価できる。EGFR発現cは、EGFR陽性細胞を最大密度で含み得る、腫瘍侵襲の最深領域を含む切片上で評価できる。このような方法は当業者の能力の範囲内である(例えば、Ervin-Haynes et al. (2006) J. Clin. Oncol. ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol. 24, No. 18S (June 20 Supplement)13000; Goldstein and Armin (2001) Cancer 92(5):1331-1346; Bibeau et al. (2006) Virchows Arch. 449(3):281-287参照)。
ある例において、治療の対象または候補を、ここに提供する抗EGFR抗体の効果を予測するために、1個以上の多型性についてスクリーニングする。抗EGFR抗体、例えばここに提供する修飾EGFR抗体と相互作用できる多くの受容体、ヒト集団で多型である。ある患者または患者の集団について、ここに提供する修飾抗EGFR抗体の効果は、タンパク質における特異的多型性の存在または非存在により影響を受け得る。例えば、FcγRIIIaは158位で多型であり、一般にV(高親和性)またはF(低親和性)のいずれかである。V/Vホモ接合型遺伝子型を有する患者は、強いナチュラル・キラー(NK)応答を開始し、抗CD20抗体リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)での処置に良好な臨床的応答を有することが観察されている(Dall'Ozzo et. al. (2004) Cancer Res. 64:4664-4669)。さらなる多型性は、FcγRIIa R131またはH131を含み、このような多型性は、多型性によってFc結合およびその後の生物学的活性を高めるまたは強めることが知られtいる。
ある例において、ここに提供する抗EGFR抗体、例えばここに提供する修飾抗EGFR抗体で治療するための対象または候補は、抗EGFR抗体、例えば当分野で知られるあらゆる抗EGFR抗体の投与が原因の1個以上の副作用を経験している対象、例えばヒト患者であるが、これに限定されない。対象に副作用を起こした抗EGFR抗体治療に換えてここに提供する抗EGFRを投与することは、同等なまたは改善された治療有効性をもたらし、同時に減少したまたは少ない副作用をもたらし得る。それゆえに、このような方法において、ここに提供する抗EGFR抗体以外の抗EGFR抗体治療剤を投与され、該治療剤の投与と関連する1個以上の症状または副作用を経験する対象を同する。次いで、同定された患者に、ここに提供する抗EGFR抗体を投与し、治療を継続する。ここに提供する抗EGFRの投与量および投与頻度を含む投与レジメは、先の抗EGFR抗体治療と同一でも異なってもよい。いくつかの例では、投与量を増加しても減少してもよい。特定の処置する対象、疾患または状態の性質、現存する症状または副作用の性質および投与する特定のここに提供する修飾抗EGFR抗体のような因子に基づき投与レジメを決定するのは、担当医の技術範囲内である。
ヒト皮膚において、EGFRは基底ケラチン生成細胞で発現され、上皮増殖を刺激し、分化を阻害し、創傷治癒を加速し得る(Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12:1-5; Nanney et al. (1996) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748)。EGFR機能の阻害はケラチン生成細胞の増殖および遊走を阻害し、炎症性ケモカイン発現を起こし得る。これらの効果は炎症性細胞動員および続く皮膚傷害に至り得て、これはここに記載する副作用のような副作用をもたらし得る。皮膚基底層環境のpHは中性である(例えば、正確にまたは約pH7.0〜7.2)。それゆえに、中性pHよりも低pHで活性が上昇した抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体、例えばここに提供する抗EGFR抗体は皮膚毒性を減少させ、副作用を減少させ得る。皮膚におけるEGFR阻害が原因の副作用およびその同定および分類方法の例を下に記載する。
EGFRは腎臓、特に、70%の濾過マグネシウムが再吸収される場所であるヘンレループの上行性肢で高度に発現される。それゆえに、EGFRと相互作用する抗体はマグネシウム輸送を妨害し得る。血中マグネシウムが低濃度である低マグネシウム血症は、抗EGFR抗体の投与の副作用であり得る。ある研究において、セツキシマブ治療を受けた患者の5%がグレード3または4低マグネシウム血症を示した。
当分野で知られる治療候補の他のスクリーニング方法が意図される。例えば、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ(KRAS)変異状態が、結腸直腸癌におけるセツキシマブ治療に対する応答の予測であることが最近示されている(Van Cutsem et al. (2008) J. Clin. Oncol 26 (May 20 suppl): Abstract 2)。KRASは、多くのシグナル伝達経路において役割を有するGTPaseである。KRASをコードする遺伝子の変異は、25%を超える結腸直腸癌に存在し、EGFR阻害薬物の成功の予測である。変異KRAS遺伝子の発現は、EGFR阻害剤治療に対する応答の低下をもたらす。KRAS変異は、市販の検査診断で検出できる。
ここに提供する方法において、抗EGFR抗体または抗体フラグメントの治療有効量を投与できる。このような投与量は当業者により、例えば担当医により経験的に決定できる。ある例において、投与する投与量は、特定の疾患または状態に対する既知抗EGFR抗体、例えばセツキシマブの投与量を参照する。ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体の治療有効濃度は、例えばここに提供するまたは当分野で知られるアッセイを使用する、既知インビトロおよびインビボ系における抗EGFR抗体の試験により経験的に決定できる。
ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体は、例えば全身または局所投与を含む、ポリペチドの投与について当分野で知られるあらゆる方法により対象に投与できる。抗EGFR抗体は、非経腸(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または腔内)、局所、硬膜外または粘膜(例えば鼻腔内、経口、膣、外陰膣、食道、口腔食道、気管支または肺)のような経路で投与できる。抗EGFR抗体は、対象に外的に、局所または経皮作用の発揮のために疾患の部位に投与できる。抗EGFR抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物は、任意の好都合な経路で、例えば輸注またはボーラス注射により、上皮性または皮膚粘膜裏層(例えば、経口粘膜、膣、直腸および腸管粘膜)を介する吸収により投与できる。抗EGFR抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物は、他の生物学的活性剤と共に投与できる。具体例において、抗EGFR抗体は、輸注送達、例えば輸注ポンプまたはシリンジポンプにより投与され、他の治療剤と組み合わせてまたは単剤療法として投与できる。
ここに提供する方法において、ここに提供する抗EGFR抗体、例えば修飾抗EGFR抗体を、1種以上の他の治療レジメンまたは治療剤の前に、後にまたは同時に投与でき、熟練した医師は、経験的にまたは薬剤の薬物動態および作用機序に基づき、各治療レジメンまたは治療剤の適当な1回または複数回投与量、ならびに適当な投与のタイミングおよび方法を決定できる。付加的治療レジメまたは治療剤は、抗EGFR抗体の効果または安全性を高め得る。ある例において、付加的治療レジメまたは治療剤は、抗EGFR抗体の作用を変えるのではなく、同一疾患または合併性を処置できる。ある例において、付加的治療レジメまたは治療剤は、抗EGFR抗体の投与と関連する当分野で知られるまたはここに記載する1個以上の副作用を改善、低減または回避し得る。
次の実施例は、説明目的のみで包含し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
抗EGFR抗体変異体の産生およびpH依存性活性のスクリーニング
1. 一次スクリーニング
a. ライブラリーの産生
軽鎖(配列番号1110および配列番号9をコード)および重鎖(配列番号1111および配列番号8に示す完全重鎖配列をコード)を含む参照セツキシマブ抗EGFR抗体を産生し、それによりFLAGタグ(配列番号13)を、定常ドメインのC末端に結合し、IgG抗体(配列番号1109に示す完全長DNA配列)をコードするために発現ベクターにクローン化した。セツキシマブ抗EGFR抗体の一点変異体のライブラリーを構築し、部位特異的変異誘発により産生した。ライブラリーはセツキシマブの変異体抗EGFR抗体を含み、それにより各メンバーは、セツキシマブの重鎖(配列番号8と配列番号3に示す可変重鎖)または軽鎖(配列番号19と配列番号10に示す可変軽鎖)の可変領域内に、参照抗体と比較して、100アミノ酸位置の1個に単一アミノ酸変異を含んだ。変更した位置は、セツキシマブ抗EGFR抗体の軽鎖および重鎖の可変領域であり、大多数の位置は、軽鎖または重鎖のCDR内であった(図1参照)。少なくとも15アミノ酸変異を各位置で産生し、それによりアミノ酸ヒスチジンを、各位置で15変異に包含させた。産生したライブラリーの一変異体メンバーの数は1501であった。ライブラリーの各メンバーを配列決定した。ライブラリーのメンバーのグリセロールストックを製造し、−80℃で保存した。
スクリーニングのために、ライブラリーの1メンバーをコードする発現ベクターを、IgG抗体として個々にCHO細胞に発現させ、上清を回収した。プラスミドDNAを、製造者のプロトコルに従い、リポフェクタミン2000(Invitrogen, Cat. No. 11668-027)を使用して単層CHO−S細胞(Invitrogen, Cat. No. 11619-012)に遺伝子導入した。簡単に言うと、CHO−S細胞をトランスフェクションの前夜に播種し、10%胎児ウシ血清(FBS)添加DMEM中で増殖させた。翌日、細胞が80%コンフルエントの後、CHO−S細胞の培地をOpti-MEM(Invitrogen)に変えた。プラスミドDNAおよびリポフェクタミン(0.2μg DNAおよび0.5μL リポフェクタミン)の混合物をCHO−S細胞に添加し、一夜インキュベートした。翌日、細胞をCD−CHO無血清培地(Invitrogen, Cat. No. 10743-029)に添加した。遺伝子導入細胞からの上清をトランスフェクション後に回収した(一般にトランスフェクション後72時間)。
ELISAを二連で行い、二連反応の平均OD値を計算した。OD値に基づき、pH7.4(および1mM乳酸)と比較して、pH6.0(および16.6mM乳酸)でsEGFR−H6に高い結合活性を示す変異体抗EGFR抗体を同定しており、表15に示す。表は希釈1および希釈2での変異体抗体のpH6.0の平均OD(OD6.0)、pH7.4の平均OD(OD7.4)およびpH6.0と7.4の平均OD値比(OD6.0/OD7.4)を示す。表15変異体抗EGFR抗体の重鎖(HC)および軽鎖(LC)の可変領域の配列番号も示す。
b V=可変
抗体濃度を抗EGFR抗体定量ELISAにより決定した。簡単に言うと、プレートを100μL sEGFR−H6(Sino Biologicals Inc, Cat# 10001-H08H)抗原で、PBS中12nM(1.32μg/mL)でコートし、250μl/ウェルのPBSで3回洗浄し、1時間、室温で5mg/mL BSA含有250μlのPBSで遮断した。抗EGFR−FLAG抗体標品(タンパク質Aカラム精製)の連続希釈を、5mg/mL BSA含有PBSで調製した。出発抗体濃度は100ng/mLであり、続いて記載のとおり1:3希釈した。試験サンプル希釈(1:3希釈)を調製し、100μl/ウェルの標品および試験サンプルをウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを、3回250μl/ウェルの5mg/mL BSA含有PBSで洗浄した。100μL/ウェルウサギ抗ヒトIgG−Fc−HRPを、PBS/5mg/mL BSA中、1:5000(最終濃度0.2μL/mL)希釈で添加した。プレートを1時間、RTでインキュベートし、3回250μl/ウェルのPBS/5mg/mL BSAで洗浄した。TMB基質を添加し、プレートを上記のとおり読んだ。
比活性(SA)を、平均OD値を抗体濃度で割って計算した。次いで、各変異体について変異体抗EGFR抗体の比活性を参照FLAGタグ付き抗EGFR親抗体の比活性で割って比活性を規準化して、規準化比活性(NSA)を得た。表16は、希釈1および希釈2での上記同定された変異体の各々の規準化比活性を示す。pH6.0でNSA>0.4およびpH7.4でNSA<0.4を有する変異体抗EGFR抗体を同定し、さらなる分析のために選択した。これらの同定された抗体の変異は、軽鎖(LC)変異:L004C、L004V、S056HまたはN091Vを含む抗体;および重鎖(HC)変異:V024I、V024L、S025C、S025G、S025I、S025Q、S025T、S025L、N031I、N031T、N031V、Y032T、V050L、G054R、G054C、G054P、D058M、Y059E、F063R、F063C、F063G、F063M、F063V、T064N、T064V、S068F、S068Q、D072K、D072L、D072M、D072W、N073Q、S074H、S074R、S074D、S074G、S074Y、K075H、K075W、Q077R、Q077E、T100I、T100P、Y101W、Y104D、Y104F、Y104SまたはA107Nを含む抗体である。
確認スクリーニングを、5%血清を両pH値で使用した以外、パート1に記載のとおり行った。表17は、希釈1および希釈2で例示的な試験した修飾抗体について、各希釈でのpH6.0のOD(OD6.0)、各希釈でのpH7.4のOD(OD7.4)およびpH6.0と7.4の平均OD値の比(OD6.0/OD7.4)を示す。
コンビナトリアルライブラリーの産生およびスクリーニング
重鎖に変異LC−I29S、V24E、S25C、F27R、R97H、Y104Dおよび/またはHC−Q111Pの全組み合わせを有する抗体メンバーを含む、抗EGFR変異体メンバーのコンビナトリアルライブラリーを製造した。多点変異体を、実施例1に記載のセツキシマブ抗EGFR参照抗体に部位特異的変異誘発により産生した。ライブラリーはセツキシマブの変異体抗EGFR抗体を含み、それにより各メンバーは、重鎖(配列番号8と配列番号3に示す可変重鎖)または軽鎖(配列番号9と配列番号10に示す可変軽鎖)の可変領域において、参照抗体と比較して1、2、3、4、5、6または7アミノ酸変異を含んだ。産生したコンビナトリアルライブラリーの変異体メンバーの総数は128であった。ライブラリーの各メンバーを配列決定した。ライブラリーのメンバーのグリセロールストックを調製し、−80℃で保存した。スクリーニングのために、ライブラリーの1メンバーをコードする発現ベクターを、IgG抗体としてCHO細胞に個々に発現させ、上清を回収した。
ELISA上へのヒト血清添加の効果
非修飾(セツキシマブ参照抗体)および変異体抗EGFR抗体(HC−Y104DおよびHC−Y104D/HC−Q111P)の結合に対するヒト血清の効果を定量的ELISAで決定した。
CHO−S細胞を、GlutaMAX(8mM)を添加したCD−CHO培地を使用して、シェーカーフラスコで培養した。トランスフェクションの日、凡その密度1.0×106細胞/mLの300mLのCHO−S細胞を、製造者のプロトコルに従い、375μgのプラスミドDNAと375μLのFreeStyleTMMAX試薬(Invitrogen)を使用して遺伝子導入した。トランスフェクション96時間後、培地を遠心分離(4000g×20’)により回収した。条件培地中の発現抗体を、さらにタンパク質A樹脂(BioRad:Cat# 156-0218)から調製したタンパク質Aカラム(2mL)を使用して、親和性クロマトグラフィーにより精製した。カラムに結合したIgGを、1工程で0.1M グリシン−HCl、pH2.5で溶出した。溶出したIgGを中和し、BCAタンパク質アッセイ(Pierce Biotechnology)を使用してタンパク質決定前に透析した。
ELISAアッセイを、実施例1に記載のとおり、いくつか修飾して実施した。セツキシマブ抗EGFR−FLAG参照抗体およびFLAGタグ付き抗EGFRHC−Y104DおよびHC−Y104D/Q111P変異体抗体の3倍連続希釈を出発濃度100ng/mLから調製した。標準および変異体抗体を、血清不含、5%ヒト血清または25%ヒト血清含有pH7.4緩衝液(KRB、pH7.4、1mM乳酸)で調製した。標準および変異体抗体をまた血清不含、5%ヒト血清または25%ヒト血清含有pH6.0緩衝液(KRB、16.6mM乳酸)で調製した。各条件について、抗EGFR−FLAG抗体標品およびHC−Y104DおよびHC−Y104D/Q111P変異体抗体の最終濃度は666.67pM(100ng/mL)、222.22pM(33.33ng/mL)、74.07pM(11.11ng/mL)、24.69pM(3.70ng/mL)、8.23pM(1.23ng/mL)、2.74pM(0.41ng/mL)、0.91pM(0.137ng/mL)および0であった。100μLの各濃度の各抗体を、96ウェルプレートのウェルに添加した。各プレートは、抗EGFR−FLAG抗体標品、ポジティブコントロール(親抗体)およびネガティブコントロール(一次抗体なし)を含んだ。ELISAを3連で行った。
ELISAにおける乳酸濃度の効果
非修飾(セツキシマブ参照抗体)および変異体抗EGFR抗体(HC−Y104DおよびHC−Y104D/HC−Q111P)の結合における乳酸の効果を、アッセイ緩衝液を修飾して、実施例3に記載のとおりpH感受性ELISAで決定した。
同定されたヒットの結合親和性
バイオレイヤー干渉法を、pH6.5およびpH7.4で変異体抗EGFR抗体のEGFRへの結合を測定するために実施した。sEGFRに対するセツキシマブおよび変異体抗EGFR抗体の解離定数(KD)を、Octet QKe装置(ForteBio, Menlo Park, CA)を使用して、96ウェル形式でバイオレイヤー干渉法により測定した。Data Acquisitionソフトウェアを、ビオチニル化sECD EGFRリガンド負荷および抗体結合および解離工程を含む全操作工程で使用した。リガンド負荷および抗体結合および解離工程をpH値の異なる2群で行った(pH6.5群およびpH7.4群)。
種々のpHでの結合差異を評価するために、リガンド負荷工程について、ビオチニル化sECD EGFRを、PBS(pH6.5またはpH7.4)中、ストレプトアビジンバイオレイヤーと結合させた。ストレプトアビジンセンサーを、PBS(pH6.5またはpH7.4)を含むウェルに1分浸し、次いでセンサーをPBS(pH6.5またはpH7.4)中ビオチニル化sEGFR(50μg/mL)を含むウェルに2分浸した。センサーを、PBS(pH6.5またはpH7.4)を含むウェルで洗浄した。全工程中、プレートを1000rpmで撹拌した。
会合速度測定のために、固定化したsECD−EGFRセンサーを、pH6.5または7.4のPBS中、22nMまたは66.7nMの抗体(セツキシマブまたは変異体抗EGFR抗体)を含むウェルに2分浸した。解離速度測定のために、抗体結合センサーを、pH6.5または7.4のPBSウェルに4分浸した。sEGFRと抗体(セツキシマブまたは変異体抗EGFR抗体)の結合および解離を、光学層およびバイオレイヤーから反射された光により生じた干渉パターンの変化により定量した。
さらなる実験において、PBS、クレブス−リンゲル重炭酸緩衝液(KRB)またはKRBと25%ヒト血清中、pH6.0、6.5およびpH7.4で変異体抗EGFR抗体のsECD EGFRへの結合を、上記方法に順ずるバイオレイヤー干渉法を使用して測定した。結果を下記表20に示す。
EGFRリン酸化
参照セツキシマブ抗体または抗EGFR抗体変異体で処置したヒト新生児ケラチン生成細胞およびA431細胞からのリン酸化EGFRの濃度をELISA(RnD systems reagents, #DYC3570-2)で測定した。
約10,000細胞のヒト新生児ケラチン生成細胞(Invitrogen C-001-5C)またはA431細胞(ATCC CRL 1555)を、96ウェルプレート(BD Falcon #35-3072)のウェルに播種した。一夜、37℃で加湿雰囲気の5%CO2インキュベーターでインキュベーション後、細胞を無血清ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で洗浄し、最懸濁し、一夜同一条件下にインキュベートした。細胞を冷リン酸緩衝化食塩水(PBS;137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、pH7.2〜7.4)で洗浄した。次いで、プレート2群に分けた。第一群で、10μg/mL 精製セツキシマブまたはHC−Y104D抗EGFR抗体または緩衝液コントロールを、pH7.4に調節したリン酸緩衝液に添加した。第二群で、精製セツキシマブまたはHC−Y104D抗EGFR抗体または緩衝液コントロールを、pH6.5に調節したリン酸緩衝液に添加した。A431細胞について、用量−応答も行い、それによりセツキシマブまたはHC−Y104D抗EGFR抗体を、30μg/mL、10μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL、0.123μg/mLおよび0.001μg/mL濃度でサンプルに添加した。細胞を15〜30分、37℃でインキュベートした。
96ウェルマイクロプレート(Costar #2592)をラット抗ヒト抗ホスホEGFR捕獲抗体(PBS中8.0μg/mL、100μL/ウェル)(R&D SYSTEMS # 842428)で一夜、室温で被覆した。各ウェルを吸引し、洗浄緩衝液(PBS、pH7.2〜7.4中0.05%TWEEN(登録商標)20(R&D Systems # WA126))で計5回洗浄した。プレートを、1〜2時間、室温で300μLの遮断緩衝液(PBS中1%BSA、0.05%NaN3、pH7.2〜7.4)で遮断した。ウェルを吸引し、洗浄緩衝液で計5回洗浄した。細胞ライセート(セツキシマブ、Y104D抗EGFR抗体、EGFのみまたはRx無し)を、IC希釈剤(1%NP-40 Alternative、20mM Tris(pH8.0)、137mM NaCl、10%グリセロール、2mM EDTA、1mM活性化オルトバナジン酸ナトリウム)で希釈し、100μLを添加した。吸引および洗浄工程を繰り返し、HRPとコンジュゲートした100μLのマウス抗ヒトホスホ−EGFR(Y1068)抗体(20mM Tris(pH8.0)、137mM NaCl、0.05%TWEEN(登録商標)20、0.1%BSA)を添加した。プレートを密閉し、2時間、室温でインキュベートした。吸引および洗浄工程を繰り返した。基質(H2O2とテトラメチルベンジジンの1:1混合物(R&D Systems, Catalog # DY999))(100μL)を各ウェルに添加し、プレートを20分、室温でインキュベートした。停止溶液(2N H2SO4(R&D Systems, Catalog # DY994)(50μL)を添加し、ウェルの光学密度(OD)を、450nmに設定し、540nmまたは570nmでの波長補正を伴うマイクロプレートリーダーで直ぐに測定した。
a) A431細胞
結果は、EGFRのEGF抗原誘発リン酸化を示した(図3A参照)。pH6.5および7.4で抗体で前処理したA431細胞からのサンプルで、結果は、リン酸化EGFR(EGFR−P)のレベルが、EGFで刺激していないコントロール細胞と同等であるように、抗EGFRセツキシマブ抗体の存在がEGFRのEGF誘発リン酸化を阻害したことを示した。細胞と変異体HC−Y104D変異体のプレインキュベーションもEGF誘発リン酸化を阻害従、参照セツキシマブより低い程度であった。変異体HC−Y104DのEGFRのEGF誘発リン酸化を阻害する能力は、pH6.5で大きかった。
同様の結果が、新生児ケラチン生成細胞からのサンプルで観察された(図3C参照)。pH6.5およびpH7.4で、参照セツキシマブ抗体は、EGF誘発リン酸化の同等な阻害をもたらした。pH7.4で、細胞とHC−Y104D抗体のプレインキュベーションは、EGF誘発リン酸化を阻害しなかった。しかしながら、pH6.5で、EGFRのEGF誘発リン酸化は、抗体無しのサンプルと比較して約1/4に減少し、変異体抗体がpH7.4と比較して、pH6.5で大きな活性を示すことを証明した。
セツキシマブまたはHC−Y104D抗EGFR抗体存在下のヒトおよび新生児ケラチン生成細胞の増殖
ヒト新生児ケラチン生成細胞(Invitrogen C-001-5C)および成人ケラチン生成細胞(Invitrogen C-005-5C)の増殖を、セツキシマブまたはHC−Y104D抗EGFR抗体とインキュベーション後に測定した。セツキシマブまたはHC−Y104D抗EGFR抗体を、通常の増殖培地(10%FBS、DMEM(pH7.4))に10μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL、0.123μg/mL、0.0411μg/mL、0.0137μg/mLおよび0.00457μg/mLの濃度まで添加した。
異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対するセツキシマブまたはHC−Y104D抗EGFR抗体の効果
FaDu下咽頭癌細胞であるA431類表皮癌細胞ならびにA431細胞由来の操作された細胞株A431LDHAおよびA431CA9を使用して、セツキシマブおよびHC−Y104D抗EGFR抗体の抗腫瘍活性の評価に使用した異種移植腫瘍モデルを作製した。
A431類表皮癌異種移植モデルを使用して、セツキシマブおよびHC−Y104D抗EGFR抗体の抗腫瘍活性を評価および比較した。
雄、無胸腺NCr−nu/nuマウスに、RPMI−1640培地に懸濁した3.3×106 A431類表皮癌細胞(ATCC CRL1555)を0.1mL皮下(SC)注射により右側腹部に接種した。腫瘍サイズが〜100mm3に達したとき、動物を6実験群(n=5/群;計30匹の動物)に無作為化し、これらは媒体(セツキシマブ緩衝液)、1.2mg/kg、4mg/kg、12mg/kg、40mg/kgまたは80mg/kg体重セツキシマブを腹腔内(IP)投与により実験の0日目、5日目、7日目、11日目および14日目に週に2回投与された。腫瘍体積(mm3)で測定した腫瘍増殖を、週に2回、デジタル式ノギスを使用して決定し、腫瘍体積を式(1/2*L*W2)(ここで、L(長さ)は腫瘍の最長直径であり、W(幅)は、“長さ”の測定に垂直な最長直径である)に従い計算した。具体的に、腫瘍体積を0日目、5日目、7日目、11日目および14日目に測定した。
A431異種移植モデルを上記のとおり製造した。腫瘍サイズが〜100mm3に達したとき、動物を5実験群(n=4/群)に無作為化した:(1)群1−媒体(セツキシマブ緩衝液)、(2)群2−0.1mg/マウス(4mg/kg体重)セツキシマブ、(3)群3−1.0mg/マウス(40mg/kg体重)セツキシマブ、(4)群4−0.1mg/マウス(4mg/kg体重)HC−Y104D抗EGFR抗体または(5)群5−1.0mg/マウス(40mg/kg体重)HC−Y104D抗EGFR抗体。マウスに、た0.1mgまたは1.0mgのセツキシマブ参照またはHC−Y104D抗EGFR抗体変異体または媒体コントロールを0日目、4日目、7日目、11日目および14日目の週に2回腹腔内(IP)投与した。腫瘍増殖を上記のとおり0日目、4日目、7日目、11日目、14日目および18日目に測定従、媒体処置動物で最後の腫瘍測定は、動物を殺したために14日目であった。セツキシマブまたはHC−Y104D抗EGFR抗体処置群の腫瘍増殖阻害(TGI)を、式:%TGI=[1−(TB−TA)/(CB−CA)]×100(式中、TBは処置開始後14日目の処置群の平均腫瘍体積(mm3)であり、TAは処置開始前0日目の処置群の平均腫瘍体積(mm3)であり、CBは、コントロール群の処置開始14日目の平均腫瘍体積であり、CAは処置前のコントロール群の平均腫瘍体積である)を使用して、計算した(例えば、Teicher BA and Andrews PA: Anticancer Drug Development, Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials and Approval, 2nd edition. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 134, 2004 and T. Friess et al., (2006) Anticancer Research 26:3505-3512参照)。
FaDu下咽頭癌異種移植モデルを、セツキシマブおよびHC−Y104D抗EGFR抗体の抗腫瘍活性の評価および比較のために使用した。
雄、無胸腺NCr−nu/nuマウスに、RPMI−1640培地に懸濁した5.0×106 FaDu下咽頭癌細胞(ATCC)を右側腹部に0.1mL皮下(SC)注射により接種した。腫瘍サイズが〜100mm3に達したとき、動物を6実験群(n=7/群)に無作為化し、これらは、媒体(セツキシマブ緩衝液)、1.2mg/kg、4mg/kg、12mg/kg、40mg/kgまたは80mg/kg体重セツキシマブを、実験の0日目、3日目、7日目、10日目および14日目に週に2回腹腔内(IP)投与により投与した。腫瘍増殖を、上記のとおり、−1日目、3日目、7日目、10日目および14日目に測定した。
e FaDu異種移植モデルを上記のとおり製造した。腫瘍サイズが〜100mm3に達したとき、動物を5実験群(n=4/群)に無作為化した:(1)群1 − 媒体(セツキシマブ緩衝液)、(2)群2 − 4mg/kgセツキシマブ、(3)群3 − 40mg/kgセツキシマブ、(4)群4 − 4mg/kgHC−Y104D抗EGFR抗体または(5)群5 − 40mg/kgHC−Y104D抗EGFR抗体。抗体または媒体のみを0日目、3日目、7日目および10日目に週に2回腹腔内(IP)投与した。腫瘍増殖を、上記のとおり、抗体投与直前に−1日目、3日目、7日目、10日目、14日目にノギスを使用して測定した。
エクスビボでの抗EGFR抗体Y104DのA431皮下腫瘍または皮膚移植片への結合
1. エクスビボでの皮下腫瘍への結合試験
a. 皮下腫瘍におけるEGFR発現
免疫組織化学(IHC)を使用して、実施例8.1に記載のとおりヌードマウスにおける異種移植片として増殖させたA431ヒト腫瘍におけるEGFR発現レベルを評価した。A431皮下腫瘍を回収し、10%中性緩衝化ホルマリン(NBF)に固定化し、パラフィンに包埋した。5μm切片をスライドにマウントし、乾燥した。染色前に、スライドを脱パラフィン処理および再水和した。EGFRIHCキット(Dako, Carpinteria, CA)を使用して、切片を免疫標識した。製造者の指示に従い3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)で染色を可視化した。核をヘマトキシリンで対比染色した。顕微鏡写真をInsight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)と連結させたNikon Eclipse TE2000U顕微鏡で撮った。腫瘍細胞におけるEGFRの激しい細胞膜陽性は、A431細胞由来の異種移植腫瘍が高EGFR発現レベルを保持することを確認した。
免疫蛍光(IF)を使用して、セツキシマブおよびHC−Y104Dがと結合し、それゆえにヒトEGFRを標識する能力を評価した。アービタックスおよびHC−Y104DをDyLight594に、製造者の指示に従いDyLight 594 Antibody Labeling Kit(Thermo Scientific; Rockford, IL)を使用して、PBS中10、5、1、0.3、0.1μg/mLでコンジュゲートした。切断後、A431腫瘍の切片を、10分間、冷アセトンで固定し、1時間、5μg/mLまたは1μg/mLのDyLight594コンジュゲートセツキシマブまたはHC−Y104D抗体とインキュベートした。PBSで洗浄後、切片をDAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、ジヒドロクロライド)(Molecular Probes, Eugene)で対比染色した。顕微鏡写真を、20倍および40倍対物でレンズで、Insight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)と連結させたNikon Eclipse TE2000U顕微鏡を、実験条件間の比較を可能にするために各画像について同一設定で使用して撮った。
a. 霊長類皮膚におけるEGFR発現
免疫組織化学(IHC)を使用して、ヒトおよび非ヒト霊長類皮膚サンプルにおけるEGFR発現レベルを評価した。ヒト皮膚サンプルは、地元の外科センターから得て、カニクイザル、マーモセットおよびリスザル皮膚は、Worldwide Primates Inc.(Miami, FL)から得た。ヒト、カニクイザル、マーモセットおよびリスザルのホルムアルデヒド固定サンプルを上記のとおり切断し、EGFRIHCキット(DAKO)でIHCのために処理した。核をヘマトキシリンで対比染色した。顕微鏡写真を20倍および40倍対物レンズで上記のとおり撮った。
免疫蛍光(IF)を使用して、セツキシマブおよびHC−Y104Dが皮膚サンプルにおけるヒトEGFRと結合し、それゆえに標識する能力を評価した。ヒト、カニクイザル、マーモセットおよびリスザル(ヒト皮膚は地元の外科センターから得て、カニクイザル、マーモセットおよびリスザル皮膚はWorldwide Primate, Floridaから得た)の凍結切片を、上記のとおり、中性pHで、Alexafluor 594(Thermo Scientific DyLight 594 Antibody Labeling Kit; Rockford, IL)とコンジュゲートした1.0μg/mLセツキシマブまたはHC−Y104Dを使用して、直接的免疫標識した。核をDAPIで対比染色した。顕微鏡写真を、上記のとおり、20倍および40倍対物レンズを使用して撮った。
インビボでの腫瘍対皮膚での蛍光性標識抗EGFR抗体Y104Dの選択的結合
セツキシマブ、Y104D抗EGFR抗体およびコントロールヒトIgGを、室温で60分、近IR蛍光であるDyLight755 Sulfydryl-Reactive Dye(DL755)(Thermo Scientific, Rockford, IL)で標識した。DL755標識IgG、セツキシマブおよびHC−Y104Dの異種移植腫瘍またはヒトまたはサル皮膚移植への結合を、励起波長745nmおよび発光波長800nmを用いるIVISノギス蛍光造影システムを使用して評価した。画像を抗体投与前および抗体投与後1分、2分、10分、60分、120分、240分、360分、1日および毎日撮った。ヒト皮膚移植モデルにおいて、画像を抗体投与後10日目にも撮った。
A431異種移植腫瘍を、上の実施例8に記載のとおり、ヌードマウスの右側腹部にA431細胞を注射することにより産生した。移植21日後、マウスに、10μg/マウス(0.5mg/kg)ヒトIgGDL755、HC−Y104DDL755またはセツキシマブDL755(n=4/群)を投与した。DL755標識を、励起波長745nmおよび発光波長800nmを用いるIVISノギス蛍光造影システムを使用して、4動物/群で検出した。画像を抗体投与前および抗体投与4時間後、次いで7日間毎日撮った。
PC−3細胞由来の異種移植腫瘍を、100μl無血清Opti-MEM(登録商標)中、2×106 PC−3細胞(Caliper Life Sciences)を、雄ヌードマウスの右前脛骨筋に注射することにより産生した。移植35日後、PC−3腫瘍担持マウスに、10μg/マウス(0.5mg/kg)ヒトIgGDL755、HC−Y104DDL755またはセツキシマブDL755(n=2/群)を投与し、DL755標識を、上記のとおりIVISノギス蛍光造影システムを使用して検出した。画像を抗体投与前、続いて5日間毎日撮った。平行免疫組織化学的研究もPC−3異種移植腫瘍で、上記のとおり、Fc検出によりヒトIgG(コントロール)、HC−Y104Dまたはセツキシマブの1mg/マウスi.v.投与48時間後に行った。
ヒ分層植皮移植(STSG)(ヒト皮膚は地元の外科センターから得た)およびヒト包皮移植(NDRI(1628 JFK Blvd, 8 Penn Center, Philadelphia, PA)から購入)を、Ncr nu/nuマウスの左背側部に外科的に移植した。EGFR発現を、ヒト皮膚移植片中、移植後それぞれ70日目および32日目に、抗EGFRIHCキット(Dako)により確認した。移植32日および36日後、標識抗体を、ヒト皮膚移植片を有するマウスに、300μg/マウスの投与量でi.v.投与した。
サルSTSG(BioToxから得たカニクイザル皮膚)を、7匹のNcr nu/nuマウスの左背側部に外科的に移植した。EGFR発現を、移植70日および32日後にそれぞれサル皮膚移植片で、抗EGFRIHCキット(Dako)により確認した。移植32日および36日後、標識抗体を、30μg/マウスの投与量でサル皮膚移植モデルを有するマウスにi.v.投与した。
定量化した蛍光シグナル強度を使用して、実施例10.1で決定した腫瘍結合のDL755シグナル強度を、実施例10.2で決定した同一抗体からのヒト皮膚移植結合の対応するDL755シグナル強度で割ることにより、セツキシマブおよびHC−Y104D抗体について抗体腫瘍:皮膚結合の比を決定した(n=2/群)。次いで、比をコントロールIgG投与動物について結合した腫瘍:皮膚結合比に対して規準化した。
皮膚移植モデルにおける皮膚毒性に対するセツキシマブの効果
患者の眼瞼裂からのドナー皮膚を採取し、分層皮膚移植を、4匹のNcr nu/nuマウスに移植した。皮膚移植15日目から出発して、マウスの2匹に、各々2mgセツキシマブ(100mg/kg、HED 60mg/kg)を週に2回、4週間静脈内投与した。セツキシマブ投与後35日目、最終セツキシマブ投与7日後に、皮膚移植片の状態を視覚的評価した。ヒトドナー皮膚移植および宿主マウス皮膚の両者を含むドナー皮膚および移植皮膚の
サンプを回収し、抗EGFR IHCキット(Dako)を使用して、免疫組織化学により分析した。
抗EGFR抗体および化学療法組み合わせ処置
化学療法剤であるシスプラチンと組み合わせたセツキシマブおよびHC−Y104D抗EGFR抗体の効果を、A431異種移植腫瘍増殖の阻害について評価した。
皮下A431異種移植腫瘍を、上の実施例8に記載のとおり雄ヌードマウスで確立した。腫瘍サイズが約100〜200mm3のとき、動物を表22に示す9実験群(n=5/群)に無作為化し、セツキシマブを腹腔内投与により週に2回および/またはシスプラチンを静脈内投与により週に2回投与した。具体的に、試験品を、0日目、4日目、7日目、11日目および14日目に投与した。
皮下A431異種移植腫瘍を、上記のとおり雄ヌードマウスに確立した。腫瘍サイズが約100mm3のとき、動物を、表23に示すとおり8実験群(n=5/群)に無作為化し、週に2回、セツキシマブまたはHC−Y104DをIP投与および/またはシスプラチンをIV投与された。具体的に、試験品を、0日目、4日目、7日目および11日目に投与した。先に記載のとおり、腫瘍体積(mm3)を−1日目、4日目、7日目、11日目および14日目に決定した。
腫瘍細胞およびケラチン生成細胞増殖阻害に対する抗EGFR抗体−薬物コンジュゲート(ADC)の効果
抗EGFR抗体−薬物コンジュゲート(ADC)を、薬物の標的細胞内での遊離を可能にするために、ビオチニル化抗体とストレプトアビジン−サポリン(Advanced Targeting Systems Bio, Cat# IT-27)の混合または開裂可能タンパク質架橋剤(Advanced Targeting Systems Bioにより提供されるサービス)のいずれかを使用して、免疫毒素サポリンをセツキシマブ、HC−Y104DおよびHC−Y104D/Q111P抗EGFR抗体に融合させることにより産生した。
A431細胞を、10%胎児ウシ血清(FBS;Mediatech)添加RPMI 1640倍血で培養した。ADC処置前日、A431細胞を、200μL体積中、1,000細胞/ウェルで透明底白色96ウェルプレートに播種した。細胞は未処置のままであるかサポリンコンジュゲートセツキシマブ(Wt−Sap)、サポリンコンジュゲートY104D(Y104D−Sap)、サポリンコンジュゲートY104D/Q111P(YDQP−Sap)またはサポリンコンジュゲートヒトIgGで、1μg/mLから出発して濃度を上げながら処置した。細胞を5日間ADC処置に付した。生存細胞を、5日目に、製造者の指示に従いCell Titer-glo Luminescent kit(Promega)で測定した。生存細胞のパーセンテージを、未処置細胞に対して計算し、EC50値をGraphPad Prismを使用して計算した。結果を下の表24に示す。結果は、A431癌細胞に対して、WT−Sapは、Y104D−SapおよびTDQP−Sapと同等の細胞増殖阻害(CGI)活性を示したことを示す。
新生児ケラチン生成細胞(HEK−N)細胞を、増殖因子添加Epilife培地(Gibco)で培養した。サポリンADC処置前日、HEK−N細胞を、200μL体積中、1,000細胞/ウェルで透明底白色96ウェルプレートに播種した。細胞は未処置のままであるかサポリンコンジュゲートセツキシマブ(Wt−Sap)、サポリンコンジュゲートY104D(Y104D−Sap)、サポリンコンジュゲートY104DQ111P(YDQP−Sap)またはサポリンコンジュゲートヒトIgGで、1μg/mLから出発して濃度を上げながら処置した。細胞を5日間ADC処置に付した。生存細胞を、5日目に、製造者の指示に従いCell Titer-glo Luminescent kit(Promega)で測定した。生存細胞のパーセンテージを、未処置細胞に対して計算し、EC50値をGraphPad Prismを使用して計算した。結果を下の表24に示す。結果は、ケラチン生成細胞に対して、WT−Sapが、Y104D−SapおよびTDQP−Sapよりはるかに高い(CGI)活性を示したことを示す。
第二コンビナトリアルライブラリーの産生およびスクリーニング
組み合わせ抗EGFR抗体変異体の第二世代ライブラリーを製造し、さらに変異体抗EGFR抗体候補を得た。候補を、低pH条件下、選択的結合について試験した。
第二コンビナトリアルライブラリーを、実施例2に記載した方法を使用するHC−Y104DおよびHC−Y104D/Q111Pの部位特異的変異誘発により、完全長抗EGFR抗体変異体HC−S053G/Y104DおよびHC−S053G/Y104D/Q111Pから製造した。次いで、新たに産生した変異体および先に産生したHC−Y104DおよびHC−Y104D/Q111Pを親クローンとして使用し、それに対し、変異S025V、F027G、T030FおよびD072Lを個々に付加して、表25に概説する20種の構築物のライブラリーを作製した。全構築物を配列検証した。
第二コンビナトリアルライブラリーの構築物およびセツキシマブを、上の実施例1に記載する標準的トランスフェクション方法を使用してCHO細胞に遺伝子導入し、抗体の発現を、先に記載したとおり上清中の濃度の測定により決定した(実施例1)。結果を表25に示す。結果は、ミニCPSライブラリーの多くのクローンが低発現であることを示す。
Y104D/Q111PおよびT030F/Y104D/Q111P変異体のヒト化およびスクリーニング
HC−Y104D/Q111P(クローン2−2;別名DP)およびHC−T030F/Y104D/Q111P(クローン2−14;別名FDP)の完全長軽鎖および重鎖CDR配列をコードする二本鎖DNAフラグメントを使用して、ヒト化クローンのライブラリーを製造し、次いでこれをpH依存性EGFR結合およびタンパク質発現レベルについてスクリーニングした。
CHO−S細胞を96ウェルプレートに播種し、ヒト化クローンで遺伝子導入した。各プレートはまたポジティブコントロール(HC−Y104D/Q111PまたはHC−T030F/Y104D/Q111P)およびネガティブコントロール(ベクターのみ)を含んだ。上清をトランスフェクション48時間後に回収した。IgG濃度を実施例1に記載のとおり決定した。上清を2ng/mLに調節し、実施例1に記載のとおり、pH感受性ELISAを使用してpH6.0およびpH7.4でのEGFR結合のpH依存性結合を試験した。pH6.0およびpH7.4での結合活性を、同一プレート上のポジティブコントロール(HC−Y104D/Q111PまたはHC−T030F/Y104D/Q111P)の結合活性と比較した。
上記ヒト化抗体ヒットの発現を、発現レベルについてもスクリーニングした。CHO−S細胞を、実施例1に記載の方法を使用して96ウェルプレートに播種し、上記表28および29に示した選択ヒト化クローンで遺伝子導入した。IgG濃度を実施例1に記載のとおり決定した。結果を表30に示す。結果は、ヒト化クローンの収率が親クローンと比較して実質的に増加することを示す。
Claims (37)
- 非修飾抗EGFR抗体の可変重鎖における位置104に対応するアミノ酸位置でのアスパラギン酸での置換(Y104D)を含む修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントであって:
該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントがEGFR抗原と結合するのに十分な可変重鎖および可変軽鎖またはその一部を含み、該可変重鎖単独または該可変重鎖および該可変軽鎖の両者は修飾されており;
該その一部は抗原結合部位を形成するのに十分であり、かつY104Dアミノ酸置換を含み;
該対応するアミノ酸位置は、該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変重鎖と配列番号3に示す可変重鎖のアラインメントにより同定し;
該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントは、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)またはその可溶性フラグメントに特異的に結合し、該非修飾抗EGFR抗体においてY104Dを含む最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個または11個のアミノ酸置換を含み;
該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントがY104Dに加えてアミノ酸置換を含むとき、該Y104Dに加えてのアミノ酸置換は、
(a)該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変重鎖またはその一部において、配列番号3に示すアミノ酸位置を参照して、V24E、V24I、V24L、S25C、S25H、S25R、S25A、S25D、S25G、S25M、S25Q、S25V、S25L、F27R、L29H、T30F、N31H、S53G、F63R、F63C、F63M、F63S、D72L、D72W、N73Q、K75H、K75W、Q77E、T100P、Q111PおよびQ111Vから選択されるアミノ酸置換に対応する少なくとも1つのアミノ酸置換、ここで:
該対応するアミノ酸位置は、該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変重鎖と配列番号3に示す可変重鎖のアラインメントにより同定し;
該その一部は抗原結合部位を形成するのに十分であり、かつ該アミノ酸置換を含む;および/または
(b)該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変軽鎖またはその一部において、配列番号4に示すアミノ酸位置を参照して、L4F、L4V、T5PおよびR24Gから選択されるアミノ酸置換に対応する少なくとも1つのアミノ酸置換、ここで:
該対応するアミノ酸位置は、該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変軽鎖と配列番号4に示す可変軽鎖のアラインメントにより同定し;
該その一部は抗原結合部位を形成するのに十分であり、かつ該アミノ酸置換を含む、
から選択され、
該非修飾抗EGFR抗体は:
i)(a) 配列番号3に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖、または
(b) 配列番号1に示す重鎖および配列番号2に示す軽鎖
を含むセツキシマブまたはその抗原結合フラグメント;
ii)配列番号8に示す重鎖および配列番号9に示す軽鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメント
iii)配列番号5に示す重鎖および配列番号2に示す軽鎖を含むFabフラグメントまたはその抗原結合フラグメント;および
iv)i)、ii)またはiii)のヒト化形態;
から選択され、
該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍環境において条件依存活性であり、非腫瘍環境の条件下と比較して、腫瘍環境の条件下で、ヒト上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)またはその可溶性フラグメントに少なくとも2.0の結合活性比を示し、
該腫瘍環境の条件は6.0〜6.5のpHまたは10mM〜20mMの乳酸濃度の一方または両者および10mg/mL〜50mg/mLのタンパク質濃度を含み;
該非腫瘍環境の条件は7.0〜7.8のpHまたは0.5mM〜5mMの乳酸濃度の一方または両者および10mg/mL〜50mg/mLのタンパク質濃度を含む、修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 該結合活性比が少なくとも3.0である、請求項1に記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 該抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントが、7.4のpHを含む非腫瘍環境の条件下と比較して6.0〜6.5のpHを含む腫瘍環境の条件下で該結合活性比を示す、請求項1に記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 該非腫瘍環境の条件が、7.0〜7.4のpH(両端を含む)および0.5mM〜2mMの乳酸濃度を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 該腫瘍環境の条件下および該非腫瘍環境の条件下のタンパク質濃度が同じである、請求項1〜4のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。
- i)a) 配列番号495、1062、1112、1114〜1117、1124〜1126または1128〜1130に示すアミノ酸の配列を含む可変重鎖;および
b) 配列番号4または10に示すアミノ酸の配列を含む可変軽鎖を含む、抗体;および
ii)i)の抗体の抗原結合フラグメント;
から選択される、請求項1〜5のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 次のものを含む抗体から選択される、修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント:
a) 配列番号495に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
b) 配列番号1062に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
c) 配列番号1112に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
d) 配列番号1114に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
e) 配列番号1115に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
f) 配列番号1116に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
g) 配列番号1117に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
h) 配列番号1124に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
i) 配列番号1125に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
j) 配列番号1126に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
k) 配列番号1128に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
l) 配列番号1129に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;
m) 配列番号1130に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖;および
n) 配列番号1118に示す可変重鎖および配列番号4または10に示す可変軽鎖。 - アミノ酸置換がY104Dのみである、請求項1に記載の修飾抗EGFR抗体またはそのフラグメント。
- アミノ酸置換がHC−Y104D/HC−Q111P;HC−S25C/HC−Y104D;HC−S53G/HC−Y104D;HC−S53G/HC−Y104D/HC−Q111P;HC−S25V/HC−Y104D;HC−S25V/HC−Y104D/HC−Q111P;HC−S25V/HC−S53G/HC−Y104D;HC−S25V/HC−S53G/HC−Y104D/HC−Q111P;HC−T30F/HC−Y104D;HC−T30F/HC−Y104D/HC−Q111P;HC−T30F/HC−S53G/HC−Y104D;HC−T30F/HC−S53G/HC−Y104D/HC−Q111P;HC−D72L/HC−Y104D;HC−D72L/HC−Y104D/HC−Q111P;HC−S53G/HC−D72L/HC−Y104D;またはHC−S53G/HC−D72L/HC−Y104D/HC−Q111Pのみである、請求項1に記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 非修飾抗EGFR抗体が:
配列番号1に示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する軽鎖;または
配列番号8に示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号9に示すアミノ酸の配列を有する軽鎖を含む、
請求項1〜9のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 該非修飾抗EGFR抗体がヒト化されている、請求項1〜10のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 該非修飾抗EGFR抗体が配列番号28に示す可変重鎖および配列番号29に示す可変軽鎖を含む、請求項11に記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 該非修飾抗EGFR抗体が抗原結合フラグメントであり;
該抗原結合フラグメントはFab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、二重特異性抗体、FdおよびFd’フラグメントから選択される、請求項1〜12のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 完全長IgG抗体であるか、またはFab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、二重特異性抗体、FdおよびFd’フラグメントから選択される抗原結合フラグメントである、請求項1〜13のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 標的剤に直接的または間接的に結合した請求項1〜14のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、コンジュゲート。
- 該標的剤が治療部分である、請求項15に記載のコンジュゲート。
- 該治療部分が細胞毒性部分、放射性同位体、化学療法剤、溶菌性ペプチドまたはサイトカインである、請求項16に記載のコンジュゲート。
- 該治療部分がタキソール;サイトカラシンB;グラミシジンD;臭化エチジウム;エメチン;マイトマイシン;エトポシド;テニポシド;ビンクリスチン;ビンブラスチン;コルヒチン;ドキソルビシン;ダウノルビシン;ジヒドロキシアントラシンジオン;マイタンシンまたはその類似体もしくは誘導体;オーリスタチンまたはその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体;ドラスタチン10または15またはその類似体;イリノテカンまたはその類似体;ミトキサントロン;ミトラマイシン;アクチノマイシンD;1−デヒドロテストステロン;グルココルチコイド;プロカイン;テトラカイン;リドカイン;プロプラノロール;ピューロマイシン;カリチアマイシンまたはその類似体もしくは誘導体;代謝拮抗剤;アルキル化剤;白金誘導体;デュオカルマイシンA、デュオカルマイシンSA、ラシェルマイシン(CC−1065)またはその類似体もしくは誘導体;抗生物質;ピロロ[2,l−c][1,4]−ベンゾジアゼピン類(PDB);毒素;リボヌクレアーゼ(RNase);DNase I、ブドウ球菌エンテロトキシンA;およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質から選択される、請求項17に記載のコンジュゲート。
- 該治療部分がアンサマイトシンまたはメルタンシン(DM1)から選択されるマイタンシノイドであるマイタンシン誘導体であるか;または
オーリスタチンまたはモノメチルオーリスタチンE(MMAE)またはF(MMAF)であるその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体であるか;または
メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5−フルオロウラシル、ダカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビンおよびクラドリビンから選択される代謝拮抗剤であるか;または
メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(DTIC)、プロカルバジンおよびマイトマイシンCから選択されるアルキル化剤であるか;または
シスプラチンまたはカルボプラチンである白金誘導体であるか;または
ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンおよびアントラマイシン(AMC)から選択される抗生物質であるか;または
ジフテリア毒素およびその活性フラグメントおよびハイブリッド分子、リシン毒素、コレラ毒素、志賀毒素様毒素、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ボウマン・バーク大豆プロテアーゼインヒビター、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ガラニン、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシン毒素から選択される毒素である、
請求項17または請求項18に記載のコンジュゲート。 - 請求項1〜14のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの重鎖をコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸分子;
L4F、L4V、T5PおよびR24Gから選択されるアミノ酸置換に対応する少なくとも1つのアミノ酸置換を含む請求項1〜5および10〜14のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの軽鎖をコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸分子;および
請求項1〜14のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸分子、
の1つ以上から選択される、核酸分子。 - 該コンジュゲートが融合タンパク質を含む、請求項15〜19のいずれかに記載のコンジュゲートをコードする核酸分子。
- 請求項20または請求項21に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項22に記載のベクターを含む、単離された細胞または細胞培養物。
- 修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントの製造方法であって、該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖および/または軽鎖を産生する条件下、請求項20に記載の核酸分子を含む細胞または請求項20に記載の核酸分子を含む請求項22に記載のベクターを含む細胞を培養することを含む、方法。
- 該重鎖および/または軽鎖を単離することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 該重鎖および軽鎖が単一ベクターにおいて発現され、修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する、請求項24に記載の方法。
- 該重鎖が第一ベクターにおいて発現され、該軽鎖が第一ベクターと異なる第二ベクターにおいて発現され、修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する、請求項24に記載の方法。
- 該修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することをさらに含む、請求項26または請求項27に記載の方法。
- ポリペプチドに結合した修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートの製造方法であって、該コンジュゲートが産生される条件下、請求項21に記載の核酸分子を含む細胞または請求項21に記載の核酸分子を含む請求項22に記載のベクターを含む細胞を培養することを含む、方法。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項15〜19のいずれかに記載のコンジュゲート;および
薬学的に許容される担体または添加物
を含む、医薬組成物。 - 腫瘍、癌および/または転移を処置するための使用のための、請求項30に記載の医薬組成物。
- 腫瘍、癌または転移の処置のための医薬として製剤された、請求項30または31に記載の医薬組成物。
- 腫瘍、癌または転移を処置するための医薬の製造のための、請求項1〜14のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項15〜19のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項30〜32のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体または抗原結合フラグメントまたは請求項15〜19のいずれかに記載のコンジュゲート;および
化学療法剤または抗癌剤
を含む、組み合わせ剤。 - 該化学療法剤がアルキル化剤、ニトロソウレア類、トポイソメラーゼ阻害剤および抗体から選択される、請求項34に記載の組み合わせ剤。
- 1個以上の容器中に請求項1〜14のいずれかに記載の修飾抗EGFR抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項15〜19のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項34または請求項35に記載の組み合わせ剤を含む、キット。
- 該コンジュゲートを単離することをさらに含む、請求項29に記載の方法。
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