JP6181089B2 - 条件依存活性抗上皮細胞増殖因子受容体抗体およびその使用方法 - Google Patents

条件依存活性抗上皮細胞増殖因子受容体抗体およびその使用方法 Download PDF

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Description

関連出願
優先権の利益を、２０１２年３月８日出願の“条件依存活性抗上皮細胞増殖因子受容体抗体およびその使用方法”なる表題の、米国仮出願番号６１／６８５,０８９に基づいて主張する。
本出願は、これと同日付出願の、米国仮出願番号６１／６８５,０８９に基づく優先権を主張する、“条件依存活性抗上皮細胞増殖因子受容体抗体およびその使用方法”なる表題の米国特許出願番号１３／８１５,５５３と関連する。
本出願はまた、２０１１年９月２７日出願の“条件依存活性治療的タンパク質の評価および同定または進展のための方法”なる表題の、Lalitha Kodandapani、Louis Howard Bookbinder、Gregory I. Frost、Philip Lee Sheridan、Harold Michael Shepard、Ge WeiおよびLei Huangの米国出願番号１３／２００,６６６にも関連し、これは、２０１１年９月８日出願の、“条件依存活性治療的タンパク質の評価および同定または進展のための方法”なる表題のLalitha Kodandapani、Louis Howard Bookbinder、Gregory I. Frost、Philip Lee Sheridan、Harold Michael Shepard、Ge WeiおよびLei Huangの国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／５０８９１の一部継続出願であり、これは、２０１０年９月８日出願の、“条件依存活性治療的タンパク質の評価および同定または進展のための方法および条件依存活性治療的タンパク質”なる表題のLalitha Kodandapani、Philip Lee Sheridan、Harold Michael Shepard、Louis H. BookbinderおよびGregory I. Frostの米国仮出願番号６１／４０２,９７９に基づく優先権を主張する。
上記出願の各々の主題を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
電子的に提出した配列表の引用による取り込み
配列表の電子版はこれと共に提出し、その内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる。電子ファイルは２０１３年３月８日に準備し、１２３７キロバイトサイズであり、名称3104seqPC1.txtである。
発明の分野
ここに提供されるのは、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体および修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸分子である。また提供されるのは、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体を使用する処置方法である。
背景
抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト疾患、例えば癌の処置および診断のために臨床の現場で使用される。例えば、治療用抗体の例はセツキシマブを含む。セツキシマブは、再発または転移性頭頸部癌、結腸直腸癌および他の疾患および状態の処置に対して承認されている。ＥＧＦＲの過発現またはＥＧＦＲの異常シグナル伝達または活性化が関与する他の疾患または状態の処置にも使用できる。投与された抗ＥＧＦＲ抗体は、健常細胞および組織におけるＥＧＦＲと結合できる。これは、投与できる投与量を制限する。それゆえに、セツキシマブおよび他の抗ＥＧＦＲ抗体は、患者に投与するとき限界がある。従って、改善された抗ＥＧＦＲ抗体の提供が、とりわけ本発明における目的である。
要約
提供されるのは、条件依存活性抗上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)抗体およびその抗原結合フラグメントである。抗体およびそのフラグメントは、例えば、約７〜７.２の中性ｐＨを有する皮膚の基底層で生じるような、非標的組織、例えば非腫瘍組織環境よりも、酸性ｐＨを有する標的組織、例えば腫瘍微小環境で大きな活性を示すように条件依存活性である。一般に、抗腫瘍治療剤として使用される抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ受容体と結合し、そのリガンドとの結合により起こるＥＧＦＲ介在活性を阻害する。その結果、それらは腫瘍を阻害し、または処置できる。腫瘍以外の組織、例えば皮膚における組織がＥＧＦＲを発現するため、抗ＥＧＦＲ抗体はこれらの受容体の活性を阻害し、それにより望ましくない副作用を起こす。ここに提供される抗体は、条件依存活性ではない抗体と比較しておよび／または腫瘍微小環境におけるそれらの活性と比較して、非腫瘍微小環境(例えば中性ｐＨを有する)で活性の低下を示す点で、条件依存活性である。腫瘍微小環境への選択性により、それらは望ましくない副作用が少なくまたは軽度でありおよび／または高投与量で投与できるために改善された効果を示す。
ここに提供されるのは、腫瘍微小環境の条件下で条件依存活性である、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここで、該抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、非腫瘍環境条件下と比較して、腫瘍環境におけるヒト上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントへの少なくとも３.０の結合活性比を示す。このような例において、腫瘍環境における条件は、正確にまたは約５.６〜６.８のｐＨまたは正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLのタンパク質濃度を含み、非腫瘍環境の条件は、正確にまたは約７.０〜７.８のｐＨまたは正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLのタンパク質濃度を含む。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、正確にまたは約７.０〜７.８のｐＨを含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約５.６〜６.８のｐＨを含む腫瘍微小環境において存在する条件下で、該活性比を示す。他の例において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、約７.４のｐＨを含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、約６.０〜６.５のｐＨを含む腫瘍微小環境において存在する条件下で、該活性比を示す。いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度を含む腫瘍微小環境において存在する条件下で、該活性比を示す。ここでの具体例において、上記本発明の抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、７.０〜７.４のｐＨ(両端を含む)および０.５mM〜２mMの乳酸濃度を含む非腫瘍微小環境の条件下と比較して、６.０〜６.５のｐＨおよび１０mM〜２０mMの乳酸濃度を含む腫瘍微小環境の条件下で、該活性比を示す。
このような例のいずれかで、正確にまたは約１０mg／mL〜５０mg／mLのタンパク質濃度の存在下で該結合活性比を示しまたは与え、ここで、腫瘍微小環境下および非腫瘍微小環境下の該タンパク質濃度は実質的に同一または同一である。例えば、タンパク質濃度は少なくとも１２mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mL、４０mg／mL、４５mg／mLまたは５０mg／mLである。タンパク質は血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンであり得る。タンパク質は血清、例えばヒト血清中に提供される。例えば、血清の濃度は２０％(vol/vol)〜９０％(vol/vol)、２０％(vol/vol)〜５０％(vol/vol)または２０％(vol/vol)〜４０％(vol/vol)であり、例えば９０％(vol/vol)未満であり、約または正確に少なくともまたは２０％(vol/vol)、２５％(vol/vol)、３０％(vol/vol)、３５％(vol/vol)、４０％(vol/vol)、４５％(vol/vol)または５０％(vol/vol)である。具体例において、該活性比は、正確にまたは約２５％(vol/vol)である血清濃度、例えばヒト血清濃度を含む条件下で存在する。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの上記のあらゆる例において、該結合活性比は、ヒトＥＧＦＲまたはその可溶性フラグメントに対する結合活性の測定または評価が可能ないずれかのアッセイで決定して、非腫瘍微小環境における条件下と比較した、腫瘍微小環境における条件下の活性比である。例えば、結合活性は、インビトロで固相結合アッセイにより決定できる。固相結合アッセイは、免疫アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)であり得る。このような例において、結合活性は結合の分光光度的測定値であり、結合活性比は、同一濃度の抗体、例えば正確にまたは約１ng／mL〜１００ng／mLである濃度の抗体で、非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較した、腫瘍微小環境において存在する条件下での結合に対する分光光度的測定値の比である。
他の例において、結合活性はバイオセンサーを使用して決定した解離定数(ＫＤ)であり、抗体またはその抗原結合フラグメントは、非腫瘍微小環境における条件下と比較して、腫瘍微小環境における条件下で、少なくとも３倍緊密な親和性があるならば、少なくとも３の比率を示す。このような例において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、典型的に、腫瘍微小環境に存在する条件下で、１×１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ未満またはそれ以下の解離定数(ＫＤ)を示す。さらなる例において、結合活性はバイオセンサーを使用して決定するオフ速度であり、抗体またはその抗原結合フラグメントは、オフ速度が非腫瘍微小環境下に存在する条件下と比較して、腫瘍微小環境に存在する条件下で少なくとも３倍遅いならば、少なくとも３の比を示す。バイオセンサーを使用するこのような例のいずれかで、バイオセンサーはBiacoreセンサーまたはOctetセンサーまたは当業者に知られる他の類似のバイオセンサーであり得る。
ここでのさらなる例において、結合活性は、インビボで、対象においてＥＧＦＲを発現する腫瘍微小環境またはＥＧＦＲを発現する非腫瘍微小環境において評価する。このような例において、非腫瘍微小環境はヒトＥＧＦＲを発現する皮膚の基底層である。このようなインビボ結合活性は、腫瘍微小環境がヒトＥＧＦＲを発現するヒト腫瘍異種移植片であり、非腫瘍微小環境がヒトＥＧＦＲを発現するヒト皮膚異種移植片である、非ヒト動物である対象で決定できる。例えば、ヒト腫瘍異種移植片はＡ４３１異種移植片である。このような例において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、蛍光標識され、両条件下の結合活性を蛍光シグナル強度として決定でき、これをコントロールＩｇＧに対して規準化できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのあらゆる例において、該活性比は少なくとも３.５、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはそれ以上である。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのあらゆる例において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、最も近いヒトＶＨ遺伝子断片生殖系列配列に対して少なくとも５６％配列同一性を示す可変重鎖；および最も近いヒトＶＬ遺伝子断片生殖系列配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示す軽鎖を含む。
例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントにとりわけ含まれるのは、配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４〜１１１８、１１２４〜１１２６、１１２８〜１１３０、１１３４〜１１３７または１１４６〜１１５２に示すアミノ酸の配列または配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４〜１１１８、１１２４〜１１２６、１１２８〜１１３０、１１３４〜１１３７または１１４６〜１１５２のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する可変重(ＶＨ)鎖および配列番号４、１０、１１３８〜１１４５、１１５３〜１１５９または１１８６に示すアミノ酸の配列または配列番号４、１０、１１３８〜１１４５、１１５３〜１１５９または１１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する可変軽(ＶＬ)鎖を含む、抗体である。
例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの非限定的例は、次のものを含む抗体である：
ａ) 配列番号４９５に示す可変重鎖または配列番号４９５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｂ) 配列番号１０６２に示す可変重鎖または配列番号１０６２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｃ) 配列番号１１１２に示す可変重鎖または配列番号１１１２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｄ) 配列番号１１１４に示す可変重鎖または配列番号１１１４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｅ) 配列番号１１１５に示す可変重鎖または配列番号１１１５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｆ) 配列番号１１１６に示す可変重鎖または配列番号１１１６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｇ) 配列番号１１１７に示す可変重鎖または配列番号１１１７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｈ) 配列番号１１２４に示す可変重鎖または配列番号１１２４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｉ) 配列番号１１２５に示す可変重鎖または配列番号１１２５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｊ) 配列番号１１２６に示す可変重鎖または配列番号１１２６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｋ) 配列番号１１２８に示す可変重鎖または配列番号１１２８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｌ) 配列番号１１２９に示す可変重鎖または配列番号１１２９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｍ) 配列番号１１３０に示す可変重鎖または配列番号１１３０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｎ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１３８に示す可変軽鎖または配列番号１１３８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｏ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１３９に示す可変軽鎖または配列番号１１３９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｐ) 配列番号１１３５に示す可変重鎖または配列番号１１３５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１３８に示す可変軽鎖または配列番号１１３８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｑ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４０に示す可変軽鎖または配列番号１１４０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｒ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４１に示す可変軽鎖または配列番号１１４１に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｓ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４２に示す可変軽鎖または配列番号１１４２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｔ) 配列番号１１３５に示す可変重鎖または配列番号１１３５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４２に示す可変軽鎖または配列番号１１４２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｕ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４３に示す可変軽鎖または配列番号１１４３に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｖ) 配列番号１１３６に示す可変重鎖または配列番号１１３６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４２に示す可変軽鎖または配列番号１１４２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｗ) 配列番号１１３７に示す可変重鎖または配列番号１１３７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４４に示す可変軽鎖または配列番号１１４４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｘ) 配列番号１１３６に示す可変重鎖または配列番号１１３６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４４に示す可変軽鎖または配列番号１１４４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｙ) 配列番号１１３７に示す可変重鎖または配列番号１１３７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４５に示す可変軽鎖または配列番号１１４５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｚ) 配列番号１１３６に示す可変重鎖または配列番号１１３６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４５に示す可変軽鎖または配列番号１１４５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ａａ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５３に示す可変軽鎖または配列番号１１５３に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｂｂ) 配列番号１１４７に示す可変重鎖または配列番号１１４７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５３に示す可変軽鎖または配列番号１１５３に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｃｃ) 配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５４に示す可変軽鎖または配列番号１１５４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｄｄ) 配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５４に示す可変軽鎖または配列番号１１５４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｅｅ) 配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５５に示す可変軽鎖または配列番号１１５５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｆｆ) 配列番号１１５１に示す可変重鎖または配列番号１１５１に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｇｇ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または１１４８または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列または１１４８および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｈｈ) 配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｉｉ) 配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｊｊ) 配列番号１１５２に示す可変重鎖または配列番号１１５２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｋｋ) 配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｌｌ) 配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｍｍ) 配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｎｎ) 配列番号１１５２に示す可変重鎖または配列番号１１５２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｏｏ) 配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｐｐ) 配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｑｑ) 配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５８に示す可変軽鎖または配列番号１１５８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｒｒ) 配列番号１１５２に示す可変重鎖または配列番号１１５２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５９に示す可変軽鎖または配列番号１１５９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｓｓ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５９に示す可変軽鎖または配列番号１１５９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｔｔ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｕｕ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；および
ｖｖ) 配列番号１１１８に示す可変重鎖または配列番号１１１８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号４または１０に示す可変軽鎖または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列。
上記の抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで、配列同一性は少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８％、９９％またはそれ以上である。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれにも含まれるのは、本抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞において、少なくとも１mg／mL、例えば少なくとも１.５mg／mL、２mg／mL、３mg／mL、５mg／mL、６mg／mL、７mg／mL、８mg／mL、９mg／mL、１０mg／mLまたはそれ以上の濃度で発現され得る抗体またはその抗原結合フラグメントである。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントのいずれも、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである抗体である。例えば、とりわけここで提供される条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体は、この条件依存活性を示さないまたは条件依存活性を示す程度が低い、抗ＥＧＦＲ抗体の変異体である抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントである。それゆえに、提供されるのは、セツキシマブと命名された治療用抗体の修飾形態およびセツキシマブの他の変異体、例えばそのヒト化変異体および他の形態である抗体である(例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を記載する公開国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１１０５９７６２、ＷＯ２００５０５６６０６Ａ２、ＷＯ２００６００９６９４、ＷＯ２０１００８０４６３、ＷＯ２０１２０２００５９、ＷＯ２００８１５２５３７、ＷＯ９６４０２１０および米国特許番号７,０６０,８０８、７,７２３,４８４および７,９３０,１０７参照)。それゆえに、非修飾抗体は、アミノ酸置換を含まず、ＥＧＦＲに特異的に結合するセツキシマブ抗体、その抗原結合フラグメントおよびその変異体であり得る(例えば、公開国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１１０５９７６２、ＷＯ２００５０５６６０６Ａ２、ＷＯ２００６００９６９４、ＷＯ２０１００８０４６３、ＷＯ２０１２０２００５９、ＷＯ２００８１５２５３７、ＷＯ９６４０２１０および米国特許番号７,０６０,８０８、７,７２３,４８４および７,９３０,１０７および出願／特許の他のファミリーメンバーのいずれかに記載された抗ＥＧＦＲ抗体参照)。修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントは、腫瘍微小環境において条件依存活性である。
条件依存活性抗体、例えば修飾、抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントは、非修飾抗体の可変重鎖、可変軽鎖もしくは両者またはその抗原結合フラグメント中のこのような領域にアミノ酸置換を有するものを含む。ある例において、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体はアミノ酸置換を含まず、ＥＧＦＲに特異的に結合するセツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体である。具体例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントは、ｐＨの差以外同一条件下で測定したとき、正確にまたは約ｐＨ７.４と比較して、正確にまたは約ｐＨ６.０〜ｐＨ６.５で、少なくとも２.０のＥＧＦＲに対する結合活性比を示すことができる。ある例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、同一条件下で測定したとき、ｐＨ７.４での非修飾抗体と比較して、ｐＨ７.４でＥＧＦＲに対する４０％未満の結合活性を示すが、ただし、修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントはａ)Ｎ３１Ｉ、Ｎ３１Ｖ、Ｖ５０Ｌ、Ｙ５９ＥおよびＴ６４Ｎから選択されるアミノ酸置換を含む可変重鎖；またはｂ)アミノ酸置換Ｌ４Ｃを含む可変軽鎖を含まない。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントのあらゆる例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、同一条件下で測定したとき、ｐＨ６.０〜ｐＨ６.５での非修飾抗体と比較して、正確にまたは約ｐＨ６.０〜ｐＨ６.５で、ＥＧＦＲに対する少なくとも２０％の結合活性を示す。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントのあらゆる例において、可変重鎖またはその一部は、配列番号３に示すアミノ酸位置に対応して、ＨＣ−Ｖ２４Ｅ、ＨＣ−Ｖ２４Ｉ、ＨＣ−Ｖ２４Ｌ、ＨＣ−Ｓ２５Ｃ、ＨＣ−Ｓ２５Ｈ、ＨＣ−Ｓ２５Ｒ、ＨＣ−Ｓ２５Ａ、ＨＣ−Ｓ２５Ｄ、ＨＣ−Ｓ２５Ｇ、ＨＣ−Ｓ２５Ｍ、ＨＣ−Ｓ２５Ｑ、ＨＣ−Ｓ２５Ｖ、ＨＣ−Ｓ２５Ｌ、ＨＣ−Ｓ２８Ｃ、ＨＣ−Ｌ２９Ｈ、ＨＣ−Ｎ３１Ｈ、ＨＣ−Ｇ５４Ｄ、ＨＣ−Ｇ５４Ｓ、ＨＣ−Ｆ６３Ｒ、ＨＣ−Ｆ６３Ｃ、ＨＣ−Ｆ６３Ｍ、ＨＣ−Ｆ６３Ｐ、ＨＣ−Ｆ６３Ｓ、ＨＣ−Ｔ６４Ｖ、ＨＣ−Ｌ６７Ｇ、ＨＣ−Ｄ７２Ｌ、ＨＣ−Ｄ７２Ｐ、ＨＣ−Ｄ７２Ｗ、ＨＣ−Ｎ７３Ｑ、ＨＣ−Ｋ７５Ｈ、ＨＣ−Ｋ７５Ｇ、ＨＣ−Ｋ７５Ｐ、ＨＣ−Ｋ７５Ｗ、ＨＣ−Ｓ７６Ｉ、ＨＣ−Ｓ７６Ｖ、ＨＣ−Ｑ７７Ｅ、ＨＣ−Ｔ１００Ｐ、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ、ＨＣ−Ｙ１０４Ｓ、ＨＣ−Ｙ１０４Ｖ、ＨＣ−Ｑ１１１Ｉ、ＨＣ−Ｑ１１１Ｖから選択されるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含む。対応するアミノ酸位置は本抗体のＶＨ鎖と、配列番号３に示すＶＨ鎖のアラインメントにより同定できる。その一部は、抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含み得る。ある例において、修飾可変軽鎖またはその一部は、配列番号４に示すアミノ酸位置に対応して、ＬＣ−Ｌ４Ｆ、ＬＣ−Ｌ４Ｖ、ＬＣ−Ｔ５ＰおよびＬＣ−Ｒ２４Ｇから選択されるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含む。対応するアミノ酸位置は本抗体のＶＬ鎖と配列番号４に示すＶＬ鎖のアラインメントにより同定でき、その一部は、抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含み得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントにまた含まれるのは、非修飾抗体の可変軽鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)Ｌ２において１個以上のアミノ酸残基のアミノ酸置換を含む。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントにおいて、可変軽鎖またはその一部は、配列番号４に示すアミノ酸残基に対応して、ＬＣ−Ａ５１Ｔ、ＬＣ−Ａ５１Ｌ、ＬＣ−Ｓ５２Ａ、ＬＣ−Ｓ５２Ｃ、ＬＣ−Ｓ５２Ｄ、ＬＣ−Ｓ５２Ｅ、ＬＣ−Ｓ５２Ｇ、ＬＣ−Ｓ５２Ｉ、ＬＣ−Ｓ５２Ｍ、ＬＣ−Ｓ５２Ｑ、ＬＣ−Ｓ５２Ｖ、ＬＣ−Ｓ５２Ｗ、ＬＣ−Ｓ５２Ｒ、ＬＣ−Ｓ５２Ｋ、ＬＣ−Ｅ５３Ｇ、ＬＣ−Ｓ５４Ｍ、ＬＣ−Ｉ５５Ａ、ＬＣ−Ｉ５５Ｆ、ＬＣ−Ｓ５６Ｇ、ＬＣ−Ｓ５６Ｌ、ＬＣ−Ｓ５６Ａ、ＬＣ−Ｓ５６Ｃ、ＬＣ−Ｓ５６Ｄ、ＬＣ−Ｓ５６Ｅ、ＬＣ−Ｓ５６Ｆ、ＬＣ−Ｓ５６Ｎ、ＬＣ−Ｓ５６Ｐ、ＬＣ−Ｓ５６Ｑ、ＬＣ−Ｓ５６Ｖ、ＬＣ−Ｓ５６Ｗ、ＬＣ−Ｓ５６Ｈ、ＬＣ−Ｓ５６ＲおよびＬＣ−Ｓ５６Ｋから選択されるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含み得る。その一部は、抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含み得る。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントのいずれかのある例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントは腫瘍微小環境において条件依存活性である。
また修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントに含まれるのは、非修飾抗体の可変重(ＶＨ)鎖、可変軽(ＶＬ)鎖または両者が修飾されていない抗体にアミノ酸置換を含むものすべてである。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のある例において、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、アミノ酸置換を含まず、ＥＧＦＲと特異的に結合するセツキシマブ、抗原結合フラグメントまたはその変異体である。ＶＨ鎖におけるアミノ酸置換残基は、配列番号３に示すアミノ酸位置と対比して、対応するアミノ酸位置は抗体のＶＨ鎖と配列番号３に示すＶＨ鎖のアラインメントにより同定して、例えば、２６位、３６位、６６位、６９位、７５位、９３位、９４位、１０９位、１１０位、１１１位および１１２位から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置に出現してよい。ある例において、ＶＬ鎖におけるアミノ酸置換は、配列番号４に示すアミノ酸位置に対して、対応するアミノ酸位置は抗体のＶＬ鎖と配列番号４に示すＶＬ鎖のアラインメントにより同定して、２９位、４８位、５１位、５２位、５３位、５５位、５６位、８６位および９８位から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置に出現してよい。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントのいずれかのある例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントは腫瘍微小環境において条件依存活性である。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、可変重鎖またはその一部が、配列番号３に示すアミノ酸残基に対応して、Ｇ２６Ｈ、Ｇ０２６Ｒ、Ｇ０２６Ｄ、Ｇ０２６Ｆ、Ｇ０２６Ｍ、Ｇ０２６Ｎ、Ｇ０２６Ｐ、Ｇ０２６Ｑ、Ｇ０２６Ｓ、Ｇ０２６Ｙ、Ｇ０２６Ｌ、Ｗ０３６Ｋ、Ｗ０３６Ａ、Ｗ０３６Ｉ、Ｗ０３６Ｖ、Ｗ０３６Ｙ、Ｒ０６６Ｌ、Ｒ０６６Ａ、Ｒ０６６Ｃ、Ｒ０６６Ｅ、Ｒ０６６Ｆ、Ｒ０６６Ｎ、Ｒ０６６Ｐ、Ｒ０６６Ｑ、Ｒ０６６Ｓ、Ｒ０６６Ｔ、Ｒ０６６Ｖ、Ｒ０６６Ｇ、Ｉ０６９Ａ、Ｉ０６９Ｃ、Ｉ０６９Ｇ、Ｉ０６９Ｙ、Ｋ０７５Ｈ、Ｋ０７５Ｒ、Ｋ０７５Ｌ、Ｋ０７５Ａ、Ｋ０７５Ｃ、Ｋ０７５Ｅ、Ｋ０７５Ｆ、Ｋ７５Ｇ、Ｋ０７５Ｍ、Ｋ７５Ｐ、Ｋ０７５Ｑ、Ｋ０７５Ｔ、Ｋ０７５Ｖ、Ｋ０７５Ｗ、Ｋ０７５Ｙ、Ｙ０９３Ｈ、Ｙ０９３Ｖ、Ｙ０９３Ｗ,Ｙ０９４Ｒ、Ｙ０９４Ｌ、Ｗ１０９Ｉ、Ｗ１０９Ｍ、Ｗ１０９Ｙ、Ｇ１１０Ｒ、Ｇ１１０Ａ、Ｇ１１０Ｍ、Ｇ１１０Ｐ、Ｇ１１０Ｔ、Ｑ１１１Ｋ、Ｑ１１１Ｈ、Ｑ１１１Ｒ、Ｑ１１１Ｌ、Ｑ１１１Ｄ、Ｑ１１１Ｅ、Ｑ１１１Ｇ、Ｑ１１１Ｉ、Ｑ１１１Ｍ、Ｑ１１１Ｐ、Ｑ１１１Ｓ、Ｑ１１１Ｔ、Ｑ１１１Ｖ、Ｑ１１１Ｗ、Ｑ１１１Ｙ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｎ、Ｇ１１２Ｐ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２ＴおよびＨＣ−Ｇ１１２Ｙから選択されるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を有し、その一部は抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含む；および／または可変軽鎖またはその一部が、配列番号４に示すに対応して、Ｉ０２９Ａ、Ｉ０２９Ｅ、Ｉ０２９Ｆ、Ｉ０２９Ｓ、Ｉ０２９Ｔ、Ｉ０２９Ｒ、Ｉ０４８Ｍ、Ｉ０４８Ｓ、Ｉ０４８Ｌ、Ｉ０４８Ｋ、Ａ０５１Ｔ、Ａ０５１Ｌ、Ｓ０５２Ａ、Ｓ０５２Ｃ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｅ、Ｓ０５２Ｇ、Ｓ０５２Ｉ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｑ、Ｓ０５２Ｖ、Ｓ０５２Ｗ、Ｓ０５２Ｒ、Ｓ０５２Ｋ、Ｅ５３Ｇ、Ｉ０５５Ａ、Ｉ０５５Ｆ、Ｓ０５６Ｇ、Ｓ０５６Ｌ、Ｓ０５６Ａ、Ｓ０５６Ｃ、Ｓ０５６Ｄ、Ｓ０５６Ｅ、Ｓ０５６Ｆ、Ｓ０５６Ｎ、Ｓ０５６Ｐ、Ｓ０５６Ｑ、Ｓ０５６Ｖ、Ｓ０５６Ｗ、Ｓ０５６Ｈ、Ｓ０５６Ｒ、Ｓ０５６Ｋ、Ｙ０８６Ｆ、Ｙ０８６Ｍ、Ｙ０８６Ｈ、Ｆ０９８Ａ、Ｆ０９８Ｍ、Ｆ０９８Ｓ、Ｆ０９８ＶおよびＦ０９８Ｙから選択されるアミノ酸置換に対応するアミノ置換を有し、その一部は抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含むあらゆるものを含む。
ここでのあらゆる例において、正確にまたは約ｐＨ７.４と比較した、ｐＨ６.０またはｐＨ６.５での修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントの結合活性比は、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、４.０、４.５、５.０またはそれより大きい。ここでのあらゆる例において、ここで提供される修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントは、ｐＨの差以外同一条件下で測定したとき、正確にまたは約ｐＨ７.４と比較して、正確にまたは約ｐＨ６.０〜ｐＨ６.５で、ＥＧＦＲに対して少なくとも２.０より大きい結合活性比を示す。
ここでのあらゆる例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｐＨ７.４での配列番号３に示す可変重鎖および配列番号４または配列番号１０に示す可変軽鎖を含むセツキシマブ抗体の対応する形態と比較して、結合活性は同一条件下で測定して、ｐＨ７.４でＥＧＦＲに対する結合活性が減少してよい。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、セツキシマブ抗体の対応する形態の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％未満またはそれ以下の結合活性を示し得る。
ここでのあらゆる例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｐＨ７.４で配列番号３に示す可変重鎖および配列番号４または配列番号１０に示す可変軽鎖を含むセツキシマブ抗体の対応する形態と比較して、結合活性は同一条件下で測定して、正確にまたは約ｐＨ６.０〜６.５でＥＧＦＲに対して高い結合活性を示し得る。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、セツキシマブ抗体の対応する形態の１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％を超えるまたはそれ以上の結合活性を示し得る。
またここに提供される抗ＥＧＦＲ抗体に含まれるのは、非修飾抗体の可変重(ＶＨ)鎖、可変軽(ＶＬ)鎖または両者が修飾されていない抗体におけるアミノ酸置換を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある例において、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、アミノ酸置換を含まず、ＥＧＦＲと特異的に結合するセツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体である。ＶＨ鎖またはその一部は、配列番号３に示すアミノ酸位置に対して、対応するアミノ酸位置は抗体のＶＨ鎖と配列番号３に示すＶＨ鎖のアラインメントにより同定して、Ｔ０２３Ｈ、Ｔ０２３Ｒ、Ｔ０２３Ｃ、Ｔ０２３Ｅ、Ｔ０２３Ｇ、Ｔ０２３Ｉ、Ｔ０２３Ｍ、Ｔ０２３Ｎ、Ｔ０２３Ｐ、Ｔ０２３Ｓ、Ｔ０２３Ｖ、Ｔ０２３Ｗ、Ｔ０２３Ｌ、Ｖ０２４Ｒ、Ｖ０２４Ｆ、Ｖ０２４Ｇ、Ｖ０２４Ｉ、Ｖ０２４Ｍ、Ｖ０２４Ｐ、Ｖ０２４Ｓ、Ｖ０２４Ｔ、Ｖ０２４Ｌ、Ｓ０２５Ｈ、Ｓ０２５Ｒ、Ｓ０２５Ａ、Ｓ０２５Ｄ、Ｓ０２５Ｅ、Ｓ０２５Ｆ、Ｓ０２５Ｇ、Ｓ０２５Ｉ、Ｓ０２５Ｍ、Ｓ０２５Ｐ、Ｓ０２５Ｑ、Ｓ０２５Ｔ、Ｓ０２５Ｖ、Ｓ０２５Ｌ、Ｇ０２６Ｈ、Ｇ０２６Ｒ、Ｇ０２６Ｄ、Ｇ０２６Ｆ、Ｇ０２６Ｍ、Ｇ０２６Ｎ、Ｇ０２６Ｐ、Ｇ０２６Ｑ、Ｇ０２６Ｓ、Ｇ０２６Ｙ、Ｇ０２６Ｌ、Ｆ０２７Ｈ、Ｆ０２７Ｒ、Ｆ０２７Ａ、Ｆ０２７Ｄ、Ｆ０２７Ｅ、Ｆ０２７Ｍ、Ｆ０２７Ｐ、Ｆ０２７Ｑ、Ｆ０２７Ｓ、Ｆ０２７Ｔ、Ｆ０２７Ｖ、Ｆ０２７Ｗ、Ｆ０２７Ｙ、Ｆ０２７Ｌ、Ｓ０２８Ｋ、Ｓ０２８Ｈ、Ｓ０２８Ｒ、Ｓ０２８Ａ、Ｓ０２８Ｄ、Ｓ０２８Ｉ、Ｓ０２８Ｍ、Ｓ０２８Ｐ、Ｓ０２８Ｑ、Ｓ０２８Ｖ、Ｓ０２８Ｗ、Ｓ０２８Ｌ、Ｌ０２９Ｋ、Ｌ０２９Ｈ、Ｌ０２９Ａ、Ｌ０２９Ｄ、Ｌ０２９Ｇ、Ｌ０２９Ｍ、Ｌ０２９Ｎ、Ｌ０２９Ｓ、Ｌ０２９Ｖ、Ｔ０３０Ｈ、Ｔ０３０Ｒ、Ｔ０３０Ｄ、Ｔ０３０Ｇ、Ｔ０３０Ｉ、Ｔ０３０Ｍ、Ｔ０３０Ｎ、Ｔ０３０Ｐ、Ｔ０３０Ｖ、Ｔ０３０Ｗ、Ｔ０３０Ｙ、Ｎ０３１Ｋ、Ｎ０３１Ｈ、Ｎ０３１Ｅ、Ｎ０３１Ｇ、Ｎ０３１Ｌ、Ｙ０３２Ｈ、Ｙ０３２Ｃ、Ｙ０３２Ｍ、Ｙ０３２Ｎ、Ｙ０３２Ｔ、Ｙ０３２Ｖ、Ｙ０３２Ｌ、Ｇ０３３Ｍ、Ｇ０３３Ｓ、Ｇ０３３Ｔ、Ｖ０３４Ａ、Ｖ０３４Ｃ、Ｖ０３４Ｉ、Ｖ０３４Ｍ、Ｖ０３４Ｐ、Ｈ０３５Ｉ、Ｈ０３５Ｑ、Ｗ０３６Ｋ、Ｗ０３６Ａ、Ｗ０３６Ｉ、Ｗ０３６Ｖ、Ｗ０３６Ｙ、Ｖ０５０Ｋ、Ｖ０５０Ｈ、Ｖ０５０Ａ、Ｖ０５０Ｄ、Ｖ０５０Ｇ、Ｖ０５０Ｔ、Ｉ０５１Ｋ、Ｉ０５１Ｈ、Ｉ０５１Ｅ、Ｉ０５１Ｎ、Ｉ０５１Ｙ、Ｉ０５１Ｌ、Ｗ０５２Ｉ、Ｗ０５２Ｎ、Ｓ０５３Ｈ、Ｓ０５３Ｒ、Ｓ０５３Ａ、Ｓ０５３Ｃ、Ｓ０５３Ｇ、Ｓ０５３Ｉ、Ｓ０５３Ｍ、Ｓ０５３Ｐ、Ｓ０５３Ｌ、Ｓ０５３Ｖ、Ｓ０５３Ｙ、Ｇ０５４Ｈ、Ｇ０５４Ｒ、Ｇ０５４Ａ、Ｇ０５４Ｃ、Ｇ０５４Ｄ、Ｇ０５４Ｐ、Ｇ０５４Ｓ、Ｇ０５５Ｒ、Ｇ０５５Ｍ、Ｇ０５５Ｓ、Ｇ０５５Ｙ、Ｎ０５６Ｋ、Ｎ０５６Ｐ、Ｎ０５６Ｖ、Ｔ０５７Ｈ、Ｔ０５７Ｒ、Ｔ０５７Ｌ、Ｔ０５７Ｃ、Ｔ０５７Ｆ、Ｔ０５７Ｍ、Ｔ０５７Ｎ、Ｔ０５７Ｑ、Ｔ０５７Ｗ、Ｔ０５７Ｙ、Ｄ０５８Ｌ、Ｄ０５８Ｇ、Ｄ０５８Ｍ、Ｄ０５８Ｑ、Ｙ０５９Ｒ、Ｙ０５９Ｄ、Ｙ０５９Ｉ、Ｙ０５９Ｔ、Ｙ０５９Ｖ、Ｎ０６０Ｋ、Ｎ０６０Ｃ、Ｎ０６０Ｆ、Ｎ０６０Ｇ、Ｎ０６０Ｐ、Ｎ０６０Ｑ、Ｎ０６０Ｓ、Ｎ０６０Ｔ、Ｎ０６０Ｙ、Ｔ０６１Ｎ、Ｔ０６１Ｑ、Ｐ０６２Ｇ、Ｆ０６３Ｈ、Ｆ０６３Ｒ、Ｆ０６３Ａ、Ｆ０６３Ｃ、Ｆ０６３Ｄ、Ｆ０６３Ｇ、Ｆ０６３Ｍ、Ｆ０６３Ｎ、Ｆ０６３Ｑ、Ｆ０６３Ｓ、Ｔ０６４Ｒ、Ｔ０６４Ｌ、Ｔ０６４Ｃ、Ｔ０６４Ｆ、Ｔ０６４Ｇ、Ｔ０６４Ｑ、Ｔ０６４Ｖ、Ｓ０６５Ｈ、Ｓ０６５Ｒ、Ｓ０６５Ｌ、Ｓ０６５Ｃ、Ｓ０６５Ｅ、Ｓ０６５Ｆ、Ｓ０６５Ｉ、Ｓ０６５Ｍ、Ｓ０６５Ｎ、Ｓ０６５Ｐ、Ｓ０６５Ｑ、Ｓ０６５Ｔ、Ｓ０６５Ｗ、Ｓ０６５Ｙ、Ｒ０６６Ｌ、Ｒ０６６Ａ、Ｒ０６６Ｃ、Ｒ０６６Ｅ、Ｒ０６６Ｆ、Ｒ０６６Ｎ、Ｒ０６６Ｐ、Ｒ０６６Ｑ、Ｒ０６６Ｓ、Ｒ０６６Ｔ、Ｒ０６６Ｖ、Ｒ０６６Ｇ、Ｌ０６７Ａ、Ｌ０６７Ｃ、Ｌ０６７Ｄ、Ｌ０６７Ｅ、Ｌ０６７Ｉ、Ｌ０６７Ｍ、Ｌ０６７Ｑ、Ｌ０６７Ｓ、Ｌ０６７Ｔ、Ｌ０６７Ｙ、Ｓ０６８Ｋ、Ｓ０６８Ｈ、Ｓ０６８Ｒ、Ｓ０６８Ｌ、Ｓ０６８Ｃ、Ｓ０６８Ｄ、Ｓ０６８Ｅ、Ｓ０６８Ｆ、Ｓ０６８Ｇ、Ｓ０６８Ｉ、Ｓ０６８Ｎ、Ｓ０６８Ｑ、Ｓ０６８Ｖ、Ｉ０６９Ａ、Ｉ０６９Ｃ、Ｉ０６９Ｇ、Ｉ０６９Ｙ、Ｎ０７０Ｈ、Ｎ０７０Ｒ、Ｎ０７０Ｌ、Ｎ０７０Ｄ、Ｎ０７０Ｅ、Ｎ０７０Ｆ、Ｎ０７０Ｇ、Ｎ０７０Ｉ、Ｎ０７０Ｐ、Ｎ０７０Ｑ、Ｎ０７０Ｖ、Ｎ０７０Ｙ、Ｋ０７１Ｈ、Ｋ０７１Ｒ、Ｋ０７１Ｌ、Ｋ０７１Ｃ、Ｋ０７１Ｆ、Ｋ０７１Ｇ、Ｋ０７１Ｑ、Ｋ０７１Ｓ、Ｋ０７１Ｔ、Ｋ０７１Ｗ、Ｋ０７１Ｙ、Ｄ０７２Ｋ、Ｄ０７２Ｈ、Ｄ０７２Ｒ、Ｄ０７２Ｌ、Ｄ０７２Ａ、Ｄ０７２Ｇ、Ｄ０７２Ｉ、Ｄ０７２Ｍ、Ｄ０７２Ｎ、Ｄ０７２Ｑ、Ｄ０７２Ｓ、Ｄ０７２Ｖ、Ｄ０７２Ｗ、Ｄ０７２Ｙ、Ｎ０７３Ｈ、Ｎ０７３Ｒ、Ｎ０７３Ｌ、Ｎ０７３Ａ、Ｎ０７３Ｃ、Ｎ０７３Ｇ、Ｎ０７３Ｉ、Ｎ０７３Ｍ、Ｎ０７３Ｐ、Ｎ０７３Ｑ、Ｎ０７３Ｓ、Ｎ０７３Ｖ、Ｎ０７３Ｗ、Ｎ０７３Ｙ、Ｓ０７４Ｋ、Ｓ０７４Ｈ、Ｓ０７４Ｒ、Ｓ０７４Ｌ、Ｓ０７４Ｃ、Ｓ０７４Ｄ、Ｓ０７４Ｅ、Ｓ０７４Ｇ、Ｓ０７４Ｉ、Ｓ０７４Ｍ、Ｓ０７４Ｐ、Ｓ０７４Ｔ、Ｓ０７４Ｖ、Ｓ０７４Ｙ、Ｋ０７５Ｈ、Ｋ０７５Ｒ、Ｋ０７５Ｌ、Ｋ０７５Ａ、Ｋ０７５Ｃ、Ｋ０７５Ｅ、Ｋ０７５Ｆ、Ｋ０７５Ｍ、Ｋ０７５Ｑ、Ｋ０７５Ｔ、Ｋ０７５Ｖ、Ｋ０７５Ｗ、Ｋ０７５Ｙ、Ｓ０７６Ｈ、Ｓ０７６Ｒ、Ｓ０７６Ｌ、Ｓ０７６Ａ、Ｓ０７６Ｃ、Ｓ０７６Ｄ、Ｓ０７６Ｅ、Ｓ０７６Ｆ、Ｓ０７６Ｍ、Ｓ０７６Ｐ、Ｓ０７６Ｑ、Ｓ０７６Ｔ、Ｓ０７６Ｙ、Ｑ０７７Ｈ、Ｑ０７７Ｒ、Ｑ０７７Ｌ、Ｑ０７７Ａ、Ｑ０７７Ｅ、Ｑ０７７Ｇ、Ｑ０７７Ｉ、Ｑ０７７Ｍ、Ｑ０７７Ｎ、Ｑ０７７Ｖ、Ｑ０７７Ｗ、Ｑ０７７Ｙ、Ｙ０９３Ｈ、Ｙ０９３Ｖ、Ｙ０９３Ｗ、Ｙ０９４Ｒ、Ｙ０９４Ｌ、Ｒ０９７Ｈ、Ｒ０９７Ｗ、Ａ０９８Ｐ、Ｌ０９９Ｎ、Ｌ０９９Ｗ、Ｔ１００Ｈ、Ｔ１００Ｌ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｎ、Ｔ１００Ｐ、Ｔ１００Ｑ、Ｔ１００Ｓ、Ｔ１００Ｖ、Ｔ１００Ｙ、Ｙ１０１Ｈ、Ｙ１０１Ｅ、Ｙ１０１Ｆ、Ｙ１０１Ｍ、Ｙ１０２Ｒ、Ｙ１０２Ｄ、Ｙ１０２Ｉ、Ｙ１０２Ｎ、Ｙ１０２Ｗ、Ｄ１０３Ｒ、Ｄ１０３Ｌ、Ｄ１０３Ａ、Ｄ１０３Ｉ、Ｄ１０３Ｑ、Ｄ１０３Ｙ、Ｄ１０３Ｐ、Ｙ１０４Ｈ、Ｙ１０４Ｌ、Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｉ、Ｙ１０４Ｍ、Ｙ１０４Ｓ、Ｙ１０４Ｖ、Ｅ１０５Ｈ、Ｅ１０５Ｔ、Ｆ１０６Ｌ、Ｆ１０６Ｖ、Ｆ１０６Ｗ、Ａ１０７Ｋ、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｌ、Ａ１０７Ｅ、Ａ１０７Ｇ、Ａ１０７Ｎ、Ａ１０７Ｓ、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｙ、Ａ１０７Ｄ、Ｙ１０８Ｋ、Ｙ１０８Ｈ、Ｙ１０８Ｒ、Ｙ１０８Ｌ、Ｙ１０８Ｉ、Ｙ１０８Ｎ、Ｙ１０８Ｓ、Ｙ１０８Ｔ、Ｙ１０８Ｖ、Ｙ１０８Ｗ、Ｗ１０９Ｉ、Ｗ１０９Ｍ、Ｗ１０９Ｙ、Ｇ１１０Ｒ、Ｇ１１０Ａ、Ｇ１１０Ｍ、Ｇ１１０Ｐ、Ｇ１１０Ｔ、Ｑ１１１Ｋ、Ｑ１１１Ｈ、Ｑ１１１Ｒ、Ｑ１１１Ｌ、Ｑ１１１Ｄ、Ｑ１１１Ｅ、Ｑ１１１Ｇ、Ｑ１１１Ｍ、Ｑ１１１Ｐ、Ｑ１１１Ｓ、Ｑ１１１Ｔ、Ｑ１１１Ｗ、Ｑ１１１Ｙ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｎ、Ｇ１１２Ｐ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｖ２４Ｅ、Ｓ２８Ｃ、Ｆ６３Ｐ、Ｌ６７Ｇ、Ｄ７２Ｐ、Ｋ７５Ｇ、Ｋ７５Ｐ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７６Ｖ、Ｑ１１１ＩおよびＱ１１１Ｖから選択されるアミノ酸置換に対応する１個以上のアミノ酸置換を含んでよく；そしてその一部は抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含む。ある例において、ＶＬ鎖またはその一部は、配列番号４に示すアミノ酸位置に対して、対応するアミノ酸位置は抗体のＶＬ鎖と配列番号４に示すＶＬ鎖のアラインメントにより同定して、Ｄ００１Ｗ、Ｉ００２Ｖ、Ｉ００２Ｗ、Ｌ００３Ｄ、Ｌ００３Ｆ、Ｌ００３Ｇ、Ｌ００３Ｓ、Ｌ００３Ｗ、Ｌ００３Ｙ、Ｌ００３Ｒ、Ｌ００４Ｅ、Ｌ００４Ｆ、Ｌ００４Ｉ、Ｌ００４Ｐ、Ｌ００４Ｓ、Ｌ００４Ｔ、Ｌ００４Ｖ、Ｌ００４Ｗ、Ｌ００４Ｋ、Ｌ００４Ｈ、Ｌ００４Ｒ、Ｔ００５Ａ、Ｔ００５Ｄ、Ｔ００５Ｅ、Ｔ００５Ｆ、Ｔ００５Ｇ、Ｔ００５Ｎ、Ｔ００５Ｓ、Ｔ００５Ｗ、Ｔ００５Ｌ、Ｔ００５Ｋ、Ｔ００５Ｈ、Ｔ００５Ｒ、Ｒ０２４Ａ、Ｒ０２４Ｃ、Ｒ０２４Ｆ、Ｒ０２４Ｌ、Ｒ０２４Ｍ、Ｒ０２４Ｓ、Ｒ０２４Ｗ、Ｒ０２４Ｙ、Ａ０２５Ｇ、Ｓ０２６Ａ、Ｓ０２６Ｃ、Ｓ０２６Ｉ、Ｓ０２６Ｍ、Ｓ０２６Ｎ、Ｓ０２６Ｖ、Ｓ０２６Ｗ、Ｓ０２６Ｌ、Ｓ０２６Ｇ、Ｓ０２６Ｈ、Ｓ０２６Ｒ、Ｑ０２７Ａ、Ｑ０２７Ｄ、Ｑ０２７Ｉ、Ｑ０２７Ｍ、Ｑ０２７Ｎ、Ｑ０２７Ｐ、Ｓ０２８Ａ、Ｓ０２８Ｄ、Ｓ０２８Ｎ、Ｓ０２８Ｑ、Ｓ０２８Ｌ、Ｓ０２８Ｋ、Ｓ０２８Ｈ、Ｉ０２９Ａ、Ｉ０２９Ｅ、Ｉ０２９Ｆ、Ｉ０２９Ｓ、Ｉ０２９Ｔ、Ｉ０２９Ｒ、Ｇ０３０Ｅ、Ｇ０３０Ｉ、Ｇ０３０Ｐ、Ｇ０３０Ｖ、Ｇ０３０Ｌ、Ｔ０３１Ａ、Ｔ０３１Ｆ、Ｔ０３１Ｇ、Ｔ０３１Ｍ、Ｔ０３１Ｓ、Ｔ０３１Ｗ、Ｔ０３１Ｌ、Ｔ０３１Ｋ、Ｔ０３１Ｈ、Ｎ０３２Ｇ、Ｉ０３３Ｆ、Ｉ０３３Ｇ、Ｉ０３３Ｍ、Ｉ０３３Ｔ、Ｉ０３３Ｖ、Ｉ０３３Ｈ、Ｉ０４８Ｍ、Ｉ０４８Ｓ、Ｉ０４８Ｌ、Ｉ０４８Ｋ、Ｋ０４９Ａ、Ｋ０４９Ｅ、Ｋ０４９Ｇ、Ｋ０４９Ｎ、Ｋ０４９Ｑ、Ｋ０４９Ｓ、Ｋ０４９Ｔ、Ｋ０４９Ｖ、Ｋ０４９Ｌ、Ｋ０４９Ｈ、Ｋ０４９Ｒ、Ａ０５１Ｔ、Ａ０５１Ｌ、Ｓ０５２Ａ、Ｓ０５２Ｃ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｅ、Ｓ０５２Ｇ、Ｓ０５２Ｉ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｑ、Ｓ０５２Ｖ、Ｓ０５２Ｗ、Ｓ０５２Ｒ、Ｓ０５２Ｋ、Ｅ０５３Ｇ、Ｓ０５４Ｍ、Ｉ０５５Ａ、Ｉ０５５Ｆ、Ｓ０５６Ｇ、Ｓ０５６Ｌ、Ｓ０５６Ａ、Ｓ０５６Ｃ、Ｓ０５６Ｄ、Ｓ０５６Ｅ、Ｓ０５６Ｆ、Ｓ０５６Ｎ、Ｓ０５６Ｐ、Ｓ０５６Ｑ、Ｓ０５６Ｖ、Ｓ０５６Ｗ、Ｓ０５６Ｈ、Ｓ０５６Ｒ、Ｓ０５６Ｋ、Ｙ０８６Ｆ、Ｙ０８６Ｍ、Ｙ０８６Ｈ、Ｙ０８７Ｌ、Ｙ０８７Ｃ、Ｙ０８７Ｄ、Ｙ０８７Ｆ、Ｙ０８７Ｇ、Ｙ０８７Ｉ、Ｙ０８７Ｎ、Ｙ０８７Ｐ、Ｙ０８７Ｔ、Ｙ０８７Ｖ、Ｙ０８７Ｗ、Ｙ０８７Ｋ、Ｙ０８７Ｈ、Ｙ０８７Ｒ、Ｑ０８９Ｅ、Ｎ０９１Ａ、Ｎ０９１Ｉ、Ｎ０９１Ｍ、Ｎ０９１Ｓ、Ｎ０９１Ｔ、Ｎ０９１Ｖ、Ｎ０９１Ｈ、Ｎ０９１Ｒ、Ｎ０９２Ｄ、Ｎ０９２Ｓ、Ｎ０９２Ｔ、Ｎ０９２Ｖ、Ｎ０９２Ｗ、Ｎ０９２Ｒ、Ｎ０９３Ｔ、Ｔ０９６Ｍ、Ｔ０９６Ｖ、Ｔ０９７Ｖ、Ｆ０９８Ａ、Ｆ０９８Ｍ、Ｆ０９８Ｓ、Ｆ０９８Ｖ、Ｆ０９８Ｙ、Ｇ０９９Ｌ、Ｇ０９９Ｄ、Ｇ０９９Ｅ、Ｇ０９９Ｆ、Ｇ０９９Ｉ、Ｇ０９９Ｍ、Ｇ０９９Ｎ、Ｇ０９９Ｓ、Ｇ０９９Ｔ、Ｇ０９９Ｖ、Ｇ０９９Ｋ、Ｇ０９９Ｈ、Ｑ１００Ｃ、Ｑ１００Ｄ、Ｑ１００Ｅ、Ｑ１００Ｆ、Ｑ１００Ｉ、Ｑ１００Ｍ、Ｑ１００Ｎ、Ｑ１００Ｐ、Ｑ１００Ｔ、Ｑ１００Ｖ、Ｑ１００Ｗ、Ｑ１００Ｙ、Ｑ１００Ｋ、Ｑ１００ＨおよびＱ１００Ｒから選択されるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含んでよく；そしてその一部は抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含む。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのあらゆる例において、可変重鎖またはその一部は、Ｖ０２４Ｉ、Ｖ０２４Ｅ、Ｖ０２４Ｌ、Ｓ０２５Ｃ、Ｓ０２５Ｇ、Ｓ０２５Ｉ、Ｓ０２５Ｑ、Ｓ０２５Ｔ、Ｓ０２５Ｌ、Ｓ０２５Ｖ、Ｆ０２７Ｒ、Ｔ０３０Ｆ、Ｙ０３２Ｔ、Ｓ０５３Ｇ、Ｇ０５４Ｒ、Ｇ０５４Ｃ、Ｇ０５４Ｐ、Ｄ０５８Ｍ、Ｆ０６３Ｒ、Ｆ０６３Ｃ、Ｆ０６３Ｇ、Ｆ０６３Ｍ、Ｄ０７２Ｋ、Ｄ０７２Ｍ、Ｄ０７２Ｗ、Ｄ０７２Ｌ、Ｓ０７４Ｈ、Ｓ０７４Ｒ、Ｓ０７４Ｄ、Ｓ０７４Ｇ、Ｓ０７４Ｙ、Ｋ０７５Ｈ、Ｋ０７５Ｗ、Ｑ０７７Ｒ、Ｎ０９１Ｖ、Ｒ０９７Ｈ、Ｔ１００Ｉ、Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４Ｆ、Ｆ０２７Ｒ、Ｌ０２９Ｓ、Ｒ０９７ＨおよびＱ１１１Ｐから選択されるアミノ酸置換を含んでよく；および／または可変軽鎖またはその一部はアミノ酸置換Ｌ４ＶまたはＩ２９Ｓを含み得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのここでの具体例において、可変重鎖またはその一部は、Ｖ２４Ｅ、Ｖ２４Ｉ、Ｖ２４Ｌ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｈ、Ｓ２５Ｒ、Ｓ２５Ａ、Ｓ２５Ｄ、Ｓ２５Ｇ、Ｓ２５Ｍ、Ｓ２５Ｑ、Ｓ２５Ｖ、Ｓ２５Ｌ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ２９Ｈ、Ｎ３１Ｈ、Ｇ５４Ｄ、Ｇ５４Ｓ、Ｆ６３Ｒ、Ｆ６３Ｃ、Ｆ６３Ｍ、Ｆ６３Ｐ、Ｆ６３Ｓ、Ｔ６４Ｖ、Ｌ６７Ｇ、Ｄ７２Ｌ、Ｄ７２Ｐ、Ｄ７２Ｗ、Ｎ７３Ｑ、Ｋ７５Ｈ、Ｋ７５Ｇ、Ｋ７５Ｐ、Ｋ７５Ｗ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７６Ｖ、Ｑ７７Ｅ、Ｔ１００Ｐ、Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４Ｓ、Ｙ１０４Ｖ、Ｑ１１１Ｉ、Ｑ１１１Ｖから選択されるアミノ酸置換を含んでよく、さらにアミノ酸置換Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｖ、Ｆ２７Ｒ、Ｔ３０Ｆ、Ｓ５３Ｇ、Ｄ７２Ｌ、Ｒ９７Ｈ、Ｙ１０４ＤおよびＱ１１１Ｐを含んでよい。修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、可変重鎖、可変軽鎖または両者に２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸置換を含まず、ＥＧＦＲと特異的に結合するセツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体に少なくとも２個のアミノ酸置換を含み、ここで、配列番号３に示すアミノ酸位置にして、ＶＨ鎖におけるアミノ酸置換はＶ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｖ、Ｆ２７Ｒ、Ｔ３０Ｆ、Ｓ５３Ｇ、Ｄ７２Ｌ、Ｒ９７Ｈ、Ｙ１０４ＤおよびＱ１１１Ｐから選択されるアミノ酸置換に対応し、ここで、対応するアミノ酸位置は抗体のＶＨ鎖と配列番号３に示すＶＨ鎖のアラインメントにより同定する；そして、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、ＶＬ鎖におけるアミノ酸置換はアミノ酸置換Ｉ２９Ｓに対応し；ここで、対応するアミノ酸位置は抗体のＶＬ鎖と配列番号４に示すＶＬ鎖のアラインメントにより同定する。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸置換ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｖ２４Ｅ／ＨＣ−Ｆ２７Ｒ／ＨＣ−Ｒ９７Ｈ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；またはＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓを含む。このような例のいずれかで、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントは、正確にまたは約ｐＨ７.４と比較して、正確にまたは約ｐＨ６.０〜ｐＨ６.５で、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、４.０、４.５、５.０またはそれより大きいＥＧＦＲに対する結合活性比を示す。
具体例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントは、ここに記載するとおり正確にまたは約ｐＨ７.４と比較して、正確にまたは約ｐＨ６.０〜ｐＨ６.５で少なくとも２.０および一般に少なくとも３.０またはそれより高いＥＧＦＲに対する結合活性比を示す。このような例において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸置換Ｙ１０４Ｄを含む。例えば、アミノ酸置換は、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；またはＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐである。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのあらゆる例において、非修飾セツキシマブ抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体は、ａ)配列番号１に示すアミノ酸の配列または配列番号１に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号２に示すアミノ酸の配列または配列番号２に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する軽鎖；またはｂ)配列番号８に示すアミノ酸の配列または配列番号８に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号９に示すアミノ酸の配列または配列番号９に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する軽鎖を含む。
ここに提供するあらゆる例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、非修飾セツキシマブがヒト化されている変異体であるものを含む。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのあらゆる例において、非修飾セツキシマブは、配列番号２８に示す可変重鎖および配列番号２９に示す可変軽鎖を含む。
ここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントのあらゆる例において、抗体は完全長抗体または抗原結合フラグメントである。例えば、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントから選択される。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのあらゆる例において、非修飾セツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体はその抗原結合フラグメントであり、該抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントから選択される。例えば、非修飾セツキシマブは、配列番号５に示すアミノ酸の配列または配列番号５に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号２に示すアミノ酸の配列または配列番号２に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する軽鎖を含むＦａｂフラグメントであり得る。
ここに提供されるのは：ａ)配列番号３１〜３２、３５〜５７、５９〜８５、８７〜１１２、１１４〜１２５、１２７〜１３１、１３３〜１３４、１３８〜１３９、１４１〜１４９、１４８〜１６８、１７０、１７４、１７６〜１７７、１８０、１８２、１８６〜１８９、１９１〜１９８、２００、２０２〜２０５、２０７〜２１０、２１２〜２１６、２１８、２２０〜２２４、２２６、２２８〜２３６、２３８〜２４０、２４３、２４６、２５０〜２５１、２５３、２５５、２５７〜２６８、２７０〜２７７、２７９〜２８３、２８５〜２９２、２９４〜３２２、３２４〜３３６、３３８〜３５２、３５５〜３５９、３６１〜３６６、３６８〜３９４、３９６〜４０２、４０４〜４４８、４５０〜４６５、４６７〜４７７、４７９、４８１〜４８３、４８５〜４８７、４８９〜５０５、５０７〜５１０、５１２〜５２３、５２５〜５５７、１０６２、１０６３、１０９３、１０９８〜１１０７および１１１２〜１１１３のいずれかに示す可変重(ＶＨ)鎖または配列番号３１〜３２、３５〜５７、５９〜８５、８７〜１１２、１１４〜１２５、１２７〜１３１、１３３〜１３４、１３８〜１３９、１４１〜１４９、１４８〜１６８、１７０、１７４、１７６〜１７７、１８０、１８２、１８６〜１８９、１９１〜１９８、２００、２０２〜２０５、２０７〜２１０、２１２〜２１６、２１８、２２０〜２２４、２２６、２２８〜２３６、２３８〜２４０、２４３、２４６、２５０〜２５１、２５３、２５５、２５７〜２６８、２７０〜２７７、２７９〜２８３、２８５〜２９２、２９４〜３２２、３２４〜３３６、３３８〜３５２、３５５〜３５９、３６１〜３６６、３６８〜３９４、３９６〜４０２、４０４〜４４８、４５０〜４６５、４６７〜４７７、４７９、４８１〜４８３、４８５〜４８７、４８９〜５０５、５０７〜５１０、５１２〜５２３、５２５〜５５７、１０６２、１０６３、１０９３、１０９８〜１１０７および１１１２〜１１１３のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列；および／またはｂ)配列番号５５８、５６０〜５６５、５６８〜５７０、５７２〜５８３、５８５〜６０３、６０５、６０８〜６０９、６１１〜６２１、６２４〜６２７、６２９〜６４１、６４３、６４５、６４７、６４９〜６５０、６５２、６５６〜６６０、６６２〜６７８、６８０〜６８５、６８７〜７３３、７３５〜７４１、７４３、７４５〜７５１、７５３、７５６〜７５９、７６４〜７６８、７７５、７７８〜８０９、８１０、８１２〜８１７、８２０〜８２２、８２４〜８３５、８３７〜８５５、８５７、８６０〜８６１、８６３〜８７３、８７６〜８７９、８８１〜８９３、８９５、８９７、８９９、９０１〜９０２、９０４、９０８〜９１２、９１４〜９３０、９３２〜９３７、９３９〜９８５、９８７〜９９３、９９５、９９７〜１００３、１００５、１００８〜１０１１、１０１６〜１０２０、１０２７、１０３０〜１０６１のいずれかに示す可変(ＶＬ)鎖または配列番号５５８、５６０〜５６５、５６８〜５７０、５７２〜５８３、５８５〜６０３、６０５、６０８〜６０９、６１１〜６２１、６２４〜６２７、６２９〜６４１、６４３、６４５、６４７、６４９〜６５０、６５２、６５６〜６６０、６６２〜６７８、６８０〜６８５、６８７〜７３３、７３５〜７４１、７４３、７４５〜７５１、７５３、７５６〜７５９、７６４〜７６８、７７５、７７８〜８０９、８１０、８１２〜８１７、８２０〜８２２、８２４〜８３５、８３７〜８５５、８５７、８６０〜８６１、８６３〜８７３、８７６〜８７９、８８１〜８９３、８９５、８９７、８９９、９０１〜９０２、９０４、９０８〜９１２、９１４〜９３０、９３２〜９３７、９３９〜９８５、９８７〜９９３、９９５、９９７〜１００３、１００５、１００８〜１０１１、１０１６〜１０２０、１０２７、１０３０〜１０６１のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。
ある例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ａ)配列番号３１〜３２、３５〜５７、５９〜８５、８７〜１１２、１１４〜１２５、１２７〜１３１、１３３〜１３４、１３８〜１３９、１４１〜１４９、１４８〜１６８、１７０、１７４、１７６〜１７７、１８０、１８２、１８６〜１８９、１９１〜１９８、２００、２０２〜２０５、２０７〜２１０、２１２〜２１６、２１８、２２０〜２２４、２２６、２２８〜２３６、２３８〜２４０、２４３、２４６、２５０〜２５１、２５３、２５５、２５７〜２６８、２７０〜２７７、２７９〜２８３、２８５〜２９２、２９４〜３２２、３２４〜３３６、３３８〜３５２、３５５〜３５９、３６１〜３６６、３６８〜３９４、３９６〜４０２、４０４〜４４８、４５０〜４６５、４６７〜４７７、４７９、４８１〜４８３、４８５〜４８７、４８９〜５０５、５０７〜５１０、５１２〜５２３、５２５〜５５７、１０６２、１０６３、１０９３、１０９８〜１１０７および１１１２〜１１１３のいずれかに示す可変重(ＶＨ)鎖または配列番号３１〜３２、３５〜５７、５９〜８５、８７〜１１２、１１４〜１２５、１２７〜１３１、１３３〜１３４、１３８〜１３９、１４１〜１４９、１４８〜１６８、１７０、１７４、１７６〜１７７、１８０、１８２、１８６〜１８９、１９１〜１９８、２００、２０２〜２０５、２０７〜２１０、２１２〜２１６、２１８、２２０〜２２４、２２６、２２８〜２３６、２３８〜２４０、２４３、２４６、２５０〜２５１、２５３、２５５、２５７〜２６８、２７０〜２７７、２７９〜２８３、２８５〜２９２、２９４〜３２２、３２４〜３３６、３３８〜３５２、３５５〜３５９、３６１〜３６６、３６８〜３９４、３９６〜４０２、４０４〜４４８、４５０〜４６５、４６７〜４７７、４７９、４８１〜４８３、４８５〜４８７、４８９〜５０５、５０７〜５１０、５１２〜５２３、５２５〜５５７、１０６２、１０６３、１０９３、１０９８〜１１０７および１１１２〜１１１３のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列；およびｂ)配列番号４または配列番号１０に示す可変軽(ＶＬ)鎖または配列番号４または配列番号１０に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
ある例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ａ)配列番号３に示す可変重(ＶＨ)鎖または配列番号３に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；およびｂ)配列番号５５８、５６０〜５６５、５６８〜５７０、５７２〜５８３、５８５〜６０３、６０５、６０８〜６０９、６１１〜６２１、６２４〜６２７、６２９〜６４１、６４３、６４５、６４７、６４９〜６５０、６５２、６５６〜６６０、６６２〜６７８、６８０〜６８５、６８７〜７３３、７３５〜７４１、７４３、７４５〜７５１、７５３、７５６〜７５９、７６４〜７６８、７７５、７７８〜８０９、８１０、８１２〜８１７、８２０〜８２２、８２４〜８３５、８３７〜８５５、８５７、８６０〜８６１、８６３〜８７３、８７６〜８７９、８８１〜８９３、８９５、８９７、８９９、９０１〜９０２、９０４、９０８〜９１２、９１４〜９３０、９３２〜９３７、９３９〜９８５、９８７〜９９３、９９５、９９７〜１００３、１００５、１００８〜１０１１、１０１６〜１０２０、１０２７、１０３０〜１０６１のいずれかに示す可変軽鎖(ＶＬ)または配列番号５５８、５６０〜５６５、５６８〜５７０、５７２〜５８３、５８５〜６０３、６０５、６０８〜６０９、６１１〜６２１、６２４〜６２７、６２９〜６４１、６４３、６４５、６４７、６４９〜６５０、６５２、６５６〜６６０、６６２〜６７８、６８０〜６８５、６８７〜７３３、７３５〜７４１、７４３、７４５〜７５１、７５３、７５６〜７５９、７６４〜７６８、７７５、７７８〜８０９、８１０、８１２〜８１７、８２０〜８２２、８２４〜８３５、８３７〜８５５、８５７、８６０〜８６１、８６３〜８７３、８７６〜８７９、８８１〜８９３、８９５、８９７、８９９、９０１〜９０２、９０４、９０８〜９１２、９１４〜９３０、９３２〜９３７、９３９〜９８５、９８７〜９９３、９９５、９９７〜１００３、１００５、１００８〜１０１１、１０１６〜１０２０、１０２７、１０３０〜１０６１のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を含む。
ここに記載するとおり、重鎖にＹ１０４Ｄに対応するアミノ酸置換を含み、少なくとも２.０の結合活性比を示す、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体のここでの具体例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２４、１１２５、１１２６、１１２７、１１２８、１１２９、１１３０または１１３１に示すアミノ酸配列または配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２４、１１２５、１１２６、１１２７、１１２８、１１２９、１１３０または１１３１のいずれかに対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する可変重(ＶＨ)鎖；および配列番号４または１０に示すアミノ酸の配列または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する可変軽(ＶＬ)鎖を含む。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０６２または１１２５に示すアミノ酸の配列または配列番号１０６２または１１２５のいずれかに対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む可変重(ＶＨ)鎖；および配列番号４または１０に示すアミノ酸の配列または配列番号４または１０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する可変軽(ＶＬ)鎖を含む。
ここでのあらゆる例において、抗ＥＧＦＲまたはその抗原結合フラグメントはヒト化されている。典型的に、このような例において、抗ＥＧＦＲまたはその抗原結合フラグメントは条件依存活性を保持し、非腫瘍微小環境と比較して、腫瘍微小環境において少なくとも２.０および一般に少なくとも３.０またはそれより高い活性比を示す。ここに提供するヒト化抗体のいくつかの場合において、可変重鎖は配列番号３に示す可変重鎖に対して８５％未満の配列同一性かつ配列番号３に示す可変重鎖に対して６５％を超える配列同一性を示し；そして可変軽鎖は配列番号４に示す可変軽鎖に対して８５％未満の配列同一性かつ配列番号４に示す可変軽鎖に対して６５％を超える配列同一性を示す。このような抗体の例は、下記のアミノ酸の配列を含むいずれかのものである：
ａ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１３８に示す可変軽鎖または配列番号１１３８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｂ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１３９に示す可変軽鎖または配列番号１１３９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｃ) 配列番号１１３５に示す可変重鎖または配列番号１１３５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１３８に示す可変軽鎖または配列番号１１３８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｄ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４０に示す可変軽鎖または配列番号１１４０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｅ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４１に示す可変軽鎖または配列番号１１４１に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｆ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４２に示す可変軽鎖または配列番号１１４２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｇ) 配列番号１１３５に示す可変重鎖または配列番号１１３５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４２に示す可変軽鎖または配列番号１１４２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｈ) 配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４３に示す可変軽鎖または配列番号１１４３に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｉ) 配列番号１１３６に示す可変重鎖または配列番号１１３６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４２に示す可変軽鎖または配列番号１１４２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｊ) 配列番号１１３７に示す可変重鎖または配列番号１１３７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４４に示す可変軽鎖または配列番号１１４４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｋ) 配列番号１１３６に示す可変重鎖または配列番号１１３６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４４に示す可変軽鎖または配列番号１１４４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｌ) 配列番号１１３７に示す可変重鎖または配列番号１１３７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４５に示す可変軽鎖または配列番号１１４５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｍ) 配列番号１１３６に示す可変重鎖または配列番号１１３６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４５に示す可変軽鎖または配列番号１１４５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｎ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５３に示す可変軽鎖または配列番号１１５３に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｏ) 配列番号１１４７に示す可変重鎖または配列番号１１４７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５３に示す可変軽鎖または配列番号１１５３に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｐ) 配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５４に示す可変軽鎖または配列番号１１５４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｑ) 配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５４に示す可変軽鎖または配列番号１１５４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｒ) 配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５５に示す可変軽鎖または配列番号１１５５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｓ) 配列番号１１５１に示す可変重鎖または配列番号１１５１に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｔ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または１１４８または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列または１１４８および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｕ) 配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｖ) 配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｗ) 配列番号１１５２に示す可変重鎖または配列番号１１５２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｘ) 配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｙ) 配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｚ) 配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ａａ) 配列番号１１５２に示す可変重鎖または配列番号１１５２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｂｂ) 配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｃｃ) 配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｄｄ) 配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５８に示す可変軽鎖または配列番号１１５８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｅｅ) 配列番号１１５２に示す可変重鎖または配列番号１１５２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５９に示す可変軽鎖または配列番号１１５９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｆｆ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５９に示す可変軽鎖または配列番号１１５９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
ｇｇ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；ａｎｄ
ｈｈ) 配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列。
ここに提供するあらゆる例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体は完全長ＩｇＧ抗体である。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２２〜２５、１０６９および１０７０のいずれかに示す重鎖定常領域またはそれと少なくとも７５％配列同一性を示すその変異体；および配列番号１０７２〜１０７３のいずれかに示す軽鎖定常領域またはそれと少なくとも７５％配列同一性を示すその変異体を含み得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗原結合フラグメントを含む、ここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体のあらゆる例において、抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントから選択され得る。ある例において、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントはＦａｂまたはｓｃＦｖである。
ここでのあらゆる例において、例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体または非修飾セツキシマブにおけるアミノ酸の配列のような、ここに提供する参照配列またはある配列番号のものに配列同一性を示すアミノ酸の配列は、それと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示す。配列同一性ギャップ有りまたは無しでグローバル・アライメントを使用して決定できる。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを含むここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体のあらゆる例において、抗体または抗原結合フラグメントはまたａ)配列番号１または３に示すアミノ酸位置を参照し、対応するアミノ酸位置は、抗体のＶＨ鎖と配列番号３に示すＶＨ鎖のアラインメントにより同定して、１位のグルタミン(Ｑ)のグルタミン酸(Ｅ)での置換、Ｑ１Ｃ、Ｖ２Ｃ、Ｑ３Ｔ、Ｑ３Ｃ、Ｌ４Ｃ、Ｋ５Ｑ、Ｋ５Ｖ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ｃ、Ｑ６Ｅ、Ｑ６Ｃ、Ｓ７Ｃ、Ｇ８Ｃ、Ｐ９Ａ、Ｐ９Ｇ、Ｐ９Ｃ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１０Ｃ、Ｌ１１Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｑ１３Ｋ、Ｑ１３Ｒ、Ｑ１３Ｃ、Ｐ１４Ｃ、Ｓ１５Ｇ、Ｓ１５Ｔ、Ｓ１５Ｃ、Ｑ１６Ｇ、Ｑ１６Ｒ、Ｑ１６Ｅ、Ｑ１６Ｃ、Ｓ１７Ｔ、Ｓ１７Ｃ、Ｌ１８Ｃ、Ｓ１９Ｋ、Ｓ１９Ｒ、Ｓ１９Ｔ、Ｓ１９Ｃ、Ｉ２０Ｌ、Ｉ２０Ｃ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２１Ｃ、Ｔ２３Ａ、Ｔ２３Ｋ、Ｔ２３Ｃ、Ｖ２４Ａ、Ｖ２４Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｆ２７Ｇ、Ｓ２８Ｎ、Ｓ２８Ｔ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ、Ｔ３０Ｋ、Ｎ３１Ｖ、Ｎ３１Ｄ、Ｎ３１Ｉ、Ｎ３１Ｔ、Ｎ３２Ｓ、Ｙ３２Ｒ、Ｙ３２Ｗ、Ｇ３３Ａ、Ｇ３３Ｄ、Ｇ３３Ｅ、Ｇ３３Ｙ、Ｖ３４Ｌ、Ｖ３４Ｎ、Ｖ３４Ｅ、Ｖ３４Ｑ、Ｖ３４Ｓ、Ｖ３４Ｗ、Ｈ３５Ｓ、Ｖ３７Ｉ、Ｓ４０Ａ、Ｓ４０Ｐ、Ｐ４１Ｔ、Ｇ４４Ａ、Ｌ４８Ｖ、Ｌ４８Ｉ、Ｇ４９Ｓ、Ｇ４９Ａ、Ｖ５０Ｌ、Ｖ５０Ｑ、Ｖ５０Ｅ、Ｖ５０Ｉ、Ｖ５０Ｙ、Ｖ５０Ｎ、Ｉ５１Ｇ、Ｉ５１Ｍ、Ｉ５１Ｓ、Ｉ５１Ｑ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｃ、Ｉ５１Ｖ、Ｗ５２Ｆ、Ｗ５２Ｙ、Ｗ５２Ｇ、Ｗ５２Ｔ、Ｓ５３Ｑ、Ｓ５３Ｔ、Ｓ５３Ｎ、Ｓ５３Ｙ、Ｇ５４Ａ、Ｇ５４Ｖ、Ｇ５４Ｌ、Ｇ５４Ｉ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５５Ｄ、Ｇ５５Ａ、Ｇ５５Ｅ、Ｇ５５Ｈ、Ｇ５５Ｆ、Ｎ５６Ａ、Ｎ５６Ｇ、Ｎ５６Ｓ、Ｎ５６Ｔ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｄ、Ｔ５７Ｇ、Ｔ５７Ｓ、Ｔ５７Ｅ、Ｔ５７Ｐ、Ｄ５８Ｙ、Ｄ５８Ｎ、Ｙ５９Ａ、Ｙ５９Ｃ、Ｙ５９Ｅ、Ｙ５９Ｆ、Ｙ５９Ｇ、Ｙ５９Ｓ、Ｙ５９Ｗ、Ｔ５９Ｈ、Ｙ５９Ｐ、Ｙ５９Ｑ、Ｎ６０Ｄ、Ｎ６０Ａ、Ｔ６１Ｅ、Ｔ６１Ｐ、Ｐ６２Ｓ、Ｆ６３Ｌ、Ｆ６３Ｖ、Ｔ６４Ｋ、Ｔ６４Ｅ、Ｔ６４Ａ、Ｔ６４Ｎ、Ｔ６４Ｄ、Ｓ６５Ｇ、Ｌ６７Ｆ、Ｌ６７Ｖ、Ｓ６８Ｔ、Ｎ７０Ｓ、Ｎ７０Ｔ、Ｋ７１Ｖ、Ｄ７２Ｅ、Ｎ７３Ｔ、Ｓ７４Ａ、Ｓ７６Ｎ、Ｑ７７Ｔ、Ｑ７７Ｓ、Ｖ７８Ｌ、Ｖ７８Ｆ、Ｖ７８Ａ、Ｆ７９Ｙ、Ｆ７９Ｓ、Ｆ７９Ｖ、Ｆ８０Ｌ、Ｆ８０Ｍ、Ｋ８１Ｑ、Ｋ８１Ｔ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８２Ｌ、Ｎ８３Ｔ、Ｎ８３Ｓ、Ｓ８４Ｎ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｖ、Ｑ８６Ｒ、Ｑ８６Ｄ、Ｑ８６Ｔ、Ｓ８７Ａ、Ｓ８７Ｐ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｉ９２Ｔ、Ｉ９２Ｖ、Ａ９６Ｃ、Ｒ９７Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｌ９９Ｃ、Ｌ９９Ｅ、Ｔ１００Ｄ、Ｔ１００Ｃ、Ｔ１００Ａ、Ｙ１０１Ｃ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０１Ａ、Ｙ１０２Ｃ、Ｙ１０２Ｆ、Ｙ１０２Ａ、Ｙ１０２Ｗ、Ｄ１０３Ｅ、Ｄ１０３Ｐ、Ｄ１０３Ｃ、Ｙ１０４Ｃ、Ｅ１０５Ｃ、Ｅ１０５Ｎ、Ｅ１０５Ｄ、Ｅ１０５Ｙ、Ｆ１０６Ｃ、Ｆ１０６Ｄ、Ｆ１０６Ｙ、Ａ１０７Ｃ、Ａ１０７Ｄ、Ｙ１０８ＣおよびＹ１０８Ｆから選択される、アミノ酸置換に対応する可変重鎖におけるアミノ酸置換；および／またはｂ)配列番号２または４に示すアミノ酸位置を参照して、対応するアミノ酸位置は、抗体のＶＬ鎖と配列番号４に示すＶＬ鎖のアラインメントにより同定して、１位のアスパラギン酸(Ｄ)のグルタミン酸(Ｅ)での置換、Ｄ１Ｃ、Ｉ２Ｔ、Ｉ２Ｃ、Ｌ３Ｖ、Ｌ３Ｔ、Ｌ３Ｃ、Ｌ４Ｃ、Ｔ５Ｃ、Ｑ６Ｃ、Ｓ７Ｃ、Ｐ８Ｃ、Ｖ９Ｃ、Ｖ９Ａ、Ｖ９Ｄ、Ｖ９Ｇ、Ｖ９Ｐ、Ｖ９Ｓ、Ｉ１０Ｔ、Ｉ１０Ｓ、Ｉ１０Ｆ、Ｉ１０Ｃ、Ｌ１１Ｑ、Ｌ１１Ｃ、Ｓ１２Ａ、Ｓ１２Ｃ、Ｖ１３Ｌ、Ｖ１３Ｍ、Ｖ１３Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｖ１３Ｃ、Ｓ１４Ｔ、Ｓ１４Ｃ、Ｐ１５Ｖ、Ｐ１５Ｌ、Ｐ１５Ｃ、Ｇ１６Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｅ１７Ｄ、Ｅ１７Ｋ、Ｅ１７Ｃ、Ｒ１８Ｖ、Ｒ１８Ｋ、Ｒ１８Ｃ、Ｖ１９Ａ、Ｖ１９Ｔ、Ｖ１９Ｃ、Ｓ２０Ｔ、Ｓ２０Ｃ、Ｓ２０Ａ、Ｆ２１Ｉ、Ｆ２１Ｌ、Ｆ２１Ｃ、Ｓ２２Ｔ、Ｓ２２Ｃ、Ｒ２４Ｐ、Ａ２５Ｖ、Ａ２５Ｓ、Ａ２５Ｉ、Ａ２５Ｐ、Ａ２５Ｔ、Ａ２５Ｙ、Ａ２５Ｃ、Ａ２５Ｆ、Ａ２５Ｍ、Ａ２５Ｌ、Ａ２５Ｗ、Ｓ２６Ｄ、Ｑ２７Ｗ、Ｑ２７Ｅ、Ｑ２７Ｆ、Ｑ２７Ｙ、Ｑ２７Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｓ２８Ｒ、Ｓ２８Ｆ、Ｇ３０Ｙ、Ｇ３０Ｃ、Ｇ３０Ｈ、Ｇ３０Ｋ、Ｇ３０Ｑ、Ｇ３０Ｒ、Ｇ３０Ｗ、Ｇ３０Ｆ、Ｇ３０Ｔ、Ｇ３０Ｍ、Ｇ３０Ｓ、Ｇ３０Ａ、Ｔ３１Ｅ、Ｔ３１Ｖ、Ｔ３１Ｄ、Ｔ３１Ｒ、Ｎ３２Ｈ、Ｉ３３Ｌ、Ｈ３４Ｃ、Ｑ３８Ｋ、Ｒ３９Ｋ、Ｔ４０Ｐ、Ｔ４０Ｓ、Ｎ４１Ｇ、Ｎ４１Ｄ、Ｇ４２Ｑ、Ｇ４２Ｋ、Ｇ４２Ｅ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｐ、Ｒ４５Ｋ、Ｋ４９Ｙ、Ｋ４９Ｆ、Ｙ５０Ｇ、Ｓ５３Ｖ、Ｓ６０Ｄ、Ｓ６０Ａ、Ｇ６４Ｓ、Ｇ６４Ａ、Ｄ７０Ｅ、Ｄ７０Ｖ、Ｆ７１Ｙ、Ｓ７４Ｔ、Ｎ７６Ｓ、Ｎ７６Ｔ、Ｓ７７Ｒ、Ｓ７７Ｇ、Ｖ７８Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｅ８１Ａ、Ｉ８３Ｆ、Ｉ８３Ｓ、Ｉ８３Ｖ、Ｉ８３Ａ、Ｄ８５Ｖ、Ｄ８５Ｔ、Ｄ８５Ｉ、Ｄ８５Ｍ、Ｙ８７Ｓ、Ｑ８９Ｃ、Ｑ８９Ｈ、Ｑ９０Ｃ、Ｎ９１Ｃ、Ｎ９１Ｑ、Ｎ９１Ｌ、Ｎ９２Ｃ、Ｎ９２Ｌ、Ｎ９２Ｒ、Ｎ９２Ｋ、Ｎ９２Ｍ、Ｎ９２Ｙ、Ｎ９２Ｈ、Ｎ９２Ｅ、Ｎ９２Ｆ、Ｎ９３Ａ、Ｎ９３Ｄ、Ｎ９３Ｅ、Ｎ９３Ｖ、Ｎ９３Ｋ、Ｎ９３Ｃ、Ｗ９４Ｆ、Ｗ９４Ｙ、Ｐ９５Ｃ、Ｔ９６Ｃ、Ｔ９６Ｌ、Ｔ９６Ｅ、Ｔ９７Ｃ、Ｔ９７Ａ、Ｔ９７Ｄ、Ｔ９７Ｅ、Ｔ９７Ｐ、Ｔ９７Ｋ、Ｔ９７Ｎ、Ｔ９７Ｑ、Ｔ９７Ｉ、Ｔ９７Ｇ、Ｔ９７Ｌ、Ｔ９７Ｈ、Ｔ９７Ｒ、Ｔ９７Ｓ、Ｇ９９Ａ、Ａ１００Ｇ、Ａ１００Ｑ、Ｋ１０３Ｔ、Ｌ１０４ＶおよびＬ１０６Ｉから選択されるアミノ酸置換に対応する可変軽鎖におけるアミノ酸置換；および／またはｃ)ＥＵインデックスナンバリングに従い、２３０位のプロリン(Ｐ)のアラニン(Ａ)での置換、Ｅ２３３Ｄ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｔ、Ｓ２６７Ｈ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｎ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｅ２６９Ｔ、Ｅ２６９Ｌ、Ｅ２６９Ｎ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｔ、Ｄ２７０Ｈ、Ｅ２７２Ｓ、Ｅ２７２Ｋ、Ｅ２７２Ｉ、Ｅ２７２Ｙ、Ｖ２７３Ｉ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｓ、Ｎ２７６Ｅ、Ｎ２７６Ｒ、Ｎ２７６Ｌ、Ｎ２７６Ｙ、Ｙ２７８Ｔ、Ｙ２７８Ｅ、Ｙ２７８Ｋ、Ｙ２７８Ｗ、Ｅ２８３Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｖ３０２Ｉ、Ｗ３１３Ｆ、Ｅ３１８Ｒ、Ｋ３２０Ｔ、Ｋ３２０Ｄ、Ｋ３２０Ｉ、Ｋ３２２Ｔ、Ｋ３２２Ｈ、Ｖ３２３Ｉ、Ｓ３２４Ｔ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｒ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｓ３２４Ｌ、Ｓ３２４Ｙ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｋ３２６Ｌ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ａ３２７Ｄ、Ａ３２７Ｔ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｍ、Ｐ３３１Ｖ、Ｐ３３１Ｈ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｅ３３３Ｔ、Ｅ３３３Ｈ、Ｅ３３３Ｉ、Ｅ３３３Ｙ、Ｋ３３４Ｉ、Ｋ３３４Ｔ、Ｋ３３４Ｆ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｙ、Ｄ２２１Ｋ、Ｄ２２１Ｙ、Ｋ２２２Ｅ、Ｋ２２２Ｙ、Ｔ２２３Ｅ、Ｔ２２３Ｋ、Ｈ２２４Ｅ、Ｈ２２４Ｙ、Ｔ２２５Ｅ、Ｔ２２５Ｅ、Ｔ２２５Ｋ、Ｔ２２５Ｗ、Ｐ２２７Ｅ、Ｐ２２７Ｋ、Ｐ２２７Ｙ、Ｐ２２７Ｇ、Ｐ２２８Ｅ、Ｐ２２８Ｋ、Ｐ２２８Ｙ、Ｐ２２８Ｇ、Ｐ２３０Ｅ、Ｐ２３０Ｙ、Ｐ２３０Ｇ、Ａ２３１Ｅ、Ａ２３１Ｋ、Ａ２３１Ｙ、Ａ２３１Ｐ、Ａ２３１Ｇ、Ｐ２３２Ｅ、Ｐ２３２Ｋ、Ｐ２３２Ｙ、Ｐ２３２Ｇ、Ｅ２３３Ｎ、Ｅ２３３Ｑ、Ｅ２３３Ｋ、Ｅ２３３Ｒ、Ｅ２３３Ｓ、Ｅ２３３Ｔ、Ｅ２３３Ｈ、Ｅ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｖ、Ｅ２３３Ｌ、Ｅ２３３Ｉ、Ｅ２３３Ｆ、Ｅ２３３Ｍ、Ｅ２３３Ｙ、Ｅ２３３Ｗ、Ｅ２３３Ｇ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｓ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｍ、Ｌ２３４Ｗ、Ｌ２３４Ｐ、Ｌ２３４Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２３５Ｐ、Ｌ２３５Ｇ、Ｇ２３６Ｄ、Ｇ２３６Ｅ、Ｇ２３６Ｎ、Ｇ２３６Ｑ、Ｇ２３６Ｋ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ｓ、Ｇ２３６Ｔ、Ｇ２３６Ｈ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｖ、Ｇ２３６Ｌ、Ｇ２３６Ｉ、Ｇ２３６Ｆ、Ｇ２３６Ｍ、Ｇ２３６Ｙ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｐ、Ｇ２３７Ｄ、Ｇ２３７Ｅ、Ｇ２３７Ｎ、Ｇ２３７Ｑ、Ｇ２３７Ｋ、Ｇ２３７Ｒ、Ｇ２３７Ｓ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｈ、Ｇ２３７Ｖ、Ｇ２３７Ｌ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｆ、Ｇ２３７Ｍ、Ｇ２３７Ｙ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｐ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２３８Ｅ、Ｐ２３８Ｎ、Ｐ２３８Ｑ、Ｐ２３８Ｋ、Ｐ２３８Ｒ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ｔ、Ｐ２３８Ｈ、Ｐ２３８Ｖ、Ｐ２３８Ｌ、Ｐ２３８Ｉ、Ｐ２３８Ｆ、Ｐ２３８Ｍ、Ｐ２３８Ｙ、Ｐ２３８Ｗ、Ｐ２３８Ｇ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｋ、Ｓ２３９Ｒ、Ｓ２３９Ｖ、Ｓ２３９Ｌ、Ｓ２３９Ｉ、Ｓ２３９Ｍ、Ｓ２３９Ｗ、Ｓ２３９Ｐ、Ｓ２３９Ｇ、Ｆ２４１Ｄ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４３Ｅ、Ｋ２４６Ｄ、Ｋ２４６Ｅ、Ｋ２４６Ｈ、Ｋ２４６Ｙ、Ｄ２４９Ｑ、Ｄ２４９Ｈ、Ｄ２４９Ｙ、Ｒ２５５Ｅ、Ｒ２５５Ｙ、Ｅ２５８Ｓ、Ｅ２５８Ｈ、Ｅ２５８Ｙ、Ｔ２６０Ｄ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｙ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６２Ｆ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４Ｑ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｇ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｋ、Ｄ２６５Ｒ、Ｄ２６５Ｓ、Ｄ２６５Ｔ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｍ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｗ、Ｄ２６５Ｐ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｋ、Ｓ２６７Ｒ、Ｓ２６７Ｖ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｉ、Ｓ２６７Ｆ、Ｓ２６７Ｍ、Ｓ２６７Ｙ、Ｓ２６７Ｗ、Ｓ２６７Ｐ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｋ、Ｈ２６８Ｒ、Ｈ２６８Ｔ、Ｈ２６８Ｖ、Ｈ２６８Ｌ、Ｈ２６８Ｉ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ｍ、Ｈ２６８Ｗ、Ｈ２６８Ｐ、Ｈ２６８Ｇ、Ｅ２６９Ｋ、Ｅ２６９Ｓ、Ｅ２６９Ｖ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｍ、Ｅ２６９Ｗ、Ｅ２６９Ｐ、Ｅ２６９Ｇ、Ｄ２７０Ｒ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｌ、Ｄ２７０Ｉ、Ｄ２７０Ｆ、Ｄ２７０Ｍ、Ｄ２７０Ｙ、Ｄ２７０Ｗ、Ｄ２７０Ｐ、Ｄ２７０Ｇ、Ｐ２７１Ｄ、Ｐ２７１Ｅ、Ｐ２７１Ｎ、Ｐ２７１Ｑ、Ｐ２７１Ｋ、Ｐ２７１Ｒ、Ｐ２７１Ｓ、Ｐ２７１Ｔ、Ｐ２７１Ｈ、Ｐ２７１Ａ、Ｐ２７１Ｖ、Ｐ２７１Ｌ、Ｐ２７１Ｉ、Ｐ２７１Ｆ、Ｐ２７１Ｍ、Ｐ２７１Ｙ、Ｐ２７１Ｗ、Ｐ２７１Ｇ、Ｅ２７２Ｄ、Ｅ２７２Ｒ、Ｅ２７２Ｔ、Ｅ２７２Ｈ、Ｅ２７２Ｖ
、Ｅ２７２Ｌ、Ｅ２７２Ｆ、Ｅ２７２Ｍ、Ｅ２７２Ｗ、Ｅ２７２Ｐ、Ｅ２７２Ｇ、Ｋ２７４Ｄ、Ｋ２７４Ｎ、Ｋ２７４Ｓ、Ｋ２７４Ｈ、Ｋ２７４Ｖ、Ｋ２７４Ｉ、Ｋ２７４Ｆ、Ｋ２７４Ｍ、Ｋ２７４Ｗ、Ｋ２７４Ｐ、Ｋ２７４Ｇ、Ｆ２７５Ｌ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２７６Ｔ、Ｎ２７６Ｈ、Ｎ２７６Ｖ、Ｎ２７６Ｉ、Ｎ２７６Ｆ、Ｎ２７６Ｍ、Ｎ２７６Ｗ、Ｎ２７６Ｐ、Ｎ２７６Ｇ、Ｙ２７８Ｄ、Ｙ２７８Ｎ、Ｙ２７８Ｑ、Ｙ２７８Ｒ、Ｙ２７８Ｓ、Ｙ２７８Ｈ、Ｙ２７８Ｖ、Ｙ２７８Ｌ、Ｙ２７８Ｉ、Ｙ２７８Ｍ、Ｙ２７８Ｐ、Ｙ２７８Ｇ、Ｄ２８０Ｋ、Ｄ２８０Ｌ、Ｄ２８０Ｗ、Ｄ２８０Ｐ、Ｄ２８０Ｇ、Ｇ２８１Ｄ、Ｇ２８１Ｋ、Ｇ２８１Ｙ、Ｇ２８１Ｐ、Ｖ２８２Ｅ、Ｖ２８２Ｋ、Ｖ２８２Ｙ、Ｖ２８２Ｐ、Ｖ２８２Ｇ、Ｅ２８３Ｋ、Ｅ２８３Ｈ、Ｅ２８３Ｌ、Ｅ２８３Ｙ、Ｅ２８３Ｐ、Ｅ２８３Ｇ、Ｖ２８４Ｅ、Ｖ２８４Ｎ、Ｖ２８４Ｔ、Ｖ２８４Ｌ、Ｖ２８４Ｙ、Ｈ２８５Ｄ、Ｈ２８５Ｅ、Ｈ２８５Ｑ、Ｈ２８５Ｋ、Ｈ２８５Ｙ、Ｈ２８５Ｗ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ２８６Ｙ、Ｎ２８６Ｐ、Ｎ２８６Ｇ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ２８８Ｙ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｗ、Ｐ２９１Ｄ、Ｐ２９１Ｅ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｔ、Ｐ２９１Ｈ、Ｐ２９１Ｉ、Ｐ２９１Ｇ、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｔ、Ｒ２９２Ｙ、Ｅ２９３Ｎ、Ｅ２９３Ｒ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９３Ｈ、Ｅ２９３Ｖ、Ｅ２９３Ｌ、Ｅ２９３Ｉ、Ｅ２９３Ｆ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｙ、Ｅ２９３Ｗ、Ｅ２９３Ｐ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９４Ｋ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｓ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｈ、Ｅ２９４Ｖ、Ｅ２９４Ｌ、Ｅ２９４Ｉ、Ｅ２９４Ｆ、Ｅ２９４Ｍ、Ｅ２９４Ｙ、Ｅ２９４Ｗ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｇ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５Ｅ、Ｑ２９５Ｎ、Ｑ２９５Ｒ、Ｑ２９５Ｓ、Ｑ２９５Ｔ、Ｑ２９５Ｈ、Ｑ２９５Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｍ、Ｑ２９５Ｙ、Ｑ２９５Ｗ、Ｑ２９５Ｐ、Ｑ２９５Ｇ、Ｙ２９６Ｋ、Ｙ２９６Ｒ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｖ、Ｙ２９６Ｍ、Ｙ２９６Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｋ、Ｎ２９７Ｒ、Ｎ２９７Ｔ、Ｎ２９７Ｈ、Ｎ２９７Ｖ、Ｎ２９７Ｌ、Ｎ２９７Ｉ、Ｎ２９７Ｆ、Ｎ２９７Ｍ、Ｎ２９７Ｙ、Ｎ２９７Ｗ、Ｎ２９７Ｐ、Ｎ２９７Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｅ、Ｓ２９８Ｑ、Ｓ２９８Ｋ、Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２９８Ｉ、Ｓ２９８Ｆ、Ｓ２９８Ｍ、Ｓ２９８Ｙ、Ｓ２９８Ｗ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｑ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｗ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｇ、Ｙ３００Ｄ、Ｙ３００Ｅ、Ｙ３００Ｎ、Ｙ３００Ｑ、Ｙ３００Ｋ、Ｙ３００Ｒ、Ｙ３００Ｓ、Ｙ３００Ｔ、Ｙ３００Ｈ、Ｙ３００Ａ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｍ、Ｙ３００Ｗ、Ｙ３００Ｐ、Ｙ３００Ｇ、Ｒ３０１Ｄ、Ｒ３０１Ｅ、Ｒ３０１Ｈ、Ｒ３０１Ｙ、Ｖ３０３Ｄ、Ｖ３０３Ｅ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｄ、Ｓ３０４Ｎ、Ｓ３０４Ｔ、Ｓ３０４Ｈ、Ｓ３０４Ｌ、Ｖ３０５Ｅ、Ｖ３０５Ｔ、Ｖ３０５Ｙ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３１７Ｑ、Ｅ３１８Ｑ、Ｅ３１８Ｈ、Ｅ３１８Ｌ、Ｅ３１８Ｙ、Ｋ３２０Ｎ、Ｋ３２０Ｓ、Ｋ３２０Ｈ、Ｋ３２０Ｖ、Ｋ３２０Ｌ、Ｋ３２０Ｆ、Ｋ３２０Ｙ、Ｋ３２０Ｗ、Ｋ３２０Ｐ、Ｋ３２０Ｇ、Ｋ３２２Ｄ、Ｋ３２２Ｓ、Ｋ３２２Ｖ、Ｋ３２２Ｉ、Ｋ３２２Ｆ、Ｋ３２２Ｙ、Ｋ３２２Ｗ、Ｋ３２２Ｐ、Ｋ３２２Ｇ、Ｓ３２４Ｈ、Ｓ３２４Ｆ、Ｓ３２４Ｍ、Ｓ３２４Ｗ、Ｓ３２４Ｐ、Ｓ３２４Ｇ、Ｎ３２５Ｋ、Ｎ３２５Ｒ、Ｎ３２５Ｓ、Ｎ３２５Ｆ、Ｎ３２５Ｍ、Ｎ３２５Ｙ、Ｎ３２５Ｗ、Ｎ３２５Ｐ、Ｎ３２５Ｇ、Ｋ３２６Ｐ、Ａ３２７Ｅ、Ａ３２７Ｋ、Ａ３２７Ｒ、Ａ３２７Ｈ、Ａ３２７Ｖ、Ａ３２７Ｉ、Ａ３２７Ｆ、Ａ３２７Ｍ、Ａ３２７Ｙ、Ａ３２７Ｗ、Ａ３２７Ｐ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｋ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ３２８Ｓ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｙ、Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｐ、Ｌ３２８Ｇ、Ｐ３２９Ｄ、Ｐ３２９Ｅ、Ｐ３２９Ｎ、Ｐ３２９Ｑ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｒ、Ｐ３２９Ｓ、Ｐ３２９Ｔ、Ｐ３２９Ｈ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３２９Ｌ、Ｐ３２９Ｉ、Ｐ３２９Ｍ、Ｐ３２９Ｙ、Ｐ３２９Ｗ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｅ、Ａ３３０Ｎ、Ａ３３０Ｔ、Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｇ、Ｐ３３１Ｄ、Ｐ３３１Ｑ、Ｐ３３１Ｒ、Ｐ３３１Ｔ、Ｐ３３１Ｌ、Ｐ３３１Ｉ、Ｐ３３１Ｆ、Ｐ３３１Ｍ、Ｐ３３１Ｙ、Ｐ３３１Ｗ、Ｉ３３２Ｋ、Ｉ３３２Ｒ、Ｉ３３２Ｓ、Ｉ３３２Ｖ、Ｉ３３２Ｆ、Ｉ３３２Ｍ、Ｉ３３２Ｗ、Ｉ３３２Ｐ、Ｉ３３２Ｇ、Ｅ３３３Ｌ、Ｅ３３３Ｆ、Ｅ３３３Ｍ、Ｅ３３３Ｐ、Ｋ３３４Ｐ、Ｔ３３５Ｎ、Ｔ３３５Ｓ、Ｔ３３５Ｈ、Ｔ３３５Ｖ、Ｔ３３５Ｌ、Ｔ３３５Ｉ、Ｔ３３５Ｆ、Ｔ３３５Ｍ、Ｔ３３５Ｗ、Ｔ３３５Ｐ、Ｔ３３５Ｇ、Ｉ３３６Ｅ、Ｉ３３６Ｋ、Ｉ３３６Ｙ、Ｓ３３７Ｅ、Ｓ３３７Ｎ、Ｓ３３７Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｓ、Ｋ３２６Ｎ、Ｋ３２６Ｑ、Ｋ３２６Ｄ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｙ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｅ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｌ、Ｑ２９５Ｋ、Ｅ２９４Ｎ、Ｓ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｄ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｄ２８０Ｑ、Ｄ２８０Ｙ、Ｋ２９０Ｇ、Ｋ２９０Ｔ、Ｋ２９０Ｙ、Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｅ、Ｙ２７８Ｔ、Ｎ２９７Ｄ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｈ、Ｋ３２６Ｔ、Ｌ３２８Ａ、Ｌ３２８Ｈ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２ＮおよびＩ３３２Ｑから選択される重鎖定常領域におけるアミノ酸置換から選択される、アミノ酸置換も含み得る。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのあらゆる例は、ＥＧＦＲと免疫特異的に結合できる。
またここに提供されるのは、標的剤と直接的または間接的に結合したここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかを含むコンジュゲートである。コンジュゲートは次の成分を含み得る：(Ａｂ)、(Ｌ)ｑおよび(標的剤)ｍ(ここで：
ＡｂはＥＧＦＲと結合する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
ＬはＡｂを標的剤に結合するリンカーであり；
ｍは少なくとも１、例えば少なくとも１〜８であり；
ｑは０またはそれ以上、例えば、得られたコンジュゲートがＥＧＦＲに結合する限り、０〜８である)；そして
得られたコンジュゲートはＥＧＦＲに結合する。
ここに提供するコンジュゲートのあらゆる例において、標的剤はタンパク質、ペプチド、核酸または小分子であり得る。例えば、標的剤は治療部分であり得る。治療部分は細胞毒性部分、放射性同位体、化学療法剤、溶菌性ペプチドまたはサイトカインであり得る。ここでのコンジュゲートにおける治療部分の非限定的例は、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；臭化エチジウム；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テニポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒチン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；マイタンシンまたはその類似体もしくは誘導体；オーリスタチンまたはその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体；ドラスタチン１０または１５またはその類似体；イリノテカンまたはその類似体；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリチアマイシンまたはその類似体もしくは誘導体；代謝拮抗剤；アルキル化剤；白金誘導体；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラシェルマイシン(ＣＣ−１０６５)またはその類似体もしくは誘導体；抗生物質；ピロロ[２,ｌ−ｃ][１,４]−ベンゾジアゼピン類(ＰＤＢ)；毒素；リボヌクレアーゼ(ＲＮａｓｅ)；ＤＮａｓｅ Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；またはヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質であり得る。
例えば、治療部分は、アンサマイトシンまたはメルタンシン(ＤＭ１)から選択されるマイタンシノイドであるマイタンシン誘導体である。他の例において、治療部分は、オーリスタチンまたはモノメチルオーリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)またはＦ(ＭＭＡＦ)であるその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体である。他の例において、治療部分は、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビンおよびクラドリビンから選択される代謝拮抗剤である。他の例において、治療部分は、クロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(ＢＣＮＵ)、ロムスチン(ＣＣＮＵ)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(ＤＴＩＣ)、プロカルバジンおよびマイトマイシンＣから選択されるアルキル化剤である。他の例において、治療部分は、シスプラチンまたはカルボプラチンである白金誘導体である。他の例において、治療部分は、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンおよびアントラマイシン(ＡＭＣ)から選択される抗生物質である。他の例において、治療部分は、ジフテリア毒素およびその活性フラグメントおよびハイブリッド分子、リシン毒素、コレラ毒素、志賀毒素様毒素、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ボウマン・バーク大豆プロテアーゼインヒビター、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ガラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシン毒素から選択される毒素である。
ここに提供するコンジュゲートのあらゆる例において、抗体と標的剤は直接的に結合する。例えば、抗体と標的剤はリンカーを介して連結する。リンカーはペプチドまたはポリペチドであってよく、または化学的リンカーである。リンカーは開裂可能リンカーまたは非開裂可能リンカーであり得る。リンカーは、抗体上の１個以上の遊離チオールにコンジュゲートでき、または１個以上の１級アミンにコンジュゲートできる。
ここに提供されるのは、ここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの１個以上の重鎖をコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子である。またここに提供されるのは、ここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの１個以上の軽鎖をコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸分子である。またここに提供されるのは、ここに提供する核酸分子を含むベクターおよびここに提供するベクターを含む細胞である。ここに提供する細胞の例は、原核生物および真核生物細胞を含む。
ここに提供されるのは、ここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントおよび化学療法剤を含む組み合わせ剤である。化学療法剤は、アルキル化剤、ニトロソウレア類、トポイソメラーゼ阻害剤および抗体から選択され得る。ある例において、化学療法剤は第一抗体と異なる付加的抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある例において、付加的抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよびその抗原結合フラグメントまたはその変異体から選択される。
ここに提供されるのは、１個以上の容器中に、ここに提供する抗体または抗原結合フラグメントまたはここに提供する組み合わせ剤および使用指示を含む、キットである。
ここに提供されるのは、ここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントのいずれか、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントのいずれかおよび薬学的に許容される担体または添加物を含む、医薬組成物である。医薬組成物はまたここに提供する抗体または抗原結合フラグメントおよび１種または複数種の付加的薬剤を含む、ここに提供する組み合わせ剤のいずれも含み得る。ここに提供する医薬組成物は、ゲル剤、軟膏剤、液剤、懸濁液剤、エアロゾル剤、錠剤、丸剤または粉剤として製剤できおよび／または全身投与、非経腸投与、局所投与、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、皮下投与、エアロゾル化投与、静脈内投与、気管支投与、肺投与、膣投与、外陰膣投与、食道投与または口腔食道投与のために製剤できる。ここに提供する医薬組成物は単回投与量投与または多回投与量投与に製剤できる。ある例において、ここに提供する医薬組成物は、徐放性製剤である。
ここに提供されるのは、抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態の処置方法である。ある例において、方法は対象における抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態の処置のためであり、ここに提供する医薬組成物のいずれかの薬学的に有効量を対象に投与することを含む。
またここに提供されるのは、抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態の処置方法である。ある例において、方法は対象における抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態の処置のためであり：ａ)抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態を有する対象を同定し、かつ該対象が抗ＥＧＦＲ抗体の投与と関連する副作用を示し；およびｂ)条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与することを含む。このような例において、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の可変重鎖、可変軽鎖または両者にアミノ酸置換を含む修飾抗体であり、該修飾抗ＥＧＦＲ抗体は腫瘍微小環境において条件依存活性である。ある例において、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、アミノ酸置換を含まず、ＥＧＦＲに特異的に結合するセツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体である。
ここでの方法において、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｐＨの差以外同一条件下で測定したとき、正確にまたは約ｐＨ７.４と比較して、正確にまたは約ｐＨ６.０〜ｐＨ６.５でＥＧＦＲに対する高い結合活性比を示し得る。ここでの方法において、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｐＨの差以外同一条件下で測定したとき、正確にまたは約ｐＨ７.４と比較して、正確にまたは約ｐＨ６.０〜ｐＨ６.５で少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、５.０またはそれ以上のＥＧＦＲに対する結合活性比を示し得る。
ここでの方法のある例において、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、非修飾抗体よりも、ｐＨ６.０〜ｐＨ７.０から選択されるｐＨで、ｐＨ７.４で高い活性を有する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントであるか；または修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントは、非修飾抗体と比較して、ｐＨ６.０〜ｐＨ７.０から選択されるｐＨで、ｐＨ７.４より低い活性を有する。
ここに提供する方法において、治療的投与のために、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの投与量は、腫瘍微小環境における対照物質または非修飾抗体に対するその相対的活性により調節できる。それゆえに、投与量は、特に対照条件依存活性(例えば修飾抗体)が対照物質または非修飾抗体よりも腫瘍微小環境で活性であるならば低くてもよい。投与量が低いとき、副作用の減少が低投与量によりもたらされ得る。ある面において、腫瘍微小環境に対して高い選択性を示す条件依存活性抗体は、現存する類似治療剤より高投与量で投与でき、その結果効果が上がる。投与量は、当業者が容易に経験的に決定できる。
ここに提供するあらゆる方法の例において、抗体またはそのフラグメントが投与されている対象は、基底ケラチン生成細胞における抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲ受容体への結合と関連する副作用を示すことが同定されたものである。副作用は、例えば、ざ瘡様発疹、丘疹小水疱性皮疹、発毛異常、皮膚乾燥および掻痒および圧痛を伴う爪周囲炎症、毛細血管拡張症、色素増加症、発疹を伴わない掻痒、紅斑、口腔口唇潰瘍、アナフィラキシー反応、呼吸困難、咳、喘鳴、肺炎、低酸素血症、呼吸不全、肺塞栓、胸水および非特異的呼吸器障害、発熱、悪寒、無力症／倦怠感、粘膜表面問題、悪心、消化器問題、腹痛、頭痛および低マグネシウム血症を含むが、これらに限定されない。
ここに提供する方法の実施のあらゆる例において、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは修飾抗ＥＧＦＲまたはその抗原結合フラグメントである。修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのＶＨ鎖またはその一部は、配列番号１または３に示すアミノ酸位置を参照し、対応するアミノ酸位置は、抗体のＶＨ鎖と配列番号３に示すＶＨ鎖のアラインメントにより同定して、Ｔ０２３Ｋ、Ｔ０２３Ｈ、Ｔ０２３Ｒ、Ｔ０２３Ａ、Ｔ０２３Ｃ、Ｔ０２３Ｅ、Ｔ０２３Ｇ、Ｔ０２３Ｉ、Ｔ０２３Ｍ、Ｔ０２３Ｎ、Ｔ０２３Ｐ、Ｔ０２３Ｓ、Ｔ０２３Ｖ、Ｔ０２３Ｗ、Ｔ０２３Ｌ、Ｖ０２４Ｒ、Ｖ０２４Ａ、Ｖ０２４Ｆ、Ｖ０２４Ｇ、Ｖ０２４Ｉ、Ｖ０２４Ｍ、Ｖ０２４Ｐ、Ｖ０２４Ｓ、Ｖ０２４Ｔ、Ｖ０２４Ｌ、Ｖ０２４Ｅ、Ｓ０２５Ｈ、Ｓ０２５Ｒ、Ｓ０２５Ａ、Ｓ０２５Ｃ、Ｓ０２５Ｄ、Ｓ０２５Ｅ、Ｓ０２５Ｆ、Ｓ０２５Ｇ、Ｓ０２５Ｉ、Ｓ０２５Ｍ、Ｓ０２５Ｐ、Ｓ０２５Ｑ、Ｓ０２５Ｔ、Ｓ０２５Ｖ、Ｓ０２５Ｌ、Ｇ０２６Ｈ、Ｇ０２６Ｒ、Ｇ０２６Ｄ、Ｇ０２６Ｆ、Ｇ０２６Ｍ、Ｇ０２６Ｎ、Ｇ０２６Ｐ、Ｇ０２６Ｑ、Ｇ０２６Ｓ、Ｇ０２６Ｙ、Ｇ０２６Ｌ、Ｆ０２７Ｈ、Ｆ０２７Ｒ、Ｆ０２７Ａ、Ｆ０２７Ｄ、Ｆ０２７Ｅ、Ｆ０２７Ｇ、Ｆ０２７Ｍ、Ｆ０２７Ｐ、Ｆ０２７Ｑ、Ｆ０２７Ｓ、Ｆ０２７Ｔ、Ｆ０２７Ｖ、Ｆ０２７Ｗ、Ｆ０２７Ｙ、Ｆ０２７Ｌ、Ｓ０２８Ｋ、Ｓ０２８Ｈ、Ｓ０２８Ｒ、Ｓ０２８Ａ、Ｓ０２８Ｄ、Ｓ０２８Ｉ、Ｓ０２８Ｍ、Ｓ０２８Ｐ、Ｓ０２８Ｑ、Ｓ０２８Ｖ、Ｓ０２８Ｗ、Ｓ０２８Ｌ、Ｌ０２９Ｋ、Ｌ０２９Ｈ、Ｌ０２９Ａ、Ｌ０２９Ｄ、Ｌ０２９Ｇ、Ｌ０２９Ｉ、Ｌ０２９Ｍ、Ｌ０２９Ｎ、Ｌ０２９Ｓ、Ｌ０２９Ｖ、Ｔ０３０Ｈ、Ｔ０３０Ｒ、Ｔ０３０Ｄ、Ｔ０３０Ｇ、Ｔ０３０Ｉ、Ｔ０３０Ｍ、Ｔ０３０Ｎ、Ｔ０３０Ｐ、Ｔ０３０Ｓ、Ｔ０３０Ｖ、Ｔ０３０Ｗ、Ｔ０３０Ｙ、Ｎ０３１Ｋ、Ｎ０３１Ｈ、Ｎ０３１Ｄ、Ｎ０３１Ｅ、Ｎ０３１Ｇ、Ｎ０３１Ｉ、Ｎ０３１Ｔ、Ｎ０３１Ｖ、Ｎ０３１Ｌ、Ｙ０３２Ｈ、Ｙ０３２Ｒ、Ｙ０３２Ｃ、Ｙ０３２Ｍ、Ｙ０３２Ｎ、Ｙ０３２Ｔ、Ｙ０３２Ｖ、Ｙ０３２Ｌ、Ｇ０３３Ｅ、Ｇ０３３Ｍ、Ｇ０３３Ｓ、Ｇ０３３Ｔ、Ｇ０３３Ｙ、Ｖ０３４Ａ、Ｖ０３４Ｃ、Ｖ０３４Ｉ、Ｖ０３４Ｍ、Ｖ０３４Ｐ、Ｖ０３４Ｌ、Ｈ０３５Ｉ、Ｈ０３５Ｑ、Ｗ０３６Ｋ、Ｗ０３６Ａ、Ｗ０３６Ｉ、Ｗ０３６Ｖ、Ｗ０３６Ｙ、Ｖ０５０Ｋ、Ｖ０５０Ｈ、Ｖ０５０Ａ、Ｖ０５０Ｄ、Ｖ０５０Ｅ、Ｖ０５０Ｇ、Ｖ０５０Ｉ、Ｖ０５０Ｎ、Ｖ０５０Ｑ、Ｖ０５０Ｔ、Ｖ０５０Ｌ、Ｉ０５１Ｋ、Ｉ０５１Ｈ、Ｉ０５１Ａ、Ｉ０５１Ｃ、Ｉ０５１Ｅ、Ｉ０５１Ｇ、Ｉ０５１Ｎ、Ｉ０５１Ｑ、Ｉ０５１Ｓ、Ｉ０５１Ｖ、Ｉ０５１Ｙ、Ｉ０５１Ｌ、Ｗ０５２Ｉ、Ｗ０５２Ｎ、Ｗ０５２Ｙ、Ｓ０５３Ｈ、Ｓ０５３Ｒ、Ｓ０５３Ａ、Ｓ０５３Ｃ、Ｓ０５３Ｇ、Ｓ０５３Ｉ、Ｓ０５３Ｍ、Ｓ０５３Ｐ、Ｓ０５３Ｑ、Ｓ０５３Ｌ、Ｓ０５３Ｔ、Ｓ０５３Ｖ、Ｓ０５３Ｙ、Ｇ０５４Ｈ、Ｇ０５４Ｒ、Ｇ０５４Ａ、Ｇ０５４Ｃ、Ｇ０５４Ｄ、Ｇ０５４Ｐ、Ｇ０５４Ｓ、Ｇ０５５Ｈ、Ｇ０５５Ｒ、Ｇ０５５Ｍ、Ｇ０５５Ｓ、Ｇ０５５Ｙ、Ｎ０５６Ｋ、Ｎ０５６Ａ、Ｎ０５６Ｐ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０５６Ｖ、Ｎ０５６Ｇ、Ｔ０５７Ｈ、Ｔ０５７Ｒ、Ｔ０５７Ｌ、Ｔ０５７Ａ、Ｔ０５７Ｃ、Ｔ０５７Ｄ、Ｔ０５７Ｆ、Ｔ０５７Ｍ、Ｔ０５７Ｎ、Ｔ０５７Ｑ、Ｔ０５７Ｗ、Ｔ０５７Ｙ、Ｄ０５８Ｌ、Ｄ０５８Ｇ、Ｄ０５８Ｍ、Ｄ０５８Ｎ、Ｄ０５８Ｑ、Ｙ０５９Ｈ、Ｙ０５９Ｒ、Ｙ０５９Ａ、Ｙ０５９Ｃ、Ｙ０５９Ｄ、Ｙ０５９Ｅ、Ｙ０５９Ｇ、Ｙ０５９Ｉ、Ｙ０５９Ｐ、Ｙ０５９Ｑ、Ｙ０５９Ｓ、Ｙ０５９Ｔ、Ｙ０５９Ｖ、Ｙ０５９Ｗ、Ｎ０６０Ｋ、Ｎ０６０Ａ、Ｎ０６０Ｃ、Ｎ０６０Ｄ、Ｎ０６０Ｆ、Ｎ０６０Ｇ、Ｎ０６０Ｐ、Ｎ０６０Ｑ、Ｎ０６０Ｓ、Ｎ０６０Ｔ、Ｎ０６０Ｙ、Ｔ０６１Ｎ、Ｔ０６１Ｑ、Ｐ０６２Ｇ、Ｆ０６３Ｈ、Ｆ０６３Ｒ、Ｆ０６３Ｌ、Ｆ０６３Ａ、Ｆ０６３Ｃ、Ｆ０６３Ｄ、Ｆ０６３Ｇ、Ｆ０６３Ｍ、Ｆ０６３Ｎ、Ｆ０６３Ｑ、Ｆ０６３Ｓ、Ｆ０６３Ｖ、Ｔ０６４Ｒ、Ｔ０６４Ｌ、Ｔ０６４Ｃ、Ｔ０６４Ｆ、Ｔ０６４Ｇ、Ｔ０６４Ｎ、Ｔ０６４Ｑ、Ｔ０６４Ｖ、Ｓ０６５Ｈ、Ｓ０６５Ｒ、Ｓ０６５Ｌ、Ｓ０６５Ｃ、Ｓ０６５Ｅ、Ｓ０６５Ｆ、Ｓ０６５Ｇ、Ｓ０６５Ｉ、Ｓ０６５Ｍ、Ｓ０６５Ｎ、Ｓ０６５Ｐ、Ｓ０６５Ｑ、Ｓ０６５Ｔ、Ｓ０６５Ｗ、Ｓ０６５Ｙ、Ｒ０６６Ｌ、Ｒ０６６Ａ、Ｒ０６６Ｃ、Ｒ０６６Ｅ、Ｒ０６６Ｆ、Ｒ０６６Ｎ、Ｒ０６６Ｐ、Ｒ０６６Ｑ、Ｒ０６６Ｓ、Ｒ０６６Ｔ、Ｒ０６６Ｖ、Ｒ０６６Ｇ、Ｌ０６７Ａ、Ｌ０６７Ｃ、Ｌ０６７Ｄ、Ｌ０６７Ｅ、Ｌ０６７Ｉ、Ｌ０６７Ｍ、Ｌ０６７Ｑ、Ｌ０６７Ｓ、Ｌ０６７Ｔ、Ｌ０６７Ｖ、Ｌ０６７Ｙ、Ｓ０６８Ｋ、Ｓ０６８Ｈ、Ｓ０６８Ｒ、Ｓ０６８Ｌ、Ｓ０６８Ｃ、Ｓ０６８Ｄ、Ｓ０６８Ｅ、Ｓ０６８Ｆ、Ｓ０６８Ｇ、Ｓ０６８Ｉ、Ｓ０６８Ｎ、Ｓ０６８Ｑ、Ｓ０６８Ｔ、Ｓ０６８Ｖ、Ｉ０６９Ａ、Ｉ０６９Ｃ、Ｉ０６９Ｇ、Ｉ０６９Ｙ、Ｎ０７０Ｈ、Ｎ０７０Ｒ、Ｎ０７０Ｌ、Ｎ０７０Ｄ、Ｎ０７０Ｅ、Ｎ０７０Ｆ、Ｎ０７０Ｇ、Ｎ０７０Ｉ、Ｎ０７０Ｐ、Ｎ０７０Ｑ、Ｎ０７０Ｓ、Ｎ０７０Ｔ、Ｎ０７０Ｖ、Ｎ０７０Ｙ、Ｋ０７１Ｈ、Ｋ０７１Ｒ、Ｋ０７１Ｌ、Ｋ０７１Ａ、Ｋ０７１Ｃ、Ｋ０７１Ｆ、Ｋ０７１Ｇ、Ｋ０７１Ｑ、Ｋ０７１Ｓ、Ｋ０７１Ｔ、Ｋ０７１Ｖ、Ｋ０７１Ｗ、Ｋ０７１Ｙ、Ｄ０７２Ｋ、Ｄ０７２Ｈ、Ｄ０７２Ｒ、Ｄ０７２Ｌ、Ｄ０７２Ａ、Ｄ０７２Ｇ、Ｄ０７２Ｉ、Ｄ０７２Ｍ、Ｄ０７２Ｎ、Ｄ０７２Ｑ、Ｄ０７２Ｓ、Ｄ０７２Ｖ、Ｄ０７２Ｗ、Ｄ０７２Ｙ、Ｎ０７３Ｈ、Ｎ０７３Ｒ、Ｎ０７３Ｌ、Ｎ０７３Ａ、Ｎ０７３Ｃ、Ｎ０７３Ｇ、Ｎ０７３Ｉ、Ｎ０７３Ｍ、Ｎ０７３Ｐ、Ｎ０７３Ｑ、Ｎ０７３Ｓ、Ｎ０７３Ｔ、Ｎ０７３Ｖ、Ｎ０７３Ｗ、Ｎ０７３Ｙ、Ｓ０７４Ｋ、Ｓ０７４Ｈ、Ｓ０７４Ｒ、Ｓ０７４Ｌ、Ｓ０７４Ａ、Ｓ０７４Ｃ、Ｓ０７４Ｄ、Ｓ０７４Ｅ、Ｓ０７４Ｇ、Ｓ０７４Ｉ、Ｓ０７４Ｍ、Ｓ０７４Ｐ、Ｓ０７４Ｔ、Ｓ０７４Ｖ、Ｓ０７４Ｙ、Ｋ０７５Ｈ、Ｋ０７５Ｒ、Ｋ０７５Ｌ、Ｋ０７５Ａ、Ｋ０７５Ｃ、Ｋ０７５Ｅ、Ｋ０７５Ｆ、Ｋ０７５Ｍ、Ｋ０７５Ｑ、Ｋ０７５Ｔ、Ｋ０７５Ｖ、Ｋ０７５Ｗ、Ｋ０７５Ｙ、Ｓ０７６Ｈ、Ｓ０７６Ｒ、Ｓ０７６Ｌ、Ｓ０７６Ａ、Ｓ０７６Ｃ、Ｓ０７６Ｄ、Ｓ０７６Ｅ、Ｓ０７６Ｆ、Ｓ０７６Ｍ、Ｓ０７６Ｐ、Ｓ０７６Ｑ、Ｓ０７６Ｔ、Ｓ０７６Ｙ、Ｑ０７７Ｈ、Ｑ０７７Ｒ、Ｑ０７７Ｌ、Ｑ０７７Ａ、Ｑ０７７Ｅ、Ｑ０７７Ｇ、Ｑ０７７Ｉ、Ｑ０７７Ｍ、Ｑ０７７Ｎ、Ｑ０７７Ｓ、Ｑ０７７Ｖ、Ｑ０７７Ｗ、Ｑ０７７Ｙ、Ｙ０９３Ｈ、Ｙ０９３Ｖ、Ｙ０９３Ｗ、Ｙ０９４Ｒ、Ｙ０９４Ｌ、Ｒ０９７Ｈ、Ｒ０９７Ｗ、Ａ０９８Ｐ、Ｌ０９９Ｎ、Ｌ０９９Ｗ、Ｔ１００Ｈ、Ｔ１００Ｌ、Ｔ１００Ａ、Ｔ１００Ｄ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｎ、Ｔ１００Ｐ、Ｔ１００Ｑ、Ｔ１００Ｓ、Ｔ１００Ｖ、Ｔ１００Ｙ、Ｙ１０１Ｈ、Ｙ１０１Ｅ、Ｙ１０１Ｆ、Ｙ１０１Ｍ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０２Ｒ、Ｙ１０２Ｃ、Ｙ１０２Ｄ、Ｙ１０２Ｉ、Ｙ１０２Ｎ、Ｙ１０２Ｗ、Ｄ１０３Ｒ、Ｄ１０３Ｌ、Ｄ１０３Ａ、Ｄ１０３Ｃ、Ｄ１０３Ｉ、Ｄ１０３Ｐ、Ｄ１０３Ｑ、Ｄ１０３Ｙ、Ｙ１０４Ｈ、Ｙ１０４Ｌ、Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｉ、Ｙ１０４Ｍ、Ｙ１０４Ｓ、Ｙ１０４Ｖ、Ｅ１０５Ｈ、Ｅ１０５Ｔ、Ｆ１０６Ｌ、Ｆ１０６Ｖ、Ｆ１０６Ｗ、Ｆ１０６Ｙ、Ａ１０７Ｋ、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｌ、Ａ１０７Ｃ、Ａ１０７Ｄ、Ａ１０７Ｅ、Ａ１０７Ｇ、Ａ１０７Ｎ、Ａ１０７Ｓ、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｙ、Ｙ１０８Ｋ、Ｙ１０８Ｈ、Ｙ１０８Ｒ、Ｙ１０８Ｌ、Ｙ１０８Ｃ、Ｙ１０８Ｆ、Ｙ１０８Ｉ、Ｙ１０８Ｎ、Ｙ１０８Ｓ、Ｙ１０８Ｔ、Ｙ１０８Ｖ、Ｙ１０８Ｗ、Ｗ１０９Ｉ、Ｗ１０９Ｍ、Ｗ１０９Ｙ、Ｇ１１０Ｒ、Ｇ１１０Ａ、Ｇ１１０Ｍ、Ｇ１１０Ｐ、Ｇ１１０Ｔ、Ｑ１１１Ｋ、Ｑ１１１Ｈ、Ｑ１１１Ｒ、Ｑ１１１Ｌ、Ｑ１１１Ｄ、Ｑ１１１Ｅ、Ｑ１１１Ｇ、Ｑ１１１Ｍ、Ｑ１１１Ｐ、Ｑ１１１Ｓ、Ｑ１１１Ｔ、Ｑ１１１Ｗ、Ｑ１１１Ｙ、Ｑ１１１Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｎ、Ｇ１１２Ｐ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１ＰおよびＶ２４Ｅ／Ｆ２７Ｒ／Ｒ９７Ｈ／Ｑ１１１Ｐから選択されるアミノ酸置換に対応する１個以上のアミノ酸置換を含み、その一部は抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含む；および／または修飾ＶＬ鎖またはその一部は、配列番号２または４に示すアミノ酸位置を参照して、対応するアミノ酸位置は、抗体のＶＬ鎖と配列番号４に示すＶＬ鎖のアラインメントにより同定して、Ｄ００１Ｗ、Ｉ００２Ｃ、Ｉ００２Ｖ、Ｉ００２Ｗ、Ｌ００３Ｄ、Ｌ００３Ｆ、Ｌ００３Ｇ、Ｌ００３Ｓ、Ｌ００３Ｔ、Ｌ００３Ｖ、Ｌ００３Ｗ、Ｌ００３Ｙ、Ｌ００３Ｒ、Ｌ００４Ｃ、Ｌ００４Ｅ、Ｌ００４Ｆ、Ｌ００４Ｉ、Ｌ００４Ｐ、Ｌ００４Ｓ、Ｌ００４Ｔ、Ｌ００４Ｖ、Ｌ００４Ｗ、Ｌ００４Ｋ、Ｌ００４Ｈ、Ｌ００４Ｒ、Ｔ００５Ａ、Ｔ００５Ｃ、Ｔ００５Ｄ、Ｔ００５Ｅ、Ｔ００５Ｆ、Ｔ００５Ｇ、Ｔ００５Ｎ、Ｔ００５Ｓ、Ｔ００５Ｗ、Ｔ００５Ｌ、Ｔ００５Ｋ、Ｔ００５Ｈ、Ｔ００５Ｒ、Ｔ００５Ｐ、Ｒ０２４Ａ、Ｒ０２４Ｃ、Ｒ０２４Ｆ、Ｒ０２４Ｌ、Ｒ０２４Ｍ、Ｒ０２４Ｓ、Ｒ０２４Ｗ、Ｒ０２４Ｙ、Ｒ０２４Ｇ、Ａ０２５Ｃ、Ａ０２５Ｇ、Ａ０２５Ｌ、Ａ０２５Ｖ、Ｓ０２６Ａ、Ｓ０２６Ｃ、Ｓ０２６Ｄ、Ｓ０２６Ｉ、Ｓ０２６Ｍ、Ｓ０２６Ｎ、Ｓ０２６Ｖ、Ｓ０２６Ｗ、Ｓ０２６Ｌ、Ｓ０２６Ｇ、Ｓ０２６Ｈ、Ｓ０２６Ｒ、Ｑ０２７Ａ、Ｑ０２７Ｄ、Ｑ０２７Ｅ、Ｑ０２７Ｆ、Ｑ０２７Ｉ、Ｑ０２７Ｍ、Ｑ０２７Ｎ、Ｑ０２７Ｐ、Ｑ０２７Ｔ、Ｓ０２８Ａ、Ｓ０２８Ｄ、Ｓ０２８Ｎ、Ｓ０２８Ｑ、Ｓ０２８Ｌ、Ｓ０２８Ｋ、Ｓ０２８Ｈ、Ｉ０２９Ａ、Ｉ０２９Ｅ、Ｉ０２９Ｆ、Ｉ０２９Ｓ、Ｉ０２９Ｔ、Ｉ０２９Ｒ、Ｇ０３０Ａ、Ｇ０３０Ｅ、Ｇ０３０Ｆ、Ｇ０３０Ｉ、Ｇ０３０Ｍ、Ｇ０３０Ｐ、Ｇ０３０Ｑ、Ｇ０３０Ｓ、Ｇ０３０Ｖ、Ｇ０３０Ｙ、Ｇ０３０Ｌ、Ｇ０３０Ｋ、Ｇ０３０Ｈ、Ｇ０３０Ｒ、Ｔ０３１Ａ、Ｔ０３１Ｆ、Ｔ０３１Ｇ、Ｔ０３１Ｍ、Ｔ０３１Ｓ、Ｔ０３１Ｖ、Ｔ０３１Ｗ、Ｔ０３１Ｌ、Ｔ０３１Ｋ、Ｔ０３１Ｈ、Ｎ０３２Ｇ、Ｉ０３３Ｆ、Ｉ０３３Ｇ、Ｉ０３３Ｍ、Ｉ０３３Ｔ、Ｉ０３３Ｖ、Ｉ０３３Ｈ、Ｉ０４８Ｍ、Ｉ０４８Ｓ、Ｉ０４８Ｌ、Ｉ０４８Ｋ、Ｋ０４９Ａ、Ｋ０４９Ｅ、Ｋ０４９Ｆ、Ｋ０４９Ｇ、Ｋ０４９Ｎ、Ｋ０４９Ｑ、Ｋ０４９Ｓ、Ｋ０４９Ｔ、Ｋ０４９Ｖ、Ｋ０４９Ｙ、Ｋ０４９Ｌ、Ｋ０４９Ｈ、Ｋ０４９Ｒ、Ａ０５１Ｔ、Ａ０５１Ｌ、Ｓ０５２Ａ、Ｓ０５２Ｃ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｅ、Ｓ０５２Ｇ、Ｓ０５２Ｉ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｑ、Ｓ０５２Ｖ、Ｓ０５２Ｗ、Ｓ０５２Ｒ、Ｓ０５２Ｋ、Ｅ０５３Ｇ、Ｓ０５４Ｍ、Ｉ０５５Ａ、Ｉ０５５Ｆ、Ｓ０５６Ｇ、Ｓ０５６Ｌ、Ｓ０５６Ａ、Ｓ０５６Ｃ、Ｓ０５６Ｄ、Ｓ０５６Ｅ、Ｓ０５６Ｆ、Ｓ０５６Ｎ、Ｓ０５６Ｐ、Ｓ０５６Ｑ、Ｓ０５６Ｖ、Ｓ０５６Ｗ、Ｓ０５６Ｈ、Ｓ０５６Ｒ、Ｓ０５６Ｋ、Ｙ０８６Ｆ、Ｙ０８６Ｍ、Ｙ０８６Ｈ、Ｙ０８７Ｌ、Ｙ０８７Ｃ、Ｙ０８７Ｄ、Ｙ０８７Ｆ、Ｙ０８７Ｇ、Ｙ０８７Ｉ、Ｙ０８７Ｎ、Ｙ０８７Ｐ、Ｙ０８７Ｓ、Ｙ０８７Ｔ、Ｙ０８７Ｖ、Ｙ０８７Ｗ、Ｙ０８７Ｋ、Ｙ０８７Ｈ、Ｙ０８７Ｒ、Ｑ０８９Ｅ、Ｎ０９１Ｌ、Ｎ０９１Ａ、Ｎ０９１Ｃ、Ｎ０９１Ｉ、Ｎ０９１Ｍ、Ｎ０９１Ｓ、Ｎ０９１Ｔ、Ｎ０９１Ｖ、Ｎ０９１Ｈ、Ｎ０９１Ｒ、Ｎ０９２Ｃ、Ｎ０９２Ｄ、Ｎ０９２Ｌ、Ｎ０９２Ｍ、Ｎ０９２Ｓ、Ｎ０９２Ｔ、Ｎ０９２Ｖ、Ｎ０９２Ｗ、Ｎ０９２Ｙ、Ｎ０９２Ｈ、Ｎ０９２Ｋ、Ｎ０９２Ｒ、Ｎ０９３Ｔ、Ｔ０９６Ｌ、Ｔ０９６Ｃ、Ｔ０９６Ｍ、Ｔ０９６Ｖ、Ｔ０９７Ｌ、Ｔ０９７Ａ、Ｔ０９７Ｄ、Ｔ０９７Ｇ、Ｔ０９７Ｑ、Ｔ０９７Ｓ、Ｔ０９７Ｖ、Ｔ０９７Ｋ、Ｔ０９７Ｒ、Ｆ０９８Ａ、Ｆ０９８Ｍ、Ｆ０９８Ｓ、Ｆ０９８Ｖ、Ｆ０９８Ｙ、Ｇ０９９Ｌ、Ｇ０９９Ｄ、Ｇ０９９Ｅ、Ｇ０９９Ｆ、Ｇ０９９Ｉ、Ｇ０９９Ｍ、Ｇ０９９Ｎ、Ｇ０９９Ｓ、Ｇ０９９Ｔ、Ｇ０９９Ｖ、Ｇ０９９Ｋ、Ｇ０９９Ｈ、Ｑ１００Ｃ、Ｑ１００Ｄ、Ｑ１００Ｅ、Ｑ１００Ｆ、Ｑ１００Ｉ、Ｑ１００Ｍ、Ｑ１００Ｎ、Ｑ１００Ｐ、Ｑ１００Ｔ、Ｑ１００Ｖ、Ｑ１００Ｗ、Ｑ１００Ｙ、Ｑ１００Ｋ、Ｑ１００ＨおよびＱ１００Ｒから選択されるアミ
ノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含んでよく、その一部は抗原結合部位の形成に十分であり、アミノ酸置換を含む。
ここに提供する方法の例において、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその変異体は、配列番号１に示すアミノ酸の配列または配列番号１に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号２に示すアミノ酸の配列または配列番号２に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する軽鎖；または配列番号８に示すアミノ酸の配列または配列番号８に示すアミノ酸の配列と少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号９に示すアミノ酸の配列または配列番号９に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する軽鎖を含み得る。
ここに提供する方法のある例において、非修飾抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体はヒト化されている。ここに提供する方法のある例において、非修飾抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体は、配列番号２８に示す可変重鎖および配列番号２９に示す可変軽鎖を含む。ここに提供する方法のある例において、非修飾抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体はその抗原結合フラグメントであり、該抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントから選択される。
ここに提供する方法のある例において、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体は、配列番号５に示すアミノ酸の配列または配列番号５に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号２に示すアミノ酸の配列または配列番号２に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する軽鎖を含むＦａｂフラグメントである。
ここに提供するあらゆる方法の例において、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３０〜５５７、１０６３、１０６４、１０６２、１０９３、１０９８〜１１０７、１１１２〜１１３１、１１３４〜１１３７または１１４６〜１１５２のいずれかに示す可変重(ＶＨ)鎖または配列番号３０〜５５７、１０６３、１０６４、１０６２、１０９３、１０９８〜１１０７、１１１２〜１１３１、１１３４〜１１３７または１１４６〜１１５２のいずれかに対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；および／または配列番号８１０〜１０６１、１０６７〜１０６８、１１３８〜１１４５または１１５３〜１１５９のいずれかに示す可変(ＶＬ)鎖または配列番号８１０〜１０６１、１０６７〜１０６８、１１３８〜１１４５または１１５３〜１１５９のいずれかに対して少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み得る。
ここに提供するあらゆる方法の例において、抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態は、腫瘍、癌または転移である。抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態の例は、頭頸部癌、非小細胞性肺癌または結腸直腸癌である。ここに提供する方法において、抗体を投与する対象は、例えば、ヒトのような哺乳動物を含む。
ここに提供する方法の例において、医薬組成物は、局所的、非経腸的、局所的、全身的に投与できる。ある例において、医薬組成物は鼻腔内、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、皮下、経口または肺投与により投与される。
ここに提供する方法は、他の抗腫瘍治療、例えば手術、放射線、化学療法、ウイルス治療および他の抗腫瘍抗体が、抗体治療と共に、前に、途中で、後におよび間欠的に適用される、組み合わせ治療を含む。組み合わせ治療で投与できる化学療法剤は、例えば、イリノテカン、シンバスタチンおよび５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)を含むが、これらに限定されない。ここに提供する方法は、１種以上の付加的抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントの投与を含み得る。付加的抗ＥＧＦＲ抗体の非限定的例はセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよびその抗原結合フラグメントを含む。
ここに提供する方法において、医薬組成物および抗癌剤を、単一組成物としてまたは別の組成物として製剤できる。医薬組成物および抗癌剤を逐次的に、同時にまたは間欠性に投与してよい。
ここに提供する方法において、抗体は、約または正確に０.１mg／kg〜約または正確に１００mg／kg、例えば、例えば、約または正確に０.５mg／kg〜約または正確に５０mg／kg、約または正確に５mg／kg〜約または正確に５０mg／kg、約または正確に１mg／kg〜約または正確に２０mg／kg、約または正確に１mg／kg〜約または正確に１００mg／kg、約または正確に１０mg／kg〜約または正確に８０mg／kgまたは約または正確に５０mg／kg〜約または正確に１００mg／kgまたはそれ以上の投与量；または約または正確に０.０１mg／ｍ２〜約または正確に８００mg／ｍ２またはそれ以上、例えば、約または正確に０.０１mg／ｍ２、約または正確に０.１mg／ｍ２、約または正確に０.５mg／ｍ２、約または正確に１mg／ｍ２、約または正確に５mg／ｍ２、約または正確に１０mg／ｍ２、約または正確に１５mg／ｍ２、約または正確に２０mg／ｍ２、約または正確に２５mg／ｍ２、約または正確に３０mg／ｍ２、約または正確に３５mg／ｍ２、約または正確に４０mg／ｍ２、約または正確に４５mg／ｍ２、約または正確に５０mg／ｍ２、約または正確に１００mg／ｍ２、約または正確に１５０mg／ｍ２、約または正確に２００mg／ｍ２、約または正確に２５０mg／ｍ２、約または正確に３００mg／ｍ２、約または正確に４００mg／ｍ２、約または正確に５００mg／ｍ２、約または正確に６００mg／ｍ２、約または正確に７００mg／ｍ２または約または正確に８００mg／ｍ２またはそれ以上の投与量で投与できる。
ここでの方法のある面において、対象は、抗ＥＧＦＲ治療に対する耐性に寄与するマーカーを含まず、例えばマーカーが、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳまたはＢＲＡＦにおける変異であるときである。例えば、対象は、ＫＲＡＳ変異陰性上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)発現結腸直腸癌を有する。
ここでの方法の他の例において、対象は、抗ＥＧＦＲ治療に対する耐性に寄与するマーカー、例えばＫＲＡＳ、ＮＲＡＳまたはＢＲＡＦにおける変異であるマーカーを有する腫瘍を含み、本抗体またはそのフラグメントは、このようなマーカーを有する腫瘍に対して有効である。
ここに提供する組成物はあらゆる抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態、例えば、例えば、腫瘍、癌および転移の処置のためである。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態は頭頸部癌、非小細胞性肺癌または他の肺癌または結腸直腸癌である。
モノクローナル抗体セツキシマブ(アービタックス(登録商標))の配列。図１はセツキシマブの配列を示す(配列番号１および２)。図１Ａは重鎖の配列を示す。図１Ｂは軽鎖の配列を示す。可変鎖は下線を引き、修飾のために選択される残基は太字、斜体で示す。 抗ＥＧＦＲ抗体のアラインメント。図２は、セツキシマブ重鎖および軽鎖と他の抗ＥＧＦＲ抗体のアラインメントの例を示す。“＊”は、整列した残基が同一であることを意味し、“：”は、整列した残基が同一ではないが、類似しており、保存的アミノ酸残基を整列した位置に含むことを意味し、“．”は、整列した残基が類似しており、整列した位置に半保存的アミノ酸残基を含むことを意味する。アミノ酸置換の例示的、非限定的な、対応する位置は強調表示により示す。例えば、図２Ａは、セツキシマブ重鎖可変領域(ＶＨ；配列番号３および軽鎖可変領域(ＶＬ；配列番号４)と、Ｈｕ２２５、配列番号２８に示すＶＨおよび配列番号２９に示すＶＬのアラインメントを示す。図２Ｂは、セツキシマブ重鎖可変領域(ＶＨ；配列番号３および軽鎖可変領域(ＶＬ；配列番号４)と、参照抗ＥＧＦＲ抗体、配列番号３に示すＶＨおよび配列番号１０に示すＶＬのアラインメントを示す。 ＥＧＦＲのＥＧＦ抗原誘発リン酸化の阻害。図３は、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ修飾抗ＥＧＦＲ抗体によるＥＧＦＲリン酸化の阻害を示す。図３Ａは、Ａ４３１細胞のＥＧＦ誘発リン酸化の阻害を示す。図３Ｂは、抗体(セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体)の濃度に対してプロットしたリン酸化ＥＧＦＲの濃度を用いる用量依存的阻害効果を示す。図３Ｃは、新生児ケラチン生成細胞のＥＧＦ誘発リン酸化の阻害を示す。 セツキシマブまたは修飾ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体存在下の成人ケラチン生成細胞またはヒト新生児ケラチン生成細胞の細胞増殖阻害。図４は、セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ修飾抗ＥＧＦＲ抗体を用いた成人ケラチン生成細胞またはヒト新生児ケラチン生成細胞の増殖を示す。図４Ａは、セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ修飾抗ＥＧＦＲ抗体を用いた成人ケラチン生成細胞の増殖を示す。図４Ｂは、セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ修飾抗ＥＧＦＲ抗体を用いたヒト新生児ケラチン生成細胞の増殖を示す。 セツキシマブまたは修飾ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体を投与されたインビボ動物モデル。図５は、マウス異種移植腫瘍モデルにおけるセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ修飾抗ＥＧＦＲ抗体による腫瘍増殖阻害を示す。 セツキシマブと修飾ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の間の腫瘍および皮膚結合の差異。図６は、７日間経時変化における、抗体１回ｉ.ｖ.投与後、ヒト皮膚移植片に対する異種移植腫瘍のＤＬ７５５標識セツキシマブおよび修飾ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗体結合の比を示す。
詳細な記載
概要
Ａ. 定義
Ｂ. ＥＧＦＲおよび抗ＥＧＦＲ抗体
１. ＥＧＦＲ
２. 抗ＥＧＦＲ抗体および副作用
３. セツキシマブ
ａ. 構造
ｂ. 機能
Ｃ. 修飾抗ＥＧＦＲ抗体および条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体
１. 修飾抗ＥＧＦＲ抗体
ａ. 重鎖修飾
ｂ. 軽鎖修飾
ｃ. 修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントの例
２. ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体
３. 付加的修飾
４. コンジュゲート
ａ. 標的剤
ｉ. マイタンシノイド薬物部分
ii. オーリスタチンおよびドラスタチン薬物部分
iii. 細胞毒素部分
iv. 標的送達のための核酸
ｂ. リンカー
ｉ. ペプチドリンカー
ii. 化学的リンカー
Ｄ. 抗ＥＧＦＲ抗体特性および活性の同定および評価のための方法
１. 結合アッセイ
ａ. 固相支持体結合アッセイ
ｉ. 表面プラズモン共鳴
ii. バイオレイヤー干渉法
iii. 免疫アッセイ
ａ)ＥＬＩＳＡ
ｂ)免疫沈殿
ｃ)ウェスタンブロット
ｄ)免疫組織化学
ｅ)放射免疫アッセイ
ｂ. 溶液結合アッセイ
ｉ. 等温滴定熱量測定(ＩＴＣ)
ii. スペクトルアッセイ
２. 細胞アッセイ
３. 動物モデル
ａ. 副作用評価
４. 薬物動態および薬力学アッセイ
Ｅ. 抗ＥＧＦＲ抗体の同定、産生および製造のための方法
１. 条件依存治療的タンパク質の同定
２. 抗ＥＧＦＲ抗体の産生および製造
ａ. ベクター
ｂ. 細胞および発現系
ｉ. 原核生物発現
ii. 酵母
iii. 昆虫
iv. 哺乳動物細胞
ｖ. 植物
３. 精製
Ｆ. 医薬組成物、製剤、キット、製品および組み合わせ剤
１. 医薬組成物および製剤
２. 製品／キット
３. 組み合わせ剤
Ｇ. 治療的使用
１. 疾患および状態の例
ａ. 癌
ｂ. 非癌過増殖性疾患
ｃ. 自己免疫性疾患または障害
ｄ. 炎症性障害
ｅ. 感染症
ｆ. 他の疾患および状態
２. 治療対象
ａ. ＥＧＦＲを過発現する対象の選択
ｂ. ＥＧＦＲ関連多型性を示す対象の選択
ｃ. 抗ＥＧＦＲ関連副作用を示す対象の同定
ｉ. 皮膚毒性
ii. 低マグネシウム血症
ｄ. 処置対象の選択または同定のための他の方法
３. 投与量
４. 投与経路
５. 組み合わせ治療
Ｈ. 実施例
Ａ. 定義
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同一意味を有する。本明細書の全体にわたり記載されている全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、Genbank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公開された資料は、特に断らない限り、その全体を引用により本明細書に包含させる。ここでの用語について複数の定義が存在するならば、本章のものが優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスが引用されているとき、このような識別子は変わることがあり、インターネット上の特定の情報は導入され、また削除され得るが、同等の情報をインターネットでの検索により取得することができる。それらの引用は、当該情報の利用可能性および公衆への流布を証するものである。
ここで使用する条件依存活性タンパク質は、一つの環境、特に一つのインビボ環境で、第二の環境と比較してより活性である。例えば、条件依存活性タンパク質は、非腫瘍環境、例えば皮膚、消化管または他の非腫瘍環境における非腫瘍環境よりも、腫瘍環境でより活性であり得る。
ここで使用する、“腫瘍微小環境における条件依存活性”を有する治療剤または“腫瘍微小環境において条件依存活性”である治療剤またはその異形は、非腫瘍微小環境(例えば健康なまたは非病的組織または細胞、例えば皮膚の基底層)下よりも、腫瘍微小環境下で治療剤として活性である、ここに提供する治療剤、例えば抗ＥＧＦＲ抗体(例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体)である。腫瘍微小環境における条件依存活性はインビボまたはインビトロで評価できる。例えば、腫瘍微小環境における条件依存活性は、インビトロで、非腫瘍環境において存在する条件、例えば中性ｐＨ(例えば７.０〜７.４)または低乳酸濃度(例えば１mM〜５mM)と比較した、腫瘍微小環境において存在する条件下、例えば低ｐＨ(例えばｐＨ６.０〜６.５)または高乳酸濃度(例えば１０mM〜２０mM)でのＥＧＦＲの結合に対する結合アッセイにおいて評価できる。活性比(例えば結合活性)が非腫瘍環境の条件下(例えばｐＨ７.０〜７.４および１mM〜５mM乳酸)よりも腫瘍環境の条件下(例えばｐＨ６.０〜６.５および／または１０mM〜２０mM乳酸)で大きいならば、条件依存活性が存在する。例えば、活性比が少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０またはそれ以上ならば、腫瘍環境における条件依存活性が存在する。いくつかの例では、活性比が５.０より大きい、例えば少なくとも６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、１６.０、１７.０、１８.０、１９.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上であるならば、腫瘍環境における条件依存活性が存在する。
腫瘍微小環境において条件依存活性であるここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体に包含されるのは、修飾がない同一抗体と比較して、１個以上の修飾(例えばアミノ酸置換、挿入または欠失)を含み、該修飾により、非腫瘍微小環境よりも腫瘍微小環境でより活性である抗体である。例えば、条件依存活性をするために修飾された抗体は、一般にセツキシマブまたはその抗原結合フラグメントまたはその変異体における１個以上の修飾を含む。変異体は、ここに提供する修飾以外の、例えば免疫原性を低下させるためのヒト化による、修飾をされたものを含む。典型的に、ここに提供される修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾セツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体の対応する形態と比較して、非腫瘍微小環境よりも腫瘍微小環境においてより活性である(すなわち大きなまたは増加した活性を示す)。例えば、条件依存活性は、腫瘍環境において、非修飾抗体と同等のまたは非修飾抗体より増加した活性を保持または発揮しながら、非修飾抗体と比較して、非腫瘍環境における修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性(例えばＥＧＦＲに対する結合活性)を減少させることに起因し得る。
ここで使用する病的または非病的微小環境を“模倣する条件”は、インビボでの環境において存在する１個以上の条件に対応するインビトロまたはインビボアッセイ条件をいう。例えば、微小環境が低ｐＨにより特徴付けられているならば、微小環境を模倣する条件は、低ｐＨを有する緩衝液またはアッセイ条件を含む。
ここで使用する、腫瘍微小環境において存在する条件は、非腫瘍微小環境(例えば健常または非病的細胞または組織)と対比した、前者に存在する条件をいう。腫瘍微小環境に存在する条件は、血管新生増加、低酸素、低ｐＨ、乳酸濃度増加、ピルビン酸濃度増加、間質液圧上昇および代謝物変化または腫瘍を示す代謝を含む。例えば、腫瘍微小環境において存在する条件は、７.４未満の低ｐＨ、典型的に正確にまたは約５.６〜６.８、例えば高くてもまたは約または正確にｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８である。他の例において、腫瘍微小環境において存在する条件は、高乳酸濃度、正確にまたは約５mM〜２０mM乳酸、例えば１０mM〜２０mM乳酸、例えば１５mM〜１８mM、特に少なくともまたは少なくとも約または正確に１６mM、１６.５mMまたは１７mM乳酸である。
ここで使用する非腫瘍微小環境において存在する条件は、腫瘍微小環境に存在しない１個以上の条件を含む。ここでの目的のために、１個以上の条件は、腫瘍微小環境および非腫瘍環境に存在する、相互に対応するが、二つの微小環境で異なる特性または特徴、例えばｐＨ、乳酸濃度またはピルビン酸濃度である。非腫瘍微小環境(例えば皮膚の基底層)において存在する条件は、約７.０〜約７.８のｐＨ、例えば少なくともまたは約または正確にｐＨ７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.７または７.８(例えば、米国特許番号７７８１４０５参照)、ある例においてｐＨ７.４である。例えば、ｐＨは、正確にまたは約７.０〜７.４の中性ｐＨである。非腫瘍微小環境(例えば皮膚の基底層)において存在する条件は、０.５〜５mM乳酸、例えば、例えば０.２mM〜４mM乳酸、例えば０.５mM、１mM、２mM、３mM、４mMまたは５mM乳酸である乳酸濃度である。
ここで使用する“低ｐＨ”は、約５.６〜約６.８の範囲のｐＨ、例えば高くてもまたは約または正確にｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８である。
ここで使用する、タンパク質を“同一条件下で比較する”との記述は、異なるタンパク質を、タンパク質または薬剤の活性または特性に影響し得る任意の１個以上の条件が、試験薬間で変わらないまたは実質的に変わらないように、同一または実質的に同一に処理することを意味する。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較するとき、任意の１個以上の条件、例えばポリペチドの量または濃度；製剤中の添加物、担体または他の活性剤以外の他の成分の存在(量を含む)(例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体)；温度；ｐＨ、保存時間；保存容器；保存条件(例えば撹拌)および／または暴露または使用と関連する他の条件が、比較するポリペチド間で同一または実質的に同一である。
ここで使用する“有害作用”または“副作用”または“有害事象”または“有害副作用”は、治療剤投与と関連する害を及ぼす、有害なおよび／または望ましくない効果をいう。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブ投与と関連する副作用は当業者に知られ、ここに記載されている。このような副作用は、例えば、皮膚毒性、例えば発疹である。副作用または有害作用は毒性で類別され、各グレードの定義を提供する種々の毒性スケールが存在する。このようなスケールの例は、国立がん研究所共通毒性基準バージョン２.０、世界保健機関の毒性スケールまたは有害事象共通用語基準(ＣＴＣＡＥ)スケールである。一般に、スケールは次のとおりである：グレード１＝軽度副作用；グレード２＝中程度副作用；グレード３＝重度副作用；グレード４＝生命を危うくするまたは身体障害性副作用；グレード５＝致死。重症度のグレードの割り当ては医師または他の医療従事者の経験の範囲内である。
ここで使用する上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ；Uniprot Accession No. P00533配列番号６に示す)は、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーであり、リガンド、例えば上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ならびにＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ヘパリン結合ＥＧＦ(ＨＢ−ＥＧＦ)およびベータセルリンを含む他の内在性ＥＧＦ様リガンドと結合し、活性化されるチロシンキナーゼ増殖因子受容体である。活性化されると、ＥＧＦＲは細胞増殖、増殖、生存および運動性に重要なシグナル伝達カスケードに包含される。腫瘍細胞への存在に加えて、上皮細胞増殖因子受容体は遍在性であり、造血細胞および上皮起源の細胞を除く正常細胞の表面上に無作為に分散している。例えば、ＥＧＦＲは皮膚ケラチン生成細胞で発現される。
ここで使用する抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲと特異的に結合し、リガンドのＥＧＦＲへの結合を遮断し、それによりＥＧＦＲの競合的阻害およびＥＧＦＲ活性化の阻害を起こす、あらゆる抗体をいう。それゆえに、抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦＲ阻害剤である。ここでの抗ＥＧＦＲ抗体の記載は、ＥＧＦＲと特異的に結合する完全長抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。
ここで使用するセツキシマブ(２２５、アービタックスとしても知られ、かつ販売されている)は、ＥＧＦＲ阻害剤であるキメラ(マウス／ヒト)モノクローナル抗体である、抗ＥＧＦＲ抗体である。セツキシマブは、配列番号１(重鎖)および配列番号２(軽鎖)に示すアミノ酸の配列を含む。
ここで使用するセツキシマブの抗原結合フラグメントは、セツキシマブに由来するが、セツキシマブの完全長より短いが、しかし少なくとも抗原結合部位を形成するのに十分な該抗体の可変領域の一部(例えば１個以上のＣＤＲ)を含み、それゆえにセツキシマブの結合特異性および／または活性を保持する抗体をいう。セツキシマブの抗原結合フラグメントの例は、配列番号３に示すアミノ酸の配列(可変重鎖)および配列番号４に示すアミノ酸の配列(可変軽鎖)または抗原と結合するのに十分な配列番号３および配列番号４の一部を含む抗体を含む。例えば、セツキシマブの抗原結合フラグメントの例は、配列番号５(ＶＨ−ＣＨ１)および配列番号２(軽鎖ＶＨ−ＣＬ)に示すアミノ酸の配列を含むＦａｂ抗体である。
ここで使用するセツキシマブの変異体は、セツキシマブにおいてここに提供する修飾以外の１個以上の修飾を示し、ＥＧＦＲと特異的に結合する、セツキシマブまたはその抗原結合フラグメント由来の抗体である。例えば、セツキシマブの変異体は、毒性を減らすためのヒト化変異体を含む。セツキシマブの変異体の例は、可変重鎖について配列番号３に示すアミノ酸の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列および／または可変軽鎖について配列番号４に示すアミノ酸の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有し、ここに提供する修飾を含まず(その修飾前に)、ＥＧＦＲと特異的に結合するものを含む。例えば、ここに提供するセツキシマブ変異体の例は、配列番号１に示す可変重鎖および配列番号１０に示す可変軽鎖を有する抗体または配列番号２８に示す可変重鎖および配列番号２９に示す可変軽鎖を有する抗体または配列番号８に示す重鎖および配列番号９に示す軽鎖を有する抗体およびその対応する抗体形態である。最初にここで提供した修飾を含まないセツキシマブの変異体は、非修飾抗体として使用でき、さらにここに提供する修飾を含むように修飾できると理解される。
可変重鎖、可変軽鎖または両者における修飾と関連してここで使用する“両者”は、抗体が、抗体において可変重鎖における１個以上の修飾および可変軽鎖における１個以上の修飾を含むことを意味する。
ここで使用する“非修飾抗体”は、ここに提供する修飾のために選択される出発ポリペチド重鎖および軽鎖またはそのフラグメントをいう。出発標的ポリペチドは、活性を評価する優勢参照ポリペチドである、抗体の野生型または参照形態をいう。例えば、セツキシマブは、ここでの修飾のための優勢または参照ポリペチドである。非修飾または出発標的抗体を、抗体の優勢または参照形態と異なるように改変または変異してよいが、それにもかかわらずここでは、ここで産生されるその後に修飾されたポリペチド(例えば抗原結合フラグメントまたはセツキシマブの変異体)に対して、出発非修飾標的タンパク質という。それゆえに、非修飾参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性の所望の増加または減少を有するように修飾されている当分野で知られる現存するタンパク質を出発非修飾標的タンパク質として選択し、使用できる。例えば、１個以上の１アミノ酸置換により優勢または参照形態から修飾されており、所望の特性が増加または減少している、例えば免疫原性が減少しているタンパク質は標的タンパク質であってよく、ここでは、同一または異なる特性をさらに修飾するための、非修飾をいう。
ここで使用する“修飾抗ＥＧＦＲ抗体”または“変異体抗ＥＧＦＲ抗体”は、参照または非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、そのアミノ酸の配列に、ここに記載する少なくとも１アミノ酸付加、欠失または置換を含む抗ＥＧＦＲ抗体をいう。参照または非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例は、配列番号１(重鎖)および２(軽鎖)または配列番号８(重鎖)および配列番号９(軽鎖)に示す完全長抗ＥＧＦＲ抗体ポリペチド；またはその抗原結合フラグメント、例えば配列番号３(可変重鎖)および配列番号４(可変軽鎖)、配列番号５(ＶＨ−ＣＨ１)および配列番号２(ＶＬ)または配列番号３(可変重鎖)および配列番号１０(可変軽鎖)に示す抗ＥＧＦＲ抗体ポリペチドまたは任意の記載した配列番号のものと少なくとも６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一を示す重鎖または軽鎖またはその一部を示し、それにより得られた抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合するその抗体変異体である。修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲへの結合を示す限り、最大１５０個のアミノ酸置換を含み得る。典型的に、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個または５０個のアミノ酸置換を含む。修飾抗ＥＧＦＲ抗体はまた、ここに記載されているとおり、少なくとも１アミノ酸付加、欠失または置換に加えて、任意の１個以上の他の修飾も含み得ることは理解される。
ここで使用する“修飾”は、ポリペチドのアミノ酸の配列または核酸分子におけるヌクレオチドの配列の修飾をいい、それぞれアミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。ポリペチドを修飾する方法は当業者に慣用であり、例えば組み換えＤＮＡ方法の使用による。
ここで使用する“欠失”は、核酸またはポリペチド配列についていうとき、標的ポリヌクレオチドまたはポリペチドまたは天然または野生型配列のような配列と比較して、１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の削除をいう。
ここで使用する“挿入”は、核酸またはポリペチド配列についていうとき、標的、天然、野生型または他の関連配列内の１個以上の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入をいう。それゆえに、野生型配列と比較して、１個以上の挿入を含む核酸分子は、配列の直線長内に１個以上の追加のヌクレオチドを含む。ここで使用する核酸およびアミノ酸配列への“付加”は、他の配列と比較して、いずれかの末端へのヌクレオチドまたはアミノ酸の追加をいう。
ここで使用する“置換”または“交換”は、分子の長さ(残基の数により記載)を変えることなく、天然、標的、野生型または他の核酸またはポリペチド配列の１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸を、別のヌクレオチドまたはアミノ酸に置き換えることを意味する。それゆえに、分子における１個以上の置換は、分子のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を変えない。特定のポリペチドと比較したアミノ酸置換は、ポリペチド配列の長さに従ったアミノ酸残基の番号の点で表すことができる。例えば、イソロイシン(Ｉｌｅ；Ｉ)からシステイン(Ｃｙｓ；Ｃ)への置換であるアミノ酸配列の１９位のアミノ酸に修飾を有する修飾ポリペチドは、修飾された１９位のアミノ酸がシステインであることを示すために、Ｉ１９Ｃ、Ｉｌｅ１９Ｃｙｓまたは単にＣ１９と表すことができる。この例において、置換を有する分子は、非修飾ポリペチドのＩｌｅ１９に修飾を有する。ここでの目的のために、修飾が抗体の重鎖(ＨＣ)または軽鎖(ＬＣ)中であるため、修飾をまた改変されたポリペチドの鎖を示すために、ＨＣ−またはＬＣ−を付して示すこともできる。
ここで使用する“に対応する位置”または配列表に示されるような、開示された配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸位置と“対応する”ヌクレオチドまたはアミノ酸位置なる記述は、標準的アラインメントアルゴリズム、例えばＧＡＰアルゴリズムを使用して、同一性を最大化するために開示された配列とのアラインメントにより同定されたヌクレオチドまたはアミノ酸の位置である。ここでの目的のために、ここで提供される修飾のための残基は、配列番号３に記載された可変重鎖および配列番号４に記載された可変軽鎖にされたアミノ酸の位置で示す。それゆえに、対応する残基は、参照重鎖配列またはその一部と配列番号３に示す配列のアラインメントおよび／または対応する軽鎖配列またはその一部と配列番号４に示す配列のアラインメントにより決定できる。配列を整列することにより、当業者は、例えば、ガイドとして保存および同一アミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定できる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列を、最高次数のマッチが得られるように整列する(例えば：Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照)。アラインメントの例を図２に示し、対応する整列した残基に基づくアミノ酸置換の例を表５および表７に示す。
ここで使用する配列のアラインメントは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の２個以上の配列の整列のための相同性の使用をいう。典型的に、５０％以上の同一性で関連する２個以上の配列を整列する。整列した一組の配列を、対応する位置で整列した２個以上の配列といい、ゲノムＤＮＡ配列と整列したＲＮＡ、例えばＥＳＴおよび他のｃＤＮＡ由来の整列配列を含み得る。関連または変異体ポリペチドまたは核酸分子は、当業者に知られる任意の方法で整列できる。このような方法は、典型的にマッチを最大化し、手動アラインメントの使用および多数の利用可能なアラインメントプログラム(例えば、ＢＬＡＳＴＰ)および当業者に知られるその他のような方法を含む。ポリペチドまたは核酸の配列を整列することにより、当業者は、保存および同一アミノ酸残基をガイドとして使用して、類似部分または位置を同定できる。さらに、当業者はまたヒトおよび非ヒト配列間での対応するアミノ酸またはヌクレオチド残基を発見するためにガイドとして保存アミノ酸またはヌクレオチド残基を使用できる。対応する位置はまた、例えばコンピューター・シミュレーションしたタンパク質構造のアラインメントの使用により、構造的アラインメントにも基づき得る。他の例において、対応する領域を同定できる。当業者はまたヒトおよび非ヒト配列間での対応するアミノ酸残基を発見するためにガイドとして保存アミノ酸残基を用いることができる。
ここで使用するポリペチド、例えば抗体の“特性”は、結合特異性、構造的配置または配座、タンパク質安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、立体配座安定性、熱耐性およびｐＨ条件に対する耐性を含むが、これらに限定されないポリペチドにより示されるあらゆる特性をいう。特性の変化は、ポリペチドの“活性”を変え得る。例えば、抗体ポリペチドの結合特異性の変化は、ポリペチドの抗原に結合する能力および／または種々の結合活性、例えば親和性またはアビディティまたはインビボ活性を変え得る。
ここで使用するポリペチド、例えば抗体の“活性”または“機能的活性”は、ポリペチドにより示されるあらゆる活性をいう。このような活性は経験的に決定できる。活性の例は、例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合または二量体化を介して生体分子と相互作用する能力、酵素活性、例えば、キナーゼ活性またはタンパク分解活性を含むが、これらに限定されない。抗体(抗体フラグメントを含む)に関して、活性は、特定の抗原と特異的に結合する能力、抗原結合親和性(例えば高または低親和性)、抗原結合のアビディティ(例えば高または低アビディティ)、オン速度、オフ速度、エフェクター機能、例えば抗原中和またはクリアランスを促進する能力、ウイルス中和およびインビボ活性、例えば病原体の感染または侵襲を阻止するまたはクリアランスを促進するまたは体内の特定の組織または体液または細胞に浸透する能力を含むが、これらに限定されない。活性は、インビトロまたはインビボで、認知されたアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴またはオンまたはオフ速度を測定するための同等なアッセイ、免疫組織化学および免疫蛍光組織学および顕微鏡、細胞アッセイ、フローサイトメトリーおよび結合アッセイ(例えば、パニングアッセイ)を使用して評価できる。例えば、抗体ポリペチドについて、活性は、結合親和性、アビディティおよび／または結合係数(例えば、オン／オフ速度について)および他の活性の測定によりインビトロでまたは種々の効果をインビボで測定することにより、例えば免疫効果、例えば抗原クリアランス、組織への抗体の浸透または局所化、疾患、例えば感染からの保護、血清または他の流体抗体力価または当分野で周知の他のアッセイにより評価できる。ポリペチドが活性を示すことを示すこのようなアッセイの結果を、インビボのポリペチドの活性と相関させることができ、ここで、インビボ活性は治療活性または生物学的活性ということができる。修飾ポリペチドの活性は、非修飾ポリペチドと比較して１％の活性、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上を含むが、これらに限定されない、非修飾ポリペチドの任意の活性パーセンテージのレベルであり得る。修飾(例えば変異体)抗体の機能性または活性を決定するためのアッセイは当分野で周知である。
ここで使用する“少なくとも１個の活性を示す”または“少なくとも１個の活性を保持する”は、修飾を含まない標的または非修飾ポリペチドと比較して、修飾ポリペチド、例えば変異体抗体または他の治療的ポリペチド(例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント)により示される活性をいう。標的ポリペチドの活性を保持する修飾または変異体ポリペチドは、非修飾ポリペチドの改善された活性、減少した活性または維持された活性を示し得る。いくつかの例において、修飾または変異体ポリペチドは、標的または非修飾ポリペチドと比較して増加した活性を保持し得る。いくつかの例では、修飾または変異体ポリペチドは、非修飾または標的ポリペチドと比較して、減少した活性を保持し得る。修飾または変異体ポリペチドの活性は、非修飾または標的ポリペチドの１％の活性、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の活性を含むが、これらに限定されない、非修飾または標的ポリペチドの任意の活性パーセンテージのレベルであり得る。他の態様において、活性の変化は、非修飾または標的ポリペチドより少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上の倍率で高い。活性の保持についてのアッセイは、保持する活性による。このようなアッセイはインビトロまたはインビボで実施できる。活性は、例えば、当分野で知られ、下記活性についての実施例に記載するアッセイ、例えばＥＬＩＳＡおよびパニングアッセイであるがこれらに限定されないアッセイを使用して測定できる。非修飾または標的ポリペチドと比較した修飾または変異体ポリペチドの活性もまたインビボ治療的または生物学的活性あるいはポリペチド投与後の結果に関して評価できる。
ここで使用する修飾抗ＥＧＦＲ抗体に対する“増加した活性”は、同一条件下で試験したとき、修飾抗ＥＧＦＲ抗体がアミノ酸置換を含まない非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、大きな活性を示すことをいう。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾または参照抗ＥＧＦＲ抗体の少なくともまたは少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上の活性を示す。
ここで使用する“結合”、“結合した”またはその文法的変形は、分子の他分子との引力相互作用への参加し、２個の分子が互いに近接した安定な結合を生じることを意味する。結合は、非共有結合、共有結合(例えば可逆性および不可逆性共有結合)を含むが、これらに限定されず、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質および小分子、例えば薬物を含む化合物であるが、これらに限定されない分子間の相互作用を含む。結合の例は、抗体-抗原相互作用および受容体-リガンド相互作用である。抗体が特定の抗原と“結合”するとき、結合は、抗体結合部位での、同系の抗体-抗原相互作用を介する抗体による抗原の特異的認識を意味する。結合はまた、ポリペチドの複数鎖の結合、例えばジスルフィド結合を介して相互作用する抗体鎖を含み得る。
ここで使用する結合活性は、１個以上の結合パートナーと結合するか否か、どのように結合するかに関する、分子、例えばポリペチドの特徴である。結合活性は、結合パートナーと結合する能力、結合パートナーと結合する親和性(例えば高親和性)、結合パートナーと結合するアビディティ、結合パートナーとの結合の強度および／または結合パートナーとの結合の特異性を含む。
ここで使用する“親和性”または“結合親和性”は、２個以上の分子、例えば結合パートナーの間の相互作用の強度、典型的に２個の結合パートナー間の非共有結合的相互作用の強度を記載する。抗原エピトープに対する抗体またはその抗原結合フラグメントの親和性は、単一抗体結合部位とエピトープの間の全非供給結合的相互作用の強度の指標である。低親和性抗体-抗原相互作用は弱く、分子は急速に解離する傾向にあり、一方高親和性抗体-抗原結合は強く、分子は長時間結合したままである。親和性の計算方法、例えば結合／解離定数を決定する方法は周知である。例えば、高抗体親和性は、約１０６Ｍ-１以上、約１０７Ｍ-１以上、約１０８Ｍ-１以上または約１０９Ｍ-１、１０１０Ｍ-１、１０１１Ｍ-１または１０１２Ｍ-１以上の平衡結合定数(ＫＡ)で抗体特異的が標的タンパク質に結合することを意味する。抗体はまた、１０-４Ｍ、１０-６Ｍ〜１０-７Ｍまたは１０-８Ｍ、１０-１０Ｍ、１０-１１Ｍまたは１０-１２Ｍまたはそれ以下の平衡解離定数(ＫＤ)により特徴付けられる。親和性は経験的に概算でき、または親和性を、例えば、特定の抗原に対してある抗体と他の抗体の親和性を比較することにより、比較上決定できる。例えば、このような親和性は、慣用技術を使用して、例えば平衡透析により；製造業者の一般的取扱法に従ってBiacore 2000装置を使用して；放射標識標的抗原を使用する放射免疫アッセイにより；または当業者に知られる他の方法により容易に決定できる。親和性データを、例えば、Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949)の方法により分析できる。
ここで使用する抗体アビディティは、多価抗体とその同族抗原の複数相互作用、例えば反復エピトープまたはエピトープアレイを有する抗原と結合する、複数結合部位を含む抗体の強度をいう。高アビディティ抗体は、低アビディティ抗体と比較して、高強度のこのような相互作用を有する。
ここで使用する“親和性定数”は、抗原に対する抗体の親和性を測定するために使用する結合定数(Ｋａ)をいう。親和性定数が高いほど、抗体の抗原に対する親和性が大きい。親和性定数は、モル濃度の逆数の単位(すなわちＭ-１)で表し、抗体反応のための標準的動力学的方法(例えば、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴または当分野で知られる他の動力学的相互作用アッセイ)により測定した結合-解離反応の速度定数から計算できる。抗体の結合親和性はまた解離定数またはＫｄとして表し得る。解離定数は結合定数の逆数、Ｋｄ＝１／Ｋａである。それゆえに、親和性定数はまたＫｄで表し得る。
ここで使用する用語“同一”は、抗体結合親和性について使用するとき、結合定数(Ｋａ)または解離定数(Ｋｄ)が対照抗体の約１〜１００倍または１〜１０倍以内であることを意味する(対照抗体より１〜１００倍大きな親和性または１〜１００分の１低い親和性またはこのような範囲内の任意の数値または範囲または値)。
ここで使用する“実質的に同一”は、結合定数(Ｋａ)または解離定数(Ｋｄ)について使用するとき、結合定数が参照抗体の結合定数、Ｋａの約５〜５０００倍大きいまたは小さいことを意味する(参照抗体より５〜５０００倍大きいまたは５〜５０００分の１小さい)。
ここで使用する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する“特異的に結合”または“免疫特異的に結合”はここでは交換可能に使用し、抗体の抗体結合部位と抗原の間の非共有結合的相互作用により、同族抗原との１個以上の非共有結合を形成する抗体または抗原結合フラグメントの能力をいう。典型的に、ＥＧＦＲと免疫特異的に結合(または特異的に結合)する抗体は、約または正確に１×１０７Ｍ-１または１×１０８Ｍ-１またはそれより大きい親和性定数Ｋａ(または１×１０-７Ｍまたは１×１０-８Ｍまたはそれより小さい解離定数(Ｋｄ))でＥＧＦＲと結合する。親和性定数は、抗体反応のための標準的動力学的方法、例えば、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)(Rich and Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123:1599)、等温滴定熱量測定(ＩＴＣ)または当分野で知られる他の動力学的相互作用アッセイ(例えば、Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, pages 332-336 (1989)参照)；また抗体の結合親和性の計算のためのＳＰＲおよびＩＴＣ方法の例の記載について米国特許番号７,２２９,６１９も参照のこと)により決定できる。リアルタイム検出および結合率のモニタリングのための計測手段および方法は知られており、市販されている(例えば、Biacore 2000、Biacore AB, Upsala, SwedenおよびGE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335)。特定の抗原(例えばＥＧＦＲ)と免疫特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、免疫アッセイ、例えば放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、表面プラズモン共鳴または他の当業者に知られる他の技法により同定できる。
ここで使用する用語“表面プラズモン共鳴”は、例えば、Biacoreシステム(GE Healthcare Life Sciences)を使用する、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変更の検出によりリアルタイム相互作用の分析を可能にする光学現象である。
ここで使用する“抗体”は、天然であれ、一部もしくは完全に合成により、例えば組み換えにより産生されたものであれ、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメントをいい、抗原結合部位を形成するのに十分である免疫グロブリン分子の可変重鎖および軽鎖領域の少なくとも一部を含み、集合したとき、抗原と特異的に結合するあらゆるフラグメントを含む。それゆえに、抗体は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン(抗体結合部位)と相同または実質的に相同である結合ドメインを有するあらゆるタンパク質を含む。例えば、抗体は、２個の重鎖(ＨおよびＨ’と示し得る)および２個の軽鎖(ＬおよびＬ’と示し得る)を含み、ここで、各重鎖が完全長免疫グロブリン重鎖であるかまたは抗原結合部位を形成するのに十分なその一部(例えば重鎖はＶＨ鎖、ＶＨ-ＣＨ１鎖およびＶＨ-ＣＨ１-ＣＨ２-ＣＨ３鎖を含むが、これらに限定されない)であり、各軽鎖は完全長軽鎖または抗原結合部位を形成するのに十分なその一部(例えば軽鎖は、ＶＬ鎖およびＶＬ-ＣＬ鎖を含むが、これらに限定されない)であり得る、抗体を含む。各重鎖(ＨおよびＨ’)は１個の軽鎖(それぞれＬおよびＬ’)と対形成する。典型的に、抗体は最小限可変重(ＶＨ)鎖および／または可変軽(ＶＬ)鎖の全てまたは少なくとも一部を含む。抗体はまた定常領域の全てまたは一部も含み得る。
ここでの目的のために、用語抗体は、完全長抗体および抗体フラグメント、例えば抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントを含むその一部を含む。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合したＦｖｓ(ｄｓＦｖ)、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、一本鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖ)、一本鎖Ｆａｂｓ(ｓｃＦａｂ)、二重特異性抗体、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体または上記のいずれかの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗体はまた、合成抗体、組み換えにより産生した抗体、多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および細胞内抗体を含む。ここに提供する抗体は、あらゆる免疫グロブリンタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、あらゆるクラス(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブクラス(例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ)のメンバーを含む。
ここで使用する抗体の形態は、抗体の特定の構造をいう。ここでの抗体は、完全長抗体およびその一部、例えば、例えば、Ｆａｂフラグメントまたは他の抗体フラグメントを含む。それゆえに、Ｆａｂは特定の抗体の形態である。
ここで使用する抗体の“対応する形態”への言及は、２抗体の特性または活性を比較するとき、特性を同一抗体の形態を使用して比較することをいう。例えば、抗体が第一抗体の対応する形態の活性と比較して活性が低いと記載されているとき、特定の形態、例えばその抗体のＦａｂが第一抗体のＦａｂと比較して活性が低いことを意味する。
ここで使用する完全長抗体は、２個の完全長重鎖(例えばＶＨ-ＣＨ１-ＣＨ２-ＣＨ３またはＶＨ-ＣＨ１-ＣＨ２-ＣＨ３-ＣＨ４)および２個の完全長軽鎖(ＶＬ-ＣＬ)およびヒンジ領域を有する抗体、例えば抗体分泌Ｂ細胞により産生されたヒト抗体および合成により産生された同一ドメインを有する抗体である。
ここで使用する抗体フラグメントまたは抗体部分は、完全長より短いが、少なくとも抗原結合部位を形成するのに十分な該抗体の可変領域の一部(例えば１個以上のＣＤＲ)を含み、それゆえに完全長抗体の結合特異性および／または活性を保持する完全長抗体の任意の部分をいい；抗体フラグメントは、完全長抗体の酵素処理により産生された抗体誘導体、ならびに合成的に、例えば組み換えにより産生した誘導体を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ)２、一本鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄフラグメントを含むが、これらに限定されない(例えば、Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov参照)。フラグメントは、例えばジスルフィド架橋および／またはペプチドリンカーにより、互いに結合した複数鎖を含み得る。抗体フラグメントは、一般に少なくとも約５０アミノ酸および典型的に少なくとも２００アミノ酸を含む。
ここで使用するＦｖ抗体フラグメントは、非共有結合的相互作用により結合した１個の可変重ドメイン(ＶＨ)および１個の可変軽(ＶＬ)ドメインから成る。
ここで使用するｄｓＦｖは、ＶＨ-ＶＬ対を安定化させる操作された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖをいう。
ここで使用するＦｄフラグメントは、抗体重鎖の可変ドメイン(ＶＨ)および１個の定常領域ドメイン(ＣＨ１)を含む抗体のフラグメントをいう。
ここで使用するＦａｂフラグメントは、パパインによる完全長免疫グロブリンの消化により生じる抗体フラグメントまたは合成的に、例えば組み換え方法により産生される同一構造を有するフラグメントを言う。Ｆａｂフラグメントは軽鎖(ＶＬおよびＣＬを含む)および重鎖の可変ドメイン(ＶＨ)および重鎖の１個の定常領域ドメイン(ＣＨ１)を含む他の鎖を含む。
ここで使用するＦ(ａｂ’)２フラグメントは、免疫グロブリンのペプシンによるｐＨ４.０〜４.５での消化により生じる抗体フラグメントまたは合成的に、例えば組み換え方法により産生される同一構造を有するフラグメントをいう。Ｆ(ａｂ’)２フラグメントは、本質的に２個のＦａｂフラグメントを含み、ここで、各重鎖部分は、２個のフラグメントを連結するジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む、付加的数アミノ酸を含む。
ここで使用するＦａｂ’フラグメントは、Ｆ(ａｂ’)２フラグメントの半分(１個の重鎖および１個の軽鎖)を含むフラグメントである。
ここで使用するＦｄ’フラグメントは、Ｆ(ａｂ’)２フラグメントの１個の重鎖部分を含む抗体のフラグメントである。
ここで使用するＦｖ’フラグメントは、抗体分子のＶＨおよびＶＬドメインのみを含むフラグメントである。
ここで使用するｈｓＦｖは、Ｆａｂフラグメントに通常存在する定常ドメインがヘテロ二量体コイルド-コイル-ドメインで置き換わっている抗体フラグメントをいう(例えば、Arndt et al. (2001) JMol Biol. 7:312:221-228参照)。
ここで使用するｓｃＦｖフラグメントは、任意の順番でポリペチドリンカーにより共有結合的結合した可変軽鎖(ＶＬ)および可変重鎖(ＶＨ)を含む抗体フラグメントをいう。リンカーは、２個の可変ドメインが実質的干渉なしに架橋するような長さのものである。リンカーの例は(Ｇｌｙ-Ｓｅｒ)ｎ残基であり、数個のＧｌｕまたはＬｙｓ残基が溶解度を上げるために全体に分散している。
ここで使用する二重特異性抗体は、二量体ｃＦｖをいい、二重特異性抗体は、典型的にｓｃＦｖｓより短いペプチドリンカーを有し、優先的に二量体化する。
ここで使用するポリペチド“ドメイン”は、構造的におよび／または機能的に区別可能または定義可能であるポリペチドの一部(３個またはそれ以上、一般に５個、１０個またはそれ以上のアミノ酸)である。ポリペチドドメインの例は、１個以上の構造的モチーフから成るポリペチド内の独立して折りたたまれた構造を形成できる(例えばループ領域により結合したアルファらせんおよび／またはベータ鎖の組み合わせ)および／または特定の機能的活性、例えば酵素活性、二量体化または抗原結合により認識されるポリペチドの一部である。ポリペチドは１個以上、典型的に１個を超える、異なるドメインを有し得る。例えば、ポリペチドは１個以上の構造的ドメインおよび１個以上の機能的ドメインを有し得る。単一ポリペチドドメインは、構造および機能により区別できる。ドメインは、アミノ酸の連続的直線的配列を含み得る。あるいは、ドメインは、ポリペチドのアミノ酸の直線状配列をとおして非連続的である、複数の非連続的アミノ酸部分を包含できる。典型的に、ポリペチドは、多数のドメインを含む。例えば、抗体分子の各重鎖および各軽鎖は、各約１１０アミノ酸長の多数の免疫グロブリン(Ｉｇ)ドメインを含む。当業者はポリペチドドメインを熟知し、構造的および／または機能的相同性により、他のこのようなドメインから同定できる。ここでの例のために、定義を記載しているが、特定のドメインを名称により認識することは十分に当分野技術の範囲内である。必要であれば、ドメインの同定のために適当なソフトウェアを用い得る。
ここで使用するポリペチドの機能的領域は、少なくとも１個の機能的ドメイン(例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合または二量体化を介して生体分子と相互作用する能力のような特定の機能または酵素活性、例えば、キナーゼ活性またはタンパク分解活性を与える)を含むポリペチドの領域であり、ポリペチドの機能的領域の例は、抗体ドメイン、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または抗原結合部分、例えば抗体結合部位を含む、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬおよびその一部、例えばＣＤＲである。
ここで使用するポリペチドの構造的領域は、少なくとも１個の構造的ドメインを含むポリペチドの領域である。
ここで使用するＩｇドメインは、各々ループにより結合されたアミノ酸の逆平行ベータ鎖を含む、２個のベータ-プリーツシートを含む、免疫グロブリン(Ｉｇ)折りたたみと呼ばれる構造により区別される、当業者によりそのようなものとして認識されたドメインである。Ｉｇ折りたたみ中の２個のベータシートは、疎水性相互作用および保存的鎖内ジスルフィド結合によりサンドイッチされている。抗体鎖内の個々の免疫グロブリンドメインは、さらに機能に基づき区別できる。例えば、軽鎖は１個の可変領域ドメイン(ＶＬ)および１個の定常領域ドメイン(ＣＬ)を含むが、重鎖は１個の可変領域ドメイン(ＶＨ)および３個または４個の定常領域ドメイン(ＣＨ)を含む。各ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨドメインは免疫グロブリンドメインの例である。
ここで使用する、抗体を参照した可変ドメインは、抗体毎に変わるアミノ酸の配列を含む、抗体重鎖または軽鎖の特異的Ｉｇドメインをいう。各軽鎖および各重鎖は、１個の可変領域ドメイン(ＶＬおよびＶＨ)を含む。可変ドメインは抗原特異性を提供し、従って抗原認識を担う。各可変領域は、抗原結合部位ドメインおよびフレームワーク領域(ＦＲ)の一部であるＣＤＲを含む。
ここで使用する“超可変領域”、“ＨＶ”、“相補性決定領域”、“ＣＤＲ”および“抗体ＣＤＲ”は、一体となって抗体の抗原結合部位を結合する、各可変領域内の多数の部分の一つをいうために交換可能に使用される。各可変領域ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる３個のＣＤＲを含む。３個のＣＤＲは、直線状アミノ酸配列をとおして非連続的であるが、折りたたまれたポリペチドでは近接している。ＣＤＲは、可変ドメインのベータシートの平行鎖を結合するループ内に位置する。
ここで使用する“抗原結合ドメイン”、“抗原結合部位”、“抗原結合部位”および“抗体結合部位”は、同族抗原を認識し、物理的に相互作用する抗体内のドメインをいうために同義で使用する。天然の通常の完全長抗体分子は、各々重鎖可変領域の一部および軽鎖可変領域の一部を含む、２個の通常の抗原結合部位を含む。通常の抗原結合部位は、可変領域ドメイン内の逆平行ベータ鎖を結合するループを含む。抗原結合部位は、可変領域ドメインの他の部分を含み得る。各通常の抗原結合部位は、重鎖からの３個の超可変領域および軽鎖からの３個の超可変領域を含む。超可変領域は相補性決定領域(ＣＤＲ)とも呼ばれる。
ここで使用する、抗体重鎖または軽鎖または可変重鎖または軽鎖に関する“その一部”は、重鎖および軽鎖を含む抗体に集合したとき、全６個のＣＤＲを含む対応する完全長抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持するのに十分である、可変重(ＶＨ)および可変軽(ＶＬ)鎖の少なくとも１個または２個、典型的に３個、４個、５個または全６個のＣＤＲを含むように、抗原結合部位を形成するのに十分であるその連続的一部である。一般に、十分な抗原結合部位は、重鎖のＣＤＲ３(ＣＤＲＨ３)を必要とする。典型的にさらに軽鎖のＣＤＲ３(ＣＤＲＬ３)を必要とする。ここに記載するとおり、当業者は、ＣＤＲを知っており、KabatまたはChothiaナンバリングに基づき同定できる(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917参照)。
ここで使用するフレームワーク領域(ＦＲ)は、ベータシート内に位置する抗体可変領域ドメインのドメインであり、ＦＲ領域は、アミノ酸配列の点で、超可変領域と比較して、より保存されている。
ここで使用する定常領域ドメインは、抗体の中で可変領域ドメインと比較して、より保存されているアミノ酸の配列を含む、抗体重鎖または軽鎖におけるドメインである。各軽鎖は単一軽鎖定常領域(ＣＬ)ドメインを含み、各重鎖は１個以上の重鎖定常領域(ＣＨ)ドメインを含み、これは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。完全長ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧアイソタイプはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を含み、一方ＩｇＥおよびＩｇＭはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。ＣＨ１およびＣＬドメインは抗体分子のＦａｂアームを伸ばし、そうして、抗原との相互作用および抗体アームの回転に寄与する。抗体定常領域は、例えば、抗体が、例えば種々の細胞、生体分子および組織との相互作用を介して、特異的に結合する、抗原、病原体および毒素のクリアランスを含むが、これらに限定されないエフェクター機能を発揮し得る。
ここで使用する“Kabatナンバリング”は、IgG1 Kabat抗体のインデックスナンバリングをいう(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)。例えば、Kabatナンバリングに基づき、ＣＤＲ-ＬＩは残基Ｌ２４〜Ｌ３４に対応し；ＣＤＲ-Ｌ２は残基Ｌ５０〜Ｌ５６に対応し；ＣＤＲ-Ｌ３は残基Ｌ８９〜Ｌ９７に対応し；ＣＤＲ-Ｈ１は長さによって残基Ｈ３１〜Ｈ３５、３５ａまたは３５ｂに対応し；ＣＤＲ-Ｈ２は残基Ｈ５０〜Ｈ６５に対応し；ＣＤＲ-Ｈ３は残基Ｈ９５〜Ｈ１０２に対応する。当業者は、Kabatを使用して定常領域の領域を同定できる。表１および２は、抗体例であるセツキシマブのKabatナンバリングおよびＥＵナンバリングスキームを使用した対応する残基を示す。
ここで使用する“ＥＵナンバリング”または“ＥＵインデックス”は、Edelman et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85に記載されたＥＵ抗体のナンバリングスキームをいう。“KabatにおけるようなＥＵインデックス”は、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242に示されたヒトＩｇＧ１ Kabat抗体のＥＵインデックスナンバリングをいう。ＥＵナンバリングまたはKabatにおけるようなＥＵナンバリングは、しばしば軽および重抗体鎖のＦｃ領域のアミノ酸残基番号をいうために当業者に使用される。例えば、当業者は、ＥＵナンバリングを使用して、定常領域の領域を同定できる。例えば、ＣＬドメインは、Kabatナンバリングに従い残基Ｌ１０８〜Ｌ２１６またはＥＵナンバリングに従いＬ１０８〜Ｌ２１４に対応する。ＣＨ１は、残基１１８〜２１５(ＥＵナンバリング)または１１４〜２２３(Kabatナンバリング)に対応し；ＣＨ２は残基２３１〜３４０(ＥＵナンバリング)または２４４〜３６０(Kabatナンバリング)に対応し；ＣＨ３は残基３４１〜４４６(ＥＵナンバリング)または３６１〜４７８(Kabatナンバリング)ドメインに対応し；ＣＤＲ-Ｌ２は残基Ｌ５０〜Ｌ５６に対応し；ＣＤＲ-Ｌ３は残基Ｌ８９〜Ｌ９７に対応し；ＣＤＲ-Ｈ１は長さにより残基Ｈ３１-Ｈ３５、３５ａまたは３５ｂに対応し；ＣＤＲ-Ｈ２は残基Ｈ５０〜Ｈ６５に対応し；ＣＤＲ-Ｈ３は残基Ｈ９５〜Ｈ１０２に対応する。表１および２は、抗体例であるセツキシマブのKabatおよびＥＵナンバリングを使用した対応する残基を示す。最上行(太字)はアミノ酸残基番号を示し；２番目の行(太字)は最上行に示す番号により同定される位置でのアミノ酸残基を一文字表記で示し；３番目の行(斜体)は、Kabatナンバリングに従う対応するKabat番号を示し；４番目の行(太字ではなく、斜体ではない)は、ＥＵナンバリングに従う対応するＥＵインデックス番号を示す。
ここで使用する“抗体ヒンジ領域”または“ヒンジ領域”は、ガンマ、デルタおよびアルファ抗体アイソタイプの重鎖中に、他の抗体ドメインと相同性を有しないＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に天然起源ポリペチド領域である。この領域はプロリン残基に富み、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体を柔軟性にし、抗原と結合するときに互いの種々の角度を想定して、Ｆａｂ部分の２個の“アーム”(各々１個の抗体結合部位を含む)を可動性にする。この柔軟性により、Ｆａｂアームは移動性となり、細胞表面上のエピトープまたは他の抗原と相互作用するために抗体結合部位を整列させる。ヒンジ領域内の２個の鎖間ジスルフィド結合が２個の重鎖間の相互作用を安定化させる。ここに提供するいくつかの態様において、合成により産生した抗体フラグメントは、例えば、２個の抗体鎖間の相互作用を介して安定性を促進するために、１個以上のヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は二量体化ドメインの例である。
ここで使用する用語“由来する”は、他の抗体、例えばモノクローナル抗体由来の抗体フラグメントをいうとき、元の抗体の結合特異性を保持する抗体フラグメント(例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメント)の操作をいう。このようなフラグメントは、酵素開裂、化学的架橋、組み換え手段またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない当分野で知られる多様な方法により誘導できる。一般に、誘導した抗体フラグメントは、本抗体フラグメントと親抗体が同一エピトープに結合するように、親抗体の同一または実質的に同一の重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)を共有する。
ここで使用する“親抗体”または“源抗体”は、抗体フラグメント(例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)、Ｆ(ａｂ)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメント)を誘導した抗体をいう。
ここで使用する用語“エピトープ”は、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基のいずれかをいう。エピトープ決定基は、典型的に化学的に活性な分子の表面集団、例えばアミノ酸または糖側鎖を含み、典型的に特異的三次元構造的特徴、ならびに特異的電荷特徴を有する。
ここで使用するヒト化抗体は、ヒトへの投与が免疫応答を誘発しないような、“ヒト”アミノ酸の配列を包含させる修飾をした抗体である。ヒト化抗体は、典型的に非ヒト種免疫グロブリンに由来する相補性決定領域(ＣＤＲまたは超可変ループ)を含み、抗体分子の残りは主としてヒト免疫グロブリン由来である。このような抗体の製造方法は知られている。例えば、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づく、抗体をコードするために組み換えＤＮＡ技術により改変できる。このような領域を同定する方法は知られており、免疫グロブリンの可変および非可変領域の同定のために設計されたコンピュータープログラムを含む。それゆえに、一般に、ヒト化抗体は、可変ドメインの少なくとも一方および典型的に２個の実質的に全てを含み、ここで、全てまたは実質的に全ての超可変ループは非ヒト免疫グロブリンに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、所望によりまた免疫グロブリン、典型的にヒト免疫グロブリンの定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部を含む。可変領域に関して、ヒト化抗体は、典型的にヒトＶＨ遺伝子断片に由来する最も近いＶＨ領域と５６％を超える配列同一性、例えば少なくとも５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％またはそれ以上の配列同一性を示し、ヒトＶＬ遺伝子断片に由来する最も近いＶＬ領域と少なくとも７５％配列同一性、例えば少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％またはそれ以上の配列同一性を有する。それゆえに、ヒト化抗体は、ヒト化前の親または参照または非修飾抗体よりも、その最も近いＶ生殖系列断片に由来するヒトＶ領域と、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％またはそれ以上の配列同一性を示す。
ここで使用する生殖系列遺伝子断片は、免疫グロブリン重または軽(カッパおよびラムダ)鎖をコードする、生殖系列からの免疫グロブリン(Ｉｇ)可変(Ｖ)、多様性(Ｄ)および接合部(Ｊ)または定常(Ｃ)遺伝子をいう。生殖系列には複数のＶ、Ｄ、ＪおよびＣ遺伝子断片があるが、遺伝子再構成により、各１個の断片のみが各機能的に再構成された遺伝子に生じる。例えば、機能的に再構成された重鎖は１個のＶ、１個のＤおよび１個のＪを含み、機能的に再構成された軽鎖遺伝子は１個のＶおよび１個のＪを含む。それゆえに、これらの遺伝子断片は胚細胞に運ばれるが、機能的遺伝子に構成されるまで重鎖および軽鎖に転写および翻訳され得ない。骨髄でのＢ細胞分化中、これらの遺伝子断片は、１０１０を超える特異性を産生できる動的遺伝システムにより無作為に組み換えられる。ここでの目的のために、遺伝子断片は、個々の生殖系列断片の組み合わせまたは編集によりインビトロで再構成される。
ここでの可変生殖系列断片の記載は、Ｖ、ＤおよびＪ群、亜群、遺伝子またはそのアレルをいう。遺伝子断片配列は、既知データベースから入手できる(例えば、National Center for Biotechnology Information (NCBI), the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)(IMGT), the Kabat database and the Tomlinson's VBase database (Lefranc (2003) Nucleic Acids Res., 31:307-310; Martin et al., Bioinformatics Tools for Antibody Engineering in Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH (2007), pp. 104-107参照；また公開国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１０／０５４００７も参照)。
ここで使用する、生殖系列断片に関連した“群”は、免疫グロブリンからのコアコーディング領域、すなわち重鎖または軽鎖をコードする可変(Ｖ)遺伝子、多様性(Ｄ)遺伝子、連結(Ｊ)遺伝子または定常(Ｃ)遺伝子をいう。生殖系列断片群の例は、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶＬ(ＶκまたはＶλ)およびＪＬ(ＪκまたはＪλ)を含む。
ここで使用する、生殖系列断片に関連した“亜群”は、ヌクレオチド配列類似性または同一性により規定される一組の配列をいう。一般に、亜群は、ある種で同一群[Ｖ、Ｄ、ＪまたはＣ]に属する一組の遺伝子であり、少なくともヌクレオチドレベルで７５％同一性を有する。亜群は、ＩＭＧＴ命名法に基づき分類される(imgt.cines.fr；例えば、Lefranc et al. (2008) Briefings in Bioinformatics, 9:263-275参照)。一般に、亜群は多遺伝子ファミリーを表す。
ここで使用する遺伝子のアレルは、参照遺伝子配列と比較して、コーディング領域に１個以上のヌクレオチド相違(例えば置換、挿入または欠失)により、配列多型性を有する生殖系列配列をいう。それゆえに、同一亜群に属するＩＧ配列はそのコーディング配列は極めて類似しているが、それにもかかわらず高多型性を示し得る。亜群アレルは、アスタリスク(＊)とその後の２個の数字番号を用いて、ＩＭＧＴ命名法に基づき分類される。
ここで使用する、生殖系列断片に関連した“ファミリー”は、アミノ酸配列類似性または同一性により規定される生殖系列断片配列の組をいう。一般に、生殖系列ファミリーは全ての遺伝子のアレルを含む。
ここで使用する“生殖系列断片に由来する”Ｖ遺伝子断片は、組換え現象により、Ｖ生殖系列遺伝子(ＶＨまたはＶＬ生殖系列断片)に由来する、ＶＨまたはＶＬ核酸配列における対応するヌクレオチドをいう。
ここで使用する、抗体重鎖(ＶＨ領域)または軽鎖(ＶＬ領域)またはその一部またはフラグメントにおけるＶ領域の記載は、組換え現象により、対応するＶ生殖系列断片遺伝子に由来するヌクレオチドによりコードされるアミノ酸をいう。
ここで使用する多量体化ドメインは、ポリペチド分子と１個以上の付加的ポリペチド分子の安定な相互作用を促進するアミノ酸の配列であり、各々相補性多量体化ドメインを含み、これは、第一ドメインとの安定な多量体を形成するために同一または異なる多量体化ドメインであり得る。一般に、ポリペチドは、直接的または間接的に多量体化ドメインと結合する。多量体化ドメインの例は、免疫グロブリン配列またはその一部、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域および適合性タンパク質-タンパク質相互作用ドメインである。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプを含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭおよびその修飾形態からのＦｃドメインまたはその一部のような、例えば、免疫グロブリン定常領域またはドメインであり得る。
ここで使用する二量体化ドメインは、２個のポリペチド配列間(例えば、抗体鎖であるが、これに限定されない)の相互作用を促進する多量体化ドメインである。二量体化ドメインは、２個のポリペチド配列間、例えば完全長抗体ヒンジ領域の全てまたは一部のジスルフィド結合の形成を促進するシステイン残基を含むアミノ酸配列またはポリペチド間の相互作用を促進することが知られているアミノ酸の配列である１個以上の二量体化配列(例えば、ロイシンジッパー、ＧＣＮ４ジッパー)を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する“Ｆｃ”または“Ｆｃ領域”または“Ｆｃドメイン”は、第一定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体重鎖の定常領域を含むポリペチドをいう。それゆえに、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの最後の２個の定常領域免疫グロブリンドメインまたはＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３個の定常領域免疫グロブリンドメインをいう。所望により、Ｆｃドメインは、これらのドメインのＮ末端に可動性ヒンジの全てまたは一部を含み得る。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧのＦｃドメインの例として、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３および、所望により、Ｃγ１とＣγ２の間にヒンジの全てまたは一部を含む。Ｆｃ領域の境界は変わり得るが、典型的に、少なくともヒンジ領域の一部を含む。さらに、Ｆｃはまた対立遺伝子または種変異体のいずれかまたは変異体または修飾形態のいずれか、例えばＦｃＲへの結合またはＦｃ介在エフェクター機能を変える変異体または修飾形態のいずれかをも含む。
ここで使用する“Ｆｃキメラ”は、１個以上のポリペチドが、直接的または間接的に、Ｆｃ領域またはその誘導体に結合しているキメラポリペチドをいう。典型的に、Ｆｃキメラは、免疫グロブリンのＦｃ領域と他のポリペチドを併せる。Ｆｃポリペチドの誘導体または修飾Ｆｃポリペチドは当業者に知られる。
ここで使用するキメラポリペチドは、少なくとも２個の異なるポリペチドからの部分または単一ポリペチドの２個の非連続的部分からの部分を含むポリペチドをいう。それゆえに、キメラポリペチドは、一般に１個のポリペチドの全てまたは一部からのアミノ酸の配列残基および他の異なるポリペチドの全てまたは一部からのアミノ酸の配列を含む。２個の部分を直接的または間接的に結合でき、キメラポリペチドの実質的部分の完全性を、平衡条件および生理的条件下、例えば等張ｐＨ７緩衝化食塩水中で維持するのに十分な強度のペプチド結合、他の共有結合または他の非共有結合性相互作用を介して結合できる。
ここで使用する融合タンパク質は、２個の異なるポリペチドに対応するアミノ酸の配列を含むように操作されたポリペチドであり、これらは、例えば、ベクターの長さに沿って、近接して、例えば、隣接して互いに２個のポリペチドをコードする、２個の核酸を含むベクターからの融合タンパク質の発現により互いに結合される。従って、融合タンパク質は、ペプチド結合を介して直接的または間接的に結合した２個以上の、または２個以上の部分由来のタンパク質またはペプチドを含むキメラタンパク質をいう。２個の分子は、構築物で隣接しているかまたはリンカーまたはスペーサーポリペチドにより離れていてよい。
ここで使用する“リンカー”または“スペーサー”ペプチドは、２個のポリペチド配列を連結する短いアミノ酸の配列(またはこのようなアミノ酸配列をコードする核酸)をいう。“ペプチドリンカー”は、２個のポリペチド配列を連結する短いアミノ酸の配列をいう。ポリペチドリンカーの例は、ペプチド形質導入ドメインを抗体に連結するリンカーまたは合成抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖフラグメント中の２個の抗体鎖を連結するリンカーである。リンカーは周知であり、あらゆる知られたリンカーを提供する方法において使用できる。ポリペチドリンカーの例は(Ｇｌｙ-Ｓｅｒ)ｎアミノ酸配列であり、数個のＧｌｕまたはＬｙｓ残基が溶解度を上げるために全体に分散している。他のリンカーの例はここに記載し、これらおよび他の知られたリンカーのいずれも提供する組成物および方法と共に使用できる。
ここで使用する“タグ”または“エピトープタグ”は、典型的にポリペチド、例えばここに提供する抗体のＮ-またはＣ-末端に付加するアミノ酸の配列をいう。ポリペチドと融合したタグの挿入は、ポリペチド精製および／または検出を容易にし得る。典型的に、タグまたはタグポリペチドは、抗体により認識されるエピトープを提供するのに十分な残基を有するまたは検出または精製のために働き得るが、結合しているポリペチドの活性を妨害しないように十分短いポリペチドをいう。タグポリペチドは、典型的に、それと特異的に結合している抗体が、結合するポリペチドのエピトープと実質的に交差反応しないように、十分に独特である。適切なタグポリペチドは、一般に少なくとも５または６アミノ酸残基、通常約８〜５０アミノ酸残基、典型的に９〜３０残基である。タグは、多量体で１個以上のキメラポリペチドと結合し、多量体の検出またはサンプルまたは混合物からのその回収を可能にし得る。このようなタグは周知であり、容易に合成し、設計できる。グポリペチドの例は親和性精製に使用するものを含み、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、インフルエンザ赤血球凝集素(ＨＡ)タグポリペチドおよびその抗体１２ＣＡ５(Field et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165)；ｃ-ｍｙｃタグおよびその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体(例えば、 Evan et al. (1985) Molecular and Cellular Biology 5 :3610-3616参照)；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(ｇＤ)タグおよびその抗体(Paborsky et al. (1990) Protein Engineering 3:547-553)を含む。エピトープタグ付き抗体の検出に使用する抗体は、典型的にここでは二次抗体と呼ぶ。
ここで使用する標識または検出可能部分は、検出可能マーカー(例えば、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、造影剤(例えば、金属)、放射性核種、発色団、検出可能ペプチドまたは検出可能生成物の形成を触媒する酵素)であり、これは、分子(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、例えばここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント)に直接的または間接的に接着または結合できまたはそれと会合し、インビボおよび／またはインビトロで検出できる。検出方法は、知られる検出のインビボおよび／またはインビトロ方法を含む、当分野で知られるあらゆる方法であり得る(例えば、目視、磁気共鳴(ＭＲ)スペクトロスコピー、超音波シグナル、Ｘ線、ガンマ線スペクトロスコピー(例えば、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)走査、単光子放射型コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ))、蛍光スペクトロスコピーまたは吸収による造影)。間接的検出は、検出可能部分と直接的または間接的に結合する原子、分子または組成物の物理的現象、例えば、エネルギーまたは粒子放出または吸収の測定をいう(例えば、一次抗体(例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント)と結合する標識二次抗体またはその抗原結合フラグメントの検出)。
ここで使用する“核酸”は、典型的にホスホジエステル結合により連結した、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)およびリボ核酸(ＲＮＡ)を含む、少なくとも２個の結合したヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体をいう。用語“核酸”にまた含まれるのは、核酸の類似体、例えばペプチド核酸(ＰＮＡ)、ホスホロチオエートＤＮＡおよび他のこのような類似体および誘導体またはそれらの組み合わせである。核酸はまた、例えば、ヌクレオチド類似体またはホスホジエステル結合以外の“主鎖”結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合(ペプチド核酸)を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体も含む。本用語はまた、等価物として、ヌクレオチド類似体、一本鎖(センスまたはアンチセンス)および二本鎖核酸から成るＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、変異体および類似体も含む。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡについて、ウラシル塩基はウリジンである。
ここで使用する単離核酸分子は、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。“単離”核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組み換え技術により製造したとき他の細胞性物質または培養培地を実質的に含まずまたは化学的に合成したとき、化学的前駆体または他の化学物を実質的に含まない。ここに提供する単離核酸分子の例は、ここに提供する抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離核酸分子である。
ここで使用する、核酸配列、領域、エレメントまたはドメインに関連した“操作可能に結合”は、核酸領域が互いに機能的に関連することを意味する。例えば、リーダーペプチドをコードする核酸は、ポリペチドをコードする核酸に操作可能に結合でき、それにより本核酸は転写および翻訳されて、機能的融合タンパク質を発現でき、ここで、該リーダーペプチドは融合ポリペチドの分泌に作用する。いくつかの例において、第一ポリペチド(例えば、リーダーペプチド)をコードする核酸を、第二ポリペチドをコードする核酸と操作可能に結合し、核酸を単一ｍＲＮＡ転写物として転写させるが、ｍＲＮＡ転写物の翻訳は、２個のポリペチドの一方の発現をもたらし得る。例えば、アンバー終止コドンを、部分的アンバーサプレッサー細胞に導入されたとき、得られた単一ｍＲＮＡ転写物が翻訳されて、第一および第二ポリペチドを含む融合タンパク質を生じ得るかまたは翻訳されて第一ポリペチドのみを生じ得るように、第一ポリペチドをコードする核酸と第二ポリペチドをコードする核酸の間に導入できる。他の例において、プロモーターを、ポリペチドをコードする核酸と操作可能に結合でき、それによりプロモーターは核酸の転写を制御または仲介する。
ここで使用する、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関連した“合成”は、組み換え方法および／または化学的合成方法により産生する核酸分子またはポリペチド分子をいう。
ここで使用する天然起源α-アミノ酸の残基は、自然に見られる２０個のα-アミノ酸の残基であり、これは、ヒトにおいて荷電ｔＲＮＡ分子の特異的認識により、その同族ｍＲＮＡコドンと共にタンパク質に取り込まれる。
ここで使用する“ポリペチド”は、共有結合的に結合した２個以上のアミノ酸をいう。用語“ポリペチド”および“タンパク質”はここでは交換可能に使用する。
ここで使用する“ペプチド”は、２〜約または正確に４０アミノ酸長のポリペチドをいう。
ここで使用する“アミノ酸”は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物をいう。ポリペチドは２個以上のアミノ酸を含む。ここでの目的のために、提供する抗体に含まれるアミノ酸は、２０種の天然起源アミノ酸(表３)、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体(例えば、α-炭素が側鎖を有するアミノ酸)を含む。ここで使用する、ここに現れるポリペチドの種々のアミノ酸配列に存在するアミノ酸は、その周知の、三文字または一文字略号で同定する(表３参照)。種々の核酸分子およびフラグメントに存在するヌクレオチドは、当分野で日常的に使用されている標準的一文字記号表示により指定する。
ここで使用する“アミノ酸残基”は、ポリペチドのそのペプチド結合での化学的消化(加水分解)により形成されるアミノ酸をいう。ここに記載するアミノ酸残基は、一般に“Ｌ”異性体である。“Ｄ”異性体の残基は、所望の機能的特性がポリペチドにより保持されている限り、任意のＬ-アミノ酸残基に置き換わり得る。ＮＨ２は、ポリペチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968)に記載され、37 C.F.R. §§ 1.821 - 1.822で採択さた標準的ポリペチド命名法を遵守して、アミノ酸残基の略号を表３に示す。
ここに式により示す全てのアミノ酸の配列残基は、通常のアミノ末端からカルボキシル末端方向で左から右方向である。さらに、用語“アミノ酸残基”は、対応表(表３)に記載のアミノ酸、修飾、非天然および異常アミノ酸を包含すると規定される。さらに、アミノ酸残基配列の開始または終了時のダッシュ記号は、１個以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合またはアミノ末端基、例えばＮＨ２またはカルボキシル末端基、例えばＣＯＯＨへのペプチド結合を示す。
ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に知られ、一般に得られる分子の生物学的活性を変えることなく行い得る。当業者は、一般に、ポリペチドの非必須領域における一アミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変えないことを認識する(例えば、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224参照)。
このような置換は、下記表４に示す置換の例に従い、行い得る。
他の置換も許容でき、経験的にまたは他の知られる保存的または非保存的置換に従い決定できる。
ここで使用する“天然起源アミノ酸”は、ポリペチドに存在する２０個のＬ-アミノ酸をいう。
ここで使用する用語“非天然アミノ酸”は、天然アミノ酸を模倣する構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に修飾されている有機化合物をいう。非天然起源アミノ酸は、それゆえに、例えば、２０個の天然起源アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、アミノ酸のＤ-立体異性体を含むが、これに限定されない。非天然アミノ酸の例は当業者に知られ、２-アミノアジピン酸(Ａａｄ)、３-アミノアジピン酸(Ｂａａｄ)、β-アラニン／β-アミノ-プロピオン酸(Ｂａｌａ)、２-アミノ酪酸(Ａｂｕ)、４-アミノ酪酸／ピペリジン酸(４Ａｂｕ)、６-アミノカプロン酸(Ａｃｐ)、２-アミノヘプタン酸(Ａｈｅ)、２-アミノイソ酪酸(Ａｉｂ)、３-アミノイソ酪酸(Ｂａｉｂ)、２-アミノピメリン酸(Ａｐｍ)、２,４-ジアミノ酪酸(Ｄｂｕ)、デスモシン(Ｄｅｓ)、２,２’-ジアミノピメリン酸(Ｄｐｍ)、２,３-ジアミノプロピオン酸(Ｄｐｒ)、Ｎ-エチルグリシン(ＥｔＧｌｙ)、Ｎ-エチルアスパラギン(ＥｔＡｓｎ)、ヒドロキシリシン(Ｈｙｌ)、アロ-ヒドロキシリシン(Ａｈｙｌ)、３-ヒドロキシプロリン(３Ｈｙｐ)、４-ヒドロキシプロリン(４Ｈｙｐ)、イソデスモシン(Ｉｄｅ)、アロ-イソロイシン(Ａｉｌｅ)、Ｎ-メチルグリシン、サルコシン(ＭｅＧｌｙ)、Ｎ-メチルイソロイシン(ＭｅＩｌｅ)、６-Ｎ-メチルリシン(ＭｅＬｙｓ)、Ｎ-メチルバリン(ＭｅＶａｌ)、ノルバリン(Ｎｖａ)、ノルロイシン(Ｎｌｅ)およびオルニチン(Ｏｒｎ)を含むが、これらに限定されない。
ここで使用するＤＮＡ構築物は、天然で見られない方法で組み合わせおよび並置された、ＤＮＡの断片を含む一本鎖または二本鎖、直鎖状または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、ヒト操作の結果存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
ここで使用するＤＮＡ断片は、特定化された性状を有する大きなＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定化ポリペチドをコードするＤＮＡ断片は、長いＤＮＡ分子、例えばプラスミドまたはプラスミドフラグメントの一部であり、５’から３’方向で読んだとき、特定化ポリペチドのアミノ酸の配列をコードする。
ここで使用する用語ポリヌクレオチドは、５’から３’末端に読むデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然源から単離でき、インビトロで合成できまたは天然および合成分子の組み合わせにより製造できる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ここでは、ヌクレオチド(略称“ｎｔ”)または塩基対(略称“ｂｐ”)の点で示す。用語ヌクレオチドは、文脈がそれを許すとき、一本鎖および二本鎖分子について使用する。本用語が二本鎖分子に適用されるとき、それは全体的長さを表示するために使用し、用語塩基対に等しいと理解されるべきである。二本鎖ポリヌクレオチドの２個の鎖はわずかに長さが異なり、その末端はずれていることがあり、それ故に、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全ヌクレオチドは対形成されないことは当業者に認識される。このような不対末端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えない。
ここで使用する組み換えによる産生は、クローン化ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための分子生物学の周知の方法を使用する、組み換えＤＮＡ方法手段の使用を意味する。
ここで使用する“発現”は、ポリペチドがポリヌクレオチドの転写および翻訳により産生される過程をいう。ポリペチドの発現のレベルは、例えば、宿主細胞で産生されるポリペチドの量を決定する方法を含む、当分野で知られるあらゆる方法を使用して、評価できる。このような方法は、ＥＬＩＳＡ、クーマシーブルー染色とその後のゲル電気泳動、ローリータンパク質アッセイおよびブラッドフォードタンパク質アッセイによる細胞ライセート中のポリペチドの定量を含む。
ここで使用する“宿主細胞”は、ベクターを受容し、維持し、繁殖し、増幅するために使用する細胞をいう。宿主細胞はまたベクターによりコードされるポリペチドの発現にも使用できる。ベクターに含まれる核酸は、宿主細胞が分割したとき複製され、それにより核酸を増幅する。
ここで使用する“ベクター”は、ベクターが適当な宿主細胞に形質転換されたとき、１個以上の異種性タンパク質が発現され得る、複製可能核酸である。ベクターの記載は、ポリペチドをコードする核酸またはそのフラグメントを、典型的に制限消化およびライゲーションにより導入できる、ベクターを含む。ベクターの記載はまた、ポリペチド、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸を含むベクターを含む。ベクターは、ポリペチドをコードする核酸を、核酸増幅または核酸によりコードされるポリペプチドの発現／表示のために、宿主細胞に導入するために使用する。ベクターは、典型的にエピソームのままであるが、染色体のゲノムに遺伝子またはその一部を組込むために設計し得る。また意図されるのは、人工染色体、例えば酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体であるベクターである。このような媒体の選択および使用は当業者に周知である。ベクターはまた“ウイルスベクター”または“ウイルスベクター”を含む。ウイルスベクターは、外来遺伝子を細胞に伝達(媒体またはシャトルとして)するために、外来遺伝子に操作可能に結合した操作されたウイルスである。
ここで使用する“発現ベクター”は、ＤＮＡの発現が可能なベクターであり、これは、このようなＤＮＡフラグメントの発現を起こすことができる制御配列、例えばプロモーター領域と操作可能に結合している。このような付加的セグメントはプロモーターおよびターミネーター配列を含み、所望により１個以上の複製起点、１個以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般にプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来しまたは両者のエレメントを含み得る。それゆえに、発現ベクターは、適当な宿主細胞への導入により、クローン化ＤＮＡの発現を」もたらす、組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えばプラスミド、ファージ、組み換えウイルスまたは他のベクターをいう。適当な発現ベクターは当業者に周知であり、真核生物細胞および／または原核生物細胞で複製可能なものおよびエピソームに残るものまたは宿主細胞ゲノムに統合されるものを含む。
ここで使用する“一次配列”は、ポリペチドにおけるアミノ酸の配列残基または核酸分子におけるヌクレオチドの配列をいう。
ここで使用する“配列同一性”は、試験および参照ポリペチドまたはポリヌクレオチド間の比較による、同一または類似アミノ酸またはヌクレオチド塩基の数をいう。配列同一性は、類似性または同一性の領域を同定するための核酸またはタンパク質配列の配列アラインメントにより決定できる。ここでの目的のために、配列同一性は、一般に同一残基の同定のためのアラインメントにより同定される。アラインメントは局所的でも網羅的でもよい。マッチ、ミスマッチおよびギャップを比較配列間で同定できる。ギャップは、同一または類似特徴が整列されるように、整列した配列の残基間に挿入されたヌルアミノ酸またはヌクレオチドである。一般に、内部および末端ギャップがあり得る。ギャップペナルティを使用するとき、配列同一性は、末端ギャップについてペナルティ無しで決定できる(例えば末端ギャップは罰せられない)。あるいは、配列同一性を、ギャップを考慮せず、同一位置の数／整列した配列全体の長さ×１００として決定できる。
ここで使用する“網羅的アラインメント”は、始めから終わりまで２個の配列を整列するアラインメントであり、各配列の各文字を１回のみ整列させる。アラインメントは、配列間に類似性または同一性があろうがなかろうが生じる。例えば、“網羅的アラインメント”に基づく５０％配列同一性は、各々１００ヌクレオチド長の２個の比較配列の全配列のアラインメントにおいて、５０％の残基が同一であることを意味する。網羅的アラインメントはまた、整列した配列の長さが同一ではないときでさえ、配列同一性の決定に使用できることは理解される。配列の末端の相違は、“末端ギャップについてペナルティなし”を選択しない限り、配列同一性の決定の考慮にいれる。一般に、網羅的アラインメントは、その長さのほとんどにおいて相当な類似性を共有する配列で使用する。網羅的アラインメントの実施のためのアルゴリズムの例は、ニードルマン-ウンシュアルゴリズムを含む(Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970))。網羅的アラインメントを実施するためのプログラムの例は公的に利用可能であり、National Center for Biotechnology Information (NCBI)ウェブサイト(ncbi.nlm.nih.gov/)で入手可能なGlobal Sequence Alignment Toolおよびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlで入手可能なプログラムを含む。
ここで使用する“局所的アラインメント”は、２個の配列を整列するが、これらの配列の類似性または同一性を有する部分のみを整列するアラインメントである。それゆえに、局所的アラインメントは、一方の配列のサブセグメントが他方の配列に存在するかを決定する。類似性がないとき、アラインメントは帰ってこない。局所的アラインメントアルゴリズムはＢＬＡＳＴまたはスミス-ウォーターマンアルゴリズムを含む(Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))。例えば、“局所的アラインメント”に基づく５０％配列同一性は、任意の長さの２個の比較配列の完全配列のアラインメントにおいて、１００ヌクレオチド長の類似性または同一性の領域が、類似性または同一性の領域で同一である５０％の残基を有することを意味する。
ここでの目的のために、配列同一性は、各供給者が確立したデフォルトギャップペナルティを用いて使用する標準的アラインメントアルゴリズムプログラムにより決定できる。ギャッププログラムのデフォルトパラメータは、(１)Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)により記載されている、Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)の単項比較マトリックス(同一のための値１および非同一のための値０を含む)および重み付き比較マトリックス；(２)各ギャップのペナルティ３.０および各ギャップにおける各記号の付加的０.１０ペナルティ；および(３)末端ギャップについてペナルティなしを含む。少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％“同一”または同一性パーセントを記載する他の類似変数を、任意の２個の核酸分子のヌクレオチド配列または任意の２個のポリペチドのアミノ酸配列が有するかを、局所的または網羅的アラインメントに基づく既知コンピューターアルゴリズムにより決定できる(例えば、多数の知られたそして公的に利用可能なアラインメントデータベースおよびプログラムへのリンクを提供するwikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software参照)。一般に、ここでの目的のために配列同一性は、網羅的アラインメント、例えば、NCBI/BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome)から入手可能なニードルマン-ウンシュ網羅的配列アラインメントツール；ＬＡｌｉｇｎ(HuangおよびMillerアルゴリズムを実行するWilliam Pearson(Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357))；およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlから入手可能なXiaoqui Huangのプログラムに基づくコンピューターアルゴリズムを使用して決定する。典型的に、比較するポリペチドまたはヌクレオチドの各々の完全長配列を、網羅的アラインメントにおいては各配列の完全長にわたり整列する。局所的アラインメントもまたコンピュータ処理する配列が実質的に同一長さであるとき、使用できる。
それゆえに、ここで使用する用語“同一性”は、試験および参照ポリペチドまたはポリヌクレオチドの間の比較またはアラインメントをいう。一つの非限定的例において、“と少なくとも９０％同一”は、参照ポリペチドまたはポリヌクレオチドに対する９０〜１００％の同一性パーセントをいう。９０％またはそれ以上のレベルの同一性は、例示目的を過程すれば、１００アミノ酸またはヌクレオチド長の試験および参照ポリペチドまたはポリヌクレオチドを比較し、試験ポリペチドまたはポリヌクレオチド中の１０％(すなわち、１００中１０個)を超えないアミノ酸またはヌクレオチドが参照ポリペチドと異なるとの事実の指標である。類似比較を試験および参照ポリヌクレオチドで行い得る。このような相違は、アミノ酸配列の全長にわたり無作為に分散されている点変異として示され得るかまたは最大許容までの種々の長さ、例えば、１０／１００アミノ酸差異(約９０％同一性)の１個以上の位置に固まり得る。相違はまたアミノ酸残基の欠失または短縮化によるものであり得る。相違は核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。比較配列の長さによって、約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルで、結果はプログラムおよびギャップパラメータ設定と無関係であり得て、このような高レベルの同一性は、容易に、しばしばソフトウェアを頼ることなく評価できる。
ここで使用するジスルフィド結合(Ｓ-Ｓ結合またはジスルフィド架橋ともいう)は、チオール基のカップリングに由来する共有結合性単結合である。タンパク質のジスルフィド結合は、システイン残基のチオール基間で形成され、ポリペチドドメイン、例えば抗体ドメイン間の相互作用を安定化する。
ここで使用する“結合”または“コンジュゲート”は、共有結合または非共有結合的相互作用を介する結合を意味する。
ここで使用する用語“抗体へのコンジュゲート”または“抗体への結合”またはその文法的変異は、ある部分の抗体またはその抗原結合フラグメントへの結合、例えば診断または治療部分をいうとき、該部分が抗体またはその抗原結合フラグメントに、例えば、組み換え手段による融合タンパク質の産生または化学的手段による翻訳後の融合タンパク質の産生のような、ペプチドの結合のためのあらゆる知られた手段により結合していることを意味する。コンジュゲーションはペプチドまたは化合物リンカーまたは化学的架橋剤を含むが、これらに限定されない、コンジュゲーションを行うための多様な結合剤のいずれかを用い得る。
ここで使用する“マイタンシノイド薬物部分”は、マイタンシン化合物の構造を有する抗体-薬物コンジュゲートの部分構造をいう。マイタンシンは、最初に東アフリカの灌木メイテナス・セラタ(Maytenus serrate)から単離された(米国特許番号３,８９６,１１１)。その後、ある種の微生物もマイタンシノイド類、例えばマイタンシノールおよびＣ-３マイタンシノールエステルを産生することが発見された(米国特許番号４,１５１,０４２)。合成マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体が報告されている。米国特許番号４,１３７,２３０；４,２４８,８７０；４,２５６,７４６；４,２６０,６０８；４,２６５,８１４；４,２９４,７５７；４,３０７,０１６；４,３０８,２６８；４,３０８,２６９；４,３０９,４２８；４,３１３,９４６；４,３１５,９２９；４,３１７,８２１；４,３２２,３４８；４,３３１,５９８；４,３６１,６５０；４,３６４,８６６；４,４２４,２１９；４,４５０,２５４；４,３６２,６６３；および４,３７１,５３３およびKawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451)参照。
“遊離システインアミノ酸”は、チオール官能基(ＳＨ)を有し、分子内または分子間ジスルフィド架橋として対形成していないシステインアミノ酸残基をいう。親抗体に操作して導入できる。
ここで使用する“リンカー”、“リンカー単位”または“結合”は、抗体を薬物部分または治療部分に共有結合により結合する原子の鎖を含むペプチドまたは化学的部分をいう。
ここで使用する“抗体依存性細胞介在細胞毒性”および“ＡＤＣＣ”は、Ｆｃ受容体(ＦｃＲｓ)を発現する非特異的細胞毒性細胞(例えば、ナチュラル・キラー(ＮＫ)細胞、好中球およびマクロファージ)が標的細胞への抗体の結合を認識し、続いて標的細胞の溶解を起こす細胞介在反応をいう。ＡＤＣＣを仲介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol, 9:457-92の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイを実施し得る(米国特許番号５,５００,３６２；米国特許番号５,８２１,３３７)。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)およびナチュラル・キラー(ＮＫ)細胞である。これとは別にまたはこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Clynes et al (1998) PNAS (USA), 95:652-656に記載のような動物モデルで評価し得る。
ここで使用する“治療活性”は、治療的ポリペチドのインビボ活性をいう。一般に、治療活性は、疾患または状態の処置に関係する活性である。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体の治療活性は、ＥＧＦＲリン酸化、シグナル伝達および細胞増殖に対する阻害活性、特に腫瘍細胞増殖に対する阻害活性を含む。治療的修飾ポリペチドの活性は、非修飾ポリペチドと比較して、１％の活性、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の治療活性を含むが、これに限定されない、非修飾ポリペチドの治療活性のあらゆるパーセンテージのレベルであり得る。
ここで使用する用語“評価”は、サンプル中に存在するタンパク質、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの活性の絶対値を得るおよびまた活性のレベルの指標である指数、比、パーセンテージ、ビジュアルまたは他の値を得る意味で、定量的および決定を含むことを意図する。評価は直接的でも間接的でもよい。
ここで使用する“疾患または障害”は、感染、後天性の状態、遺伝性の状態を含むが、これらに限定されない原因または状態に由来し、同定可能な症状により特徴付けられる生物における病態をいう。
ここで使用する“ＥＧＦＲ関連疾患または状態”または“抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態”は、異常ＥＧＦＲシグナル伝達またはＥＧＦＲ過発現と関連するまたはそれが原因である疾患または状態のいずれかをいう。このような疾患および状態は当業者に知られており、このようなものの例はここに記載されている。例えば、ＥＧＦＲ関連疾患または状態または抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態は、癌、例えば、結腸直腸癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌および非小細胞肺癌であるが、これらに限定されない。
ここで使用する、疾患または状態を有する対象の“処置”は、処置後に対象の症状が部分的にまたは完全に軽減するかまたは静的なままであることを意味する。それゆえに、処置は予防、治療および／または治癒を含む。予防は、潜在的疾患の予防および／または症状悪化または疾患進行の予防を含む。処置はまたここに提供する抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかまたはここに提供する組成物の医薬的使用のいずれかも包含する。
ここで使用する“予防”または予防法およびその文法的同等物は、疾患または状態を発症する危険性を低下させる、方法をいう。
ここで使用する“薬学的に効果的な薬物”は、例えば、小分子薬物および治療的タンパク質を含む、麻酔剤、血管収縮剤、分散剤、慣用の治療剤を含むが、これらに限定されないあらゆる治療剤または生物活性剤を含む。
ここで使用する“治療効果”は、疾患または状態の症状を変える、典型的に改善または回復させるまたは疾患または状態を治癒する、対象の処置により得られる効果である。
ここで使用する“治療有効量”または“治療有効投与量”は、対象への投与後に治療効果を生じるのに少なくとも十分な薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物の量をいう。それゆえに、疾患または障害の症状の予防、治癒、軽減、抑止または一部抑止に必要な量である。
ここで使用する“治療有効性”は、薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物が投与された対象において治療効果を生じる薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物の能力をいう。
ここで使用する“予防有効量”または“予防有効投与量”は、対象に投与したとき、意図する予防効果を有する、例えば、疾患または症状の発症または再発を予防または遅延する、疾患または症状の発症または再発の可能性を減らすまたはウイルス感染の発生率を減らす、薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物の量をいう。完全な予防効果は、１投与量投与で達成される必要はなく、一連の投与後にのみ達成され得る。それゆえに、予防有効量は、１回以上の投与であり得る。
ここで使用する、処置による、例えば医薬組成物または他の治療剤の投与による、特定の疾患または障害の症状の改善は、組成物または治療剤の投与に起因し得るまたは関連し得る、永続性であれ、一時的であれ、持続性であれ、一過性であれ、症状の何らかの軽減をいう。
ここで使用する“プロドラッグ”は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、より活性な親形態に酵素により活性化されるかまたは変換される、薬学的活性物質の前駆体または誘導体形態である(例えば、Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14:375-382; and Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.): 247-267, Humana Press, 1985参照)。
ここで使用する“抗癌剤”は、悪性細胞および組織に対して破壊性であるまたは毒性であるあらゆる薬剤をいう。例えば、抗癌剤は、癌細胞を殺すかまたは腫瘍または癌細胞の増殖を他に阻害または障害させる薬剤を含む。抗癌剤の例は化学療法剤である。
ここで使用する“抗血管形成剤”または“血管形成阻害剤”は、血管の発生を遮断または妨害する化合物である。
ここで使用する“過増殖性疾患”は、受容体のＥＧＦＲファミリーのメンバーを発現する非癌細胞の過剰な増殖が原因の状態である。
ここで使用する用語“対象”は、哺乳動物、例えばヒトを含む動物をいう。
ここで使用する患者はヒト対象をいう。
ここで使用する動物は、動物のいずれか、例えば、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類；齧歯類、例えばマウスおよびラット；家禽、例えばニワトリ；反芻動物、例えばヤギ、ウシ、シカ、ヒツジ；ブタおよび他の動物であるが、これらに限定されない。非ヒト動物は、意図する動物からヒトを除外する。ここに提供されるポリペチドは、任意の源、動物、植物、原核生物および真菌由来である。ほとんどのポリペチドは、哺乳動物起源を含む動物起源である。
ここで使用する“組成物”はあらゆる混合物をいう。溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
ここで使用する“組み合わせ”は、２個以上の物質の何らかの結合をいう。組み合わせは２個以上の別々のもの、例えば２個の組成物または２個のコレクションであってよく、それらの混合物、例えば２個以上の物質の単混合物またはこれらのあらゆる変形であってよい。組み合わせの要素は一般に機能的に連合または関連する。
ここで使用する組み合わせ治療は、２種以上の異なる治療剤、例えば抗ＥＧＦＲ抗体(またはその抗原結合フラグメント)および１種以上の治療剤の投与をいう。異なる治療剤は別々に、逐次的に間欠性に提供され、投与されてよく、または単一組成物で提供されてよい。
ここで使用するキットは、生物学的活性または特性の、活性化、投与、診断および評価を含むが、これらに限定されない目的のための、所望により他のエレメント、例えば付加的試薬およびその組み合わせまたはエレメントの使用指示を含む、包装された組み合わせをいう。
ここで使用する“単位投与形態”は、ヒトおよび動物対象への投与に適し、当分野でされるとおり個々に包装された、物理的に分かれた単位をいう。
ここで使用する“単回投与量製剤”は、直接投与用製剤をいう。
ここで使用する多投与量製剤は、治療剤の多投与量を含み、治療剤の一投与量を数回提供するために直接できる製剤である。投与量は、分、時間、週、日または月にわたり投与され得る。多投与量製剤は投与量調節、投与量保存および／または投与量分割が可能である。多投与量製剤は長期にわたり使用されるため、一般に微生物増殖を予防するための１種以上の防腐剤を含む。
ここで使用する“製品”は、製造され、販売されている製品である。本明細書で使用するとき、本用語は、包装材に包含されるここに提供する組成物のいずれかを包含することを意図する。
ここで使用する“流体”は、流動できるあらゆる組成物をいう。それゆえに、流体は半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームの形である組成物および他のこのような組成物を包含する。
ここで使用する単離または精製ポリペチドまたはタンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合フラグメント)または生物学的に活性なその一部(例えば単離抗原結合フラグメント)は、タンパク質が由来する細胞または組織からの細胞性物質または他の混入タンパク質が実質的にないかまたは化学的に合成したとき化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない。当業者がこのような純度を評価するために使用する、標準的分析方法、例えば薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)で容易に検出可能な不純物がないように見えるときまたはさらなる精製が物質の物理的および化学的特性、例えば酵素および生物学的活性に検出可能な変化を起こさないとき、調製物は実質的に含まないと決定できる。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製方法は当業者に知られる。実質的に化学的に純粋な化合物は、しかしながら、立体異性体の混合物であり得る。このような場合、さらなる精製が化合物の比活性を高めるかもしれない。ここで使用する“細胞抽出物”または“ライセート”は、溶解または破壊した細胞から製造した調製物またはフラクションをいう。
ここで使用する“コントロール”は、試験パラメータに関して処置されていない点を除けば試験サンプルと実質的に同一であるサンプルであるか、または、血漿サンプルであるならば、目的の状態による影響を受けていない正常ボランティア由来であり得る。コントロールは内部コントロールであり得る。
ここで使用する単数表現は、文脈から他の解釈が必要でない限り、複数も含む。それゆえに、例えば、“免疫グロブリンドメイン”を含むポリペチドは、１個または複数個の免疫グロブリンドメインを含むポリペチドを含む。
ここで使用する用語“または”は、明示的に代替物しか示さないまたは代替物が相互排他的ではない限り、“および／または”を含む。
ここで使用する範囲および量は、“約”特定の値または範囲として表すことができる。約はまた正確な量も含む。それゆえに、“約５塩基”は“約５塩基”およびまた“５塩基”を意味する。
ここで使用する“任意”または“所望により”は、その後に記載された事象または条項が起こるかまたは起こらないことを意味し、本記載は該事象または状況が起こる例および起こらない例を含む。例えば、所望により変異体部分は、該部分が変異体または非変異体であることを意味する。
ここで使用するあらゆる保護基、アミノ酸類および他の化合物についての略語は、特に断らない限り、その一般的使用、認識された略語またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(Biochem. (1972) 11(9):1726-1732参照)に従う。
開示を明確にするために、そして限定せずに、詳細な記載は下記小区分に分ける。
Ｂ. ＥＧＦＲおよび抗ＥＧＦＲ抗体
抗ＥＧＦＲ抗体は知られ、転移結腸直腸癌(ＭＣＲＣ)、頭頸部の扁平上皮細胞癌(ＳＣＣＨＮ)および非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)を含む種々の適応症に承認されている。抗ＥＧＦＲ抗体は、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ、C225またはIMC-C225)、Zhuの11F8(ＷＯ２００５／０９０４０７)、EMD 72000(マツズマブ)、ベクティビックスＴＭ(パニツムマブ；ABX-EGF)、TheraCIM(ニモツズマブ)およびHu-Max-EGFR(ザルツムマブ)を含むが、これらに限定されない。しかしながら、対象に投与されたとき、これらの治療用抗体は対象に有害副作用をもたらす(Eng C. (2009) Nat. Rev. Clin. Oncol., 6:207-218)。これはその使用を制限する。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、しばしば投与の中断および処置の中止に至る、皮膚毒性および消化器障害(悪心、嘔吐、下痢を含む)を含む顕著で、特徴的有害事象と関連する。例えば、ＥＧＦＲは皮膚のプレケラチノサイトおよび基底細胞で高度に発現される。皮膚前駆体における抗ＥＧＦＲ抗体によるＥＧＦＲシグナル伝達遮断は、皮膚前駆体増殖阻害、アポトーシスおよび炎症に至る。これは皮膚毒性、例えば発疹および他の皮膚損傷をもたらし得る。
本発明により、標的化疾患組織、例えば腫瘍で高い活性を示すが、非疾患組織または臓器、特に有害事象と関連する組織部位(例えば皮膚の基底層または真皮)で低い活性を示す抗体の提供により、副作用を軽減できることが判明した。治療剤として、抗ＥＧＦＲ抗体の活性は主に腫瘍環境が標的化され、それは酸性ｐＨおよび高乳酸レベル、例えば、１０〜１５mM乳酸を示す。
対照的に、多くの副作用が局在化する場所である真皮は中性ｐＨおよび正常乳酸レベルを示す。固形腫瘍を特徴付ける条件の相違、例えば低ｐＨおよび低酸素症が、腫瘍の病的微小環境でより活性である抗体の提供に利用できる。それゆえに、ここに提供されるのは、腫瘍微小環境で条件依存活性であり、正常組織と比較して、腫瘍微小環境に存在する条件下で、改変された活性または増加した活性を示す、修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、ここに提供される抗体は、中性ｐＨまたは低乳酸よりも低ｐＨおよび／または高乳酸で活性である。この改変された活性の結果、本抗体で処置された対象は少ないおよび／または減少した副作用を示す。
特に、ここに提供されるのは、低ｐＨ、例えば、ｐＨ５.８〜６.８、例えば腫瘍の酸性ｐＨ環境と比較して、中性ｐＨで活性、例えば結合活性が低い抗ＥＧＦＲ抗体である。他の例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、高乳酸濃度、例えば濃度１０〜１５mM乳酸で活性、例えば結合活性が高い。さらに別の例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、低ｐＨかつ高乳酸レベルで高い活性、例えば結合活性で結合する。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、投与されたとき減少したまたは少ない副作用をもたらすように、改変された活性を示す。
１. ＥＧＦＲ
上皮細胞増殖因子受容体(Uniprot Accession No. P00533；配列番号６)は、１７０kDAＩ型糖タンパク質である。ＥＧＦＲはＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ(ＥｒｂＢ−２)、Ｈｅｒ３(ＥｒｂＢ−３)およびＨｅｒ４(ＥｒｂＢ−４)を含む受容体チロシンキナーゼ群のＥｒｂＢファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲは細胞表面上に発現され、細胞外リガンド結合ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメインおよび膜貫通型親油性セグメントを含む３個のドメインを含む。腫瘍細胞への存在に加えて、上皮細胞増殖因子受容体は遍在性であり、造血細胞および上皮起源の細胞以外の正常細胞に無作為に分布している。
上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ；受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１としても知られる)は、細胞増殖、増殖、生存および運動性に重要なシグナル伝達カスケードに関与するチロシンキナーゼ増殖因子受容体である。ＥＧＦＲ活性は、内在性リガンド、例えば上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ならびにＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ヘパリン結合ＥＧＦ(ＨＢ−ＥＧＦ)およびベータセルリンを含む他の内在性ＥＧＦ様リガンドの結合により刺激または活性化される。リガンド結合により、リガンド−ＥＧＦＲ複合体は二量体化および細胞への内部移行に付される。ＥＧＦＲは他の単量体ＥＧＦＲ分子とホモ二量体化、あるいは、他のＨＥＲ受容体、例えばＨＥＲ２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４とヘテロ二量体化できる。ＥＧＦＲ二量体化は内因性細胞内タンパク質−チロシンキナーゼ活性を開始させる。それゆえに、二量体化は、細胞質側末端におけるチロシン残基の自己リン酸化を介して細胞内タンパク質キナーゼを活性化する。これらのホスホチロシン残基は、下流エフェクター、例えばアダプター分子および酵素のドッキング部位として働き、マイトージェン−活性タンパク質キナーゼ(ＭＡＰＫ)、Ａｋｔ／ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ(ＪＮＫ)を含む多様なシグナル伝達経路を開始させ、それによりＤＮＡ合成、細胞増殖、細胞遊走、細胞生存および細胞接着に関与する多様な分裂促進的機構を制御する。
活性化増殖因子受容体を介する異常シグナル伝達は多くの固形腫瘍で共通する(Yarden and Sliwkowski (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-137)。ＥＧＦＲは神経膠腫および結腸癌、頭頸部癌、膵癌、非小細胞肺癌、乳癌、腎癌、卵巣癌および膀胱癌を含む多様なヒト固形腫瘍で観察されている(Herbst and Hong (2002) Seminars in Oncology 29(5) Suppl. 14: 18-30)。そのようなものとして、ＥＧＦＲは抗癌治療剤の魅力的な標的である。ＥＧＦＲは細胞生存およびアポトーシス、血管形成、細胞運動性および転移の制御に重要である(Herbst et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1(4):719-732)。異常ＥＧＦＲシグナル伝達およびＥＧＦＲ過発現が種々の癌で観察されており、予後不良および侵襲性または転移性疾患の危険性増加と相関する(Herbst et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1(4):719-732)。ＥＧＦＲ活性化は腫瘍血管形成の刺激因子である血管内皮細胞増殖因子の分泌の顕著な上方制御と関連する(Petit at al. (1997) Am J Pathol 151:1523-1530)。
２. 抗ＥＧＦＲ抗体および副作用
異常ＥＧＦＲシグナル伝達を標的とし、阻害する治療剤は抗ＥＧＦＲ抗体を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)への結合により作用する。抗ＥＧＦＲ抗体は、リガンド、例えばＥＧＦの、細胞外リガンド結合ドメインへの結合の競合および阻害により作用する。この結果は、細胞質ドメインリン酸化であり、得られたシグナル伝達事象が阻害される。それゆえに、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ介在細胞シグナル伝達および細胞増殖の遮断により治療剤として有効であり得る。
しかしながら、抗ＥＧＦＲ抗体は癌細胞と正常細胞を区別できず、それゆえに有害副作用が一般的である。例えば、ＥＧＦＲは上皮性組織に広く分布しており、その結果が多くのＥＧＦＲ阻害剤で共通の皮膚毒性である(Herbst and Hong (2002) Seminars in Oncology 29(5) Suppl. 14: 18-30)。ヒト皮膚において、ＥＧＦＲは基底ケラチン生成細胞で発現され、上皮増殖刺激、分化阻害および創傷治癒加速ができる(Lacouture and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5; Nanney et al. (1990) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748; Lacouture, M.E. (2006) Nat Rev Cancer 6:803-812)。ＥＧＦＲ機能の阻害は、ケラチン生成細胞の増殖および遊走を障害し、炎症性ケモカイン発現、発疹に至り得る(Lacouture, M.E. (2006) Nat Rev Cancer 6:803-812)。ＥＧＦＲ阻害剤の処置によるケラチン生成細胞のアポトーシスの増加は、ＥＧＦＲ阻害剤で処置した対象における発疹の発症と相関する(Lacouture, M.E. (2006) Nat Rev Cancer 6:803-812)。ケラチン生成細胞は、７.０〜７.２のｐＨを有する、皮膚の最も深い層である基底層に位置する。真皮の血管が表皮のための栄養分の供給と廃棄物除去を行い、そうして表皮、特に基底層は全身を循環する抗ＥＧＦＲ治療に最も感受性である。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブと関連する最も一般的副作用は皮膚反応であり、これは患者の４５〜１００％で見られる(Le and Perez-Soler (2009) Target Oncol 4:107-119)。一般的皮膚反応は、ざ瘡様発疹、丘疹小水疱性皮疹、発毛異常、皮膚乾燥および掻痒および圧痛を伴う爪周囲炎症を含む(Eng (2009) Nat Rev Clin Oncol 6:207-218; Monti et al. (2007) Int J Biol Markers 22:S53-S61; Saif and Kim (2007) Expert Opin Drug Saf 6:175-182)。付加的皮膚反応は、毛細血管拡張症、色素増加症、発疹を伴わない掻痒、紅斑および口腔口唇潰瘍を含む(Eng (2009) Nat Rev Clin Oncol 6:207-218)。セツキシマブは患者の約５〜１５％に免疫応答を惹起し、重篤なアナフィラキシー反応が報告されている患者もある(Chung et al. (2008) N Engl JMed 358:1109-1117)。これらの過敏症反応は、ＩｇＧ抗体の産生を誘発するセツキシマブのガラクトース−アルファ−１,３−ガラクトースオリゴ糖と結び付けられている(Chung et al. (2008) N Engl JMed 358:1109-1117)。さらなる副作用は、呼吸困難、咳、喘鳴、肺炎、低酸素血症、呼吸器機能不全／不全、肺塞栓、胸水および非特異的呼吸器障害を含む肺毒性を含む(Hoag et al. (2009) J Experimental & Clinical Cancer Research 28:113)。他の副作用は発熱、悪寒、無力症／倦怠感、粘膜表面問題、悪心、消化器問題、腹痛、頭痛および低マグネシウム血症を含む(Eng (2009) Nat Rev Clin Oncol 6:207-218; Fakih and Vincent, (2010) Curr. Oncol. 17(S1):S18-S30；国際特許番号ＷＯ２０１１０５９７６２)。
ここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体は、非腫瘍細胞標的、例えば基底ケラチン生成細胞および他の基底細胞と比較して、腫瘍細胞に選択性を有する。それゆえに、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体は、現在利用可能な抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、患者に投与されたとき、皮膚毒性を含む全身副作用の排除、最小化または減少を含む、副作用を減少でき、一方で、ＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する能力を維持する。現存する治療剤と比較して、高い効果を達成するための投与を可能にする。
３. セツキシマブ
ここに提供される条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体に含まれるのは、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体と比較して、修飾されている修飾抗ＥＧＦＲ抗体である(例えばセツキシマブのヒト化形態、例えばＨｕ２２５)。セツキシマブ(Ｃ２２５またはＩＭＣ−Ｃ２２５としても知られる)は、ヒト上皮細胞増殖因子受容体に結合するマウス／ヒトキメラ、ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。セツキシマブは、免疫原としてヒトＡ４３１類表皮癌細胞からＥＧＦＲを使用して同定されたＭ２２５に由来する(Gill et al. (1984) J Biol Chem 259:7755-7760; Sato et al., (1983) Mol Biol Med 1:511-529; Masui et al., (1984) Cancer Res 44:1002-1007; Kawamoto et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:1337-1341)。Ｍ２２５は上皮細胞増殖因子のＥＧＦ受容体への結合を阻害し、インビボでＥＧＦ刺激チロシンキナーゼ活性のアンタゴニストである(Gill et al. (1984) J Biol Chem 259:7755-7760)。
ａ. 構造
セツキシマブは完全長マウス／ヒトキメラＩｇＧ１抗体である。完全長抗体は、２個の同一重(Ｈ)鎖(各々通常約４４０アミノ酸含む)および２個の同一軽(Ｌ)鎖(各々約２２０アミノ酸を含む)の４個のポリペチド鎖を含む。軽鎖は、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる２この異なる形態で存在する。各鎖は、免疫グロブリン(Ｉｇ)ドメインとして組織化される一連のドメインに組織化される。Ｉｇドメインは、各々ループにより結合されたアミノ酸の逆平行ベータ鎖を含む、２個のベータ−プリーツシートを含む、Ｉｇ折りたたみと呼ばれる構造を特徴とする。Ｉｇ折りたたみの２個のベータシートは、疎水性相互作用および保存鎖内ジスルフィド結合によりサンドイッチされている。抗体鎖の複数のＩｇドメインが可変(Ｖ)および定常(Ｃ)領域ドメインに組織化される。可変ドメインは、相補性決定領域(ＣＤＲ)または超可変(ＨＶ)領域と呼ばれる３個の部分を介して、抗体に抗原特異性を付与する。ＣＤＲ領域は厳密に規定され、抗体で普遍的に番号付けされる(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; AbM (Martin et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol 203:121-153; Pederson et al. (1992) Immunomethods 1:126参照)併せて、３個の重鎖ＣＤＲおよび３個の軽鎖ＣＤＲが抗体の抗原結合部位(抗体結合部位)を構成し、これは、同族抗原と物理的に相互作用し、抗体の特異性を付与する。定常領域は、補体およびエフェクター細胞の活性化を促進する。ＣＤＲ領域と同様、定常領域は厳密に定義され、ＥＵインデックスおよびKabatナンバリングスキームを使用して抗体において普遍的に番号付けされる(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)。軽鎖は、Ｃ領域(ＣＬ)およびＶ領域(ＶＬ)に対応する２個のドメインを有する。重鎖は、Ｖ領域(ＶＨ)およびＣ領域に３個または４個のドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４)、および、いくつかの例では、ヒンジ領域の４個のドメインを有する。各重鎖は、ジスルフィド結合により軽鎖と結合し、２個の重鎖は互いにジスルフィド結合により結合する。重鎖の結合は、ヒンジ領域として知られる重鎖の可動性領域が介在する。
セツキシマブは、マウスモノクローナル抗体２２５(Ｍ２２５)からの可変領域およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域(配列番号１０６９)およびヒトＣκ軽鎖定常領域(配列番号１０７１)を含むヒト定常領域を含む。セツキシマブの完全重鎖は、配列番号１１１１に示すヌクレオチドの配列によりコードされる配列番号１に示すアミノ酸の配列を有し、軽鎖は配列番号１１１０に示すヌクレオチドの配列によりコードされる配列番号２に示すアミノ酸の配列を有する。重鎖は、マウス可変ドメイン(ＶＨ、配列番号１のアミノ酸残基１〜１１９、配列番号３に示す)およびＣＨ１(配列番号１のアミノ酸残基１２０〜２２２)、ヒンジ領域(配列番号１のアミノ酸残基２２３〜２３８)、ＣＨ２(配列番号１のアミノ酸残基２３９〜３４２)およびＣＨ３(配列番号１のアミノ酸残基３４３〜４４９)を含むヒト定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ヒンジ−ＣＨ３から成る。軽鎖は、マウス可変ドメイン(ＶＬ、配列番号２のアミノ酸残基１〜１０７、配列番号４に示す)およびヒトカッパ軽定常領域(Ｃκ、配列番号２のアミノ酸残基１０８〜２１３)から成る。
セツキシマブのＣＤＲは、ＶＨ ＣＤＲ１(アミノ酸残基２６〜３５、ＡｂＭ定義による(Martin et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol 203:121-153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1:126)または配列番号３のアミノ酸残基３１〜３５、Kabat定義による、それぞれ配列番号１４および１５に示す)；ＶＨ ＣＤＲ２(配列番号３のアミノ酸残基５０〜６５、配列番号１６に示す)；ＶＨ ＣＤＲ３(配列番号３のアミノ酸残基９８〜１０８、配列番号１７に示す)；ＶＬ ＣＤＲ１(配列番号４のアミノ酸残基２４〜３４、配列番号１８に示す)；ＶＬ ＣＤＲ２(配列番号４のアミノ酸残基５０〜５６、配列番号１９に示す)；およびＶＬ ＣＤＲ３(配列番号４のアミノ酸残基８９〜９７、配列番号２０に示す)を含む。
KabatナンバリングKabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)によると、セツキシマブのＣＤＲはＶＨ ＣＤＲ１(アミノ酸残基２６〜３５、ＡｂＭ定義に従うまたはアミノ酸残基３１〜３５、Kabat定義に従う)；ＶＨ ＣＤＲ２(アミノ酸残基５０〜６５)；ＶＨ ＣＤＲ３(アミノ酸残基９５〜１０２)；ＶＬ ＣＤＲ１(アミノ酸残基２４〜３４)；ＶＬ ＣＤＲ２(アミノ酸残基５０〜５６)；およびＶＬ ＣＤＲ３(アミノ酸残基８９〜９７)を含む。
ＥＧＦＲ(ｓＥＧＦＲ)の細胞外ドメインに結合するセツキシマブＦａｂの結晶構造は先に決定されている(Li et al., (2005) Cancer Cell 7:301-311)。セツキシマブは上皮細胞増殖因子受容体のドメインIII(配列番号６のアミノ酸３１０〜５１４)と結合し、天然リガンド上皮細胞増殖因子と一部重複するエピトープを有する。セツキシマブの残基Ｌ２７Ｇｌｎ、Ｌ５０Ｔｙｒ、Ｌ９４Ｔｒｐ、Ｈ５２Ｔｒｐ、Ｈ５８Ａｓｐ、Ｈ１０１Ｔｙｒ、Ｈ１０２Ｔｙｒ、Ｈ１０３ＡｓｐおよびＨ１０４ＴｙｒがｓＥＧＦＲのドメインIIIと接触する。セツキシマブの軽鎖はＥＧＦＲのＣ末端ドメインと結合し、セツキシマブのＶＬ ＣＤＲ１残基Ｌ２７ＧｌｎはｓＥＧＦＲの残基Ｎ４７３と結合する。ＶＨ ＣＤＲ３残基Ｈ１０２Ｔｙｒは、ドメインIIIの大βシートの表面上の疎水性ポケットに突出し、ｓＥＧＦＲのＱ３８４およびＱ４０８のグルタミン側鎖と水素結合する。ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３は疎水性ポケット上に位置し、ｓＥＧＦＲのＨ５２ＴｒｐおよびＳ４１８とｓＥＧＦＲのＨ１０４ＴｙｒおよびＳ４６８の間の側鎖水素結合、Ｈ５４ＧｌｙおよびＨ１０３Ａｓｐカルボニル酸素およびｓＥＧＦＲ Ｓ４４０およびＲ３５３の間の側鎖から主鎖相互作用およびｓＥＧＦＲのＨ５６ＡｓｎおよびＳ４１８およびＱ３８４の間の間接的水素結合により側鎖に固定される。ＥＧＦのｓＥＧＦＲへの結合の遮断に加えて、セツキシマブの可変重鎖はドメインＩを立体的に遮断し、それによりドメインIIが二量体化に必要な立体配座を取ることを妨げる。
セツキシマブの他の変異体が報告されており、知られている。セツキシマブのヒト化バージョンであるＨｕ２２５は、配列番号２８に示すアミノ酸の配列を有する可変重鎖および配列番号２９に示すアミノ酸の配列を有する可変軽鎖を有する。セツキシマブ(２２５)と比較して、Ｈｕ２２５は、配列番号４に示すアミノ酸の配列(Ｈｕ２２５配列番号２９に示すＶＬ)における９位のバリン(Ｖ)の置換、Ｉ１０Ｔ、Ｖ１３Ｌ、Ｖ１９Ａ、Ｓ２０Ｔ、Ｆ２１Ｌ、Ｒ３９Ｋ、Ｔ４０Ｐ、Ｎ４１Ｇ、Ｇ４２Ｑ、Ｓ４３Ａ、Ｓ６０Ｄ、Ｓ７４Ｔ、Ｎ７６Ｓ、Ｓ７７Ｒ、Ｖ７８Ｌ、Ｓ８０Ｐ、Ｉ８３Ｆ、Ｄ８５Ｖ、Ａ１００ＱおよびＬ１０６Ｉおよび配列番号３に示すアミノ酸の配列(Ｈｕ２２５配列番号２８に示すＶＨ)に対応する位置での可変軽鎖(ＶＬ)におけるグリシン(Ｇ)での交換(置換)における１位におけるグルタミン(Ｑ)に対応する位置でのグルタミン酸(Ｅ)での置換、Ｋ５Ｖ、Ｑ６Ｅ、Ｐ９Ｇ、Ｓ１６Ｇ、Ｑ１７Ｇ、Ｓ１９Ｒ、Ｉ２０Ｌ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２３Ａ、Ｖ２４Ａ、Ｓ４０Ａ、Ｓ６８Ｔ、Ｓ７６Ｎ、Ｑ７７Ｔ、Ｆ７９Ｙ、Ｆ８０Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｑ８６Ｒ、Ｓ８７Ａ、Ｎ８８Ｅ、Ｉ９２ＶおよびＡ１１９Ｓに対応する可変重鎖(ＶＨ)での交換(置換)を含む、フレームワーク領域におけるアミノ酸残基でのアミノ酸置換を有する。付加的セツキシマブ変異体は、配列番号８に示す重鎖および配列番号９に示す軽鎖を有するものを含む。さらに多くの他の変異体が記載されており、当分野で知られる(例えば米国特許番号７,６５７,３８０、７,９３０,１０７、７,０６０,８０８、７,７２３,４８４、米国特許公開番号２０１１０１４８２２、２００５１４２１３３、２０１１１１７１１０、国際特許公開番号ＷＯ２０１２００３９９５、ＷＯ２０１００８０４６３、ＷＯ２０１２０２００５９、ＷＯ２００８１５２５３７およびLippow et al. (2007) Nat Biotechnol. 25(10):1171-1176参照)。ここで記載する修飾は、当分野で知られるあらゆるものを含む、あらゆるセツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体におけるものであり得る。
ｂ. 機能
セツキシマブは、正常細胞および腫瘍細胞の両者のＥＧＦＲ上の細胞外ドメインと結合し、リガンド結合およびその後の活性化を阻止する(Li et al., (2005) Cancer Cell 7:301-311; Blick et al., (2007) Drugs 67(17):2585-2607)。セツキシマブは、上皮細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子アルファ(ＴＧＦ−アルファ)の結合を競合的に阻害し、細胞増殖および転移拡散を阻止する。すなわち、セツキシマブの結合がチロシン−受容体キナーゼのリン酸化および活性化を遮断し、細胞増殖阻害、アポトーシス誘発、マトリックスメタロプロテアーゼ分泌減少および血管内皮細胞増殖因子産生減少に至る。セツキシマブはまた血管形成阻害を介して、抗腫瘍効果も誘発できる。セツキシマブは用量依存的方法で、高度に転移性のヒトＴＣＣ ２５３ＪＢ−Ｖ細胞におけるＶＥＧＦ、ＩＬ−８およびｂＦＧＦの発現を阻害し、微小血管密度を低下させる(Perrotte et al. (1999), Clin. Cancer Res., 5:257-264)。セツキシマブはインビトロおよびインビボで腫瘍細胞におけるＶＥＧＦ発現を下方制御できる(Petit et al. (1997), Am. J. Pathol., 151:1523-1530; Prewett et al. (1998), Clin. Cancer Res.4:2957-2966)。セツキシマブはまた抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)および受容体内部移行にも関与する。
Ｃ. 修飾抗ＥＧＦＲ抗体および条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体
ここに提供されるのは、非病的または非腫瘍微小環境、例えば皮膚または皮膚の基底層よりも、腫瘍微小環境で高いまたは大きな活性を示す、条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメント、例えば修飾または変異体抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。このような抗体は非腫瘍微小環境において存在する条件下(例えば皮膚の基底層)と比較して、腫瘍環境において存在する条件下、ヒト上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに対して高い結合活性を示すあらゆるものである。腫瘍微小環境で大きな結合活性を示すために、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍に対する選択的活性を示し、非腫瘍微小環境における細胞への結合活性が低い。条件依存結合活性により達成されるこのような選択性は、非腫瘍細胞、例えば皮膚の基底ケラチン生成細胞に対する望ましくない活性を最小化する。それゆえに、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、対象に投与したとき、減少したまたは少ない副作用を提供する。
変更されたｐＨ微小環境は、腫瘍微小環境で見られる最も一般的な微小環境である(例えばFogh Andersen et al. (1995) Clin. Chem., 41:1522-1525; Bhujwalla et al. (2002) NMR Biomed., 15:114-119; Helmlinger et al. (1997) Nature Med., 3:177; Gerweck and Seetharaman (1996), Cancer Res. 56(6):1194-1198参照)。例えば、多くの腫瘍において、‘ワールブルク効果’により、５.６〜６.８範囲のｐＨの微小環境が作られる。また、高乳酸レベルが、頭頸部、転移結腸直腸癌、子宮頸癌および扁平上皮細胞癌を含むが、これらに限定されない多様な腫瘍と関連することが判明している(例えば、Walenta et al. (1997) American Journal of Pathology 150(2): 409-415; Schwickert et al. (1995) Cancer Research 55: 4757-4759; Walenta et al. (2000) Cancer Research 60: 916-921; Guo et al. (2004) J Nucl Med 45: 1334-1339; Mathupala et al. (2007) J Bioenerg Biomembr 39: 73-77; Holroyde et al. (1979) Cancer Research 39: 4900-4904; Schurr and (2007) Neuroscience 147: 613-619; Quenneta et al. (2006) Radiotherapy and Oncology 81: 130-135)。多くの腫瘍で、‘ワールブルク効果’により、１０〜１５mMの乳酸濃度の微小環境が作られる。腫瘍微小環境と対照的に、抗ＥＧＦＲ抗体の投与による多くの副作用が局在化する場所である真皮は、中性ｐＨおよび正常乳酸レベルを示す。
あらゆる抗ＥＧＦＲ抗体の修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗原結合フラグメントを含むここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、正確にまたは約ｐＨ５.６〜６.８のｐＨまたは正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度の一方または両者を含む腫瘍微小環境において存在する条件下、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.８のｐＨまたは正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、高い結合活性でＥＧＦＲ(特にヒトＥＧＦＲ)と結合する。非腫瘍微小環境における条件下と比較して、腫瘍微小環境における条件下での結合活性は、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上の活性比を有し得る。
一般に、活性比は、生理学的レベルのタンパク質存在下で示される。インビボまたは生理学的環境において、間質性タンパク質濃度(例えばアルブミン)は血漿の２０〜５０％の間である。血清は約６０〜８０ｇ／Ｌタンパク質を含み、種々の組織は１２mg／mL〜４０mg／mL 間質性タンパク質を含むことが証明されている(例えばAukland and Reed (1993) Physiological Reviews, 73:1-78参照)。それゆえに、これらの条件下、インビボで選択的および条件依存活性を示す抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、血清、例えばヒト血清中にまたは血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンまたは抗体または受容体と相互作用しないまたは他に直接抗体−受容体相互作用を変える他のタンパク質として提供され得る、１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質、例えば少なくとも少なくとも１２mg／mL〜４０mg／mLタンパク質(例えば少なくとも１２mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mLまたは４０mg／mLタンパク質)の存在下で活性比を示す。例えば、タンパク質は血清中に提供され、抗ＥＧＦＲ抗体を選択または特徴付けするためのアッセイおよび方法は２０％〜５０％血清(vol/vol)、例えば２０％〜５０％ヒト血清、例えば少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％血清(vol/vol)の存在下で行う。それゆえに、ここでの具体例において、あらゆる抗ＥＧＦＲ抗体の修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗原結合フラグメントを含むここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、は、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.８のｐＨまたは正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約ｐＨ５.６〜６.８のｐＨまたは正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)腫瘍微小環境において存在する条件下で高い結合活性でＥＧＦＲ(特にヒトＥＧＦＲ)と結合する。非腫瘍微小環境における条件下と比較して、腫瘍微小環境における条件下での高い結合活性は、一般に腫瘍微小環境における条件下および非腫瘍微小環境における条件下のタンパク質濃度が実質的に同一または同一である条件下で存在する。具体例において、活性比は少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上であり得る。
特に、ここに提供する抗体は、１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質、例えば少なくとも１２mg／mL〜４０mg／mLタンパク質(例えば少なくとも１２mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mLまたは４０mg／mLタンパク質)存在下、中性ｐＨ(例えば７.４)よりもｐＨ６.０〜ｐＨ６.５で高い結合活性で上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)と結合するものを含む。例えば、ここに提供する抗体は、２０％〜５０％血清(vol/vol)、例えば２０％〜５０％ヒト血清、例えば少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％血清(vol/vol)の存在下、中性ｐＨ(例えば７.４)よりも、ｐＨ６.０〜ｐＨ６.５で高い結合活性で上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)と結合するものを含む。例えば、中性ｐＨ(例えばｐＨ７.４)の条件下と比較したｐＨ６.０〜ｐＨ６.５の条件下での結合活性比は１.０を超え、例えば、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上である。
ここでの修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含むここに提供する条件依存活性抗体に含まれるのは、１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質、例えば少なくとも１２mg／mL〜４０mg／mLタンパク質(例えば少なくとも１２mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mLまたは４０mg／mLタンパク質)の存在下、０.５mM〜５mMの乳酸濃度よりも、１０〜２０mMの高乳酸濃度で高い結合活性で上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)に結合するものである。例えば、ここでの修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含むここに提供する条件依存活性抗体は、２０％〜５０％血清(vol/vol)、例えば２０％〜５０％ヒト血清、例えば少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％血清(vol/vol)の存在下、０.５mM〜５mMの乳酸濃度よりも、１０〜２０mMの高乳酸濃度で高い結合活性で上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)に結合するものである。例えば、１mM〜５mMの条件下と比較した１０〜２０mM乳酸、例えば正確にまたは約１６mMの条件下の結合活性比は１.０を超え、例えば、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上またはそれ以上である。
ある例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質、例えば少なくとも１２mg／mL〜４０mg／mLタンパク質(例えば少なくとも１２mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mLまたは４０mg／mLタンパク質)の存在下、中性ｐＨ(約ｐＨ７.４)および１mM〜５mMの乳酸濃度の条件下よりも、ｐＨ６.０またはｐＨ６.５および１０mM〜２０mMの乳酸濃度の条件下で高い結合活性を示す。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、２０％〜５０％血清(vol/vol)、例えば２０％〜５０％ヒト血清、例えば少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％血清(vol/vol)の存在下、中性ｐＨ(約ｐＨ７.４)および１mM〜５mMの乳酸濃度の条件下よりもｐＨ６.０またはｐＨ６.５および１０mM〜２０mMの乳酸濃度の条件下で高い結合活性を示す。例えば、中性ｐＨ(例えば７.４)および１mM〜５mMの乳酸の条件下と比較したｐＨ６.０または６.５および１０〜２０mM、例えばまたは約１６mMの乳酸の条件下の結合活性比は１.０を超え、例えば、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上またはそれ以上である。
非腫瘍微小環境における条件下と比較した腫瘍微小環境条件における上記条件下の結合活性比は、抗体または抗原結合フラグメントのＥＧＦＲ(例えばヒトＥＧＦＲ)への結合を評価するための当業者に知られるあらゆる方法に基づき決定または評価できる。このようなアッセイの例はセクションＤに記載する。一例において、結合活性は、腫瘍微小環境における上記条件のいずれかの下および非腫瘍微小環境における上記条件のいずれかの下のインビトロで固相結合アッセイ、例えば免疫アッセイ(例えば酵素結合免疫吸着検定法；ＥＬＩＳＡ)で決定できる。このような例において、結合活性は、分光光度的測定値(例えば用いる特定の検出方法に適合した光学密度および吸光度波長)として表すことができ、結合活性比は、同一濃度の抗体(例えば１ng／mL〜１００ng／mLの抗体濃度)での、非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較した結合腫瘍微小環境において存在する条件下での分光光度的測定値の比であり得る。これは、ここでの実施例に例示する。抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、固相免疫アッセイにおける分光光度的測定値または他の類似定量的指標で決定して、活性比が１.０を超え、例えば、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上またはそれ以上であるならば、条件依存活性抗体である。
他の例において、結合活性は、腫瘍微小環境における上記条件のいずれかの下および非腫瘍微小環境における上記条件のいずれかの下、結合の動力学的尺度(例えば解離定数、ＫＤ、結合定数ＫＡ、オフ速度または結合親和性の他の動力学的パラメータ)として決定する。このような尺度は、当業者に知られるあらゆる結合アッセイを使用して決定できる。具体例において、親和性ベースのバイオセンサーテクノロジーを結合親和性の尺度として使用する。バイオセンサーテクノロジーの例は、例えば、Biacoreテクノロジー、BioRad ProteOn、Reichert、ＧＷＣテクノロジー、IBIS SPIR造影、Nomadics SensiQ、Akubio RAPid、ForteBio Octet、IAsys、Nanofilmおよびその他を含む(例えばRich et al. (2009) Analytical Biochemistry, 386:194-216参照)。このような例において、結合活性は解離定数(ＫＤ)として示すことができ、結合活性比は、非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較した、腫瘍微小環境において存在する条件下での緊密な親和性結合の比であり得る。例えば、少なくとも２.０の結合活性比は少なくとも２倍緊密な親和性があることを意味し、少なくとも３.０の結合活性比は少なくとも３倍緊密な親和性があることを意味し、少なくとも４.０の結合活性比は少なくとも４倍緊密な親和性があることを意味し、少なくとも５.０の結合活性比は少なくとも５倍緊密な親和性があることを意味し、少なくとも１０.０の結合活性比は少なくとも１０倍緊密な親和性があることを意味し、ここで、各比は、非腫瘍微小環境における条件下と比較した腫瘍微小環境における条件下である。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントは、典型的に結合ＥＧＦＲ(例えばヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに対して、腫瘍微小環境において存在する条件下、１×１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ未満またはそれ以下である解離定数(ＫＤ)を示す。他の例において、結合活性はオフ速度として表すことができ、結合活性比は、非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較した、腫瘍微小環境において存在する条件下のｋｏｆｆの比であり得る。例えば、少なくとも２.０の結合活性比は抗体が少なくとも２倍遅いオフ速度を示すことを意味し、少なくとも３.０の結合活性比は抗体が少なくとも３倍遅いオフ速度を示すことを意味し、少なくとも４.０の結合活性比は抗体が少なくとも４倍遅いオフ速度を示すことを意味し、少なくとも５.０の結合活性比は抗体が少なくとも５倍遅いオフ速度を示すことを意味し、少なくとも１０.０の結合活性比は抗体が少なくとも１０倍遅いオフ速度を示すことを意味し、ここで、各比は、非腫瘍微小環境における条件下と比較した腫瘍微小環境における条件下である。これは、ここでの実施例に例示する。抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、結合の動力学的測定を使用して決定して、活性比が１.０を超え、例えば、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上またはそれ以上であるとき、条件依存活性抗体である。
さらなる例において、結合活性は、腫瘍微小環境における結合および非腫瘍微小環境における結合を評価するインビボ結合活性アッセイで決定する。非腫瘍微小環境の例は、抗体のケラチン生成細胞を含む皮膚の基底層への結合である。結合アッセイは、各環境において、ＥＧＦＲを発現する細胞を含むことが知られる動物モデルを使用して実施できる。特に、動物モデルはヒトＥＧＦＲを発現する。例えば、ヒトＥＧＦＲを発現する腫瘍または非腫瘍細胞を含むように微小環境を操作する異種移植により産生したマウス動物モデルまたは他の哺乳動物モデルを使用できる。これは、ここでは、腫瘍異種移植法(例えばＡ４３１細胞または他のヒト腫瘍細胞を用いる)および皮膚異種移植法を使用して例示する。このような例において、抗体またはその抗原結合フラグメントは検出可能に標識され、例えば蛍光標識されている。このような例において、結合活性は、生じる検出可能シグナル(例えば蛍光シグナルの強度)として表すことができ、結合活性比は、結合非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較した、腫瘍微小環境において存在する条件下の検出可能シグナル(例えば蛍光シグナル)の強度の比であり得る。染色強度を、コントロールまたは参照抗体の染色に対する規準化により規準化できる。これは、ここでの実施例に例示する。抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、２環境でインビボ結合で決定した活性比が１.０を超え、例えば、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上またはそれ以上であるならば、条件依存活性抗体である。
腫瘍微小環境における条件依存活性、例えば腫瘍微小環境において存在する条件下(例えば低ｐＨ、例えばｐＨ６.０および高乳酸、例えば１０〜２０mM)、増加した結合活性のために、ここに提供する抗体は、非病的環境と比較して、腫瘍微小環境においてＥＧＦＲに対して増加した阻害活性を示す。このような阻害活性は、リガンド誘発リン酸化、二量体化および／または細胞増殖の阻害を含むが、これらに限定されない。このような活性の結果、ここに提供する抗体は、腫瘍、例えば固形腫瘍を有する対象にインビボで投与されたとき、腫瘍増殖阻害を示す。腫瘍増殖は、投与された抗体の非存在下の腫瘍増殖と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害される。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の機能的活性は、腫瘍モデルで評価したとき、非病的組織における活性が低下している限り(例えば皮膚発疹の発生率)、現存する抗ＥＧＦＲ治療、例えばセツキシマブでの治療より低い、同等または大きくてよい。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、ここに記載するとおり、インビボ動物腫瘍モデル、例えばＡ４３１モデルで、セツキシマブより低い結合親和性(高いＫｄ)で、セツキシマブと同等の効果をインビボで示す。
ここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、対象に投与したとき、他の現存する抗ＥＧＦＲ治療を投与された、例えばセツキシマブでの治療をされた(例えば配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態)対象と比較して、対象が減少したまたは少ない副作用を示すように、条件依存および選択的腫瘍特異的活性を示す。例えば、提供される抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは低い皮膚毒性を示す。皮膚毒性、例えば皮膚発疹は当業者に知られる標準的アッセイで評価でき、ここに記載されている。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、霊長類モデルで評価して、少なくとも１.５分の１、２分の１、２.５分の１、３分の１、４分の１、５分の１またはそれ以上発疹が少ない。
ここに記載されているとおり、非腫瘍微小環境よりも腫瘍微小環境で大きな活性を示す条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを同定または産生する方法は当業者のレベルの範囲内である。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体のライブラリーを含み製造でき、ここにセクションＤに記載する工程および方法を使用してスクリーニングできる。下記サブサブセクションにおいて、上記の改変された特性および活性を示す、セツキシマブまたは抗原結合フラグメントまたはその変異体由来の修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例を含む抗ＥＧＦＲ抗体の例を示す。得られた抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体に集合したとき、最小限ＥＧＦＲ抗原(例えばヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントと結合するのに十分な可変重鎖および可変軽鎖またはその一部を含むことは理解される。
１. 修飾抗ＥＧＦＲ抗体
ここに提供されるのは、修飾または変異体抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。修飾抗ＥＧＦＲ抗体に包含されるのは、非病的環境、例えば皮膚または皮膚の基底層よりも、腫瘍微小環境において高いまたは大きな活性を示すような条件依存活性である抗体である。ここに提供される抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブまたはその誘導体の変異体である。得られた抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体に集合したとき、最小限ＥＧＦＲ抗原(例えばヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントと結合するのに十分な可変重鎖および可変軽鎖またはその一部を含むことは理解され、それにより可変重鎖または軽鎖の一方または両者は修飾されている。上記のとおり、このような修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントに包含されるのは、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.８のｐＨ(例えば７.０〜７.４のｐＨ)または正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度(例えば１mM〜４mM)の一方または両者を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約ｐＨ５.６〜６.８のｐＨ(例えばｐＨ６.０〜６.５)または正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度(例えば１０mM〜２０mM、例えば少なくとも１６mM)の一方または両者を含む腫瘍微小環境において存在する条件下、高い結合活性でＥＧＦＲ(特にヒトＥＧＦＲ)と結合する抗体である。非腫瘍微小環境における条件下と比較して、腫瘍微小環境における条件下での高い結合活性は、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上の活性比であり得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態よりも、ｐＨ６.０またはｐＨ６.５で高いまたは減少したまたは同等な結合活性を示す。ある例において、抗体は、配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態よりも、ｐＨ６.０で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の結合活性を示す。一般に、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾セツキシマブ抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体、例えば配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態の結合活性と比較して、ｐＨ６.０またはｐＨ６.５で１００％〜５００％、例えば少なくとも１００％またはそれ以上の(すなわち増加した)結合活性、例えば正確にまたは約または少なくとも１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％またはそれ以上の結合活性を示す。
ある例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、ｐＨ７.４で、非修飾セツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体、例えば配列番号１に示す重鎖および配列番号２に示す軽鎖または配列番号８に示す重鎖および配列番号９に示す軽鎖を有するセツキシマブの対応する形態の、３０％〜９５％のＥＧＦＲ結合活性を示す。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、中性ｐＨ(例えばｐＨ７.４)で、アミノ酸修飾(例えば置換)を含まない参照または非修飾セツキシマブの、少なくとも３０％の結合活性、例えば正確にまたは約または少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の結合活性を示す。具体例において、ここに提供する抗体は、ｐＨ６.０またはｐＨ６.５で、同一条件下の非修飾セツキシマブ抗体または抗原結合フラグメントまたはその変異体の結合活性と比較して、同等なまたは高い結合活性を示すかまたは維持するが、中性ｐＨ(例えばｐＨ７.４)で、配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態よりも、ｐＨ７.４で低い、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％の結合活性を示す。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、ｐＨ７.４で、修飾を含まない参照抗ＥＧＦＲ抗体、例えば配列番号１に示す重鎖および配列番号２に示す軽鎖または配列番号８に示す重鎖および配列番号９に示す軽鎖を有するセツキシマブの対応する形態の３０％〜９５％のＥＧＦＲ結合活性を示し、ｐＨ６.０で１００％〜５００％のＥＧＦＲ結合活性を示すものを含む。
ここに提供される修飾抗ＥＧＦＲ抗体に包含されるのは、高乳酸レベル、例えば、１０〜２０mM乳酸で減少した、増加したまたは同等のＥＧＦＲ結合活性を示すものである。一般に、抗体は、１０〜２０mM乳酸濃度の条件下で、配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の結合活性を示す。いくつかの例では、抗体は、１０〜２０mM乳酸濃度の条件下、増加した結合活性、例えば非修飾セツキシマブ抗体、抗原結合フラグメントまたはその変異体、例えば配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態の１００％〜５００％の活性、例えば１００％を超える結合活性、例えば少なくともまたは少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の結合活性を示す。
ある例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾セツキシマブ抗体、抗原結合フラグメントまたはその変異体、例えば配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態と比較して、正常乳酸レベル(例えば、０〜５mM乳酸)で３０％〜９５％のＥＧＦＲ結合活性を示す。例えば、ここに提供する抗体は、１０〜２０mM乳酸の条件下で、同一条件下のセツキシマブの結合活性と同等の結合活性を保持するまたは示すが、１mM〜５mM乳酸の条件下、１mM〜５mM乳酸の条件下結合活性が減少し、例えば配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の結合活性を示す。さらに別の例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、修飾を含まない参照または非修飾抗ＥＧＦＲ抗体、例えば配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態と比較して、正常乳酸レベル(例えば、０〜５mM乳酸)で３０％〜９５％のＥＧＦＲ結合活性を示し、高乳酸レベル(例えば、１０〜２０mM乳酸)で１００％〜５００％のＥＧＦＲ結合活性を示す。
ここに示す例示的実施例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、修飾を含まない参照抗ＥＧＦＲ抗体、例えば配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態と比較して、ｐＨ７.４で３０％〜９５％のＥＧＦＲ結合活性、ｐＨ６.０で１００％〜５００％のＥＧＦＲ結合活性、正常乳酸レベル(例えば、０〜５mM乳酸)で３０％〜９５％のＥＧＦＲ結合活性および高乳酸レベル(例えば、１０〜２０mM乳酸)で１００％〜５００％のＥＧＦＲ結合活性を示す。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、酸性ｐＨ(例えば、ｐＨ６.０)でＥＧＦＲへの結合が増加し、高乳酸レベル(例えば、１６.６mM乳酸)でＥＧＦＲへの結合が増加し、中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.４)でＥＧＦＲへの結合が減少しおよび／または正常乳酸レベル(例えば１mM乳酸)でＥＧＦＲへの結合が減少する。
結合活性が腫瘍微小環境において存在する条件下で増加している例において、提供される抗体は、非修飾セツキシマブまたは抗原結合フラグメントまたはその変異体、例えば配列番号１に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号２に示す軽鎖アミノ酸の配列または配列番号８に示す重鎖アミノ酸の配列および配列番号９に示す軽鎖アミノ酸の配列を有する野生型セツキシマブの対応する形態と比較して、ｐＨ６.０またはｐＨ６.５でＥＧＦＲへの結合親和性が増加しおよび／または中性ｐＨ(例えばｐＨ７.４)で結合親和性が減少する。具体例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、インビトロでｐＨ７.４で結合親和性(例えば、Ｋｄ)が少なくとも１.５分の１、２分の１、２.５分の１、３分の１、４分の１、５分の１またはそれ以上減少するが、ｐＨ６.０で同等なＥＧＦＲへの結合を保持する。
ここに提供される抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの例は、配列番号１、３、５、８または２８のいずれかに示す重鎖および配列番号２、４、９、１０または２９のいずれかに示す軽鎖または配列番号１、３、５、８または２８のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号２、４、９、１０または２９のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を有する軽鎖を有する参照抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、修飾を含むものである。ここに提供される修飾抗ＥＧＦＲ抗体に包含されるのは、セツキシマブと比較して改変された特性を有する抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブの変異体である。例示的態様において、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍と関連するまたは腫瘍に特異的な１個以上の条件下、例えば、結合ＥＧＦＲにより、腫瘍環境に標的化されるように修飾される。
ここに記載する修飾は、セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体またはその変異体抗体のいずれにおいてでもあり得る。例えば、修飾は、配列番号１に示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号２に示す配列を有する軽鎖または配列番号８に示すアミノの配列を有する重鎖および配列番号９に示すアミノ酸の配列を有する軽鎖または重鎖または軽鎖に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列番号１または８に示す重鎖および／または配列番号２または９に示す軽鎖の配列変異体を含むセツキシマブ抗体に成す。ある例において、修飾は、配列番号２８に示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号２９に示すアミノ酸の配列を有する軽鎖；または配列番号２８に示す重鎖および／または配列番号２９に示す軽鎖に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列変異体を含むヒト化セツキシマブ抗体に成す。
一般に、修飾はこのような抗体の可変領域に成す。例えば、修飾は、このようなセツキシマブ抗体の重および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号３に示す可変重鎖配列および配列番号４に示す可変軽鎖配列；または配列番号３に示す可変重鎖配列および配列番号１０に示す可変軽鎖配列を含む配列において成す。得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体は完全長ＩｇＧ１抗体であってよくまたはそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントであってよい。さらに、得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、ＩｇＧ１以外のドメインを含み得る。
修飾は、単一アミノ酸修飾、例えば一アミノ酸交換(置換)、挿入または欠失または多アミノ酸修飾、例えば多アミノ酸置換、挿入または欠失であり得る。修飾の例は、一または多アミノ酸置換を含むアミノ酸置換である。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、修飾を含まない抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、少なくともまたは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上の修飾位置を含み得る。ある例において、提供される修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾セツキシマブまたは抗原結合フラグメントまたはその変異体と比較して、１個のみまたは２個のみのアミノ酸置換を含む。アミノ酸置換は、例えば、表４に示す保存的置換または非保存的置換、例えばここに記載されているあらゆるものであり得る。ここに記載するとおり条件依存活性を提供するここでの修飾の例を含む抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、得られた抗体が非腫瘍微小環境と比較して、腫瘍微小環境における条件依存活性を保持する限り、記載のとおりヒト化によりさらに修飾してよい。
ここでの目的のために、アミノ酸交換または置換を含む修飾のための位置およびアミノ酸の記載は、配列番号３に示す可変重鎖および配列番号４に示す可変軽鎖を参照する。配列番号１、５、８または２８に示すような他の重鎖または配列番号２、９、１０または２９に示すような他の軽鎖または配列番号１、２、５、８〜１０または２８〜２９のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すその変異体における対応するアミノ酸残基の同定により、ここに提供する修飾を他の抗ＥＧＦＲ抗体に成すことは当業者のレベルの範囲内である。他の抗ＥＧＦＲ抗体における対応する位置は、抗ＥＧＦＲ抗体重鎖または軽鎖と参照抗ＥＧＦＲの配列番号３に示す重鎖または配列番号４に示す軽鎖のアラインメントにより同定できる。例えば、図２は、配列番号３および４と抗ＥＧＦＲ抗体のアラインメントおよび対応する位置の同定の例を記載する。修飾(例えばアミノ酸置換)の目的で、対応するアミノ酸残基はアミノ酸残基のいずれかであってよく、配列番号３または４に示す残基と同一である必要はない。典型的に、配列番号３または４における残基とのアラインメントにより同定した対応するアミノ酸残基は、配列番号３または４と同一であるか、その保存的または半保存的アミノ酸残基であるアミノ酸残基である(例えば図２参照)。ここに提供する置換の例は、置換が抗ＥＧＦＲ抗体重鎖または軽鎖の非修飾形態に存在するものと異なる限り、抗ＥＧＦＲ抗体重鎖または軽鎖における対応する残基に成し得ることも理解される。本記載およびここでのあらゆる場所の記載に基づき、記載する変異の１個以上を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体を製造し、ここに記載するとおり、各々特性または活性について試験することは、当業者のレベルの範囲内である。
抗ＥＧＦＲ抗体における修飾は、抗体の可変領域における修飾および抗体の定常領域における修飾、例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＬ領域における修飾を含む、他の修飾も含む抗ＥＧＦＲ抗体にも成し得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、当業者に知られる標準的組み換えＤＮＡ技術により製造できる。標的タンパク質の任意の１個以上のアミノ酸に変異を起こすあらゆる既知方法を用いることができる。本方法は、コード化核酸分子の標準的部位特異的または無作為変異誘発または固相ポリペチド合成方法を含む。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸分子を変異誘発、例えばコード化核酸の無作為変異誘発、エラープローンＰＣＲ、部位特異的変異誘発、重複ＰＣＲ、遺伝子混合または他の組み換え方法に付し得る。抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸を、次いで、異種性に発現すべき宿主細胞に導入できる。それゆえに、またここに提供されるのは、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかをコードする核酸分子である。
配列番号３に示す可変重鎖および配列番号４に示す可変軽鎖を参照したセツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントの可変重鎖および／または可変軽鎖またはその一部の例における非限定的例を下に提供する。
ａ. 重鎖修飾
ここに提供されるのは、配列番号３に示す可変重鎖を含むセツキシマブ抗体におけるアミノ酸残基に対応する、セツキシマブ抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体の可変重鎖に修飾、例えばアミノ酸置換を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。得られた修飾は、配列番号１、３、５、８または２８またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体に示すような、重鎖またはその一部であり得る。修飾は相補性決定領域(ＣＤＲ)またはフレームワーク領域中であり得る。
例えば、ここに提供されるのは、配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、９３位、９４位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位または１１２位に対応するに似の位置に少なくとも１アミノ酸交換または置換を有する、可変重鎖またはその一部を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、アミノ酸位置は、配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、２３位のスレオニン(Ｔ)(Ｔ２３)、Ｖ２４、Ｓ２５、Ｇ２６、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｌ２９、Ｔ３０、Ｎ３１、Ｙ３２、Ｇ３３、Ｖ３４、Ｈ３５、Ｗ３６、Ｖ５０、Ｉ５１、Ｗ５２、Ｓ５３、Ｇ５４、Ｇ５５、Ｎ５６、Ｔ５７、Ｄ５８、Ｙ５９、Ｎ６０、Ｔ６１、Ｐ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ｓ６５、Ｒ６６、Ｌ６７、Ｓ６８、Ｉ６９、Ｎ７０、Ｋ７１、Ｄ７２、Ｎ７３、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｓ７６、Ｑ７７、Ｙ９３、Ｙ９４、Ｒ９７、Ａ９８、Ｌ９９、Ｔ１００、Ｙ１０１、Ｙ１０２、Ｄ１０３、Ｙ１０４、Ｅ１０５、Ｆ１０６、Ａ１０７、Ｙ１０８、Ｗ１０９、Ｇ１１０、Ｑ１１１またはＧ１１２に対応する位置での置換に対応する位置での置換であり得る。
Kabatナンバリングを参照して、修飾、例えばアミノ酸交換または置換できる重鎖におけるこのような位置は、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、９０位、９１位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１００ａ位、１００ｂ位、１００ｃ位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位または１０６位に対応するあらゆる位置を含むが、これらに限定されない。ある例において、上記位置のいずれかに対応する位置で修飾(例えば置換)されているアミノ酸残基は、配列番号３に示すアミノ酸の保存的残基または半保存的アミノ酸残基である(例えば図２参照)。
一例において、ここに提供されるのは、例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２および／またはＣＤＲＨ３のような１個または複数のＣＤＲに修飾を有する可変重鎖を含むである。例えば、ここに提供されるのは、配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位または３５位に対応する位置のいずれかでＣＤＲ１；配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位または６５位に対応する位置のいずれかでＣＤＲ２；配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位または１０８位に対応する位置のいずれかでＣＤＲ３に１個以上のアミノ酸置換を有する可変重鎖を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
他の例において、ここに提供されるのは、フレームワーク領域(ＦＷ)重鎖ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３またはＦＷ４に修飾を含む可変重鎖を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、ここに提供されるのは、配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、２３位、２４位または２５位に対応する位置のいずれかで重鎖ＦＷ１；配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、３６位または３７位に対応する位置のいずれかでＦＷ２；配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、９３位、９４位または９７位に対応する位置のいずれかでＦＷ３；および配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、１０９位、１１０位、１１１位または１１２位に対応するいずれかの位置でＦＷ４に１個以上のアミノ酸置換を有する可変重鎖を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
ここに提供されるのは、配列番号３に示す位置を参照して、表５に示す置換に対応する、可変重鎖またはその一部に少なくとも１アミノ酸置換を有する修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
ここに提供する可変重鎖またはその一部に修飾を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例は、上に記載するとおり腫瘍環境における条件依存活性を示すものである。例えば、ここに提供する抗体の例は、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.８のｐＨまたは正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者(例えばｐＨ７.４および／または１mM乳酸)および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して正確にまたは約ｐＨ５.６〜６.８のｐＨまたは正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度(例えばｐＨ６.０および／または１６.６mM乳酸)の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む、腫瘍微小環境において存在する条件下、上記のとおり１.０を超え、例えば１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、３.０、４.０、５.０を超えるまたはそれを超える高い結合活性でＥＧＦＲ(特にヒトＥＧＦＲ)と結合するものを含む。
例えば、ここに記載するとおり条件依存活性である修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例は、配列番号３に示す重鎖アミノ酸位置を参照して、２４、２５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、５０、５３、５４、５８、５９、６３、６４、６７、６８、７２、７３、７４、７５、７６、７７、９７、１００、１０１、１０４、１０７、１１１の位置または対応する位置に１個以上のアミノ酸置換を有する可変重鎖を含む。例えば、アミノ酸位置は、配列番号３のいずれかに示すアミノ酸位置を参照して、２４位のバリン(Ｖ)(Ｖ２４)、Ｓ２５、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｌ２９、Ｔ３０、Ｎ３１、Ｙ３２、Ｖ５０、Ｓ５３、Ｇ５４、Ｄ５８、Ｙ５９、Ｆ６３、Ｔ６４、Ｌ６７、Ｓ６８、Ｄ７２、Ｎ７３、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｓ７６、Ｑ７７、Ｒ９７、Ｔ１００、Ｙ１０１、Ｙ１０４、Ａ１０７、Ｑ１１１での置換に対応する位置の置換であり得る。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の例は、重鎖置換Ｖ２４Ｉ、Ｖ２４Ｌ、Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｇ、Ｓ２５Ｉ、Ｓ２５Ｍ、Ｓ２５Ｖ、Ｓ２５Ｑ、Ｓ２５Ｔ、Ｓ２５Ｌ、Ｓ２５Ｈ、Ｓ２５Ｒ、Ｓ２５Ａ、Ｓ２５Ｄ、Ｆ２７Ｒ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ２９Ｈ、Ｔ３０Ｆ、Ｎ３１Ｈ、Ｎ３１Ｉ、Ｎ３１Ｔ、Ｎ３１Ｖ、Ｙ３２Ｔ、Ｖ５０Ｌ、Ｓ５３Ｇ、Ｇ５４Ｄ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｒ、Ｇ５４Ｃ、Ｇ５４Ｐ、Ｄ５８Ｍ、Ｙ５９Ｅ、Ｆ６３Ｒ、Ｆ６３Ｃ、Ｆ６３Ｇ、Ｆ６３Ｍ、Ｆ６３Ｖ、Ｆ６３Ｐ、Ｆ６３Ｓ、Ｔ６４Ｎ、Ｔ６４Ｖ、Ｌ６７Ｇ、Ｓ６８Ｆ、Ｓ６８Ｑ、Ｄ７２Ｋ、Ｄ７２Ｌ、Ｄ７２Ｐ、Ｄ７２Ｍ、Ｄ７２Ｗ、Ｎ７３Ｑ、Ｓ７４Ｈ、Ｓ７４Ｒ、Ｓ７４Ｄ、Ｓ７４Ｇ、Ｓ７４Ｙ、Ｋ７５Ｈ、Ｋ７５Ｇ、Ｋ７５Ｗ、Ｋ７５Ｐ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７６Ｖ、Ｑ７７Ｒ、Ｑ７７Ｅ、Ｒ９７Ｈ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｐ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｓ、Ｙ１０５Ｖ、Ａ１０７Ｎ、Ｑ１１１Ｉ、Ｑ１１１Ｐ、Ｑ１１１Ｖに対応する１個以上のアミノ酸置換を含む。
具体例において、ここに提供する修飾の例は、配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、２４位、２５位、２７位、３０位、５３位、７２位、９７位、１０４位および１１１位に対応する位置での抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖の修飾を含む。例えば、アミノ酸位置は、配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、２４位のバリン(Ｖ)(Ｖ２４)、Ｓ２５、Ｆ２７、Ｔ３０、Ｓ５３、Ｄ７２、Ｒ９７、Ｙ１０４またはＱ１１１の置換に対応する位置での置換であり得る。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体におけるアミノ酸置換の例は、２４に対応する位置のグルタミン酸(Ｅ)；２５に対応する位置のＣ；２５に対応する位置のＶ；２７に対応する位置のＲ；３０位に対応する位置のＦ；５３位に対応する位置のＧ；７２位に対応する位置のＬ；９７に対応する位置のＨ；１０４に対応する位置のＤまたは１１１に対応する位置のＰを有する重鎖残基の置換を含むが、これらに限定されない。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号３に示すアミノ酸の配列を参照して、Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｖ、Ｆ２７Ｒ、Ｔ３０Ｆ、Ｓ５３Ｇ、Ｄ７２Ｌ、Ｒ９７Ｈ、Ｙ１０４ＤまたはＱ１１１Ｐの重鎖置換に対応する１個以上のアミノ酸置換を含む。抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、可変重鎖に一アミノ酸置換のみを含み得る。典型的に、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、可変重鎖に上記アミノ酸置換の少なくとも２個以上、例えば配列番号３に示すアミノ酸の配列を参照して、Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｖ、Ｆ２７Ｒ、Ｔ３０Ｆ、Ｓ５３Ｇ、Ｄ７２Ｌ、Ｒ９７Ｈ、Ｙ１０４ＤまたはＱ１１１Ｐの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８または９アミノ酸置換を含む。抗ＥＧＦＲまたはその抗原結合フラグメントは、例えばサブセクション３に下記のとおり、重鎖に付加的修飾を含んでよくまたはここに記載する抗体のヒト化の結果である。特に、ここに提供されるのは、重鎖残基Ｙ１０４、例えばアミノ酸置換Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４ＦまたはＹ１０４Ｓのアミノ酸置換を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。
重鎖における非限定的アミノ酸置換を、配列番号３に示すナンバリングを参照して表６に示す。アミノ酸置換を含む可変重鎖の配列番号の例を示す。ここに提供する可変重鎖におけるあらゆるアミノ酸置換について、置換は、配列番号３に示す配列とのアラインメントにより他の抗ＥＧＦＲ抗体における対応する位置で成すことができ(例えば図２参照)、それにより対応する位置は整列した位置である。それゆえに、抗体は重鎖定常領域またはその一部を含み得る。具体例において、アミノ酸置換は、上記のとおり、修飾可変重鎖またはその一部を含む得られた修飾抗体が、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.８のｐＨまたは正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者(例えばｐＨ７.４および／または１mM乳酸)および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約ｐＨ５.６〜６.８のｐＨまたは正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度(例えばｐＨ６.０および／または１６.６mM乳酸)の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む、腫瘍微小環境において存在する条件下で１.０を超える結合活性比を示す限り、配列番号１、３、５、８または２８に示すまたはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体のいずれかのようなセツキシマブ重鎖またはその一部の対応する位置であり得る。
ｂ. 軽鎖修飾
ここに提供されるのは、配列番号４に示す可変軽鎖を含むセツキシマブ抗体におけるアミノ酸残基に対応する、セツキシマブ抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体の可変軽鎖において修飾、例えばアミノ酸置換を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。得られた修飾は、配列番号２、４、９、１０または２９に示す軽鎖またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体においてであり得る。修飾は相補性決定領域(ＣＤＲ)またはフレームワーク領域中であり得る。
例えば、ここに提供されるのは、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、１位、２位、３位、４位、５位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、４８位、４９位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、８６位、８７位、８９位、９１位、９２位、９３位、９６位、９７位、９８位、９９位または１００位に対応する位置で、可変軽鎖またはその一部において少なくとも１アミノ酸交換または置換を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、アミノ酸位置は、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、１位のアスパラギン酸(Ｄ)(Ｄ１)、Ｉ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｔ５、Ｒ２４、Ａ２５、Ｓ２６、Ｑ２７、Ｓ２８、Ｉ２９、Ｇ３０、Ｔ３１、Ｎ３２、Ｉ３３、Ｉ４８、Ｋ４９、Ａ５１、Ｓ５２、Ｅ５３、Ｓ５４、Ｉ５５、Ｓ５６、Ｙ８６、Ｙ８７、Ｑ８９、Ｎ９１、Ｎ９２、Ｎ９３、Ｔ９６、Ｔ９７、Ｆ９８、Ｇ９９またはＡ１００の置換に対応する位置での置換であり得る。Kabatナンバリングに関して、例えばアミノ酸交換または置換により修飾できる軽鎖における位置の例は、１位、２位、３位、４位、５位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、４８位、４９位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、８６位、８７位、８９位、９１位、９２位、９３位、９６位、９７位、９８位、９９位または１００位に対応する位置のいずれかを含むが、これらに限定されない。ある例において、上記位置のいずれかに対応する位置で修飾(例えば置換)されているアミノ酸残基は、配列番号２、４、９、１０または２９のいずれかに示すアミノ酸の保存的残基または半保存的アミノ酸残基である。
一例において、ここに提供されるのは、例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３のようなＣＤＲに修飾を有する可変軽鎖を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、ここに提供されるのは、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位または３３位に対応する位置のいずれかでの軽鎖ＣＤＲ１；配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位または５６位に対応する位置のいずれかでのＣＤＲ２；配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、８９位、９１位、９２位、９３位、９６位または９７位に対応する位置のいずれかでのＣＤＲ３に１個以上のアミノ酸置換を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
他の例において、ここに提供されるのは、フレームワーク領域(ＦＷ)、例えば、軽鎖ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３またはＦＷ４において修飾を含む可変軽鎖を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、ここに提供されるのは、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、１位、２位、３位、４位または５位に対応する位置のいずれかで軽鎖ＦＷ１；配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、４８位または４９位に対応する位置のいずれかでＦＷ２；配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、８６位または８７位に対応する位置のいずれかでＦＷ３；および配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、９８位、９９位または１００位に対応する位置のいずれかでＦＷ４に１個以上のアミノ酸置換を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
ここに提供されるのは、配列番号４に示す位置を参照して表７に示すいずれかに対応する、可変軽鎖またはその一部に少なくとも１アミノ酸置換を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
ここに提供する可変軽鎖またはその一部において修飾を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例は、上に記載するとおり腫瘍環境における条件依存活性を示すものである。例えば、ここに提供する抗体の例は、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.８のｐＨまたは正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者(例えばｐＨ７.４および／または１mM乳酸)および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約ｐＨ５.６〜６.８のｐＨまたは正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度(例えばｐＨ６.０および／または１６.６mM乳酸)の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む、腫瘍微小環境において存在する条件下、上記のとおり１.０を超え、例えば１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、３.０、４.０、５.０を超えるまたはそれを超える、高い結合活性でＥＧＦＲ(特にヒトＥＧＦＲ)と結合するものを含む。
例えば、ここに記載するとおり条件依存活性である修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例は、配列番号４のいずれかに示す軽鎖アミノ酸位置を参照して、４位、５位、２４位、２９位、５６位または９１の位置または対応する位置に１個以上のアミノ酸置換を有する可変軽鎖を含む。例えば、アミノ酸位置は、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、４位のロイシン(Ｌ)(Ｌ４)、Ｔ５、Ｒ２４、Ｉ２９、Ｓ５６またはＮ９１の置換に対応する位置での置換であり得る。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の例は、軽鎖置換Ｌ４Ｃ、Ｌ４Ｆ、Ｌ４Ｖ、Ｔ５Ｐ、Ｒ２４Ｇ、Ｉ２９Ｓ、Ｓ５６ＨまたはＮ９１Ｖに対応する１個以上のアミノ酸置換を含む。抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、可変軽鎖に一アミノ酸置換のみを含み得る。典型的に、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、可変軽鎖に上記アミノ酸置換の少なくとも２個以上、配列番号４に示すアミノ酸の配列を参照して、Ｌ４Ｃ、Ｌ４Ｆ、Ｌ４Ｖ、Ｔ５Ｐ、Ｒ２４Ｇ、Ｉ２９Ｓ、Ｓ５６ＨまたはＮ９１Ｖの例えば少なくとも２、３、４、５または６アミノ酸置換を含む。抗ＥＧＦＲまたはその抗原結合フラグメントは、例えばサブセクション３に下記のとおり、軽鎖に付加的修飾を含んでよく、またはここに記載する抗体のヒト化の結果である。
具体例において、ここに提供する修飾の例は、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、２９位に対応する位置での抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖の修飾を含む。例えば、アミノ酸位置は、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、２９位のイソロイシン(Ｉ)(Ｉ２９)の置換に対応する位置での置換であり得る。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体におけるアミノ酸置換の例は２９に対応する位置でのセリン(Ｓ)を有する軽鎖残基の置換を含むが、これらに限定されない。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号４に示すアミノ酸の配列におけるＩ２９Ｓの軽鎖置換に対応するアミノ酸置換を含む。
上記の重鎖の修飾のいずれかおよび上記の軽鎖における修飾のいずれかを抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントで組み合わせることができる。このような修飾の非限定的例は、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；またはＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓを含む。
ここに提供する可変軽鎖におけるアミノ酸置換のいずれかにおいて、置換は、配列番号４に示す配列とのアラインメントにより他の抗ＥＧＦＲ抗体における対応する位置で成すことができ(例えば図２参照)、それにより対応する位置は整列した位置である。具体例において、アミノ酸置換は、修飾可変軽鎖を有する得られた修飾抗体が、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.８のｐＨまたは正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者(例えばｐＨ７.４および／または１mM乳酸)および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約ｐＨ５.６〜６.８のｐＨまたは正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度(例えばｐＨ６.０および／または１６.６mM乳酸)の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む、腫瘍微小環境において存在する条件下で、上記記するとおり１.０を超える結合活性比を有する限り、配列番号２、４、９、１０または２９のいずれかに示すセツキシマブ軽鎖またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体における対応する位置であり得る。
ｃ. 修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントの例
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体、例えば上記のいずれかは、上記のとおり、抗体に集合したとき、最小限抗原と結合するのに十分な修飾可変重鎖および／または修飾可変軽鎖またはその一部を含む。ここに提供されるのは、配列番号３０〜５５７、１０６２〜１０６４、１０９３、１０９８〜１１０７または１１１２〜１１３１のいずれかに示す修飾可変重鎖または配列番号３０〜５５７、１０６２〜１０６４、１０９３、１０９８〜１１０７または１１１２〜１１３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列；および配列番号４または１０に示す可変軽鎖を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。他の例において、ここに提供されるのは、配列番号３に示す可変重鎖；および配列番号５５８〜１０６１または１０６５〜１０６８のいずれかに示す可変軽鎖または配列番号５５８〜１０６１または１０６５〜１０６８のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
ある例において、ここに提供されるのは、可変重鎖および可変軽鎖の両者に修飾を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体であり、それにより抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号３０〜５５７、１０６２〜１０６４、１０９３、１０９８〜１１０７または１１１２〜１１３１のいずれかに示す修飾可変重鎖または配列番号３０〜５５７、１０６２〜１０６４、１０９３、１０９８〜１１０７または１１１２〜１１３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列；および配列番号５５８〜１０６１または１０６５〜１０６８のいずれかに示す可変軽鎖または配列番号５５８〜１０６１または１０６５〜１０６８のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む。具体例において、ここに提供されるのは、配列番号４９５に示す修飾可変重鎖または配列番号４９５と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を示す配列および配列番号６３９または配列番号８９１に示す修飾可変軽鎖または配列番号６３９または８９１と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む修飾抗ＥＧＦＲである(命名ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ)。他の例において、ここに提供されるのは、修飾配列番号１０６２に示す可変重鎖または配列番号１０６２および配列番号６３９と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を示す配列または配列番号８９１に示す修飾可変軽鎖または配列番号６３９または８９１と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む修飾抗ＥＧＦＲである(命名ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ)。さらなる例において、ここに提供されるのは、配列番号５８に示す修飾可変重鎖または配列番号５８と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を示す配列および配列番号６３９または配列番号８９１に示す修飾可変軽鎖または配列番号６３９または８９１と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を示す修飾抗ＥＧＦＲである(命名ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ)。他の例において、ここに提供されるのは、配列番号５４７に示す修飾可変重鎖または配列番号５４７と少なくとも少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を示す配列および配列番号６３９または配列番号８９１に示す修飾可変軽鎖または配列番号６３９または８９１と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む修飾抗ＥＧＦＲである(命名ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ)。
特に、ここに提供されるのは、配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４〜１１１９、１１２４〜１１３１に示す可変重鎖または配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４〜１１１９、１１２４〜１１３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列；および配列番号４または１０に示す可変軽鎖を含む修飾抗ＥＧＦＲである。
ここに提供する抗体は完全長ＩｇＧ１抗体でも、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４からの他のサブタイプでもよい。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブのカッパ軽鎖定常領域(配列番号１０７１に示す)またはセツキシマブのＩｇＧ１重鎖定常領域(配列番号１０６９に示す)を含む完全長ＩｇＧ１抗体である。重鎖定常領域はまた配列番号２２に示すヒトＩｇＧ１重鎖であってよく、Ｉｇクラスから、例えばＩｇＧ２(配列番号２３に示す)、ＩｇＧ３(配列番号２４に示す)またはＩｇＧ４(配列番号２５に示す)または配列番号２６、２７または１０７０に示す修飾ＩｇＧ１重鎖定常領域であり得る。軽鎖定常領域はまたヒトカッパ軽鎖(配列番号１０７２に示す)またはヒトラムダ軽鎖(配列番号１０７３に示す)であり得る。
例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖は上記修飾可変重鎖および配列番号１０６９に示すＩｇＧ１重鎖を含み得る。他の例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖は上記修飾可変重鎖および配列番号２２に示すＩｇＧ１重鎖を含み得る。さらに別の例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖は上記修飾可変重鎖および配列番号１０７０に示すＩｇＧ１重鎖を含み得る。一例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖は、上記修飾可変軽鎖および配列番号１０７１に示すカッパ軽鎖を含み得る。他の例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖は、上記修飾可変軽鎖および配列番号１０７２に示すカッパ軽鎖を含み得る。
例えば、ここに提供されるのは、配列番号３０〜５５７、１０６２〜１０６４、１０９３、１０９８〜１１０７または１１１２〜１１３１のいずれかに示す可変重鎖または配列番号３０〜５５７、１０６２〜１０６４、１０９３、１０９８〜１１０７または１１１２〜１１３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列、さらに配列番号２２、１０６９または１０７０のいずれかに示すＩｇＧ１定常領域に対応するアミノ酸の配列；および配列番号２または９に示す軽鎖を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。ある例において、ここに提供されるのは、配列番号１または８のいずれかに示す可変重鎖；および配列番号５５８〜１０６１または１０６５〜１０６８のいずれかに示す軽鎖または配列番号５５８〜１０６１または１０６５〜１０６８のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列、さらに配列番号１０７１または１０７２に示すカッパ軽鎖定常領域に対応するアミノ酸の配列を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体はまた抗体フラグメントを含み、これは、完全長抗体の完全配列より少ないが、完全長抗体の特異的結合能の少なくとも一部、例えば重鎖および軽鎖の可変部分を保持する、完全長抗体の誘導体である。抗体フラグメントはまた、親抗体の結合親和性を保持するために、抗体フレームワーク内に導入された抗体の抗原結合部分(例えば、キメラ抗体)を含み得る。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントおよび修飾フラグメントを含む他のフラグメントを含むが、これらに限定されない(例えば、Methods in Molecular Biology, Vol. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov参照)。抗体フラグメント、例えばジスルフィド架橋により互いに結合した複数鎖を含んでよく、組み換え的に製造できる。抗体フラグメントは、２個以上のドメインを結合するための合成リンカー、例えばペプチドリンカーを含み得る。抗原結合フラグメントの製造方法は当分野で周知であり、ここに提供する抗体のいずれかの修飾に使用できる。抗体分子のフラグメントは、例えば、酵素開裂によるように、製造できる。例えば、パパインでのプロテアーゼ開裂により、重鎖定常領域、Ｆｃドメインの二量体が開裂されて、２個のＦａｂ領域を形成する(すなわち可変領域含有部分)。
一本鎖抗体は、特異的抗体の重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)の連結により組み換え的に操作できる。可変領域のための特定の核酸配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)および他の組み換え核酸テクノロジーによるような、標準的分子生物学方法によりクローン化できる。ｓｃＦｖｓの製造方法は、例えば、Whitlow and Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Pack et al. (1993) Bio/Technology 11:1271-77；および米国特許番号４,９４６,７７８、５,８４０,３００、５,６６７,９８８、５,６５８,７２７、５,２５８,４９８)により記載されている。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のフラグメント、例えば上記のいずれかは、上記のとおり最小限修飾可変重鎖および／または修飾可変軽鎖を含む。また提供されるのは、配列番号３０〜５５７、１０６２〜１０６４、１０９３、１０９８〜１１０７または１１１２〜１１３１のいずれかに示す修飾可変重鎖および／または修飾配列番号５５８〜１０６１または１０６５〜１０６８のいずれかに示す可変軽鎖または配列番号３０〜１０６８、１０９３または１０９８〜１１３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する可変鎖を含む上記のいずれかの抗原結合フラグメント抗体である。例えば、抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントを含むが、これらに限定されない。
例えば、このような抗ＥＧＦＲ抗体は、さらにセツキシマブからの重鎖ＣＨ１定常領域(配列番号１１に示す)またはセツキシマブのカッパ軽鎖定常領域(配列番号１０７１に示す)を含むＦａｂフラグメントｃである。重鎖ＣＨ１定常領域はまた配列番号１１０８に示すヒトＩｇＧ１ ＣＨ１定常領域であり得る。一例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖は、上記修飾可変重鎖、例えば配列番号３０〜５５７、１０６２〜１０６４、１０９３、１０９８〜１１０７または１１１２〜１１３１に示すいずれかおよび配列番号１１に示すＣＨ１重鎖ドメインを含み得る。他の例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖は、上記修飾可変重鎖、例えば配列番号３０〜５５７、１０６２〜１０６４、１０９３、１０９８〜１１０７または１１１２〜１１３１に示すいずれかおよび配列番号１１０８に示すＣＨ１重鎖ドメインを含み得る。一例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖は、上記修飾可変軽鎖、例えば配列番号５５８〜１０６１または１０６５〜１０６８に示すいずれかおよび配列番号１０７１に示すカッパ軽鎖を含み得る。他の例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖は、上記修飾可変軽鎖、例えば配列番号５５８〜１０６１または１０６５〜１０６８に示すいずれかおよび配列番号１０７２に示すカッパ軽鎖を含み得る。
具体例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかの抗原結合ドメインから製造できる。組み換え技術を使用した一本鎖抗体の製造方法は当分野で知られ、例えば、Marasco et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893, Whitlow and Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Pack et al. (1993) Bio/Technology 11:1271-77；および米国特許番号４,９４６,７７８、５,８４０,３００、５,６６７,９８８、５,６５８,７２７に記載されているようなものである。
一本鎖抗体は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの軽鎖可変(ＶＬ)ドメインまたはその機能的領域および重鎖可変(ＶＨ)ドメインまたはその機能的領域を含み得る。ある例において、一本鎖抗体のＶＬドメインまたはその機能的領域は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの相補性決定領域１(ＣＤＲ１)、相補性決定領域２(ＣＤＲ２)および／または相補性決定領域３(ＣＤＲ３)を含み得る。ある例において、一本鎖抗体のＶＨドメインまたはその機能的領域は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの相補性決定領域１(ＣＤＲ１)、相補性決定領域２(ＣＤＲ２)および相補性決定領域３(ＣＤＲ３)を含み得る。ある例において、一本鎖抗体さらにペプチドリンカーを含む。このような例において、ペプチドリンカーは軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)と重鎖可変ドメイン(ＶＨ)の間に位置できる。
一本鎖抗体は、抗体の１個以上のドメインの間にペプチドスペーサーまたはリンカーを含み得る。例えば、抗体の軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)は、可動性リンカーペプチドを介して重鎖可変ドメイン(ＶＨ)に結合できる。種々のペプチドリンカーは当分野で周知であり、提供する方法において用いることができる。ペプチドリンカーは一連のグリシン残基(Ｇｌｙ)またはセリン(Ｓｅｒ)残基を含み得る。ポリペチドリンカーの例は、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ、(ＧｌｙｍＳｅｒ)ｎまたは(ＳｅｒｍＧｌｙ)ｎ(ここで、ｍは１〜６、一般に１〜４、典型的に２〜４であり、ｎは１〜３０または１〜１０、典型的に１〜４である)を有し、溶解度を上げるためにグルタミン酸(Ｇｌｕ)またはリシン(Ｌｙｓ)残基がいくつか分散しているペプチドである(例えば、コンジュゲートに使用するリンカーの例を提供する国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／０６６４１参照)。ペプチドリンカーの例は、配列(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２１)、ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ(配列番号１０７４)、ＧＳＧＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号１０７５)、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ(配列番号１０７６)、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＱ(配列番号１０７７)、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ(配列番号１０７８)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号１０７９)、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ(配列番号１０８０)およびＥＳＧＳＶＳＳＥＥＬＡＦＲＳＬＤ(配列番号１０８１)のペプチドを含むが、これらに限定されない。一般に、リンカーペプチドは約１〜５０アミノ酸長である。ここで使用するリンカーはまた細胞内利用能、血清安定性、特異性および溶解度を増加でき、または柔軟性を増加でき、または立体障害を軽減する。結合部分は、例えば、Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883, Whitlow et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995およびNewton et al., (1996) Biochemistry 35:545-553に記載されている。他の適切なペプチドリンカーは、引用により本明細書に包含させる米国特許番号４,７５１,１８０または４,９３５,２３３に記載のものを含む。
２. ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体
ここに提供されるのは、ヒトまたはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、知られた抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれか、例えば上記セクション１に提供される修飾重鎖および／または修飾軽鎖を含む修飾抗ＥＧＦＲのいずれかをヒト化できる。ヒト化の方法は当業者に周知である。抗体のヒト化は、マウスまたは他の非ヒト抗体をヒト抗体に進化させるために使用できる。得られた抗体はヒト配列が増加しており、マウスまたは非ヒト抗体配列が減少しているかまたはこれを含まないが、出発抗体と同等の結合親和性および特異性を維持する。
非ヒトまたはヒト抗体を操作またはヒト化する方法は当分野で周知である。一般に、ヒト化または操作された抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類または他の哺乳動物であるが、しかしこれらに限定されない非ヒトである、源由来の１個以上のアミノ酸残基を有する。ヒトアミノ酸残基はそれらに移入され、それゆえに、しばしば“移入”残基と呼ばれ、これは、典型的に既知ヒト配列からの“移入”可変、定常または他のドメインから取る。既知ヒトＩｇ配列は、例えば、ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; atcc.org/phage/hdb.html; sciquest.com/; www.abcam.com/; antibodyresource.com/onlinecomp.html; public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html. immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; m.ehime-u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html; biodesign.com/table.asp; icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; isac-net.org/sites_geo.html; aximt1.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/links1.html; recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwvu.edu/; mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; jerini.de/fr_products.htm; patents.ibm.con/ibm.html. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)に開示されている。
このような移入された配列は、免疫原性を低下するためにまたは結合、親和性、オン速度、オフ速度、アビディティ、特異性、半減期または当分野で知られる他の適切な特徴を減少、増加または修飾するために使用できる。一般に非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の一部または全ては維持されるが、非ヒト配列の可変領域および定常領域はヒトまたは他のアミノ酸に置き換わる。抗体はまた所望により抗原への高親和性および他の好ましい生物学的特性を維持しながらヒト化もできる。この目的を達成するために、ヒト化抗体は、所望により、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析過程により製造してよい。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者は熟知している。選択した、候補免疫グロブリン配列の起こりそうな三次元立体配座構造を説明し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の役割の可能性の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基を、所望の抗体特徴、例えば標的抗原への親和性の増加を達成するように、コンセンサスおよび移入配列からの選択および組み合わせができる。一般に、ＣＤＲ残基は直接的にそして、ほとんど実質的に抗原結合への影響に関与する。本発明の抗体のヒト化または操作は、あらゆる知られた方法、例えば、Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)、米国特許番号５,７２３,３２３、５,９７６,８６２、５,８２４,５１４、５,８１７,４８３、５,８１４,４７６、５,７６３,１９２、５,７２３,３２３、５,７６６,８８６、５,７１４,３５２、６,２０４,０２３、６,１８０,３７０、５,６９３,７６２、５,５３０,１０１、５,５８５,０８９、５,２２５,５３９；４,８１６,５６７、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３４４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６に記載のものであるが、これらに限定されない方法を使用して実施でき、これらは、その全体を、それらに引用されている引用文献を含み、引用により本明細書に包含させる。
典型的に、一般に一部非ヒトであるものであり、ここでヒト化される、出発参照または親抗体は、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.８のｐＨまたは正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者(例えばｐＨ７.４および／または１mM乳酸)および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約ｐＨ５.６〜６.８のｐＨまたは正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度(例えばｐＨ６.０および／または１６.６mM乳酸)の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む、腫瘍微小環境において存在する条件下、上記のとおり、１.０を越える、例えば一般に少なくとも２.０、３.０、４.０、５.０、６.０、７.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、５０.０またはそれ以上の結合活性比を有する。このような抗体の例は、配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４〜１１１９、１１２４〜１１３１に示す可変重鎖または配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４〜１１１９、１１２４〜１１３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列；および配列番号４または１０に示す可変軽鎖を含むものである。
例えば、抗体ヒト化は、例えば、個々のヒトフレームワークのプールにフレーム内で融合したヒト化すべき標的抗体の６個のＣＤＲを含むコンビナトリアルライブラリーの合成(例えば上記抗体のいずれか)により、実施できる。例えば、ＣＤＲは、配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４〜１１１９、１１２４〜１１３１のいずれかに示すＣＤＲＨ１(アミノ酸残基２６〜３５、ＡｂＭ定義に従いまたはアミノ酸残基３１〜３５、Kabat定義に従う)、ＣＤＲＨ２(アミノ酸残基５０〜６５)またはＣＤＲＨ３(アミノ酸残基９５−１０２)のいずれかの１個以上に由来してよくおよび／または配列番号４または１０に示すＣＤＲＬ１(アミノ酸残基２４〜３４)、ＣＤＲＬ２(アミノ酸残基５０〜５６)またはＣＤＲＬ３(アミノ酸残基８９〜９７)のいずれかの１個以上に由来してよい。全ての知られた重鎖および軽鎖ヒト生殖系列遺伝子を代表する遺伝子を含むヒトフレームワークライブラリーを利用できる。得られたコンビナトリアルライブラリーを、続いて、目的の抗原への結合についてスクリーニングできる。この手法は、親抗体への結合活性の維持の点で、完全にヒトフレームワークの最も好ましい組み合わせの選択を可能にする。ヒト化抗体を、続いて、さらに多様な技術により最適化できる。
当業者がヒト化を行うために成し得るアミノ酸交換または置換の数は、上記のものを含む多くの因子による。一般に言って、抗ＥＧＦＲ抗体、フラグメントまたは変異体のアミノ酸交換(置換)、挿入または欠失の数は、ここに特定するとおり、４０個、３０個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個を超えず、例えば１〜３０個またはその中の任意の範囲または値である。
機能に必須の抗ＥＧＦＲ抗体におけるアミノ酸は、当分野で知られる方法、例えば部位特異的変異誘発またはアラニン走査変異誘発により決定できる(例えば、Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989))。後記の方法は、一アラニン変異を、分子における全残基に導入する。得られた変異体分子を、次いで、ここに記載されている方法のいずれかを使用するＥＧＦＲへの結合のような、しかしこれに限定されない生物学的活性について試験する。抗体結合に重要な部位も、構造的分析、例えば結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識により同定できる(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992))。
ここで提供されるヒト化クローンは、その最も近いヒトＶＨ遺伝子断片生殖系列配列に少なくとも５６％配列同一性、例えば少なくとも５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％またはそれ以上の配列同一性；およびその最も近いヒトＶＬ遺伝子断片生殖系列配列に少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％またはそれ以上の配列同一性を示すものを含む。ヒト生殖系列断片の配列は知られ、当業者に入手可能である。例えば、遺伝子断片配列は既知データベース、例えば、National Center for Biotechnology Information (NCBI), the international ImMunoGeneTics information system (登録商標)(ＩＭＧＴ)、KabatデータベースおよびTomlinson's VBaseデータベースから入手可能である(Lefranc (2003) Nucleic Acids Res., 31:307-310; Martin et al., Bioinformatics Tools for Antibody Engineering in Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH (2007), pp. 104-107参照；公開国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１０／０５４００７も参照)。さらに、最も近い生殖系列配列を検索できるデータベース、例えばＩｇ配列のＶ(可変)領域を分析するために設計されたNational Center for Biotechnology InformationからのIgBlast(NCBI; www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)が利用可能である。このような検索の実施に際し、クエリー配列はＶ遺伝子断片のある部分を含まなければならない(例えば可変重鎖の残基１〜９７；可変軽鎖の残基１〜９５)。
一例において、ここに提供されるヒト化クローンは、配列番号１０６２に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖を有する、Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(ＤＰ)と命名された抗ＥＧＦＲ抗体に由来する。他の例において、ここに提供されるヒト化クローンは、配列番号１１２５に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖を有するＴ３０Ｆ／Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(ＦＤＰ)と命名された抗ＥＧＦＲ抗体に由来する。このようなヒト化クローンの非限定的例は表８に示す。表８〜１０は、各クローンの可変重鎖および軽鎖の配列番号(ＳＥＱ)を示す。表９および１０もまた親セツキシマブの可変配列およびＩＧＨＶ３−３３(ＶＨ)およびＩＧＫＶ６−２１(ＶＬ)と命名されるその最も近いヒトＶ領域生殖系列配列に対する、ヒト化クローンの配列同一性を要約する(例えばNagdelaine-Beuzelin et al. (2007) Critical Reviews in Oncology/Hematology (2007) 64:210-225参照)。IgBlastを使用して同定した各クローンの最も近い生殖系列配列も太字で示す。
それゆえに、ここに提供されるのは、次に示すアミノ酸の配列を有する可変重鎖および軽鎖を含む、抗ＥＧＦＲ抗体である：
配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１３８に示す可変軽鎖または配列番号１１３８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１３９に示す可変軽鎖または配列番号１１３９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３５に示す可変重鎖または配列番号１１３５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１３８に示す可変軽鎖または配列番号１１３８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４０に示す可変軽鎖または配列番号１１４０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４１に示す可変軽鎖または配列番号１１４１に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４２に示す可変軽鎖または配列番号１１４２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３５に示す可変重鎖または配列番号１１３５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４２に示す可変軽鎖または配列番号１１４２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３４に示す可変重鎖または配列番号１１３４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４３に示す可変軽鎖または配列番号１１４３に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３６に示す可変重鎖または配列番号１１３６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４２に示す可変軽鎖または配列番号１１４２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３７に示す可変重鎖または配列番号１１３７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４４に示す可変軽鎖または配列番号１１４４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３６に示す可変重鎖または配列番号１１３６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４４に示す可変軽鎖または配列番号１１４４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３７に示す可変重鎖または配列番号１１３７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４５に示す可変軽鎖または配列番号１１４５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１３６に示す可変重鎖または配列番号１１３６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１４５に示す可変軽鎖または配列番号１１４５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５３に示す可変軽鎖または配列番号１１５３に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４７に示す可変重鎖または配列番号１１４７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５３に示す可変軽鎖または配列番号１１５３に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５４に示す可変軽鎖または配列番号１１５４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５４に示す可変軽鎖または配列番号１１５４に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５５に示す可変軽鎖または配列番号１１５５に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１５１に示す可変重鎖または配列番号１１５１に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５６に示す可変軽鎖または配列番号１１５６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１５２に示す可変重鎖または配列番号１１５２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１５２に示す可変重鎖または配列番号１１５２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４８に示す可変重鎖または配列番号１１４８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４９に示す可変重鎖または配列番号１１４９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１５０に示す可変重鎖または配列番号１１５０に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５８に示す可変軽鎖または配列番号１１５８に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１５２に示す可変重鎖または配列番号１１５２に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５９に示す可変軽鎖または配列番号１１５９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５９に示す可変軽鎖または配列番号１１５９に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；
配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１５７に示す可変軽鎖または配列番号１１５７に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列；ａｎｄ
配列番号１１４６に示す可変重鎖または配列番号１１４６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列および配列番号１１８６に示す可変軽鎖または配列番号１１８６に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列。
上記抗ＥＧＦＲ抗体のいずれも、さらに重鎖定常領域または軽鎖定常領域またはその一部を含み得る。定常領域は免疫グロブリンタイプのいずれか(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、クラス(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブクラス(例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ)のいずれかであり得る。具体例において、ここに提供する抗体は、さらにＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４からの他のサブタイプからの定常領域を含む、完全長抗体であり得る。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブのカッパ軽鎖定常領域(配列番号１０７１に示す)またはセツキシマブのＩｇＧ１重鎖定常領域(配列番号１０６９に示す)を含む、完全長ＩｇＧ１抗体であり得る。重鎖定常領域はまた、Ｉｇクラス、例えばＩｇＧ２(配列番号２３に示す)、ＩｇＧ３(配列番号２４に示す)またはＩｇＧ４(配列番号２５に示す)からの、配列番号２２に示すヒトＩｇＧ１重鎖であってよくまたは配列番号２６、２７または１０７０に示す修飾ＩｇＧ１重鎖定常領域であってよい。軽鎖定常領域はまたヒトカッパ軽鎖(配列番号１０７２に示す)またはヒトラムダ軽鎖(配列番号１０７３に示す)であり得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体はまた、完全長抗体の完全配列未満を含むが、完全長抗体の特異的結合能の少なくとも一部、例えば重鎖および軽鎖の可変部分を保持する完全長抗体の誘導体である、抗体フラグメントを含む。抗体フラグメントはまた、親抗体の結合親和性を保持するために、抗体フレームワーク内に導入された抗体の抗原結合部分(例えば、キメラ抗体)を含み得る。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントおよび修飾フラグメントを含む他のフラグメントを含むが、これらに限定されない(例えば、Methods in Molecular Biology, Vol. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov参照)。抗体フラグメント、例えばジスルフィド架橋により互いに結合した複数鎖を含んでよく、組み換え的に製造できる。抗体フラグメントは、２個以上のドメインを結合するための合成リンカー、例えばペプチドリンカーを含み得る。抗原結合フラグメントの製造方法は当分野で周知であり、ここに提供する抗体のいずれかの修飾に使用できる。抗体分子のフラグメントは、例えば、酵素開裂によるように、製造できる。例えば、パパインでのプロテアーゼ開裂により、重鎖定常領域、Ｆｃドメインの二量体が開裂されて、２個のＦａｂ領域を形成する(すなわち可変領域含有部分)。
一本鎖抗体は、特異的抗体の重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)の連結により組み換え的に操作できる。可変領域のための特定の核酸配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)および他の組み換え核酸テクノロジーによるような、標準的分子生物学方法によりクローン化できる。ｓｃＦｖｓの製造方法は、例えば、Whitlow and Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Pack et al. (1993) Bio/Technology 11:1271-77；および米国特許番号４,９４６,７７８、５,８４０,３００、５,６６７,９８８、５,６５８,７２７、５,２５８,４９８)により記載されている。
上記抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメント、あらゆる抗ＥＧＦＲ抗体の修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗原結合フラグメントを含むここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.８のｐＨまたは正確にまたは約０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む非腫瘍微小環境において存在する条件下と比較して、正確にまたは約ｐＨ５.６〜６.８のｐＨまたは正確にまたは約５mM〜２０mMの乳酸濃度の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質(例えば２０％〜５０％ヒト血清)を含む腫瘍微小環境において存在する条件下、高い結合活性で、ＥＧＦＲ(特にヒトＥＧＦＲ)に結合する。非腫瘍微小環境における条件下と比較して、腫瘍微小環境における条件下での高い結合活性は、一般にタンパク質濃度腫瘍微小環境における条件下および非腫瘍微小環境における条件下が実質的に同一または同一である条件下で存在する。具体例において、活性比は、少なくともまたは２.０を超え、一般に３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上である。
上記抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれも、特に非ヒト化親抗体と比較して、哺乳動物細胞において製造するとき顕著な生産性を生じる。例えば、上記抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかをコードする核酸を含む(例えば表８に示す重鎖および軽鎖をコードする核酸を含む哺乳動物宿主細胞)は、少なくとも正確にまたは少なくとも約または少なくとも１mg／mL、１.５mg／mL、２.０mg／mL、２.５mg／mL、３.０mg／mL、３.５mg／mL、４.０mg／mL、４.５mg／mL、５.０mg／mL、５.５mg／mL、６.０mg／mL、６.５mg／mL、７.０mg／mL、８.０mg／mL、９.０mg／mL、１０.０mg／mLまたはそれ以上である濃度で、抗体の発現をする。
３. 付加的修飾
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のいずれも、１個以上の付加的修飾を含み得る。修飾(例えばアミノ酸置換)は、重鎖または軽鎖の可変領域または定常領域においてであり得る。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体に包含し得る付加的修飾の例は、米国特許番号７,６５７,３８０、７,９３０,１０７、７,０６０,８０８、７,７２３,４８４、米国特許公開番号２０１１０１４８２２、２００５１４２１３３、２０１１１１７１１０、国際特許公開番号ＷＯ２０１２００３９９５、ＷＯ２０１００８０４６３、ＷＯ２０１２０２００５９、ＷＯ２００８１５２５３７およびLippow et al. (2007) Nat Biotechnol. 25(10):1171-1176により記載のものを含むが、これらに限定されない。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかに包含できる、当分野で記載する例示的アミノ酸修飾の非限定的例は、
配列番号４に示すアミノ酸の配列における、１位のアスパラギン酸(Ｄ)のグルタミン酸(Ｅ)での置換、Ｄ１Ｃ、Ｉ２Ｔ、Ｉ２Ｃ、Ｌ３Ｖ、Ｌ３Ｔ、Ｌ３Ｃ、Ｌ４Ｃ、Ｔ５Ｃ、Ｑ６Ｃ、Ｓ７Ｃ、Ｐ８Ｃ、Ｖ９Ｃ、Ｖ９Ａ、Ｖ９Ｄ、Ｖ９Ｇ、Ｖ９Ｐ、Ｖ９Ｓ、Ｉ１０Ｔ、Ｉ１０Ｓ、Ｉ１０Ｆ、Ｉ１０Ｃ、Ｌ１１Ｑ、Ｌ１１Ｃ、Ｓ１２Ａ、Ｓ１２Ｃ、Ｖ１３Ｌ、Ｖ１３Ｍ、Ｖ１３Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｖ１３Ｃ、Ｓ１４Ｔ、Ｓ１４Ｃ、Ｐ１５Ｖ、Ｐ１５Ｌ、Ｐ１５Ｃ、Ｇ１６Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｅ１７Ｄ、Ｅ１７Ｋ、Ｅ１７Ｃ、Ｒ１８Ｖ、Ｒ１８Ｋ、Ｒ１８Ｃ、Ｖ１９Ａ、Ｖ１９Ｔ、Ｖ１９Ｃ、Ｓ２０Ｔ、Ｓ２０Ｃ、Ｓ２０Ａ、Ｆ２１Ｉ、Ｆ２１Ｌ、Ｆ２１Ｃ、Ｓ２２Ｔ、Ｓ２２Ｃ、Ｒ２４Ｐ、Ａ２５Ｖ、Ａ２５Ｓ、Ａ２５Ｉ、Ａ２５Ｐ、Ａ２５Ｔ、Ａ２５Ｙ、Ａ２５Ｃ、Ａ２５Ｆ、Ａ２５Ｍ、Ａ２５Ｌ、Ａ２５Ｗ、Ｓ２６Ｄ、Ｑ２７Ｗ、Ｑ２７Ｅ、Ｑ２７Ｆ、Ｑ２７Ｙ、Ｑ２７Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｓ２８Ｒ、Ｓ２８Ｆ、Ｇ３０Ｙ、Ｇ３０Ｃ、Ｇ３０Ｈ、Ｇ３０Ｋ、Ｇ３０Ｑ、Ｇ３０Ｒ、Ｇ３０Ｗ、Ｇ３０Ｆ、Ｇ３０Ｔ、Ｇ３０Ｍ、Ｇ３０Ｓ、Ｇ３０Ａ、Ｔ３１Ｅ、Ｔ３１Ｖ、Ｔ３１Ｄ、Ｔ３１Ｒ、Ｎ３２Ｈ、Ｉ３３Ｌ、Ｈ３４Ｃ、Ｑ３８Ｋ、Ｒ３９Ｋ、Ｔ４０Ｐ、Ｔ４０Ｓ、Ｎ４１Ｇ、Ｎ４１Ｄ、Ｇ４２Ｑ、Ｇ４２Ｋ、Ｇ４２Ｅ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｐ、Ｒ４５Ｋ、Ｋ４９Ｙ、Ｋ４９Ｆ、Ｙ５０Ｇ、Ｓ５３Ｖ、Ｓ６０Ｄ、Ｓ６０Ａ、Ｇ６４Ｓ、Ｇ６４Ａ、Ｄ７０Ｅ、Ｄ７０Ｖ、Ｆ７１Ｙ、Ｓ７４Ｔ、Ｎ７６Ｓ、Ｎ７６Ｔ、Ｓ７７Ｒ、Ｓ７７Ｇ、Ｖ７８Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｅ８１Ａ、Ｉ８３Ｆ、Ｉ８３Ｓ、Ｉ８３Ｖ、Ｉ８３Ａ、Ｄ８５Ｖ、Ｄ８５Ｔ、Ｄ８５Ｉ、Ｄ８５Ｍ、Ｙ８７Ｓ、Ｑ８９Ｃ、Ｑ８９Ｈ、Ｑ９０Ｃ、Ｎ９１Ｃ、Ｎ９１Ｑ、Ｎ９１Ｌ、Ｎ９２Ｃ、Ｎ９２Ｌ、Ｎ９２Ｒ Ｎ９２Ｋ、Ｎ９２Ｍ、Ｎ９２Ｙ、Ｎ９２Ｈ、Ｎ９２Ｅ、Ｎ９２Ｆ、Ｎ９３Ａ、Ｎ９３Ｄ、Ｎ９３Ｅ、Ｎ９３Ｖ、Ｎ９３Ｋ、Ｎ９３Ｃ、Ｗ９４Ｆ、Ｗ９４Ｙ、Ｐ９５Ｃ、Ｔ９６Ｃ、Ｔ９６Ｌ、Ｔ９６Ｅ、Ｔ９７Ｃ、Ｔ９７Ａ、Ｔ９７Ｄ、Ｔ９７Ｅ、Ｔ９７Ｐ、Ｔ９７Ｋ、Ｔ９７Ｎ、Ｔ９７Ｑ、Ｔ９７Ｉ、Ｔ９７Ｇ、Ｔ９７Ｌ、Ｔ９７Ｈ、Ｔ９７Ｒ、Ｔ９７Ｓ、Ｇ９９Ａ、Ａ１００Ｇ、Ａ１００Ｑ、Ｋ１０３Ｔ、Ｌ１０４ＶおよびＬ１０６Ｉに対応する位置での可変軽鎖(ＶＬ)におけるアミノ酸交換(置換)を含む変異体；
配列番号３に示すアミノ酸の配列における、１位のグルタミン(Ｑ)のグルタミン酸(Ｅ)での置換、Ｑ１Ｃ、Ｖ２Ｃ、Ｑ３Ｔ、Ｑ３Ｃ、Ｌ４Ｃ、Ｋ５Ｑ、Ｋ５Ｖ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ｃ、Ｑ６Ｅ、Ｑ６Ｃ、Ｓ７Ｃ、Ｇ８Ｃ、Ｐ９Ａ、Ｐ９Ｇ、Ｐ９Ｃ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１０Ｃ、Ｌ１１Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｑ１３Ｋ、Ｑ１３Ｒ、Ｑ１３Ｃ、Ｐ１４Ｃ、Ｓ１５Ｇ、Ｓ１５Ｔ、Ｓ１５Ｃ、Ｑ１６Ｇ、Ｑ１６Ｒ、Ｑ１６Ｅ、Ｑ１６Ｃ、Ｓ１７Ｔ、Ｓ１７Ｃ、Ｌ１８Ｃ、Ｓ１９Ｋ、Ｓ１９Ｒ、Ｓ１９Ｔ、Ｓ１９Ｃ、Ｉ２０Ｌ、Ｉ２０Ｃ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２１Ｃ、Ｔ２３Ａ、Ｔ２３Ｋ、Ｔ２３Ｃ、Ｖ２４Ａ、Ｖ２４Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｆ２７Ｇ、Ｓ２８Ｎ、Ｓ２８Ｔ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ、Ｔ３０Ｋ、Ｎ３１Ｖ、Ｎ３１Ｄ、Ｎ３１Ｉ、Ｎ３１Ｔ、Ｎ３２Ｓ、Ｙ３２Ｒ、Ｙ３２Ｗ、Ｇ３３Ａ、Ｇ３３Ｄ、Ｇ３３Ｅ、Ｇ３３Ｙ、Ｖ３４Ｌ、Ｖ３４Ｎ、Ｖ３４Ｅ、Ｖ３４Ｑ、Ｖ３４Ｓ、Ｖ３４Ｗ、Ｈ３５Ｓ、Ｖ３７Ｉ、Ｓ４０Ａ、Ｓ４０Ｐ、Ｐ４１Ｔ、Ｇ４４Ａ、Ｌ４８Ｖ、Ｌ４８Ｉ、Ｇ４９Ｓ、Ｇ４９Ａ、Ｖ５０Ｌ、Ｖ５０Ｑ、Ｖ５０Ｅ、Ｖ５０Ｉ、Ｖ５０Ｙ、Ｖ５０Ｎ、Ｉ５１Ｇ、Ｉ５１Ｍ、Ｉ５１Ｓ、Ｉ５１Ｑ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｃ、Ｉ５１Ｖ、Ｗ５２Ｆ、Ｗ５２Ｙ、Ｗ５２Ｇ、Ｗ５２Ｔ、Ｓ５３Ｑ、Ｓ５３Ｔ、Ｓ５３Ｎ、Ｓ５３Ｙ、Ｇ５４Ａ、Ｇ５４Ｖ、Ｇ５４Ｌ、Ｇ５４Ｉ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５５Ｄ、Ｇ５５Ａ、Ｇ５５Ｅ、Ｇ５５Ｈ、Ｇ５５Ｆ、Ｎ５６Ａ、Ｎ５６Ｇ、Ｎ５６Ｓ、Ｎ５６Ｔ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｄ、Ｔ５７Ｇ、Ｔ５７Ｓ、Ｔ５７Ｅ、Ｔ５７Ｐ、Ｄ５８Ｙ、Ｄ５８Ｎ、Ｙ５９Ａ、Ｙ５９Ｃ、Ｙ５９Ｅ、Ｙ５９Ｆ、Ｙ５９Ｇ、Ｙ５９Ｓ、Ｙ５９Ｗ、Ｔ５９Ｈ、Ｙ５９Ｐ、Ｙ５９Ｑ、Ｎ６０Ｄ、Ｎ６０Ａ、Ｔ６１Ｅ、Ｔ６１Ｐ、Ｐ６２Ｓ、Ｆ６３Ｌ、Ｆ６３Ｖ、Ｔ６４Ｋ、Ｔ６４Ｅ、Ｔ６４Ａ、Ｔ６４Ｎ、Ｔ６４Ｄ、Ｓ６５Ｇ、Ｌ６７Ｆ、Ｌ６７Ｖ、Ｓ６８Ｔ、Ｎ７０Ｓ、Ｎ７０Ｔ、Ｋ７１Ｖ、Ｄ７２Ｅ、Ｎ７３Ｔ、Ｓ７４Ａ、Ｓ７６Ｎ、Ｑ７７Ｔ、Ｑ７７Ｓ、Ｖ７８Ｌ、Ｖ７８Ｆ、Ｖ７８Ａ、Ｆ７９Ｙ、Ｆ７９Ｓ、Ｆ７９Ｖ、Ｆ８０Ｌ、Ｆ８０Ｍ、Ｋ８１Ｑ、Ｋ８１Ｔ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８２Ｌ、Ｎ８３Ｔ、Ｎ８３Ｓ、Ｓ８４Ｎ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｖ、Ｑ８６Ｒ、Ｑ８６Ｄ、Ｑ８６Ｔ、Ｓ８７Ａ、Ｓ８７Ｐ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｉ９２Ｔ、Ｉ９２Ｖ、Ａ９６Ｃ、Ｒ９７Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｌ９９Ｃ、Ｌ９９Ｅ、Ｔ１００Ｄ、Ｔ１００Ｃ、Ｔ１００Ａ、Ｙ１０１Ｃ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０１Ａ、Ｙ１０２Ｃ、Ｙ１０２Ｆ、Ｙ１０２Ａ、Ｙ１０２Ｗ、Ｄ１０３Ｅ、Ｄ１０３Ｐ、Ｄ１０３Ｃ、Ｙ１０４Ｃ、Ｅ１０５Ｃ、Ｅ１０５Ｎ、Ｅ１０５Ｄ、Ｅ１０５Ｙ、Ｆ１０６Ｃ、Ｆ１０６Ｄ、Ｆ１０６Ｙ、Ａ１０７Ｃ、Ａ１０７Ｄ、Ｙ１０８ＣおよびＹ１０８Ｆに対応する位置での可変重鎖(ＶＨ)におけるアミノ酸交換(置換)を含む変異体；および
ＥＵインデックスナンバリングに従い、２３０位のプロリン(Ｐ)のアラニン(Ａ)での置換、Ｅ２３３Ｄ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｔ、Ｓ２６７Ｈ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｎ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｅ２６９Ｔ、Ｅ２６９Ｌ、Ｅ２６９Ｎ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｔ、Ｄ２７０Ｈ、Ｅ２７２Ｓ、Ｅ２７２Ｋ、Ｅ２７２Ｉ、Ｅ２７２Ｙ、Ｖ２７３Ｉ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｓ、Ｎ２７６Ｅ、Ｎ２７６Ｒ、Ｎ２７６Ｌ、Ｎ２７６Ｙ、Ｙ２７８Ｔ、Ｙ２７８Ｅ、Ｙ２７８Ｋ、Ｙ２７８Ｗ、Ｅ２８３Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｖ３０２Ｉ、Ｗ３１３Ｆ、Ｅ３１８Ｒ、Ｋ３２０Ｔ、Ｋ３２０Ｄ、Ｋ３２０Ｉ、Ｋ３２２Ｔ、Ｋ３２２Ｈ、Ｖ３２３Ｉ、Ｓ３２４Ｔ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｒ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｓ３２４Ｌ、Ｓ３２４Ｙ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｋ３２６Ｌ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ａ３２７Ｄ、Ａ３２７Ｔ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｍ、Ｐ３３１Ｖ、Ｐ３３１Ｈ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｅ３３３Ｔ、Ｅ３３３Ｈ、Ｅ３３３Ｉ、Ｅ３３３Ｙ、Ｋ３３４Ｉ、Ｋ３３４Ｔ、Ｋ３３４Ｆ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｙ、Ｄ２２１Ｋ、Ｄ２２１Ｙ、Ｋ２２２Ｅ、Ｋ２２２Ｙ、Ｔ２２３Ｅ、Ｔ２２３Ｋ、Ｈ２２４Ｅ、Ｈ２２４Ｙ、Ｔ２２５Ｅ、Ｔ２２５Ｅ、Ｔ２２５Ｋ、Ｔ２２５Ｗ、Ｐ２２７Ｅ、Ｐ２２７Ｋ、Ｐ２２７Ｙ、Ｐ２２７Ｇ、Ｐ２２８Ｅ、Ｐ２２８Ｋ、Ｐ２２８Ｙ、Ｐ２２８Ｇ、Ｐ２３０Ｅ、Ｐ２３０Ｙ、Ｐ２３０Ｇ、Ａ２３１Ｅ、Ａ２３１Ｋ、Ａ２３１Ｙ、Ａ２３１Ｐ、Ａ２３１Ｇ、Ｐ２３２Ｅ、Ｐ２３２Ｋ、Ｐ２３２Ｙ、Ｐ２３２Ｇ、Ｅ２３３Ｎ、Ｅ２３３Ｑ、Ｅ２３３Ｋ、Ｅ２３３Ｒ、Ｅ２３３Ｓ、Ｅ２３３Ｔ、Ｅ２３３Ｈ、Ｅ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｖ、Ｅ２３３Ｌ、Ｅ２３３Ｉ、Ｅ２３３Ｆ、Ｅ２３３Ｍ、Ｅ２３３Ｙ、Ｅ２３３Ｗ、Ｅ２３３Ｇ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｓ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｍ、Ｌ２３４Ｗ、Ｌ２３４Ｐ、Ｌ２３４Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２３５Ｐ、Ｌ２３５Ｇ、Ｇ２３６Ｄ、Ｇ２３６Ｅ、Ｇ２３６Ｎ、Ｇ２３６Ｑ、Ｇ２３６Ｋ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ｓ、Ｇ２３６Ｔ、Ｇ２３６Ｈ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｖ、Ｇ２３６Ｌ、Ｇ２３６Ｉ、Ｇ２３６Ｆ、Ｇ２３６Ｍ、Ｇ２３６Ｙ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｐ、Ｇ２３７Ｄ、Ｇ２３７Ｅ、Ｇ２３７Ｎ、Ｇ２３７Ｑ、Ｇ２３７Ｋ、Ｇ２３７Ｒ、Ｇ２３７Ｓ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｈ、Ｇ２３７Ｖ、Ｇ２３７Ｌ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｆ、Ｇ２３７Ｍ、Ｇ２３７Ｙ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｐ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２３８Ｅ、Ｐ２３８Ｎ、Ｐ２３８Ｑ、Ｐ２３８Ｋ、Ｐ２３８Ｒ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ｔ、Ｐ２３８Ｈ、Ｐ２３８Ｖ、Ｐ２３８Ｌ、Ｐ２３８Ｉ、Ｐ２３８Ｆ、Ｐ２３８Ｍ、Ｐ２３８Ｙ、Ｐ２３８Ｗ、Ｐ２３８Ｇ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｋ、Ｓ２３９Ｒ、Ｓ２３９Ｖ、Ｓ２３９Ｌ、Ｓ２３９Ｉ、Ｓ２３９Ｍ、Ｓ２３９Ｗ、Ｓ２３９Ｐ、Ｓ２３９Ｇ、Ｆ２４１Ｄ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４３Ｅ、Ｋ２４６Ｄ、Ｋ２４６Ｅ、Ｋ２４６Ｈ、Ｋ２４６Ｙ、Ｄ２４９Ｑ、Ｄ２４９Ｈ、Ｄ２４９Ｙ、Ｒ２５５Ｅ、Ｒ２５５Ｙ、Ｅ２５８Ｓ、Ｅ２５８Ｈ、Ｅ２５８Ｙ、Ｔ２６０Ｄ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｙ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６２Ｆ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４Ｑ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｇ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｋ、Ｄ２６５Ｒ、Ｄ２６５Ｓ、Ｄ２６５Ｔ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｍ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｗ、Ｄ２６５Ｐ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｋ、Ｓ２６７Ｒ、Ｓ２６７Ｖ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｉ、Ｓ２６７Ｆ、Ｓ２６７Ｍ、Ｓ２６７Ｙ、Ｓ２６７Ｗ、Ｓ２６７Ｐ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｋ、Ｈ２６８Ｒ、Ｈ２６８Ｔ、Ｈ２６８Ｖ、Ｈ２６８Ｌ、Ｈ２６８Ｉ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ｍ、Ｈ２６８Ｗ、Ｈ２６８Ｐ、Ｈ２６８Ｇ、Ｅ２６９Ｋ、Ｅ２６９Ｓ、Ｅ２６９Ｖ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｍ、Ｅ２６９Ｗ、Ｅ２６９Ｐ、Ｅ２６９Ｇ、Ｄ２７０Ｒ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｌ、Ｄ２７０Ｉ、Ｄ２７０Ｆ、Ｄ２７０Ｍ、Ｄ２７０Ｙ、Ｄ２７０Ｗ、Ｄ２７０Ｐ、Ｄ２７０Ｇ、Ｐ２７１Ｄ、Ｐ２７１Ｅ、Ｐ２７１Ｎ、Ｐ２７１Ｑ、Ｐ２７１Ｋ、Ｐ２７１Ｒ、Ｐ２７１Ｓ、Ｐ２７１Ｔ、Ｐ２７１Ｈ、Ｐ２７１Ａ、Ｐ２７１Ｖ、Ｐ２７１Ｌ、Ｐ２７１Ｉ、Ｐ２７１Ｆ、Ｐ２７１Ｍ、Ｐ２７１Ｙ、Ｐ２７１Ｗ、Ｐ２７１Ｇ、Ｅ２７２Ｄ、Ｅ２７２Ｒ、Ｅ２７２Ｔ、Ｅ２７２Ｈ、Ｅ２７２Ｖ、Ｅ２７２Ｌ、Ｅ２７２Ｆ、Ｅ２７２Ｍ、Ｅ２７２Ｗ、Ｅ２７２Ｐ、Ｅ２７２Ｇ、Ｋ２７４Ｄ、Ｋ２７４Ｎ、Ｋ２７４Ｓ、Ｋ２７４Ｈ、Ｋ２７４Ｖ、Ｋ２７４Ｉ、Ｋ２７４Ｆ、Ｋ２７４Ｍ、Ｋ２７４Ｗ、Ｋ２７４Ｐ、Ｋ２７４Ｇ、Ｆ２７５Ｌ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２７６Ｔ、Ｎ２７６Ｈ、Ｎ２７６Ｖ、Ｎ２７６Ｉ、Ｎ２７６Ｆ、Ｎ２７６Ｍ、Ｎ２７６Ｗ、Ｎ２７６Ｐ、Ｎ２７６Ｇ、Ｙ２７８Ｄ、Ｙ２７８Ｎ、Ｙ２７８Ｑ、Ｙ２７８Ｒ、Ｙ２７８Ｓ、Ｙ２７８Ｈ、Ｙ２７８Ｖ、Ｙ２７８Ｌ、Ｙ２７８Ｉ、Ｙ２７８Ｍ、Ｙ２７８Ｐ、Ｙ２７８Ｇ、Ｄ２８０Ｋ、Ｄ２８０Ｌ、Ｄ２８０Ｗ、Ｄ２８０Ｐ、Ｄ２８０Ｇ、Ｇ２８１Ｄ、Ｇ２８１Ｋ、Ｇ２８１Ｙ、Ｇ２８１Ｐ、Ｖ２８２Ｅ、Ｖ２８２Ｋ、Ｖ２８２Ｙ、Ｖ２８２Ｐ、Ｖ２８２Ｇ、Ｅ２８３Ｋ、Ｅ２８３Ｈ、Ｅ２８３Ｌ、Ｅ２８３Ｙ、Ｅ２８３Ｐ、Ｅ２８３Ｇ、Ｖ２８４Ｅ、Ｖ２８４Ｎ、Ｖ２８４Ｔ、Ｖ２８４Ｌ、Ｖ２８４Ｙ、Ｈ２８５Ｄ、Ｈ２８５Ｅ、Ｈ２８５Ｑ、Ｈ２８５Ｋ、Ｈ２８５Ｙ、Ｈ２８５Ｗ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ２８６Ｙ、Ｎ２８６Ｐ、Ｎ２８６Ｇ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ２８８Ｙ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｗ、Ｐ２９１Ｄ、Ｐ２９１Ｅ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｔ、Ｐ２９１Ｈ、Ｐ２９１Ｉ、Ｐ２９１Ｇ、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｔ、Ｒ２９２Ｙ、Ｅ２９３Ｎ、Ｅ２９３Ｒ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９３Ｈ、Ｅ２９３Ｖ、Ｅ２９３Ｌ、Ｅ２９３Ｉ、Ｅ２９３Ｆ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｙ、Ｅ２９３Ｗ、Ｅ２９３Ｐ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９４Ｋ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｓ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｈ、Ｅ２９４Ｖ、Ｅ２９４Ｌ、Ｅ２９４Ｉ、Ｅ２９４Ｆ、Ｅ２９４Ｍ、Ｅ２９４Ｙ、Ｅ２９４Ｗ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｇ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５Ｅ、Ｑ２９５Ｎ、Ｑ２９５Ｒ、Ｑ２９５Ｓ、Ｑ２９５Ｔ、Ｑ２９５Ｈ、Ｑ２９５Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｍ、Ｑ２９５Ｙ、Ｑ２９５Ｗ、Ｑ２９５Ｐ、Ｑ２９５Ｇ、Ｙ２９６Ｋ、Ｙ２９６Ｒ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｖ、Ｙ２９６Ｍ、Ｙ２９６Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｋ、Ｎ２９７Ｒ、Ｎ２９７Ｔ、Ｎ２９７Ｈ、Ｎ２９７Ｖ、Ｎ２９７Ｌ、Ｎ２９７Ｉ、Ｎ２９７Ｆ、Ｎ２９７Ｍ、Ｎ２９７Ｙ、Ｎ２９７Ｗ、Ｎ２９７Ｐ、Ｎ２９７Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｅ、Ｓ２９８Ｑ、Ｓ２９８Ｋ、Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２９８Ｉ、Ｓ２９８Ｆ、Ｓ２９８Ｍ、Ｓ２９８Ｙ、Ｓ２９８Ｗ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｑ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｗ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｇ、Ｙ３００Ｄ、Ｙ３００Ｅ、Ｙ３００Ｎ、Ｙ３００Ｑ、Ｙ３００Ｋ、Ｙ３００Ｒ、Ｙ３００Ｓ、Ｙ３００Ｔ、Ｙ３００Ｈ、Ｙ３００Ａ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｍ、Ｙ３００Ｗ、Ｙ３００Ｐ、Ｙ３００Ｇ、Ｒ３０１Ｄ、Ｒ３０１Ｅ、Ｒ３０１Ｈ、Ｒ３０１Ｙ、Ｖ３０３Ｄ、Ｖ３０３Ｅ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｄ、Ｓ３０４Ｎ、Ｓ３０４Ｔ、Ｓ３０４Ｈ、Ｓ３０４Ｌ、Ｖ３０５Ｅ、Ｖ３０５Ｔ、Ｖ３０５Ｙ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３１７Ｑ、Ｅ３１８Ｑ、Ｅ３１８Ｈ、Ｅ３１８Ｌ、Ｅ３１８Ｙ、Ｋ３２０Ｎ、Ｋ３２０Ｓ、Ｋ３２０Ｈ、Ｋ３２０Ｖ、Ｋ３２０Ｌ、Ｋ３２０Ｆ、Ｋ３２０Ｙ、Ｋ３２０Ｗ、Ｋ３２０Ｐ、Ｋ３２０Ｇ、Ｋ３２２Ｄ、Ｋ３２２Ｓ、Ｋ３２２Ｖ、Ｋ３２２Ｉ、Ｋ３２２Ｆ、Ｋ３２２Ｙ、Ｋ３２２Ｗ、Ｋ３２２Ｐ、Ｋ３２２Ｇ、Ｓ３２４Ｈ、Ｓ３２４Ｆ、Ｓ３２４Ｍ、Ｓ３２４Ｗ、Ｓ３２４Ｐ、Ｓ３２４Ｇ、Ｎ３２５Ｋ、Ｎ３２５Ｒ、Ｎ３２５Ｓ、Ｎ３２５Ｆ、Ｎ３２５Ｍ、Ｎ３２５Ｙ、Ｎ３２５Ｗ、Ｎ３２５Ｐ、Ｎ３２５Ｇ、Ｋ３２６Ｐ、Ａ３２７Ｅ、Ａ３２７Ｋ、Ａ３２７Ｒ、Ａ３２７Ｈ、Ａ３２７Ｖ、Ａ３２７Ｉ、Ａ３２７Ｆ、Ａ３２７Ｍ、Ａ３２７Ｙ、Ａ３２７Ｗ、Ａ３２７Ｐ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｋ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ３２８Ｓ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｙ、Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｐ、Ｌ３２８Ｇ、Ｐ３２９Ｄ、Ｐ３２９Ｅ、Ｐ３２９Ｎ、Ｐ３２９Ｑ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｒ、Ｐ３２９Ｓ、Ｐ３２９Ｔ、Ｐ３２９Ｈ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３２９Ｌ、Ｐ３２９Ｉ、Ｐ３２９Ｍ、Ｐ３２９Ｙ、Ｐ３２９Ｗ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｅ、Ａ３３０Ｎ、Ａ３３０Ｔ、Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｇ、Ｐ３３１Ｄ、Ｐ３３１Ｑ、Ｐ３３１Ｒ、Ｐ３３１Ｔ、Ｐ３３１Ｌ、Ｐ３３１Ｉ、Ｐ３３１Ｆ、Ｐ３３１Ｍ、Ｐ３３１Ｙ、Ｐ３３１Ｗ、Ｉ３３２Ｋ、Ｉ３３２Ｒ、Ｉ３３２Ｓ、Ｉ３３２Ｖ、Ｉ３３２Ｆ、Ｉ３３２Ｍ、Ｉ３３２Ｗ、Ｉ３３２Ｐ、Ｉ３３２Ｇ、Ｅ３３３Ｌ、Ｅ３３３Ｆ、Ｅ３３３Ｍ、Ｅ３３３Ｐ、Ｋ３３４Ｐ、Ｔ３３５Ｎ、Ｔ３３５Ｓ、Ｔ３３５Ｈ、Ｔ３３５Ｖ、Ｔ３３５Ｌ、Ｔ３３５Ｉ、Ｔ３３５Ｆ、Ｔ３３５Ｍ、Ｔ３３５Ｗ、Ｔ３３５Ｐ、Ｔ３３５Ｇ、Ｉ３３６Ｅ、Ｉ３３６Ｋ、Ｉ３３６Ｙ、Ｓ３３７Ｅ、Ｓ３３７Ｎ、Ｓ３３７Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｓ、Ｋ３２６Ｎ、Ｋ３２６Ｑ、Ｋ３２６Ｄ、Ｋ３２５Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｙ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｅ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｌ、Ｑ２９５Ｋ、Ｅ２９４Ｎ、Ｓ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｄ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｄ２８０Ｑ、Ｄ２８０Ｙ、Ｋ２９０Ｇ、Ｋ２９０Ｔ、Ｋ２９０Ｙ、Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｅ、Ｙ２７８Ｔ、Ｎ２９７Ｄ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｈ、Ｋ３２６Ｔ、Ｌ３２８Ａ、Ｌ３２８Ｈ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２ＮおよびＩ３３２Ｑを含む、例えば、
ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域における、重鎖定常領域におけるアミノ酸交換(置換)を含む変異体を含む。
４. コンジュゲート
またここに提供されるのは、直接的にまたはリンカーを介して１個以上の標的剤と結合した、ここに提供する条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体を含むコンジュゲートである。これらのコンジュゲートは次の抗体(Ａｂ)、(リンカー(Ｌ))ｑ、(標的剤)ｍの要素を含み、式：Ａｂ−(Ｌ)ｑ−(標的剤)ｍ(ここで、ｑは０またはそれ以上であり、ｍは少なくとも１である)で表される。それゆえに、ここで提供されるコンジュゲートは、腫瘍微小環境で条件依存活性または選択的であり、ＥＧＦＲと結合する、ここに提供する抗体に共有結合により結合した、１個以上の標的剤を含む。
それゆえに、これらのコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)または免疫コンジュゲートとも呼ばれ、細胞毒性または細胞増殖抑制剤、すなわち、癌の処置において腫瘍細胞を殺すまたは阻害する薬物の標的化送達のために使用できる。このようなコンジュゲートは、非病的細胞から除かれることが望まれる腫瘍細胞に選択性であり、それにより正常細胞に許容されないレベルの毒性をもたらさない。それゆえに、コンジュゲートは、最大効果と同時に最小毒性かつ低副作用を達成する。それゆえに、このような化合物は、癌および他の疾患または障害の診断または処置のためのここに記載する方法で使用できる。
上記のとおり、標的剤の数は変数ｍにより指定され、ここで、ｍは１またはそれ以上の整数である。標的剤は、ここに提供する抗体に変数ｑで指定される数のリンカーによりコンジュゲートし、ここで、ｑは０または任意の整数である。変数ｑおよびｍは、得られたコンジュゲートが標的細胞、特に、酸性微小環境における腫瘍細胞のＥＧＦＲと相互作用し、標的剤が標的細胞により内部移行するように選択する。典型的に、ｍは１〜８である。ｑは、結合した標的化および標的剤の数および／またはリンカーの機能により、０またはそれ以上であり、ｑは一般に０〜４である。１個を超える標的剤がコンジュゲートに存在するとき、標的剤は同一でも異なってもよい。
標的剤は、直接的にまたは１個以上のリンカーを介して、抗ＥＧＦＲ抗体に共有結合により結合できる。得られたコンジュゲートが、結合した標的剤の内部移行が起こるように、標的細胞のＥＧＦＲと相互作用する限り、コンジュゲートのエレメントの任意の適切な結合が意図される。それゆえに、ここに提供するコンジュゲートは、融合タンパク質として製造でき、化学的に結合できまたは融合タンパク質部分および化学的に結合した部分またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
標的剤はまたリンカーおよび／または抗ＥＧＦＲ抗体とのコンジュゲーションにより適するようにまたはその細胞内活性を高めるために、修飾もできる。例えば、ポリペチド標的剤の場合、このような修飾は、Ｎ末端またはＣ末端またはその近辺へのＣｙｓ残基導入、反応基、例えばチオール基を導入するための誘導体化および標的剤を小胞体に指向させる、好ましくは、標的剤のカルボキシ末端への、ソーティングシグナル、例えば(Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ)ｎ(配列番号１１９０)(ここで、ＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇ、好ましくはＬｙｓであり、ｎは１〜６、好ましくは１〜３である)の付加 (例えば、Seetharam et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17376-17381; and Buchner et al. (1992) Anal. Biochem. 205:263-270) を含むが、これらに限定されない。
他の例において、標的剤は、例えば、好ましい位置でのより予測可能なチオールコンジュゲーションを提供するために１個以上のシステイン残基を除去するために、修飾できる。得られた修飾標的剤の特異性の変更を、そのような変更が望ましくない限り、避けることに注意しなければならない。全ての例において、特定の修飾を経験的に決定できる。
リンカーＬは、共有結合性結合を介して、抗体を標的剤に結合する。リンカーはペプチドまたは非ペプチドであってよく、標的剤の抗ＥＧＦＲ抗体への近接による立体障害を解放または減少するおよび／またはコンジュゲートの他の特性、例えば特異性、毒性、溶解度、血清安定性および／または標的部分の細胞内利用能を増加または変更するおよび／または抗ＥＧＦＲ抗体と標的剤の間の結合の柔軟性を高めるように選択できる。
融合タンパク質が意図されるとき、リンカーを、得られた核酸分子が、腫瘍微小環境において、ＥＧＦＲと結合し、それを発現する細胞により内部移行され、内部移行タンパク質の全てまたは一部が好ましくは細胞質に輸送される融合タンパク質をコードするように、選択する。数個のリンカーが、各リンカーの有利な特性を用いるために結合できることも意図される。このような場合、コンジュゲートのリンカー部分は５０個を超えるアミノ酸残基を含み得る。残基の数は、得られた融合タンパク質が標的細胞のＥＧＦＲと結合し、結合した標的剤を、標的剤を細胞質および／または核を輸送する経路を介して内部移行する限り、重要ではない。
標的剤は、腫瘍細胞の選択集団への標的化送達が望ましい、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、治療部分または他の薬剤であり得る。このような標的剤は、細胞毒性剤、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレアーゼ類、毒素、薬物または他の薬剤を含むが、これらに限定されない。治療的部分は、細胞毒性部分、放射性同位体、化学療法剤、溶菌性ペプチドおよびサイトカインを含むが、これらに限定されない。治療的部分の例は、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；臭化エチジウム；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テニポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒチン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；マイタンシンまたはその類似体もしくは誘導体；オーリスタチンまたはその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体；ドラスタチン１０または１５またはその類似体；イリノテカンまたはその類似体；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリチアマイシンまたはその類似体もしくは誘導体；代謝拮抗剤；アルキル化剤；白金誘導体；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラシェルマイシン(ＣＣ−１０６５)またはその類似体もしくは誘導体；抗生物質；ピロロ[２,ｌ−ｃ][１,４]−ベンゾジアゼピン(ＰＤＢ)；毒素；リボヌクレアーゼ(ＲＮａｓｅ)；ＤＮａｓｅ Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含むが、これらに限定されない。
薬物も、これらの方法において標的剤として使用できる。このような薬物は５−フルオロウラシル、ビンカアルカロイドおよび抗生物質例えばダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンおよびアントラマイシン(ＡＭＣ)、ネオカルチノスタチン(Takahashi et al. (1988) Cancer 61:881-888)およびビンデシン(Rowland et al., (1986) Cancer Immunol Immunother 21(3):183-187)を含む。
抗体−毒素コンジュゲートで使用する毒素は、細菌毒素、例えばジフテリア毒素およびその活性フラグメントおよびハイブリッド分子、植物毒素、例えばリシン毒素(米国特許番号４,７５３,８９４；米国特許番号５,６２９,１９７；米国特許番号４,９５８,００９；米国特許番号４,９５６,４５３)、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン(Mandler et al. (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjug. Chem. 13:786-791)、マイタンシノイド系、例えばＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４(ＥＰ１３９１２１３；Chari (2008) Acc Chem Res 41:98-107; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), and calicheamicin (Damle (2004) Expert Opin Biol Ther 4:1445-1452; Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)を含む。最後に、オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ(ＡＥ)、モノメチルオーリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)およびモノメチルオーリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)、ドラスタチンの合成類似体を使用できる(Doronin et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)。他の毒素は、コレラ毒素、志賀毒素様毒素、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ボウマン・バーク大豆プロテアーゼインヒビター、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ガラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシン毒素を含む。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構により、その細胞毒性および細胞増殖抑制効果を生じ得る。
ａ. 標的剤
標的剤は、腫瘍細胞の選択集団への標的化送達が望ましい、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、治療部分または他の薬剤を含む。このような標的剤は、細胞毒性剤、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレアーゼ類、毒素、薬物または他の薬剤を含むが、これらに限定されない。
ｉ. マイタンシノイド薬物部分
マイタンシノイド薬物部分は、米国特許番号８,１４２,７８４に記載されている。マイタンシン化合物は、微小管タンパク質であるチューブリンの重合の阻害を介して、有糸分裂中の微小管形成を阻害することにより細胞増殖を阻害する(Remillard et al. (1975) Science 189:1002-1005；米国特許番号５,２０８,０２０)。マイタンシンおよびマイタンシノイド系は、高度に細胞毒性であるが、癌治療におけるそれらの臨床的使用は、主として腫瘍への低い選択性に起因する重篤な全身副作用により極めて制限されている。マイタンシンでの治験は、中枢神経系および消化器系に対する重篤な有害作用のために中止されている(Issel et al. (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207)。
マイタンシノイド薬物部分は、(ｉ)発酵または発酵産物の化学的修飾、誘導体化により相対的に製造しやすい、(ii)抗体への非ジスルフィドリンカーを介するコンジュゲーションに適切な官能基で誘導体化しやすい、(iii)血漿中で安定であるおよび(iv)多様な腫瘍細胞株に対して有効であるために、抗体−薬物コンジュゲートにおける魅力的な薬物部分である。
マイタンシノイド薬物部分として使用するのに適するマイタンシン化合物は当分野で周知であり、遺伝子操作技術を使用して製造した、既知方法に従い天然源から単離できる(Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973参照)またはマイタンシノールおよびマイタンシノール類似体は、既知方法に従い合成的に製造できる。
マイタンシノイド薬物部分の例は、修飾芳香環、例えば：Ｃ−１９−デクロロ(米国特許番号４,２５６,７４６)(アンサマイトシンＰ２のリチウムアルミニウムハイドライド還元により製造)；Ｃ−２０−ヒドロキシ(またはＣ−２０−デメチル)＋／−Ｃ−１９−デクロロ(米国特許番号４,３６１,６５０および４,３０７,０１６)(ストレプトマイセス属またはアクチノミセス属を使用するデメチル化またはＬＡＨを使用する脱塩素により製造)；およびＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ(−ＯＣＯＲ)、＋／−デクロロ(米国特許番号４,２９４,７５７)(アシルクロライド類を使用するアシル化により製造)を有するもの；および他の位置に修飾を有するものを含む。
マイタンシノイド薬物部分の例はまた、修飾、例えば：マイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５の反応により製造したＣ−９−ＳＨ(米国特許番号４,４２４,２１９)；Ｃ−１４−アルコキシメチル(デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ)(米国特許番号４,３３１,５９８)；ノカルジア属から製造したＣ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル(ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ)(米国特許番号４,４５０,２５４)；ストレプトマイセス属によるマイタンシノールの変換により製造したＣ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ(米国特許番号４,３６４,８６６)；トレビア・ヌーディフロラ(Trewia nudiflora)から単離されたＣ−１５−メトキシ(米国特許番号４,３１３,９４６および米国特許番号４,３１５,９２９)；ストレプトマイセス属によるマイタンシノールのデメチル化により製造されたＣ−１８−Ｎ−デメチル(米国特許番号４,３６２,６６３および米国特許番号４,３２２,３４８)；およびマイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により製造された４,５−デオキシ(米国特許番号４,３７１,５３３)を有するものを含む。
マイタンシン化合物上の多くの位置が、結合のタイプによって、結合位置として有用であることが知られている。例えば、エステル結合形成のために、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位が全て適切である。
マイタンシノイド薬物部分は、抗ＥＧＦＲ抗体に直接コンジュゲーションによりまたはここに提供するリンカーのいずれかを使用して結合できる。具体例において、細胞毒性または薬物は、ＤＭ１(Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−(３−メルカプト−１−オキソプロピル)−マイタンシン)としても知られるメルタンシンである。メルタンシンは、４−メルカプト吉草酸を介して結合できる。エムタンシンコンジュゲートも、リンカー４−(３−メルカプト−２,５−ジオキソ−１−ピロリジニルメチル)−シクロヘキサンカルボン酸(ＭＣＣを)使用して、ここでの抗体を用いて形成できる。
ii. オーリスタチンおよびドラスタチン薬物部分
オーリスタチンおよびドラスタチンは、公開米国出願番号ＵＳ２０１１／０２１７３２１に記載されている。ドラスタチンおよびオーリスタチンは微小管動態、ＧＴＰ加水分解および核および細胞分裂を妨害することが示されており、(Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)、抗真菌活性を有する(Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)。さらに、オーリスタチンは、極めて強力で、合成され、安定でかつリンカー結合を可能にするために化学的修飾しやすい(Senter (2009) Curr Opin Chem Biol 13:235-244)。
オーリスタチンが合成物であるため、親薬物の特性を顕著に変えるために、複合的構造的修飾を成し得る。例えば、モノメチルオーリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)は、アミノ酸残基フェニルアラニンで終了し、これは、細胞膜透過性を障害する(Doronina et al., (2006) Bioconjug Chem. 17:114-124)。それゆえに、ＭＭＡＦのＡＤＣへのコンジュゲーションは、抗原陽性細胞による選択的薬物取り込みを促進できる(Doronina et al., (2006) Bioconjug Chem. 17:114-124; Doronina et al., (2003) Nat Biotechnol. 21:778-784)。
ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド性薬物部分のＮ(アミノ)末端またはＣ(カルボキシル)末端を介して抗体に結合できる(ＷＯ２００２／０８８１７２)。オーリスタチン具体化の例は、Ｎ末端およびＣ末端に結合したモノメチルオーリスタチン薬物部分ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを含む(Senter et al. (2004) “Proceedings of the American Association for Cancer Research,” Volume 45, Abstract Number 623、２００４年３月２８日発表；米国公開番号２０１１／００２０３４３)。
ドラスタチンまたはオーリスタチンは、抗ＥＧＦＲ抗体に直接コンジュゲーションによりまたはここに提供するリンカーのいずれかを使用して結合できる。具体例において、ドラスタチンまたはオーリスタチンは、バリン−シトルリン(Ｖａｌ−Ｃｉｔ)のようなペプチドリンカーにより、抗ＥＧＦＲ抗体に結合できる。
iii. 細胞毒素部分
本方法および組成物に使用するのに適する細胞毒素は、小分子、例えばＤＮＡ開裂剤および細菌、真菌、植物、昆虫、ヘビおよびクモ毒素を含むが、これらに限定されないタンパク質性細胞毒素を含む。ここに提供されるコンジュゲートへの取り込みが意図される細胞毒素の例のアミノ酸配列を表１１に示す。
(ａ)ＤＮＡ開裂剤
本方法の実施に際して、キメラリガンド−毒素における細胞毒素として包含させるのに適切なＤＮＡ開裂剤の例は、アントラキノン−オリゴピロール−カルボキサミド、ベンゾイミダゾール、レイナマイシン；ジネマイシンＡ；エンジイン；ならびに生物学的に活性なその類似体または誘導体(すなわち、実質的に等価な生物学的活性を有するもの)を含むが、これらに限定されない。既知類似体および誘導体は、例えば、Islam et al., J. Med. Chem. 34 2954-61, 1991; Skibo et al., J. Med. Chem. 37:78-92, 1994; Behroozi et al., Biochemistry 35:1568-74, 1996; Helissey et al., Anticancer Drug Res. 11:527-51, 1996; Unno et al., Chem. Pharm. Bull. 45:125-33, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5:903-19, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5: 883-901, 1997; およびXu et al., Biochemistry 37:1890-7, 1998に開示されている。他の例は、エンジインキノンイミン類(米国特許番号５,６２２,９５８)；２,２ｒ−ビス(２−アミノエチル)−４−４’−ビチアゾール(Lee et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 40:151-7, 1996)；エピリチシン(epilliticine)−サレン銅コンジュゲート(Routier et al., Bioconjug. Chem., 8:789-92, 1997)を含むが、これらに限定されない。
(ｂ)代謝拮抗剤
キメラリガンド−毒素の細胞毒素として包含させるのに有用な代謝拮抗剤の例は、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、メルファラン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、窒素マスタードおよびマイトマイシンｃを含むが、これらに限定されない。
(ｃ)タンパク質性細胞毒素
本方法において使用するキメラリガンド−毒素に取り込むのに有用なタンパク質性細胞毒素の例は、タイプ１およびタイプ２リボソーム不活性化タンパク質(ＲＩＰ)を含むが、これらに限定されない。有用なタイプ１植物ＲＩＰは、ジアンチン３０、ジアンチン３２、リクニン(lychnin)、サポリン１〜９、ヨウシュヤマゴボウ活性化タンパク質(ＰＡＰ)、ＰＡＰ II、ＰＡＰ−Ｒ、ＰＡＰ−Ｓ、ＰＡＰ−Ｃ、マパルミン(mapalmin)、ドデカンドリン、ブリオジン−Ｌ、ブリオジン、コリシン１および２、ルフィン−Ａ、ルフィン−Ｂ、ルフィン−Ｓ、１９Ｋ−タンパク質合成阻害タンパク質(ＰＳＩ)、１５Ｋ−ＰＳＩ、９Ｋ−ＰＳＩ、アルファ−キリロウィン、ベータ−キリロウィン、ゲロニン、モモルジン、モモルジン−II、モモルジン−Ｉｃ、ＭＡＰ−３０、アルファ−モモルカリン、ベータ−モモルカリン、トリコサンチン、ＴＡＰ−２９、トリコキリン；オオムギＲＩＰ；アマＲＩＰ、トリチン、トウモロコシＲＩＰ、アスパリン(Asparin)１および２(Stirpe et al., Bio/Technology 10:405-12, 1992)を含むが、これらに限定されない。有用なタイプ２ＲＩＰは、ボルケンシン、リシン、ニグリン−ｂ、ＣＩＰ−２９、アブリン、モデシン、エブリチン−α、エブリチン−β、エブリチン−γ、ヴィルクミン(vircumin)、ポレクチン(porrectin)、ならびにその生物学的に活性な酵素サブユニットを含むが、これらに限定されない(Stirpe et al., Bio/Technology 10:405-12, 1992; Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994; and Sandvig and Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996)。
(ｄ)細菌毒素
細胞毒素として有用な細菌毒素の例は、志賀毒素および志賀毒素様毒素(すなわち同一活性または構造を有する毒素)、ならびにその触媒サブユニットおよび生物学的に機能的なフラグメントを含むが、これらに限定されない。これらの細菌毒素はまたタイプ２ＲＩＰでもある(Sandvig and Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996; Armstrong, J. Infect. Dis., 171:1042-5, 1995; Kim et al., Microbiol. Immunol. 41:805-8, 1997, and Skinner et al., Microb. Pathog. 24:117-22, 1998)。有用な細菌毒素の付加的例は、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素を含むが、これらに限定されない(Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; and Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994)。毒素酵素サブユニットの切断型および変異体も細胞毒素部分として使用できる(Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994; Mesri et al., J. Biol. Chem. 268:4853-62, 1993; Skinner et al., Microb. Pathog. 24:117-22, 1998；および米国特許番号５,０８２,９２７)。他の標的剤は、コリシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ１−９、クロアシンＤＦ１３および真菌ＲＮａｓｅ、α−サルシンを含む、３４を超えるＲＮａｓｅ毒素の記載されているコリシンファミリーを含むが、これらに限定されない(Ogawa et al. Science 283:2097-100, 1999; Smarda et al., FoliaMicrobiol (Praha) 43:563-82, 1998; Wool et al., Trends Biochem. Sci., 17:266-69, 1992)。
(ｅ)ポルフィリンおよび他の軽活性化毒素
ポルフィリンは、タンパク質に容易に架橋できる周知の光活性化可能毒素である(例えば、米国特許番号５,２５７,９７０；米国特許番号５,２５２,７２０；米国特許番号５,２３８,９４０；米国特許番号５,１９２,７８８；米国特許番号５,１７１,７４９；米国特許番号５,１４９,７０８；米国特許番号５,２０２,３１７；米国特許番号５,２１７,９６６；米国特許番号５,０５３,４２３；米国特許番号５,１０９,０１６；米国特許番号５,０８７,６３６；米国特許番号５,０２８,５９４；米国特許番号５,０９３,３４９；米国特許番号４,９６８,７１５；米国特許番号４,９２０,１４３および国際出願ＷＯ９３／０２１９２参照)。
iv. 標的送達のための核酸
ここに提供するコンジュゲートはまた、核酸の標的細胞への送達に使用できる。核酸は、細胞のゲノムの修飾を意図し、それにより遺伝子治療を行うＤＮＡならびにアンチセンス剤として使用するためのＤＮＡおよびＲＮＡを含む。核酸は、アンチセンス剤としての使用が意図されるアンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイムおよび他のオリゴヌクレオチドを含む。核酸はまたＲＮＡ輸送シグナル、例えばウイルスパッケージング配列も含み得る(例えば、Sullenger et al. (1994) Science 262:1566-1569参照)。核酸はまた無傷遺伝子または遺伝子治療への使用が意図されるタンパク質をコードするＤＮＡ分も含む。
遺伝子治療を行うために細胞に送達され得るＤＮＡ(またはＲＮＡ)は、腫瘍特異的細胞毒性分子、例えば腫瘍壊死因子、ウイルス抗原および細胞を抗癌剤に感受性とする他のタンパク質をコードするＤＮＡおよび欠損遺伝子を置き換えるための嚢胞性線維症と関連する欠損遺伝子(ＣＦＴＲ)のような遺伝子をコードするＤＮＡを含む(例えば、米国出願番号０７／７４５,９００に基づく国際出願ＷＯ９３／０３７０９；およびRiordan et al. (1989) Science 245:1066-1073参照)。
ここに記載するとおり使用するための核酸およびオリゴヌクレオチドは、当業者に知られるあらゆる方法により合成できる(例えば、米国出願番号０７／７２３,４５４に基づくＷＯ９３／０１２８６；米国特許番号５,２１８,０８８；米国特許番号５,１７５,２６９；米国特許番号５,１０９,１２４参照)。アンチセンス剤として使用するためのオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの同定は十分に当分野の技術の範囲内である。遺伝子治療のための標的化送達のための遺伝子をコードするＤＮＡの選択も十分に当分野の技術レベルの範囲内である。例えば、このようなオリゴヌクレオチドの望ましい特性、長さおよび他の特徴は周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、内在性核酸分解酵素による分解に耐えるように設計され、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスロアミデート、ホスフェートエステルおよび他のこのような結合を含むが、これらに限定されない(例えば、Agrawal et al. (1987) Tetrahedron Lett. 28:3539-3542; Miller et al. (1971) J. Am. Chem. Soc. 93:6657-6665; Stec et al. (1985) Tetrahedron Lett. 26:2191-2194; Moody et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:4769-4782; Letsinger et al. (1984) Tetrahedron 40:137-143; Eckstein (1985) Annu. Rev. Biochem. 54:367-402; Eckstein (1989) Trends Biochem. Sci. 14:97-100; Stein (1989) In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed, Macmillan Press, London, pp. 97-117; Jager et al. (1988) Biochemistry 27:7237-7246参照)。
(ａ)アンチセンスオリゴヌクレオチド；三重分子；ダンベルオリゴヌクレオチド；ＤＮＡ；細胞外タンパク質結合オリゴヌクレオチド；および小ヌクレオチド分子を含むアンチセンスヌクレオチド
アンチセンスヌクレオチドは、相補性配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合し、それによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するオリゴヌクレオチドである(例えば、ダンベルアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載するAltman et al.の米国特許番号５,１６８,０５３、Inouyeの米国特許番号５,１９０,９３１、Burchの米国特許番号５,１３５,９１７；Smithの米国特許番号５,０８７,６１７およびClusel et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21:3405-3411参照)。三重分子は、二本鎖ＤＮＡを標的とし、それにより転写を阻止する一ＤＮＡ鎖をいう(例えば、二本鎖ＤＮＡ上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドの製造法を記載する、Hogan et al. の米国特許番号５,１７６,９９６参照)。
(ｂ)リボザイム
リボザイムは、メッセンジャーＲＮＡを特異的に開裂するＲＮＡ構築物である。ＲＮＡ鎖の開裂および／またはライゲーションに関与することが知られている少なくとも５クラスのリボザイムがある。リボザイムは、ＲＮＡ転写物のいずれかに標的化でき、このような転写物を触媒的に開裂できる(例えば、リボザイムおよびその産生方法を記載する米国特許番号５,２７２,２６２；米国特許番号５,１４４,０１９；およびCech et al. の米国特許番号５,１６８,０５３、５,１８０,８１８、５,１１６,７４２および５,０９３,２４６参照)。このようなリボソームのいずれかを、酸性条件下、ＥＧＦＲ関連細胞への送達のために条件依存活性抗ＥＧＦＲ抗体と結合できる。
リボザイムは、核への挿入により、リボザイムが直接的に転写されるように、真核生物プロモーター、例えば真核生物ウイルスプロモーター、一般に後期プロモーターと結合したリボザイムをコードするＤＮＡとして標的細胞に送達され得る。このような場合、構築物もまた、結合した核酸の核への送達に適するものとするために、一般に標的剤の一部としてまたはリンカーの一部として、核移行配列にも包含される。
(ｃ)標的化送達のための治療産物をコードする核酸
とりわけ使用を意図する治療産物をコードするＤＮＡは、ＥＧＦＲ関連腫瘍細胞に正確なコピー抗癌剤、例えば腫瘍壊死因子および細胞毒性剤、例えば志賀Ａ１毒素またはサポリンをコードするＤＮＡである。コンジュゲートは核移行配列(ＮＴＳ)を含むべきである。コンジュゲートが、標的剤および結合したＤＮＡが細胞質内で開裂されるように設計されるならば、ＮＴＳは、内部移行により、コンジュゲートが核に輸送されるように、ＤＮＡと結合したままであるリンカーの部分に包含されるべきである。核移行配列(ＮＴＳ)は異種性配列であってよくまたは選択したケモカイン受容体標的剤由来であってよい。典型的コンセンサスＮＴＳ配列は、アミノ末端プロリンまたはグリシン、続く少なくとも３個の塩基性残基を、７〜９アミノ酸のアレイで含む(例えば、Dang et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:18019-18023, Dang et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:4048-4054参照)。
(ｄ)核酸のタンパク質へのカップリング
ここでの化学的コンジュゲーションを実施するために、標的剤を、核酸に直接的にまたは１個以上のリンカーを介して結合する。核酸を５’末端、３’末端および他のどこかでタンパク質のアミノおよびカルボキシル末端および他の部位とコンジュゲートする方法は当業者に知られる(レビューのために例えば、Goodchild, (1993) In: Perspectives in Bioconjugate Chemistry, Mears, Ed., American Chemical Society, Washington, D.C. pp. 77-99参照)。例えば、タンパク質は、核酸に紫外線照射(Sperling et al. (1978) Nucleic Acids Res. 5:2755-2773; Fiser et al. (1975) FEBS Lett. 52:281-283)、二機能性化学物質(Baeumert et al. (1978) Eur. J. Biochem. 89:353-359; and Oste et al. (1979) Mol. Gen. Genet. 168:81-86)および光化学的架橋(Vanin et al. (1981) FEBS Lett. 124:89-92; Rinke et al. (1980) J.Mol.Biol. 137:301-304; Millon et al. (1980) Eur. J. Biochem. 110:485-492)を使用して結合している。
特に、反応材(Ｎ−アセチル−Ｎ’−(ｐ−グリオキシルイルベンベンゾリル)シスタミンおよび２−イミノチオランは、ＤＮＡをタンパク質、例えばα２マクログロブリン(α２Ｍ)に、混合ジスルフィド形成を介してカップリングするために使用されている(Cheng et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:659-669参照)。Ｎ−アセチル−Ｎ’−(ｐ−グリオキシルイルベンベンゾリル)シスタミンは、非対グアニン残基と特異的に反応し、還元により、遊離スルフヒドリル基を産生する。２−イミノチオランはタンパク質と反応してスルフヒドリル基を産生し、これは、次いで、誘導体化ＤＮＡと、分子間ジスルフィド交換反応によりコンジュゲートする。コンジュゲートの内部移行により、標的化核酸が活性である限り、あらゆる結合を使用し得る。それゆえに、結合の開裂が必要であることが予測されるが、いくつかの反応材、例えばプロモーターと結合したリボザイムをコードするＤＮＡまたは核への送達のための治療剤をコードするＤＮＡについて、このような開裂は必ずしも必要ではないことが予期される。
チオール結合は、ヘテロ二機能性反応材を使用して容易に形成できる。アミンはまた、水溶液中の非保護オリゴヌクレオチドまたは核酸の末端５’ホスフェートに、核酸と水可溶性カルボジイミド、例えば１−エチル−３’[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド(ＥＤＣ)またはＮ−エチル−Ｎ’(３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドヒドロクロライド(ＥＤＣＩ)を、イミダゾール緩衝液中、ｐＨ６で反応させて、５’ホスホロイミダゾリドを形成させることにより結合されている。５’ホスホロイミダゾリドとアミン含有分子およびエチレンジアミンの接触により、安定なホスロアミデートとなる(例えば、Chu et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:6513-6529；および米国が指定されているＷＯ８８／０５０７７参照)。特に、ＤＮＡの溶液を、ＥＤＣで、ｐＨ６で飽和させ、撹拌しながら４℃で一夜インキュベートする。次いで、得られた溶液を、例えば約３体積の１００mM クエン酸緩衝液の添加によりｐＨ８.５に緩衝化し、約５μg〜約２０μgのケモカイン受容体標的剤を添加し、得られた混合物を４℃で約４８時間撹拌する。未反応タンパク質を、カラムクロマトグラフィー、例えば、溶出緩衝液として、０.１Ｍ炭酸アンモニウム溶液、ｐＨ７.０を使用するSEPHADEX G75(Pharmacia)を使用して、混合物から除去し得る。単離コンジュゲートを凍結乾燥し、使用するまで保存してよい。
米国特許番号５,２３７,０１６は、５’末端でブロムアセチル化されたヌクレオチドの製造方法および得られたオリゴヌクレオチドとチオール基の反応を記載する。５’末端ブロモアセチル基で誘導体化されたオリゴヌクレオチドは、米国特許番号５,２３７,０１６に記載のとおり、５’−アミノヘキシル−ホスロアミデートオリゴヌクレオチドとブロモ酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの反応により製造できる。米国特許番号５,２３７,０１６はまたチオール誘導体化ヌクレオチドの製造方法も記載し、これは、続いて、選択増殖因子上のチオール基と反応できる。簡単に言うと、チオール誘導体化ヌクレオチドは、５’−リン酸化ヌクレオチドを、(１)１反応工程でのジイミド存在下でのホスフェート基とイミダゾールの反応およびイミダゾール脱離基のシスタミンでの置換；およびジチオスレイトールでのシスタミンリンカーのジスルフィド結合の還元の２工程を含む(また、類似法を記載するChu et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:3671-3691も参照)。５’−リン酸化出発オリゴヌクレオチドは、当業者に知られた方法により製造できる(例えば、Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p. 122参照)。
アンチセンスオリゴマーまたは核酸、例えばメチルホスホネートオリゴヌクレオチド(ＭＰ−オリゴマー)は、ＳＰＤＰまたはＳＭＰＢとの反応により誘導体化できる。得られたＭＰ−オリゴマーをＨＰＬＣにより精製し、ケモカイン受容体標的剤とカップリングし得る。ＭＰ−オリゴマー(約０.１μM)を約４０〜５０μlの１：１アセトニトリル／水に溶解し、そこにリン酸緩衝液(ｐＨ７.５、最終濃度０.１Ｍ)および約１mlリン酸緩衝化食塩水中の１mg ＭＰ−オリゴマーを添加する。反応を約５〜１０時間、室温で進行させ、続いて、約１５μL ０.１ヨードアセトアミドで反応停止させる。コンジュゲートを、ヘパリンセファロースＨｉ Ｔｒａｐカラム(１ml、Pharmacia)で精製し、線上または段階勾配で溶出し得る。コンジュゲートは０.６Ｍ ＮａＣｌに溶出するはずである。
ｂ. リンカー
リンカーＬは、共有結合性結合を介して抗体を標的剤に結合する。リンカーは、１個以上の標的剤を抗ＥＧＦＲ抗体に結合し、抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)を形成するのに使用できる二官能性または多官能性部分である。ＡＤＣは、標的剤および抗ＥＧＦＲ抗体に結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して、容易に製造できる。抗ＥＧＦＲ抗体のシステインチオール基またはアミン基、例えば、Ｎ末端またはリシン側鎖は、リンカー剤、標的剤または標的剤−リンカー剤の官能基と結合を形成できる。
リンカーは、好ましくは標的細胞に輸送または送達される前、抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)が安定であり、無傷なままである、すなわち、抗体が標的剤に結合したままであるように、細胞外環境で安定である。それゆえに、リンカーは標的細胞外で安定であり、細胞内に入ると、抗体および標的剤をある効果的速度で開裂し得るかまたは解離可能である。意図されるリンカーは、(ｉ)抗体の特異的結合特性を妨害しない；(ii)コンジュゲートまたは標的剤の細胞内送達を可能にする；(iii)コンジュゲートがその標的化部位に送達または輸送されるまで、安定かつ無傷である、すなわち、開裂されない；そして(iv)標的剤の細胞毒性、殺細胞効果または細胞増殖抑制効果を妨害しない。ＡＤＣの安定性は、標準的分析技術、例えばマススペクトロメトリーおよび／またはＨＰＬＣにより測定し得る。
リンカーは、抗体および標的剤の両者への共有結合性結合を可能にするための２個の反応性官能基を有し、それ故に、反応性の意味で二価性を示す。２個以上の官能部分または生物学的に活性な部分、例えばペプチド、核酸、薬物、毒素、抗体、ハプテンおよびレポーター基の結合に有用なこのような化学的架橋剤は知られ、コンジュゲートの産生におけるその使用について方法は記載されている(Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242)。
ある例において、リンカーは、抗体上に存在する求電子基に反応性である求核性基を有する反応性官能基を有する。抗体上の有用な求電子基は、アルデヒド基およびケトンカルボニル基を含むが、これらに限定されない。リンカーの求核性基のヘテロ原子が抗体の求電子基と反応し、抗体単位に結合する共有結合性を形成できる。リンカー上の有用な求核性基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジドを含むが、これらに限定されない。抗体上の求電子基は、リンカーへの結合のための好都合な位置を提供する。
ｉ. ペプチドリンカー
リンカーは、１個以上のアミノ酸単位を含むペプチド性であり得る。ペプチドリンカー剤は、固相または液相合成方法により製造でき(E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press)、これはペプチド化学の分野で周知であり、自動化合成機、例えばRainin Symphony Peptide Synthesizer(Protein Technologies, Inc.)またはモデル４３３(Applied Biosystems)上でのｔ−ＢＯＣ化学(Geiser et al. “Automation of solid-phase peptide synthesis” in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218)およびＦｍｏｃ／ＨＢＴＵ化学(Fields, G. and Noble, R. (1990) “Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids”, Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214)を含む。ペプチドベースのリンカーは、タンパク質分解が酵素的であり、酵素が腫瘍細胞内での優先的発現について選択可能であるため、加水分解的または還元的に不安定であるリンカーを超える利益を提供する。カテプシンＢ開裂可能ペプチドリンカー、バリン−シトルリン(Ｖａｌ−Ｃｉｔ)およびその修飾、例えばマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン(ｍｃ−ｖｃ)、フェニルアラニン−リシン、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ(配列番号１２０１)、他のトリ／テトラペプチドが、ＡＤＣにおいて用いられているペプチドリンカーの例である(Dosio et al., (2010) Toxins 3:848-883; Doronina et al., (2006) Bioconjug Chem. 17:114-124; Doronina et al., (2003) Nat Biotechnol. 21:778-784; Sanderson et al., (2005) Clin Cancer Res 11:843-852; Ducry and Stump (2010) Bioconjug Chem. 21:5-13)。非開裂可能ペプチドリンカーの例は、Ｎ−メチル−バリン−シトルリンを含む。他のペプチドリンカーは、米国公開番号２０１１／００２０３４３に記載されている。
好ましいペプチドリンカーは、融合タンパク質内に包含でき、宿主細胞、例えば大腸菌で発現されるものである。このようなリンカーは、酵素基質、例えばカテプシンＢ基質、カテプシンＤ基質、トリプシン基質、トロンビン基質、スブチリシン基質、第Ｘａ因子基質およびエンテロキナーゼ基質；(ｇｌｙｍｓｅｒ)ｎおよび(ｓｅｒmｇｌｙ)ｎ(ここで、ｍは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４であり、ｎは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４である)のようなリンカーを含む、溶解度、柔軟性および／または細胞内開裂性を高めるリンカーを含む(例えば、コンジュゲートで使用するためのリンカーの例を提供する国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／０６６４１参照)。ある態様において、数種のリンカーを、各リンカーの所望の特性を利用するために包含させ得る。
ii. 化学的リンカー
ＡＤＣはまた、非開裂可能部分または化学的架橋剤であるリンカーを使用しても製造できる。非開裂可能リンカーの例は、アミドリンカーおよびアミド結合およびエステル結合とスクシネートスペーサーを含む(Dosio et al., (2010) Toxins 3:848-883)。化学的架橋リンカーの例は、ＳＭＣＣ(スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート)およびＳＩＡＢ(スクシンイミジル(４−ヨードアセチル)アミノベンゾエート)を含む。ＳＭＣＣは、中程度の長さのシクロヘキサン安定化スペーサーアームの逆末端にＮＨＳ−エステル反応基およびマレイミド反応基を含む、アミン−から−スルフヒドリルクロスリンカーである。ＳＩＡＢは短い、アミン−から−スルフヒドリルコンジュゲーションのためのＮＨＳ−エステルおよびヨードアセチルクロスリンカーである。架橋剤の他の例は、チオエーテルリンカー、化学的に不安定なヒドラゾンリンカー、４−メルカプト吉草酸、ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣおよびスルホ−ＳＭＰＢおよびＳＶＳＢ(スクシンイミジル−(４−ビニルスルホン)ベンゾエート)およびビス−マレイミド剤、例えば市販のＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ(ＰＥＯ)３およびＢＭ(ＰＥＯ)４(Pierce Biotechnology, Inc.)を含むが、これらに限定されない。ビス−マレイミド剤は、抗体のシステイン残基の遊離チオール基の、チオール含有標的剤またはリンカー中間体への、連続的または同時的形式での結合を可能にする。他のチオール反応性官能基は、マレイミド以外に、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネートおよびイソチオシアネートを含む。他のリンカーの例および使用方法は、米国公開番号２００５／０２７６８１２およびDucry and Stump (2010) Bioconjug Chem. 21:5-13に記載されている。
リンカーは、所望により溶解度または反応性を調節する基で置換されていてよい。例えば、スルホネート置換基は、反応材の水溶解度を上げ、ＡＤＣの製造に用いる合成経路によって、リンカー剤と抗体または薬物部分とのカップリング反応を促進しまたは抗ＥＧＦＲ Ａｂ−Ｌと標的剤または標的剤−Ｌと抗ＥＧＦＲ Ａｂのカップリング反応を促進する。
他のリンカー剤は、業者、例えばMolecular Biosciences Inc.(Boulder, Colo.)から得ることができ、またはToki et al. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872；米国特許番号６,２１４,３４５；ＷＯ０２／０８８１７２；米国２００３１３０１８９；米国２００３０９６７４３；ＷＯ０３／０２６５７７；ＷＯ０３／０４３５８３；およびＷＯ０４／０３２８２８に記載の方法により合成できる。例えば、リンカー剤、例えばＤＯＴＡ−マレイミド(４−マレイミドブチラミドベンジル−ＤＯＴＡ)は、アミノベンジル−ＤＯＴＡとクロロギ酸イソプロピル(Aldrich)で活性化した４−マレイミド酪酸(Fluka)の、Axworthy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807)に記載の方法に従う反応により製造できる。ＤＯＴＡ−マレイミド剤は、システイン操作された抗体の遊離システインアミノ酸と反応し、抗体上に金属錯化リガンドを提供する(Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86)。キレート化リンカー標識剤、例えばＤＯＴＡ−ＮＨＳ(１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−テトラ酢酸モノ(Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル)は市販されている(Macrocyclics, Dallas, Tex.)。
リンカーは、分枝した、多官能性リンカー部分を介して、１個を越える薬物部分を抗体に共有結合性結合するための樹状型リンカーであり得る(Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King et al. (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990)。樹状リンカーは、標的剤対抗体のモル比、すなわち、負荷を上げることができ、これはＡＤＣの効果を高め得る。それゆえに、抗体が１個しか反応性システインチオール基を有しないとき、多数の薬物部分を樹状リンカーを介して結合できる。樹状リンカー剤の例は、米国特許公開番号２００５／０２７６８１２に記載されている。
Ｄ. 抗ＥＧＦＲ抗体特性および活性の同定および評価のための方法
ここに提供される抗ＥＧＦＲ抗体は、非腫瘍微小環境と比較した、腫瘍微小環境における選択的およびゆえに条件依存活性の発現に基づき選択する。このような抗体は、２個の異なる腫瘍微小環境または非腫瘍微小環境において存在する条件を模倣または反映する条件下の、抗体の活性を比較するまたは抗体の採集をする、スクリーニング方法または他の方法により同定できる。同定された抗体またはその抗原結合フラグメントを、例えば、治療有効性、ＥＧＦＲに対する親和性、毒性、副作用、薬物動態および薬力学のような臨床的特性を評価するために、当業者に知られる多様なアッセイでさらに特徴付けできる。
ここに記載するとおり、固形腫瘍で特徴的条件、例えば低ｐＨおよび低酸素における相違は、腫瘍の病的微小環境においてより活性である抗体の提供に影響する。このようなアッセイまたは方法の実施において、他のタンパク質の濃度が、選択および条件依存活性に影響を与えるまたは影響する条件であり、それゆえに、スクリーニングアッセイにおいて使用されるパラメータであることも判明した。例えば、実施例３に示すとおり、添加タンパク質の非存在下と比較して、添加タンパク質存在下で、選択抗体の活性比または条件依存活性は上昇し、この差異は、生理学的濃度のタンパク質(例えば２５％ヒト血清)で大きい。インビボまたは生理学的環境において、間質性タンパク質濃度(例えばアルブミン)は、２０〜５０％の血漿のどこかである。血清は約６０〜８０ｇ／Ｌタンパク質を含み、種々の組織は１２mg／mL〜４０mg／mL間質性タンパク質を含むことが証明されている(例えばAukland and Reed (1993) Physiological Reviews, 73:1-78参照)。それゆえに、これらの環境を模倣するために、抗ＥＧＦＲ抗体を選択または特徴付けするためのアッセイおよび方法は１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質の存在下で実施し、これは、例えば、血清、例えばヒト血清中、または血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンまたは抗体または受容体と相互作用しないまたは他に直接的に抗体−受容体相互作用を変えない他のタンパク質として提供できる。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体を選択または特徴付けするためのアッセイおよび方法は、１２〜４０mg／mLタンパク質、例えば少なくとも１２mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mLまたは４０mg／mLタンパク質存在下で行う。他の例において、タンパク質は血清中に提供し、抗ＥＧＦＲ抗体を選択または特徴付けするためのアッセイおよび方法は、２０％〜５０％血清(vol/vol)、例えば２０％〜５０％ヒト血清、例えば少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％血清(vol/vol)存在下で行う。
特に、抗ＥＧＦＲの条件依存活性は、２重形式でアッセイを実施することにより決定でき、それにより各アッセイを２回、異なる条件下、例えば異なるｐＨおよび／または乳酸濃度および生理学的濃度の総タンパク質の存在下で行う。それゆえに、腫瘍微小環境において条件依存活性である抗ＥＧＦＲ抗体の評価または選択方法は、２０〜５０％血清(vol/vol)または１０〜５０mg／mLタンパク質(例えば血清アルブミン)および約５.８〜６.８の酸性ｐＨおよび／または１０mM〜２０mMの高乳酸レベルを含む、第一組の条件(例えば腫瘍微小環境において存在する条件)下、活性を評価するあらゆるアッセイまたは方法を含む。例えば、第一組の条件は、少なくとも２５％血清(vol/vol)または１２〜４０mg／mLタンパク質(例えば血清アルブミン)および約６.０〜６.５の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mMの高乳酸レベルを含み得る。このような方法において、抗ＥＧＦＲ抗体をまた２０〜５０％血清(vol/vol)または１０〜５０mg／mLタンパク質(例えば血清アルブミン)および約７.０〜７.４のほぼ中性ｐＨまたは中性ｐＨおよび／または０.５〜５mMの乳酸濃度を含む、第二組の条件下、活性を測定する。例えば、第二組の条件は、少なくとも２５％血清(vol/vol)または１２〜４０mg／mLタンパク質(例えば血清アルブミン)および約７.０〜７.２のｐＨおよび／または１mM〜４mMの乳酸濃度を含む。このような例において、生理的環境を模倣するために添加したタンパク質(例えば血清タンパク質)の量は、典型的に両者の組の条件で同一または実質的に同一であるが、互いに±２５％またはそれ未満変わり得る。
第二組の条件と比較して第一組の条件下で大きな活性を示す抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを、腫瘍微小環境で条件依存活性または選択的である抗ＥＧＦＲ抗体として選択する。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第二組の条件と比較して、第一組の条件下、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上の活性比を示すものを選択する。典型的に、腫瘍微小環境に対して選択的治療剤として使用するために、少なくとも、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、第二組の条件(例えば非腫瘍微小環境において存在する条件)と比較して、第一組の条件(例えば腫瘍微小環境において存在する条件)下、少なくとも３.０またはそれ以上の活性比を示すものである。
ここに記載する腫瘍微小環境における条件依存活性に対してスクリーニングおよび／または評価できるＥＧＦＲに特異的な抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲに特異的であるあらゆる抗体を含む。このような抗体は、例えば、適当な宿主動物の免疫化またはインビトロでのリンパ球の免疫化、続くハイブリドーマ産生のための骨髄腫細胞との融合による、ハイブリドーマ方法により製造できる(例えばKohler et al. (1975) Nature, 256:495, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。例えば、抗体を、ＥＧＦＲ発現細胞、ＥＧＦＲ由来ペプチドまたは他の抗原で免疫化できる。抗原は、その免疫原性を高めるために担体とともに提供でき、アジュバントとの製剤として提供および投与できおよび／または複数注射で投与できる。抗体はまた組み換えＤＮＡ方法により製造できる(例えば米国特許番号４,８１６,５６７)。
抗ＥＧＦＲ抗体はまた修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む。修飾抗ＥＧＦＲ抗体はあらゆる知られた抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントに由来し得る。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体の例は、例えば、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ、C225またはIMC-C225)、Ｈｕ２２５、Zhuの11F8(ＷＯ２００５／０９０４０７)、EMD 72000(マツズマブ)、ベクティビックスＴＭ(パニツムマブ；ABX-EGF)、TheraCIM(ニモツズマブ)およびHu-Max-EGFR(ザルツムマブ)を含む。このような抗体の突然変異体および変異体形態のライブラリーまたはコレクションは、参照非修飾抗体へのアミノ酸置換、付加または欠失を導入するための当分野で知られる方法により産生できる。ここでの方法において使用するための修飾または変異体タンパク質の産生は当業者のレベルの範囲内である。変異誘発の方法は当分野で周知であり、例えば、QuikChange(Stratagene)または飽和変異誘発のような部位特異的変異誘発を含む。変異誘発方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異誘発、部位特異的変異誘発、無作為点変異誘発、ウラシル含有鋳型を使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二本鎖ＤＮＡを使用した変異誘発、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復および当業者に知られる多くの他のものを含むが、これらに限定されない。ここでの方法において、変異誘発は、タンパク質の完全長にわたりまたはタンパク質の領域内で実施できる。変異は合理的または無作為にできる。製造されたコレクションまたはライブラリーのある例において、置換されている各アミノ酸は、独立して１９個の残りのアミノ酸で置換されているかまたは各位置または位置の一部で１９個未満の残りのアミノ酸、例えば１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個または１８個の残りのアミノ酸で置換されている。
抗体の完全長または抗原結合フラグメントを、ここに記載される条件依存活性について評価またはスクリーニングできる。それゆえに、抗体は、最小限免疫特異的にＥＧＦＲと結合するための可変重鎖の十分な部分および可変軽鎖の十分な部分を含む限り、抗体の任意の形態であり得る。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体のフラグメントまたは変異体、例えば、ここに記載するまたは当分野で知られる変異体またはフラグメントのいずれかを、ここに提供するアッセイに使用できる。
さらに、インビトロアッセイおよびインビボ動物モデル、例えばここに提供するものを、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性および／または副作用測定に使用できる。ここに提供するアッセイは、検出可能または他の点で測定可能な方法で抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を試験または評価できる、あらゆるアッセイを含む。ここに提供するアッセイは、多数の抗ＥＧＦＲ抗体、例えばタンパク質変異体の活性を、同時に２重形式で評価するためのハイスループット形式で開発できる。
このようなアッセイはインビトロまたはインビボで実施できる。活性評価は、抗ＥＧＦＲ抗体のあらゆる活性、例えばＥＧＦＲへの結合、細胞増殖阻害(ＣＧＩ)活性または腫瘍増殖阻害活性であり得る。例えば、インビトロ結合アッセイは、結合を上記条件下で行う、固相支持体結合アッセイまたは溶液結合アッセイを使用して実施できる。他の例において、結合アッセイは、結合を腫瘍に存在する細胞対非腫瘍に存在する細胞で比較する、インビボで実施できる。特に、インビボ結合アッセイは、投与された抗体の腫瘍細胞対基底皮膚ケラチン生成細胞の結合または局在化の評価により実施できる。これは、ここで、異種移植片または皮膚移植モデルを使用して例示される。他のモデルも用いることができる。
ここに提供されるのは、アッセイの例である。アッセイは、限定的であることを意味しない。結合を検出するアッセイ、機能的アッセイ、インビボアッセイ、動物モデルおよび臨床的アッセイを含む、当業者に知られるあらゆるアッセイを、ここに提供する方法において抗ＥＧＦＲ抗体の同定、選択または特徴付けに使用することが意図される。アッセイ例の記載を下に提供する。
１. 結合アッセイ
例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、ＥＧＦＲに結合する能力についてアッセイできる。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、当業者に知られるあらゆる方法により、ＥＧＦＲと結合するそれらの能力を評価できる。アッセイの例をここで下に記載する。ある例において、ＥＧＦＲのフラグメントまたは変異体をここに提供するアッセイに使用できる。例えば、ＥＧＦＲは可溶性タンパク質として発現できる。例えば、ここに記載するアッセイで使用できる可溶性ＥＧＦＲは、可溶性ＥＧＦ受容体細胞外ドメイン(ｓＥＣＤ)である。
結合アッセイを溶液、懸濁液または固相支持体上で実施できる。例えば、ＥＧＦＲを固相支持体(例えば炭素または可塑性表面、組織培養皿またはチップ)に固定化し、抗体と接触させ得る。未結合抗体または標的タンパク質を洗い出すことができ、次いで結合複合体を検出できる。結合アッセイは、非特異的結合を減らすための条件下、例えば高イオン強度緩衝液(例えば０.３〜０.４Ｍ ＮａＣｌ)と非イオン性洗剤(例えば０.１％Triton X-100またはTween 20)の使用および／またはタンパク質(例えばウシ血清アルブミンまたはゼラチン)の遮断により、実施できる。ネガティブコントロールも、背景結合の測定としてこのようなアッセイに包含できる。結合親和性はスキャッチャード分析(Munson et al., (1980) Anal. Biochem., 107:220)、表面プラズモン共鳴、等温熱量測定、定量的ＥＬＩＳＡまたは当業者に知られる他の方法を使用して決定できる(例えば、Liliomet al. (1991) J. Immunol Methods. 143(1):119-25)。
ここに記載するアッセイは、二重アッセイ比較方法を含み、それにより結合を２個の異なる結合条件下で決定する。異なる結合条件の非限定的例は、例えば、ｐＨ、例えば低ｐＨ(例えば、ｐＨ６.０またはｐＨ６.５)対中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.４)または乳酸濃度、例えば高乳酸濃度(１０〜２０mM)対低乳酸濃度(０〜５mM)を含む。２０〜５０％血清(vol/vol)または１０〜５０mg／mLタンパク質(例えば血清アルブミン)を含むタンパク質濃度も包含できる。ここに記載するアッセイの工程のいずれも２個の異なる結合条件を模倣するため２重条件下で実施できる。例えば、アッセイがＥＬＩＳＡであるとき、ＥＬＩＳＡの任意の工程、例えばコーティング、ブロッキング、試験分子とのインキュベーション(例えば治療用抗体または抗原結合フラグメントまたはその変異体)または検出を、ここに記載する条件下で実施できる。本アッセイにおいて、各修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、両模倣条件下、個々におよび別々に同族結合パートナー(例えばＥＧＦＲ)への結合について評価できる。同族結合パートナー(例えばＥＧＦＲ)への修飾抗ＥＧＦＲ抗体の結合活性を評価および比較できる。結合を測定するアッセイの例は、溶液結合アッセイおよび固相支持体結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴および免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡを含む。
ある例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、種々のｐＨ条件、例えば低ｐＨおよび中性ｐＨで、免疫特異的にＥＧＦＲと結合する能力についてアッセイできる。ある例において、アッセイは、中性ｐＨよりも低ｐＨで高い活性、例えば結合活性を有する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を同定できる。ここでの具体例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその変異体のＥＧＦＲまたは可溶性ＥＧＦＲへの結合活性を、低ｐＨ(＜７.４)および高乳酸濃度の条件下および約７.３〜７.４の生理的ｐＨおよび低乳酸濃度の条件下で評価できる。さらに、ヒト血清(例えば、５％または２５％ヒト血清)を、さらに天然環境を模倣するために、結合アッセイに包含できる。
このようなアッセイを、例えば、溶液中(例えば、Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421)、ビーズ上(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ上(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌上(米国特許番号５,２２３,４０９)、胞子上(米国特許番号５,５７１,６９８；５,４０３,４８４；および５,２２３,４０９)、プラスミド上(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)またはファージ上(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; and Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310)で実施できる。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、結合活性が評価および決定できるように、標識できる。例えば、結合を検出するために、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、検出を促進するために検出可能部分またはタグで標識できる。当業者は、アッセイ条件のための適当な検出可能部分またはタグを選択できる。例えば、ある二次試薬、例えば抗Ｉｇ抗体を、ヒト血清を含む溶液中の抗体である修飾タンパク質の結合の検出に使用できない。さらに、抗ＩｇＧ抗体を、抗体である生体分子の結合の検出に使用できない。
検出または同定され得る当業者に知られる任意の検出可能部分または他の部分を使用できる。部分またはタグは、試験分子、例えば治療的タンパク質または抗体に、直接的にまたは間接的に、例えばリンカーを使用して、結合できる。結合は治療用抗体のＮ末端またはＣ末端であり得る。ここでの方法に使用できるタグおよび部分は、表１２に示すものを含むが、これらに限定されない。
検出可能部分をここに記載する治療用抗体に結合できる当業者に知られるあらゆるリンカーを使用できる。リンカーの例は、グリシン・リッチ可動性リンカー(−Ｇ４Ｓ−)ｎ(ここで、ｎは正の整数、例えば１(配列番号１０９４)、２(配列番号１０９５)、３(配列番号２１)、４(配列番号１０９６)、５(配列番号１０９７)またはそれ以上である)を含む。
結合アッセイは、溶液中、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を固相支持体に取り付けることによりまたはＥＧＦＲを固相支持体に取り付けることにより実施できる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲの間の結合の測定に使用できるアッセイの例の記載を、次のサブセクションに提供する。
ａ. 固相支持体結合アッセイ
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を評価するためのアッセイは、抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲへの結合を一方または両者が固相支持体に結合する条件下で測定する結合アッセイを含む。例えば、溶液中の抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、固相支持体に固定したＥＧＦＲと相互作用させてよくまたは溶液中のＥＧＦＲを固相支持体に固定化した修飾抗ＥＧＦＲ抗体と相互作用させてよい。固相支持体結合アッセイは、固相への固定化が、結合抗ＥＧＦＲ抗体の未結合抗ＥＧＦＲ抗体からの分離を容易にするため、溶液結合アッセイと比較して有利であり得る。表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法およびＥＬＩＳＡを含む、当業者に知られるあらゆる固相支持体結合アッセイがここに提供する方法における使用が意図される。
ｉ. 表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)は、サンプル中の分析物分子の固定化分子への分子結合により起こる、屈折率変化の測定により、高度に感受性のアッセイにおいて未標識分子の結合を検出できる(Piliarik et al., (2009) Methods Mol Biol. 503:65-88)。ＳＰＲは、表面プラスモンが波打つときに起こり、これは、金属における電子の集団振動であり、金属／誘電体界面で励起する。ＳＰＲは、角度および波長の特異的組み合わせで、反射光強度を減少させる。分子結合は、金属フィルム上の極薄有機(誘電体)層の屈折率および厚さを変えることができ、これはＳＰＲ共鳴条件を変える。
ある例において、ＳＰＲ動力学的分析を、修飾抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲへの結合オン速度およびオフ速度を決定するために使用できる(例えば、BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist et al. (1993) Curr Opin Immunol. 5(2):282-6; Garcia-Ojeda et al. (2004) Infect Immun. 72(6):3451-60参照)。ＳＰＲ動力学的分析は、表面に固定化抗体を備えたチップへの抗原の結合および解離の分析を含む。抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲの可溶性細胞外ドメインへの結合の測定へのＳＰＲの使用は当業者の能力の範囲内である(例えば、Saxena et al. (2011), J. Clin. Oncol. 29(suppl):e13030)。
例えば、１個以上の抗ＥＧＦＲ抗体、例えば１個以上の修飾抗ＥＧＦＲ抗体を有する溶液を、固定化ＥＧＦＲ上を通過させてよくまたはＥＧＦＲを有する溶液を、固定化抗ＥＧＦＲ抗体または抗体上を通過させてよい。会合速度を、時間の関数としてＳＰＲシグナルを測定することにより測定できる。会合後、緩衝液溶液を固相支持体上を通し、時間の関数として解離速度を測定できる。会合および解離速度から、平衡結合定数を計算できる(Jecklin et al. (2009), J. Mol. Recognit. 22(4):319-29; Nguyen et al, (2007) Methods. 42(2):150-61; Tanious et al. (2008), Methods Cell Biol. 84:53-77)。ＳＰＲを使用するＥＧＦＲへの結合の検出による抗ＥＧＦＲ抗体の活性の測定は当業者の能力の範囲内である(例えば、Alvarenga et al. (2012) Anal. Biochem 421(1):138-151参照)。
ii. バイオレイヤー干渉法
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、バイオレイヤー干渉法による抗体のＥＧＦＲへの結合の測定により評価できる。バイオレイヤー干渉法は、バイオセンサーチップ上の固定化生体分子層および内部参照層の２個の表面から反射される可視光の干渉パターンを測定することにより、生体分子相互作用を検出するための、無標識方法である。溶液での分子の固定化生体分子への結合は生体分子層の厚さを増加させ、これが波長シフトをもたらす。結合後、固定化生体分子を緩衝液溶液と接触させ、分子の解離を測定できる。固定化生体分子への結合はリアルタイムに測定でき、会合速度定数、解離速度定数、結合親和性および結合特異性を決定できる。例えば、ストレプトアビジンをバイオレイヤーに結合でき、ビオチニル化ｓＥＧＦＲをストレプトアビジンバイオレイヤーと結合できる。適切な緩衝液中の抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体をバイオレイヤーに添加し、ｓＥＧＦＲと接触させ得る。抗ＥＧＦＲ抗体の濃度を経験的にまたは当業者に知られた因子、例えば近接予測解離定数、抗体の溶解度、温度および緩衝液条件に基づき選択できる。ｓＥＧＦＲと抗ＥＧＦＲ抗体の結合は、光学層およびバイオレイヤーから反射された光から産生された干渉パターンの変化の測定により定量できる。結合動態は、結合速度定数の計算のために測定する。解離速度定数の測定のために、センサーを適切な緩衝液中でインキュベートし、抗ＥＧＦＲ抗体およびＥＧＦＲの解離を測定し得る。抗ＥＧＦＲ抗体の結合親和性を、動力学的解離速度定数と動力学的会合速度定数の比として計算できる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲの間の解離定数を測定するためのバイオレイヤー干渉法アッセイの例を実施例５に記載する。
iii. 免疫アッセイ
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の結合の分析に使用できる免疫アッセイは、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検定法)、メソスケールディスカバリー(MSD, Gaithersburg, Maryland)、“サンドイッチ”免疫アッセイ、免疫沈殿アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定化アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイ、免疫組織化学または免疫電子顕微鏡のような、しかしこれらに限定されない技術を使用する、競合的および非競合的アッセイ系を含む。このようなアッセイは日常的であり、当分野で周知である(例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるAusubel et al., Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York参照)。他のアッセイ形式は、特異的分子(例えば、抗体)と結合し、被包試薬またはマーカーを放出するために設計されたリポソームを使用する、リポソーム免疫アッセイ(ＬＩＡ)を含む。次いで、放出された化学物を標準技術に従い検出する(Monroe et al., (1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41参照)。限定することを意図しない免疫アッセイの例を、下に簡単に記載する。
ａ)ＥＬＩＳＡ
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲの間の結合を、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)により検出できる。ＥＬＩＳＡは、タンパク質／リガンド相互作用、例えば抗体／抗原相互作用検出のために使用できる免疫学的アッセイである。典型的に、ＥＬＩＳＡにおいて、抗体／抗原相互作用を、抗体／抗原複合体に直接的または間接的に結合した酵素マーカーからのシグナルの測定により検出する。
例えば、ＥＬＩＳＡは：１)ＥＧＦＲまたはその変異体での固相のコーティング；２)固相上の非特異的結合部位を遮断するための固相とブロッキング剤のインキュベーション；３)固相と修飾抗ＥＧＦＲ抗体のインキュベーション；４)修飾抗ＥＧＦＲ抗体を検出できるが、修飾抗ＥＧＦＲ抗体と結合し得るアッセイ緩衝液に含まれるヒト血清を検出しない、二次検出剤、例えば標識二次抗体とのインキュベーション；および５)二次検出剤の検出を含む。さらに、１回以上の洗浄工程(例えば、１回、２回、３回、４回またはそれ以上の洗浄工程)が、本方法の任意の工程の間に包含され得る。
２重形式または二重アッセイにおいて、ＥＧＦＲを、同一である標準的条件下に固定化できる。典型的に、両条件下での吸着または固定化を促進するために使用する緩衝液は中性または生理的緩衝液である。生理的緩衝液の例は、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、ハンクス平衡塩溶液(ＨＢＳＳ)、リンゲルまたはクレブスを含むが、これらに限定されない。ｐＨおよび緩衝能はアッセイ条件の関数であり、当業者により経験的に決定または選択できる。生理的緩衝液の例は、クレブス−リンゲル重炭酸(ＫＲＢ)緩衝液(Sigma Aldrich, Catalog No. K4002)である。さらに、固定化剤、典型的に同族結合パートナーの固相支持体上への吸着または固定化を、ヒト血清を天然環境条件を模倣するために接触工程またはスクリーニングにおいて使用するために、ヒト血清を含まない緩衝液中で行う。
ＫＲＢ緩衝液または他の類似生理的緩衝液中の様々な濃度のＥＧＦＲを固相支持体に吸着できる。例えば、正確にまたは約１〜５０nM、例えば、３〜３０nM、例えば５〜２０nM、例えば、正確にまたは約３nM、６nM、９nM、１２nM、１３nM、１４nM、１５nM、１６nM、１７nM、１８nM、１９nM、２０nM、２５nM、３０nM、３５nM、４０nMまたは５０nMを吸着できる。吸着するＥＧＦＲの量は結合剤の関数であり、例えば、標的抗原への結合が知られたコントロールの使用により、経験的に決定できる。吸着は、固相支持体上の結合部位への同族結合タンパク質の結合を可能にする任意の所望の長さの時間および温度で進むことができる。例えば、吸着は、一般に４℃〜３７℃、例えば４℃、室温(すなわち、２２℃)または３７℃で行う。吸着の時間は一般に３０分〜４８時間またはそれ以上であり、温度の関数として変わり得る。
ＥＧＦＲの支持体への付加後、本方法の次工程を２個の別々のアッセイとして行い得る。例えば、支持体を、２個の異なるアッセイ条件、例えば低ｐＨおよび中性ｐＨ下での結合アッセイの実行のために別々に処理する。条件はまた２０〜５０％血清(vol/vol)または１０〜５０mg／mLタンパク質(例えば血清アルブミン)を含み得る。ある例において、別々のアッセイの実施に際し、変える条件は緩衝液条件に関するもののみであることは理解される。時間および温度インキュベーション条件は、一般に平行アッセイで同一である。
ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体の添加前に、固相支持体表面上の非特異的タンパク質結合部位を、典型的に遮断する。それゆえに、抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲを接触させる工程は、典型的にブロッキング後に実施できる。固相支持体のブロッキングは、固相支持体への非特異的結合を減らし、背景シグナルを減らし、吸着タンパク質への非特異的結合を減らし、吸着タンパク質を安定化する。ブロッキング条件の選択は当業者の能力の範囲内である。当分野で記載されているあらゆるブロッキング条件をここに提供する方法において使用できる。
典型的に、インキュベーション反応を、抗ＥＧＦＲ抗体をＥＧＦＲに結合させる任意の所望の長さの時間および温度で実施できる。例えば、結合は、一般に４℃〜３７℃、例えば４℃、室温または３７℃で実施する。結合の時間は一般に３０分〜４８時間またはそれ以上であり、温度の関数であり得る。例えば、接触を１mM乳酸、ｐＨ７.４および２５％ヒト血清と行い得る。別に、接触工程を１６.５mM乳酸、ｐＨ６.０、２５％ヒト血清で行い得る。各接触反応において、接触は１時間、室温(すなわち、２２℃)であり得る。固相支持体を、結合に使用したのと同一緩衝液で洗浄し、未結合標的抗原を除去し得る。ある例において、ＥＬＩＳＡアッセイを、種々の濃度の修飾抗ＥＧＦＲ抗体の存在下で実施できる。一般に、種々の濃度を連続希釈で試験する。全上清、希釈上清または精製タンパク質を試験できる。
ＥＧＦＲと結合する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、当業者に知られるあらゆるアッセイまたは方法を使用して、選択または同定できる。典型的に、反応を、結合分子またはタンパク質の検出を可能にする任意の所望の長さの時間および温度で実施できる。例えば、検出は、一般に４℃〜３７℃、例えば４℃、室温または３７℃で行う。結合の時間は、一般に３０分〜４８時間またはそれ以上であり、温度の関数である。典型的に、結合分子またはタンパク質の結合は、室温で、正確にまたは約３０分〜４時間、例えば１時間〜２時間、例えば約１時間である。固相支持体を、結合に使用したのと同一緩衝液で洗浄し、未結合標的抗原を除去できる。
結合活性を各アッセイ条件下で決定したら、第一条件(例えば低ｐＨおよび／または高乳酸濃度)および第二条件(例えば正常ｐＨおよび／または低乳酸濃度)下の結合活性を比較する。例えば、各ウェルの光学密度(または２個以上のウェルの平均)を比較できる(例えば、表１５および１６参照)。ある例において、各ウェルの光学密度(または２個以上のウェルの平均)を修飾抗ＥＧＦＲ抗体の濃度で割り、比活性を計算する。ある例において、比活性を、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の比活性を、例えば、セツキシマブを含む参照抗体、例えば抗ＥＧＦＲ親抗体の比活性で割ることにより、各修飾抗ＥＧＦＲ抗体について規準化比活性(ＮＳＡ)を得るために規準化する(例えば、表１６参照)。
中性ｐＨよりも低ｐＨで大きな活性を有する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を同定できる。ある例において、中性ｐＨよりも低ｐＨで高い結合活性を有する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を同定できる。例えば、中性ｐＨでのＮＳＡよりも低ｐＨで大きなＮＳＡを有する抗ＥＧＦＲ抗体を同定できる。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体は、１、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.１、２.２、２.３、２.４、２.５、２.６、２.７、２.８、２.９、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、５.５、６.０、７.０、８.０またはそれ以上である(低ｐＨでのＮＳＡ)／(中性ｐＨでのＮＳＡ)の比を有する。ある例において、閾値、例えば０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０またはそれ以上を超える、(低ｐＨでのＮＳＡ)を有する抗ＥＧＦＲ抗体を同定する。ある例において、カットオフ値、例えば０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０またはそれ以上より低い(中性ｐＨでのＮＳＡ)を有する抗ＥＧＦＲ抗体を同定する。中性ｐＨよりも低ｐＨで活性名抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、１個以上のこれらに基準に合う抗ＥＧＦＲ抗体を含み得る。ある例において、低ｐＨはｐＨ６.０またはｐＨ６.５である。ある例において、中性ｐＨはｐＨ７.４である。
ここに記載するＥＬＩＳＡ方法を実施例１に例示する。ＥＬＩＳＡ方法の工程および本方法の要素のさらなる記載を下に提供する。
ここに提供する結合アッセイで使用できる固相支持体は、分子、例えば試験分子またはタンパク質の同族結合パートナー、例えばリガンド、受容体または抗原を添付できるあらゆる担体を含む。典型的に、変異体試験分子(例えば抗体変異体、例えば抗ＥＧＦＲ抗体変異体のライブラリーまたはコレクション)のハイスループットスクリーニングを促進するために、同族結合パートナーを固相支持体に添付する。ここに提供する方法において固相支持体として使用するための担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース類、天然および修飾セルロース類、ポリアクリルアミド類、アガロース類および磁気固相支持体、例えばマグネタイトを含む固相支持体を含むが、これらに限定されない。固相支持体は、１個以上のビーズまたは粒子、マイクロスフェア、チューブまたはプレートの表面、フィルター膜および当分野で知られる他の固相支持体であり得る。固相支持体系の例は、多ウェルプレートまたは膜を含む、例えば、ガラス、シリコン、金属、ナイロン、セルロース、可塑性または混合物から構築された、平面を含むがこれらに限定されず；またはビーズ、例えばシリカゲル、制御された細孔ガラス、磁気(Dynabead)またはセルロースビーズの形であり得る。さらに、このような方法は、懸濁液での使用に適合できまたはカラムの形であり得る。
特定のアッセイ条件によって、適切な固相支持体を選択するのは当業者のレベルの範囲内である。例えば、ニッケル被覆マイクロプレートは、緩衝液ｐＨが高結合型ではなくＮｉ被覆プレートへの抗原コーティングに影響を与え得るために、Ｈｉｓタグ付きタンパク質の結合にあまり適さない。固相支持体が種々のｐＨ条件で使用するのに適するか否かを決定するのは、当業者のレベルの範囲内である。
試験分子または同族結合パートナーを、当業者に知られるあらゆる方法により固相支持体に固定化できる。結合のための共有結合または非共有結合方法を使用できる。典型的に、試験分子または同族結合パートナー(例えばリガンドまたは抗原)を、水性媒体からの吸着により固定化する。ある例において、吸着は、病的微小環境(例えば腫瘍または癌微小環境)を模倣する条件下、正常微小環境を模倣する条件下または当業者に知られる標準的条件下に実施できる。例えば、吸着は、正確にまたは約６.０〜７.４のｐＨ範囲、ある例において正確にまたは約ｐＨ７.４の緩衝液を使用して実施できる。特に、吸着を行うために、高結合型マイクロプレートを固相支持体として使用できる。高結合型プレートは当業者に知られ、種々の製造者から容易に入手可能である(例えば、eBioscience, San Diego, CA, Cat. No. 44-2404-21から入手可能なNuncMaxisorp平底プレート；Costar 96-well EIA/RIA Stripwell plate, Costar 2592参照)。
他のモードの付加、例えば共有結合性カップリングまたは他の周知の 標的タンパク質を固体マトリックスに付加する方法も使用できる。治療的タンパク質および／または同族結合パートナーの結合の共有結合方法は化学的架橋方法を含む。反応性試薬は、支持体とタンパク質または同族結合パートナーの官能基の間に共有結合を形成できる。化学的に反応できる官能基の例は、アミノ基、チオール基およびカルボキシル基である。Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、Ｎ−ヒドロスクシンイミドおよびグルタラルデヒドは、官能基と反応する試薬の例である。他の例において、試験分子および／または同族結合パートナーは、例えば、免疫親和性またはリガンド−受容体相互作用(例えばビオチン−ストレプトアビジンまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−グルタチオン)であるが、これらに限定されない方法により、固相支持体に間接的に結合できる。例えば、試験分子は、ＥＬＩＳＡプレートまたは他の類似アドレス可能アレイに被覆できる。
ブロッキング溶液は、ヒト、ウシ、ウマまたは他の血清アルブミンのものを含む。典型的に、ブロッキング溶液はヒト血清を含む。固相支持体、例えばプレートのブロッキングは、１個以上のブロッキング剤を添加する結合アッセイ緩衝液を使用して実施できる。ブロッキング剤の例は、１〜５％ウシ血清アルブミン、１〜５％脱脂粉乳および２５％ヒト血清を含む。洗剤、例えばTween-20および防腐剤、例えばチメロサールをブロッキング溶液に添加できる。結合アッセイ緩衝液は、すなわち、腫瘍微小環境緩衝液または正常生理的緩衝液を含む。水性タンパク質溶液−固相支持体混合物は、典型的に３０分、１時間またはそれより長い時間維持され、温度の関数として変わり得る。ブロッキング反応は任意の温度で実施でき、一般に４℃〜３７℃、例えば４℃、室温(すなわち、２２℃)または３７℃で実施できる。ある例において、反応を少なくとも１個の時間、約４℃〜３７℃の温度で進行させる。例えば、ブロッキングを、室温で１時間で達成できる。インキュベーションおよびブロッキング後、得られた固相を、その後未結合タンパク質がなくなるようにすすぎ、その後試験分子(例えば治療的タンパク質または抗体またはその変異体)と接触させる。
酵素標識の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む。シグナル発生のために添加できる酵素基質の例は、Sureblue TMB Microwell Peroxidase Substrate 1-component(KPL, #52-00-03)を含む、ＰＮＰＰ(ｐ−ニトロフェニルホスフェート、二ナトリウム塩)、ＡＢＴＳ(２,２’−アジノビス[３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸]−ジアンモニウム塩)、ＯＰＤ(ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド)およびＴＭＢ(３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン)(SOMA Labs, Romeo, Mich.)を含む。反応を停止試薬(例えばＴＭＢ停止溶液)の添加により停止できる。適切な波長(すなわち４５０nm)での吸光度を決定できる。
蛍光のために、多数の蛍光光度計が利用可能である。化学発光体、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)のために、ルミノメーターまたはフィルムが利用可能である。酵素を用いて、蛍光、化学発光または着色産物を、蛍光定量的、発光定量的、分光光度的または視覚的に決定または測定できる。例えば、抗タグ剤を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)または他の検出可能剤とコンジュゲートできる。
蛍光、放射性または他の検出可能部分の存在により、検出を促進できる。典型的に、抗ＥＧＦＲ抗体がタグ付けされているために、検出を抗タグ剤を使用して行う。抗タグ剤の選択は、結合分子またはタンパク質と用いるタグの関数である。さらに、アッセイで使用する環境条件(例えばｐＨ)と適合性である抗タグ剤を選択する。このような試薬の同定または選択およびアッセイ条件とのその適合性の試験は当業者のレベルの範囲内である。例えば、実施例はこのような方法を例示する。
抗タグ剤は、例えば商業的起源または他の起源から容易に入手可能である。ここでの方法における検出で使用可能な抗タグ剤の例は、抗ＦＬＡＧ抗体または抗Ｍｙｃ抗体(Abcam, Cambridge, MA; GeneTex, Irvine, CAのような業者から入手可能)を含むが、これらに限定されない。
典型的に、ここでの方法において、結合複合体の検出方法は、活性のレベルを評価できるように、定量化され得るものである。例えば、標識は、シグナル、例えば発色シグナル、化学発光シグナル、化学蛍光シグナルまたは放射性シグナルを生じ得る。標識の性質によって、標識を検出または検出し、定量するための種々の技術を用い得る。例えば、定量化方法は、分光光度的方法、蛍光方法および放射性方法を含むが、これらに限定されない。
ｂ)免疫沈殿
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、免疫沈殿によるＥＧＦＲへの結合の検出により評価できる。免疫沈殿プロトコルは、一般に溶解緩衝液、例えば１％NP-40 Alternative、２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、１３７mM ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２mM ＥＤＴＡ、１mM活性化オルトバナジン酸ナトリウム、１０μg／mL アプロチニン、１０μg／mL ロイペプチン；またはＲＩＰＡ緩衝液(１％ＮＰ−４０またはTriton X-100、１％デオキシコール酸ナトリウム、０.１％ＳＤＳ、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７.２、１％トラジロール)で細胞集団を溶解することを含む。溶解緩衝液は、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤(例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム)を補い得る。付加的工程は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の細胞ライセートへの添加、および一定時間(例えば、１〜４時間)、４０℃でのインキュベーション、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇセファロースビーズの細胞ライセートへの添加、約１時間またはそれ以上、４０℃でのインキュベーション、ビーズの溶解緩衝液での洗浄およびビーズのＳＤＳ／サンプル緩衝液への再懸濁を含む。修飾抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲを免疫沈殿させる能力を、例えば、ウェスタンブロット分析により評価できる。当業者は、抗体の抗原への結合を高め、背景を下げるために修飾できるパラメータについて熟知している(例えば、細胞ライセートのセファロースビーズでの予洗)。免疫沈殿プロトコルに関するさらなる議論について、例えば、Ausubel et al., Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1参照。
ｃ)ウェスタンブロット
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、ＥＧＦＲへの結合をウェスタンブロットで検出することにより評価できる。ウェスタンブロット分析は、一般に抽出物サンプルの調製(例えばＥＧＦＲを発現する組織または抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる疾患または障害、例えばここに記載する疾患または障害を有する対象または患者からの組織)を含む。付加的工程は、ポリアクリルアミドゲル(例えば、抗原分子量によって８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)または２−Ｄゲル電気泳動(例えば、ＷＯ０４／０４３２７６参照)でのサンプルの電気泳動、サンプルのポリアクリルアミドゲルから膜、例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンへの移動、膜のブロッキング溶液(例えば、３％ＢＳＡまたは脱脂乳含有ＰＢＳ)でのブロッキング、膜の洗浄緩衝液(例えば、ＰＢＳ−Tween 20)での洗浄、膜のブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体(すなわち目的の抗体)でのプロービング、膜の洗浄緩衝液での洗浄、膜の、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)または放射性分子(例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ)とコンジュゲートした二次抗体(一次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体)でのプロービング、膜の洗浄緩衝液での洗浄および抗原の存在の検出を含む。当業者は、検出シグナルを高め、背景ノイズを下げるために修飾できるパラメータについて熟知している。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる議論について、例えば、Ausubel et al., Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1参照。
ｄ)免疫組織化学
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性は、ＥＧＦＲへの結合の免疫組織化学による検出により評価できる。免疫組織化学は、一般に組織サンプルの調製(例えばＥＧＦＲを発現する組織または抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる疾患または障害、例えばここに記載する疾患または障害を有する対象または患者からの組織から)、タンパク質分子をその天然立体配座に保存するための組織の固定、組織を透過するためのサンプルの透過処理試薬(例えばTween、Nonidet P40)への入浴、サンプルのブロッキング溶液(例えば、３％ＢＳＡまたは脱脂乳含有ＰＢＳ)でのブロッキング、サンプルの洗浄緩衝液(例えば、ＰＢＳ−Tween 20)での洗浄、サンプルの、ブロッキング緩衝液で希釈した抗ＥＧＦＲ抗体(例えばここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体)でのプロービング、サンプルの洗浄緩衝液での洗浄、サンプルの、ブロッキング緩衝液で希釈した蛍光色素(例えばフルオレセインイソチオシアネート、Alexa fluor、ローダミン)とコンジュゲートした二次抗体(抗ＥＧＦＲ抗体を認識)でのプロービング、サンプルの洗浄緩衝液での洗浄および蛍光顕微鏡を介する抗原の存在の検出を含む。当業者は、検出シグナルを高め、背景ノイズを下げるために修飾できるパラメータについて熟知している。
ｅ)放射免疫アッセイ
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、ＥＧＦＲへの結合の放射免疫アッセイによる検出により評価できる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体の抗原、例えばＥＧＦＲへの結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフ速度を、例えば、競合的結合アッセイにより決定できる。競合的結合アッセイの一例は、存在する未標識抗原の量を増やしながら、目的の抗体と標識抗原(例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ)をインキュベーションし、標識抗原に結合した抗体を検出することを含む、放射免疫アッセイである。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲに対する親和性および結合オフ速度を、スキャッチャードプロット分析によりデータから決定できる。第二抗体との競合はまた放射免疫アッセイを使用しても決定できる。この場合、ＥＧＦＲ抗原、例えばＥＧＦＲ可溶性フラグメントを、存在する未標識第二抗体の量を増やしながら、標識化合物(例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ)とコンジュゲートしたここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体とインキュベートする。
ｂ. 溶液結合アッセイ
溶液結合アッセイを、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性の測定に使用できる。ある例において、溶液結合アッセイを、抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲまたはフラグメントまたはその変異体、例えば可溶性ＥＧＦＲフラグメントへの結合の測定に使用する。当業者はここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の結合を測定するために溶液結合アッセイを選択できる。以下は、使用できる溶液結合アッセイの例の簡単な記載である。しかしながら、これらは限定的であることを意味せず、当業者に知られるあらゆる溶液結合アッセイが、ここに提供する方法における使用のために意図され、平衡透析、競合的結合アッセイ(例えば、Myers et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、放射標識結合アッセイ(例えば、Feau et al., (2009) J. Biomol. Screen. 14(1):43-48)、熱量測定(等温滴定熱量測定(ＩＴＣ)および示差走査熱量測定(例えば、Perozzo et al., (2004) J. Recept Signal. Transduct Res. 24(1-2):1-52; Holdgate (2001) Biotechniques 31(1):164-166, 168, 170), Celej et al. (2006) Anal. Biochem. 350(2):277-284)を含む)および蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを含むスペクトル蛍光アッセイを含む。結合活性を溶液で測定するときのここでの方法の条件は、本明細書の記載に基づき当業者が決定できる。例えば、条件は、固相支持体上で実施する結合アッセイについて上記した条件から適合できる。
ｉ. 等温滴定熱量測定(ＩＴＣ)
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、ＥＧＦＲへの結合の等温滴定熱量測定(ＩＴＣ)による検出により評価できる。ＩＴＣにおいて、一結合パートナーを、他の結合パートナーを含む溶液中に滴定し、それにより発熱または吸熱がおこり、これを熱量計で定量する。ＩＴＣは、ナノモルまたはそれ未満の量の反応物からの熱効果の検出に使用できる。例えば、等温滴定熱量測定アッセイを、治療的タンパク質の同族結合パートナーへの結合に関与する、結合の自由エネルギー(ΔＧ)、結合のエンタルピー(ΔＨ)およびエントロピー(ΔＳ)および熱容量変化(ΔＣｐ)を含む、全熱力学的パラメータの測定に使用できる。これらの特性の分析は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲの間の結合の活性および熱力学的パラメータの解明を助ける(Perozzo et al., (2004) J. Recept. Signal. Transduct. Res. 24(1-2):1-52)。ＩＴＣを使用したＥＧＦＲへの結合の検出による抗ＥＧＦＲ抗体の活性の測定は当業者の能力の範囲内である(例えば、Alvarenga et al. (2012) Anal. Biochem 421(1):138-151参照)。
ii. スペクトルアッセイ
スペクトルアッセイを、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性測定に使用できる。抗ＥＧＦＲ抗体およびＥＧＦＲの結合は、ＵＶ−ｖｉｓスペクトル技術、蛍光アッセイ例えば蛍光共鳴エネルギー移動アッセイおよび蛍光消光アッセイを含む、当業者に知られるあらゆるスペクトルアッセイにより検出できる(Wu et al. (2007), J. Pharm. Biomed. Anal.44(3):796-801)。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体ＥＧＦＲへの結合の結果としての蛍光またはＵＶ／ｖｉｓ吸収の変化、例えば固有蛍光の消光を検出できる。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体および／またはＥＧＦＲを、蛍光標識またはＵＶ／ｖｉｓ標識で標識できる。抗ＥＧＦＲ抗体の標識は当業者の能力の範囲内である(例えば、Gleysteen et al. (2008) Head & Neck 30(6):782-789; Rosenthal et al. (2007) Mol. Cancer Ther. 6:1230-1238参照)。スペクトルシグナル測定後、観察された結合定数を計算できる(例えば、Zhang et al. (2009) Spectrochim Acta A Biomol. Spectrosc. 72(3):621-626)。
２. 細胞アッセイ
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を測定するためのアッセイは、細胞アッセイを含む。使用できる細胞株は、文献に記載されたあらゆる細胞株または寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection(ＡＴＣＣ)から得ることができる細胞株を含む。当業者は、所望の特性の細胞株を選択できる。一般に、アッセイは、ＥＧＦＲを発現することが知られた細胞株を使用して行う。このような細胞は当業者に知られる。例えば、細胞株を同定するために、ＡＴＣＣカタログ(atcc.org)を参考とし得る。また、特定の細胞型が望ましいならば、このような細胞および／またはその直ちに入手可能な起源を得る手段は当業者に知られる。科学論文の分析は、ＥＧＦＲを発現する細胞の適当な選択を容易に明らかにし得る。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体をスクリーニングする細胞アッセイにおいて使用できるＥＧＦＲを発現する細胞株の例は、ＤｉＦｉヒト結腸直腸癌細胞、Ａ４３１細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５５)、Ｃａｃｏ−２結腸直腸腺癌細胞(ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３７)、ＨＲＴ−１８結腸直腸腺癌細胞(ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４４)、ＨＴ−２９結腸直腸腺癌細胞(ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８)、ヒト新生児ケラチン生成細胞およびＭＣＦ１０Ａ上皮性細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０３１７)を含む(例えば、Olive et al. (1993) In Vitro Cell Dev Biol. 29A(3 Pt 1):239-248; Wu et al. (1995) J. Clin. Invest. 95(4): 1897-1905参照)。ここに記載する細胞アッセイで使用できる細胞の例は、例えば、ここに記載されている腫瘍または癌細胞を含む、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる細胞を含む。
ある例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに記載するアッセイの活性を測定するためのアッセイは、抗ＥＧＦＲ抗体の副作用、例えばここに記載するまたは当分野で知られる副作用のいずれかと関連する組織からの細胞株を使用して行う。例えば、アッセイを皮膚細胞株を使用して実施できる。ＥＧＦＲは、ケラチン生成細胞、例えば基底ケラチン生成細胞および毛包の外毛根鞘；およびエクリンおよび皮脂腺の細胞を含む数細胞型で発現される(Albanell et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):110-124; Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5; Nanney et al. (1990) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748)。ある例において、ここに提供される抗ＥＧＦＲ抗体の活性を測定するための細胞アッセイは、ケラチン生成細胞、例えば、例えば、ヒト新生児ケラチン生成細胞；毛包の外毛根鞘からの細胞；およびエクリンおよび皮脂腺の細胞を使用して実施する。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の活性を測定する細胞アッセイにおいて使用できる他の細胞は、例えば、メラニン形成細胞、例えば、例えば、新生児メラニン形成細胞；ランゲルハンス細胞；線維芽細胞；メルケル細胞；神経細胞；腺細胞；皮脂腺細胞(脂腺細胞)；および例えば皮膚線維芽細胞および創傷線維芽細胞のような線維芽細胞を含む。このような細胞の培養方法は当業者の能力の範囲内である(例えば、Limat and Hunziker (1996) Methods Mol Med. 2:21-31; Abdel-Naser et al. (2005) Egypt. Dermatol. Online J. 1(2):1参照)。
ＥＧＦＲを発現する細胞株は、一過性または安定トランスフェクションにより産生できる。さらに、任意の一次細胞または細胞株を、例えば蛍光標識され抗ＥＧＦＲ抗体および蛍光活性化細胞ソーティング(ＦＡＣＳ)の使用により、ＥＧＦＲの発現について評価できる。細胞株の例はＡ５４９(肺)、ＨｅＬａ、ジャーカット、ＢＪＡＢ、Ｃｏｌｏ２０５、Ｈ１２９９、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３、ＨＵＭＥＣ、ＨＵＶＥＣおよびＰｒＥＣを含む。
ある例において、精製または未精製の、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体、を細胞に外的に添加する。ある例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体をコードする１個以上の核酸を、細胞、例えばここに記載されている細胞での発現に適するベクターに導入する。細胞を、ベクターで遺伝子導入し、抗ＥＧＦＲ抗体治療的タンパク質が細胞により発現される。抗ＥＧＦＲ抗体は分泌型、可溶性分子または細胞内抗体として発現され得る。トランスフェクションの方法は当業者に知られ(例えば、Kaufman R.J. (1990) Methods in Enzymology 185:537-566; Kaufman et al. (1990) Methods in Enzymology 185:537-566; Hahn and Scanlan (2010) Top. Curr. Chem. 296:1-13参照)、例えば、化学的方法、例えばポリカチオン性シクロデキストリンベクター(例えば、Cryan et al, (2004) Eur J Pharm Sci. 21(5):625-33)およびカチオン性リポソームを含むリポソーム複合体を含む(例えばGao and Huang (1995) Gene Ther. 2(10):710-722参照)。使用できるカチオン性リポソームの例は、米国特許番号７,９８９,６０６に記載のものを含み、３−ベータ−[Ｎ−(Ｎ’,Ｎ’−ジメチル−アミノエタン)−１−カルバモイル]−コレステロール(ＤＣ−Ｃｈｏｌ)、１,２−ビス(オレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニオ−プロパン(ＤＯＴＡＰ)(例えば、国際特許公開番号ＷＯ９８／０７４０８参照)、リシニルホスファチジルエタノールアミン(Ｌ−ＰＥ)、リポポリアミン類、例えばリポスペルミン、Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)−Ｎ,Ｎ−ｄ−ジメチル−２,３−ビス(ドデシルオキシ)１−プロパンアミニウムブロマイド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(ＤＤＡＢ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、Ｎ(１,２,３−ジオレイルオキシ)プロピル−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリエチルアンモニウム(ＤＯＴＭＡ)、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＧＬ−６７、ＧＬ−８９、リポフェクチンおよびリポフェクタミンを含む(Thiery, et al. Gene Ther. (1997); Felgner, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. (1995); Eastman, et al., Hum. Gene Ther. (1997))。トランスフェクションの方法はまた非化学的方法、例えばエレクトロポレーション(Chu et al. (1987), Nucl. Acid. Res. 15(3) 1311-1326)、ソノポレーション(例えば、Kumon, et al (2009), Ultrasound Med Biol. 35(3):494-506)、遺伝子銃(例えば、O'Brien and Lummis (2004) Methods 33(2):121-125)およびウイルス形質導入(例えば、Flotte and Carter (1995) Gene Ther. 2(6):357-362)も含む。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性は、例えば、細胞の表面への結合を検出できるあらゆるアッセイを使用して評価できる。活性はまた抗ＥＧＦＲ抗体の機能的活性の評価により評価できる。ある例において、アッセイは、抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲと結合し、ある生化学的事象、例えば細胞溶解、食作用、リガンド／受容体結合阻害、成長および／または増殖の阻害およびアポトーシスのようなエフェクター機能を仲介する生物学の能力に基づき得る。
このようなアッセイは、しばしば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体に対する細胞応答、例えば細胞生存、細胞死、細胞食作用、細胞溶解、細胞形態学の変化または転写活性化、例えば天然遺伝子またはレポーター遺伝子の細胞発現のモニタリングを含む。例えば、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、フローサイトメトリー、細胞分離技術、蛍光活性化細胞ソーティング(ＦＡＣＳ)、相顕微鏡、蛍光顕微鏡、受容体結合アッセイ、細胞シグナル伝達アッセイ、免疫細胞化学、レポーター遺伝子アッセイ、細胞形態学(例えば、細胞体積、核体積、細胞周囲長および核周囲長)、リガンド結合、基質結合、ヌクレアーゼ活性、アポトーシス、走化性または細胞遊走、細胞表面マーカー発現、細胞増殖、ＧＦＰ陽性および色素希釈アッセイ(例えば、細胞膜に結合する色素での細胞トラッカーアッセイ)、ＤＮＡ合成アッセイ(例えば、３Ｈ−チミジンおよび蛍光ＤＮＡ結合色素、例えばＢｒｄＵまたはＨｏｅｃｈｓｔ色素とＦＡＣＳ分析)および核内フォーカスアッセイは全て、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性測定に適切なアッセイである。測定できる他の機能的活性は、リガンド結合、基質結合、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性、既知および非特徴付け遺伝子マーカーの両者に対する転写変化(例えば、ノーザンブロット)、細胞代謝変化、細胞増殖、細胞表面マーカー発現、ＤＮＡ合成、マーカーおよび色素希釈アッセイ(例えば、ＧＦＰおよび細胞トラッカーアッセイ)に関連する変化、接触阻害、ヌードマウスにおける腫瘍増殖およびその他を含むが、これらに限定されない。
例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲを発現することが知られる細胞の１個以上の表現型の調節について評価できる。その使用のための表現型アッセイ、キットおよび試薬は当業者に周知であり、ここで、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性測定に使用する。いくつかの業者の一つから購入できる代表的表現型アッセイは、細胞生存能、細胞毒性、増殖または細胞生存を決定するためのもの(Molecular Probes, Eugene, Oregon; PerkinElmer, Boston, Mass.)、酵素アッセイを含むタンパク質ベースのアッセイ(Panvera, LLC, Madison, Wis.; BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J.; Oncogene Research Products, San Diego, Calif.)、細胞制御、シグナル形質導入、炎症、酸化的過程およびアポトーシス(Assay Designs Inc., Ann Arbor, Mich.)、トリグリセリド蓄積(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.)、血管形成アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイおよび代謝アッセイ(Chemicon International Inc., Temecula, Calif.; Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.)を含む。
特定の表現型アッセイに適すると決定された細胞(すなわち、ここに記載するまたはＥＧＦＲを発現することが当分野で知られる任意の細胞)を抗ＥＧＦＲ抗体ならびにコントロール抗体で処理できる。ある例において、ＥＧＦまたはそのフラグメントを、受容体の活性化が起こるように包含させる。処理期間の最後に、処理および未処理細胞を、ここに記載するまたは当分野で知られる１個以上の方法で分析できる。ある例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、細胞形態学の変化の測定、ＥＧＦＲリン酸化または細胞増殖の測定により評価できる。
アッセイは、ＥＧＦＲおよび／またはＥＧＦＲを発現する細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の効果を評価するために実施できる。ある例において、ＥＧＦＲの活性は、抗体がＥＧＦまたは他の刺激剤の作用を調節(例えば阻害)するならば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の存在下または存在下、ＥＧＦまたは他の刺激剤の存在下で刺激され得る。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦがＥＧＦＲと相互作用するのブロッキングにより作用できる。それゆえに、ここでのスクリーニング方法は、アンタゴニスト抗ＥＧＦＲ抗体の同定を可能にする。
例えば、ＥＧＦＲリン酸化アッセイを、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲのリン酸化を阻害する能力の測定に使用できる。ＥＧＦの、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合体は受容体二量体化およびチロシンリン酸化を誘発し、非制御の増殖を生じ得る(Seshacharyulu et al. (2012) Expert. Opin. Ther. Targets. 16(1):15-31)。抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害し、ＥＧＦＲリン酸化を減少できる(例えば、米国特許番号８,０７１,０９３参照)。それゆえに、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の活性は、リン酸化ＥＧＦＲの検出により評価できる。ある例において、リン酸化ＥＧＦＲを、当分野で知られるまたはここに記載する方法を使用するＥＬＩＳＡアッセイにより、細胞ライセートで検出できる(例えば、実施例６および図３参照)。阻害効果に対する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の用量依存性を、リン酸化ＥＧＦＲの濃度を修飾抗ＥＧＦＲ抗体の濃度に対してプロットすることにより決定できる。ＥＧＦＲのチロシンリン酸化形態は、例えば、Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo.)、RAYBIO(Norcross, Ga)またはThermo Scientific(Rockford, IL)から入手可能な、ＥＧＦＲホスホＥＬＩＳＡキットを使用して検出できる。
増殖アッセイを、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性の測定に使用できる。アッセイは、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体によるＥＧＦＲを発現する細胞の増殖阻害を測定できる。細胞を、細胞増殖に十分な時間インキュベートし得る(例えば、１２時間または１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間またはそれより長い)。細胞増殖を、当分野で知られるあらゆる方法で測定でき、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ、５−ブロモ−２−デオキシウリジン(ＢｒｄＵ)ＥＬＩＳＡ、テトラゾリウムマイクロプレートアッセイおよび酸ホスファターゼアッセイを含む(例えば、Maghni et al. (1999) J. Immunol. Method. 223(2):185-194)。細胞増殖はまたInvitrogen(Cyquant NF cell proliferation assay kit)、Cambrex(ViaLight HS(high sensitivity) BioAssay)、Promega(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay、Guava Technologies(CellGrowth assay)、Stratagene(Quantos cell proliferation assay)から入手可能なキットを使用して測定できる(例えば、Assays for Cell Proliferation Studies, Genetic Eng. Biotechnol. News. 26(6))。ある例において、細胞増殖を、抗体無しの細胞増殖に対して規準化できる。増殖アッセイの例において、アッセイする抗ＥＧＦＲ抗体を含む通常の増殖培地中の細胞を９６ウェルプレートのウェルにで添加できる。細胞増殖アッセイの例を実施例７に記載する。
３. 動物モデル
動物モデルを使用するインビボを、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の治療活性を評価するために実施できる。抗ＥＧＦＲ抗体を、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体での治療が考慮される疾患および状態の動物モデルに投与し得る。このような動物モデルは当分野で知られ、ヒト癌外植片または継代された異種移植片組織が免疫無防備状態動物、例えばヌードまたはＳＣＩＤマウスに導入された異種間癌モデルを含むが、これに限定されない(例えば、Klein. et al. (1997) Nature Medicine 3:402-408参照)。有効性を、腫瘍形成、腫瘍収縮または転移の阻害を測定するアッセイを使用して、予測できる。動物モデルはまた、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の副作用の評価にも使用できる。
種々の腫瘍細胞株または腫瘍動物モデルは当業者に知られ、ここに記載されている。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を腫瘍担持動物に投与し、体重および腫瘍体積をモニターできる。さらなる例において、有害副作用を評価するために、抗ＥＧＦＲ抗体を正常動物に投与し、体重をモニターできる。抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる疾患または状態の処置の指標であるパラメータのモニタリングにより評価できる。例えば、抗腫瘍形成能の指標であるパラメータは腫瘍サイズの収縮および／または腫瘍進行遅延である。それゆえに、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を、腫瘍増殖またはサイズを減少させるものの同定のために評価できる。腫瘍サイズは、抗ＥＧＦＲ抗体で処置した腫瘍担持ヒトまたは動物モデルでインビボで評価できる。腫瘍収縮または腫瘍サイズは、当分野で知られる種々のアッセイ、例えば、体重、体積または物理的測定により評価できる。
腫瘍担持動物モデルを産生できる。インビボ腫瘍を、免疫欠損齧歯類への腫瘍細胞の接種または移植(例えば皮下注射による)により産生された異種移植腫瘍、対応する免疫適格性マウスまたはラット系へのマウスまたはラット腫瘍細胞株の接種(例えば皮下注射による)により産生された同質遺伝子的腫瘍モデル、動物モデルに移植された一次腫瘍の転移により産生された転移腫瘍、腫瘍細胞の起源と同一種への腫瘍細胞の移植により産生された同種移植片腫瘍および動物の遺伝子操作により産生された自然発症腫瘍を含む、あらゆる知られた方法により産生できる。腫瘍モデルを、同所性に、腫瘍細胞をその起源の組織または臓器に注射することにより、例えば、乳房腫瘍細胞をマウス乳房脂肪体に移植することにより産生できる。ある例において、異種移植モデルまたは同質遺伝子的モデルを使用する。例えば、腫瘍を、免疫適格性宿主(同質遺伝子的)または免疫欠損宿主(例えばヌードまたはＳＣＩＤマウス；異種移植片)に腫瘍細胞懸濁液(例えば１×１０６〜５×１０６細胞／動物)を皮下注射することにより、右腋窩に確立できる。動物モデルは、例えば、サルおよびマウスを含む哺乳動物のような、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる生物におけるモデルを含む。
腫瘍は同質遺伝子的、同種異系間または異種間であり得る。腫瘍は、内在性または外来性ＥＧＦＲを発現し得る。外来性ＥＧＦＲ発現は、適当な核酸を含む細胞のトランスフェクションまたは形質導入を介して、当分野で知られたまたはここに記載する組み換え発現の方法を使用して達成できる。細胞株の例は、ＥＧＦＲ遺伝子導入ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＣＦ７(ヒト乳房)、ヒト類表皮扁平上皮癌Ａ４３１、口内扁平上皮細胞癌(ＯＳＣＣ)細胞株ＢｃａＣＤ８８５、ＣＯＬＯ ３５６／ＦＧ膵細胞株およびＬＳ１７４Ｔ結腸直腸腫瘍を含む(例えば、Santon et al., (1986) Cancer Res. 46:4701-05 and Ozawa et al., (1987) Int. J. Cancer 40:706-10；米国特許公開番号２０１１０１１１０５９；Reusch et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(1):183-190; and Yang et al. (2011) Int. J. Nanomedicine 6:1739-1745参照)。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、多様な同所性腫瘍モデルで試験できる。これらの動物モデルは、当業者により、例えば、膵癌、前立腺癌および乳癌のような、高悪性度癌の病態生理の研究および治療に使用される。無胸腺ヌードまたはＳＣＩＤマウスを含むが、これらに限定されない免疫欠乏マウスを、ドナー患者のヒト腫瘍細胞またはフラグメントの臓器内注射部位(例えば膵臓、前立腺または乳腺)から広がった局所および全身腫瘍のスコアリングに使用できる。
ある例において、抗ＥＧＦＲ標的タンパク質の試験は、ＥＧＦＲ抗原を有する特異的標的細胞の枯渇の評価を容易にするために、霊長類(例えばカニクイザルモデル)における効果の試験を含み得る。さらなる霊長類モデルは、アカゲザルを含むが、これに限定されない。
例えば、腫瘍のレシピエントは、適切なマウス系のいずれかであり得る。レシピエントは、１個以上の免疫関連機能において免疫適格性または免疫無防備状態であってよく、ｎｕ／ｎｕ、ＳＣＩＤおよびベージュマウスを含むが、これらに限定されない。腫瘍細胞を移植できる動物の例は、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、重症複合免疫不全／ベージュマウス(ＳＣＩＤ−ベージュ)を含む(例えば、米国特許公開番号２０１１０１１１０５９；Reusch et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(1):183-190; Yang et al. (2011) Int. J. Nanomedicine 6:1739-1745参照)。他の例は、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植片マウスおよびトランスジェニックマウス(ノックインおよびノックアウトを含む)を含む。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を、マウス癌モデル、例えば異種移植片マウスで試験できる。この方法において、腫瘍または腫瘍細胞株を、マウスに移植または注射し、その後マウスを抗ＥＧＦＲ抗体で処置して、抗ＥＧＦＲ抗体が癌増殖および転移を減少させるまたは阻害する能力を決定する。また意図されるのは、免疫欠損マウスにヒト末梢血リンパ球(ＰＢＬｓ)を注射するＳＣＩＤマウスモデルである。
マウス、例えばヌードまたはＳＣＩＤマウスにおけるヒト腫瘍異種移植モデルの例は、ヒト肺癌(Ａ５４９細胞、ATCC No. CCL-185)；ヒト乳房腫瘍(GI-101A細胞、Rathinavelu et al., (1999) Cancer Biochem. Biophys., 17:133-146)；ヒト卵巣癌(OVCAR-3細胞、ATCC No. HTB-161)；ヒト膵癌(PANC-1細胞、ATCC No. CRL-1469およびMIA PaCa-2細胞、ATCC No. CRL-1420)；ＤＵ１４５細胞(ヒト前立腺癌細胞、ATCC No. HTB-81)；ヒト前立腺癌(PC-3細胞、ATCC# CRL-1435)；結腸癌(HT-29細胞)；ヒト黒色腫(888-MEL細胞、1858-MEL細胞または1936-MEL細胞；例えばWang et al., (2006) J. Invest. Dermatol. 126:1372-1377参照)；およびヒト線維肉腫(HT-1080細胞、ATCC No. CCL-121)およびヒト中皮腫(MSTO-211H細胞)を含むが、これらに限定されない。マウスにおけるラット腫瘍異種移植モデルの例は、神経膠腫腫瘍(Ｃ６細胞；ATCC No. CCL-107)を含むが、これに限定されない。マウス腫瘍同種移植片モデルの例は、マウス黒色腫(B16-F10細胞；ATCC No. CRL-6475)を含むが、これに限定されない。マウスにおけるネコ腫瘍異種移植モデルの例は、ネコ線維肉腫(FC77.T細胞；ATCC No. CRL-6105)を含むが、これに限定されない。マウスにおけるイヌ腫瘍異種移植モデルの例は、イヌ骨肉腫(Ｄ１７細胞；ATCC No. CCL-183)を含むが、これに限定されない。ヒト異種移植モデルおよび同質遺伝子的腫瘍モデルの非限定的例を下の表１３および１４に示す。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与経路は、ここに記載するまたは当分野で知られた任意の投与経路、例えば腹腔内、腫瘍内または静脈内であり得る。抗ＥＧＦＲ抗体は、ここに記載するまたは当分野で知られる種々の投与量で投与できる。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍担持動物に、例えば、約０.１mg／kg、０.１５mg／kg、０.２mg／kg、０.２５mg／kg、０.３０mg／kg、０.３５mg／kg、０.４０mg／kg、０.４５mg／kg、０.５mg／kg、０.５５mg.kg、０.６mg／kg、０.７mg／kg、０.８mg／kg、０.９mg／kg、１.０mg／kg、１.１mg／kg、１.２mg／kg、１.３mg／kg、１.４mg／kg、１.５mg／kg、１.６mg／kg、１.７mg／kg、１.８mg／kg、１.９mg／kg、２mg／kg、２.５mg／kg、３mg／kg、３.５mg／kg、４mg／kg、４.５mg／kg、５mg／kg、５.５mg／kg、６mg／kg、６.５mg／kg、７mg／kg、７.５mg／kg、８mg／kg、８.５mg／kg、９mg／kg、９.５mg／kg、１０mg／kg、１１mg／kg、１２mg／kg、１３mg／kg、１４mg／kg、１５mg／kg、１６mg／kg、１７mg／kg、１８mg／kg、１９mg／kg、２０mg／kg、２１mg／kg、２２mg／kg、２３mg／kg、２４mg／kg、２５mg／kg、３０mg／kg、４０mg／kg、５０mg／kg、６０mg／kg、７０mg／kg、８０mg／kg、９０mg／kg、１００mg／kgまたはそれ以上またはその間である。ある例において、投与量の例は、約または正確に０.０１mg／ｍ２〜約または正確に８００mg／ｍ２、例えば例えば、約または正確に０.０１mg／ｍ２、約または正確に０.１mg／ｍ２、約または正確に０.５mg／ｍ２、約または正確に１mg／ｍ２、約または正確に５mg／ｍ２、約または正確に１０mg／ｍ２、約または正確に１５mg／ｍ２、約または正確に２０mg／ｍ２、約または正確に２５mg／ｍ２、約または正確に３０mg／ｍ２、約または正確に３５mg／ｍ２、約または正確に４０mg／ｍ２、約または正確に４５mg／ｍ２、約または正確に５０mg／ｍ２、約または正確に１００mg／ｍ２、約または正確に１５０mg／ｍ２、約または正確に２００mg／ｍ２、約または正確に２５０mg／ｍ２、約または正確に３００mg／ｍ２、約または正確に４００mg／ｍ２、約または正確に５００mg／ｍ２、約または正確に６００mg／ｍ２および約または正確に７００mg／ｍ２を含むが、これらに限定されない。当業者は、mg／kgおよびmg／ｍ２の単位で投与量を認識し、変換できると理解される(例えば、Michael J. Derelanko, TOXICOLOGIST'S POCKET HANDBOOK, CRC Press, p.16 (2000)参照)。
腫瘍サイズおよび体積を当業者に知られた技術に基づきモニターできる。例えば、腫瘍サイズおよび体積を、Ｘ線検査、超音波造影、剖検、ノギスの使用により、マイクロＣＴまたは１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴによりモニターできる。腫瘍サイズはまた目視で評価できる。。具体例において、腫瘍サイズ(直径)をノギスを使用して直接的に測定する。他の例において、腫瘍体積を、ノギスまたは超音波評価により得た腫瘍直径(Ｄ)の測定の平均を使用して、測定できる。体積を、式Ｖ＝Ｄ３×π／６(ノギスを使用して測定した直径について)；式Ｖ＝[長さ×(幅)２]／２(ここで、長さは最長直径であり、幅は長さに垂直の最短直径である)；またはＶ＝Ｄ２×ｄ×π／６(超音波を使用して測定した直径について、ここで、ｄは深さまたは厚さである)から決定できる。例えば、ノギス測定は腫瘍長さ(ｌ)および幅(ｗ)から成り、腫瘍体積を長さ×幅２×０.５２として計算できる。他の例において、マイクロＣＴスキャンを腫瘍体積測定に使用できる(例えばHuang et al. (2009) PNAS, 106:3426-3430参照)。このような例において、マウスにOptiray Pharmacy ioversol注射７４％造影剤(例えば７４１mgのイオベルソール／mL)を注射し、マウスを麻酔し、ＣＴ走査をMicroCat 1Aスキャナーまたは他の類似スキャナー(例えばIMTek)を使用して行う(４０kV、６００μA、１９６回転工程、総角度または回転＝１９６)。画像をソフトウェア(例えばＲＶＡ３ソフトウェアプログラム；ImTek)を使用して再構築できる。腫瘍体積を、利用可能なソフトウェア(例えばAmira 3.1 software; Mercury Computer Systems)を使用して決定できる。ある例において、腫瘍を０日目に皮下注射し、一次腫瘍の体積を指定時点で測定できる。
移植腫瘍が予定サイズまたは体積に達したら、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を投与できる。進行性の腫瘍を可視化でき、腫瘍サイズおよび腫瘍体積を当業者に知られるあらゆる技術を使用して測定できる。例えば、腫瘍体積または腫瘍サイズをここに記載されている技術のいずれかを使用して測定できる。腫瘍体積およびサイズを、移植後、例えば、１時間毎、６時間毎、１２時間毎、２４時間毎、３６時間毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、毎週、３週毎、毎月またはそれ以上のような、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与後、一定期間、一定間隔で評価または測定できる。経時的な腫瘍体積の中央変化のグラフを作成できる。これを実施例８に例示する。総曲線下面積(ＡＵＣ)を計算できる。治療指数も式ＡＵＣ未処置動物−ＡＵＣ処置動物／ＡＵＣ未処置×１００を使用して計算できる。
一般に、同一方法で、同一時間に、同一タイプの腫瘍細胞を用いて産生された腫瘍担持動物をコントロールとして使用する。このようなコントロール腫瘍担持動物は、未処置のままであるもの(修飾抗ＥＧＦＲ抗体が投与されない)を含む。付加的コントロール動物は、当分野で知られる抗ＥＧＦＲ抗体が投与されたものを含む。このような抗ＥＧＦＲ抗体の例はセツキシマブである。腫瘍担持動物に既知抗ＥＧＦＲ抗体をコントロールとして投与する例において、コントロール抗体の投与量は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の量と同一であり得る。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性の評価は、コントロール処置または未処置腫瘍担持動物と比較した、腫瘍サイズ(例えば直径)、体積または重量の減少を仲介する抗体の同定を含み得る。コントロール処置または未処置腫瘍担持動物と比較した腫瘍サイズ、体積または重量の減少は、コントロール処置または未処置腫瘍担持動物と比較して、抗ＥＧＦＲ抗体自体が腫瘍退縮または収縮を仲介するまたは抗ＥＧＦＲ抗体が腫瘍進行遅延を仲介することを意味することは理解される。腫瘍収縮または腫瘍進行遅延は、抗腫瘍形成能の指標であるパラメータである。
例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を、コントロール処置または未処置腫瘍担持動物と比較して、動物における腫瘍サイズの目視評価に基づき、腫瘍サイズまたは体積の減少を仲介するとして選択できる。他の例において、抗ＥＧＦＲ抗体を、未処置腫瘍担持動物と比較してまたは参照抗ＥＧＦＲ抗体で処置した腫瘍担持動物と比較して、当分野で知られるあらゆる測定(例えばノギスの使用)により評価して、腫瘍サイズが直径で減少しているならば、腫瘍サイズまたは体積の減少を仲介するとして選択する。腫瘍サイズまたは体積の比較は、移植後の任意の予定時間に行うことができ、当業者により経験的に決定できると理解される。ある例において、比較は、未処置コントロールを殺す日に行い得る。他の例において、総ＡＵＣの分析を行い、経時的に腫瘍のサイズおよび体積の指標としてＡＵＣ値を比較する。
腫瘍サイズまたは体積に対する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の効果を、抗ＥＧＦＲ抗体処置動物と比較したコントロール処置動物の投与後指定時間の腫瘍サイズまたは体積の非として表す(コントロール処置動物腫瘍サイズまたは体積／修飾抗ＥＧＦＲ抗体処置動物腫瘍サイズまたは体積)。評価は、動物における１.０を超え、例えば、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上である腫瘍収縮の比を示す結果をもたらす抗ＥＧＦＲ抗体の同定を含み得る。具体例において、結果を、処理経過中の総ＡＵＣ面積の比として表す(コントロール処置動物の腫瘍サイズまたは体積のＡＵＣ／修飾抗ＥＧＦＲ抗体処置動物の腫瘍サイズまたは体積のＡＵＣ)。抗ＥＧＦＲ抗体は、対象において、ＡＵＣで測定して、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上である腫瘍収縮の比をもたらすものを選択できる。１.２または５の比は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体が腫瘍サイズまたは体積減少に有効であり、参照またはコントロールと比較して、１２０％または５００％抗腫瘍形成能活性をもたらすことを意味すると理解される。
具体例において、治療指数を、腫瘍サイズまたは体積に対する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の効果の指標として決定する。抗ＥＧＦＲ抗体は、コントロール抗ＥＧＦＲ抗体の治療指数と比較して、少なくともまたは少なくとも約または１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％またはそれ以上である治療指数を有し得る。
付加的例において、腫瘍を動物から回収し、秤量できる。抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、コントロール腫瘍担持動物から回収した腫瘍と比較して、腫瘍重量の減少をもたらし得る。重量を、投与後同一時間のコントロール処置動物から回収した腫瘍とも比較できる。重量の変化を腫瘍重量比として表し得る(コントロール処置動物腫瘍重量／抗ＥＧＦＲ処置動物腫瘍重量)。抗ＥＧＦＲ抗体は、対象において、１.０を超え、例えば、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上である、腫瘍重量の比を示すことをもたらし得る。１.２または５である腫瘍重量の比は、抗ＥＧＦＲ抗体が腫瘍重量の減少に有効であり、参照またはコントロールと比較して、１２０％または５００％抗腫瘍形成能活性をもたらすことを意味すると理解される。
具体例において、動物における他の臓器または組織に対する抗ＥＧＦＲ抗体の効果を評価できる。例えば、他の臓器を動物から回収し、秤量および／または試験できる。
ａ. 副作用評価
安全性および耐容性を評価するための試験も当業者に知られており、ここで使用できる。抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与後、あらゆる有害反応、例えばここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる有害反応をモニターできる。動物試験を、有害副作用、例えば標準的薬理学プロファイルで評価できないまたは修飾抗ＥＧＦＲ抗体の反復投与後にしか生じない副作用の評価のために実施できる。ある例において、このようなアッセイを２種 −− 例えば、齧歯類および非齧歯類 −− で行い、何らかの予期されない有害作用が見過ごされてないことを隔日にする。一般に、これらのモデルは、遺伝毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖／発生毒性、発癌性を含む多様な毒性を測定できる。
副作用評価のために測定できる他のパラメータは、摂食量、体重、抗体形成、臨床的化学および巨視的および標準的臓器／組織の顕微鏡的試験(例えば心臓毒性)の標準的測定を含む。測定の付加的パラメータは、注射部位外傷および何らかの中和抗体の測定を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、正常組織、免疫原性／抗体産生およびコンジュゲートまたはリンカー毒性との交差反応性も評価できる。このようなは、特異的懸念の処置について個別化され、ＩＣＨ Ｓ６に設定されたガイダンスに従う(例えば、“Preclinical Safety Evaluation Of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals,” International Conference on Harmonisation Of Technical Requirements For Registration of Pharmaceuticals For Human Use, July 1997 (addendum June 2011)参照)。そのようなものとして、一般的原則は、製品が十分に特徴がはっきりしていることおよびそれについて不純物／汚染物が除かれていること、試験物質が開発を通して同等であることおよびＧＬＰコンプライアンスを含む。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、対象において減少したおよび／または少ない副作用、例えば有害副作用を示すものの同定のために評価できる。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を、その副作用の指標であるパラメータについて試験できる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体の副作用の減少は、ここに記載するまたは当分野で知られる抗ＥＧＦＲ抗体の副作用のいずれかを含み得る。副作用を、健常動物モデルまたは疾患または状態の動物モデル、例えばここに記載されている動物モデルで評価できる。
ある例において、対象は、皮膚毒性および低マグネシウム血症を含む、抗ＥＧＦＲ抗体の副作用、例えばここに記載するまたは当分野で知られる副作用の指標である特性について評価する。例えば、セツキシマブの副作用は、症候性低マグネシウム血症、爪囲炎、発熱、皮膚科学的毒性、顔面および躯幹上部の丘疹小水疱性皮疹、発毛異常、頭毛喪失、顔面の毛および睫毛の成長増加、皮膚乾燥および掻痒および圧痛を伴う爪周囲炎症を含む、ここに記載するおよび／または当業者に知られるあらゆるものである(Eng (2009) Nat. Rev. 6:207-218; Schrag et al. J. Natl. Cancer Inst. 97(16):1221-1224; Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12:1-5)。ある例において、セツキシマブの副作用は、丘疹膿疱性発疹、皮膚乾燥、掻痒、眼および爪変化、ざ瘡様皮膚反応、ざ瘡様発疹、ざ瘡様濾胞性発疹、アクネ様発疹、斑点状丘疹皮膚発疹、単形性膿疱性損傷、丘疹膿疱性反応を含む皮膚毒性を含む(Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5)。抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブ投与と関連する他の皮膚毒性は、掻痒、紅斑および爪囲炎を含む(Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5)。
このような副作用の同定および分類は当業者の能力の範囲内である。ある例において、ここに提供される抗ＥＧＦＲ抗体の副作用を、動物における皮膚毒性の評価により評価する。例えば、本明細書の他のどこかに記載するとおり、低マグネシウム血症を、血清マグネシウムレベル測定により診断および／または評価できる。丘疹小水疱性皮疹およびざ瘡様発疹は、丘疹(小さく、盛り上がった面皰)および膿疱(小さく、膿が詰まった疱疹)から成る発疹の観察により、動物モデル、例えばマウスモデルおよびカニクイザルモデルで特徴付けられ得る。皮膚乾燥は、鱗状およびくすんだ肌、細孔および紙のような薄い皮膚肌目により特徴付けられ得る。皮膚色素増加症は、過剰メラニン沈着による皮膚の黒ずみにより特徴付けられ得る。掻痒は、動物のひっかき行動観察により評価できる。爪囲炎は試験により評価できる。例えば、皮膚毒性の存在を、ヒト皮膚がマウス上に移植されたマウスモデルで評価できる(例えば、Nanney et al.(1996) J. Invest. Dermatol. 106(6):1169-1174参照)。さらに、皮膚科学的副作用を他の動物モデルで評価できる。例えば、カニクイザルにおいて、セツキシマブ投与後の注射部位の炎症および外的外皮落屑を評価できる。類似効果は、鼻道、食道および舌の上皮性粘膜および尿細管上皮の変性変化において観察できる。評価できる他の上皮性毒性は、結膜炎、目の赤みおよび腫脹および消化器系障害の徴候を含む(例えば、Lutterbuese et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. 107(28):12605-12610; European Medicines Agency (2009) Summary of product characteristics (Erbitux)参照)。
動物モデルで評価できる他の有害反応は、皮膚発疹、注射部位反応、例えば浮腫または腫脹、頭痛、発熱、疲労、悪寒、紅潮、めまい、蕁麻疹、喘鳴または胸部絞扼感、悪心、嘔吐、悪寒、背痛、胸痛、筋肉痙攣、発作または痙攣、血圧変化およびアナフィラキシーまたは重篤な過敏症応答を含む。ある例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の副作用の指標である特性は、対象の生存、体重減少、副作用、例えば発熱、発疹または他のアレルギー、疲労または腹痛の存在、対象における免疫応答誘発、抗体の組織分布のような１個以上の特性を含む。典型的に、投与における抗ＥＧＦＲ抗体の濃度増加または減少の効果を評価するために、安全性および耐容性の試験において、一定範囲の投与量および種々の投与頻度で投与できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の投与後に患者または対象で発症する有害反応のタイプおよび重症度を評価し、他の抗ＥＧＦＲ抗体、例えば当分野で知られるまたはここに記載されている抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかの投与後の患者または対象において発症する有害反応と比較できる。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体と、他の抗ＥＧＦＲ抗体の投与に発症する有害反応の相違を評価できる。
それゆえに、ここに記載するパラメータのいずれかを、抗ＥＧＦＲ抗体の毒性／安全性の指標として評価できる。抗ＥＧＦＲ抗体は、対象において最小毒性の発現を示すものを選択できる。副作用を評価するための動物モデルにおいて、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の投与量および投与方法は、ここに記載するあらゆる投与量および投与方法を含み得る。抗ＥＧＦＲ抗体を投与されていないまたは投与された参照抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブまたはその変異体を投与されたコントロール対象を包含できる。
４. 薬物動態および薬力学アッセイ
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の薬物動態(ＰＫ)および薬力学(ＰＤ)アッセイを、ここに記載するまたは当分野で知られた方法を使用して実施できる(例えば、Klutchko, et al., (1998) J. Med. Chem. 41:3276-3292参照)。測定パラメータの例は、一般に投与後の最大(ピーク)血漿濃度(Ｃｍａｘ)、ピーク時間(すなわち最大血漿濃度が生じるとき；Ｔｍａｘ)、最小血漿濃度(すなわち投与間の最小血漿濃度；Ｃｍｉｎ)、排出半減期(Ｔ１／２)および曲線下面積(すなわち時間対血漿濃度のプロットにより作成した曲線下面積；ＡＵＣ)を含む。投与された修飾抗ＥＧＦＲ抗体の絶対バイオアベイラビリティを、皮下送達後の曲線下面積(ＡＵＣｓｃ)と静脈内送達後のＡＵＣ(ＡＵＣiv)の比較により決定できる。絶対バイオアベイラビリティ(Ｆ)を式：Ｆ＝([ＡＵＣ]ｓｃ×投与量ｓｃ)／([ＡＵＣ]iv×投与量iv)を使用して計算できる。投与後の血漿中の抗ＥＧＦＲ抗体の濃度を、血液サンプル中の抗体の濃度の評価に適する当分野で知られるあらゆる方法を使用して測定できる。方法の例は、ＥＬＩＳＡおよび比濁分析を含むが、これらに限定されない。付加的測定パラメータは、ｉ.ｖ.投与後に得た濃度−時間データおよびバイオアベイラビリティのコンパートメント解析を含む。体内分布、線量測定(放射標識抗体またはＦｃ融合物について)およびＰＫ試験も、齧歯類モデルを含む、ここに記載するまたは当分野で知られる動物モデルを含む動物モデルで実施できる。このような試験は、投与されたいくつかのまたは全投与量の耐容性、局所組織への毒性、齧歯類異種移植片動物モデルへの優先的局在化および標的細胞(例えばＣＤ２０陽性細胞)の枯渇を評価できる。薬力学的試験は、特異的腫瘍細胞標的またはシグナル伝達機構ブロッキング、ＥＧＦＲ発現細胞またはシグナルの枯渇を含み得るが、これらに限定されない。
ＰＫおよびＰＤアッセイは、健常動物モデル、病的動物モデルおよびヒトを含む、ここに記載するまたは当分野で知られた任意の動物モデルで実施できる。ＰＤおよび／またはＰＫ特性についての修飾抗ＥＧＦＲ抗体のスクリーニングは、修飾抗ＥＧＦＲ抗体により提供されるＰＤ、ＰＫおよび治療有効性の最適バランスの定義に有用であり得る。例えば、Ｆｃ受容体のアレイは種々の免疫細胞型、ならびに種々の組織で差次的に発現することが当分野で知られている。Ｆｃ受容体の差次的組織分布は、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の薬力学(ＰＤ)および薬物動態(ＰＫ)特性に影響し得る。
一定範囲の投与量および種々の投与頻度の投与量を、投与量における修飾抗ＥＧＦＲ抗体の濃度の増加または減少の効果を評価するために、薬物動態試験において投与できる。投与された修飾抗ＥＧＦＲ抗体の薬物動態特性、例えばバイオアベイラビリティを、ここに記載されている治療剤またはレジメンの併用投与の有無で評価できる。例えば、イヌ、例えばビーグル犬に、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を単独でまたはここに記載されている１種以上の治療剤またはレジメンと共に投与し得る。修飾抗ＥＧＦＲ抗体を治療剤またはレジメンの投与前、途中または後に投与してよい。次いで、血液サンプルを種々の時点で採り、血漿中の修飾抗ＥＧＦＲ抗体の量を、例えば比濁分析により決定できる。次いで、ＡＵＣを測定し、付加的治療剤またはレジメンの併用投与の有無で投与された修飾抗ＥＧＦＲ抗体のバイオアベイラビリティを決定できる。このような試験を、投与された抗ＥＧＦＲ抗体の薬物動態特性、例えばバイオアベイラビリティに対する併用投与の効果の評価のために実施できる。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体の１回または反復投与を、血漿濃度およびクリアランスを使用する半減期の評価のために、約６０００倍(約０.０５〜３００mg／kg)の投与範囲にわたり実施でき、ならびに定常状態の分布体積および全身吸収のレベルを測定できる。
Ｅ. 抗ＥＧＦＲ抗体の同定、産生および製造のための方法
１. 条件依存性治療用タンパク質の同定
非病的微小環境(例えば健常または正常環境)よりも病的微小環境で活性である条件依存活性治療用タンパク質、例えば抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、種々の環境において存在する条件下、活性の定量および評価を可能にするあらゆるアッセイにより同定できる。このようなアッセイは上のセクションＤに記載する。活性を比較し、正常環境(または非病的または正常環境において存在する条件下)よりも病的微小環境(または病的環境において存在する条件下)で活性である治療用タンパク質を同定できる。結果は、望まない全身効果、例えば副作用または望まない活性が減少または最小化されるように、活性が病的微小環境に条件依存標的化されている治療用タンパク質の同定である。
セクションＤに詳述するとおり、このようなアッセイをインビボまたはインビトロで実施できる。例えば、条件依存活性分子を同定するためのアッセイを、インビトロで、非病的または健常または正常環境に存在するものと異なる病的微小環境において存在する１個以上の条件を含むまたは模倣するように緩衝液の１個以上の条件の操作により実施できる。腫瘍環境について、これらの条件は低または酸性ｐＨ、例えばｐＨ５.８〜６.８(例えばｐＨ６.０〜６.５)および／または高乳酸濃度(例えば１０mM〜１６mM)を含む。対照的に、非腫瘍微小環境における条件は中性ｐＨ(例えばｐＨ７.０〜７.４)および／または１mM〜５mM乳酸濃度を含む。条件依存活性治療用タンパク質を同定するこのようなアッセイの例は米国出願番号１３／２００,６６６および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／５０８９１に記載されている。また、条件は、２０〜５０％血清(vol/vol)または１０〜５０mg／mLタンパク質(例えば血清アルブミン)を含むように、生理的条件を模擬または模倣するようにモデル化できる。このような方法は、条件依存活性抗体、例えば抗ＥＧＦＲ抗体および他の薬剤を含む条件依存活性抗癌剤の同定に使用でき、その結果このような薬剤は腫瘍でより活性である。類似方法を、全身免疫抑制性活性を減らすためにあらゆる条件依存活性治療用タンパク質、例えば抗炎症剤、例えば、インフリキシマブ(レミケード)、エタネルセプト(エンブレル)および他の類似薬剤の同定のために実施できる。
２. 抗ＥＧＦＲ抗体の産生および製造
抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を標準的細胞培養および当分野で知られる他の発現系で発現できる。ここに提供する方法において使用する前に、タンパク質を精製してよい。あるいは、全上清または希釈上清を、ここでの二重アッセイでスクリーニングしてよい。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、当業者の範囲内である組み換えＤＮＡ方法により製造できる。抗ＥＧＦＲ抗体をコードするＤＮＡを合成により産生できまたは慣用法を使用して容易に単離および配列決定できる(例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的結合できるオリゴヌクレオチドプローブの使用により)。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を産生または発現することが知られるあらゆる細胞源が、このようなＤＮＡの好ましい起源として利用し得る。他の例において、抗ＥＧＦＲをコードするＤＮＡの配列が決定されたら、核酸配列を遺伝子合成技術を使用して構築できる。
さらに、変異誘発技術も、抗ＥＧＦＲ抗体の修飾形態の産生に用いることができる。ＤＮＡも修飾され得る。例えば、遺伝子合成または日常的分子生物学技術をヌクレオチドの挿入、欠失、付加または置換の実施に使用できる。例えば、付加的ヌクレオチド配列を核酸配列と連結できる。一例において、ベクター、例えば、タンパク質発現ベクターへの抗体遺伝子のクローニングの目的で、リンカー配列、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位を含む配列を付加できる。さらに、機能的ＤＮＡエレメントを特定化する付加的ヌクレオチド配列を、核酸分子に操作可能に結合できる。このような配列の例は、細胞内タンパク質発現を促進するために設計されたプロモーター配列およびタンパク質分泌を促進するために設計されたリーダーペプチド配列を含むが、これらに限定されない。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、完全長タンパク質または完全長より短いタンパク質として発現され得る。例えば、抗体フラグメントは発現できる。ここに提供する核酸分子およびタンパク質は当業者に知られるあらゆる方法により製造できる。このような方法は日常的であり、当業者に周知である。遺伝子合成、ＰＣＲ、ライゲーション、クローニング、トランスフェクションおよび精製技術を含む、日常的分子生物学技術を含む。このような方法の記載を下に提供する。
単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いで、宿主細胞に遺伝子導入し得る。ベクターの選択は所望の適用に依存し得る。例えば、核酸挿入後、ベクターは、典型的に、例えば、複製および／または発現のためのタンパク質遺伝子の増幅のために宿主細胞の形質転換に使用される。このような例において、高レベル発現に適するベクターを使用する。
抗体発現のために、一般に、抗体の重鎖をコードする核酸をベクターにクローン化し、抗体の軽鎖をコードする核酸をベクターにクローン化する。遺伝子は、その二重発現のために単一ベクターにまたは別々のベクターにクローン化され得る。所望により、ベクターはまた他の抗体形態を産生するために、さらに付加的定常領域またはヒンジ領域をコードする配列を含み得る。ベクターを遺伝子導入し、宿主細胞で発現できる。発現は当業者に知られた任意の細胞発現系においてであり得る。例えば、宿主細胞は、組み換え宿主細胞中で抗体の合成をさせるために、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない細胞を含む。例えば、宿主細胞は、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、２９３ＦＳ細胞、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞、ＮＳＯ細胞または他の骨髄腫細胞を含むが、これらに限定されない。他の発現ベクターおよび宿主細胞はここに記載されている。
一例において、抗体の重鎖をコードする核酸を第一発現ベクターにライゲートし、抗体の軽鎖をコードする核酸を第二発現ベクターにライゲートする。発現ベクターは同一でも異なってもよいが、一般にそこからのタンパク質(重鎖および軽鎖)の同等な発現を可能にするために十分に適合性である。第一および第二発現ベクターを、一般に、典型的に１：１比で、宿主細胞に同時遺伝子導入する。ベクターの例は、ｐγ１ＨＣおよびｐκＬＣを含むが、これらに限定されない(Tiller et al. (2008) J Immunol. Methods, 329:112-24)。他の発現ベクターは、軽鎖発現ベクターｐＡＧ４６２２および重鎖発現ベクターｐＡＨ４６０４を含む(Coloma et al. (1992) J Immunol. Methods, 152:89-104)。ｐＡＧ４６２２ベクターは、ヒトκ Ｌ鎖のＣ領域ドメインおよびｇｐｔ選択可能マーカーをコードするゲノム配列を含む。ｐＡＨ４６０４ベクターはｈｉｓＤ選択可能マーカーおよびヒトＨ鎖γ１ Ｃ領域ドメインをコードする配列を含む。他の例において、重鎖および軽鎖を重鎖および軽鎖両者のための発現カセットを有する単一ベクターにクローン化できる。
それゆえに、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、完全長抗体または、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂヒンジ、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、ｓｃＦｖタンデム、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖヒンジ、ｓｃＦｖヒンジ(ΔＥ)二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントのようなその抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない完全長より短い抗体として産生または発現できる。種々の技術が、抗体フラグメント産生のために開発されている。伝統的に、これらのフラグメントを、無傷抗体のタンパク分解消化を介して誘発した(例えばMorimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117; Brennance et al. (1985) Science, 229:81参照)。フラグメントはまた組み換え宿主細胞により直接的に産生され得る。例えば、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体フラグメントは全て宿主細胞、例えば大腸菌内で発現および分泌されることができ、そうして大量のこれらのフラグメントの容易な産生を可能しる。また、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを化学的にカップリングして、Ｆ(ａｂ’)２フラグメントを形成し得る(Carter et al. (1992) Bio/Technology, 10:163-167)。他の手法によると、Ｆ(ａｂ’)２フラグメントを直接的に組み換え宿主細胞培養から単離できる。ある例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント(ｓｃＦｖ)である(例えばＷＯ９３／１６１８５；米国特許番号５,５７１,８９４および米国特許番号５,５８７,４５８参照)。ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域を欠く無傷結合部位を有する唯一の種であり、それゆえに、インビボ使用中の非特異的結合を低減させるのに適する。ｓｃＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端いずれかのエフェクタータンパク質の融合を産生できる。抗体フラグメントは直鎖状抗体でもあり得る(例えば米国特許番号５,６４１,８７０参照)。このような直鎖状抗体フラグメントは単一特異性または二重特異性であり得る。抗体フラグメント産生のための他の技術は当業者に知られる。
例えば、発現により、抗体重鎖および軽鎖はジスルフィド結合により対形成して、完全長抗体またはそのフラグメントを形成する。例えば、完全長Ｉｇ発現のために、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードする配列を第一発現ベクターにクローン化でき、ＶＬ−ＣＬドメインをコードする配列を第二発現ベクターにクローン化できる。ＶＬ−ＣＬドメインをコードする第二発現ベクターの共発現により、完全長抗体が発現される。他の例において、Ｆａｂを産生するために、ＶＨ−ＣＨ１をコードする配列を第一発現ベクターにクローン化でき、ＶＬ−ＣＬドメインをコードする配列を第二発現ベクターにクローン化できる。重鎖は軽鎖と対形成し、Ｆａｂモノマーが産生される。種々のＩｇＧサブタイプのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３の配列は当業者に知られる(例えば米国公開出願番号２００８０２４８０２８参照)。同様に、ＣＬ、ラムダまたはカッパの配列も知られる(例えば米国公開出願番号２００８０２４８０２８参照)。このような配列の例をここに提供する。
全抗体および抗体フラグメントの発現のためにベクターに挿入できる配列の例は、ここに記載する抗体フラグメントの配列を含む(例えば配列番号３０〜１０６８、１０９３、１０９８〜１１０７、１１１２〜１１３１および１１３４〜１１５９参照)。例えば、セツキシマブの可変重鎖および可変軽鎖配列(それぞれ配列番号３および４)またはここに記載する任意の抗体の可変重鎖および可変軽鎖配列(例えば、それぞれ配列番号３０〜１０６８、１０９３、１０９８〜１１０７、１１１２〜１１３１および１１３４〜１１５９)を、ここに記載するまたは当業者に知られる適切な発現ベクターに挿入できる。重鎖または軽鎖の定常領域の全てまたは一部もＩｇＧ抗体またはそのフラグメントの発現のためのベクターに挿入してよくまたは含まれていてよい。さらに、ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬ配列を、Ｆａｂ分子の発現のための適切な発現ベクターに挿入できる。抗体の可変重鎖および可変軽鎖ドメイン(すなわち、それぞれ配列番号３０〜１０６８、１０９３、１０９８〜１１０７、１１１２〜１１３１および１１３４〜１１５９)を、一本鎖抗体を産生するために、適切な発現ベクター、例えば可変重鎖と可変軽鎖の間にリンカーをコードするベクターに発現できる。リンカーの例は、グリシン・リッチ可動性リンカー(−Ｇ４Ｓ−)ｎ(ここで、ｎは正の整数、例えば１(配列番号１０９４)、２(配列番号１０９５)、３(配列番号２１)、４(配列番号１０９６)、５(配列番号１０９７)またはそれ以上である)を含む。
ａ. ベクター
ベクターの選択は所望の適用に依存し得る。抗ＥＧＦＲ抗体またはその一部、例えば抗原結合フラグメントの発現のために、多くの発現ベクターが利用可能であり、当業者に知られる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択に影響を受ける。このような選択は十分に当業者のレベルの範囲内である。一般に、発現ベクターは転写プロモーターおよび所望によりエンハンサー、翻訳シグナルおよび転写および翻訳終止シグナルを含み得る。安定な形質転換に使用する発現ベクターは、典型的に形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択可能マーカーを有する。いくつかの例では、複製起点を、細胞内のベクターのコピー数の増幅に使用できる。ベクターはまた一般にライゲートした核酸分子と列操作可能に結合した付加的ヌクレオチド配を含み得る(例えばＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ)。抗体での適用のために、ベクターは、一般には、定常領域をコードする配列を含む。それゆえに、抗体またはその一部はまたタンパク質融合体として発現され得る。例えば、融合体を、ポリペチドに付加的機能性を付加するために産生できる。融合タンパク質の例は、シグナル配列、例えば局在化のための、エピトープタグ、例えばＨｉｓ６タグまたはｍｙｃタグまたは精製のためのタグ、例えば、ＧＳＴ融合体およびタンパク質分泌および／または膜結合を指向する配列の融合体をい含むが、これらに限定されない。
例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の発現は、当分野で知られる任意のプロモーター／エンハンサーにより制御できる。適切な細菌プロモーターは当分野で周知であり、下に記載する。哺乳動物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のための他の適切なプロモーターは当分野で周知であり、いくつかの下に例示する。異種性核酸発現の指示に使用するプロモーターの選択は特定の適用による。使用できるプロモーターは、ＳＶ４０早期プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981))、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982))を含む真核生物発現ベクター；原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター(Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543)またはｔａｃプロモーター(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983))；また“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”: in Scientific American 242:79-94 (1980))も参照のこと；ノパリンシンテターゼプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984))またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター(Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)))および光合成酵素リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984))を含む植物発現ベクター；酵母および他の真菌由来のプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターおよび組織特異性を示し、トランスジェニック動物で使用されている次の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域(Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987))；膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985))、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987))、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞で活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域(Leder et al., Cell 45:485-495 (1986))、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987))、肝臓で活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987))、肝臓で活性なアルファ−１抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987))、骨髄球性細胞で活性なベータグロビン遺伝子制御領域(Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986))、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987))、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域(Shani, Nature 314:283-286 (1985))および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))を含むが、これらに限定されない。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的に、宿主細胞での抗体またはその一部の発現に必要な付加的エレメントの全てを含む転写単位または発現カセットを含む。典型的発現カセットは、タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に結合したプロモーターおよび転写物の効率的ポリアデニル化、リボソーム結合部位および翻訳終止に必要なシグナルを含む。カセットの付加的エレメントは、エンハンサーを含み得る。さらに、カセットは、典型的に効率的終止を提供するために構造的遺伝子の下流に転写終止領域を含む。終止領域は、プロモーター配列と同一遺伝子から得てよくまたは異なる遺伝子から得てよい。
ある発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー、例えばチミジンキナーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。あるいは、例えば、ポリヘドロンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示の下、タンパク質をコードする核酸配列と共に、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用する、遺伝子増幅を含まない高収率発現系も適切である。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の発現のためのここでの目的のために、ベクターは、抗体の可変領域をコードする核酸配列に操作可能に結合した抗体の定常領域をコードするヌクレオチドの配列を含み得る。ベクターは、ＣＨ１、ＣＨ２、ヒンジ、ＣＨ３またはＣＨ４および／またはＣＬの１個または全ての配列を含み得る。一般に、例えばＦａｂｓのために、ベクターはＣＨ１またはＣＬ(カッパまたはラムダ軽鎖)のは家ｒつを含む。定常領域またはヒンジ領域の配列は当業者に知られる(例えば米国公開出願番号２００８０２４８０２８参照)。このような配列の例をここに提供する。
発現ベクターの例は、例えば、ｐＣＭＶのような任意の哺乳動物発現ベクターを含む。細菌発現のために、このようなベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄおよび融合ベクター、例えばＭＢＰ、ＧＳＴおよびＬａｃＺを含む。他の真核生物ベクター、例えば真核生物ウイルスからの制御エレメントを含むあらゆるものを真核生物発現ベクターとして使用できる。これらは、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルス由来のベクターを含む。真核生物ベクターの例は、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴ０１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＣＥおよびＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドロンプロモーターまたは真核生物の発現で有効性が示される他のプロモーターの指示下にタンパク質発現を可能にする任意の他のベクターを含む。
ベクターへのＤＮＡフラグメント挿入のための当業者に知られるあらゆる方法を使用して、タンパク質または抗体鎖をコードする核酸を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法はインビトロ組み換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組み換え(遺伝的組み換え)を含み得る。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡフラグメントを、相補性粘着性末端を有するクローニングベクターにライゲートすることにより達成できる。ＤＮＡのフラグメントに使用するための相補性制限部位がクローニングベクターに存在しないならば、ＤＮＡ分子末端を酵素的に修飾してよい。あるいは、所望の任意の部位を、ヌクレオチド配列(リンカー)をＤＮＡ末端にライゲートすることにより製造でき、ｋぉれらのライゲートしたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学的合成核酸を含み得る。
ｂ. 細胞および発現系
一般に、異種性ＤＮＡを発現するように操作でき、分泌経路を有する細胞型のいずれかが、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の発現に適する。発現宿主は、原核生物および真核生物、例えば細菌細胞(例えば大腸菌)、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞を含む動物細胞を含む。発現宿主は、タンパク質産生レベルならびに発現タンパク質上に存在する翻訳後修飾にタイプが異なり得る。さらに、発現宿の選択は、しばしば使用するベクターおよび転写および翻訳エレメントの選択に関連する。例えば、発現宿主の選択は、しばしば、しかし常にではないが、使用する前駆体配列の選択による。例えば、多くの異種性シグナル配列は、同一種の宿主細胞においてしか発現できない(すなわち、昆虫細胞シグナル配列は昆虫細胞中で至適に発現される)。対照的に、例えば、酵母、昆虫または哺乳動物宿主細胞で十分に作用するヒト血清アルブミン(ｈＨＳＡ)シグナル配列および昆虫および哺乳動物細胞で機能的であることが証明されている組織プラスミノーゲンアクティベータープレ／プロ配列のような、他のシグナル配列を異種性宿主で使用できる(Tan et al., (2002) Protein Eng. 15:337)。発現宿主の選択はこれらおよび他の因子、例えば制御および安全性考察、生産費用および精製の必要性および方法に基づきなし得る。それゆえに、ベクター系は、使用する宿主細胞と適合性でなければならない。
真核生物宿主における発現は、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリス、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ細胞および鱗翅目細胞、植物および植物細胞、例えばタバコ、トウモロコシ、イネ、藻類およびアオウキクサ属での発現を含み得る。発現のための真核生物細胞は、哺乳動物細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞またはベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)細胞を含む。真核生物発現宿主はまた、例えば、血清、乳および卵での産生を含む、トランスジェニック動物における産生も含む。
組み換え分子は、遺伝子配列の多くのコピーが賛成さえるように、宿主細胞に、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションを介して導入できる。一般に、標準的トランスフェクション方法を使用して大量の抗体鎖を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞株を産生し、これを続いて標準技術を使用して精製できる(例えば、Colley et al. (1989) J. Biol. Chem., 264:17619-17622; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed.), 1990参照)。真核生物および原核生物細胞の形質転換を標準技術に従い実施する(例えば、Morrison (1977) J. Bact. 132:349-351; Clark-Curtiss and Curtiss (1983) Methods in Enzymology, 101, 347-362参照)。例えば、外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する周知方法のいずれかを使用できる。これらはリン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポソーム、微量注入、プラズマベクター、ウイルスベクターおよびクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝的物質を宿主細胞に導入するあらゆる他の周知の方法の使用を含む。一般に、抗体発現の目的で、宿主細胞は、少なくともＶＨ鎖をコードする第一ベクターおよび少なくともＶＬ鎖をコードする第二ベクターで遺伝子導入する。それゆえに、使用する特定の遺伝子操作法は、少なくとも両遺伝子の、抗体ポリペチドまたはその修飾形態の発現が可能な宿主細胞への導入が成功できることのみを必要である。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、抗体をコードする核酸分子の宿主細胞または宿主動物への導入および組み換え抗体をコードする核酸分子のインビトロでの発現のゆな、インビトロおよびインビボ方法を含むタンパク質産生のための当分野で知られるあらゆる方法により産生できる。原核生物、特に大腸菌は、大量の再会合抗体またはその一部の産生のためのシステムを提供し、特にタンパク質の発現および精製の適用において望ましい。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の単純かつ迅速な技術である。ハイスループット発現のための大腸菌宿主株は、ＢＬ２１(EMD Biosciences)およびＬＭＧ１９４(ＡＴＣＣ)を含むが、これらに限定されない。このような大腸菌宿主株の例はＢＬ２１である。ハイスループット発現のためのベクターは、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣベクターを含むが、これらに限定されない。
ｉ. 原核生物発現
原核生物、特に大腸菌は、大量の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその一部を産生するシステムを提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の単純かつ迅速な技術である。大腸菌の発現ベクターは、高レベルのタンパク質発現誘発および宿主細胞に幾分毒性であるの発現に有用である誘導型プロモーターを含む。誘導型プロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターおよび温度制御λＰＬプロモーターを含む。
抗体またはその一部は、大腸菌の細胞質環境で発現できる。細胞質は還元性環境であり、ある抗体にとって、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。還元剤、例えばジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノールおよび変性剤(例えば、例えばグアニジン−ＨＣｌおよびウレア)を抗体の再可溶化に使用できる。別の手法の例は、細菌細胞膜周辺腔における組み換え抗体またはそのフラグメントの発現であり、これは酸化環境を提供し、シャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼが可溶性タンパク質の産生を起こす。典型的に、タンパク質を周辺質に指向するリーダー配列を発現すべきタンパク質に融合させる。次いで、リーダーは周辺質内でシグナルペプチダーゼにより除去される。発現タンパク質を周辺質に転座させる経路の例は、Ｓｅｃ経路、ＳＲＰ経路およびＴＡＴ経路である。周辺質−標的リーダー配列は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子からのｐｅｌＢリーダー、ＳｔIIリーダー配列およびＤｓｂリーダー配列を含む。いくつかの例では、周辺質発現は、発現タンパク質の培養培地への漏出を可能にする。抗体の分泌は、培養上清からの迅速で、単純な精製を可能にする。分泌されない抗体は、周辺質から、浸透圧性溶解により得ることができる。細胞質発現と同様、いくつかの例ではタンパク質は不溶性となる可能性があり、変性剤および還元剤を、可溶化および再折りたたみの促進に使用できる。誘導および増殖の温度も発現レベルおよび溶解度に影響し得る。典型的に、２５℃〜３７℃の温度を使用する。変異も発現タンパク質の溶解度の上昇のために使用できる。典型的に、細菌は無グリコシル化タンパク質を産生する。それゆえに、グリコシル化を、宿主細胞からの精製後に、インビトロで付加し得る。
ii. 酵母
酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウイア・リポリティカ、クルイベロミセス・ラクチスおよびピキア・パストリスは、組み換え抗体またはその一部のための有用な発現宿主である。酵母を、エピソーム複製ベクターでまたは相同組み換えによる安定な染色体組込みにより形質転換できる。典型的に、誘導型プロモーターを遺伝子発現制御に使用する。このようなプロモーターの例は、ＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５およびメタロチオネインプロモーター、例えばＣＵＰ１を含む。発現ベクターは、しばしば、形質転換ＤＮＡの選択および維持のための選択可能マーカー、例えばＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３を含む。酵母でのタンパク質発現は可溶性である。シャペロニン、例えばＢｉｐおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現は発現レベルおよび溶解度を改善できる。さらに、酵母でのタンパク質発現は、分泌シグナルペプチド融合体、例えばサッカロマイセス・セレビシエからの酵母接合型アルファ−因子分泌シグナルおよび酵母細胞表面タンパク質、例えばＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはArxula adeninivoransのグルコアミラーゼとの融合体を使用して、分泌を指示できる。例えばＫｅｘ−２プロテアーゼのためのプロテアーゼ開裂部位を、分泌経路に存在するために、発現ポリペチドからの融合配列を除去するために操作できる。酵母はまたＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化できる。
iii. 昆虫
特にバキュロウイルス発現を使用する昆虫細胞は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその一部の発現に有用である。昆虫細胞は高レベルのタンパク質を発現し、高級真核生物で使用されるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、拘束性宿主範囲を有し、これは真核生物発現の安全性を高め、制御懸念を減らす。典型的発現ベクターは、高レベル発現のためのプロモーター、例えばバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターおよびｐ１０プロモーターを使用する。一般に使用されるバキュロウイルス系は、バキュロウイルス、例えばキンウワバ科核多核体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)およびカイコ核多核体病ウイルス(ＢｍＮＰＶ)および昆虫細胞株例えばヨトウガ由来のＳｆ９およびイラクサギンウワバ由来のＴＮを含む。高レベル発現のために、発現する分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンの直ぐ下流に融合できる。ヒト抗体を発現できるバキュロウイルス組み換え体の産生のために、デュアル発現伝達、例えばｐＡｃＵＷ５１(Phar Mingen)を使用する。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞で的確に処理され、発現タンパク質の培養培地への分泌に使用できる。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の発現のための昆虫細胞における別の発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。細胞株、例えばヨトウガのＳｆ９由来細胞およびイラクサギンウワバのＴＮ由来細胞を発現に使用できる。バキュロウイルス最初期遺伝子プロモーターＩＥ１を、一貫したレベルの発現の誘発のために使用できる。典型的発現ベクターは、ｐＩＥ１−３およびｐＩ３１−４伝達ベクター(Novagen)を含む。発現ベクターは、典型的に選択可能マーカー、例えばネオマイシンおよびハイグロマイシンの使用により維持する。
iv. 哺乳動物細胞
哺乳動物発現系を、その抗原結合フラグメントを含む抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の発現に使用できる。発現構築物は、ウイルス感染、例えばアデノウイルスまたは直接ＤＮＡ伝達、例えばリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランおよび物理的手段、例えばエレクトロポレーションおよび微量注入により哺乳動物細胞に伝達される。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、典型的にｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列(コザック・コンセンサス配列)およびポリアデニル化エレメントを含む。このようなベクターはしばしば高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスの末端反復配列(ＲＳＶ)を含む。これらのプロモーター−エンハンサーは多くの細胞型で活性である。組織および細胞タイプ・プロモーターおよびエンハンサー領域も発現に使用できる。プロモーター／エンハンサー領域の例は、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ１抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御のような遺伝子由来のものを含むが、これらに限定されない。選択可能マーカーを使用して、発現構築物を有する細胞を選択および維持できる。選択可能マーカー遺伝子の例は、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、ＮＥＯＲ／Ｇ４１８系、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)系またはグルタミンシンテターゼ(ＧＳ)系を使用して産生できる。ＧＳシステム使は、共同発現ベクター、例えばｐＥＥ１２／ｐＥＥ６を使用し、重鎖および軽鎖の両者を発現する。細胞表面シグナル伝達分子、例えばＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γとの融合は、細胞表面上に活性状態のタンパク質の発現を指示できる。
マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む多くの細胞株が哺乳動物発現に利用可能である。細胞株の例は、例えば、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０(非分泌)および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞のような、当分野で知られるまたはここに記載するあらゆるものを含む。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を促進する、無血清培地に適応させた細胞株も利用可能である。一つのこのような例は、無血清ＥＢＮＡ−１細胞株である(Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42)。
ｖ. 植物
トランスジェニック植物細胞および植物を、ここに記載されている抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその一部の発現に使用できる。発現構築物は、典型的に直接ＤＮＡ伝達、例えば微粒子銃およびプロトプラストへのＰＥＧ介在伝達およびアグロバクテリウム介在形質転換を使用して、植物に伝達される。発現ベクターはプロモーターおよびエンハンサー配列、転写終止エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常双子葉植物宿主、例えばアラビドプシス属およびタバコおよび単子葉植物宿主、例えばトウモロコシおよびイネを分ける。発現に使用する植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターおよびメイズユビキチン−１(ｕｂｉ−１)プロモータープロモーターを含む。選択可能マーカー、例えばハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼはしばしば形質転換細胞の選択および維持を促進するために使用される。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体(カルス組織)または全植物に再生されて培養に維持できる。トランスジェニック植物細胞はまたプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの産生のために操作された藻類を含む(例えば、Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442参照)。植物が哺乳動物細胞と異なるグリコシル化パターンを有するため、これは、これらの宿主で産生するタンパク質の選択に影響し得る。
３. 精製
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合部分は、当業者に知られるまたはここに記載されているあらゆる方法により精製できる。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズフラクションおよびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはカラムクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない、当分野で知られる標準的タンパク質精製技術を使用して、相当な純度まで精製できる。例えば、抗体は、カラムクロマトグラフィーにより精製できる。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を精製する方法の例は、カラムクロマトグラフィーを使用するものであって、ここで、固相支持体カラム物質が、免疫グロブリンと高親和性で結合する、ストレプトコッカス属の細胞表面関連タンパク質であるタンパク質Ｇに結合している。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体はカラムクロマトグラフィーにより精製でき、ここで、固相支持体カラム物質は、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ抗体と高親和性で結合するスタフィロコッカス属の細胞表面関連タンパク質であるタンパク質Ａと結合している(例えば、Liu et al. (2010) MAbs 2(5):480-499参照)。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の精製に使用できる他の免疫グロブリン結合細菌タンパク質は、タンパク質Ａおよびタンパク質ＧのＩｇＧ結合ドメインを合わせた組み換え融合タンパク質であるタンパク質Ａ／Ｇ；およびペプトストレプトコッカス属の表面タンパク質であるタンパク質Ｌを含む(Bjorck (1988) J. Immunol., 140(4):1194-1197; Kastern, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267(18):12820-12825; Eliasson et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:4323-4327)。
抗ＥＧＦＲ抗体は、６０％、７０％、８０％純度および典型的に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％純度まで精製できる。純度は、標準的方法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により評価できる。
宿主細胞由来の抗体またはその一部を含む抗ＥＧＦＲ抗体の精製方法は、選択した宿主細胞および発現系による。分泌された分子について、タンパク質は、一般に細胞除去後、培養培地から精製される。細胞内発現について、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製し得る。トランスジェニック生物、例えばトランスジェニック植物および動物を発現に使用するとき、組織または臓器を、溶解細胞抽出物製造のための出発物質として使用できる。さらに、トランスジェニック動物産生は、乳または卵中のポリペチドの産生を含み、これは回収でき、必要であれば、さらにタンパク質を抽出し、さらに当分野で標準的な方法を使用して精製できる。
タンパク質が形質転換細菌で大量に発現されるとき、これは、典型的に、プロモーター誘導後であるが、発現は構成的であってよく、ポリペチドは不溶性凝集体を形成し得る。当業者に知られるポリペチド封入体の精製に適する数種のプロトコルがある。多数の変法が当業者に明らかである。
例えば、一つの方法において、細胞懸濁液を一般に遠心分離し、封入体を含むペレットを緩衝液に再懸濁し、これは、封入体を溶解しないが、洗浄する、例えば、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.２)、１mM ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌおよび２％Triton-X 100(非イオン性洗剤)である。できるだけ多くの細胞残骸を除去するために、洗浄を繰り返す必要があるかもしれない。残った封入体のペレットを適当な緩衝液(例えば、２０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ６.８、１５０mM ＮａＣｌ)に再懸濁し得る。他の適当な緩衝液は当業者に明らかである。
あるいは、抗体を細菌周辺質から精製できる。抗体が細菌の周辺質に搬出されるとき、細菌の周辺質フラクションを、当業者に知られる他の方法に加えて、冷浸透圧性ショックにより単離できる。例えば、一つの方法において、組み換えポリペチドを周辺質から単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成する。ペレットを、２０％スクロースを含む適切な緩衝液に再懸濁できる。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、ペレットを氷冷５mM ＭｇＳＯ４に再懸濁し、氷浴上に約１０分維持する。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、保存する。上清に存在する組み換え抗ＥＧＦＲ抗体を、宿主タンパク質から、当業者に周知の標準的分離技術、例えばここに記載されている分離技術により分離できる。これらの方法は、次の、溶解度差次的分画、サイズ差次的濾過およびカラムクロマトグラフィーの工程を含むが、これらに限定されない。
Ｆ. 医薬組成物、製剤、キット、製品および組み合わせ剤
１. 医薬組成物および製剤
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの医薬組成物が投与のためにここで提供される。薬学的に許容される組成物は、動物およびヒトにおける使用のための一般に認識されている薬局方に従い製造された、規制当局または他の機関の承認を考慮して製造される。典型的に、化合物は、当分野で周知の技術および方法を使用して、医薬組成物に製剤される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126参照)。
医薬組成物は治療剤、予防および／または診断適用に使用できる。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、薬学的に許容される担体または希釈剤とともに製剤できる。一般に、このような医薬組成物は、抗体の生物学的特性、例えばその特異的エピトープへの結合(例えばＥＧＦＲへの結合)を顕著に妨害しない成分を利用する。各成分は、他の成分と適合性であり、患者に有害でない点で、薬学的におよび生理学的に許容される。製剤は、好都合には単位投与量形態で提示でき、医薬分野で周知の方法で製造でき、錠剤、丸剤、粉末剤、液体溶液剤または懸濁液剤(例えば、注射可能な、摂取可能なおよび局所の製剤(例えば、点眼剤、ゲル剤、ペースト剤、クリーム剤または軟膏剤)、エアロゾル剤(例えば、経鼻スプレー剤)、リポソーム剤、坐薬剤、腟坐剤、注射可能および点滴可能溶液剤および徐放性製剤を含むが、これらに限定されない。例えば、Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; and Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY参照。全身性に投与されるとき、治療的組成物は無菌、発熱性物質除去、一般に無微粒子状物質であり、ｐＨ、等張性および安定性に関する責を有する、非経腸的に許容される溶液中である。これらの条件は当業者に知られる。非経腸的に投与可能な組成物の製造方法は当業者に周知であるか、明らかであり、例えば、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy (以前はRemington's Pharmaceutical Sciences)”, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)により詳細に記載されている。
ここに提供する医薬組成物は種々の形態、例えば、固体、半固体、液体、粉末、水性または凍結乾燥形態であり得る。適切な医薬担体の例は当分野で知られ、とりわけ水、緩衝剤、食塩水溶液、リン酸緩衝化食塩水溶液、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液、アルコール類、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール類、ゼラチン、グリセリン、炭水化物例えばラクトース、スクロース、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル類、ヒドロキシメチルセルロース、粉末を含むが、これらに限定されない。ここに提供する医薬組成物は、とりわけ、例えば、抗酸化剤、防腐剤、抗微生物剤、鎮痛剤、結合剤、崩壊剤、着色料、希釈剤、添加物、増量剤、流動促進剤、可溶化剤、安定化剤、張性剤、媒体、粘性剤、風味剤、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、乳化および懸濁化剤、例えばアカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ベントナイト、カルボマー、カラゲナン、カルボキシメチルセルロース、セルロース、コレステロール、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、オクトキシノール９、オレイルアルコール、ポビドン、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル類、ステアリルアルコール、トラガカント、キサンタンゴムおよびその誘導体、溶媒および雑多な成分、例えば結晶セルロース、微結晶セルロース、クエン酸、デキストリン、デキストロース、液体グルコース、乳酸、ラクトース、塩化マグネシウム、メタリン酸カリウム、デンプンを含む、他の添加物を含み得る(一般に、Alfonso R. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins参照)。このような担体および／または添加物は慣用の方法で製剤でき、対象に適切な投与量で投与できる。安定化剤、例えば脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマーおよびキレート剤は、組成物が体内で分解するのを阻止し得る。
抗体投与経路は既知方法に従い、例えば、下記静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、髄腔内、吸入または病巣内経路による注射または注入、局所または徐放系による。抗体は、典型的に、連続的に点滴によりまたはボーラス注射により投与される。抗体を局所または全身様式で投与できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗体は、薬学的に許容される担体と混合物で製造できる。化合物の製剤および投与のための技術は当業者に知られる(例えば“Remington's Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, Pa.参照)。この治療的組成物は、静脈内または鼻または肺を通して、好ましくは液体または粉末エアロゾル(凍結乾燥物)として投与できる。組成物はまた、所望により非経腸的にまたは皮下に投与できる。全身性に投与するとき、治療的組成物は、無菌、発熱性物質除去、一般に無微粒子状物質であり、ｐＨ、等張性および安定性に関する責を有する、非経腸的に許容される溶液中である。これらの条件は当業者に知られる。
使用に適する医薬組成物は、１種以上の抗ＥＧＦＲ抗体が意図する目的の達成に有効な量で包含される組成物を含む。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。治療有効投与量は、ここに記載するとおり、インビトロおよびインビボ方法を使用して決定できる。従って、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、医薬製剤中にあるとき、投与用の単位投与形態で存在できる。
治療的製剤は、多くの慣用の投与量製剤で投与できる。簡単に言うと、ここに提供される抗体の投与量製剤は、所望の程度の純度を有する化合物と生理学的に許容される担体、添加物または安定化剤の混合により、保存または投与のために製造される。このような物質は、用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、緩衝液、例えばＴＲＩＳ ＨＣｌ、ホスフェート、シトレート、アセテートおよび他の有機酸塩；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量(約１０残基未満)ペプチド、例えばポリアルギニン、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリジノン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン；単糖類、二糖類およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリン類を含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール類、例えばマンニトールまたはソルビトール；カウンターイオン、例えばナトリウムおよび／または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN、PLURONICSまたはポリエチレングリコールを含み得る。
インビボ投与に使用するとき、修飾抗ＥＧＦＲ抗体製剤は無菌でなければならず、慣用の薬務に従い製剤できる。これは、凍結乾燥および再構成前または後の無菌濾過膜を介する濾過により容易に達成される。抗体は、通常凍結乾燥形態または溶液で保存される。他の媒体、例えばゴマ油、ピーナッツ油または綿実油のような天然起源植物油またはオレイン酸エチルのような合成脂肪媒体など望まれ得る。緩衝液、防腐剤、抗酸化剤などを、承認された薬務に従い包含できる。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば正確にまたは約０.１mg／mL、０.２mg／mL、０.３mg／mL、０.４mg／mL、０.５mg／mL、０.６mg／mL、０.７mg／mL、０.８mg／mL、０.９mg／mL、１.０mg／mL、１.５mg／mL、２.０mg／mL、２.５mg／mL、３.０mg／mL、３.５mg／mL、４.０mg／mL、４.５mg／mL、５.０mg／mL、５.５mg／mL、６.０mg／mL、６.５mg／mL、７.０mg／mL、７.５mg／mL、８.０mg／mL、８.５mg／mL、９.０mg／mL、９.５mg／mL、１０mg／mLまたはそれ以上のような、正確にまたは約０.１〜１０mg／mLの濃度で提供され得る。溶液の体積は、例えば、正確にまたは約０.５mL、１mL、２mL、３mL、４mL、５mL、１０mL、１５mL、２０mL、２５mL、３０mL、３５mL、４０mL、４５mL、５０mL、５５mL、６０mL、６５mL、７０mL、７５mL、８０mL、８５mL、９０mL、９５mL、１００mLまたはそれ以上のような、正確にまたは約１〜１００mLであり得る。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体は、リン酸緩衝化食塩水中に供給される。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、リン酸緩衝化食塩水中に２mg／mL濃度で１００mgの抗ＥＧＦＲ抗体を含む５０mL、頓用バイアルとして供給できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、保存のために凍結乾燥され、使用前に適切な担体で再構成され得る。この技術は、慣用の免疫グロブリンおよびタンパク質製剤で有効であることが示されており、分野で知られる凍結乾燥および再構成技術を用いることができる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、放出制御または徐放組成物として提供できる。重合体物質が、ここに提供する抗体の放出制御または徐放を達成できる丸剤およびカプセル剤の製剤のために当分野で知られている(例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Langer and Peppas (1983) J. Macromol. Sci. 23:61; see also Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105；米国特許番号５,６７９,３７７、５,９１６,５９７、５,９１２,０１５、５,９８９,４６３、５,１２８,３２６；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１５１５４およびＷＯ９９／２０２５３参照)。徐放製剤で使用するポリマーの例は、ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン−コ−ビニルアセテート)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(ＰＬＧ)、ポリ無水物、ポリ(Ｎ−ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(ＰＬＡ)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧＡ)およびポリオルトエステル類を含む。一般に、徐放性製剤で使用するポリマーは不活性であり、浸出可能不純物がなく、保存に安定であり、無菌および生分解性である。徐放製剤の製造のための当分野で知られるあらゆる技術を、１種以上のここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を含む徐放性製剤の製造に使用できる。
ある例において、医薬組成物は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体および１種以上の付加的抗体を含む。ある例において、１種以上の付加的抗体は、例えば、ＡＢＸ−ＥＧＦまたはセツキシマブのような、ここに記載するまたは当分野で知られる抗ＥＧＦＲ抗体である。
２. 製品／キット
抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体またはその誘導体または生物学的に活性な一部をコードする核酸の医薬組成物は、パッケージング物質、抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる疾患または状態、例えばここに記載するまたは当分野で知られる疾患および状態の処置に有効である医薬組成物および抗体または核酸分子が感染、疾患または障害の処置に使用するものであることを示すラベルを含む製品として包装できる。医薬組成物は、一回投与量または多回投与量のための医薬組成物の一定量を含む単位投与形態で包装できる。包装された組成物は、投与前に再構成(例えば水または食塩水で)できる、提供される修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む医薬組成物の凍結乾燥粉末を含み得る。
ここに提供する製品はパッケージング物質を含む。医薬品のパッケージングに使用するパッケージング物質は当業者に周知である。例えば、各々引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許番号５,３２３,９０７、５,０５２,５５８および５,０３３,２５２参照。医薬パッケージング物質の例は、ブリスターパック、ビン、チューブ、吸入器(例えば、加圧式定量吸入器(ＭＤＩ)、乾燥粉末吸入器(ＤＰＩ)、ネブライザー(例えば、ジェットまたは超音波ネブライザー)および他の一回吸入液体システム)、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、および選択製剤および意図する投与方法および処置に適する任意のパッケージング材を含むが、これらに限定されない。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体、その抗体をコードする核酸分子、医薬組成物または組み合わせ剤はまたキットとして提供できる。キットは、所望により１個以上の要素、例えば使用指示、デバイスおよび付加的試薬(例えば、組成物希釈および／または凍結乾燥タンパク質再構成のための滅菌水または食塩水溶液)および、本方法実施のためのチューブ、容器およびシリンジのような要素を含んでよい。キットの例は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を含んでよく、所望により使用指示、対象に抗ＥＧＦＲ抗体を投与するためのデバイス、対象における抗ＥＧＦＲ抗体を検出するためのデバイス、対象から得たサンプルにおける抗ＥＧＦＲ抗体を検出するための対象に付加的治療剤を投与するためのデバイスを含んでよい。
キットは、所望により、指示を含んでよい。指示は、典型的に、キットに含まれる修飾抗ＥＧＦＲ抗体および、所望により、他の要素および対象における適当な状態を決定する方法、適当な投与量、投与レジメンおよび抗ＥＧＦＲ抗体を投与するための適当な投与方法を含む投与方法を記載する理解できる表現を含む。指示はまた処置経過中の対象のモニタリングのためのガイダンスも含み得る。
キットはまたここに記載する医薬組成物および診断用アイテムを含み得る。例えば、このようなキットは、対象における選択抗ＥＧＦＲ抗体の濃度、量または活性を測定するためのアイテムを含み得る。
ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体は、単離した生物学的サンプルにおけるＥＧＦＲの検出用診断キットに提供される(例えば、腫瘍細胞、例えば対象から得た循環腫瘍細胞または対象から摘出した腫瘍細胞)。ある例において、診断キットは、一団の１個以上の抗ＥＧＦＲ抗体および／または１個以上のコントロール抗体(すなわち当分野で知られる非ＥＧＦＲ結合抗体またはＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブ)を含み、ここで、一団中の１個以上の抗体がここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
ここに提供するキットはまた対象に抗ＥＧＦＲ抗体を投与するためのデバイスを含み得る。対象への医薬の投与について当分野で知られる多様なデバイスのいずれかをここに提供するキットに包含できる。デバイスの例は、皮下針、静脈内針およびカテーテルを含むが、これらに限定されない。典型的にキットの修飾抗ＥＧＦＲ抗体を投与するためのデバイスは、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の所望の投与方法と適合性である。
３. 組み合わせ剤
提供されるのは、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体および第二剤、例えば第二抗ＥＧＦＲ抗体または他の治療剤または診断剤の組み合わせ剤である。組み合わせ剤は、ここに提供する方法に従い治療を行うための任意の抗ＥＧＦＲ抗体または試薬を含み得る。例えば、組み合わせ剤は、任意の抗ＥＧＦＲ抗体および化学療法剤を含み得る。組み合わせ剤はまたここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体と１種以上の付加的治療用抗体も含み得る。例えば、付加的治療剤は抗癌剤、例えばセクションＧに記載するような化学療法剤である。提供される修飾抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせ剤は、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を含む医薬組成物を含む。ここに提供する組み合わせ剤は、単一組成物または別々の組成物として製剤できる。
Ｇ. 治療的使用
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントは、抗ＥＧＦＲ抗体の使用について当業者に知られるあらゆる目的のために使用できる。例えば、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体は、治療、診断、産業および／または研究目的の一つ以上のために使用できる。特に、ここに提供する方法は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の治療的使用のための方法を含む。ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲを含む標的細胞、例えば、例えば癌細胞を死滅させるために使用できる。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦＲを遮断、アンタゴナイズまたはアゴナイズできる。このような活性により、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントは、腫瘍、癌または転移を含むが、これらに限定されない抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態のいずれかの処置のために、患者または対象に投与できる。治療的使用は、治療有効量の抗ＥＧＦＲ抗体の、単独または他の処置または薬剤と組み合わせた投与を含む。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントは、現存する抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブを使用する疾患または状態のいずれかの処置のための治療剤として使用できる。抗ＥＧＦＲ抗体は、投与されたとき、対象において、他の抗ＥＧＦＲ抗体の投与後に観察され得る副作用と比較して、減少したまたは少ない副作用の発生をもたらす。本明細書の他のどこかに記載するとおり、現存する抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブは、投与されたとき、対象において局所および全身副作用、特に皮膚副作用の発生をもたらし得る。これらの副作用は、治療的使用を制限し得る。多くの場合、これらの副作用は、中性生理的ｐＨ環境、例えば皮膚真皮でのＥＧＦＲへの結合と関連する。ここに提供する方法は、ここに提供する抗ＥＧＦＲの投与を含み、これは、中性ｐＨ、例えば約６.８〜約７.６の範囲のｐＨ、例えば高くてもまたは約または正確にｐＨ６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５または７.６よりも、低ｐＨ、例えば約５.６〜約６.８の範囲のｐＨ、例えば高くてもまたは約または正確にｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８で活性である。所望により、低ｐＨでの条件は、高乳酸濃度、例えば約１０mM〜約３０mM、例えば１０mM、１１mM、１２mM、１３mM、１４mM、１５mM、１６mM、１７mM、１８mM、１９mM、２０mM、２５mM、３０mMまたはそれ以上を含み得る。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体の１個以上の副作用と関連する中性生理的環境、例えば皮膚基底層よりも、腫瘍環境(低ｐＨおよび／または高乳酸濃度を有し得る)で大きな活性を有し得る。これは、局所および全身副作用を含む副作用を減少または予防するために、病的組織、例えば腫瘍組織のみを標的治療とすることにより、利点であり得る。
少ない副作用と関連する抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、高投与量レジメンで投与でき、改善された効果および安全性を有し得る。現存する抗ＥＧＦＲ抗体治療剤、例えばセツキシマブで観察されるものと比較して減少し得る副作用は、ここに記載するまたは当分野で知られる望ましくない非治療効果のいずれか、例えば悪心、嘔吐、胸部絞扼感、頭痛および関連心血管効果、例えば血圧不安定性および動脈性狭窄、皮膚毒性、骨髄抑制、心臓毒性、脱毛、腎機能不全、口内炎、貧血、発作、免疫反応、例えば急性アナフィラキシー、血清病、抗体産生、感染、癌、自己免疫性疾患および心臓毒性を含む。
ある例において、現存する抗ＥＧＦＲ抗体治療剤、例えばセツキシマブが原因の副作用と比較して、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、１個以上の副作用の重症度を、非修飾ＥＧＦＲ抗体の１個以上の副作用の重症度に対して少なくともまたは約９９％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約６５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約５５％、少なくともまたは約５０％、少なくともまたは約４５％、少なくともまたは約４０％、少なくともまたは約３５％、少なくともまたは約３０％、少なくともまたは約２５％、少なくともまたは約２０％、少なくともまたは約１５％または少なくともまたは約１０％減少させる。
本方法は、例えば対象の処置前の、例えば患者または対象がＥＧＦＲ依存性疾患または状態を有するか否かを決定するための、処置のための患者または対象の選択を含み得る。ある例において、ここに提供する方法は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブの投与が原因の有害副作用を経験したか、または経験している患者または対象を同定する段階を含む。当業者はは、当業者に知られるおよび／またはここに記載されている試験およびアッセイを使用して、このような状態、障害および副作用を容易に診断できる。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体での疾患および状態の処置は、注入、皮下注射、筋肉内、皮内、経口および局所および経皮投与を含むが、これらに限定されない、ここに記載する適切な製剤を使用して、任意の適切な投与経路により実施できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗体フラグメントは、投与されたとき、対象において、他の抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブと比較して、少ないまたは減少した副作用の発現をもたらし得るが、ある程度の副作用は投与により生じ得ることは理解される。容認できる副作用の数および程度は化合物を投与する状態によることは理解される。例えば、ある種の毒性および望ましくない副作用は、生命を危うくする病気の処置のときには許容されるが、それは、結果がそれほど悪くない障害の処置には居ようされない。療的使用に有効な量は、疾患の重症度および対象の体重および一般的状態ならびに投与経路に依存し得る。治療剤の局所投与は、典型的に、任意の全身投与の方法よりも少ない投与量を必要するが、治療剤の局所濃度は、いくつかの例では、全身投与により安全性を伴い達成できるものより局所投与のほうが高いことがある。
このセクションは、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の使用および投与方法の例を記載する。これらの記載する使用は例であり、ここに記載されている方法の使用を制限しない。このような方法は、抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる状態または疾患のいずれかの処置方法を含むが、これに限定されない。このような疾患または状態の同定は、担当医の技術の範囲内である。
１. 疾患および状態の例
ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、抗体、例えば抗ＥＧＦＲ抗体を使用できる任意の治療的目的に使用できる(例えば、Reeves et al. (2011) Otolaryngol Head Neck Surg. 144(5):676-84; Adams et al. (2008) Expert Rev Anticancer Ther. 8(8):1237-45; Belda-Iniesta et al. (2006) Cancer Biol Ther. 5(8):912-4; Liu et al. (2010) Cancer Chemother Pharmacol. 65(5):849-61参照)。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる疾患または障害を有する患者に投与する。ある例において、疾患の処置は、疾患の症状に対抗するための、疾患の臨床的顕在化後のここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体の投与を含む。ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、疾患根絶のために投与する。ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる疾患または障害の例は、自己免疫性および炎症性疾患、感染症および癌を含む。
ａ. 癌
ＥＧＦＲは、多様なヒト悪性腫瘍、例えば肺癌、頭頸部癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌および神経膠腫における癌発生および進行と関連する。ＥＧＦＲ関連分子因子、例えばコピー数および遺伝子変異が、癌の予後および予測因子として同定されている(例えば、Bronte et al. (2011) Front Biosci. 3:879-887; Harding and Burtness (2005) Drugs Today 41(2):107-127参照)。例えば、高ＥＧＦＲ発現は、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)の患者の予後不良と関連する(Szabo et al. (2011) Oral Oncol. 47(6):487-49６)。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦ受容体と結合し、刺激を阻止できる。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の受容体への結合は、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)の結合を阻害しおよび／または抗体−受容体複合体の内部移行をもたらすことができる(Harding and Burtness, Drugs Today (Barc))。それゆえに、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、受容体リン酸化および受容体関連キナーゼ活性の活性化を阻害し、最終的に受容体介在細胞シグナル伝達を遮断できる。
低ｐＨおよび／または高乳酸濃度でのここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の増加した活性のために、抗ＥＧＦＲ抗体は、非標的細胞または組織と比較して、腫瘍微小環境で優先的活性であり得る。ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントは、ＥＧＦＲを発現する、固形腫瘍を含む腫瘍の処置に使用できる。ＥＧＦＲ発現腫瘍は、その局所微小環境に存在するＥＧＦに感受性であり得て、さらに腫瘍産生ＥＧＦまたはトランスフォーミング増殖因子−アルファ(ＴＧＦ−α)により刺激され得る。本方法により処置または予防できる疾患および状態は、例えば、腫瘍増殖がＥＧＦＲ傍分泌および／または自己分泌ループを介して刺激されるものを含む。ここに記載する方法は、それゆえに血管が新生されていないまたはまだ実質的に血管が新生されていない腫瘍の処置に有用なであり得る。さらに、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍関連血管形成を阻止できる。血管内皮のＥＧＦＲ刺激は、腫瘍の血管新生と関連する。典型的に、血管内皮は、他の源(例えば腫瘍細胞)からのＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−αにより傍分泌形態で刺激される。従って、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、血管が新生された腫瘍または新生物の処置に有用であり得る。
変更されたｐＨ微小環境は、疾患状態で見られる最も一般的な微小環境、例えば腫瘍微小環境であり、他の特性、例えば低酸素と比較して、疾患微小環境で最も均一である(例えばFogh Andersen et al. (1995) Clin. Chem., 41:1522-1525; Bhujwalla et al. (2002) NMR Biomed., 15:114-119; Helmlinger et al. (1997) Nature Med., 3:177; Gerweck and Seetharaman (1996), Cancer Res. 56(6):1194-1198参照)。例えば、多くの腫瘍において、‘ワールブルク効果’が、約５.６〜約６.８の範囲のｐＨ、例えば高くてもまたは約または正確にｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８の微小環境を産生する。それゆえに、中性ｐＨよりも酸性ｐＨで活性な抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非標的疾患細胞または組織での活性を最小化しながら、ＥＧＦＲ発現腫瘍の処置に使用できる。
さらに、多くの腫瘍において、‘ワールブルク効果’は、１０〜１５mMの乳酸濃度の微小環境を産生する。高乳酸レベルは、頭頸部、転移結腸直腸癌、子宮頸癌および扁平上皮細胞癌を含むが、これらに限定されない、多様な腫瘍と関連することが判明している(例えば、Correlation of High Lactate Levels in Head and Neck Tumors with Incidence of Metastasis. Stefan Walenta, Ahmad Salameh, Heidi Lyng, Jan F. Evensen, Margarethe Mitze, Einar K. Rofstad, and Wolfgang Mueller-Klieser. (1997) American Journal of Pathology 150(2): 409-415; Correlation of High Lactate Levels in Human Cervical Cancer with Incidence of Metastasis. Georg Schwickert, Stefan Walenta, Kolbein Suiulfor. Einar K. Rofstad, and Wolfgang Mueller-Klieser. (1995) Cancer Research 55: 4757-4759; High Lactate Levels Predict Likelihood of Metastases, Tumor Recurrence, and Restricted Patient Survival in Human Cervical Cancers. Stefan Walenta, Michael Wetterling, Michael Lehrke, Georg Schwickert, Kolbein Sundfor, Einar K. Rofstad, and Wolfgang Mueller-Klieser. (2000) Cancer Research 60: 916-921; In Vitro Proton Magnetic Resonance Spectroscopic Lactate and Choline Measurements, 18F-FDG Uptake, and Prognosis in Patients with Lung Adenocarcinoma. JianFei Guo, Kotaro Higashi, Hajime Yokota, Yosinobu Nagao, Yoshimichi Ueda, Yuko Kodama, Manabu Oguchi, Suzuka Taki, Hisao Tonami, and Itaru Yamamoto. (2004) J Nucl Med 45: 1334-1339; Lactate and malignant tumors: A therapeutic target at the end stage of glycolysis. Saroj P. Mathupala, Chaim B. Colen, Prahlad Parajuli, Andrew E. Sloan (2007) J Bioenerg Biomembr 39: 73-77; Lactate Metabolism in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. Christopher P. Holroyde, Rita S. Axelrod, Charles L. Skutches, Agnes C. Haff, Pavle Paul, and George A. Reichard. (1979) Cancer Research 39: 4900-4904; Lactate, not pyruvate, is neuronal aerobic glycolysis end product: an in vitro electrophysiological study. A Schurr and R.S. Payne. (2007) Neuroscience 147: 613-619; Tumor lactate content predicts for response to fractionated irradiation of human squamous cell carcinomas in nude mice. Verena Quennet, Ala Yarominab, Daniel Zipsb, Andrea Rosnerb, Stefan Walentaa, Michael Baumannb, Wolfgang Mueller-Kliesera. (2006) Radiotherapy and Oncology 81: 130-135参照)。それゆえに、正常生理的乳酸濃度よりも高乳酸濃度で活性な抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非標的疾患細胞または組織での活性を最小化しながら、ＥＧＦＲ発現腫瘍の処置に使用できる。
処置できる腫瘍は、原発腫瘍および転移腫瘍、ならびに難治性腫瘍を含む。難治性腫瘍は、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独またはそれらの組み合わせでの処置に応答しないまたは耐性である腫瘍を含む。難治性腫瘍はまたこのような薬剤での処置により阻止されたように見えるが、処置中止後、最大５年間、ときどき最大１０年間またはそれより後で再発する腫瘍を含む。腫瘍は、ＥＧＦＲを正常レベルで発現してよくまたはＥＧＦＲを、例えば、正常レベルの少なくとも１０倍、１００倍または１０００倍であるレベルで過発現してよい。
ＥＧＦＲを発現し、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントで処置できる腫瘍の例は、癌、神経膠腫、肉腫(脂肪肉腫を含む)、腺癌、腺肉腫および腺腫を含む。このような腫瘍は、例えば、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸または肝臓を含む、体の実質的に全ての部分で生じ得る。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントで処置できる腫瘍の例は、ＥＧＦＲを過発現するものである。処置できるＥＧＦＲを過発現することが観察されているいくつかの腫瘍は、結腸直腸および頭頸部腫瘍、特に頭頸部の扁平上皮細胞癌、脳腫瘍例えば神経膠芽腫および肺、乳房、膵臓、食道、膀胱、腎臓、卵巣、子宮頸および前立腺の腫瘍を含むが、これらに限定されない。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体および抗体そのフラグメントにより処置できる腫瘍の他の例は、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽腫、毛細血管芽腫、髄膜腫および脳転移腫瘍、黒色腫、消化器および腎癌および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫(例えば多形神経膠芽腫)および平滑筋肉腫を含む。ＥＧＦＲを発現し得る癌の例は、リンパ腫、芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫および白血病またはリンパ系悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。このような癌の例は、血液系腫瘍、例えばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫(バーキットリンパ腫、小リンパ性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉症、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病およびリンパ形質細胞性白血病)、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆体細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ性白血病を含む成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、骨髄球性腫瘍、例えば成熟を伴うＡＭＬ、分化なしのＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病を含む骨髄異形成症候群および慢性骨髄増殖性障害；中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫および網膜芽細胞腫；頭頸部(例えば、鼻咽頭癌、唾液腺癌および食道癌)、肺(例えば、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌)、消化管(例えば、消化器癌を含む胃または胃部の癌、胆道または胆管の癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌および肛門の癌)、生殖器系(例えば、精巣、肛門陰茎または前立腺癌、子宮、膣、外陰、子宮頸部、卵巣および子宮内膜癌)、皮膚(例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、光線性角化症)、肝臓(例えば、肝癌、肝癌、肝細胞癌および肝細胞腫)、骨(例えば、骨巨細胞腫および溶骨性骨癌)、付加的組織および臓器の固形腫瘍(例えば、膵癌、膀胱癌、腎臓または腎癌、甲状腺癌、乳癌、腹膜の癌およびカポジ肉腫)および血管系の腫瘍(例えば、血管肉腫および血管外皮腫)を含むが、これらに限定されない。
ｂ. 非癌過増殖性疾患
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗体そのフラグメントは、対象における非癌過増殖性疾患の処置に使用できる。ＥＧＦＲは、Ｇタンパク質共役受容体(ＧＰＣＲ)、サイトカイン、受容体チロシンキナーゼおよびインテグリンから多様な細胞応答、例えばマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化、遺伝子転写および増殖へのシグナル伝達における重要な経路要素である。リガンドＥＧＦＲへの結合は、細胞質チロシン残基の自己リン酸化を誘発し、これは、細胞増殖に至る細胞経路を活性化できる。過発現および／または過刺激が超増殖を起こし得る。例えば、ＥＧＦＲｖIII変異により、ＥＧＦＲ受容体が構成的に活性なキナーゼ機能を有し、細胞増殖を刺激する。抗ＥＧＦＲ抗体が非癌過増殖性障害を処置できることは当分野で知られている。例えば、胃の希な、前悪性、非癌性、過増殖性障害であるメネトリエ病はセツキシマブで処置できる(Fiske et al. (2009) Sci Trasl. Med. 1(8): 8ra18; Myers et al.(2012) Mol. Cell. Proteomics 11:10.1074/mcp.M111.015222, 1-15)。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体により処置できる過増殖性疾患の例は、抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる過増殖性疾患のいずれかを含み、例えば、乾癬、日光角化症および脂漏性角化症、疣贅、ケロイド瘢痕および湿疹を含む。また包含されるのは、ウイルス感染、例えばパピローマウイルス感染が原因の過増殖性疾患である。種々のタイプの乾癬は、例えば膿汁様ブリスター(膿疱性乾癬)、重篤な皮膚脱落(紅皮症乾癬)、液滴様点(滴状乾癬)および滑らかな炎症損傷(逆乾癬)のような特徴を示し得る。乾癬の処置は、全てのタイプの乾癬(例えば、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、関節症性乾癬、類乾癬、掌蹠膿疱症)の処置を含むと理解される。
ｃ. 自己免疫性疾患または障害
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗体そのフラグメントは、自己免疫性疾患または障害の処置に使用できる。ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる自己免疫性疾患または障害の例は、同種異系間島移植拒絶反応、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、抗好中球細胞質自己抗体(ＡＮＣＡ)、副腎の自己免疫性疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性蕁麻疹、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン症候群、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群、慢性炎症性脱髄性ポリニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素疾患、クローン病、皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、必須混合型クリオグロブリン血症、第VIII因子不全、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、グッドパスチャー症候群、移植片−対−宿主疾患(ＧＶＨＤ)、橋本甲状腺炎、血友病Ａ、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、ＩｇＡニューロパシー、ＩｇＭ多発神経障害、免疫仲介血小板減少症、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合型結合組織疾患、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、ポリ腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、ポリ筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、固体臓器移植片拒絶、スティッフマン症候群、全身エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、例えば疱疹状皮膚炎、脈管炎、白斑症およびウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない。
ｄ. 炎症性障害
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗体そのフラグメントは、炎症性疾患または障害の処置に使用できる。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体により処置できる炎症性障害は、急性呼吸促迫症候群(ＡＲＤＳ)、急性敗血症性関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性脈管炎、アレルギー、喘息、アテローム性動脈硬化症、慢性細菌またはウイルス感染による慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、冠動脈疾患、脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨溶解、急性および遅延性過敏症反応と関連する炎症、腫瘍と関連する炎症、末梢神経傷害または脱髄性疾患、組織外傷、例えば熱傷および虚血と関連する炎症、髄膜炎による炎症、多臓器傷害症候群、肺線維症、敗血症および敗血症性ショック、スティーブンス・ジョンソン症候群、未分化関節症および未分化脊椎関節症を含むが、これらに限定されない。
ｅ. 感染症
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗体そのフラグメントは、感染症の処置に使用できる。ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる感染症は、病原体、例えばウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生虫が原因の疾患を含むが、これらに限定されない。感染症は、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、デング、エプスタイン・バー、ハンタ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｉ型単純ヘルペス、II型単純ヘルペス、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、インフルエンザ、麻疹、ムンプス、パポーバウイルス、ポリオ、呼吸器多核体ウイルス、牛疫、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹、ＳＡＲＳウイルス、天然痘およびウイルス性髄膜炎を含むウイルスが原因であり得る。感染症はまた、バチルス・アントラシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・トラコマチス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・テタニ、ジフテリア、大腸菌、レジオネラ、ヘリコバクター・ピロリ、マイコバクテリウム・リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、百日咳、シュードモナス・エルジノーサ、シュードモナス・ニューモニア、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、ビブリオ・コレラエおよびエルシニア・ペスチスを含む細菌が原因でもある。感染症はまた真菌、例えばアスペルギルス・フミガーツス、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ・アルビカンス、コクシジオイデス・イミチス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツムおよびペニシリウム・マルネッフェイが原因でもあり得る。感染症はまた原虫および寄生虫、例えばクラミジア、コクシジウム(kokzidiose)、リーシュマニア、マラリア、リケッチアおよびトリパノソーマが原因であり得る。
ｆ. 他の疾患および状態
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗体そのフラグメントは、ＥＧＦＲ発現と関連するおよび／または現存する抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブが処置することが知られている他の疾患および状態の処置に使用できる。ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる他の疾患および状態は、心臓状態、例えば鬱血性心不全(ＣＨＦ)、心筋炎および心筋の他の常態；皮膚状態、例えば酒さ、アクネおよび湿疹；骨および歯の状態、例えば骨喪失、骨粗鬆症、ページェット病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、歯周病、廃用性骨減少症、骨軟化症、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、骨転移、骨疼痛管理、液性悪性高カルシウム血症、歯周再建、脊髄傷害および骨折；代謝状態、例えばゴーシェ病；内分泌状態、例えばクッシング症候群；および神経学状態を含むが、これらに限定されない。
２. 治療対象
抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体での治療の対象または候補は、抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる疾患または状態、例えばここに記載するまたは当分野で知られる疾患または状態を有する対象、例えばヒト患者を含むが、これらに限定されない。
ａ. ＥＧＦＲを過発現する対象の選択
ある例において、治療の対象または候補を、例えば膜上のウェスタンブロッティング(ＷＢ)および全ホモジネートおよび組織マイクロアレイ上の免疫組織化学(ＩＨＣ)のような、当分野で知られる方法を使用するＥＧＦＲ発現の陽性の証拠について試験する。さらに、リン酸化ＥＧＦＲ(ｐＥＧＦＲ)を、膜上のウェスタンブロッティングにより測定できる(例えば、Thariat et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1313参照)。ＥＧＦＲ評価を、例えば、EGFRPHARMDXスコアリング・ガイドライン(Dako, Glostrup, Denmark)を使用して評価できる。ＥＧＦＲ発現ｃは、ＥＧＦＲ陽性細胞を最大密度で含み得る、腫瘍侵襲の最深領域を含む切片上で評価できる。このような方法は当業者の能力の範囲内である(例えば、Ervin-Haynes et al. (2006) J. Clin. Oncol. ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol. 24, No. 18S (June 20 Supplement)13000; Goldstein and Armin (2001) Cancer 92(5):1331-1346; Bibeau et al. (2006) Virchows Arch. 449(3):281-287参照)。
ｂ. ＥＧＦＲ関連多型性を示す対象の選択
ある例において、治療の対象または候補を、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の効果を予測するために、１個以上の多型性についてスクリーニングする。抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾ＥＧＦＲ抗体と相互作用できる多くの受容体、ヒト集団で多型である。ある患者または患者の集団について、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の効果は、タンパク質における特異的多型性の存在または非存在により影響を受け得る。例えば、ＦｃγＲIIIａは１５８位で多型であり、一般にＶ(高親和性)またはＦ(低親和性)のいずれかである。Ｖ／Ｖホモ接合型遺伝子型を有する患者は、強いナチュラル・キラー(ＮＫ)応答を開始し、抗ＣＤ２０抗体リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)での処置に良好な臨床的応答を有することが観察されている(Dall'Ozzo et. al. (2004) Cancer Res. 64:4664-4669)。さらなる多型性は、ＦｃγＲIIａ Ｒ１３１またはＨ１３１を含み、このような多型性は、多型性によってＦｃ結合およびその後の生物学的活性を高めるまたは強めることが知られｔいる。
ある例において、治療の対象または候補を、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の効果を予測するために１個以上の多型性についてスクリーニングする。このような方法は当業者の能力の範囲内である。この情報を、例えば、治験に包含するまたは除外する患者を選択するためにまたは承認後医師および患者に適当な投与量および処置選択肢に関するガイダンスを提供するために使用できる。例えば、ＦｃγＲIIIａ １５８Ｆがホモ接合型またはヘテロ接合型である患者では、抗体薬物、例えば抗ＣＤ２０ ｍＡｂリツキシマブは効果が下がり得る(Carton 2002 Blood 99: 754-758; Weng 2003 J. Clin. Oncol. 21:3940-3947)；このような患者は、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体にはるかに良好な臨床的応答を示し得る。
ｃ. 抗ＥＧＦＲ関連副作用を示す対象の同定
ある例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体で治療するための対象または候補は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば当分野で知られるあらゆる抗ＥＧＦＲ抗体の投与が原因の１個以上の副作用を経験している対象、例えばヒト患者であるが、これに限定されない。対象に副作用を起こした抗ＥＧＦＲ抗体治療に換えてここに提供する抗ＥＧＦＲを投与することは、同等なまたは改善された治療有効性をもたらし、同時に減少したまたは少ない副作用をもたらし得る。それゆえに、このような方法において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体以外の抗ＥＧＦＲ抗体治療剤を投与され、該治療剤の投与と関連する１個以上の症状または副作用を経験する対象を同する。次いで、同定された患者に、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を投与し、治療を継続する。ここに提供する抗ＥＧＦＲの投与量および投与頻度を含む投与レジメは、先の抗ＥＧＦＲ抗体治療と同一でも異なってもよい。いくつかの例では、投与量を増加しても減少してもよい。特定の処置する対象、疾患または状態の性質、現存する症状または副作用の性質および投与する特定のここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のような因子に基づき投与レジメを決定するのは、担当医の技術範囲内である。
本明細書の他のどこかに記載するとおり、ＥＧＦＲは、多くの正常ヒト組織で発現する(Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5)。それゆえに、多くの治療剤抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブの投与は望ましくない反応を起こす。このような副作用は当業者に周知であり、評価または同定できる。抗ＥＧＦＲ抗体治療剤が原因の副作用を同定する方法は、ここに記載するあらゆる方法、例えば患者問診、患者試験および血液試験を含む。評価できる副作用は、例えば、セツキシマブの投与と関連する副作用のような、ここに記載するあらゆる副作用を含む、抗ＥＧＦＲ抗体の投与と関連することが当業者に知られるあらゆる副作用であり得る。
例えば、セツキシマブの副作用は、症候性低マグネシウム血症、爪囲炎、発熱、皮膚科学的毒性、顔面および躯幹上部の丘疹小水疱性皮疹、発毛異常、頭毛喪失、顔面の毛および睫毛の成長増加、皮膚乾燥および掻痒および圧痛を伴う爪周囲炎症を含む、ここに記載するおよび／または当業者に知られるあらゆるものを含む(Eng (2009) Nat. Rev. 6:207-218; Schrag et al. (2005) J. Natl. Cancer Inst. 97(16):1221-1224; Lacouture and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12:1-5)。ある例において、セツキシマブの副作用は丘疹膿疱性発疹、皮膚乾燥、掻痒、眼および爪変化、ざ瘡様皮膚反応、ざ瘡様発疹、ざ瘡様濾胞性発疹、アクネ様発疹、斑点状丘疹皮膚発疹、単形性膿疱性損傷、丘疹膿疱性反応を含む皮膚毒性を含む(Lacouture and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12:1-5)。副作用は外部事象により誘発され得および／または経時的に発症し得る。例えば、皮膚発疹は日光暴露により誘発され得、段階的に、例えば感覚障害、紅斑および浮腫(例えば、第１週)；丘疹膿疱性発疹(例えば、第２週)；および痂皮(例えば、第４週)と進行し得る。発疹の処置が成功したら、紅斑および皮膚乾燥は、先に丘疹膿疱性発疹(例えば、第４〜６週)に冒された領域で見られ得る。抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブの投与と関連し得る他の皮膚毒性は、掻痒、紅斑および爪囲炎を含む(Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5)。例えば、セツキシマブは、患者の約５％に免疫応答を誘発する。このような免疫応答は、抗体またはフラグメントの循環からの免疫複合体介在クリアランスを生じ、反復投与を治療に不適とし、それにより患者の治療利益を減らし、抗体再投与を限定し得る。
ある例において、副作用の重症度をNational Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) v4.0に従い評価でき、これは、副作用の重症度の類別基準を設定する。ＣＴＣＡＥは、各有害作用の重症度の独特な臨床的記載を示すグレード１〜５を含む。ＣＴＣＡＥの一般的ガイドラインの下、グレード１有害事象は軽度、無症候性または軽度の症状、臨床的または診断的観察のみであり、介入は示されていない。グレード２有害事象は中程度の、最小の、局所的または非侵襲性介入が示され、年相応の手段的日常生活動作(ＡＤＬ)を制限する。グレード３有害事象は重篤なまたは医学的に顕著な、しかし、直ちに生命を危うくするものではなく、入院または長期入院が示され、セルフケアＡＤＬを無能および制限する。グレード４有害事象は、生命を危うくする結果であり、緊急の介入が指示される。グレード５有害事象は、有害事象と関連する死と分類される。それゆえに、例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を、特定のグレードの副作用を有すると同定された対象に投与したとき、ＣＴＣＡＥ ｖ４.０下で分類する副作用のグレードの減少により特徴付けられる副作用をもたらし得る。ある例において、副作用の減少は、ここに記載するまたは当業者に知られるあらゆる症状を含む、副作用と関連する症状の重症度の減少により特徴付けられる。
抗ＥＧＦＲ抗体の副作用を示す患者の他の道程方法は当業者に知られ、クオリティ・オブ・ライフ質問表を含む(例えば、Jonker et al. (2007) N. Engl. J. Med. 357:2040-2048)。抗ＥＧＦＲ抗体の副作用および副作用の重症度を同定するために当業者に知られる方法の例を下に記載する。これらの副作用は例であり、限定的であることを意図しない。抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブの投与と関連する当分野で知られるまたは個々に記載するあらゆる副作用を対象で同定でき、それにより対象を、そのような副作用がさらに増悪しないおよび／または減少するように、続いてここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる。
ｉ. 皮膚毒性
ヒト皮膚において、ＥＧＦＲは基底ケラチン生成細胞で発現され、上皮増殖を刺激し、分化を阻害し、創傷治癒を加速し得る(Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12:1-5; Nanney et al. (1996) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748)。ＥＧＦＲ機能の阻害はケラチン生成細胞の増殖および遊走を阻害し、炎症性ケモカイン発現を起こし得る。これらの効果は炎症性細胞動員および続く皮膚傷害に至り得て、これはここに記載する副作用のような副作用をもたらし得る。皮膚基底層環境のｐＨは中性である(例えば、正確にまたは約ｐＨ７.０〜７.２)。それゆえに、中性ｐＨよりも低ｐＨで活性が上昇した抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は皮膚毒性を減少させ、副作用を減少させ得る。皮膚におけるＥＧＦＲ阻害が原因の副作用およびその同定および分類方法の例を下に記載する。
丘疹(小さく、盛り上がった面皰)および膿疱(小さく、膿が詰まった疱疹)から成る皮疹により特徴付けられる丘疹小水疱性皮疹およびざ瘡様発疹は、典型的に顔面、頭皮および胸上部および背中に現れる。アクネと異なり、丘疹小水疱性皮疹は白色頭または黒色頭を有さず、掻痒または圧痛のある損傷を伴い、症候性であり得る(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010)。丘疹小水疱性皮疹およびざ瘡様発疹は、患者試験および／または臨床的問診により同定および分類できる。グレード１丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は、＜１０％体表面積(ＢＳＡ)を覆う丘疹および／または膿疱と分類され、これは、掻痒または圧痛の症状と関連し得る。グレード２丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は、１０〜３０％ＢＳＡを覆う丘疹および／または膿疱と分類され、これは掻痒または圧痛の症状と関連し得る；心理社会的影響と関連し；的手段的日常生活動作(ＡＤＬ)を限定する。グレード３丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は、＞３０％ＢＳＡを覆う丘疹および／または膿疱と分類され、これは、掻痒または圧痛の症状と関連し得る；セルフケアＡＤＬを限定する；そして、経口抗生物質指示を伴う局所重感染と関連し得る。グレード４丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は、ＢＳＡのあらゆるパーセントを覆う丘疹および／または膿疱と分類され、掻痒または圧痛の症状と関連し得て、IV抗生物質の指示を伴う広範な重感染と関連し；生命を危うくする結果である。グレード５丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は死をもたらすと分類される(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブの副作用の例は皮膚乾燥であり、これは、鱗状およびくすんだ肌；細孔および紙のような薄い皮膚肌目により特徴付けられる障害である。皮膚乾燥は患者の試験および／または臨床的問診により同定および分類できる。グレード１皮膚乾燥は＜１０％ＢＳＡを覆い、関連する紅斑または掻痒がないとして分類される。グレード２皮膚乾燥は、１０％〜３０％ＢＳＡを覆い、紅斑または掻痒を伴い、手段的ＡＤＬの制限があると分類される。グレード３皮膚乾燥は＞３０％ＢＳＡを覆い、掻痒およびセルフケアＡＤＬの制限と関連すると分類される(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
皮膚色素増加症は、過剰なメラニン沈着による皮膚の黒ずみにより特徴付けられる副作用である。皮膚色素増加症は患者の試験および／または臨床的問診により同定および分類できる。グレード１皮膚色素増加症は、＜１０％ＢＳＡを覆う色素増加症、心理社会的影響なしと分類される。グレード２皮膚色素増加症は、＞１０％ＢＳＡを覆う色素増加症および心理社会的影響と関連すると分類される(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
掻痒は、激しい掻痒感により特徴付けられる副作用である。掻痒は患者試験および／または臨床的問診により評価できる。グレード１掻痒は、軽度のまたは局所的掻痒として分類され、局所介入が示される。グレード２掻痒の症状は、激しいまたは広汎性の掻痒、間欠性掻痒、ひっかき行動による皮膚変化(例えば、浮腫、丘疹形成、剥脱、苔癬化、滲出／痂皮)、手段的ＡＤＬの制限を含み、経口介入が示され得る。グレード３掻痒の症状は、激しい、広汎性のおよび／または常時の掻痒、セルフケアＡＤＬの制限または睡眠の制限を含み、経口コルチコステロイドまたは免疫抑制性治療が示され得る(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
爪囲炎は、爪周囲の軟組織が含まれる、感染過程により特徴付けられる副作である。爪囲炎は患者試験および／または臨床的問診により評価できる。グレード１爪囲炎は、爪郭浮腫または紅斑および角質破壊の症状を含むとして分類される。グレード２爪囲炎の症状は、局所介入が示され得て、経口介入(例えば、抗生物質、抗真菌、抗ウイルス)が示され、疼痛を伴う爪郭浮腫または紅斑、分泌物または爪プレート分離および手段的ＡＤＬの制限を含み得る。グレード３爪囲炎の症状はセルフケアＡＤＬの制限を含み得て、外科的介入またはIV抗生物質が示される。
ii. 低マグネシウム血症
ＥＧＦＲは腎臓、特に、７０％の濾過マグネシウムが再吸収される場所であるヘンレループの上行性肢で高度に発現される。それゆえに、ＥＧＦＲと相互作用する抗体はマグネシウム輸送を妨害し得る。血中マグネシウムが低濃度である低マグネシウム血症は、抗ＥＧＦＲ抗体の投与の副作用であり得る。ある研究において、セツキシマブ治療を受けた患者の５％がグレード３または４低マグネシウム血症を示した。
ヘンレループは中性ｐＨ(例えば、ｐＨ６.９〜７.４)を有する(Dieleman et al.(2001) J. Acquir Immune Defic Syndr. 28(1):9-13; Dantzler et al. (2000) Pflugers Arch. 440(1):140-148)。それゆえに、中性ｐＨよりも低ｐＨで活性が増加した修飾抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は低マグネシウム血症を減少し得る。
低マグネシウム血症は、血清マグネシウムレベルの測定により診断および／または評価できる。例えば、ＣＴＣＡＥは、グレード１低マグネシウム血症を、＜正常下限(ＬＬＮ)−１.２mg／dLの血清マグネシウム濃度；グレード２低マグネシウム血症を、１.２〜０.９mg／dL血清マグネシウム；グレード３低マグネシウム血症を、＜０.９〜０.７mg／dL血清マグネシウム、グレード４低マグネシウム血症を、＜０.７mg／dL血清マグネシウムおよび生命を危うくする結果を伴い得る、そしてグレード５低マグネシウム血症を死に至ると分類する。さらに、低マグネシウム血症の症状は当業者に知られ、疲労、錯感覚および低カルシウム血症を含む(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010; Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
ｄ. 処置対象の選択または同定のための他の方法
当分野で知られる治療候補の他のスクリーニング方法が意図される。例えば、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ(ＫＲＡＳ)変異状態が、結腸直腸癌におけるセツキシマブ治療に対する応答の予測であることが最近示されている(Van Cutsem et al. (2008) J. Clin. Oncol 26 (May 20 suppl): Abstract 2)。ＫＲＡＳは、多くのシグナル伝達経路において役割を有するＧＴＰａｓｅである。ＫＲＡＳをコードする遺伝子の変異は、２５％を超える結腸直腸癌に存在し、ＥＧＦＲ阻害薬物の成功の予測である。変異ＫＲＡＳ遺伝子の発現は、ＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答の低下をもたらす。ＫＲＡＳ変異は、市販の検査診断で検出できる。
３. 投与量
ここに提供する方法において、抗ＥＧＦＲ抗体または抗体フラグメントの治療有効量を投与できる。このような投与量は当業者により、例えば担当医により経験的に決定できる。ある例において、投与する投与量は、特定の疾患または状態に対する既知抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブの投与量を参照する。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の治療有効濃度は、例えばここに提供するまたは当分野で知られるアッセイを使用する、既知インビトロおよびインビボ系における抗ＥＧＦＲ抗体の試験により経験的に決定できる。
治療的に投与される抗ＥＧＦＲ抗体の有効量は、例えば、治療的目標、投与経路および患者の状態による。さらに、担当医は、疾患の重症度およびタイプ、患者の健康、体重、性別、食習慣、時間および投与経路、他の医薬および他の関連臨床的因子を含む、薬物の作用を修飾することが知られる種々の因子を考慮できる。さらに、治療専門家は、副作用、例えばここに記載するまたは当分野で知られる副作用の発生率およびその重症度を考慮できる。従って、治療専門家は、必要に応じて、至適治療効果が得られ、かつ望ましくない副作用を最小化するために必要な抗体またはその抗原結合フラグメントの投与量をタイトレーションし、投与経路を修飾できる。臨床医は、抗体を投与量が所望の効果を達成するものに到達するまで投与できる。この治療の進展を、ここに記載するまたは当分野で知られる慣用のアッセイによりモニターできる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与量は、活性を達成し、同時に作副用を減らしまたは排除するのに必要な至適または最小投与量の同定により変わり得る。
一般に、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与の投与量範囲は、抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性の状態の症状が回復する、所望の治療効果を生じるのに十分多いものである。一般に、投与量は患者の年齢、状態、性別および疾患の程度により変わり、当業者により決定できる。ある例において、投与量は有害副作用を起こすほど多くない。投与量は、個々の医師が何らかの有害副作用の出現の場合には調節できる。投与量の例は、約または正確に０.１mg／kg〜１００mg／kg、例えば少なくとも約または約０.１mg／kg、約または正確に０.１５mg／kg、約または正確に０.２mg／kg、約または正確に０.２５mg／kg、約または正確に０.３０mg／kg、約または正確に０.３５mg／kg、約または正確に０.４０mg／kg、約または正確に０.４５mg／kg、約または正確に０.５mg／kg、約または正確に０.５５mg.kg、約または正確に０.６mg／kg、約または正確に０.７mg／kg、約または正確に０.８mg／kg、約または正確に０.９mg／kg、約または正確に１.０mg／kg、約または正確に１.１mg／kg、約または正確に１.２mg／kg、約または正確に１.３mg／kg、約または正確に１.４mg／kg、約または正確に１.５mg／kg、約または正確に１.６mg／kg、約または正確に１.７mg／kg、約または正確に１.８mg／kg、約または正確に１.９mg／kg、約または正確に２mg／kg、約または正確に２.５mg／kg、約または正確に３mg／kg、約または正確に３.５mg／kg、約または正確に４mg／kg、約または正確に４.５mg／kg、約または正確に５mg／kg、約または正確に５.５mg／kg、約または正確に６mg／kg、約または正確に６.５mg／kg、約または正確に７mg／kg、約または正確に７.５mg／kg、約または正確に８mg／kg、約または正確に８.５mg／kg、約または９mg／kg、約または９.５mg／kg、約または正確に１０mg／kg、約または正確に１１mg／kg、約または正確に１２mg／kg、約または正確に１３mg／kg、約または正確に１４mg／kg、約または正確に１５mg／kg、約または正確に１６mg／kg、約または正確に１７mg／kg、約または正確に１８mg／kg、約または正確に１９mg／kg、約または正確に２０mg／kg、約または正確に２１mg／kg、約または正確に２２mg／kg、約または正確に２３mg／kg、約または正確に２４mg／kg、約または正確に２５mg／kg、約または正確に３０mg／kg、約または正確に４０mg／kg、約または正確に５０mg／kg、約または正確に６０mg／kg、約または正確に７０mg／kg、約または正確に８０mg／kg、約または９０mg／kg、約または正確に１００mg／kgまたはそれ以上を含むが、これらに限定されない。ある例において、投与量の例は、約または正確に０.０１mg／ｍ２〜約または正確に８００mg／ｍ２、例えば例えば、少なくとも約または約または正確に０.０１mg／ｍ２、約または正確に０.１mg／ｍ２、約または正確に０.５mg／ｍ２、約または正確に１mg／ｍ２、約または正確に５mg／ｍ２、約または正確に１０mg／ｍ２、約または正確に１５mg／ｍ２、約または正確に２０mg／ｍ２、約または正確に２５mg／ｍ２、約または正確に３０mg／ｍ２、約または正確に３５mg／ｍ２、約または正確に４０mg／ｍ２、約または正確に４５mg／ｍ２、約または正確に５０mg／ｍ２、約または正確に１００mg／ｍ２、約または正確に１５０mg／ｍ２、約または正確に２００mg／ｍ２、約または正確に２５０mg／ｍ２、約または正確に３００mg／ｍ２、約または正確に４００mg／ｍ２、約または正確に５００mg／ｍ２、約または正確に６００mg／ｍ２および約または正確に７００mg／ｍ２を含むが、これらに限定されない。当業者は、mg／kgおよびmg／ｍ２の単位で投与量を認識し、変換できると理解される(例えば、Michael J. Derelanko, TOXICOLOGIST'S POCKET HANDBOOK, CRC Press, p.16 (2000)参照)。
疾患または状態の処置のために、抗ＥＧＦＲ抗体の投与量は疾患のタイプおよび重症度により変わり得る。抗ＥＧＦＲ抗体は、一回投与、複数の別々の投与または持続輸注により投与できる。数日間またはそれより長い期間の反復投与について、状態によって、処置は、疾患症状の所望の抑制が起こるまたは患者の状態の所望の改善が達成されるまで反復できる。反復投与は、処置の進行に応じて、抗ＥＧＦＲ抗体の量の増加または減少を含み得る。例えば、初期負荷投与量は維持投与量より多くてよい。ある例において、初期負荷投与量は４００mg／ｍ２であり、維持投与量は２５０mg／ｍ２である。
他の投与レジメンもまた意図される。例えば、投与レジメは変わり得る。副作用が減少した抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体は高投与レジメンで使用できる。さらに、病的組織で活性が増加した抗ＥＧＦＲ抗体は低投与レジメンで使用できる。ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体の活性の決定方法は当業者に知られ、方法の例はここに記載されている。さらに、投与レジメは経験的に決定できる。開示する抗ＥＧＦＲ抗体の個々の投与の最適な量および間隔は、処置する状態の性質および程度、投与の形態、経路および部位および特定の処置する対象の年齢および状態により、医師は使用すべき適当な投与量を決定できる。この投与量を、適宜何回も反復できる。副作用が生じたら、通常の診療に従い、量および／または投与頻度を変え、または減らし得る。このような試験は当業者のレベルの範囲内である。
ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体を１日あたりまたは数日間にわたり１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上投与する。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体を２回以上の連続投与で投与し、ここで、投与は選択した一定時間離れている。ある例において、選択した時間は、少なくともまたは約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間または３ヶ月間である。
特定の投与量または投与レジメンの副作用も、抗ＥＧＦＲ抗体の１投与量以上の投与後に、例えば、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる方法により評価できる。投与量および／または投与頻度は、副作用のタイプおよび重症度により修飾できる。
当業者により理解されるとおり、至適処置レジメンは変わり、至適治療的投与量および投与頻度を決定するために、治療前および１サイクル以上の治療後に、処置下の疾患の状態および患者の一般的健康を評価するのは処置方法の範囲内である。さらに特定の対象のいずれかについて、特異的投与レジメンは、個々の要求および医薬製剤を投与するまたは投与を監督する人の専門的判断に応じて経時的に調節でき、ここに示す投与量は単なる例であり、範囲をそれに限定することを意図しないことは理解される。疾患または状態、例えばここに記載する疾患または状態の処置のために投与する抗ＥＧＦＲ抗体の量は、ここに記載するまたは当業者に知られる標準的臨床的技術により決定できる。さらに、インビトロアッセイおよび動物モデルを用いて、至適投与量範囲の同定の助けとし得る。このようなアッセイは、対象、例えばヒトへの投与のために外挿できる投与量範囲を提供し得る。動物モデルに基づく至適投与量範囲の同定方法は当業者に周知であり、例はここに記載されている。
４. 投与経路
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば全身または局所投与を含む、ポリペチドの投与について当分野で知られるあらゆる方法により対象に投与できる。抗ＥＧＦＲ抗体は、非経腸(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または腔内)、局所、硬膜外または粘膜(例えば鼻腔内、経口、膣、外陰膣、食道、口腔食道、気管支または肺)のような経路で投与できる。抗ＥＧＦＲ抗体は、対象に外的に、局所または経皮作用の発揮のために疾患の部位に投与できる。抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物は、任意の好都合な経路で、例えば輸注またはボーラス注射により、上皮性または皮膚粘膜裏層(例えば、経口粘膜、膣、直腸および腸管粘膜)を介する吸収により投与できる。抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物は、他の生物学的活性剤と共に投与できる。具体例において、抗ＥＧＦＲ抗体は、輸注送達、例えば輸注ポンプまたはシリンジポンプにより投与され、他の治療剤と組み合わせてまたは単剤療法として投与できる。
投与の方法および／または経路は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の投与と関連する有害副作用を軽減するために変わり得る。例えば、患者が軽度または中程度(すなわち、グレード１または２)輸注反応を経験するならば、輸注速度を減速する(例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減らす)。患者が重篤な(すなわち、グレード３または４)輸注反応を経験するならば、輸注を一時的にまたは永久に中止し得る。
ある例において、対象が有害副作用、例えば重篤な皮膚毒性、例えば重篤なざ瘡様発疹を経験するならば、処置を調節し得る。例えば、有害副作用発生後、投与を、１〜２週間または有害副作用が改善するまでのように遅らせ得る。ある例において、さらに有害副作用が生じた後、投与量を減らし得る。例えば、投与量が２５０mg／ｍ２であるならば、有害副作用の２回目の発生後、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を１〜２週間遅らせてよい。副作用が改善したならば、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を２５０mg／ｍ２に量を減らして続けてよい。副作用が３回目に発生した後、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を１〜２週間遅らせてよい。副作用が改善したら、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を１５０mg／ｍ２に量を減らして続けてよい。有害副作用が数回発生した後、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を中止してよい。軽度または中程度皮膚毒性を有する患者において、当業者は、投与量を修飾することなく投与を続け得る。このような決定は当業者の能力の範囲内である。
送達のための適当な方法は、抗ＥＧＦＲ抗体または抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の特性に基づき、当業者が選択できる。このような特性は、溶解度、吸湿性、結晶化特性、融点、密度、粘性、流動、安定性および分解プロファイルを含むが、これらに限定されない。
５. 組み合わせ治療
ここに提供する方法において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、１種以上の他の治療レジメンまたは治療剤の前に、後にまたは同時に投与でき、熟練した医師は、経験的にまたは薬剤の薬物動態および作用機序に基づき、各治療レジメンまたは治療剤の適当な１回または複数回投与量、ならびに適当な投与のタイミングおよび方法を決定できる。付加的治療レジメまたは治療剤は、抗ＥＧＦＲ抗体の効果または安全性を高め得る。ある例において、付加的治療レジメまたは治療剤は、抗ＥＧＦＲ抗体の作用を変えるのではなく、同一疾患または合併性を処置できる。ある例において、付加的治療レジメまたは治療剤は、抗ＥＧＦＲ抗体の投与と関連する当分野で知られるまたはここに記載する１個以上の副作用を改善、低減または回避し得る。
例えば、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体は、化学療法、放射線治療または化学療法および放射線治療両者と共に投与できる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、抗体、細胞毒性剤、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管形成剤、心保護剤、免疫刺激剤、免疫抑制性剤、血液細胞の増殖を促進する薬剤、血管形成阻害剤、タンパク質チロシンキナーゼ(ＰＴＫ)阻害剤、付加的抗ＥＧＦＲ抗体、ＦｃγＲIIｂまたは他のＦｃ受容体阻害剤または他の治療剤を含むが、これらに限定されない１種以上の他の予防剤または治療剤と組み合わせて投与できる。
１種以上の付加的薬剤は、抗ＥＧＦＲ抗体と同時に、逐次的にまたは間欠性にできる。該薬剤は、抗ＥＧＦＲ抗体と、例えば、同一医薬組成物の一部としてまたは同一送達方法で併用できる。ある例において、該薬剤は、抗ＥＧＦＲ抗体と、修飾抗ＥＧＦＲ抗体と同時であるが、異なる送達手段で併用できる。該薬剤はまた抗ＥＧＦＲ抗体の投与と異なる時間であるが、抗ＥＧＦＲ抗体の投与と合わせた予防または治療効果を有するのに十分に近い時間に投与できる。ある例において、１種以上の付加的薬剤は、抗ＥＧＦＲ抗体の投与と一定期間離れて、後にまたは前に投与できる。ある例において、該期間は１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間または３ヶ月間である。ある例において、１種以上の付加的薬剤を複数回投与しおよび／またはここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を複数回投与する。
ある例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、１種以上の抗体または抗体フラグメントと投与する。抗ＥＧＦＲ抗体は、同一疾患または付加的合併性の処置に効果を有する１種以上の他の抗体と投与できる。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体と共に投与する１種以上の抗体は、抗癌抗体、自己免疫性または炎症性疾患を処置するための抗体、移植片拒絶を処置するための抗体、移植変対宿主病(ＧＶＨＤ)を処置するための抗体および感染症を処置するための抗体から選択できる。ある例において、ここに提供される抗ＥＧＦＲ抗体の２種以上を組み合わせて投与する。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体と併用できる抗癌抗体の例は、抗１７−ＩＡ細胞表面抗原抗体、例えばPanorex(登録商標)(エドレコロマブ)；抗４−１ＢＢ抗体；抗４Ｄｃ抗体；抗Ａ３３抗体、例えばＡ３３およびＣＤＰ−８３３；抗α１インテグリン抗体、例えばナタリズマブ；抗α４β７インテグリン抗体、例えばLDP-02；抗αＶβ１インテグリン抗体、例えばF-200、M-200およびSJ-749；抗αＶβ３インテグリン抗体、例えばアブシキシマブ、CNTO-95、Mab-17E6およびVitaxin(登録商標)；抗補体因子５(Ｃ５)抗体、例えば５Ｇ１.１；抗ＣＡ１２５抗体、例えばOvaRex(登録商標)(オレゴボマブ)；抗ＣＤ３抗体、例えばNuvion(登録商標)(ビジリズマブ)およびRexomab；抗ＣＤ４抗体、例えばIDEC-151、MDX-CD4、OKT4A；抗ＣＤ６抗体、例えばオンコリシンＢおよびオンコリシンＣＤ６；抗ＣＤ７抗体、例えばＨＢ２；抗ＣＤ１９抗体、例えばＢ４３、MT-103およびオンコリシンＢ；抗ＣＤ２０抗体、例えば２Ｈ７、2H7.v16、2H7.v114、2H7.v115、Bexxar(登録商標)(トシツモマブ)、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)およびZevalin(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン)；抗ＣＤ２２抗体、例えばLymphocide(登録商標)(エピラツズマブ)；抗ＣＤ２３抗体、例えばIDEC-152；抗ＣＤ２５抗体、例えばバシリキシマブおよびZenapax(登録商標)(ダクリズマブ)；抗ＣＤ３０抗体、例えばＡＣ１０、MDX-060およびSGN-30；抗ＣＤ３３抗体、例えばMylotarg(登録商標)(ゲムツズマブオゾガマイシン)、オンコリシンＭおよびSmart Ml 95；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ４０抗体、例えばSGN-40およびトラリズマブ；抗ＣＤ４０Ｌ抗体、例えば５ｃ８、Antova(登録商標)およびIDEC-131；抗ＣＤ４４抗体、例えばビヴァツヅマブ；抗ＣＤ４６抗体；抗ＣＤ５２抗体、例えばＣａｍｐａｔｈ(登録商標)(アレムツズマブ)；抗ＣＤ５５抗体、例えばSC-1；抗ＣＤ５６抗体、例えばhuN901-DM1；抗ＣＤ６４抗体、例えばMDX-33；抗ＣＤ６６ｅ抗体、例えばXR-303；抗ＣＤ７４抗体、例えばIMMU-1 10；抗ＣＤ８０抗体、例えばガリキシマブおよびIDEC-1 14；抗ＣＤ８９抗体、例えばMDX-214；抗ＣＤ１２３抗体；抗ＣＤ１３８抗体、例えばB-B4-DM1；抗ＣＤ１４６抗体、例えばAA-98；抗ＣＤ１４８抗体；抗ＣＥＡ抗体、例えばcT84.66、ラベツズマブおよびPentacea(登録商標)；抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えばMDX-101；抗ＣＸＣＲ４抗体；抗ＥＧＦＲ抗体、例えばABX-EGF、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ)、IMC-C225およびMerck Mab 425；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えばCrucellの抗ＥｐＣＡＭ、ING-1およびIS-IL-2；抗エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４抗体；抗Ｈｅｒ２抗体、例えばハーセプチン(登録商標))、MDX-210；抗ＦＡＰ(線維芽細胞活性化タンパク質)抗体、例えばシブロツズマブ；抗フェリチン抗体、例えばNXT-211；抗ＦＧＦ−１抗体；抗ＦＧＦ−３抗体；抗ＦＧＦ−８抗体；抗ＦＧＦＲ抗体、抗フィブリン抗体；抗Ｇ２５０抗体、例えばWX-G250およびRencarex(登録商標)；抗ＧＤ２ガングリオシド抗体、例えばEMD-273063およびTriGem；抗ＧＤ３ガングリオシド抗体、例えばBEC2、KW-2871およびミツモマブ；抗ｇｐIIｂ／IIIａ抗体、例えばReoPro；抗ヘパリナーゼ抗体；抗Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２抗体、例えばハーセプチン(登録商標)(トラスツマブ)、ＭＤＸ−２１０およびペルツズマブ；抗ＨＬＡ抗体、例えばOncolym(登録商標)、Smart 1D10；抗ＨＭ１.２４抗体；抗ＩＣＡＭ抗体、例えばＩＣＭ３；抗ＩｇＡ受容体抗体；抗ＩＧＦ−１抗体、例えばCP-751871およびEM-164；抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えばIMC-A12；抗ＩＬ−６抗体、例えばCNTO-328およびエルシリモマブ；抗ＩＬ−１５抗体、例えばHuMax(登録商標)-IL15；抗ＫＤＲ抗体；抗ラミニン５抗体；抗ルイスＹ抗原抗体、例えばHu3S193およびIGN-311；抗ＭＣＡＭ抗体；抗Ｍｕｃ１抗体、例えばBravaRexおよびTriAb；抗ＮＣＡＭ抗体、例えばERIC-1およびICRT；抗ＰＥＭ抗原抗体、例えばTheragynおよびTherex；抗ＰＳＡ抗体；抗ＰＳＣＡ抗体、例えばＩＧ８；抗Ｐｔｋ抗体；抗ＰＴＮ抗体；抗ＲＡＮＫＬ抗体、例えばＡＭＧ−１６２；抗ＲＬＩＰ７６抗体；抗ＳＫ−１抗原抗体、例えばMonopharm C；抗ＳＴＥＡＰ抗体；抗タグ７２抗体、例えばCC49-SCAおよびMDX-220；抗ＴＧＦ−β抗体、例えばCAT-152；抗ＴＮＦ−α抗体、例えばCDP571、CDP870、D2E7、ヒュミラ(登録商標)(アダリムマブ)およびレミケード(登録商標)(インフリキシマブ)；抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体；抗ＶＥ−カドヘリン−２抗体；および抗ＶＬＡ−４抗体、例えばアンテグレン(登録商標)を含むが、これらに限定されない。さらに、ＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２およびｇｐ７２エピトープ抗体１０５ＡＤ７を含むが、これらに限定されない抗イディオタイプ抗体を使用できる。さらに、抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体Ｂｉ２０を含むが、これに限定されない二重特異性抗体を使用できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体と併用できる自己免疫性または炎症性疾患、移植片拒絶、ＧＶＨＤを処置できる抗体の例は、抗α４β７インテグリン抗体、例えばLDP-02、抗ベータ２インテグリン抗体、例えばLDP-01、抗補体(Ｃ５)抗体、例えば5G1.1、抗ＣＤ２抗体、例えばBTI-322、MEDI-507、抗ＣＤ３抗体、例えばOKT3、ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３、抗ＣＤ４抗体、例えばIDEC-151、MDX-CD4、ＯＫＴ４Ａ、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１４抗体、例えばＩＣ１４、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ２３抗体、例えばIDEC 152、抗ＣＤ２５抗体、例えばゼナパックス、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、例えば５ｃ８、Antova、IDEC-131、抗ＣＤ６４抗体、例えばＭＤＸ−３３、抗ＣＤ８０抗体、例えばIDEC-114、抗ＣＤ１４７抗体、例えばABX-CBL、抗Ｅ−セレクチン抗体、例えばCDP850、抗ｇｐIIｂ／IIIａ抗体、例えばReoPro(登録商標)／Abcixima、抗ＩＣＡＭ−３抗体、例えばＩＣＭ３、抗ＩＣＥ抗体、例えばVX-740、抗ＦｃγＲ１抗体、例えばMDX-33、抗ＩｇＥ抗体、例えばrhuMab-E25、抗ＩＬ−４抗体、例えばSB-240683、抗ＩＬ−５抗体、例えばSB-240563、SCH55700、抗ＩＬ−８抗体、例えばABX-IL8、抗インターフェロンガンマ抗体および抗ＴＮＦａ抗体、例えばCDP571、CDP870、D2E7、インフリキシマブ、MAK-195F、抗ＶＬＡ−４抗体、例えばアンテグレンを含むが、これらに限定されない。自己免疫性または炎症性疾患、移植片拒絶およびＧＶＨＤの処置に併用できる他のＦｃ含有分子の例は、ｐ７５ ＴＮＦ受容体／Ｆｃ融合エンブレル(登録商標)(エタネルセプト)およびRegeneronのＩＬ−１トラップを含むが、これに限定されない。
感染症の処置に併用できる抗体は、抗炭疽抗体、例えばABthrax、抗ＣＭＶ抗体、例えばCytoGamおよびセビルマブ、抗クリプトスポリジウム抗体、例えばCryptoGAM、Sporidin-G、抗ヘリコバクター抗体、例えばPyloran、抗Ｂ型肝炎抗体、例えばHepeX-B、Nabi-HB、抗ＨＩＶ抗体、例えばHRG-214、抗ＲＳＶ抗体、例えばフェルビズマブ、ＨＮＫ−２０、パリビズマブ、RespiGamおよび抗スタフィロコッカス抗体、例えばAurexis、Aurograb、BSYX-A110およびSE-Mabを含むが、これらに限定されない。
ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、１個以上のＦｃ受容体との結合を競合する１個以上の分子と併用する。例えば、阻害性受容体ＦｃγＲIIｂの阻害剤の併用は、エフェクター機能を高め得る。同様に、活性化受容体、例えばＦｃγＲIIIａの阻害剤の併用は、望まないエフェクター機能を最小化し得る。Ｆｃ受容体阻害剤は、ＦｃγＲIIｂ、ＦｃγＲIIIａまたは他のＦｃ受容体との結合について競合的阻害剤として作用するように操作されたＦｃ分子、ならびに他の免疫グロブリン、特に、IVＩｇ(静脈内免疫グロブリン)と呼ばれる処置を含むが、これらに限定されない。一つの態様において、阻害剤を投与し、抗ＥＧＦＲ抗体の投与前に作用させる。逐次投与の効果を達成する別の方法は、Ｆｃ受容体阻害剤の速放性投与形態を投与し、その後抗ＥＧＦＲ抗体の徐放性製剤を投与することである。速放性および放出制御製剤は、別々に投与しても、一単位投与量形態に併せてもよい。
ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、１個以上の化学療法剤と投与する。化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎類、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；抗アンドロゲン例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン系、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン系、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン系、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン系、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン系、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４(５)−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY 117018、オナプリストンおよびトレミフェン(フェアストン)を含む抗エストロゲン類；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサートおよび５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；アジリジン系、例えばベンゾデパ、カルボコン、メツレデパおよびウレデパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホロアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン系およびメチルメラミン系；葉酸補充剤、例えばフォリン酸；窒素マスタード類、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロライド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；タンパク質、例えばアルギニンデイミナーゼおよびアスパラギナーゼ；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ；タキサン類、例えばパクリタキセル(タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)およびドセタキセル(タキソテール(登録商標))、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；チミジル酸シンターゼ阻害剤(例えばTomudex)；アセグラトンを含む付加的化学療法剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デホスファミド；デメコルチン；ジアジクオン；ジフルオロメチルオルニチン(ＤＭＦＯ)；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２,２’,２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド(“Ara-C”)；シクロホスファミド；チオテパ；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；エトポシド(ＶＰ−１６)；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプレリン；ゼローダ；イバンドロン酸；CPT-11；レチノイン酸；エスペラマイシン系；カペシタビン；およびトポイソメラーゼ阻害剤、例えばイリノテカンを含むが、これらに限定されない。上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を使用できる。ある例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体をイリノテカンと投与する(例えば、Pfeiffer et al. (2007) Acta. Oncol. 46(5):697-701参照)。
化学療法剤を、プロドラッグとして投与できる。ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と共に投与できるプロドラッグの例は、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ベータ−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されていてよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換されていてよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびより活性な細胞毒性遊離剤に変換できる他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含むが、これらに限定されない。
ある例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、１種以上の抗血管形成剤と併用できる。例えば、抗血管形成因子は、血管形成促進に関与する増殖因子または増殖因子受容体と結合した小分子またはタンパク質(例えば、抗体、Ｆｃ融合またはサイトカイン)である。抗血管形成剤の例は、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)と結合する抗体またはＶＥＧＦ−Ｒと結合する抗体、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｒ発現レベルを減少させるＲＮＡベースの治療剤、ＶＥＧＦ−毒素融合体、RegeneronのＶＥＧＦ−トラップ、アンジオスタチン(プラスミノーゲンフラグメント)、抗トロンビンIII、アンギオザイム、ABT-627、Bay 12-9566、BeneFin、ベバシズマブ、ビスホスホネート、BMS-275291、軟骨誘発阻害剤(ＣＤＩ)、ＣＡＩ、ＣＤ５９補体フラグメント、CEP-7055、Col 3、コンブレタスタチンＡ−４、エンドスタチン(コラーゲンXVIIIフラグメント)、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、フィブロネクチンフラグメント、ｇｒｏ−ベータ、ハロフジノン、ヘパリナーゼ類、ヘパリンヘキササッカライドフラグメント、ＨＭＶ８３３、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)、IM-862、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロン誘導型タンパク質１０(ＩＰ−１０)、インターロイキン−１２、クリングル５(プラスミノーゲンフラグメント)、マリマスタット、メタロプロテイナーゼ阻害剤(例えばTIMPs)、２−メトキシエストラジオール、MMI 270(CGS 27023A)、プラスミノーゲンアクティベーター阻害剤(ＰＡＩ)、血小板因子−４(ＰＦ４)、プリノマスタット、プロラクチン１６kDaフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質(ＰＲＰ)、PTK 787/ZK 222594、レチノイド類、ソリマスタット、スクアラミン、SS3304、SU5416、SU6668、SU11248、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン−１(ＴＳＰ−１)、TNP470、トランスフォーミング増殖因子ベータ(ＴＧＦ−β)、バスキュロスタチン、バソスタチン(カルレティキュリンフラグメント)、ZS6126およびZD6474を含むが、これらに限定されない。
ある例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１種以上のチロシンキナーゼ阻害剤と共に投与する。チロシンキナーゼ阻害剤の例は、キナゾリン類、例えばPD 153035、４−(３−クロロアニリノ)キナゾリン；ピリドピリミジン類；ピリミドピリミジン類；ピロロピリミジン類、例えばCGP 59326、CGP 60261およびCGP 62706；ピラゾロピリミジン類、４−(フェニルアミノ)−７Ｈ−ピロロ(２,３−ｄ)ピリミジン類；クルクミン(ジフェルロイルメタン、４,５−ビス(４−フルオロアニリノ)フタルイミド)；ニトロチオフェン部分含有チロホスチン類；PD-0183805(Warner-Lambert)；アンチセンス分子(例えばＥｒｂＢコード化核酸と結合するもの)；キノキサリン類(米国特許番号５,８０４,３９６)；チロホスチン類(米国特許番号５,８０４,３９６)；ＺＤ６４７４(Astra Zeneca)；ＰＴＫ−７８７(Novartis／Schering AG)；汎ＥｒｂＢ阻害剤、例えばＣ１−１０３３(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521; Isis/Lilly)；メシル酸イマチニブ(STI571、Gleevec(登録商標)；Novartis)；PKI 166(Novartis)；ＧＷ２０１６(GlaxoSmithKline)；C1-1033(Pfizer)；ＥＫＢ−５６９(Wyeth)；セマキシニブ(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；ＰＴＫ−７８７(Novartis／Schering AG)；INC-1 C11(Imclone)；または次の広報に記載されているもの：米国特許番号５,８０４,３９６；ＰＣＴ ＷＯ９９／０９０１６(American Cyanimid)；ＰＣＴ ＷＯ９８／４３９６０(American Cyanamid)；ＰＣＴ ＷＯ９７／３８９８３(Warner-Lambert)；ＰＣＴ ＷＯ９９／０６３７８(Warner-Lambert)；ＰＣＴ ＷＯ９９／０６３９６(Warner-Lambert)；ＰＣＴ ＷＯ９６／３０３４７(Pfizer、Ｉｎｃ)；ＰＣＴ ＷＯ９６／３３９７８(AstraZeneca)；ＰＣＴ ＷＯ９６／３３９７９(AstraZeneca)；ＰＣＴ ＷＯ９６／３３９８０(AstraZeneca)、ゲフィチニブ(Iressa(登録商標)、ZD1839、AstraZeneca)およびOSI-774(Tarceva(登録商標)、OSI Pharmaceuticals/Genentech)を含むが、これらに限定されない。
ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１種以上の免疫調節剤と投与する。このような薬剤は、１個以上のサイトカインの産生を増加または減少でき、自己抗原提示を上方または下方制御でき、ＭＨＣ抗原をマスクしまたは免疫細胞の１個以上のタイプの増殖、分化、遊走または活性化状態を促進する。免疫調節剤の例は、非ステロイド性抗炎症性薬物(ＮＳＡＩＤ)、例えばアスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、オキサプロジン、スリンダク、トルメチン、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェンおよびナブメトン；ステロイド類(例えばグルココルチコイド類、デキサメサゾン、コルチゾン、ヒドロキシコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、エイコサノイド類、例えばプロスタグランジン類、トロンボキサン類およびロイコトリエン類；ならびに局所ステロイド類、例えばアントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾールおよびタザロテン)；サイトカイン、例えばＴＧＦｂ、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２、ＩＬ４、ＩＬ−１０；サイトカイン、ケモカインまたは抗体を含む受容体アンタゴニスト、エンブレル(登録商標)(エタネルセプト)、ヒュミラ(登録商標)(アダリムマブ)およびレミケード(登録商標)(インフリキシマブ)を含む、ＢＡＦＦ、Ｂ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、補体因子(Ｃ５、Ｄ)、ＣＴＬＡ４、エオタキシン、Ｆａｓ、ＩＣＡＭ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮＡＲ、ＩｇＥ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒ１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インテグリン類、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＭＨＣ、セレクチン類、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦ−Ｒ１、Ｔ細胞受容体に対する、可溶性受容体および受容体−Ｆｃ融合物；異種性抗リンパ球グロブリン；他の免疫調節性分子、例えば２−アミノ−６−アリール−５置換ピリミジン類、ＭＨＣ結合ペプチドおよびＭＨＣフラグメントに対する抗イディオタイプ抗体、アザチオプリン、ブレキナール、ブロモクリプチン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、Ｄ−ペニシラミン、デオキシスペルグアリン、ＦＫ５０６、グルタラルデヒド、金、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、マロノニトロアミド類(例えばレフルノミド)、メトトレキサート、ミノサイクリン、ミゾルビン、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシンおよびスルファサラジンを含むが、これらに限定されない。
ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上のサイトカインと共に投与する。サイトカインの例は、リンホカイン、モノカインおよび伝統的ポリペチドホルモンを含むが、これらに限定されない。とりわけサイトカインに包含されるのは、増殖ホルモン、例えばヒト増殖ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト増殖ホルモンおよびウシ増殖ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)および黄体ホルモン(ＬＨ)；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経増殖因子、例えばＮＧＦ−ベータ；血小板増殖因子；トランスフォーミング増殖因子(ＴＧＦ)、例えばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ；インシュリン様増殖因子−Ｉおよび−II；エリスロポエチン(ＥＰＯ)；骨誘導因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、ベータおよびガンマ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ−ＣＳＦ(Ｍ−ＣＳＦ)；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)；および顆粒球−ＣＳＦ(Ｇ−ＣＳＦ)；インターロイキン(ＩＬ)、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータ；およびＬＩＦおよびキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペチド因子を含むが、これらに限定されない。
ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、１個以上のサイトカインまたは免疫系の細胞を刺激し、所望のエフェクター機能を増強する他の薬剤と共に投与する。例えば、ＩＬ−２を含むが、これに限定されないＮＫ細胞を刺激する薬剤をここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と投与できる。他の態様において、Ｃ５ａ、ホルミルペプチド、例えばＮ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン(Beigier-Bompadre et. al. (2003) Scand. J. Immunol. 57: 221-8)を含むが、これらに限定されないマクロファージを刺激する薬剤をここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と投与できる。また、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含むが、これらに限定されない好中球を刺激する薬剤をここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と投与できる。さらに、このような免疫刺激性サイトカインの遊走を促進する薬剤をここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と投与できる。またインターフェロンガンマ、ＩＬ−３およびＩＬ−７を含むが、これらに限定されない付加的薬剤は、１個以上のエフェクター機能を増強できる。ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を、１種以上のサイトカインまたはエフェクター細胞機能を阻害する他の薬剤と投与する。
ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を、アミノグリコシド抗生物質(例えばアプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン系、ブチロシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン)、アミノシクリトール類(例えばスペクチノマイシン)、アムフェニコール抗生物質(例えばアジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコールおよびチアムフェニコール)、アンサマイシン抗生物質(例えばリファミドおよびリファンピシン)、カルバペネム系(例えばイミペネム、メロペネム、パニペネム)；セファロスポリン系(例えばセファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフラミド、セフピロム、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セファレキシン、セフラジン)、セファマイシン系(セフブペラゾン、セフォキシチン、セフミノクス、セフメタゾールおよびセフォテタン)；リノコサミド類(例えばクリンダマイシン、リンコマイシン)；マクロライド(例えばアジスロマイシン、ブレフェルジンＡ、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トブラマイシン)、モノバクタム系(例えばアズトレオナム、カルモナムおよびチゲモナム)；ムピロシン；オキサセフェム系(例えばフロモキセフ、ラタモキセフおよびモキサラクタム)；ペニシリン系(例えばアムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナメシリン、ペネタマートヨウ化水素酸塩、ペニシリンｏ−ベネタミン、ペニシリンＯ、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンゾエート、ペニシリンＶヒドラバミン、ペニメピサイクリンおよびフェネチシリンカリウム)；ポリペチド(例えばバシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、テイコプラニン、バンコマイシン)；キノロン系(アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリニン酸、ペフロキサシン、ピペミド酸、ロソクサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシンおよびトロバフロキサシン)；リファンピン；ストレプトグラミン系(例えばキヌプリスチン、ダルホプリスチン)；スルホンアミド系(スルファニルアミド、スルファメトキサゾール)；テトラサイクリン系(クロルテトラサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、デメチルクロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ズラマイシン、ミノサイクリン、ネオマイシン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリンおよびバンコマイシン)を含むが、これらに限定されない１種以上の抗生物質と共に投与できる。
ある例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、アンホテリシンＢ、シクロピロクス、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ニスタチン、テルビナフィン、テルコナゾールおよびチオコナゾールを含むが、これらに限定されない１種以上の抗真菌剤と共に投与できる。ある例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤およびタイプＩインターフェロン、ウイルス融合阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、クレブジン、エンフュービルタイド、エンテカビル、フォスカーネット、ガンシクロビル、イドクスウリジン、インジナビル、ロピナビル、プレコナリル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、トリフルリジン、ビダラビンおよびジドブジンを含む他のものを含むが、これらに限定されない１種以上の抗ウイルス剤と共に投与する。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、他の治療レジメンと組み合わせ得る。例えば、一つの態様において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体で処置する患者は、放射線治療を受け得る。放射線治療は、当分野で一般に用いられ、当業者に知られるプロトコルに従い投与できる。このような治療は、セシウム、イリジウム、ヨウ素またはコバルト放射線を含むが、これらに限定されない。放射線治療は全身照射であってよくまたは体内または体の上の特異的部位または組織、例えば肺、膀胱または前立腺に直接局所であってよい。典型的に、放射線治療を、約１〜２週間の期間にわたりパルスで投与する。放射線治療は、しかしながら、長期間にわたり投与できる。例えば、放射線治療を、頭頸部癌を有する患者に約６〜約７週間投与し得る。所望により、放射線治療を一回投与または複数、連続的投与として投与できる。熟練した医師は、ここで有用な放射線治療の適当な１回または複数投与量を経験的に決定できる。ある例において、抗ＥＧＦＲ抗体および所望により、１種以上の他の抗癌治療をエクスビボで癌細胞を処置するために使用する。このようなクスビボ処置は、骨髄移植、特に、自己骨髄移植に有用であることが意図される。例えば、癌細胞を含む細胞または組織の、例えばここに記載する、抗ＥＧＦＲ抗体および１種以上の抗癌治療での治療は、レシピエント患者への移植前に癌細胞を枯渇または実質的に枯渇できる。
放射線治療は、同位体標識された分子、例えば抗体での処置も含み得る。放射免疫療法剤の例は、ゼヴァリン(登録商標)(Ｙ−９０標識抗ＣＤ２０)、LymphoCide(登録商標)(Ｙ−９０標識抗ＣＤ２２)およびベキサール(登録商標)(１−１３１標識抗ＣＤ２０)を含むが、これらに限定されない。
さらに、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、さらに別の他の治療的技術、例えば手術または光線療法と組み合わせて患者または対象に投与できることも意図する。
Ｈ. 実施例
次の実施例は、説明目的のみで包含し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１
抗ＥＧＦＲ抗体変異体の産生およびｐＨ依存性活性のスクリーニング
１. 一次スクリーニング
ａ. ライブラリーの産生
軽鎖(配列番号１１１０および配列番号９をコード)および重鎖(配列番号１１１１および配列番号８に示す完全重鎖配列をコード)を含む参照セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体を産生し、それによりＦＬＡＧタグ(配列番号１３)を、定常ドメインのＣ末端に結合し、ＩｇＧ抗体(配列番号１１０９に示す完全長ＤＮＡ配列)をコードするために発現ベクターにクローン化した。セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体の一点変異体のライブラリーを構築し、部位特異的変異誘発により産生した。ライブラリーはセツキシマブの変異体抗ＥＧＦＲ抗体を含み、それにより各メンバーは、セツキシマブの重鎖(配列番号８と配列番号３に示す可変重鎖)または軽鎖(配列番号１９と配列番号１０に示す可変軽鎖)の可変領域内に、参照抗体と比較して、１００アミノ酸位置の１個に単一アミノ酸変異を含んだ。変更した位置は、セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域であり、大多数の位置は、軽鎖または重鎖のＣＤＲ内であった(図１参照)。少なくとも１５アミノ酸変異を各位置で産生し、それによりアミノ酸ヒスチジンを、各位置で１５変異に包含させた。産生したライブラリーの一変異体メンバーの数は１５０１であった。ライブラリーの各メンバーを配列決定した。ライブラリーのメンバーのグリセロールストックを製造し、−８０℃で保存した。
ｂ. ライブラリーメンバーのスクリーニング
スクリーニングのために、ライブラリーの１メンバーをコードする発現ベクターを、ＩｇＧ抗体として個々にＣＨＯ細胞に発現させ、上清を回収した。プラスミドＤＮＡを、製造者のプロトコルに従い、リポフェクタミン２０００(Invitrogen, Cat. No. 11668-027)を使用して単層ＣＨＯ−Ｓ細胞(Invitrogen, Cat. No. 11619-012)に遺伝子導入した。簡単に言うと、ＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクションの前夜に播種し、１０％胎児ウシ血清(ＦＢＳ)添加ＤＭＥＭ中で増殖させた。翌日、細胞が８０％コンフルエントの後、ＣＨＯ−Ｓ細胞の培地をOpti-MEM(Invitrogen)に変えた。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミン(０.２μg ＤＮＡおよび０.５μL リポフェクタミン)の混合物をＣＨＯ−Ｓ細胞に添加し、一夜インキュベートした。翌日、細胞をＣＤ−ＣＨＯ無血清培地(Invitrogen, Cat. No. 10743-029)に添加した。遺伝子導入細胞からの上清をトランスフェクション後に回収した(一般にトランスフェクション後７２時間)。
上清を、下記２条件下、並行、ハイスループットｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用して、ＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメイン(ＥＧＦＲｓＥＣＤ)に対する結合をアッセイした。ＥＧＦＲｓＥＣＤをＨｉｓタグとコンジュゲート(ｓＥＧＦＲ−Ｈ６)し、商業的に得た(Sino Biologics, Cat #10001-H08H)。
簡単に言うと、ｓＥＧＦＲ−Ｈ６を、緩衝液Ａ(クレブス−リンゲル緩衝液(ＫＲＢ、Sigma Aldrich, # K4002)、ｐＨ７.４、ヒト血清不在)中、１２nM(１.３２μg／mL)で１００μL ｓＥＧＦＲ−Ｈ６抗原でプレートを、一夜、４℃または２時間、室温(ＲＴ)でコーティングすることにより、９６ウェルＨｉ結合プレート(Costar #2592)上に固定化した。次いで、プレートを３回緩衝液Ａ２５０μL／ウェルで洗浄した。次いで、プレートを２群に分け、第一群(ｐＨ７.４群)を続いて１時間、ＲＴで２５０μLのｐＨ７.４緩衝液Ｂ(１mM乳酸／２５％ヒト血清)で遮断し、第二群(ｐＨ６.０群)を、続いて、１時間、ＲＴで２５０μLのｐＨ６.０緩衝液Ｃ(１６.６mM乳酸／２５％ヒト血清)で遮断し、その間カバーした。
上記セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体ライブラリーの各変異体メンバーの１００μLのＦＬＡＧタグ付き抗ＥＧＦＲ抗体変異体上清を、結合ｓＥＧＦＲ−Ｈ６抗原を含む各々、２枚の９６ウェルプレートの別のウェルに、２希釈(希釈１および希釈２)で、添加した(各群１枚、ｐＨ６.０群およびｐＨ７.４群)。希釈について、上記浄化上清サンプルを、ｐＨ７.４緩衝液Ｂ(ＫＲＢ、ｐＨ７.４、１mM乳酸／２５％ヒト血清；群１)またはｐＨ６.０緩衝液Ｃ(ＫＲＢ、ｐＨ６.０、１６.６mM乳酸／２５％ヒト血清；群２)で、１：２０(希釈１)または１：１００(希釈２)に同一緩衝液で希釈した。ＦＬＡＧタグにコンジュゲートした参照セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体(抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ抗体)を標品として使用し、連続希釈(３×、出発濃度３０ng／mL、続いて１：３希釈)をｐＨ７.４緩衝液Ｂ(ＫＲＢ、ｐＨ７.４、１mM乳酸／２５％ヒト血清)またはｐＨ６.０緩衝液Ｃ(ＫＲＢ、ｐＨ６.０、１６.６mM乳酸／２５％ヒト血清)で調製し、１００μLをウェルあたり添加した。希釈後、セツキシマブ抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ抗体の濃度は、２００pM(３０ng／mL)、６６.６７pM(１０ng／mL)、２２.２２pM(３.３３ng／mL)、７.４１pM(１.１１ng／mL)、２.４７pM(０.３７ng／mL)、０.８２pM(０.１２３ng／mL)および０であった。
セツキシマブ抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ抗体標品および変異体抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧサンプルを含むプレートをカバーし、ＲＴで１時間インキュベートした。次いで、プレートを３回２５０μL／ウェルのｐＨ７.４緩衝液ＢまたはｐＨ６.０緩衝液Ｃで洗浄した。ｐＨ７.４緩衝液ＢまたはｐＨ６.０緩衝液Ｃ中、５００ng／mLの１００μL／ウェルヤギ抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ検出抗体(Abcam, #ab 1238)を各ウェルに添加し、プレートをカバーし、１時間、ＲＴでインキュベートした。次いで、プレートを３回２５０μL／ウェルのｐＨ７.４緩衝液ＢまたはｐＨ６.０緩衝液Ｃで洗浄した。最後に、１００μL Sureblue TMB Microwell Peroxidase Substrate 1-component(KPL, #52-00-03)溶液を各ウェルに添加し、プレートを１５〜２０分、ＲＴで発色させた(遮光)。１００μL ＴＭＢ停止溶液(ＫＰＬ、＃５０−８５−０６)の各ウェルへの添加により反応を停止させ、プレートをマイクロプレート分光光度計(Molecular Devices, Spectra Max M2)を使用して、３０分以内にＯＤ４５０nMを呼んだ。
ｃ. 抗体結合結果
ＥＬＩＳＡを二連で行い、二連反応の平均ＯＤ値を計算した。ＯＤ値に基づき、ｐＨ７.４(および１mM乳酸)と比較して、ｐＨ６.０(および１６.６mM乳酸)でｓＥＧＦＲ−Ｈ６に高い結合活性を示す変異体抗ＥＧＦＲ抗体を同定しており、表１５に示す。表は希釈１および希釈２での変異体抗体のｐＨ６.０の平均ＯＤ(ＯＤ６.０)、ｐＨ７.４の平均ＯＤ(ＯＤ７.４)およびｐＨ６.０と７.４の平均ＯＤ値比(ＯＤ６.０／ＯＤ７.４)を示す。表１５変異体抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖(ＨＣ)および軽鎖(ＬＣ)の可変領域の配列番号も示す。
ａ ＨＣ＝重鎖；ＬＣ＝軽鎖
ｂ Ｖ＝可変
ｄ. 抗体濃度決定
抗体濃度を抗ＥＧＦＲ抗体定量ＥＬＩＳＡにより決定した。簡単に言うと、プレートを１００μL ｓＥＧＦＲ−Ｈ６(Sino Biologicals Inc, Cat# 10001-H08H)抗原で、ＰＢＳ中１２nM(１.３２μg／mL)でコートし、２５０μl／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、１時間、室温で５mg／mL ＢＳＡ含有２５０μlのＰＢＳで遮断した。抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ抗体標品(タンパク質Ａカラム精製)の連続希釈を、５mg／mL ＢＳＡ含有ＰＢＳで調製した。出発抗体濃度は１００ng／mLであり、続いて記載のとおり１：３希釈した。試験サンプル希釈(１：３希釈)を調製し、１００μl／ウェルの標品および試験サンプルをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、３回２５０μl／ウェルの５mg／mL ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄した。１００μL／ウェルウサギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰを、ＰＢＳ／５mg／mL ＢＳＡ中、１：５０００(最終濃度０.２μL／mL)希釈で添加した。プレートを１時間、ＲＴでインキュベートし、３回２５０μl／ウェルのＰＢＳ／５mg／mL ＢＳＡで洗浄した。ＴＭＢ基質を添加し、プレートを上記のとおり読んだ。
ｅ. 比活性計算
比活性(ＳＡ)を、平均ＯＤ値を抗体濃度で割って計算した。次いで、各変異体について変異体抗ＥＧＦＲ抗体の比活性を参照ＦＬＡＧタグ付き抗ＥＧＦＲ親抗体の比活性で割って比活性を規準化して、規準化比活性(ＮＳＡ)を得た。表１６は、希釈１および希釈２での上記同定された変異体の各々の規準化比活性を示す。ｐＨ６.０でＮＳＡ＞０.４およびｐＨ７.４でＮＳＡ＜０.４を有する変異体抗ＥＧＦＲ抗体を同定し、さらなる分析のために選択した。これらの同定された抗体の変異は、軽鎖(ＬＣ)変異：Ｌ００４Ｃ、Ｌ００４Ｖ、Ｓ０５６ＨまたはＮ０９１Ｖを含む抗体；および重鎖(ＨＣ)変異：Ｖ０２４Ｉ、Ｖ０２４Ｌ、Ｓ０２５Ｃ、Ｓ０２５Ｇ、Ｓ０２５Ｉ、Ｓ０２５Ｑ、Ｓ０２５Ｔ、Ｓ０２５Ｌ、Ｎ０３１Ｉ、Ｎ０３１Ｔ、Ｎ０３１Ｖ、Ｙ０３２Ｔ、Ｖ０５０Ｌ、Ｇ０５４Ｒ、Ｇ０５４Ｃ、Ｇ０５４Ｐ、Ｄ０５８Ｍ、Ｙ０５９Ｅ、Ｆ０６３Ｒ、Ｆ０６３Ｃ、Ｆ０６３Ｇ、Ｆ０６３Ｍ、Ｆ０６３Ｖ、Ｔ０６４Ｎ、Ｔ０６４Ｖ、Ｓ０６８Ｆ、Ｓ０６８Ｑ、Ｄ０７２Ｋ、Ｄ０７２Ｌ、Ｄ０７２Ｍ、Ｄ０７２Ｗ、Ｎ０７３Ｑ、Ｓ０７４Ｈ、Ｓ０７４Ｒ、Ｓ０７４Ｄ、Ｓ０７４Ｇ、Ｓ０７４Ｙ、Ｋ０７５Ｈ、Ｋ０７５Ｗ、Ｑ０７７Ｒ、Ｑ０７７Ｅ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｐ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４ＳまたはＡ１０７Ｎを含む抗体である。
ａ ＨＣ＝重鎖、ＬＣ＝軽鎖
２. 確認スクリーニング
確認スクリーニングを、５％血清を両ｐＨ値で使用した以外、パート１に記載のとおり行った。表１７は、希釈１および希釈２で例示的な試験した修飾抗体について、各希釈でのｐＨ６.０のＯＤ(ＯＤ６.０)、各希釈でのｐＨ７.４のＯＤ(ＯＤ７.４)およびｐＨ６.０と７.４の平均ＯＤ値の比(ＯＤ６.０／ＯＤ７.４)を示す。
ａ ＨＣ＝重鎖、ＬＣ＝軽鎖
実施例２
コンビナトリアルライブラリーの産生およびスクリーニング
重鎖に変異ＬＣ−Ｉ２９Ｓ、Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｆ２７Ｒ、Ｒ９７Ｈ、Ｙ１０４Ｄおよび／またはＨＣ−Ｑ１１１Ｐの全組み合わせを有する抗体メンバーを含む、抗ＥＧＦＲ変異体メンバーのコンビナトリアルライブラリーを製造した。多点変異体を、実施例１に記載のセツキシマブ抗ＥＧＦＲ参照抗体に部位特異的変異誘発により産生した。ライブラリーはセツキシマブの変異体抗ＥＧＦＲ抗体を含み、それにより各メンバーは、重鎖(配列番号８と配列番号３に示す可変重鎖)または軽鎖(配列番号９と配列番号１０に示す可変軽鎖)の可変領域において、参照抗体と比較して１、２、３、４、５、６または７アミノ酸変異を含んだ。産生したコンビナトリアルライブラリーの変異体メンバーの総数は１２８であった。ライブラリーの各メンバーを配列決定した。ライブラリーのメンバーのグリセロールストックを調製し、−８０℃で保存した。スクリーニングのために、ライブラリーの１メンバーをコードする発現ベクターを、ＩｇＧ抗体としてＣＨＯ細胞に個々に発現させ、上清を回収した。
ライブラリーを、２５％ヒト血清を添加し、抗体を濃度４ng／mL、２ng／mLおよび１ng／mLに希釈して、実施例１に記載のとおりスクリーニングした。ＰＨ７.４と比較して、ｐＨ６.０で高結合活性を示す抗体の例を表１８に示し、これは、４ng／mL濃度での、修飾抗体およびセツキシマブのｐＨ６.０のＯＤ(ＯＤ６.０)、ＰＨ７.４のＯＤ(ＯＤ７.４)およびｐＨ６.０と７.４の平均ＯＤ値比(ＯＤ６.０／ＯＤ７.４)を示す。最高ＯＤ ｐＨ６.０／ＯＤ ｐＨ７.４結合比を有する抗体は、重鎖ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(配列番号１０６２)、ＨＣ−Ｖ２４Ｅ／Ｆ２７Ｒ／Ｒ９７Ｈ／Ｑ１１１Ｐ(配列番号１０９３)、ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／Ｙ１０４Ｄ(配列番号１１１２)およびＨＣ−Ｓ２５Ｃ／Ｑ１１１Ｐ(配列番号１１１３)を含むものであった。
実施例３
ＥＬＩＳＡ上へのヒト血清添加の効果
非修飾(セツキシマブ参照抗体)および変異体抗ＥＧＦＲ抗体(ＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ)の結合に対するヒト血清の効果を定量的ＥＬＩＳＡで決定した。
１. 発現および精製
ＣＨＯ−Ｓ細胞を、GlutaMAX(８mM)を添加したＣＤ−ＣＨＯ培地を使用して、シェーカーフラスコで培養した。トランスフェクションの日、凡その密度１.０×１０６細胞／mLの３００mLのＣＨＯ−Ｓ細胞を、製造者のプロトコルに従い、３７５μgのプラスミドＤＮＡと３７５μLのFreeStyleTMMAX試薬(Invitrogen)を使用して遺伝子導入した。トランスフェクション９６時間後、培地を遠心分離(４０００ｇ×２０’)により回収した。条件培地中の発現抗体を、さらにタンパク質Ａ樹脂(BioRad:Cat# 156-0218)から調製したタンパク質Ａカラム(２mL)を使用して、親和性クロマトグラフィーにより精製した。カラムに結合したＩｇＧを、１工程で０.１Ｍ グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２.５で溶出した。溶出したＩｇＧを中和し、ＢＣＡタンパク質アッセイ(Pierce Biotechnology)を使用してタンパク質決定前に透析した。
安定なＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体発現細胞株を確立するために、凡その密度１.０×１０６細胞／mLの３０mLのＣＨＯ−Ｓ細胞を、製造者のプロトコルに従い、３７.５μgのプラスミドＤＮＡと３７.５μLのFreeStyleTMMAX試薬(Invitrogen)を使用して遺伝子導入した。トランスフェクション７２時間後、細胞を、９６ウェル丸底プレート(Nunc)の１５ウェルに、１次元連続希釈ストラテジーを使用して、GlutaMAX(８mM)および１mg／mL Ｇ４１８添加ＣＤ−ＣＨＯ培地にクローン化した。４週間後、Ｙ１０４Ｄ変異体発現クローンを、検出抗体としてペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(Jackson Immonolab)を使用するウェスタンブロット分析(ＷＢ)によりスクリーニングした。陽性クローンを段階的に１２ウェル、次いで６ウェルプレート、その後Ｔ−２５およびＴ−７５フラスコおよび最終的にシェーカーフラスコに段階的に拡張した。５mg／ＬのＹ１０４Ｄで発現する１３Ｅ３および１５Ｄ６の２クローンをさらにウェーブバッグ・バイオリアクター産生に拡張して、Ｙ１０４Ｄ変異体のインビトロ、エクスビボおよびインビボの全特徴付けを支持した。
安定なＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ二重変異体発現細胞株を確立するために、凡その密度１.０×１０６細胞／mLの２５×５mLのＣＨＯ−Ｓ細胞を、製造者のプロトコルに従い、MaxCyte STX装置を使用して、エレクトロポレーションにより２５μgのプラスミドＤＮＡを使用して遺伝子導入した。トランスフェクション７２時間後、４×５mLの細胞を、９６ウェル丸底プレート(Nunc)の２５ウェルに、１次元連続希釈ストラテジーを使用して、GlutaMAX(８mM)および１mg／mL Ｇ４１８添加ＣＤ−ＣＨＯ培地にクローン化した。４週間後、Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体を発現するクローンを、検出抗体としてペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(Jackson Immonolab)を使用するウェスタンブロット分析(ＷＢ)によりスクリーニングした。次いで、陽性クローンを上記のとおりシェーカーフラスコまで段階的に拡張した。２〜５mg／ＬのＹ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐで発現する９−１−５Ｂおよび９−４−６Ａの２クローンを、さらにウェーブバッグ・バイオリアクター産生まで拡張して、Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体のインビトロ、エクスビボおよびインビボの全特徴付けを支持した。
２. ＥＬＩＳＡ上へのヒト血清添加の効果
ＥＬＩＳＡアッセイを、実施例１に記載のとおり、いくつか修飾して実施した。セツキシマブ抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ参照抗体およびＦＬＡＧタグ付き抗ＥＧＦＲＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体抗体の３倍連続希釈を出発濃度１００ng／mLから調製した。標準および変異体抗体を、血清不含、５％ヒト血清または２５％ヒト血清含有ｐＨ７.４緩衝液(ＫＲＢ、ｐＨ７.４、１mM乳酸)で調製した。標準および変異体抗体をまた血清不含、５％ヒト血清または２５％ヒト血清含有ｐＨ６.０緩衝液(ＫＲＢ、１６.６mM乳酸)で調製した。各条件について、抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ抗体標品およびＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体抗体の最終濃度は６６６.６７pM(１００ng／mL)、２２２.２２pM(３３.３３ng／mL)、７４.０７pM(１１.１１ng／mL)、２４.６９pM(３.７０ng／mL)、８.２３pM(１.２３ng／mL)、２.７４pM(０.４１ng／mL)、０.９１pM(０.１３７ng／mL)および０であった。１００μLの各濃度の各抗体を、９６ウェルプレートのウェルに添加した。各プレートは、抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ抗体標品、ポジティブコントロール(親抗体)およびネガティブコントロール(一次抗体なし)を含んだ。ＥＬＩＳＡを３連で行った。
結果は、ヒト血清が変異体抗ＥＧＦＲのｓＥＣＤ ＥＧＦＲへの結合を増加させることを示した。ヒト血清不在でのｓＥＣＤ ＥＧＦＲへの結合と比較して、５％ヒト血清添加は、ｐＨ６.０またはｐＨ７.４でＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ抗ＥＧＦＲ変異体についてＯＤの約３倍増加をもたらした。２５％ヒト血清添加は、ｐＨ６.０またはｐＨ７.４で、ヒト血清不在での結合と比較して、ＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ抗ＥＧＦＲ変異体でＯＤの約４〜５倍増加をもたらした。セツキシマブについて、ｐＨ６.０またはｐＨ７.４で５％または２５％ヒト血清添加は、ヒト血清不在でのＯＤと比較して、ＯＤの２倍未満の増加をもたらした。
実施例４
ＥＬＩＳＡにおける乳酸濃度の効果
非修飾(セツキシマブ参照抗体)および変異体抗ＥＧＦＲ抗体(ＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ)の結合における乳酸の効果を、アッセイ緩衝液を修飾して、実施例３に記載のとおりｐＨ感受性ＥＬＩＳＡで決定した。
セツキシマブ抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ参照抗体標品および試験するＦＬＡＧタグ付き抗ＥＧＦＲ抗体変異体(ＨＣ−Ｙ１０４ＤまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ)を、１６.７mM乳酸含有または乳酸不含のｐＨ６.０緩衝液(ＫＲＢ、ｐＨ６.０、血清無し)中で調製した。標準および変異体も、１６.７mM乳酸含有または乳酸不含ｐＨ７.４緩衝液(ＫＲＢ、血清無し)に調製した。各抗体を、最終濃度６６６.６７pM(１００ng／mL)、２２２.２２pM(３３.３３ng／mL)、７４.０７pM(１１.１１ng／mL)、２４.６９pM(３.７０ng／mL)、８.２３pM(１.２３ng／mL)、２.７４pM(０.４１ng／mL)、０.９１pM(０.１３７ng／mL)および０に希釈した。１００μLの標品および抗体変異体を適当なウェルに添加した。各プレートは、抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ抗体標品、ポジティブコントロール(親抗体)およびネガティブコントロール(一次抗体なし)を含んだ。ＥＬＩＳＡを３連で行った。結果は、高乳酸の存在は、ｐＨ６.０またはｐＨ７.４でセツキシマブまたは抗ＥＧＦＲ変異体のｓＥＣＤ ＥＧＦＲへの結合に有意な効果がないことを示した。
実施例５
同定されたヒットの結合親和性
バイオレイヤー干渉法を、ｐＨ６.５およびｐＨ７.４で変異体抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲへの結合を測定するために実施した。ｓＥＧＦＲに対するセツキシマブおよび変異体抗ＥＧＦＲ抗体の解離定数(ＫＤ)を、Octet QKe装置(ForteBio, Menlo Park, CA)を使用して、９６ウェル形式でバイオレイヤー干渉法により測定した。Data Acquisitionソフトウェアを、ビオチニル化ｓＥＣＤ ＥＧＦＲリガンド負荷および抗体結合および解離工程を含む全操作工程で使用した。リガンド負荷および抗体結合および解離工程をｐＨ値の異なる２群で行った(ｐＨ６.５群およびｐＨ７.４群)。
ビオチニル化ｓＥＣＤ ＥＧＦＲを、１５μLのＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン溶液(超純粋水中２０mM)(PIERCE, Cat# 21329)を１mgのｓＥＧＦＲに溶液で添加し、反応混合物を室温で３０分インキュベートすることにより製造した。未反応ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンを透析により除去し、ビオチニル化ｓＥＧＦＲのタンパク質濃度を、製造者の指示に従い、ＢＣＡタンパク質アッセイ(PIERCE, Cat# 23225)により測定した。
１. ｐＨ６.５およびｐＨ７.４での抗ＥＧＦＲ変異体の結合親和性
種々のｐＨでの結合差異を評価するために、リガンド負荷工程について、ビオチニル化ｓＥＣＤ ＥＧＦＲを、ＰＢＳ(ｐＨ６.５またはｐＨ７.４)中、ストレプトアビジンバイオレイヤーと結合させた。ストレプトアビジンセンサーを、ＰＢＳ(ｐＨ６.５またはｐＨ７.４)を含むウェルに１分浸し、次いでセンサーをＰＢＳ(ｐＨ６.５またはｐＨ７.４)中ビオチニル化ｓＥＧＦＲ(５０μg／mL)を含むウェルに２分浸した。センサーを、ＰＢＳ(ｐＨ６.５またはｐＨ７.４)を含むウェルで洗浄した。全工程中、プレートを１０００rpmで撹拌した。
親和性測定のための抗体結合および解離工程：
会合速度測定のために、固定化したｓＥＣＤ−ＥＧＦＲセンサーを、ｐＨ６.５または７.４のＰＢＳ中、２２nMまたは６６.７nMの抗体(セツキシマブまたは変異体抗ＥＧＦＲ抗体)を含むウェルに２分浸した。解離速度測定のために、抗体結合センサーを、ｐＨ６.５または７.４のＰＢＳウェルに４分浸した。ｓＥＧＦＲと抗体(セツキシマブまたは変異体抗ＥＧＦＲ抗体)の結合および解離を、光学層およびバイオレイヤーから反射された光により生じた干渉パターンの変化により定量した。
会合速度、解離速度およびＫＤ値を、網羅的曲線近似を使用して、ソフトウェアデータ分析(ｖ. ６.４)で計算した。ｐＨ６.５およびｐＨ７.４でのセツキシマブおよび変異体抗ＥＧＦＲ抗体のＫＤ値を表１９に示す。
２. 抗ＥＧＦＲ変異体の結合親和性に対する緩衝液組成物およびｐＨの効果
さらなる実験において、ＰＢＳ、クレブス−リンゲル重炭酸緩衝液(ＫＲＢ)またはＫＲＢと２５％ヒト血清中、ｐＨ６.０、６.５およびｐＨ７.４で変異体抗ＥＧＦＲ抗体のｓＥＣＤ ＥＧＦＲへの結合を、上記方法に順ずるバイオレイヤー干渉法を使用して測定した。結果を下記表２０に示す。
各緩衝液条件について、Ｙ１０４ＤおよびＹ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体は、ｐＨ６.０またはｐＨ６.５よりもｐＨ７.４でｓＥＧＦＲに対して低親和性(高ＫＤ値)を示し、ｐＨ６.０および６.５では同等の結合親和性であった。セツキシマブのｓＥＧＦＲに対する結合親和性は、試験した各緩衝液タイプで、ｐＨ値をとおして同等であった。ｐＨ６.０およびｐＨ６.５条件内で、セツキシマブは、ＫＲＢと比較して、ＰＢＳでｓＥＧＦＲに対して親和性がわずかに低く、ｐＨ７.４でＰＢＳおよびＫＲＢにおける親和性は同等であった。Ｙ１０４ＤおよびＹ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体は、全３ｐＨ条件内で、ＰＢＳおよびＫＲＢで同等の結合を示した。全３抗体の結合親和性は、２５％ヒト血清存在下で最高であった。２５％血清存在下、Ｙ１０４ＤおよびＹ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体およびセツキシマブは同等な結合速度(ｋｏｎ)を示従、Ｙ１０４ＤおよびＹ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体は高い解離速度(ｋｏｆｆ)を示し、該変異体の結合親和性(ＫＤ)が減少した。セツキシマブと変異体の解離速度(ｋｏｆｆ)の差異は、ｐＨ７.４で最大であった。
実施例６
ＥＧＦＲリン酸化
参照セツキシマブ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体変異体で処置したヒト新生児ケラチン生成細胞およびＡ４３１細胞からのリン酸化ＥＧＦＲの濃度をＥＬＩＳＡ(RnD systems reagents, #DYC3570-2)で測定した。
１. サンプル調製
約１０,０００細胞のヒト新生児ケラチン生成細胞(Invitrogen C-001-5C)またはＡ４３１細胞(ATCC CRL 1555)を、９６ウェルプレート(BD Falcon #35-3072)のウェルに播種した。一夜、３７℃で加湿雰囲気の５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベーション後、細胞を無血清ダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ)で洗浄し、最懸濁し、一夜同一条件下にインキュベートした。細胞を冷リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ；１３７mM ＮａＣｌ、２.７mM ＫＣｌ、８.１mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１.５mM ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７.２〜７.４)で洗浄した。次いで、プレート２群に分けた。第一群で、１０μg／mL 精製セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体または緩衝液コントロールを、ｐＨ７.４に調節したリン酸緩衝液に添加した。第二群で、精製セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体または緩衝液コントロールを、ｐＨ６.５に調節したリン酸緩衝液に添加した。Ａ４３１細胞について、用量−応答も行い、それによりセツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体を、３０μg／mL、１０μg／mL、３.３３μg／mL、１.１１μg／mL、０.３７μg／mL、０.１２３μg／mLおよび０.００１μg／mL濃度でサンプルに添加した。細胞を１５〜３０分、３７℃でインキュベートした。
抗体とのインキュベーション後、ＥＧＦ(RnD Systems, catalog no. 236-E)(１００μg／mL)も、抗体と同一緩衝液中の細胞に別に添加した。抗体添加無し(ＥＧＦのみ)または抗体添加無しまたはＥＧＦ添加(Ｒｘ無し)のコントロール細胞も試験した。細胞を１５〜３０分、３７℃でインキュベートした。抗原とインキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、冷溶解緩衝液(１％NP-40 Alternative、２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、１３７mM ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２mM ＥＤＴＡ、１mM活性化オルトバナジン酸ナトリウム、１０μg／mLアプロチニン、１０μg／mLロイペプチン)を添加した。ライセートを回収し、直ぐにアッセイするかまたは≦−７０℃で保存した。
２. ＥＬＩＳＡ
９６ウェルマイクロプレート(Costar #2592)をラット抗ヒト抗ホスホＥＧＦＲ捕獲抗体(ＰＢＳ中８.０μg／mL、１００μL／ウェル)(R&D SYSTEMS # 842428)で一夜、室温で被覆した。各ウェルを吸引し、洗浄緩衝液(ＰＢＳ、ｐＨ７.２〜７.４中０.０５％TWEEN(登録商標)20(R&D Systems # WA126))で計５回洗浄した。プレートを、１〜２時間、室温で３００μLの遮断緩衝液(ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０.０５％ＮａＮ３、ｐＨ７.２〜７.４)で遮断した。ウェルを吸引し、洗浄緩衝液で計５回洗浄した。細胞ライセート(セツキシマブ、Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体、ＥＧＦのみまたはＲｘ無し)を、ＩＣ希釈剤(１％NP-40 Alternative、２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、１３７mM ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２mM ＥＤＴＡ、１mM活性化オルトバナジン酸ナトリウム)で希釈し、１００μLを添加した。吸引および洗浄工程を繰り返し、ＨＲＰとコンジュゲートした１００μLのマウス抗ヒトホスホ−ＥＧＦＲ(Ｙ１０６８)抗体(２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、１３７mM ＮａＣｌ、０.０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０、０.１％ＢＳＡ)を添加した。プレートを密閉し、２時間、室温でインキュベートした。吸引および洗浄工程を繰り返した。基質(Ｈ２Ｏ２とテトラメチルベンジジンの１：１混合物(R&D Systems, Catalog # DY999))(１００μL)を各ウェルに添加し、プレートを２０分、室温でインキュベートした。停止溶液(２Ｎ Ｈ２ＳＯ４(R&D Systems, Catalog # DY994)(５０μL)を添加し、ウェルの光学密度(ＯＤ)を、４５０nmに設定し、５４０nmまたは５７０nmでの波長補正を伴うマイクロプレートリーダーで直ぐに測定した。
３. 結果
ａ) Ａ４３１細胞
結果は、ＥＧＦＲのＥＧＦ抗原誘発リン酸化を示した(図３Ａ参照)。ｐＨ６.５および７.４で抗体で前処理したＡ４３１細胞からのサンプルで、結果は、リン酸化ＥＧＦＲ(ＥＧＦＲ−Ｐ)のレベルが、ＥＧＦで刺激していないコントロール細胞と同等であるように、抗ＥＧＦＲセツキシマブ抗体の存在がＥＧＦＲのＥＧＦ誘発リン酸化を阻害したことを示した。細胞と変異体ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体のプレインキュベーションもＥＧＦ誘発リン酸化を阻害従、参照セツキシマブより低い程度であった。変異体ＨＣ−Ｙ１０４ＤのＥＧＦＲのＥＧＦ誘発リン酸化を阻害する能力は、ｐＨ６.５で大きかった。
抗体の阻害効果は用量依存性であった(図３Ｂ)。リン酸化ＥＧＦＲの濃度を抗体の濃度(セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体)に対してプロットした。参照セツキシマブ抗体(ＷＴ)について、阻害効果は、１μg／mLより高い抗体濃度で始まり、１０μg／mLより高い濃度でプラトーに達すると観察された。参照セツキシマブ抗体の阻害効果は、ｐＨ６.５および７.４で同等であった。ＨＣ−Ｙ１０４Ｄとプレインキュベートした細胞について、ＥＧＦ誘発リン酸化の阻害はまた１μg／mLの濃度で始まることが観察されたが、阻害は参照ＷＴ抗体より低かった。３０μg／mLで阻害はまたプラトーではなかった。しかしながら、結果は、ｐＨ６.５でのＨＣ−Ｙ１０４Ｄのプレインキュベーションが、ｐＨ７.４より大きな阻害効果をもたらすことを示した。
ｂ) 新生児ケラチン生成細胞
同様の結果が、新生児ケラチン生成細胞からのサンプルで観察された(図３Ｃ参照)。ｐＨ６.５およびｐＨ７.４で、参照セツキシマブ抗体は、ＥＧＦ誘発リン酸化の同等な阻害をもたらした。ｐＨ７.４で、細胞とＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗体のプレインキュベーションは、ＥＧＦ誘発リン酸化を阻害しなかった。しかしながら、ｐＨ６.５で、ＥＧＦＲのＥＧＦ誘発リン酸化は、抗体無しのサンプルと比較して約１／４に減少し、変異体抗体がｐＨ７.４と比較して、ｐＨ６.５で大きな活性を示すことを証明した。
実施例７
セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体存在下のヒトおよび新生児ケラチン生成細胞の増殖
ヒト新生児ケラチン生成細胞(Invitrogen C-001-5C)および成人ケラチン生成細胞(Invitrogen C-005-5C)の増殖を、セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体とインキュベーション後に測定した。セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体を、通常の増殖培地(１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ(ｐＨ７.４))に１０μg／mL、３.３３μg／mL、１.１１μg／mL、０.３７μg／mL、０.１２３μg／mL、０.０４１１μg／mL、０.０１３７μg／mLおよび０.００４５７μg／mLの濃度まで添加した。
ヒト新生児ケラチン生成細胞および成人ケラチン生成細胞(１０００細胞／ウェル)を、９６ウェルプレート(BD Falcon 35-3072)に、セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体を含む通常の増殖培地の存在下で添加した。各条件を、条件あたりｎ＝５ウェルでアッセイした。細胞を５日間、３７℃で加湿雰囲気の５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。細胞増殖を、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega Cat# G-7571)で測定し、抗体無しで生存したコントロール細胞と比較した生存細胞のパーセントとして表した。
結果を表２１および図４に示す。成人ケラチン生成細胞(図４Ａ)および新生児ケラチン生成細胞(図４Ｂ)において、セツキシマブは細胞増殖を用量依存的方法で阻害し、生存細胞パーセントは抗体濃度が増えるに連れて減少した。最高濃度のセツキシマブ(１０μg／mL)で、２３％生存細胞が成人ケラチン生成細胞および新生児ケラチン生成細胞で観察された。成人ケラチン生成細胞および新生児ケラチン生成細胞において、細胞増殖は、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体濃度が増えるに連れて減少しなかった。成人ケラチン生成細胞および新生児ケラチン生成細胞において、０.０４１１μg／mL、０.０１３７μg／mLおよび０.００４５７μg／mLの抗体濃度で、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄでのアッセイにおける生存細胞パーセントはセツキシマブでの生存細胞パーセントと同等であった。１０μg／mL、３.３３μg／mL、１.１１μg／mL、０.３７μg／mLおよび０.１２３μg／mLの抗体濃度で、成人ケラチン生成細胞および新生児ケラチン生成細胞において、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体での生存細胞パーセントは、セツキシマブでの生存細胞パーセントより有意に高かった。これは、参照抗ＥＧＦＲセツキシマブ抗体が新生児ケラチン生成細胞の増殖を阻害するが、抗ＥＧＦＲ抗体変異体ＨＣ−Ｙ１０４Ｄはしないことを証明する。
実施例８
異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対するセツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の効果
ＦａＤｕ下咽頭癌細胞であるＡ４３１類表皮癌細胞ならびにＡ４３１細胞由来の操作された細胞株Ａ４３１ＬＤＨＡおよびＡ４３１ＣＡ９を使用して、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性の評価に使用した異種移植腫瘍モデルを作製した。
１. 皮下Ａ４３１腫瘍
Ａ４３１類表皮癌異種移植モデルを使用して、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性を評価および比較した。
ａ. セツキシマブ用量応答
雄、無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウスに、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁した３.３×１０６ Ａ４３１類表皮癌細胞(ATCC CRL1555)を０.１mL皮下(ＳＣ)注射により右側腹部に接種した。腫瘍サイズが〜１００mm３に達したとき、動物を６実験群(ｎ＝５／群；計３０匹の動物)に無作為化し、これらは媒体(セツキシマブ緩衝液)、１.２mg／kg、４mg／kg、１２mg／kg、４０mg／kgまたは８０mg／kg体重セツキシマブを腹腔内(ＩＰ)投与により実験の０日目、５日目、７日目、１１日目および１４日目に週に２回投与された。腫瘍体積(mm３)で測定した腫瘍増殖を、週に２回、デジタル式ノギスを使用して決定し、腫瘍体積を式(１／２＊Ｌ＊Ｗ２)(ここで、Ｌ(長さ)は腫瘍の最長直径であり、Ｗ(幅)は、“長さ”の測定に垂直な最長直径である)に従い計算した。具体的に、腫瘍体積を０日目、５日目、７日目、１１日目および１４日目に測定した。
腫瘍体積は、媒体のみのコントロール動物で実験中経時的に直線状に増加した。セツキシマブを投与されたマウスの腫瘍の腫瘍体積は、媒体のみのコントロールより５日目および７日目で増殖が遅かった。７日目の後、セツキシマブ処置腫瘍の腫瘍増殖は、実験の残りは７日目に測定したサイズ測定で停止した。観察された腫瘍増殖の減少は用量依存性であり、５０％減少から８０mg／kg体重でセツキシマブを投与したマウスにおける腫瘍増殖ほとんど無しまでの範囲であった。
ｂ. セツキシマブ対ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ
Ａ４３１異種移植モデルを上記のとおり製造した。腫瘍サイズが〜１００mm３に達したとき、動物を５実験群(ｎ＝４／群)に無作為化した：(１)群１−媒体(セツキシマブ緩衝液)、(２)群２−０.１mg／マウス(４mg／kg体重)セツキシマブ、(３)群３−１.０mg／マウス(４０mg／kg体重)セツキシマブ、(４)群４−０.１mg／マウス(４mg／kg体重)ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体または(５)群５−１.０mg／マウス(４０mg／kg体重)ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体。マウスに、た０.１mgまたは１.０mgのセツキシマブ参照またはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体変異体または媒体コントロールを０日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目の週に２回腹腔内(ＩＰ)投与した。腫瘍増殖を上記のとおり０日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目および１８日目に測定従、媒体処置動物で最後の腫瘍測定は、動物を殺したために１４日目であった。セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体処置群の腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)を、式：％ＴＧＩ＝[１−(ＴＢ−ＴＡ)／(ＣＢ−ＣＡ)]×１００(式中、ＴＢは処置開始後１４日目の処置群の平均腫瘍体積(mm３)であり、ＴＡは処置開始前０日目の処置群の平均腫瘍体積(mm３)であり、ＣＢは、コントロール群の処置開始１４日目の平均腫瘍体積であり、ＣＡは処置前のコントロール群の平均腫瘍体積である)を使用して、計算した(例えば、Teicher BA and Andrews PA: Anticancer Drug Development, Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials and Approval, 2nd edition. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 134, 2004 and T. Friess et al., (2006) Anticancer Research 26:3505-3512参照)。
結果は、抗体非存在下で、腫瘍体積は媒体のみの存在下で経時的に徐々に増殖した(図５)。腫瘍体積ｗは、両試験濃度で、媒体のみのコントロールと比較して、参照セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ変異体抗体で処置した動物において同等に減少しており、１.０mgの抗体で処置した動物で腫瘍増殖が最小であった。１４日目、０.１mg ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体および０.１mgセツキシマブで処置した動物は、それぞれ５９％および６８％腫瘍増殖が阻害された。１４日目、１.０mg ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体および１.０mgセツキシマブで処置した動物は、それぞれ８８％および９６％腫瘍増殖が阻害された。それゆえに、結果は、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ変異体のインビボでの効果は参照セツキシマブ抗体と同等であったことを示す。
２. 皮下ＦａＤｕ腫瘍
ＦａＤｕ下咽頭癌異種移植モデルを、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性の評価および比較のために使用した。
ａ. セツキシマブ用量応答
雄、無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウスに、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁した５.０×１０６ ＦａＤｕ下咽頭癌細胞(ＡＴＣＣ)を右側腹部に０.１mL皮下(ＳＣ)注射により接種した。腫瘍サイズが〜１００mm３に達したとき、動物を６実験群(ｎ＝７／群)に無作為化し、これらは、媒体(セツキシマブ緩衝液)、１.２mg／kg、４mg／kg、１２mg／kg、４０mg／kgまたは８０mg／kg体重セツキシマブを、実験の０日目、３日目、７日目、１０日目および１４日目に週に２回腹腔内(ＩＰ)投与により投与した。腫瘍増殖を、上記のとおり、−１日目、３日目、７日目、１０日目および１４日目に測定した。
媒体のみを投与された動物では、実験の経過中、徐々に増殖を示した。１.２mg／kgセツキシマブを投与した動物の腫瘍は、媒体処置コントロールより約５０％遅く増殖した。４mg／kg、１２mg／kg、４０mg／kgまたは８０mg／kgセツキシマブの投与は測定した全時点で、腫瘍増殖を完全に停止させた。これらの結果は、ＦａＤｕ異種移植モデルがＡ４３１異種移植モデルよりもセツキシマブに感受性であることを示す。
ｂ. セツキシマブ対ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ
ｅ ＦａＤｕ異種移植モデルを上記のとおり製造した。腫瘍サイズが〜１００mm３に達したとき、動物を５実験群(ｎ＝４／群)に無作為化した：(１)群１ − 媒体(セツキシマブ緩衝液)、(２)群２ − ４mg／kgセツキシマブ、(３)群３ − ４０mg／kgセツキシマブ、(４)群４ − ４mg／kgＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体または(５)群５ − ４０mg／kgＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体。抗体または媒体のみを０日目、３日目、７日目および１０日目に週に２回腹腔内(ＩＰ)投与した。腫瘍増殖を、上記のとおり、抗体投与直前に−１日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目にノギスを使用して測定した。
媒体のみを投与された動物では、実験の経過中、徐々に増殖を示した。４mg／kgまたは４０mg／kgの変異体抗ＥＧＦＲでの処置は、腫瘍増殖を経時的に徐々に減少させ、１４日目でそれぞれ４０％および７０％減少した。４mg／kgまたは４０mg／kgセツキシマブでの処置は、実験の経過中、腫瘍増殖を完全に停止させた。
実施例９
エクスビボでの抗ＥＧＦＲ抗体Ｙ１０４ＤのＡ４３１皮下腫瘍または皮膚移植片への結合
１. エクスビボでの皮下腫瘍への結合試験
ａ. 皮下腫瘍におけるＥＧＦＲ発現
免疫組織化学(ＩＨＣ)を使用して、実施例８.１に記載のとおりヌードマウスにおける異種移植片として増殖させたＡ４３１ヒト腫瘍におけるＥＧＦＲ発現レベルを評価した。Ａ４３１皮下腫瘍を回収し、１０％中性緩衝化ホルマリン(ＮＢＦ)に固定化し、パラフィンに包埋した。５μm切片をスライドにマウントし、乾燥した。染色前に、スライドを脱パラフィン処理および再水和した。ＥＧＦＲＩＨＣキット(Dako, Carpinteria, CA)を使用して、切片を免疫標識した。製造者の指示に従い３,３’−ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)で染色を可視化した。核をヘマトキシリンで対比染色した。顕微鏡写真をInsight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)と連結させたNikon Eclipse TE2000U顕微鏡で撮った。腫瘍細胞におけるＥＧＦＲの激しい細胞膜陽性は、Ａ４３１細胞由来の異種移植腫瘍が高ＥＧＦＲ発現レベルを保持することを確認した。
ｂ. 皮下腫瘍への抗ＥＧＦＲ抗体の結合
免疫蛍光(ＩＦ)を使用して、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄがと結合し、それゆえにヒトＥＧＦＲを標識する能力を評価した。アービタックスおよびＨＣ−Ｙ１０４ＤをDyLight５９４に、製造者の指示に従いDyLight 594 Antibody Labeling Kit(Thermo Scientific; Rockford, IL)を使用して、ＰＢＳ中１０、５、１、０.３、０.１μg／mLでコンジュゲートした。切断後、Ａ４３１腫瘍の切片を、１０分間、冷アセトンで固定し、１時間、５μg／mLまたは１μg／mLのDyLight５９４コンジュゲートセツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗体とインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、切片をＤＡＰＩ(４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロライド)(Molecular Probes, Eugene)で対比染色した。顕微鏡写真を、２０倍および４０倍対物でレンズで、Insight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)と連結させたNikon Eclipse TE2000U顕微鏡を、実験条件間の比較を可能にするために各画像について同一設定で使用して撮った。
セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗体のいずれも、Ａ４３１固形腫瘍の激しい免疫標識を証明した。ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗体の標識強度は、各濃度(５μg／mLおよび１μg／mL)でセツキシマブのものと比較して低かったが、５μg／mL ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗体で得られた強度は、１μg／mLセツキシマブを使用して観察されたものと同等であった。
２. 霊長類皮膚へのエクスビボ結合試験
ａ. 霊長類皮膚におけるＥＧＦＲ発現
免疫組織化学(ＩＨＣ)を使用して、ヒトおよび非ヒト霊長類皮膚サンプルにおけるＥＧＦＲ発現レベルを評価した。ヒト皮膚サンプルは、地元の外科センターから得て、カニクイザル、マーモセットおよびリスザル皮膚は、Worldwide Primates Inc.(Miami, FL)から得た。ヒト、カニクイザル、マーモセットおよびリスザルのホルムアルデヒド固定サンプルを上記のとおり切断し、ＥＧＦＲＩＨＣキット(DAKO)でＩＨＣのために処理した。核をヘマトキシリンで対比染色した。顕微鏡写真を２０倍および４０倍対物レンズで上記のとおり撮った。
予想どおり、基底ケラチン生成細胞の膜は、ＥＧＦＲについて激しい染色を示した。カニクイザルおよびリスザル皮膚組織の基底ケラチン生成細胞も染色を示し、カニクイザル皮膚染色がヒトおよびリスザル組織で観察されるよりわずかに強度が低かった。マーモセット皮膚は検出可能な染色を、４０倍対物レンズ使用時でさえ示さなかった。これらの結果は、マーモセットＥＧＦＲではなく、カニクイザルおよびリスザルＥＧＦＲが、抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体により認識されるためにヒトＥＧＦＲと十分に類似していることを示す。
ｂ. 凍結皮膚サンプルへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合
免疫蛍光(ＩＦ)を使用して、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄが皮膚サンプルにおけるヒトＥＧＦＲと結合し、それゆえに標識する能力を評価した。ヒト、カニクイザル、マーモセットおよびリスザル(ヒト皮膚は地元の外科センターから得て、カニクイザル、マーモセットおよびリスザル皮膚はWorldwide Primate, Floridaから得た)の凍結切片を、上記のとおり、中性ｐＨで、Alexafluor 594(Thermo Scientific DyLight 594 Antibody Labeling Kit; Rockford, IL)とコンジュゲートした１.０μg／mLセツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｄを使用して、直接的免疫標識した。核をＤＡＰＩで対比染色した。顕微鏡写真を、上記のとおり、２０倍および４０倍対物レンズを使用して撮った。
セツキシマブは、ヒト組織におけるプレケラチノサイトおよび基底細胞での激しい、そして、程度は低いがカニクイザル皮膚サンプルでの免疫標識を証明した。ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗体は、セツキシマブ標識切片と比較して、ヒト皮膚およびカニクイザル皮膚の真皮におけるプレケラチノサイトおよび基底細胞ではるかに低い免疫標識強度を証明した。セツキシマブも、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄも、リスザル皮膚またはマーモセット皮膚で検出可能な標識を示さなかった。
実施例１０
インビボでの腫瘍対皮膚での蛍光性標識抗ＥＧＦＲ抗体Ｙ１０４Ｄの選択的結合
セツキシマブ、Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体およびコントロールヒトＩｇＧを、室温で６０分、近ＩＲ蛍光であるDyLight755 Sulfydryl-Reactive Dye(DL755)(Thermo Scientific, Rockford, IL)で標識した。ＤＬ７５５標識ＩｇＧ、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄの異種移植腫瘍またはヒトまたはサル皮膚移植への結合を、励起波長７４５nmおよび発光波長８００nmを用いるＩＶＩＳノギス蛍光造影システムを使用して評価した。画像を抗体投与前および抗体投与後１分、２分、１０分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分、１日および毎日撮った。ヒト皮膚移植モデルにおいて、画像を抗体投与後１０日目にも撮った。
１. 皮下Ａ４３１腫瘍へのセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ結合
Ａ４３１異種移植腫瘍を、上の実施例８に記載のとおり、ヌードマウスの右側腹部にＡ４３１細胞を注射することにより産生した。移植２１日後、マウスに、１０μg／マウス(０.５mg／kg)ヒトＩｇＧＤＬ７５５、ＨＣ−Ｙ１０４ＤＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５(ｎ＝４／群)を投与した。ＤＬ７５５標識を、励起波長７４５nmおよび発光波長８００nmを用いるＩＶＩＳノギス蛍光造影システムを使用して、４動物／群で検出した。画像を抗体投与前および抗体投与４時間後、次いで７日間毎日撮った。
ネガティブコントロール抗体であるヒトＩｇＧＤＬ７５５の腫瘍塊への結合は、投与４時間後最小であったが、７日間の実験中、徐々に増加した(約３倍)。セツキシマブＤＬ７５５により正目３位された結合は、実験の最初の４日間Ｙ１０４ＤＤＬ７５５より大きく、４日目にベースラインシグナル(投与４時間後のＩｇＧＤＬ７５５シグナル)より約１３倍高いピーク強度に達した。４日目以降、セツキシマブシグナルはわずかにベースラインシグナルの約１１〜１１.５倍に減少した。腫瘍結合Ｙ１０４ＤＤＬ７５５のシグナルは、実験中一定して上がり続け、６日目および７日目にベースラインより約１１〜１１.５倍高かった。両抗ＥＧＦＲ抗体(セツキシマブＤＬ７５５およびＹ１０４ＤＤＬ７５５)からのシグナルは、腫瘍の表面全体を覆い、全時点で腫瘍結合ＩｇＧＤＬ７５５で検出されるシグナルよりはるかに大きかった。
Ｆｃ検出によるヒトＩｇＧＤＬ７５５、ＨＣ−Ｙ１０４ＤＤＬ７５５およびセツキシマブＤＬ７５５注射マウスの免疫組織化学的染色を使用して、抗体結合の局在化をさらに詳細に評価した。上記のとおり、ヌードマウスにＡ４３１細胞を右側腹部に注射して、Ａ４３１腫瘍を産生した。Ａ４３１細胞移植２１日後、マウスに、ＩｇＧＤＬ７５５、Ｙ１０４ＤＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５を１mg／マウス(ｎ＝２／群)で一回ｉ.ｖ.投与した。抗体投与４８時間後、上記のとおり腫瘍をＩＶＩＳノギス蛍光造影システムを使用して可視化した。腫瘍造影後、マウスを灌流し、腫瘍を回収し、腫瘍の凍結切片を、上記のとおり標準法を使用して、注射抗体のＦｃ領域の検出のためにＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体とインキュベートした。ＤＡＢを、可視化を確実にするためにＨＲＰ基質として使用した。染色組織を、２０倍対物レンズを供えたInsight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)と連結させたNikon Eclipse TE2000U顕微鏡を使用して試験した。
ＩｇＧＤＬ７５５を注射した動物からの腫瘍は汎発性、非特異的ＩｇＧ染色を示した。対照的に、Ｙ１０４ＤＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５を注射した腫瘍は、明瞭な、膜特異的結合を示した。これらの結果は、Ａ４３１腫瘍における細胞膜の表面上のＥＧＦＲ標的と結合するＹ１０４ＤＤＬ７５５およびセツキシマブＤＬ７５５抗体で一貫した。
２. 皮下ＰＣ−３腫瘍に対するセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ結合
ＰＣ−３細胞由来の異種移植腫瘍を、１００μl無血清Opti-MEM(登録商標)中、２×１０６ ＰＣ−３細胞(Caliper Life Sciences)を、雄ヌードマウスの右前脛骨筋に注射することにより産生した。移植３５日後、ＰＣ−３腫瘍担持マウスに、１０μg／マウス(０.５mg／kg)ヒトＩｇＧＤＬ７５５、ＨＣ−Ｙ１０４ＤＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５(ｎ＝２／群)を投与し、ＤＬ７５５標識を、上記のとおりＩＶＩＳノギス蛍光造影システムを使用して検出した。画像を抗体投与前、続いて５日間毎日撮った。平行免疫組織化学的研究もＰＣ−３異種移植腫瘍で、上記のとおり、Ｆｃ検出によりヒトＩｇＧ(コントロール)、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄまたはセツキシマブの１mg／マウスｉ.ｖ.投与４８時間後に行った。
ヒトＩｇＧＤＬ７５５を投与したマウスは、腫瘍部位に局在するある低ＤＬ７５５シグナルを示した。ＨＣ−Ｙ１０４ＤＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５を投与したマウスは、ヒトＩｇＧＤＬ７５５を投与した動物で観察されるよりも腫瘍局所的ＤＬ７５５シグナルを示従、シグナルは、実施例９.２.ａで観察された対応するシグナルと比較して減少していた。Ｆｃ検出免疫組織化学的研究は、全３抗体について非特異的染色を確認した。膜特異的染色は観察されず、ヒトＩｇＧ、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄおよびセツキシマブは、腫瘍表面への特異的結合よりも、一般にＥＧＦＲ貧ＰＣ３腫瘍内に蓄積され得ることを示す。
皮膚毒性を評価するためのモデルとして、蛍光標識セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の、マウスに移植したヒトおよびサル皮膚移植片への結合をインビボで評価した。セツキシマブ、Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体およびコントロールヒトＩｇＧを室温で６０分、近ＩＲ蛍光であるDyLight755 Sulfydryl-Reactive Dye(DL755)(Thermo Scientific, Rockford, IL)で標識した。
３. ヒト皮膚移植片へのセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の結合
ヒ分層植皮移植(ＳＴＳＧ)(ヒト皮膚は地元の外科センターから得た)およびヒト包皮移植(ＮＤＲＩ(1628 JFK Blvd, 8 Penn Center, Philadelphia, PA)から購入)を、Ｎｃｒ ｎｕ／ｎｕマウスの左背側部に外科的に移植した。ＥＧＦＲ発現を、ヒト皮膚移植片中、移植後それぞれ７０日目および３２日目に、抗ＥＧＦＲＩＨＣキット(Dako)により確認した。移植３２日および３６日後、標識抗体を、ヒト皮膚移植片を有するマウスに、３００μg／マウスの投与量でｉ.ｖ.投与した。
ヒトＴＳＧマウスモデルにおいて、循環全身シグナルが投与１時間後に全マウスで観察され、循環標識抗体と一致した。この循環シグナルは約７日間または８日間持続した。ＤＬ７５５標識セツキシマブを投与したマウスにおいて、投与１日後、全身シグナルより大きな強度のシグナルが、皮膚移植部位で検出された。このシグナルは、投与後１〜１０日の各日に撮った画像で可視であった。ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはコントロールヒトＩｇＧ抗体を投与したマウスにおいて、試験した全時点で、全身シグナルを超える極めて小さいシグナルが皮膚移植位置で観察された。測定した各時点で、腫瘍移植部位のシグナルは、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ修飾抗ＥＧＦＲ抗体を投与したマウスより、セツキシマブ抗体を投与したマウスが有意に大きかった。
これらの結果は、移植２１日に、ヒト包皮移植を受けたマウスを、同一方法(ｎ＝３／群)を使用して、１０μg／マウス(０.５mg／kg)ヒトＩｇＧＤＬ７５５、Ｙ１０４ＤＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５の静脈内投与前および４時間後、そしてその後計６日間毎日の抗体結合を分析するフォローアップ試験で確認した。投与１日後、全身シグナルより大きな強度のシグナルが、Ｙ１０４ＤＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５を投与したマウスにおける皮膚移植部位で観察された。皮膚移植結合は、３日目まで上昇し、同一レベルで試験の残りの３日間維持される、セツキシマブＤＬ７５５投与マウスのグナル強度により証明された。Ｙ１０４ＤＤＬ７５５を投与したマウスにおける皮膚移植結合は、実験の残りの日数、ほぼ１日目で観察されたレベルに維持された。ヒトＩｇＧＤＬ７５５の皮膚移植への最小結合が実験の経過中に観察された。これらの結果は、セツキシマブＤＬ７５５が、Ｙ１０４ＤＤＬ７５５よりも、ヒト皮膚におけるエピトープに大きな結合を示すことを示す。ＩｇＧＤＬ７５５、Ｙ１０４ＤＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５のヒト包皮移植への結合の結果を、免疫組織化学で確認した。移植２８日後、ヒト包皮移植を受けたマウスに、ＩｇＧ、Ｙ１０４Ｄまたはセツキシマブを１mg／マウスで１回ｉ.ｖ.投与した。抗体投与４８時間後、マウスを灌流し、凍結切片を、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体とインキュベートした。ＤＡＢをＨＲＰ基質として使用した。染色組織を、４０倍対物レンズを供えるInsight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)と連結させたNikon Eclipse TE2000U顕微鏡を使用して試験した。インビボ試験と一致して、セツキシマブを投与したマウスからの組織は、ヒト皮膚移植への最大結合を示し、Ｙ１０４Ｄを投与したマウスからの組織は、セツキシマブ処置切片と比較して、はるかに低い染色を示し、ヒトＩｇＧを投与したマウスの組織で染色は検出不可能であった。
４. サル皮膚移植片へのセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の結合
サルＳＴＳＧ(BioToxから得たカニクイザル皮膚)を、７匹のＮｃｒ ｎｕ／ｎｕマウスの左背側部に外科的に移植した。ＥＧＦＲ発現を、移植７０日および３２日後にそれぞれサル皮膚移植片で、抗ＥＧＦＲＩＨＣキット(Dako)により確認した。移植３２日および３６日後、標識抗体を、３０μg／マウスの投与量でサル皮膚移植モデルを有するマウスにｉ.ｖ.投与した。
サルＳＴＳＧ皮膚移植片を含むマウスにおいて、循環全身シグナルが、投与１時間後に全マウスで観察され、循環標識抗体と一致した。この循環シグナルは約５〜７日間持続した。ＤＬ７５５標識セツキシマブを投与したマウスにおいて、全身シグナルを超えるシグナルが、投与１〜９日後の各日に皮膚移植で観察された。ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ修飾抗ＥＧＦＲ抗体を投与したマウスにおいて、全身シグナルを超えるシグナルが、投与１〜９日後の各日に皮膚移植で観察されたが、全ての日でセツキシマブを投与したマウスで観察されるよりも有意に低い強度が測定された。コントロールヒトＩｇＧ抗体を投与したマウスにおいて、投与１〜９日後の各日に、皮膚移植部位でかすかなシグナルのみが観察された。
５. Ａ４３１腫瘍対皮膚結合
定量化した蛍光シグナル強度を使用して、実施例１０.１で決定した腫瘍結合のＤＬ７５５シグナル強度を、実施例１０.２で決定した同一抗体からのヒト皮膚移植結合の対応するＤＬ７５５シグナル強度で割ることにより、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗体について抗体腫瘍：皮膚結合の比を決定した(ｎ＝２／群)。次いで、比をコントロールＩｇＧ投与動物について結合した腫瘍：皮膚結合比に対して規準化した。
結果を図６に示す。セツキシマブ腫瘍結合は、全時点で皮膚結合とほぼ同等であり、各時点で約１の腫瘍：皮膚結合比を生じた。対照的に、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ腫瘍結合は、Ｙ１０４Ｄ皮膚結合よりもはるかに大きかった。腫瘍：皮膚結合比は、各時点で約４〜５.５であった。これらの結果は、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄが、皮膚移植片と比較して、優先的におよび選択的に腫瘍細胞と結合することを証明する。
実施例１１
皮膚移植モデルにおける皮膚毒性に対するセツキシマブの効果
患者の眼瞼裂からのドナー皮膚を採取し、分層皮膚移植を、４匹のＮｃｒ ｎｕ／ｎｕマウスに移植した。皮膚移植１５日目から出発して、マウスの２匹に、各々２mgセツキシマブ(１００mg／kg、ＨＥＤ ６０mg／kg)を週に２回、４週間静脈内投与した。セツキシマブ投与後３５日目、最終セツキシマブ投与７日後に、皮膚移植片の状態を視覚的評価した。ヒトドナー皮膚移植および宿主マウス皮膚の両者を含むドナー皮膚および移植皮膚の
サンプを回収し、抗ＥＧＦＲ ＩＨＣキット(Dako)を使用して、免疫組織化学により分析した。
セツキシマブ処置開始後３５日目に、セツキシマブを受けていなかったマウスの皮膚移植片は皮膚に統合された。対照的に、セツキシマブを受けたマウスの皮膚移植片は、処置開始後３５日目に、元の皮膚移植サイズの半分未満に収縮し、皮膚移植と宿主皮膚の間の界面は赤く、炎症を起こしており、セツキシマブがヒト組織に対する応答を刺激することを示した。
ドナー皮膚のＩＨＣ分析は強いＨｕＥＧＦＲ染色を確認した。ヒト移植片およびマウス皮膚のいずれも含む領域の移植部位のＩＨＣ分析は、ヒト移植片プレケラチノサイトおよび基底細胞における強いＨｕＥＧＦＲ染色を示し、隣接マウス皮膚のマウスプレケラチノサイトまたは基底細胞で染色は示されないことを確認した。
実施例１２
抗ＥＧＦＲ抗体および化学療法組み合わせ処置
化学療法剤であるシスプラチンと組み合わせたセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の効果を、Ａ４３１異種移植腫瘍増殖の阻害について評価した。
１. セツキシマブおよびシスプラチン
皮下Ａ４３１異種移植腫瘍を、上の実施例８に記載のとおり雄ヌードマウスで確立した。腫瘍サイズが約１００〜２００mm３のとき、動物を表２２に示す９実験群(ｎ＝５／群)に無作為化し、セツキシマブを腹腔内投与により週に２回および／またはシスプラチンを静脈内投与により週に２回投与した。具体的に、試験品を、０日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目に投与した。
＊＝ｐ＜０.０５対媒体のみ
腫瘍体積(mm３)で測定した腫瘍増殖を、−１日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目に、実施例８に記載するとおりデジタルノギスで測定し、計算した。処置群の腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)を、式：％ＴＧＩ＝[１−(ＴＢ−ＴＡ)／(ＣＢ−ＣＡ)]×１００(ここで、ＴＢは処置群の１４日目の平均腫瘍体積(mm３)であり、ＴＡは処置群の１回目の処置前(−１日目)の平均腫瘍体積(mm３)であり、ＣＢは媒体のみのコントロール群の１４日目の平均腫瘍体積であり、ＣＡは媒体のみのコントロール群の１回目の処置前(−１日目)の平均腫瘍体積である)を使用して、計算した(例えば、Teicher BA and Andrews PA: Anticancer Drug Development, Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials and Approval, 2nd edition. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 134, 2004 and T. Friess et al., (2006) Anticancer Research 26:3505-3512参照)。結果を上記表２２に示す。
１.５mg／kgシスプラチンは、それ自体腫瘍増殖を有意に阻害しなかったが、セツキシマブと組み合わせたとき、４mg／kg(セツキシマブ単独の４１.８％ＴＧＩ対組み合わせの５３.２％ＴＧＩ)および１２mg／kg(セツキシマブ単独の６５.９％ＴＧＩ対組み合わせの７４.１％ＴＧＩ)でさらなる腫瘍増殖阻害に寄与した。５mg／kgシスプラチン単独での処置は３４.２％ＴＧＩをもたらし、セツキシマブと組み合わせたとき、４mg／kg(セツキシマブ単独の４１.８％ＴＧＩ対組み合わせの５０.２％ＴＧＩ)および１２mg／kg(セツキシマブ単独の６５.９％ＴＧＩ対組み合わせの８５.２％ＴＧＩ)でＴＧＩにさらに寄与した。最大腫瘍増殖阻害は、１２mg／kgセツキシマブ＋５mg／kgシスプラチンで観察された。
２. セツキシマブ対ＨＣ−Ｙ１０４Ｄおよびシスプラチン
皮下Ａ４３１異種移植腫瘍を、上記のとおり雄ヌードマウスに確立した。腫瘍サイズが約１００mm３のとき、動物を、表２３に示すとおり８実験群(ｎ＝５／群)に無作為化し、週に２回、セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４ＤをIP投与および／またはシスプラチンをIV投与された。具体的に、試験品を、０日目、４日目、７日目および１１日目に投与した。先に記載のとおり、腫瘍体積(mm３)を−１日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目に決定した。
媒体処置動物の平均腫瘍体積は、１４日目に約２２００mm３に達するまで実験の経過中、徐々に増えた。５mg／kgシスプラチン投与は、腫瘍増殖を、１４日目までに約４５％に減少させた。１２mg／kgセツキシマブを受けたマウスの腫瘍は、腫瘍増殖の約８０％減少を示した。この実験で、１２mg／kgセツキシマブと５mg／kgシスプラチンの組み合わせ処置の相加的効果は観察されなかった。１２mg／kg ＨＣ−Ｙ１０４Ｄを受けたマウスの腫瘍は、媒体コントロール群としてサイズが約５５％まで減少した。５mg／kgシスプラチンの付加的処置は、１２mg／kg ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ単独で観察された以上に腫瘍増殖を減少させなかった。ＨＣ−Ｙ１０４Ｄの量の４０mg／kgへの増加は、１２mg／kgセツキシマブで観察されたものに類似する腫瘍増殖阻害を生じた。４０mg／kg ＨＣ−Ｙ１０４Ｄを５mg／kgシスプラチンと組み合わせて投与したとき、付加的腫瘍阻害は観察されなかった。
実施例１３
腫瘍細胞およびケラチン生成細胞増殖阻害に対する抗ＥＧＦＲ抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)の効果
抗ＥＧＦＲ抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)を、薬物の標的細胞内での遊離を可能にするために、ビオチニル化抗体とストレプトアビジン−サポリン(Advanced Targeting Systems Bio, Cat# IT-27)の混合または開裂可能タンパク質架橋剤(Advanced Targeting Systems Bioにより提供されるサービス)のいずれかを使用して、免疫毒素サポリンをセツキシマブ、ＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ抗ＥＧＦＲ抗体に融合させることにより産生した。
ビオチン−ストレプトアビジンベースのＡＤＣ形成のために、０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.２中１〜２mg／ml濃度の抗体を酸化し、５mg／mlの最終濃度で過ヨウ素酸ナトリウム(ＮａＩＯ４)を４℃で３０分使用することにより抗体糖鎖の隣接ヒドロキシル基をアルデヒド基に変換した。酸化抗体を０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.２に対して透析した。次いで、透析した抗体を、体積比９対１でＤＭＳＯ中に調製した５０mMヒドラジド−ビオチンと混合し、反応物中５mMヒドラジド−ビオチンとし、室温で２時間インキュベートして、抗体のアルデヒド基とヒドラジド基の間にヒドラゾン結合を形成させた。ビオチニル化抗体を１×ＰＢＳに対して透析し、当モル比のストレプトアビジン−サポリンと混合して、抗体−サポリン複合体を形成させた。次いで、ＡＤＣを、ヒト腫瘍細胞株であるＡ４３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびヒトケラチン生成細胞株であるＨＥＫ−Ｎの細胞増殖を阻害する能力について試験した。
１. Ａ４３１細胞増殖のサポリンＡＤＣ阻害
Ａ４３１細胞を、１０％胎児ウシ血清(ＦＢＳ；Mediatech)添加ＲＰＭＩ １６４０倍血で培養した。ＡＤＣ処置前日、Ａ４３１細胞を、２００μL体積中、１,０００細胞／ウェルで透明底白色９６ウェルプレートに播種した。細胞は未処置のままであるかサポリンコンジュゲートセツキシマブ(Ｗｔ−Ｓａｐ)、サポリンコンジュゲートＹ１０４Ｄ(Ｙ１０４Ｄ−Ｓａｐ)、サポリンコンジュゲートＹ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(ＹＤＱＰ−Ｓａｐ)またはサポリンコンジュゲートヒトＩｇＧで、１μg／mLから出発して濃度を上げながら処置した。細胞を５日間ＡＤＣ処置に付した。生存細胞を、５日目に、製造者の指示に従いCell Titer-glo Luminescent kit(Promega)で測定した。生存細胞のパーセンテージを、未処置細胞に対して計算し、ＥＣ５０値をGraphPad Prismを使用して計算した。結果を下の表２４に示す。結果は、Ａ４３１癌細胞に対して、ＷＴ−Ｓａｐは、Ｙ１０４Ｄ−ＳａｐおよびＴＤＱＰ−Ｓａｐと同等の細胞増殖阻害(ＣＧＩ)活性を示したことを示す。
２. 新生児ケラチン生成細胞(ＨＥＫ−Ｎ)細胞のサポリンＡＤＣ阻害
新生児ケラチン生成細胞(ＨＥＫ−Ｎ)細胞を、増殖因子添加Epilife培地(Gibco)で培養した。サポリンＡＤＣ処置前日、ＨＥＫ−Ｎ細胞を、２００μL体積中、１,０００細胞／ウェルで透明底白色９６ウェルプレートに播種した。細胞は未処置のままであるかサポリンコンジュゲートセツキシマブ(Ｗｔ−Ｓａｐ)、サポリンコンジュゲートＹ１０４Ｄ(Ｙ１０４Ｄ−Ｓａｐ)、サポリンコンジュゲートＹ１０４ＤＱ１１１Ｐ(ＹＤＱＰ−Ｓａｐ)またはサポリンコンジュゲートヒトＩｇＧで、１μg／mLから出発して濃度を上げながら処置した。細胞を５日間ＡＤＣ処置に付した。生存細胞を、５日目に、製造者の指示に従いCell Titer-glo Luminescent kit(Promega)で測定した。生存細胞のパーセンテージを、未処置細胞に対して計算し、ＥＣ５０値をGraphPad Prismを使用して計算した。結果を下の表２４に示す。結果は、ケラチン生成細胞に対して、ＷＴ−Ｓａｐが、Ｙ１０４Ｄ−ＳａｐおよびＴＤＱＰ−Ｓａｐよりはるかに高い(ＣＧＩ)活性を示したことを示す。
実施例１４
第二コンビナトリアルライブラリーの産生およびスクリーニング
組み合わせ抗ＥＧＦＲ抗体変異体の第二世代ライブラリーを製造し、さらに変異体抗ＥＧＦＲ抗体候補を得た。候補を、低ｐＨ条件下、選択的結合について試験した。
１. 第二ライブラリー構築
第二コンビナトリアルライブラリーを、実施例２に記載した方法を使用するＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐの部位特異的変異誘発により、完全長抗ＥＧＦＲ抗体変異体ＨＣ−Ｓ０５３Ｇ／Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｓ０５３Ｇ／Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐから製造した。次いで、新たに産生した変異体および先に産生したＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐを親クローンとして使用し、それに対し、変異Ｓ０２５Ｖ、Ｆ０２７Ｇ、Ｔ０３０ＦおよびＤ０７２Ｌを個々に付加して、表２５に概説する２０種の構築物のライブラリーを作製した。全構築物を配列検証した。
２. 第二コンビナトリアルライブラリーのスクリーニング
第二コンビナトリアルライブラリーの構築物およびセツキシマブを、上の実施例１に記載する標準的トランスフェクション方法を使用してＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、抗体の発現を、先に記載したとおり上清中の濃度の測定により決定した(実施例１)。結果を表２５に示す。結果は、ミニＣＰＳライブラリーの多くのクローンが低発現であることを示す。
次いで、実施例１に記載するとおりｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用してｐＨ６.０およびｐＨ７.４でＥＧＦＲ結合を試験するために、上清の濃度を４ng／mL、２ng／mLおよび１ng／mLに調節した。トランスフェクションおよびｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを、各構築物で各濃度で２回ずつ行った。スクリーニング結果を表２６に示す。クローン２−９および２−１０の濃度は極度に低く、非希釈および１：２および１：４希釈で測定した。
セツキシマブは、ＥＧＦＲに、ｐＨ６.０およびｐＨ７.４で同等に結合した。全変異体クローンは、クローンＨＣ−Ｙ１０４ＤおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐと比較して、ｐＨ６.０で低い結合を示従、いくつかのクローンは、ｐＨ７.４で背景レベルまで減少した結合を証明し、高いｐＨ６.０／ｐＨ７.４比をもたらした。
実施例１５
Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１ＰおよびＴ０３０Ｆ／Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体のヒト化およびスクリーニング
ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(クローン２−２；別名ＤＰ)およびＨＣ−Ｔ０３０Ｆ／Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(クローン２−１４；別名ＦＤＰ)の完全長軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列をコードする二本鎖ＤＮＡフラグメントを使用して、ヒト化クローンのライブラリーを製造し、次いでこれをｐＨ依存性ＥＧＦＲ結合およびタンパク質発現レベルについてスクリーニングした。
１. ヒト化ライブラリーのスクリーニング
ＣＨＯ−Ｓ細胞を９６ウェルプレートに播種し、ヒト化クローンで遺伝子導入した。各プレートはまたポジティブコントロール(ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１ＰまたはＨＣ−Ｔ０３０Ｆ／Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ)およびネガティブコントロール(ベクターのみ)を含んだ。上清をトランスフェクション４８時間後に回収した。ＩｇＧ濃度を実施例１に記載のとおり決定した。上清を２ng／mLに調節し、実施例１に記載のとおり、ｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用してｐＨ６.０およびｐＨ７.４でのＥＧＦＲ結合のｐＨ依存性結合を試験した。ｐＨ６.０およびｐＨ７.４での結合活性を、同一プレート上のポジティブコントロール(ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１ＰまたはＨＣ−Ｔ０３０Ｆ／Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ)の結合活性と比較した。
低発現レベルのクローンを除く一次ヒットを選択し、二次構築および確認スクリーニングに付した。スクリーニングについて、遺伝子導入上清を４ng／mL、２ng／mLおよび１ng／mLの濃度に調節し、実施例１に記載のとおり、ｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用してｐＨ６.０およびｐＨ７.４でのＥＧＦＲ結合のｐＨ依存性結合を試験した。結果を表２７に示す。同定されたヒットの配列を決定した。初期スクリーニングにおいて、いくつかのヒットは２個の配列の混合物を含むと同定され、それゆえに、“／”(例えばＦＤＰ−ｈ９／ＦＤＰ−ｈ１３)を用いて命名した。混合物内の個々の配列を、その後の確認スクリーニングのために単離した。全てのヒットは親変異Ｙ１０４ＤおよびＱ１１１Ｐおよび／またはＴ３０Ｆを含んだ。配列分析は、１１個の独特の重鎖および１６個の独特の軽鎖の存在を示し、ヒットの各々は、ヒト化軽鎖および重鎖の独特の組み合わせを有した。完全長抗体の可変重鎖および軽鎖の配列番号を表に示す。
同定されたヒットのスクリーニングを、３０ng／mL、１０ng／mL、３.３ng／mL、１.１ng／mLの濃度に調節した遺伝子導入上清を使用して繰り返し、これを、ｐＨ６.５条件を追加した以外、実質的に記載のとおりの方法で、実施例１に記載するｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用して、ｐＨ６.０、ｐＨ６.５およびｐＨ７.４でのＥＧＦＲのｐＨ依存性結合を試験した。選択した変異体の結果を表２８および２９に示す。完全長抗体の可変重鎖および軽鎖の配列番号を表２８に示す。
要約すると、結果は、ほとんどの選択したヒットが親ポジティブコントロール(ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１ＰまたはＨＣ−Ｔ０３０Ｆ／Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ)と比較して、類似のまたは良好なｐＨ６.０の結合活性対ｐＨ７.４の結合活性比を示したことを示す。いくつかの例では、結合活性は、一般に親ポジティブコントロールと比較してｐＨ６.０で減少していたが、選択したヒットのｐＨ６.０での結合活性は親ポジティブコントロールと実質的に同一または増加した。いくつかのヒットについて、ｐＨ７.４での結合活性も親ポジティブコントロールと比較して減少していた。
２. 選択ヒト化抗体のＣＨＯ−Ｓ細胞における発現
上記ヒト化抗体ヒットの発現を、発現レベルについてもスクリーニングした。ＣＨＯ−Ｓ細胞を、実施例１に記載の方法を使用して９６ウェルプレートに播種し、上記表２８および２９に示した選択ヒト化クローンで遺伝子導入した。ＩｇＧ濃度を実施例１に記載のとおり決定した。結果を表３０に示す。結果は、ヒト化クローンの収率が親クローンと比較して実質的に増加することを示す。
修飾が当業者に明らかであるため、本発明は添付する特許請求の範囲によってのみ限定することが意図される。

Claims (37)

  1. 非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の可変重鎖における位置１０４に対応するアミノ酸位置でのアスパラギン酸での置換（Ｙ１０４Ｄ）を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであって：
    該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントがＥＧＦＲ抗原と結合するのに十分な可変重鎖および可変軽鎖またはその一部を含み、該可変重鎖単独または該可変重鎖および該可変軽鎖の両者は修飾されており；
    該その一部は抗原結合部位を形成するのに十分であり、かつＹ１０４Ｄアミノ酸置換を含み；
    該対応するアミノ酸位置は、該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変重鎖と配列番号３に示す可変重鎖のアラインメントにより同定し；
    該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに特異的に結合し、該非修飾抗ＥＧＦＲ抗体においてＹ１０４Ｄを含む最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個のアミノ酸置換を含み；
    該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントがＹ１０４Ｄに加えてアミノ酸置換を含むとき、該Ｙ１０４Ｄに加えてのアミノ酸置換は、
    （ａ）該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変重鎖またはその一部において、配列番号３に示すアミノ酸位置を参照して、Ｖ２４Ｅ、Ｖ２４Ｉ、Ｖ２４Ｌ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｈ、Ｓ２５Ｒ、Ｓ２５Ａ、Ｓ２５Ｄ、Ｓ２５Ｇ、Ｓ２５Ｍ、Ｓ２５Ｑ、Ｓ２５Ｖ、Ｓ２５Ｌ、Ｆ２７Ｒ、Ｌ２９Ｈ、Ｔ３０Ｆ、Ｎ３１Ｈ、Ｓ５３Ｇ、Ｆ６３Ｒ、Ｆ６３Ｃ、Ｆ６３Ｍ、Ｆ６３Ｓ、Ｄ７２Ｌ、Ｄ７２Ｗ、Ｎ７３Ｑ、Ｋ７５Ｈ、Ｋ７５Ｗ、Ｑ７７Ｅ、Ｔ１００Ｐ、Ｑ１１１ＰおよびＱ１１１Ｖから選択されるアミノ酸置換に対応する少なくとも１つのアミノ酸置換、ここで：
    該対応するアミノ酸位置は、該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変重鎖と配列番号３に示す可変重鎖のアラインメントにより同定し；
    該その一部は抗原結合部位を形成するのに十分であり、かつ該アミノ酸置換を含む；および／または
    （ｂ）該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変軽鎖またはその一部において、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、Ｌ４Ｆ、Ｌ４Ｖ、Ｔ５ＰおよびＲ２４Ｇから選択されるアミノ酸置換に対応する少なくとも１つのアミノ酸置換、ここで：
    該対応するアミノ酸位置は、該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの該可変軽鎖と配列番号４に示す可変軽鎖のアラインメントにより同定し；
    該その一部は抗原結合部位を形成するのに十分であり、かつ該アミノ酸置換を含む、
    から選択され、
    該非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は：
    ｉ)（ａ） 配列番号３に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖、または
    （ｂ） 配列番号１に示す重鎖および配列番号２に示す軽鎖
    を含むセツキシマブまたはその抗原結合フラグメント；
    ii)配列番号８に示す重鎖および配列番号９に示す軽鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメント
    iii)配列番号５に示す重鎖および配列番号２に示す軽鎖を含むＦａｂフラグメントまたはその抗原結合フラグメント；および
    iv)ｉ)、ii)またはiii)のヒト化形態；
    から選択され、
    該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍環境において条件依存活性であり、非腫瘍環境の条件下と比較して、腫瘍環境の条件下で、ヒト上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに少なくとも２.０の結合活性比を示し、
    該腫瘍環境の条件は６.０〜６.５のｐＨまたは１０mM〜２０mMの乳酸濃度の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLのタンパク質濃度を含み；
    該非腫瘍環境の条件は７.０〜７．８のｐＨまたは０.５mM〜５mMの乳酸濃度の一方または両者および１０mg／mL〜５０mg／mLのタンパク質濃度を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 該結合活性比が少なくとも３.０である、請求項１に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 該抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントが、７.４のｐＨを含む非腫瘍環境の条件下と比較して６.０〜６.５のｐＨを含む腫瘍環境の条件下で該結合活性比を示す、請求項１に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 該非腫瘍環境の条件が、７.０〜７.４のｐＨ(両端を含む)および０.５mM〜２mMの乳酸濃度を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 該腫瘍環境の条件下および該非腫瘍環境の条件下のタンパク質濃度が同じである、請求項１〜４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. ｉ）ａ) 配列番号４９５、１０６２、１１１２、１１１４〜１１１７、１１２４〜１１２６または１１２８〜１１３０に示すアミノ酸の配列を含む可変重鎖；および
    ｂ) 配列番号４または１０に示すアミノ酸の配列を含む可変軽鎖を含む、抗体；および
    ｉｉ）ｉ）の抗体の抗原結合フラグメント；
    から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. 次のものを含む抗体から選択される、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント：
    ａ) 配列番号４９５に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｂ) 配列番号１０６２に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｃ) 配列番号１１１２に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｄ) 配列番号１１１４に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｅ) 配列番号１１１５に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｆ) 配列番号１１１６に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｇ) 配列番号１１１７に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｈ) 配列番号１１２４に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｉ) 配列番号１１２５に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｊ) 配列番号１１２６に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｋ) 配列番号１１２８に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｌ) 配列番号１１２９に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；
    ｍ) 配列番号１１３０に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖；および
    ｎ) 配列番号１１１８に示す可変重鎖および配列番号４または１０に示す可変軽鎖。
  8. アミノ酸置換がＹ１０４Ｄのみである、請求項１に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメント。
  9. アミノ酸置換がＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ；またはＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐのみである、請求項１に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. 非修飾抗ＥＧＦＲ抗体が：
    配列番号１に示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号２に示すアミノ酸の配列を有する軽鎖；または
    配列番号８に示すアミノ酸の配列を有する重鎖および配列番号９に示すアミノ酸の配列を有する軽鎖を含む、
    請求項１〜９のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. 該非修飾抗ＥＧＦＲ抗体がヒト化されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  12. 該非修飾抗ＥＧＦＲ抗体が配列番号２８に示す可変重鎖および配列番号２９に示す可変軽鎖を含む、請求項１１に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  13. 該非修飾抗ＥＧＦＲ抗体が抗原結合フラグメントであり；
    該抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントから選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  14. 完全長ＩｇＧ抗体であるか、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントから選択される抗原結合フラグメントである、請求項１〜１３のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  15. 標的剤に直接的または間接的に結合した請求項１〜１４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、コンジュゲート。
  16. 該標的剤が治療部分である、請求項１５に記載のコンジュゲート。
  17. 該治療部分が細胞毒性部分、放射性同位体、化学療法剤、溶菌性ペプチドまたはサイトカインである、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  18. 該治療部分がタキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；臭化エチジウム；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テニポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒチン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；マイタンシンまたはその類似体もしくは誘導体；オーリスタチンまたはその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体；ドラスタチン１０または１５またはその類似体；イリノテカンまたはその類似体；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリチアマイシンまたはその類似体もしくは誘導体；代謝拮抗剤；アルキル化剤；白金誘導体；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラシェルマイシン(ＣＣ−１０６５)またはその類似体もしくは誘導体；抗生物質；ピロロ[２,ｌ−ｃ][１,４]−ベンゾジアゼピン類(ＰＤＢ)；毒素；リボヌクレアーゼ(ＲＮａｓｅ)；ＤＮａｓｅ Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質から選択される、請求項１７に記載のコンジュゲート。
  19. 該治療部分がアンサマイトシンまたはメルタンシン(ＤＭ１)から選択されるマイタンシノイドであるマイタンシン誘導体であるか；または
    オーリスタチンまたはモノメチルオーリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)またはＦ(ＭＭＡＦ)であるその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体であるか；または
    メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビンおよびクラドリビンから選択される代謝拮抗剤であるか；または
    メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(ＢＳＮＵ)、ロムスチン(ＣＣＮＵ)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(ＤＴＩＣ)、プロカルバジンおよびマイトマイシンＣから選択されるアルキル化剤であるか；または
    シスプラチンまたはカルボプラチンである白金誘導体であるか；または
    ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンおよびアントラマイシン(ＡＭＣ)から選択される抗生物質であるか；または
    ジフテリア毒素およびその活性フラグメントおよびハイブリッド分子、リシン毒素、コレラ毒素、志賀毒素様毒素、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ボウマン・バーク大豆プロテアーゼインヒビター、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ガラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシン毒素から選択される毒素である、
    請求項１７または請求項１８に記載のコンジュゲート。
  20. 請求項１〜１４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの重鎖をコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸分子；
    Ｌ４Ｆ、Ｌ４Ｖ、Ｔ５ＰおよびＲ２４Ｇから選択されるアミノ酸置換に対応する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む請求項１〜５および１０〜１４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの軽鎖をコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸分子；および
    請求項１〜１４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸分子、
    の１つ以上から選択される、核酸分子。
  21. 該コンジュゲートが融合タンパク質を含む、請求項１５〜１９のいずれかに記載のコンジュゲートをコードする核酸分子。
  22. 請求項２０または請求項２１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  23. 請求項２２に記載のベクターを含む、単離された細胞または細胞培養物。
  24. 修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの製造方法であって、該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖を産生する条件下、請求項２０に記載の核酸分子を含む細胞または請求項２０に記載の核酸分子を含む請求項２２に記載のベクターを含む細胞を培養することを含む、方法。
  25. 該重鎖および／または軽鎖を単離することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 該重鎖および軽鎖が単一ベクターにおいて発現され、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する、請求項２４に記載の方法。
  27. 該重鎖が第一ベクターにおいて発現され、該軽鎖が第一ベクターと異なる第二ベクターにおいて発現され、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する、請求項２４に記載の方法。
  28. 該修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することをさらに含む、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
  29. ポリペプチドに結合した修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートの製造方法であって、該コンジュゲートが産生される条件下、請求項２１に記載の核酸分子を含む細胞または請求項２１に記載の核酸分子を含む請求項２２に記載のベクターを含む細胞を培養することを含む、方法。
  30. 請求項１〜１４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項１５〜１９のいずれかに記載のコンジュゲート；および
    薬学的に許容される担体または添加物
    を含む、医薬組成物。
  31. 腫瘍、癌および／または転移を処置するための使用のための、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 腫瘍、癌または転移の処置のための医薬として製剤された、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
  33. 腫瘍、癌または転移を処置するための医薬の製造のための、請求項１〜１４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項１５〜１９のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項３０〜３２のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
  34. 請求項１〜１４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントまたは請求項１５〜１９のいずれかに記載のコンジュゲート；および
    化学療法剤または抗癌剤
    を含む、組み合わせ剤。
  35. 該化学療法剤がアルキル化剤、ニトロソウレア類、トポイソメラーゼ阻害剤および抗体から選択される、請求項３４に記載の組み合わせ剤。
  36. １個以上の容器中に請求項１〜１４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１５〜１９のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項３４または請求項３５に記載の組み合わせ剤を含む、キット。
  37. 該コンジュゲートを単離することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
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