KR101770559B1 - EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편 - Google Patents

EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편 Download PDF

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Abstract

본 발명은 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하는 Fab(Fragment antigen-binding) 단편, 상기 Fab 단편을 제조하기 위한 발현 컨스트럭트, 상기 Fab 단편의 제조방법 및 상기 Fab 단편을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편은 항체에 비하여 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아에서 제조할 수 있어 생산 비용이 적게 든다. 또한, 상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편은 페길화(PEGylation)을 통해 증가된 체내 반감기를 제공한다.

Description

EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편{Fragment Antigen Binding Specifically Binding to Epidermal Growth Factor Receptor}
본 발명은 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하는 Fab(Fragment Antigen Binding) 단편에 관한 것이다.
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor; HER1)은 세포표면에 존재하는 수용체 HER 패밀리의 하나로 EGF, TGF-alpha, 에피레귤린(Epiregulin) 등의 리간드 들과 결합하여 세포의 성장과 사멸에 있어 중요한 역할을 담당하고 있다. 암과 관련해서 특히 주목을 받게 된 것은 면역염색을 통해 조사한 결과 많은 종류의 암세포에서 EGFR 발현이 증가되어 있으며 이런 EGFR의 증가가 예후와도 밀접한 관련성이 있다는 보고들이 있다(Nicholson, R. I. et al., Eur. J. Cancer., 37:S9-15(2001); Yewale, C. et al., Biomaterials, 34:8690-707(2013)). 이에 따라 EGFR 신호를 억제하여 암을 치료하려는 시도가 있어 왔는데 EGFR 차단 항체인 세툭시맙(cetuximab) 및 저분자의 EGFR 티로신 키나제 억제제(EGFR tyrosine kinase inhibitor; EGFR-TK1)인 제피티닙(gefitinib; iressaⓡ), 에를로티닙(erlotinib; tarcevaⓡ) 등이 등장하여 임상에 사용되게 되었다.
EGFR-TK1은 같은 EGFR을 표적 하지만 세툭시맙과 달리 폐암을 그 적응증으로 하고 있는데 EGFR-TK1는 EGFR 발현이 예후와 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려진 암들에서는 효과가 별로 없고 관련성이 아주 미약한 폐암에서 효과를 나타내어 EGFR 발현량에 따른 신호 차이와는 다른 기전이 존재함을 시사하고 있으며 치료용 항체가 암세포에 세포독성 작용을 나타내기 위해서는 몇 가지 작용기전이 복합적으로 이용되는데, 대부분은 ADCC(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) 또는 CDC(Complement-Dependent Cytotoxicity)를 통한 면역 체계를 통해 효과를 나타낸다.
항체는 구조적으로 중쇄(heavy chain)의 불변 영역(Fc 부분)의 차이에 따라 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 5가지로 분류되며, 항체의 아이소타입(isotype) 중 IgG1과 IgG3는 ADCC, CDC의 기능이 강하고, IgG2는 ADCC의 기능이 없고, 약한 CDC의 기능이 있으며, IgG4는 약한 ADCC의 기능이 있으나 CDC의 기능은 없다고 알려져 있다. 항암분야에서 개발되어진 항체의 경우 ADCC 및 CDC 기능이 높다고 알려진 IgG1 아이소타입이 가장 많이 개발되어져 왔다.
그러나 다른 항암 표적과 달리 EGFR의 경우 IgG1 타입 뿐 아니라 IgG2 타입으로 항체 치료제가 개발되어 시판되고 있으며 이는 EGFR을 표적하는 하는 경우 항체로 인한 중화 활성(neutralizing activity)이 주된 작용이라는 것을 반증한다고 볼 수 있다.
EGFR은 테더 단량체(tethered monomer) 형태나 개방형 구조인 언테더 단량체(untethered monomer) 형태로 존재하다가 EGF가 결합하게 되면 이합체(dimer) 형태를 이뤄 키나제(kinase)가 활성화되어 신호를 전달하게 된다. 치료용 항체 세툭시맙의 경우 리간드 대신에 EGFR에 결합함으로써 키나제 활성과 하위 신호를 억제하게 된다. 이로 인해 세포성장을 억제하고, 세포 사멸을 유도하게 되는데 이러한 결합으로 수용체의 활성화 및 그로 인한 신호전달 통로가 억제되며, 그 결과 종양세포의 정상조직 침투 및 새로운 부위로의 종양확산이 감소하게 된다. 또한 종양세포가 화학요법 및 방사선 요법으로 인한 손상을 복구하는 능력을 억제하고, 종양 내 새로운 혈관 형성을 억제함으로써 종양증식을 전반적으로 억제하는 것으로 판단된다.
또한 EGFR을 타겟으로 하는 항체의 치료 기작이 EGFR의 신호전달을 억제함으로써 나타난다는 것의 증거로 세툭시맙 및 파니투무맙(panitumumab)의 경우 EGFR의 하위 신호 전달 물질인 KRAS의 유전자 돌연변이에 의해 영향을 받는다는 보고들이 있다(LieA. et al., Cancer Res., 66:3992-5(2006); Karapetis, C. S. et al., N. Engl. J. Med., 359:1757-65(2008)). 이러한 KRAS 돌연변이는 대장암의 40-45%에서 발견되는데 암 환자의 생체지표(바이오마커) 검사를 통해 'KRAS'라는 유전자 돌연변이 여부를 확인해서 돌연변이가 없는 경우에 사용하고 있다.
Erbitux®는 화학요법제와 같이 사용되어 두경부암(Head and Neck cancer), 직장결장암(colorectal cancer) 치료용 EGFR 키메라 항체(chimeric antibody)로서, ImClone systems사에 의해 개발되었고, ImClone systems사 및 Bristol-Myers Squibb사가 북미권에서, 그리고 Merck KGaA(독일)사가 북미 외의 지역에서 Erbituxⓡ 대한 권리를 가지고 있으며, 2004년 2월 미국 FDA(The U.S. Food and Drug Administration)에 의해 승인되었다. 이에 세툭시맙에 대한 특허는 2015년 만료되었으며, 국내에서는 이에 대한 바이오시밀러 개발이 한창 진행 중에 있으며, 해외에서는 EGFR에 대한 다양한 치료용 항체가 개발되어 승인되었거나, 현재 임상 진행 중으로 EGFR을 표적으로 하는 항암치료제 개발이 활발하게 이뤄지고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 암세포의 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 신호를 억제하는 항암용 항체를 대체할 수 있는 Fab 단편을 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 대장균에서 발현할 수 있고 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 개발하고 이의 우수한 결합 친화도 및 항암 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 Fab 단편을 제조하기 위한 발현 컨스트럭트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 EGFR에 대한 Fab 단편의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암에 대한 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하며 다음의 영역을 포함하는 Fab(Fragment antigen-binding) 단편을 제공한다:
(a) 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
(b) 서열목록 제5열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(CH1);
(c) 서열목록 제6서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
(d) 서열목록 제7열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역(CL).
본 발명자들은 암세포의 EGFR 신호를 억제하는 항암용 항체를 대체할 수 있는 Fab 단편을 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 대장균에서 발현할 수 있고 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 개발하고 이의 우수한 결합 친화도 및 항암 효과를 확인하였다.
본 발명의 상기 Fab 단편은 EGFR에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에서 용어 “Fab 단편”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 중쇄 가변 영역(VH), 중쇄 불변 영역 1(CH1), 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. 이러한 Fab 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명은 항체를 질환의 예방 또는 치료에 적용하는데 단점으로 여겨지는 생산 비용을 개선하고자, 홀항체(whole antibody)가 아닌 Fab 형태의 단편을 대장균에서 발현하여 제조한다.
본 명세서에서, 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 Fab 단편은 상기 VH 및 CH1으로 구성된 중쇄를 포함하는 Fab 단편이다.
또한 본 명세서에서 용어 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 Fab 단편은 상기 VL 및 CL으로 구성된 경쇄를 포함하는 Fab 단편이다.
본 발명의 Fab 단편은 EGFR에 특이적으로 결합할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, Fab 단편의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 Fab 단편의 아미노산 서열에 변화를 줄수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 Fab 단편의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다. 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathy index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61％의 상동성, 보다 바람직하게는 70％의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80％의 상동성, 가장 바람직하게는 90％의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명의 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편은 중쇄 및 경쇄의 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하기 위해, CH1 및 CL에 이황화 결합의 형성을 위한 아미노산 서열을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CH1은 그의 C-말단에 Cys-Asp-Lys을 추가적으로 포함한다(서열목록 제17서열).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 CL은 그의 C-말단에 Glu-Cys을 추가적으로 포함한다(서열목록 제18서열).
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 CL은 그의 C-말단에 Glu-Cys을 추가적으로 포함하며, 상기 CH1의 C-말단에 있는 Cys-Asp-Lys의 Cys 잔기와 상기 CL의 C-말단에 있는 Glu-Cys의 Cys 잔기가 이황화 결합된다.
본 발명의 주요한 특징 중 하나는 EGFR에 대한 Fab 단편의 페길화이다.
본 명세서에서 용어 “페길화(PEGylation)”는 목적의 단백질, 즉 상기 EGFR에 대한 Fab 단편에 폴리에틸렌글리콜(Polyethlylene glycol; PEG)을 컨쥬게이션시키는 것을 의미한다.
본 발명의 Fab 단편의 생체 내 약효 지속성과 안정성이 홀항체에 비하여 떨어지는 문제를 개선하기 위해 생체 내에서 면역반응을 일으키지 않는 생체적합성이 뛰어난 고분자인 폴리에틸렌글리콜을 접합시킨다. 이는 약물의 활성에 대한 영향을 최소화하고 페길화 효과를 극대화시킬 수 있는 부위에 접합시켜 Fab 단편의 효능 저하를 최소화한다. 페길화 된 Fab 단편은 분자량이 증가되었으므로 신사구체 여과로 인한 신장에서의 거름효과에 대한 단백질의 투과를 억제할 수 있어 손실이 감소하고 폴리에틸렌글리콜의 스틸스 작용(stealth effect)을 통해 생체 내 단백질 효소들의 분해 작용을 억제하는 결과를 보여 생체 내에서의 반감기를 증가시키고 폴리에틸렌글리콜의 입체장애로 체내 단백질 분해효소의 접근을 막아줌으로써 약물에 대한 안정성 증가효과및 폴리에틸렌글리콜의 친소성 성질에 의해 수용액 중에서 용해도를 증가시키는 효과를 갖는다.
본 발명의 EGFR에 대한 Fab 단편의 CH1이 페길화 된다. 상기 Fab 단편의 페길화를 위해 아미노산 서열이 추가적으로 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Fab 단편은 그의 CH1의 C-말단에 있는 Cys-Asp-Lys에 Thr-His-Thr-Cys-Ala-Ala이 추가적으로 결합된다(서열목록 제23서열).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 Fab 단편은 그의 CH1의 C-말단 부위에 있는 Thr-His-Thr-Cys-Ala-Ala에서 Cys 잔기가 페길화 된다.
본 명세서에서 용어 “폴리에틸렌글리콜(PEG)"는 수용성 폴리(에틸렌옥사이드)를 의미한다. 전형적으로, 본 발명에 적합한 PEG는 다음의 구조식으로 표현된다: (OCH2CH2)n (상기 화학식에서 n 2 내지 4000의 정수이다) 또한, 본 발명에 적합한 PEG 분자는 CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2” 및 “(OCH2CH2)nO”를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 PEG는 다양한 말단기 및 “말단 캡핑”그룹을 갖는 구조를 포함한다. 예를 들어, 상기 말단기는 말레이미드(Maleimide)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 페길화에 이용되는 PEG는 분자량이 5-50 kDa이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 PEG는 분자량이 18-38 kDa이다.
본 발명의 Fab 단편은 PEG 한 분자와 1:1 결합한다.
본 발명의 Fab 단편은 페길화를 통해 우수한 반감기를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Fab 단편은 마우스(Mus musculus)에서의 반감기가 20-35 시간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 제조하기 위한 다음을 포함하는 발현 컨스트럭트를 제공한다:
(a) 다음을 포함하는 중쇄-발현 컨스트럭트: (a-1) 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)-코딩 핵산 분자; 및 (a-2) 서열목록 제10서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(CH1)-코딩 핵산 분자; 그리고,
(b) 다음을 포함하는 경쇄-발현 컨스트럭트: (b-1) 서열목록 제11서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)-코딩 핵산 분자; 및 (b-2) 서열목록 제12서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역(CL)-코딩 핵산 분자.
본 발명의 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 제조하기 위한 발현 컨스트럭트는 상기 Fab 단편를 제조하기 위한 발현 컨스트럭트로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 발현 컨스트럭트를 구성하는 중쇄 불변 영역 1(CH1)-코딩 핵산분자 및 경쇄 불변 영역(CL)-코딩 핵산분자는 상기 CH1 및 CL에 이황화 결합의 형성을 위한 뉴클레오타이드 서열 및/또는 상기 CH1의 페길화를 위한 뉴클레오타이드 서열을 상기 핵산분자의 C-말단에 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 중쇄 불변 영역 1(CH1)-코딩 핵산 분자는 서열목록 제10서열, 제19서열 또는 제24서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 경쇄 불변 영역(CL)-코딩 핵산분자는 서열목록 제12서열 또는 제20서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 Fab 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80％의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90％의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95％의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 주요한 특징 중 하나는 상기 EGFR에 대한 Fab 단편은 대장균을 통해 제조될 수 있는 것이다.
상기 핵산 분자는 대장균에서 Fab 단편을 발현시키기 위해, 상기 EGFR에 대한 Fab 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 대장균의 코돈 발현 빈도를 반영하여 숙주에 유리하게 변환하였다.
본 발명에서 제작되는 발현 컨스트럭트는 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현할 수 있도록 구축된다. 일반적으로, 상기 발현 컨스트럭트의 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)에 각각 작동적으로 결합된 프로모터 및 터미네이터가 위치한다.
본 명세서에서 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 벡터에서 목적 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, T7 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ 프로모터, pR λ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터 및 trp 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열(터미네이터, 예컨대, T7 터미네이터, ADH1 터미네이터, T3 터미네이터 및 TonB 터미네이터 등)을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균이 이용되는 경우, 대장균 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL λ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pACYCDuet-1, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 EGFR에 대한 Fab 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 pACYCDuet-1에 클로닝된다. 상기 pACYCDuet-1 관련 정보는 https://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/pet_and_duet_vectors_(novagen)/pACYCDuet-1/를 참조한다.
본 발명의 Fab 단편의 대장균 내, 상세하게는 대장균 내 주변세포질(periplasm)에서 생성되도록 재조합 벡터에 신호 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호 펩타이드는 OmpA 신호 펩타이드, LamB 신호 펩타이드, StII 신호 펩타이드, MalE 신호 펩타이드, Lpp 신호 펩타이드 및 PelB 신호 펩타이드이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 신호 펩타이드는 OmpA 신호 펩타이드이다.
상기 OmpA 신호 펩타이드는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 업스트림(upstream)에 위치한다.
상기 OmpA 신호 펩타이드를 코딩하는 아미노산 서열은 서열목록 제3서열이고, 상기 OmpA 신호 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제8서열이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli C43(DE3), E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 열쇼크 방법, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 숙주세포는 대장균이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 숙주세포는 E. coli C43(DE3)이다. 상기 E. coli C43(DE3) 관련 정보는 Laurence Dumon-Seignovert et al.이 Protein Expression and Purification 37(2004) 203-206에 게재한 The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of ocerexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3)을 참조한다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 EGFR에 대한 Fab 단편을 코딩하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터에 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 숙주세포에서 EGFR에 대한 Fab 단편를 발현시키는 단계.
본 발명의 방법은 상기 EGFR에 대한 Fab 단편의 제조방법으로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본발명의 단계 (a)의 상기 숙주세포는 당업계에 공지된 다양한 배양방법에 따라 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 숙주세포는 SB(Super Broth), FB(Fastidious Broth), LB(Lysogeny Broth), TB(Terrific Broth), SOC(Super Optimal Broth with Catabolic repressor) 및 SOB(Super Optimal Broth)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양 배지에서 배양된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 숙주세포는 SB(Super Broth), FB(Fastidious Broth) 및 LB(Lysogeny Broth)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양 배지에서 배양된다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 숙주세포는 SB(Super Broth)에서 배양된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, (a) 상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fab 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암에 대한 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 또는 골수암이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 두경부암이다.
본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 상기 EGFR에 대한 Fab 단편의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 Fab 단편이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001 ㎍/kg - 1000 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하는 Fab(Fragment antigen-binding) 단편, 상기 Fab 단편을 제조하기 위한 발현 컨스트럭트, 상기 Fab 단편의 제조방법 및 상기 Fab 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 EGFR에 대한 Fab 단편은 항체에 비하여 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아에서 제조할 수 있어 생산 비용이 적게 든다.
(c) 본 발명의 EGFR에 대한 Fab 단편은 페길화(PEGylation)을 통해 증가된 체내 반감기를 제공한다.
도 1은 Fm301 컨스트럭트 및 pACYCDuet-1 벡터 맵을 나타낸다.
도 2는 Fm301의 클로닝을 PCR(Polymerase Cloning Reaction)을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 Fm302 컨스트럭트 및 pACYCDuet-1 벡터 맵을 나타낸다.
도 4는 Fm302의 클로닝을 PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 Fm306 컨스트럭트 및 pACYCDuet-1 벡터 맵을 나타낸다.
도 6은 Fm306의 클로닝을 PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 7a 내지 7c는 대장균에서 발현시킨 Fm301 및 Fm302 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과 및 항-Fab 항체와 결합시킨 결과를 나타낸다.
도 8은 Fm301 및 Fm302의 정제 후 균질도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 9는 대장균에서 발현시킨 Fm306 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 배지별(Lysogeny broth; LB, Fantidious broth; FB 및 Super broth; SB) 항체 정제 수율을 나타낸다.
도 11은 대장균에서 발현시킨 Fm302를 비-환원 다이를 이용해 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 12a 내지 12b는 Fm302의 이온 교환 크로마토그래피 결과를 나타낸다.
도 13은 Fm302의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타낸다.
도 14는 Fm302의 CH1 및 CL의 C-말단에 각각 Cys-Asp-Lys 및 Glu-Cys를 추가하여 형성되는 이황화 결합을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 Fm306의 정제 결과를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 Fm306-PEG(20K) 및 Fm306-PEG(30K) 결합체의 제조 및 수율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 17은 Fab' 컨스트럭트의 구조를 나타낸다. Fm301, Fm302 및 Fm306 모두 동일하게 4개의 쇄내 이황화 결합(intra-chain disulfide bond)를 갖고 있고, Fm302 및 Fm306의 경우 C-말단에 쇄내 이황화결합이 존재한다. Fm306의 경우 중쇄 부분 C-말단에 페길화를 위해 추가된 아미노산이 존재한다.
도 18a 내지 18d은 Fm306-PEG의 페길화를 SDS-PAGE, PEG 염색 및 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 보여준다. 도 18a는 Fm301, Fm302 및 Fm306 시료와 각 컨스트럭트별 PEG를 반응한 시료의 SDS-PAGE의 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색 결과를 나타낸다. 도 18b는 도 18a와 동일한 시료에 대한 PEG 염색 결과를 나타낸다. 도 18c는 Fm301, Fm302 및 Fm306 시료와 각 컨스트럭트별 PEG를 반응한 시료의 항-Fab 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 도 18d는 Fm301, Fm302 및 Fm306 시료와 각 컨스트럭트별 PEG를 반응한 시료의 항-PEG 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다.
도 19a 내지 19d는 Fm306-PEG의 페길화를 잔여 PEG 제거 후 SDS-PAGE, PEG 염색 및 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 보여준다. 도 19a는 Fm301, Fm302 및 Fm306 컨스트럭트별 잔여 PEG가 제거된 시료에 대한 SDS-PAGE의 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색 결과를 나타낸다. 도 19b는 도 19a와 동일한 시료에 대한 PEG 염색 결과를 나타낸다. 도 19c는 Fm301, Fm302 및 Fm306 시료 컨스트럭트별 잔여 PEG가 제거된 시료에 대한 항-Fab 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 도 19d는 Fm301, Fm302 및 Fm306 컨스트럭트별 잔여 PEG가 제거된 시료에 대한 항-PEG 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다.
도 20a 내지 20d는 각각 세툭시맙(Cetuximab), 세툭시맙-Fab, Fm302 및 Fm306FEG의 키네틱(kinetic) 값을 나타낸다.
도 21은 Fm302 및 Fm306PEG의 sEGFR-결합 친화도를 나타낸다.
도 22는 EGF, 세툭시맙, 세툭시맙-Fab, Fm302 및 Fm306PEG의 EGFR 인산화 정도를 나타낸다.
도 23은 세툭시맙, 세툭시맙-Fab, Fm302 및 Fm306PEG의 두경부암 질환모델동물에서의 종양조직 성장을 나타낸다.
도 24는 세툭시맙, 세툭시맙-Fab, Fm302 및 Fm306PEG의 두경부암 질환모델동물의 부검시점의 종양조직의 크기를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: Fab 컨스트럭트 제작
항체를 구성하는 도메인 중 VL(light chain variable region; 경쇄가변영역)과 VH(heavy chain variable region; 중쇄가변영역) 도메인에 각각 존재하는 분자내 이황화결합(intra-chain disulfide bonds)은 각 도메인의 구조를 안정화시킨다. 이와 같은 분자내 이황화결합은 항체(Anti-EGFR) 및 항원[EGFR(HER1)] 사이의 상호작용에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다[(Yang. et al., PNAS. 104(26):10813-10817(2007); Liu, H. and May, k., MAbs, 4:17-23(2012)]. 또한, 힌지 도메인(hinge domain)에 존재하는 2개의 시스테인(cysteine)은 각 도메인 사이의 분자 내 이황화결합을 형성하는데, 이는 항체가 이형체(dimer)를 이루는데 구조적으로 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다[K. Zangger. et al., Biochem. 359:353-360(2001),Levy, R. et al., J. Immunol. Methods., 394:10-21(2013)]. 하지만 본 발명에서 개발한 항-EGFR 항체절편은 힌지 도메인을 갖고 있지 않으며, 이로 인해 발생하는 힌지 도메인의 결실로 인해 Fab'를 형성하게 되고 일가(monovalent) 항체절편을 생산할 수 있게 된다. 한편, VH+CH1 및 VL+CL 도메인을 각각 발현시켜 대장균의 주변세포질(periplasm)에서 폴딩(folding)을 유도할 경우 안정적인 구조로 폴딩될 수 있는 것으로 알려져 있다(S. Ewert. et al., J. Mol. Biol. 325:531-553(2003). 항체절편의 각 도메인을 발현시켜 대장균의 주변세포질로 보내기 위하여 각 도메인 앞에 OmpA 신호 펩타이드(OmpA signal peptide)를 도입하였다.
Fab' 컨스트럭트[VH-CH1(‘CDK’ deletion), VL-CL : Fm301]
항체절편 플랫폼(platform)인 단가 Fab인 Fab'을 제작하여 Fm이라 명명하고 Fab의 VH+CH1 및 VL+CL 도메인을 클로닝하기 위해 세툭시맙의 아미노산 서열(표 1)을 근거로 하여 신호 펩타이드(OmpA)+VH+CH1 및 신호 펩타이드(OmpA)+VL+CL의 아미노산 서열(표 2 및 3)에 대한 DNA 염기서열을 코스모진텍에 의뢰하여 합성(표 4 및 5)을 진행하였다. 표 1의 서열 중 밑줄 부분은 가변 영역을 나타낸다. 이를 이용해 VH+CH1 및 VL+CL 도메인에 해당하는 부위에 PCR 프라이머를 제작(표 6)하고 신호 펩타이드(ompA)+VH+CH1 및 신호 펩타이드(OmpA)+VL+CL을 각각 발현되도록 유전자를 클로닝 하였고, 이를 제한효소 처리를 통해 대장균 공동-발현(co-expression) 벡터인 pACYCDuet-1 벡터(Novagen)에 클로닝 하였다(도 1).
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항-EGFR 중쇄 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 제1서열
항-EGFR 경쇄 DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGA 제2서열
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OmpA 신호 펩타이드 MKKTAIAIAVALAGFATVAQA 제3서열
VH QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA 제4서열
CH1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS 제5서열
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OmpA 신호 펩타이드 MKKTAIAIAVALAGFATVAQA 제3서열
VL DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK 제6서열
CL RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGA 제7서열
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OmpA 신호 펩타이드 ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC 제8서열
VH CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCG 제9서열
CH1 GCCTCTACCAAAGGTCCGAGCGTTTTCCCGCTGGCACCGAGCTCTAAATCTACCAGTGGCGGTACGGCAGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTCACCGTGAGTTGGAATTCCGGTGCACTGACCAGTGGCGTCCACACGTTCCCGGCTGTGCTGCAGAGTTCCGGTCTGTATAGCCTGTCATCGGTGGTTACCGTTCCGAGCTCTAGTCTGGGCACCCAAACGTACATTTGCAATGTCAACCATAAACCGAGCAACACGAAAGTTGATAAACGTGTCGAACCGAAATCA 제10서열
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OmpA 신호 펩타이드 ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC 제8서열
VL GATATTCTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATCCTGAGTGTTTCCCCGGGCGAACGTGTGTCATTTTCGTGTCGCGCGAGCCAGTCTATTGGTACCAATATCCACTGGTATCAGCAACGTACGAACGGCTCTCCGCGCCTGCTGATTAAATACGCCAGTGAATCCATTTCAGGCATCCCGAGCCGCTTTTCGGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACGCTGAGTATTAACTCCGTGGAATCAGAAGATATCGCAGACTATTACTGCCAGCAAAACAATAACTGGCCGACCACGTTTGGTGCTGGCACCAAACTGGAACTGAAA 제11서열
CL CGTACGGTGGCGGCCCCGAGTGTTTTTATCTTCCCGCCGTCCGATGAACAGCTGAAATCGGGTACCGCCAGCGTTGTCTGTCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAAGCAAAAGTCCAGTGGAAAGTGGACAATGCTCTGCAGTCGGGCAACAGCCAAGAAAGCGTGACCGAACAAGATAGTAAAGACTCCACGTACTCACTGTCCTCAACCCTGACGCTGAGCAAAGCGGATTATGAAAAACACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAAGGTCTGAGTAGCCCGGTTACGAAATCATTCAATCGTGGTGCC 제12서열
프라이머 서열(5' → 3') 서열목록
VH 도메인
정방향 프라이머		 CGCCCATGGCCAAAAAGACAACAGCTATCGCGATTGC 제13서열
CH1 도메인
역방향 프라이머		 ATGCGGCCGCAAGCTTCTATGATTTCGGTTCGACACG 제14서열
VL 도메인
정방향 프라이머		 AAGGAGATATACATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTG GCTGGTT 제15서열
CL 도메인
역방향 프라이머		 CTTTACCAGACTCGAGCTAGGCACCACGATTGAATGA 제16서열
Fm-301 컨스트럭트를 PCR하여 클로닝 결과를 확인하였다(도 2).
Fab' 컨스트럭트(V H -C H1 , V L -C L (+EC) : Fm302)
Fm301 컨스트럭트의 CH1 및 CL의 C-말단에 각각 아미노산 염기서열 'CDK' 및 ‘EC’를 삽입(표 7 및 8)된 컨스트럭트를 클로닝하기 위해 대장균에서 발현할 수 있는 코돈으로 변환하여 DNA 염기서열(표 9 및 10)을 코스모진텍에 의뢰하여 합성을 진행하였다. 상기 'CDK' 및 'EC'는 경쇄 및 중쇄가 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하기 위한 이황화결합을 유도하기 위하여 추가하였다. 이를 이용해 VH+CH1(+CDK) 및 VL+CL(+EC) 도메인에 해당하는 부위에 PCR 프라이머를 제작(표 11)하고 신호 펩타이드(ompA)+VH+CH1(+CDK) 및 신호 펩타이드(OmpA)+VL+CL(+EC)도메인을 각각 발현되도록 유전자를 클로닝 하였고, 이를 제한효소 처리를 통해 대장균 공동-발현 벡터인 pACYCDuet-1 벡터에 클로닝 하였다(도 3).
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OmpA 신호 펩타이드 MKKTAIAIAVALAGFATVAQA 제3서열
VH QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA 제4서열
CH1+CDK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK 제17서열
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OmpA 신호 펩타이드 MKKTAIAIAVALAGFATVAQA 제3서열
VL DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK 제6서열
CL+EC RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGAEC 제18서열
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OmpA 신호 펩타이드 ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC 제8서열
VH CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCG 제9서열
CH1+CDK GCCTCTACCAAAGGTCCGAGCGTTTTCCCGCTGGCACCGAGCTCTAAATCTACCAGTGGCGGTACGGCAGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTCACCGTGAGTTGGAATTCCGGTGCACTGACCAGTGGCGTCCACACGTTCCCGGCTGTGCTGCAGAGTTCCGGTCTGTATAGCCTGTCATCGGTGGTTACCGTTCCGAGCTCTAGTCTGGGCACCCAAACGTACATTTGCAATGTCAACCATAAACCGAGCAACACGAAAGTTGATAAACGTGTCGAACCGAAATCATGCGATAAA 제19서열
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OmpA 신호 펩타이드 ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC 제8서열
VL GATATTCTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATCCTGAGTGTTTCCCCGGGCGAACGTGTGTCATTTTCGTGTCGCGCGAGCCAGTCTATTGGTACCAATATCCACTGGTATCAGCAACGTACGAACGGCTCTCCGCGCCTGCTGATTAAATACGCCAGTGAATCCATTTCAGGCATCCCGAGCCGCTTTTCGGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACGCTGAGTATTAACTCCGTGGAATCAGAAGATATCGCAGACTATTACTGCCAGCAAAACAATAACTGGCCGACCACGTTTGGTGCTGGCACCAAACTGGAACTGAAA 제11서열
CL+EC CGTACGGTGGCGGCCCCGAGTGTTTTTATCTTCCCGCCGTCCGATGAACAGCTGAAATCGGGTACCGCCAGCGTTGTCTGTCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAAGCAAAAGTCCAGTGGAAAGTGGACAATGCTCTGCAGTCGGGCAACAGCCAAGAAAGCGTGACCGAACAAGATAGTAAAGACTCCACGTACTCACTGTCCTCAACCCTGACGCTGAGCAAAGCGGATTATGAAAAACACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAAGGTCTGAGTAGCCCGGTTACGAAATCATTCAATCGTGGTGCCGAATGC 제20서열
프라이머 서열(5' → 3') 서열목록
VH 도메인
정방향 프라이머		 CGCCCATGGCCAAAAAGACAACAGCTATCGCGATTGC 제13서열
CH1+CDK 도메인
역방향 브라이머		 ATGCGGCCGCAAGCTTCTATTTATCGCATGATTTCGGTTCGACACG 제21서열
VL 도메인
정방향 프라이머		 AAGGAGATATACATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTG GCTGGTT 제15서열
CL+EC 도메인
역방향 프라이머		 CTTTACCAGACTCGAGCTAGCATTCGGCACCACGATTGAATGA 제22서열
Fm-302 컨스트럭트를 PCR하여 클로닝 결과를 확인하였다(도 4).
Fab' 컨스트럭트(V H +C H1 +THTCAA, V L +C L +EC : Fm306)
앞서 제작한 Fm302 유전자에 부위 특이적 페길화(site specific pegylation) 반응을 위하여 CH1 도메인 C-말단에 힌지 부위의 아미노산인 THTCAA을 삽입(표 12)하여 대장균에서 발현할 수 있는 코돈으로 변환하여 DNA 염기서열(표 14 및 15)을 코스모진텍에 의뢰하여 합성을 진행하였다. 이를 이용하여 VH+CH1+THTCAA 및 VL+CL+EC에 해당하는 부위에 PCR 프라이머를 제작(표 16)하고 위해 대장균 발현PCR을 수행하였고, 이를 제한효소 처리를 통해 대장균 공동-발현 벡터인 pACYCDuet-1 벡터에 클로닝 하였다(도 5).
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OmpA 신호 펩타이드 MKKTAIAIAVALAGFATVAQA 제3서열
VH QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA 제4서열
CH1+CDK
+THTCAA		 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCAA 제23서열
- 서열 서열목록
OmpA 신호 펩타이드 MKKTAIAIAVALAGFATVAQA 제3서열
VL DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK 제6서열
CL+EC RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGAEC 제18서열
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OmpA 신호 펩타이드 ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC 제8서열
VH CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCG 제9서열
CH1+CDK
+THTCAA		 GCCTCTACCAAAGGTCCGAGCGTTTTCCCGCTGGCACCGAGCTCTAAATCTACCAGTGGCGGTACGGCAGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTCACCGTGAGTTGGAATTCCGGTGCACTGACCAGTGGCGTCCACACGTTCCCGGCTGTGCTGCAGAGTTCCGGTCTGTATAGCCTGTCATCGGTGGTTACCGTTCCGAGCTCTAGTCTGGGCACCCAAACGTACATTTGCAATGTCAACCATAAACCGAGCAACACGAAAGTTGATAAACGTGTCGAACCGAAATCATGCGATAAAACCCATACCTGCGCGGCG 제24서열
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OmpA 신호 펩타이드 ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC 제8서열
VL GATATTCTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATCCTGAGTGTTTCCCCGGGCGAACGTGTGTCATTTTCGTGTCGCGCGAGCCAGTCTATTGGTACCAATATCCACTGGTATCAGCAACGTACGAACGGCTCTCCGCGCCTGCTGATTAAATACGCCAGTGAATCCATTTCAGGCATCCCGAGCCGCTTTTCGGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACGCTGAGTATTAACTCCGTGGAATCAGAAGATATCGCAGACTATTACTGCCAGCAAAACAATAACTGGCCGACCACGTTTGGTGCTGGCACCAAACTGGAACTGAAA 제11서열
CL+EC CGTACGGTGGCGGCCCCGAGTGTTTTTATCTTCCCGCCGTCCGATGAACAGCTGAAATCGGGTACCGCCAGCGTTGTCTGTCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAAGCAAAAGTCCAGTGGAAAGTGGACAATGCTCTGCAGTCGGGCAACAGCCAAGAAAGCGTGACCGAACAAGATAGTAAAGACTCCACGTACTCACTGTCCTCAACCCTGACGCTGAGCAAAGCGGATTATGAAAAACACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAAGGTCTGAGTAGCCCGGTTACGAAATCATTCAATCGTGGTGCCGAATGC 제20서열
- 서열(5' → 3') 서열목록
VH 도메인 정방향 프라이머 CGCCCATGGCCAAAAAGACAACAGCTATCGCGATTGC 제13서열
CH1+CDK+THACAA도메인
역방향 프라이머		 CGCAAGCTTCTACGCCGCGCAGGTATGGGTTTTATCGCATGA TTTCGGTTC 제25서열
Fm-306 컨스트럭트를 PCR하여 클로닝 결과를 확인하였다(도 6).
실시예 2: Fm301 및 Fm302 컨스트럭트의 대장균 발현 확인
Fm301 및 Fm302 컨스트럭트의 유전자의 발현을 확인하기 위해 대장균 발현세포주인 C43(DE3) 세포(Lucigen)에 42℃ 열 충격(heat shock)을 통해 형질전환 시킨 후 IPTG 유도를 통해 Fm301 및 Fm302 발현을 확인하였다(도 7a 내지 7b). C43(DE3)는 37 ℃ 및 150 rpm의 조건에서 진탕배양하였다.
동일한 배양 조건 하에서 배양한 Fm301 및 302의 발현 정도를 비교한 결과 Fm302의 발현양이 더 많았으며, 정제된 Fm301 및 Fm302가 Fab 특이적 항체를 이용하여 항-fab 항체와 결합하는지 여부를 확인하기 위하여 정제된 단백질을 12% SDS-PAGE 겔로 전기영동한 후 NCM(nitrocellulose membrane)에 단백질을 트랜스퍼(transfer) 한 후 항-fab 항체와 반응시켜 확인한 결과, Fm301은 확인이 되지 않았고, Fm302만 확인되었다(도 7c).
두 항체절편을 균질성(homogeneity)을 확인하기 위하여 HPLC(SEC2000, Shimadzu, LC-6AD) 분석(이동상: PBS; 컬럼: Bio-sec 2000; 유속: 1 ㎖/min; 주입 용량: 25 ㎕)한 결과, Fm302가 균질성이 높음을 확인하였다(도 8).
실시예 3: Fm306 컨스트럭트의 대장균 발현 확인
Fm306의 대장균 발현과 정제를 위하여 Fm302와 같은 대장균 C43(DE3)를 이용 하였으며(실시예 2의 단백질 발현과 동일한 조건), 플라스미드는 pACYCDuet-1 벡터를 사용하여 2개의 도메인을 각각 발현 하도록 하였고, 주변세포질(periplasm)에서 항체절편이 발현되도록 하였다(도 9).
실시예 4: Fm302 및 Fm306 항체절편의 배양 및 정제
Fm302 항체절편 배양 및 정제
항체절편의 정제를 위한 숙주세포는 T7 RNA 폴리머라제의 레벨을 낮춰 과다발현된 재조합 단백질의 독성으로 인한 세포 사멸을 감소시킬 수 있는 대장균 C43(DE3)를 이용하였으며, 플라스미드는 pACYCDuet-1 벡터를 사용하여 2개의 도메인을 각각 발현하도록 하였고, OmpA 신호 펩타이드를 도입하여 주변세포질에서 항체절편이 생성되도록 하였다.
최적의 배양조건을 확립하기 위하여 배양액에 따른 항체절편 생산량을 비교하였다(도 10a). 비교시험에 사용한 배지는 Lysogeny broth(LB), Fastidious broth(FB) 및 Super broth(SB)를 사용하였고, 동일한 배양조건(37 ℃ 및 150 rpm 진탕 배양) 하에서의 세포의 질량과 항체절편 생산량을 비교하였다. 최종 OD600 값은 LB 3.69, FB 6.58 및 SB 11.48로 SB가 가장 높게 측정되었는데 이는 SB 배지에서 가장 많은 세포를 얻을 수 있음을 의미한다. 카파셀렉트 레진(KappaSelect resin)을 이용한 친화성 크로마토그래피의 4번 레인(lane)들의 Fm302 샘플로 상대적 활성을 비교하였을 때 SB 배지가 LB 대비 5배의 높은 것은 SB 배지에서 존재하는 항체절편의 양이 LB배지에서 항체절편의 양 보다 5배 증가될 것으로 판단되었다(도 10b).
LB 배지에 항생제 클로람페니콜을 넣고 진탕 배양기(shaking incubator)를 이용하여 37 ℃ 및 150 rpm의 조건으로 밤새 배양 하였다. 이후 새로운 SBplus 배지(Gellix)에 전날 키운 세포배양배지를 약 1-2 %가 되도록 접종하고 항생제인 클로람페니콜을 넣고 진탕 배양기를 이용하여 37 ℃ 및 150 rpm의 조건으로 배양하였다. 접종 후 OD600 값이 3.0 일 때 1 mM IPTG을 이용하여 유도하였고, 25 ℃ 및 150 rpm의 조건으로 9시간 동안 배양하였다. 이후 배양액은 4 ℃, 8000 rpm으로 원심 분리하여 침전물(pellet)을 얻었고, 이렇게 확보된 세포에 배양배지 1 L당 약 30-40 ㎖의 세포 용해 완충액[1×PBS(phosphate buffered saline), 5 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 10% 글리세롤, pH 7.4]을 첨가하여 세포와 혼합하였다. 이후 초음파 파쇄기를 이용하여 5분 동안(pulse on 3초, pulse off 3초) 세포를 용해하였다. 수용액 상의 항체절편 및 단백질들과 세포를 분리하기 위하여 원심분리기를 이용하여 20,000 rpm의 속도로 40분 동안 원심분리를 실시하였다.
이렇게 세포로부터 분리된 항체절편 및 단백질 수용액에서 항체절편만을 정제하기 위하여 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 개방 원통(open column)에 항체절편의 CL 도메인과 결합하는 카파셀렉트 레진(GE Healthcare)을 충진하고, 평형 완충액(equilibrium buffer; 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.4)을 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. 항체절편 및 단백질 수용액을 컬럼에 흘려줌으로써 레진과 항체절편이 결합하도록 한 후, 5 CV(column volume)의 세척 완충액(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.4)를 흘려주어 비특이적으로 결합한 불순물들을 제거하였다. 카파셀렉트 레진으로부터 항체절편을 분리하기 위해 용출 완충액(elution buffer; 100 mM 글라이신, 1 mM EDTA, pH 2.5)을 흘려주었다. 실험결과에서 보듯이 Fm302 컨스트럭트를 pACYCDuet-1 벡터에서 발현한 결과 항체절편은 가용성 형태로는 발현이 되었으며, 봉입체(inclusion body) 형태로는 발현되지 않음을 확인하였다. 1차 정제 결과 정제된 항체절편은 약 80%의 순도를 보였으며, 비환원 염색을 이용해 전기영동한 결과 경쇄 및 중쇄의 이질이량체를 형성하고 있음을 확인하였다(도 11).
1차로 정제된 항체절편의 순도를 더욱 높이기 위하여 이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. AKTA 프라임 FPLC 시스템에 HiTrapSP HP 컬럼(GE Healthcare)을 연결하고 평형 완충액(100 mM 글라이신, 1 mM EDTA, pH 2.5)을 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. 1차 정제 과정에서 용출된 항체절편 수용액 (pH 2.5)을 컬럼에 흘려줌으로써 레진과 항체절편이 결합하도록 한 후, 5 CV의 세척 완충액1(50 mM MES, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 6.0) 및 세척완충액2(50 mM MES, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 6.0)를 흘려주어 비특이적으로 결합한 불순물들을 제거하였다. 컬럼으로부터 항체절편을 분리하기 위하여 용출 완충액(50 mM MES, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 6.0)를 흘려주었다. 정제된 항체절편에 대하여 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 세척 과정을 통해 작은 크기의 분순물들이 모두 제거되었으며, 용출 과정에서 항체절편이 모두 용출된 것을 확인하였다(도 12a). 이때의 순도는 90% 이상인 것으로 확인되었다(도 12b).
항체절편의 균질성을 확인하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. AKTA 프라임 FPLC 시스템에 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 컬럼(GE Healthcare)을 연결하고 평형 완충액(PBS, 10% 글리세롤, 1 mM EDTA, 0.02% NaN3, pH 7.2))를 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. 2차 정제 과정에서 용출된 항체절편 수용액을 컬럼에 흘려주었고, 보유 용량(retention volume)은 55-65 ㎖로 측정되었다. 크로마토그램에서 항체절편을 나타내는 280 ㎚ 흡광도 및 SDS-PAGE 실험 결과로 미루어 보아, 항체절편의 균질성은 매우 높은 것으로 생각된다(도 13).
C-말단에 Cys가 없어 이황화 결합이 불가능한 Fm301과 이황화 결합이 가능한 Fm302에 대한 비환원젤 전기영동 분석을 실시한 결과 Fm302의 경우 이황화 결합으로 인해 하나의 밴드가 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 14).
Fm306 항체절편의 배양 및 정제
Fm306의 정제를 위하여 숙주세포 및 플라스미드는 Fm302와 같은 E-coli C43(DE3), pACYCDuet-1 벡터를 이용하였으며 OmpA 신호 펩타이드를 이용하여 주변세포질에서 항체절편이 생성되도록 하였다. 씨드(seed) 배양을 위하여 LB 배지에 항생제로 클로람페니콜을 넣고 진탕 배양기에서 37 ℃ 및 200 rpm으로 밤새 배양한다. 본배양을 위하여 SB+ 배지에 전날 키운 세포배양배지를 약 1-2 %가 되도록 접종하고 항생제인 클로람페니콜을 넣고 진탕 배양기에서 37 ℃ 및 200 rpm으로 배양한다. 접종 후 약 3-4시간이 경과하면 흡광도로 배양정도를 확인한다. 흡광도가 약 OD600=1.5 정도 되면 배양 배지에 1 mM IPTG을 넣어 유도하고 25 ℃ 및 200 rpm으로 설정한 진탕 배양기에서 밤새 배양하였다.
이후 배양액은 4 ℃ 및 8000 rpm으로 원심 분리하여 침전물을 수득하였다. 이렇게 확보된 E-coli C43(DE3)에서 발현된 Fm306 항체절편을 고순도로 정제하기 위해 배양배지 1 L당 약 30-40 ㎖의 세포 용해 완충액에 현탁시켰다. 구체적으로 인산나트륨완충액(PBS, phosphate buffered saline), 5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 10 % 글리세롤을 포함하는 pH 7.4의 세포 용해 완충액에 세포를 현탁하였다. 이후 초음파 파쇄기를 이용하여 5분 동안(pulse on 3초, pulse off 3초) 세포를 용해하였다. 수용액 상의 항체절편 및 단백질들과 세포를 분리하기 위하여 원심분리기를 이용하여 20,000 rpm의 속도로 40분 동안 원심분리를 하였다.
이렇게 세포로부터 분리된 항체절편 및 단백질 수용액에서 항체절편만을 정제하기 위하여 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 개방 원통(open column)에 항체절편의 CL 도메인과 결합하는 카파셀렉트 레진(GE Healthcare)을 충진하고, 평형 완충액(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.3)을 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. 항체절편 및 단백질 수용액을 컬럼에 흘려줌으로써 레진과 항체절편이 결합하도록 한 후, 5 CV(column volume)의 세척 완충액(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.4)을 흘려주어 비특이적으로 결합한 불순물들을 제거하였다. 카파셀렉트 레진으로부터 항체절편을 분리하기 위해 용출 완충액(100 mM 글라이신, 1 mM EDTA, pH 2.5)로 용출하였다(도 15, 1 레인).
이후 1차로 정제된 항체절편의 17 kD 주변의 4개 밴드(도 15, 1 레인) 불순물을 제거하여 순도를 높이기 위하여 2차 정제로 이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 개방 원통(open column)에 항체절편의 SP 레진(GE Healthcare)을 충진하고, 평형 완충액(100 mM glycine, 1 mM EDTA, pH 2.5)을 흘려주어 평형상태가 되도록 하였다. 항체절편 및 단백질 수용액을 컬럼에 흘려줌으로써 레진과 항체절편이 결합하도록 한 후, 5 CV(column volume)의 세척 완충액(50 mM MES, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 6.0)을 흘려주어 비특이적으로 결합한 불순물들을 제거하였다. 컬럼으로부터 항체절편을 분리하기 위하여 용출 완충액(50 mM MES, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 6.0)을 흘려주었다. 정제된 항체절편은 SDS-PAGE를 통해 확인하였다(도 15, 2 레인).
SDS-PAGE 결과에서 카파셀렉트 레진을 통한 1차 정제 이후, SP 레진을 이용한 이온교환 결과 타겟 단백질 이외의 17 kDa 주변의 불순물이 사라져 항체절편의 순도가 90 %이상 높아졌음을 확인할 수 있다(도 15).
Fm306-PEG 결합체의 제조
상기에서 기술한 방법으로 제조한 Fm306 항체절편의 페길화을 위하여 Fm306 정제 후 반응 액에 1.5 M Tris-Cl 완충액을 첨가하여 ph는 약 7.5로 맞춘 후 페길화를 위하여 반응 직전 신선한 PEG-maleimide(NANOCS)를 1:10의 몰 비로 혼합하였다. 이후 실온의 교반기 위에서 Fm306-PEG 혼합액을 혼합시키고, 반응시간은 2시간으로 하였다. 반응이 끝난 후 항체절편에 결합하지 않은 free-PEG를 제거하기 위하여 SP 레진을 이용하였다. Fm306-PEG 혼합액은 HCl 완충액을 이용하여 ph를 약 2.5로 낮춘 후 SP 레진에 결합시킨 후 동일한 ph의 조성을 갖는 완충용액(100 mM Glycine ph2.5, 1 mM EDTA)으로 20 CV 이상 충분히 세척해 주어 항체절편에 결합하지 않고 남아있는 free-PEG을 제거하였고, Fm306-PEG 결합체를 획득하였다. 이 결합체는 반응액을 10 mM 인산나트륨 완충액(PBS, ph7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 컬럼(Superdex 200, GE Healthcare)에 로딩 하였으며, 동일한 완충액을 이용하여 유속은 분 당 1 ㎖(1 ㎖/min)로 상기 컬럼에서 용출 시켰다. Fm306-PEG 결합체(도 16의 ⓐ)는 Fm306(도 16의 ⓑ)보다 분자량이 상대적으로 크므로 먼저 용출되는 특성을 이용하여 분리하였다. 각 분획을 SDS-PAGE를 이용한 비환원젤에서 Fm306-PEG 결합체는 약 100 kDa 이상의 사이즈로 나타났고 Fm306은 45 kDa으로 확인되었다. 통상적으로 페길화 된 단백질은 PAGE 상에서 천천히 이동하여 본연의 사이즈를 나타내기 어렵다고 알려져 있다(Anal Biochem. 1992 Feb 1;200(2):244-8). 이를 환원젤로 확인한 결과 약 65 kDa, 28 kDa 사이즈에서 단백질이 확인되었는데, 이는 페길화 된 항체절편(65 kDa)과 Fm306 항체절편의 경쇄부분으로 생각된다. 중쇄부분의 부위-특이적 페길화로 인해 페길화 되지 않고 남은 경쇄부분이 확인되었으며, Fm306-PEG(30K)의 SDS-PAGE에서 중쇄부분이 70 kD에서 나타나고 이는 2개의 30 kD의 PEG이 반응한 크기인 대략 85 kD크기로 계산되며 이보다 작은 크기로 나타나는 경향을 비교한 하였을 때 부위-특이적 페길화로 하나의 PEG 가 균질성이 있게 페길화 된(PEGylated) 항체절편으로 생각된다. 이렇게 수득한 Fm306-PEG(20K) 결합체의 수율은 약 80% 로 확인되었으며 다음 실험은 PEGylation된 항체절편으로 진행하였다(도 16).
Fm306-PEG(30K) 결합체도 상기 기술한 Fm306-PEG(20K)와 동일한 방법을 이용하여 제작하였다.
Fm306-PEG 결합체(도 16의 ⓒ)는 Fm306(도 16의 ⓓ)보다 분자량이 상대적으로 크므로 먼저 용출되는 특성을 이용하여 분리하였다. 이를 환원젤로 확인한 결과 약 70 kDa 및 28 kDa 사이즈에서 두 개의 밴드가 확인되었는데, 이는 페길화 된 항체절편(약 75 kDa))과 Fm306 항체절편의 중쇄와 경쇄부분으로 생각된다. 상기의 Fm306-PEG(20K)와 동일하게 중쇄부분의 부위-특이적 페길화로 인해 페길화 되지 않고 남은 경쇄부분이 확인되었으며, 같은 이유로 하나의 PEG가 균질성이 있게 PEGylated 항체절편으로 생각된다. 이렇게 수득한 Fm306-PEG(30K) 결합체의 수율은 약 80%로 확인되었으며 다음 실험은 PEGylation 된 항체절편으로 진행하였다(도 16).
Fab' 컨스트럭트 선별
항체 절편 Fab’의 CH1 도메인의 C-말단에 특이적으로 PEG를 도입하기 위하여 Fm302의 CH1 도메인 C-말단에 6개의 아미노산 서열(THTCAA)을 추가한 Fm306을 페길화 컨스트럭트로 선정하였다. 페길화는 추가된 아미노산 서열 중 시스테인 잔기의 메르캅토기(sulfhydryl) 작용기와 PEG의 말단에 위치한 말레이미드(maleimide) 작용기와의 반응을 통해 이루어진다. Fm306의 다른 위치에 존재하는 시스테인 잔기에는 페길화가 일어나지 않고 CH1 도메인의 C-말단에 페길화를 위해 추가된 아미노산 서열의 시스테인에만 페길화가 되는 것을 증명하기 위하여 Fm301 및 Fm302 컨스트럭트와의 비교 실험을 진행하였다. Fm301은 C-말단에 시스테인이 없는 컨스트럭트로서, 쇄내 이황화 결합(intra-chain disulfide bond)을 이루는 시스테인 잔기에 페길화가 되지 않음을 증명하기 위한 대조군 컨스트럭트로 사용하였고, Fm302는 각 사슬의 C-말단에 시스테인이 있는 컨스트럭트로서 해당 시스테인 잔기에 페길화가 되지 않음을 증명하기 위해 선별하였다(도 17).
페길화된 Fab'의 제조
페길화된 Fm306(Fm306-PEG)의 제조를 위하여 Fm306 정제 후, 반응액에 1.5 M Tris-HCl 완충액을 첨가하여 pH를 약 7.5로 맞추었고, Fm306와 PEG-maleimide의 비율이 1 대 10이 되도록 PEG-maleimide를 혼합하였다. 이후 실온에서 교반기를 이용하여 2시간 동안 반응시켰다. Fm301 및 Fm302도 위와 같은 방법을 이용하여 정제 후, PEG를 첨가하여 페길화 반응을 수행하였다. 페길화 컨스트럭트인 Fm306만 특이적으로 페길화 반응이 이루어졌는지 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였다 (도 18a). 페길화 여부를 알아보기 위하여 각 컨스트럭트 별로 PEG을 반응하지 않은 항체 절편 시료(도 18a의 1, 3 및 5열)와 PEG을 첨가하여 페길화를 시도한 시료 (도 18a의 2, 4 및 6열)를 각각 준비하였고 이를 환원젤에 로딩하였다. Fm301, Fm302 및 Fm306 등 항체 절편 시료(도 2a의 1, 3 및 5열) 및 Fm301과 Fm302에 PEG을 반응한 시료(도 18a의 2 및 4열)는 약 25 kDa 위치에서 항체 절편 시료의 경쇄부분과 중쇄부분을 확인할 수 있었으나, Fm306에 PEG를 반응한 시료(도 18a의 6열)는 약 65 kDa의 페길화가 이루어진 중쇄부분과 25 kDa의 경쇄부분을 확인할 수 있었다. 이는 CH1 도메인의 말단에 추가된 아미노산의 시스테인에 특이적으로 페길화가 이루어졌음을 증명하는 결과이다. Fm301 및 Fm302에 PEG를 반응한 시료 (도 18b의 2 및 4열)의 경우에도 PEG 분자가 존재하는 것을 PEG 염색을 통해 확인하였으나, 항체 절편과 같은 위치에서 나타나지 않았고 PEG 시료(도 18b의 7열)와 비교하였을 때 같은 위치에서 관찰되는 것을 확인하였다(도 18b). 이는 PEG 분자가 항체 절편과 결합하지 않았음을 뜻하고, 따라서 항체 절편에 존재하는 쇄내 이황화 결합 및 사슬간 이황화 결합(inter-chain disulfide bond)을 형성하는 시스테인 잔기에는 페길화가 이루어지지 않았음을 증명하는 결과이다. 동일한 시료에 대하여 항체 절편에 특이적으로 결합하는 항-Fab 항체 및 PEG에 특이적으로 결합하는 항-PEG 항체를 이용하여 웨스턴 블랏(western blot)을 진행하였다. Fab 특이 항체 및 PEG 특이 항체를 사용하였을 때 모두 SDS-PAGE로 확인한 결과와 같은 위치에서 항체 절편(도 18c의 6열) 및 PEG(도 18d의 6열)를 확인할 수 있었다.
반응이 끝난 후 항체 절편에 결합하지 않은 잔여 PEG를 제거하기 위하여 KappaSelect 레진이 충진된 컬럼에 Fm306-PEG 혼합액을 로딩하였다. 이후 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl 및 5 mM EDTA)을 20 CV 이상 흘려주어 충분히 세척하여 잔여 PEG를 제거한 후 완충용액(100 mM Glycine, pH 2.5, 1 mM EDTA)을 이용하여 용출하였다. 용출된 Fm306-PEG는 10 mM 인산나트륨 완충용액 (PBS, pH 7.4)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 컬럼(Superdex 200, GE Healthcare)에 로딩하였으며, 동일한 완충용액을 이용하여 유속은 분 당 1 ㎖(1 ㎖/min)로 상기 컬럼에서 용출시켰다. Fm301 및 Fm302에 대해서도 동일한 방법으로 잔여 PEG를 제거하였다. 용출한 시료를 SDS-PAGE를 이용하여 환원젤에서 관찰한 결과 Fm306의 경우(도 19a의 3열) 약 65 kDa 위치에서 PEG과 결합된 형태로 존재하는 중쇄부분이 존재함을 확인할 수 있었고, Fm301 및 Fm302의 경우(도 19a의 1 및 2열) PEG과 결합된 항체 절편은 전혀 존재하지 않았다(도 19a). 위와 동일하게 PEG 염색을 통해서 Fm306 시료(도 19b의 3열)에서만 같은 위치에 PEG가 존재함을 확인하였고, Fm301 및 Fm302 시료(도 19b의 1, 2열)에서는 PEG이 존재하지 않음을 확인하였다(도 19b). 이는 Fm301 및 Fm302의 경우 모든 PEG가 항체 절편과 결합되지 않고 정제 과정에서 제거되었음을 뜻한다. 상기 기술한 것과 동일한 방법을 이용하여 웨스턴 블랏을 진행하였고, 동일한 위치에서 항체 절편(도 19c의 3열)과 PEG(도 19d의 3열)를 확인할 수 있었다.
이러한 결과에 따르면 Fm306 컨스트럭트의 경우에만 항체 절편과 PEG가 결합되었고, Fm301 및 Fm302의 경우에는 항체 절편과 PEG가 결합하지 않았다. 따라서 Fm306에 도입된 아미노산 서열(THTCAA)의 시스테인에만 부위-특이적 페길레이션이 일어났음을 확인하였고, Fm301의 쇄내 이황화 결합 및 Fm302, Fm306의 쇄내 이황화 결합 및 사슬간 이황화 결합을 형성하고 있는 시스테인에는 페길화가 일어나지 않았음을 알 수 있다. 또한 Fm306-PEG(도 18a의 6열 및 도 19a의 3열)의 경우 중쇄부분에 해당하는 밴드는 단 한 개만 존재함을 확인하였는데, 이는 단량체(monomeric) 페길화를 증명하는 결과이다. 따라서 상기 기술된 방법을 통해 부위-특이적 페길화 및 단량체 페길화를 확인하였다.
EDMAN 시퀀싱을 통한 정제된 항체절편의 확인
정제된 항체절편의 확인 및 항체절편 앞의 신호 펩타이드의 삭제유무를 확인하기 위하여 eMass analysis Lab 사에 EDMAN 시퀀싱을 의뢰하여 정제된 항제절편의 확인과 N-말단의 신호 펩타이드의 제거를 확인하였다. 표 17에서 확인할 수 있듯이, 항체절편의 N 말단 서열은 경쇄, D-I-L-L-T 및 중쇄 Q-V-Q-L-K로 확인되었다.
Fm302 경쇄 분석 결과 D-I-L-L-T
Fm302 중쇄 Q-V-Q-L-K
실시예 5: 정제된 항체절편의 항원 결합 활성 측정
정제된 단백질이 항체절편인지 확인하기 위해 CH3 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 확인하였고, 항원인 EGFR과의 결합능을 갖고 있는지 확인하기 위해 SPR 및 ELISA를 이용하여 결합 친화도를 측정하였다.
SPR (surface plasmon resonance)을 이용한 sEGFR-결합 친화도 측정
XPR GLM 칩에 양성대조군(세툭시맙; Cetuximab)을 포함하는 항체절편 3종을 GLM 칩을 이용하여 코팅, EGFR-Fc를 흘려주어 비특이적 결합 여부를 확인 후 최적의 결합 조건을 확인하였다. 이를 바탕으로 다시 하나의 칩 위에 세툭시맙 및 항체절편을 동일하게 코팅한 뒤 EGFR-Fc를 흘려주는 방식으로 결합력 평가를 수행하였다. 측정을 위하여 ProteOn XPR 36에 GLM 칩을 50% 글리세롤을 사용하여 초기화 시킨 다음 25℃ 조건에서 러닝 완충액(running buffer; 10 mM Na-phosphate, 150 mM NaCl 및 0.005% Tween20을 포함하는 PBS, PBST, pH 7.4)를 흘려주어 칩 안정화를 시켜주었다. GLM 칩 4개 채널에 1:1 비율의 0.04 M N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)와 0.001 M sulfo-Nhydroxysuccinimide(sulfo-NHS)을 30 ㎕/min의 유속으로 220 ㎕ 흘려주어 채널을 활성화 시켰다. 세툭시맙 및 항체절편, 각 100 nM을 pH 5.5 아세테이트 완충액를 사용하여 30 ㎕/min 속도로 코팅하였다. 그 다음 1M Ethanolamine-HCl (pH 8.5)로 활성화된 칩을 불활성화 시키고 고정화 정도(immobilization level)가 각각 605-4340 RU(resonance units)가 되었음을 확인하였다. PBST로 기준을 정한 다음 EGFR-Fc 5 ~ 50 nM로부터 1/2 씩 희석한 5가지 일련의 농도를 만들어 코팅된 곳에 흘려보냄으로써 KD 값을 구하였다. 재생 완충액(Regeneration buffer; 50 mM NaOH)를 이용하여 제로베이스(zero base)를 확인 한 후 반복실험을 하여 최적 조건하에 최종 결과 값을 도출하였다.
세툭시맙 및 항체절편을 하나의 칩 위에 동일하게 코팅하여 EGFR을 동일한 농도로 흘려주었을 때 세툭시맙의 EGFR에 대한 결합 정도가 항체절편과는 민감도 부분에서 차이를 보여 세툭시맙의 경우는 EGFR-Fc의 농도를 5 nM부터 시작하여 키네틱(kinetic) 값을 구하였고 다른 항체절편들은 50 nM을 시작으로 하는 EGFR의 농도에서 최적조건을 찾아 5회 이상 반복하여 평균값을 구하였다. 그 결과 세툭시맙 17.5 pM, 세툭시맙-Fab 3.45 nM, FM302 720 pM, FM302-GPC 1.84 nM로 확인되었다 (표 18 및 도 20a 내지 20b). 세툭시맙과 비교하였을 때, Fm302의 kD 값은 다소 높은 것으로 측정되었다. 하지만 세툭시맙-Fab보다 낮은 kD 값을 갖는 것으로 측정된 것으로 미루어 보아 EGFR에 대한 결합 친화도는 충분히 높은 것으로 판단된다. 또한 Fm306PEG의 경우에도 세툭시맙-Fab의 kD 값보다 낮은 값을 갖는 것으로 측정되었는데, 이는 페길화에 의한 결합 친화도의 감소가 크지 않음을 의미한다.
분류 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(M) Rmax Chi2
세툭시맙 8.90×105 1.56×10-5 1.75×10-11 606.73 4.72
세툭시맙-Fab 2.26×105 7.78×10-4 3.45×10-9 36.43 2.02
Fm302 2.60×105 1.87×10-4 7.20×10-10 96.42 3.79
Fm306PEG 2.41×105 4.42×10-4 1.84×10-9 43.91 2.02
ELISA를 이용한 sEGFR-결합 친화도 측정
96 웰 ELISA 플레이트에 항원 sEGFR (100 ng/웰)을 넣고 4℃ 에서 밤새 반응하여 플레이트 표면에 항원을 고정화한 뒤, 상층액을 제거하고 블로킹 용액(Sigma, B6429-500ML) 200 ㎕를 각 웰에 분주하여 4℃ 에서 밤새 블로킹 하였다. 검정곡선을 얻기 위한 표준물질인 세툭시맙과 정제된 항체절편은 PBS를 이용하여 0-125 ng/㎖의 농도를 갖도록 희석하였다. 이를 각각 100 ㎕씩 분주한 뒤 실온에서 1시간 반응하여 항원과 결합하도록 하고, 반응이 끝난 후 PBST(PBS, 0.05% tween 20, pH 7.4)로 3회간 세척하였다. 항-인간 IgG(Sigma, I5260)를 1/1,000 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 반응한 후, 상층액을 제거하고 PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체 항-고트 IgG-Peroxidase (Sigma, A5420)를 1/3,000 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 반응하였다. 상층액을 제거하고 PBST로 3회 세척한 후, TMB(발색시약을 100 ㎕씩 분주하였다. 발색된 웰에 1 M의 H2SO4를 100 ㎕씩 넣어 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 리더기를 이용해 450 ㎚ 파장의 흡광도를 측정하였다. 세툭시맙 대비 Fm302의 결합 친화도는 약 47.2%인 것으로 측정되었으며 이는 EGFR에 대한 항체절편의 활성이 충분히 유지되는 것을 뜻한다. 또한, Fm306PEG의 결합 친화도는 Fm302 대비 약 32.2% 감소하였는데, 이것으로 미루어보아 페길화에 의한 결합 친화도 감소가 크지 않아 약 70%의 활성을 유지할 수 있음을 뜻한다(도 21).
A431 cell line에서 정제된 Fab의 EGFR의 인산화 확인
배양 중인 A431 세포를 0.25% 트립신/EDTA 처리하여 단일 세포로 떼어낸 후 배양접시에 1×106 개의 세포를 접종하여 24시간 동안 안정화 시킨 후 혈청이 포함되지 않은 배지로 8시간 배양 후 30 ㎍/㎖의 항체 및 항체절편을 처리하였다. 배양 중인 세포에 새로운 배지로 교체해 준 다음 배양접시로부터 세포를 회수하여 cell signaling사의 Pathscan total EGF receptor sandwich ELISA kit에서 제시하는 방법에 따랐다.
EGFR이 과발현되는 A431 세포에 항체절편을 처리하였을 때 항체에 의해 EGFR 인산화가 블로킹되어 phospho-EGF 수용체(Try845)의 결합이 억제됨을 확인하였으며, 세툭시맙 유래 세툭시맙 Fab와 Fm302는 30 ㎍/㎖에서 35%-40%정도의 인산화의 억제능을 확인하였다(도 22).
실시예 6: Fm302와 Fm306-PEG의 질환동물모델에서의 효능 확인
정제된 항체절편 Fab가 두경부암 질환동물모델에서의 항암효능효과를 확인하였다. 두경부암 질환동물모델을 제작하기 위하여 흉선이 결핍되어 있어서 면역기능과 관련된 T 세포가 생성되지 않아 면역성이 결핍된 누드마우스에 A431 세포를 배양하여 1×107 개의 암세포를 피하에 투여하여 인간 종양 이종 이식 질환동물을 제작하였다. 종양 조직이 생성되어 크기가 약 50-100 ㎣일 때 항체절편 및 약물 투여를 시작하였고, 약물은 마우스 당 0.25 ㎎씩 꼬리에 정맥주사로 주 2회 투여하였다. 총 투여는 3주 동안 6회 투여하였다. 종양조직의 크기 변화는 주 2회, 약물 투여 전에 수행하였다.
질환동물모델의 종양조직은 마우스당 주2회 0.25 ㎎를 처리하였을 경우 3주차에서 세툭시맙보다는 종양 성장억제능이 낮지만 세툭시맙 Fab에 비해 Fm302가 종양의 성장이 억제능 높음을 확인하였고, Fm306-PEG의 경우도 세툭시맙 Fab보다 반감기의 증가로 종양 성장의 억제 효과가 높음을 확인하였다(도 23).
두경부암질환모델의 실험 종료시점에 부검을 수행하여 종양조직의 무게를 측정한 결과 종양의 성장 곡선과 비슷한 경향을 확인하였다(도 24).
(5) 정제된 항체절편의 약동학적(PK; Pharmacokinetics) 분석
정제된 항체절편을 실험동물에 마우스 당 0.25 ㎎씩 꼬리에 정맥주사한 후 시간별로 안와채혈을 하여 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하였고 분리한 혈장내에 존재하는 투여된 항체절편의 양을 측정하였다.
혈액내의 항체절편의 농도 측정 결과 Fab, Fm302의 경우 혈중 농도의 반감기는 투여 후 4시간 이내로 확인되었고, 페길화 된 Fm306의 경우 혈중 농도의 반감기가 페길화 전보다 5배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 그리고 Fm306-PEG(20 kD)는 Fm306-PEG(30 kD)의 혈중 농도의 반감기가 18.6 hr에서 28.31 hr로 증가함을 확인하였다 (표 19).
Figure 112015087166547-pat00001
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SHIN-IL PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Fragment Antigen Binding Specifically Binding to Epidermal Growth Factor Receptor <130> PN150152 <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 452 <212> PRT <213> Amino acid sequence of anti-EGFR heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Amino acid sequence of anti-EGFR light chain <400> 2 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Ala 210 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Amino acid sequence of OmpA signal peptide <400> 3 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala 20 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Amino acid sequence of Heavy chain Variable region <400> 4 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 5 <211> 102 <212> PRT <213> Amino acid sequence of Heavy chain Constant region 1 <400> 5 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser 100 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Amino acid sequence of Light chain Variable region <400> 6 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 7 <211> 106 <212> PRT <213> Amino acid sequence of Light chain Constant region <400> 7 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Ala 100 105 <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of OmpA signal peptide <400> 8 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60 gcc 63 <210> 9 <211> 357 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of Heavy chain Variable region <400> 9 caagtccaac tgaaacaatc gggtccgggt ctggtccaac cgtcccaatc actgagcatc 60 acctgtaccg tgtcgggctt ctcgctgacc aattatggtg tgcattgggt tcgtcagagt 120 ccgggcaaag gtctggaatg gctgggcgtt atttggtccg gcggtaatac cgattacaac 180 accccgttta cgagtcgcct gtccatcaat aaagacaact cgaaaagcca ggtgtttttc 240 aaaatgaatt cactgcaatc gaacgatacc gcgatttatt actgcgcacg tgctctgacg 300 tattacgact atgaatttgc ctactggggc cagggtaccc tggtgacggt tagcgcg 357 <210> 10 <211> 306 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of Heavy chain Constant region 1 <400> 10 gcctctacca aaggtccgag cgttttcccg ctggcaccga gctctaaatc taccagtggc 60 ggtacggcag ctctgggctg tctggtgaaa gattattttc cggaaccggt caccgtgagt 120 tggaattccg gtgcactgac cagtggcgtc cacacgttcc cggctgtgct gcagagttcc 180 ggtctgtata gcctgtcatc ggtggttacc gttccgagct ctagtctggg cacccaaacg 240 tacatttgca atgtcaacca taaaccgagc aacacgaaag ttgataaacg tgtcgaaccg 300 aaatca 306 <210> 11 <211> 321 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of Light chain Variable region <400> 11 gatattctgc tgacccagag cccggtgatc ctgagtgttt ccccgggcga acgtgtgtca 60 ttttcgtgtc gcgcgagcca gtctattggt accaatatcc actggtatca gcaacgtacg 120 aacggctctc cgcgcctgct gattaaatac gccagtgaat ccatttcagg catcccgagc 180 cgcttttcgg gcagcggttc tggcaccgat ttcacgctga gtattaactc cgtggaatca 240 gaagatatcg cagactatta ctgccagcaa aacaataact ggccgaccac gtttggtgct 300 ggcaccaaac tggaactgaa a 321 <210> 12 <211> 318 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of Light chain Constant region <400> 12 cgtacggtgg cggccccgag tgtttttatc ttcccgccgt ccgatgaaca gctgaaatcg 60 ggtaccgcca gcgttgtctg tctgctgaat aacttctatc cgcgcgaagc aaaagtccag 120 tggaaagtgg acaatgctct gcagtcgggc aacagccaag aaagcgtgac cgaacaagat 180 agtaaagact ccacgtactc actgtcctca accctgacgc tgagcaaagc ggattatgaa 240 aaacacaaag tgtacgcctg cgaagttacc catcaaggtc tgagtagccc ggttacgaaa 300 tcattcaatc gtggtgcc 318 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Forward primer of Heavy chain Variable region <400> 13 cgcccatggc caaaaagaca acagctatcg cgattgc 37 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Reverse primer of Heavy chain Constant region 1 <400> 14 atgcggccgc aagcttctat gatttcggtt cgacacg 37 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Forward primer of Light chain Variable region <400> 15 aaggagatat acatatgaaa aagacagcta tcgcgattgc agtggcactg gctggtt 57 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Reverse primer of Light chain Constant region <400> 16 ctttaccaga ctcgagctag gcaccacgat tgaatga 37 <210> 17 <211> 105 <212> PRT <213> Amino acid sequence of Heavy chain Constant region 1 + CDK <400> 17 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 100 105 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Amino acid sequence of Light chain Constant retion +EC <400> 18 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Ala Glu Cys 100 105 <210> 19 <211> 315 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of Heavy chain Constant region 1 +CDK <400> 19 gcctctacca aaggtccgag cgttttcccg ctggcaccga gctctaaatc taccagtggc 60 ggtacggcag ctctgggctg tctggtgaaa gattattttc cggaaccggt caccgtgagt 120 tggaattccg gtgcactgac cagtggcgtc cacacgttcc cggctgtgct gcagagttcc 180 ggtctgtata gcctgtcatc ggtggttacc gttccgagct ctagtctggg cacccaaacg 240 tacatttgca atgtcaacca taaaccgagc aacacgaaag ttgataaacg tgtcgaaccg 300 aaatcatgcg ataaa 315 <210> 20 <211> 324 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of Light chain Constant region +EC <400> 20 cgtacggtgg cggccccgag tgtttttatc ttcccgccgt ccgatgaaca gctgaaatcg 60 ggtaccgcca gcgttgtctg tctgctgaat aacttctatc cgcgcgaagc aaaagtccag 120 tggaaagtgg acaatgctct gcagtcgggc aacagccaag aaagcgtgac cgaacaagat 180 agtaaagact ccacgtactc actgtcctca accctgacgc tgagcaaagc ggattatgaa 240 aaacacaaag tgtacgcctg cgaagttacc catcaaggtc tgagtagccc ggttacgaaa 300 tcattcaatc gtggtgccga atgc 324 <210> 21 <211> 46 <212> DNA <213> Reverse primer of Heavy chain Constant region 1 +CDK <400> 21 atgcggccgc aagcttctat ttatcgcatg atttcggttc gacacg 46 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Reverse primer of Light chain Constant region +EC <400> 22 ctttaccaga ctcgagctag cattcggcac cacgattgaa tga 43 <210> 23 <211> 111 <212> PRT <213> Amino acid sequence of Heavy chain Constant region 1 +CDK+THTCAA <400> 23 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 100 105 110 <210> 24 <211> 333 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of Heavy chain Constant region 1 +CDK +THTCAA <400> 24 gcctctacca aaggtccgag cgttttcccg ctggcaccga gctctaaatc taccagtggc 60 ggtacggcag ctctgggctg tctggtgaaa gattattttc cggaaccggt caccgtgagt 120 tggaattccg gtgcactgac cagtggcgtc cacacgttcc cggctgtgct gcagagttcc 180 ggtctgtata gcctgtcatc ggtggttacc gttccgagct ctagtctggg cacccaaacg 240 tacatttgca atgtcaacca taaaccgagc aacacgaaag ttgataaacg tgtcgaaccg 300 aaatcatgcg ataaaaccca tacctgcgcg gcg 333 <210> 25 <211> 51 <212> DNA <213> Reverse primer of Heavy chain Constant region 1 +CDK+THACAA <400> 25 cgcaagcttc tacgccgcgc aggtatgggt tttatcgcat gatttcggtt c 51

Claims (18)

  1. EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하며 다음의 영역을 포함하는 Fab(Fragment antigen-binding) 단편:
    (a) 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH);
    (b) 서열목록 제5열의 아미노산 서열을 포함하고 C-말단에 Cys-Asp-Lys을 추가적으로 포함하는 중쇄 불변 영역 1(CH1);
    (c) 서열목록 제6서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및
    (d) 서열목록 제7열의 아미노산 서열을 포함하고 C-말단에 Glu-Cys을 추가적으로 포함하는 경쇄 불변 영역(CL); 상기 CH1의 C-말단에 있는 Cys-Asp-Lys의 Cys 잔기와 상기 CL의 C-말단에 있는 Glu-Cys의 Cys 잔기는 이황화 결합된다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 CH1은 그의 C-말단에 있는 Cys-Asp-Lys에 Thr-His-Thr-Cys-Ala-Ala이 추가적으로 결합된 것을 특징으로 하는 Fab 단편.
  5. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 Fab 단편은 페길화(PEGylation) 된 것을 특징으로 하는 Fab 단편.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 Fab 단편은 그의 CH1이 페길화 된 것을 특징으로 하는 Fab 단편.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 Fab 단편은 그의 CH1의 C-말단 부위에 있는 Thr-His-Thr-Cys-Ala-Ala에서 Cys 잔기가 페길화 된 것을 특징으로 하는 Fab 단편.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 페길화에 이용되는 PEG(Polyethylene glycol)는 분자량이 5-50 kDa인 것을 특징으로 하는 Fab 단편.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 PEG는 분자량이 18-25 kDa인 것을 특징으로 하는 Fab 단편.
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 Fab 단편은 마우스(Mus musculus)에서의 반감기가 20-35 시간인 것을 특징으로 하는 Fab 단편.
  12. EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하는 Fab(Fragment antigen-binding) 단편을 제조하기 위한 다음을 포함하는 발현 카세트:
    (a) 다음을 포함하는 중쇄-발현 컨스트럭트: (a-1) 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)-코딩 핵산분자; 및 (a-2) 서열목록 제24서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(CH1)-코딩 핵산분자; 그리고,
    (b) 다음을 포함하는 경쇄-발현 컨스트럭트: (b-1) 서열목록 제11서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)-코딩 핵산분자; 및 (b-2) 서열목록 제20서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역(CL)-코딩 핵산분자.
  13. 상기 제 12 항의 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
  14. 상기 제 13 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  16. 다음의 단계를 포함하는 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하는 Fab(Fragment antigen-binding) 단편의 제조방법:
    (a) 상기 제 14 항 또는 제 15 항의 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 숙주세포에서 EGFR에 대한 Fab 단편을 발현시키는 단계.
  17. (a) 상기 제 1 항의 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하는 Fab(Fragment antigen-binding) 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암에 대한 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 또는 골수암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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