WO2023153442A1 - 環境応答性マスク抗体及びその利用 - Google Patents

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WO2023153442A1
WO2023153442A1 PCT/JP2023/004196 JP2023004196W WO2023153442A1 WO 2023153442 A1 WO2023153442 A1 WO 2023153442A1 JP 2023004196 W JP2023004196 W JP 2023004196W WO 2023153442 A1 WO2023153442 A1 WO 2023153442A1
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翔太 工藤
和徳 佐伯
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials

Definitions

  • the present invention relates to mask antibodies that are activated by being placed in a specific environment.
  • Antibodies have very high recognition specificity and binding activity for antigens, that is, target molecules, and various molecules such as low-molecular-weight compounds, peptides, and proteins can be antigens.
  • antibody drugs are highly productive and stable in vivo, and are being developed for various diseases such as cancer, immune diseases, and infectious diseases.
  • ADC Antibody Drug Conjugate
  • TCE T-Cell Engaging
  • a mask antibody is known as a modified antibody that specifically acts on tumor tissue by using the properties of the tumor microenvironment (enhanced protease activity in tumor tissue, etc.). Since masked antibodies have suppressed binding activity in normal tissues, they are expected to be highly safe antibody drugs with low toxicity to normal tissues via target molecules (Non-Patent Document 2).
  • a masked antibody is composed of an antibody body, a masking domain that inhibits antibody binding, and a cleavable linker that connects the antibody and the masking domain and can be cleaved by a protease (Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 3 Known masking domains include mimotope peptides that bind to complementarity determining regions (CDRs) of antibodies, and coiled-coil domains that do not directly interact with antibodies.
  • the cleavable linker is equipped with substrates for extracellular proteases such as matrix metalloprotease (MMP) and urokinase-type plasminogen activator (uPA), whose activity is enhanced in tumor tissue, and activates tumor tissue-selective antibodies.
  • MMP matrix metalloprotease
  • uPA urokinase-type plasminogen activator
  • Non-Patent Document 4 For example, previous studies using a masked anti-EGFR antibody (Cetuximab) showed activation of the masked antibody in tumor tissue, reduced skin exposure to EGFR, extended blood half-life, improved safety, etc. have been reported (Non-Patent Document 4). In addition, masking technology has been applied to various biologics molecules such as bispecific antibodies and cytokines (Patent Documents 3 and 4).
  • the tumor microenvironment is also known to be characterized by extracellular pH (pHe) acidification.
  • the acidification of tumor tissue is thought to be caused by the accumulation of lactate dependent on the sugar metabolism system of cancer cells. It has been reported that various transporters such as acid transporter and H + -ATPase are involved. Decreased pHe in tumor tissue is involved in the activation of secreted lysosomal proteases, which aids the metastasis and invasion processes of cancer cells, as well as affecting drug resistance and immune escape of cancer cells. (Non-Patent Document 5).
  • Patent Document 5 a method of introducing mutations into the CDR region of an antibody to improve antigen-binding activity in a low pH environment (Patent Document 5, Non Patent Document 6), and a masked antibody technology having a masking domain that binds to an antibody in a pH-dependent manner is known (Patent Document 6).
  • Patent Document 6 a masked antibody technology having a masking domain that binds to an antibody in a pH-dependent manner.
  • the present inventors conducted intensive research to solve the above problems, and focused on the fact that the pHe of the tumor environment is acidified. completed the invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a molecule that binds to a target antigen comprising the following [a] portion, [b] portion and [c] portion: [a] portion The portion that binds to the target antigen; [b] portion A first peptide that recognizes the target antigen-binding site contained in the [a] portion; [c] Part A second peptide consisting of an amino acid sequence containing an amino acid whose charge changes from uncharged to positively charged in the range of pH 7.5 or lower as the pH changes from neutral to acidic conditions.
  • the molecule of [1] characterized by having a higher binding affinity for the target antigen under acidic conditions compared to neutral conditions.
  • [3] The molecule of [1] or [2], comprising one or more of [a], [b] and [c] moieties, respectively.
  • [4] Contains one or more portions [a], [b] and [c], respectively, and the number of each of the [a] portions, [b] portions and [c] portions is the same , any one molecule of [1] to [3].
  • [5] The molecule of [1] or [2] comprising two each of [a], [b] and [c] moieties.
  • the second peptide contains four or more amino acids whose charge changes from uncharged to positive in response to a change in pH from neutral conditions to acidic conditions in the range of pH 7.5 or less, and A molecule according to any one of [1] to [5], which consists of an amino acid sequence with a peptide pI value greater than 6.4.
  • the second peptide contains four or more amino acids whose charge changes from uncharged to positive in response to a change in pH from neutral conditions to acidic conditions in the range of pH 7.5 or less, and A molecule according to any one of [1] to [6], which consists of an amino acid sequence with a peptide pI value of 6.8 or higher.
  • the second peptide contains four or more amino acids whose charge changes from uncharged to positive in response to a change in pH from neutral to acidic conditions in the range of pH 7.5 or less, and A molecule according to any one of [1] to [7], which consists of an amino acid sequence with a peptide pI value of 7.2 or higher.
  • the second peptide contains four or more amino acids whose charge changes from uncharged to positive in response to a change in pH from neutral conditions to acidic conditions in the range of pH 7.5 or less, and A molecule according to any one of [1] to [8], which consists of an amino acid sequence with a peptide pI value of 7.6 or higher.
  • the second peptide contains one or more amino acids having two or more consecutive basic functional groups with a pKa of 7 or less in the side chain, and the basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain a molecule of any one of [1] to [12], which consists of an amino acid sequence containing a total of four or more amino acids having [17]
  • the second peptide has a structure represented by an amino acid sequence containing an amino acid sequence having a basic functional group with a pKa of 7 or less on the side chain in every other amino acid sequence [1] to [11] any one molecule of [18]
  • the second peptide comprises an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 49 to 53, 55, 59 to 61, 65, 66, 75 to 81 ( Figures 54 and 64) [1] to [ 16] and any one molecule of [18]-[27].
  • [29] The molecule of any one of [17]-[27], wherein the second peptide comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:54 ( Figure 54).
  • [32] The molecule of any one of [1]-[31] having an EC50 ratio of 30 or greater.
  • the amino acid sequence of the second peptide contains two or more basic amino acid clusters, one basic amino acid cluster is located at the amino terminus or carboxyl terminus of said amino acid sequence, and any other basic amino acid
  • the amino acid sequence of the second peptide contains two or more basic amino acid clusters, one basic amino acid cluster is located at the amino terminus of the amino acid sequence, and the other one basic amino acid cluster is a carboxyl Any one molecule of [1] to [33] located at the terminal end. [36] The molecule of any one of [1] to [33], wherein none of the basic amino acid clusters contained in the amino acid sequence of the second peptide are located at the amino terminus and are not located at the carboxyl terminus of said amino acid sequence. .
  • the amino acid sequence of the second peptide includes an amino acid sequence that is cleaved by an intracellular and/or extracellular protease and an amino acid sequence that includes a basic amino acid cluster, wherein the amino acid sequence is (1) from the amino terminus to the carboxyl terminus, an amino acid sequence containing a basic amino acid cluster and an amino acid sequence cleaved by an intracellular and/or extracellular protease are linked in that order, or (2) from the carboxyl terminus An amino acid sequence cleaved by an intracellular and/or extracellular protease and an amino acid sequence containing a basic amino acid cluster are linked in this order toward the amino terminus, A molecule of any one of [1]-[34] or [36].
  • the number of amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain contained in the amino acid sequence of the second peptide is 5% or more and 30% or less of the total number of amino acids contained in the amino acid sequence.
  • the molecule of any one of [1] to [38], wherein the first peptide, the second peptide, and the portion that binds to the target antigen are linked in this order.
  • the molecule of any one of [1] to [39], wherein the portion that binds to the target antigen is a polypeptide consisting of an amino acid sequence not included in the first peptide and the second peptide.
  • [41] The molecule of any one of [1] to [40], which consists of a polypeptide.
  • any one selected from the group consisting of the first peptide, the second peptide, and the portion that binds to the target antigen is bound to one or both of the other two via a linker or spacer; A molecule of any one of [1] to [42].
  • [45] The molecule of any one of [1] to [44], wherein the acidic conditions are pH 6.0 or less.
  • [46] The molecule of any one of [1] to [45], wherein the acidic conditions are pH 5.5 or less.
  • [47] The molecule of any one of [1]-[46], wherein the target antigen is an antigen present in tumor tissue, endosomes or lysosomes.
  • [48] of [1] to [47] wherein the portion that binds to the target antigen is bound to another portion, the [d] portion, and the [d] portion does not contain the first peptide and the second peptide. Any one molecule.
  • Antibodies or antigen-binding fragments thereof in which the [d] portion does not bind to a target antigen peptides comprising an amino acid sequence not included in the first peptide and the second peptide, cytokines, toxins, radioactive isotopes, labels
  • the molecule of [48] which is one or more selected from the group consisting of molecules, photosensitizers, immunostimulatory agents, antitumor compounds, drugs, payloads and polymers.
  • the antitumor compound is a camptothecin derivative or a pyrrolobenzodiazepine derivative, preferably the camptothecin derivative is N-[(1S,9S)-9-Ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10 , 13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3′,4′:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1 -yl]-2-hydroxyacetamide, the molecule of [49]. [51] The molecule of [49], wherein the immunostimulatory agent is a cyclic dinucleotide derivative.
  • [52] The molecule of any one of [48]-[51], consisting of a polypeptide, or consisting of the [d] portion and a polypeptide.
  • [53] The molecule of any one of [1]-[52], wherein the first peptide is obtained by a method comprising steps (i)-(iii): (i) contacting a peptide library containing repeating sequences of aromatic amino acids and Pro with the target antigen-binding portion of [1]; (ii) recovering peptides that bind to the target antigen binding moiety; and (iii) preparing the resulting peptides by recombinant, chemical synthesis or peptide synthesis.
  • [54] A step of preparing a peptide comprising the amino acid sequence contained in the first peptide and/or the amino acid sequence contained in the second peptide by recombination, in vitro translation, chemical synthesis or peptide synthesis, [1]- A method for producing the molecule of any one of [52]. [55] A molecule that binds to a target antigen obtained by the method of [54]. [56] A method for producing the molecule of any one of [41], [42] or [52], comprising the step of (iv) below.
  • a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence comprised in the portion that binds to the target antigen, and optionally an amino acid sequence comprised in the first peptide and/or an amino acid sequence comprised in the second peptide; Introducing a polynucleotide comprising a cell, culturing the cell, and recovering from the culture a polypeptide that binds to the target antigen.
  • a molecule that binds to a target antigen obtained by the method of [56].
  • a pharmaceutical composition comprising a molecule of any one of [1]-[53], [55] and [57], a salt thereof, or a hydrate thereof.
  • [59] The pharmaceutical composition of [58], which is an anticancer agent.
  • the second peptide is rendered acidic from neutral pH conditions in the range of pH 7.5 or less.
  • the toxicity of the molecule that binds the target antigen to the recipient is reduced compared to molecules that do not contain amino acids whose charge changes from uncharged to positive in response to changing conditions [58] or [ 59].
  • the second peptide is rendered acidic from neutral pH conditions in the range of pH 7.5 or less. Increased blood levels of molecules that bind target antigens to recipients compared to molecules that do not contain amino acids whose charge changes from uncharged to positive in response to changing conditions [58] or the pharmaceutical composition of [59].
  • a test, diagnostic or reagent comprising the molecule of any one of [1]-[53], [55] and [57] or the pharmaceutical composition of [58].
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the molecule of [41] or [52].
  • a vector comprising the polynucleotide of [63].
  • a cell comprising the polynucleotide of [63] or the vector of [64] or producing the molecule of [41] or [52].
  • the present invention also includes the following inventions.
  • a pH-responsive peptide linker comprising the amino acid sequence of the second peptide of [1].
  • the peptide linker of [i] comprising the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 49-55, 59-61, 65, 66, 75-81 ( Figures 54 and 64).
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the peptide linker of [i] or [ii].
  • a vector comprising the polynucleotide of [iii].
  • a cell comprising the polynucleotide of [iii] or the vector of [iv] or producing the peptide linker of [i] or [ii].
  • FIG. 1 shows the concept of the invention.
  • An example format for a masked antibody that is activated in response to pH change is shown.
  • a masking domain (lattice) that binds to the variable region of the antibody (white) is fused to the variable region of the antibody heavy chain with a linker.
  • the linker has a cluster of histidine residues (His cluster (black)) exhibiting pH responsiveness, and the masking domain binds to the variable region of the antibody at neutral pH.
  • His cluster black
  • the histidine residues inside the His cluster become positively charged, which induces a conformational change in the linker, leaving the masking domain away from the antibody, ie, allowing the antibody to bind to the antigen.
  • FIG. 1 shows the concept of the invention.
  • FIG. 2 shows the results of ELISA evaluation of the interaction between the known anti-TROP2 antibody HT1-11 described in WO2015/098099 and the human TROP2 antigen. HT1-11 bound to the antigen in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 3 shows the output/input ratio when the degree of enrichment of peptide binders after panning against anti-TROP2 antibody HT1-11 was evaluated by pull-down experiments. The value was higher for HT1-11 than for human serum-derived IgG (IgG mixture), suggesting the enrichment of peptides that specifically bind to HT1-11.
  • FIG. 4-1 shows the results of ELISA evaluation of the interaction between the scFv-type anti-TROP2 antibody and the human TROP2 antigen.
  • Binding activity was evaluated under MMP non-addition conditions (solid line) and MMP1 addition conditions (dotted line).
  • A HT1-11-scFv-HL showed similar binding activity regardless of MMP addition conditions.
  • B HT1-11-scFv-LH showed similar binding activity regardless of MMP addition conditions.
  • FIG. 4-2 shows the results of ELISA evaluation of the interaction between the scFv-type anti-TROP2 antibody and the human TROP2 antigen. Binding activity was evaluated under MMP non-addition conditions (solid line) and MMP1 addition conditions (dotted line).
  • C MHT1001 showed stronger binding activity under MMP1 addition conditions than under MMP1 non-addition conditions.
  • FIG. 5-1 shows the results of evaluating the interaction between an IgG-type anti-TROP2 mask antibody and a human TROP2 antigen by ELISA. The binding activity was evaluated under protease-free conditions (solid line) and protease-added conditions (dotted line).
  • A HT1-11 showed similar binding activity regardless of MMP addition conditions.
  • B MHT1007 showed stronger binding activity under MMP1 addition conditions than under MMP1 non-addition conditions.
  • FIG. 5-2 shows the results of an ELISA evaluation of the interaction between an IgG-type anti-TROP2 mask antibody and a human TROP2 antigen.
  • FIG. 6-1 shows the interaction of anti-TROP2 mask antibody loaded with His cluster and human TROP2 antigen under neutral pH conditions (pH 7.5, solid line) or acidic pH conditions (pH 5.5, dotted line) evaluated by ELISA. shows the results.
  • A MHT1008 showed similar binding activity under both pH conditions.
  • B MHT1803 showed stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • Figure 6-2 shows the interaction of His cluster-loaded anti-TROP2 masked antibody with human TROP2 antigen under neutral pH conditions (pH 7.5, solid line) or acidic pH conditions (pH 5.5, dotted line) evaluated by ELISA. shows the results.
  • C MHT1804 showed stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • D MHT1805 showed stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • Figure 6-3 shows the interaction of His cluster-loaded anti-TROP2 masked antibody with human TROP2 antigen under neutral pH conditions (pH 7.5, solid line) or acidic pH conditions (pH 5.5, dotted line) assessed by ELISA. shows the results.
  • (E) MHT1806 exhibited stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • (F) MHT1808 exhibited stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • Figure 6-4 shows the interaction of His cluster-loaded anti-TROP2 masked antibody with human TROP2 antigen under neutral pH conditions (pH 7.5, solid line) or acidic pH conditions (pH 5.5, dotted line) assessed by ELISA. shows the results.
  • (G) MHT1809 showed stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • (H) MHT1810 showed stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • Figure 6-5 shows anti-TROP2 mask antibody loaded with His cluster and human TROP2 antigen neutral pH condition (pH 7.5, solid line), reaction condition with MMP1 (dashed line in (I)), acidic pH condition ( The results of ELISA evaluation of interactions at pH 6.5, dashed line in (J)) or at acidic pH conditions (pH 5.5, dashed line) are shown.
  • MHT1811 having a His cluster and an MMP substrate mounted on the linker exhibited stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions. It also showed strong binding activity under the condition of reacting with MMP1 (broken line).
  • MHT1806 showed stronger binding activity under acidic pH conditions (dashed line) of pH 6.5 or lower than under neutral pH conditions.
  • FIG. 6-6 shows the His cluster-loaded anti-TROP2 mask antibody and human TROP2 antigen under neutral pH conditions (pH 7.5, solid line), acidic pH conditions (pH 6.0, dashed line) or acidic pH conditions (pH 5.5). , dotted line) shows the results of evaluating the interaction by ELISA.
  • K MHT1808 showed stronger binding activity under acidic pH conditions of pH 6.0 or lower (dashed line) than under neutral pH conditions.
  • Figure 7 shows the binding activity of MHT1808, MHT1817, MHT1818, MHT1819 at pH 7.5 (black), pH 6.5 (grey) and pH 6.0 (white).
  • Figure 8-1 shows (A) the interaction between the known anti-CD98 antibody hM23H1L1 described in WO2015/146132 and human CD98 antigen, and (B) the interaction between the known anti-EGFR antibody Cetuximab and human EGFR evaluated by ELISA. The results are shown for each. The antibody bound to the antigen in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 8-2 shows (C) the results of evaluating the interaction between the known anti-GPRC5D antibody C3022 described in WO2018/147245 and the human GPRC5D antigen by ELISA. The antibody bound to the antigen in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 8-1 shows (A) the interaction between the known anti-CD98 antibody hM23H1L1 described in WO2015/146132 and human CD98 antigen, and (B) the interaction between the known anti-EGFR antibody Cetuximab and human EGFR evaluated by ELISA. The results are shown for each. The antibody bound to the antigen in a concentration-dependent
  • FIG. 9-1 shows (A) types of peptide libraries and (B) the output/input ratio when the enrichment degree of peptide binders after panning against the anti-CD98 antibody hM23H1L1 was evaluated by pull-down experiments.
  • the target antibody value was higher than that of human serum-derived IgG (IgG mixture), suggesting the concentration of target antibody-specific peptides.
  • FIG. 9-2 shows the degree of enrichment of peptide binders after panning against (C) the anti-EGFR antibody Cetuximab or (D) the anti-GPRC5D antibody C3022 using a peptide library (A) in a pull-down experiment. It shows the actual output/input ratio.
  • FIG. 10-1 shows the interaction of (A) the anti-CD98 masked antibody MhM8001 with a common pH-responsive linker and human CD98 antigen, and (B) the interaction of the anti-EGFR masked antibody MCE-2101 with human EGFR by ELISA. , the results of evaluation are shown respectively. Binding was evaluated under neutral pH conditions (pH 7.5, solid line) or acidic pH conditions (pH 5.5, dotted line). All antibodies showed stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • FIG. 10-1 shows the interaction of (A) the anti-CD98 masked antibody MhM8001 with a common pH-responsive linker and human CD98 antigen, and (B) the interaction of the anti-EGFR masked antibody MCE-2101 with human EGFR by ELISA. , the results of evaluation are shown respectively. Binding was evaluated under neutral pH conditions (pH 7.5, solid line) or acidic pH conditions (pH 5.5, dotted line). All antibodies showed stronger binding activity under
  • FIG. 10-2 shows the results of ELISA evaluation of the interaction between (C) anti-GPRC5D masked antibody MC3-9001 loaded with a common pH-responsive linker and human GPRC5D antigen. Binding was evaluated under neutral pH conditions (pH 7.5, solid line) or acidic pH conditions (pH 5.5, dotted line). All antibodies showed stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • FIG. 11 shows the results of an ELISA evaluation of the interaction between the anti-TROP2 mask antibody and the human TROP2 antigen. Binding was evaluated under neutral pH conditions (pH 7.5, black symbols) or acidic pH conditions (pH 5.5, open symbols). MHT1808 (filled and open circles) showed stronger binding activity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • FIG. 12 shows the N297 sugar chain of the sugar chain-modified antibody (MSG1-type sugar chain (WO2019/065964) in which an azide group is introduced to the sialic acid at the non-reducing end).
  • Figure 13 shows (A) the results of evaluating the binding activity to the human CD98 antigen of hM23-M1 in which a point mutation was introduced into the CDR1 in the hM23H1L1 heavy chain variable region by SPR (Surface plasma resonance), and (B) MhM1013.
  • FIG. 2 shows the results of evaluating the binding activity of mutated MhM1013-M1 to human CD98 antigen by ELISA.
  • MhM1013-M1 (gray) showed a masking effect equal to or greater than that of MhM1013 (black).
  • FIG. 14 shows the results of evaluating the interaction between the anti-CD98 mask antibody and the human CD98 antigen by ELISA. Binding was evaluated under neutral pH conditions (pH 7.5, black symbols) or acidic pH conditions (pH 5.5, open symbols).
  • MhM1018-M1 filled and open circles
  • MhM1024-M1 (filled squares and open squares) showed stronger binding activity at acidic pH conditions than at neutral pH conditions.
  • Figure 15-2 shows pH 7.4 (white circles, gray solid line), pH 6.5 (squares, gray dotted line), pH 6.0 (black circles, black dotted line), pH 5.5 (black squares, black solid line) of mask antibody ADC.
  • HT1-11 Full-length H chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) HT1-11 full-length L chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) MHT1001 full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) MHT1002 full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) HT1-11-scFv-HL full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) HT1-11-scFv-LH full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) MHT1007 full-length H chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) MHT1008 H chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) MHT1009 full-length H chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) MHT1803 H chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) MHT1804 full-length H chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) MHT1805 H chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) MHT1806 full-length H chain
  • FIG. 56-1 shows the results of evaluating the interaction between anti-CD98 mask antibody and human CD98 antigen by ELISA.
  • A) and (B) show the binding activities of MhM1026-M1 (black circle), MhM1028-M1 (black square), MhM1042-M1 (circle), and MhM1043-M1 (square) under conditions of pH 7.5 and pH 5.5. each shown.
  • FIG. 56-2 shows the results of evaluating the interaction between anti-CD98 mask antibody and human CD98 antigen by ELISA.
  • (C) and (D) show the binding activities of MhM1026-M1 (black circle), MhM1044-M1 (black square), MhM1045-M1 (circle), and MhM1046-M1 (square) under conditions of pH 7.5 and pH 5.5. each shown.
  • MhM1026-M1 L chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 68) MhM1028-M1 L chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 69) MhM1042-M1 L chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 70) MhM1043-M1 L chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 71) MhM1044-M1 L chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 72) MhM1045-M1 L chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 73) MhM1046-M1 L chain full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 74) Amino acid sequence of the second peptide (SEQ ID NO: 75-81)
  • DXd means "N-[(1S,9S)-9-Ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3′,4′:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-2-hydroxyacetamide”.
  • PBD in the present invention means "pyrrolobenzodiazepine”.
  • a “mimotope” means a "peptide that binds to the complementarity determining region (CDR) of an antibody".
  • the amino acid sequence of the mimotope has the characteristic that it does not necessarily match the amino acid sequence (epitope) of the antigen recognized by the antibody (Molecular Immunology.; 23(7):709-715 (1986)).
  • amino acid refers to natural amino acids and non-natural amino acids.
  • Natural amino acids are the 20 common amino acids, pyrrolidine and selenocysteine.
  • the twenty common amino acids are alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine.
  • unnatural amino acid refers to an amino acid that is not one of the 20 common amino acids, pyrrolidine or selenocysteine.
  • Other terms that may be used synonymously with unnatural amino acid are "non-naturally encoded amino acid,” “unnatural amino acid,” “non-naturally occurring amino acid,” and the like.
  • Unnatural amino acids include amino acids that occur naturally by modification of naturally occurring amino acids but are not themselves incorporated into a growing polypeptide chain by a translation complex.
  • unnatural amino acids include, but are not limited to, amino acids that are not naturally occurring and can be obtained synthetically or by modification of naturally occurring amino acids.
  • antibody is used to mean an immunoglobulin having a constant region and a variable region. Antibodies are not particularly limited, whether they are naturally occurring immunoglobulins or partially or wholly synthetically produced immunoglobulins.
  • the basic four-chain antibody structure consists of two identical light chains (L chains) and two identical heavy chains (H chains).
  • a light chain is attached to a heavy chain by one covalent disulfide bond.
  • the two heavy chains are held together by one or more disulfide bonds depending on the heavy chain isotype.
  • Each light and heavy chain has regularly spaced intrachain disulfide bonds.
  • Heavy and light chains have a constant region with very high amino acid sequence similarity and a variable region with low amino acid sequence similarity.
  • Light chains have at the amino terminus a variable region (VL) followed by a constant region (CL).
  • the heavy chain has at the amino terminus a variable region (VH) followed by three constant regions (CH1/CH2/CH3).
  • VL and VH are paired and CL is aligned with the first constant region (CH1) of the heavy chain.
  • VL and VH pair to form a single antigen-binding site.
  • the constant region of the antibody of the present invention is not particularly limited, but the constant region of a human antibody is preferably used as the antibody of the present invention for treating or preventing human diseases.
  • Heavy chain constant regions of human antibodies include, for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, and C ⁇ .
  • Light chain constant regions of human antibodies include, for example, C ⁇ and C ⁇ .
  • a Fab consists of a heavy chain VH followed by CH1, and a light chain VL followed by CL.
  • VH and VL contain complementarity determining regions (CDRs).
  • CDRs complementarity determining regions
  • Fc (also referred to as Fc region) is the carboxyl-terminal region of the heavy chain constant region, comprising CH2 and CH3, and is a dimer.
  • the Fc of the present invention may be a natural (wild-type) sequence Fc or a mutant Fc in which the natural sequence is mutated (referred to as "mutant Fc").
  • a preferred Fc region is a variant Fc, more preferably a set of Fc's capable of forming heterodimers.
  • a combination of Fc (i) contained in the first polypeptide and Fc (ii) contained in the second polypeptide, which will be described later, can be mentioned. dimer formation), it is not limited to them.
  • the variant Fc disclosed in WO2013/063702, modified Fc region contained in a heteromultimer having improved stability (including heterodimeric Fc region), disclosed in WO96/27011, Fc comprising the CH3 region of an immunoglobulin derived from an IgG antibody having "protrusions" and "cavities” contained in heterologous multimers, one or more amino acid residues to charged amino acids disclosed in WO2009/089004 Fc containing CH3 domains contained in heterodimers that are electrostatically favored by replacement, heterologous using conformational and/or pI (isoelectric point) mutations as disclosed in WO 2014/110601 Heterodimeric Fc region contained in the dimer, comprising a CH3 domain containing modifications that eliminate or reduce binding to protein A disclosed in WO2010/151792, heterodimeric Fc etc. are exemplified but not limited to these.
  • variable region consists of regions of extreme variability, called hypervariable regions (HVR), and relatively invariant regions, called framework regions (FR), separated by these regions.
  • HVR hypervariable regions
  • FR framework regions
  • Natural heavy and light chain variable regions comprise four FRs joined by three hypervariable regions, each chain's hypervariable region being held in close proximity with the other chain's hypervariable region by the FRs; It contributes to the formation of the antigen-binding site of antibodies.
  • CDRs Complementarity Determining Regions
  • Complementarity-determining regions also called hypervariable regions
  • CDRH1, CDRH2, and CDRH3 from the amino terminal side of the heavy chain amino acid sequence
  • the light chain complementarity determining region is denoted as light chain amino acid sequence.
  • CDRL1, CDRL2 and CDRL3 are designated from the amino terminal side of the sequence.
  • the positions and lengths of the CDRs were determined according to the IMGT definition (Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77).
  • FR is the part other than the CDRs of the variable region.
  • a variable region generally has four FRs, FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • the CDRs and FRs contained in the heavy and light chains are, from amino-terminus to carboxyl-terminus, FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 and FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3- FRL4, and so on.
  • CDRs and FRs can also be determined by various definitions known in the art, such as Kabat, Chothia, AbM, contact, etc., in addition to IMGT.
  • the "site" to which an antibody binds that is, the "site” recognized by an antibody means a partial peptide or partial conformation on an antigen that is bound or recognized by an antibody.
  • mutant antibody refers to an amino acid that is substituted, deleted, or added (addition includes insertion) (hereinafter collectively referred to as "mutation") in the amino acid sequence of the original antibody.
  • the number of mutated amino acids in such mutated antibodies is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40 or 50 or less.
  • Such mutant antibodies are also included in the "antibody” of the present invention.
  • molecules are molecules that include the above-described antibodies and antigen-binding fragments of antibodies, and also include molecules that are multispecific and formed from antibodies or multiple antigen-binding fragments derived from them.
  • a carries B means "A contains B” or "B is bound, added or fused to A".
  • a "substrate-loaded antibody” can be interpreted as an "substrate-containing antibody,” a “substrate-bound antibody,” a “substrate-attached antibody,” or a “substrate-fused antibody.”
  • the present invention is molecules that bind to target antigens, the molecules that specifically bind to said target antigen in a particular environment.
  • a specific environment refers to the environment in a specific tissue or intracellular organelle, such as the cancer microenvironment, the environment in endosomes, or the environment in lysosomes.
  • a cancer microenvironment is an environment within a cancer tissue, for example, an environment with an acidic pH or an environment in which proteases are present. While the pH in normal tissue is neutral, for example, pH 7.0 to 7.5, the pH in cancer tissue is 7.0 or less, preferably 6.5 or less, more preferably 6.0. It is below.
  • a molecule that binds to the target antigen of the present invention acquires responsiveness in a specific environment, so it is sometimes called an environment-responsive molecule, and when the molecule is an antibody, it is called an environment-responsive mask antibody.
  • the target antigen-binding molecule of the present invention comprises a target antigen-binding portion ([a] portion), a first peptide ([b] portion) that recognizes the target antigen-binding site contained in the portion, and pH7 a second peptide (part [c]) comprising an amino acid sequence containing amino acids whose charge changes from uncharged to positively charged in response to a change in pH from neutral to acidic conditions in the range of .5 or less; Preferably they are present in a directly or indirectly linked state.
  • "indirectly linked state” refers to a state of linked via a linker or the like.
  • the portion that binds the target antigen is preferably a polypeptide.
  • the portion binds to the target antigen through an antigen-antibody reaction or protein (eg, receptor)-ligand binding.
  • the portion that binds to the target antigen is more preferably an antibody or an antigen-binding fragment of an antibody that binds to the target antigen through an antigen-antibody reaction.
  • the first peptide masks the target antigen binding site by binding to the target antigen binding site in the portion that binds the target antigen. As a result, the target antigen binding site is unable or difficult to bind the target antigen.
  • the number of [a] portion, [b] portion and [c] portion contained in the molecule that binds to the target antigen of the present invention is not particularly limited. It is preferable to include one or two or more, including one or more of [a] part, [b] part and [c] part, respectively, [a] part, [b] part and [c] part It is more preferable that each number is the same as each other, and it is further preferable that two each of [a] part, [b] part and [c] part are included.
  • FIG. 1 shows an example of the format of a mask antibody that is activated in response to pH change as the concept of the present invention, but the present invention is not limited to this.
  • the part that binds to the target antigen is a bivalent antibody (IgG), and the second peptide is a peptide containing a cluster of histidine residues exhibiting pH responsiveness (histidine cluster (His cluster), black square part in FIG. 1). , and the first peptide indicated by the grid pattern in FIG. 1 binds to and masks the antigen-binding site of the antibody.
  • the second peptide connects the first peptide and the portion that binds to the target antigen, and exhibits pH responsiveness, so it is also called a pH-responsive linker.
  • the first peptide can recognize and bind to the target antigen-binding site, but when the second peptide is cleaved and the first peptide exists alone, it binds and dissociates depending on physicochemical conditions, so it does not bind permanently. It is considered that it is not possible to For example, in the molecule that binds to the target antigen of the present invention, the first peptide binds to the portion that binds to the target antigen via the second peptide.
  • the first peptide adopts a conformation such that the position is located near the target antigen-binding site contained in the portion that binds to the target antigen, and the first peptide is in the target antigen-binding site under equilibrium conditions unless the conformation of the molecule is changed. It can be assumed that the mechanism of action is largely masked (Fig. 1, left), but such mechanism is not limited to this. Histidine residues inside the His cluster of the second peptide are positively charged under acidic pH conditions, and the repulsive force between the histidine residues induces a structural change in the second peptide, which is a linker, and the first peptide binds to the target antigen.
  • the first peptide can no longer continue to bind to the target antigen binding site (Fig. 1 right, "+" in the figure indicates positively charged), and as a result,
  • the target antigen-binding site contained in the portion that binds to the target antigen becomes capable of binding to the target antigen, and the binding affinity to the target antigen is higher than before the structural change of the second peptide is induced. It is thought that it will come to have sexuality. That is, a molecule that binds to a target antigen of the present invention will be able to bind to the target antigen with higher affinity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • Such structural change of the second peptide due to repulsive force between histidine residues is a reversible phenomenon caused by pH change. Therefore, when a molecule that binds to a target antigen shifts from acidic pH conditions to neutral pH conditions, the structural change is opposite to the structural change that occurs when the neutral pH conditions shift to the acidic pH conditions. is induced, and binding of the first peptide to the target antigen-binding site reduces the affinity of the molecule that binds to the target antigen for the target antigen. It can be speculated that the molecule that binds to the target antigen of the present invention can exert its effect mainly through the mechanism as described above, but such mechanism is not limited thereto, and by other mechanisms or in combination with other mechanisms. At the same time, the effect may be exhibited.
  • the phrase "binds to a target antigen with a higher affinity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions” means that a molecule that binds to a target antigen under neutral pH conditions can be expressed as making the affinity of the target antigen weaker than at acidic pH conditions. That is, in the present invention, the difference between the affinity of a molecule that binds to a target antigen for the target antigen under acidic pH conditions and the affinity for the target antigen under neutral pH conditions may be increased (for example, as described below, The value of the EC50 ratio (neutral pH condition/acid pH condition) should be increased).
  • the affinity for the target antigen under acidic pH conditions may have a higher affinity, a lower affinity for the target antigen at neutral pH conditions, or both.
  • the linker portion is configured to have pH responsiveness.
  • a configuration in which the mask peptide portion (the first peptide in the present invention) is pH-responsive is also conceivable. need to get
  • the linker portion having a common sequence motif (basic amino acid cluster) of the second peptide in the configuration of the present invention can be used universally in portions that bind to different target antigens, and can bind to target antigens. There is an advantageous effect that it is not necessary to obtain a pH-responsive peptide with a different sequence for each portion to be processed.
  • a molecule that binds to a target antigen binds with a higher affinity to the target antigen under acidic pH conditions than under neutral pH conditions, so that the molecule that binds to the target antigen becomes an antigen in normal tissues. can prevent it from binding to and reduce its toxicity.
  • “Reducing toxicity” means reducing unwanted effects other than the expected efficacy when a molecule that binds to a target antigen is administered to animals such as humans, mice, rats, monkeys, rabbits, and dogs. say.
  • toxicity includes death/moribundity, weight loss, organ toxicity (skin, liver, etc.) after drug administration. Whether or not the toxicity is "reduced” can be determined using methods known to those skilled in the art, such as measurement of the subject's body weight and confirmation of pathological data after administration of molecules that bind to the target antigen.
  • a molecule that binds to a target antigen binds with higher affinity to the target antigen under acidic pH conditions than under neutral pH conditions, thereby suppressing binding to antigens expressed in normal tissues. It is speculated that its blood concentration can be improved. "Improving blood concentration” means the concentration when the molecule that binds to the target antigen is administered to animals such as humans, mice, rats, monkeys, rabbits, and dogs, and the blood concentration reaches the maximum value. (Cmax) is increased and the time to disappear from the blood is prolonged.
  • a molecule that binds to a target antigen in the blood may or may not have a masked portion that binds to the target antigen, and acts as a molecule that binds to the target antigen in a specific environment.
  • Whether or not the "blood concentration is improved" is, for example, whether the concentration (Cmax) at which the blood concentration reaches the maximum value after administration of the molecule that binds to the target antigen has increased, or It is possible to determine whether or not the time from administration of the molecule that binds to the target antigen to disappearance from the blood is prolonged. Alternatively, parameters such as plasma half-life, mean plasma residence time, plasma clearance, etc. of the molecule that binds to the target antigen can be measured using methods known to those skilled in the art.
  • the affinity for the target antigen at acidic pH is stronger than the affinity for the target antigen at neutral pH
  • the affinity for the target antigen at acidic pH and the affinity for the target antigen at neutral pH may be increased.
  • the difference is not particularly limited, for example, one having a large EC 50 ratio (neutral pH condition/acid pH condition) is a preferred embodiment.
  • EC50 is the 50% effective concentration or half effective concentration, and refers to the concentration at which a molecule such as a drug or antibody exhibits 50% of the maximal response from the lowest value.
  • the EC50 ratio (neutral pH conditions/acidic pH conditions) is the ratio of the EC50 of a molecule that binds to a target antigen at neutral pH conditions to the EC50 of a molecule that binds to a target antigen at acidic pH conditions. . Therefore, the larger the EC50 ratio (neutral pH condition/acidic pH condition) of the molecule that binds to the target antigen, i.e., the smaller the EC50 at acidic pH conditions than the EC50 at neutral pH conditions. The higher the affinity of the molecule for the target antigen at acidic pH compared to neutral pH.
  • the affinity of the molecule for the target antigen at acidic pH is low compared to neutral pH.
  • the value of the EC50 ratio (neutral pH conditions/acidic pH conditions) of the molecule that binds to the target antigen is preferably 3 or more, and more preferably the EC50 ratio (neutral pH conditions/acidic pH conditions) is It is 10 or more, and more preferably has an EC 50 ratio (neutral pH condition/acid pH condition) of 30 or more.
  • the upper limit of the value of the EC50 ratio (neutral pH condition/acidic pH condition) is not particularly limited, and may be any value such as 100, 400, 1000, 10000, etc., as long as it can be produced by a person skilled in the art. That is, the EC50 ratio (neutral pH condition/acidic pH condition) of the molecule that binds to the target antigen is preferably 3 or more and 100 or less, 3 or more and 400 or less, 3 or more and 1000 or less, or 3 or more and 10000 or less. , 10 to 100, 10 to 400, 10 to 1000 or 10 to 10000, more preferably 30 to 100, 30 to 400, 30 to 1000 or 30 to 10000 More preferred.
  • KD dissociation constant
  • affinity value for the target antigen
  • apparent KD apparent dissociation constant
  • dissociation constant can be used.
  • KD (dissociation constant) and apparent KD (apparent dissociation constant) can be measured by methods known to those skilled in the art, for example, Biacore (GE healthcare), ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FACS etc. can be used.
  • Antibodies of the present invention include non-human animal-derived antibodies (non-human animal antibodies), human antibodies, chimerized antibodies (also referred to as "chimeric antibodies"), humanized antibodies, etc., preferably human antibodies. Alternatively, humanized antibodies can be used.
  • the scope of the antibodies of the present invention also includes antibody variants (“variant antibodies” described below). For example, the scope of human antibodies includes human variant antibodies, and the scope of humanized antibodies includes human Also included are mutated antibodies.
  • non-human animal antibodies include antibodies derived from vertebrates such as mammals and birds.
  • Antibodies derived from mammals include antibodies derived from rodents such as mouse antibodies and rat antibodies, and antibodies derived from camels.
  • Examples of antibodies derived from birds include chicken antibodies.
  • chimerized antibodies include, but are not limited to, antibodies formed by combining variable regions derived from non-human animal antibodies and human antibody (human immunoglobulin) constant regions.
  • Humanized antibodies include those in which the CDRs in the variable regions of non-human animal antibodies are grafted into human antibodies (variable regions of human immunoglobulins), and in addition to the CDRs, the sequences of the framework regions of non-human animal antibodies are also partly human antibodies. and those in which one or more amino acids from any of these non-human animal antibodies are replaced with human amino acids, and the like, but are not limited thereto.
  • Antibodies can be produced by various known methods. As well-known methods, it can be produced by a method using a hybridoma, a cell immunization method, or the like, and can be produced by a genetic recombination technique. Also known is a method for obtaining phage-display-derived human antibodies selected from a human antibody library. For example, a phage display method can be used in which variable regions of human antibodies are expressed as scFv on the surface of phages and phages that bind to the antigen are selected. By analyzing the genes of phages selected for binding antigen, the DNA sequences encoding the variable regions of human antibodies that bind antigen can be determined.
  • a human antibody can be obtained by constructing an expression vector having the sequence and introducing it into an appropriate host for expression (WO1992/01047, WO1992). /20791, WO1993/06213, WO1993/11236, WO1993/19172, WO1995/01438, WO1995/15388, Annu.Rev.Immunol (1994) 12, 433-455).
  • human antibodies are obtained by a method using human antibody-producing mice having human genomic DNA fragments containing human antibody heavy chain and light chain genes (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133). Kuroiwa, Y.
  • constant regions of human therapeutic or prophylactic antibodies those of human antibodies are preferably used.
  • Heavy chain constant regions of human antibodies include, for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, and C ⁇ .
  • Light chain constant regions of human antibodies include, for example, C ⁇ and C ⁇ .
  • An antigen-binding fragment of an antibody means a partial fragment of an antibody composed of a heavy chain variable region and a light chain variable region and having antigen-binding activity.
  • Antigen-binding fragments of antibodies include, but are not limited to, antigen-binding fragments such as Fab, F(ab') 2 , scFv, Fab', Fv, and single-domain antibody (sdAb). not a thing Antigen-binding fragments of such antibodies include those obtained by treating full-length antibody proteins with enzymes such as papain and pepsin, as well as recombinant proteins produced in appropriate host cells using recombinant genes. There may be.
  • Variants of antibodies or antigen-binding fragments thereof preferably have reduced susceptibility to protein degradation or oxidation, maintenance, improvement, reduction, or change in biological activity or function. Suppression, improvement or regulation of antigen-binding ability, conferment of physicochemical or functional properties, or the like can be achieved. Proteins are known to change their function and activity by changing specific amino acid side chains on their surface. Examples include deamidation of asparagine side chains and Isomerization etc. are included. Alternative amino acid substitutions to prevent such amino acid side chain changes are also included within the scope of the variants of the present invention.
  • variants of the present invention include antibodies or antigen-binding fragments thereof having amino acid sequences in which conservative amino acid substitutions are made in the amino acid sequence of antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • Conservative amino acid substitutions are substitutions that occur within a group of amino acids that are related in their amino acid side chains.
  • the negative logarithms of the dissociation constants of groups other than the ⁇ -position amino group and the ⁇ -position carboxy group in amino acids having an acidic functional group or a basic functional group in the side chain are arginine: 12.48, asparagine acid: 3.65, cysteine: 8.18, glutamic acid: 4.25, histidine: 6.00, lysine: 10.53, tyrosine 10.07 (DR Lide, Handbook of Chemistry and Physics, 72nd Edition, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991.).
  • Modified Antibodies or Binding Fragments, Conjugates The present invention provides modified antibodies or binding fragments thereof.
  • a modified antibody of the present invention or a binding fragment thereof means one obtained by chemically or biologically modifying the antibody of the present invention or a binding fragment thereof.
  • Chemical modifications include attachment of chemical moieties to the amino acid backbone, chemical modifications of N-linked or O-linked carbohydrate chains, and the like.
  • Biological modifications include post-translational modifications (e.g., glycosylation at N- or O-linkages, glycosylation remodeling, amino- or carboxyl-terminal region processing, deamidation, aspartic acid isomerization, oxidation of methionine), and those with a methionine residue added to the amino terminus by expression using a prokaryotic host cell.
  • post-translational modifications e.g., glycosylation at N- or O-linkages, glycosylation remodeling, amino- or carboxyl-terminal region processing, deamidation, aspartic acid isomerization, oxidation of methionine
  • those with a methionine residue added to the amino terminus by expression using a prokaryotic host cell.
  • those labeled to enable detection or isolation of the antibody or antigen of the present invention such as enzyme labels, fluorescent labels, and affinity labels, are also included in the meaning of such modifications.
  • modifications of the antibody or binding fragment thereof of the present invention can improve the
  • Examples of chemical moieties included in chemical modifications include water-soluble polymers such as polyethylene glycol (PEG), ethylene glycol/propylene glycol copolymer, carboxymethylcellulose, dextran, and polyvinyl alcohol.
  • biological modifications include those modified by enzymatic or cell treatments, fusions to which other peptides such as tags are added by genetic recombination, and endogenous or exogenous glycosylation enzymes. and those prepared by using cells expressing as a host.
  • Such modifications may be made at any position or desired position in the antibody or binding fragment thereof, and the same or two or more different modifications may be made at one or more positions.
  • heavy chain sequence deletions or heavy or light chain sequence modifications have little effect on antibody antigen-binding ability and effector functions (such as complement activation and antibody-dependent cytotoxicity). does not affect, and preferably does not significantly affect.
  • the present invention also includes the deleted or modified antibody.
  • a deletion in which one or two amino acids are deleted at the heavy chain carboxyl terminus Journal of Chromatography A; 705; 129-134 (1995)
  • two amino acid residues of glycine and lysine at the heavy chain carboxyl terminus are deleted.
  • the two or more chains are heavy chains selected from the group consisting of full-length and truncated forms described above. Any one of these may be used, or any two of them may be used in combination.
  • the amount ratio or molecular number ratio of each deletion can be affected by the type and culture conditions of cultured mammalian cells that produce the antibody of the present invention. at least one of, preferably both of, one, two or several amino acid residues at the carboxyl terminus are deleted.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof may contain 1 to several molecules derived from an expression vector and/or a signal sequence or the like. Even if one amino acid is added to the amino terminus and/or the carboxyl terminus (and some or all of them are modified as described above), the desired antigen-binding activity of the antibody of the present invention is maintained. Included within the scope of modifications or modifications of antigen-binding fragments thereof, molecules comprising such modifications of antibodies or antigen-binding fragments are also encompassed within the scope of the molecules of the present invention.
  • the term "antibody or its binding fragment” also includes “modified antibody or its antigen-binding fragment”.
  • the "antibody or antigen-binding fragment thereof” included in the molecules, multispecific molecules, bispecific molecules, etc. of the present invention includes such "modified antibody or antigen-binding fragment thereof” in its meaning. .
  • Antibody-dependent cytotoxicity can also be enhanced by modulating carbohydrate modifications (glycosylation, defucosylation, etc.) attached to the antibodies of the present invention.
  • International Patent Publication Nos. WO1999/54342, WO2000/61739, WO2002/31140, WO2007/133855 and the like are known as techniques for regulating glycosylation of antibodies, but are not limited thereto.
  • a target antigen refers to a molecule associated with a specific disease.
  • a molecule associated with a specific disease refers to a molecule that is expressed or whose expression is enhanced in abnormal cells that appear in a disease caused by an antigen or molecule that is the cause of the disease. .
  • the abnormal cells are preferably tumor cells or stromal cells, and the target antigen is a tumor antigen for tumor cells and a molecule expressed on stromal cells for stromal cells. Stromal cells interact with tumor cells and play a major role in cancer growth and progression.
  • a tumor antigen is an antigen expressed on tumor cells or an antigen expressed on tumor cells in which normal cells have become cancerous. , damage tumor cells, or cause tumor cell death (apoptosis or necrosis).
  • anti-CD98 antibodies JP-A-2017-114763, WO2007/114496, WO2008/017828, WO2009/043922, WO2009/090553, JP-A-2012-092068, WO2011, and /118804 and WO2013/078377, etc.
  • anti-TROP2 antibody Linnenbach AJ et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 86(1), pp27 31 (1989), WO2008/144891 , WO2011/145744, WO2011/155579, WO2013/077458, WO2003/074566, WO2011/068845, WO2013/068946, US7999083 and WO2015/098099.
  • panitumumab panitumumab, nimotuzumab , cetuximab, ametumumab (SY-101), SYN-004, SCT-200, tomuzotuximab, GC-1118, GR-1401, depatuxizumab (ABT-806), serclutamab, AMG595 and matuzumab
  • Anti-EGFR antibody such as anti-GPRC5D antibody ( described in WO2018/147245, WO2016/090329, etc.) and the like.
  • Portions that bind target antigens of the invention may be derived from or comprise these antibodies.
  • FAP fibroblast activation protein
  • the portion that binds to the target antigen preferably comprises an amino acid sequence that is not contained in the first peptide and the second peptide, more preferably a polypeptide consisting of said amino acid sequence.
  • the target antigen and the portion that binds to the target antigen may be an antigen and an antibody that binds to the antigen or an antigen-binding fragment of an antibody, but is not limited to a combination thereof, and is not limited to a ligand and a ligand that binds to the ligand.
  • a receptor or vice versa
  • a cytokine and a receptor to which the cytokine binds can be exemplified.
  • molecules other than antibodies and the like include non-immunoglobulin proteins that bind to target antigens, nucleic acid molecules such as nucleic acid aptamers, and low-molecular-weight compounds.
  • the first peptide that recognizes the target antigen binding site contained in the portion that binds to the target antigen is the target antigen binding site By recognizing , it is a peptide that masks the site and renders the portion that binds to the target antigen unable to bind to the target antigen, makes it difficult to bind, or inhibits or interferes with the binding.
  • the portion that binds to the target antigen is an antibody or an antigen-binding fragment of an antibody (hereinafter referred to as "an antibody or the like")
  • the first peptide is a peptide that binds to the antigen-binding region of the antibody or the like.
  • Antigen-binding regions of antibodies and the like exist in variable regions of antibodies and the like, particularly in complementarity determining regions (CDRs).
  • CDRs complementarity determining regions
  • Antibodies and the like bind to an epitope (antigenic determinant) of an antigen, so the first peptide is a peptide that mimics the epitope.
  • a peptide mimicking an epitope of an antigen is called a mimotope, and in the present invention, the first peptide is preferably a mimotope that binds to a CDR.
  • a mimotope is a peptide consisting of 6 to 30, preferably 10 to 20, more preferably 13 to 17 and particularly preferably 15 amino acids.
  • mimotopes are included in the portion that binds to the target antigen by preparing various display libraries (phage display, ribosome display, nucleic acid display, bacterial display, etc.) consisting of the above number of amino acids and screening by panning.
  • display libraries phage display, ribosome display, nucleic acid display, bacterial display, etc.
  • a phage particle displaying a peptide that recognizes the target antigen-binding site is selected, and DNA encoding the mimotope and its nucleotide sequence can be obtained from the phage particle and produced.
  • the peptide is a mimotope (binds to the CDRs of the antibody) can be confirmed by crystallizing the mask antibody and performing X-ray crystal structure analysis. Moreover, if it can be confirmed by SPR or the like that the peptide competitively binds to the antigen with respect to the antibody, it is strongly suggested that the peptide is a mimotope that binds to the CDR of the antibody (see Example 4).
  • the portion that binds to the target antigen may be a molecule other than an antibody or an antigen-binding fragment of an antibody (hereinafter referred to as "antibody etc.”).
  • antibody an antigen-binding fragment of an antibody
  • the target antigen is a cytokine
  • a peptide recognizing the cytokine binding site contained in the receptor to which the cytokine binds, respectively. can be exemplified.
  • the first peptide is a peptide that recognizes the target antigen site contained in the protein, and if the portion that binds to the target antigen is a nucleic acid molecule, the first peptide is It is a peptide that recognizes the target antigen site contained in the nucleic acid molecule, and when the portion that binds to the target antigen is a low-molecular compound, the first peptide is a peptide that recognizes the target antigen site contained in the low-molecular-weight compound.
  • the second peptide contains an amino acid whose charge changes from uncharged to positive as the pH changes from neutral to acidic conditions within the range of pH 7.5 or less, and is acidic. Under pH conditions, the amino acid residue becomes positively charged and induces a conformational change in the linker.
  • the "range of pH 7.5 or less” means pH 1.0 or more and 7.5 or less, pH 2.0 or more and pH 7.5 or less, pH 3.0 or more and pH 7.5 or less, pH 4.0 or more and pH 7.5 or less, pH 5. 0 or more and pH 7.5 or less, pH 6.0 or more and pH 7.5 or less, and pH 7.0 or more and 7.5 or less.
  • the "range of pH 7.5 or less” does not have to be the entire range of pH 7.5 or less (although it may be the entire range), and any range that is completely included in the range of pH 7.5 or less. It means that the charge changes from no charge to positive charge accordingly. For example, when the pH is in the range of 5.5 to 7.5, the case where the charge of the amino acid changes as the pH changes from neutral to acidic conditions is included in the "range of pH 7.5 or less". Needless to say. Furthermore, if the charge of the amino acid changes as the pH changes from neutral to acidic conditions in the pH range of 4.5 to 6.5, then the range of 4.5 to 6.5 is 7.5 Since it is completely included in the following range, it corresponds to "the range of pH 7.5 or less".
  • neutral pH condition refers to a condition at a pH of about 7, for example, a condition of pH 7.0 or more and 7.5 or less.
  • Acidic pH conditions refer to conditions under which the pH is less than 7, for example, conditions under which the pH is less than 7.0, preferably 6.5 or less, and more preferably 6.0 or less.
  • the lower limit of the acidic pH condition is not particularly limited, and may be any lower value such as 1.0, 2, 0, 3.0, etc., as long as it is achievable in the art of those skilled in the art. That is, the acidic pH conditions are pH 1.0 to less than 7.0, pH 2.0 to less than 7.0, pH 3.0 to less than 7.0, preferably pH 1.0 to 6.5, pH 2.0 to 6.
  • pH 3.0 or more and 6.5 or less more preferably pH 1.0 or more and 6.0 or less, pH 2.0 or more and 6.0 or less, pH 3.0 or more and 6.0 or less.
  • the charge change in amino acids is a reversible phenomenon caused by pH change
  • the charge changes from uncharged to Amino acids that change to a positive charge are naturally considered to change their charge when the pH changes from "acidic conditions to neutral conditions" within the pH range of 7.5 or lower.
  • Amino acids whose charge changes from uncharged to positive in response to a change in pH from neutral to acidic conditions within the pH range of 7.5 or less may be either natural amino acids or non-natural amino acids.
  • the second peptide is also called pH-responsive linker.
  • the second peptide has a basic functional group with a pKa of 7 or less as an amino acid whose charge changes from uncharged to positive when the pH changes from neutral to acidic conditions in the range of pH 7.5 or less. Including amino acids with side chains.
  • pKa is also called an acid dissociation constant, and is a numerical value in water at 25° C., and is calculated by the method described in Chemical Handbook Basic Edition Revised 5th Edition II-331 to II-343 (edited by The Chemical Society of Japan, Maruzen Publishing Co., Ltd.). be able to.
  • pKa a value known in literature (for example, Rika Chronicle 2013 (desktop edition), Maruzen Publishing Co., Ltd.) can also be used.
  • the pKa is also used as an index that quantitatively represents the strength of a base in basic compounds or basic functional groups. That is, the strength of basicity of the original basic compound can be considered based on the acid strength of a basic compound or a conjugate acid obtained by adding a proton to a basic functional group.
  • the second peptide does not contain negatively charged amino acids under acidic pH conditions. It is presumed that the negative charge of the amino acid under acidic pH conditions neutralizes or weakens the positive charge of the amino acid that is positively charged under acidic pH conditions, thereby preventing the structural change of the linker from being induced. .
  • the amino acid having a negative charge under acidic pH conditions in the present invention is not particularly limited, but when the second peptide is composed of natural amino acids, examples of amino acids having a negative charge under acidic pH conditions include glutamic acid and aspartic acid. be done. That is, the second peptide preferably does not contain glutamic acid and/or aspartic acid.
  • pI value that represents the isoelectric point of the second peptide.
  • pH value also abbreviated as pH(I) or IEP value
  • IEP value pH(I) or IEP value
  • pH value pH(I) or IEP value
  • pI value refers to the calculated pI value, as experimental and calculated pI values can differ slightly. The pI value is determined, for example, by A.P. Sillero and J. M. Ribeiro, Analytical Biochem. , 179(2), 1989, 319-325.
  • the calculated value of the charge under acidic conditions is positive, and the charge under neutral conditions is positive.
  • the pI value is not particularly limited as long as it is larger than the calculated value of electric charge, and the pI value satisfies the condition.
  • the calculated value of the charge of the second peptide under acidic conditions of pH 3.0 or more and 6.5 or less is the second peptide under neutral conditions of pH 7.0 or more and 7.5 or less. It is sufficient if the value is larger than the calculated value of the charge of the peptide.
  • the pI value of the second peptide is preferably 6.4 or higher, more preferably 6.8 or higher, even more preferably 7.2 or higher, and 7.6 or higher. Most preferred.
  • the upper limit of the pI value is not particularly limited, and may be any value such as 12, 13, 14, etc., as long as it can be produced by a person skilled in the art.
  • the pI value of the second peptide is preferably 6.4 or more and 12 or less, 6.4 or more and 13 or less, or 6.4 or more and 14 or less, 6.8 or more and 12 or less, 6.8 or more and 13 or less, or It is more preferably 6.8 or more and 14 or less, more preferably 7.2 or more and 12 or less, 7.2 or more and 13 or less, or 7.2 or more and 14 or less, 7.6 or more and 12 or less, 7.6 Most preferably, it is ⁇ 13 or ⁇ 7.6 and ⁇ 14.
  • the second peptide preferably consists of an amino acid sequence having the following structures (1) and (2).
  • (1) (a) an amino acid sequence consisting of two or more consecutive amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain, or (b) any position of the amino acid sequence of (a) (amino terminal or one or more amino acid sequences in which one arginine or lysine is inserted or added at the carboxyl terminus, and (2) A total of 4 or more amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less on the side chain.
  • amino acid sequence (a) or the amino acid sequence (b) is referred to as a "basic amino acid cluster".
  • An amino acid sequence consisting of amino acids having two or more consecutive basic functional groups with a pKa of 7 or less in the side chain preferably has 2 to 4 consecutive basic functional groups with a pKa of 7 or less in the side chain.
  • the upper limit of the number of "amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain” is not limited, but is preferably 20 or less, more preferably 15 or less, and still more preferably 12 or less.
  • basic amino acid cluster refers to an amino acid sequence consisting of two or more consecutive amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain, and any amino acid sequence.
  • the amino acid type name may be added with the word "cluster”.
  • histidine when histidine is selected as an amino acid having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain, an amino acid sequence consisting of two or more consecutive histidines and any position of the amino acid sequence (amino terminal or An amino acid sequence with one arginine or lysine inserted or added at the carboxyl terminus) is referred to as a "histidine cluster (His cluster)."
  • the amino acid other than the basic amino acid cluster portion is an amino acid other than an amino acid having a basic functional group with a pKa of 7 or less on the side chain, arginine and lysine, and an amino acid having a negative charge under acidic pH conditions.
  • amino acids include glycine, serine, alanine, proline, and threonine as natural amino acids.
  • it is an amino acid sequence composed of glycine and/or serine (so-called GS linker) or an amino acid sequence constituting a protease substrate sequence. 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10 of such amino acids may be included on either or both of the amino terminal side and the carboxyl terminal side of the basic amino acid cluster.
  • histidine is the only amino acid having a basic functional group in the side chain with a pKa of 7 or less.
  • the number of histidine clusters should be counted.
  • the second peptide consists of the amino acid sequence “GGGGSHHGGHHGGHHGGHHGGS” (SEQ ID NO: 42, FIG. 52)
  • it is counted as containing four basic amino acid clusters because it contains four amino acid sequences consisting of two consecutive histidines. be able to.
  • the second peptide consists of the amino acid sequence “GGGGSHHGGHRHGGHHKGGHHGGS” (SEQ ID NO: 43, FIG.
  • two amino acid sequences consisting of two consecutive histidines and two amino acid sequences consisting of two consecutive histidines. Since it contains one amino acid sequence in which arginine is inserted in between and one amino acid sequence in which lysine is added to an amino acid sequence consisting of two consecutive histidines, it can be counted as containing four basic amino acid clusters. .
  • amino acid sequences in which one arginine or lysine is inserted or added at any position (including the amino terminus or carboxyl terminus) of an amino acid sequence consisting of two or more consecutive histidines include HRH, RHH, and HHR.
  • the amino acid having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain is histidine
  • the amino acid represented by H has a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain other than histidine.
  • the basic amino acid cluster in the second peptide has two or more consecutive basic functional groups with a pKa of 7 or less on the side chains in order to increase the affinity of the molecule that binds to the target antigen for the target antigen at acidic pH. It preferably contains an amino acid sequence in which one or more arginines are inserted or added at any position (including the amino terminal or carboxyl terminal) of the amino acid sequence consisting of amino acids having two or more consecutive pKa of 7 or less More preferably, it contains one amino acid sequence in which one arginine is inserted or added at any position (including the amino terminus or carboxyl terminus) of an amino acid sequence consisting of amino acids having a basic functional group on the side chain, "RHHH It is more preferable to include one basic amino acid cluster having an amino acid sequence represented by ".
  • Arginine is an amino acid having a guanidino group, which is a basic functional group, in its side chain, and its pKa is 12.48.
  • Lysine is an amino acid having an amino group, which is a basic functional group, in its side chain, and its pKa is 10.53. Therefore, both amino acids are considered to have positively charged basic functional groups on the side chains even under neutral conditions. Therefore, the arginine or lysine can enhance the structural change of the second peptide in response to pH change.
  • the second peptide containing a basic amino acid cluster to which arginine or lysine is inserted or added induces a structural change even in an environment with mild acidic conditions (e.g., pH 6.5 or more and less than 7.0). It is considered possible.
  • one or more arginines are present at any position (including the amino terminus or carboxyl terminus) of an amino acid sequence consisting of two or more consecutive amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain.
  • the EC 50 ratio neutral pH conditions/acidic pH conditions) of an amino acid sequence that is not inserted or added, and that of an amino acid sequence consisting of two or more consecutive amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less on the side chain.
  • the effect of enhancing pH responsiveness by addition can be quantified. That is, the comparison of the EC50 ratio can be calculated by (the EC50 ratio of the latter)/(the EC50 ratio of the former), and the ratio is preferably 4.0 or more.
  • the pKa of the basic functional group in the amino acid having a basic functional group in its side chain, which is contained in the basic amino acid cluster, is preferably in the range of 5.0 to 7.0, more preferably 5.5 to 6.0. 5 range.
  • the amino acid having a basic functional group on its side chain includes histidine, the basic functional group of which has a pKa of 6.00.
  • the number of basic amino acid clusters contained in the second peptide is not particularly limited as long as the clusters can induce a structural change in the linker by being positively charged under acidic pH conditions, but preferably 1 to 4, and more. It preferably contains 2 to 4, more preferably 3 or 4.
  • the number of amino acids having a basic functional group on the side chain contained in the second peptide is not particularly limited as long as the cluster can induce a structural change in the linker by being positively charged under acidic pH conditions, but is preferably , 10 or less, more preferably 5% or more and 30% or less of the total number of amino acids contained in the amino acid sequence of the second peptide.
  • the second peptide is (a) an amino acid sequence consisting of two or more consecutive amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain, or (b) any position of the amino acid sequence (amino terminal or carboxyl terminal ) contains one or more amino acid sequences in which one arginine or lysine is inserted or added, and (2) a total of four or more amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less on the side chain , the number of amino acids contained in the second peptide is 10 to 60, preferably 12 to 50, more preferably 15 to 40, more preferably 20 to 35.
  • the position of the basic amino acid cluster contained in the second peptide is not particularly limited. That is, when the amino acid sequence of the second peptide contains two or more basic amino acid clusters, (1) only one basic amino acid cluster may be located at the amino terminus or carboxyl terminus of the amino acid sequence, ( 2) one basic amino acid cluster may be located at the amino terminus of the amino acid sequence and another one basic amino acid cluster may be located at the carboxyl terminus of the amino acid sequence; (3) any basic amino acid cluster may not be located at the amino terminus of the amino acid sequence and may not be located at the carboxyl terminus.
  • the second peptide may further serve as a substrate for intracellular or extracellular protease and may contain an amino acid sequence (hereinafter also simply referred to as "substrate") that is cleaved by the protease.
  • substrate an amino acid sequence that is cleaved by intracellular and extracellular proteases
  • the amino acid sequence is oriented from the amino terminus to the carboxyl terminus or from the carboxyl terminus to the amino terminus, and the basic amino acid cluster
  • the amino acid sequence cleaved by internal and external proteases and the amino acid sequence of the portion that binds to the target antigen (part [a]) are linked in this order.
  • the second peptide may contain a structure represented by an amino acid sequence containing an amino acid sequence having alternating amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less on the side chain.
  • the number of amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain is 4-15, preferably 5-12, more preferably 6-10.
  • sequences include, for example, "GGGGGSHGHGHGHGHGHGHGHGHGHGGS" (SEQ ID NO: 44, Figure 52).
  • the acidic pH condition may be in the range of pH 7.5 or less as long as the charge of the amino acid having a basic functional group in the side chain of the second peptide changes. Accordingly, the acidic pH condition is preferably pH 6.5 or less, more preferably pH 6.0 or less, and still more preferably pH 5.5 or less.
  • the portion that binds to the first peptide, the second peptide, and the target antigen may be bound to a linker. That is, any one of the first peptide, the second peptide, and the portion that binds to the target antigen may be bound to one or both of the other two via a linker.
  • the linker is a peptide consisting of 2-30, preferably 2-20, more preferably 2-10 amino acids.
  • the second peptide may contain an amino acid sequence that is cleaved by an intracellular or extracellular protease.
  • the second peptide serves as a substrate for an intracellular and/or extracellular protease, and the amino acid sequence to be cleaved by the protease (also simply referred to as "substrate”.
  • a substrate to be cleaved by a certain protease is also referred to as "the protease substrate”.
  • the amino acid sequence that serves as a substrate for intracellular protease can be referred to as the first cleavage amino acid sequence
  • the amino acid sequence that serves as a substrate for extracellular protease can be referred to as the second cleavage amino acid sequence.
  • the second peptide contains the first cleavage amino acid sequence and the second cleavage amino acid sequence, and the second peptide combines the first cleavage amino acid sequence and the second cleavage amino acid sequence as protease cleavage sequences. Also called match.
  • Intracellular proteases are also called “intracellular-acting proteases”. After being expressed in cells, they act inside cells without being secreted outside the cells, and are involved in cell apoptosis. Examples of intracellular proteases include cytosolic cysteine proteases such as caspase, calpain (also referred to as “CAPN”), and tripeptidyl peptidase.
  • cytosolic cysteine proteases such as caspase, calpain (also referred to as “CAPN”), and tripeptidyl peptidase.
  • Calpain has isoforms such as CAPN1 ( ⁇ -calpain), CAPN2 (m-calpain), CAPN3, CAPN4, CAPN5, CAPN6, CAPN7, CAPN8, CAPN9, CAPN10, CAPN11, CAPN12, CAPN13, CAPN14, CAPN15, CAPN16, and CAPN17 exist, but any isoform can be used in the present invention.
  • CAPN1 (calpain 1) or CAPN2 (calpain 2) is utilized.
  • Tripeptidyl peptidase has isoforms such as tripeptidyl peptidase 1 and tripeptidyl peptidase 2. In the present invention, any isoform can be used, and tripeptidyl peptidase 2 is preferably used.
  • the first cleavage amino acid sequence in the second peptide is not particularly limited as long as it is an amino acid sequence that serves as a substrate for the above intracellular protease, that is, as long as it is an amino acid sequence that the protease recognizes and cleaves.
  • an amino acid sequence recognized by human CAPN1 and serving as its substrate also referred to as "CAPN1 substrate” or “CAPN substrate”
  • PLFAAP SEQ ID NO: 67, FIG. 55
  • Extracellular proteases are also called extracellular-acting proteases, which are expressed with a signal sequence, secreted outside the cell, and act outside the cell.
  • Extracellular proteases include urokinase-type plasminogen activator (uPA), matrix metalloprotease (MMP), plasmin, cathepsin, matriptase, legumain and the like.
  • MMPs are MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP18, MMP19, MMP20, MMP21, MMP23A, MMP23B, MMP24, MMP25, MMP26, MMP27 , MMP28, etc., any isoform can be used in the present invention.
  • Cathepsins include cathepsin A, cathepsin B, cathepsin C, cathepsin D, cathepsin E, cathepsin F, cathepsin G, cathepsin H, cathepsin K, cathepsin L1, cathepsin L2, cathepsin O, cathepsin S, cathepsin W, cathepsin X/Z.
  • any isoform can be used in the present invention.
  • the second cleaving amino acid sequence in the second peptide is not particularly limited as long as it is an amino acid sequence that serves as a substrate for the extracellular protease, that is, as long as it is an amino acid sequence that the protease recognizes and cleaves.
  • the amino acid sequence recognized by human uPA and serving as its substrate is SGRSANAILE (SEQ ID NO: 36, FIG. 51), SGRSANA (SEQ ID NO: 37, FIG. 51) as the uPA substrate.
  • SGRSA SEQ ID NO: 38, FIG. 51
  • human MMP1 recognizes VLVPMAMMAS (SEQ ID NO: 39, FIG. 51) and PLGLWA (SEQ ID NO: 40, FIG. 51)
  • the amino acid sequence also referred to as "MMP9 substrate
  • MMP9 substrate amino acid sequence that human MMP9 recognizes and serves as its substrate. 51
  • the order is not limited, but for example, the first peptide
  • the first peptide contains a second cleavage amino acid sequence that is a substrate for an extracellular protease
  • the target-binding portion contains A molecule that binds to a target antigen that may include a first cleavage amino acid sequence that is a substrate for an intracellular protease and that is linked in the order of a first peptide, a second peptide, and a portion that binds to the target antigen, wherein the first peptide
  • the side may contain a first cleavage amino acid sequence that is a substrate for an intracellular protea
  • the first peptide, the second cleaved amino acid sequence, the first cleaved amino acid sequence, and the portion that binds to the target antigen may be linked in this order.
  • the first cleaved amino acid sequence, the second cleaved amino acid sequence, and the portion that binds to the target antigen may be linked in this order.
  • the second truncated amino acid sequence may be included in the molecule that binds to the target antigen of the present invention. It may be contained in addition to the two peptides, for example, it may be contained in a third peptide inserted between the end of the first peptide, the second peptide and the portion that binds to the target antigen.
  • first peptide and the second peptide may partially overlap.
  • SEQ. part and part of the second peptide overlap.
  • the target antigen is (a) an amino acid sequence consisting of amino acids having two or more consecutive side chains with a basic functional group having a pKa of 7 or less, or (b) an amino acid sequence at any position (amino terminal or carboxyl terminal ) contains one or more amino acid sequences in which one arginine or lysine is inserted or added, and (2) a total of four or more amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less on the side chain and the amino acid sequence that is cleaved by the protease, which is the first cleavage amino acid sequence and / or the second cleavage amino acid sequence, when the amino acid sequence is cleaved by the protease, the target antigen is (a) an amino acid sequence consisting of amino acids having two or more consecutive side chains with a basic functional group having a pKa of 7 or less, or (b) an amino acid sequence at any position (amino terminal or carboxyl terminal ) contains one
  • the second peptide is (a) an amino acid sequence consisting of two or more consecutive amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less in the side chain, or (b) any position of the amino acid sequence (amino terminal or carboxyl terminal ) contains one or more amino acid sequences in which one arginine or lysine is inserted or added, and (2) a total of four or more amino acids having a basic functional group with a pKa of 7 or less on the side chain and the amino acid sequence to be cleaved by a protease, which is the first cleavage amino acid sequence and/or the second cleavage amino acid sequence, the number of amino acids contained in the second peptide is 15 to 150 number, preferably 15 to 120, more preferably 15 to 70, still more preferably 15 to 50.
  • Molecules that bind to target antigens of the present invention may further comprise other moieties.
  • another portion is also referred to as "[d] portion".
  • the [d] portion binds to the portion of the molecule that binds the target antigen.
  • the [d] portion is an antibody or antigen-binding fragment thereof that does not bind to the target antigen, a peptide containing an amino acid sequence not included in the first peptide and the second peptide, a cytokine, a toxin, a radioisotope, a labeling molecule, It consists of one or more compounds selected from the group consisting of photosensitizers (also referred to as “photosensitizers”), immunostimulants, antitumor compounds, drugs, payloads and polymers.
  • photosensitizers also referred to as “photosensitizers”
  • immunostimulants also referred to as “photosensitizers”
  • antitumor compounds drugs, payloads and polymers.
  • the peptide containing an amino acid sequence not included in the first peptide and the second peptide includes antibodies, antigen-binding fragments of antibodies, naturally occurring non-immunoglobulin proteins, artificially created proteins, receptors Proteins or ligand-binding fragments thereof, ligand proteins, proteins that regulate blood dynamics (e.g., antibody Fc, albumin), etc.
  • Antibodies include antibodies that are not molecules that bind to the target antigen, molecules that bind to the target antigen, Cytokines include antibodies that bind to sites other than target-binding sites, antibodies that function as multispecific molecules (e.g., bispecific antibodies) by binding to molecules that bind to target antigens, and interleukins.
  • Interferons Interferons, chemokines, colony-stimulating factors, tumor necrosis factors, growth factors, etc.; 131 I, 211 AT, 89 Sr and the like; fluorescent substances such as FITC and PE, enzymes such as HRP and AP, and biotin as labeling molecules; and phthalocyanine derivatives, chlorin derivatives and bacteriochlorin derivatives as photosensitizers.
  • immunostimulatory substances as polymers, natural or artificial sugar chains, synthetic resins, polyethylene glycol, etc., as antitumor compounds, topoisomerase inhibitors, mitotic inhibitors, cells
  • Antitumor agents such as mitotic inhibitors, microtubule polymerization/depolymerization inhibitors, glucocorticoid receptor modulators, DNA binding agents, alkylating agents, radioisotopes, siRNA, antibodies or antigen-binding fragments thereof, etc. , the aforementioned immunostimulatory substances and cytokines, and the antitumor compounds, drugs, payloads, etc. contained in the ADCs described below, but are not limited thereto.
  • the molecule that binds to the target antigen of the present invention may consist of a polypeptide, and when the [d] portion is a compound other than a polypeptide, it binds to the target antigen of the present invention.
  • a molecule can consist of a [d] portion and a polypeptide.
  • the [d] portion may be linked to a molecule that binds to the target antigen of the present invention with a linker.
  • the molecule that binds to the target antigen is an antibody or an antigen-binding portion thereof (such as an antibody)
  • the molecule that binds to the target antigen containing the [d] portion It can be called an ADC (Antibody-Drug Conjugate).
  • ADC Antibody-Drug Conjugate
  • the antitumor compound is not particularly limited as long as it is a substance that can exert a pharmacological effect by binding with an antibody or the like, and emtansine (4 -( ⁇ 3-[(3- ⁇ [(1S)-2- ⁇ [(1S,2R,3S,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20 -dimethoxy 2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5] hexacosa- 10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl]oxy ⁇ -1-methyl-2-oxoethyl]methylamino ⁇ -3-oxopropyl)sulfanyl]-2,5-dioxopyrrolidine- 1-yl ⁇ methyl)cyclohexylcarbonyl
  • topoisomerase I inhibitors such as camptothecin derivatives, preferably irinotecan and its active metabolite SN-38 (eg EP 137145A1, US4604463A), exatecan (eg EP 495432A1, US5637770A), exatecan derivatives (eg, WO2014/057687), and the like.
  • a suitable exatecan derivative is N-[(1S,9S)-9-Ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro -1H,12H-benzo[de]pyrano[3′,4′:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-2-hydroxyacetamide (e.g., WO2014/057687, WO2014/061277, WO2015/146132, WO2020/100954, WO2015/098099) can be exemplified.
  • antitumor compounds include pyrrolobenzodiazepine derivatives (for example, 6804, WO2015/095124, WO2015/052322, WO2015 /052534, WO2016/115191, WO2015/052321, WO2015/031693, WO2011/130613), and suitable pyrrobenzodiazepine derivatives include (11a'S)-7'-methoxy-8'-[(5 - ⁇ [(11aS)-7-methoxy-2-(4-methoxyphenyl)-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine -8-yl]oxy ⁇ pentyl)oxy]-1′,11a′-dihydro-5′H-spiro[cyclopropane-1,2′-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine]- 5′-one, (11a′S)-7′-me
  • Drugs include STING agonists (eg WO2021/202984, WO2020/229982, WO2020/050406, WO2021/177438), TLR7/8 agonists or TLR8 agonists (eg WO2018/009916, WO2019/084060) Immunostimulatory substances such as It's okay. Cyclic dinucleotide derivatives can be exemplified as suitable STING agonists.
  • Cyclic dinucleotide derivatives include (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-dihydroxy-7-[1-(2-hydroxyethyl)-6-oxo-1,6 -dihydro-9H-purin-9-yl]-2,10-bis(sulfanyl)-14-(6,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5,6-tetraazabenzo[cd] Azulen-2-yl)octahydro-2H,10H,12H-5,8-methano-2 ⁇ 5,10 ⁇ 5-furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]pentoxadifo Sphacyclotetradecine-2,10-dione, (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-fluoro-16-hydroxy-7-[1-(2-hydroxyethyl)-6 -o
  • the [d] portion binds to the target antigen binding portion.
  • the target antigen-binding portion is an antibody or antigen-binding fragment thereof
  • the [d] portion can be bound to the antibody or antigen-binding fragment thereof by known methods.
  • Techniques have been developed to homogenize carbohydrate chains in the production of therapeutic or prophylactic antibodies or glycoprotein molecules comprising Fc regions thereof.
  • Enzymatic transglycosylation is known as a method for homogenizing sugar chains added to glycoproteins. This is a multistep process consisting of cleavage of a sugar chain (hydrolysis reaction) and condensation of another sugar chain (transglycosylation reaction) in an in vitro environment.
  • a group of enzyme family called endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (ENGase) is used especially for conversion of N-glycans.
  • the characteristics of this enzyme are required to be 1) the ability to hydrolyze complex-type sugar chains as substrate specificity, and 2) the ability to perform transglycosylation to a specific structure.
  • an oxazoline method in which a sugar chain whose reducing end is activated using a single ENGase, for example, a sugar chain whose reducing end is oxazolated, is transferred to a GlcNAc (N-acetylglucosamine) acceptor;
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • a one-pot method is known in which a sugar chain whose reducing end is not activated is directly transferred to a GlcNAc acceptor using an ENGase of WO2022/050300 and WO2018/003983.
  • transglycosylation by these methods is used to bind the [d] portion of an antitumor compound, drug, payload, etc.
  • the target antigen-binding molecule comprising the [d] portion is , can be used for photodynamic therapy (PDT), and the molecule can be called an ADP (Antibody-Directed Phototherapy) molecule.
  • PDT photodynamic therapy
  • ADP Antibody-Directed Phototherapy
  • the photosensitizer is not particularly limited as long as it is a substance that can exert a pharmacological effect by irradiating the site where the antibody or the like is bound with light.
  • [(2S,3S)-7-carboxy-3-(2-carboxyethyl)-17-ethenyl-12-ethyl-2,8,13,18-tetramethyl-2,3,23,24-tetrahydroporphyrin- 5-yl]acetyl]amino]butanedioic acid e.g. US Patent No. 5633275, US Patent No. RE37180
  • IR700 IRDye® 700DX
  • WO2013/009475 WO2004/038378, WO2015/187677 , WO2017/031363, WO2017/031367, WO2018/156815, WO2019/232478, WO202020/5623
  • 2,4-difluoro-N-methyl-3-[10,15,20-tris[2,6-difluoro-3 -(methylsulfamoyl)phenyl]-2,3,12,13,22,24-hexahydroporphyrin-5-yl]benzenesulfonamide eg, WO2016/151458, and the like.
  • the cleavage linker (second peptide) contained in the molecule that binds to the target antigen is cleaved, and the active ingredient contained in the molecule that binds to the target antigen (e.g., drug, antidote).
  • the active ingredient contained in the molecule that binds to the target antigen e.g., drug, antidote.
  • neoplastic compounds, immunopotentiators, etc. exert their effects.
  • a peptide library may be constructed by a known method.
  • peptide libraries for various displays such as ribosomes composed of completely random amino acids may be constructed, and peptides having high affinity for the CDRs may be selected.
  • a peptide library (ZPZP lib) for various displays having a repeating motif of aromatic amino acids and Pro (ZPZP motif) near the center may be constructed, and peptides having a high affinity for the CDR may be selected.
  • Z represents an aromatic amino acid such as histidine (His), phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr) or tryptophan (Trp), and P represents proline.
  • a mimotope contained in the first peptide can also be identified by the above method.
  • Antibody CDR loops contain many aromatic amino acids. Since aromatic amino acids tend to interact with each other, it is preferred that the aromatic amino acid is present near the center of the peptide.
  • the present invention also includes peptide libraries for various displays for identifying peptides that bind to the first peptides obtained by the above method, mimotopes, and other molecules other than antibodies (cytokines, etc.).
  • (2) Method for producing a molecule that binds to a target antigen The molecule that binds to the target antigen of the present invention, the peptide comprising the amino acid sequence contained in the first peptide and/or the amino acid sequence contained in the second peptide, It can be prepared by recombination, in vitro translation, chemical synthesis, peptide synthesis and the like.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence contained in a portion that binds to a target antigen and, optionally, an amino acid sequence contained in a first peptide and/or an amino acid sequence contained in a second peptide.
  • a molecule that binds to the target antigen of the present invention can be produced by introducing a nucleotide into a cell, culturing the cell, and recovering the polypeptide that binds to the target antigen from the culture.
  • “functionally linked” means linked so that the elements perform their functions.
  • the vector may contain DNA encoding a signal peptide that facilitates secretion of the molecule that binds the target antigen from the host cell, in which case the DNA encoding the signal peptide and the molecule that binds the target antigen
  • the DNA is ligated in-frame. By removing the signal peptide after the molecule that binds to the target antigen is produced, the molecule that binds to the target antigen can be obtained as a mature protein.
  • Expression vectors are not particularly limited as long as they are replicable in hosts such as animal cells, bacteria and yeast, and examples thereof include known plasmids, phages and the like.
  • Examples of vectors used for construction of expression vectors include pcDNATM (ThermoFisher Scientific), Flexi (registered trademark) vector (Promega), pUC19, pUEX2 (Amersham), pGEX-4T, and pKK233-2. (manufactured by Pharmacia), pMAM-neo (manufactured by Clontech) and the like.
  • prokaryotic cells such as E.
  • coli and Bacillus subtilis and eukaryotic cells such as yeast and animal cells can be used, but eukaryotic cells are preferably used.
  • animal cells human embryonic kidney cell line HEK293 cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, and the like may be used.
  • An expression vector may be introduced into a host cell by a known method to transform the host cell. Examples include electroporation, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection, and the like.
  • the antibodies produced can be purified using separation and purification methods commonly used for proteins. For example, affinity chromatography, other chromatography, filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. may be appropriately selected and combined.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence containing the amino acid sequence of the second peptide of the present invention can be produced by recombination, in vitro translation, chemical synthesis, peptide synthesis, or the like. can be prepared.
  • the second peptide of the present invention can be obtained.
  • a peptide can be produced that consists of an amino acid sequence that includes the amino acid sequence of a peptide.
  • a polynucleotide encoding a peptide consisting of an amino acid sequence containing the amino acid sequence of the second peptide is linked to DNA encoding each peptide and functionally linked to elements such as promoters, enhancers and polyadenylation signals.
  • functionally linked means linked so that the elements perform their functions.
  • a DNA encoding a peptide consisting of an amino acid sequence containing the amino acid sequence of the peptide is ligated in-frame.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence containing the amino acid sequence of the second peptide can be obtained as a mature protein.
  • Expression vectors are not particularly limited as long as they are replicable in hosts such as animal cells, bacteria and yeast, and examples thereof include known plasmids, phages and the like.
  • Examples of vectors used for construction of expression vectors include pcDNATM (ThermoFisher Scientific), Flexi (registered trademark) vector (Promega), pUC19, pUEX2 (Amersham), pGEX-4T, and pKK233-2. (manufactured by Pharmacia), pMAM-neo (manufactured by Clontech) and the like.
  • prokaryotic cells such as E.
  • coli and Bacillus subtilis and eukaryotic cells such as yeast and animal cells can be used, but eukaryotic cells are preferably used.
  • animal cells human embryonic kidney cell line HEK293 cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, and the like may be used.
  • An expression vector may be introduced into a host cell by a known method to transform the host cell. Examples include electroporation, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection, and the like.
  • the antibodies produced can be purified using separation and purification methods commonly used for proteins. For example, affinity chromatography, other chromatography, filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. may be appropriately selected and combined.
  • Molecules that Bind to Target Antigens of the Present Invention can be used as abnormal cells. It can be used as a prophylactic and/or therapeutic drug for diseases caused by
  • the molecules that bind to the target antigen of the present invention can be used as anticancer agents.
  • the anticancer agent is for one or more selected from carcinoma, sarcoma, lymphoma, leukemia, myeloma, germinoma, brain tumor, carcinoid, neuroblastoma, retinoblastoma, and nephroblastoma.
  • carcinoma renal cancer, melanoma, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, conjunctival cancer, oral cavity cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, thyroid cancer, lung cancer, breast cancer , esophageal cancer, gastric cancer, duodenal cancer, small intestine cancer, colon cancer, rectal cancer, appendix cancer, anal cancer, liver cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, adrenal cancer , bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, vaginal cancer, and the like.
  • Myxoid fibrosarcoma malignant peripheral schwannoma, retroperitoneal sarcoma, synovial sarcoma, uterine sarcoma, gastrointestinal stromal tumor, leiomyosarcoma, epithelioid sarcoma, etc.
  • NK cell lymphoma Hodgkin's lymphoma, etc.; leukemia, myelogenous leukemia, lymphocytic leukemia, myeloproliferative disease, myelodysplastic syndrome; myeloma, multiple myeloma;
  • Cell tumors include testicular cancer and ovarian cancer, and brain tumors include glioma and meningioma.
  • the anticancer agent of the present invention may contain a therapeutically effective amount of the molecule that binds to the target antigen of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, solubilizer, emulsifier, preservative, adjuvant, and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier diluent, solubilizer, emulsifier, preservative, adjuvant, and the like.
  • “Pharmaceutically acceptable carriers” and the like can be appropriately selected from a wide range depending on the type of target disease and the mode of administration of the drug.
  • the method of administering the antitumor agent of the present invention can be selected as appropriate, and for example, injection administration can be used, such as local injection, intraperitoneal administration, selective intravenous injection, intravenous injection, subcutaneous injection, and organ perfusate injection. can be adopted.
  • Injectable solutions can also be formulated with carriers comprising saline solutions, glucose solutions, mixtures of saline and glucose solutions, various buffers, and the like. It may also be formulated in powder form and mixed with the liquid carrier at the time of use to prepare an injection solution.
  • oral liquids powders, pills, capsules, tablets and the like can be applied.
  • oral liquid preparations water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol, sesame oil, soybean oil, etc. are used as oral liquid preparations such as suspensions and syrups. It can be produced using oils, preservatives such as alkyl p-hydroxybenzoates, flavors such as strawberry flavor and peppermint, and the like.
  • Powders, pills, capsules and tablets contain excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, and polyvinyl alcohol. , a binder such as hydroxypropyl cellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin, and the like. Because of their ease of administration, tablets and capsules represent the preferred unit dosage forms for the compositions of this invention. Solid manufacturing carriers are used in the manufacture of tablets and capsules.
  • the amount of the molecule that binds to the target antigen of the present invention which is effective for treatment, varies depending on the nature of the condition to be treated, the age and condition of the patient, and may be finally determined by the doctor. For example, it is 0.0001 mg to 100 mg per 1 kg body weight at a time.
  • a given dosage may be administered once every 1 to 180 days, or it may be administered in divided doses of two, three, four or more times per day at appropriate intervals.
  • a molecule or the like that binds to a target antigen of the present invention can be used as a prophylactic or therapeutic drug for diseases caused by abnormal cells even in combination with other drugs.
  • the molecule or the like that binds to the target antigen of the present invention has or is likely to have a disease caused by abnormal cells before administration of another drug, at the same time as another drug, or after administration of another drug. It can be administered to a person.
  • a combination formulation preparation containing both of them
  • a single drug preparation containing only one of them
  • Test Agents, Diagnostic Agents, and Reagents Molecules and the like that bind to target antigens of the present invention can be used as test agents, diagnostic agents, reagents, and the like. Molecules, etc. that bind to the target antigen of the present invention bind to the target antigen with higher affinity under acidic pH conditions than under neutral pH conditions. , it is possible to examine changes in pH in the vicinity of the target antigen. Therefore, by using the molecule or the like that binds to the target antigen of the present invention, for example, by using it as a specimen or administering it to a subject, examination of a disease whose etiology or phenotype is caused by a change in pH in the vicinity of the target antigen.
  • the molecule or the like that binds to the target antigen of the present invention causes a disease or phenotype caused by changes in pH in the vicinity of the target antigen present in the cancer microenvironment, the environment in endosomes, or the environment in lysosomes. It can be used as a test agent, diagnostic agent, reagent, or the like for diseases or the like. Examples of test agents, diagnostic agents, or reagents include determination or measurement of disease risk, determination of the presence or absence of disease, measurement of the degree of progress or exacerbation, and effects of drug treatment with a pharmaceutical composition containing a molecule that binds to a target antigen.
  • the present invention provides a composition such as a test, diagnosis or reagent (hereinafter referred to as "test composition") containing a molecule or the like that binds to the target antigen of the present invention.
  • test composition a composition containing a molecule or the like that binds to the target antigen of the present invention.
  • Such a composition for examination etc. may contain pH buffers, osmotic pressure regulators, salts, stabilizers, preservatives, color developers, sensitizers, anti-aggregation agents and the like.
  • Example 1 Preparation of anti-TROP2 antibody HT1-11 1)-1 Expression and purification of anti-TROP2 antibody HT1-11 Heavy chain of known anti-TROP2 antibody described in WO2015/098099 (SEQ ID NO: 1, Figure 16)
  • a mammalian cell expression vector having a framework of pcDNA3.3 (Thermo Fisher Scientific) in which a DNA encoding a light chain (SEQ ID NO: 2, FIG. 17) is cloned is introduced into Expi293F cells for transient expression. Antibody molecules were purified from the culture supernatant. Expi293F cells (Thermo Fisher Scientific) were subcultured and cultured according to the manual.
  • the Expi293F cell culture medium in the exponential growth phase was diluted with Expi293 Expression medium (Thermo Fisher Scientific) to 2.5 ⁇ 10 6 cells/mL, and the heavy chain and the heavy chain were added to Opti-Pro SFM medium (Thermo Fisher Scientific).
  • An expression vector for each light chain and Polyethyleneimine (Polyscience) were added and reacted, followed by addition to Expi293F cells. Shaking culture was performed at 135 rpm for 5 days in a 37° C., 8% CO 2 incubator.
  • MabSelectSuRe (Cytiva) equilibrated with PBS pH 7.4 was added to the culture supernatant after centrifugation to adsorb target antibody molecules.
  • the adsorbed components were eluted with an acetate buffer of pH 3.5.
  • the eluted fraction was neutralized with a Tris buffer of pH 9.0, and buffer-substituted with 25 mM Histidine, 5 (w/v)% sorbitor, pH 6.0 using an ultrafiltration membrane. After concentration as necessary, it was applied to a gel filtration column Superdex 200 Increase (Cytiva) pre-equilibrated with 25 mM Histidine, 300 mM NaCl, 5 (w/v)% sorbitor, pH 5.5 to collect the monomer fraction.
  • SDS-polyacrylamide electrophoresis SDS-PAGE
  • SEC analytical size exclusion chromatography
  • the C-terminal Avi tag sequence was biotinylated.
  • 50 ⁇ L of the antibody of Example 1)-1 whose concentration was adjusted with ELISA buffer was added and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • 50 ⁇ L of horseradish peroxidase (HRP)-labeled anti-human IgG antibody (Jackson Immuno Research Laboratories) diluted 2500-fold with ELISA buffer was added and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Example 2 Enrichment of mimotope peptides that bind to anti-TROP2 antibody HT1-11
  • human serum-derived IgG Sigma-Aldrich
  • HT1-11 biotinylated with EZ-Link NHS-PEG4-Bioin Thermo Fisher Scientific
  • Phase A ribosome displaying a peptide (hereinafter referred to as "RD") was reacted with human serum-derived IgG-bound beads.
  • Unbound RD was recovered using a magnet stand (DynaMag-2, Thermo Fisher Scientific) and reacted with HT1-11 bound beads. RD that did not bind to HT1-11 was removed by washing using a magnetic stand, and mRNA was purified from RD that bound to HT1-11. RD was then prepared again by RT-PCR and in vitro translation. This panning operation was performed three times.
  • mRNA was translated in vitro to prepare RD, which was reacted with biotinylated HT1-11 or Dynabeads Streptavidin M-280 on which human serum-derived IgG was immobilized (input amount: 6 ⁇ 10 11 ).
  • mRNA was recovered from the bound RD, and the recovered amount (output) was quantitatively evaluated by RT-qPCR. As shown in FIG. 3, 2624-fold more mRNA was recovered under the conditions in which HT1-11 was immobilized compared to the conditions in which human serum IgG was immobilized. This result suggested an enrichment of peptides that specifically bind to HT1-11.
  • coli XL-1 Blue (Agilent Technologies) was transformed. E. coli was cultured in the presence of IPTG (Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside) (Sigma-Aldrich), and the culture supernatant containing the peptide-fused scFv was collected. 3)-2 Acquisition of Mimotope Peptide The binding activity to human TROP2 antigen was evaluated by ELISA in the same manner as in Example 1)-2.
  • the culture supernatant containing the peptide-fused scFv was diluted 10-fold with TBS (MMP buffer) containing 2 mM calcium chloride, and reacted with 100 nM active human MMP1 (accession number: P03956) at 37°C for 15 minutes.
  • the cleaved linker was cleaved. After that, 50 ⁇ L each was added to the plate on which the human TROP2 antigen was immobilized.
  • Bound scFv was detected with HRP-labeled anti-FLAG antibody (Sigma-Aldrich) diluted 5000-fold with ELISA buffer.
  • MMP1 addition condition/MMP1 non-addition condition clones exhibiting a large binding strength ratio
  • MMP1 addition condition/MMP1 non-addition condition clones exhibiting a large binding strength ratio
  • the sequence of the translation region was analyzed by a method known to those skilled in the art to obtain MHT1001 (SEQ ID NO: 3, FIG. 18) and MHT1002 (SEQ ID NO: 4, FIG. 19) as unique clones.
  • the binding activity to human TROP2 antigen was evaluated by ELISA in the same manner as in Example 3)-2 under MMP1 addition conditions and MMP1 non-addition conditions.
  • the antibody was adjusted to 1 ⁇ M with MMP buffer, MMP1 was added to a final concentration of 1 ⁇ M or 0 ⁇ M, and reacted at 37° C. for 15 minutes.
  • Antibodies adjusted in concentration with ELISA buffer were then added to each well.
  • HT1-11-scFv-HL and HT1-11-scFv-LH not fused with a mimotope peptide were irrespective of the addition of MMP1. It showed similar binding activity.
  • MHT1001 and MHT1002 fused with a mimotope peptide exhibited stronger binding activity under MMP1 addition conditions than under MMP1 non-addition conditions, and the binding EC 50 ratios (MMP1 non-addition conditions/MMP1 addition conditions) were 7.5. 9 and 4.3 (Fig. 4-2 (C), Fig. 4-2 (D)).
  • Example 4 Preparation of anti-TROP2 masked antibody and evaluation of its binding activity
  • Anti-TROP2 masked antibody MHT1007 (Table 2, SEQ ID NO: 7, FIG. 22) was constructed.
  • MHT1008 (Table 2, SEQ ID NO: 8, FIG.
  • MMP-cleavable linker portion in which the MMP-cleavable linker portion is modified to a non-cleavable linker that cannot be cleaved by protease and uPA-cleavable linker (including known uPA substrates (Journal of Biological Chemistry.; 272 ( 33): 20456-20462 (1997).):
  • a heavy chain expression vector of MHT1009 (Table 2, SEQ ID NO: 9, Figure 24) modified to amino acid numbers 36 to 55 of the amino acid sequence shown in Figure 24 and SEQ ID NO: 9) were constructed respectively.
  • the heavy chain expression vector of each antibody was combined with the light chain expression vector of HT1-11, each mask antibody was purified from the culture supernatant of Expi293F cells in the same manner as in Example 1)-1, and the protein concentration was determined.
  • the prepared mask antibodies were named MHT1007, MHT1008, and MHT1009 corresponding to the names of the heavy chain expression vectors (Table 2).
  • the "pH-responsive linker" in the sequence of the heavy chain sequences of each masked antibody in Table 2 corresponds to the second peptide of the molecule that binds to the target antigen of the invention.
  • the binding activity to the human TROP2 antigen was evaluated by ELISA in the same manner as in Examples 1)-2 and 3)-2, except for the parts described below, under protease addition and non-addition conditions.
  • protease addition conditions a final concentration of 300 nM of MMP1 or activated human uPA (Accession number: P00749) was added to 3 ⁇ M of the antibody, and after reaction at 37° C., the concentration of the antibody was adjusted with an ELISA buffer, and the antibody was used as the human TROP2 antigen. were added to the fixed wells.
  • HT1-11 not fused with a mimotope peptide exhibited the same binding activity under MMP1-added conditions as it did under MMP1-free conditions.
  • the binding activity of MHT1007 fused with a mimotope peptide was lower than that of HT1-11, demonstrating a masking effect similar to that of scFv.
  • it exhibited stronger binding activity under MMP1 addition conditions than under MMP1 non-addition conditions, and the binding EC 50 ratio (MMP1 non-addition conditions/MMP1 addition conditions) was 104 (FIG. 5-1(B)).
  • MHT1008 loaded with an uncleavable linker the binding activity was reduced even under the MMP1-added condition as in the non-added condition (FIG. 5-2(C)).
  • MHT1009 loaded with a uPA cleavage linker exhibited stronger binding activity under uPA addition conditions than under uPA non-addition conditions, and the binding EC 50 ratio (uPA non-addition conditions/uPA addition conditions) was 83 (Fig. 5- 2(D)). From the above results, it was shown that the mimotope obtained in Example 3 functions as a masking domain not only in the scFv state but also in the IgG state, and that the cleavage linker sequence can be modified while maintaining the masking effect.
  • the Fab region of MHT1007 containing a mask peptide and an MMP cleavage linker is prepared by a method known to those skilled in the art, and crystals of the Fab region are obtained. Chemical analysis and X-ray crystal structure analysis were performed. The results showed that the peptide bound to the CDR regions of HT1-11 (data not shown). It was also confirmed by SPR that the chemically synthesized mask peptide binds to HT1-11 competitively with the TROP2 antigen (data not shown).
  • Example 5 Design of His cluster-loaded linker and evaluation of binding pH responsiveness His, which has a side chain pKa of 6.0, is an amino acid that is prone to protonation in the tumor microenvironment where pHe is lowered.
  • An anti-TROP2 mask antibody was designed with multiple His in the linker, and its interaction with the human TROP2 antigen was evaluated by ELISA in the same manner as in Example 1)-2, except for the portions described below.
  • Antibodies were added in neutral buffer (50 mM TRIS or 50 mM HEPES, 150 mM NaCL, 0.05% Tween-20, pH 7.5) or acidic buffer (50 mM Bis-TRIS, 150 mM NaCL, 0.05% Tween-20, pH 6.5).
  • HRP horseradish peroxidase
  • MHT1008 not loaded with His showed similar binding activity under neutral pH conditions (pH 7.5) and acidic pH conditions (pH 5.5).
  • MHT1803 Table 2, SEQ ID NO: 10, FIG. 25
  • MHT1804 Table 2, SEQ ID NO: 11, FIG. 26
  • MHT1805 Table 2, SEQ ID NO: 11, FIG. 26 with one or two consecutive His (His cluster) in the linker Table 2, SEQ ID NO: 12, Figure 27
  • Figures 6-1(B), 6-2(C), 6-2(D) showed stronger binding under acidic pH conditions than under neutral pH conditions.
  • the EC50 ratios (neutral pH conditions/acid pH conditions) for binding of MHT1803, MHT1804 and MHT1805 were 3.9, 3.6 and 2.3, respectively.
  • MHT1806 (Table 2, SEQ ID NO: 13, FIG. 28) loaded with three His clusters also showed strong binding activity under acidic pH conditions (FIG. 6-3 (E)), and the EC 50 ratio (neutral pH condition/acidic pH condition) was 38.8.
  • MHT1808 (Table 2, SEQ ID NO: 14, Figure 29), MHT1809 (Table 2, SEQ ID NO: 15, Figure 30) and MHT1810 (Table 2, SEQ ID NO: 16, Fig. 31) was evaluated. Both clones exhibited stronger binding under acidic pH conditions than under neutral pH conditions (Fig. 6-3(F), Fig. 6-4(G), Fig. 6-4(H)), and the EC50 ratio (neutral pH conditions/acidic pH conditions) were 24.4, 11.4, and 7.8, respectively.
  • MHT1811 (Table 2, SEQ ID NO: 17, Figure 51) loaded with a known MMP substrate (Biopolymers.; 40(4):399-416 (1996).) composed of a His cluster and PLGLWA (SEQ ID NO: 40, Figure 51) 32) was assessed for binding activity. Even with protease substrates, MHT1811 exhibited stronger binding at acidic pH conditions than at neutral pH conditions (FIG. 6-5(I)), with an EC 50 ratio (neutral pH conditions/acid pH conditions) of 28.1. was. It also showed strong binding activity under MMP1 addition conditions, and the EC50 ratio (MMP1 non-addition conditions/MMP1 addition conditions) was 48.4.
  • MHT1817 (Table 2, SEQ ID NO: 18, FIG. 33) with a negatively charged Asp residue placed within the His cluster to verify whether protonation of His residues contributes to pH-lowering-dependent enhancement of binding activity.
  • MHT1818 (Table 2, SEQ ID NO: 19, Figure 34) and MHT1819 (Table 2, SEQ ID NO: 20, Figure 35) were designed and prepared. Each antibody was diluted to 20 nM with buffers of pH 7.5, pH 6.5, and pH 6.0, reacted at 37° C. for 30 minutes, and then evaluated for binding activity to human TROP2 antigen by ELISA.
  • the binding activity of MHT1808 was improved in a pH-lowering-dependent manner, but the binding activities of MHT1817, MHT1818, and MHT1819 were not improved as much as MHT1808 under any conditions of pH 6.5 and pH 6.0 (Fig. 7).
  • the number of Asp residues inside the His cluster increased, the change in binding activity due to pH changes decreased. This result indicates that it is preferable not to include Asp residues in the pH-responsive linker.
  • Example 6 Evaluation of binding activity of anti-CD98 antibody, anti-EGFR antibody, and anti-GPRC5D antibody 6)-1 Evaluation of binding activity of anti-CD98 antibody hM23H1L1 Known anti-CD98 antibody hM23H1L1 (heavy chain sequence (Table 3, SEQ ID NO: 21, Figure 36) and light chain sequences (Table 3, SEQ ID NO: 22, Figure 37)) were evaluated for binding activity to human CD98 antigen by ELISA.
  • biotinylated human CD98 antigen (accession number: P08195) diluted to 1 ⁇ g/mL with PBS was purified by a method known to those skilled in the art, and EZ-Link NHS-PEG4-Bioin (Thermo Fisher Scientific Co.) was added in 50 ⁇ L portions and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • 50 ⁇ L of anti-CD98 antibody hM23H1L1 prepared with ELISA buffer was added and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • HRP horseradish peroxidase
  • IgG antibody Jackson Immuno Research Laboratories
  • HRP horseradish peroxidase
  • ELISA buffer 50 ⁇ L of horseradish peroxidase (HRP)-labeled anti-human IgG antibody (Jackson Immuno Research Laboratories) diluted 2500-fold with ELISA buffer was added and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrate was added, and chemiluminescence after 10 minutes was measured with a plate reader.
  • FIG. 8-1(A) hM23H1L1 bound to human CD98 antigen in a concentration-dependent manner.
  • Human EGFR-Fc human EGFR (accession number: P00533) extracellular domain diluted to 0.2 ⁇ g / mL with PBS in 96-well Maxi-sorp plate (Black, Nunc), human IgG1 Fc region (accession The fusion protein of number: P01857) was purified by a method known to those skilled in the art.) was added in 50 ⁇ L portions and immobilized overnight at 4°C. After washing with PBS (ELISA buffer) containing 0.05% Tween-20 (Bio-Rad), blocking was performed with Blocker Casein (Thermo Fisher Scientific). After washing with ELISA buffer, 50 ⁇ L of Cetuximab prepared with MMP buffer was added and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • PBS ELISA buffer
  • Tween-20 Bio-Rad
  • HRP horseradish peroxidase
  • IgG antibody Jackson Immuno Research Laboratories
  • HRP horseradish peroxidase
  • ELISA buffer 50 ⁇ L of horseradish peroxidase (HRP)-labeled anti-human IgG antibody (Jackson Immuno Research Laboratories) diluted 2500-fold with ELISA buffer was added and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrate (Thermo Fisher Scientific) was added, and chemiluminescence after 10 minutes was measured with a plate reader.
  • FIG. 8-1(B) Cetuximab bound to the human EGFR antigen in a concentration-dependent manner.
  • Example 7 Enrichment of mimotope peptides for hM23H1L1, Cetuximab, and C3022 7)-1
  • hM23H1L1 Peptide library Linear 15mer lib
  • ZPZP lib A peptide library for ribosome display (ZPZP lib) having a repeating motif of aromatic amino acids and Pro (ZPZP motif) was constructed, and peptides capable of binding to hM23H1L1 were enriched (Fig. 9-1(A)).
  • Dynabeads Streptavidin M-280 (Thermo Fisher Scientific) and Dynabeads Streptavidin M-280 (Thermo Fisher Scientific) on which human serum-derived IgG (Sigma-Aldrich) biotinylated with EZ-Link NHS-PEG4-Bioin (Thermo Fisher Scientific) was immobilized.
  • beads protein RD was added to A (Thermo Fisher Scientific) and reacted with human serum-derived IgG and protein A. Unbound RD was recovered using a magnet stand (DynaMag-2, Thermo Fisher Scientific) and then reacted with Dynabeads Protein A bound with hM23H1L1.
  • RD that did not bind to hM23H1L1 was removed by washing using a magnetic stand, and mRNA was purified from RD that bound to hM23H1L1. RD was then prepared again by RT-PCR and in vitro translation. This panning operation was performed three times.
  • mRNA was translated in vitro to prepare RD, which was reacted with Dynabeads Protein A on which hM23H1L1 or human serum-derived IgG was immobilized (input amount: 6 ⁇ 10 11 ). After removing unbound RD by washing using a magnetic stand, mRNA was recovered from the bound RD, and the recovered amount (output) was quantitatively evaluated by RT-qPCR. As shown in FIG. 9-1(B), with respect to both the Linear 15mer lib and ZPZP lib peptide libraries, under the hM23H1L1-immobilized condition, approximately 200 times more mRNA was obtained than under the human serum IgG-immobilized condition. was recovered. This result suggested enrichment of peptides that specifically bind to hM23H1L1.
  • RD that did not bind to Cetuximab was removed by washing using a magnetic stand, and mRNA was purified from RD that bound to Cetuximab. RD was then prepared again by RT-PCR and in vitro translation. This panning operation was performed four times.
  • mRNA was translated in vitro to prepare RD, which was reacted with Dynabeads Protein A on which Cetuximab or human serum-derived IgG was immobilized (input amount: 6 ⁇ 10 11 ). After removing unbound RD by washing using a magnetic stand, mRNA was recovered from the bound RD, and the recovered amount (output) was quantitatively evaluated by RT-qPCR. As shown in FIG. 9-2(C), 276-fold more mRNA was recovered under the condition of immobilizing Cetuximab than under the condition of immobilizing human serum IgG. The results indicated an enrichment of peptides that specifically bind to Cetuximab.
  • RD that did not bind to C3022 was removed by washing using a magnetic stand, and mRNA was purified from RD that bound to C3022. RD was then prepared again by RT-PCR and in vitro translation. This panning operation was performed three times.
  • mRNA was translated in vitro to prepare RD, which was reacted with Dynabeads Protein A on which C3022 or human serum-derived IgG was immobilized (input amount: 6 ⁇ 10 11 ). After removing unbound RD by washing using a magnetic stand, mRNA was recovered from the bound RD, and the recovered amount (output) was quantitatively evaluated by RT-qPCR. As shown in FIG. 9-2(D), 503-fold more mRNA was recovered under the conditions in which C3022 was immobilized as compared to the conditions in which human serum IgG was immobilized. The results indicated an enrichment of peptides that specifically bind to C3022.
  • Example 8 Application versatility of pH-responsive linker Mimotope peptides capable of inhibiting the binding of anti-CD98 antibody and anti-GPRC5D antibody were selected in the same manner as in Example 3.
  • mimotopes were selected in the IgG state rather than in the scFv state.
  • the DNA fragment encoding the random peptide portion was purified after restriction enzyme digestion and translated into the following order: secretory signal sequence, DNA fragment, MMP cleavage linker, Cetuximab (heavy or light chain). , the DNA fragment was inserted into a mammalian cell expression vector.
  • Cetuximab in which a peptide and an MMP cleavage linker were fused to the N-terminus of the heavy or light chain, was expressed in Expi293F cells, and mimotope peptides capable of inhibiting the binding of Cetuximab were selected in the same manner as in Example 3.
  • MhM8001, MCE-2101, and MC3-9001 all showed stronger binding at acidic pH conditions (pH 5.5) than at neutral pH conditions (pH 7.5) and EC 50 ratios (neutral pH conditions/acid pH conditions). were 13.1, 39.0 and 40.4, respectively (Fig. 10-1 (A), Fig. 10-1 (B), Fig. 10-2 (C)). These results suggested that masked antibodies loaded with His clusters are universally activated under acidic pH conditions.
  • Example 9 Preparation and evaluation of binding activity of anti-TROP2 masked antibody converted to ADC
  • anti-TROP2 masked antibody MHT1808 loaded with a His cluster, MHT1221 without a His cluster (Table 2, SEQ ID NO:30, FIG. 45) and MHT1008 were designed.
  • Each antibody was prepared in the same manner as in Example 1)-1, and the binding activity to the human TROP2 antigen was tested in the same manner as in Example 5 under neutral pH conditions (pH 7.5) and acidic pH conditions (pH 5.5). was assessed by ELISA.
  • MHT1808 exhibited stronger binding at acidic pH conditions than at neutral pH conditions, with an EC50 ratio (neutral pH conditions/acid pH conditions) of 25.4.
  • MHT1221 and MHT1008 exhibited equivalent binding activity under both pH conditions, with EC 50 ratios (neutral pH condition/acid pH condition) of 1.7 and 1.2, respectively.
  • the drug linker for preparation of antibody-drug conjugates is N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrole-1- yl)hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2- ⁇ [(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2, 3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3′,4′:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino ⁇ -2 -oxoethoxy)methyl]glycinamide (Example 58 Step 8 WO2014/057687, hereinafter referred to as "linker 1”) and N-[4-(11,12-didehydrodibenz
  • Buffer exchange of antibody C-1 Buffer exchange to phosphate buffer (50 mM, pH 6.0) containing NaCl (50 mM) and EDTA (5 mM) (hereinafter referred to as PBS6.0/EDTA) NAP- 25 column (Cat. No. 17085202, Cytiva, NAP-25 Columns Sephadex, hereinafter referred to as NAP-25) according to the method specified by the manufacturer, a phosphate buffer containing NaCl (50 mM) and EDTA (5 mM) (50 mM, pH 6.0) (hereinafter referred to as PBS6.0/EDTA).
  • PB6.0 Buffer Exchange with Phosphate Buffer (50 mM, pH 6.0) (hereinafter referred to as PB6.0)
  • PB6.0 Buffer Exchange with Phosphate Buffer (50 mM, pH 6.0)
  • PB6.0 was added to the aqueous antibody solution and concentrated using Common Procedure A. After performing this operation several times, the concentration was measured (common operation B) and adjusted to 10 mg/mL using PB6.0.
  • ⁇ Ab,280 Molar extinction coefficient of antibody at 280 nm
  • DL,280 Molar extinction coefficient of drug linker at 280 nm
  • Number of drug binding Calculated in common operation F (see below)
  • ⁇ Ab,280 a value calculated from the amino acid sequence of the antibody by a known calculation method (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) was used (see Table 4 below).
  • ⁇ DL,280 is the measured molar extinction coefficient (280 nm) of the compound in which the linker 1 was reacted with mercaptoethanol or N-acetylcysteine and the maleimide group was converted to succinimide thioether, and the measured molar extinction coefficient (280 nm) of the linker 2 )It was used.
  • HPLC analysis HPLC analysis was performed under the following measurement conditions.
  • HPLC system Agilent 1290 HPLC system (Agilent Technologies) ⁇ Detector: UV absorbance meter (measurement wavelength: 280 nm)
  • Mobile phase A 0.10 (w / v) % trifluoroacetic acid (TFA), 15 (w / v) % 2-propanol aqueous solution -
  • Mobile phase B 0.075 (w / v) % TFA, 15 ( w/v) % 2-propanol, acetonitrile solution
  • Drug-bound light chain i drug-bound light chain: Li
  • heavy chain L0
  • heavy chain H0
  • the chain (heavy chain with i drug bound: Hi) increases in hydrophobicity and retention time in proportion to the number of bound drugs. It can be assigned to any of L0, L1, H0, H1, H2, H3.
  • the peak area value is corrected according to the following formula using the molar extinction coefficients of the light chain, heavy chain and drug linker, depending on the number of drug linker bonds.
  • the molar extinction coefficient (280 nm) of the light chain and heavy chain in each antibody is determined by a known calculation method (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423), the amino acids of the light chain and heavy chain of each antibody. Values deduced from sequences were used (see Table 4 below).
  • Drug average binding number (L0 peak area ratio x0 + L1 peak area ratio x1 + H0 peak area ratio x0 + H1 peak area ratio x1 + H2 peak area ratio x2 + H3 peak area ratio x3)/100 x2
  • Step 1 Antibody-Drug Conjugate (1)
  • Antibody reduction MhM1018-M1 prepared in Example 12 was adjusted to 10 mg/mL in PBS 6.0/EDTA using Common Procedures B and C-1. This solution (1.45 mL) was added with 1 M dipotassium hydrogen phosphate aqueous solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0218 mL) and 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) aqueous solution (0.0581 mL; .0 eq.) was added. Incubation at 37° C. for 2 hours reduced the interchain disulfide bonds of the antibody.
  • Antibody concentration 1.75 mg/mL, Antibody yield: 12.27 mg (83%), Average drug binding number (n) per antibody molecule: 7.4.
  • Step 1 Antibody-Drug Conjugate (2) The title antibody- A drug conjugate "MhM1024-M1-DXd-ADC" was obtained.
  • Antibody concentration 1.91 mg/mL, Antibody yield: 13.38 mg (87%), Average drug binding number per antibody molecule (n): 7.2.
  • Step 1 Preparation of (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-MHT1221 antibody
  • the MHT1221 antibody solution prepared in Example 9 was buffered in a phosphate buffer solution (50 mM, pH 6.0) (hereinafter PB6.0) according to common procedure C-2. exchanged and adjusted to 19.3 mg/mL (0.970 mL). 0.0124 mL of EndoS solution (PBS, 7.52 mg/mL) was added to this solution and incubated at 37° C. for 2 hours. After confirming that the sugar chain was cleaved using an Agilent 2100 bioanalyzer, purification was performed using a GST and Protein A column (AKTA). The target fraction was substituted with PB6.0 to obtain (Fucal,6)GlucNAc-MHT1221 antibody (20.0 mg/mL, 0.921 mL).
  • PB6.0 phosphate buffer solution
  • AKTA Protein A column
  • Step 2 Preparation of sugar chain-modified MHT1221 antibody To the (Fucal, 6) GlucNAc-MHT1221 antibody (PB6.0) (20.0 mg/mL, 0.921 mL) obtained in Step 1 above, sugar chain oxazoline (3aR ,5R,6S,7R,7aR)-3a,6,7,7a-Tetrahydro-7-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methyl-5H-pyrano[3,2-d]oxazol-6-yl O -[N5-acetyl-N1-[2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethyl]- ⁇ -neuraminemidosyl]-(2 ⁇ 6)-O- ⁇ -D-galactopyranosyl-(1 ⁇ 4) -O-2-(acetylamino)-2-deoxy- ⁇ -D-glucopyranosyl-(1 ⁇ 2)-O- ⁇ -D-manno
  • Linker 2 (m,n) in the structural formula includes (1,0) and/or (0,1) components.
  • Step 3 Conjugation of Antibody and Drug Linker
  • sugar chain-modified MHT1221 (ABS) (10.6 mg/mL, 0.500 mL) obtained in Step 2 above, 1,2-propanediol (0.5 mg/mL) was added at room temperature. 479 mL), a 10 mM dimethyl sulfoxide solution of linker 2 (0.0210 mL; 6 equivalents per antibody molecule) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 48 hours using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Corporation). .
  • Antibody concentration 1.62 mg/mL
  • Antibody yield 4.06 mg (77%)
  • Drug average binding number per antibody molecule (n) 1.9.
  • Step 1 Preparation of (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-MHT1008 antibody
  • the MHT1008 antibody solution prepared in Example 4 was buffer-exchanged with PB6.0, ca. Prepared to 16.6 mg/mL (0.880 mL).
  • a (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-MHT1008 antibody solution (PB6.0) (16.8 mg/mL, 0.800 mL) was obtained by performing the same operation as in step 1 of Example 10)-3 above.
  • Step 2 Preparation of sugar chain-modified MHT1008 antibody Using the 16.8 mg/mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-MHT1008 antibody solution (PB6.0) (0.800 mL) obtained in Step 1 above, Example 10) A sugar chain-modified MHT1008 antibody (ABS) (11.4 mg/mL, 1.00 mL) was obtained by performing the same operation as in step 2 of -3.
  • Linker 2 (m,n) in the structural formula includes (1,0) and/or (0,1) components.
  • Step 3 Conjugation of Antibody and Drug Linker
  • ABS MHT1008-PBD-ADC solution
  • Antibody concentration 1.55 mg/mL, antibody yield: 3.87 mg (77%), drug average binding number per antibody molecule (n): 1.9.
  • Step 1 Preparation of (Fucal, 6) GlucNAc-MHT1808 antibody
  • the MHT1808 antibody solution prepared in Example 9 was buffer-exchanged with PB6.0, ca. Prepared to 19.1 mg/mL (1.00 mL).
  • a (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-MHT1808 antibody solution (PB6.0) (17.1 mg/mL, 1.0 mL) was obtained by performing the same operation as in step 1 of Example 10)-3 above.
  • Step 2 Preparation of sugar chain-modified MHT1808 antibody Using the 17.1 mg/mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-MHT1008 antibody solution (PB6.0) (1.00 mL) obtained in Step 1 above, Example 10) -3 A sugar chain-modified MHT1808 antibody (PBS7.4) (7.0 mg/mL, 1.60 mL) was obtained by performing the same operation as in step 2.
  • Linker 2 (m,n) in the structural formula includes (1,0) and/or (0,1) components.
  • Step 3 Conjugation of Antibody and Drug Linker Using the sugar chain-modified MHT1808 antibody (PBS7.4) (7.00 mg/mL, 0.450 mL) obtained in Step 2 above, the step of Example 10)-3 2.50 mL of MHT1008-PBD-ADC solution (ABS) was obtained by performing the same operation as in 3. Characteristic evaluation: Using common operations E and F, the following characteristic values were obtained.
  • Antibody concentration 1.24 mg/mL, antibody yield: 4.35 mg (86%), drug average binding number per antibody molecule (n): 1.9.
  • CD98 antigen was measured as an analyte Anti-Human IgG (Fc) antibody (Human antibody Capture kit, Cytiva) was immobilized on Sensor Chip CM5 (Cytiva) according to the kit instructions.HBS-EP+ (Cytiva) ) was applied at 5 ⁇ L/min for 60 seconds to immobilize each anti-CD98 antibody to be evaluated diluted to 2 ⁇ g/mL with HBS-EP+. /min for 90 seconds and the dissociation measured for 250 seconds to calculate the K D.
  • Fc Anti-Human IgG
  • Cytiva Human antibody Capture kit, Cytiva
  • MhM1013 and MhM1013-M1 fused with a mimotope peptide exhibited stronger binding activity under MMP1 addition conditions than under MMP1 non-addition conditions.
  • the EC 50 ratios for MhM1013 and MhM1013-M1 binding were 239 and 552, respectively.
  • Example 12 Preparation and binding activity evaluation of anti-CD98 mask antibody to be converted into ADC
  • His cluster We designed anti-CD98 masked antibodies MhM1018-M1 (Table 3, SEQ ID NO:34, FIG. 49) without the .
  • Each antibody was prepared in the same manner as in Example 1)-1, and the binding activity to human CD98 antigen under neutral pH conditions (pH 7.5) and acidic pH conditions (pH 5.5) in the same manner as in Example 8. was assessed by ELISA.
  • MhM1018-M1 exhibited comparable binding activity under both pH conditions, with an EC 50 ratio (neutral pH condition/acidic pH condition) of 1.7, respectively.
  • MhM1024-M1 exhibited stronger binding at acidic pH conditions than at neutral pH conditions, with an EC 50 ratio (neutral pH conditions/acid pH conditions) of 19.2.
  • Example 13 Evaluation of growth inhibitory activity of ADC FaDu (ATCC), a human head and neck cancer line of TROP2 and CD98 positive cells, was prepared in E-MEM medium (Wako: hereinafter, E-MEM medium). FaDu was adjusted to 2.0 ⁇ 10 4 cells/mL with E-MEM medium, and added to 96-well cell culture plates in 100 ⁇ L portions. After cell addition, FaDu was cultured overnight at 37° C., 5% CO 2 .
  • E-MEM medium was removed from the culture plate, and E-MEM medium adjusted to each pH (7.4, 6.5, 6.0, 5.5) was added to 300 nM, 100 nM, and 33.3 nM.
  • 100 ⁇ L of anti-TROP2 masked PBD-ADC or anti-CD98 masked DXd-ADC diluted to 11.1 nM, 3.7 nM, 1.2 nM and 0.4 nM was added.
  • the antibody-containing medium was removed, and 100 ⁇ L of E-MEM medium adjusted to pH 7.4 was added. Cultured at 37° C., 5% CO 2 for 6 days.
  • Viable cell rate (%) a/b x 100 a: Average luminescence intensity of test substance-added wells b: Average luminescence intensity of medium-added wells 13)-1 Cell-killing activity of anti-TROP2 masked PBD-ADC As shown in FIG.
  • anti-CD98 mask antibody MhM1026-M1 (Table 5, SEQ ID NO: 68, Figure 57), MhM1028-M1 (Table 5, SEQ ID NO: 69, Figure 58), MhM1042-M1 (Table 5, SEQ ID NO: 70, Figure 59), MhM1043-M1 (Table 5, SEQ ID NO: 71, Figure 60), MhM1044- M1 (Table 5, SEQ ID NO: 72, Figure 61), MhM1045-M1 (Table 5, SEQ ID NO: 73, Figure 62) and MhM1046-M1 (Table 5, SEQ ID NO: 74, Figure 63) were designed, respectively.
  • a mask antibody was prepared in the same manner as in 1)-1 of Example 1, and the binding activity under neutral pH conditions and acidic pH conditions was evaluated by ELISA in the same manner as in Examples 5 and 6.
  • MhM1026-M1, MhM1028-M1, MhM1042-M1 and MhM1043-M1 exhibited similar binding activity under the condition of pH 7.5.
  • MhM1028-M1, MhM1042-M1 and MhM1043-M1 exhibited stronger binding activity than MhM1026-M1 (Fig. 56-1(B)).
  • EC 50 ratio neutral pH condition / acidic pH condition
  • placing Arg in the vicinity of the His cluster improves pH responsiveness by 4.0-5.2 times.
  • the environment-responsive masked antibody of the present invention can be used for treatment of various cancers.
  • SEQ ID NO: 1 heavy chain amino acid sequence of anti-TROP2 antibody
  • SEQ ID NO: 2 light chain amino acid sequence of anti-TROP2 antibody
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of MHT1001
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of MHT1002
  • SEQ ID NO: 5 amino acid sequence of HT1-11-scFv-HL
  • SEQ ID NO: 6 amino acid sequence of HT1-11-scFv-LH
  • Figure 21 SEQ ID NO: 7: heavy chain amino acid sequence of MHT1007
  • SEQ ID NO: 8 heavy chain amino acid sequence of MHT1008
  • SEQ ID NO: 9 heavy chain amino acid sequence of MHT1009
  • SEQ ID NO: 10 heavy chain amino acid sequence of MHT1803
  • SEQ ID NO: 12 heavy chain amino acid sequence of
  • SEQ ID NO: 37 Amino acid sequence recognized by human uPA and serving as its substrate
  • SEQ ID NO: 38 Amino acid sequence recognized by human uPA and serving as its substrate
  • SEQ ID NO: 39 Amino acid sequence recognized by human MMP1 and serving as its substrate
  • SEQ ID NO: 40 Amino acid sequence recognized by human MMP1 and serving as its substrate
  • SEQ ID NO: 41 Amino acid sequence recognized by human MMP9 and serving as its substrate
  • SEQ ID NO: 42 amino acid sequence of second peptide ( Figure 52)
  • SEQ ID NO: 43 Amino acid sequence of second peptide ( Figure 52)
  • SEQ ID NO: 44 amino acid sequence of second peptide ( Figure 52)
  • SEQ ID NO: 45 amino acid sequence of human GPRC5D amino terminal peptide ( Figure 53)
  • SEQ ID NO: 46 amino acid sequence of second peptide ( Figure 54)
  • SEQ ID NO: 47 amino acid sequence of second peptide ( Figure 54)
  • SEQ ID NO: 48 amino acid sequence of second peptide ( Figure 54)
  • SEQ ID NO: 52 Amino acid sequence of second peptide ( Figure 54)
  • SEQ ID NO: 53 Amino acid sequence of second peptide ( Figure 54)
  • SEQ ID NO: 68 Light chain amino acid sequence of MhM1026-M1 ( Figure 57)
  • SEQ ID NO: 69 Light chain amino acid sequence of MhM1028-M1
  • SEQ ID NO: 70 Light chain amino acid sequence of MhM1042-M1 ( Figure 59)
  • SEQ ID NO:71 Light chain amino acid sequence of MhM1043-M1 ( Figure 60)
  • SEQ ID NO: 72 Light chain amino acid sequence of MhM1044-M1 ( Figure 61)
  • SEQ ID NO:73 Light chain amino acid sequence of MhM1045-M1 ( Figure 62)
  • SEQ ID NO:74 Light chain amino acid sequence of MhM1046-M1 ( Figure 63)
  • SEQ ID NO: 76 amino acid sequence of second peptide
  • SEQ ID NO: 77 amino acid sequence of second peptide
  • SEQ ID NO: 78 amino acid sequence of

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Abstract

従来のマスク抗体より優れた性能を有するマスク抗体を提供すること。　下記［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分を含んでなる、該標的抗原に結合する分子： ［ａ］部分　標的抗原に結合する部分； ［ｂ］部分　［ａ］部分に含まれる標的抗原結合部位を認識する第１ペプチド； ［ｃ］部分　ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を含むアミノ酸配列からなる第２ペプチド。

Description

環境応答性マスク抗体及びその利用
　本発明は、特定の環境に置かれることにより活性化されるマスク抗体に関する。
　抗体は抗原すなわち標的分子への認識特異性や結合活性が非常に高く、低分子化合物、ペプチド、蛋白質など多様な分子が抗原になり得る。また、抗体医薬品は生産性や生体内での安定性も高く、癌、免疫疾患、感染症など様々な疾患を対象に開発が進められている。近年では、より薬効の優れた抗体医薬品として、細胞毒性のある薬剤を抗体に結合させたＡｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＤＣ）や、二重特異性抗体によって標的細胞と細胞傷害性Ｔ細胞を架橋し、標的細胞を攻撃可能なＴ－Ｃｅｌｌ　Ｅｎｇａｇｉｎｇ（ＴＣＥ）などの研究開発が進められている。ＡＤＣやＴＣＥなどは強力な抗腫瘍活性を示す一方で、標的分子が正常組織に発現する場合、標的分子を介した正常組織への毒性が課題となっている（非特許文献１）。
　腫瘍微小環境の性質（腫瘍組織におけるプロテアーゼ活性の亢進など）を利用し、腫瘍組織で特異的に作用する改変抗体としてマスク抗体が知られている。マスク抗体は、正常組織中での結合活性が抑制されているため、標的分子を介した正常組織への毒性が低く、安全性の高い抗体医薬品として期待されている（非特許文献２）。マスク抗体は、抗体本体、抗体の結合を阻害するマスキングドメイン、抗体とマスキングドメインをつなぎプロテアーゼにより切断可能な切断リンカーから構成される（特許文献１）。マスキングドメインとしては、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）に結合するミモトープペプチドの他、抗体とは直接相互作用しないコイルドコイルドメインなどが知られている（非特許文献３）。また切断リンカーには、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）やウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）など、腫瘍組織で活性が亢進している細胞外プロテアーゼの基質が搭載され、腫瘍組織選択的な抗体の活性化を可能にしている（特許文献２）。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）をマスク化した先行研究では、腫瘍組織におけるマスク抗体の活性化や、ＥＧＦＲが発現する皮膚への暴露量低下、血中半減期の延長、安全性の改善などが報告されている（非特許文献４）。その他、二重特異性抗体やサイトカインなど多様なバイオロジクス分子に対してマスク化技術が適用されている（特許文献３、４）。
　腫瘍微小環境の特徴としては、亢進したプロテアーゼ活性以外にも、細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）の酸性化が知られている。腫瘍組織の酸性化は、癌細胞の糖代謝系に依存した乳酸の蓄積が原因であると考えられており、細胞外へのプロトン放出には、Ｎａ＋／Ｈ＋　ｅｘｃｈａｎｇｅｒ(ＮＨＥ)、モノカルボン酸トランスポーター、Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅなど各種トランスポーターが関与していることが報告されている。腫瘍組織のｐＨｅ低下は、分泌されたリソソームプロテアーゼの活性化に関与しており、癌細胞の転移や浸潤プロセスを助けている他、がん細胞の薬剤耐性や免疫逃避などにも影響を与えている（非特許文献５）。
　腫瘍微小環境のｐＨｅ低下を利用し、腫瘍組織特異性を向上させる抗体技術として、抗体のＣＤＲ領域に変異を導入し低ｐＨ環境で抗原への結合活性を向上させる手法や（特許文献５、非特許文献６）、ｐＨ依存的に抗体に結合するマスキングドメインをもつマスク抗体技術が知られている（特許文献６）。後者では、抗ＣＴＬＡ－４抗体に対して中性ｐＨ条件では結合するが、酸性ｐＨ条件では結合しないマスキングペプチドの取得例が報告されている。
国際公開ＷＯ２００９／０２５８４６号 国際公開ＷＯ２０１０／０８１１７３号 国際公開ＷＯ２０１６／０１４９７４号 国際公開ＷＯ２０２０／０６９３９８号 国際公開ＷＯ２０１０／１０４８２１号 国際公開ＷＯ２０１８／２１８０７６号
Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．；１７：１９７－２２３（２０１８）． Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｌ　Ｔｈｅｒ．；１４（８）：１０４９－５３（２０１４）． ＡＣＳ　Ｃｅｎｔ．　Ｓｃｉ．；７：７２４－３８（２０２１）． Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ．；５（２０７）：１－１０（２０１３）． Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．；１３（８９）：１－８（２０１３）． Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｄ．　Ｓｃｉ．；１１８（９）：１－１０（２０２１）．
　従来のマスク抗体より優れた性能を有するマスク抗体を提供する。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、腫瘍環境のｐＨｅが酸性化していることに着目し、マスク抗体のマスクペプチドと抗体を連結するリンカーを改良することにより、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］　下記［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分を含んでなる、標的抗原に結合する分子:
［ａ］部分　標的抗原に結合する部分；
［ｂ］部分　［ａ］部分に含まれる標的抗原結合部位を認識する第１ペプチド；
［ｃ］部分　ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を含むアミノ酸配列からなる第２ペプチド。
［２］　酸性条件下において、中性条件下と比較して、標的抗原に対しより高い結合親和性を有することを特徴とする、［１］の分子。
［３］　［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分をそれぞれ１つ又は２つ以上含む、［１］又は［２］の分子。
［４］　［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分をそれぞれ１つ又は２つ以上含み、［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分のそれぞれの数が互いに同一である、［１］～［３］のいずれか１つの分子。
［５］　［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分をそれぞれ２つずつ含む、[１]又は[２]の分子。
［６］　第２ペプチドが、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を４つ以上含み、且つ第２ペプチドのｐＩ値が６．４を超えるアミノ酸配列からなる、［１］～［５］のいずれか１つの分子。
［７］　第２ペプチドが、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を４つ以上含み、且つ第２ペプチドのｐＩ値が６．８以上であるアミノ酸配列からなる、［１］～［６］のいずれか１つの分子。
［８］　第２ペプチドが、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を４つ以上含み、且つ第２ペプチドのｐＩ値が７．２以上であるアミノ酸配列からなる、［１］～［７］のいずれか１つの分子。
［９］　第２ペプチドが、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を４つ以上含み、且つ第２ペプチドのｐＩ値が７．６以上であるアミノ酸配列からなる、［１］～［８］のいずれか１つの分子。
［１０］　第２ペプチドが、ｐＨが酸性条件において負電荷を有するアミノ酸を含まないアミノ酸配列からなる、［１］～［９］のいずれか１つの分子。
［１１］　第２ペプチドが、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含まないアミノ酸配列からなる、［１］～［１０］のいずれか１つの分子。
［１２］　第２ペプチドが、以下の（１）及び（２）の構造を有するアミノ酸配列からなる、［１］～［１１］のいずれか１つの分子：
（１）（ａ）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列、又は（ｂ）(a)のアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列（（ａ）のアミノ酸配列及び（ｂ）のアミノ酸配列を塩基性アミノ酸クラスターという。）を１つ以上含み、且つ、
（２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含む。
［１３］　第２ペプチドが、以下の（１）及び（２）の構造を有するアミノ酸配列からなる、［１］～［１２］のいずれか１つの分子：
（１）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を１つ以上含み、且つ、
（２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含む。
［１４］　第２ペプチドが、以下の（１）及び（２）の構造を有するアミノ酸配列からなる、［１］～［１３］のいずれか１つの分子：
（１）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を１つ含み、且つ、
（２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含む。
［１５］　第２ペプチドが、以下の（１）及び（２）の構造を有するアミノ酸配列からなる、［１］～［１４］のいずれか１つの分子：
（１）ＲＨＨＨで表されるアミノ酸配列を１つ含み、且つ、
（２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含む。
［１６］　第２ペプチドが、２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を１つ以上含み、且つ該ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含むアミノ酸配列からなる、［１］～［１２］のいずれか１つの分子。
［１７］　第２ペプチドが、ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を１つ置きに有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列で表される構造からなる、［１］～［１１］のいずれか１つの分子。
［１８］　塩基性官能基のｐＫａが５．０～７．０である、［１２］～［１７］のいずれか１つの分子。
［１９］　塩基性官能基のｐＫａが５．５～６．５である、［１２］～［１８］のいずれか１つの分子。
［２０］　ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸が天然アミノ酸である、［１２］～［１９］のいずれか１つの分子。
［２１］　ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸が非天然アミノ酸である、［１２］～［１９］のいずれか１つの分子。
［２２］　ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸がヒスチジンである、［１２］～［２０］のいずれか１つの分子。
［２３］　第２ペプチドが塩基性アミノ酸クラスターを１～４個含むアミノ酸配列からなる、［１］～［２２］のいずれか１つの分子。
［２４］　第２ペプチドが１０～６０個のアミノ酸からなる、［１］～［２３］のいずれか１つの分子。
［２５］　第２ペプチドが１２～５０個のアミノ酸からなる、［１］～［２４］のいずれか１つの分子。
［２６］　第２ペプチドが１５～４０個のアミノ酸からなる、［１］～［２５］のいずれか１つの分子。
［２７］　第２ペプチドが２０～３５個のアミノ酸からなる、［１］～［２６］のいずれか１つの分子。
［２８］　第２ペプチドが配列番号４９乃至５３、５５、５９乃至６１、６５、６６、７５乃至８１（図５４及び６４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、［１］～［１６］及び［１８］～［２７］のいずれか１つの分子。
［２９］　第２ペプチドが配列番号５４（図５４）で示されるアミノ酸配列を含む、［１７］～［２７］のいずれか１つの分子。
［３０］　ＥＣ５０比が３以上である［１］～［２９］のいずれか１つの分子。
［３１］　ＥＣ５０比が１０以上である［１］～［３０］のいずれか１つの分子。
［３２］　ＥＣ５０比が３０以上である［１］～［３１］のいずれか１つの分子。
［３３］　第２ペプチドが１０個以下のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を含むアミノ酸配列からなる、［１］～［３２］のいずれか１つの分子。
［３４］　第２ペプチドのアミノ酸配列に２つ以上の塩基性アミノ酸クラスターが含まれ、１つの塩基性アミノ酸クラスターが該アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシル末端に位置し、且つ他のいずれの塩基性アミノ酸クラスターも該アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシル末端に位置しない、［１］～［３３］のいずれか１つの分子。
［３５］　第２ペプチドのアミノ酸配列に２つ以上の塩基性アミノ酸クラスターが含まれ、１つの塩基性アミノ酸クラスターが該アミノ酸配列のアミノ末端に位置し、且つ他の１つの塩基性アミノ酸クラスターがカルボキシル末端に位置する、［１］～［３３］のいずれか１つの分子。
［３６］　第２ペプチドのアミノ酸配列に含まれるいずれの塩基性アミノ酸クラスターも、該アミノ酸配列のアミノ末端に位置せず且つカルボキシル末端に位置しない、［１］～［３３］のいずれか１つの分子。
［３７］　第２ペプチドのアミノ酸配列に細胞内及び／又は細胞外のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列及び塩基性アミノ酸クラスターを含むアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、
（１）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、塩基性アミノ酸クラスターを含むアミノ酸配列、細胞内及び／又は細胞外のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列の順に連結してなる、又は
（２）カルボキシル末端からアミノ末端に向かって、細胞内及び／又は細胞外のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列、塩基性アミノ酸クラスターを含むアミノ酸配列の順に連結してなる、
［１］～［３４］又は［３６］のいずれか１つの分子。
［３８］　第２ペプチドのアミノ酸配列に含まれるｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸数が、該アミノ酸配列に含まれる全アミノ酸数の５％以上、３０％以下である、［１２］～［３７］のいずれか１つの分子。
［３９］　第１ペプチド、第２ペプチド、標的抗原に結合する部分の順に連結してなる、［１］～［３８］のいずれか１つの分子。
［４０］　標的抗原に結合する部分が、第１ペプチド及び第２ペプチドには含まれないアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］～［３９］のいずれか１つの分子。
［４１］　ポリペプチドからなる、［１］～［４０］のいずれか１つの分子。
［４２］　アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、第１ペプチド、第２ペプチド、標的抗原に結合する部分に結合してなる、［４１］の分子。
［４３］　第１ペプチド、第２ペプチド及び標的抗原に結合する部分からなる群より選択されるいずれか１つが、他の２つのうち１つ又は両方とリンカー又はスペーサーを介して結合している、［１］～［４２］のいずれか１つの分子。
［４４］　酸性条件がｐＨ６．５以下である、［１］～［４３］のいずれか１つの分子。
［４５］　酸性条件がｐＨ６．０以下である、［１］～［４４］のいずれか１つの分子。
［４６］　酸性条件がｐＨ５．５以下である、［１］～［４５］のいずれか１つの分子。
［４７］　標的抗原が腫瘍組織、エンドソーム又はリソソームに存在する抗原である、［１］～［４６］のいずれか１つの分子。
［４８］　標的抗原に結合する部分に、他の部分である［ｄ］部分が結合してなり、［ｄ］部分が第１ペプチド及び第２ペプチドを含まない、［１］～［４７］のいずれか１つの分子。
［４９］　［ｄ］部分が、標的抗原に結合する部分ではない抗体若しくはその抗原結合断片、第１ペプチド及び第２ペプチドに含まれないアミノ酸配列を含むペプチド、サイトカイン、毒素、放射性同位元素、標識分子、光感受性物質、免疫賦活化物質、抗腫瘍性化合物、薬物、ペイロード並びにポリマーからなる群より選択される１つ又は２つ以上である、［４８］の分子。
［５０］　抗腫瘍性化合物が、カンプトテシン誘導体又はｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ誘導体であり、好適には、カンプトテシン誘導体がＮ－［（１Ｓ，９Ｓ）－９－Ｅｔｈｙｌ－５－ｆｌｕｏｒｏ－９－ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌ－１０，１３－ｄｉｏｘｏ－２，３，９，１０，１３，１５－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，１２Ｈ－ｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ｐｙｒａｎｏ［３'，４'：６，７］ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｏ［１，２－ｂ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔａｍｉｄｅである、［４９］の分子。
［５１］　免疫賦活化物質が環状ジヌクレオチド誘導体である［４９］の分子。
［５２］　ポリペプチドからなるか、又は［ｄ］部分及びポリペプチドからなる、［４８］～［５１］のいずれか１つの分子。
［５３］　第１ペプチドが、下記工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む方法により得られる、［１］～［５２］のいずれか１つの分子：
（ｉ）芳香族性アミノ酸とＰｒｏの繰返し配列を含むペプチドライブラリーを［１］の標的抗原に結合する部分に接触させる工程；
（ｉｉ）該標的抗原に結合する部分に結合するペプチドを回収する工程；及び
（ｉｉｉ）得られたペプチドを組換え、化学合成又はペプチド合成により調製する工程。
［５４］　第１ペプチドに含まれるアミノ酸配列及び／又は第２ペプチドに含まれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドを組換え、インビトロ翻訳、化学合成又はペプチド合成により調製する工程を含む、［１］～［５２］のいずれか１つの分子の製造方法。
［５５］　［５４］の方法により得られる、標的抗原に結合する分子。
［５６］　下記（ｉｖ）記載の工程を含む、［４１］、［４２］又は［５２］のいずれか１つの分子の製造方法。
（ｉｖ）標的抗原に結合する部分に含まれるアミノ酸配列、並びに、任意で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）、第１ペプチドに含まれるアミノ酸配列、及び／又は、第２ペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを細胞に導入し、該細胞を培養し、該培養物から該標的抗原に結合するポリペプチドを回収する工程。
［５７］　［５６］の方法により得られる、標的抗原に結合する分子。
［５８］　［１］～［５３］、［５５］及び［５７］のいずれか１つの分子、その塩又はそれらの水和物を含む、医薬組成物。
［５９］　抗がん剤である、［５８］の医薬組成物。
［６０］　標的抗原に結合する分子の中性ｐＨ条件における抗原結合活性を酸性ｐＨ条件における抗原結合活性より弱くすることにより、第２ペプチドがｐＨ７．５以下の範囲でｐＨの中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を含まない分子と比較して、被投与者に対する標的抗原に結合する分子の毒性が低減されている［５８］又は［５９］の医薬組成物。
［６１］　標的抗原に結合する分子の中性ｐＨ条件における抗原結合活性を酸性ｐＨ条件における抗原結合活性より弱くすることにより、第２ペプチドがｐＨ７．５以下の範囲でｐＨの中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を含まない分子と比較して、被投与者に対する標的抗原に結合する分子の血中濃度が向上されている［５８］又は［５９］の医薬組成物。
［６２］　［１］～［５３］、［５５］及び［５７］のいずれか１つの分子又は［５８］の医薬組成物を含む検査薬、診断薬又は試薬。
［６３］　［４１］又は［５２］の分子のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
［６４］　［６３］のポリヌクレオチドを含むベクター。
［６５］　［６３］のポリヌクレオチド若しくは［６４］のベクターを含むか又は［４１］又は［５２］の分子を産生する細胞。
　さらに、本発明は以下の発明も包含する。
［ｉ］　［１］の第２ペプチドのアミノ酸配列を含む、ｐＨ応答性を有するペプチドリンカー。
［ｉｉ］　配列番号４９乃至５５、５９乃至６１、６５、６６、７５乃至８１（図５４及び６４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、［ｉ］のペプチドリンカー。
［ｉｉｉ］　［ｉ］又は［ｉｉ］のペプチドリンカーのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
［ｉｖ］　［ｉｉｉ］のポリヌクレオチドを含むベクター。
［ｖ］　［ｉｉｉ］のポリヌクレオチド若しくは［ｉｖ］のベクターを含むか又は［ｉ］又は［ｉｉ］のペプチドリンカーを産生する細胞。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２２－１９１２５号及び日本国特許出願番号２０２２－１９６５２４号開示内容を包含する。
図１は、本発明のコンセプトを示している。ｐＨ変化に応答して活性化されるマスク抗体のフォーマットを一例として示す。抗体の可変領域（白）に結合するマスキングドメイン（格子）がリンカーで抗体重鎖の可変領域に融合されている。リンカーにはｐＨ応答性を示すヒスチジン残基のクラスター（Ｈｉｓクラスター（黒塗り））が存在しており、中性ｐＨの状態ではマスキングドメインが抗体の可変領域と結合している。その一方、酸性ｐＨ条件ではＨｉｓクラスター内部のヒスチジン残基が正に帯電し、リンカーの構造変化が誘起され、マスキングドメインが抗体から離れた状態、すなわち抗体が抗原に結合可能な状態になる。 図２は、ＷＯ２０１５／０９８０９９号に記載の公知の抗ＴＲＯＰ２抗体ＨＴ１－１１とヒトＴＲＯＰ２抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。ＨＴ１－１１は濃度依存的に抗原に結合した。 図３は、抗ＴＲＯＰ２抗体ＨＴ１－１１に対するパニング後のペプチドバインダーの濃縮度合いをプルダウン実験で評価した際のｏｕｔｐｕｔ／ｉｎｐｕｔ比を示している。ヒト血清由来ＩｇＧ（ＩｇＧ　ｍｉｘｔｕｒｅ）よりもＨＴ１－１１で値が高く、ＨＴ１－１１特異的に結合するペプチドの濃縮が示唆された。 図４－１は、ｓｃＦｖ型の抗ＴＲＯＰ２抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。結合活性はＭＭＰ非添加条件（実線）及びＭＭＰ１添加条件（点線）で評価した。（Ａ）ＨＴ１－１１－ｓｃＦｖ－ＨＬはＭＭＰ添加条件に関わらず同様の結合活性を示した。（Ｂ）ＨＴ１－１１－ｓｃＦｖ－ＬＨはＭＭＰ添加条件に関わらず同様の結合活性を示した。 図４－２は、ｓｃＦｖ型の抗ＴＲＯＰ２抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。結合活性はＭＭＰ非添加条件（実線）及びＭＭＰ１添加条件（点線）で評価した。（Ｃ）ＭＨＴ１００１はＭＭＰ１添加条件においてＭＭＰ１非添加条件よりも強い結合活性を示した。（Ｄ）ＭＨＴ１００２はＭＭＰ１添加条件においてＭＭＰ１非添加条件よりも強い結合活性を示した。 図５－１は、ＩｇＧ型の抗ＴＲＯＰ２マスク抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。結合活性はプロテアーゼ非添加条件（実線）及びプロテアーゼ添加条件（点線）で評価した。（Ａ）ＨＴ１－１１はＭＭＰ添加条件に関わらず同様の結合活性を示した。（Ｂ）ＭＨＴ１００７はＭＭＰ１添加条件においてＭＭＰ１非添加条件よりも強い結合活性を示した。 図５－２は、ＩｇＧ型の抗ＴＲＯＰ２マスク抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。結合活性はプロテアーゼ非添加条件（実線）及びプロテアーゼ添加条件（点線）で評価した。（Ｃ）ＭＨＴ１００８はＭＭＰ添加条件に関わらず同様の結合活性を示した。（Ｄ）ＭＨＴ１００９はｕＰＡ添加条件においてｕＰＡ非添加条件よりも強い結合活性を示した。 図６－１は、Ｈｉｓクラスターを搭載した抗ＴＲＯＰ２マスク抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、実線）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、点線）における相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。（Ａ）ＭＨＴ１００８は両ｐＨ条件で同様の結合活性を示した。（Ｂ）ＭＨＴ１８０３は中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。 図６－２は、Ｈｉｓクラスターを搭載した抗ＴＲＯＰ２マスク抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、実線）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、点線）における相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。（Ｃ）ＭＨＴ１８０４は中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。（Ｄ）ＭＨＴ１８０５は中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。 図６－３は、Ｈｉｓクラスターを搭載した抗ＴＲＯＰ２マスク抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、実線）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、点線）における相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。（Ｅ）ＭＨＴ１８０６は中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。（Ｆ）ＭＨＴ１８０８は中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。 図６－４は、Ｈｉｓクラスターを搭載した抗ＴＲＯＰ２マスク抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、実線）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、点線）における相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。（Ｇ）ＭＨＴ１８０９は中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。（Ｈ）ＭＨＴ１８１０は中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。 図６－５は、Ｈｉｓクラスターを搭載した抗ＴＲＯＰ２マスク抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、実線）、ＭＭＰ１と反応させた条件（（Ｉ）において破線）、酸性ｐＨ条件（ｐＨ６．５、（Ｊ）において破線）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、点線）における相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。（Ｉ）ＨｉｓクラスターとＭＭＰ基質をリンカーに搭載したＭＨＴ１８１１は中性ｐＨ条件よりも酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。また、ＭＭＰ１と反応させた条件（破線）でも強い結合活性を示した。（Ｊ）ＭＨＴ１８０６は中性ｐＨ条件よりｐＨ６．５以下の酸性ｐＨ条件（破線）で強い結合活性を示した。 図６－６は、Ｈｉｓクラスターを搭載した抗ＴＲＯＰ２マスク抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、実線）、酸性ｐＨ条件（ｐＨ６．０、破線）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、点線）における相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。（Ｋ）ＭＨＴ１８０８は中性ｐＨ条件よりもｐＨ６．０以下の酸性ｐＨ条件（破線）で強い結合活性を示した。 図７は、ｐＨ７．５（黒色）、ｐＨ６．５（灰色）、ｐＨ６．０（白色）におけるＭＨＴ１８０８、ＭＨＴ１８１７、ＭＨＴ１８１８、ＭＨＴ１８１９の結合活性を示している。 図８－１は、（Ａ）ＷＯ２０１５／１４６１３２号に記載の公知の抗ＣＤ９８抗体ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１とヒトＣＤ９８抗原の相互作用、及び（Ｂ）公知の抗ＥＧＦＲ抗体ＣｅｔｕｘｉｍａｂとヒトＥＧＦＲの相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果をそれぞれ示している。抗体は濃度依存的に抗原に結合した。 図８－２は、（Ｃ）ＷＯ２０１８／１４７２４５号に記載の公知の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体Ｃ３０２２とヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。抗体は濃度依存的に抗原に結合した。 図９－１は、（Ａ）ペプチドライブラリーの種類および、（Ｂ）抗ＣＤ９８抗体ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１に対するパニング後のペプチドバインダーの濃縮度合いをプルダウン実験で評価した際のｏｕｔｐｕｔ／ｉｎｐｕｔ比を示している。ヒト血清由来ＩｇＧ（ＩｇＧ　ｍｉｘｔｕｒｅ）よりも標的抗体で値が高く、標的抗体特異的なペプチドの濃縮が示唆された。 図９－２は、図９－１（Ａ）ペプチドライブラリーを使用した（Ｃ）抗ＥＧＦＲ抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、又は（Ｄ）抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体Ｃ３０２２に対するパニング後のペプチドバインダーの濃縮度合いをプルダウン実験で評価した際のｏｕｔｐｕｔ／ｉｎｐｕｔ比を示している。ヒト血清由来ＩｇＧ（ＩｇＧ　ｍｉｘｔｕｒｅ）よりも標的抗体で値が高く、標的抗体特異的なペプチドの濃縮が示唆された。 図１０－１は、共通のｐＨ応答性リンカーを搭載した（Ａ）抗ＣＤ９８マスク抗体ＭｈＭ８００１とヒトＣＤ９８抗原の相互作用、及び（Ｂ）抗ＥＧＦＲマスク抗体ＭＣＥ－２１０１とヒトＥＧＦＲの相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果をそれぞれ示している。結合は中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、実線）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、点線）で評価した。いずれの抗体も中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。 図１０－２は、共通のｐＨ応答性リンカーを搭載した（Ｃ）抗ＧＰＲＣ５Ｄマスク抗体ＭＣ３－９００１とヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。結合は中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、実線）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、点線）で評価した。いずれの抗体も中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。 図１１は、抗ＴＲＯＰ２マスク抗体とヒトＴＲＯＰ２抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。結合は中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、黒色シンボル）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、白色シンボル）で評価した。ＭＨＴ１８０８（黒丸及び白丸）は中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。ＭＨＴ１２２１（黒四角及び白四角）及びＭＨＴ１００８（黒三角及び白三角）は中性ｐＨ条件と酸性ｐＨ条件で同等の結合活性を示した。 図１２は、糖鎖改変抗体のＮ２９７糖鎖（非還元末端のシアル酸にアジド基を導入したＭＳＧ１型糖鎖（ＷＯ２０１９/０６５９６４号））を示している。 図１３は、（Ａ）ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１重鎖可変領域内のＣＤＲ１に点変異を導入したｈＭ２３－Ｍ１のヒトＣＤ９８抗原に対する結合活性をＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）で評価した結果及び、（Ｂ）ＭｈＭ１０１３に上記変異を導入したＭｈＭ１０１３－Ｍ１のヒトＣＤ９８抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。ＭｈＭ１０１３－Ｍ１（灰色）はＭｈＭ１０１３（黒色）と同等以上のマスク効果を示した。 図１４は、抗ＣＤ９８マスク抗体とヒトＣＤ９８抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。結合は中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５、黒色シンボル）又は酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５、白色シンボル）で評価した。ＭｈＭ１０１８－Ｍ１（黒丸及び白丸）は中性ｐＨ条件と酸性ｐＨ条件で同等の結合活性を示した。ＭｈＭ１０２４－Ｍ１（黒四角及び白四角）は中性ｐＨ条件より酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示した。 図１５－１は、マスク抗体ＡＤＣのｐＨ７．４（白丸、灰色実線）、ｐＨ６．５（四角、灰色点線）、ｐＨ６．０（黒丸、黒色点線）、ｐＨ５．５（黒四角、黒色実線）におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖阻害活性を示している。（Ａ）ＭＨＴ１８０８－ＰＢＤ－ＡＤＣはｐＨ低下依存的に強い増殖阻害活性を示した。（Ｂ）ＭＨＴ１２２１－ＰＢＤ－ＡＤＣはいずれの条件でも同等の増殖阻害活性を示した。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。 図１５－２は、マスク抗体ＡＤＣのｐＨ７．４（白丸、灰色実線）、ｐＨ６．５（四角、灰色点線）、ｐＨ６．０（黒丸、黒色点線）、ｐＨ５．５（黒四角、黒色実線）におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖阻害活性を示している。（Ｃ）ＭｈＭ１０２４－Ｍ１－ＤＸｄ－ＡＤＣはｐＨ低下依存的に強い増殖阻害活性を示した。（Ｄ）ＭｈＭ１０１８－Ｍ１－ＤＸｄ－ＡＤＣはいずれの条件でも同等の増殖阻害活性を示した。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。 ＨＴ１－１１　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１） ＨＴ１－１１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２） ＭＨＴ１００１全長のアミノ酸配列（配列番号３） ＭＨＴ１００２全長のアミノ酸配列（配列番号４） ＨＴ１－１１－ｓｃＦｖ－ＨＬ全長のアミノ酸配列（配列番号５） ＨＴ１－１１－ｓｃＦｖ－ＬＨ全長のアミノ酸配列（配列番号６） ＭＨＴ１００７　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号７） ＭＨＴ１００８　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号８） ＭＨＴ１００９　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号９） ＭＨＴ１８０３　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１０） ＭＨＴ１８０４　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１１） ＭＨＴ１８０５　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１２） ＭＨＴ１８０６　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１３） ＭＨＴ１８０８　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１４） ＭＨＴ１８０９　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１５） ＭＨＴ１８１０　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１６） ＭＨＴ１８１１　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１７） ＭＨＴ１８１７　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１８） ＭＨＴ１８１８　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号１９） ＭＨＴ１８１９　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２０） ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２１） ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２２） Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２３） Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２４） Ｃ３０２２　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２５） Ｃ３０２２　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２６） ＭｈＭ８００１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２７） ＭＣＥ－２１０１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２８） ＭＣ３－９００１　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号２９） ＭＨＴ１２２１　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号３０） ｈＭ２３－Ｍ１　Ｈ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号３１） ｈＭ２３－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号３２） ＭｈＭ１０１３　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号３３） ＭｈＭ１０１８－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号３４） ＭｈＭ１０２４－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号３５） ヒトｕＰＡが認識し、その基質となるアミノ酸配列及びヒトＭＭＰ１またはヒトＭＭＰ９が認識し、その基質となるアミノ酸配列（配列番号３６～４１） 第２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号４２～４４） ヒトＧＰＲＣ５Ｄアミノ末端ペプチドのアミノ酸配列（配列番号４５） 第２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号４６～６６） ヒトＣＡＰＮ１が認識し、その基質となるアミノ酸配列（配列番号６７） 図５６－１は、抗ＣＤ９８マスク抗体とヒトＣＤ９８抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。（Ａ）、（Ｂ）はｐＨ７．５、ｐＨ５．５の条件におけるＭｈＭ１０２６－Ｍ１（黒丸）、ＭｈＭ１０２８－Ｍ１（黒四角）、ＭｈＭ１０４２－Ｍ１（丸）、ＭｈＭ１０４３－Ｍ１（四角）の結合活性をそれぞれ示している。 図５６－２は、抗ＣＤ９８マスク抗体とヒトＣＤ９８抗原の相互作用をＥＬＩＳＡで評価した結果を示している。（Ｃ）、（Ｄ）はｐＨ７．５、ｐＨ５．５の条件におけるＭｈＭ１０２６－Ｍ１（黒丸）、ＭｈＭ１０４４－Ｍ１（黒四角）、ＭｈＭ１０４５－Ｍ１（丸）、ＭｈＭ１０４６－Ｍ１（四角）の結合活性をそれぞれ示している。 ＭｈＭ１０２６－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号６８） ＭｈＭ１０２８－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号６９） ＭｈＭ１０４２－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号７０） ＭｈＭ１０４３－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号７１） ＭｈＭ１０４４－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号７２） ＭｈＭ１０４５－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号７３） ＭｈＭ１０４６－Ｍ１　Ｌ鎖全長のアミノ酸配列（配列番号７４） 第２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号７５～８１）
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．定義
　本発明において「ＤＸｄ」とは、「Ｎ－［（１Ｓ，９Ｓ）－９－Ｅｔｈｙｌ－５－ｆｌｕｏｒｏ－９－ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌ－１０，１３－ｄｉｏｘｏ－２，３，９，１０，１３，１５－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，１２Ｈ－ｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ｐｙｒａｎｏ［３’，４’：６，７］ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｏ［１，２－ｂ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔａｍｉｄｅ」を意味する。
　本発明において「ＰＢＤ」とは、「ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ」を意味する。
　本発明において「ミモトープ」とは、「抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）に結合するペプチド」を意味する。ミモトープのアミノ酸配列は抗体が認識する抗原のアミノ酸配列（エピトープ）とは必ずしも一致しない特徴をもつ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．；２３（７）：７０９－７１５（１９８６））。
　本発明において「アミノ酸」とは、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のことをいう。
　天然アミノ酸は、２０の共通アミノ酸、ピロリジン及びセレノシステインである。上記２０の共通アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンである。
　非天然アミノ酸は、２０の共通アミノ酸、ピロリジン又はセレノシステインのいずれでもないアミノ酸をいう。非天然アミノ酸と同義語として使用され得る他の用語は、「天然にコードされていないアミノ酸」、「非天然型アミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」等である。非天然アミノ酸は、天然アミノ酸の修飾によって天然に存在するが翻訳複合体によって成長するポリペプチド鎖にはそれら自身は組み込まれないアミノ酸を含む。さらに、非天然アミノ酸は、天然に存在せず合成的に得ることができるか、又は天然アミノ酸の修飾によって得ることができるアミノ酸を含むが、これに限定されない。
　本発明において、「抗体」は、定常領域と可変領域とを有する免疫グロブリンの意味で用いる。抗体は、天然のものであるか、又は、部分的若しくは完全合成により製造された免疫グロブリンであるかは特に限定されない。
　基本的な４鎖抗体の構造は、２つの同一な軽鎖（Ｌ鎖）、及び、２つの同一な重鎖（Ｈ鎖）から構成される。軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する。２つの重鎖は、重鎖のアイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれの軽鎖、重鎖は規則的な間隔を持つ鎖内ジスルフィド結合を持つ。重鎖と軽鎖には、アミノ酸配列が非常に高い類似性を示す定常領域とアミノ酸配列の類似性が低い可変領域とが存在する。軽鎖は、定常領域（ＣＬ）が続く可変領域（ＶＬ）をアミノ末端に有する。重鎖は３つの定常領域（ＣＨ１／ＣＨ２／ＣＨ３）が続く可変領域（ＶＨ）をアミノ末端に有する。ＶＬとＶＨは対となり、ＣＬは重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）と並んでいる。ＶＬとＶＨは対となって、単一の抗原結合部位を形成する。
　本発明の抗体の定常領域としては、特に限定されるものではないが、ヒトの疾患を治療又は予防するための本発明の抗体としては、好適にはヒト抗体の定常領域が使用される。ヒト抗体の重鎖定常領域としては、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、Ｃε等を挙げることができる。ヒト抗体の軽鎖定常領域としては、例えば、Ｃκ、Ｃλ等を挙げることができる。
　Ｆａｂは、重鎖のＶＨとそれに続くＣＨ１、及び、軽鎖のＶＬとそれに続くＣＬからなる。ＶＨとＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＶＨとＣＨ１及びＶＬとＣＬの間にはリンカー又は連結部が在ってもよい。
　Ｆｃ（Ｆｃ領域ともいう）は、重鎖の定常領域のカルボキシル末端領域であって、ＣＨ２とＣＨ３を含み、二量体である。本発明のＦｃは、天然（野生型）の配列のＦｃであっても、天然の配列に変異がなされた変異型のＦｃ（「変異型Ｆｃ」という）であってもよく、本発明の多重特異性分子及び二重特異性分子において、好適なＦｃ領域は変異型Ｆｃであり、より好適にはヘテロ２量体を形成し得る１組のＦｃである。１組のＦｃとしては、後述の、第１ポリペプチドに含まれるＦｃ（ｉ）及び第２ポリペプチドに含まれるＦｃ（ｉｉ）の組合せをあげることができるが、１組のＦｃが会合（ヘテロ２量体形成）することができれば、それらに限定されるものではない。
　変異型Ｆｃとしては、ＷＯ２０１３／０６３７０２号に開示される、向上した安定性を有するヘテロ多量体に含まれる改変Ｆｃ領域（ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む）、ＷＯ９６／２７０１１号に開示される、異種多量体に含まれる、「突起」及び「空隙」を有するＩｇＧ抗体から誘導されるイムノグロブリンのＣＨ３領域を含むＦｃ、ＷＯ２００９／０８９００４号に開示される、１以上のアミノ酸残基を荷電アミノ酸に置換することで静電的に有利であるヘテロ二量体に含まれるＣＨ３ドメインを含むＦｃ、ＷＯ２０１４／１１０６０１号に開示される、立体構造変異及び／又はｐＩ（等電点）変異を用いた異種二量体に含まれる異種二量体Ｆｃ領域、ＷＯ２０１０／１５１７９２号に開示される、プロテインＡへの結合を無くすか又は減少させる改変を含むＣＨ３ドメインを含む、ヘテロ二量体のＦｃ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
　可変領域は、超可変領域（ＨＶＲ：ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ）と称される極度の可変性を有する領域と、その領域により分離されたフレームワーク領域（ＦＲ：Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる比較的不変の領域からなる。天然の重鎖と軽鎖の可変領域は、３つの超可変領域により接続される４つのＦＲを含み、各鎖の超可変領域はＦＲにより他の鎖の超可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。
　抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離している。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
　本発明において、ＣＤＲの位置と長さは、ＩＭＧＴの定義（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２７　（２００３）　５５－７７）により決定した。
　ＦＲは、可変領域のＣＤＲ以外の部分である。可変領域は、一般にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の４つのＦＲを持つ。
　重鎖並びに軽鎖に含まれるＣＤＲとＦＲは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲＨ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４、並びに、ＦＲＬ１－ＣＤＲＬ１－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４、の順にそれぞれ配置される。
　ＣＤＲとＦＲの位置は、当技術分野で周知の様々な定義、例えば、ＩＭＧＴ以外にも、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔ等の定義により決定することもできる。
　本発明において、抗体が結合する「部位」、すなわち抗体が認識する「部位」とは、抗体が結合又は認識する抗原上の部分ペプチド又は部分高次構造を意味する。
　本発明においては、かかる部位のことをエピトープ、抗体の結合部位とも呼ぶ。本発明において、「変異抗体」とは、元の抗体が有するアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加（付加には挿入が含まれる）（以下、「変異」と総称する）してなるアミノ酸配列を有し、且つ本発明の標的とする抗原に結合するポリペプチドを意味する。かかる変異抗体における変異アミノ酸の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０又は５０個以下である。かかる変異抗体も本発明の「抗体」に包含される。
　本発明において、「１又は数個」における「数個」とは、２～１０個を指す。
　本発明において、「分子」は、上述の抗体、抗体の抗原結合断片を含む分子であり、さらに抗体又はそれらに由来する複数の抗原結合断片より形成された多重特異的である分子を含む。
　本発明において「ＡがＢを搭載する」とは「ＡがＢを含む」又は「ＡにＢが結合、付加もしくは融合している」ことを意味する。例えば、「基質を搭載する抗体」は、「基質を含む抗体」、「基質が結合した抗体」、「基質が付加した抗体」又は「基質が融合した抗体」と解することができる。
 
２．標的抗原に結合する分子
　本発明は、標的抗原に結合する分子であって、特定の環境で前記標的抗原に特異的に結合する分子である。
　特定の環境とは、特定の組織又は細胞内小器官における環境をいい、例えば、癌微小環境、エンドソーム中の環境又はリソソーム中の環境が挙げられる。
　癌微小環境とは、癌組織内における環境をいい、例えば、酸性ｐＨの環境やプロテアーゼが存在する環境である。正常組織におけるｐＨが中性条件、例えば、ｐＨ７．０～７．５であるのに対して、癌組織内におけるｐＨは、７．０以下、好ましくは６．５以下、さらに好ましくは６．０以下である。
　本発明の標的抗原に結合する分子は、特定の環境で応答性を獲得するため、環境応答性分子と呼ぶことがあり、分子が抗体の場合、環境応答性マスク抗体と呼ぶ。
　本発明の標的抗原に結合する分子は、標的抗原に結合する部分（［ａ］部分）、該部分に含まれる該標的抗原結合部位を認識する第１ペプチド（［ｂ］部分）、及び、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む第２ペプチド（［ｃ］部分）を含み、好ましくはそれらが直接又は間接的に連結した状態で存在する。ここで、「間接的に連結した状態」とは、リンカー等を介して連結した状態をいう。標的抗原に結合する部分は、好ましくは、ポリペプチドである。該部分は、抗原抗体反応又はタンパク質（例えば、受容体）－リガンド結合により、標的抗原に結合する。標的抗原に結合する部分は、より好ましくは、抗原抗体反応により標的抗原に結合する抗体又は抗体の抗原結合断片である。第１ペプチドが、標的抗原に結合する部分中の標的抗原結合部位に結合することにより、該標的抗原結合部位をマスクする。この結果、該標的抗原結合部位は、標的抗原に結合することができないか又は結合し難くなる。
　本発明の標的抗原に結合する分子に含まれる［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分の数は特に限定されないが、［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分をそれぞれ１つ又は２つ以上含むことが好ましく、［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分をそれぞれ１つ又は２つ以上含み、［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分のそれぞれの数が互いに同一であることがより好ましく、［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分をそれぞれ２つずつ含むことがさらに好ましい。　図１に、本発明のコンセプトとしてｐＨ変化に応答して活性化されるマスク抗体のフォーマットを一例として示すが、本発明はこれに限定されない。標的抗原に結合する部分が２価の抗体（ＩｇＧ）であり、第２ペプチドがｐＨ応答性を示すヒスチジン残基のクラスター（ヒスチジンクラスター（Ｈｉｓクラスター）、図１の黒塗り四角部分）を含むペプチドである分子であり、図１の格子柄で示された第１ペプチドが抗体の抗原との結合部位に結合し該部位をマスクしている。第２ペプチドは、第１ペプチドと標的抗原に結合する部分を連結しており、ｐＨ応答性を示すので、ｐＨ応答性リンカーとも呼ぶ。第１ペプチドは、標的抗原結合部位を認識し結合し得るが、第２ペプチドが切断され、第１ペプチド単独で存在する場合、物理化学的条件により、結合、解離するので、永続的に結合していることはできないと考えられる。例えば、本発明の標的抗原に結合する分子においては、第１ペプチドは、第２ペプチドを介して標的抗原に結合する部分に結合しているので、標的抗原に結合する分子は、第１ペプチドの位置が標的抗原に結合する部分に含まれる該標的抗原結合部位の近傍に位置するようなコンフォメーションをとり、第１ペプチドは、分子のコンフォメーションが変化しない限り、平衡条件では標的抗原結合部位の大部分がマスクされているといった作用機序をとると想定することができるが (図１の左）、かかる機序はこれに限定されない。酸性ｐＨ条件により、第２ペプチドのＨｉｓクラスター内部のヒスチジン残基が正に帯電し、ヒスチジン残基どうしの斥力によりリンカーである第２ペプチドの構造変化が誘起され、第１ペプチドが標的抗原に結合する分子から解離し、第１ペプチドは、標的抗原結合部位に結合し続けることはできなくなり（図１の右、図中の「+」は正に帯電していることを示す）、この結果、標的抗原に結合する部分に含まれる該標的抗原結合部位が標的抗原に結合し得るようになり、第２ペプチドの構造変化が誘起される前と比較して、該標的抗原に対しより高い結合親和性を有するようになると考えられる。すなわち、本発明の標的抗原に結合する分子は、酸性ｐＨ条件下で、中性ｐＨ条件下に比して、標的抗原に対してより高い親和性をもって結合し得るようになる。このようなヒスチジン残基どうしの斥力による第２ペプチドの構造変化は、ｐＨ変化により生じる可逆的な現象である。従って、標的抗原に結合する分子が、酸性ｐＨ条件下から中性ｐＨ条件下に移行することで、中性ｐＨ条件下から酸性ｐＨ条件下に移行した際に生じる構造変化とは逆の構造変化が誘起され、第１ペプチドが標的抗原結合部位に結合することで、標的抗原に結合する分子の標的抗原に対する親和性は低下すると考えられる。本発明の標的抗原に結合する分子は、主として上述の様な機序によりその効果を発揮し得ると推測され得るが、かかる機序はそれに限定されず、他のメカニズムにより、又は他のメカニズムと併せて、その効果を発揮してもよい。
　本発明において、「酸性ｐＨ条件下で、中性ｐＨ条件下に比して、標的抗原に対してより高い親和性をもって結合する」という表現は、標的抗原に結合する分子の中性ｐＨ条件での標的抗原への親和性を、酸性ｐＨ条件での標的抗原への親和性よりも弱くすると表現することもできる。つまり、本発明においては、標的抗原に結合する分子の酸性ｐＨ条件における標的抗原への親和性と中性ｐＨ条件における標的抗原への親和性の差を大きくすればよい（例えば、後述のようにＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）の値を大きくすればよい）。標的抗原に結合する分子の酸性ｐＨ条件における標的抗原への親和性と中性ｐＨ条件における標的抗原への親和性の差を大きくするためには、例えば、酸性ｐＨ条件における標的抗原への親和性を高くしてもよいし、中性ｐＨ条件における標的抗原への親和性を低くしてもよいし、又は、その両方でもよい。
　本発明においては、第２ペプチドに塩基性アミノ酸クラスターを導入することでリンカー部分にｐＨ応答性を持たせる構成としている。マスクペプチド部分（本発明においては第１ペプチド）にｐＨ応答性を持たせる構成も考えられるが、そのような構成とした場合には、標的抗原に結合する部分毎に異なる配列のｐＨ応答性ペプチドを取得する必要がある。一方で、本発明の構成における、第２ペプチドの共通の配列モチーフ（塩基性アミノ酸クラスター）を有するリンカー部分は、異なる標的抗原に結合する部分においても汎用的に用いることができ、標的抗原に結合する部分毎に異なる配列のｐＨ応答性ペプチドを取得する必要がないという有利な効果がある。
　標的抗原に結合する分子は、酸性ｐＨ条件下で、中性ｐＨ条件下に比して、標的抗原に対してより高い親和性をもって結合することにより、標的抗原に結合する分子が正常組織において抗原に結合するのを防止し、その毒性を低減することができる。「毒性を低減する」とは、標的抗原に結合する分子がヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌなどの動物に投与されたときの、期待する薬効以外の望まない効果を低減することをいう。例えば、毒性には薬剤投与後の死亡・瀕死、体重減少、臓器毒性（皮膚、肝臓等）等を含む。「毒性が低減した」か否かは、標的抗原に結合する分子投与後における、被験者の体重測定、病理データの確認等の当業者に公知の方法を用いて判断することが可能である。
　標的抗原に結合する分子は、酸性ｐＨ条件下で、中性ｐＨ条件下に比して、標的抗原に対してより高い親和性をもって結合することにより、正常組織において発現する抗原への結合が抑えられ、その血中濃度を向上させることができると推測される。「血中濃度を向上させる」とは、標的抗原に結合する分子がヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌなどの動物に投与されたとき、血中濃度が最大値に達した時の濃度（Ｃｍａｘ）が高くなること、血中から消失するまでの時間が延長されることを含む。血中における標的抗原に結合する分子は、標的抗原に結合する部分がマスクされている状態であってもされていない状態であってもよく、特定の環境において標的抗原に結合する分子として働くことができればよい。「血中濃度が向上した」か否かは、例えば、標的抗原に結合する分子が投与されてから血中濃度が最大値に達した時の濃度（Ｃｍａｘ）が高くなったか否か、又は、標的抗原に結合する分子が投与されてから血中から消失するまでの時間が延長されたか否かにより判断することが可能であり、それらは標的抗原に結合する分子投与後における、血中薬物濃度、又は、標的抗原に結合する分子の血漿中半減期、平均血漿中滞留時間、血漿中クリアランス等のパラメーターを当業者に公知の方法を用いて測定することができる。
　本発明において、酸性ｐＨにおける標的抗原への親和性が中性ｐＨにおける標的抗原への親和性よりも強い限り、酸性ｐＨにおける標的抗原への親和性と中性ｐＨにおける標的抗原への親和性の差は特に限定されないが、例えば、ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）が大きいものが好ましい実施態様である。ここで、ＥＣ５０とは５０％効果濃度又は半数効果濃度のことであり、薬物や抗体等の分子が最低値からの最大反応の５０％を示す濃度のことを指す。ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）とは、中性ｐＨ条件における標的抗原に結合する分子のＥＣ５０と、酸性ｐＨ条件における標的抗原に結合する分子のＥＣ５０との比である。従って、標的抗原に結合する分子のＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）が大きい値であるほど、すなわち中性ｐＨ条件におけるＥＣ５０よりも酸性ｐＨ条件におけるＥＣ５０が小さい値であるほど、該分子の酸性ｐＨにおける標的抗原への親和性は中性ｐＨと比較して高い。標的抗原に結合する分子のＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）が小さい値であるほど、すなわち中性ｐＨ条件におけるＥＣ５０よりも酸性ｐＨ条件におけるＥＣ５０が大きい値であるほど、該分子の酸性ｐＨにおける標的抗原への親和性は中性ｐＨと比較して低い。標的抗原に結合する分子のＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）の値は、好ましくは３以上であり、より好ましくはＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）の値が１０以上であり、さらに好ましくはＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）の値が３０以上である。ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）の値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、１００、４００、１０００、１００００等、いかなる値でもよい。すなわち、標的抗原に結合する分子のＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）の値は、３以上１００以下、３以上４００以下、３以上１０００以下又は３以上１００００以下であることが好ましく、１０以上１００以下、１０以上４００以下、１０以上１０００以下又は１０以上１００００以下であることがより好ましく、３０以上１００以下、３０以上４００以下、３０以上１０００以下又は３０以上１００００以下であることがさらに好ましい。
　標的抗原への親和性の値として抗原が可溶型抗原の場合はＫＤ（解離定数）を用いることが可能であるが、抗原が膜型抗原の場合は見かけのＫＤ（Ａｐｐａｒｅｎｔ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｔａｎｔ：見かけの解離定数）を用いることが可能である。ＫＤ（解離定数）、及び、見かけのＫＤ（見かけの解離定数）は、当業者公知の方法で測定することが可能であり、例えばＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ等を用いることが可能である。
 
抗体
　本発明の抗体としては、非ヒト動物由来の抗体（非ヒト動物抗体）、ヒト抗体、キメラ化抗体（「キメラ抗体」ともいう）、ヒト化抗体などを挙げることができ、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体を用いることができる。本発明の抗体の範囲には、抗体の変異体（後述の「変異抗体」）も含まれ、例えば、ヒト抗体の範囲には、ヒト変異抗体も含まれ、ヒト化抗体の範囲には、ヒト化変異抗体も含まれる。
　非ヒト動物抗体としては、哺乳類、鳥類等の脊椎動物に由来する抗体などを挙げることができる。哺乳類由来の抗体としては、マウス抗体、ラット抗体などのげっ歯類、又はラクダ由来の抗体などを挙げることができる。鳥類由来の抗体としては、ニワトリ抗体等を挙げることができる。
　キメラ化抗体としては、非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体（ヒト免疫グロブリン）定常領域とを結合してなる抗体などを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
　ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲをヒト抗体（ヒト免疫グロブリンの可変領域）に移植したもの、ＣＤＲに加え非ヒト動物抗体のフレームワーク領域の配列も一部ヒト抗体に移植したもの、それらのいずれかの非ヒト動物抗体由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸をヒト型のアミノ酸で置換したものなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
　抗体は、公知の種々の方法で作製することができる。公知の方法として、ハイブリドーマを用いる方法や細胞免疫法等により作製し、遺伝子組換えの手法により作製することができる。また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域をｓｃＦｖとしてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ１９９２／０１０４７号、ＷＯ１９９２／２０７９１号、ＷＯ１９９３／０６２１３号、ＷＯ１９９３／１１２３６号、ＷＯ１９９３／１９１７２号、ＷＯ１９９５／０１４３８号、ＷＯ１９９５／１５３８８号、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，４３３－４５５）。また、ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡ断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３－１４３，；　Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｖｏｌ．１０，ｐ．６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，　Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ　Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２－７２７等を参照。）によっても取得することができるが、それらに限定されない。ヒト治療用又は予防用抗体の定常領域としては、好適には、ヒト抗体のものが使用される。ヒト抗体の重鎖定常領域としては、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、Ｃε等をあげることができる。ヒト抗体の軽鎖定常領域としては、例えば、Ｃκ、Ｃλ等をあげることができる。
　抗体の抗原結合断片とは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から構成される、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味する。抗体の抗原結合断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓｄＡｂ）等の抗原結合断片を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の抗原結合断片は、抗体蛋白質の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。
 
抗体又はその結合断片の変異体
　本発明の抗体又はその抗原結合断片の変異体には、好適には、蛋白質の分解若しくは酸化に対する感受性の低下、生物活性や機能の維持、改善若しくは低下や変化の抑制、抗原結合能の改善若しくは調節、又は理化学的性質若しくは機能的性質の付与等がなされ得る。蛋白質は、その表面にある特定のアミノ酸側鎖が変化して当該蛋白質の機能や活性が変化することが知られ、そのような例には、アスパラギン側鎖の脱アミド化、アスパラギン酸側鎖の異性化等が含まれる。そのようなアミノ酸側鎖の変化を防ぐために別のアミノ酸に置き換えたものも、本発明の変異体の範囲に含まれる。
　本発明の変異体の例として、抗体又はその抗原結合断片の有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換されてなるアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片を挙げることができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。
　好適なアミノ酸グループは、以下の通りである：酸性グループ＝アスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかる変異抗体におけるアミノ酸置換は、元の抗体が有する抗原結合活性を低下させない範囲で行うのが好ましい。上記アミノ酸の内、その側鎖に酸性官能基又は塩基性官能基を有するアミノ酸における、α位アミノ基及びα位カルボキシ基以外の基の解離定数の負の対数は、アルギニン：１２．４８、アスパラギン酸：３．６５、システイン：８．１８、グルタミン酸：４．２５、ヒスチジン：６．００、リシン：１０．５３、チロシン１０．０７であることが知られている（Ｄ．Ｒ．Ｌｉｄｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ，７２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９１．）。
 
抗体又はその結合断片の修飾体、複合体
　本発明は、抗体又はその結合断片の修飾体を提供する。本発明の抗体又はその結合断片の修飾体とは、本発明の抗体又はその結合断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合又はＯ－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合又はＯ－結合への糖鎖付加、糖鎖リモデリング、アミノ末端領域又はカルボキシル末端領域のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりアミノ末端にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティー標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体又はその結合断片の修飾物は、元の本発明の抗体又はその結合断片の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
　化学的修飾体に含まれる化学部分としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを例示することができる。
　生物学的な修飾物としては、酵素処理や細胞処理等により修飾が施されたもの、遺伝子組換えによりタグ等他のペプチドが付加された融合体、並びに内因性又は外来性の糖鎖修飾酵素を発現する細胞を宿主として調製されたもの等を挙げることができる。
　かかる修飾は、抗体又はその結合断片における任意の位置に、又は所望の位置において施されてもよく、１つ又は２つ以上の位置に同一又は２種以上の異なる修飾がなされてもよい。
　しかし、これらの重鎖配列の欠失、あるいは、重鎖又は軽鎖配列の修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）にはあまり影響を及ぼさず、好適には、有意に影響を及ぼさない。
　従って、本発明には当該欠失又は修飾を受けた抗体も含まれる。例えば、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ；７０５；１２９－１３４（１９９５））、重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化された当該欠失体（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端のグルタミン又はグルタミン酸残基がピログルタミル化修飾された抗体（ＷＯ２０１３／１４７１５３号）等を挙げることができる（それらをまとめて「欠失体」と呼ぶ）。ただし、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖及び軽鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体が２本以上の鎖（例えば重鎖）を含む場合、当該２本以上の鎖（例えば重鎖）は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組合せたものであっても良い。各欠失体の量比又は分子数比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の少なくとも片方、好ましくは双方でカルボキシル末端の１つ、２つ又は数個のアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
　さらに、本発明の抗体又はその抗原結合断片（本発明の分子、多重特異的分子、二重特異的分子等に含まれるもの等）に、発現ベクター及び／又はシグナル配列等に由来する１～数個のアミノ酸がアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に付加され（且つその一部又は全部が前記のように修飾され）ていても、所望の抗原結合活性が維持されていれば、本発明の抗体の修飾体又はその抗原結合断片の修飾体の範囲に包含され、そのような抗体又は抗原結合断片の修飾体を含む分子も本発明の分子の範囲に包含される。
　本発明において「抗体又はその結合断片」は「抗体又はその抗原結合断片の修飾体」もその意味に含むものである。また、本発明の分子、多重特異的な分子、二重特異的な分子等に含まれる「抗体又はその抗原結合断片」はかかる「抗体又はその抗原結合断片の修飾体」もその意味に含むものである。
　また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、国際特許公開ＷＯ１９９９／５４３４２号、ＷＯ２０００／６１７３９号、ＷＯ２００２／３１１４０号、ＷＯ２００７／１３３８５５号等が知られているが、これらに限定されるものではない。
 
標的抗原に結合する部分：［ａ］部分
　標的抗原とは、特定の疾患に関連した分子をいう。特定の疾患に関連した分子とは、該疾患の原因となっている抗原や分子の疾患に罹患した場合に、該疾患において出現する異常細胞において、発現するか、又は発現が亢進する分子をいう。該分子に上記の標的抗原に結合する部分が結合することにより、異常細胞を攻撃し、疾患の症状を軽減し、又は疾患を治療し得る分子をいう。前記異常細胞は、好ましくは腫瘍細胞や間質細胞であり、標的抗原は、腫瘍細胞については、腫瘍抗原であり、間質細胞については、間質細胞上に発現している分子である。間質細胞は、腫瘍細胞と相互作用を行い、がんの増殖及び進行に大きな役割を果たす。腫瘍抗原は、腫瘍細胞に発現している抗原又は正常細胞ががん化した腫瘍細胞に発現する抗原であり、上記の標的抗原に結合する部分が腫瘍抗原に結合することにより、腫瘍細胞の増殖を阻害し、腫瘍細胞を傷害し、又は腫瘍細胞を死滅（アポトーシス又はネクローシス）させる。
　腫瘍抗原として、ＣＤ９８、ＴＲＯＰ２、ＥＧＦＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＤＲ５、ＥＰＨＡ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＦＯＬＲ１、ＶＥＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＤ４７、ＣＤＨ６、ＣＤ１４７、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、Ａ３３、ＣａｎＡｇ、Ｇ２５０、ＭＵＣ１、ＧＰＮＭＢ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ、ＣＬＤＮ６、ＤＬＬ－３、ＳＬＣ４４Ａ４等が挙げられる。
　また、上記腫瘍抗原に対する抗体として、抗ＣＤ９８抗体（特開２０１７－１１４７６３号公報、ＷＯ２００７／１１４４９６号、ＷＯ２００８／０１７８２８号、ＷＯ２００９／０４３９２２号、ＷＯ２００９／０９０５５３号、特開２０１２－０９２０６８号公報、ＷＯ２０１１／１１８８０４号及びＷＯ２０１３／０７８３７７号等に記載されている。）、抗ＴＲＯＰ２抗体（Ｌｉｎｎｅｎｂａｃｈ　Ａ　Ｊ他　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８６巻（１号），　ｐｐ２７ ３１（１９８９）、ＷＯ２００８／１４４８９１号、ＷＯ２０１１／１４５７４４号、ＷＯ２０１１／１５５５７９号、ＷＯ２０１３／０７７４５８号、ＷＯ２００３／０７４５６６号、ＷＯ２０１１／０６８８４５号、ＷＯ２０１３／０６８９４６号、ＵＳ７９９９０８３号及びＷＯ２０１５／０９８０９９号等に記載されている。）、ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ、ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ａｍｅｔｕｍｕｍａｂ（ＳＹ－１０１）、ＳＹＮ－００４、ＳＣＴ－２００、ｔｏｍｕｚｏｔｕｘｉｍａｂ、ＧＣ－１１１８、ＧＲ－１４０１、ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ（ＡＢＴ－８０６）、Ｓｅｒｃｌｕｔａｍａｂ、ＡＭＧ５９５及びｍａｔｕｚｕｍａｂ等の抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ＷＯ２０１８／１４７２４５号及びＷＯ２０１６／０９０３２９号等に記載されている。）等が挙げられる。本発明の標的抗原に結合する部分は、こられの抗体に由来するか又は含んでよい。
　間質細胞に発現している分子として、例えば、ＦＡＰ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。
　標的抗原に結合する部分は、好適には、第１ペプチド及び第２ペプチドには含まれないアミノ酸配列を含んでなり、より好適には該アミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　標的抗原及び該標的抗原に結合する部分は、抗原及び該抗原に結合する抗体又は抗体の抗原結合断片であってもよいが、その組み合わせに限定されるものではなく、リガンド及び該リガンドに結合する受容体（又はその逆）、サイトカイン及び該サイトカインが結合する受容体（又はその逆）を例示することができる。また、抗体等以外の分子として、標的抗原に結合する非免疫グロブリンタンパク質、核酸アプタマー等の核酸分子、低分子化合物も例示することができる。
 
第１ペプチド：［ｂ］部分
　標的抗原に結合する部分（［ａ］部分）に含まれる該標的抗原結合部位を認識する第１ペプチドは、標的抗原に結合する部分に含まれる該標的抗原結合部位を認識することにより、該部位をマスクし、標的抗原に結合する部分が標的抗原に結合できなくする、結合し難くする、又は、結合するのを阻害もしくは妨害するペプチドである。標的抗原に結合する部分が抗体又は抗体の抗原結合断片（以下「抗体等」という。）である場合、第１ペプチドは抗体等の抗原との結合領域に結合するペプチドである。ここで、標的抗原結合部位を「認識する」とは、標的抗原結合部位に「結合する」、標的抗原結合部位に「親和性を有する」等と同義である。抗体等の抗原との結合領域は、抗体等の可変領域、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）に存在する。抗体等は抗原のエピトープ（抗原決定基）と結合するので、第１ペプチドはエピトープを模倣したペプチドである。抗原のエピトープを模倣した（ｍｉｍｉｃ）ペプチドをミモトープ（Ｍｉｍｏｔｏｐｅ）といい、本発明において、前記第１ペプチドは、好ましくはＣＤＲに結合するミモトープである。ミモトープは、６～３０個、好ましくは１０～２０個、さらに好ましくは１３～１７個、特に好ましくは１５個のアミノ酸からなるペプチドである。ミモトープは、例えば、上記のアミノ酸数からなる各種ディスプレイ（ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、核酸ディスプレイ、細菌ディスプレイ等）・ライブラリーを作製し、パニングによりスクリーニングを行うことにより、標的抗原に結合する部分に含まれる該標的抗原結合部位を認識するペプチドを提示するファージ粒子を選別し、該ファージ粒子からミモトープをコードするＤＮＡ及びそのヌクレオチド配列を得て製造することができる。ペプチドがミモトープであること（抗体のＣＤＲに結合していること）は、マスク抗体を結晶化して、Ｘ線結晶構造解析を行うことにより確認できる。また、ペプチドが抗体に対し抗原と競合的に結合することをＳＰＲ等により確認できれば、当該ペプチドは当該抗体のＣＤＲに結合するミモトープであることが強く示唆される（実施例４参照）。
　前述の通り、標的抗原に結合する部分は、抗体又は抗体の抗原結合断片（以下「抗体等」という。）以外の分子であってもよく、ミモトープ以外の第１ペプチドとして、標的抗原がリガンドの場合、該リガンドが結合する受容体に含まれる該リガンド結合部位を認識するペプチドを、標的抗原がサイトカインの場合、該サイトカインが結合する受容体に含まれる該サイトカイン結合部位を認識するペプチドを、それぞれ例示することができる。標的抗原に結合する部分が非免疫グロブリンタンパク質の場合、第１ペプチドは該タンパク質に含まれる該標的抗原部位を認識するペプチドであり、標的抗原に結合する部分が核酸分子の場合、第１ペプチドは該核酸分子に含まれる該標的抗原部位を認識するペプチドであり、標的抗原に結合する部分が低分子化合物の場合、第１ペプチドは該低分子化合物に含まれる該標的抗原部位を認識するペプチドである。
 
第２ペプチド：［ｃ］部分
　第２ペプチドは、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を含み、酸性ｐＨ条件では該アミノ酸残基が正に帯電し、リンカーの構造変化が誘起される。ここで、「ｐＨ７．５以下の範囲」は、ｐＨ１．０以上７．５以下、ｐＨ２．０以上ｐＨ７．５以下、ｐＨ３．０以上ｐＨ７．５以下、ｐＨ４．０以上ｐＨ７．５以下、ｐＨ５．０以上ｐＨ７．５以下、ｐＨ６．０以上ｐＨ７．５以下及びｐＨ７．０以上７．５以下のいずれの範囲も含む。さらに、「ｐＨ７．５以下の範囲」は、ｐＨ７．５以下の全域でなくてもよく（全域であってもよいが）、ｐＨ７．５以下の範囲にそっくり含まれる任意の範囲で、ｐＨに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化することを意味する。例えば、ｐＨが５．５～７．５の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じてアミノ酸の電荷が変化する場合が「ｐＨ７．５以下の範囲」に含まれることは言うまでもない。さらに、ｐＨが４．５～６．５の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じてアミノ酸の電荷が変化する場合、４．５～６．５の範囲は７．５以下の範囲にそっくり含まれるので、「ｐＨ７．５以下の範囲」に該当する。ここで、中性ｐＨ条件とは、ｐＨが約７の条件をいい、例えば、ｐＨ７．０以上７．５以下の条件をいう。また、酸性ｐＨ条件とは、ｐＨが７未満の条件をいい、例えば、ｐＨが７．０未満、好ましくは６．５以下、さらに好ましくは６．０以下の条件をいう。酸性ｐＨ条件の下限は特に限定されず、当業者の技術において実現可能な限り、１．０、２，０、３．０等、いかなる低い値でもよい。すなわち、酸性ｐＨ条件は、ｐＨ１．０以上７．０未満、ｐＨ２．０以上７．０未満、ｐＨ３．０以上７．０未満、好ましくはｐＨ１．０以上６．５以下、ｐＨ２．０以上６．５以下、ｐＨ３．０以上６．５以下、さらに好ましくはｐＨ１．０以上６．０以下、ｐＨ２．０以上６．０以下、ｐＨ３．０以上６．０以下である。また、アミノ酸における電荷の変化はｐＨ変化により生じる可逆的な現象であることから、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが「中性条件から酸性条件」に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸は、当然にｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが「酸性条件から中性条件」に変化することによっても電荷が変化すると考えられる。ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸である場合には、本願の出願時点で公開されているＷＯ２００６／１３２９６９号、ＷＯ２００８／０３０６１２号、ＷＯ２００８／０３０６１３号、ＷＯ２００８／０３０６１４号、ＷＯ２０１０／０３７０６２号、ＷＯ２０１８／２２３１０８号等に記載の非天然アミノ酸から適宜選択して用いることができる。第２ペプチドをｐＨ応答性リンカーとも呼ぶ。第２ペプチドは、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸として、ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を含む。ｐＫａは、酸性化合物又は酸性官能基における、酸の強さを定量的に表すための指標の１つであり、水素イオンが放出される解離反応における平衡定数Ｋａの負の常用対数ｐＫａ（ｐＫａ＝－ｌｏｇ１０Ｋａ）によって表される。ｐＫａは酸解離定数とも呼ばれ、２５℃、水中における数値であり、化学便覧基礎編改訂５版ＩＩ－３３１～ＩＩ－３４３（日本化学会編、丸善出版株式会社）に記載の方法によって算出することができる。ｐＫａは文献等（例えば理科年表平成２５年（机上版）、丸善出版株式会社）で公知の数値を用いることもできる。ｐＫａは、塩基性化合物又は塩基性官能基において、塩基の強さを定量的に表す指標としても用いられる。すなわち、塩基性化合物又は塩基性官能基にプロトンを付加させた共役酸にして、その共役酸の酸の強さによって元の塩基性化合物の塩基性の強さを考えることができる。
　第２ペプチドに含まれるアミノ酸残基が酸性ｐＨ条件で正電荷を帯びることがｐＨ応答性リンカーとして求められる性質であるため、ｐＨが酸性条件において負電荷を有するアミノ酸を含まないことが好ましい。ｐＨが酸性条件における該アミノ酸の負電荷が、酸性ｐＨ条件で正電荷を帯びるアミノ酸の正電荷を中和したり弱めたりすることにより、リンカーの構造変化が誘起されなくなるためであると推測される。本発明におけるｐＨが酸性条件において負電荷を有するアミノ酸は特に限定されないが、第２ペプチドが天然アミノ酸から構成される場合には、ｐＨが酸性条件において負電荷を有するアミノ酸としてグルタミン酸、アスパラギン酸が挙げられる。すなわち、第２ペプチドは、グルタミン酸及び／又はアスパラギン酸を含まないことが好ましい。
　本発明は第２ペプチドの等電点を表す「ｐＩ値」を用いて記述することもできる。分子の「ｐＩ値」（ｐＨ（Ｉ）又はＩＥＰ値とも略記する）という用語は、本明細書で使用される場合、分子の等電点、特にアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の等電点を指すものとし、これは、特定の分子が正味の電荷を持たないｐＨ値である。分子のｐＩ値が高い値であるほど、すなわち特定の分子が正味の電荷を持たないｐＨ値が高い値（塩基性側）であるほど、該分子は酸性条件では正電荷を帯びやすい。分子のｐＩ値が低い値であるほど、すなわち特定の分子が正味の電荷を持たないｐＨ値が低い値（酸性側）であるほど、該分子は酸性条件では正電荷を帯びにくい。実験的ｐＩ値及び計算されたｐＩ値はわずかに異なる可能性があるため、本明細書における用語「ｐＩ値」は、計算されたｐＩ値を指す。ｐＩ値は、例えばＡ．　Ｓｉｌｌｅｒｏ　ａｎｄ　Ｊ．Ｍ．Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７９（２），１９８９，３１９－３２５に従い、計算しようとするペプチドを構成する各アミノ酸残基のｐＫａ並びにアミノ末端のアミノ基及びカルボキシル末端のカルボキシル基のｐＫａから計算することができる。
　第２ペプチドに含まれるアミノ酸残基が酸性ｐＨ条件で正電荷を帯びることがｐＨ応答性リンカーとして求められる性質であるため、酸性条件での電荷の計算値が正であり、中性条件での電荷の計算値よりも大きければよく、その条件を満たすｐＩ値であれば特に限定されない。リンカーの構造変化を誘起させるためには、例えば、ｐＨ３．０以上６．５以下の酸性条件における第２ペプチドの電荷の計算値が、ｐＨ７．０以上７．５以下の中性条件における第２ペプチドの電荷の計算値よりも大きい値をとっていればよい。従って、第２ペプチドのｐＩ値は、６．４以上であることが好ましく、６．８以上であることがより好ましく、７．２以上であることがさらに好ましく、７．６以上であることが最も好ましい。ｐＩ値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、１２、１３、１４等、いかなる値でもよい。すなわち、第２ペプチドのｐＩ値が、６．４以上１２以下、６．４以上１３以下又は６．４以上１４以下であることが好ましく、６．８以上１２以下、６．８以上１３以下又は６．８以上１４以下であることがより好ましく、７．２以上１２以下、７．２以上１３以下又は７．２以上１４以下であることがさらに好ましく、７．６以上１２以下、７．６以上１３以下又は７．６以上１４以下であることが最も好ましい。
　例えば、本発明の実施例で用いた第２ペプチドについて、Ａ．　Ｓｉｌｌｅｒｏ　ａｎｄ　Ｊ．Ｍ．Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７９（２），１９８９，３１９－３２５に従い算出したｐＩ値を表１に示す。表１中、「ｐＨ応答性」は、酸性条件下における、構造変化の有無を示す。表１において、「ｐＨ応答性」は、「有」、「弱」、「無」の３通りで表している。後記の実施例５の方法でＥＬＩＳＡにより結合活性の変化を目視により判断しており、明確に結合活性の変化が認められた場合を「有」とし、結合活性の変化が認められない場合を「無」とし、若干の変化が認められた場合を「弱」とした。
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　第２ペプチドは、以下の（１）及び（２）の構造を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。
（１）（ａ）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列、又は
（ｂ）(ａ)のアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を１つ以上含み、且つ、
（２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含む。
　ここで、（ａ）のアミノ酸配列又は（ｂ）のアミノ酸配列を、「塩基性アミノ酸クラスター」という。２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列は、好ましくは２～４個の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列、さらに好ましくは２～３個の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列である。また、「ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸」の数の上限は限定されないが、好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１５個以下、さらに好ましくは１２個以下である。
　上記のように、本発明において、「塩基性アミノ酸クラスター」とは、２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列及び該アミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入又は付加されたアミノ酸配列のことをいう。また、ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸として、特定のアミノ酸を選択した場合には、該アミノ酸の種類名に「クラスター」の語を付加して称することがある。例えば、ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸としてヒスチジンが選択された場合には、２つ以上の連続するヒスチジンからなるアミノ酸配列及び該アミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入又は付加されたアミノ酸配列は「ヒスチジンクラスター（Ｈｉｓクラスター）」という。
　第２ペプチドにおいて、塩基性アミノ酸クラスター部分以外のアミノ酸は、ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸、アルギニン及びリシン、酸性ｐＨ条件において負電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸であれば、特に限定されない。このようなアミノ酸として、天然アミノ酸では、グリシン、セリン、アラニン、プロリン、スレオニンが挙げられる。好ましくは、グリシン及び／若しくはセリンから構成されるアミノ酸配列（いわゆるＧＳリンカー）又はプロテアーゼ基質配列を構成するアミノ酸配列である。このようなアミノ酸は、塩基性アミノ酸クラスターのアミノ末端側及びカルボキシル末端側の一方又は両方に１～３０個、好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個含まれていてもよい。
　天然アミノ酸の中でｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸は、ヒスチジンのみであり、天然アミノ酸で構成される第２ペプチド中の塩基性アミノ酸クラスターの数を数える場合には、ヒスチジンクラスターの数を数えればよい。例えば、第２ペプチドが「ＧＧＧＧＳＨＨＧＧＨＨＧＧＨＨＧＧＨＨＧＧＳ」（配列番号４２、図５２）というアミノ酸配列からなる場合、連続する２つのヒスチジンからなるアミノ酸配列を４つ含むことから、塩基性アミノ酸クラスターを４つ含むと数えることができる。別の例として、第２ペプチドが「ＧＧＧＧＳＨＨＧＧＨＲＨＧＧＨＨＫＧＧＨＨＧＧＳ」（配列番号４３、図５２）というアミノ酸配列からなる場合、連続する２つのヒスチジンからなるアミノ酸配列を２つ、連続する２つのヒスチジンからなるアミノ酸配列の間にアルギニンが挿入されたアミノ酸配列を１つ、連続する２つのヒスチジンからなるアミノ酸配列にリシンが付加されたアミノ酸配列を１つ含むことから、塩基性アミノ酸クラスターを４つ含むと数えることができる。なお、２つ以上の連続するヒスチジンからなるアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入又は付加されたアミノ酸配列としては、例えば、ＨＲＨ、ＲＨＨ、ＨＨＲ、ＨＲＨＨ、ＨＨＲＨ、ＲＨＨＨ、ＨＨＨＲ、ＨＫＨ、ＫＨＨ、ＨＨＫ、ＨＫＨＨ、ＨＨＫＨ、ＫＨＨＨ、ＨＨＨＫ等が挙げられる。これは、ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸がヒスチジンの場合の例示であり、Ｈで表されるアミノ酸は、ヒスチジン以外のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸であってもよい。
　第２ペプチド中の塩基性アミノ酸クラスターは、標的抗原に結合する分子の酸性ｐＨにおける標的抗原に対する親和性を高めるために、２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つ以上のアルギニンが挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むことが好ましく、２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニンが挿入又は付加されたアミノ酸配列を１つ含むことがより好ましく、「ＲＨＨＨ」で表されるアミノ酸配列を有する塩基性アミノ酸クラスターを１つ含むことがさらに好ましい。
　アルギニンは側鎖に塩基性官能基であるグアニジノ基を有するアミノ酸であり、そのｐＫａは１２．４８である。リシンは側鎖に塩基性官能基であるアミノ基を有するアミノ酸であり、そのｐＫａは１０．５３である。従って、両アミノ酸は中性条件下においても側鎖の塩基性官能基が正電荷を帯びていると考えられる。従って、当該アルギニン又はリシンは、第２ペプチドのｐＨ変化に応じた構造変化を増強させることができる。この効果により、アルギニン又はリシンが挿入又は付加された塩基性アミノ酸クラスターを含む第２ペプチドは、酸性条件が穏やかな環境（例えば、ｐＨ６．５以上７．０未満）においても、構造変化を誘起させることができると考えられる。
　本発明においては、２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つ以上のアルギニンが挿入又は付加されていないアミノ酸配列のＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）と、２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つ以上のアルギニンが挿入又は付加されたアミノ酸配列のＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）とを比較することにより、アルギニンの挿入又は付加によるｐＨ応答性の増強効果を定量することができる。すなわち、ＥＣ５０比の比較は、（後者のＥＣ５０比）／（前者のＥＣ５０比）により算出することができ、その比は４．０以上であることが好ましい。
　塩基性アミノ酸クラスターに含まれる、塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸における塩基性官能基のｐＫａは、好ましくは、５．０～７．０の範囲、より好ましくは、５．５～６．５の範囲である。塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸として塩基性官能基のｐＫａが６．００であるヒスチジンを含むことが最も好ましい。
　第２ペプチドに含まれる塩基性アミノ酸クラスターの数は、該クラスターが酸性ｐＨ条件において正に帯電することでリンカーの構造変化を誘起させることができれば特に限定されないが、好ましくは１～４個、さらに好ましくは２～４個、さらに好ましくは３若しくは４個含む。
　第２ペプチドに含まれる基性官能基を側鎖に有するアミノ酸の数は、該クラスターが酸性ｐＨ条件において正に帯電することでリンカーの構造変化を誘起させることができれば特に限定されないが、好ましくは、１０個以下であり、より好ましくは、第２ペプチドのアミノ酸配列に含まれる全アミノ酸数の５％以上、３０％以下である。
　第２ペプチドが、（ａ）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列、又は（ｂ）アミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を１つ以上含み、且つ、（２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含むアミノ酸配列からなる場合、第２ペプチドに含まれるアミノ酸の数は、１０～６０個、好ましくは１２～５０個、さらに好ましくは１５～４０個、さらに好ましくは２０～３５個である。
　第２ペプチドに含まれる塩基性アミノ酸クラスターの位置は特に限定されない。すなわち、第２ペプチドのアミノ酸配列に２つ以上の塩基性アミノ酸クラスターが含まれる場合、（１）１つの塩基性アミノ酸クラスターのみが該アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシル末端に位置してもよく、（２）１つの塩基性アミノ酸クラスターが該アミノ酸配列のアミノ末端に位置し且つ他の１つの塩基性アミノ酸クラスターが該アミノ酸配列のカルボキシル末端に位置してもよく、（３）いずれの塩基性アミノ酸クラスターも、該アミノ酸配列のアミノ末端に位置せず且つカルボキシル末端に位置しなくてもよい。本発明において、第２ペプチドは、さらに細胞内外のプロテアーゼの基質となり、該プロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列（以下単に「基質」ともいう。）を含んでいてもよい。第２ペプチドのアミノ酸配列に細胞内外のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列をさらに含む場合、該アミノ酸配列がアミノ末端からカルボキシル末端に向かって又はカルボキシル末端からアミノ末端に向かって、塩基性アミノ酸クラスター、細胞内外のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列、標的抗原に結合する部分（［ａ］部分）のアミノ酸配列の順に連結することが好ましい。
　さらに、第２ペプチドは、ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を１つ置きに有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列で表される構造からなるものを含んでいてもよい。ここで、ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸の数は、４～１５個、好ましくは５～１２個、さらに好ましくは６～１０個である。このような配列として、例えば、「ＧＧＧＧＳＨＧＨＧＨＧＨＧＨＧＨＧＨＧＨＧＧＳ」（配列番号４４、図５２）が挙げられる。
　ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を１つ置きに有するアミノ酸配列と、（ａ）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列、又は（ｂ）アミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の両方を含んでいてもよい。
　酸性ｐＨ条件は、第２ペプチドの塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸の電荷が変化すれば、ｐＨ７．５以下の範囲であればよい。従って酸性ｐＨ条件は、好ましくは、ｐＨ６．５以下の範囲、より好ましくは、ｐＨ６．０以下の範囲、さらに好ましくは、ｐＨ５．５以下の範囲である。
　第１ペプチド、第２ペプチド及び標的抗原に結合する部分はリンカーと結合していてもよい。すなわち、第１ペプチド、第２ペプチド及び標的抗原に結合する部分のいずれか１つが、他の２つのうち１つ又は両方とリンカーを介して結合していてもよい。ここで、リンカーは、アミノ酸２～３０個、好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個からなるペプチドである。
　第２ペプチドは、細胞内プロテアーゼ又は細胞外プロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。第２ペプチドが、細胞内及び／又は細胞外のプロテアーゼの基質となり、該プロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列（単に「基質」ともいう。あるプロテアーゼにより切断される基質を「当該プロテアーゼ基質」ともいう。）を含んでいる場合、細胞内プロテアーゼの基質となるアミノ酸配列を第１切断アミノ酸配列と呼び、細胞外プロテアーゼの基質となるアミノ酸配列を第２切断アミノ酸配列と呼ぶことができる。本発明においては、第２ペプチドに、第１切断アミノ酸配列と第２切断アミノ酸配列を含ませることを、第２ペプチドにおいて、プロテアーゼ切断配列として、第１切断アミノ酸配列と第２切断アミノ酸配列を組合わせるともいう。
　細胞内プロテアーゼは、「細胞内作用型プロテアーゼ」ともいい、細胞内で発現した後、細胞外に分泌されることなく、細胞内で作用し、細胞のアポトーシスに関連する。細胞内プロテアーゼとして、細胞質性システインプロテアーゼであるカスパーゼ、カルパイン（「ＣＡＰＮ」ともいう。）、トリペプチジルペプチダーゼ等が挙げられる。カルパインは、ＣＡＰＮ１（μ－カルパイン）、ＣＡＰＮ２（ｍ－カルパイン）、ＣＡＰＮ３、ＣＡＰＮ４、ＣＡＰＮ５、ＣＡＰＮ６、ＣＡＰＮ７、ＣＡＰＮ８、ＣＡＰＮ９、ＣＡＰＮ１０、ＣＡＰＮ１１、ＣＡＰＮ１２、ＣＡＰＮ１３、ＣＡＰＮ１４、ＣＡＰＮ１５、ＣＡＰＮ１６、ＣＡＰＮ１７等のアイソフォームが存在するが、本発明においては、いずれのアイソフォームも利用することができる。好ましくは、ＣＡＰＮ１（カルパイン１）又はＣＡＰＮ２（カルパイン２）を利用する。トリペプチジルペプチダーゼは、トリペプチジルペプチダーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ２等のアイソフォームが存在するが、本発明においては、いずれのアイソフォームも利用することができ、好ましくは、トリペプチジルペプチダーゼ２を利用する。従って、第２ペプチド中の第１切断アミノ酸配列としては、上記の細胞内プロテアーゼの基質となるアミノ酸配列であれば、すなわち、該プロテアーゼが認識し、切断するアミノ酸配列であれば特に限定されないが、好ましくは、ヒトＣＡＰＮ１が認識し、その基質となるアミノ酸配列（「ＣＡＰＮ１基質」又は「ＣＡＰＮ基質」ともいう。）を、ＣＡＰＮ基質としては、ＰＬＦＡＡＰ（配列番号６７、図５５）を、それぞれ好適な例としてあげることができる。
　細胞外プロテアーゼは、細胞外作用型プロテアーゼともいい、シグナル配列を有した状態で発現され、細胞外へ分泌され、細胞外で作用する。細胞外プロテアーゼとして、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、プラスミン、カテプシン、マトリプターゼ、レグメイン等が挙げられる。ＭＭＰは、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１８、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８等のアイソフォームが存在するが、本発明においては、いずれのアイソフォームも利用することができる。カテプシンとしては、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＬ１、カテプシンＬ２、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＷ、カテプシンＸ／Ｚ等のアイソフォームが存在するが、本発明においてはいずれのアイソフォームも利用することができる。従って、第２ペプチド中の第２切断アミノ酸配列としては、上記の細胞外プロテアーゼの基質となるアミノ酸配列であれば、すなわち、該プロテアーゼが認識し、切断するアミノ酸配列であれば特に限定されないが、好ましくは、ヒトｕＰＡが認識し、その基質となるアミノ酸配列（「ｕＰＡ基質」ともいう。）を、ｕＰＡ基質としては、ＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥ（配列番号３６、図５１）、ＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号３７、図５１）、ＳＧＲＳＡ（配列番号３８、図５１）を、また、ヒトＭＭＰ１が認識し、その基質となるアミノ酸配列（「ＭＭＰ１基質」又は「ＭＭＰ基質」ともいう。）としては、ＶＬＶＰＭＡＭＭＡＳ（配列番号３９、図５１）及びＰＬＧＬＷＡ（配列番号４０、図５１）を、さらに、ヒトＭＭＰ９が認識し、その基質となるアミノ酸配列（「ＭＭＰ９基質」ともいう。）を、ＭＭＰ９基質としては、ＰＬＧＬＡＧ（配列番号４１、図５１）を、それぞれ好適な例としてあげることができる。
　第２ペプチドに、細胞内プロテアーゼの基質である第１切断アミノ酸配列と細胞外プロテアーゼの基質である第２切断アミノ酸配列の両方が含まれる場合、その順序は限定されないが、例えば、第１ペプチド、第２ペプチド、標的抗原に結合する部分の順に連結している標的抗原に結合する分子において、第１ペプチド側に細胞外プロテアーゼの基質である第２切断アミノ酸配列が含まれ、標的結合部分側に細胞内プロテアーゼの基質である第１切断アミノ酸配列が含まれていてもよく第１ペプチド、第２ペプチド、標的抗原に結合する部分の順に連結している標的抗原に結合する分子において、第１ペプチド側に細胞内プロテアーゼの基質である第１切断アミノ酸配列が含まれ、標的結合部分側に細胞外プロテアーゼの基質である第２切断アミノ酸配列が含まれていてもよい。従って、標的抗原に結合する分子においては、好ましくは、第１ペプチド、第２切断アミノ酸配列、第１切断アミノ酸配列、標的抗原に結合する部分の順に連結していてもよく、第１ペプチド、第１切断アミノ酸配列、第２切断アミノ酸配列、標的抗原に結合する部分の順に連結していてもよい。
　前数段落は、専ら第２切断アミノ酸配列が第２ペプチドに含まれる場合について記載しているが、第２切断アミノ酸配列は、本発明の標的抗原に結合する分子に含まれていれば、第２ペプチド以外に含まれてもよく、例えば、第１ペプチドの末端、第２ペプチドと標的抗原に結合する部分の間に挿入された第３のペプチドに含まれてもよい。
　また、第１ペプチドと第２ペプチドは部分的に重複してもよい。例えば、配列番号１３、図２８（ＭＨＴ１８０６Ｈ鎖の全長アミノ酸配列）において、ミモトープペプチド(アミノ酸２０～３５）のＣ末端（ＨＨ）は、ヒスチジンクラスターの一部になっており、第１ペプチドの一部と第２ペプチドの一部が重複している。
　第２ペプチドに、（ａ）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列、又は（ｂ）アミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を１つ以上含み、且つ、（２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含むアミノ酸配列、並びに上記の第１切断アミノ酸配列及び/又は第２切断アミノ酸配列であるプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列の両方が含まれる場合、プロテアーゼによりアミノ酸配列が切断された場合に、標的抗原に結合する分子に、（ａ）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列、又は（ｂ）アミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を１つ以上含み、且つ、（２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含むアミノ酸配列が含まれないことが好ましい。
　第２ペプチドが、（ａ）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列、又は（ｂ）アミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を１つ以上含み、且つ、（２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含むアミノ酸配列、並びに上記の第１切断アミノ酸配列及び/又は第２切断アミノ酸配列であるプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列の両方が含まれる場合、第２ペプチドに含まれるアミノ酸の数は、１５～１５０個、好ましくは１５～１２０個、さらに好ましくは１５～７０個、さらに好ましくは１５～５０個である。
 
他の部分
　本発明の標的抗原に結合する分子は、さらに他の部分を含んでいてもよい。本発明においては、かかる他の部分のことを「［ｄ］部分」ともいう。［ｄ］部分は、前記分子の標的抗原に結合する部分に結合する。［ｄ］部分は、該標的抗原に結合する部分ではない抗体若しくはその抗原結合断片、第１ペプチド及び第２ペプチドに含まれないアミノ酸配列を含むペプチド、サイトカイン、毒素、放射性同位元素、標識分子、光感受性物質（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ：「光増感剤」ともいう）、免疫賦活化物質、抗腫瘍性化合物、薬物、ペイロード並びにポリマーからなる群より選択される１つ又は２つ以上の化合物からなる。
　ここで、第１ペプチド及び第２ペプチドに含まれないアミノ酸配列を含むペプチドとしては、抗体、抗体の抗原結合断片、天然に存在する非免疫グロブリン性タンパク質、人工的に創出されたタンパク質、受容体タンパク質又はそのリガンド結合断片、リガンドタンパク質、血中動態を調節するタンパク（例えば、抗体のＦｃ、アルブミン）等、抗体としては、標的抗原に結合する分子ではない抗体、標的抗原に結合する分子中の標的結合標的部位以外の部位に結合する抗体、標的抗原に結合する分子と結合することにより多重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）として機能する抗体等を、サイトカインとしては、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、増殖因子等を、毒素としては、シアノトキシン、ヘモトキシン、ネクロトキシン、神経毒、細胞毒素等の生物毒素、環境毒素等を、放射性同位元素としては、１３１Ｉ、２１１ＡＴ、８９Ｓｒ等を、標識分子としては、ＦＩＴＣ、ＰＥ等の蛍光物質、ＨＲＰ、ＡＰ等の酵素、ビオチン等を、光感受性物質としては、フタロシアニン誘導体、クロリン誘導体、バクテリオクロリン誘導体等を、免疫賦活化物質としては、アジュバント等を、ポリマーとしては、天然又は人工糖鎖、合成樹脂、ポリエチレングリコール等を、抗腫瘍性化合物としては、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、細胞分裂阻害剤、微小管重合／脱重合阻害剤、グルココルチコイド受容体調節剤、ＤＮＡ結合剤、アルキル化剤、放射性同位元素、ｓｉＲＮＡ、抗体又はその抗原結合断片等を、薬物としては、抗腫瘍剤、前述の免疫賦活化物質及びサイトカイン、下に述べるＡＤＣに含まれる抗腫瘍性化合物、薬物、ペイロード等をそれぞれ例示することができるが、それらに限定されるものではない。
　［ｄ］部分がポリペプチドである場合、本発明の標的抗原に結合する分子はポリペプチドからなってよく、［ｄ］部分がポリペプチド以外の化合物である場合、本発明の標的抗原に結合する分子は［ｄ］部分及びポリペプチドからなり得る。
　［ｄ］部分は、本発明の標的抗原に結合する分子とリンカーで連結されていてもよい。
　［ｄ］部分が抗腫瘍性化合物、薬物又はペイロードであり、標的抗原に結合する分子が抗体又はその抗原結合部分（抗体等）である場合、［ｄ］部分を含む標的抗原に結合する分子をＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；抗体－薬物複合体）ということができる。ＡＤＣについては、［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．（２０１３）１０４５：１－２７；Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６等に記載されている。抗腫瘍性化合物としては、抗体等が結合することにより薬理学的な効果を奏し得る物質であれば特に限定されず、抗腫瘍剤である場合に使用し得る抗腫瘍性化合物として、エムタンシン（４－（｛３－［（３－｛［（１Ｓ）－２－｛［（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，１６Ｅ，１８Ｅ，２０Ｒ，２１Ｓ）－１１－クロロ－２１－ヒドロキシ－１２，２０－ジメトキシ２，５，９，１６－テトラメチル－８，２３－ジオキソ－４，２４－ジオキサ－９，２２－ジアザテトラシクロ［１９．３．１．１１０，１４．０３，５］　ヘキサコサ－１０，１２，１４（２６），１６，１８－ペンタエン－６－イル］オキシ｝－１－メチル－２－オキソエチル］メチルアミノ｝－３－オキソプロピル）スルファニル］－２，５－ジオキソピロリジン－１－イル｝メチル）シクロヘキシルカルボニル基）（例えば、ＷＯ２００１／０００２４４、ＷＯ２００１／０００２４５）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、Ｌｉａｎｇ，Ｘ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１７１巻、２０１９年、１２９－１６８頁）、好適には、トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシン誘導体、好適には、イリノテカン及びその活性代謝産物であるＳＮ－３８（例えば、ＥＰ　１３７１４５Ａ１、ＵＳ４６０４４６３Ａ、）、エキサテカン（例えば、ＥＰ　４９５４３２Ａ１、ＵＳ５６３７７７０Ａ）、エキサテカン誘導体（例えば、ＷＯ２０１４／０５７６８７）等をあげることができる。好適なエキサテカン誘導体として、Ｎ－［（１Ｓ，９Ｓ）－９－Ｅｔｈｙｌ－５－ｆｌｕｏｒｏ－９－ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌ－１０，１３－ｄｉｏｘｏ－２，３，９，１０，１３，１５－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，１２Ｈ－ｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ｐｙｒａｎｏ［３'，４'：６，７］ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｏ［１，２－ｂ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔａｍｉｄｅ（例えば、ＷＯ２０１４／０５７６８７、ＷＯ２０１４／０６１２７７、ＷＯ２０１５／１４６１３２、ＷＯ２０２０／１００９５４、ＷＯ２０１５／０９８０９９）を例示することができる。他の抗腫瘍性化合物として、ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ誘導体（例えば、ＷＯ２０１９／０６５９６４、ＷＯ２０１３／１７３４９６、ＷＯ２０１４／１３０８７９、ＷＯ２０１７／００４３３０、ＷＯ２０１７／００４０２５、ＷＯ２０１７／０２０９７２、ＷＯ２０１６／０３６８０４、ＷＯ２０１５／０９５１２４、ＷＯ２０１５／０５２３２２、ＷＯ２０１５／０５２５３４、ＷＯ２０１６／１１５１９１、ＷＯ２０１５／０５２３２１、ＷＯ２０１５／０３１６９３、ＷＯ２０１１／１３０６１３）も例示することができ、好適なｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ誘導体としては、（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－１’，１１ａ’－ジヒドロ－５’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－５’－オン、（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－１’，１０’，１１’，１１ａ’－テトラヒドロ－５’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－５’－オン、（１１ａ’Ｓ，１１ａ’’’’Ｓ）－８’，８’’－［１，５－ペンタンジイルビス（オキシ）］ビス（７’－メトキシ－１’，１１ａ’－ジヒドロ－５’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－５’－オン）及び（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－８’－（３－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝プロポキシ）－１’，１１ａ’－ジヒドロ－５’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－５’－オン等（ＷＯ２０１９／０６５９６４）を例示することができる。薬物としては、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、ＷＯ２０２１／２０２９８４、ＷＯ２０２０／２２９９８２、ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０２１／１７７４３8）、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ８アゴニスト（例えば、ＷＯ２０１８／００９９１６、ＷＯ２０１９／０８４０６０）等の免疫賦活化物質でもよい。好適なＳＴＩＮＧアゴニストとしては、環状ジヌクレオチド誘導体を例示することができる。環状ジヌクレオチド誘導体としては、（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＳ，１６Ｒ）－１５，１６－ジヒドロキシ－７－［１－（２－ヒドロキシエチル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－２，１０－ビス（スルファニル）－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－２，１０－ジオン、（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－７－［１－（２－ヒドロキシエチル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－２，１０－ビス（スルファニル）－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－２，１０－ジオン、（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－７－［１－（２－アミノエチル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－１４－（８，９－ジヒドロ－６－チア－２，３，５－トリアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２（７Ｈ）－イル）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ビス（スルファニル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－２，１０－ジオン、Ｎ－（２－｛９－［（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１４－（８，９－ジヒドロ－６－チア－２，３，５－トリアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２（７Ｈ）－イル）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ビス（スルファニル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エチル）－２－ヒドロキシアセトアミドを例示することができる（ＷＯ２０２１／１７７４３８）。本発明において、［ｄ］部分は標的抗原結合部分に結合する。標的抗原結合部分が抗体又はその抗原結合断片である場合、［ｄ］部分は、公知の方法により抗体又はその抗原結合断片に結合させることができる。治療又は予防用の抗体又はそのＦｃ領域を含む糖タンパク質分子の製造において、糖鎖を均一化させる技術が開発されている。糖タンパク質に付加する糖鎖を均一にする方法として、酵素を使った糖鎖転移反応が知られている。これは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ環境での糖鎖の切断（加水分解反応）と別の糖鎖の縮合（糖鎖転移反応）からなる、多段階プロセスである。特にＮ型糖鎖の変換を目的とする場合、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）と呼ばれる一群の酵素ファミリーが用いられる。この酵素の特性として、１）基質特異性として複合型糖鎖に対する加水分解反応を行う能力を持つこと、及び、２）特定の構造に対する糖鎖転移反応を行う能力を持つことが要求される。糖鎖転移反応では、単独のＥＮＧａｓｅを用いて還元末端が活性化された糖鎖である、例えば還元末端をオキサゾリン化した糖鎖をＧｌｃＮＡｃ（Ｎ－アセチルグルコサミン）アクセプターに転移するオキサゾリン法と、２種類のＥＮＧａｓｅを使用して還元末端が活性化されていない糖鎖をＧｌｃＮＡｃアクセプターに直接転移するワンポット法が知られている（ＷＯ２０２２／０５０３００、ＷＯ２０１８／００３９８３）。本発明において、抗腫瘍性化合物、薬物、ペイロード等の［ｄ］部分を抗体又はその抗原結合断片に直接又はリンカー等を介して結合させるために、例えば、それらの方法による糖鎖転移反応を使用することができる。［ｄ］部分が光感受性物質であり、標的抗原に結合する部分が抗体又はその抗原結合部分（抗体等）であるか又はそれらを含む場合、［ｄ］部分を含む標的抗原に結合する分子は、光線力学的療法（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ　Ｔｈｅｒａｐｙ；ＰＤＴ）に用いることができ、当該分子はＡＤＰ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ）分子ということができる。ＡＤＰ分子については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２０１３）２，ｐ．２７０－３０５等に記載されている。光感受性物質としては、抗体等が結合した部位に光照射することで薬理学的な効果を奏し得る物質であれば特に限定されず、光感受性物質として、（２Ｓ）－２－［［２－［（２Ｓ，３Ｓ）－７－カルボキシ－３－（２－カルボキシエチル）－１７－エテニル－１２－エチル－２，８，１３，１８－テトラメチル－２，３，２３，２４－テトラヒドロポルフィリン－５－イル］アセチル］アミノ］ブタン二酸（例えば、米国特許第５６３３２７５号、米国特許第ＲＥ３７１８０号）、ＩＲ７００（ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ）（例えば、ＷＯ２０１３／００９４７５、ＷＯ２００４／０３８３７８、ＷＯ２０１５／１８７６７７、ＷＯ２０１７／０３１３６３、ＷＯ２０１７／０３１３６７、ＷＯ２０１８／１５６８１５、ＷＯ２０１９／２３２４７８、ＷＯ２０２０２０／５６２３）、２，４－ジフルオロ－Ｎ－メチル－３－［１０，１５，２０－トリス［２，６－ジフルオロ－３－（メチルスルファモイル）フェニル］－２，３，１２，１３，２２，２４－ヘキサヒドロポルフィリン－５－イル］ベンゼンスルホンアミド（例えば、ＷＯ２０１６／１５１４５８）等を例示することができる。
　標的抗原を有する細胞を含む組織又はその近傍において、標的抗原に結合する分子に含まれる切断リンカー（第２ペプチド）が切断され、標的抗原に結合する分子に含まれる有効成分（例えば、薬物、抗腫瘍性化合物、免疫賦活化物質等）が効果を発揮する。
 
３．標的抗原に結合する分子の製造方法
（１）第１ペプチドに含まれるミモトープの同定方法
　任意の抗体又はその抗原結合断片に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）に結合するペプチドを、ペプチドライブラリーを利用して同定することができる。ペプチドライブラリーは公知の方法で構築すればよい。例えば、完全ランダムなアミノ酸から構成されるリボソーム等の各種ディスプレイ用のペプチドライブラリーを構築し、前記ＣＤＲに親和性の大きいペプチドを選択すればよい。また、中央付近に芳香族性アミノ酸とＰｒｏの繰り返しモチーフ（ＺＰＺＰ　モチーフ）をもつ各種ディスプレイ用のペプチドライブラリー（ＺＰＺＰ　ｌｉｂ）を構築し、前記ＣＤＲに親和性の大きいペプチドを選択すればよい。ここで、Ｚはヒスチジン（Ｈｉｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）のいずれかの芳香族アミノ酸を表し、Ｐはプロリンを表す。
　第１ペプチドに含まれるミモトープも上記方法で同定することができる。
　抗体のＣＤＲループは、芳香族アミノ酸が多く含まれる。芳香族アミノ酸同士は相互作用しやすいため、ペプチドの中央付近に芳香族アミノ酸が存在していることが好ましい。
　本発明は、上記方法により得られた第１ペプチドや、ミモトープその他抗体以外の分子（サイトカイン等）に結合するペプチドを同定するための各種ディスプレイ用のペプチドライブラリーをも包含する。
（２）標的抗原に結合する分子の製造方法
　本発明の標的抗原に結合する分子であり、第１ペプチドに含まれるアミノ酸配列及び／又は第２ペプチドに含まれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドは、組換え、インビトロ翻訳、化学合成、ペプチド合成等により調製することができる。
　例えば、標的抗原に結合する部分に含まれるアミノ酸配列、並びに、任意で、第１ペプチドに含まれるアミノ酸配列、及び／又は、第２ペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを細胞に導入し、該細胞を培養し、該培養物から該標的抗原に結合するポリペプチドを回収することにより、本発明の標的抗原に結合する分子を製造することができる。
　標的抗原に結合する部分に含まれるアミノ酸配列、並びに、任意で、第１ペプチドに含まれるアミノ酸配列、及び／又は、第２ペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドは、それぞれのペプチドをコードするＤＮＡを連結し、さらに、プロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等のエレメントと機能的に連結してもよい。ここで機能的に連結とは、エレメントがその機能を果たすように連結することをいう。これらのＤＮＡを発現ベクターに挿入し、宿主細胞を該ベクターで形質転換し、該宿主細胞を培養して産生させ、回収すればよい。該ベクターは宿主細胞からの標的抗原に結合する分子の分泌を促進するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含んでいてもよい、この場合、シグナルペプチドをコードするＤＮＡと標的抗原に結合する分子をコードするＤＮＡをインフレームで連結しておく。標的抗原に結合する分子が産生された後にシグナルペプチドを除去することにより、標的抗原に結合する分子を成熟タンパク質として得ることができる。
　発現ベクターは、動物細胞、細菌、酵母等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、公知のプラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター（プロメガ社）、ｐＵＣ１９、ｐＵＥＸ２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ－ｎｅｏ（クロンテック社製）等が挙げられる。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞も酵母、動物細胞等の真核細胞も用いることができるが、真核細胞を用いることが好ましい。例えば、動物細胞として、ヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞等を用いればよい。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換すればよい。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション法等が挙げられる。産生された抗体は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用して精製することができる。例えば、アフィニティー・クロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択し、組合せればよい。
（３）第２ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドの製造方法
　本発明の第２ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドは、組換え、インビトロ翻訳、化学合成、ペプチド合成等により調製することができる。
　例えば、第２ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入し、該細胞を培養し、該培養物から目的のペプチドを回収することにより、本発明の第２ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドを製造することができる。
　第２ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それぞれのペプチドをコードするＤＮＡを連結し、さらに、プロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等のエレメントと機能的に連結してもよい。ここで機能的に連結とは、エレメントがその機能を果たすように連結することをいう。これらのＤＮＡを発現ベクターに挿入し、宿主細胞を該ベクターで形質転換し、該宿主細胞を培養して産生させ、回収すればよい。該ベクターは宿主細胞からの第２ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含んでいてもよい、この場合、シグナルペプチドをコードするＤＮＡと第２ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡをインフレームで連結しておく。第２ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドが産生された後にシグナルペプチドを除去することにより、第２ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドを成熟タンパク質として得ることができる。
　発現ベクターは、動物細胞、細菌、酵母等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、公知のプラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター（プロメガ社）、ｐＵＣ１９、ｐＵＥＸ２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ－ｎｅｏ（クロンテック社製）等が挙げられる。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞も酵母、動物細胞等の真核細胞も用いることができるが、真核細胞を用いることが好ましい。例えば、動物細胞として、ヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞等を用いればよい。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換すればよい。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション法等が挙げられる。産生された抗体は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用して精製することができる。例えば、アフィニティー・クロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択し、組合せればよい。
 
４．本発明の標的抗原に結合する分子の利用
　本発明の標的抗原に結合する分子、その塩又はそれらの水和物（以下「本発明の標的抗原に結合する分子等」という。）は、異常細胞に起因する疾患の予防及び／又は治療薬として用いることができる。
　異常細胞が腫瘍細胞である場合、本発明の標的抗原に結合する分子等は抗がん剤として用いることができる。
　該抗がん剤は、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、胚細胞腫、脳腫瘍、カルチノイド、神経芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽腫から選択される一種又は複数種に対して使用することができる。具体的には、がん腫では、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がんなどが挙げられ、肉腫では、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫などが挙げられ、リンパ腫では、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫などが挙げられ、白血病では、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群などが挙げられ、骨髄腫では、多発性骨髄腫などが挙げられ、胚細胞腫では、精巣がん、卵巣がんなどが挙げられ、脳腫瘍では、神経膠腫、髄膜腫などが挙げられる。
　本発明の抗がん剤は、治療に有効量の本発明の標的抗原に結合する分子と薬学上許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤、補助剤等を含めることができる。「薬学上許容可能な担体」等は、対象疾患の種類や薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜選択することができる。本発明の抗腫瘍剤の投与方法は適宜選択することができるが、例えば注射投与することができ、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等を採用することができる。また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、又は塩水とグルコース溶液の混合物、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調整するようにしてもよい。 
　他の投与方法についても、製剤の開発と共に適宜選択することができる。例えば経口投与の場合には、経口液剤や散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤等を適用することができる。経口液剤の場合には、懸濁剤及びシロップ剤等のような経口液体調整物として、水、シュークロース、ソルビトール、フラクト－ス等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造することができる。散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤は、ラクト－ス、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギニン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤及びカプセル剤は、投与が容易であるという点において、この発明の組成物における好ましい単位投与形態である。錠剤やカプセル剤を製造する際には、固体の製造担体が用いられる。
　治療に用いるに有効な本発明の標的抗原に結合する分子等の量は、治療する病状の性質、患者の年齢や状態により変更され、最終的には医師が決めればよい。例えば、１回体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ～１００ｍｇである。所定の投与量は１～１８０日に１回投与してもよいし、１日当たり２回、３回、４回又はそれ以上の分割投与とし適当な間隔で投与してもよい。
　本発明の標的抗原に結合する分子等は、他の薬剤と組み合わせても、異常細胞に起因する疾患の予防薬又は治療薬として用いられ得る。本発明の標的抗原に結合する分子等は、他の薬剤を投与する前に、他の薬剤と同時に、又は、他の薬剤を投与した後に、異常細胞に起因する疾患しているか又はそのおそれのある者等に投与され得る。本発明の標的抗原に結合する分子等を他の薬剤の同時に投与する場合、それらの配合剤（それら両方を含む製剤）及び各単剤（それぞれ一方だけを含む製剤）のいずれでもよい。
 
５．検査薬、診断薬及び試薬
　本発明の標的抗原に結合する分子等は、検査薬、診断薬又は試薬等として使用することができる。本発明の標的抗原に結合する分子等は、酸性ｐＨ条件下で、中性ｐＨ条件下に比して、標的抗原に対してより高い親和性をもって結合するため、標的抗原への抗体の結合量から、標的抗原近傍のｐＨの変化を調べることができる。従って、本発明の標的抗原に結合する分子等を、例えば、検体に使用する又は対象に投与する等により、標的抗原近傍のｐＨの変化を病因とする疾患又は表現型とする疾患等についての検査薬、診断薬又は試薬等として使用することができる。好適には、本発明の標的抗原に結合する分子等は、癌微小環境、エンドソーム中の環境又はリソソーム中の環境に存在する標的抗原近傍における、ｐＨの変化を病因とする疾患又は表現型とする疾患等についての検査薬、診断薬又は試薬等として使用することができる。検査薬、診断薬又は試薬としては、例えば、罹患リスクの判定又は測定、罹患の有無の判定、進行や増悪化の程度の測定、標的抗原に結合する分子を含む医薬組成物による薬物治療の効果の測定又は判定、薬物治療以外の治療の効果の測定又は判定、再発リスクの測定、再発の有無の判定等に用いられるものが含まれるが、検査薬、診断薬又は試薬としての使用であればそれらに限定されるものではない。本発明は、本発明の標的抗原に結合する分子等を含む検査、診断又は試薬等組成物（以下、「検査等用組成物」という。）を提供する。かかる検査等用組成物には、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調節剤、塩類、安定化剤、防腐剤、顕色剤、増感剤、凝集防止剤等を含有させることができる。
　以下、実施例において本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年発行）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。遺伝子やベクター構築のために必要なプライマーは、必要に応じて合成委託（株式会社ＦＡＳＭＡＣ、及びＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）した。
 
（実施例１）　抗ＴＲＯＰ２抗体ＨＴ１－１１の調製
１）－１　抗ＴＲＯＰ２抗体ＨＴ１－１１の発現・精製
　ＷＯ２０１５／０９８０９９号に記載の公知の抗ＴＲＯＰ２抗体の重鎖（配列番号１、図１６）又は軽鎖（配列番号２、図１７）をコードするＤＮＡがクローニングされたｐｃＤＮＡ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格とした哺乳動物細胞用発現ベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に導入し、一過性発現させた培養上清より抗体分子を精製した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）はマニュアルに従い、継代、培養を行った。対数増殖期にあるＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養液を２．５×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＥｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で希釈し、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に重鎖、軽鎖それぞれの発現ベクターとＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）を加えて反応後、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞へ添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで５日間、１３５ｒｐｍで振とう培養した。遠心分離後の培養上清に対してＰＢＳ　ｐＨ７．４で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ社）を添加し、目的の抗体分子を吸着させた。非吸着成分をＰＢＳで除去した後、ｐＨ３．５の酢酸バッファーで吸着成分を溶出した。溶出画分はｐＨ９．０のＴｒｉｓバッファーでｐＨを中性に調製し、限外ろ過膜を用いて２５ｍＭ　Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、５（ｗ／ｖ）％　Ｓｏｒｂｉｔｏｒ、ｐＨ６．０にバッファー置換した。必要に応じて濃縮後、予め２５ｍＭ　Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５（ｗ／ｖ）％　Ｓｏｒｂｉｔｏｒ、ｐＨ５．５で平衡化したゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００　Ｉｎｃｒｅａｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ社）に供し、モノマー画分を回収した。精製サンプルは、ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）と分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、モノマー純度を評価した。精製抗体の濃度は、分光光度計の２８０ｎｍの吸光度と、ＰＡＣＥ法で算出した吸光係数を用いて当業者公知の方法で決定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．；４（１１）：２４１１－２４２３（１９９５））。
 
１）－２　ＥＬＩＳＡによる抗ＴＲＯＰ２抗体ＨＴ１－１１と抗ＴＲＯＰ２抗原の結合活性評価
　９６ウェルＭａｘｉ－ｓｏｒｐ　ｐｌａｔｅ（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を５０μＬずつ添加し、４℃で一晩固相化した。Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を０．０５（ｗ／ｖ）％含むＰＢＳ（ＥＬＩＳＡバッファー）で洗浄後、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でブロッキングした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン化ヒトＴＲＯＰ２抗原（アクセション番号：Ｐ０９７５８。細胞外ドメインを当業者公知の手法で精製後、Ｃ末端Ａｖｉタグ配列をビオチン化した。）を５０μＬずつ添加して３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで濃度調整した実施例１）－１の抗体を５０μＬずつ添加して３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで２５００倍に希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ添加し、３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｐｉｃｏ　ＥＬＩＳＡ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、１０分後の化学発光をプレートリーダーで測定した。図２に示すように、ＨＴ１－１１は濃度依存的にヒトＴＲＯＰ２抗原に結合した。
 
（実施例２）　抗ＴＲＯＰ２抗体ＨＴ１－１１に結合するミモトープペプチドの濃縮
　完全ランダムな１５アミノ酸から構成されるリボソームディスプレイ用のペプチドライブラリー（Ｌｉｎｅａｒ　１５ｍｅｒ　ｌｉｂ）を構築し、当業者公知の方法でＨＴ１－１１へ結合可能なペプチドを濃縮した。最初に、ＥＺ－Ｌｉｎｋ　ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でビオチン化したヒト血清由来ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）又はＨＴ１－１１をＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｍ－２８０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に固相化し、ペプチドを提示しているリボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ：以下「ＲＤ」という。）をヒト血清由来ＩｇＧ結合ビーズと反応させた。結合しなかったＲＤをマグネットスタンド（ＤｙｎａＭａｇ‐２、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収後、ＨＴ１－１１結合ビーズと反応させた。マグネットスタンドを用いた洗浄操作によりＨＴ１－１１に結合しなかったＲＤを除去し、ＨＴ１－１１に結合したＲＤからｍＲＮＡを精製した。その後、ＲＴ－ＰＣＲ及びインビトロ翻訳によりＲＤを再度調製した。このパニング操作を３回実施した。
　パニング３ラウンド後のｍＲＮＡをインビトロ翻訳しＲＤを調製後、ビオチン化したＨＴ１－１１又はヒト血清由来ＩｇＧが固相化されたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｍ－２８０とそれぞれ反応させた（インプット量：６×１０１１）。マグネットスタンドを用いた洗浄操作により結合しなかったＲＤを除去後、結合したＲＤからｍＲＮＡを回収し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより、回収量（アウトプット）を定量評価した。図３に示すように、ＨＴ１－１１を固相した条件では、ヒト血清ＩｇＧを固相した条件と比較して２６２４倍多くｍＲＮＡが回収された。この結果から、ＨＴ１－１１に特異的に結合するペプチドの濃縮が示唆された。
 
（実施例３）　抗ＴＲＯＰ２抗体に結合するミモトープペプチドのスクリーニング
３）－１　パニング由来のペプチドを融合したＨＴ１－１１　ｓｃＦｖの調製
　パニング３ラウンド後のＤＮＡフラグメントに制限酵素を添加し、ランダムペプチド部分をコードするＤＮＡフラグメントを当業者公知の方法で精製した。ｐｅｌＢシグナル配列、ＤＮＡフラグメント、ＭＭＰ切断リンカー（公知のＭＭＰ基質含む（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ．；１６１：８０４－８１２（２０１２）．）：配列番号３及び図１８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４１～６０）、ＨＴ１－１１　ｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬの順又は、ＶＬ－ＶＨの順）、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグの順で翻訳されるように、当業者公知の方法でＤＮＡフラグメントを大腸菌発現ベクターにライゲーションし、大腸菌ＸＬ－１　Ｂｌｕｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を形質転換した。ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）存在下で大腸菌を培養し、ペプチド融合ｓｃＦｖを含む培養上清を回収した。
３）－２　ミモトープペプチドの取得
　実施例１）－２と同様の方法でヒトＴＲＯＰ２抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。ペプチド融合ｓｃＦｖを含む培養上清は、２ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳ（ＭＭＰバッファー）で１０倍希釈し、１００ｎＭの活性型ヒトＭＭＰ１（アクセション番号：Ｐ０３９５６）と３７℃で１５分反応させ、ＭＭＰ切断リンカーを切断した。その後、ヒトＴＲＯＰ２抗原を固相化したプレートに５０μＬずつ添加した。結合したｓｃＦｖはＥＬＩＳＡバッファーで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で検出した。また、ＭＭＰ１非添加条件でも同様の操作を行い、結合強度比（ＭＭＰ１添加条件／ＭＭＰ１非添加条件）が大きい値を示すクローンを陽性クローンとして選抜した。陽性クローンの発現ベクターを精製後、当業者公知の方法で翻訳領域の配列を解析し、ユニーククローンとしてＭＨＴ１００１（配列番号３、図１８）及びＭＨＴ１００２（配列番号４、図１９）を得た。
３）－３　陽性クローンの結合活性評価
　ＨＴ１－１１―ｓｃＦｖ－ＨＬ（配列番号５、図２０）、ＨＴ１－１１－ｓｃＦｖ－ＬＨ（配列番号６、図２１）及び実施例３）－２で同定した陽性クローンＭＨＴ１００１、ＭＨＴ１００２を大腸菌ＸＬ－１　Ｂｌｕｅで発現させ、培養上清よりＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｅｘｃｅｌ（Ｃｙｔｉｖａ社）で精製し、ＴＢＳに置換した。精製抗体の濃度は、分光光度計の２８０ｎｍの吸光度と、ＰＡＣＥ法で算出した吸光係数を用いて当業者公知の方法で決定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．；４（１１）：２４１１－２４２３（１９９５））。精製サンプルを用いて実施例３）－２と同様の方法でＭＭＰ１添加条件、ＭＭＰ１非添加条件におけるヒトＴＲＯＰ２抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。ＭＭＰバッファーで抗体を１μＭに調製し、終濃度１μＭ又は０μＭになるようＭＭＰ１を添加し、３７℃で１５分反応させた。その後、ＥＬＩＳＡバッファーで濃度調整した抗体を各ウェルに添加した。
　図４－１（Ａ）、図４－１（Ｂ）に示すように、ミモトープペプチドを融合していないＨＴ１－１１－ｓｃＦｖ－ＨＬ及びＨＴ１－１１－ｓｃＦｖ－ＬＨはＭＭＰ１の添加に寄らず同様の結合活性を示した。また、ミモトープペプチドを融合したＭＨＴ１００１及びＭＨＴ１００２は、ＭＭＰ１添加条件においてＭＭＰ１非添加条件よりも強い結合活性を示しており、結合のＥＣ５０比（ＭＭＰ１非添加条件／ＭＭＰ１添加条件）はそれぞれ７．９、４．３だった（図４－２（Ｃ）、図４－２（Ｄ））。
 
（実施例４）　抗ＴＲＯＰ２マスク抗体の調製・結合活性評価
　当業者公知の手法で、ＭＨＴ１００１のミモトープペプチド及びＭＭＰ切断リンカー（実施例３）－１参照）を融合した抗ＴＲＯＰ２マスク抗体ＭＨＴ１００７（表２、配列番号７、図２２）の重鎖発現ベクターを構築した。同様に、ＭＭＰ切断リンカー部分をプロテアーゼで切断できない非切断リンカーに改変したＭＨＴ１００８（表２、配列番号８、図２３）及びｕＰＡの切断リンカー（公知のｕＰＡ基質含む（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．；２７２（３３）：２０４５６－２０４６２（１９９７）．）：図２４及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号３６～５５）に改変したＭＨＴ１００９（表２、配列番号９、図２４）の重鎖発現ベクターをそれぞれ構築した。各抗体の重鎖発現ベクターをＨＴ１－１１の軽鎖発現ベクターを組合せ、実施例１）－１と同様の方法でＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の培養上清より各マスク抗体を精製し、蛋白質濃度を決定した。調製したマスク抗体は重鎖発現ベクター名と対応させ、ＭＨＴ１００７、ＭＨＴ１００８、ＭＨＴ１００９と命名した（表２）。表２の各マスク抗体の重鎖配列の配列中の「ｐＨ応答性リンカー」は本発明の標的抗原に結合する分子の第２ペプチドに相当する。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以下に記載する部分を除き、実施例１）－２、実施例３）－２と同様の方法でプロテアーゼ添加条件、非添加条件におけるヒトＴＲＯＰ２抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。プロテアーゼ添加条件では、３μＭの抗体に対して終濃度３００ｎＭのＭＭＰ１又は、活性型ヒトｕＰＡ（アクセション番号：Ｐ００７４９）を添加し、３７℃で反応後、ＥＬＩＳＡバッファーで濃度調整した抗体をヒトＴＲＯＰ２抗原の固定されたウェルに添加した。
　図５－１（Ａ）に示すように、ミモトープペプチドを融合していないＨＴ１－１１はＭＭＰ１添加条件においても非添加条件と同様の結合活性を示した。また、プロテアーゼ非添加条件において、ミモトープペプチドを融合したＭＨＴ１００７の結合活性はＨＴ１－１１よりも低下しており、ｓｃＦｖ時と同様にマスク効果が示された。また、ＭＭＰ１添加条件においてＭＭＰ１非添加条件よりも強い結合活性を示しており、結合のＥＣ５０比（ＭＭＰ１非添加条件／ＭＭＰ１添加条件）は１０４だった（図５－１（Ｂ））。非切断リンカーを搭載したＭＨＴ１００８では、ＭＭＰ１添加条件でも非添加条件と同様に結合活性が低下していた（図５－２（Ｃ））。ｕＰＡ切断リンカーを搭載したＭＨＴ１００９では、ｕＰＡ添加条件においてｕＰＡ非添加条件よりも強い結合活性を示しており、結合のＥＣ５０比（ｕＰＡ非添加条件／ｕＰＡ添加条件）は８３だった（図５－２（Ｄ））。上記結果から、実施例３で取得したミモトープはｓｃＦｖの状態だけでなくＩｇＧの状態でもマスキングドメインとして機能すること、切断リンカー配列はマスク効果を維持した状態で改変可能であることが示された。
　取得したペプチドがミモトープであることを確認するために、マスクペプチドとＭＭＰ切断リンカー（実施例３）－１参照）を含むＭＨＴ１００７のＦａｂ領域を当業者公知の方法で調製し、当該Ｆａｂ領域の結晶化及びＸ線結晶構造解析を行った。その結果、該ペプチドはＨＴ１－１１のＣＤＲ領域に結合していることが示された（データ示さず）。また、化学合成したマスクペプチドがＴＲＯＰ２抗原と競合的にＨＴ１－１１に結合することをＳＰＲで確認した（データ示さず）。
（実施例５）　Ｈｉｓクラスター搭載リンカーの設計と結合のｐＨ応答性評価
　側鎖のｐＫａが６．０であるＨｉｓはｐＨｅが低下する腫瘍微小環境でプロトン化しやすいアミノ酸である。リンカー内に複数のＨｉｓを搭載した抗ＴＲＯＰ２マスク抗体を設計し、ヒトＴＲＯＰ２抗原との相互作用を以下に記載する部分を除き、実施例１）－２と同様にＥＬＩＳＡで評価した。抗体を中性バッファー（５０ｍＭ　ＴＲＩＳ又は５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣＬ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．５）又は酸性バッファー（５０ｍＭ　Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣＬ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．５―５．５）で２０００ｎＭに希釈し、３７℃で反応後、各バッファーで濃度を調整しヒトＴＲＯＰ２抗原の固定されたウェルに添加した。洗浄及びＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）の希釈も各ｐＨ条件にそろえて実施した。
　図６－１（Ａ）に示すようにＨｉｓを搭載していないＭＨＴ１００８は、中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５）及び酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５）で同様の結合活性を示した。その一方で、連続したＨｉｓ（Ｈｉｓクラスター）をリンカー内に１つ又は２つ搭載したＭＨＴ１８０３（表２、配列番号１０、図２５）、ＭＨＴ１８０４（表２、配列番号１１、図２６）及びＭＨＴ１８０５（表２、配列番号１２、図２７）は中性ｐＨ条件よりも酸性ｐＨ条件で強い結合を示した（図６－１（Ｂ）、図６－２（Ｃ）、図６－２（Ｄ））。ＭＨＴ１８０３、ＭＨＴ１８０４、ＭＨＴ１８０５の結合のＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）はそれぞれ３．９、３．６、２．３だった。また、Ｈｉｓクラスター数を３つ搭載したＭＨＴ１８０６（表２、配列番号１３、図２８）も同様に酸性ｐＨ条件で強い結合活性を示し（図６－３（Ｅ））、ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）は３８．８だった。
　Ｈｉｓクラスターを形成する連続したＨｉｓの数を検討するために、ＭＨＴ１８０８（表２、配列番号１４、図２９）、ＭＨＴ１８０９（表２、配列番号１５、図３０）及び、ＭＨＴ１８１０（表２、配列番号１６、図３１）の結合活性を評価した。いずれのクローンも中性ｐＨ条件よりも酸性ｐＨ条件で強い結合を示し（図６－３（Ｆ）、図６－４（Ｇ）、図６－４（Ｈ））、ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）はそれぞれ２４．４、１１．４、７．８だった。
　ＨｉｓクラスターとＰＬＧＬＷＡ（配列番号４０、図５１）で構成される公知のＭＭＰ基質（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．；４０（４）：３９９－４１６（１９９６）．）を搭載したＭＨＴ１８１１（表２、配列番号１７、図３２）の結合活性を評価した。プロテアーゼ基質を含む場合も、ＭＨＴ１８１１は中性ｐＨ条件よりも酸性ｐＨ条件で強い結合を示し（図６－５（Ｉ））、ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）は２８．１だった。また、ＭＭＰ１添加条件でも強い結合活性を示し、ＥＣ５０比（ＭＭＰ１非添加条件／ＭＭＰ１添加条件）は４８．４だった。
　結合活性が向上する酸性ｐＨ条件を解析した。図６－５（Ｊ）に示すように、ＭＨＴ１８０６はｐＨ６．５以下の酸性ｐＨ条件で中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５）よりも結合活性が向上した。また、ＭＨＴ１８０８はｐＨ６．０以下の酸性ｐＨ条件で中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５）よりも結合活性が向上した（図６－６（Ｋ））。
　Ｈｉｓ残基のプロトネーションがｐＨ低下依存的な結合活性の向上に寄与するか検証するために、Ｈｉｓクラスター内に負電荷のＡｓｐ残基を配置したＭＨＴ１８１７（表２、配列番号１８、図３３）、ＭＨＴ１８１８（表２、配列番号１９、図３４）、ＭＨＴ１８１９（表２、配列番号２０、図３５）を設計、調製した。ｐＨ７．５、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０のバッファーで各抗体を２０ｎＭに希釈し、３７℃で３０分反応後、ヒトＴＲＯＰ２抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。ＭＨＴ１８０８はｐＨ低下依存的に結合活性が向上したが、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０のいずれの条件においてもＭＨＴ１８１７、ＭＨＴ１８１８、ＭＨＴ１８１９の結合活性はＭＨＴ１８０８程向上しなかった（図７）。また、Ｈｉｓクラスター内部のＡｓｐ残基数が増える程、ｐＨ変化に伴う結合活性の変化は小さくなった。この結果は、ｐＨ応答性リンカー中にＡｓｐ残基が含まれない方が好ましいことを示す。
 
（実施例６）　抗ＣＤ９８抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の結合活性評価
６）－１　抗ＣＤ９８抗体ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１の結合活性評価
　ＷＯ２０１５／１４６１３２号に記載の公知の抗ＣＤ９８抗体ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１（重鎖配列（表３、配列番号２１、図３６）、軽鎖配列（表３、配列番号２２、図３７））のヒトＣＤ９８抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。
　９６ウェルＭａｘｉ－ｓｏｒｐ　ｐｌａｔｅ（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を５０μＬずつ添加し、４℃で一晩固相化した。Ｔｗｅｅｎ－２０（バイオ・ラッド社）を０．０５％含むＰＢＳ（ＥＬＩＳＡバッファー）で３回洗浄後、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でブロッキングした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン化ヒトＣＤ９８抗原（アクセション番号：Ｐ０８１９５。細胞外ドメインを当業者公知の手法で精製後、ＥＺ－Ｌｉｎｋ　ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でビオチン化した。）を５０μＬずつ添加して３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで調製した抗ＣＤ９８抗体ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１を５０μＬずつ添加して３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで２５００倍に希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ添加し、３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｐｉｃｏ　ＥＬＩＳＡ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、１０分後の化学発光をプレートリーダーで測定した。図８－１（Ａ）に示すように、ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１は濃度依存的にヒトＣＤ９８抗原に結合した。
 
６）－２　抗ＥＧＦＲ抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの調製・結合活性評価
　公知の抗ＥＧＦＲ抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（表３、重鎖配列（配列番号２３、図３８）、軽鎖配列（配列番号２４、図３９））を実施例１）－１と同様に調製し、ヒトＥＧＦＲに対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。
　９６ウェルＭａｘｉ－ｓｏｒｐ　ｐｌａｔｅ（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳで０．２μｇ／ｍＬに希釈したヒトＥＧＦＲ－Ｆｃ（ヒトＥＧＦＲ（アクセション番号：Ｐ００５３３）の細胞外ドメインと、ヒトＩｇＧ１　Ｆｃ領域（アクセション番号：Ｐ０１８５７）の融合蛋白質を当業者公知の方法で精製した。）を５０μＬずつ添加し、４℃で一晩固相化した。Ｔｗｅｅｎ－２０（バイオ・ラッド社）を０．０５％含むＰＢＳ（ＥＬＩＳＡバッファー）で洗浄後、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でブロッキングした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＭＭＰバッファーで調製したＣｅｔｕｘｉｍａｂを５０μＬずつ添加して３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで２５００倍に希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ添加し、３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｐｉｃｏ　ＥＬＩＳＡ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、１０分後の化学発光をプレートリーダーで測定した。図８－１（Ｂ）に示すように、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂは濃度依存的にヒトＥＧＦＲ抗原に結合した。
 
６）－３　抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の調製・結合活性評価
　ＷＯ２０１８／１４７２４５号に記載の公知の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体Ｃ３０２２（表３、重鎖配列（配列番号２５、図４０）、軽鎖配列（配列番号２６、図４１））を実施例１）－１と同様に調製し、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。
　９６ウェルＭａｘｉ－ｓｏｒｐ　ｐｌａｔｅ（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を５０μＬずつ添加し、４℃で一晩固相化した。Ｔｗｅｅｎ－２０（バイオ・ラッド社）を０．０５％含むＰＢＳ（ＥＬＩＳＡバッファー）で洗浄後、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でブロッキングした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン化ヒトＧＰＲＣ５Ｄアミノ末端ペプチド（ＭＹＫＤＣＩＥＳＴＧＤＹＦＬＬＣＤＡＥＧＰＷＧＩＩＬＥ（配列番号４５、図５３）－Ｋ（Ｂｉｏｔｉｎ）－ＮＨ２（ペプチド研究所））を５０μＬずつ添加して３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＭＭＰバッファーで調製した抗体を５０μＬずつ添加して３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで２５００倍に希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ添加し、３０分室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｐｉｃｏ　ＥＬＩＳＡ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、１０分後の化学発光をプレートリーダーで測定した。図８－２（Ｃ）に示すように、Ｃ３０２２は濃度依存的にヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合した。表３の各マスク抗体の重鎖配列又は軽鎖配列の配列中の「ｐＨ応答性リンカー」は本発明の標的抗原に結合する分子の第２ペプチドに相当する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例７）　ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｃ３０２２に対するミモトープペプチドの濃縮
７）－１　ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１に結合するミモトープペプチドの濃縮
　完全ランダムな１５アミノ酸から構成されるペプチドライブラリー（Ｌｉｎｅａｒ　１５ｍｅｒ　ｌｉｂ）又は、中央付近に芳香族性アミノ酸とＰｒｏの繰り返しモチーフ（ＺＰＺＰ　モチーフ）をもつリボソームディスプレイ用のペプチドライブラリー（ＺＰＺＰ　ｌｉｂ）を構築し、ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１へ結合可能なペプチドを濃縮した（図９－１（Ａ））。最初に、ＥＺ－Ｌｉｎｋ　ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でビオチン化したヒト血清由来ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を固相化したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｍ－２８０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に対してＲＤを添加し、ヒト血清由来ＩｇＧやＰｒｏｔｅｉｎ　Ａと反応させた。結合しなかったＲＤをマグネットスタンド（ＤｙｎａＭａｇ‐２、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収後、ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１を結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａと反応させた。マグネットスタンドを用いた洗浄操作によりｈＭ２３Ｈ１Ｌ１に結合しなかったＲＤを除去し、ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１に結合したＲＤからｍＲＮＡを精製した。その後、ＲＴ－ＰＣＲ及びインビトロ翻訳によりＲＤを再度調製した。このパニング操作を３回実施した。
　パニング３ラウンド後のｍＲＮＡをインビトロ翻訳してＲＤを調製後、ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１又はヒト血清由来ＩｇＧが固相化されたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａとそれぞれ反応させた（インプット量：６×１０１１）。マグネットスタンドを用いた洗浄操作により結合しなかったＲＤを除去後、結合したＲＤからｍＲＮＡを回収し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより、回収量（アウトプット）を定量評価した。図９－１（Ｂ）に示すように、Ｌｉｎｅａｒ　１５ｍｅｒ　ｌｉｂ及びＺＰＺＰ　ｌｉｂの両ペプチドライブラリーに関して、ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１を固相した条件では、ヒト血清ＩｇＧを固相した条件と比較して約２００倍多くｍＲＮＡが回収された。この結果から、ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１に特異的に結合するペプチドの濃縮が示唆された。
 
７）－２　Ｃｅｔｕｘｉｍａｂに対するミモトープペプチドの濃縮
　完全ランダムな１５アミノ酸から構成されるリボソームディスプレイ用のペプチドライブラリー（Ｌｉｎｅａｒ　１５ｍｅｒ　ｌｉｂ）を用いて、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂへ結合可能なペプチドを濃縮した。最初に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及び、ヒト血清由来ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を固相化したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に対してＲＤを添加し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａやヒト血清由来ＩｇＧと反応させた。結合しなかったＲＤをマグネットスタンド（ＤｙｎａＭａｇ‐２、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収後、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａと反応させた。マグネットスタンドを用いた洗浄操作によりＣｅｔｕｘｉｍａｂに結合しなかったＲＤを除去し、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂに結合したＲＤからｍＲＮＡを精製した。その後、ＲＴ－ＰＣＲ及びインビトロ翻訳によりＲＤを再度調製した。このパニング操作を４回実施した。
　パニング４ラウンド後のｍＲＮＡをインビトロ翻訳しＲＤを調製後、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ又はヒト血清由来ＩｇＧが固相化されたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａとそれぞれ反応させた（インプット量：６×１０１１）。マグネットスタンドを用いた洗浄操作により結合しなかったＲＤを除去後、結合したＲＤからｍＲＮＡを回収し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより、回収量（アウトプット）を定量評価した。図９－２（Ｃ）に示すように、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを固相した条件では、ヒト血清ＩｇＧを固相した条件と比較して２７６倍多くｍＲＮＡが回収された。この結果から、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂに特異的に結合するペプチドの濃縮が示された。
７）－３　Ｃ３０２２に対するミモトープペプチドの濃縮
　完全ランダムな１５アミノ酸から構成されるリボソームディスプレイ用のペプチドライブラリー（Ｌｉｎｅａｒ　１５ｍｅｒ　ｌｉｂ）を用いて、Ｃ３０２２へ結合可能なペプチドを濃縮した。最初に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及び、ヒト血清由来ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を固相化したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に対してＲＤを添加し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａやヒト血清由来ＩｇＧと反応させた。結合しなかったＲＤをマグネットスタンド（ＤｙｎａＭａｇ‐２、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収後、Ｃ３０２２を結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａと反応させた。マグネットスタンドを用いた洗浄操作によりＣ３０２２に結合しなかったＲＤを除去し、Ｃ３０２２に結合したＲＤからｍＲＮＡを精製した。その後、ＲＴ－ＰＣＲ及びインビトロ翻訳によりＲＤを再度調製した。このパニング操作を３回実施した。
　パニング３ラウンド後のｍＲＮＡをインビトロ翻訳しＲＤを調製後、Ｃ３０２２又はヒト血清由来ＩｇＧが固相化されたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａとそれぞれ反応させた（インプット量：６×１０１１）。マグネットスタンドを用いた洗浄操作により結合しなかったＲＤを除去後、結合したＲＤからｍＲＮＡを回収し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより、回収量（アウトプット）を定量評価した。図９－２（Ｄ）に示すように、Ｃ３０２２を固相した条件では、ヒト血清ＩｇＧを固相した条件と比較して５０３倍多くｍＲＮＡが回収された。この結果から、Ｃ３０２２に特異的に結合するペプチドの濃縮が示された。
 
（実施例８）ｐＨ応答性リンカーの適用汎用性　
　実施例３と同様の方法で抗ＣＤ９８抗体、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の結合を阻害可能なミモトープペプチドを選抜した。抗ＥＧＦＲ抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂに関しては、ｓｃＦｖの状態でなくＩｇＧの状態でミモトープを選抜した。実施例３と同様に、ランダムペプチド部分をコードするＤＮＡフラグメントを制限酵素消化後に精製し、分泌シグナル配列、ＤＮＡフラグメント、ＭＭＰ切断リンカー、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（重鎖又は軽鎖）の順で翻訳されるように、ＤＮＡフラグメントを哺乳動物細胞発現用ベクターに挿入した。ペプチド及びＭＭＰ切断リンカーが重鎖又は軽鎖のＮ末端に融合したＣｅｔｕｘｉｍａｂはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現させ、実施例３と同様の方法でＣｅｔｕｘｉｍａｂの結合を阻害可能なミモトープペプチドを選抜した。
　Ｈｉｓクラスターを３つ搭載したｐＨ応答性リンカーを使用し、酸性ｐＨ条件において汎用的にマスク抗体が活性化するかどうか検証した。上記スクリーニングで同定したミモトープを搭載した抗ＣＤ９８マスク抗体ＭｈＭ８００１（表３、配列番号２７、図４２）、抗ＥＧＦＲマスク抗体ＭＣＥ－２１０１（表３、配列番号２８、図４３）及び、抗ＧＰＲＣ5Ｄマスク抗体ＭＣ３－９００１（表３、配列番号２９、図４４）を設計した。実施例１）－１と同様にマスク抗体を調製し、実施例５、実施例６と同様に、中性ｐＨ条件、酸性ｐＨ条件での結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。
　ＭｈＭ８００１、ＭＣＥ－２１０１及び、ＭＣ３－９００１は全て中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５）よりも酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５）で強い結合を示し、ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）はそれぞれ１３．１、３９．０、４０．４だった（図１０－１（Ａ）、図１０－１（Ｂ）、図１０－２（Ｃ））。これらの結果から、Ｈｉｓクラスターを搭載したマスク抗体は汎用的に酸性ｐＨ条件で活性化することが示唆された。
 
（実施例９）　ＡＤＣ化する抗ＴＲＯＰ２マスク抗体の調製・結合活性評価
　Ｈｉｓクラスターをリンカー部分に搭載することで、ｐＨ低下依存的にマスク抗体の殺細胞活性が向上するか検証することを目的に、Ｈｉｓクラスターを搭載した抗ＴＲＯＰ２マスク抗体ＭＨＴ１８０８、Ｈｉｓクラスターを搭載していないＭＨＴ１２２１（表２、配列番号３０、図４５）及び、ＭＨＴ１００８を設計した。実施例１）－１と同様の方法で各抗体を調製し、実施例５と同様の方法で中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５）、酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５）におけるヒトＴＲＯＰ２抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。
　図１１に示すように、ＭＨＴ１８０８は中性ｐＨ条件よりも酸性ｐＨ条件で強い結合を示し、ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）は２５．４だった。一方で、ＭＨＴ１２２１及びＭＨＴ１００８は両ｐＨ条件で同等の結合活性を示し、ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）はそれぞれ１．７、１．２だった。
 
（実施例１０）　抗体－薬物コンジュゲートの製造
　抗体－薬物コンジュゲートを製造するための薬物リンカーは、Ｎ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド（実施例５８　工程８　ＷＯ２０１４／０５７６８７号、以下「リンカー１」と称する）及び、Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド（実施例２－１　ＷＯ２０２０／１９６４７４号、以下「リンカー２」と称する）を使用した。
 
抗体－薬物コンジュゲートの製造及び同定に使用する共通操作
共通操作Ａ：抗体及び抗体－薬物コンジュゲート水溶液の濃縮
　Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ（５０，０００　ＭＷＣＯ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び遠心機Ａｌｌｅｇｒａ　Ｘ－１５Ｒ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）（ＳＸ４７５０Ａ）にて濃縮した（４０００ｇ）。
 
共通操作Ｂ：抗体の濃度測定
　ＵＶ測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ　１０００，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を用いて、メーカー規定の方法に従い測定を使用した。
 
共通操作Ｃ：抗体のバッファー交換
Ｃ－１：ＮａＣｌ（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（５ｍＭ）を含むリン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）（以下ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡと称する。）へのバッファー交換
　ＮＡＰ－２５カラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７０８５２０２，Ｃｙｔｉｖａ，ＮＡＰ－２５　Ｃｏｌｕｍｎｓ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ、以下ＮＡＰ－２５と称する）を用いてメーカー規定の方法に従い、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（５ｍＭ）を含むリン酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）（以下ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡと称する。）にて平衡化させた。このＮＡＰ－２５カラム一本につき、抗体水溶液２．５ｍＬをのせたのち、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ３．５ｍＬで溶出させた画分（３．５ｍＬ）を分取した。この画分を共通操作Ａ、Ｂにて濃縮、濃度測定を行ったのちに、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡを用いて１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
 
Ｃ－２：リン酸バッファー（５０ｍＭ，　ｐＨ６．０）（以下、ＰＢ６．０と称する）へのバッファー交換
　抗体水溶液にＰＢ６．０を加え共通操作Ａを用いて濃縮した。この操作を数回行った後、濃度測定（共通操作Ｂ）を行い、ＰＢ６．０を用いて１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
 
共通操作Ｄ：抗体－薬物コンジュゲートの精製
　ＮＡＰ－２５を用いてメーカー規定操作に従い、抗体画分を溶出させた。カラムの平衡化及び溶出溶液に５（ｗ／ｖ）％Ｓｏｒｂｉｔｏｌ―１０ｍＭ　酢酸バッファー（以下、ＡＢＳと称する）を使用し、
 
共通操作Ｅ：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度の測定
　抗体－薬物コンジュゲートの濃度Ｃ’（ｍｇ／ｍＬ）は、ランベルト・ベールの法則、吸光度Ａ２８０＝モル吸光係数ε２８０（Ｌ・ｍｏｌ－１・ｃｍ－１）×モル濃度Ｃ（ｍｏｌ・Ｌ－１）×セル光路長ｌ（ｃｍ）より導ける式（Ｉ）で算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　Ｃ’（ｍｇ／ｍＬ）の算出に使用した各値は以下によって得た。
・吸光度Ａ２８０：抗体－薬物コンジュゲート水溶液の２８０ｎｍＵＶ吸光度の実測値
　Ｌａｍｂａ２５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて計測
・モル質量ＭＷ（ｇ・ｍｏｌ－１）：抗体のアミノ酸配列からより求められる抗体分子量の計算推定値（抗体－薬物コンジュゲートのモル質量の近似値として使用）。
・光路長ｌ（ｃｍ）：１ｃｍ
・抗体薬物コンジュゲートのモル吸光係数ε２８０：下記の式（ＩＩ）より算出
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　　　εＡｂ，２８０：２８０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数
　　　εＤＬ，２８０：２８０ｎｍにおける薬物リンカーのモル吸光係数
　　　薬物結合数：共通操作Ｆにて算出（下記参照）
　　　εＡｂ，２８０は抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９９５，　ｖｏｌ．４，　２４１１－２４２３）で算出した値を使用した（下記表４参照）。
　εＤＬ，２８０はリンカー１ではメルカプトエタノール又はＮ－アセチルシステインで反応させ、マレイミド基をサクシニイミドチオエーテルに変換した化合物の実測のモル吸光係数（２８０ｎｍ）、リンカー２では実測のモル吸光係数（２８０ｎｍ）を使用した。
 
共通操作Ｆ：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定
　抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数は、ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　（ＲＰＣ）を用いて測定した。
 
Ｆ－１．サンプル調製（抗体分子間ジスルフィドの還元）
　抗体－薬物コンジュゲート溶液（約１ｍｇ／ｍＬ、６０μＬ）にジチオトレイトール（ＤＴＴ）水溶液（１００ｍＭ、１５μＬ）を添加した後、混合物を３７℃で３０分インキュベートし、軽鎖及び重鎖間のジスルフィド結合を切断した。
 
Ｆ－２．ＨＰＬＣ分析
　ＨＰＬＣ分析は下記の測定条件にて行った。
・ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・検出器：紫外吸光度計（測定波長：２８０ｎｍ）
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｐｈｅｎｙｌ（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ、１３０Å；Ｗａｔｅｒｓ、Ｐ／Ｎ１８６００２８８４）
・カラム温度：７５℃
・移動相Ａ：０．１０（ｗ／ｖ）％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１５（ｗ／ｖ）％２－プロパノール水溶液
・移動相Ｂ：０．０７５（ｗ／ｖ）％ＴＦＡ、１５（ｗ／ｖ）％２－プロパノール、アセトニトリル溶液
・グラジエントプログラム：（ｍｉｎ，Ｂ％）：（０，１４）-（１５，３６）-（１７，８０）-（１７．０１，１４）-（２５，１４）
・サンプル注入量：１０μＬ
 
Ｆ－３．データ解析
Ｆ－３－１　薬物の結合していない抗体の軽鎖（Ｌ０）及び重鎖（Ｈ０）に対して、薬物の結合した軽鎖（薬物がｉ個結合した軽鎖：Ｌｉ）及び重鎖（薬物がｉ個結合した重鎖：Ｈｉ）は、結合した薬物の数に比例して疎水性が増し保持時間が大きくなることから、Ｌ０、Ｌ０及びＨ０との保持時間比較により検出ピークをＬ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３のいずれかに割り当てることができる。
　
Ｆ－３－２　薬物リンカーにＵＶ吸収があるため、薬物リンカーの結合数に応じて、軽鎖、重鎖及び薬物リンカーのモル吸光係数を用いて下式に従ってピーク面積値の補正を行う。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　ここで、各抗体における軽鎖及び重鎖のモル吸光係数（２８０ｎｍ）は、既知の計算方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９９５，　ｖｏｌ．４，　２４１１－２４２３）によって、各抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列から推定される値を使用した（下記表４参照）。
 
Ｆ－３－３　ピーク面積補正値合計に対する各鎖ピーク面積比（％）を下式に従って計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Ｆ－３－４　抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数を、下式に従って計算した。
　薬物平均結合数＝（Ｌ０ピーク面積比ｘ０＋Ｌ１ピーク面積比ｘ１＋Ｈ０ピーク面積比ｘ０＋Ｈ１ピーク面積比ｘ１＋Ｈ２ピーク面積比ｘ２＋Ｈ３ピーク面積比ｘ３）／１００ｘ２
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
１０）－１　ＭｈＭ１０１８－Ｍ１－ＤＸｄ－ＡＤＣの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１）
抗体の還元：実施例１２にて作製したＭｈＭ１０１８－Ｍ１を、共通操作Ｂ及びＣ－１を用いて、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡにて１０ｍｇ／ｍＬに調製した。本溶液（１．４５ｍＬ）に１Ｍリン酸水素二カリウム水溶液（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．；０．０２１８ｍＬ）及び、１０ｍＭ　ＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）水溶液（０．０５８１ｍＬ；抗体一分子に対して６．０当量）を加えた。３７℃で２時間インキュベートすることによって、抗体内鎖間部のジスルフィド結合を還元した。
　抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション：上記溶液を１５℃で１０分間インキュベートした。次いでリンカー１の１０ｍＭ　ジメチルスルホキシド溶液（０．０９６９ｍＬ；抗体一分子に対して１０当量）を加え、１５℃で１時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、１００ｍＭ　ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．ＬＬＣ）水溶液（０．００９７ｍＬ；抗体一分子に対して１０当量）を加え撹拌後、さらに室温にて２０分間静置し、薬物リンカーの反応を停止させた。
　精製：上記溶液を、共通操作Ｄによる精製を行い、標記抗体－薬物コンジュゲート「ＭｈＭ１０１８－Ｍ１－ＤＸｄ－ＡＤＣ」を含有する溶液を７ｍＬ得た。
　特性評価：共通操作Ｅ及びＦを使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：１．７５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１２．２７ｍｇ（８３％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．４。
 
１０）－２　ＭｈＭ１０２４－Ｍ１－ＤＸｄ－ＡＤＣの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（２）
　実施例１２にて作製したＭｈＭ１０２４－Ｍ１（２８０ｎｍ吸光係数として１．６６ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用）を１．５３ｍＬ用いて、実施例１０）－１の工程１と同様の方法により、標記抗体－薬物コンジュゲート「ＭｈＭ１０２４－Ｍ１－ＤＸｄ－ＡＤＣ」を得た。
　特性評価：共通操作Ｅ及びＦを使用して、下記の特性値を得た。
　抗体濃度：１．９１ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：１３．３８ｍｇ（８７％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：７．２。
 
１０）－３　ＭＨＴ１２２１－ＰＢＤ－ＡＤＣの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
ｉ）ＥｎｄｏＳ酵素
ｉｉ）ＥｎｄｏＳ（Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ）酵素，糖鎖オキサゾリン
 
上記糖鎖改変抗体のＮ２９７糖鎖は、非還元末端のシアル酸にアジド基を導入したＭＳＧ１型糖鎖（ＷＯ２０１９/０６５９６４号）を示す（図１２）。
 
工程１：（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ＭＨＴ１２２１抗体の調製
　実施例９で調製したＭＨＴ１２２１抗体溶液を、共通操作Ｃ－２に従いリン酸緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）（以下ＰＢ６．０）にバッファー交換し、１９．３ｍｇ／ｍＬ（０．９７０ｍＬ）に調製した。この溶液にＥｎｄｏＳ溶液（ＰＢＳ、７．５２ｍｇ／ｍＬ）を０．０１２４ｍＬ加え、３７℃で２時間インキュベートした。Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　バイオアナライザを用いて糖鎖が切断されたことを確認した後、ＧＳＴ及びＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＡＫＴＡ）で精製した。目的物のフラクションをＰＢ６．０に置換し、（Ｆｕｃａ１，６）ＧｌｕｃＮＡｃ－ＭＨＴ１２２１抗体（２０．０ｍｇ／ｍＬ，０．９２１ｍＬ）を得た。
 
工程２：糖鎖改変ＭＨＴ１２２１抗体の調製
　上記工程１にて得られた（Ｆｕｃａ１，６）ＧｌｕｃＮＡｃ－ＭＨＴ１２２１抗体（ＰＢ６．０）（２０．０ｍｇ／ｍＬ，０．９２１ｍＬ）　に、糖鎖オキサゾリン（３ａＲ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｒ，７ａＲ）－３ａ，６，７，７ａ－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－７－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－２－ｍｅｔｈｙｌ－５Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｄ］ｏｘａｚｏｌ－６－ｙｌ　Ｏ－［Ｎ５－ａｃｅｔｙｌ－Ｎ１－［２－［２－［２－（２－ａｚｉｄｏｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ］ｅｔｈｏｘｙ］ｅｔｈｙｌ］－α－ｎｅｕｒａｍｉｎａｍｉｄｏｓｙｌ］－（２→６）－Ｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→４）－Ｏ－２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→２）－Ｏ－α－Ｄ－ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→３）－Ｏ－［Ｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→４）－Ｏ－２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→２）－α－Ｄ－ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→６）］－β－Ｄ－ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　（ＷＯ２０１９／０６５９６４号　実施例５６、以下［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－Ｏｘ）（図１２）溶液（ＰＢ６．０）（５０．０ｍｇ／ｍＬ，０．０５６１ｍＬ）と、ＧＳＴ－ＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ溶液（ＷＯ２０１７／０１０５５９号）（ＰＢＳ）（５．００ｍｇ／ｍＬ，０．０７３８ｍＬ）を加え、３０℃で３時間インキュベートした。Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　バイオアナライザで糖鎖の転移を確認後、ＧＳＴ及びＣＨＴカラム（ＡＫＴＡ）にて精製した。目的物を含むフラクションを　１０ｍＭ酢酸緩衝溶液，５％ソルビトールｐＨ５．５（以下ＡＢＳ）に置換し、糖鎖改変ＭＨＴ１２２１抗体（１０．６ｍｇ／ｍＬ，１．５０ｍＬ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
ｉｉｉ　）　リンカー２
構造式中の（ｍ，ｎ）が（１，０）及び／又は（０，１）の成分を含む。
 
工程３：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　上記工程２にて得られた糖鎖改変ＭＨＴ１２２１（ＡＢＳ）（１０．６ｍｇ／ｍＬ，０．５００ｍＬ）に、室温にて１，２－プロパンジオール（０．４７９ｍＬ）、リンカー２の１０ｍＭジメチルスルホキシド溶液（０．０２１０ｍＬ；抗体１分子に対して６当量）を加え、チューブローテーター（ＭＴＲ－１０３、アズワン株式会社）を用いて、室温にて４８時間反応させた。
 
精製操作：上記溶液を共通操作Ｄで２回精製し、ＭＨＴ１２２１－ＰＢＤ－ＡＤＣ溶液を２．５０ｍＬ得た。
特性評価：共通操作Ｅ，Ｆを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：１．６２ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４．０６ｍｇ（７７％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：１．９。
 
１０）－４　ＭＨＴ１００８－ＰＢＤ－ＡＤＣの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
ｉ）ＥｎｄｏＳ酵素
ｉｉ）ＥｎｄｏＳ（Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ）酵素，糖鎖オキサゾリン
 
上記糖鎖改変抗体のＮ２９７糖鎖は、非還元末端のシアル酸にアジド基を導入したＭＳＧ１型糖鎖（ＷＯ２０１９/０６５９６４号）を示す（図１２）。
 
工程１：（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ＭＨＴ１００８抗体の調製
　実施例４で調製したＭＨＴ１００８抗体溶液をＰＢ６．０でバッファー交換し、ｃａ．１６．６ｍｇ／ｍＬ（０．８８０ｍＬ）に調製した。上記実施例１０）－３の工程１と同様の操作を行い、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ＭＨＴ１００８抗体溶液（ＰＢ６．０）（１６．８ｍｇ／ｍＬ、０．８００ｍＬ）を得た。
　
工程２：糖鎖改変ＭＨＴ１００８抗体の調製
　上記工程１で得られた１６．８ｍｇ／ｍＬ（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ＭＨＴ１００８抗体溶液（ＰＢ６．０）（０．８００ｍＬ）を用いて、実施例１０）－３の工程２と同様の操作を行うことによって、糖鎖改変ＭＨＴ１００８抗体（ＡＢＳ）（１１．４ｍｇ／ｍＬ，　１．００ｍＬ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
ｉｉｉ　）　リンカー２
構造式中の（ｍ，ｎ）が（１，０）及び／又は（０，１）の成分を含む。
 
工程３：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　上記工程２で得られた糖鎖改変ＭＨＴ１００８抗体（ＡＢＳ）（１１．４ｍｇ／ｍＬ，　０．４５０ｍＬ）を用いて、実施例１０）－３の工程３と同様の操作を行うことによって、ＭＨＴ１００８－ＰＢＤ－ＡＤＣの溶液（ＡＢＳ）を２．５０ｍＬ得た。
特性評価：共通操作Ｅ，Ｆを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：１．５５ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：３．８７ｍｇ（７７％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：１．９。
 
１０）－５　ＭＨＴ１８０８－ＰＢＤ－ＡＤＣの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
ｉ　）　ＥｎｄｏＳ酵素
ｉｉ　）　ＥｎｄｏＳ（Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ）酵素，糖鎖オキサゾリン
 
上記糖鎖改変抗体のＮ２９７糖鎖は、非還元末端のシアル酸にアジド基を導入したＭＳＧ１型糖鎖（ＷＯ２０１９/０６５９６４号）を示す（図１２）。
 
工程１：（Ｆｕｃａ１，６）ＧｌｕｃＮＡｃ－ＭＨＴ１８０８抗体の調製
　実施例９で調製したＭＨＴ１８０８抗体溶液を、ＰＢ６．０でバッファー交換し、ｃａ．１９．１ｍｇ／ｍＬ（１．００ｍＬ）に調製した。上記実施例１０）－３の工程１と同様の操作を行い、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ＭＨＴ１８０８抗体溶液（ＰＢ６．０）（１７．１ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍＬ）を得た。
 
工程２：糖鎖改変ＭＨＴ１８０８抗体の調製
　上記工程１で得られた１７．１ｍｇ／ｍＬ（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ＭＨＴ１００８抗体溶液（ＰＢ６．０）（１．００ｍＬ）を用いて、実施例１０）－３工程２と同様の操作を行うことによって、糖鎖改変ＭＨＴ１８０８抗体（ＰＢＳ７．４）（７．０ｍｇ／ｍＬ，　１．６０ｍＬ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
ｉｉｉ　）　リンカー２
構造式中の（ｍ，ｎ）が（１，０）及び／又は（０，１）の成分を含む。
 
工程３：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　上記工程２で得られた糖鎖改変ＭＨＴ１８０８抗体（ＰＢＳ７．４）（７．００ｍｇ／ｍＬ，　０．４５０ｍＬ）を用いて、実施例１０）－３の工程３と同様の操作を行うことによって、ＭＨＴ１００８－ＰＢＤ－ＡＤＣの溶液（ＡＢＳ）を２．５０ｍＬ得た。
特性評価：共通操作Ｅ，Ｆを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：１．２４ｍｇ／ｍＬ，抗体収量：４．３５ｍｇ（８６％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（ｎ）：１．９。
 
（実施例１１）　異なる親和性を有する抗ＣＤ９８抗体のマスク効果
１１）－１　抗ＣＤ９８抗体の結合親和性評価
　Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００を用い、固定化した抗Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体へ抗ＣＤ９８抗体（ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１又は、Ｈ鎖ＣＤＲ１に点変異を導入したｈＭ２３－Ｍ１（表３、重鎖配列（配列番号３１、図４６）、軽鎖配列（配列番号３２、図４７））をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、ＣＤ９８抗原をアナライトとして測定した。抗Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ、Ｃｙｔｉｖａ社）はＳｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ　ＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ社）へ、キット説明書に従い固定化させた。ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ社）で２μｇ／ｍLに希釈した評価する各抗ＣＤ９８抗体を５μＬ／ｍｉｎで６０秒間接触させて固定化した。その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋で希釈した複数濃度のＣＤ９８抗原をアナライトとして各サンプルを流速３０μＬ／ｍｉｎで９０秒間添加し、２５０秒間乖離を測定するマルチサイクルカイネティクス解析によりＫＤを算出した。図１３（Ａ）に示すように、ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１及びｈＭ２３－Ｍ１の結合親和性（ＫＤ）はそれぞれ０．５８ｎＭ、１０．３ｎＭだった。
１１）－２　抗ＣＤ９８マスク抗体のマスク効果評価
　実施例３と同様の方法でＺＰＺＰ　ｌｉｂ由来のミモトープを同定し、抗ＣＤ９８マスク抗体ＭｈＭ１０１３（表３、配列番号３３、図４８）及び、ｈＭ２３－Ｍ１の重鎖とＭｈＭ１０１３の軽鎖をもつＭｈＭ１０１３－Ｍ１（表３）を調製した。以下に記載する部分を除き、実施例４、実施例６と同様の方法でＭＭＰ１添加条件、非添加条件におけるヒトＣＤ９８抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。プロテアーゼ添加条件では、２μＭの抗体に対して２００ｎＭのＭＭＰ１を添加し、３７℃で反応後、ＭＭＰバッファーで濃度調整した抗体をヒトＣＤ９８抗原の固定されたウェルに添加した。プロテアーゼ非添加条件でも同様に、ＭＭＰバッファーで調製した抗体を各ウェルに添加した。
　図１３（Ｂ）に示すように、ミモトープペプチドを融合したＭｈＭ１０１３及びＭｈＭ１０１３－Ｍ１は、ＭＭＰ１添加条件でＭＭＰ１非添加条件よりも強い結合活性を示した。ＭｈＭ１０１３及びＭｈＭ１０１３－Ｍ１の結合のＥＣ５０比（ＭＭＰ１非添加条件／ＭＭＰ１添加条件）はそれぞれ２３９、５５２だった。
 
（実施例１２）　ＡＤＣ化する抗ＣＤ９８マスク抗体の調製・結合活性評価
　Ｈｉｓクラスターを搭載することで、ｐＨ低下依存的にマスク抗体の殺細胞活性が向上するか検証することを目的に、Ｈｉｓクラスターを搭載していない抗ＣＤ９８マスク抗体ＭｈＭ１０１８―Ｍ１（表３、配列番号３４、図４９）及びＨｉｓクラスターを搭載したＭｈＭ１０２４－Ｍ１（表３、配列番号３５、図５０）を設計した。実施例１）－１と同様の方法で各抗体を調製し、実施例８と同様の方法で中性ｐＨ条件（ｐＨ７．５）、酸性ｐＨ条件（ｐＨ５．５）におけるヒトＣＤ９８抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。
　図１４に示すように、ＭｈＭ１０１８―Ｍ１は両ｐＨ条件で同等の結合活性を示し、ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）はそれぞれ１．７だった。一方で、ＭｈＭ１０２４－Ｍ１は中性ｐＨ条件よりも酸性ｐＨ条件で強い結合を示し、ＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）は１９．２だった。
 
（実施例１３）　ＡＤＣの増殖阻害活性評価
　ＴＲＯＰ２及びＣＤ９８陽性細胞のヒト頭頸部癌株であるＦａＤｕ（ＡＴＣＣ）は、１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＥ－ＭＥＭ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｗａｋｏ：以下、Ｅ－ＭＥＭ培地）で培養した。ＦａＤｕをＥ－ＭＥＭ培地で２．０×１０４Ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるように調整し、９６穴用細胞培養用プレートに１００μＬずつ添加した。細胞添加後、ＦａＤｕは３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。
　翌日、培養プレートからＥ－ＭＥＭ培地を除去し、各ｐＨ（７．４、６．５、６．０、５．５）になるように調整したＥ－ＭＥＭ培地で３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ、０．４ｎＭに希釈した抗ＴＲＯＰ２マスクＰＢＤ－ＡＤＣあるいは抗ＣＤ９８マスクＤＸｄ－ＡＤＣを１００μＬ添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で１時間培養した後、抗体を含む培地を除去し、ｐＨ７．４に調整したＥ－ＭＥＭ培地を１００μＬ添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で６日間培養した。培養後、培養液と等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｉｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で１０分間静置後にプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で発光量を計測した。
生細胞率は次式で算出した。
生細胞率（％）＝ａ÷ｂ×１００
ａ：被験物質添加ウェルの発光量の平均値
ｂ：培地添加ウェルの発光量の平均値
１３）－１　抗ＴＲＯＰ２マスクＰＢＤ－ＡＤＣの殺細胞活性
　図１５－１（Ａ）に示すように、Ｈｉｓクラスターを搭載したＭＨＴ１８０８－ＰＢＤ－ＡＤＣは、ｐＨ低下依存的に強い増殖阻害活性を示し、ＥＣ５０比（ｐＨ７．４／ｐＨ５．５）は１０．７だった。また、Ｈｉｓクラスターを搭載していないＭＨＴ１２２１－ＰＢＤ－ＡＤＣは、いずれの条件でも同等の増殖阻害活性を示し、ＥＣ５０比（ｐＨ７．４／ｐＨ５．５）は１．９だった（図１５－１（Ｂ））。
１３）－２　抗ＣＤ９８マスクＤＸｄ－ＡＤＣの殺細胞活性
　図１５－２（Ｃ）に示すように、Ｈｉｓクラスターを搭載したＭｈＭ１０２４－Ｍ１－ＤＸｄ－ＡＤＣは、ｐＨ低下依存的に強い増殖阻害活性を示し、ＥＣ５０比（ｐＨ７．４／ｐＨ５．５）は１０．９だった。また、Ｈｉｓクラスターを搭載していないＭｈＭ１０１８－Ｍ１－ＤＸｄ－ＡＤＣは、いずれの条件でも同等の増殖阻害活性を示し、ＥＣ５０比（ｐＨ７．４／ｐＨ５．５）は２．８だった（図１５－２（Ｄ））。
 
（実施例１４）　ｐＨ応答性の向上
　ｐＨ応答性の向上を目的に、Ｈｉｓクラスター近傍に正電荷アミノ酸（ＡｒｇまたはＬｙｓ）を配置した抗ＣＤ９８マスク抗体ＭｈＭ１０２６－Ｍ１（表５、配列番号６８、図５７）、ＭｈＭ１０２８－Ｍ１（表５、配列番号６９、図５８）、ＭｈＭ１０４２－Ｍ１（表５、配列番号７０、図５９）、ＭｈＭ１０４３－Ｍ１（表５、配列番号７１、図６０）、ＭｈＭ１０４４－Ｍ１（表５、配列番号７２、図６１）、ＭｈＭ１０４５－Ｍ１（表５、配列番号７３、図６２）、ＭｈＭ１０４６－Ｍ１（表５、配列番号７４、図６３）をそれぞれ設計した。実施例１の１）―１と同様にマスク抗体を調製し、実施例５、６と同様に、中性ｐＨ条件、酸性ｐＨ条件での結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。
　図５６－１（Ａ）に示すように、ｐＨ７．５の条件ではＭｈＭ１０２６－Ｍ１、ＭｈＭ１０２８－Ｍ１、ＭｈＭ１０４２－Ｍ１、ＭｈＭ１０４３－Ｍ１は同様の結合活性を示した。その一方ｐＨ５．５の条件では、ＭｈＭ１０２８－Ｍ１、ＭｈＭ１０４２－Ｍ１、ＭｈＭ１０４３－Ｍ１がＭｈＭ１０２６－Ｍ１よりも強い結合活性を示した（図５６－１（Ｂ））。ＭｈＭ１０２６－Ｍ１の値を１としてＥＣ５０比（中性ｐＨ条件／酸性ｐＨ条件）を比較した結果、Ｈｉｓクラスター近傍にＡｒｇを配置することで、４．０－５．２倍ｐＨ応答性が向上することが示された（表５）。
　同様に、Ｈｉｓクラスター近傍にＬｙｓを配置したＭｈＭ１０４４－Ｍ１、ＭｈＭ１０４５－Ｍ１、ＭｈＭ１０４６－Ｍ１の結合活性をＭｈＭ１０２６－Ｍ１と比較した結果、図５６－２（Ｃ）、（Ｄ）に示すように、ｐＨ条件によらず全てのクローンは同様の結合活性を示した。また、ＭｈＭ１０２６－Ｍ１の値を１としてＥＣ５０比を比較した結果、クローン間で変化が無かった（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　本発明の環境応答性マスク抗体は各種がんの治療等に使用することができる。
配列番号１：抗ＴＲＯＰ２抗体の重鎖アミノ酸配列（図１６）
配列番号２：抗ＴＲＯＰ２抗体の軽鎖アミノ酸配列（図１７）
配列番号３：ＭＨＴ１００１のアミノ酸配列（図１８）
配列番号４：ＭＨＴ１００２のアミノ酸配列（図１９）
配列番号５：ＨＴ１－１１―ｓｃＦｖ－ＨＬのアミノ酸配列（図２０）
配列番号６：ＨＴ１－１１－ｓｃＦｖ－ＬＨのアミノ酸配列（図２１）
配列番号７：ＭＨＴ１００７の重鎖アミノ酸配列（図２２）
配列番号８：ＭＨＴ１００８の重鎖アミノ酸配列（図２３）
配列番号９：ＭＨＴ１００９の重鎖アミノ酸配列（図２４）
配列番号１０：ＭＨＴ１８０３の重鎖アミノ酸配列（図２５）
配列番号１１：ＭＨＴ１８０４の重鎖アミノ酸配列（図２６）
配列番号１２：ＭＨＴ１８０５の重鎖アミノ酸配列（図２７）
配列番号１３：ＭＨＴ１８０６の重鎖アミノ酸配列（図２８）
配列番号１４：ＭＨＴ１８０８の重鎖アミノ酸配列（図２９）
配列番号１５：ＭＨＴ１８０９の重鎖アミノ酸配列（図３０）
配列番号１６：ＨＭＴ１８１０の重鎖アミノ酸配列（図３１）
配列番号１７：ＭＨＴ１８１１の重鎖アミノ酸配列（図３２）
配列番号１８：ＭＨＴ１８１７の重鎖アミノ酸配列（図３３）
配列番号１９：ＭＨＴ１８１８の重鎖アミノ酸配列（図３４）
配列番号２０：ＭＨＴ１８１９の重鎖アミノ酸配列（図３５）
配列番号２１：抗ＣＤ９８抗体ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１の重鎖アミノ酸配列（図３６）
配列番号２２：抗ＣＤ９８抗体ｈＭ２３Ｈ１Ｌ１の軽鎖アミノ酸配列（図３７）
配列番号２３：抗ＥＧＦＲ抗体ｃｅｔｕｘｉｍａｂの重鎖アミノ酸配列（図３８）
配列番号２４：抗ＥＧＦＲ抗体ｃｅｔｕｘｉｍａｂの軽鎖アミノ酸配列（図３９）
配列番号２５：抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体Ｃ３０２２の重鎖アミノ酸配列（図４０）
配列番号２６：抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体Ｃ３０２２の軽鎖アミノ酸配列（図４１）
配列番号２７：ＭｈＭ８００１の軽鎖アミノ酸配列（図４２）
配列番号２８：ＭＣＥ－２１０１の軽鎖アミノ酸配列（図４３）
配列番号２９：ＭＣ３－９００１の重鎖アミノ酸配列（図４４）
配列番号３０：ＭＨＴ１２２１の重鎖アミノ酸配列（図４５）
配列番号３１：ｈＭ２３－Ｍ１の重鎖アミノ酸配列（図４６）
配列番号３２：ｈＭ２３－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図４７）
配列番号３３：ＭｈＭ１０１３の軽鎖アミノ酸配列（図４８）
配列番号３４：ＭｈＭ１０１８－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図４９）
配列番号３５：ＭｈＭ１０２４－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図５０）
配列番号３６：ヒトｕＰＡが認識し、その基質となるアミノ酸配列（図５１）
配列番号３７：ヒトｕＰＡが認識し、その基質となるアミノ酸配列（図５１）
配列番号３８：ヒトｕＰＡが認識し、その基質となるアミノ酸配列（図５１）
配列番号３９：ヒトＭＭＰ１が認識し、その基質となるアミノ酸配列（図５１）
配列番号４０：ヒトＭＭＰ１が認識し、その基質となるアミノ酸配列（図５１）
配列番号４１：ヒトＭＭＰ９が認識し、その基質となるアミノ酸配列（図５１）
配列番号４２：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５２）
配列番号４３：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５２）
配列番号４４：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５２）
配列番号４５：ヒトＧＰＲＣ５Ｄアミノ末端ペプチドのアミノ酸配列（図５３）
配列番号４６：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号４７：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号４８：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号４９：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５０：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５１：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５２：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５３：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５４：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５５：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５６：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５７：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５８：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号５９：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号６０：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号６１：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号６２：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号６３：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号６４：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号６５：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号６６：第２ペプチドのアミノ酸配列（図５４）
配列番号６７：ヒトＣＡＰＮ１が認識し、その基質となるアミノ酸配列（図５５）
配列番号６８：ＭｈＭ１０２６－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図５７）
配列番号６９：ＭｈＭ１０２８－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図５８）
配列番号７０：ＭｈＭ１０４２－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図５９）
配列番号７１：ＭｈＭ１０４３－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図６０）
配列番号７２：ＭｈＭ１０４４－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図６１）
配列番号７３：ＭｈＭ１０４５－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図６２）
配列番号７４：ＭｈＭ１０４６－Ｍ１の軽鎖アミノ酸配列（図６３）
配列番号７５：第２ペプチドのアミノ酸配列（図６４）
配列番号７６：第２ペプチドのアミノ酸配列（図６４）
配列番号７７：第２ペプチドのアミノ酸配列（図６４）
配列番号７８：第２ペプチドのアミノ酸配列（図６４）
配列番号７９：第２ペプチドのアミノ酸配列（図６４）
配列番号８０：第２ペプチドのアミノ酸配列（図６４）
配列番号８１：第２ペプチドのアミノ酸配列（図６４）
 
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (65)

  1. 　下記［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分を含んでなる、標的抗原に結合する分子:
    ［ａ］部分　標的抗原に結合する部分；
    ［ｂ］部分　［ａ］部分に含まれる標的抗原結合部位を認識する第１ペプチド；
    ［ｃ］部分　ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を含むアミノ酸配列からなる第２ペプチド。
  2. 　酸性条件下において、中性条件下と比較して、標的抗原に対しより高い結合親和性を有することを特徴とする、請求項１に記載の分子。
  3. 　［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分をそれぞれ１つ又は２つ以上含む、請求項１又は２に記載の分子。
  4. 　［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分をそれぞれ１つ又は２つ以上含み、［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分のそれぞれの数が互いに同一である、請求項１～３のいずれか１つに記載の分子。
  5. 　［ａ］部分、［ｂ］部分及び［ｃ］部分をそれぞれ２つずつ含む、請求項１又は２に記載の分子。
  6. 　第２ペプチドが、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を４つ以上含み、且つ第２ペプチドのｐＩ値が６．４を超えるアミノ酸配列からなる、請求項１～５のいずれか１つに記載の分子。
  7. 　第２ペプチドが、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を４つ以上含み、且つ第２ペプチドのｐＩ値が６．８以上であるアミノ酸配列からなる、請求項１～６のいずれか１つに記載の分子。
  8. 　第２ペプチドが、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を４つ以上含み、且つ第２ペプチドのｐＩ値が７．２以上であるアミノ酸配列からなる、請求項１～７のいずれか１つに記載の分子。
  9. 　第２ペプチドが、ｐＨ７．５以下の範囲でｐＨが中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を４つ以上含み、且つ第２ペプチドのｐＩ値が７．６以上であるアミノ酸配列からなる、請求項１～８のいずれか１つに記載の分子。
  10. 　第２ペプチドが、ｐＨが酸性条件において負電荷を有するアミノ酸を含まないアミノ酸配列からなる、請求項１～９のいずれか１つに記載の分子。
  11. 　第２ペプチドが、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含まないアミノ酸配列からなる、請求項１～１０のいずれか１つに記載の分子。
  12. 　第２ペプチドが、以下の（１）及び（２）の構造を有するアミノ酸配列からなる、請求項１～１１のいずれか１つに記載の分子：
    （１）（ａ）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列、又は（ｂ）(a)のアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニン若しくはリシンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列（（ａ）のアミノ酸配列及び（ｂ）のアミノ酸配列を塩基性アミノ酸クラスターという。）を１つ以上含み、且つ、
    （２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含む。
  13. 　第２ペプチドが、以下の（１）及び（２）の構造を有するアミノ酸配列からなる、請求項１～１２のいずれか１つに記載の分子：
    （１）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を１つ以上含み、且つ、
    （２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含む。
  14. 　第２ペプチドが、以下の（１）及び（２）の構造を有するアミノ酸配列からなる、請求項１～１３のいずれか１つに記載の分子：
    （１）２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸からなるアミノ酸配列の任意の位置（アミノ末端又はカルボキシル末端を含む）に１つのアルギニンが挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を１つ含み、且つ、
    （２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含む。
  15. 　第２ペプチドが、以下の（１）及び（２）の構造を有するアミノ酸配列からなる、請求項１～１４のいずれか１つに記載の分子：
    （１）ＲＨＨＨで表されるアミノ酸配列を１つ含み、且つ、
    （２）前記のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含む。
  16. 　第２ペプチドが、２つ以上の連続するｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を１つ以上含み、且つ該ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を計４つ以上含むアミノ酸配列からなる、請求項１～１２のいずれか１つに記載の分子。
  17. 　第２ペプチドが、ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を１つ置きに有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列で表される構造からなる、請求項１～１１のいずれか１つに記載の分子。
  18. 　塩基性官能基のｐＫａが５．０～７．０である、請求項１２～１７のいずれか１つに記載の分子。
  19. 　塩基性官能基のｐＫａが５．５～６．５である、請求項１２～１８のいずれか１つに記載の分子。
  20. 　ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸が天然アミノ酸である、請求項１２～１９のいずれか１つに記載の分子。
  21. 　ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸が非天然アミノ酸である、請求項１２～１９のいずれか１つに記載の分子。
  22. 　ｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸がヒスチジンである、請求項１２～２０のいずれか１つに記載の分子。
  23. 　第２ペプチドが塩基性アミノ酸クラスターを１～４個含むアミノ酸配列からなる、請求項１～２２のいずれか１つに記載の分子。
  24. 　第２ペプチドが１０～６０個のアミノ酸からなる、請求項１～２３のいずれか１つに記載の分子。
  25. 　第２ペプチドが１２～５０個のアミノ酸からなる、請求項１～２４のいずれか１つに記載の分子。
  26. 　第２ペプチドが１５～４０個のアミノ酸からなる、請求項１～２５のいずれか１つに記載の分子。
  27. 　第２ペプチドが２０～３５個のアミノ酸からなる、請求項１～２６のいずれか１つに記載の分子。
  28. 　第２ペプチドが配列番号４９乃至５３、５５、５９乃至６１、６５、６６、７５乃至８１（図５４及び６４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１６及び１８～２７のいずれか１つに記載の分子。
  29. 　第２ペプチドが配列番号５４（図５４）で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１７～２７のいずれか１つに記載の分子。
  30. 　ＥＣ５０比が３以上である請求項１～２９のいずれか１つに記載の分子。
  31. 　ＥＣ５０比が１０以上である請求項１～３０のいずれか１つに記載の分子。
  32. 　ＥＣ５０比が３０以上である請求項１～３１のいずれか１つに記載の分子。
  33. 　第２ペプチドが１０個以下のｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸を含むアミノ酸配列からなる、請求項１～３２のいずれか１つに記載の分子。
  34. 　第２ペプチドのアミノ酸配列に２つ以上の塩基性アミノ酸クラスターが含まれ、１つの塩基性アミノ酸クラスターが該アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシル末端に位置し、且つ他のいずれの塩基性アミノ酸クラスターも該アミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシル末端に位置しない、請求項１～３３のいずれか１つに記載の分子。
  35. 　第２ペプチドのアミノ酸配列に２つ以上の塩基性アミノ酸クラスターが含まれ、１つの塩基性アミノ酸クラスターが該アミノ酸配列のアミノ末端に位置し、且つ他の１つの塩基性アミノ酸クラスターがカルボキシル末端に位置する、請求項１～３３のいずれか１つに記載の分子。
  36. 　第２ペプチドのアミノ酸配列に含まれるいずれの塩基性アミノ酸クラスターも、該アミノ酸配列のアミノ末端に位置せず且つカルボキシル末端に位置しない、請求項１～３３のいずれか１つに記載の分子。
  37. 　第２ペプチドのアミノ酸配列に細胞内及び／又は細胞外のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列及び塩基性アミノ酸クラスターを含むアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、
    （１）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、塩基性アミノ酸クラスターを含むアミノ酸配列、細胞内及び／又は細胞外のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列の順に連結してなる、又は
    （２）カルボキシル末端からアミノ末端に向かって、細胞内及び／又は細胞外のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列、塩基性アミノ酸クラスターを含むアミノ酸配列の順に連結してなる、
    請求項１～３４又は３６のいずれか１つに記載の分子。
  38. 　第２ペプチドのアミノ酸配列に含まれるｐＫａが７以下の塩基性官能基を側鎖に有するアミノ酸数が、該アミノ酸配列に含まれる全アミノ酸数の５％以上、３０％以下である、請求項１２～３７のいずれか１つに記載の分子。
  39. 　第１ペプチド、第２ペプチド、標的抗原に結合する部分の順に連結してなる、請求項１～３８のいずれか１つに記載の分子。
  40. 　標的抗原に結合する部分が、第１ペプチド及び第２ペプチドには含まれないアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１～３９のいずれか１つに記載の分子。
  41. 　ポリペプチドからなる、請求項１～４０のいずれか１つに記載の分子。
  42. 　アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、第１ペプチド、第２ペプチド、標的抗原に結合する部分に結合してなる、請求項４１に記載の分子。
  43. 　第１ペプチド、第２ペプチド及び標的抗原に結合する部分からなる群より選択されるいずれか１つが、他の２つのうち１つ又は両方とリンカー又はスペーサーを介して結合している、請求項１～４２のいずれか１つに記載の分子。
  44. 　酸性条件がｐＨ６．５以下である、請求項１～４３のいずれか１つに記載の分子。
  45. 　酸性条件がｐＨ６．０以下である、請求項１～４４のいずれか１つに記載の分子。
  46. 　酸性条件がｐＨ５．５以下である、請求項１～４５のいずれか１つに記載の分子。
  47. 　標的抗原が腫瘍組織、エンドソーム又はリソソームに存在する抗原である、請求項１～４６のいずれか１つに記載の分子。
  48. 　標的抗原に結合する部分に、他の部分である［ｄ］部分が結合してなり、［ｄ］部分が第１ペプチド及び第２ペプチドを含まない、請求項１～４７のいずれか１つに記載の分子。
  49. 　［ｄ］部分が、標的抗原に結合する部分ではない抗体若しくはその抗原結合断片、第１ペプチド及び第２ペプチドに含まれないアミノ酸配列を含むペプチド、サイトカイン、毒素、放射性同位元素、標識分子、光感受性物質、免疫賦活化物質、抗腫瘍性化合物、薬物、ペイロード並びにポリマーからなる群より選択される１つ又は２つ以上である、請求項４８に記載の分子。
  50. 　抗腫瘍性化合物が、カンプトテシン誘導体又はｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ誘導体であり、好適には、カンプトテシン誘導体がＮ－［（１Ｓ，９Ｓ）－９－Ｅｔｈｙｌ－５－ｆｌｕｏｒｏ－９－ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌ－１０，１３－ｄｉｏｘｏ－２，３，９，１０，１３，１５－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，１２Ｈ－ｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ｐｙｒａｎｏ［３'，４'：６，７］ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｏ［１，２－ｂ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔａｍｉｄｅである、請求項４９に記載の分子。
  51. 　免疫賦活化物質が環状ジヌクレオチド誘導体である請求項４９に記載の分子。
  52. 　ポリペプチドからなるか、又は［ｄ］部分及びポリペプチドからなる、請求項４８～５１のいずれか１つに記載の分子。
  53. 　第１ペプチドが、下記工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む方法により得られる、請求項１～５２のいずれか１つに記載の分子：
    （ｉ）芳香族性アミノ酸とＰｒｏの繰返し配列を含むペプチドライブラリーを請求項１記載の標的抗原に結合する部分に接触させる工程；
    （ｉｉ）該標的抗原に結合する部分に結合するペプチドを回収する工程；及び
    （ｉｉｉ）得られたペプチドを組換え、化学合成又はペプチド合成により調製する工程。
  54. 　第１ペプチドに含まれるアミノ酸配列及び／又は第２ペプチドに含まれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドを組換え、インビトロ翻訳、化学合成又はペプチド合成により調製する工程を含む、請求項１～５２のいずれか１つに記載の分子の製造方法。
  55. 　請求項５４に記載の方法により得られる、標的抗原に結合する分子。
  56. 　下記（ｉｖ）記載の工程を含む、請求項４１、４２又は５２のいずれか１つに記載の分子の製造方法。
    （ｉｖ）標的抗原に結合する部分に含まれるアミノ酸配列、並びに、任意で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）、第１ペプチドに含まれるアミノ酸配列、及び／又は、第２ペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを細胞に導入し、該細胞を培養し、該培養物から該標的抗原に結合するポリペプチドを回収する工程。
  57. 　請求項５６に記載の方法により得られる、標的抗原に結合する分子。
  58. 　請求項１～５３、５５及び５７のいずれか１つに記載の分子、その塩又はそれらの水和物を含む、医薬組成物。
  59. 　抗がん剤である、請求項５８に記載の医薬組成物。
  60. 　標的抗原に結合する分子の中性ｐＨ条件における抗原結合活性を酸性ｐＨ条件における抗原結合活性より弱くすることにより、第２ペプチドがｐＨ７．５以下の範囲でｐＨの中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を含まない分子と比較して、被投与者に対する標的抗原に結合する分子の毒性が低減されている請求項５８又は５９に記載の医薬組成物。
  61. 　標的抗原に結合する分子の中性ｐＨ条件における抗原結合活性を酸性ｐＨ条件における抗原結合活性より弱くすることにより、第２ペプチドがｐＨ７．５以下の範囲でｐＨの中性条件から酸性条件に変化することに応じて電荷が無電荷から正電荷に変化するアミノ酸を含まない分子と比較して、被投与者に対する標的抗原に結合する分子の血中濃度が向上されている請求項５８又は５９に記載の医薬組成物。
  62. 　請求項１～５３、５５及び５７のいずれか１つに記載の分子又は請求項５８に記載の医薬組成物を含む検査薬、診断薬又は試薬。
  63. 　請求項４１又は５２に記載の分子のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  64. 　請求項６３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  65. 　請求項６３に記載のポリヌクレオチド若しくは請求項６４に記載のベクターを含むか又は請求項４１又は５２に記載の分子を産生する細胞。
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