CN114729035B - 抗cea抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

一种抗CEA抗体‑依喜替康类似物偶联物及其医药用途。具体而言，如通式(Pc‑L‑Y‑D)所示的抗CEA抗体‑依喜替康类似物偶联物，其中Pc为抗CEA抗体或其抗原结合片段，L为接头单元；Y选自‑O‑(CRaRb)m‑CR1R2‑C(O)‑、‑O‑CR1R2‑(CRaRb)m‑、‑O‑CR1R2‑、‑NH‑(CRaRb)m‑CR1R2‑C(O)‑和‑S‑(CRaRb)m‑CR1R2‑C(O)；n为1至10，n是小数或整数。

Description

抗CEA抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途
本申请要求2019年12月16日提交的中国专利申请(申请号CN 201911294912.3)的优先权。
技术领域
本公开涉及抗CEA抗体-依喜替康类似物偶联物，其制备方法，包含其的药物组合物，以及其用于制备治疗CEA介导的疾病或病症的药物中的用途；尤其在用于制备抗癌药物中的用途。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM-5或CD66e)是最早被人们发现的肿瘤相关抗原之一，它是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白，CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域(Thompson J.A.，J Clin LabAnal.5：344-366，1991)。CEA最初由Gold P和Freedman SO在结肠癌组织提取物中发现并报道(Gold and Freedman 1965；Gold and Freedman，1965)，随后报道了利用敏感的放射性免疫分析的方法在结肠癌病人和其他肿瘤病人的血清中检测到CEA，而在健康人或其他疾病患者血清中CEA的含量极低(Thomson，Krupey et al.，1969)。CEA在癌细胞中表达升高，升高的CEA促进细胞间粘着，进而促进细胞的转移(Marshall J.，Semin Oncol.，30(增刊8)：30-6，2003)。CEA常见表达在上皮组织，包括胃肠、呼吸、和泌尿生殖道的细胞，及结肠、宫颈、汗腺、和前列腺的细胞(Nap等，Tumour Biol.，9(2-3)：145-53，1988；Nap等，CancerRes.，52(8)：2329-23339，1992)。
抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)将单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和细胞毒性物质的高效性，同时又避免了前者疗效偏低和后者毒副作用过大等缺陷。这也就意味着，与以往传统的化疗药物相比，抗体-药物偶联物能更精准地结合肿瘤细胞并降低将对正常细胞的影响。
目前已有靶向CEA的抗体及ADC药物的专利报道，如WO2015069430。但是，目前仍需要开发更有效且更具安全性的抗CEA抗体-药物偶联物，以更好地用于CEA相关肿瘤的治疗。
发明内容
本公开涉及抗CEA抗体-药物偶联物及其医药用途，包含任选通过接头偶联至毒素药物的抗CEA抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：
i)所述重链可变区的HCDR1和HCDR3与如SEQ ID NO：7序列所示的重链可变区的HCDR1和HCDR3相同，所述重链可变区的HCDR2与如SEQ ID NO：7序列所示的重链可变区的HCDR2相同或与其具有一个氨基酸差异；所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3与如SEQID NO：8序列所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3相同；
ii)所述重链可变区的HCDR1和HCDR3与如SEQ ID NO：9序列所示的重链可变区的HCDR1和HCDR3相同，所述重链可变区的HCDR2与如SEQ ID NO：9序列所示的重链可变区的HCDR2相同或与其具有一个氨基酸差异；所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3与如SEQID NO：10序列所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3相同；
iii)所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3与如SEQ ID NO：11序列所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3相同；所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3与如SEQ IDNO：12序列所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3相同；或
iv)所述重链可变区的HCDR1和HCDR3与如SEQ ID NO：13序列所示的重链可变区的HCDR1和HCDR3相同，所述重链可变区的HCDR2与如SEQ ID NO：13序列所示的重链可变区的HCDR2相同或与其具有一个氨基酸差异；所述轻链可变区的LCDR1和LCDR3与如SEQ ID NO：14序列所示的轻链可变区的LCDR1和LCDR3相同，所述轻链可变区的LCDR2与如SEQ ID NO：14序列所示的轻链可变区的LCDR2相同或与其具有一个氨基酸差异。
本公开的一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
v)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：15、SEQID NO：38和SEQ ID NO：17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
vi)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQID NO：26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：21、SEQID NO：47和SEQ ID NO：23所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
vii)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQID NO：32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
viii)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的HCDR1和HCDR3，和如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：38所示的HCDR2；所述轻链可变区包含分别如SEQID NO：35和SEQ ID NO：37所示的LCDR1和LCDR3，和如SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：64所示的LCDR2。
在一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
在一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ IDNO：37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ IDNO：37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：64和SEQ IDNO：37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
或
优选地，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本公开的一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
本公开的一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物，如前任一项所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，或与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列有至少90％同一性；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，或与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列有至少90％同一性；或
(b)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，或与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列有至少90％同一性；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，或与SEQ ID NO：1O所示的氨基酸序列有至少90％同一性；或
(c)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，或与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列有至少90％同一性；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，或与SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列有至少90％同一性；或
(d)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，或与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列有至少90％同一性；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，或与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列有至少90％同一性。
本公开的一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(e)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：39、40、41或42所示，或与SEQ IDNO：39、40、41或42所示的任意一条氨基酸序列有至少90％同一性；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：43、44、45或46所示，或与SEQ ID NO：43、44、45或46所示的任意一条氨基酸序列有至少90％同一性；
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示；和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示；或
(f)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：48、49、50、51或52所示，或与SEQID NO：48、49、50、51或52所示的任意一条氨基酸序列有至少90％同一性；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：53、54或55所示，或与SEQ ID NO：53、54或55所示的任意一条氨基酸序列有至少90％同一性；
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：52所示；和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：53所示；或
(g)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：56、57或58所示，或与SEQ ID NO：56、57或58所示的任意一条氨基酸序列有至少90％同一性；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：59、60、61、62或63所示，或与SEQ ID NO：59、60、61、62或63所示的任意一条氨基酸序列有至少90％同一性；
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示；和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：62所示；或
(h)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：65、66、67或68所示，或与SEQ IDNO：65、66、67或68所示的任意一条氨基酸序列有至少90％同一性；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：69、70、71、72、73、74、75或76所示，或与SEQ ID NO：69、70、71、72、73、74、75或76所示的任意一条氨基酸序列有至少90％同一性；
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示；和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：76所示。
本公开的一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物，如前任一项所述抗CEA抗体为人源化抗体，所述人源化抗体包含来源自人抗体的框架区或其框架区变体，所述框架区变体为在人抗体的轻链框架区和/或重链框架区上分别具有至多10个氨基酸的回复突变；
优选地，所述框架区变体选自以下(i)至(1)中任一项所述：
(i)包含序列分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区的框架区中包含选自46P、47W、49Y、70S和71Y中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或包含序列如SEQ ID NO：15所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：38所示的HCDR2、和序列如SEQ ID NO：17所示的HCDR3的重链可变区的框架区中包含选自38K或46K中的一个或更多个氨基酸回复突变；
(j)包含序列分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区的框架区中包含选自2V、42G、44V和71Y中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或包含序列如SEQ ID NO：21所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：47所示的HCDR2、和序列如SEQ ID NO：23所示的HCDR3的重链可变区的框架区中包含选自48I、66K、67A、69L、71V、73K、82F、82A R中的一个或更多个氨基酸回复突变；
(k)包含序列分别如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区的框架区中包含选自3V、43P和58V中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或包含序列分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区的框架区中包含选自38K、66K、71V中的一个或更多个氨基酸回复突变；和(1)包含序列如SEQ ID NO：35所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：64所示的LCDR2、和序列如SEQ ID NO：37所示的LCDR3的轻链可变区的框架区中包含选自4V、36Y、43P、47V、49E、70D和87I中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或包含序列如SEQID NO：33所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：38所示的HCDR2、和序列如SEQID NO：34所示的HCDR3的重链可变区的框架区中包含选自2I、38K和46K中的一个或更多个氨基酸回复突变；
(m)包含序列分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区的框架区中包含选自2V、42G、44V和71Y中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或包含序列如SEQ ID NO：21所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：47所示的HCDR2、和序列如SEQ ID NO：23所示的HCDR3的重链可变区的框架区中包含选自66K、67A、69L、71V、73K、82F、82A R中的一个或更多个氨基酸回复突变；
其中，所述突变的回复位点根据Kabat编号规则编号。
本公开的一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物，如前任一项所述抗CEA抗体为人源化抗体，所述人源化抗体包含来源自人抗体的框架区或其框架区变体，所述框架区变体为在人抗体的轻链框架区和/或重链框架区上分别具有至多10个氨基酸的回复突变；
优选地，所述框架区变体选自以下(i)至(1)中任一项所述：
(i)包含序列分别如SEQ ID NO：18所示的LCDR1、SEQ ID NO：19所示的LCDR2和SEQID NO：20所示的LCDR3的轻链可变区的框架区中包含选自46P、47W、49Y、70S和71Y中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或
包含序列如SEQ ID NO：15所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：38所示的HCDR2、和序列如SEQ ID NO：17所示的HCDR3的重链可变区的框架区中包含选自38K或46K中的一个或更多个氨基酸回复突变；
(j)包含序列分别如SEQ ID NO：24所示的LCDR1、SEQ ID NO：25所示的LCDR2和SEQID NO：26所示的LCDR3的轻链可变区的框架区中包含选自2V、42G、44V和71Y中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或
包含序列如SEQ ID NO：21所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：47所示的HCDR2、和序列如SEQ ID NO：23所示的HCDR3的重链可变区的框架区中包含选自48I、66K、67A、69L、71V、73K、82F、82A R中的一个或更多个氨基酸回复突变；
(k)包含序列分别如SEQ ID NO：30所示的LCDR1、SEQ ID NO：31所示的LCDR2和SEQID NO：32所示的LCDR3的轻链可变区的框架区中包含选自3V、43P和58V中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或
包含序列分别如SEQ ID NO：27所示的HCDR1、SEQ ID NO：28所示的HCDR2和SEQ IDNO：29所示的HCDR3的重链可变区的框架区中包含选自38K、66K、71V中的一个或更多个氨基酸回复突变；和
(1)包含序列如SEQ ID NO：35所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：64所示的LCDR2、和序列如SEQ ID NO：37所示的LCDR3的轻链可变区的且框架区中包含选自4V、36Y、43P、47V、49E、70D和87I中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或
包含序列如SEQ ID NO：33所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：38所示的HCDR2、和序列如SEQ ID NO：34所示的HCDR3的重链可变区的框架区中包含选自2I、38K和46K中的一个或更多个氨基酸回复突变；
其中，所述回复突变的位点根据Kabat编号规则编号。
本公开的一些实施方案中，所述的抗体药物偶联物，如前任一项所述抗CEA抗体或其抗原结合片段，包含抗体重链恒定区和轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区；更优选地，所述抗体包含序列如SEQ ID NO：77所示的重链恒定区，和序列如SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：79所示的轻链恒定区；
最优选地，本公开中使用的抗CEA抗体包含：
(m)序列如SEQ ID NO：80所示或与其具有至少85％同一性的重链，和/或序列如SEQ ID NO：81所示或与其具有至少85％同一性的轻链；
(n)序列如SEQ ID NO：82所示或与其具有至少85％同一性的重链，和/或序列如SEQ ID NO：83所示或与其具有至少85％同一性的轻链；
(o)序列如SEQ ID NO：84所示或与其具有至少85％同一性的重链，和/或序列如SEQ ID NO：85所示或与其具有至少85％同一性的轻链；或
(p)序列如SEQ ID NO：86所示或与其具有至少85％同一性的重链，和/或序列如SEQ ID NO：87所示或与其具有至少85％同一性的轻链。
在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)和二硫键稳定化的V区(dsFv)。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其为通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体药物偶联物：
其中：
Y选自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-和-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；
Ra和Rb相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟烷基、环烷基和杂环基；或者，Ra和Rb与其相连接的碳原子一起形成环烷基和杂环基；
R1选自卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基和杂芳基；或者，R1和R2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
或者，Ra和R2与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
m为0至4的整数；
n为1至10，n是小数或整数；
L为接头单元；
Pc为如前所述的CEA抗体或其抗原结合片段。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其中n为0至10之间的整数或小数，n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的均值，优选为1至8，更优选为2至8，最优选为4至6，n是小数或整数的均值。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其中n为3-5的小数或整数的均值。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其中n为6-7的小数或整数的均值。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物如通式(Pc-L-Y-D)所示，其中：
Y为-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；
Ra和Rb相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素和烷基；
R1为卤代烷基或C3-6环烷基；
R2选自氢原子、卤代烷基和C3-6环烷基；
或者，R1和R2与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；
m为0或1。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其中Y选自：
其中Y的O端与接头单元L相连。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其中Y为：其中Y的O端与接头单元L相连。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述抗体药物偶联物选自：
其中：
L为接头单元；
Pc为抗CEA抗体或其抗原结合片段；
n为1至10，n是小数或整数。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述抗体药物偶联物选自：
其中：
L为接头单元；
Pc为抗CEA抗体或其抗原结合片段；
n为1至10，n是小数或整数。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其中接头单元-L-为-L1-L2-L3-L4-，
L1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH2-C(O)-NR3-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C1-8烷基、C1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
L2选自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化学键，其中p1为1至20的整数；
L3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，其中所述的氨基酸选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基，并任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；
L4选自-NR5(CR6R7)t-、-C(O)NR5、-C(O)NR5(CH2)t-和化学键，其中t为1至6的整数；
R3、R4和R5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
R6和R7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
在一些实施方案中，L1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH2-C(O)-NR3-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C1-8烷基、C1-8烷基-C3-6环烷基或1至8个链原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C1-8烷基、C1-8烷基-C3-6环烷基或1至8个链原子的直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代。
在一些实施方案中，L2选自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化学键，其中p1为1至20的整数。
在一些实施方案中，L3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，其中所述的氨基酸选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基，并任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代。
在一些实施方案中，L4选自-NR5(CR6R7)t-、-C(O)NR5-、-C(O)NR5(CH2)t-或化学键，其中t为1至6的整数。
在一些实施方案中，R3、R4和R5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
在一些实施方案中，R6和R7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其中接头单元-L-为-L1-L2-L3-L4-，
L1为s1为2至8的整数；
L2为化学键；
L3为四肽残基；优选的，L3为甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFG，SEQ ID No：92)的四肽残基；
L4为-NR5(CR6R7)t-，R5、R6或R7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2；
其中所述的L1端与Pc相连，L4端与Y相连。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物如通式(Pc-L-Y-D)所示或如通式Pc-L-D所示，其中-L-为：
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物如通式(Pc-L-Y-D)所示或如通式Pc-L-D所示，其中-L-Y-任选自：
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其为通式(Pc-La-Y-D)所示的抗体药物偶联物：
其中：
W、L2、L3、R5、R6、R7如接头单元L中所定义；
Pc、n、R1、R2、m如通式(Pc-L-Y-D)中所定义。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的抗体药物偶联物，其为通式(Pc-Lb-Y-D)所示的抗体药物偶联物：
其中：
s1为2至8的整数；
Pc、R1、R2、R5～R7、m和n如通式(Pc-La-Y-D)中所定义。
本公开的一些实施方案中，如前任一项所述抗体药物偶联物选自：
其中Pc和n如通式(Pc-L-Y-D)中所定义。
本公开的一些实施方案中，所述抗体药物偶联物选自：
Hu63-13-2-A
Hu47-14-2-A
或
Hu67-14-2-A
Hu103-32-2-A
其中，n如通式(Pc-L-Y-D)中所定义；
所述抗体如下：
Hu63-13包含序列如SEQ ID NO：80所示的重链，和序列如SEQ ID NO：81所示的轻链；
Hu47-14包含序列如SEQ ID NO：82所示的重链，和序列如SEQ ID NO：83所示的轻链；
Hu67-14包含序列如SEQ ID NO：84所示的重链，和序列如SEQ ID NO：85所示的轻链；
Hu103-32包含序列如SEQ ID NO：86所示的重链，和序列如SEQ ID NO：87所示的轻链。
可选的，其中n可以为0至10的非零整数或小数，优选为1-10之间的整数或小数；更优选为2至8，可以为整数，也可以为小数；最优选为3至8，可以为整数，也可以为小数；可选的，n为3至5的小数或整数；可选的，n为6至7的小数或整数。
本公开进一步提供一种制备如通式(Pc-La-Y-D)所示的抗体药物偶联物的方法，其包括以下步骤：
Pc还原后，与通式(La-Y-D)偶联反应，得到通式(Pc-La-Y-D)所示的化合物；其中：
Pc为抗CEA抗体或其抗原结合片段；
W、L2、L3、R1、R2、R5～R7、m和n如通式(Pc-La-Y-D)中所定义。
本公开进一步提供一种制备如通式(Pc-L‘-D)所示的抗体药物偶联物的方法，其包括以下步骤：
Pc还原后，与通式(L’-D)偶联反应，得到化合物；其中：
Pc为如前所述的抗CEA抗体或其抗原结合片段；
n如通式(Pc-L-Y-D)中所定义。
另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含如前任一项所述的抗体-药物偶联物，以及一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
另一方面，本公开提供如前任一项所述的抗体药物偶联物或包含其的药物组合物作为药物的用途。
另一方面，本公开提供如前任一项所述的抗体-药物偶联物或包含其的药物组合物在制备用于治疗CEA介导的疾病或病症的药物中的用途。其中所述CEA介导的疾病或病症为CEA高表达癌症。或者，其中所述CEA介导的疾病或病症为CEA中表达癌症。
另一方面，本公开提供如前任一项所述的抗体药物偶联物或包含其的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途；其中所述癌症优肿瘤和癌症优选头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、库肯勃氏瘤、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；更优选的，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。
另一方面，本公开进一步涉及一种用于治疗和/或预防肿瘤的方法，该方法包括向需要其的患者施用治疗有效剂量的如前任一项所述的抗体药物偶联物或包含其的药物组合物；优选其中所述的肿瘤为与CEA高表达相关的癌症。
另一方面，本公开进一步涉及一种用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括向需要其的患者施用治疗有效剂量的如前任一项所述的抗体药物偶联物或包含其的药物组合物；其中所述肿瘤和癌症优选头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、库肯勃氏瘤、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；更优选的，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。
可将活性化合物(例如根据本公开所述的配体-药物偶联物、或其药学上可接受的盐)制成适合于通过任何适当途径给药的形式，活性化合物优选是以单位剂量的方式，或者是以受试者能够以单剂进行自我给药的方式。本公开的单位剂量的方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。
本公开治疗方法中所用活性化合物或组合物的施用剂量通常将随疾病的严重性、受试者的体重和活性化合物的功效而改变。不过，作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1～1000mg。
本公开的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1至99重量％的活性化合物。
本公开提供的CEA抗体及抗体药物偶联物具有与细胞表面抗原良好的亲和力，良好的细胞内吞效率和很强的肿瘤抑制效率，并且具有更宽的药物应用窗口，适于临床的药物应用。
附图说明
图1：人源化抗体在细胞水平与人CEA的结合FACS检测结果。
图2：ADC分子的旁观者效应细胞毒性；数据结果显示所有ADC分子都具有很强的旁观者效应细胞毒性，MKN45和HCT116共培养时，ADC分子能抑制两种细胞的增殖，而单独培养HCT116时，偶联2-A的ADC分子对细胞基本没有毒性。
图3：在LS174T移植瘤模型中，ADC分子对肿瘤体积的影响；数据结果显示，与对照组PBS相比，所有ADC分子都具有抑制肿瘤体积增大的效果，3mpk组的抑瘤效果强于1mpk组；3mpk组中抑瘤效果最好的为Hu63-13-2-A，其次为Hu47-14-2-A，再次为Hu67-14-2-A，最差的为Lmab-CL2A-SN38。
图4：在LS174T移植瘤模型中，ADC分子对肿瘤重量的影响；数据结果显示，与对照组PBS相比，所有ADC分子在低剂量和高剂量下都具有抑制肿瘤重量增加的效果。3mpk组中抑瘤效果最好的为Hu63-13-2-A，其次为Hu47-14-2-A，再次为Hu67-14-2-A，最差的为Lmab-CL2A-SN38。
图5：在MKN45移植瘤模型中，ADC分子对肿瘤体积的影响；数据结果显示，与对照组PBS相比，所有ADC分子都具有抑制肿瘤体积增大的效果，3mpk组的抑瘤效果强于1mpk组；3mpk组中抑瘤效果最好的为Hu67-14-2-A，其次为Hu103-32-2-A，再次为Hu63-13-2-A，最差的为Lmab-CL2A-SN38。
图6：在MKN45移植瘤模型中，ADC分子对肿瘤重量的影响；数据结果显示，与对照组PBS相比，所有ADC分子在低剂量和高剂量下都具有抑制肿瘤重量增加的效果。3mpk组中抑瘤效果最好的为Hu67-14-2-A，其次为Hu103-32-2-A，再次为Hu63-13-2-A，最差的为Lmab-CL2A-SN38。
具体实施方式
一、术语
除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本公开所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本公开时，依据以下定义使用下列术语。
当本公开中使用商品名时，旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的非专利药和活性药物部分。
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“药物”是指可以改变或查明机体的生理功能及病理状态，可用以预防，诊断和治疗疾病的化学物质。药物包括细胞毒性药物。药物和毒物之间并无严格界限，毒物是指在较小剂量即对机体产生毒害作用，损害人体健康的化学物质，任何药物剂量过大都可产生毒性反应。
细胞毒性药物，即抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。细胞毒性药物包括毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，毒素药物，化疗药物，抗生素和核溶酶。
术语“接头单元”、“接头”或“连接片段”是指一端与配体连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。
接头可以包含一种或多种接头构件。示例性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”，在本文中也称作“MCC”)和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。接头可以包括延伸物、间隔物和氨基酸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如US2005-0238649A1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
缩写
接头组件包括但不限于：
MC＝6-马来酰亚氨基己酰基，结构如下：
Val-Cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的例示二肽)，
瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸，
PAB＝对氨基苄氧羰基(“自我牺牲”接头组件的例示)，
Me-Val-Cit＝N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶B的切割)，
MC(PEG)6-OH＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可附着于抗体半胱氨酸)，
SPP＝N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯，
SPDP＝N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，
SMCC＝琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，
IT＝亚氨基硫烷。
术语“抗体药物偶联物”指抗体通过稳定的连接单元与具有生物活性的药物相连。在本公开中“抗体药物偶联物”或抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)，指将单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的连接单元与具有生物活性的毒性药物相连。抗体可直接地或经接头地偶联至药物。每个抗体的平均药物模块数(平均药物载荷或载药量，可用n值表示)，其范围可以是例如每个抗体偶联约0到约20个药物模块，在某些实施方案中是每个抗体偶联1个到约10个药物模块，在某些实施方案中是每个抗体偶联1个到约8个药物模块。
术语“平均药物载荷”或“载药量”是指式(I)分子中每个配体上加载的细胞毒性药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值，药物载量的范围可以是每个配体(Pc)连接0-12个，优选1-10个细胞毒性药物)。在本公开的实施方案中，载药量表示为n，也可称为DAR(Drug-antibody Ratio)值，示例性的为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的均值。可用常规方法如UV/可见光光谱法、质谱、ELISA试验和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分子的药物品均数量。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条重链和两条轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。根据免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
全长抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
术语“完全人源抗体”、“完全人抗体”或“全人抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。
术语“抗原结合片段”是指抗体的保持结合抗原的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。“抗原结合片段”中包含的结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段，示例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
通常，Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(例如，切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的部分和L链通过二硫键结合在一起。
通常，F(ab′)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中二硫键的下方部分而获得的，分子量约为100,000，并具有抗原结合活性，并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
通常，Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。
此外，可以通过将编码Fab′片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或VH)和抗体轻链可变结构域(或VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alffhan等人(1995)，Protein Eng 8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteinsof immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义只应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3，以及重链可变结构域的CDR2和CDR3。还包括“Chothia”编号规则、“ABM”编号规则、“contact”编号规则(参见Martin，ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc M.P.，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。
术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗体结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本公开的抗体(或抗原结合片段)以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M或10-9M的解离平衡常数(KD)结合CEA，(或其表位)例如，在本公开中抗体与细胞表面抗原的亲和力采用FACS法测定KD值。
当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CEA抗原或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本文实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
术语“核酸分子”是指DNA分子或RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
氨基酸序列“同一性”指比对氨基酸序列过程中，在必要时引入间隙，以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，第一序列中与第二序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
术语“表达载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，Lefranc，G.，The ImmunoglobulinFactsBook，Academic Press，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染宿主细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的N端位点。阳性的克隆在生物反应器的培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
术语“肽”是指介于氨基酸和蛋白质之间的化合物片段，由2个或2个以上氨基酸分子通过肽键相互连接而成，是蛋白质的结构与功能片段。
术语“糖”是指由C、H、O三种元素组成的生物大分子，可分为单糖、二糖和多糖等。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基，更优选含有1至10个碳原子的烷基，最优选含有1至6个碳原子(包含1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子)的烷基。非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2，2-二乙基戊基、正癸基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
术语“杂烷基”指含有一个或多个选自N、O或S的杂原子的烷基，其中烷基如上所定义。
术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子，更优选含有1至6个碳原子(包含1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子)的亚烷基。亚烷基的非限制性示例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、1，1-亚乙基(-CH(CH3)-)、1，2-亚乙基(-CH2CH2)-、1，1-亚丙基(-CH(CH2CH3)-)、1，2-亚丙基(-CH2CH(CH3)-)、1，3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和1，5-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性示例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“卤代烷基”指烷基上的氢被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。
术语“氘代烷基”指烷基上的氢被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。
术语“羟烷基”指烷基上的氢被一个或多个羟基取代，其中烷基如上所定义。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“氨基”指-NH2。
术语“硝基”指-NO2。
术语“氰基”指-CN。
本公开还包括各种氘化形式的式(I)化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式(I)化合物。在制备氘代形式的式(I)化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1个、2个或3个氢原子彼此独立地被取代基取代。取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本公开抗体药物偶联物的盐，或本公开中所述的活性化合物的盐，这类盐用于受试者时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本公开配体药物偶联物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
本公开的一个实施方式中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在抗体的巯基上。
可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：
(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，
(2)控制反应时间和温度，
(3)选择不同的反应试剂。
常规的药物组合物的制备见中国药典。
术语“药学上可接受的载体”用于本公开的药物，是指能改变药物进入受试者的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的示例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。
术语“赋形剂”是在药物组合物中除活性化合物以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。
药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入受试者的血流中。或者，最好按可保持本公开化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的示例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。
药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液，例如1，3-丁二醇中制备的溶液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用包括合成甘油单或二酯在内的任何调和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以制备注射剂。
本公开涉及一类可裂解的特定结构的连接臂和特定结构的活性物，及由连接臂、活性物与抗体组成的抗体药物偶联物(ADC)。此类ADC是经由间隔物将一种毒性物质连于抗体而形成的复合物。该抗体偶联药物(ADC)在体内经降解而释放出活性分子，从而起到抗肿瘤的作用。
二、合成方法
为了完成合成目的，采用如下的合成技术方案：
通式(Pc-La-Y-D)所示的化合物的制备方法，其包括如下步骤：
Pc还原后，与通式(La-Y-D)偶联反应，得到通式(Pc-La-Y-D)所示的化合物；还原剂优选TCEP，特别地，优选还原抗体上的二硫键；
其中：
Pc、W、L2、L3、R1、R2、R5～R7、m和n如通式(Pc-La-Y-D)中所定义。
在以上说明书中提出了本公开一种或多种实施方案的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本公开，但是以下描述优选的方法和材料。通过说明书和权利要求书，本公开的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中，除非上下文中有清楚的另外指明，单数形式包括复数指代物的情况。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本公开所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本公开的优选实施方案。这些实施例不应以任何方式理解为限制本公开的范围，本公开的范围由权利要求书限定。
实施例1：CEA重组蛋白和稳转细胞的制备
一、重组CEA抗原及细胞表面表达CEA蛋白的序列
编码带Fc、His标签的人CEA氨基酸序列分别克隆到哺乳动物细胞表达载体中，在293E细胞中表达纯化后获得重组蛋白用于后续各实施例的实验中。同时将不带标签的人CEA基因、人CEACAM1基因和猴CEA基因转染到CHO细胞中，形成在细胞表面表达CEA蛋白的CHO细胞株，用于后续抗体的筛选和鉴定。相关蛋白氨基酸序列如下：
1、人CEA-his(hCEA-His)氨基酸序列：
2、人CEA-Fc(hCEA-Fc)氨基酸序列：
3、猴CEA-His(cynoCEA-His)氨基酸序列：
4、CHO细胞表面表达人CEA(hCEA-CHO)氨基酸序列：
5、CHO细胞表面表达猴CEA(cynoCEA-CHO)氨基酸序列：
6、CHO细胞表面表达人CEACAM1(CEACAM1-CHO)氨基酸序列：
二、相关蛋白的纯化
1、带His标签蛋白的纯化
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质。用PBS缓冲液(pH 7.4)平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积，将上清样品以一定流速上Ni Sepharose excel柱。用PBS缓冲液冲洗柱子，至A280读数降至基线，再用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液，最后用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液浓缩后用脱盐柱将样品缓冲液换成PBS溶液，以备后续实验使用。
2、含Fc的蛋白、嵌合抗体及杂交瘤抗体的纯化
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，含Fc的重组蛋白、嵌合抗体表达上清用Protein A柱进行纯化，杂交瘤表达上清用Protein G柱进行纯化。上清液以一定流速上柱。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH 3.0的100mM乙酸洗脱目的蛋白，用pH 8.0的1MTris-HCl中和。洗脱样品浓缩换成PBS后分装备用。
实施例2：小鼠抗人CEA单克隆抗体的制备
1、免疫和融合
小鼠的免疫使用hCEA-His蛋白和cyno-CEA-His蛋白，或hCEA-CHO细胞和cynoCEA-CHO细胞进行交叉免疫。蛋白免疫的用量为第一次免疫50μg，之后的免疫用25μg，细胞免疫为每次107个细胞，每两周免疫一次。免疫3次后取血测定血清中抗体的效价，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，采用PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以0.5-1×106个/ml的密度用MC半固体完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×OPI和2％Methyl cellulose的RPMI-1640培养基)重悬，分装于35mm细胞培养皿中，37℃，5％CO2孵育7-9天。融合后第7-9天，根据细胞克隆大小，挑取单细胞克隆至加有200μl/孔的HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)的96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2培养3天进行检测。
2、杂交瘤细胞筛选
抗体的初步筛选用基于细胞表面抗原的酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行。将细胞铺在Elisa板(Corning，Cat#3599)中，37℃培养箱中培养过夜，待细胞完全贴壁，快要长满整个孔时，去上清液，用PBS清洗一次，加入细胞固定液(Beyotime，Cat#P0098)，室温放置45分钟，去固定液，洗板机洗板3次，加入5％脱脂奶粉，37℃封闭3h以上。去封闭液，洗板机洗板3次。封闭好的细胞板可以置于-20℃保存或直接使用。使用时加入梯度稀释的杂交瘤细胞培养上清液，37℃孵育1小时，洗板机洗3遍，加入100μl 10000倍稀释的Goat anti-mouse IgG H&L(HRP)二抗(Abcam，Cat#ab205719)，37℃孵育1小时，洗板机洗3遍，加入100μl TMB(KPL，Cat#5120-0077)置于37℃显色10分钟，加入100μl 1M硫酸终止反应，用酶标仪读取450nm的吸光值。测试抗体与细胞表面的CEA结合而不会被可溶性CEA(sCEA)竞争掉时，将抗体与sCEA孵育30分钟后再加入细胞板中。
将筛选出的阳性克隆进行扩增冻存保种和二到三次亚克隆直至获得单细胞克隆。选择出的杂交瘤克隆用无血清细胞培养法进一步制备和纯化抗体。得到的杂交瘤抗体用流式细胞仪检测抗体与细胞表面CEA蛋白的结合情况(方法见本公开测试例1)，挑选出结合活性好的杂交瘤细胞株。其中，单克隆杂交瘤细胞株mAb47，mAb63、mAb67和mAb103的结合活性检测结果见表1：
表1：鼠源抗体对细胞表面CEA蛋白的结合实验结果
3、杂交瘤抗体序列测定
选择单克隆杂交瘤细胞株mAb47，mAb63、mAb67和mAb103，克隆单克隆抗体的序列。过程如下：收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，Cat#15596-018)提取RNA，反转录为cDNA。用cDNA为模板进行PCR扩增后送测序公司测序，得到的DNA序列对应的抗体氨基酸序列如下表2所示：
表2：鼠源抗CEA抗体的可变区序列
表3：抗CEA抗体的CDR序列
备注：表中的抗体CDR序列是根据Kabat编号系统确定。
4、人IgG1嵌合抗体制备
将上述杂交瘤筛选所获得的mAb47，mAb63、mAb67和mAb103候选分子经过扩增测序可得到可变区编码基因序列，以测序所得序列设计首尾引物，以测序基因为模板，经过PCR搭建各抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及hIgG1/hkappa/hlambda恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)进行同源重组，构建重组嵌合抗体全长表达质粒VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr，进而获得其嵌合抗体Ch47、Ch63、Ch67和Ch103。
实施例3：鼠源抗人CEA单克隆抗体的人源化
通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别graft(嫁接)到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。下面范例中抗体的CDR氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
1、鼠源抗体mAb47的人源化
挑选同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，例如，鼠源抗体mAb47的人源化轻链模板选IGKV6-21*01和IGKJ2*01，人源化重链模板选IGHV7-4-1*02和IGHJ6*01，将鼠源抗体mAb47的CDR分别移植到相应的人源模板中进行人源化改造，鼠源抗体mAb47的人源化回复突变设计见下表4：
表4：鼠源抗体mAb47的人源化设计
备注：表中氨基酸位置编号均为Kabat编号规则的编号，例如，L46P，是指依照Kabat编号系统编号，将第46位L突变回P；Grafted代表鼠源抗体CDR植入人种系FR区序列。
另外，进一步地，在重链可变区h47VH3中引入D61S突变(即在抗体HCDR2上进行氨基酸突变，使抗体HCDR2序列由SEQ ID NO：16)突变为：WINTYSGVPTYASDFKG(SEQ ID NO：38))，得到重链可变区h47VH4，抗体仍具有良好活性。
鼠源抗体mAb47人源化后的具体序列见表5所示：
表5：鼠源抗体mAb47人源化后的可变区序列
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备注：表中下划线为CDR区(根据Kabat编号系统确定)，粗斜体为突变位点
2、鼠源抗体mAb63的人源化
挑选同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，例如，鼠源抗体mAb63的人源化轻链模板选IGKV1-39*01和IGKJ4*01，人源化重链模板选IGHV1-46*01和IGHJ1*01，将鼠源抗体mAb63的CDR分别移植到相应的人源模板中进行人源化改造，鼠源抗体mAb63的人源化回复突变设计见下表6：
表6：鼠源抗体mAb63的人源化设计
备注：表中氨基酸位置编号均为Kabat编号规则的编号，例如，S 82A R，是指依照Kabat编号系统编号，将第82A位S突变回R；Grafted代表鼠源抗体CDR植入人种系FR区序列。
另外，进一步地，在重链可变区h63VH1中引入N54S突变(即在抗体HCDR2上进行氨基酸突变，使抗体HCDR2序列由DIFPKNGNTDYNRKFKD(SEQ ID NO：22)突变为：DIFPKSGNTDYNRKFKD(SEQ ID NO：47))，得到重链可变区h63VH5，抗体仍具有良好活性。
鼠源抗体mAb63人源化及突变后的具体序列见表7所示：
表7：鼠源抗体mAb63人源化后的可变区序列
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备注：表中下划线为CDR区(根据Kabat编号系统确定)，粗斜体为突变位点
3、鼠源抗体mAb67的人源化
挑选同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，例如，鼠源抗体mAb67的人源化轻链模板选IGKV4-1*01和IGKJ4*01、IGKV3-15*01和IGKJ4*01、或IGKV1-39*01和IGKJ4*01，人源化重链模板选IGHV1-3*01和IGHJ1*01、或IGHV5-51*01和IGHJ1*01，将鼠源抗体mAb67的CDR分别移植到相应的人源模板中进行人源化改造，鼠源抗体mAb67的人源化回复突变设计见下表8：
表8：鼠源抗体mAb67的人源化设计
备注：表中氨基酸位置编号均为Kabat编号规则的编号，例如，A43P是指依照Kabat编号系统编号，将第43位A突变回P；Grafted代表鼠源抗体CDR植入人种系FR区序列。
鼠源抗体mAb67人源化后的具体序列见表9所示：
表9：鼠源抗体mAb67人源化后的可变区序列
备注：表中下划线为CDR区(根据Kabat编号系统确定)，粗斜体为突变位点
4、鼠源抗体mAb103的人源化
挑选同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，例如，鼠源抗体mAb103的人源化轻链模板选IGLV4-69*01和IGLJ2*01，人源化重链模板选IGHV7-4-1*02和IGHJ1*01，将鼠源抗体mAb103的CDR分别移植到相应的人源模板中进行人源化改造，鼠源抗体mAb103的人源化回复突变设计见下表10：
表10：鼠源抗体mAb103的人源化设计
备注：表中氨基酸位置编号均为Kabat编号规则的编号，例如，K49E是指依照Kabat编号系统编号，将第49位K突变回E；Grafted代表鼠源抗体CDR植入人种系FR区序列。
另外，进一步地，在重链h103VH1中引入D61S突变(即在抗体HCDR2上进行氨基酸突变，使抗体HCDR2序列由SEQ ID NO：16)突变为：WINTYSGVPTYASDFKG (SEQ ID NO：38))；在轻链h103VL3中引入D56E突变(即在抗体LCDR2上进行氨基酸突变，使抗体LCDR2序列由LKKDGSHSTGD(SEQ ID NO：36)突变为：LKKDGSHSTGE(SEQ ID NO：64))，抗体仍具有良好活性。
鼠源抗体mAb103人源化后的具体序列见表11所示：
表11.鼠源抗体mAb103人源化后的可变区序列
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备注：表中下划线为CDR区(根据Kabat编号系统确定)，粗斜体为突变位点5、人源化抗体的制备
分别构建抗体轻链和重链的表达载体，将人源化的抗体轻/重链分别交叉配对组合，转染293E细胞后收集培养上清纯化即得到人源化的全长抗体。人源化抗体重链恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其变体的恒定区，示例性的，使用人重链IgG1恒定区(如SEQID NO：77所示)与前述人源化重链可变区连接形成抗体全长重链；人源化抗体轻链恒定区可选自选自人源κ、λ链或其变体的恒定区，示例性的，使用人轻链恒定区κ链(如SEQ ID NO：78所示)或人轻链恒定区λ链(如SEQ ID NO：79所示)与前述人源化轻链可变区连接形成抗体全长轻链。
示例性的抗体的恒定区序列如下：
人IgG1重链恒定区：
人轻链恒定区κ链：
人轻链恒定区λ链：
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示例性的，将前述来源自mAb47的如表5中所述的人源化抗体重链可变区与序列如SEQ ID NO：77所示的人重链IgG1恒定区氨基端连接形成抗体全长重链，同时将表5中所述的人源化抗体轻链可变区与序列如SEQ ID NO：78所示的人轻链κ恒定区氨基端连接形成抗体全长轻链，得到如下表12所示的系列mAb47人源化抗体：
表12.mAb47人源化抗体
备注：表中例如“Hu47-14”表示编号为Hu47-14的人源化抗体的轻链可变区为h47VL2，重链可变区为h47VH4，重链恒定区序列如SEQ ID NO：77所示，轻链恒定区序列如SEQ ID NO：78所示。
示例性的，将前述来源自mAb63的如表7中所述的人源化抗体重链可变区与序列如SEQ ID NO：77所示的人重链IgG1恒定区氨基端连接形成抗体全长重链，同时将表7中所述的人源化抗体轻链可变区与序列如SEQ ID NO：78所示的人轻链κ恒定区氨基端连接形成抗体全长轻链，得到如下表13所示系列mAb63人源化抗体：
表13.mAb63人源化抗体
备注：表中例如“Hu63-13”表示编号为Hu63-13的人源化抗体的轻链可变区为h63VL1，重链可变区为h63VH5，其重链恒定区序列如SEQ ID NO：77所示，轻链恒定区序列如SEQ ID NO：78所示。
示例性的，将前述来源自mAb67的如表9中所述的人源化抗体重链可变区与序列如SEQ ID NO：77所示的人重链IgG1恒定区氨基端连接形成抗体全长重链，将表9中所述的人源化抗体轻链可变区与序列如SEQ ID NO：78所示的人轻链κ恒定区氨基端连接形成抗体全长轻链，得到如下表14所示的系列mAb67人源化抗体。
表14.mAb67人源化抗体
备注：表中例如“Hu67-14”表示编号为Hu67-14的人源化抗体的轻链可变区为h67VL4，重链可变区为h67VH3，其重链恒定区序列如SEQ ID NO：77所示，轻链恒定区序列如SEQ ID NO：78所示。
示例性的，将前述来源自mAb103的如表11中所述的人源化抗体重链可变区与序列如SEQ ID NO：77所示的人重链IgG1恒定区氨基端连接形成抗体全长重链，将表11中所述的人源化抗体轻链可变区与序列如SEQ ID NO：79所示的人轻链λ恒定区氨基端连接形成抗体全长轻链，得到如下表15所示的系列mAb103人源化抗体：
表15.mAb103人源化抗体
备注：表中例如“Hu103-32”表示编号为Hu103-32的人源化抗体的轻链可变区为h103VL8，重链可变区为h103VH4，其重链恒定区序列如SEQ ID NO：77所示，轻链恒定区序列如SEQ ID NO：79所示。
示例性的，人源化抗体轻/重链全长序列如下表16所示：
表16.人源化抗体的轻/重链序列
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备注：表中斜体字为恒定区序列，正体字为可变区序列
目前已知的2个CEA靶点ADC分子：SAR-408701和labetuzumab govitecan(也称Lmab-CL2A-SN38)，其中的抗体轻/重链序列如下：
SAR-408701中的抗体(简称Sanofi)的重链序列：
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SAR-408701中的抗体(简称Sanofi)的轻链序列
Lmab-CL2A-SN38中的labetuzumab(简称Lmab)抗体重链序列
Lmab-CL2A-SN38中的Labemzumab(简称Lmab)轻链序列
用常规基因克隆、重组表达的方法分别克隆、表达、纯化上述抗体。
实施例4：化合物的制备
本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或质谱(MS)来确定的。NMR的测定是用BrukerAVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10-6(ppm)作为单位给出。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。
UPLC的测定用Waters Acquity UPLC SQD液质联用仪。
HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)。
UV-HPLC的测定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度计。
增殖抑制率及IC50值的测定用PHERA starFS酶标仪(德国BMG公司)。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm硅胶板。
柱层析一般使用烟台黄海200～300目硅胶为载体。
本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。
实施例中如无特殊说明，反应均在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。
加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。
实施例中如无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。
实施例中如无特殊说明，反应的温度为室温。
室温为最适宜的反应温度，温度范围是20℃～30℃。
实施例中pH＝6.5的PBS缓冲液的配制：取KH2PO4 8.5g，K2HPO4.3H2O 8.56g，NaCl5.85g，EDTA 1.5g置于瓶中，定容至2L，超声波使其全部溶解，摇匀即得。
纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂的体系包括：A：二氯甲烷和异丙醇体系，B：二氯甲烷和甲醇体系，C：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和酸性或碱性试剂等进行调节。
本公开部分化合物是通过Q-TOF LC/MS来表征的。Q-TOF LC/MS使用安捷伦6530精确质量数四级杆-飞行时间质谱仪和安捷伦1290-Infinity超高效液相色谱仪(安捷伦Poroshell 300SB-C8 5μm，2.1×75mm色谱柱)。
本公开抗体药物偶联物的Y-D药物部分参见PCT/CN2019/107873，相关的化合物合成及测试引用至本专利。其中的非限制性实施例合成引用如下：
1、本公开毒素药物的合成
(S)-2-环丙基-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺1-A
吲)-2-环丙基-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺1-B
向1b(4mg，7.53μmol)中加入2mL乙醇和0.4mL N，N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴冷却至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基吗啉，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入2-环丙基-2-羟基乙酸1a(2.3mg，19.8μmol，采用专利申请“WO2013106717”公开的方法制备而得)、1-羟基苯并三唑(3mg，22.4μmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.3mg，22.4μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应1小时。撤去冰水浴，加热至30℃搅拌2小时。反应液减压浓缩，所得到的粗品化合物1用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridgePrep C18 OBD 5μm 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH4OAc)，B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物(1-A：1.5mg，1-B：1.5mg)。
MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。
单一构型化合物1-B(较短保留时间)
UPLC分析：保留时间1.06分钟，纯度：88％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.37(d，1H)，7.76(d，1H)，7.30(s，1H)，6.51(s，1H)，5.58-5.56(m，1H)，5.48(d，1H)，5.41(s，2H)，5.32-5.29(m，2H)，3.60(t，1H)，3.19-3.13(m，1H)，2.38(s，3H)，2.20-2.14(m，1H)，1.98(q，2H)，1.87-1.83(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，1.34-1.28(m，1H)，0.86(t，3H)，0.50-0.39(m，4H)。
单一构型化合物1-A(较长保留时间)
UPLC分析：保留时间1.10分钟，纯度：86％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.35(d，1H)，7.78(d，1H)，7.31(s，1H)，6.52(s，1H)，5.58-5.53(m，1H)，5.42(s，2H)，5.37(d，1H)，5.32(t，1H)，3.62(t，1H)，3.20-3.15(m，2H)，2.40(s，3H)，2.25-2.16(m，1H)，1.98(q，2H)，1.87-1.82(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，1.21-1.14(m，1H)，0.87(t，3H)，0.47-0.35(m，4H)。
2、本公开连接子毒素药物的合成
N-((2R，10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-1，6，9，12，15-五氧代-3-氧杂-5，8，11，14-四氮杂十六-16-基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺2-A
N-((2S，10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-1，6，9，12，15-五氧代-3-氧杂-5，8，11，14-四氮杂十六-16-基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺2-B
第一步
2-环丙基-2-羟基乙酸苄酯2a
将1a(1.3g，11.2mmol；采用专利申请“WO2013/106717”公开的方法制备而得)溶于50mL乙腈中，依次加入碳酸钾(6.18g，44.8mmol)、溴化苄(1.33mL，11.2mmol)和四丁基碘化铵(413mg，1.1mmol)。将反应液室温搅拌48小时，通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合并滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物2a(2g，产率：86.9％)。
第二步
10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3，6-二氧代-2，9-二氧杂-4，7-二氮杂十一-11-酸苄酯2b
将2a(120.9mg，0.586mmol，)和2g(180mg，0.489mmol；采用专利申请“CN105829346A”公开的方法制备而得)加入反应瓶，加入4mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(109mg，0.98mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌40分钟，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合并有机相并浓缩。所得残余物溶于4mL二氧六环中，加入2mL水，加入碳酸氢钠(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(126mg，0.49mmol)，室温搅拌2小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物2b(48mg，产率：19％)。
MS m/z(ESI)：515.0[M+1]。
第三步
10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3，6-二氧代-2，9-二氧杂-4，7-二氮杂十一-11-酸2c
将2b(20mg，0.038mmol)溶于4.5mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V∶V＝2∶1)混合溶剂中，加入钯碳(12mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物2c(13mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-环丙基-2-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯2d
将1b(10mg，18.8μmol)加入反应瓶，加入1mL N，N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品5c(13mg，30.6μmol)，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(16.9mg，61.2μmol)，冰浴搅拌反应40分钟。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物2d(19mg，产率：73.6％)。
MS m/z(ESI)：842.1[M+1]。
第五步
2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-2-环丙基-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)乙酰胺2e
将2d(19mg，22.6μmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入1mL甲苯并减压浓缩，重复两次。向残余物中加入3mL正己烷打浆，静置后倾倒出上层清液，保留固体。将固体残余物减压浓缩，油泵拉干得到粗品标题产物2e(17mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI)：638.0[M+18]。
第六步
N-((2R，10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-1，6，9，12，15-五氧代-3-氧杂-5，8，11，14-四氮杂十六-16-基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺2-A
N-((2S，10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-1，6，9，12，15-五氧代-3-氧杂-5，8，11，14-四氮杂十六-16-基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺2-B
将粗品2e(13.9mg，22.4μmol)溶于0.6mL N，N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入2f(21.2mg，44.8μmol，采用专利申请“EP2907824”公开的方法制备而得)的0.3mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(18.5mg，67.3μmol)，冰浴搅拌反应10分钟，撤去冰浴，升至室温搅拌1小时，反应生成化合物2。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD5μm 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物(2-A：2.4mg，2-B：1.7mg)。
MS m/z(ESI)：1074.4[M+1]。
单一构型化合物2-A(较短保留时间)：
UPLC分析：保留时间1.14分钟，纯度：85％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.60(t，1H)，8.51-8.49(d，1H)，8.32-8.24(m，1H)，8.13-8.02(m，2H)，8.02-7.96(m，1H)，7.82-7.75(m，1H)，7.31(s，1H)，7.26-7.15(m，4H)，6.99(s，1H)，6.55-6.48(m，1H)，5.65-5.54(m，1H)，5.41(s，2H)，5.35-5.15(m，3H)，4.74-4.62(m，1H)，4.54-4.40(m，2H)，3.76-3.64(m，4H)，3.62-3.48(m，2H)，3.20-3.07(m，2H)，3.04-2.94(m，1H)，2.80-2.62(m，12H)，2.45-2.30(m，3H)，2.25-2.15(m，2H)，2.15-2.04(m，2H)，1.93-1.78(m，2H)，1.52-1.39(m，3H)，1.34-1.12(m，5H)，0.87(t，3H)，0.64-0.38(m，4H)。
单一构型化合物2-B(较长保留时间)：
UPLC分析：保留时间1.16分钟，纯度：89％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.68-8.60(m，1H)，8.58-8.50(m，1H)，8.32-8.24(m，1H)，8.13-8.02(m，2H)，8.02-7.94(m，1H)，7.82-7.75(m，1H)，7.31(s，1H)，7.26-7.13(m，3H)，6.99(s，1H)，6.55-6.48(m，1H)，5.60-5.50(m，1H)，5.41(s，2H)，5.35-5.15(m，2H)，4.78-4.68(m，1H)，4.60-4.40(m，2H)，3.76-3.58(m，4H)，3.58-3.48(m，1H)，3.20-3.10(m，2H)，3.08-2.97(m，2H)，2.80-2.72(m，2H)，2.45-2.30(m，3H)，2.25-2.13(m，2H)，2.13-2.04(m，2H)，2.03-1.94(m，2H)，1.91-1.78(m，2H)，1.52-1.39(m，3H)，1.34-1.12(m，4H)，0.91-0.79(m，3H)，0.53-0.34(m，4H)。
实施例5：抗体药物偶联(ADC)制备
ADC原液药物载量分析
实验目的及原理
ADC原液是一种抗体交联物类药物，其治疗疾病的机理是依赖抗体的靶向性将毒素分子运送到细胞中，进而将细胞杀死。药物的载量对药效起着决定性的作用。使用紫外法对ADC原液的药物载量进行了测定。
实验方法
将装有琥珀酸钠缓冲液的比色皿分别置于参比吸收池和样品测定吸收池中后，扣除溶剂空白后，再将装有供试品溶液的比色皿置于样品测定吸收池中，测定280nm和370nm处吸光度。
结果计算：采用紫外分光光度法(使用仪器：Thermo nanodrop2000紫外分光光度计)测定ADC原液载量，其原理是在某波长下ADC原液的总吸光值等于胞毒药物与单克隆抗体在该波长下吸光值的加和，即：
(1)A280nm＝εmab-280bCmab+εDrug-280bCDrug
εDrug-280：药物在280nm平均摩尔消光系数5100；
CDrug：药物的浓度；
εmab-280：单抗原液在280nm平均摩尔消光系数214600；
Cmab：单抗原液的浓度；
b：光程长度为1cm。
同理可以得到样品在370nm下的总吸光值方程：
(2)A370nm＝εmab-370bCmab+εDrug-370bCDrug
εDrug-370：药物在370nm平均摩尔消光系数19000；
CDrug：药物的浓度；
εmab-370：单抗原液在370nm消光系数为0；
Cmab：单抗原液的浓度；
b：光程长度为1cm。
由(1)和(2)两种方程结合单克隆抗体和药物在两个检测波长下的消光系数和浓度数据可以计算出药物的载量。
药物载量＝CDrug/Cmab。
1、本公开抗体药物偶联ADC制备
毒素化合物1-B是一种DNA拓扑异构酶I抑制剂，其与拓扑异构酶I及DNA形成的复合物能引起DNA单链断裂，阻止DNA复制，在细胞内能有效抑制细胞的增殖。
ADC的制备过程如下：将人源化的抗体(选自Hu63-13，Hu47-14，Hu67-14或Hu103-32)置于pH 6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液中(抗体浓度10mg/ml)，加入相当于抗体5.3倍摩尔量的10mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(Innochem，CAS：51805-45-9，Cat#B45573)，置于37℃恒温振荡培养箱中，反应3小时。将上述反应液置于冰浴中降温至25℃。
将相当于抗体15倍摩尔量的毒素化合物2-A溶解于二甲基亚砜中，加入到上述反应液中，置于室温下的振荡器上，反应3小时后停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.01M的EDTA)，得到目标抗体药物偶联分子，药物抗体摩尔比(DAR，n值)为6～8。
本领域的技术人员可以根据反应条件和试剂的调整，获得不同DAR值的偶联物。例如：通过调整抗体与TCEP、毒素化合物摩尔比，加入相当于抗体2.5倍摩尔量的10mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液和10倍摩尔量的毒素化合物2-A，得到药物抗体摩尔比(DAR，n值)为3～5的ADC分子。
具体制备获得的ADC如下：
ADC样品 包含抗体 DAR值(n)
Hu47-14-2-A Hu47-14 6.6
Hu63-13-2-A Hu63-13 6.29
Hu67-14-2-A Hu67-14 6.41
Hu103-32-2-A Hu103-32 6.94
Hu63-13-2-A Hu63-13 3.97
Hu67-14-2-A Hu67-14 4.28
Hu103-32-2-A Hu103-32 4.8
Hu63-13-2-A
Hu47-14-2-A
Hu67-14-2-A
Hu103-32-2-A
根据测试例的要求，本公开还制备了其他DAR值的ADC，具体见测试例。
2、对照ADC Lmab-CL2A-SN38(ADC-4)的制备
为了评估本公开中的构建的ADC与对照ADC分子Lmab-CL2A-SN38的区别，参考WHODrug Information Vol.30，No.1，2016中的结构和文献Mol Pharm.2015Jun 1；12(6)：1836-47中的方法，合成毒素CL2A-SN38，将CL2A-SN38偶联到Lmab上，形成ADC分子Lmab-CL2A-SN38，参考上述ADC制备方法，调整反应条件，获得不同DAR值的ADC分子，制备好的ADC分子放于-20℃保存备用。
测试例
测试例1：FACS结合实验
为了检测抗体与细胞表面CEA蛋白的结合情况，用在细胞表面表达CEA的细胞通过FACS检测抗体的结合活性。收集细胞，400g，4℃离心5分钟；加入含有终浓度10％FBS的预冷的PBS，400g，4℃离心5分钟，重复两次；将细胞分配至96孔板，105个细胞/孔；每孔加入100μl梯度稀释的抗体溶液，4℃孵育60分钟，离心去上清；每孔加入含有终浓度10％FBS的预冷的PBS 250μl重悬细胞，400g，4℃离心5分钟，去上清液，重复两次；加入50μl 1∶200稀释的二抗Alexa Fluor@488羊抗人IgG(H+L)(Lifetechologies，Cat#A11013)，4℃避光孵育45分钟，离心去上清液；每孔加入含有终浓度10％FBS的预冷的PBS 250μl重悬，400g，4℃离心5分钟，重复两次；每孔加入100μl预冷的PBS重悬细胞；上流式细胞仪检测(BD，FACSverse)；得到荧光信号值，信号越高表示抗体与细胞表面的蛋白结合活性越强。将检测结果用PRISM分析软件做结合曲线图，拟合得到抗体与细胞表面蛋白人CEA(MKN45人胃癌细胞，南京科佰生物科技有限公司，Cat#CBP60488)、cynoCEA-CHO、CEACAM1-CHO结合活性的EC50值。人源化抗体的结合活性如下表17、18所示：
表17.人源化抗体对不同种属的细胞表面CEA蛋白的结合活性
/>
其它人源化抗体对细胞表面CEA蛋白(MKN45、cynoCEA-CHO)的结合活性检测结果见下表18所示：
表18.人源化抗体对细胞表面CEA蛋白的结合活性
实验结果表明，本公开中筛选到的人源化抗体保持了与鼠源抗体相似的结合活性，均能与细胞表面人CEA蛋白结合；本公开中筛选到的人源化抗体能与细胞表面猴CEA蛋白结合，且与猴CEA蛋白结合活性优于阳性对照抗体。
测试例2：与可溶性CEA(sCEA)竞争实验
为了检测抗体在sCEA存在的情况下是否也优先与细胞膜表面的CEA结合，我们将梯度稀释的抗体与一定溶度的sCEA(5μg/ml)预先孵育30分钟，然后收集MKN45细胞，将细胞分配至96孔板；每孔分别加入梯度稀释的抗体和抗体与sCEA预孵育的混合溶液，4℃孵育60分钟，离心去上清；加入含有终浓度10％FBS的预冷的PBS清洗细胞，重复两次；加入50μl 1∶200稀释的二抗Alexa Fluor@488羊抗人IgG(H+L)(Lifetechologies，Cat#A11013)，4℃避光孵育45分钟，离心去上清液；加入终浓度10％FBS的预冷的PBS 250μl清洗细胞；重复两次；每孔加入100μl预冷的PBS重悬细胞；上流式细胞仪(FACS)检测(BD，FACSverse)，得到荧光信号值。如果不加sCEA与加sCEA的信号在各个抗体浓度下的比值都小于2，说明抗体在sCEA的存在下结合曲线也没有出现很大的改变，抗体依然优先与细胞膜表面的CEA结合。实验结果见表19和表20，其中，Hu63-13、Hu47-14、Hu67-14、Hu103-32和阳性对照Lmab抗体不同浓度下不加sCEA与加sCEA的荧光信号比值见下表19所示，其它实验抗体不加sCEA与加sCEA的荧光信号最大比值见下表20所示：
表19.人源化抗体不加sCEA与加sCEA的荧光信号比值
表20.抗体不加sCEA与加sCEA的荧光信号最大比值
抗体 最大荧光信号比值 抗体 最大荧光信号比值
Hu47-2 1.04 Hu103-1 1.30
Hu47-3 1.10 Hu103-2 1.17
Hu47-4 1.13 Hu103-3 1.14
Hu47-6 1.26 Hu103-4 1.17
Hu47-7 1.11 Hu103-5 1.15
Hu47-8 1.04 Hu103-6 1.15
Hu47-10 1.13 Hu103-7 1.07
Hu47-12 1.08 Hu103-9 1.57
Hu63-1 1.31 Hu103-10 1.19
Hu63-3 1.14 Hu103-11 1.16
Hu67-1 1.35 Hu103-12 1.24
Hu67-2 1.21 Hu103-13 1.16
Hu67-4 1.25 Hu103-14 1.10
Hu67-5 1.09 Hu103-15 1.23
Hu67-6 1.22 Hu103-17 1.12
Hu67-7 1.03 Hu103-18 1.22
Hu67-9 1.10 Hu103-19 1.36
Hu67-10 1.34 Hu103-20 1.22
Hu67-11 1.18 Hu103-21 1.27
Hu67-12 1.31 Hu103-22 1.33
Hu67-15 1.05 Hu103-23 1.31
mAb63 1.43 mAb103 1.02
mAb47 1.08 Sanofi 2.65
实验结果表明，本公开中筛选到的人源化抗体Hu63-13、Hu47-14、Hu67-14、Hu103-32在各种抗体浓度下不加sCEA与加sCEA的荧光信号比值都小于2，例如Hu63-13最大比值为1.59，而阳性对照Lmab的最大比值达5.18，本公开中筛选到的抗体优于对照抗体。本公开中筛选到的人源化抗体不加sCEA与加sCEA的荧光信号最大比值均小于2，且小于阳性对照抗体，表明本公开中筛选到的人源化抗体在sCEA的存在下依然优先与细胞膜表面的CEA结合，且优于阳性对照抗体。
测试例3：Biacore测定抗体与可溶性CEA的亲和力
用Biacore(GE，T200)仪器测定待测人源化抗体和人、猴可溶性CEA的亲和力。按照人抗捕获试剂盒(GE，Cat#BR-1008-39)说明书中的方法将人抗捕获抗体共价偶联于Biacore仪器的生物传感芯片CM5(GE，Cat#BR-1005-30)上，从而亲和捕获一定量的待测抗体，然后于芯片表面流经一系列浓度梯度的可溶性CEA抗原，利用Biacore实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。实验得到的数据用BIAevaluation version 4.1软件以(1∶1)Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值。由于本公开希望筛选到的抗体与细胞膜表面的CEA结合活性强于可溶性CEA，因此抗体与可溶性CEA的亲和力越低越好。人源化抗体与可溶性CEA的亲和力测试结果如下表21所示：
表21.人源化抗体与人可溶性CEA的亲和力
测试的结果表明，人源化抗体Hu63-13、Hu47-14和Hu67-14与可溶性CEA蛋白的亲和力都比较低，明显低于对照抗体Sanofi和Lmab。这预示了Hu63-13、Hu47-14和Hu67-14在体内不容易被血液中的可溶性CEA中和掉，可以有大量抗体与细胞膜表面表达CEA的细胞结合。
测试例4：抗CEA抗体在CEA高表达细胞MKN45中的内吞活性
本公开中的抗CEA抗体偶联物被细胞内吞后能将毒素释放对细胞起到杀伤作用，因此CEA抗体在CEA表达的细胞中的内吞活性能促进ADC发挥活性。为了评估人源化抗体在MKN45中的内吞活性，将MKN45铺在96孔板(Coring，Cat#3795)中过夜培养，次日分别将人源化的CEA抗体Hu63-13、Hu47-14、Hu67-14和Hu103-32与iFL Green Human IgG LabelingReagent(Invitrogen，Cat#Z25611)预孵育15分钟，iFL试剂会与人源化抗体的Fc结合，之后将抗体和iFL复合物加入细胞培养板中，分别在6小时和24小时后将细胞培养液去除，加入PBS清洗两遍，消化收集细胞，用FACS检测细胞中的荧光信号强度，抗体被细胞内吞后会将结合在抗体Fc上的iFL带入细胞，iFL被吞入细胞内部在酸性环境下才能检测到荧光信号，因此检测到的信号越强代表抗体的内吞活性越高。各人源化抗体的内吞活性如图1所示：所有人源化抗体都能被MKN45内吞，随着时间的延长，内吞的抗体越多。
测试例5：ADC对不同CEA表达水平癌细胞的细胞毒性
人源化的CEA抗体与毒素2-A偶联后，评估各个ADC对不同CEA表达水平癌细胞系的细胞毒性。分别将CEA高表达细胞MKN45，CEA中表达细胞LS174T和CEA表达阴性细胞HCT116铺在96孔板中，次日在细胞中加入梯度稀释的ADC样品，放于37℃培养5天，每孔中加入CellTiter-Glo试剂(Promega，Cat#G9242)50μl，避光孵育10分钟后，用细胞成像检测仪(BioTek，Cytation5)检测发光信号。将检测结果用PRISM分析软件做抑制曲线图，拟合得到ADC抑制细胞增殖活性的IC50值，各ADC对细胞的毒性如下所示：
表22 ADC对不同CEA表达水平细胞的细胞毒性
与毒素2-A偶联的ADC分子表现出CEA表达水平依赖的细胞毒性，CEA表达水平越高，ADC对细胞的毒性越强。同时，在高DAR值和低DAR值时都对CEA表达细胞具有比较强的细胞毒性，对CEA不表达细胞的细胞毒性比较弱。而对照ADC分子Lmab-CL2A-SN38对三种细胞系的细胞毒性都相当，对细胞的毒性没有选择性。IC50比值的大小可以间接反映ADC分子的安全性，比值越大，说明ADC分子对不表达CEA的细胞毒性越弱，在体内可能具有更好的安全性。
测试例6：ADC的旁观者效应细胞毒性
ADC被内吞进入细胞后，毒素从ADC上释放下来，对细胞产生毒性，细胞死亡裂解后又会将毒素释放出细胞，毒素可以进一步进入附近的细胞，对附近的细胞也产生毒性。
为了评估ADC的旁观者效应细胞毒性，将CEA高表达细胞系MKN45和CEA表达阴性细胞系HCT116加入6孔细胞培养板中共培养，24小时后加入终浓度为4nM的ADC样品，置于37℃细胞培养箱中继续培养5天。然后用胰酶消化收集细胞，加入终浓度为10μg/ml的CEAMonoclonal Antibody FITC(ThermoFisher，Cat#MA1-80578)，在冰上避光孵育1小时，用PBS清洗细胞2遍，用流式细胞仪进行细胞计数，有荧光信号的细胞为表达CEA的MKN45细胞，无信号的细胞为不表达CEA的HCT116细胞。
ADC样品的旁观者细胞毒性结果如图2所示：所有ADC分子都具有很强的旁观者效应细胞毒性。MKN45和HCT116共培养时，ADC分子能抑制两种细胞的增殖，而单独培养HCT116时，偶联2-A的ADC分子对细胞基本没有毒性。而对照ADC分子Lmab-CL2A-SN38对共培养和单独培养的细胞都具有很强的毒性。
实验所用ADC分子DAR值如下所示：Hu63-13-2-A DAR 6.29；Hu47-14-2-A DAR6.6；Hu67-14-2-A DAR 6.41；Lmab-CL2A-SN38 DAR 7.0。
测试例7：ADC分子的体内抑瘤活性
用LS174T和MKN45移植瘤模型来评估ADC分子的体内药效。SPF级Balb/c裸鼠(常州卡文斯实验动物有限责任公司，合格证号：201833814，SCXK(苏)2016-0010)饲养条件为：12/12小时光/暗周期，温度23±1℃，湿度40～50％，给予标准灭菌鼠饲料，自由进食饮水。实验开始前小鼠在实验室环境中适应性饲养10天，然后在小鼠右肋部皮下接种LS174T细胞(5×105个细胞/只)或MKN45细胞(4×106个细胞/只)，待肿瘤长到150mm3左右进行随机分组，每组8只小鼠。分组完成后在小鼠腹腔注射给药，ADC样品给药剂量为1mg/kg或3mg/kg，空白对照组腹腔注射PBS，只给药一次，观察并测量小鼠身上的肿瘤大小，记录数据。肿瘤体积(V)的计算公式为：V＝1/2×L长×L短 2；肿瘤相对体积(RTV)＝VT/V0；抑瘤率(％)＝(CRTV-TRTV)/CRTV(％)。其中V0、VT分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积，CRTV、TRTV分别为实验结束时的空白对照组及实验组的相对肿瘤体积。
ADC的体内药效结果与对照组PBS相比，所有ADC分子在低剂量和高剂量下都具有抑制肿瘤体积增大和重量增加的效果，并且具有一定的剂量依赖效应，3mpk组的抑瘤效果强于1mpk组。在LS174T移植瘤模型中，结果如图3(肿瘤体积变化)和图4(最后一天的的肿瘤重量)所示：3mpk组中抑瘤效果最好的为Hu63-13-2-A，其次为Hu47-14-2-A，再次为Hu67-14-2-A，最差的为Lmab-CL2A-SN38。在MKN45移植瘤模型中，结果如图5(肿瘤体积变化)和图6(最后一天的的肿瘤重量)所示：3mpk组中抑瘤效果最好的为Hu67-14-2-A，其次为Hu103-32-2-A，再次为Hu63-13-2-A，最差的为Lmab-CL2A-SN38。
ADC分子体内的抑瘤率如下表23和表24所示：ADC的抑瘤率具有明显的剂量效应，在LS174T移植瘤模型中，低剂量组(1mpk)抑瘤率最高的为Hu63-13-2-A(55.95％)，其次为Hu67-14-2-A(43.71％)，最差的为Hu47-14-2-A(23.04％)；高剂量组(3mpk)抑瘤率最高的为Hu63-13-2-A(77.13％)，其次为Hu47-14-2-A(66.87％)，再次为Hu67-14-2-A(47.66％)，最差的为Lmab-CL2A-SN38(33.44％)。在MKN45移植瘤模型中，低剂量组(1mpk)抑瘤率最高的为Hu67-14-2-A(15.88％)，其次为Hu103-32-2-A(11.39％)，最差的为Hu63-13-2-A(9.89％)；高剂量组(3mpk)抑瘤率最高的为Hu67-14-2-A(79.51％)，其次为Hu103-32-2-A(74.66％)，再次为Hu63-13-2-A(60.26％)，最差的为Lmab-CL2A-SN38(13.51％)。
表23 ADC在体内的抑瘤率
注：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，NA表示无。
表24 MKN45移植瘤模型ADC在体内的抑瘤率
分组 DAR 剂量 抑瘤率％ P值(与对照组相比)
空白对照组 NA NA NA NA
Hu63-13-2-A 6.3 1mpk 9.89％ 0.6492
Hu63-13-2-A 6.3 3mpk 60.26％* 0.0124
Hu67-14-2-A 6.13 1mpk 15.88％ 0.5336
Hu67-14-2-A 6.13 3mpk 79.51％** 0.0087
Hu103-32-2-A 6.94 1mpk 11.39％ 0.5219
Hu103-32-2-A 6.94 3mpk 74.66％** 0.0033
Lmab-CL2A-SN38 7.0 3mpk 13.51％ 0.4980
注：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，NA表示无。
测试例8：ADC分子的体内药代动力学测试
用SD大鼠进行体内药代动力学测试。SD大鼠(西普尔-必凯实验动物有限公司)随机分组，每组3只，静脉注射给药，给药剂量为3mg/kg，给药组于给药前及给药后5分钟，8小时，1天，2天，4天，7天，10天，14天，21天，28天采集全血0.3ml，不加抗凝，取血后在4℃放置30分钟，1000g离心15分钟，取上层血清置于EP管中，于-80℃保存。用ELISA方法检测血清中的血药浓度，用Winnolin软件计算受试药物的药代动力学参数，检测结果如下所示：
表25 ADC分子的体内药代动力学参数
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所有ADC分子都具有较好的药代动力学性质，抗体的半衰期要稍微长于ADC分子。Hu63-13-2-A的体内半衰期为7.1天，抗体的半衰期为8天；Hu47-14-2-A的体内半衰期为6.6天，抗体的半衰期为7.9天；Hu67-14-2-A的体内半衰期为7.1天，抗体的半衰期为7.5天；Hu103-32-2-A的体内半衰期为5.63天，抗体的半衰期为6.58天。
测试例9：ADC分子的体外血浆稳定性测试
为了评估ADC分子在体外血浆中的稳定性，将ADC分子分别加入人和猴血浆中，浓度100μg/ml，置于37℃放置21天，每周取一次样品用LC/MS/MS(Shimadzu，LC-30AD超高效液相色谱系统；Applied Biosystems，API4000三重四极杆串联质谱仪)分析检测血浆中游离毒素的含量。检测结果如下所示：
表26血浆中游离毒素含量百分比
检测结果为0表示血浆中游离毒素含量低于检测下限，无法检出。所有ADC分子在人和猴的血浆中都具有很好的稳定性，37℃孵育21天后Hu63-13-2-A在人和猴血浆中游离毒素的含量分别为0.32％和0.4％；Hu47-14-2-A在人和猴血浆中游离毒素的含量分别为0.34％和0.29％；Hu67-14-2-A在人和猴血浆中游离毒素的含量分别为0.4％和0.24％；Hu103-32-2-A在人和猴血浆中游离毒素的含量分别为1.13％和0.96％。
测试例10：化合物对肿瘤细胞体外增殖抑制测试
一、测试目的
本实验的目的是为了检测本公开药物化合物，对U87MG细胞(中科院细胞库，Catalog#TCHu138)和SK-BR-3肿瘤细胞(人乳腺癌细胞，ATCC，货号HTB-30)体外增殖的抑制活性。以不同浓度的化合物体外处理细胞，经6天培养后，采用CTG(Luminescent Cell Viability Assay，Promega，货号：G7573)试剂对细胞的增值进行检测，根据IC50值评价该化合物的体外活性。
二、实验方法
下面以对U87MG细胞体外增殖抑制测试方法为例，用于举例说明本发明中测试本发明化合物对肿瘤细胞进行体外增殖抑制活性测试的方法。本方法同样适用于，但不限于对其它肿瘤细胞进行体外增殖抑制活性测试。
1、细胞培养：U87MG和SK-BR-3细胞分别用10％FBS的EMEM培养基(GE，货号SH30024.01)和含10％FBS的McCoy′s 5A培养基(Gibco，货号16600-108)培养。
2、细胞准备：取对数生长期的U87MG和SK-BR-3细胞，用PBS(磷酸盐缓冲液，上海源培生物科技股份有限公司)洗涤1次之后，加入2-3ml胰蛋白酶(0.25％Trypsin-EDTA(1x)，Gibico，Life Technologies公司)消化2-3分钟，待细胞消化完全后，加入10-15ml细胞培养液，将经过消化的细胞洗脱下来，1000rpm离心5分钟，弃上清，接着加入10-20ml细胞培养液将细胞重悬，制成单细胞悬液。
3、细胞铺板：将U87MG和SK-BR-3单细胞悬液混匀，用细胞培养液分别调整活细胞密度至2.75×103细胞/ml和8.25×103细胞/ml，将密度调整过后的细胞悬液混匀，以180μl/孔加入96孔细胞培养板。96孔板外周孔只加入200μl培养基。将培养板在培养箱培养24小时(37℃，5％CO2)。
4、化合物准备：用DMSO(二甲基亚砜，上海泰坦科技股份有限公司)溶解化合物，配制成初始浓度为10mM的存储液。
小分子化合物的起始浓度为500nM，配药方法如下。
在96孔U型底配药板第一列中分别加入30μl不同待测样品，样品浓度为100μM；第2列至第11列每孔中加入20μl DMSO。取第一列样品10μl至第二列20μl DMSO中，混匀，取10μl至第三列中，以此类推至第10列。将配药板中的药每孔取5μl至95μl EMEM培养基中，混匀，待用。
ADC的起始浓度为10nM或500nM，配药方法如下。
在96孔板第一列中分别加入100μl不同待测样品，样品浓度为100nM或5μM；第2列至第11列每孔中加入100μl PBS。取第一列样品50μl至第二列100μl PBS中，混匀，取50μl至第三列中，以此类推3倍稀释至第10列。
5、加样操作：向培养板中加入20μl配置的不同浓度的待测样品，每个样品两复孔。将培养板在培养箱孵育6天(37℃，5％CO2)。
6、显色操作：取出96孔细胞培养板，向每孔加入90μl CTG溶液，室温孵育10分钟。
7、读板操作：取出96孔细胞培养板，置于酶标仪(BMG labtech，PHERAstar FS)中，用酶标仪测定化学发光。
三、数据分析
用Microsoft Excel，Graphpad Prism 5对数据进行处理分析。实验结果参见下表。
表27本公开中的小分子片段对SK-BR-3细胞和U87细胞体外增殖抑制的IC50值。
结论：本公开中的小分子片段对SK-BR-3细胞和U87细胞具有明显的增殖抑制活性，手性中心对化合物的抑制活性有一定影响。

Claims (24)

1.一种抗体药物偶联物，包含任选通过接头偶联至毒素药物的抗CEA抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：47和SEQ ID NO：23所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:48、49、50、51或52所示；和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53、54或55所示。
5.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示；和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示。
6.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体为人源化抗体，所述人源化抗体包含来源自人抗体的框架区或其框架区变体，所述框架区变体为在人抗体的轻链框架区和/或重链框架区上分别具有至多10个氨基酸的回复突变。
7.根据权利要求6所述的抗体药物偶联物，其中所述的框架区变体在轻链可变区的框架区中包含选自2V、42G、44V和71Y中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或在重链可变区的框架区中包含选自48I、66K、67A、69L、71V、73K、82F、82A R中的一个或更多个氨基酸回复突变；
其中，所述回复突变的位点根据Kabat编号规则编号。
8.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体包含抗体重链恒定区和轻链恒定区。
9.根据权利要求8所述的抗体药物偶联物，其中所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体。
10.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中所述抗CEA抗体包含序列如SEQ IDNO:77所示的重链恒定区，和序列如SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79所示的轻链恒定区。
11.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，所述抗CEA抗体包含序列如SEQ ID NO:80所示的重链，和序列如SEQ ID NO：81所示的轻链。
12.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其为通式(Pc-L-Y-D)所示的抗体药物偶联物：
其中：
Y为-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；
Ra和Rb相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素或C1-6烷基；
R1和R2与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；
m为0或1；
n为1至10；
L为接头单元-L1-L2-L3-L4-，其中
L1为s1为2至8的整数；
L2为化学键；
L3为四肽残基；
L4为-NR5(CR6R7)t-，R5、R6或R7相同或不同，且各自独立地为氢原子或C1-6烷基，t为1或2；
其中所述的L1端与Pc相连，L4端与Y相连；
Pc为如权利要求1所述的抗CEA抗体或其抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的抗体药物偶联物，其中n为2至8。
14.根据权利要求12所述的抗体药物偶联物，其中n为4至6。
15.根据权利要求12所述的抗体药物偶联物，其中Y选自：
其中Y的O端与接头单元L相连。
16.根据权利要求12所述的抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物为通式(Pc-L-D)所示的抗体药物偶联物：
其中：
Pc为如权利要求1所述的抗CEA抗体或其抗原结合片段；
n为1至10；
其中接头单元-L-为-L1-L2-L3-L4-，其中
L1为s1为2至8的整数；
L2为化学键；
L3为四肽残基；
L4为-NR5(CR6R7)t-，R5、R6或R7相同或不同，且各自独立地为氢原子或C1-6烷基，t为1或2；
其中所述的L1端与Pc相连。
17.根据权利要求12所述的抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物选自：
其中Pc和n如权利要求12中所定义。
18.根据权利要求12所述的抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物如下所示：
其中，n为1至10；
Hu63-13包含序列如SEQ ID NO:80所示的重链，和序列如SEQ ID NO：81所示的轻链。
19.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至18中任一项所述的抗体药物偶联物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体药物偶联物或根据权利要求19所述的药物组合物在制备用于治疗CEA介导的疾病或病症的药物中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述CEA介导的疾病或病症为CEA高表达癌症。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体药物偶联物或根据权利要求19所述的药物组合物在制备治疗和/或预防肿瘤和癌症的药物中的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述肿瘤和癌症选自头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝胆癌、胰腺癌、胃肠道癌、肾癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、骨癌、骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、库肯勃氏瘤、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌。
24.根据权利要求23所述的用途，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤；所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌；所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病；所述胃肠道癌选自胃癌、肠癌、结肠直肠癌；所述的肾癌为透明细胞肾细胞癌；所述的皮肤癌为黑色素瘤；所述的骨癌为软骨肉瘤和尤因氏肉瘤；所述的骨髓瘤为多发性骨髓瘤；所述的咽喉癌为鼻咽癌；所述的脑癌选自神经胶质瘤和多形性成胶质细胞瘤。
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