TW202342106A - 環境應答性遮蔽抗體及其利用 - Google Patents

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Abstract

提供一種具有比歷來的遮蔽抗體優異之性能的遮蔽抗體。 一種會與標的抗原結合的分子，其包含下述[a]部分、[b]部分及[c]部分而成： [a]部分為會與標的抗原結合之部分； [b]部分為辨識[a]部分所包含的標的抗原結合部位之第1肽； [c]部分為由包含下述胺基酸的胺基酸序列所構成之第2肽，該胺基酸係在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷。

Description

環境應答性遮蔽抗體及其利用
本發明係關於藉由置於特定環境而被活化的遮蔽抗體。
抗體對抗原即標的分子的辨識特異性和結合活性非常高，且低分子化合物、肽、蛋白質等各種各樣的分子可成為抗原。又，抗體醫藥品係生產性和在活體內的穩定性亦高，正以癌症、免疫疾病、感染症等各式各樣的疾病為對象而進行開發中。在近年，作為藥效更優異的抗體醫藥品，正進行使有細胞毒性的藥劑與抗體結合而成的抗體藥物結合物(Antibody Drug Conjugate(ADC))、和藉由雙特異性抗體將標的細胞與細胞毒性T細胞交聯而可攻擊標的細胞的T細胞接合(T-Cell Engaging(TCE))等之研究開發。在ADC和TCE等顯示強力的抗腫瘤活性的另一方面，標的分子於正常組織表現的情形，透過標的分子之對正常組織的毒性係成為課題(非專利文獻1)。
已知一種作為修飾抗體之遮蔽抗體，其係利用腫瘤微小環境的性質(腫瘤組織中的蛋白酶活性亢進等)，而會在腫瘤組織特異性地作用。遮蔽抗體由於在正常組織中的結合活性被抑制，因此透過標的分子之對正常組織的毒性低，被期待作為安全性高的抗體醫藥品(非專利文獻2)。遮蔽抗體係由抗體本體、阻礙抗體結合的遮蔽結構域、連接抗體與遮蔽結構域且能夠藉由蛋白酶而切斷的切斷連接子所構成(專利文獻1)。就遮蔽結構域而言，除了會與抗體之互補決定區(CDR：Complemetarity determining region)結合的模擬表位肽(mimotope peptide)之外，已知有與抗體並不直接相互作用的捲曲螺旋(coiled-coil)結構域等(非專利文獻3)。又，在切斷連接子，係搭載基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease (MMP))、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化物(urokinase-type plasminogen activator (uPA))等在腫瘤組織中活性亢進之細胞外蛋白酶的基質，而使腫瘤組織選擇性的抗體之活化成為可能(專利文獻2)。例如，在將抗EGFR抗體(西妥昔單抗(Cetuximab))遮蔽化的先前研究中，已有報告腫瘤組織中的遮蔽抗體之活化、對有EGFR表現的皮膚的暴露量降低、血中半衰期的延長、安全性的改善等(非專利文獻4)。除此之外，遮蔽化技術已被應用在雙特異性抗體和細胞介素(cytokine)等各種各樣的生物製劑分子(專利文獻3、4)。
就腫瘤微小環境的特徵而言，除了亢進的蛋白酶活性以外，亦已知細胞外pH(pHe)的酸性化亦為。腫瘤組織的酸性化的原因被認為是依存於癌細胞的糖代謝系統之乳酸的累積所致，對於質子向細胞外的釋放而言，已報告與Na +/H +交換器(Na +/H +exchanger(NHE))、單羧酸轉運蛋白、H +-ATPase等各種轉運蛋白有關。腫瘤組織的pHe降低係與分泌的溶酶體蛋白酶之活化有關，除了有助於癌細胞的轉移和浸潤過程外，亦對癌細胞的耐藥性和免疫逃脫等有影響(非專利文獻5)。
作為利用腫瘤微小環境的pHe降低而使腫瘤組織特異性提升的抗體技術，已知有對抗體的CDR區域導入變異並使在低pH環境下對抗原的結合活性提升的手法(專利文獻5、非專利文獻6)、具有會pH依存性地與抗體結合之遮蔽結構域的遮蔽抗體技術(專利文獻6)。於後者已報告一種遮蔽肽之取得例，該遮蔽肽對於抗CTLA-4抗體，在中性pH條件下會結合，但在酸性pH條件下並不結合。 [先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：國際公開WO2009/025846號 專利文獻2：國際公開WO2010/081173號 專利文獻3：國際公開WO2016/014974號 專利文獻4：國際公開WO2020/069398號 專利文獻5：國際公開WO2010/104821號 專利文獻6：國際公開WO2018/218076號 [非專利文獻]
非專利文獻1：Nature Review Drug Discovery.；17：197-223(2018). 非專利文獻2：Expert Opin Biol Ther.；14(8)：1049-53(2014). 非專利文獻3：ACS Cent. Sci.；7：724-38(2021). 非專利文獻4：Sci Transl Med.；5(207)：1-10(2013). 非專利文獻5：Cancer Cell International.；13(89)：1-8(2013). 非專利文獻6：Proc. Natl. Acd. Sci.；118(9)：1-10(2021).
[發明欲解決之課題]
提供具有比歷來的遮蔽抗體優異之性能的遮蔽抗體。 [用以解決課題之手段]
本發明人等為了解決上述問題而進行深入研究，著眼於腫瘤環境的pHe酸性化，藉由改良連結遮蔽抗體之遮蔽肽與抗體的連接子(linker)，而完成本發明。
即，本發明包含以下之發明。 [1]一種會與標的抗原結合的分子，其包含下述[a]部分、[b]部分及[c]部分而成： [a]部分為會與標的抗原結合之部分； [b]部分為辨識[a]部分所包含的標的抗原結合部位之第1肽； [c]部分為由包含下述胺基酸的胺基酸序列所構成之第2肽，該胺基酸係在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷。 [2]如[1]之分子，其特徵為與中性條件下比較，於酸性條件下，對標的抗原具有更高的結合親和性。 [3]如[1]或[2]之分子，其中[a]部分、[b]部分及[c]部分為各自包含1個或2個以上。 [4]如[1]～[3]中任一項之分子，其中[a]部分、[b]部分及[c]部分為各自包含1個或2個以上，且[a]部分、[b]部分及[c]部分每一者的數目彼此相同。 [5]如[1]或[2]之分子，其中[a]部分、[b]部分及[c]部分為各自包含2個。 [6]如[1]～[5]中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含4個以上之在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，且第2肽的pI值大於6.4。 [7]如[1]～[6]中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含4個以上之在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，且第2肽的pI值為6.8以上。 [8]如[1]～[7]中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含4個以上之在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，且第2肽的pI值為7.2以上。 [9]如[1]～[8]中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含4個以上之在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，且第2肽的pI值為7.6以上。 [10]如[1]～[9]中任一項之分子，其中第2肽由不包含pH為酸性條件時具有負電荷的胺基酸之胺基酸序列所構成。 [11]如[1]～[10]中任一項之分子，其中第2肽由不包含天冬胺酸及/或麩胺酸之胺基酸序列所構成。 [12]如[1]～[11]中任一項之分子，其中第2肽由具有以下之(1)及(2)的結構的胺基酸序列所構成： (1)包含1個以上之 (a)由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列、或 (b)在(a)之胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸或離胺酸插入或附加而成的胺基酸序列(將(a)之胺基酸序列及(b)之胺基酸序列稱為鹼性胺基酸團簇)；且 (2)包含共計4個以上之前述在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。 [13]如[1]～[12]中任一項之分子，其中第2肽由具有以下之(1)及(2)的結構之胺基酸序列所構成： (1)包含1個以上之在由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸插入或附加而成的胺基酸序列；且 (2)包含共計4個以上之前述在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。 [14]如[1]～[13]中任一項之分子，其中第2肽由具有以下之(1)及(2)的結構之胺基酸序列所構成： (1)包含1個之在由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸插入或附加而成的胺基酸序列；且 (2)包含共計4個以上之前述在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。 [15]如[1]～[14]中任一項之分子，其中第2肽由具有以下之(1)及(2)的結構之胺基酸序列所構成： (1)包含1個之以RHHH表示的胺基酸序列；且 (2)包含共計4個以上之前述在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。 [16]如[1]～[12]中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列含有1個以上之連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸，且包含共計4個以上之該在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。 [17]如[1]～[11]中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所表示的結構所構成，該胺基酸序列包含每隔1個胺基酸而具有在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之胺基酸序列。 [18]如[12]～[17]中任一項之分子，其中鹼性官能基之pKa為5.0～7.0。 [19]如[12]～[18]中任一項之分子，其中鹼性官能基之pKa為5.5～6.5。 [20]如[12]～[19]中任一項之分子，其中在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸為天然胺基酸。 [21]如[12]～[19]中任一項之分子，其中在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸為非天然胺基酸。 [22]如[12]～[20]中任一項之分子，其中在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸為組胺酸。 [23]如[1]～[22]中任一項之分子，其中第2肽由包含1～4個之鹼性胺基酸團簇的胺基酸序列所構成。 [24]如[1]～[23]中任一項之分子，其中第2肽由10～60個之胺基酸所構成。 [25]如[1]～[24]中任一項之分子，其中第2肽由12～50個之胺基酸所構成。 [26]如[1]～[25]中任一項之分子，其中第2肽由15～40個之胺基酸所構成。 [27]如[1]～[26]中任一項之分子，其中第2肽由20～35個之胺基酸所構成。 [28]如[1]～[16]及[18]～[27]中任一項之分子，其中第2肽包含序列識別號49至53、55、59至61、65、66、75至81(圖54及64)之任一者所示的胺基酸序列。 [29]如[17]～[27]中任一項之分子，其中第2肽包含序列識別號54(圖54)所示的胺基酸序列。 [30]如[1]～[29]中任一項之分子，其EC 50比為3以上。 [31]如[1]～[30]中任一項之分子，其EC 50比為10以上。 [32]如[1]～[31]中任一項之分子，其EC 50比為30以上。 [33]如[1]～[32]中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含10個以下之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。 [34]如[1]～[33]中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列包含2個以上之鹼性胺基酸團簇，有1個鹼性胺基酸團簇位於該胺基酸序列之胺基末端或羧基末端，且其他之任一個鹼性胺基酸團簇皆未位於該胺基酸序列之胺基末端或羧基末端。 [35]如[1]～[33]中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列包含2個以上之鹼性胺基酸團簇，有1個鹼性胺基酸團簇位於該胺基酸序列之胺基末端，且有其他之1個鹼性胺基酸團簇位於羧基末端。 [36]如[1]～[33]中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列所包含的任一個鹼性胺基酸團簇皆未位於該胺基酸序列之胺基末端且未位於羧基末端。 [37]如[1]～[34]或[36]中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列包含會被細胞內及/或細胞外之蛋白酶切斷的胺基酸序列及包含鹼性胺基酸團簇的胺基酸序列，該胺基酸序列為： (1)從胺基末端向羧基末端，以包含鹼性胺基酸團簇的胺基酸序列、會被細胞內及/或細胞外之蛋白酶切斷的胺基酸序列的順序連結而成；或 (2)從羧基末端向胺基末端，以會被細胞內及/或細胞外之蛋白酶切斷的胺基酸序列、包含鹼性胺基酸團簇的胺基酸序列的順序連結而成。 [38]如[12]～[37]中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列所包含的在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸數，為該胺基酸序列所包含的總胺基酸數之5%以上30%以下。 [39]如[1]～[38]中任一項之分子，其以第1肽、第2肽、會與標的抗原結合之部分的順序連結而成。 [40]如[1]～[39]中任一項之分子，其中會與標的抗原結合之部分，為由第1肽及第2肽所不包含的胺基酸序列所構成的多肽。 [41]如[1]～[40]中任一項之分子，其由多肽所構成。 [42]如[41]之分子，其從胺基末端向羧基末端，以第1肽、第2肽、會與標的抗原結合之部分結合而成。 [43]如[1]～[42]中任一項之分子，其中選自由第1肽、第2肽及會與標的抗原結合之部分所組成的群組之任1個，係與其他2個之中的1個或兩方透過連接子或間隔子(spacer)結合。 [44]如[1]～[43]中任一項之分子，其中酸性條件為pH6.5以下。 [45]如[1]～[44]中任一項之分子，其中酸性條件為pH6.0以下。 [46]如[1]～[45]中任一項之分子，其中酸性條件為pH5.5以下。 [47]如[1]～[46]中任一項之分子，其中標的抗原為存在於腫瘤組織、胞內體或溶酶體的抗原。 [48]如[1]～[47]中任一項之分子，其係在會與標的抗原結合之部分有為其他部分之[d]部分結合而成，且[d]部分不包含第1肽及第2肽。 [49]如[48]之分子，其中[d]部分為選自由下述所組成的群組之1個或2個以上：非會與標的抗原結合之部分的抗體或其抗原結合片段、包含第1肽及第2肽所不包含的胺基酸序列之肽、細胞介素、毒素、放射性同位素、標識分子、光敏感性物質、免疫賦活物質、抗腫瘤性化合物、藥物、有效負載(payload)以及聚合物。 [50]如[49]之分子，其中抗腫瘤性化合物為喜樹鹼(camptothecin)衍生物或吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)衍生物，較佳為喜樹鹼衍生物係N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]-2-羥基乙醯胺。 [51]如[49]之分子，其中免疫賦活物質為環狀二核苷酸衍生物。 [52]如[48]～[51]中任一項之分子，其由多肽所構成、或由[d]部分及多肽所構成。 [53]如[1]～[52]中任一項之分子，其中第1肽係藉由包含下述步驟(i)～(iii)的方法而獲得： (i)使包含芳香族性胺基酸和Pro的重複序列之肽庫與如[1]之會與標的抗原結合之部分接觸的步驟； (ii)將與該會與標的抗原結合之部分結合的肽回收的步驟；及 (iii)將獲得的肽藉由重組、化學合成或肽合成而調製的步驟。 [54]一種如[1]～[52]中任一項之分子之製造方法，其包含將包含第1肽所包含的胺基酸序列及/或第2肽所包含的胺基酸序列而成的肽藉由重組、活體外轉譯、化學合成或肽合成而調製的步驟。 [55]一種會與標的抗原結合的分子，其係藉由如[54]之方法而獲得。 [56]一種如[41]、[42]或[52]中任一項之分子之製造方法，其包含下述(iv)記載之步驟。 (iv)將包含核苷酸序列而成的多核苷酸導入細胞，培養該細胞，自該培養物回收會與該標的抗原結合之多肽的步驟，其中該核苷酸序列編碼會與標的抗原結合之部分所包含的胺基酸序列、以及可選擇地(optionally)編碼第1肽所包含的胺基酸序列及/或第2肽所包含的胺基酸序列。 [57]一種會與標的抗原結合的分子，其係藉由如[56]之方法而獲得。 [58]一種醫藥組成物，其包含如[1]～[53]、[55]及[57]中任一項之分子、其鹽或彼等之水合物。 [59]如[58]之醫藥組成物，其為抗癌劑。 [60]如[58]或[59]之醫藥組成物，其係藉由使會與標的抗原結合的分子之中性pH條件下的抗原結合活性比酸性pH條件下的抗原結合活性弱，而與第2肽不包含下述胺基酸的分子比較，降低了會與標的抗原結合的分子對於被投予者之毒性，該胺基酸係在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷。 [61]如[58]或[59]之醫藥組成物，其係藉由使會與標的抗原結合的分子之中性pH條件下的抗原結合活性比酸性pH條件下的抗原結合活性弱，而與第2肽不包含下述胺基酸的分子比較，提升了會與標的抗原結合的分子對於被投予者之血中濃度，該胺基酸係在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷。 [62]一種檢查藥、診斷藥或試藥，其包含如[1]～[53]、[55]及[57]中任一項之分子或如[58]之醫藥組成物。 [63]一種多核苷酸，其包含編碼如[41]或[52]之分子之胺基酸序列的核苷酸序列。 [64]一種載體，其包含如[63]之多核苷酸。 [65]一種細胞，其包含如[63]之多核苷酸或者是如[64]之載體、或會產生如[41]或[52]之分子。
再者，本發明亦包含以下之發明。 [i]一種具有pH應答性的肽連接子，其包含如[1]之第2肽之胺基酸序列。 [ii]如[i]之肽連接子，其包含序列識別號49至55、59至61、65、66、75至81(圖54及64)之任一者所示的胺基酸序列。 [iii]一種多核苷酸，其包含編碼如[i]或[ii]之肽連接子之胺基酸序列的核苷酸序列。 [iv]一種載體，其包含如[iii]之多核苷酸。 [v]一種細胞，其包含如[iii]之多核苷酸或者是如[iv]之載體、或會產生如[i]或[ii]之肽連接子。
本說明書包含成為本案優先權之基礎的日本國專利申請案第2022-19125號及日本國專利申請案第2022-196524號的揭示內容。
[用以實施發明的形態]
以下，詳細地説明本發明。 1.定義 於本發明中所謂「DXd」，係意指「N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]-2-羥基乙醯胺」。
於本發明中所謂「PBD」，係意指「吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)」。
於本發明中所謂「模擬表位」，係意指「會與抗體之互補決定區(CDR：Complemetarity determining region)結合的肽」。模擬表位之胺基酸序列具有與抗體所辨識的抗原之胺基酸序列(表位(epitope))未必一致的特徵(Molecular Immunology.；23(7)：709-715(1986))。
於本發明中所謂「胺基酸」，係指天然胺基酸及非天然胺基酸。
天然胺基酸為20種共同的胺基酸、吡咯啶及硒代半胱胺酸。上述20種共同胺基酸為丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。
非天然胺基酸，係指非為20種共同胺基酸、吡咯啶或硒代半胱胺酸之任一種的胺基酸。可與非天然胺基酸作為同義語使用的其他用語為「非天然編碼的胺基酸」、「非天然型胺基酸」、「非天然存在的胺基酸」等。非天然胺基酸中包含藉由天然胺基酸的修飾而天然存在但於藉由轉譯複合體而成長的多肽鏈中彼等本身並不被併入之胺基酸。再者，非天然胺基酸係非天然存在而可合成獲得、或包含可藉由天然胺基酸的修飾而獲得之胺基酸，但未限定於此。
於本發明中，「抗體」係以具有恆定區與可變區的免疫球蛋白的意義使用。抗體並不特別限定為天然的、或為藉由部分或是完全合成而製造的免疫球蛋白。
基本的4鏈抗體之結構，係由2個相同的輕鏈(L鏈)、及2個相同的重鏈(H鏈)所構成。輕鏈係藉由1個共價雙硫鍵而與重鏈結合。2個重鏈係因應重鏈的同型(isotype)，藉由1個或複數個雙硫鍵而彼此結合。各自的輕鏈、重鏈具有持有規律之間隔的鏈內雙硫鍵。於重鏈與輕鏈，係存有胺基酸序列顯示非常高類似性的恆定區及胺基酸序列之類似性低的可變區。輕鏈係於胺基末端具有後接有恆定區(CL)的可變區(VL)。重鏈係於胺基末端具有後接有3個恆定區(CH1/CH2/CH3)的可變區(VH)。VL與VH成對，CL與重鏈的第一恆定區(CH1)並排。VL與VH成對，而形成單一之抗原結合部位。
就本發明之抗體的恆定區而言，並未特別限定，但就用以治療或預防人類之疾病的本發明之抗體而言，較佳為使用人類抗體之恆定區。就人類抗體之重鏈恆定區而言，可列舉例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等。就人類抗體之輕鏈恆定區而言，可列舉例如Cκ、Cλ等。
Fab包含重鏈之VH與後接於其的CH1、及輕鏈之VL與後接於其的CL。VH與VL包含互補決定區(CDR)。VH與CH1及VL與CL之間可存有連接子或連結部。
Fc(亦稱為Fc區域)為重鏈之恆定區的羧基末端區域，包含CH2與CH3，且為二聚體。本發明之Fc可為天然(野生型)的序列之Fc，亦可為於天然的序列有變異發生的變異型之Fc(稱為「變異型Fc」)，於本發明之多重特異性分子及雙特異性分子中，較佳的Fc區域為變異型Fc，更佳為可形成異二聚體的1組之Fc。就1組之Fc而言，可列舉後述之第1多肽所包含的Fc(i)及第2多肽所包含的Fc(ii)之組合，若1組之Fc可會合(形成異二聚體)，則未限定於彼等。
就變異型Fc而言，可例示以下，但未限定於此等：WO2013/063702號中揭示者，其係具有提升的安定性之異多聚體所包含的變異Fc區域(包含異二聚體Fc區域)；WO96/27011號中揭示之異種多聚體所包含的Fc，其包含從具有「突起」及「空隙」的IgG抗體所衍生的免疫球蛋白之CH3區域；WO2009/089004號中揭示之Fc，其包含藉由將1以上之胺基酸殘基取代為帶電胺基酸而靜電上有利之異二聚體所包含的CH3結構域；WO2014/110601號中揭示者，其係使用立體結構變異及/或pI(等電點)變異而成的異種二聚體所包含的異種二聚體Fc區域；WO2010/151792號中揭示之異二聚體的Fc，其包含含有使對蛋白質A的結合消失或減少之修飾的CH3結構域。
可變區由被稱為高度變異區(HVR：hypervariable region)之具有極度可變性的區域、與藉由該區域而被分離的被稱為框架區(FR：Framework region)之比較不變的區域所構成。天然的重鏈與輕鏈的可變區包含藉由3個高度變異區而連接的4個FR，且各鏈的高度變異區藉由FR而與其他之鏈的高度變異區一起被保持極為靠近，有助於抗體之抗原結合部位的形成
已知抗體分子的重鏈及輕鏈中各自有3處的互補決定區(CDR：Complemetarity determining region)。互補決定區亦稱為高度變異區，係於抗體的重鏈及輕鏈之可變區內，為一級結構之變異性特別高的部位，於重鏈及輕鏈的多肽鏈之一級結構上通常各自分離在3個部位。於本發明中，針對抗體之互補決定區，將重鏈的互補決定區從重鏈胺基酸序列之胺基末端側起標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈的互補決定區從輕鏈胺基酸序列之胺基末端側起標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位在立體結構之上互相鄰接，決定對於要結合之抗原的特異性
於本發明中，CDR之位置及長度係藉由IMGT的定義(Developmental and Comparative Immunology 27 (2003)55-77)而決定。
FR為可變區之CDR以外的部分。可變區一般具有FR1、FR2、FR3、FR4之4個FR。
重鏈以及輕鏈所包含的CDR與FR，係從胺基末端向羧基末端，各自以FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4、以及FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的順序被配置。
CDR與FR的位置亦可藉由該技術領域中周知之各式各樣的定義，例如於IMGT以外，亦可由Kabat、Chothia、AbM、contact等之定義而決定。
於本發明中，所謂抗體所結合的「部位」、即抗體所辨識的「部位」，係意指抗體所結合或辨識之抗原上的部分肽或部分高次結構。
於本發明中，亦將該部位稱為表位、抗體的結合部位。於本發明中，所謂「變異抗體」，係意指具有於原本抗體具有的胺基酸序列中有胺基酸取代、缺失、附加(附加中包含插入)(以下，總稱為「變異」)而成的胺基酸序列，且會與作為本發明之標的之抗原結合的多肽。該變異抗體中的變異胺基酸的數目為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40或50個以下。該變異抗體亦包含在本發明之「抗體」中。
於本發明中，所謂「1或數個」中的「數個」，係指2～10個。
於本發明中，「分子」為包含上述之抗體、抗體之抗原結合片段的分子，進一步包含由抗體或源自該等之複數個抗原結合片段而形成的多重特異性之分子。
於本發明中所謂「A搭載B」係指「A包含B」或「B結合、附加或融合於A」。例如，「搭載基質的抗體」可解釋為「包含基質的抗體」、「有基質結合的抗體」、「有基質附加的抗體」或「有基質融合的抗體」。
2.會與標的抗原結合的分子 本發明為會與標的抗原結合的分子，係會在特定環境下與前述標的抗原特異性結合的分子。
所謂特定環境，係指特定組織或細胞內小器官中的環境，可列舉例如癌微小環境、胞內體中的環境或溶酶體中的環境。
所謂癌微小環境，係指癌組織內的環境，例如酸性pH的環境或有蛋白酶存在的環境。正常組織中的pH為中性條件，例如pH7.0～7.5，相對於此，癌組織內的pH為7.0以下，較佳為6.5以下，進一步較佳為6.0以下。
本發明之會與標的抗原結合的分子由於在特定環境下獲得應答性，而有時稱為環境應答性分子，分子為抗體的情形，稱為環境應答性遮蔽抗體。
本發明之會與標的抗原結合的分子包含會與標的抗原結合之部分([a]部分)、辨識該部分所包含的該標的抗原結合部位之第1肽([b]部分)、及包含下述胺基酸序列之第2肽([c]部分)，且較佳為以彼等直接或間接連結的狀態下存在，其中該胺基酸序列包含在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸。此處，所謂「間接連結的狀態」，係指透過連接子等而連結的狀態。會與標的抗原結合之部分較佳為多肽。該部分藉由抗原抗體反應或蛋白質(例如，受體)-配體結合，而與標的抗原結合。會與標的抗原結合之部分更佳為藉由抗原抗體反應而與標的抗原結合的抗體或抗體之抗原結合片段。第1肽藉由與會與標的抗原結合之部分中之標的抗原結合部位結合，而遮蔽該標的抗原結合部位。此結果，該標的抗原結合部位無法與標的抗原結合或變得難以結合。
本發明之會與標的抗原結合的分子所包含的[a]部分、[b]部分及[c]部分的數目未特別限定，但較佳為[a]部分、[b]部分及[c]部分各自包含1個或2個以上，更佳為[a]部分、[b]部分及[c]部分各自包含1個或2個以上且[a]部分、[b]部分及[c]部分每一者的數目彼此相同，進一步較佳為[a]部分、[b]部分及[c]部分各自包含2個。在圖1中，以一例呈示作為本發明之概念之應答pH變化而被活化的遮蔽抗體之形式，但本發明並未限定於此。係會與標的抗原結合之部分為2價之抗體(IgG)，且第2肽為包含顯示pH應答性的組胺酸殘基之團簇(組胺酸團簇(His團簇)，圖1的黑色實心四方形部分)之肽的分子，圖1之以網格圖案表示的第1肽係與抗體之與抗原的結合部位結合並遮蔽該部位。第2肽將第1肽和會與標的抗原結合之部分連結，因顯示pH應答性，所以亦稱為pH應答性連接子。茲認為第1肽雖可辨識標的抗原結合部位並結合，但在第2肽被切斷而第1肽單獨存在之情形，會依物理化學的條件，而結合、解離，因此無法永續地結合。例如，於本發明之會與標的抗原結合的分子中，由於第1肽透過第2肽而與會與標的抗原結合之部分結合，因此會與標的抗原結合的分子係採取如第1肽之位置位於會與標的抗原結合之部分所包含的該標的抗原結合部位的附近之構形，可以假定第1肽係只要分子之構形不變化，則在平衡條件下採取標的抗原結合部位的大部分被遮蔽等的作用機制(圖1之左)，但該機制並未限定於此。藉由酸性pH條件，而第2肽之His團簇內部的組胺酸殘基帶正電，且藉由組胺酸殘基彼此的排斥力而誘發了為連接子的第2肽之結構變化，第1肽從會與標的抗原結合的分子解離，第1肽就無法與標的抗原結合部位持續結合(圖1之右，圖中之「+」表示帶正電)，其結果認為，會與標的抗原結合之部分所包含的該標的抗原結合部位變成可與標的抗原結合，與第2肽之結構變化被誘發前比較，而變成對於該標的抗原具有更高的結合親和性。即，本發明之會與標的抗原結合的分子係變得在酸性pH條件下比起在中性pH條件下，可對於標的抗原以更高的親和性結合。此種組胺酸殘基彼此的排斥力所致的第2肽之結構變化，係藉由pH變化而產生的可逆的現象。因此認為，會與標的抗原結合的分子因從酸性pH條件下移行至中性pH條件下，而誘發與從中性pH條件下移行至酸性pH條件下之際產生的結構變化相反的結構變化，且因第1肽與標的抗原結合部位結合，而會與標的抗原結合的分子對於標的抗原的親和性降低。可推測，本發明之會與標的抗原結合的分子主要藉由如上述的機制而發揮其效果，但該機制並未限定於此，亦可藉由其他機制、或與其他機制合併，而發揮其效果。
於本發明中，所稱「在酸性pH條件下比起在中性pH條件下，對於標的抗原以更高的親和性結合」之表現，亦可表現為使會與標的抗原結合的分子在中性pH條件下之對標的抗原的親和性，比酸性pH條件下之對標的抗原的親和性更弱。即，於本發明中，若使會與標的抗原結合的分子之酸性pH條件下的對標的抗原的親和性與中性pH條件下的對標的抗原的親和性之差增大即可(例如，若如後述地使EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)之值增大即可)。為了使會與標的抗原結合的分子之酸性pH條件下的對標的抗原的親和性與中性pH條件下的對標的抗原的親和性之差增大，例如，可提高酸性pH條件下的對標的抗原的親和性，亦可降低中性pH條件下的對標的抗原的親和性，或亦可進行其兩方。
於本發明中，其構成係藉由在第2肽中導入鹼性胺基酸團簇，而使連接子部分具有pH應答性。雖亦可考慮使遮蔽肽部分(於本發明中，第1肽)具有pH應答性之構成，但在設為此種構成之情形，有對每個會與標的抗原結合之部分取得不同的序列之pH應答性肽之必要。另一方面，本發明之構成中的具有第2肽之共同序列基序(鹼性胺基酸團簇)的連接子部分，即使於不同之會與標的抗原結合之部分亦可通用性地使用，有所謂不需要對與每個會與標的抗原結合之部分獲得不同的序列之pH應答性肽的有利效果。
會與標的抗原結合的分子，係在酸性pH條件下比起在中性pH條件下，對於標的抗原以更高的親和性結合，其藉此而防止會與標的抗原結合的分子在正常組織中與抗原結合，且降低其毒性。所謂「降低毒性」，係指降低會與標的抗原結合的分子被投予至人類、小鼠、大鼠、猴、兔子、狗等動物時的所期待之藥效以外的不希望的效果。例如，於毒性係包含藥劑投予後之死亡・瀕死、體重減少、臟器毒性(皮膚、肝臟等)等。是否「毒性降低」，係能夠使用在會與標的抗原結合的分子投予後的被驗者之體重測定、病理數據之確認等所屬技術領域中具通常知識者周知的方法來進行判斷。
會與標的抗原結合的分子，係在酸性pH條件下比起在中性pH條件下，對於標的抗原以更高的親和性結合，推測其可藉此而抑制對在正常組織中表現之抗原的結合，且使其血中濃度提升。所謂「使血中濃度提升」，係包含會與標的抗原結合的分子被投予至人類、小鼠、大鼠、猴、兔子、狗等動物時，血中濃度到達最大值時的濃度(Cmax)變高、到從血中消失為止的時間被延長。在血中之會與標的抗原結合的分子，可為會與標的抗原結合之部分被遮蔽的狀態抑或是未遮蔽的狀態，只要可在特定環境中作為會與標的抗原結合的分子發揮作用即可。是否「血中濃度提升」，係例如能夠藉由會與標的抗原結合的分子被投予後至血中濃度達到最大值時之濃度(Cmax)是否變高、或會與標的抗原結合的分子被投予後至從血中消失為止的時間是否被延長而判斷，而彼等係可使用所屬技術領域中具通常知識者周知之方法來測定在會與標的抗原結合的分子投予後之血中藥物濃度、或會與標的抗原結合的分子之血漿中半減期、平均血漿中滞留時間、血漿中廓清率等參數。
於本發明中，只要酸性pH下的對標的抗原的親和性比中性pH下的對標的抗原的親和性更強，則酸性pH下的對標的抗原的親和性與中性pH下的對標的抗原的親和性之差並未特別限定，但例如，EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)為大者為較佳實施態樣。此處，所謂EC 50，係50%效果濃度或半數效果濃度，指藥物和抗體等分子從最低值至顯示最大反應之50%的濃度。所謂EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)，係中性pH條件下的會與標的抗原結合的分子之EC 50與酸性pH條件下的會與標的抗原結合的分子之EC 50的比。因此，會與標的抗原結合的分子之EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)為越大之值，即酸性pH條件下的EC 50比中性pH條件下的EC 50之值為越是更小之值，則該分子之酸性pH下的對標的抗原的親和性與中性pH相比就越高。會與標的抗原結合的分子之EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)為越小之值，即酸性pH條件下的EC 50比中性pH條件下的EC 50為越是更大值，則該分子之酸性pH下的對標的抗原的親和性與中性pH相比就越低。會與標的抗原結合的分子之EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)之值較佳為3以上，更佳為EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)之值為10以上，進一步較佳為EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)之值為30以上。EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)之值的上限未特別限定，只要於所屬技術領域中具通常知識者之技術內可製作，則可為100、400、1000、10000等之任意之值。即，會與標的抗原結合的分子之EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)之值較佳為3以上100以下、3以上400以下、3以上1000以下或3以上10000以下，更佳為10以上100以下、10以上400以下、10以上1000以下或10以上10000以下，進一步較佳為30以上100以下、30以上400以下、30以上1000以下或30以上10000以下。
在抗原為可溶型抗原的情形，可使用KD(解離常數)作為對標的抗原的親和性之值，但抗原為膜型抗原的情形，能夠使用表觀KD(Apparent dissociation constant：表觀解離常數)。KD(解離常數)及表觀KD(表觀解離常數)能夠以所屬技術領域中具通常知識者周知之方法進行測定，例如能夠使用Biacore(GE healthcare)、ELISA(酵素免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay))、FACS等。
抗體 就本發明之抗體而言，可列舉源自非人類動物的抗體(非人類動物抗體)、人類抗體、嵌合化抗體(亦稱為「嵌合抗體」)、人類化抗體等，較佳可使用人類抗體或人類化抗體。於本發明之抗體的範圍中，亦包含抗體之變異體(後述之「變異抗體」)，例如於人類抗體之範圍中，亦包含人類變異抗體，於人類化抗體之範圍中，亦包含人類化變異抗體。
就非人類動物抗體而言，可列舉哺乳類、鳥類等之源自脊椎動物的抗體等。就源自哺乳類的抗體而言，可列舉小鼠抗體、大鼠抗體等之源自齧齒類、或駱駝的抗體等。就源自鳥類的抗體而言，可列舉雞抗體等。
就嵌合化抗體而言，可列舉將源自非人類動物抗體的可變區與人類抗體(人類免疫球蛋白)恆定區結合而成的抗體等，但未限定於此等。
就人類化抗體而言，可列舉將非人類動物抗體之可變區中的CDR移植至人類抗體(人類免疫球蛋白的可變區)而成者、除了CDR以外亦將非人類動物抗體的框架區的序列一部分移植至人類抗體而成者、將源自彼等之任一非人類動物抗體的1個或2個以上之胺基酸以人類型之胺基酸取代而成者等，但未限定於此等。
抗體可利用周知的各種方法製作。作為周知的方法，可藉由使用融合瘤的方法或細胞免疫法等而製作，且藉由基因重組的手法而製作。又，亦已知悉取得源自從人類抗體庫選出的噬菌體展現(Phage display)之人類抗體的方法。例如，可使用噬菌體展現法，其係使人類抗體之可變區作為scFv表現於噬菌體表面，而選擇會與抗原結合的噬菌體。可藉由解析以會與抗原結合所選出的噬菌體的基因，來決定編碼會與抗原結合之人類抗體的可變區之DNA序列。若明白會與抗原結合之scFv的DNA序列，則可藉由製作具有該序列的表現載體且導入至適當的宿主使其表現，而取得人類抗體(WO1992/01047號、WO1992/20791號、WO1993/06213號、WO1993/11236號、WO1993/19172號、WO1995/01438號、WO1995/15388號、Annu.Rev.Immunol(1994)12，433-455)。又，人類抗體亦可藉由使用具有包含人類抗體之重鏈與輕鏈的基因之人類基因體DNA片段的人類抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka，K.et al.，Nature Genetics(1997)16，p.133-143，； Kuroiwa，Y.et.al.，Nuc.Acids Res.(1998)26，p.3447-3448；Yoshida， H.et.al.，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10，p.69-73(Kitagawa， Y.，Matuda，T.and Iijima，S.eds.)，Kluwer Academic Publishers，1999.；Tomizuka，K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，p.722-727等)而取得，但未限定於彼等。就人類治療用或預防用抗體之恆定區而言，較佳為使用人類抗體。就人類抗體之重鏈恆定區而言，可列舉例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等。就人類抗體之輕鏈恆定區而言，可列舉例如Cκ、Cλ等。
所謂抗體之抗原結合片段，係意指由重鏈可變區及輕鏈可變區所構成之具有與抗原的結合活性之抗體的部分片段。就抗體之抗原結合片段而言，可列舉例如Fab、F(ab’) 2、scFv、Fab’、Fv、單域抗體(sdAb)等之抗原結合片段，但未限定於此等。該抗體之抗原結合片段除了藉由以木瓜酵素、胃蛋白酶等之酵素處理抗體蛋白質的全長分子而獲得者，亦可為使用重組基因而於適當的宿主細胞中產生的重組蛋白質。
抗體或其結合片段之變異體 本發明之抗體或其抗原結合片段之變異體中，較佳為可進行對於蛋白質的分解或氧化之感受性的降低、生物活性和功能的維持、改善或降低和變化的抑制、抗原結合能力的改善或調節、或物理化學性質或功能性質的賦予等。已知蛋白質係位於其表面之特定胺基酸側鏈變化而該蛋白質的功能或活性會變化，此種例子中包含天冬醯胺酸側鏈的脱醯胺化、天冬胺酸側鏈的異構化等。為了防止如此的胺基酸側鏈的變化而取代為另外的胺基酸者，亦包含在本發明之變異體的範圍中。
作為本發明之變異體的例子，可列舉具有於抗體或其抗原結合片段所具有的胺基酸序列中經保存性胺基酸取代而成的胺基酸序列之抗體或其抗原結合片段。所謂保存性胺基酸取代，係指在與胺基酸側鏈有關連的胺基酸群內發生的取代。
適合的胺基酸群如下：酸性群=天冬胺酸、麩胺酸；鹼性群=離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性群=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及非帶電極性家族=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其他適合的胺基酸群如下：脂肪族羥基群=絲胺酸及蘇胺酸；含醯胺群=天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族群=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；以及芳香族群=苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。該變異抗體中的胺基酸取代較佳為在不使原本抗體所具有的抗原結合活性降低的範圍下進行。已知上述胺基酸之中，在其側鏈具有酸性官能基或鹼性官能基的胺基酸中的α位胺基及α位羧基以外之基的解離常數之負對數為精胺酸：12.48、天冬胺酸：3.65、半胱胺酸：8.18、麩胺酸：4.25、組胺酸：6.00、離胺酸：10.53、酪胺酸10.07(D.R.Lide，Handbook of Chemistry and Physics，72nd Edition，CRC Press，Boca Raton，FL，1991.)。
抗體或其結合片段之修飾體、複合體 本發明提供抗體或其結合片段之修飾體。所謂本發明之抗體或其結合片段之修飾體，意指對本發明之抗體或其結合片段實施化學性或生物學性的修飾而成者。化學性的修飾體中包含對胺基酸骨架之化學部分之鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈之化學修飾體等。生物學性的修飾體中包含：經轉譯後修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結之糖鏈附加、糖鏈重塑、胺基末端區域或羧基末端區域的加工、脱醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化)者；藉由使用原核生物宿主細胞進行表現，而甲硫胺酸殘基附加於胺基末端者等。又，為了可進行本發明之抗體或抗原之檢測或單離而經標識者，例如，酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含在該修飾物之定義中。此種本發明之抗體或其結合片段之修飾物，係有用於原本之本發明之抗體或其結合片段的安定性及血中滯留性的改善、抗原性的降低、該抗體或抗原的檢測或單離等。
就化學性修飾體所包含的化學部分而言，可例示聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇等之水溶性聚合物。
就生物學性的修飾物而言，可列舉藉由酵素處理或細胞處理等而實施修飾而成者、藉由基因重組而附加標籤等其他之肽而成的融合體、以及以表現內因性或外生性之糖鏈修飾酵素的細胞作為宿主所調製而成者等。
該修飾可在抗體或其結合片段中之任意的位置、或於所欲之位置實施，亦可於1個或2個以上之位置進行相同或2種以上之不同的修飾。
然而，此等之重鏈序列的缺失、或者重鏈或輕鏈序列的修飾，係對於抗體的抗原結合能力及效應子功能(effector function)(補體的活化、抗體依賴性細胞毒殺作用等)並不太造成影響，較佳為不顯著造成影響。
因此，本發明中亦包含受到該缺失或修飾的抗體。可列舉例如：於重鏈羧基末端有1或2個之胺基酸缺失的缺失體(Journal of Chromatography A；705；129-134(1995))；重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸的2個之胺基酸殘基缺失，且新位於羧基末端之脯胺酸殘基被醯胺化的該缺失體(Analytical Biochemistry，360：75-83(2007))；抗體的重鏈或輕鏈之胺基末端的麩醯胺酸或麩胺酸殘基經焦麩胺醯基化修飾的抗體(WO2013/147153號)等(將彼等統稱為「缺失體」)。惟，只要保有抗原結合能力及效應子功能，則本發明相關之抗體的重鏈及輕鏈之羧基末端的缺失體並未限定於上述之種類。本發明相關之抗體包含2條以上的鏈(例如重鏈)之情形，該2條以上的鏈(例如重鏈)，可為選自由全長及上述之缺失體所組成的群組之重鏈的任一種，亦可為組合任二種者。各缺失體之量比或分子數比會受到產生本發明相關之抗體的哺乳類培養細胞的種類及培養條件的影響，但就本發明相關之抗體的主成分而言，可列舉在2條重鏈之至少單方，較佳為在雙方，羧基末端的1個、2個或數個之胺基酸殘基缺失的情形。
再者，於本發明之抗體或其抗原結合片段(本發明之分子、多重特異的分子、雙特異的分子等中所包含者等)，即使有源自表現載體及/或訊息序列等的1個～數個之胺基酸被附加於胺基末端及/或羧基末端(且其一部分或全部如前述地經修飾)，亦若維持著所欲之抗原結合活性，則包含在本發明之抗體的修飾體或其抗原結合片段的修飾體之範圍中，且包含該種抗體或抗原結合片段的修飾體之分子亦包含在本發明之分子的範圍中。
於本發明中，「抗體或其結合片段」，係其意義亦包含「抗體或其抗原結合片段的修飾體」者。又，本發明之分子、多重特異的分子、雙特異的分子等所包含的「抗體或其抗原結合片段」，係其意義亦包含該「抗體或其抗原結合片段的修飾體」者。
又，能夠藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾(醣苷化、脫岩藻醣化(defucosylation)等)，而增強抗體依賴性細胞毒殺活性。就抗體之糖鏈修飾的調節技術而言，已知國際專利公開WO1999/54342號、WO2000/61739號、WO2002/31140號、WO2007/133855號等，但未限定於此等。
會與標的抗原結合之部分：[a]部分 所謂標的抗原，係指與特定疾病有關連的分子。所謂與特定疾病有關連的分子，係指於罹患成為該疾病的原因之抗原和分子的疾病之情形，會於在該疾病所出現的異常細胞中表現、或表現亢進的分子。係指藉由上述會與標的抗原結合之部分與該分子結合，而攻擊異常細胞，可減輕疾病的症狀或治療疾病的分子。前述異常細胞較佳為腫瘤細胞、間質細胞，標的抗原就腫瘤細胞而言，為腫瘤抗原，就間質細胞而言，為在間質細胞上表現的分子。間質細胞係與腫瘤細胞進行相互作用，在癌症的增殖及惡化扮演重要角色。腫瘤抗原係在腫瘤細胞上表現的抗原或在正常細胞癌化而成的腫瘤細胞上表現的抗原，藉由上述會與標的抗原結合之部分與腫瘤抗原結合，而抑制腫瘤細胞的增殖，傷害腫瘤細胞或使腫瘤細胞死亡(細胞凋亡或壞死)。
作為腫瘤抗原，可列舉CD98、TROP2、EGFR、GPRC5D、CD33、CD37、DR5、EPHA2、FGFR2、FGFR4、FOLR1、VEGF、CD20、CD22、CD70、PD-L1、CTLA-4、CD166、CD71、CD47、CDH6、CD147、間皮素(Mesothelin)、A33、CanAg、G250、MUC1、GPNMB、整合素(Integrin)、肌腱蛋白-C(Tenascin-C)、CLDN6、DLL-3、SLC44A4等。
又，作為抗上述腫瘤抗原的抗體，可列舉抗CD98抗體(記載於日本特開2017-114763號公報、WO2007/114496號、WO2008/017828號、WO2009/043922號、WO2009/090553號、特開2012-092068號公報、WO2011/118804號及WO2013/078377號等)、抗TROP2抗體(記載於Linnenbach A J等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 86卷(1號)，pp27 31(1989)、WO2008/144891號、WO2011/145744號、WO2011/155579號、WO2013/077458號、WO2003/074566號、WO2011/068845號、WO2013/068946號、US7999083號及WO2015/098099號等)、帕尼單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、西妥昔單抗、安美木單抗(ametumumab)(SY-101)、SYN-004、SCT-200、托木妥昔單抗(tomuzotuximab)、GC-1118、GR-1401、德帕土西珠單抗(depatuxizumab)(ABT-806)、思諾妥單抗(Serclutamab)、AMG595及馬妥珠單抗(matuzumab)等之抗EGFR抗體、抗GPRC5D抗體(記載於WO2018/147245號及WO2016/090329號等)等。本發明之會與標的抗原結合之部分源自此等抗體或可包含此等抗體。
作為在間質細胞表現的分子，可列舉例如，FAP(纖維母細胞活化蛋白(fibroblast activation protein))等。
會與標的抗原結合之部分，係較佳為包含第1肽及第2肽所不包含的胺基酸序列而成，更佳為由該胺基酸序列而成的多肽。
標的抗原及會與該標的抗原結合之部分，可為抗原及會與該抗原結合之抗體或抗體之抗原結合片段，但未限定於該組合，可例示配體及會與該配體結合的受體(或反之亦然)、細胞介素及該細胞介素會結合的受體(或反之亦然)。又，作為抗體等以外之分子，亦可例示會與標的抗原結合之非免疫球蛋白蛋白質、核酸適配體(aptamer)等之核酸分子、低分子化合物。
第1肽：[b]部分 辨識會與標的抗原結合之部分([a]部分)所包含的該標的抗原結合部位之第1肽，係藉由辨識會與標的抗原結合之部分所包含的該標的抗原結合部位，而遮蔽該部位，使會與標的抗原結合之部分與標的抗原無法結合、難以結合、或抑制或是阻礙結合之肽。會與標的抗原結合之部分為抗體或抗體之抗原結合片段(以下稱為「抗體等」)的情形，第1肽為會與抗體等之與抗原的結合區域結合之肽。此處，所謂「辨識」標的抗原結合部位，係與會與標的抗原結合部位「結合」、對標的抗原結合部位「具有親和性」等同意義。抗體等之與抗原的結合區域，係存在於抗體等之可變區，尤其是互補決定區(CDR)。抗體等由於會與抗原的表位(抗原決定基)結合，因此第1肽為模仿表位之肽。將模仿(mimic)抗原的表位之肽稱為模擬表位(Mimotope)，於本發明中，前述第1肽，較佳為會與CDR結合的模擬表位。模擬表位為由6～30個、較佳為由10～20個，進一步較佳為由13～17個，特佳為由15個之胺基酸所組成的肽。模擬表位係例如，可藉由製作由上述之胺基酸數所組成的各種展現(噬菌體展現、核糖體展現、核酸展現、細菌展現等)庫，且以淘選進行篩選，而選出提示辨識會與標的抗原結合之部分所包含的該標的抗原結合部位之肽的噬菌體粒子，且從該噬菌體粒子獲得編碼模擬表位的DNA及其核苷酸序列來製造。肽為模擬表位(指已與抗體之CDR結合)，係藉由將遮蔽抗體結晶化，進行X射線結晶結構解析而可確認。又，若可藉由SPR等來確認肽相對於抗體而競爭性地與抗原結合，則強烈暗示該肽為會與該抗體的CDR結合之模擬表位(參照實施例4)
如前述，會與標的抗原結合之部分，可為抗體或抗體之抗原結合片段(以下稱為「抗體等」)以外的分子，作為模擬表位以外之第1肽，可分別於標的抗原為配體之情形，例示辨識該配體會結合之受體所包含的該配體結合部位之肽，於標的抗原為細胞介素之情形，例示辨識該細胞介素會結合之受體所包含的該細胞介素結合部位之肽。會與標的抗原結合之部分為非免疫球蛋白蛋白質的情形，第1肽為辨識該蛋白質所包含的該標的抗原部位之肽，會與標的抗原結合之部分為核酸分子的情形，第1肽為辨識該核酸分子所包含的該標的抗原部位之肽，會與標的抗原結合之部分為低分子化合物的情形，第1肽為辨識該低分子化合物所包含的該標的抗原部位之肽。
第2肽：[c]部分 第2肽，係包含在pH7.5以下之範圍內因應pH從中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，在酸性pH條件下，該胺基酸殘基帶正電，連接子的結構變化被誘發。此處，「pH7.5以下的範圍」包含pH1.0以上7.5以下、pH2.0以上pH7.5以下、pH3.0以上pH7.5以下、pH4.0以上pH7.5以下、pH5.0以上pH7.5以下、pH6.0以上pH7.5以下及pH7.0以上7.5以下之任一者的範圍。再者，「pH7.5以下的範圍」可不為pH7.5以下的全部區域(但亦可為全部區域)，意指在完全被pH7.5以下之範圍所包含的任意範圍內，因應pH而電荷會從無電荷變化成正電荷。例如，不用說，在pH為5.5～7.5的範圍內，因應pH從中性條件變化成酸性條件而胺基酸的電荷會變化之情形係包含於「pH7.5以下的範圍」中。再者，在pH為4.5～6.5的範圍內因應pH從中性條件變化成酸性條件而胺基酸的電荷會變化之情形，由於4.5～6.5的範圍完全被7.5以下的範圍所包含，所以符合「pH7.5以下的範圍」。此處，所謂中性pH條件，係指pH為約7的條件，例如，指pH7.0以上7.5以下的條件。又，所謂酸性pH條件，係指pH低於7的條件，例如，指pH低於7.0、較佳為6.5以下、進一步較佳為6.0以下的條件。酸性pH條件的下限並未特別限定，只要於所屬技術領域中具通常知識者之技術可實現，則可為1.0、2.0、3.0等任意之低值。即，酸性pH條件為pH1.0以上且低於7.0、pH2.0以上且低於7.0、pH3.0以上且低於7.0，較佳為pH1.0以上6.5以下、pH2.0以上6.5以下、pH3.0以上6.5以下，進一步較佳為pH1.0以上6.0以下、pH2.0以上6.0以下、pH3.0以上6.0以下。又，因胺基酸中之電荷的變化為藉由pH變化而產生的可逆現象，所以在pH7.5以下的範圍內因應pH「從中性條件變化成酸性條件」而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，當然被認為在pH7.5以下的範圍內電荷也會因pH「從酸性條件變化成中性條件」而變化。在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，可為天然胺基酸亦可為非天然胺基酸。在為非天然胺基酸的情形，可由在本案的申請時點已被公開的WO2006/132969號、WO2008/030612號、WO2008/030613號、WO2008/030614號、WO2010/037062號、WO2018/223108號等記載的非天然胺基酸中適當選擇而使用。也將第2肽稱為pH應答性連接子。第2肽，係包含在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸作為在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸。pKa係用以定量地表示酸性化合物或酸性官能基的酸之強度的指標之1，以會釋放氫離子的解離反應的平衡常數Ka之負的常用對數pKa(pKa=-log10Ka)表示。pKa亦稱為酸解離常數，為25℃、水中之數值，可藉由化學便覧基礎編修訂5版II-331～II-343(日本化學會編、丸善出版股份有限公司)記載之方法而算出。pKa亦可使用文獻等(例如理科年表平成25年(桌上版)、丸善出版股份有限公司)中周知的數值。pKa亦用以作為定量地表示鹼性化合物或鹼性官能基中鹼基的強度的指標。即，可作為使質子附加於鹼性化合物或鹼性官能基而成的共軛酸，而以該共軛酸的酸之強度來考慮原本的鹼性化合物的鹼性之強度。
第2肽所包含的胺基酸殘基在酸性pH條件下帶正電荷，係作為pH應答性連接子而被要求的性質，因此較佳為不含有pH為酸性條件時具有負電荷的胺基酸。推測是因為pH為酸性條件時的該胺基酸之負電荷會中和或減弱酸性pH條件下帶正電荷的胺基酸之正電荷，藉此而連接子的結構變化變得不被誘發。本發明中之pH為酸性條件時具有負電荷的胺基酸並未特別限定，但在第2肽由天然胺基酸所構成的情形，作為pH為酸性條件時具有負電荷的胺基酸，可列舉麩胺酸、天冬胺酸。即，第2肽較佳為不包含麩胺酸及/或天冬胺酸。
本發明亦可使用表示第2肽之等電點的「pI值」來描述。所謂分子之「pI值」(亦縮寫為pH(I)或IEP值)的用語，在本說明書中被使用的情形，指分子之等電點，特別是指胺基酸、肽或蛋白質之等電點，此係特定之分子不具有淨電荷的pH值。分子之pI值為越高值，即特定之分子不具有淨電荷的pH值為越高值(鹼性側)，該分子在酸性條件下就越容易帶正電荷。分子之pI值為越低值，即特定之分子不具有淨電荷的pH值為越低值(酸性側)，該分子在酸性條件下就越難帶正電荷。因實驗的pI值及所計算的pI值會有些微不同的可能性，本說明書中的用語「pI值」係指所計算的pI值。pI值係例如可按照A. Sillero and J. M. Ribeiro，Analytical Biochem.，179(2)，1989，319-325，從構成所欲計算之肽的各胺基酸殘基之pKa以及胺基末端的胺基及羧基末端的羧基之pKa而計算。
第2肽所包含的胺基酸殘基在酸性pH條件下帶正電荷，係作為pH應答性連接子而被要求的性質，因此若在酸性條件下的電荷之計算值為正值，且比在中性條件下的電荷之計算值更大即可，若為滿足該條件的pI值，則未特別限定。為了誘發連接子之結構變化，例如若取在pH3.0以上6.5以下之酸性條件下的第2肽之電荷的計算值比pH7.0以上7.5以下之中性條件下的第2肽之電荷的計算值更大之值即可。因此，第2肽之pI值較佳為6.4以上，更佳為6.8以上，進一步較佳為7.2以上，最佳為7.6以上。pI值之上限並未特別限定，只要於所屬技術領域中具通常知識者之技術中可製作，則可為12、13、14等任意之值。即，第2肽之pI值較佳為6.4以上12以下、6.4以上13以下或6.4以上14以下，更佳為6.8以上12以下、6.8以上13以下或6.8以上14以下，進一步較佳為7.2以上12以下、7.2以上13以下或7.2以上14以下，最佳為7.6以上12以下、7.6以上13以下或7.6以上14以下。
例如，將針對本發明之實施例中使用的第2肽而按照A. Sillero and J. M. Ribeiro，Analytical Biochem.，179(2)，1989，319-325算出的pI值示於表1。表1中，「pH應答性」係表示有無酸性條件下的結構變化。於表1中，「pH應答性」以「有」、「弱」、「無」的3種方式表示。以後述之實施例5的方法，藉由ELISA而以目視判斷結合活性之變化，將觀察到明確結合活性之變化的情形設為「有」，將未觀察到結合活性之變化的情形設為「無」，將觀察到若干變化的情形設為「弱」。
[表1]
名稱 pH應答性 胺基酸序列 序列識別號 殘基數 pI
MHT1007 無 GSGGGGSVLVPMAMMASGGS 序列識別號46 20 5.7
MHT1008 無 GSGGGGSGGGGSGGGGSGGS 序列識別號47 20 5.7
MHT1009 無 GSGGSGGSGRSANAILEGGS 序列識別號48 20 6.36
MHT1803 有 HHHSGGGGSGGGGSGGGGSHHH 序列識別號49 22 7.74
MHT1804 有 GSGHHHSGGGGSHHHGSGGS 序列識別號50 20 7.74
MHT1805 有 GSGGGGSHHHHSGGGGSGGS 序列識別號51 20 7.64
MHT1806 有 HHHSGGGGSHHHHSGGGGSHHH 序列識別號52 22 7.88
MHT1808 有 GGGGSGHHHGGHHHGGHHHGGS 序列識別號53 22 7.85
MHT1809 有 GGGGSHHGGHHGGHHGGHHGGS 序列識別號42 22 7.82
MHT1810 有 GGGGHGHGHGHGHGHGHGHGGS 序列識別號54 22 7.82
MHT1811 有 GGGGSGGGSGHHHGGHHHGGHHHGSPLGLWAGGS 序列識別號55 34 7.85
MHT1817 弱 GGGGSGHHHGGHDHGGHHHGGS 序列識別號56 22 7.2
MHT1818 弱 GGGGSGHDHGGHHHGGHDHGGS 序列識別號57 22 6.79
MHT1819 無 GGGGSGHDHGGHDHGGHDHGGS 序列識別號58 22 6.4
MhM8001 有 GGGGSGHHHGGHHHGGHHHGGS 序列識別號59 22 7.85
MCE-2101 有 GGGGSGHHHGGHHHGGHHHGGS 序列識別號60 22 7.85
MC3-9001 有 GGGGSGHHHGGHHHGGHHHGGS 序列識別號61 22 7.85
MHT1221 無 GSGGGGSGGGGSGGGGSGGS 序列識別號62 20 5.7
MhM1013 無 GSGSGGGGSVLVPMAMMASGGS 序列識別號63 22 5.7
MhM1018-M1 無 GSGSGGGGSGGGGSGGGGSGGS 序列識別號64 22 5.7
MhM1024-M1 有 GSGGGGSGHHHGGHHHGGHHHGGS 序列識別號65 24 7.85
MHT1814 有 GGGGSGHHHGGHRHGGHHHGGS 序列識別號66 22 10.13
MhM1026-M1 有 GGGGSGGGHHHGGHHHGGHHHGGS 序列識別號75 24 7.85
MhM1028-M1 有 GGGGSGGGHHHGRHHHGGHHHGGS 序列識別號76 24 10.13
MhM1042-M1 有 GGGGSGGRHHHGGHHHGGHHHGGS 序列識別號77 24 10.13
MhM1043-M1 有 GGGGSGGGHHHGGHHHGRHHHGGS 序列識別號78 24 10.13
MhM1044-M1 有 GGGGSGGGHHHGKHHHGGHHHGGS 序列識別號79 24 9.33
MhM1045-M1 有 GGGGSGGKHHHGGHHHGGHHHGGS 序列識別號80 24 9.33
MhM1046-M1 有 GGGGSGGGHHHGGHHHGKHHHGGS 序列識別號81 24 9.33
第2肽係較佳為由具有以下之(1)及(2)之結構的胺基酸序列所構成。 (1)包含1個以上之 (a)由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列、或 (b)在(a)之胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸或離胺酸插入或附加而成的胺基酸序列；且 (2)包含共計4個以上之前述在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。
此處，將(a)之胺基酸序列或(b)之胺基酸序列稱為「鹼性胺基酸團簇」。由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列，係較佳為由連續2～4個之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列，進一步較佳為由連續2～3個之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列。又，「在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸」的數目之上限並未限定，較佳為20個以下，進一步較佳為15個以下，進一步較佳為12個以下。
如上述，於本發明中，所謂「鹼性胺基酸團簇」，係指由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列、及在該胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個之精胺酸或離胺酸插入或附加而成的胺基酸序列。又，於選擇了特定之胺基酸作為在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之情形，有時於該胺基酸之種類名附加「團簇」的用語而命名。例如，於選擇組胺酸作為在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸的情形，由連續2個以上之組胺酸而成的胺基酸序列、及在該胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個之精胺酸或離胺酸插入或附加的胺基酸序列稱為「組胺酸團簇(His團簇)」。
於第2肽中，鹼性胺基酸團簇部分以外之胺基酸若為在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸、精胺酸及離胺酸、酸性pH條件時具有負電荷的胺基酸以外之胺基酸，則未特別限定。作為此種胺基酸，於天然胺基酸可列舉甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸、脯胺酸、蘇胺酸。較佳為由甘胺酸及/或絲胺酸構成的胺基酸序列(所謂的GS連接子)或構成蛋白酶基質序列的胺基酸序列。於鹼性胺基酸團簇之胺基末端側及羧基末端側的一方或兩方，可被包含1～30個、較佳為1～20個、進一步較佳為1～10個此種胺基酸。
在天然胺基酸之中，在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸僅有組胺酸，在計數以天然胺基酸構成的第2肽中之鹼性胺基酸團簇的數目的情形，若計數組胺酸團簇之數目即可。例如，第2肽由所謂「GGGGSHHGGHHGGHHGGHHGGS」(序列識別號42，圖52)的胺基酸序列構成的情形，因包含4個之由連續2個之組胺酸所構成的胺基酸序列，可數算為包含4個鹼性胺基酸團簇。作為另外之例，第2肽由所謂「GGGGSHHGGHRHGGHHKGGHHGGS」(序列識別號43、圖52)的胺基酸序列而成的情形，因包含2個之由連續2個之組胺酸所構成的胺基酸序列、1個之在由連續2個之組胺酸所構成的胺基酸序列之間有精胺酸插入而成的胺基酸序列、1個之在由連續2個之組胺酸所構成的胺基酸序列有離胺酸附加而成的胺基酸序列，而可數算為包含4個鹼性胺基酸團簇。又，就在由連續2個以上之組胺酸所構成的胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個之精胺酸或離胺酸插入或附加而成的胺基酸序列而言，可列舉例如HRH、RHH、HHR、HRHH、HHRH、RHHH、HHHR、HKH、KHH、HHK、HKHH、HHKH、KHHH、HHHK等。此為在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸為組胺酸的情形之例示，以H表示的胺基酸亦可為組胺酸以外之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。
為了提高會與標的抗原結合的分子之酸性pH下的對標的抗原的親和性，第2肽中之鹼性胺基酸團簇，係較佳為包含在由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個以上之精胺酸插入或附加而成的胺基酸序列，更佳為包含1個之在由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸插入或附加而成的胺基酸序列，進一步較佳為包含1個之具有以「RHHH」表示的胺基酸序列的鹼性胺基酸團簇。
精胺酸係在側鏈具有為鹼性官能基之胍基的胺基酸，其pKa為12.48。離胺酸係在側鏈具有為鹼性官能基之胺基的胺基酸，其pKa為10.53。因此，認為兩胺基酸即使在中性條件下側鏈之鹼性官能基亦帶正電荷。因此，該精胺酸或離胺酸可增強第2肽之因應pH變化的結構變化。認為藉由此效果，而包含有精胺酸或離胺酸插入或附加而成的鹼性胺基酸團簇的第2肽，係即使在酸性條件弱的環境(例如，pH6.5以上且低於7.0)下，亦可誘發結構變化。
於本發明中，可藉由將在由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)並未有1個以上之精胺酸插入或附加的胺基酸序列之EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)、與在由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個以上之精胺酸插入或附加而成的胺基酸序列之EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)進行比較，而定量由精胺酸之插入或附加所致的pH應答性之增強效果。即，EC 50比之比較係可藉由(後者之EC 50比)/(前者之EC 50比)而算出，且其比較佳為4.0以上。
鹼性胺基酸團簇所包含的在側鏈具有鹼性官能基之胺基酸中的鹼性官能基之pKa，較佳為5.0～7.0的範圍，更佳為5.5～6.5的範圍。最佳為包含鹼性官能基之pKa為6.00的組胺酸，作為在側鏈具有鹼性官能基的胺基酸。
第2肽所包含的鹼性胺基酸團簇之數目，若可藉由該團簇在酸性pH條件下帶正電而誘發連接子之結構變化，則未特別限定，但較佳為包含1～4個，進一步較佳為2～4個，進一步較佳為3或4個。
第2肽所包含的在側鏈具有鹼基性官能基的胺基酸之數目，若可藉由該團簇在酸性pH條件下帶正電而誘發連接子之結構變化，則未特別限定，但較佳為10個以下，更佳為第2肽之胺基酸序列所包含的總胺基酸數之5%以上30%以下。
第2肽包含1個以上之(a)由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列、或(b)在胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個之精胺酸或離胺酸插入或附加而成的胺基酸序列，且(2)由包含共計4個以上之前述在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之胺基酸序列所構成的情形，第2肽所包含的胺基酸之數目為10～60個，較佳為12～50個，進一步較佳為15～40個，進一步較佳為20～35個。
第2肽所包含的鹼性胺基酸團簇之位置未特別限定。即，第2肽之胺基酸序列中包含2個以上之鹼性胺基酸團簇的情形，(1)可為僅1個之鹼性胺基酸團簇位於該胺基酸序列之胺基末端或羧基末端，(2)可為1個之鹼性胺基酸團簇位於該胺基酸序列之胺基末端且另1個之鹼性胺基酸團簇位於該胺基酸序列之羧基末端，(3)可為任一個之鹼性胺基酸團簇皆不位於該胺基酸序列之胺基末端且不位於羧基末端。於本發明中，第2肽可進一步成為細胞內外的蛋白酶之基質，且包含會被該蛋白酶切斷的胺基酸序列(以下亦簡稱為「基質」)。第2肽之胺基酸序列進一步包含會被細胞內外之蛋白酶切斷的胺基酸序列之情形，較佳為該胺基酸序列從胺基末端向羧基末端或從羧基末端向胺基末端，以鹼性胺基酸團簇、會被細胞內外之蛋白酶切斷的胺基酸序列、會與標的抗原結合之部分([a]部分)之胺基酸序列的順序連結。
再者，第2肽可包含由下述胺基酸序列所表示的結構所構成者，該胺基酸序列包含每隔一個胺基酸而具有在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之胺基酸序列。此處，在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之數目為4～15個，較佳為5～12個，進一步較佳為6～10個。作為此種序列，可列舉例如，「GGGGSHGHGHGHGHGHGHGHGGS」(序列識別號44，圖52)。
亦可包含下列兩方：每隔1個胺基酸而具有在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之胺基酸序列；及(a)由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列、或(b)在胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個之精胺酸或離胺酸插入或附加的胺基酸序列。
酸性pH條件若是第2肽之在側鏈具有鹼性官能基的胺基酸之電荷會變化，則若為pH7.5以下的範圍即可。因此，酸性pH條件較佳為pH6.5以下的範圍，更佳為pH6.0以下的範圍，進一步較佳為pH5.5以下的範圍。
第1肽、第2肽及會與標的抗原結合之部分可與連接子結合。即，第1肽、第2肽及會與標的抗原結合之部分之任1者可透過連接子與其他2個之中的1個或兩方結合。此處，連接子係由胺基酸2～30個、較佳為2～20個、更佳為2～10個所構成的肽。
第2肽可包含會被細胞內蛋白酶或細胞外蛋白酶切斷的胺基酸序列。第2肽成為細胞內及/或細胞外蛋白酶的基質，且包含該會被蛋白酶切斷的胺基酸序列(亦簡稱為「基質」。亦將會被某蛋白酶切斷的基質稱為「該蛋白酶基質」)的情形，可將成為細胞內蛋白酶的基質的胺基酸序列稱為第1切斷胺基酸序列，將成為細胞外蛋白酶的基質的胺基酸序列稱為第2切斷胺基酸序列。於本發明中，亦將使第2肽包含第1切斷胺基酸序列與第2切斷胺基酸序列，稱為於第2肽中組合第1切斷胺基酸序列與第2切斷胺基酸序列作為蛋白酶切斷序列。
細胞內蛋白酶亦稱為「細胞內作用型蛋白酶」，在細胞內表現後，不會被分泌到細胞外，而在細胞內作用，參與細胞之細胞凋亡。作為細胞內蛋白酶，可列舉為細胞質性半胱胺酸蛋白酶的凋亡蛋白酶、鈣蛋白酶(亦稱為「CAPN」)、三肽基肽酶等。鈣蛋白酶有CAPN1(μ-鈣蛋白酶)、CAPN2(m-鈣蛋白酶)、CAPN3、CAPN4、CAPN5、CAPN6、CAPN7、CAPN8、CAPN9、CAPN10、CAPN11、CAPN12、CAPN13、CAPN14、CAPN15、CAPN16、CAPN17等之同功型存在，但於本發明中，任一同功型皆可利用。較佳為利用CAPN1(鈣蛋白酶1)或CAPN2(鈣蛋白酶2)。三肽基肽酶有三肽基肽酶1、三肽基肽酶2等之同功型存在，於本發明中，任一同功型皆可利用，較佳為利用三肽基肽酶2。因此，就第2肽中之第1切斷胺基酸序列而言，若為會成為上述之細胞內蛋白酶的基質的胺基酸序列，即若為該蛋白酶所辨識、切斷的胺基酸序列，則未特別限定，但較佳可各自列舉以下作為適合例：人類CAPN1所辨識且成為其基質的胺基酸序列(亦稱為「CAPN1基質」或「CAPN基質」)，就CAPN基質而言，為PLFAAP(序列識別號67，圖55)。
細胞外蛋白酶亦稱為細胞外作用型蛋白酶，以具有訊息序列的狀態表現，且被分泌到細胞外，在細胞外作用。作為細胞外蛋白酶，可列舉尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化物(uPA)、基質金屬蛋白酶(MMP)、血纖維蛋白溶酶(plasmin)、組織蛋白酶(cathepsin)、馬曲肽酶(matriptase)、天冬醯胺內肽酶(legumain)等。MMP有MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP18、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28等之同功型存在，但本發明中，任一同功型皆可利用。就組織蛋白酶而言，有組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶F、組織蛋白酶G、組織蛋白酶H、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L1、組織蛋白酶L2、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶W、組織蛋白酶X/Z等之同功型存在，但於本發明中任一同功型皆可利用。因此，就第2肽中之第2切斷胺基酸序列而言，若為會成為上述細胞外蛋白酶的基質的胺基酸序列，即若為該蛋白酶所辨識、切斷的胺基酸序列，則未特別限定，但較佳可各自列舉以下作為適合的例：人類uPA所辨識且成為其基質的胺基酸序列(亦稱為「uPA基質」)，就uPA基質而言，為SGRSANAILE(序列識別號36，圖51)、SGRSANA(序列識別號37，圖51)、SGRSA(序列識別號38，圖51)；又，就人類MMP1所辨識且成為其基質的胺基酸序列(亦稱為「MMP1基質」或「MMP基質」)而言，為VLVPMAMMAS(序列識別號39，圖51)及PLGLWA(序列識別號40，圖51)；又，人類MMP9所辨識且成為其基質的胺基酸序列(亦稱為「MMP9基質」)，作為MMP9基質而言，為PLGLAG(序列識別號41，圖51)。
於第2肽包含為細胞內蛋白酶之基質的第1切斷胺基酸序列與為細胞外蛋白酶之基質的第2切斷胺基酸序列兩方之情形，其順序並未限定，但例如，可於以第1肽、第2肽、會與標的抗原結合之部分的順序連結之會與標的抗原結合的分子中，於第1肽側包含為細胞外蛋白酶之基質的第2切斷胺基酸序列，且於標的結合部分側包含為細胞內蛋白酶之基質的第1切斷胺基酸序列，亦可於以第1肽、第2肽、會與標的抗原結合之部分的順序連結之會與標的抗原結合的分子中，於第1肽側包含為細胞內蛋白酶之基質的第1切斷胺基酸序列，且於標的結合部分側包含為細胞外蛋白酶之基質的第2切斷胺基酸序列。因此，於會與標的抗原結合的分子中，較佳為可以第1肽、第2切斷胺基酸序列、第1切斷胺基酸序列、會與標的抗原結合之部分的順序連結，亦可以第1肽、第1切斷胺基酸序列、第2切斷胺基酸序列、會與標的抗原結合之部分的順序連結。
雖然前面數段落主要記載關於第2切斷胺基酸序列被包含於第2肽中之情形，但第2切斷胺基酸序列若被包含在本發明之會與標的抗原結合的分子中，則亦可被包含在第2肽以外，例如，亦可被包含在第1肽之末端、於第2肽與會與標的抗原結合之部分之間所插入的第3肽中。
又，第1肽與第2肽可部分地重複。例如，於序列識別號13、圖28(MHT1806H鏈之全長胺基酸序列)，模擬表位肽(胺基酸20～35)之C末端(HH)成為組胺酸團簇之一部分，第1肽之一部分與第2肽之一部分重複。
在第2肽中，包含有包含1個以上之(a)由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列或(b)在胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸或離胺酸插入或附加而成的胺基酸序列，且(2)包含共計4個以上之前述在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之胺基酸序列、以及為上述第1切斷胺基酸序列及/或第2切斷胺基酸序列之會被蛋白酶切斷的胺基酸序列的兩方之情形，在胺基酸序列被蛋白酶切斷時，較佳為在會與標的抗原結合的分子不包含：包含1個以上之(a)由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列或(b)在胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸或離胺酸插入或附加而成的胺基酸序列，且(2)包含共計4個以上之前述在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之胺基酸序列。
第2肽包含有包含1個以上之(a)由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列或(b)在胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸或離胺酸插入或附加而成的胺基酸序列，且(2)包含共計4個以上之前述在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之胺基酸序列、以及為上述第1切斷胺基酸序列及/或第2切斷胺基酸序列之會被蛋白酶切斷的胺基酸序列的兩方之情形，第2肽所包含的胺基酸之數目為15～150個，較佳為15～120個，進一步較佳為15～70個，進一步較佳為15～50個。
其他部分 本發明之會與標的抗原結合的分子，可進一步含有其他部分。於本發明中，亦將該其他部分稱為「[d]部分」。[d]部分係會與前述分子之會與標的抗原結合之部分結合。[d]部分由選自以下群組之1個或2個以上之化合物構成，該群組由非該會與標的抗原結合之部分的抗體或其抗原結合片段、包含第1肽及第2肽中所不包含的胺基酸序列之肽、細胞介素、毒素、放射性同位素、標識分子、光感受性物質(photosensitizer：亦稱「光增感劑」)、免疫賦活物質、抗腫瘤性化合物、藥物、有效負載以及聚合物組成。
此處，各自就包含第1肽及第2肽所不包含的胺基酸序列之肽而言，可例示抗體、抗體之抗原結合片段、天然存在的非免疫球蛋白性蛋白質、人工創造的蛋白質、受體蛋白質或其配體結合片段、配體蛋白質、調節血中動態的蛋白質(例如，抗體的Fc、白蛋白)等；就抗體而言，可例示非會與標的抗原結合的分子之抗體、會和會與標的抗原結合的分子中之標的結合標的部位以外之部位結合的抗體、藉由和會與標的抗原結合的分子結合而作為多重特異性分子(例如，雙特異性抗體)發揮功能的抗體等；就細胞介素而言，可例示介白素、干擾素、趨化因子、群落刺激因子、腫瘤壞死因子、增殖因子等；就毒素而言，可例示藻毒素(cyanotoxin)、血毒素(hemotoxin)、壞死毒素(necrotoxin)、神經毒素、細胞毒素等之生物毒素、環境毒素等；就放射性同位素而言，可例示 131I、 211AT、 89Sr等；就標識分子而言，可例示FITC、PE等之螢光物質、HRP、AP等之酵素、生物素等；就光敏感性物質而言，可例示酞青素衍生物、氯衍生物、菌綠素(bacteriochlorin)衍生物等；就免疫賦活物質而言，可例示佐劑等；就聚合物而言，可例示天然或人工糖鏈、合成樹脂、聚乙二醇等；就抗腫瘤性化合物而言，可例示拓樸異構酶抑制劑、有絲分裂抑制劑、細胞分裂抑制劑、微小管重合/脱重合抑制劑、糖皮質素受體調節劑、DNA結合劑、烷基化劑、放射性同位素、siRNA、抗體或其抗原結合片段等；就藥物而言，可例示抗腫瘤劑、前述之免疫賦活物質及細胞介素、下述的ADC所包含的抗腫瘤性化合物、藥物、有效負載等；但未限定於此等。
[d]部分為多肽的情形，本發明之會與標的抗原結合的分子可由多肽構成，[d]部分為多肽以外之化合物的情形，本發明之會與標的抗原結合的分子可由[d]部分及多肽構成。
[d]部分可與本發明之會與標的抗原結合的分子以連接子連結。
[d]部分為抗腫瘤性化合物、藥物或有效負載，且會與標的抗原結合的分子為抗體或其抗原結合部分(抗體等)之情形，可將包含[d]部分之會與標的抗原結合的分子稱為ADC(Antibody-Drug Conjugate；抗體-藥物結合物)。關於ADC，係記載於[Methods Mol Biol.(2013)1045：1-27；Nature Biotechnology (2005)23，p.1137-1146等。就抗腫瘤性化合物而言，若為藉由抗體等結合而可發揮藥理學的效果的物質則未特別限定，作為可於抗腫瘤劑之情形使用的抗腫瘤性化合物，可列舉美坦新(emtansine)(4-(｛3-[(3-｛[(1S)-2-｛[(1S,2R,3S,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-氯-21-羥基-12,20-二甲氧基2,5,9,16-四甲基-8,23-二側氧基-4,24-二氧雜-9,22-二氮雜四環[19.3.1.110,14.03,5]二十六-10,12,14(26),16,18-戊烯-6-基]氧基｝-1-甲基-2-側氧基乙基]甲基胺基｝-3-側氧基丙基)氫硫基]-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基｝甲基)環己基羰基)(例如，WO2001/000244、WO2001/000245)、拓樸異構酶抑制劑(例如，Liang, X.等人，Eur.J.Med.Chem.171卷、2019年、129-168頁)，較佳為拓樸異構酶I抑制劑，例如，喜樹鹼衍生物，較佳為愛萊諾迪肯(irinotecan)及其活性代謝產物SN-38(例如，EP 137145A1、US4604463A)、依喜替康(exatecan)(例如，EP 495432A1、US5637770A)、依喜替康衍生物(例如，WO2014/057687)等。作為較佳的依喜替康衍生物，可例示N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]-2-羥基乙醯胺(例如，WO2014/057687、WO2014/061277、WO2015/146132、WO2020/100954、WO2015/098099)。作為其他之抗腫瘤性化合物，亦可例示吡咯并苯并二氮呯衍生物(例如，WO2019/065964、WO2013/173496、WO2014/130879、WO2017/004330、WO2017/004025、WO2017/020972、WO2016/036804、WO2015/095124、WO2015/052322、WO2015/052534、WO2016/115191、WO2015/052321、WO2015/031693、WO2011/130613)，就較佳的吡咯并苯并二氮呯衍生物而言，可例示(11a’S)-7’-甲氧基-8’-[(5-｛[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基]氧基｝戊基)氧基]-1’,11a’-二氫-5’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-5’-酮、(11a’S)-7’-甲氧基-8’-[(5-｛[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧基-5’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-8’-基]氧基｝戊基)氧基]-1’,10’,11’,11a’-四氫-5’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-5’-酮、(11a’S,11a’’’’S)-8’,8’’-[1,5-戊二基雙(氧基]雙(7’-甲氧基-1’,11a’-二氫-5’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-5’-酮)及(11a’S)-7’-甲氧基-8’-(3-｛[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基]氧基｝丙氧基)-1’,11a’-二氫-5’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-5’-酮等(WO2019/065964)。就藥物而言，可為STING致效劑(例如，WO2021/202984、WO2020/229982、WO2020/050406、WO2021/177438)、TLR7/8致效劑或TLR8致效劑(例如，WO2018/009916、WO2019/084060)等之免疫賦活物質。就較佳的STING致效劑而言，可例示環狀二核苷酸衍生物。就環狀二核苷酸衍生物而言，可例示(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-二羥基-7-[1-(2-羥基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-雙(氫硫基)-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧二磷環十四烯-2,10-二酮、(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-16-羥基-7-[1-(2-羥基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-雙(氫硫基)-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧二磷環十四烯-2,10-二酮、(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-胺基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-14-(8,9-二氫-6-硫-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-2,10-雙(氫硫基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧二磷環十四烯-2,10-二酮、N-(2-｛9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R, 15aR,16R)-14-(8,9-二氫-6-硫-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧基-2,10-雙(氫硫基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧二磷環十四烯-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基｝乙基)-2-羥基乙醯胺(WO2021/177438)。於本發明中，[d]部分會與標的抗原結合部分結合。標的抗原結合部分為抗體或其抗原結合片段的情形，可利用周知之方法而使[d]部分與抗體或其抗原結合片段結合。於治療或預防用之包含抗體或其Fc區域的糖蛋白質分子之製造，已開發使糖鏈均勻之技術。作為使附加於糖蛋白質的糖鏈均勻的方法，已知有使用酵素的糖鏈轉移反應。其係由在活體外環境之糖鏈的切斷(水解反應)與其他糖鏈的縮合(糖鏈轉移反應)所組成的多階段製程。尤其以N型糖鏈的轉換為目的的情形，係使用被稱為內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(ENGase)的一群酵素家族。作為此酵素之特性，而要求：1)作為基質特異性而具有進行對複合型糖鏈之水解反應的能力；及2)具有進行對特定結構之糖鏈轉移反應的能力。在糖鏈轉移反應中，已知有使用單獨的ENGase而將還原末端經活化的糖鏈之例如還原末端經唑啉化的糖鏈轉移至GlcNAc(N-乙醯葡萄糖胺)受體的唑啉法；及使用2種類之ENGase而將還原末端未活化的糖鏈直接轉移至GlcNAc受體的一鍋法(one pot method) (WO2022/050300、WO2018/003983)。於本發明中，為了使抗腫瘤性化合物、藥物、有效負載等之[d]部分直接或透過連接子等而與抗體或其抗原結合片段結合，而例如，可使用利用彼等之方法的糖鏈轉移反應。[d]部分為光敏感性物質，且會與標的抗原結合之部分為抗體或其抗原結合部分(抗體等)或包含彼等的情形，包含[d]部分之會與標的抗原結合的分子可用於光動力療法(Photodynamic Therapy；PDT)，該分子可稱為ADP(抗體導向的光療法(Antibody-Directed Phototherapy))分子。關於ADP分子，已記載於Antibodies(2013)2，p.270-305等。就光敏感性物質而言，若為藉由對抗體等結合的部位進行光照射而可發揮藥理學的效果的物質，則未特別限定，作為光敏感性物質，可例示(2S)-2-[[2-[(2S,3S)-7-羧基-3-(2-羧基乙基)-17-乙烯基-12-乙基-2,8,13,18-四甲基-2,3,23,24-四氫卟啉-5-基]乙醯基]胺基]丁二酸(例如，美國專利第5633275號、美國專利第RE37180號)、IR700(IRDye(註冊商標)700DX)(例如，WO2013/009475、WO2004/038378、WO2015/187677、WO2017/031363、WO2017/031367、WO2018/156815、WO2019/232478、WO202020/5623)、2,4-二氟-N-甲基-3-[10,15,20-參[2,6-二氟-3-(甲基胺磺醯基)苯基]-2,3,12,13,22,24-六氫卟啉-5-基]苯磺醯胺(例如，WO2016/151458)等。
於包含具有標的抗原之細胞的組織或其附近，會與標的抗原結合的分子所包含的切斷連接子(第2肽)被切斷，會與標的抗原結合的分子所包含的有效成分(例如，藥物、抗腫瘤性化合物、免疫賦活物質等)發揮效果。
3.會與標的抗原結合的分子之製造方法 (1)第1肽所包含的模擬表位之鑑定方法 可利用肽庫來鑑定會與任意之抗體或其抗原結合片段所包含的互補決定區(CDR)結合之肽。肽庫以周知之方法構築即可。例如，構築由完全隨機的胺基酸所構成的核糖體等之各種展現用的肽庫，選擇對前述CDR親和性大的肽即可。又，構築在中央附近具有芳香族性胺基酸與Pro的重複基序(ZPZP基序)的各種展現用之肽庫(ZPZP lib)，選擇對前述CDR親和性大的肽即可。此處，Z表示組胺酸(His)、苯丙胺酸(Phe)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)之任一芳香族胺基酸，P表示脯胺酸。
第1肽所包含的模擬表位亦可藉由上述方法鑑定。
抗體之CDR環(loop)富含芳香族胺基酸。芳香族胺基酸彼此由於容易相互作用，而較佳在肽的中央附近有芳香族胺基酸存在。
本發明亦包含用以鑑定會與利用上述方法獲得的第1肽、模擬表位之外抗體以外的分子(細胞介素等)結合之肽的各種展現用的肽庫。 (2)會與標的抗原結合的分子之製造方法 為本發明之會與標的抗原結合的分子，且包含第1肽所包含的胺基酸序列及/或第2肽所包含的胺基酸序列而成之肽，可藉由重組、活體外轉譯、化學合成、肽合成等而調製。
例如，可藉由將包含編碼會與標的抗原結合之部分所包含的胺基酸序列、以及可選擇之編碼第1肽所包含的胺基酸序列及/或第2肽所包含的胺基酸序列的核苷酸序列而成之多核苷酸導入細胞，培養該細胞，從該培養物回收會與該標的抗原結合之多肽，而製造本發明之會與標的抗原結合的分子。
包含編碼會與標的抗原結合之部分所包含的胺基酸序列、以及可選擇之第1肽所包含的胺基酸序列、及/或第2肽所包含的胺基酸序列的核苷酸序列而成之多核苷酸，係連結編碼各自之肽的DNA，進而亦可與啟動子、增強子、多腺苷酸化訊息等元件功能性連結。此處，功能性連結係指元件以發揮其功能的方式連結。將此等之DNA插入表現載體，以該載體將宿主細胞轉形，培養該宿主細胞而使其產生，且進行回收即可。該載體可包含編碼會促進從宿主細胞分泌會與標的抗原結合的分子之訊息肽的DNA，於此情形，以同框(in-frame)連結編碼訊息肽的DNA和編碼會與標的抗原結合的分子的DNA。可藉由在會與標的抗原結合的分子產生後去除訊息肽，而獲得為成熟蛋白質之會與標的抗原結合的分子。
表現載體若為在動物細胞、細菌、酵母等之宿主中能夠複製者，則未特別限定，可列舉例如周知之質體、噬菌體等。就表現載體之構築所使用的載體而言，可列舉例如pcDNA(商標)(ThermoFisher Scientific公司)、Flexi(註冊商標)載體(Promega公司)、pUC19、pUEX2(Amersham公司製)、pGEX-4T、pKK233-2(Pharmacia公司製)、pMAM-neo(Clontech公司製)等。就宿主細胞而言，可使用大腸菌、枯草菌等之原核細胞，亦可使用酵母、動物細胞等之真核細胞，但較佳為使用真核細胞。例如，作為動物細胞，使用為人類胎兒腎細胞株之HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等即可。表現載體若能以周知之方法導入宿主細胞，且將宿主細胞轉形即可。可列舉例如電穿孔法、磷酸鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖轉染法等。所產生的抗體可使用通常之蛋白質所使用的分離、純化方法進行純化。例如，適當選擇並組合親和性・層析法、其他層析法、過濾、超過濾、鹽析、透析等即可。 (3)由包含第2肽之胺基酸序列的胺基酸序列所構成的肽之製造方法 本發明之由包含第2肽之胺基酸序列的胺基酸序列所構成之肽，可藉由重組、活體外轉譯、化學合成、肽合成等而調製。
例如，可藉由將編碼包含第2肽之胺基酸序列的胺基酸序列而成的肽之多核苷酸導入細胞，培養該細胞，從該培養物回收目的之肽，而製造本發明之由包含第2肽之胺基酸序列的胺基酸序列所構成的肽。
編碼由包含第2肽之胺基酸序列的胺基酸序列所構成的肽之多核苷酸，係連結編碼各自之肽的DNA，進而亦可與啟動子、增強子、多腺苷酸化訊息等元件功能性連結。此處，功能性連結係指元件以發揮其功能的方式連結。將此等之DNA插入表現載體，以該載體將宿主細胞轉形，培養該宿主細胞而使其產生，且進行回收即可。該載體可包含編碼會促進從宿主細胞分泌包含第2肽之胺基酸序列的胺基酸序列而成的肽之訊息肽的DNA，於此情形，以同框(in-frame)連結編碼訊息肽的DNA與編碼由包含第2肽之胺基酸序列的胺基酸序列所構成的肽的DNA。可藉由在由包含第2肽之胺基酸序列的胺基酸序列所構成的肽產生後去除訊息肽，而獲得為成熟蛋白質之包含第2肽之胺基酸序列的胺基酸序列而成的肽。
表現載體若為在動物細胞、細菌、酵母等之宿主中能夠複製者，則未特別限定，可列舉例如，周知之質體、噬菌體等。就表現載體之構築所使用的載體而言，可列舉例如pcDNA(商標)(ThermoFisher Scientific公司)、Flexi(註冊商標)載體(Promega公司)、pUC19、pUEX2(Amersham公司製)、pGEX-4T、pKK233-2(Pharmacia公司製)、pMAM-neo(Clontech公司製)等。就宿主細胞而言，可使用大腸菌、枯草菌等之原核細胞，亦可使用酵母、動物細胞等之真核細胞，但較佳為使用真核細胞。例如，作為動物細胞，使用為人類胎兒腎細胞株之HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等即可。表現載體若能以周知之方法導入宿主細胞，且將宿主細胞轉形即可。可列舉例如電穿孔法、磷酸鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖轉染法等。所產生的抗體可使用通常之蛋白質所使用的分離、純化方法進行純化。例如，適當選擇並組合親和性・層析法、其他層析法、過濾、超過濾、鹽析、透析等即可。
4.本發明之會與標的抗原結合的分子之利用 本發明之會與標的抗原結合的分子、其鹽或彼等之水合物(以下稱為「本發明之會與標的抗原結合的分子等」)可使用作為起因於異常細胞的疾病之預防及/或治療藥。
異常細胞為腫瘤細胞的情形，本發明之會與標的抗原結合的分子可使用作為抗癌劑。
該抗癌劑可對於選自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、胚細胞瘤、腦腫瘤、類癌、神經母細胞瘤、網膜母細胞瘤、腎母細胞瘤的一種或複數種使用。具體而言，癌腫瘤可列舉腎癌、黑色素瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、結膜癌、口腔癌、喉頭癌、咽頭癌、甲狀腺癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、闌尾癌、肛門癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰臟癌、腎上腺癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、陰道癌等；肉瘤可列舉脂肪肉瘤、血管肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、伊文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、骨肉瘤、未分化多形性肉瘤、纖維黏液樣肉瘤、惡性周邊神經鞘瘤、後腹膜肉瘤、滑膜肉瘤、子宮肉瘤、消化道間質瘤、平滑肌肉瘤、上皮樣肉瘤等；淋巴瘤可列舉B細胞淋巴瘤、T・NK細胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)等；白血病可列舉骨髓性白血病、淋巴性白血病、骨髓增殖性疾病、骨髓增生不良症候群等；骨髓瘤可列舉多發性骨髓瘤等；胚細胞瘤可列舉睪丸癌、卵巢癌等；腦腫瘤可列舉神經膠質瘤、腦脊髓膜瘤等。
本發明之抗癌劑可含有治療有效量的本發明之會與標的抗原結合的分子和藥學上可容許的載劑(carrier)、稀釋劑、助溶劑、乳化劑、保存劑、佐劑等。「藥學上可容許的載劑」等可因應對象疾病的種類或藥劑的投予形態而適當選自廣泛之範圍。本發明之抗腫瘤劑的投予方法可適當選擇，但例如可注射投予，可採用局部注入、腹腔內投予、選擇性靜脈內注入、靜脈注射、皮下注射、臟器灌注液注入等。又，注射用之溶液可使用由鹽溶液、葡萄糖溶液、或鹽水與葡萄糖溶液之混合物、各種的緩衝液等所組成之載劑來進行製劑化。又，亦能以粉末狀態製劑化，且於使用時與前述液體載劑混合而調整注射液。
關於其他的投予方法，亦可與製劑開發同時適當地選擇。例如於經口投予的情形，可適用經口液劑或散劑、丸劑、膠囊劑及錠劑等。於經口液劑的情形，作為如懸浮劑及糖漿劑等經口液體調整物，可使用水、蔗糖、山梨醇、果糖等之糖類、聚乙二醇等之二醇類、芝麻油、大豆油等之油類、對羥苯甲酸烷酯等之防腐劑、草莓風味、薄荷等之風味劑類等而製造。散劑、丸劑、膠囊劑及錠劑，係可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等之賦形劑、澱粉、褐藻酸鈉等之崩散劑、硬脂酸鎂、滑石等之潤滑劑、聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等之結合劑、脂肪酸酯等之表面活性劑、甘油等之塑化劑等而製劑化。於所謂容易投予之點，錠劑及囊劑為此發明之組成物的較佳單位投予形態。於製造錠劑或膠囊劑之際，係使用固體之製造載劑。
對用於治療有效的本發明之會與標的抗原結合的分子等的量，係依治療之病狀的性質、患者的年齡、狀態而變更，最終由醫師決定即可。例如，1次每1kg體重為0.0001mg～100mg。規定的投予量係可1～180日投予1次，亦可設為每1日2次、3次、4次或其以上之分割投予而以適當間隔投予。
本發明之會與標的抗原結合的分子等亦可與其他藥劑組合，而使用作為起因於異常細胞的疾病之預防藥或治療藥。本發明之會與標的抗原結合的分子等，可於投予其他藥劑前、與其他藥劑於同時、或於投予其他藥劑後，被投予至罹患起因於異常細胞的疾病或有該疑慮者等。將本發明之會與標的抗原結合的分子等於與其他藥劑同時投予的情形，可為彼等之摻合劑(包含彼等兩方之製劑)及各單劑(各自僅包含一方之製劑)之任一者。
5.檢查藥、診斷藥及試藥 本發明之會與標的抗原結合的分子等，可使用作為檢查藥、診斷藥或試藥等。本發明之會與標的抗原結合的分子等，因在酸性pH條件下比起在在中性pH條件下，對於標的抗原以更高的親和性結合，所以可從抗體對標的抗原之結合量，調查標的抗原附近之pH變化。因此，可將本發明之會與標的抗原結合的分子等，例如藉由使用於檢體或投予至對象，而使用作為針對以標的抗原附近的pH變化為病因或表現型之疾病等的檢查藥、診斷藥或試藥等。較佳為：本發明之會與標的抗原結合的分子等可使用作為針對以存在於癌微小環境、胞內體中之環境或溶酶體中之環境的標的抗原附近的pH變化為病因或表現型之疾病等的檢查藥、診斷藥或試藥等。就檢查藥、診斷藥或試藥而言，包含可於例如罹患風險的判定或測定、有無罹患的判定、進行或惡化程度的測定、利用包含會與標的抗原結合的分子的醫藥組成物所致的藥物治療之效果的測定或判定、藥物治療以外之治療效果的測定或判定、再發風險的測定、有無再發的判定等使用者，但若是作為檢查藥、診斷藥或試藥使用，則未限定於此等。本發明提供包含本發明之會與標的抗原結合的分子等的檢查、診斷或試藥等組成物(以下，稱為「檢查等用組成物」)。該檢查等用組成物中可含有pH緩衝劑、浸透壓調節劑、鹽類、穩定劑、防腐劑、顯色劑、增感劑、凝集防止劑等。 [實施例]
以下，於實施例中進一步詳細說明本發明，但本發明並未限定於此等。
又，於下述實施例中，有關基因操作的各操作只要沒有特別明示，則根據「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J., Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold SpringHarbor Laboratory Press於1989年發行)記載之方法及其他之所屬技術領域中具通常知識者使用的實驗書中記載之方法而進行，或於使用市售試藥或套組的情形，係按照市售品的說明書而進行。為了基因、載體構築而需要的引子，係因應必要而委託合成(FASMAC股份有限公司、及Thermo Fisher Scientific公司)。
(實施例1)抗TROP2抗體HT1-11之調製 1)-1 抗TROP2抗體HT1-11之表現・純化 將以選殖了編碼WO2015/098099號記載之周知的抗TROP2抗體的重鏈(序列識別號1、圖16)或輕鏈(序列識別號2、圖17)的DNA之pcDNA3.3(Thermo Fisher Scientific公司)作為骨架的哺乳動物細胞用表現載體，導入Expi293F細胞，從暫時性表現的培養上清液純化抗體分子。Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司)按照手冊進行繼代、培養。以Expi293表現培養基(Thermo Fisher Scientific公司)稀釋處於對數增殖期的Expi293F細胞培養液，使其成為2.5×10 6個細胞/mL，於Opti-Pro SFM培養基(Thermo Fisher Scientific公司)中加入重鏈、輕鏈各自之表現載體與聚乙烯亞胺(Polyethylenimine)(Polyscience公司)而反應後，添加至Expi293F細胞。於37℃、8%CO 2培養箱以135rpm振盪培養5日。對於離心分離後之培養上清液添加以PBS pH7.4平衡化的MabSelectSuRe(Cytiva公司)，使目的之抗體分子吸附。以PBS去除非吸附成分後，以pH3.5之乙酸緩衝液將吸附成分進行沖提。沖提劃分係以pH9.0的Tris緩衝液將pH調製成中性，使用超過濾膜，以25mM組胺酸、5(w/v)% Sorbitor、pH6.0進行緩衝液取代。因應必要而濃縮後，供給至預先以25mM組胺酸、300mM NaCl、5(w/v)% Sorbitor、pH5.5平衡化的凝膠過濾管柱Superdex 200 Increase(Cytiva公司)，回收單體劃分。純化樣品係供給至SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)及分析用尺寸排除層析法(SEC)，而評價單體純度。純化抗體之濃度，係使用分光光度計之280nm的吸光度與以PACE法算出的吸光係數，而以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之方法來決定(Protein Science.；4(11)：2411-2423(1995))。
1)-2利用ELISA之抗TROP2抗體HT1-11與抗TROP2抗原之結合活性評價 在96孔Maxi-sorp盤(黑色，Nunc公司)中各添加50μL之以PBS稀釋為1μg/mL的NeutrAvidin(Thermo Fisher Scientific公司)，在4℃固相化一晩。以含0.05(w/v)%之Tween-20(Bio-Rad公司)的PBS(ELISA緩衝液)洗淨後，以酪蛋白阻斷劑(Blocker Casein)(Thermo Fisher Scientific公司)進行阻斷。以ELISA緩衝液洗淨後，各添加50μL之以PBS稀釋為1μg/mL的生物素化人類TROP2抗原(登錄號：P09758。將細胞外結構域以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之手法純化後，將C末端Avi標籤序列生物素化)，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，各添加50μL之以ELISA緩衝液進行濃度調整的實施例1)-1之抗體，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，添加50μL之以ELISA緩衝液稀釋2500倍的山葵過氧化酶(Horseradish peroxidase(HRP))標識抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research Laboratories公司)，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，添加SuperSignal Pico ELISA化學發光基質(Chemiluminescent substrate)(Thermo Fisher Scientific公司)，以微量盤分析儀(plate reader)測定10分鐘後的化學發光。如圖2所示，HT1-11係濃度依存性地與人類TROP2抗原結合。
(實施例2)會與抗TROP2抗體HT1-11結合的模擬表位肽之濃縮 構築由完全隨機的15個之胺基酸所構成的核糖體展現用之肽庫(Linear 15mer lib)，並以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之方法將可與HT1-11結合的肽進行濃縮。首先，將以EZ-Link NHS-PEG4-Bioin(Thermo Fisher Scientific公司)生物素化的來自人類血清的IgG(Sigma-Aldrich公司)或HT1-11於Dynabeads Streptavidin M-280(Thermo Fisher Scientific公司)固相化，使提示肽的核糖體(ribosome displaying peptide：以下稱為「RD」)與來自人類血清的IgG結合珠反應。將未結合的RD使用磁架(magnet stand)(DynaMag‐2、Thermo Fisher Scientific公司)回收後，使其與HT1-11結合珠反應。藉由使用磁架的洗淨操作，而將未與HT1-11結合的RD去除，從與HT1-11結合的RD純化mRNA。之後，藉由RT-PCR及活體外轉譯將RD再次調製。實施此淘選操作3次。
將淘選3次後之mRNA進行活體外轉譯而調製RD後，使其與生物素化的HT1-11或來自人類血清的IgG經固相化而成的Dynabeads Streptavidin M-280各自反應(輸入量：6×10 11)。藉由使用磁架的洗淨操作將未結合的RD去除後，從結合的RD回收mRNA，藉由RT-qPCR定量評價回收量(輸出量)。如圖3所示，在將HT1-11固相的條件，係相較於將人類血清IgG固相的條件，而回收多2624倍的mRNA。由此結果，暗示會與HT1-11特異性結合之肽的濃縮。
(實施例3)會與抗TROP2抗體結合的模擬表位肽之篩選 3)-1融合了源自淘選之肽的HT1-11 scFv之調製 對淘選3次後之DNA片段添加限制酶，將編碼隨機肽部分的DNA片段以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之方法進行純化。以會以pelB訊息序列、DNA片段、MMP切斷連接子(包含周知之MMP基質(Journal of Controlled Release.；161：804-812(2012).)：序列識別號3及圖18所示的胺基酸序列之胺基酸編號41～60)、HT1-11 scFv(VH-VL的順序或VL-VH的順序)、FLAG標籤、His標籤的順序被轉譯的方式，以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之方法，將DNA片段與大腸菌表現載體連結，將大腸菌XL-1 Blue(Agilent Technologies公司)轉形。在IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖哌喃糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside))(Sigma-Aldrich公司)存在下培養大腸菌，回收包含肽融合scFv的培養上清液。 3)-2 模擬表位肽之取得 以與實施例1)-2同樣之方法，以ELISA評價對人類TROP2抗原的結合活性。包含肽融合scFv的培養上清液係以含2mM之氯化鈣的TBS(MMP緩衝液)進行10倍稀釋，使其與100nM之活性型人類MMP1(登錄號：P03956)在37℃反應15分鐘，而切斷MMP切斷連接子。之後，各添加50μL至已將人類TROP2抗原固相化之盤中。結合的scFv係使用以ELISA緩衝液稀釋5000倍的HRP標識抗FLAG抗體(Sigma-Aldrich公司)進行檢測。又，未添加MMP1的條件亦進行同樣的操作，選出結合強度比(添加MMP1的條件/未添加MMP1的條件)顯示大的值之殖株作為陽性殖株。純化陽性殖株的表現載體後，以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之方法解析轉譯區域的序列，獲得為獨特殖株之MHT1001 (序列識別號3、圖18)及MHT1002(序列識別號4、圖19)。 3)-3 陽性殖株之結合活性評價 使HT1-11-scFv-HL(序列識別號5、圖20)、HT1-11-scFv-LH(序列識別號6、圖21)及於實施例3)-2鑑定的陽性殖株MHT1001、MHT1002於大腸菌XL-1 Blue表現，由培養上清液以Ni Sepharose excel(Cytiva公司)純化，取代為TBS。純化抗體之濃度係使用分光光度計之280nm的吸光度、與以PACE法算出的吸光係數，而以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之方法決定(Protein Science.；4(11)：2411-2423(1995))。使用純化樣品，以與實施例3)-2同樣之方法，以ELISA評價添加MMP1的條件、未添加MMP1的條件下對於人類TROP2抗原之結合活性。以MMP緩衝液將抗體調製成1μM，添加MMP1使終濃度成為1μM或0μM，使其在37℃反應15分鐘。之後，在各孔中添加以ELISA緩衝液進行濃度調整的抗體。
如圖4-1(A)、圖4-1(B)所示，未融合模擬表位肽的模擬表位肽的HT1-11-scFv-HL及HT1-11-scFv-LH，係無關於MMP1的添加，而顯示同樣的結合活性。又，融合了模擬表位肽的MHT1001及MHT1002，係於添加MMP1的條件下，比未添加MMP1的條件顯示更強的結合活性，結合的EC 50比(未添加MMP1的條件/添加MMP1的條件)各自為7.9、4.3 (圖4-2(C)、圖4-2(D))。
(實施例4)抗TROP2遮蔽抗體之調製・結合活性評價 以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之手法，構築融合了MHT1001之模擬表位肽及MMP切斷連接子(參照實施例3)-1)的抗TROP2遮蔽抗體MHT1007(表2、序列識別號7、圖22)之重鏈表現載體。同樣地，各自構築將MMP切斷連接子修飾為以蛋白酶無法切斷之非切斷連接子的MHT1008 (表2、序列識別號8、圖23)及修飾為uPA的切斷連接子(包含周知之uPA基質(Journal of Biological Chemistry.；272(33)：20456-20462(1997).)：圖24及序列識別號9所示的胺基酸序列之胺基酸編號36～55)的MHT1009(表2、序列識別號9、圖24)之重鏈表現載體。組合各抗體之重鏈表現載體與HT1-11之輕鏈表現載體，以與實施例1)-1同樣之方法，從Expi293F細胞之培養上清液純化各遮蔽抗體，決定蛋白質濃度。所調製的遮蔽抗體係對應於重鏈表現載體名，而命名為MHT1007、MHT1008、MHT1009(表2)。表2之各遮蔽抗體的重鏈序列之序列中之「pH應答性連接子」係相當於本發明之會與標的抗原結合的分子之第2肽。
[表2] 表2　抗TROP2遮蔽抗體與胺基酸序列資訊
遮蔽抗體名 重鏈序列 輕鏈序列
MHT1007 MHT1007 (序列識別號7、圖22) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1008 MHT1008 (序列識別號8、圖23) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1009 MHT1009 (序列識別號9、圖24) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1803 MHT1803 (序列識別號10、圖25) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1804 MHT1804 (序列識別號11、圖26) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1805 MHT1805 (序列識別號12、圖27) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1806 MHT1806 (序列識別號13、圖28) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1808 MHT1808 (序列識別號14、圖29) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1809 MHT1809 (序列識別號15、圖30) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1810 MHT1810 (序列識別號16、圖31) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1811 MHT1811 (序列識別號17、圖32) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1817 MHT1817 (序列識別號18、圖33) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1818 MHT1818 (序列識別號19、圖34) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1819 MHT1819 (序列識別號20、圖35) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
MHT1221 MHT1221 (序列識別號30、圖45) HT1-11 (序列識別號2、圖17)
除了以下記載的部分以外，以與實施例1)-2、實施例3)-2同樣的方法，以ELISA評價添加蛋白酶的條件、未添加的條件下的對於人類TROP2抗原之結合活性。在添加蛋白酶的條件，係對於3μM之抗體，添加終濃度300nM之MMP1或活性型人類uPA(登錄號：P00749)，在37℃反應後，將以ELISA緩衝液進行濃度調整的抗體添加到經固定人類TROP2抗原之孔中。
如圖5-1(A)所示，未融合模擬表位肽的HT1-11係於添加MMP1的條件下，亦顯示與未添加的條件同樣的結合活性。又，於未添加蛋白酶的條件下，融合了模擬表位肽的MHT1007之結合活性比HT1-11更低，與scFv時同樣地顯示遮蔽效果。又，於添加MMP1的條件下，比未添加MMP1的條件顯示更強的結合活性，結合之EC 50比(未添加MMP1的條件/添加MMP1的條件)為104(圖5-1(B))。在搭載了非切斷連接子的MHT1008，係於添加MMP1的條件亦與未添加的條件同樣地結合活性降低(圖5-2(C))。在搭載了uPA切斷連接子的MHT1009，係於添加uPA的條件下，比未添加uPA的條件顯示更強的結合活性，結合之EC 50比(未添加uPA的條件/添加uPA的條件)為83(圖5-2(D))。由上述結果顯示：實施例3所取得的模擬表位不僅於scFv之狀態，而且於IgG的狀態亦作為遮蔽結構域而發揮功能；切斷連接子序列在維持遮蔽效果的狀態下能夠進行修飾。
為了確認所取得的肽為模擬表位，而以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知的方法調製包含遮蔽肽與MMP切斷連接子(參照(實施例3)-1)的MHT1007之Fab區域，進行該Fab區域的結晶化及X射線結晶結構解析。其結果顯示：該肽與HT1-11之CDR區域結合(未顯示數據)。又，以SPR確認了化學合成的遮蔽肽係與TROP2抗原競爭地與HT1-11結合(未顯示數據)。
(實施例5)His團簇搭載連接子之設計與結合之pH應答性評價 側鏈之pKa為6.0的His係在pHe降低的腫瘤微小環境中容易質子化的胺基酸。設計在連接子內搭載了複數個His的抗TROP2遮蔽抗體，將與人類TROP2抗原之相互作用，除了以下記載的部分以外，與實施例1)-2同樣地以ELISA評價。將抗體以中性緩衝液(50mM TRIS或50mM HEPES、150mM NaCL、0.05% Tween-20、pH7.5)或酸性緩衝液(50mM Bis-TRIS、150mM NaCL、0.05% Tween-20、pH6.5-5.5)稀釋為2000nM，在37℃反應後，以各緩衝液調整濃度，並添加到有固定人類TROP2抗原的孔中。洗淨及山葵過氧化酶(HRP)標識抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research Laboratories公司)之稀釋，亦同時於各pH條件下實施。
如圖6-1(A)所示，未搭載His的MHT1008在中性pH條件(pH7.5)及酸性pH條件(pH5.5)下顯示同樣的結合活性。另一方面，在連接子內搭載了1個或連續2個之His(His團簇)之MHT1803(表2、序列識別號10、圖25)、MHT1804(表2、序列識別號11、圖26)及MHT1805(表2、序列識別號12、圖27)，係在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合(圖6-1(B)、圖6-2(C)、圖6-2(D))。MHT1803、MHT1804、MHT1805的結合之EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)各自為3.9、3.6、2.3。又，搭載了3個His團簇數之MHT1806(表2、序列識別號13、圖28)亦同樣地在酸性pH條件顯示強的結合活性(圖6-3(E))，EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)為38.8。
為了探討形成His團簇的連續His之數目，評價MHT1808(表2、序列識別號14、圖29)、MHT1809(表2、序列識別號15、圖30)及MHT1810(表2、序列識別號16、圖31)之結合活性。任一植株皆在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合(圖6-3(F)、圖6-4(G)、圖6-4(H))，EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)各自為24.4、11.4、7.8。
評價搭載了His團簇和以PLGLWA(序列識別號40、圖51)構成的周知之MMP基質(Biopolymers.；40(4)：399-416(1996).)的MHT1811(表2、序列識別號17、圖32)之結合活性進行。包含蛋白酶基質的情形，MHT1811也在酸性pH條件下比在中性pH條件下更顯示強的結合(圖6-5(I))，EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)為28.1。又，即使在添加MMP1的條件下亦顯示強的結合活性，EC 50比(未添加MMP1的條件/添加MMP1的條件)為48.4。
解析了結合活性提升的酸性pH條件。如圖6-5(J)所示，MHT1806係結合活性在pH6.5以下之酸性pH條件下比在中性pH條件(pH7.5)下更為提升。又，MHT1808係結合活性在pH6.0以下之酸性pH條件下比在中性pH條件(pH7.5)下更為提升(圖6-6(K))。
為了驗證His殘基的質子化是否有助於依存於pH降低的結合活性提升，而設計並調製在His團簇內配置負電荷之Asp殘基的MHT1817(表2、序列識別號18、圖33)、MHT1818(表2、序列識別號19、圖34)、MHT1819(表2、序列識別號20、圖35)。將各抗體以pH7.5、pH6.5、pH6.0之緩衝液稀釋為20nM，在37℃反應30分鐘後，以ELISA評價對人類TROP2抗原的結合活性。MHT1808雖結合活性依存於pH降低地提升了，但在pH6.5、pH6.0之任一條件下MHT1817、MHT1818、MHT1819之結合活性也並未像MHT1808那樣提升(圖7)。又，His團簇內部之Asp殘基數越增加，伴隨pH變化的結合活性之變化就變小。此結果顯示較佳為pH應答性連接子中不含Asp殘基者。
(實施例6)抗CD98抗體、抗EGFR抗體、抗GPRC5D抗體之結合活性評價 6)-1 抗CD98抗體hM23H1L1之結合活性評價 以ELISA評價WO2015/146132號記載之周知的抗CD98抗體hM23H1L1(重鏈序列(表3、序列識別號21、圖36)、輕鏈序列(表3、序列識別號22、圖37))對人類CD98抗原的結合活性。
在96孔Maxi-sorp盤(黑色，Nunc公司)中各添加50μL之以PBS稀釋為1μg/mL的NeutrAvidin(Thermo Fisher Scientific公司)，在4℃固相化一晩。以含0.05%之Tween-20(Bio-Rad公司)的PBS(ELISA緩衝液)洗淨3次後，以酪蛋白阻斷劑(Thermo Fisher Scientific公司)進行阻斷。以ELISA緩衝液洗淨後，各添加50μL之以PBS稀釋為1μg/mL的生物素化人類CD98抗原(登錄號：P08195。將細胞外結構域以本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之手法純化後，以EZ-Link NHS-PEG4-Bioin(Thermo Fisher Scientific公司)進行生物素化)，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，各添加50μL之以ELISA緩衝液調製的抗CD98抗體hM23H1L1，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，添加50μL以ELISA緩衝液稀釋2500倍的山葵過氧化酶(HRP)標識抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research Laboratories公司)，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，添加SuperSignal Pico ELISA化學發光基質(Thermo Fisher Scientific公司)，以微量盤分析儀(plate reader)測定10分鐘後的化學發光。如圖8-1(A)所示，hM23H1L1係濃度依存性地與人類CD98抗原結合。
6)-2 抗EGFR抗體西妥昔單抗之調製・結合活性評價 將周知之抗EGFR抗體西妥昔單抗(表3、重鏈序列(序列識別號23、圖38)、輕鏈序列(序列識別號24、圖39))與實施例1)-1同樣地調製，並以ELISA評價對人類EGFR的結合活性。
在96孔Maxi-sorp盤(黑色，Nunc公司)中各添加50μL之以PBS稀釋為0.2μg/mL的人類EGFR-Fc(將人類EGFR(登錄號：P00533)之細胞外結構域、和人類IgG1 Fc區域(登錄號：P01857)之融合蛋白質以本技術領域中具通常知識者周知之方法純化)，在4℃固相化一晚。以含0.05%之Tween-20(Bio-Rad公司)的PBS(ELISA緩衝液)洗淨後，以酪蛋白阻斷劑(Thermo Fisher Scientific公司)進行阻斷。以ELISA緩衝液洗淨後，各添加50μL之以MMP緩衝液調製的西妥昔單抗，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，添加50μL之以ELISA緩衝液稀釋2500倍的山葵過氧化酶(HRP)標識抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research Laboratories公司)，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，添加SuperSignal Pico ELISA化學發光基質(Thermo Fisher Scientific公司)，以微量盤分析儀測定10分鐘後的化學發光。如圖8-1(B)所示，西妥昔單抗係濃度依存性地與人類EGFR抗原結合。
6)-3 抗GPRC5D抗體之調製・結合活性評價 與實施例1)-1同樣地調製WO2018/147245號記載之周知的抗GPRC5D抗體C3022(表3、重鏈序列(序列識別號25、圖40)、輕鏈序列(序列識別號26、圖41))，並以ELISA評價對人類GPRC5D抗原的結合活性。
在96孔Maxi-sorp盤(黑色，Nunc公司)中各添加50μL之以PBS稀釋為1μg/mL的NeutrAvidin (Thermo Fisher Scientific公司)，在4℃固相化一晩。以含0.05%之Tween-20(Bio-Rad公司)的PBS(ELISA緩衝液)洗淨後，以酪蛋白阻斷劑(Thermo Fisher Scientific公司)進行阻斷。以ELISA緩衝液洗淨後，各添加50μL之以PBS稀釋為1μg/mL的生物素化人類GPRC5D胺基末端肽(MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILE(序列識別號45、圖53)-K(Biotin)-NH 2(肽研究所))，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，各添加50μL之以MMP緩衝液調製的抗體，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，添加50μL之以ELISA緩衝液稀釋2500倍的山葵過氧化酶(HRP)標識抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research Laboratories公司)，於室溫振盪30分鐘。以ELISA緩衝液洗淨後，添加SuperSignal Pico ELISA化學發光基質(Thermo Fisher Scientific公司)，以微量盤分析儀測定10分鐘後的化學發光。如圖8-2(C)所示，C3022係濃度依存性地與人類GPRC5D抗原結合。表3之各遮蔽抗體的重鏈序列或輕鏈序列之序列中的「pH應答性連接子」係相當於本發明之會與標的抗原結合的分子的第2肽。
[表3] 表3　抗CD98抗體、抗EGFR抗體、抗GPRC5D抗體之胺基酸序列資訊
遮蔽抗體名 重鏈序列 輕鏈序列
hM23H1L1 hM23H1L1 (序列識別號21、圖36) hM23H1L1 (序列識別號22、圖37)
西妥昔單抗 西妥昔單抗 (序列識別號23、圖38) 西妥昔單抗 (序列識別號24、圖39)
C3022 C3022 (序列識別號25、圖40) C3022 (序列識別號26、圖41)
MhM8001 hM23H1L1 (序列識別號21、圖36) MhM8001 (序列識別號27、圖42)
MCE-2101 西妥昔單抗 (序列識別號23、圖38) MCE-2101 (序列識別號28、圖43)
MC3-9001 MC3-9001 (序列識別號29、圖44) C3022 (序列識別號26、圖41)
hM23-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) hM23-M1 (序列識別號32、圖47)
MhM1013 hM23H1L1 (序列識別號21、圖36) MhM1013 (序列識別號33、圖48)
MhM1013-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1013 (序列識別號33、圖48)
MhM1018-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1018 (序列識別號34、圖49)
MhM1024-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1024 (序列識別號35、圖50)
(實施例7)對hM23H1L1、西妥昔單抗、C3022的模擬表位肽之濃縮 7)-1 會與hM23H1L1結合的模擬表位肽之濃縮 構築由完全隨機的15個之胺基酸所構成的肽庫(Linear 15mer lib)、或在中央附近具有芳香族性胺基酸與Pro的重複基序(ZPZP基序)的核糖體展現用之肽庫(ZPZP lib)，濃縮可與hM23H1L1結合的肽(圖9-1(A))。首先，對於將以EZ-Link NHS-PEG4-Bioin(Thermo Fisher Scientific公司)生物素化的來自人類血清的IgG(Sigma-Aldrich公司)固相化而成的Dynabeads Streptavidin M-280 (Thermo Fisher Scientific公司)及Dynabeads Protein A(Thermo Fisher Scientific公司)添加RD，使其與來自人類血清的IgG、Protein A反應。使用磁架(DynaMag‐2，Thermo Fisher Scientific公司)回收未結合的RD後，使其與結合了hM23H1L1的Dynabeads Protein A反應。藉由使用磁架的洗淨操作而去除未與hM23H1L1結合的RD，從與hM23H1L1結合的RD純化mRNA。之後，藉由RT-PCR及活體外轉譯而再次調製RD。實施此淘選操作3次。
將淘選3次後之mRNA進行活體外轉譯而調製RD後，使其與hM23H1L1或來自人類血清的IgG經固相化而成的Dynabeads Protein A各自反應(輸入量：6×10 11)。藉由使用磁架的洗淨操作而去除未結合的RD後，從結合的RD回收mRNA，藉由RT-qPCR而定量評價回收量(輸出量)。如圖9-1(B)所示，關於Linear 15mer lib及ZPZP lib之二肽庫，在將hM23H1L1固相的條件，係相較於將人類血清IgG固相的條件，而回收多約200倍的mRNA。由此結果暗示會與hM23H1L1特異性結合的肽之濃縮。
7)-2 對西妥昔單抗的模擬表位肽之濃縮 使用由完全隨機的15個之胺基酸所構成的核糖體展現用之肽庫(Linear 15mer lib)，濃縮可與西妥昔單抗結合的肽。首先，對Dynabeads Protein A(Thermo Fisher Scientific公司)、及將來自人類血清的IgG(Sigma-Aldrich公司)固相化而成的Dynabeads Protein A(Thermo Fisher Scientific公司)添加RD，使其與Protein A或來自人類血清的IgG反應。使用磁架(DynaMag‐2、Thermo Fisher Scientific公司)回收未結合的RD後，使其與結合了西妥昔單抗的Dynabeads Protein A反應。藉由使用磁架的洗淨操作而去除未與西妥昔單抗結合的RD，從與西妥昔單抗結合的RD純化mRNA。之後，藉由RT-PCR及活體外轉譯而再度調製RD。實施此淘選操作4次。
將淘選4次後之mRNA進行活體外轉譯而調製RD後，使其與西妥昔單抗或來自人類血清的IgG經固相化而成的Dynabeads Protein A各自反應(輸入量：6×10 11)。藉由使用磁架的洗淨操作而去除未結合的RD後，從結合的RD回收mRNA，藉由RT-qPCR而定量評價回收量(輸出量)。如圖9-2(C)所示，在將西妥昔單抗固相的條件，係相較於將人類血清IgG固相的條件，而回收多276倍的mRNA。由此結果顯示會與西妥昔單抗特異性結合的肽之濃縮。
7)-3 對C3022的模擬表位肽之濃縮 使用由完全隨機的15個之胺基酸所構成的核糖體展現用之肽庫(Linear 15mer lib)，濃縮可與C3022結合的肽。首先，對Dynabeads Protein A(Thermo Fisher Scientific公司)、及來自人類血清的IgG(Sigma-Aldrich公司)固相化而成的Dynabeads Protein A(Thermo Fisher Scientific公司)添加RD，使與Protein A或來自人類血清的IgG反應。使用磁架(DynaMag‐2、Thermo Fisher Scientific公司)回收未結合的RD後，使其與結合了C3022的Dynabeads Protein A反應。藉由使用磁架的洗淨操作而去除未與C3022結合的RD，從與C3022結合的RD純化mRNA。之後，藉由RT-PCR及活體外轉譯而再度調製RD。實施此淘選操作3次。
將淘選3次後之mRNA進行活體外轉譯而調製RD後，使其與C3022或來自人類血清的IgG經固相化而成的Dynabeads Protein A各自反應(輸入量：6×10 11)。藉由使用磁架的洗淨操作而去除未結合的RD後，從結合的RD回收mRNA，藉由RT-qPCR而定量評價回收量(輸出量)。如圖9-2(D)所示，在將C3022固相的條件，係相較於將人類血清IgG固相的條件，而回收多503倍的mRNA。由此結果顯示，會與C3022特異性結合的肽之濃縮。
(實施例8)pH應答性連接子之適用通用性 以與實施例3同樣之方法，挑選可抑制抗CD98抗體、抗GPRC5D抗體之結合的模擬表位肽。關於抗EGFR抗體西妥昔單抗，非以scFv的狀態而是以IgG的狀態挑選模擬表位。與實施例3同樣地，將編碼隨機肽部分的DNA片段以制限酵素消化後進行純化，以會以分泌訊息序列、DNA片段、MMP切斷連接子、西妥昔單抗(重鏈或輕鏈)之順序被轉譯的方式，將DNA片段插入至哺乳動物細胞表現用載體。使將肽及MMP切斷連接子與重鏈或輕鏈之N末端融合而成的西妥昔單抗在Expi293F細胞中表現，以與實施例3同樣之方法選出可抑制西妥昔單抗之結合的模擬表位肽。
使用搭載了3個His團簇的pH應答性連接子，驗證在酸性pH條件下遮蔽抗體是否通用性地活化。設計搭載了在上述篩選鑑定的模擬表位的抗CD98遮蔽抗體MhM8001(表3、序列識別號27、圖42)、抗EGFR遮蔽抗體MCE-2101(表3、序列識別號28、圖43)、及抗GPRC5D遮蔽抗體MC3-9001(表3、序列識別號29、圖44)。與實施例1)-1同樣地調製遮蔽抗體，與實施例5、實施例6同樣地，以ELISA評價中性pH條件、酸性pH條件下的結合活性。
MhM8001、MCE-2101、及MC3-9001，係全部比中性pH條件(pH7.5)而更在酸性pH條件(pH5.5)下顯示強的結合，EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)各自為13.1、39.0、40.4(圖10-1(A)、圖10-1(B)、圖10-2(C))。由此等之結果，暗示搭載了His團簇的遮蔽抗體通用性地在酸性pH條件下活化。
(實施例9)ADC化的抗TROP2遮蔽抗體之調製・結合活性評價 以驗證是否藉由將His團簇搭載於連接子部分而遮蔽抗體之殺細胞活性會依存於pH降低地提升為目的，設計搭載了His團簇的抗TROP2遮蔽抗體MHT1808、未搭載His團簇的MHT1221(表2、序列識別號30、圖45)、及MHT1008。以與實施例1)-1同樣之方法調製各抗體，以與實施例5同樣之方法，以ELISA評價中性pH條件(pH7.5)、酸性pH條件(pH5.5)下之對人類TROP2抗原的結合活性。
如圖11所示，MHT1808係在酸性pH條件下比在中性pH條件下更顯示強的結合，EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)為25.4。另一方面，MHT1221及MHT1008係在兩pH條件下顯示同等之結合活性，EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)各自為1.7、1.2。
(實施例10)抗體-藥物結合物之製造 用以製造抗體-藥物結合物的藥物連接子，係使用N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-｛[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲 并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基｝-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺酸醯胺(實施例58 步驟8 WO2014/057687號，以下稱為「連接子1」)、及N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-｛4-[(｛[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-｛[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基]氧基｝戊基)氧基]-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基｝氧基)甲基]苯基｝-L-丙胺酸醯胺(實施例2-1 WO2020/196474號，以下稱為「連接子2」)。
於抗體-藥物結合物之製造及鑑定使用的共通操作 共通操作A：抗體及抗體-藥物結合物水溶液之濃縮 以Amicon Ultra(50,000 MWCO，Millipore Corporation)及離心機Allegra X-15R Centrifuge (Beckman Coulter)(SX4750A)進行濃縮(4000g)。
共通操作B：抗體之濃度測定 使用UV測定器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific Inc.)，按照製造商規定的方法進行測定。
共通操作C：抗體之緩衝液交換 C-1：緩衝液交換為包含NaCl(50mM)及EDTA(5mM)的磷酸緩衝液(50mM，pH6.0)(以下稱為PBS6.0/EDTA) 使用NAP-25管柱(Cat.No.17085202，Cytiva，NAP-25 Columns Sephadex，以下稱為NAP-25)，按照製造商規定的方法，以包含NaCl(50mM)及EDTA(5mM)的磷酸緩衝液(50mM，pH6.0)(以下稱為PBS6.0/EDTA)使其平衡化。對一支的此NAP-25管柱，置入抗體水溶液2.5mL後，分取以PBS6.0/EDTA3.5mL沖提的劃分(3.5mL)。與將此劃分以共通操作A、B進行濃縮、濃度測定後，使用PBS6.0/EDTA調整為10mg/mL。
C-2：緩衝液交換為磷酸緩衝液(50mM， pH6.0)(以下，稱為PB6.0) 於抗體水溶液中添加PB6.0並使用共通操作A而進行濃縮。進行此操作數次後，進行濃度測定(共通操作B)，使用PB6.0而調整為10mg/mL。
共通操作D：抗體-藥物結合物之純化 使用NAP-25而按照製造商規定的方法，沖提抗體劃分。於管柱之平衡化及沖提溶液，使用5(w/v)%山梨糖醇-10mM 乙酸緩衝液(以下，稱為ABS)， 共通操作E：抗體-藥物結合物中的抗體濃度之測定 抗體-藥物結合物之濃度C’(mg/mL)，係以由朗伯-比爾定律(Lambert-Beer law)、吸光度A280=莫耳吸光係數ε 280(L･mol -1･cm -1)×莫耳濃度C(mol･L -1)×槽光徑長l(cm)可導出的式(I)來算出。
C’(mg/mL)之算出中使用的各值係藉由以下獲得。 ・吸光度A280：抗體-藥物結合物水溶液之280nmUV吸光度的實測值 以Lamba25(PerkinElmer)計測 ・莫耳質量MW(g・mol -1)：由抗體之胺基酸序列求得的抗體分子量之計算推定值(作為抗體-藥物結合物之莫耳質量的近似值使用)。 ・光徑長l(cm)：1cm ・抗體藥物結合物之莫耳吸光係數ε 280：由下述之式(II)算出
ε Ab,280：280nm中的抗體之莫耳吸光係數 ε DL,280：280nm中的藥物連接子之莫耳吸光係數 藥物結合數：以共通操作F算出(參照下述) ε Ab,280係使用從抗體之胺基酸序列以已知的計算方法(Protein Science， 1995， vol.4， 2411-2423)算出的值(參照下述表4)。
ε DL,280在連接子1係使用以巰基乙醇或N-乙醯基半胱胺酸進行反應，將順丁烯二醯亞胺基變換為琥珀醯亞胺硫醚的化合物之實測的莫耳吸光係數(280nm)，在連接子2係使用實測之莫耳吸光係數(280nm)。
共通操作F：抗體-藥物結合物中的抗體每一分子的藥物平均結合數之測定 抗體-藥物結合物中的抗體每一分子的藥物平均結合數係使用逆相層析法(RPC)測定。
F-1.樣品調製(抗體分子間雙硫鍵的還原) 於抗體-藥物結合物溶液(約1mg/mL，60μL)中添加二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100mM，15μL)後，將混合物於37℃保溫30分鐘，將輕鏈及重鏈間的雙硫鍵切斷。
F-2.HPLC分析 HPLC分析係以下述測定條件進行。 ・HPLC系統：Agilent1290HPLC系統(Agilent Technologies) ・檢測器：紫外吸光度計(測定波長：280nm) ・管柱：ACQUITY UPLC BEH Phenyl(2.1×50mm，1.7μm，130Å；Waters，P/N186002884) ・管柱溫度：75℃ ・移動相A：0.10(w/v)%三氟乙酸(TFA)、15(w/v)%2-丙醇水溶液 ・移動相B：0.075(w/v)%TFA、15(w/v)%2-丙醇、乙腈溶液 ・梯度程式：(min，B%)：(0，14)-(15，36)-(17，80)-(17.01，14)-(25，14) ・樣品注入量：10μL F-3.數據解析 相對於F-3-1未結合藥物的抗體之輕鏈(L0)及重鏈(H0)，有藥物結合的輕鏈(有藥物i個結合的輕鏈：Li)及重鏈(有藥物i個結合的重鏈：Hi)，由於會與結合的藥物之數目成比例地疏水性增加而滯留時間變大，因此可藉由與L0、L0及H0的滯留時間比較，而將檢測波峰分配為L0、L1、H0、H1、H2、H3之任一者。
F-3-2 因於藥物連接子有UV吸收，故因應藥物連接子之結合數，而使用輕鏈、重鏈及藥物連接子之莫耳吸光係數，按照下式進行波峰面積值的校正。
其中，各抗體中的輕鏈及重鏈之莫耳吸光係數(280nm)，係使用藉由已知之計算方法(Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423)而自各抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸序列所推定的值(參照下述表4)
F-3-3按照下式計算相對於波峰面積校正值合計之各鏈波峰面積比(%)。
F-3-4按照下式計算抗體-藥物結合物中的抗體每一分子的藥物平均結合數。
藥物平均結合數=(L0波峰面積比×0+L1波峰面積比×1+H0波峰面積比×0+H1波峰面積比×1+H2波峰面積比×2+H3波峰面積比×3)/100×2
[表4] 表4　各抗體之莫耳吸光係數、吸光係數、抗體分子量
抗體 280nm莫耳吸光係數 (L･mol -1･cm -1) 吸光係數 (L･g -1･cm -1) 抗體 分子量
全部 重鏈 輕鏈
MhM1018-M1 254340 77008 50162 1.67 152093
MhM1024-M1 254340 77008 50162 1.66 153582
MHT1808 237380 90988 27702 1.56 152575
MHT1221 237380 90988 27702 1.57 150888
MHT1008 237380 90988 27702 1.57 151086
藥物連接子 280nm莫耳吸光係數(L･mol -1･cm -1)
連接子1 5440
連接子2 23155
10)-1 MhM1018-M1-DXd-ADC之合成
步驟1：抗體-藥物結合物(1) 抗體之還原：將實施例12所製作的MhM1018-M1，使用共通操作B及C-1，以PBS6.0/EDTA調製成10mg/mL。於本溶液(1.45mL)中添加1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque, Inc.；0.0218mL)、及10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.0581mL；對於抗體一分子為6.0當量)。藉由在37℃保溫2小時，而將抗體內鏈間部之雙硫鍵還原。
抗體與藥物連接子之結合：將上述溶液於15℃保溫10分鐘。接著添加連接子1之10mM 二甲基亞碸溶液(0.0969mL；相對於抗體一分子為10當量)，於15℃保溫1小時，使藥物連接子與抗體結合。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0097mL；相對於抗體一分子為10當量)並攪拌後，再於室溫靜置20分鐘，使藥物連接子的反應停止。
純化：將上述溶液進行利用共通操作D的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物「MhM1018-M1-DXd-ADC」的溶液7mL。
特性評價：使用共通操作E及F，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.75mg/mL，抗體產量：12.27mg(83%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.4。
10)-2 MhM1024-M1-DXd-ADC之合成
步驟1：抗體-藥物結合物(2) 使用1.53mL之實施例12所製作的MhM1024-M1(使用1.66mLmg -1cm -1作為280nm吸光係數)，藉由與實施例10)-1之步驟1相同的方法，獲得標題抗體-藥物結合物「MhM1024-M1-DXd-ADC」。
特性評價：使用共通操作E及F，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.91mg/mL，抗體產量：13.38mg(87%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.2。
10)-3 MHT1221-PBD-ADC之合成
i)EndoS酵素 ii)EndoS(D233Q/Q303L)酵素，糖鏈唑啉 上述糖鏈修飾抗體之N297糖鏈表示對非還原末端的唾液酸導入了疊氮基的MSG1型糖鏈(WO2019/065964號)(圖12)。
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-MHT1221抗體之調製 將實施例9所調製的MHT1221抗體溶液，按照共通操作C-2緩衝液交換為磷酸緩衝溶液(50mM，pH6.0)(以下PB6.0)，調製成19.3mg/mL(0.970mL)。於此溶液中添加EndoS溶液(PBS、7.52mg/mL)0.0124mL，於37℃保溫2小時。使用Agilent 2100 Bioanalyzer確認糖鏈被切斷後，以GST及ProteinA管柱(AKTA)純化。將目的物之劃分取代為PB6.0，獲得(Fuca1,6)GlucNAc-MHT1221抗體(20.0mg/mL，0.921mL)。
步驟2：糖鏈修飾MHT1221抗體之調製 對上述步驟1中獲得的(Fuca1,6)GlucNAc-MHT1221抗體(PB6.0)(20.0mg/mL，0.921mL)，添加糖鏈唑啉(3aR,5R,6S,7R,7aR)-3a,6,7,7a-四氫-7-羥基-5-(羥基甲基)-2-甲基-5H-哌喃并[3,2-d]唑-6-基O-[N5-乙醯基-N1-[2-[2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙基]-α-神經胺酸醣基(neuraminamidosyl)]-(2→6)-O-β-D-半乳哌喃醣基-(1→4)-O-2-(乙醯基胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃醣基-(1→2)-O-α-D-甘露哌喃醣基-(1→3)-O-[O-β-D-半乳哌喃醣基-(1→4)-O-2-(乙醯基胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃醣基-(1→2)-α-D-甘露哌喃醣基-(1→6)]-β-D-甘露哌喃醣苷(WO2019/065964號實施例56，以下[N3-PEG(3)]-MSG1-Ox)(圖12)溶液(PB6.0)(50.0mg/mL，0.0561mL)、及GST-EndoS D233Q/Q303L溶液(WO2017/010559號)(PBS)(5.00mg/mL，0.0738mL)，於30℃保溫3小時。以Agilent 2100 Bioanalyzer確認糖鏈之轉移後，以GST及CHT管柱(AKTA)純化。將包含目的物之劃分取代為10mM乙酸緩衝溶液、5%山梨糖醇pH5.5(以下ABS)，獲得糖鏈修飾MHT1221抗體(10.6mg/mL，1.50mL)。
iii)連接子2 結構式中之(m,n)包含(1,0)及/或(0,1)之成分。
步驟3：抗體與藥物連接子之結合(conjugation) 對上述步驟2中獲得的糖鏈修飾MHT1221(ABS) (10.6mg/mL，0.500mL)，在室溫添加1,2-丙二醇(0.479mL)、連接子2之10mM二甲基亞碸溶液(0.0210mL；對於抗體1分子為6當量)，使用試管旋轉混合器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，使其於室溫反應48小時。
純化操作：將上述溶液以共通操作D純化2次，獲得2.50mL之MHT1221-PBD-ADC溶液。 特性評價：使用共通操作E、F，而獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.62mg/mL，抗體產量：4.06mg(77%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9。
10)-4 MHT1008-PBD-ADC之合成
i)EndoS酵素 ii)EndoS(D233Q/Q303L)酵素，糖鏈唑啉 上述糖鏈修飾抗體之N297糖鏈表示對非還原末端的唾液酸導入了疊氮基的MSG1型糖鏈(WO2019/065964號)(圖12)。
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-MHT1008抗體之調製 將實施例4所調製的MHT1008抗體溶液以PB6.0進行緩衝液交換，調製為ca.16.6mg/mL(0.880mL)。進行與上述實施例10)-3之步驟1同樣的操作，獲得(Fucα1,6)GlcNAc-MHT1008抗體溶液(PB6.0) (16.8mg/mL，0.800mL)。
步驟2：糖鏈修飾MHT1008抗體之調製 使用上述步驟1中獲得的16.8mg/mL (Fucα1,6) GlcNAc-MHT1008抗體溶液(PB6.0) (0.800mL)，藉由進行與實施例10)-3之步驟2同樣的操作，而獲得糖鏈修飾MHT1008抗體(ABS)(11.4mg/mL，1.00mL)。
iii)連接子2 結構式中之(m,n)包含(1,0)及/或(0,1)之成分。
步驟3：抗體與藥物連接子之結合 使用上述步驟2中獲得的糖鏈修飾MHT1008抗體(ABS)(11.4mg/mL，0.450mL)，藉由進行與實施例10)-3之步驟3同樣的操作，而獲得MHT1008-PBD-ADC之溶液(ABS)2.50mL。 特性評價：使用共通操作E、F，而獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.55mg/mL，抗體產量：3.87mg(77%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9。
10)-5 MHT1808-PBD-ADC之合成
i)EndoS酵素 ii)EndoS(D233Q/Q303L)酵素，糖鏈唑啉 上述糖鏈修飾抗體之N297糖鏈表示對非還原末端之唾液酸導入了疊氮基的MSG1型糖鏈(WO2019/065964號)(圖12)。
步驟1：(Fuca1,6)GlucNAc-MHT1808抗體之調製 將實施例9所調製的MHT1808抗體溶液以PB6.0進行緩衝液交換，調製為ca.19.1mg/mL(1.00mL)。進行與上述實施例10)-3之步驟1同樣的操作，獲得(Fucα1,6)GlcNAc-MHT1808抗體溶液(PB6.0) (17.1mg/mL，1.0mL)。
步驟2：糖鏈修飾MHT1808抗體之調製 使用上述步驟1中獲得的17.1mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-MHT1008抗體溶液(PB6.0)(1.00mL)，藉由進行與實施例10)-3步驟2同樣之操作，獲得糖鏈修飾MHT1808抗體(PBS7.4)(7.0mg/mL，1.60mL)。
iii)連接子2 結構式中之(m,n)包含(1,0)及/或(0,1)之成分。
步驟3：抗體與藥物連接子之結合 使用上述步驟2中獲得的糖鏈修飾MHT1808抗體(PBS7.4)(7.00mg/mL，0.450mL)，藉由進行與實施例10)-3之步驟3同樣的操作，獲得MHT1008-PBD-ADC之溶液(ABS)2.50mL。 特性評價：使用共通操作E、F，而獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.24mg/mL，抗體產量：4.35mg (86%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9。
(實施例11)具有不同親和性的抗CD98抗體之遮蔽效果 11)-1 抗CD98抗體之結合親和性評價 使用Biacore T200，將抗CD98抗體(hM23H1L1或對H鏈CDR1導入點變異的hM23-M1(表3、重鏈序列(序列識別號31、圖46)、輕鏈序列(序列識別號32、圖47))作為配體捕捉(capture)到經固定化的抗人類 IgG(Fc)抗體，將CD98抗原作為分析物而進行測定。按照套組説明書，使抗人類IgG(Fc)抗體(Human antibody Capture kit，Cytiva公司)固定到Sensor Chip CM5(Cytiva公司)。使以HBS-EP+(Cytiva公司)稀釋成2μg/mL的進行評價的各抗CD98抗體，以5μL/min接觸60秒而固定化。之後，將以HBS-EP+稀釋的複數濃度之CD98抗原作為分析物，而以流速30μL/min添加各樣品90秒，藉由測定250秒間乖離的多循環動力學(multicycle kinetics)解析，而算出K D。如圖13(A)所示，hM23H1L1及hM23-M1之結合親和性(K D)各自為0.58nM、10.3nM。 11)-2 抗CD98遮蔽抗體之遮蔽效果評價 以與實施例3同樣之方法鑑定源自ZPZP lib的模擬表位，調製抗CD98遮蔽抗體MhM1013(表3、序列識別號33、圖48)、及具有hM23-M1之重鏈與MhM1013之輕鏈的MhM1013-M1(表3)。除了以下記載的部分以外，以與實施例4、實施例6同樣之方法，以ELISA評價添加MMP1的條件、非添加條件下的對於人類CD98抗原之結合活性。在添加蛋白酶的條件，係對於2μM之抗體，添加200nM之MMP1，在37℃反應後，將以MMP緩衝液進行濃度調整的抗體添加到經固定人類CD98抗原之孔中。在未添加蛋白酶的條件亦同樣地，將以MMP緩衝液所調製的抗體添加到各孔中。
如圖13(B)所示，融合了模擬表位肽的MhM1013及MhM1013-M1，係在添加MMP1的條件下顯示比未添加MMP1的條件更強的結合活性。MhM1013及MhM1013-M1之結合的EC 50比(未添加MMP1的條件/添加MMP1的條件)各自為239、552。
(實施例12)ADC化的抗CD98遮蔽抗體之調製・結合活性評價 以驗證是否藉由搭載His團簇而依存於pH降低的遮蔽抗體之殺細胞活性會提升為目的，設計未搭載His團簇的抗CD98遮蔽抗體MhM1018-M1(表3、序列識別號34、圖49)及搭載了His團簇的MhM1024-M1(表3、序列識別號35、圖50)。以與實施例1)-1同樣之方法調製各抗體，以與實施例8同樣之方法，以ELISA評價中性pH條件(pH7.5)、酸性pH條件(pH5.5)下的對人類CD98抗原的結合活性。
如圖14所示，MhM1018-M1在兩pH條件下顯示同等之結合活性，EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)各自為1.7。另一方面，MhM1024-M1係在酸性pH條件下比在中性pH條件下更顯示強的結合，EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)為19.2。
(實施例13)ADC之增殖抑制活性評價 TROP2及CD98陽性細胞之為人類頭頸部癌株的FaDu(ATCC)係以含有10%胎牛血清(Hyclone)的E-MEM培養基(Wako：以下，E-MEM培養基)培養。將FaDu以E-MEM培養基調整成2.0×10 4Cells/mL，對96孔用細胞培養用盤各添加100μL。細胞添加後，FaDu在37℃、5%CO 2下培養一晩。
次日，自培養盤去除E-MEM培養基，添加100μL之以經調整為各pH(7.4、6.5、6.0、5.5)的E-MEM培養基稀釋成300nM、100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.2nM、0.4nM的抗TROP2遮蔽PBD-ADC或抗CD98遮蔽DXd-ADC。在37℃、5%CO 2下培養1小時後，去除含有抗體的培養基，添加100μL之調整為pH7.4的E-MEM培養基。在37℃、5%CO 2下培養6日。培養後，添加與培養液等量之CellTiter-Glo Liminescent Cell Viability Assay (Promega)而以平盤混合器(plate mixer)攪拌。在室溫下靜置10分鐘後，以微量盤分析儀(PerkinElmer)測量發光量。 活細胞率係以下式算出。 活細胞率(%)=a÷b×100 a：被驗物質添加孔之發光量的平均值 b：培養基添加孔之發光量的平均值 13)-1 抗TROP2遮蔽PBD-ADC之殺細胞活性 如圖15-1(A)所示，搭載了His團簇的MHT1808-PBD-ADC係pH降低依存性地顯示強的增殖抑制活性，EC 50比(pH7.4/pH5.5)為10.7。又，未搭載His團簇的MHT1221-PBD-ADC係於任一條件皆顯示同等之增殖抑制活性，EC 50比(pH7.4/pH5.5)為1.9(圖15-1(B))。 13)-2 抗CD98遮蔽DXd-ADC之殺細胞活性 如圖15-2(C)所示，搭載了His團簇的MhM1024-M1-DXd-ADC係pH降低依存性地顯示強的增殖抑制活性，EC 50比(pH7.4/pH5.5)為10.9。又，未搭載His團簇的MhM1018-M1-DXd-ADC係於任一條件皆顯示同等之增殖抑制活性，EC 50比(pH7.4/pH5.5)為2.8(圖15-2(D))。
(實施例14)pH應答性之提升 以pH應答性之提升為目的，各自設計在His團簇附近配置正電荷胺基酸(Arg或Lys)的抗CD98遮蔽抗體MhM1026-M1(表5、序列識別號68、圖57)、MhM1028-M1(表5、序列識別號69、圖58)、MhM1042-M1(表5、序列識別號70、圖59)、MhM1043-M1(表5、序列識別號71、圖60)、MhM1044-M1(表5、序列識別號72、圖61)、MhM1045-M1(表5、序列識別號73、圖62)、MhM1046-M1(表5、序列識別號74、圖63)。與實施例1之1)-1同樣地調製遮蔽抗體，與實施例5、6同樣地，以ELISA評價在中性pH條件、酸性pH條件之結合活性。
如圖56-1(A)所示，在pH7.5的條件，MhM1026-M1、MhM1028-M1、MhM1042-M1、MhM1043-M1顯示同樣的結合活性。另一方面，在pH5.5的條件，MhM1028-M1、MhM1042-M1、MhM1043-M1顯示比MhM1026-M1更強的結合活性(圖56-1(B))。將MhM1026-M1之值設為1而比較EC 50比(中性pH條件/酸性pH條件)的結果，顯示藉由在His團簇附近配置Arg而提升4.0-5.2倍pH應答性(表5)。
同樣地，將在His團簇附近配置Lys的MhM1044-M1、MhM1045-M1、MhM1046-M1之結合活性與MhM1026-M1比較的結果，如圖56-2(C)、(D)所示，不論pH條件為何，全部的植株顯示同樣的結合活性。又，將MhM1026-M1之值設為1而比較EC 50比的結果，植株之間無變化(表5)。
[表5] 表5 抗CD98遮蔽抗體之胺基酸序列資訊與EC 50比之比較
遮蔽抗體名 重鏈序列 輕鏈序列 EC 50比之比較
MhM1026-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1026 (序列識別號68、圖57) 1
MhM1028-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1028 (序列識別號69、圖58) 5.2
MhM1042-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1042 (序列識別號70、圖59) 4.3
MhM1043-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1043 (序列識別號71、圖60) 4.0
MhM1044-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1044 (序列識別號72,圖61) 1.1
MhM1045-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1045 (序列識別號73、圖62) 1.0
MhM1046-M1 hM23-M1 (序列識別號31、圖46) MhM1046 (序列識別號74、圖63) 1.1
[產業上利用之可能性]
本發明之環境應答性遮蔽抗體可使用於各種癌之治療等。 [序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1：抗TROP2抗體之重鏈胺基酸序列(圖16) 序列識別號2：抗TROP2抗體之輕鏈胺基酸序列(圖17) 序列識別號3：MHT1001之胺基酸序列(圖18) 序列識別號4：MHT1002之胺基酸序列(圖19) 序列識別號5：HT1-11-scFv-HL之胺基酸序列(圖20) 序列識別號6：HT1-11-scFv-LH之胺基酸序列(圖21) 序列識別號7：MHT1007之重鏈胺基酸序列(圖22) 序列識別號8：MHT1008之重鏈胺基酸序列(圖23) 序列識別號9：MHT1009之重鏈胺基酸序列(圖24) 序列識別號10：MHT1803之重鏈胺基酸序列(圖25) 序列識別號11：MHT1804之重鏈胺基酸序列(圖26) 序列識別號12：MHT1805之重鏈胺基酸序列(圖27) 序列識別號13：MHT1806之重鏈胺基酸序列(圖28) 序列識別號14：MHT1808之重鏈胺基酸序列(圖29) 序列識別號15：MHT1809之重鏈胺基酸序列(圖30) 序列識別號16：HMT1810之重鏈胺基酸序列(圖31) 序列識別號17：MHT1811之重鏈胺基酸序列(圖32) 序列識別號18：MHT1817之重鏈胺基酸序列(圖33) 序列識別號19：MHT1818之重鏈胺基酸序列(圖34) 序列識別號20：MHT1819之重鏈胺基酸序列(圖35) 序列識別號21：抗CD98抗體hM23H1L1之重鏈胺基酸序列(圖36) 序列識別號22：抗CD98抗體hM23H1L1之輕鏈胺基酸序列(圖37) 序列識別號23：抗EGFR抗體西妥昔單抗之重鏈胺基酸序列(圖38) 序列識別號24：抗EGFR抗體西妥昔單抗之輕鏈胺基酸序列(圖39) 序列識別號25：抗GPRC5D抗體C3022之重鏈胺基酸序列(圖40) 序列識別號26：抗GPRC5D抗體C3022之輕鏈胺基酸序列(圖41) 序列識別號27：MhM8001之輕鏈胺基酸序列(圖42) 序列識別號28：MCE-2101之輕鏈胺基酸序列(圖43) 序列識別號29：MC3-9001之重鏈胺基酸序列(圖44) 序列識別號30：MHT1221之重鏈胺基酸序列(圖45) 序列識別號31：hM23-M1之重鏈胺基酸序列(圖46) 序列識別號32：hM23-M1之輕鏈胺基酸序列(圖47) 序列識別號33：MhM1013之輕鏈胺基酸序列(圖48) 序列識別號34：MhM1018-M1之輕鏈胺基酸序列(圖49) 序列識別號35：MhM1024-M1之輕鏈胺基酸序列(圖50) 序列識別號36：人類uPA所辨識且成為其基質的胺基酸序列(圖51) 序列識別號37：人類uPA所辨識且成為其基質的胺基酸序列(圖51) 序列識別號38：人類uPA所辨識且成為其基質的胺基酸序列(圖51) 序列識別號39：人類MMP1所辨識且成為其基質的胺基酸序列(圖51) 序列識別號40：人類MMP1所辨識且成為其基質的胺基酸序列(圖51) 序列識別號41：人類MMP9所辨識且成為其基質的胺基酸序列(圖51) 序列識別號42：第2肽之胺基酸序列(圖52) 序列識別號43：第2肽之胺基酸序列(圖52) 序列識別號44：第2肽之胺基酸序列(圖52) 序列識別號45：人類GPRC5D胺基末端肽之胺基酸序列(圖53) 序列識別號46：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號47：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號48：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號49：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號50：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號51：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號52：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號53：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號54：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號55：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號56：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號57：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號58：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號59：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號60：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號61：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號62：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號63：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號64：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號65：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號66：第2肽之胺基酸序列(圖54) 序列識別號67：人類CAPN1所辨識且成為其基質的胺基酸序列(圖55) 序列識別號68：MhM1026-M1之輕鏈胺基酸序列(圖57) 序列識別號69：MhM1028-M1之輕鏈胺基酸序列(圖58) 序列識別號70：MhM1042-M1之輕鏈胺基酸序列(圖59) 序列識別號71：MhM1043-M1之輕鏈胺基酸序列(圖60) 序列識別號72：MhM1044-M1之輕鏈胺基酸序列(圖61) 序列識別號73：MhM1045-M1之輕鏈胺基酸序列(圖62) 序列識別號74：MhM1046-M1之輕鏈胺基酸序列(圖63) 序列識別號75：第2肽之胺基酸序列(圖64) 序列識別號76：第2肽之胺基酸序列(圖64) 序列識別號77：第2肽之胺基酸序列(圖64) 序列識別號78：第2肽之胺基酸序列(圖64) 序列識別號79：第2肽之胺基酸序列(圖64) 序列識別號80：第2肽之胺基酸序列(圖64) 序列識別號81：第2肽之胺基酸序列(圖64) 本說明書中引用的全部刊物、專利及專利申請案係藉由直接引用而併入本說明書。
無
圖1呈示本發明之概念。呈示應答pH變化而被活化的遮蔽抗體之型式作為一例。會與抗體之可變區(白)結合的遮蔽結構域(格子)以連接子而與抗體重鏈之可變區融合。於連接子有顯示pH應答性的組胺酸殘基之團簇(His團簇(黑色實心))存在，在中性pH的狀態下遮蔽結構域係與抗體之可變區結合。另一方面，在酸性pH條件下，His團簇內部的組胺酸殘基帶正電，誘發連接子的結構變化，而成為遮蔽結構域遠離抗體的狀態、即抗體可與抗原結合的狀態。 圖2呈示以ELISA評價WO2015/098099號記載之周知的抗TROP2抗體HT1-11與人類TROP2抗原之相互作用的結果。HT1-11係濃度依存性地與抗原結合。 圖3呈示將對於抗TROP2抗體HT1-11之淘選後的肽結合物之濃縮程度以拉下實驗(Pull-down experiment)評價之際的輸出/輸入比。在HT1-11，數值比來自人類血清的IgG(IgG混合物)更高，暗示會與HT1-11特異性結合之肽的濃縮。 圖4-1呈示以ELISA評價scFv型之抗TROP2抗體與人類TROP2抗原之相互作用的結果。結合活性係以未添加MMP的條件(實線)及添加MMP1的條件(點虛線)進行評價。(A)HT1-11-scFv-HL係無關於添加MMP的條件而顯示同樣的結合活性。(B)HT1-11-scFv-LH係無關於添加MMP的條件而顯示同樣的結合活性。 圖4-2呈示以ELISA評價scFv型之抗TROP2抗體與人類TROP2抗原之相互作用的結果。結合活性係以未添加MMP的條件(實線)及添加MMP1的條件(點虛線)進行評價。(C)MHT1001係於添加MMP1的條件下顯示比未添加MMP1的條件更強的結合活性。(D)MHT1002係於添加MMP1的條件下顯示比未添加MMP1的條件更強的結合活性。 圖5-1呈示以ELISA評價IgG型之抗TROP2遮蔽抗體與人類TROP2抗原之相互作用的結果。結合活性係以未添加蛋白酶的條件(實線)及添加蛋白酶的條件(點虛線)進行評價。(A)HT1-11係無關於添加MMP的條件而顯示同樣的結合活性。(B)MHT1007係於添加MMP1的條件下顯示比未添加MMP1的條件更強的結合活性。 圖5-2呈示以ELISA評價IgG型之抗TROP2遮蔽抗體與人類TROP2抗原之相互作用的結果。結合活性係以未添加蛋白酶的條件(實線)及添加蛋白酶的條件(點虛線)進行評價。(C)MHT1008係無關於添加MMP的條件而顯示同樣的結合活性。(D)MHT1009係於添加uPA的條件下顯示比未添加uPA的條件更強的結合活性。 圖6-1呈示以ELISA評價搭載了His團簇的抗TROP2遮蔽抗體與人類TROP2抗原之中性pH條件(pH7.5，實線)或酸性pH條件(pH5.5，點虛線)下的相互作用的結果。(A)MHT1008在兩pH條件下顯示相同的結合活性。(B)MHT1803係在酸性pH條件下顯示比在中性pH條件下強的結合活性。 圖6-2呈示以ELISA評價搭載了His團簇的抗TROP2遮蔽抗體與人類TROP2抗原之中性pH條件(pH7.5，實線)或酸性pH條件(pH5.5，點虛線)下的相互作用的結果。(C)MHT1804係在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。(D)MHT1805係在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。 圖6-3呈示以ELISA評價搭載了His團簇的抗TROP2遮蔽抗體與人類TROP2抗原之中性pH條件(pH7.5，實線)或酸性pH條件(pH5.5，點虛線)下的相互作用的結果。(E)MHT1806係在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。(F)MHT1808係在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。 圖6-4呈示以ELISA評價搭載了His團簇的抗TROP2遮蔽抗體與人類TROP2抗原之中性pH條件(pH7.5，實線)或酸性pH條件(pH5.5，點虛線)下的相互作用的結果。(G)MHT1809係在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。(H)MHT1810係在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。 圖6-5呈示以ELISA評價搭載了His團簇的抗TROP2遮蔽抗體與人類TROP2抗原之中性pH條件(pH7.5，實線)、與MMP1反應的條件(於(I)長虛線)、酸性pH條件(pH6.5，於(J)長虛線)或酸性pH條件(pH5.5，點虛線)下的相互作用的結果。(I)將His團簇與MMP基質搭載於連接子的MHT1811係在酸性pH條件下比在中性pH條件下更顯示強的結合活性。又，在與MMP1反應的條件(長虛線)下亦顯示強的結合活性。(J)MHT1806係在pH6.5以下之酸性pH條件(長虛線)下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。 圖6-6呈示以ELISA評價搭載了His團簇的抗TROP2遮蔽抗體與人類TROP2抗原之中性pH條件(pH7.5，實線)、酸性pH條件(pH6.0，長虛線)或酸性pH條件(pH5.5，點虛線)下的相互作用的結果。(K)MHT1808係在pH6.0以下之酸性pH條件(長虛線)下比在中性pH條件下更顯示強的結合活性。 圖7呈示pH7.5(黑色)、pH6.5(灰色)、pH6.0(白色)下的MHT1808、MHT1817、MHT1818、MHT1819之結合活性。 圖8-1分別呈示以ELISA評價(A)WO2015/146132號記載之周知的抗CD98抗體hM23H1L1與人類CD98抗原之相互作用的結果，及(B)周知之抗EGFR抗體西妥昔單抗與人類EGFR之相互作用的結果。抗體係濃度依存性地與抗原結合。 圖8-2呈示以ELISA評價(C)WO2018/147245號記載之周知的抗GPRC5D抗體C3022與人類GPRC5D抗原之相互作用的結果。抗體係濃度依存性地與抗原結合。 圖9-1呈示(A)肽庫之種類及(B)將對於抗CD98抗體hM23H1L1之淘選後的肽結合物之濃縮程度以拉下實驗評價之際的輸出/輸入比。在標的抗體，數值比來自人類血清的IgG(IgG混合物)更高，暗示標的抗體特異性之肽的濃縮。 圖9-2呈示對於使用圖9-1(A)肽庫的(C)抗EGFR抗體西妥昔單抗、或(D)抗GPRC5D抗體C3022之淘選後的肽結合物之濃縮程度以拉下實驗評價之際的輸出/輸入比。在標的抗體，數值比來自人類血清的IgG(IgG混合物)更高，暗示標的抗體特異之肽的濃縮。 圖10-1分別呈示以ELISA評價搭載了共通之pH應答性連接子的(A)抗CD98遮蔽抗體MhM8001與人類CD98抗原之相互作用、及(B)抗EGFR遮蔽抗體MCE-2101與人類EGFR之相互作用的結果。結合係在中性pH條件(pH7.5、實線)或酸性pH條件(pH5.5、點虛線)下進行評價。任一抗體皆在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。 圖10-2呈示以ELISA評價搭載了共通之pH應答性連接子的(C)抗GPRC5D遮蔽抗體MC3-9001與人類GPRC5D抗原之相互作用的結果。結合係在中性pH條件(pH7.5、實線)或酸性pH條件(pH5.5、點虛線)下進行評價。任一抗體皆在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。 圖11呈示以ELISA評價抗TROP2遮蔽抗體與人類TROP2抗原之相互作用的結果。結合係在中性pH條件(pH7.5、黑色符號)或酸性pH條件(pH5.5、白色符號)下進行評價。MHT1808(黑色圓圈及白色圓圈)係在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。MHT1221(黑色四方形及白色四方形)及MHT1008(黑色三角及白色三角)係在中性pH條件與酸性pH條件下顯示同等之結合活性。 圖12呈示糖鏈修飾抗體之N297糖鏈(對非還原末端的唾液酸導入了疊氮基的MSG1型糖鏈(WO2019/065964號))。 圖13係呈示(A)以SPR(表面電漿共振(Surface plasmon resonance))評價對hM23H1L1重鏈可變區內之CDR1導入點變異而成的hM23-M1對於人類CD98抗原之結合活性的結果、及(B)以ELISA評價對MhM1013導入上述變異而成的MhM1013-M1對於人類CD98抗原之結合活性的結果。MhM1013-M1(灰色)顯示與MhM1013(黑色)同等以上之遮蔽效果。 圖14呈示以ELISA評價抗CD98遮蔽抗體與人類CD98抗原之相互作用的結果。結合係在中性pH條件(pH7.5，黑色符號)或酸性pH條件(pH5.5，白色符號)下進行評價。MhM1018-M1(黑色圓圈及白色圓圈)係在中性pH條件和酸性pH條件下顯示同等之結合活性。MhM1024-M1(黑色四方形及白色四方形)係在酸性pH條件下比在中性pH條件下顯示強的結合活性。 圖15-1呈示遮蔽抗體ADC之pH7.4(白色圓圈、灰色實線)、pH6.5(四方形、灰色點虛線)、pH6.0(黑色圓圈、黑色點虛線)、pH5.5(黑色四方形、黑色實線)下的活體外增殖抑制活性。(A)MHT1808-PBD-ADC顯示依存於pH降低之強的增殖抑制活性。(B)MHT1221-PBD-ADC在所有條件下皆顯示同等的增殖抑制活性。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖15-2呈示遮蔽抗體ADC之pH7.4(白色圓圈、灰色實線)、pH6.5(四方形、灰色點虛線)、pH6.0(黑色圓圈、黑色點虛線)、pH5.5(黑色四方形、黑色實線)下的活體外增殖抑制活性。(C)MhM1024-M1-DXd-ADC顯示依存於pH降低之強的增殖抑制活性。(D)MhM1018-M1-DXd-ADC在所有條件下皆顯示同等的增殖抑制活性。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖16為HT1-11 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號1)。 圖17為HT1-11 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號2)。 圖18為MHT1001全長之胺基酸序列(序列識別號3)。 圖19為MHT1002全長之胺基酸序列(序列識別號4)。 圖20為HT1-11-scFv-HL全長之胺基酸序列(序列識別號5)。 圖21為HT1-11-scFv-LH全長之胺基酸序列(序列識別號6)。 圖22為MHT1007 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號7)。 圖23為MHT1008 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號8)。 圖24為MHT1009 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號9)。 圖25為MHT1803 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號10)。 圖26為MHT1804 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號11)。 圖27為MHT1805 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號12)。 圖28為MHT1806 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號13)。 圖29為MHT1808 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號14)。 圖30為MHT1809 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號15)。 圖31為MHT1810 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號16)。 圖32為MHT1811 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號17)。 圖33為MHT1817 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號18)。 圖34為MHT1818 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號19)。 圖35為MHT1819 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號20)。 圖36為hM23H1L1 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號21)。 圖37為hM23H1L1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號22)。 圖38為西妥昔單抗 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號23)。 圖39為西妥昔單抗 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號24)。 圖40為C3022 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號25)。 圖41為C3022 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號26) 圖42為MhM8001 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號27)。 圖43為MCE-2101 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號28)。 圖44為MC3-9001 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號29)。 圖45為MHT1221 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號30)。 圖46為hM23-M1 H鏈全長之胺基酸序列(序列識別號31)。 圖47為hM23-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號32)。 圖48為MhM1013 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號33)。 圖49為MhM1018-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號34)。 圖50為MhM1024-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號35)。 圖51為人類uPA所辨識且成為其基質的胺基酸序列及人類MMP1或人類MMP9所辨識且成為其基質的胺基酸序列(序列識別號36～41)。 圖52為第2肽之胺基酸序列(序列識別號42～44)。 圖53為人類GPRC5D胺基末端肽之胺基酸序列(序列識別號45)。 圖54為第2肽之胺基酸序列(序列識別號46～66)。 圖55為人類CAPN1所辨識且成為其基質的胺基酸序列(序列識別號67)。 圖56-1呈示以ELISA評價抗CD98遮蔽抗體與人類CD98抗原之相互作用的結果。(A)、(B)分別呈示pH7.5、pH5.5之條件下的MhM1026-M1(黑色圓圈)、MhM1028-M1(黑色四方形)、MhM1042-M1(圓圈)、MhM1043-M1(四方形)之結合活性。 圖56-2呈示以ELISA評價抗CD98遮蔽抗體與人類CD98抗原之相互作用的結果。(C)、(D)分別呈示pH7.5、pH5.5之條件下的MhM1026-M1(黑色圓圈)、MhM1044-M1(黑色四方形)、MhM1045-M1(圓圈)、MhM1046-M1(四方形)之結合活性。 圖57為MhM1026-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號68)。 圖58為MhM1028-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號69)。 圖59為MhM1042-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號70)。 圖60為MhM1043-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號71)。 圖61為MhM1044-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號72)。 圖62為MhM1045-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號73)。 圖63為MhM1046-M1 L鏈全長之胺基酸序列(序列識別號74)。 圖64為第2肽之胺基酸序列(序列識別號75～81)。
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無。

Claims (65)

  1. 一種會與標的抗原結合的分子，其包含下述[a]部分、[b]部分及[c]部分而成： [a]部分為會與標的抗原結合之部分； [b]部分為辨識[a]部分所包含的標的抗原結合部位之第1肽； [c]部分為由包含下列胺基酸的胺基酸序列所構成之第2肽，該胺基酸係在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷。
  2. 如請求項1之分子，其於酸性條件下，與中性條件下比較，對標的抗原具有更高的結合親和性。
  3. 如請求項1或2之分子，其中[a]部分、[b]部分及[c]部分為各自包含1個或2個以上。
  4. 如請求項1至3中任一項之分子，其中[a]部分、[b]部分及[c]部分為各自包含1個或2個以上，且[a]部分、[b]部分及[c]部分每一者的數目彼此相同。
  5. 如請求項1或2之分子，其中[a]部分、[b]部分及[c]部分為各自包含2個。
  6. 如請求項1至5中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含4個以上之在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，且第2肽的pI值大於6.4。
  7. 如請求項1至6中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含4個以上之在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，且第2肽的pI值為6.8以上。
  8. 如請求項1至7中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含4個以上之在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，且第2肽的pI值為7.2以上。
  9. 如請求項1至8中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含4個以上之在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷的胺基酸，且第2肽的pI值為7.6以上。
  10. 如請求項1至9中任一項之分子，其中第2肽由不包含pH為酸性條件時具有負電荷的胺基酸之胺基酸序列所構成。
  11. 如請求項1至10中任一項之分子，其中第2肽由不包含天冬胺酸及/或麩胺酸之胺基酸序列所構成。
  12. 如請求項1至11中任一項之分子，其中第2肽由具有以下之(1)及(2)的結構之胺基酸序列所構成： (1)包含1個以上之 (a)由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列、或 (b)在(a)之在胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸或離胺酸插入或附加而成的胺基酸序列(將(a)之胺基酸序列及(b)之胺基酸序列稱為鹼性胺基酸團簇)；且 (2)包含共計4個以上之該在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。
  13. 如請求項1至12中任一項之分子，其中第2肽由具有以下之(1)及(2)的結構之胺基酸序列所構成： (1)包含1個以上之在由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸插入或附加而成的胺基酸序列；且 (2)包含共計4個以上之該在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。
  14. 如請求項1至13中任一項之分子，其中第2肽由具有以下之(1)及(2)的結構之胺基酸序列所構成： (1)包含1個之在由連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸所構成的胺基酸序列的任意位置(包含胺基末端或羧基末端)有1個精胺酸插入或附加而成的胺基酸序列；且 (2)包含共計4個以上之該在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。
  15. 如請求項1至14中任一項之分子，其中第2肽由具有以下之(1)及(2)的結構之胺基酸序列所構成： (1)包含1個之以RHHH表示的胺基酸序列；且 (2)包含共計4個以上之該在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。
  16. 如請求項1至12中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含1個以上之連續2個以上之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸，且包含共計4個以上之該在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。
  17. 如請求項1至11中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所表示的結構所構成，該胺基酸序列包含每隔1個胺基酸而具有在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸之胺基酸序列。
  18. 如請求項12至17中任一項之分子，其中鹼性官能基之pKa為5.0～7.0。
  19. 如請求項12至18中任一項之分子，其中鹼性官能基之pKa為5.5～6.5。
  20. 如請求項12至19中任一項之分子，其中在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸為天然胺基酸。
  21. 如請求項12至19中任一項之分子，其中在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸為非天然胺基酸。
  22. 如請求項12至20中任一項之分子，其中在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸為組胺酸。
  23. 如請求項1至22中任一項之分子，其中第2肽由包含1～4個之鹼性胺基酸團簇的胺基酸序列所構成。
  24. 如請求項1至23中任一項之分子，其中第2肽由10～60個之胺基酸所構成。
  25. 如請求項1至24中任一項之分子，其中第2肽由12～50個之胺基酸所構成。
  26. 如請求項1至25中任一項之分子，其中第2肽由15～40個之胺基酸所構成。
  27. 如請求項1至26中任一項之分子，其中第2肽由20～35個之胺基酸所構成。
  28. 如請求項1至16及18至27中任一項之分子，其中第2肽包含序列識別號49至53、55、59至61、65、66、75至81(圖54及64)之任一者所示的胺基酸序列。
  29. 如請求項17至27中任一項之分子，其中第2肽包含序列識別號54(圖54)所示的胺基酸序列。
  30. 如請求項1至29中任一項之分子，其EC 50比為3以上。
  31. 如請求項1至30中任一項之分子，其EC 50比為10以上。
  32. 如請求項1至31中任一項之分子，其EC 50比為30以上。
  33. 如請求項1至32中任一項之分子，其中第2肽由下述胺基酸序列所構成，該胺基酸序列包含10個以下之在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸。
  34. 如請求項1至33中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列包含2個以上之鹼性胺基酸團簇，有1個鹼性胺基酸團簇位於該胺基酸序列之胺基末端或羧基末端，且其他之任一個鹼性胺基酸團簇皆未位於該胺基酸序列之胺基末端或羧基末端。
  35. 如請求項1至33中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列包含2個以上之鹼性胺基酸團簇，有1個鹼性胺基酸團簇位於該胺基酸序列之胺基末端，且有其他之1個鹼性胺基酸團簇位於羧基末端。
  36. 如請求項1至33中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列所包含的任一個鹼性胺基酸團簇皆未位於該胺基酸序列之胺基末端且未位於羧基末端。
  37. 如請求項1至34或36中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列包含會被細胞內及/或細胞外之蛋白酶切斷的胺基酸序列及包含鹼性胺基酸團簇的胺基酸序列，該胺基酸序列為： (1)從胺基末端向羧基末端，以包含鹼性胺基酸團簇的胺基酸序列、會被細胞內及/或細胞外之蛋白酶切斷的胺基酸序列的順序連結而成；或 (2)從羧基末端向胺基末端，以會被細胞內及/或細胞外之蛋白酶切斷的胺基酸序列、包含鹼性胺基酸團簇的胺基酸序列的順序連結而成。
  38. 如請求項12至37中任一項之分子，其中第2肽之胺基酸序列所包含的在側鏈具有pKa為7以下之鹼性官能基的胺基酸數，為該胺基酸序列所包含的總胺基酸數之5%以上30%以下。
  39. 如請求項1至38中任一項之分子，其以第1肽、第2肽、會與標的抗原結合之部分的順序連結而成。
  40. 如請求項1至39中任一項之分子，其中會與標的抗原結合之部分，為由第1肽及第2肽所不包含的胺基酸序列所構成的多肽。
  41. 如請求項1至40中任一項之分子，其由多肽所構成。
  42. 如請求項41之分子，其從胺基末端向羧基末端，以第1肽、第2肽、會與標的抗原結合之部分結合而成。
  43. 如請求項1至42中任一項之分子，其中選自由第1肽、第2肽及會與標的抗原結合之部分所組成的群組之任1個，係與其他2個之中的1個或兩方透過連接子或間隔子(spacer)結合。
  44. 如請求項1至43中任一項之分子，其中酸性條件為pH6.5以下。
  45. 如請求項1至44中任一項之分子，其中酸性條件為pH6.0以下。
  46. 如請求項1至45中任一項之分子，其中酸性條件為pH5.5以下。
  47. 如請求項1至46中任一項之分子，其中標的抗原為存在於腫瘤組織、胞內體或溶酶體的抗原。
  48. 如請求項1至47中任一項之分子，其係在會與標的抗原結合之部分有為其他部分之[d]部分結合而成，且[d]部分不包含第1肽及第2肽。
  49. 如請求項48之分子，其中[d]部分為選自由下述所組成的群組之1個或2個以上：非會與標的抗原結合之部分的抗體或其抗原結合片段、包含第1肽及第2肽所不包含的胺基酸序列之肽、細胞介素、毒素、放射性同位素、標識分子、光敏感性物質、免疫賦活物質、抗腫瘤性化合物、藥物、有效負載(payload)以及聚合物。
  50. 如請求項49之分子，其中抗腫瘤性化合物為喜樹鹼(camptothecin)衍生物或吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)衍生物，較佳為喜樹鹼衍生物係N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]-2-羥基乙醯胺。
  51. 如請求項49之分子，其中免疫賦活物質為環狀二核苷酸衍生物。
  52. 如請求項48至51中任一項之分子，其由多肽所構成、或由[d]部分及多肽所構成。
  53. 如請求項1至52中任一項之分子，其中第1肽係藉由包含下述步驟(i)～(iii)的方法而獲得： (i)使包含芳香族性胺基酸和Pro的重複序列之肽庫與如請求項1之會與標的抗原結合之部分接觸的步驟； (ii)將與該會與標的抗原結合之部分結合的肽回收的步驟；及 (iii)將獲得的肽藉由重組、化學合成或肽合成而調製的步驟。
  54. 如請求項1至52中任一項之分子之製造方法，其包含將包含第1肽所包含的胺基酸序列及/或第2肽所包含的胺基酸序列而成的肽藉由重組、活體外轉譯、化學合成或肽合成而調製的步驟。
  55. 一種會與標的抗原結合的分子，其係藉由如請求項54之方法而獲得。
  56. 如請求項41、42或52中任一項之分子之製造方法，其包含下述(iv)記載之步驟： (iv)將包含核苷酸序列而成的多核苷酸導入細胞，培養該細胞，且自該培養物回收會與該標的抗原結合之多肽的步驟，其中該核苷酸序列編碼會與標的抗原結合之部分所包含的胺基酸序列、以及可選擇地(optionally)編碼第1肽所包含的胺基酸序列及/或第2肽所包含的胺基酸序列。
  57. 一種會與標的抗原結合的分子，其係藉由如請求項56之方法而獲得。
  58. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至53、55及57中任一項之分子、其鹽或彼等之水合物。
  59. 如請求項58之醫藥組成物，其為抗癌劑。
  60. 如請求項58或59之醫藥組成物，其係藉由使會與標的抗原結合的分子之中性pH條件下的抗原結合活性比酸性pH條件下的抗原結合活性弱，而與第2肽不包含下述胺基酸的分子比較，降低了會與標的抗原結合的分子對於被投予者之毒性，該胺基酸係在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷。
  61. 如請求項58或59之醫藥組成物，其係藉由使會與標的抗原結合的分子之中性pH條件下的抗原結合活性比酸性pH條件下的抗原結合活性弱，而與第2肽不包含下述胺基酸的分子比較，提升了會與標的抗原結合的分子對於被投予者之血中濃度，該胺基酸係在pH7.5以下之範圍內因應pH由中性條件變化成酸性條件而電荷會從無電荷變化成正電荷。
  62. 一種檢查藥、診斷藥或試藥，其包含如請求項1至53、55及57中任一項之分子或如請求項58之醫藥組成物。
  63. 一種多核苷酸，其包含編碼如請求項41或52之分子之胺基酸序列的核苷酸序列。
  64. 一種載體，其包含如請求項63之多核苷酸。
  65. 一種細胞，其包含如請求項63之多核苷酸或者是如請求項64之載體、或會產生如請求項41或52之分子。
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