JP2023502883A - クローディン１８．２を標的とする抗体－薬物コンジュゲート - Google Patents

クローディン１８．２を標的とする抗体－薬物コンジュゲート Download PDF

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Abstract

野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片に結合した薬物部分を含む抗体－薬物コンジュゲートが提供される。抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のβ３－β４ループ（配列番号３０の残基４５～６３、ＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣ）およびβ５鎖（配列番号３０の残基１６９～１７２、ＹＴＦＧ）に結合する。いくつかの実施形態では、薬物部分の数と抗体または断片の数との比は、１：１～２０：１である。

Description

背景
クローディン、例えばクローディン１８．２は、がん免疫療法の有望な標的と考えられている。クローディンは、タイトセルジャンクションの重要な構成要素を形成するタンパク質のファミリーである。それらは、細胞間の分子の流れを制御する傍細胞バリアを確立する。タンパク質は、細胞質にＮ末端およびＣ末端を有する。異なるクローディンは異なる組織で発現され、それらの機能の変化はそれぞれの組織のがんの形成に関連している。クローディン－１は結腸がんで発現され、クローディン－１８は胃がんで発現され、クローディン－１０は肝細胞癌で発現される。
クローディン１８は、２つのアイソフォーム、アイソフォーム１およびアイソフォーム２を有する。アイソフォーム２（クローディン１８．２またはＣＬＤＮ１８．２）は、高度に選択的な細胞系統マーカーである。正常組織におけるクローディン１８．２の発現は、厳密には胃粘膜の分化した上皮細胞に限定されるが、胃幹細胞領域には存在しなかった。クローディン１８．２は悪性形質転換において保持され、かなりの割合の原発性胃がんおよびその転移で発現された。クローディン１８．２の頻繁に異所性の活性化は、膵臓、食道、卵巣および肺の腫瘍にも見られた。これらのデータは、ＣＬＤＮ１８．２が、ヒトがんの多様性において頻繁な異所性活性化を伴って、正常組織において高度に制限された発現パターンを有することを示唆した。
概要
野生型クローディン１８．２および一般的な変異体Ｍ１４９Ｌに選択的に結合し、クローディン１８．１などの他のクローディン１８アイソフォームには結合しない抗クローディン１８．１抗体が本明細書で発見される。驚くべき予想外の発見において、本開示は、これらの抗体が、特に臨床開発中のリード抗クローディン１８．２抗体であるＩＭＡＢ３６２（クロージキシマブ（ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ））と比較した場合に、受容体媒介抗体インターナリゼーションの誘導において非常に有効であることを実証する。したがって、薬物部分にコンジュゲートした場合、これらの抗体は、クローディン１８．２タンパク質を過剰発現するがん細胞などの標的細胞に薬物を効率的に送達することができる。
本開示の抗体の受容体媒介抗体インターナリゼーションを誘導する能力の大幅な増加は、これらの抗体がクローディン１８．２タンパク質にどのように結合するかに起因し得る。実施例１４で実証され、図２０に示されるように、抗体への結合に重要なクローディン１８．２タンパク質上のアミノ酸残基は、細胞外ループ（例えば、Ｗ３０、Ｌ４９、Ｗ５０、Ｃ５３、Ｃ６３およびＲ８０）のコンフォメーションを安定化するために重要なものを含む。より重要なことに、抗体への結合に関与する残基は、第１の細胞外ループのβ３鎖とβ４鎖との間に位置するＮ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０およびＥ６２、ならびに第２の細胞外ループのβ５にあるＹ１６９およびＧ１７２を含むと考えられる。対照的に、既知の抗クローディン１８．２抗体は、細胞外ループの一方にのみ結合すると考えられる。
本開示の一実施形態によれば、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片に共有結合した薬物部分を含み、抗体またはその断片がＣＬＤＮ１８．２のβ３－β４ループおよびβ５鎖に結合する、抗体－薬物コンジュゲートが提供される。β３－β４ループは配列番号３０の残基４５～６３（ＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣ）からなり、β５鎖は配列番号３０の残基１６９～１７２（ＹＴＦＧ）からなる。
いくつかの実施形態では、薬物部分の数と抗体または断片の数との比は、１：１～２０：１である。いくつかの実施形態では、比は２：１～１０：１である。いくつかの実施形態では、比は２：１～６：１である。いくつかの実施形態では、比は、約２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１または５：１である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、β１およびβ２に結合しないか、またはβ３－β４ループもしくはβ５鎖への結合の親和性の少なくとも１０分の１の親和性でβ１もしくはβ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．１タンパク質に結合しないか、またはＣＬＤＮ１８．２への結合の親和性の少なくとも１０分の１の親和性でＣＬＤＮ１８．１に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、野生型ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に対する親和性の少なくとも１％である親和性でＣＬＤＮ１８．２ Ｍ１４９Ｌ変異体に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０およびＥ６２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、ならびに配列番号３０のＹ１６９およびＧ１７２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。
薬物部分は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、免疫抑制剤、放射性同位体、毒素などであり得る。薬物部分は、がん細胞に放出されると、がん細胞の増殖を阻害するか、またはがん細胞にアポトーシスを引き起こすことができる。薬物部分の例は、ＤＭ１（メイタンシン、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－またはＮ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－メイタンシン）、ｍｃ－ＭＭＡＤ（６－マレイミドカプロイル－モノメチルアウリスタチンＤまたはＮ－メチル－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－メトキシ－４－［（２Ｓ）－２－［（１Ｒ，２Ｒ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソ－３－［［（１Ｓ）－２－フェニル－１－（２－チアゾリル）エチル］アミノ］プロピル］－１－ピロリジニル］－１－［（１Ｓ）－１－メチルプロピル］－４－オキソブチル］－Ｎ－メチル－（９Ｃｌ）－Ｌ－バリンアミド）、ｍｃ－ＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル－モノメチルアウリスタチンＦまたはＮ－［６－（２，５－ジヒドロ－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１－オキソヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｌ－バリル－Ｌ－バリル－（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－３－メトキシ－５－メチル－４－（メチルアミノ）ヘプタノイル－（αＲ，βＲ，２Ｓ）－β－メトキシ－α－メチル－２－ピロリジンプロパノイル－Ｌ－フェニルアラニン）およびｍｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＥ（６－マレイミドカプロイル－ＶａｌｃＣｉｔ－（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）－モノメチルアウリスタチンＥまたはＮ－［［［４－［［Ｎ－［６－（２，５－ジヒドロ－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１－オキソヘキシル］－Ｌ－バリル－Ｎ５－（アミノカルボニル）－Ｌ－オルニチル］アミノ］フェニル］メトキシ］カルボニル］－Ｎ－メチル－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ，２Ｒ）－４－［（２Ｓ）－２－［（１Ｒ，２Ｒ）－３－［［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－メチル－２－フェニルエチル］アミノ］－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル］－１－ピロリジニル］－２－メトキシ－１－［（１Ｓ）－１－メチルプロピル］－４－オキソブチル］－Ｎ－メチル－Ｌ－バリンアミド）からなる群より選択される。ＤＭ１は、チューブリン阻害剤メイタンシンの誘導体であり、一方、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦは、アウリスタチン誘導体である。
疾患および状態を処置するための方法および使用も提供される。一実施形態では、本開示の抗体－薬物コンジュゲートを患者に投与することを含む、がんの処置を必要とする患者のがんを処置する方法が提供される。
図１は、フローサイトメトリーによって、ＤＮＡ免疫後の全てのマウス由来のマウス血清がＣＬＤ１８Ａ２をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞と高いタイトレーションで反応したことを示し、ＣＬＤ１８Ａ１は陰性対照である。
図２は、細胞ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによって、ハイブリドーマ上清がヒトＣＬＤ１８Ａ２をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に結合し得ることを示す。
図３は、フローサイトメトリーによって、精製マウス抗体が、陽性参照抗体と比較して、高いＥＣ５０でヒトＣＬＤ１８Ａ２をトランスフェクトしたＭＫＮ４５細胞に結合し得ることを示す。
図４は、フローサイトメトリーによって、精製マウス抗体が、高いＥＣ５０でＭ１４９Ｌ変異を有するヒトＣＬＤ１８Ａ２を内因的に発現するＳＵ６２０細胞に結合し得る一方で、参照抗体は結合しなかったことを示す。
図５は、フローサイトメトリーによって、精製マウス抗体が、高いＥＣ５０でマウスＣＬＤ１８Ａ２をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に結合し得ることを示す。
図６は、フローサイトメトリーによって、精製マウス抗体が、高いＥＣ５０でカニクイザルＣＬＤ１８Ａ２をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に結合し得ることを示す。
図７は、フローサイトメトリーによって、精製マウス抗体が、高いＥＣ５０でヒトＣＬＤ１８Ａ２をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に結合し得ることを示す。
図８は、フローサイトメトリーによって、キメラ抗体が、陽性参照抗体と比較して、高いＥＣ５０でヒトＣＬＤ１８Ａ２をトランスフェクトしたＭＫＮ４５細胞に結合し得ることを示す。
図９は、フローサイトメトリーによって、キメラ抗体が、ヒトＣＬＤ１８Ａ１をトランスフェクトしたＭＫＮ４５細胞に結合し得ないことを示す。
図１０は、フローサイトメトリーによって、ヒト化抗体が、陽性参照抗体と比較して、高いＥＣ５０でヒトＣＬＤ１８Ａ２をトランスフェクトしたＭＫＮ４５細胞に結合し得ることを示す。
図１１は、フローサイトメトリーによって、ヒト化抗体が、ヒトＣＬＤ１８Ａ１をトランスフェクトしたＭＫＮ４５細胞に結合し得ないことを示す。
図１２は、フローサイトメトリーによって、ＣＤＲ変異を有するヒト化抗体が、陽性参照抗体と比較して、高いＥＣ５０でヒトＣＬＤ１８Ａ２をトランスフェクトしたＭＫＮ４５細胞に結合し得ることを示す。
図１３は、フローサイトメトリーによって、ＣＤＲ変異を有するヒト化抗体がヒトＣＬＤ１８Ａ１をトランスフェクトしたＭＫＮ４５細胞に結合し得ないことを示す。
図１４は、脱リスクバリアントが細胞表面ＣＬＤ１８Ａ２への強力な結合を有していたことを示す。
図１５は、ＣＬＤ１８Ａ２の特定の変異が、これらの変異体をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に結合する示された抗体に有意な効果を有することを示し、これらのアミノ酸残基がエピトープの少なくとも一部を構成することを示唆する。
図１６は、抗体４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２が、１７５Ｄ１０と比較して、クローディン１８．２の高ＣＨＯ－Ｋ１細胞および低ＣＨＯ－Ｋ１細胞の両方において優れた結合を有していたことを示す。
図１７は、１７５Ｄ１０抗体を参照として使用した４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２の有力なＡＤＣＣ試験結果を示す。
図１８は、４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２のＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅバージョンが、ＡＤＣＣアッセイにおいて１７５Ｄ１０対応物よりも性能が優れていたことを示す。
図１９は、４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２も、１７５Ｄ１０よりも優れたＡＤＣＰ効果を有していたことを示す。
図２０は、クローディンタンパク質の３Ｄおよびモチーフ構造を示す。
図２１は、クローディン１８．２を発現するＣＨＯ細胞上での、参照抗体ＩＭＡＢ３６２と比較した試験キメラ抗体のインターナリゼーション結果を示す。
図２２は、クローディン１８．２を発現するＣＨＯ細胞上での、参照抗体ＩＭＡＢ３６２と比較した試験ヒト化抗体のインターナリゼーション結果を示す。
図２３は、クローディン１８．２を発現するＭＫＮ４５細胞上での、参照抗体ＩＭＡＢ３６２と比較した試験ヒト化抗体のインターナリゼーション結果を示す。
図２４は、抗体およびそれらの薬物コンジュゲートの結合親和性を示す。
図２５Ａは、ＤＡＮ－Ｇトランスフェクタントへのインターナリゼーションの際の試験抗体－ＭＭＡＥコンジュゲートの細胞毒性を示す。図２５Ｂは、ＮＵＧＣトランスフェクタントへのインターナリゼーションの際の試験抗体－ＭＭＡＥコンジュゲートの細胞毒性を示す。 図２５Ｃは、ＳＣＧ－７９０１トランスフェクタントへのインターナリゼーションの際の試験抗体－ＭＭＡＥコンジュゲートの細胞毒性を示す。
図２６は、ヒトクローディン１８．２を内因的に発現するＳＮＵ６２０へのインターナリゼーションの際の試験抗体－ＭＭＡＥコンジュゲートの細胞毒性を示す。
図２７は、試験用動物における腫瘍成長の減少について抗体－薬物コンジュゲートを抗体単独と比較する。
図２８は、抗体－薬物コンジュゲートの平均または個々の腫瘍減少効果を示す。
定義
「ａ」または「ａｎ」を付した実体の用語は、その実体の１つまたはそれを超えるものを指すことに留意されたい。例えば、「ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗体）」は、１つまたはそれを超える抗体を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたはそれを超える」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」も複数の「ポリペプチド」も包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に結合されたモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれを超えるアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、産物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つもしくはそれを超えるアミノ酸の１つもしくは複数の鎖を指すのに使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語と互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことが意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来し得るか、または組換え技術によって産生され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない。これは、化学合成を含む任意の方法で生成され得る。
細胞、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、巨大分子の天然源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。本明細書で使用される「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ技術によって産生された場合、細胞物質、ウイルス物質、もしくは培養培地、または化学合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然の状態では見られない核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質または組織から単離された細胞またはポリペプチドを指すのに本明細書で使用される。単離されたポリペプチドは、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する「組換え」という用語は、天然には存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態が意図され、その非限定的な例は、通常は一緒に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることによって作製することができる。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的でアラインメントされ得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占められる場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有されるマッチする位置または相同位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性を共有するが、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列と一定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％）の「配列同一性」を有するとは、アラインメントさせた場合、その割合の塩基（またはアミノ酸）が、２つの配列を比較する際に同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性またはパーセント配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものを使用して決定され得る。好ましくは、デフォルトパラメータがアラインメントに使用される。１つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的に等価なポリヌクレオチドは、上記の特定のパーセント相同性を有し、同じまたは類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
「等価な核酸またはポリヌクレオチド」という用語は、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列とある程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸のホモログは、その相補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことが意図される。一態様では、核酸のホモログは、核酸またはその相補体にハイブリダイズすることができる。同様に、「等価なポリペプチド」とは、参照ポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを指す。いくつかの態様では、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。いくつかの態様では、等価なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの付加、欠失、置換およびそれらの組み合わせを有する。いくつかの態様では、等価な配列は、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩橋）を保持する。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。一般に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、約１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度/温度の溶液中で約４０℃にて行われる。典型的には、中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、約６×ＳＳＣ中で約５０℃にて行われ、一般に、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、約１×ＳＳＣ中で約６０℃にて行われる。ハイブリダイゼーション反応は、当業者に周知の「生理学的条件下」で行うこともできる。生理学的条件の非限定的な例は、細胞内に通常見られる温度、イオン強度、ｐＨおよびＭｇ２＋の濃度である。
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）の特定の配列から構成され、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）が入る。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピュータ内のデータベースに入力することができ、機能ゲノミクスおよび相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用することができる。「多型」という用語は、遺伝子またはその一部の１つより多い形態の共存を指す。少なくとも２つの異なる形態、すなわち、２つの異なるヌクレオチド配列がある遺伝子の一部は、「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多型領域は、その同一性が異なる対立遺伝子において異なる単一ヌクレオチドであり得る。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ポリヌクレオチドの組立ての前または後にヌクレオチド構造に対する修飾を付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知または予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれとの両方を包含する。
「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、その天然の状態で、または当業者に周知の方法によって操作されるとき、転写および/または翻訳されてポリペプチドおよび/またはその断片のためのｍＲＮＡを産生することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、そこからコード配列を推定することができる。
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、完全抗体および任意の抗原結合断片またはその一本鎖であり得る。したがって、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。そのようなものの例としては、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域もしくはその任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも一部が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部である。構造にかかわらず、抗体断片は、インタクトな抗体によって認識される同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語は、アプタマー、シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）、およびダイアボディを含む。「抗体断片」という用語はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質を含む。
「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様では、領域は１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されている。リンカーは、柔軟性のためにグリシンに富むことができ、溶解性のためにセリンまたはトレオニンに富むことができ、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続することができ、またはその逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。ＳｃＦｖ分子は当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
抗体という用語は、生化学的に区別することができる様々な広範なクラスのポリペプチドを包含する。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、その中にいくつかのサブクラスがあることを理解する（例えば、γｌ－γ４）。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは、十分に特徴付けられており、機能特化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾バージョンは、本開示を考慮して当業者に容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスが明らかに本開示の範囲内であり、以下の議論は一般に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。４つの鎖は、典型的には、「Ｙ」字型のジスルフィド結合によって結合され、軽鎖は、「Ｙ」の口から始まり可変領域を通って続く重鎖を腕木で支える。
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書中に開示されるＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ，λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合し得る。一般に、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、軽鎖および重鎖は互いに共有結合され、２つの重鎖の「テール」部分は共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ字型のフォーク状末端のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端まで及ぶ。
軽鎖および重鎖ともに、構造的および機能的に相同性のある領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。これに関して、軽鎖部分（ＶＫ）および重鎖部分（ＶＨ）の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが理解されよう。逆に、軽鎖（ＣＫ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、例えば、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である。ＣＨ３ドメインおよびＣＫドメインは、実際には、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
上記のように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＫドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＫ鎖の各々の３つのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）によって規定される。いくつかの例では、例えば、ラクダ種に由来するか、またはラクダ免疫グロブリンに基づいて操作された特定の免疫グロブリン分子では、完全な免疫グロブリン分子は、軽鎖を含まず、重鎖のみからなり得る。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）を参照されたい。
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境でその三次元立体配置をとるときに抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されるアミノ酸の短い不連続配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる抗原結合ドメイン内のアミノ酸の残りの部分は、分子間の変動性が少ない。フレームワーク領域は、主にβシート構造をとり、ＣＤＲは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってＣＤＲを正しい向きへの配置をもたらす足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、その同族エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、それらが正確に定義されているので（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓ」、Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７））、当業者によって任意の所与の重鎖可変領域または軽鎖可変領域について容易に同定することができる。
当技術分野内で使用および/または許容される用語の２つまたはそれを超える定義がある場合、本明細書で使用される用語の定義は、明示的に反対のことが述べられていない限り、全てのそのような意味を含むことが意図される。具体的な一例が、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる不連続な抗原結合部位を記述するための「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの定義は、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内であることが意図される。上記で引用した参考文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を比較として以下の表に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変化する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
Figure 2023502883000001
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定義した。当業者は、配列自体を超えるいかなる実験データにも依存することなく、「Ｋａｂａｔナンバリング」のこのシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示されるナンバリングシステムを指す。
上記の表に加えて、Ｋａｂａｔナンバーシステムは、以下のようにＣＤＲ領域を記述する：ＣＤＲ－Ｈ１は、およそアミノ酸３１（すなわち、第１のシステイン残基からおよそ９残基下流）で始まり、およそ５～７個のアミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｈ２は、ＣＤＲ－Ｈ１の末端から１５番目の残基で始まり、およそ１６～１９個のアミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリジン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｈ３は、ＣＤＲ－Ｈ２の末端からおよそ３３番目のアミノ酸残基で始まり、３～２５個のアミノ酸を含み、配列Ｗ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終わり、Ｘは任意のアミノ酸である。ＣＤＲ－Ｌ１は、およそ残基２４で始まり（すなわち、システイン残基の後）、およびおよそ１０～１７個の残基を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｌ２は、ＣＤＲ－Ｌ１の末端からおよそ１６番目の残基で始まり、およそ７個の残基を含む。ＣＤＲ－Ｌ３は、ＣＤＲ－Ｌ２の末端からおよそ３３番目の残基で始まり（すなわち、システイン残基の後）、およそ７～１１個の残基を含み、配列ＦまたはＷ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終わり、Ｘは任意のアミノ酸である。
本明細書に開示される抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源のものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマまたはニワトリの抗体である。別の実施形態では、可変領域は、起源がコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）（例えば、サメから）であってもよい。
本明細書で使用される場合、「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部ヒンジ領域、中間ヒンジ領域、および/または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本開示で使用するための抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示で使用するための抗体は、ＣＨ２ドメイン（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）の少なくとも一部を欠いていてもよい。上記のように、重鎖定常領域は、天然に存在する免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように改変され得ることが当業者によって理解される。
本明細書に開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖定常領域は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
本明細書で使用される場合、「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインのうちの少なくとも１つを含む。
「軽鎖－重鎖対」とは、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合を介して二量体を形成することができる軽鎖と重鎖との集合体を指す。
前述のように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。本明細書で使用される場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端にある。
本明細書で使用される場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、従来のナンバリングスキーム（残基２４４～３６０、Ｋａｂａｔナンバリングシステム；および残基２３１～３４０、ＥＵナンバリングシステム；Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）を参照されたい）を用いて、例えば、抗体の約残基２４４から残基３６０まで延在する重鎖分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対になっていないという点でユニークである。むしろ、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挟まれている。ＣＨ３ドメインがＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで延在し、およびおよそ１０８個の残基を含むことも十分に立証されている。
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、およそ２５個の残基を含み、柔軟であり、したがって２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別個のドメイン、すなわち上部、中間、および下部ヒンジドメイン（Ｒｏｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：４０８３（１９９８））に細分することができる。
本明細書で使用される場合、「ジスルフィド結合」という用語は、２個の硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（２２６位または２２９位、ＥＵナンバリングシステム）を使用して、ＣＨ１およびＣＫ領域はジスルフィド結合によって結合され、２つの重鎖は２３９および２４２に対応する位置で２つのジスルフィド結合によって結合される。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られるかまたはそれに由来し、定常領域（本開示に従って、インタクトであっても、部分的であっても、改変されていてもよい）が第２の種から得られる任意の抗体という意味を持つ。ある特定の実施形態では、標的結合領域または標的結合部位は、非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトである。
本明細書で使用される場合、「ヒト化パーセント」は、ヒト化ドメインと生殖細胞系ドメインとの間のフレームワークのアミノ酸の相違（すなわち、非ＣＤＲ差）の数を決定し、その数をアミノ酸の総数から減算し、次いで、それをアミノ酸の総数で除算し、１００を乗じることによって計算される。
「特異的に結合する」または「特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のかなりの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、抗体は、抗原結合ドメインを介して、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、あるエピトープに結合する場合、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書では、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対親和性を認定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有すると見なすことができるか、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置と予防（prophylactic）または予防的（preventative）手段との両方を指し、目的は、がんの進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されないが、検出可能または検出不能であるかに関わらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的であるかに関わらず）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延ばすことを意味し得る。処置を必要とする者としては、既に状態もしくは障害を有する者のほか、状態もしくは障害を有する傾向がある者、または状態もしくは障害を予防すべき者が挙げられる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト、家庭動物、農場動物、および動物園、スポーツまたはペット用の動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、雌ウシなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「処置を必要とする患者に」または「処置を必要とする対象」などの語句は、例えば、検出、診断手順および/または処置のために使用される本開示の抗体または組成物の投与から利益を得る対象、例えば哺乳動物対象を含む。
抗クローディン１８．２抗体および断片
本開示は、野生型クローディン１８．２および一般的な変異体Ｍ１４９Ｌ（この変異を内因的に発現するＳＵ６２０細胞）の両方に対して高い親和性を有する抗クローディン１８．２抗体を提供する。本発明者らの知る限りでは、現在知られている全ての抗クローディン１８．２タンパク質はこの変異体に結合しない。したがって、本開示の抗体は、野生型およびＭ１４９Ｌ変異体クローディン１８．２タンパク質の両方を標的化することができるという固有の利点を有する。がん患者のかなりの部分がこの一般的な変異を有するので、この利点は重要である。本開示の抗体が他のクローディン１８アイソフォームであるクローディン１８．１に結合しない（またははるかに低い親和性でクローディン１８．１に結合する）ことも注目に値する。
本開示の抗体および断片は、臨床候補を参照として使用した場合でも優れた特性を示した。現在、１７５Ｄ１０（ＩＭＡＢ３６２；クロージキシマブ）は、胃および胃食道接合部腺癌を処置するための第ＩＩＩ相臨床試験を受けている。本抗体および断片は、１７５Ｄ１０と比較して、より強い結合活性を示しただけでなく、様々な異なる条件下でより高いＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ活性も示した。
また重要なことに、本開示は、これらの抗体が、ＩＭＡＢ３６２と比較した場合でさえ、受容体媒介抗体インターナリゼーションの誘導において非常に有効であることを実証する。本開示の抗体の受容体媒介抗体インターナリゼーションを誘導する能力の大幅な増加は、これらの抗体がクローディン１８．２タンパク質にどのように結合するかに起因し得ると考えられる。実施例１４で実証され、図２０に示されるように、抗体への結合に重要なクローディン１８．２タンパク質上のアミノ酸残基は、細胞外ループ（例えば、Ｗ３０、Ｌ４９、Ｗ５０、Ｃ５３、Ｃ６３およびＲ８０）のコンフォメーションを安定化するために重要なものを含む。Ｗ３０、Ｌ４９およびＷ５０は、ループ１のコンフォメーションを安定化するのに役立つＷ－ＬＷ－Ｃ－Ｃコンセンサスモチーフの一部である。Ｃ５３およびＣ６３は、β鎖間ジスルフィド結合を形成する。Ｒ８０は、細胞表面上の平行クローディン１８．２分子間の相互作用を維持するため、またはループ１のコンフォメーションを安定化するために重要である可能性がある。
また、抗体結合に重要なのは、残基Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０、Ｅ６２、Ｙ１６９およびＧ１７２である。これらのうち、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０およびＥ６２は、β３鎖内に位置するか、またはβ４鎖のＣ６３を介して位置する。配列番号３０の残基４５～６３（ＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣ）からなるこの領域は、本明細書では「β３～β４ループ」と呼ばれ、クローディン１８．２の第１の細胞外ループ（ループ１）の一部である。対照的に、Ｙ１６９およびＧ１７２は、第２の細胞外ループ（ループ２）のβ５鎖（配列番号３０の残基１６９～１７２；ＹＴＦＧ）の一部である。
受容体媒介性抗体インターナリゼーションを誘導するための本開示の抗体による非常に増加した活性は、β３～β４ループおよびβ５鎖の両方における残基に結合するそれらの能力に起因することが想定される。これに関連して、公知の抗クローディン１８．２抗体は、ループの一方にのみ結合すると考えられる。
実験データはまた、本開示の抗体が、既知の抗体と比較して、より高い結合特異性および改善されたＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを有することを示す。
ヒトクローディン１８．２配列
Figure 2023502883000002
Figure 2023502883000003
本開示の一実施形態によれば、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片であって、ＣＬＤＮ１８．２の第１の細胞外ループおよび第２の細胞外ループの両方に結合する抗体またはその断片が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のβ３－β４ループおよびβ５鎖の両方に結合する。
本開示の別の実施形態によれば、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片であって、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＭ１４９Ｌ変異体にさらに結合する抗体またはその断片が提供される。いくつかの実施形態では、抗体または断片は、ヒト野生型クローディン１８．１（ＣＬＤＮ１８．１）タンパク質に結合しないか、または野生型ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に対する親和性の約１％を超える親和性でＣＬＤＮ１８．１に結合しない。
タンパク質に対する抗体または断片の結合親和性は、当技術分野で公知の多くの方法で測定することができる。例えば、独立型ＣＬＤＮ１８．１またはＣＬＤＮ１８．２タンパク質を用いた無細胞アッセイを測定することができる。しかしながら、好ましくは、測定は、実際の結合環境を模倣する細胞表面上のＣＬＤＮ１８．１またはＣＬＤＮ１８．２タンパク質を用いて行われる。そのような結合アッセイは、実験例において十分に例示されている。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、野生型ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に対する親和性の少なくとも１％、またはあるいは少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、０．５％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％であるＭ１４９Ｌ変異体に対する結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片はヒトＣＬＤＮ１８．１に結合しない。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２への結合と比較して、ヒトＣＬＤＮ１８．１への結合がはるかに弱く、例えば、１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、または０．００１％以下であるが、それに限定されない。
上記のように、本開示の抗体およびその断片は、既知の抗体（図４を参照された；少なくとも参照抗体はＭ１４９と相互作用するが、本開示の抗体はＭ１４９と相互作用しない）とは異なるエピトープでクローディン１８．２タンパク質に結合する。したがって、一実施形態では、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片であって、抗体またはその断片と野生型ＣＬＤＮ１８．２タンパク質との間の結合が、野生型ＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＮ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０およびＥ６２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、ならびにＹ１６９およびＧ１７２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むアミノ酸残基を伴う抗体またはその断片が提供される。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＮ４５に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＹ４６に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＧ４８に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＬ４９に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＷ５０に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片はＣＬＤＮ１８．２のＣ５３に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＶ５４に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＲ５５に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＥ５６に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＥ５８に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＦ６０に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＥ６２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片はＣＬＤＮ１８．２のＣ６３に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０、およびＥ６２から選択される少なくとも２つのアミノ酸残基に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０、およびＥ６２から選択される少なくとも３つのアミノ酸残基に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０、およびＥ６２から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０、およびＥ６２から選択される少なくとも５つのアミノ酸残基に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２の少なくともＹ１６９に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２の少なくともＧ１７２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２のＹ１６９およびＧ１７２から選択される少なくとも２つのアミノ酸残基に結合する。
いくつかの実施形態では、結合は、Ｗ３０を含むアミノ酸残基、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０およびＥ６２からなる群より選択される２、３、４、５つまたはそれを超えるアミノ酸残基、ならびに野生型ＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＹ１６９およびＧ１７２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を伴う。いくつかの実施形態では、結合は、野生型ＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＷ３０、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０、Ｅ６２およびＹ１６９を含むアミノ酸残基を伴う。
ＣＬＤＮ１８．２上のこれらのアミノ酸に対するより弱い結合は、Ｇ４８、Ｌ４９、Ｗ５０、Ｃ５３、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６などの他のアミノ酸と比較してもよい。いくつかの実施形態では、比較は、１７５Ｄ１０に対する同じアミノ酸における結合に対するものである。例えば、本開示の抗体または断片の結合は、Ｄ２８、Ｑ３３、Ｎ３８、Ｖ４３、Ｇ５９およびＶ７９のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは全てに対して１７５Ｄ１０（ＩＭＧＴ／２Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢカード番号：１０４７３）の結合よりも弱い。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＭ１４９Ｌに結合しない。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＭ１４９Ｌ変異体に結合する。
本開示の一実施形態によれば、表ＡのＣＤＲの組み合わせに示されるＣＤＲ領域を有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその断片が提供される。
Figure 2023502883000004
Figure 2023502883000005
Figure 2023502883000006
Figure 2023502883000007
Figure 2023502883000008
これらのＣＤＲ領域を含む抗体は、マウス、ヒト化またはキメラに関わらず、強力なクローディン１８．２結合および阻害活性を有していた。実施例１１および１２に示されるように、ＣＤＲ内の特定の残基は、特性を保持もしくは改善するために、または翻訳後修飾（ＰＴＭ）を受ける可能性を低減するために修飾することができる。そのような修飾ＣＤＲは、親和性成熟ＣＤＲまたは脱リスクＣＤＲと呼ばれ得る。
脱リスクＣＤＲの非限定的な例は、表Ｂ～Ｄの第３列に提供されている。親和性が成熟したものには、１つ、２つまたは３つのアミノ酸の付加、欠失および/または置換を有するものが含まれ得る。いくつかの実施形態では、置換は保存的置換であり得る。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含み、当技術分野で定義されている。したがって、免疫グロブリンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。別の実施形態では、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順序および/または組成が異なる構造的に類似のストリングで置き換えることができる。
保存的アミノ酸置換の非限定的な例を以下の表に提供し、０またはそれを超える類似性スコアは２つのアミノ酸間の保存的置換を示す。
Figure 2023502883000009
Figure 2023502883000010
したがって、一実施形態では、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片であって、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、表Ａの組み合せ１～３３またはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のうちの１つもしくはそれを超えるものが各々１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸の付加、欠失、保存的アミノ酸置換もしくはそれらの組み合せを含む組み合せ１～３３の各々から選択される抗体またはその断片が提供される。
いくつかの実施形態では、その各々が表Ａまたは表Ｂ～Ｄから選択される、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体または断片が提供される。例えば、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片であって、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１は、配列番号２０８～２２６の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または１つ、２つもしくは３つのアミノ酸の付加、欠失、アミノ酸置換によって配列番号２０８～２２６のいずれか一つに由来するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号２２７～２３３の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはアミノ酸の付加、欠失、アミノ酸置換によって配列番号２２７～２３３のいずれか一つに由来するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号３、８、１３、１９および４２～５８の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または１つ、２つもしくは３つのアミノ酸の付加、欠失、アミノ酸置換によって配列番号３、８、１３、１９および４２～５８のいずれか一つに由来するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号２３４～２５４の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または１つ、２つもしくは３つのアミノ酸の付加、欠失、アミノ酸置換によって配列番号２３４～２５４のいずれか一つに由来するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号２５５～２８０の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸の付加、欠失、アミノ酸置換によって配列番号２５５～２８０のいずれか一つに由来するアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は、配列番号２８１～３０３の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸付加、欠失、アミノ酸置換によって配列番号２８１～３０３のいずれか一つに由来するアミノ酸配列を含む抗体またはその断片が提供される。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号２０８～２２６、３０４～３０５および３０８～３０９の群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号２２７～２３３の群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号３、８、１３、１９、２０および４２～５８の群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号２３４～２５４の群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号２５５～２８０、３０６，３１０および３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は、配列番号２８１～３０３、３０７、および３１２～３１４の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
抗体１２０Ｂ７Ｂ２は、クローディン１８．２の強力な阻害剤であることが実証されている。そのＣＤＲ配列を、いくつかの脱リスクバージョンと共に表Ｂに提供する。一実施形態では、本開示は、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片であって、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１は、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹ（配列番号１）、ＱＳＬＬＮＡＧＮＱＫＮＹ（配列番号１７）もしくはＱＳＬＬＥＳＧＮＱＫＮＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列、または配列番号１、１７もしくは１８からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は、ＷＡＳ（配列番号２）のアミノ酸配列または配列番号２からの１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は、ＣＱＮＧＹＹＦＰＦＴ（配列番号３）、ＱＮＡＹＹＦＰＦＴ（配列番号１９）またはＱＥＧＹＹＦＰＦＴ（配列番号２０）のアミノ酸配列または配列番号３、１９もしくは２０からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は、ＧＹＴＦＴＧＹＩ（配列番号４）のアミノ酸配列または配列番号４からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は、ＩＮＰＹＮＤＧＴ（配列番号５）またはＩＮＰＹＮＤＤＴ（配列番号２１）のアミノ酸配列または配列番号５もしくは２１からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は、ＡＲＡＹＦＧＮＳＦＡＹ（配列番号６）またはＡＲＡＹＦＧＮＡＦＡＹ（配列番号２２）のアミノ酸配列または配列番号６もしくは２２からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む抗体またはその断片を提供する。
異なる抗体由来のＣＤＲが大きな相同性を共有することに注目することは興味深い（表Ａを参照されたい）。この場合、抗体または断片の結合親和性または結合活性に大きな影響を与えることなく、各対応するＣＤＲを交換できると想定される。あるいは、ＣＤＲ中の各特定のアミノ酸は、異なる抗体由来の対応するＣＤＲ中に存在する別のアミノ酸で置換され得る。
いくつかの実施形態では、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片が提供される。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１は、配列番号２１０、３０４もしくは３０５のアミノ酸配列、または配列番号２１０、３０４もしくは３０５からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号２２７のアミノ酸配列、または配列番号２２７からの１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号３、１９もしくは２０のアミノ酸配列、または配列番号３、１９もしくは２０からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号２５３のアミノ酸配列または配列番号２５３からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号２７８もしくは３０６のアミノ酸配列または配列番号２７８もしくは３０６からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は、配列番号３０３もしくは３０７のアミノ酸配列または配列番号３０３もしくは３０７からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号２１０、３０４または３０５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号３、１９または２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号２５３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号２７８または３０６のアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は、配列番号３０３または３０７のアミノ酸配列を含む。
軽鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１４１、１９２～１９５および２０６～２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列、または生物学的同等物、例えば配列番号１４１、１９２～１９５および２０６～２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドが挙げられる。
重鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１７１、１８８～１９１および２０５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または生物学的同等物、例えば配列番号１７１、１８８～１９１および２０５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１は配列番号３０４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号２５３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号３０６のアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は配列番号３０７のアミノ酸配列を含む。抗体または断片の非限定的な例としては、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号２０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域が挙げられる。
同様に、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３は、良好な抗体であることが示されている。したがって、別の実施形態では、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片であって、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１は、配列番号２１０、３０４もしくは３０５のアミノ酸配列または配列番号２１０、３０４もしくは３０５からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号２２９のアミノ酸配列または配列番号２２９からの１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号２４２のアミノ酸配列または配列番号２４２からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号２６３のアミノ酸配列または配列番号２６３からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は、配列番号２８９のアミノ酸配列または配列番号２８９からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む抗体またはその断片が提供される。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１は配列番号２１０、３０４または３０５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２２９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号２４２のアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ２は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号２８９のアミノ酸配列を含む。
軽鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１２４、１８５～１８７および２０３～２０４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または生物学的同等物、例えば配列番号１２４、１８５～１８７および２０３～２０４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドが挙げられる。
重鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１５３および１８１～１８４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または生物学的同等物、例えば配列番号１５３および１８１～１８４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１は配列番号３０４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２２９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号２４２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は配列番号２８９のアミノ酸配列を含む。非限定的な例の抗体またはその断片としては、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号１８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域が挙げられる。
また、４Ｆ１１Ｅ２は、良好な抗体であることが示されている。したがって、別の実施形態では、野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片であって、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１は、配列番号２１６、３０８もしくは３０９のアミノ酸配列または配列番号２１６、３０８もしくは３０９からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号２２７のアミノ酸配列または配列番号２２７からの１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号２４６のアミノ酸配列または配列番号２４６からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号２６８、３１０もしくは３１１のアミノ酸配列または配列番号２６８、３１０もしくは３１１からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は、配列番号２９４、３１２、３１３もしくは３１４のアミノ酸配列または、配列番号２９４、３１２、３１３もしくは３１４からの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む抗体またはその断片が提供される。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１は配列番号２１６、３０８または３０９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号２４６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２６８、３１０または３１１のアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は配列番号２９４、３１２、３１３または３１４のアミノ酸配列を含む。
軽鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１２９、１７８～１８０および２０１～２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または生物学的同等物、例えば配列番号１２９、１７８～１８０および２０１～２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドが挙げられる。
重鎖可変領域の非限定的な例としては、配列番号１５９、１７５～１７７および１９６～２００からなる群より選択されるアミノ酸配列、または生物学的等価物、例えば配列番号１５９、１７５～１７７および１９６～２００からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ１は配列番号３０９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号２４６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号３１１のアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤＲＨ３は配列番号２９４のアミノ酸配列を含む。抗体または断片の非限定的な例としては、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。実施例９に示されるように、ヒト化抗体は、マウス対応物に対する１つまたはそれを超える復帰変異を含み得る。そのような復帰変異の例を表３に示す。いくつかの実施形態では、抗体または断片は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える復帰変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗クローディン１８．２抗体は、配列番号１１７～１４４、１７８～１８０、１８５～１８７、１９２～１９５、２０１～２０２、２０３～２０４または２０６～２０７のいずれか１つのＶＬ、および配列番号１４５～１７４、１７５～１７７、１８１～１８４、１８８～１９１、１９６～２００または２０５のいずれか１つのＶＨ、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物を含む。ＶＨまたはＶＬの生物学的等価物は、指定されたアミノ酸を含むが、全体で８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列である。したがって、配列番号１４５の生物学的等価物は、配列番号１４５と全体的に８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するが、ＣＤＲを保持し、必要に応じて、１つもしくはそれを超える、または全ての復帰変異を保持するＶＨであり得る。
本明細書に開示される抗体は、それらが由来する天然に存在する結合ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるように改変され得ることも当業者によって理解される。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、類似していてもよく、例えば、出発配列と一定のパーセント同一性を有していてもよく、例えば、出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であってもよい。
ある特定の実施形態では、抗体は、抗体と通常関連しないアミノ酸配列または１つもしくはそれを超える部分を含む。例示的な修飾を以下により詳細に説明する。例えば、本開示の抗体は、柔軟なリンカー配列を含み得るか、または機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または標識）を付加するように修飾され得る。
本開示の抗体、そのバリアントまたは誘導体としては、共有結合が抗体のエピトープへの結合を妨げないように修飾された、すなわち、抗体への任意の種類の分子の共有結合によって修飾された誘導体が挙げられる。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって修飾することができる。多数の化学修飾のいずれも、限定されないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む公知の技術によって行うことができる。さらに、抗体は、１つまたはそれを超える非古典的アミノ酸を含有し得る。
抗体－薬物コンジュゲート
いくつかの実施形態では、抗体または断片は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物応答修飾剤、医薬品、またはＰＥＧにコンジュゲートされ得る。
一実施形態では、本開示の抗体または断片は、薬物部分に共有結合している。薬物部分は、抗体上のコンジュゲーション点と反応性の基であり得るか、またはそれを含むように修飾され得る。例えば、薬物部分は、アルキル化（例えば、抗体のε－アミノ基リジンまたはＮ末端で）、酸化した炭水化物の還元的アミノ化、ヒドロキシル基とカルボキシル基との間のエステル交換、アミノ基またはカルボキシル基でのアミド化、およびチオールへのコンジュゲーションによって結合することができる。
いくつかの実施形態では、抗体分子あたりにコンジュゲートされた薬物部分ｐの数は、平均１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３または１～２の範囲である。いくつかの実施形態では、ｐは、平均２～８、２～７、２～６、２～５、２～４または２～３の範囲である。他の実施形態では、ｐは、平均１、２、３、４、５、６、７または８である。いくつかの実施形態では、ｐは、平均約１～約２０、約１～約１０、約２～約１０、約２～約９、約１～約８、約１～約７、約１～約６、約１～約５、約１～約４、約１～約３、または約１～約２の範囲である。いくつかの実施形態では、ｐは、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４または約２～約３の範囲である。
例えば、タンパク質の化学的活性化が遊離チオール基の形成をもたらす場合、タンパク質はスルフヒドリル反応性剤とコンジュゲートされ得る。一態様では、剤は、遊離チオール基に実質的に特異的なものである。そのような剤としては、例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ベンジルハライド（例えば、ヨウ化物、臭化物または塩化物）、ビニルスルホンおよびピリジルチオが挙げられる。
薬物は、リンカーによって抗体または断片に結合することができる。適切なリンカーとしては、例えば、切断可能なリンカーおよび切断不可能なリンカーが挙げられる。切断可能なリンカーは、典型的には、細胞内条件下での切断を受けやすい。適切な切断可能なリンカーとしては、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーが挙げられる。例示的な実施形態では、リンカーは、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ）、フェニルアラニン－リジン（ｐｈｅ－ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドカプロン酸－バリン－シトルリン（citruline）－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｍｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ）リンカーなどのジペプチドリンカーであり得る。別のリンカーは、スルホスクシンイミジル－４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓｍｃｃ）である。スルホ－ｓｍｃｃコンジュゲーションは、スルフヒドリル（チオール、－ＳＨ）と反応するマレイミド基を介して起こるが、そのスルホ－ＮＨＳエステルは、（リジンおよびタンパク質またはペプチドのＮ末端に見られるように）第一級アミンに対して反応性である。さらに別のリンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の適切なリンカーとしては、特定のｐＨまたはｐＨ範囲で加水分解可能なリンカー、例えばヒドラゾンリンカーが挙げられる。更なる適切な切断可能なリンカーとしては、ジスルフィドリンカーが挙げられる。リンカーは、薬物が放出されるために抗体が細胞内で分解されなければならない程度に抗体に共有結合され得る（例えば、ｍｃリンカーなど）。
リンカーは、抗体に結合するための基を含み得る。例えば、リンカーとしては、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシルまたはスルフヒドリル反応性基（例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ベンジルハライド（例えば、ヨウ化物、臭化物または塩化物）、ビニルスルホンおよびピリジルチオ）を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、薬物部分は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、免疫抑制剤、放射性同位体、毒素などである。コンジュゲートは、腫瘍細胞またはがん細胞の増殖を阻害するため、腫瘍またはがん細胞にアポトーシスを引き起こすため、または患者のがんを処置するために使用することができる。したがって、コンジュゲートを、動物がんの処置のための種々の状況に応じて使用することができる。コンジュゲートは、腫瘍細胞またはがん細胞に薬物を送達するために使用することができる。理論に束縛されるものではないが、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、クローディン１８．２を発現するがん細胞に結合または会合し、コンジュゲートおよび/または薬物は、受容体媒介エンドサイトーシスにより腫瘍細胞またはがん細胞の内部に取り込まれ得る。
細胞内に入ると、コンジュゲート（例えば、リンカーにおいて）内の１つもしくはそれを超える特異的ペプチド配列は、１つもしくはそれを超える腫瘍細胞またはがん細胞関連プロテアーゼによって加水分解的に切断され、薬物の放出をもたらす。次いで、放出された薬物は、細胞内を自由に移動し、細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性または他の活性を誘導する。いくつかの実施形態では、薬物は、腫瘍細胞またはがん細胞の外側で抗体から切断され、薬物は続いて細胞に浸透するか、または細胞表面で作用する。
薬物部分またはペイロードの例は、ＤＭ１（メイタンシン、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－またはＮ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－メイタンシン）、ｍｃ－ＭＭＡＤ（６－マレイミドカプロイル－モノメチルアウリスタチンＤまたはＮ－メチル－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－メトキシ－４－［（２Ｓ）－２－［（１Ｒ，２Ｒ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソ－３－［［（１Ｓ）－２－フェニル－１－（２－チアゾリル）エチル］アミノ］プロピル］－１－ピロリジニル］－１－［（１Ｓ）－１－メチルプロピル］－４－オキソブチル］－Ｎ－メチル－（９Ｃｌ）－Ｌ－バリンアミド）、ｍｃ－ＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル－モノメチルアウリスタチンＦまたはＮ－［６－（２，５－ジヒドロ－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１－オキソヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｌ－バリル－Ｌ－バリル－（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－３－メトキシ－５－メチル－４－（メチルアミノ）ヘプタノイル－（αＲ，βＲ，２Ｓ）－β－メトキシ－α－メチル－２－ピロリジンプロパノイル－Ｌ－フェニルアラニン）およびｍｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＥ（６－マレイミドカプロイル－ＶａｌｃＣｉｔ－（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）－モノメチルアウリスタチンＥまたはＮ－［［［４－［［Ｎ－［６－（２，５－ジヒドロ－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１－オキソヘキシル］－Ｌ－バリル－Ｎ５－（アミノカルボニル）－Ｌ－オルニチル］アミノ］フェニル］メトキシ］カルボニル］－Ｎ－メチル－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ，２Ｒ）－４－［（２Ｓ）－２－［（１Ｒ，２Ｒ）－３－［［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－メチル－２－フェニルエチル］アミノ］－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル］－１－ピロリジニル］－２－メトキシ－１－［（１Ｓ）－１－メチルプロピル］－４－オキソブチル］－Ｎ－メチル－Ｌ－バリンアミド）からなる群より選択される。ＤＭ１は、チューブリン阻害剤メイタンシンの誘導体であり、一方、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦは、アウリスタチン誘導体である。いくつかの実施形態では、薬物部分は、ｍｃ－ＭＭＡＦおよびｍｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＥからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬物部分はメイタンシノイドまたはアウリスタチンである。
抗体または断片は、放射性標識、免疫調節薬、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療薬または診断薬、薬物または毒素であり得る細胞傷害剤、超音波増強剤、非放射性標識、それらの組み合わせ、および当技術分野で公知の他のそのような薬剤などの検出可能な標識を含み得る治療薬にコンジュゲートまたは融合され得る。
抗体は、それを化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識することができる。次いで、化学発光タグ付き抗原結合ポリペプチドの存在を、化学反応の過程中で生じる発光の存在を検出することによって決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
抗体はまた、１５２Ｅｕなどの蛍光発光金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を使用して抗体に結合させることができる。様々な部分を抗体にコンジュゲートさせるための技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３－５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３－５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．４７５－５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．３０３－１６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（５２：１１９－５８（１９８２））を参照されたい。
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法
本開示はまた、本開示の抗体、そのバリアントまたは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域全体を、同じポリヌクレオチド分子上または別個のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の一部を、同じポリヌクレオチド分子上または別個のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。
抗体を作製する方法は当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域および定常領域の両方が完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当技術分野で記載され、本明細書に記載される技術を使用して作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作製するために使用され得る例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，４５８，５９２号、同第６，４２０，１４０号に記載されており、それらの全体が参照により組み込まれる。
処置方法
本明細書に記載されるように、本開示の抗体、バリアント、誘導体または抗体－薬物コンジュゲートは、特定の処置および診断方法において使用され得る。
本開示はさらに、本明細書中に記載される障害または状態の１つまたはそれより多くを処置するために、本開示の抗体、断片または抗体－薬物コンジュゲートを患者、例えば、動物、哺乳動物およびヒトに投与することを伴う、抗体に基づく治療を対象とする。本開示の治療用化合物としては、本開示の抗体（本明細書に記載されるそのバリアントおよび誘導体を含む）ならびに本開示の抗体をコードする核酸またはポリヌクレオチド（本明細書に記載されるそのバリアントおよび誘導体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の抗体はまた、がんを処置または阻害するために使用され得る。上記のように、クローディン１８．２は、腫瘍細胞、特に胃、膵臓、食道、卵巣および肺の腫瘍において過剰発現され得る。クローディン１８．２の阻害は、腫瘍の処置に有用であることが示されている。
したがって、いくつかの実施形態では、がんの処置を必要とする患者のがんを処置する方法が提供される。この方法は、一実施形態では、有効量の本開示の抗体、断片または抗体－薬物コンジュゲートを患者に投与することを伴う。いくつかの実施形態では、患者のがん細胞（例えば、間質細胞）の少なくとも１つがクローディン１８．２を過剰発現する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法などの細胞療法も本開示で提供される。本開示の抗クローディン１８．２抗体と接触させる（またはあるいは本開示の抗クローディン１８．２抗体を発現するように操作される）適切な細胞を使用することができる。そのような接触または操作を行ったら、次いで、細胞を、処置を必要とするがん患者に導入することができる。がん患者は、本明細書に開示される種類のいずれかのがんを有し得る。細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えば、腫瘍浸潤Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、細胞は、がん患者自身から単離された。いくつかの実施態様では、細胞は、ドナーによって、または細胞バンクから提供された。細胞ががん患者から単離されると、望ましくない免疫反応を最小限に抑えることができる。
がんの非限定的な例としては、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、および甲状腺がんが挙げられる。いくつかの実施形態では、がんは、胃がん、膵臓がん、食道がん、卵巣がん、および肺がんのうちの１つまたはそれより多くである。
本開示の抗体もしくはバリアント、またはそれらの誘導体で処置、予防、診断および/または予後判定することができる、細胞生存率の増加に関連する更なる疾患または状態としては、悪性腫瘍および関連障害、例えば白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索種、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない悪性腫瘍の進行および/または転移が挙げられるが、これらに限定されない。
任意の特定の患者に対する具体的な投与量および処置レジメンは、使用される特定の抗体、そのバリアントまたは誘導体、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事、ならびに投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、ならびに処置される特定の疾患の重症度を含む様々な要因に依存する。医療介護者によるそのような要因の判断は、当業者の通常の技術に属するものである。量はまた、処置される個々の患者、投与経路、製剤の種類、使用される化合物の特徴、疾患の重症度、および所望の効果に依存する。使用される量は、当技術分野で周知の薬理学的および薬物動態学的な原理によって決定することができる。
抗体、断片または抗体－薬物コンジュゲートの投与方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。抗原結合ポリペプチドまたは組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。したがって、本開示の抗原結合ポリペプチドを含有する医薬組成物は、経口、直腸、非経口、槽内（intracistemally）、膣内、腹腔内、局所（散剤、軟膏剤、滴剤もしくは経皮パッチによる場合のように）、頬側、または経口もしくは鼻スプレーとして投与され得る。
本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与様式を指す。
投与は全身的または局所的であり得る。さらに、本開示の抗体を、脳室内注射および髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい場合があり、脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバなどのリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進され得る。肺投与は、例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤との製剤化によっても使用することができる。
本開示の抗原結合ポリペプチドまたは組成物を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局所注入、例えば、手術後の創傷被覆材と組み合わせた局所適用、注射による、カテーテルによる、坐剤による、またはインプラントによって達成することができ、前記インプラントは、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜、または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料である。好ましくは、本開示の抗体を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収しない材料を使用するように注意しなければならない。
炎症性、免疫性もしくは悪性の疾患、障害または状態の処置、阻害および予防に有効である本開示の抗体、断片または抗体－薬物コンジュゲートの量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、最適な投与量範囲を特定するのを助けるために使用され得る。製剤に使用される正確な用量はまた、投与経路および疾患、障害または状態の重篤度に依存し、施術者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿することができる。
一般的な提案として、本開示の抗体、断片または抗体－薬物コンジュゲートの患者に投与される投与量は、典型的には、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ～１００ｍｇ、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ～２０ｍｇ、または患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ～１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答のために、他の種からの抗体よりもヒト体内での半減期が長い。したがって、より低い投与量のヒト抗体と、より少ない頻度の投与とが可能であることが多い。さらに、本開示の抗体の投与量および投与頻度は、例えば脂質化などの修飾によって抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳内）を増強することによって減らすことができる。
更なる実施形態では、本開示の組成物は、サイトカインと組み合わせて投与される。本開示の組成物と共に投与され得るサイトカインには、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０ＬおよびＴＮＦ－αが含まれるが、これらに限定されない。
更なる実施形態では、本開示の組成物は、例えば放射線療法などの他の治療または予防レジメンと組み合わせて投与される。
組成物
本開示はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、有効量の抗体、断片、または抗体－薬物コンジュゲート、および許容され得る担体を含む。いくつかの実施態様では、組成物は、第２の抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含む。
特定の実施形態では、「薬学的に許容され得る」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されていること、または動物、より具体的にはヒトでの使用のために米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。さらに、「薬学的に許容され得る担体」は、一般に、任意の種類の非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤である。
「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌液体、例えば水および油であって、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油であり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合、水が好ましい担体である。食塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射液剤用の液体担体として使用することができる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、または酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩などのｐＨ緩衝剤も含有することができる。ベンジルアルコール、メチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸、または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および等張性を調整するための剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースも想定される。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体と共に坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的な担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、治療有効量の抗原結合ポリペプチド、好ましくは精製形態の抗原結合ポリペプチドを適切な量の担体と共に含有する。製剤は投与様式に適するべきである。親製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て用シリンジまたは複数回投与バイアルに封入することができる。
一実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として日常的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性バッファー中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、注射部位の痛みを和らげるために可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器内の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、単位剤形で別々に供給されるかまたは一緒に混合される。組成物が注入によって投与される場合、組成物は、無菌医薬品グレードの水または食塩水を含む注入ボトルで分注することができる。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
本開示の化合物は、中性形態または塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容され得る塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンで形成されたもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンで形成されたものが含まれる。
実施例１：ヒトクローディン１８アイソフォーム２（ＣＬＤ１８Ａ２）に対するマウスモノクローナル抗体の作製
ａ．免疫：
Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ６マウスを、ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤ１８Ａ２）断片をコードする真核生物発現ベクターで免疫した。５０μｇのプラスミドＤＮＡを１日目および１０日目に四頭筋（筋肉内、ｉ．ｍ．）に注入した。マウスの血清中のヒトＣＬＤ１８Ａ２に対する抗体の存在を、ヒトＣＬＤ１８Ａ２をコードする核酸で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用して、フローサイトメトリーによって２０日目にモニターした。検出可能な免疫応答（図１）を有するマウスを、ヒトＣＬＤ１８Ａ２をコードする核酸で一過性にトランスフェクトした５×１０７個のＨＥＫ２９３細胞の腹腔内注射によって融合の３日前および２日前に追加免疫した。
ｂ．ＣＬＤ１８Ａ２に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成：
マウス脾細胞を単離し、標準プロトコルに基づいてマウス骨髄腫細胞株にＰＥＧで融合した。次いで、得られたハイブリドーマを、ヒトＣＬＤ１８をコードする核酸でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用して、細胞ＥＬＩＳＡによってＣＬＤ１８Ａ２特異性を有する免疫グロブリンの産生についてスクリーニングした。
免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ＣＲＬ７３８６４１）を使用して２：１の比でＰ３Ｘ６３ＡＧ８Ｕ．１非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５９７）と融合した。細胞を平底マイクロタイタープレートに約３×１０４／ウェルで播種し、続いて１０％ウシ胎児血清、２％ハイブリドーマ融合物およびクローニングサプリメント（ＨＦＣＳ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ＣＲＬ１３６３７３５）＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ社、ＣＲＬＨ０２６２）を含有する選択培地で約２週間インキュベートした。１０～１４日後、個々のウェルを、抗ＣＬＤ１８Ａ２モノクローナル抗体についてＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした（図２）。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、ＦＡＣＳによってＣＬＤ１８Ａ２またはＣＬＤ１８Ａ１を発現するＨＥＫ２９３で再度スクリーニングし、ＣＬＤ１８Ａ２が依然として陽性でありＣＬＤ１８Ａ１が陰性である場合、限界希釈によってサブクローニングした。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性評価のために組織培養培地中に少量の抗体を生成させた。（ＦＡＣＳによって）親細胞の反応性を保持した各ハイブリドーマからの少なくとも１つのクローンを選択した。各クローンについて３バイアルのセルバンクを生成し、液体窒素中で保存した。
ｃ．ＣＬＤ１８Ａ１ではなくＣＬＤ１８Ａ２に結合するモノクローナル抗体の選択：
抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを行った。マウスｍｏｎｏＡＢ ＩＤキット（Ｚｙｍｅｄ社、ＣＲＬ９０－６５５０）を使用して、同定されたＣＬＤ１８Ａ２反応性モノクローナル抗体のＩｇサブクラスを決定した。３２のハイブリドーマ細胞株を生成した：６４Ｇ１１Ｂ４、６５Ｇ８Ｂ８、５６Ｅ８Ｆ１０Ｆ４、５４Ａ２Ｃ４、４４Ｆ６Ｂ１１、１５Ｃ２Ｂ７、２０Ｆ１Ｅ１０、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３、５８Ｇ２Ｃ２、１０１Ｃ４Ｆ１２、１０３Ａ１０Ｂ２、４０Ｃ１０Ｅ３、７８Ｅ８Ｇ９Ｇ６、４Ｆ１１Ｅ２、１０Ｇ７Ｇ１１、１２Ｆ１Ｆ４、７８Ｃ１０Ｂ６Ｇ４、１１９Ｇ１１Ｄ９、１１３Ｇ１２Ｅ５Ｅ６、１１６Ａ８Ｂ７、１０５Ｆ７Ｇ１２、８４Ｅ９Ｅ１２、１０３Ｆ４Ｄ４、１１０Ｃ１２Ｂ６、８５Ｈ１２Ｅ８、１０３Ｈ２Ｂ４、１０３Ｆ６Ｄ３、１１３Ｅ１２Ｆ７、１２０Ｂ７Ｂ２、１１１Ｂ１２Ｄ１１、１１１Ｅ７Ｅ２、および１００Ｆ４Ｇ１２。以下で更なる詳細を示す：
６４Ｇ１１Ｂ４、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
６５Ｇ８Ｂ８、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
５６Ｅ８Ｆ１０Ｆ４、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
５４Ａ２Ｃ４、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
４４Ｆ６Ｂ１１、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１５Ｃ２Ｂ７、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
２０Ｆ１Ｅ１０、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
７２Ｃ１Ｂ６Ａ３、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
５８Ｇ２Ｃ２、マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体
１０１Ｃ４Ｆ１２、マウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ、κ抗体
１０３Ａ１０Ｂ２、マウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ、κ抗体
４０Ｃ１０Ｅ３、マウスモノクローナルＩｇＧ１、λ抗体
７８Ｅ８Ｇ９Ｇ６、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
４Ｆ１１Ｅ２、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１０Ｇ７Ｇ１１、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１２Ｆ１Ｆ４、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
７８Ｃ１０Ｂ６Ｇ４、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１１９Ｇ１１Ｄ９、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１１３Ｇ１２Ｅ５Ｅ６、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１１６Ａ８Ｂ７、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１０５Ｆ７Ｇ１２、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
８４Ｅ９Ｅ１２、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１０３Ｆ４Ｄ４、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１１０Ｃ１２Ｂ６、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
８５Ｈ１２Ｅ８、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１０３Ｈ２Ｂ４、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１０３Ｆ６Ｄ３、マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体
１１３Ｅ１２Ｆ７、マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体
１２０Ｂ７Ｂ２、マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体
１１１Ｂ１２Ｄ１１、マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体
１１１Ｅ７Ｅ２、マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体
１００Ｆ４Ｇ１２、マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体。
実施例２．ハイブリドーマ配列決定
ハイブリドーマ細胞（１×１０７個）を採取し、脾臓組織について上記のＴｒｉ試薬を使用して全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを、上記の製造業者の指示に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩキットを使用して調製した。得られたｃＤＮＡ産物をプライマーＶｈＲｅｖＵおよびＶｈＦｏｒＵを用いたＰＣＲの鋳型として使用し、得られた３００ｂｐ ＰＣＲ産物をＰＣＲクリーンアップキットを用いてクリーンアップし、同じプライマーで配列決定した。軽鎖Ｖ領域特異的プライマーＶｋＲｅＶ７およびＶｋＦｏｒ（可変領域のみ）またはＫａｐｐａＦｏｒプライマー（κ軽鎖全体）を用いてＰＣＲ反応も行った。精製されたＰＣＲ産物（cleaned PCR product）に対して配列決定反応を行って、抗体、６４Ｇ１１Ｂ４、６５Ｇ８Ｂ８、５６Ｅ８Ｆ１０Ｆ４、５４Ａ２Ｃ４、４４Ｆ６Ｂ１１、１５Ｃ２Ｂ７、２０Ｆ１Ｅ１０、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３、５８Ｇ２Ｃ２、１０１Ｃ４Ｆ１２、１０３Ａ１０Ｂ２、４０Ｃ１０Ｅ３、７８Ｅ８Ｇ９Ｇ６、４Ｆ１１Ｅ２、１０Ｇ７Ｇ１１、１２Ｆ１Ｆ４、７８Ｃ１０Ｂ６Ｇ４、１１９Ｇ１１Ｄ９、１１３Ｇ１２Ｅ５Ｅ６、１１６Ａ８Ｂ７、１０５Ｆ７Ｇ１２、８４Ｅ９Ｅ１２、１０３Ｆ４Ｄ４、１１０Ｃ１２Ｂ６、８５Ｈ１２Ｅ８、１０３Ｈ２Ｂ４、１０３Ｆ６Ｄ３、１１３Ｅ１２Ｆ７、１２０Ｂ７Ｂ２、１１１Ｂ１２Ｄ１１、１１１Ｅ７Ｅ２、および１００Ｆ４Ｇ１２についてのＤＮＡ配列を得た。それらの可変（ＶＨおよびＶＬ）配列を以下の表１に示す。
表１：抗体の可変領域の配列
Figure 2023502883000011
Figure 2023502883000012
Figure 2023502883000013
Figure 2023502883000014
Figure 2023502883000015
 実施例３．ＣＬＤ１８Ａ２に反応性のモノクローナル抗体の産生および精製
機能特性評価のためにｍｇ量の抗体を産生するために、ハイブリドーマ細胞を２×１０６細胞／ｍｌで透析ベースのバイオリアクター（ＣＥＬＬｉｎｅ ＣＬ１０００、Ｉｎｔｅｇｒａ社（スイス国クール在））に播種した。抗体含有上清を毎週１回採取した。各マウスモノクローナル抗体を、Ｍｅｌｏｎ Ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｃｅ社（米国ロックフォード在））を使用して精製し、硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮した。抗体濃度および純度を、ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動およびクマシー染色によって推定した。
実施例４．ＣＬＤ１８Ａ２に反応性のマウスモノクローナル抗体の結合
ＣＬＤ１８Ａ２を過剰発現したＭＫＮ４５細胞をフラスコから採取した。１００μｌの１×１０６細胞／ｍｌの細胞を、１００ｎＭから出発して０．００３ｎＭまで３倍段階希釈した、図３に示す一次抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。２００μｌのＦＡＣＳバッファーで二回洗浄した後、細胞を二次抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ５ｍｌチューブに移し、ＦＡＣＳによって分析した。この研究の結果は、フローサイトメトリーによって、精製マウス抗体が、陽性参照抗体と比較して、高いＥＣ５０でヒトＣＬＤ１８Ａ２でトランスフェクトしたＭＫＮ４５細胞に結合できることを示した。
実施例５．ＣＬＤ１８Ａ２変異体に反応性のマウスモノクローナル抗体の結合
Ｍ１４９Ｌ変異を有するＣＬＤ１８Ａ２を内因的に発現したＳＵ６２０細胞をフラスコから採取した。１００μｌの１×１０６細胞／ｍｌの細胞を、１００ｎＭから出発して０．００３ｎＭまで３倍段階希釈した、図４に示す一次抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。２００μｌのＦＡＣＳバッファーで二回洗浄した後、細胞を二次抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ５ｍｌチューブに移し、ＦＡＣＳによって分析した。この研究の結果は、フローサイトメトリーによって、精製マウス抗体が、高いＥＣ５０でＭ１４９Ｌ変異を有するヒトＣＬＤ１８Ａ２を内因的に発現するＳＵ６２０細胞に結合し得る一方で、参照抗体は結合しなかったことを示した（図４）。
実施例６．マウスおよびカニクイザルＣＬＤ１８Ａ２に反応性のマウスモノクローナル抗体の結合
マウスおよびカニクイザルＣＬＤ１８Ａ２とのこれらの抗体の交差反応性を評価するために、マウス、カニクイザルまたはヒトＣＬＤ１８Ａ２を過剰発現したＨＥＫ２９３細胞をフラスコから採取した。１００μｌの１×１０６細胞／ｍｌの細胞を、１００ｎＭから出発して０．００３ｎＭまで３倍段階希釈した、図３に示す一次抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。２００μｌのＦＡＣＳバッファーで二回洗浄した後、細胞を二次抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ５ｍｌチューブに移し、ＦＡＣＳによって分析した。この研究の結果は、フローサイトメトリーによって、精製マウス抗体が、少なくとも参照抗体と同様に、高いＥＣ５０でマウスおよびカニクイザルＣＬＤ１８Ａ２に結合できることを示した（図５、図６および図７）。
実施例７．ＣＬＤ１８Ａ２に反応性のキメラ抗体の結合
マウスＶＨおよびＶＫ遺伝子を合成して産生し、次いで、それぞれヒトγ１およびヒトκ定常ドメインを含むベクターにクローニングした。精製キメラ抗体は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞から産生された。
ヒトＣＬＤ１８Ａ２またはＣＬＤ１８Ａ１を安定に発現したＭＫＮ４５細胞をフラスコから採取した。１００μｌの１×１０６細胞／ｍｌの細胞を、１００ｎＭから出発して０．００３ｎＭまで３倍段階希釈した、図４に示す一次キメラ抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。２００μｌのＦＡＣＳバッファーで二回洗浄した後、細胞を二次抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ５ｍｌチューブに移し、ＦＡＣＳによって分析した。研究の結果は、キメラ抗体が、高いＥＣ５０でヒトＣＬＤ１８Ａ２に結合できるが、ＣＬＤ１８Ａ１には結合しないことを示した（図８および図９）。
実施例８．キメラ抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、ＡＤＣＣ ＭＯＡ経路活性化：エフェクター細胞におけるＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）経路を介した遺伝子転写の活性化におけるより早い時点での代替的な読み出しを使用する。さらに、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体、Ｖ１５８（高親和性）バリアント、およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定に発現する操作されたＪｕｒｋａｔ細胞をエフェクター細胞として使用する。ＡＤＣＣ ＭＯＡにおける抗体の生物学的活性を、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として産生されるルシフェラーゼによって定量し、エフェクター細胞中のルシフェラーゼ活性を発光読み出しで定量した（図１）。シグナルは高く、アッセイのバックグラウンドは低かった。
クローディン１８．２キメラモノクローナル抗体または参照抗体の連続希釈液を、操作されたＪｕｒｋａｔエフェクター細胞（ＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞）と共に、ＡＤＣＣバイオアッセイ標的細胞（クローディン１８．２を発現）が有る場合と無い場合とで、３７℃で６時間の誘導のためインキュベートした。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を使用してルシフェラーゼ活性を定量した（表２）。結果は、これらのキメラ抗体が非常に強いＡＤＣＣ活性を有することを示す。
表２．試験抗体のＥＣ５０
Figure 2023502883000016
 実施例９．４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２マウスｍＡｂのヒト化
ｍＡＢ ４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２可変領域遺伝子を使用して、ヒト化ＭＡｂを作製した。このプロセスの第１のステップでは、ＭＡｂのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体的に最もよくマッチするヒト生殖細胞系Ｉｇ遺伝子配列を見出した。
ヒト化抗体のアミノ酸配列を以下の表３に列挙する。
表３．ヒト化配列
Figure 2023502883000017
Figure 2023502883000018
ヒト化ＶＨおよびＶＬ遺伝子を合成して産生し、次いで、それぞれヒトγ１およびヒトκ定常ドメインを含むベクターにクローニングした。ヒトＶＨとヒトＶＬとのペアリングにより、ヒト化抗体を作製した（表４を参照されたい）。
表４．ＶＨおよびＶＬ領域を有するヒト化抗体
Figure 2023502883000019
Figure 2023502883000020
 実施例１０．ＣＬＤ１８Ａ２に反応性のヒト化抗体の結合
ヒトＣＬＤ１８Ａ２またはＣＬＤ１８Ａ１を安定に発現したＭＫＮ４５細胞をフラスコから採取した。１００μｌの１×１０６細胞／ｍｌの細胞を、１００ｎＭから出発して０．００３ｎＭまで３倍段階希釈した、図４に示す一次ヒト化抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。２００μｌのＦＡＣＳバッファーで二回洗浄した後、細胞を二次抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ５ｍｌチューブに移し、ＦＡＣＳによって分析した。研究の結果は、示されたヒト化抗体が、ＣＬＤ１８Ａ１ではなく、ヒトＣＬＤ１８Ａ２に高いＥＣ５０で結合できることを示した（図１０および図１１）。
実施例１１．ＣＬＤ１８Ａ２に反応性のＰＴＭ（翻訳後修飾）脱リスクヒト化抗体の結合
翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、治療用タンパク質の開発中に、不均一性の増加、生物活性の低下、安定性の低下、免疫原性、断片化および凝集などの問題を引き起こす可能性がある。ＰＴＭの潜在的な影響は、それらの位置および場合によっては溶媒曝露に依存する。配列のＣＤＲを、以下の潜在的なＰＴＭについて分析した：アスパラギン脱アミド、アスパラギン酸異性化、遊離システインチオール基、Ｎ－グリコシル化、酸化、潜在的な加水分解部位による断片化など。
４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２においてＰＴＭを生じるリスクを低下させるために、ＶＨおよびＶＬ中のいくつかの関連アミノ酸を変異させた。次いで、９つの抗体を生成した。
Figure 2023502883000021
Figure 2023502883000022
 ＊アミノ酸位置（例えば、Ｎ５５）は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａではなく、対応するＶＨまたはＶＬアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数に従う。
Figure 2023502883000023
ヒトＣＬＤ１８Ａ２またはＣＬＤ１８Ａ１を安定に発現したＭＫＮ４５細胞をフラスコから採取した。１００μｌの１×１０６細胞／ｍｌの細胞を、１００ｎＭから出発して０．００３ｎＭまで３倍段階希釈した、図４に示す一次変異抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。２００μｌのＦＡＣＳバッファーで二回洗浄した後、細胞を二次抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ５ｍｌチューブに移し、ＦＡＣＳによって分析した。研究の結果は、示された抗体が、ＣＬＤ１８Ａ１ではなく、ヒトＣＬＤ１８Ａ２に高いＥＣ５０で結合できることを示した（図１２および図１３）。
４Ｆ１１Ｅ２ｄ（ＨＣＮ５５Ｅ／ＬＣＳ３２Ａ）および４Ｆ１１Ｅ２ｄ（ＨＮ５５ＥＮ１０４Ｑ／ＬＣＳ３２Ａ）の脱リスクバリアントの抗原結合能を評価するために、細胞ベースの結合アッセイでバリアントを試験した。１００ｎＭから開始して連続希釈した抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を、１０５個の細胞と共に氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、次いで、細胞をＡＰＣ標識二次抗体と共に氷上でさらに３０分間インキュベートした。抗体と結合した細胞をＦＡＣＳによって分析した。バリアントは、細胞表面クローディン１８．２（図１４）に対する強力な結合を示した。
実施例１２．ＰＴＭ脱リスクヒト化抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
クローディン１８．２ＰＴＭ脱リスクヒト化抗体または参照抗体の連続希釈液を、操作されたＪｕｒｋａｔエフェクター細胞（ＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞）と共に、ＡＤＣＣバイオアッセイ標的細胞（クローディン１８．２を発現）が有る場合と無い場合とで、３７℃で６時間の誘導のためインキュベートした。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を使用してルシフェラーゼ活性を定量した（表５）。結果は、これらのヒト化抗体が非常に強いＡＤＣＣ活性を有することを示す。
表５．ＡＤＣＣ
Figure 2023502883000024
 実施例１３．エピトープマッピング
クローディン１８．２の細胞外ドメインの全てのアミノ酸を個々にＡに変異させた。各変異型クローディン１８．２または野生型クローディン１８．２をＨｅｋ２９３細胞内にトランスフェクトした。クローディン１８．２の発現を、示された抗体によって評価した。結果を図１５に示す（変異が結合を低減したアミノ酸残基のみを示す）。
図１５に示されるように、アミノ酸Ｗ３０、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｌ４９、Ｗ５０、Ｃ５３、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０、Ｅ６２、Ｃ６３、Ｒ８０、Ｙ１６９およびＧ１７２は、３つの試験抗体、４Ｆ１１Ｅ２（Ｈ４Ｆ）、７２Ｃ１８６Ａ３（Ｈ７２Ｃ１）および１２０Ｂ７Ｂ２（１２０）、または参照抗体１７５Ｄ１０（ＩＭＡＢ３６２）の結合に関与している。Ｗ３０は、クローディン１８．２タンパク質の最初の細胞外ドメインの前半に残基のクラスターを形成するようであった。Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｌ４９、Ｗ５０、Ｃ５３、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０、Ｅ６２およびＣ６３は、同じ細胞外ドメイン内の残基の第２のクラスターであるようであった。一方、Ｙ１６９およびＧ１７２は、第２の細胞外ドメインまたはその近傍に位置する。
様々なクローディンタンパク質の結晶構造が解明されている。図２０（Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１３９７：２５－３４）に示すように、クローディンタンパク質は、四つの膜貫通セグメント、短い細胞内Ｎ末端、コンセンサスＷ－ＬＷ－Ｃ－Ｃモチーフを含む大きな第１の細胞外ループ（ループ１、またはＥＣＳ１）、より短い第２の細胞外ループ（ループ２、またはＥＣＳ２）、および細胞内Ｃ末端テール部を含む。ループ１は、４本のβ鎖β１、β２、β３、およびβ４を含み、ループは、１本のβ鎖β５を含む。
Ｗ３０、Ｌ４９およびＷ５０のアラニンへの変異は、ループ１のコンフォメーションを不安定化した可能性があった。Ｃ５３またはＣ６３の変異は、β３とβ４との間のジスルフィド結合を破壊した可能性があった。Ｒ８０は、細胞表面上の平行クローディン１８．２分子間の相互作用を維持するために、またはループ１のコンフォメーションを安定化するために重要である可能性がある。Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０、およびＥ６２（β３～β４ループ内）、ならびにＹ１６９およびＧ１７２（β５内）を含む残りの残基は、ここで試験される抗体への結合のための界面を提示する可能性がある。
実施例１４．ヒト化４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２抗体とベンチマーク１７５Ｄ１０クローディン１８．２抗体との比較
細胞ベースの結合
ヒト化抗クローディン１８．２抗体：４Ｆ１１Ｅ２（ＨＣＮ５５Ｅ／ＬＣＳ３２Ａ）、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３（ＨＣＷＴ／ＬＣＳ３２Ａ）および１２０Ｂ７Ｂ２（ＨＣＧ５７ＤＳ１０４Ａ／ＬＣＳ３２ＡＧ９７Ａ）をベンチマーク抗体１７５Ｄ１０（ＩＭＡＢ３６２）と比較するために、この実施例では、ヒトクローディン１８．２発現細胞における細胞ベースの結合を決定した。ヒトＣＬＤＮ１８．２発現のレベルに基づいて、ヒトＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を高発現細胞と低発現細胞とにソートした。１００ｎＭから開始して連続希釈した抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を、１０５個の細胞と共に氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、次いで、細胞をＡＰＣ標識二次抗体と共に氷上でさらに３０分間インキュベートした。抗体と結合した細胞をＦＡＣＳによって分析した。
図１６に示すように、４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２は、クローディン１８．２の高ＣＨＯ－Ｋ１細胞および低ＣＨＯ－Ｋ１細胞の両方において、１７５Ｄ１０よりも優れた結合を示した。
ＡＤＣＣアッセイ
ヒト化抗クローディン１８．２抗体：４Ｆ１１Ｅ２（ＨＣＮ５５Ｅ／ＬＣＳ３２Ａ）、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３（ＨＣＷＴ／ＬＣＳ３２Ａ）および１２０Ｂ７Ｂ２（ＨＣＧ５７ＤＳ１０４Ａ／ＬＣＳ３２ＡＧ９７Ａ）のＡＤＣＣ効果をベンチマーク抗体１７５Ｄ１０（ＩＭＡＢ３６２）とさらに比較するために、この実施例では細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを行った。簡潔には、ＮＫ９２細胞を、異なる用量の抗クローディン１８．２抗体の存在下でクローディン１８．２過剰発現２９３細胞と共培養した。図１７に示すように、４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２は、１７５Ｄ１０抗体よりも優れたＡＤＣＣ効力を示した。
特定の治療用抗体の場合、増強されたＡＤＣＣは、抗体に基づく標的療法に対する治療域を増加させ得る。増強されたＡＤＣＣは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異などを用いてＦｃ領域を操作することにより達成され得る。ＮＫ９２細胞ベースのＡＤＣＣアッセイでは、Ｆｃ領域にＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異を有する４Ｈ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２抗体は、同じＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異を有する対照抗体１７５Ｄ１０と比較して、クローディン１８．２過剰発現２９３細胞のより強いＮＫ９２媒介細胞殺滅を媒介した（図１８）。
抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）
マクロファージによる腫瘍細胞貪食作用に対する抗ＣＬＤＮ１８．２ｍＡｂの効果を、ＣＬＤＮ１８．２陽性ＮＵＧ－Ｃ４細胞を異なる濃度の抗ＣＬＤＮ１８．２ｍＡｂの存在下でヒト分化マクロファージと共培養したインビトロアッセイで評価した。手短に言えば、ＣＤ１４＋単球をヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製し、インビトロで６日間成熟マクロファージに分化させた。単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を回収し、エフェクター細胞として２４ウェルディッシュに一晩再播種した。標的細胞としてのＮＵＧ－Ｃ４発現ＣＬＤＮ１８．２－ｅＧＦＰを、異なる濃度の抗ＣＬＤＮ１８．２ｍＡｂの存在下で、貪食細胞あたり５つの腫瘍細胞の比でＭＤＭに添加した。３時間のインキュベーション後、貪食されていない標的細胞をＰＢＳで洗い流し、残りの貪食細胞を回収し、マクロファージマーカーＣＤ１４で染色した後、フローサイトメトリー分析を行った。貪食作用指数を、ＣＤ１４＋細胞中でのＧＦＰ＋細胞のパーセントを定量し、ＩｇＧ対照のものに対して正規化することによって計算した。
図１９に示すように、全てのＣ１８．２ｍＡｂは、濃度依存的にＮＵＧ－Ｃ４細胞の貪食作用を有意に増強した。野生型ＩｇＧ１およびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異ＩｇＧ１フォーマットの両方において、４Ｈ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２抗体は、参照抗体１７５Ｄ１０よりも強いＡＤＣＰ効果を示した。
まとめると、この実施例は、新たに開発された４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２抗体が、参照抗体１７５Ｄ１０よりも強い細胞ベースの結合およびＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ効力を有したことを実証する。これらの新しい抗体の改善された特性は、参照抗体１７５Ｄ１０の結合特異性と比較して、これらの抗体のより高い結合特異性に起因し得ると想定される。例えば、１７５Ｄ１０のクローディン１８．２との相互作用は、Ｄ２８、Ｑ３３、Ｎ３８およびＶ４３、次いでＧ５９およびＶ７９への強い結合を含む図１５の一連の範囲にわたって強い。対照的に、新しい抗体４Ｆ１１Ｅ２、７２Ｃ１Ｂ６Ａ３および１２０Ｂ７Ｂ２は、第１の細胞外ドメインの前半内のＷ３０に対してより高い特異性を有し、第１の細胞外ドメインの後半内のＧ４８～Ｅ５６に対してより高い特異性を有する。新しい抗体はまた、同じく後半にあるＹ４６に対してわずかにより強い結合を有する。Ｄ２８、Ｑ３３、Ｎ３８、Ｖ４３、Ｇ５９およびＶ７９へのそれらの結合はかなり弱く、これはおそらく新しい抗体の改善されたＡＤＣＣおよびＡＤＣＰに寄与していた。
実施例１５：クローディン１８．２抗体へのｐＨＡｂコンジュゲーション
ＣＬＤＮ１８．２に結合した抗クローディン１８．２抗体のインターナリゼーションを、ｐＨＡｂ反応性色素ベースのインターナリゼーションアッセイを使用して決定した。ｐＨＡｂ色素は、ｐＨ＞７で非常に低い蛍光を有し、溶液のｐＨが酸性になるにつれて蛍光が劇的に増加するｐＨセンサー色素である。ｐＨＡｂ色素は、５３２ｎｍに励起極大（Ｅｘ）を有し、５６０ｎｍに発光極大（Ｅｍ）を有する。ｐＨＡｂ色素コンジュゲート抗体は、受容体媒介抗体インターナリゼーションをモニターするために使用することができる。抗体－ｐＨＡｂ色素コンジュゲートが細胞膜上のその受容体に結合すると、それは最小の蛍光を示す。しかしながら、受容体媒介インターナリゼーションの際に、抗体－ｐＨＡｂ色素コンジュゲートは、ｐＨが酸性であるエンドソームおよびリソソーム小胞に輸送され、ｐＨＡｂ色素を蛍光させる。この蛍光は、細胞イメージング、フローサイトメトリーおよび適切なフィルターを備えた蛍光プレートベースのリーダーを含む様々な技術を使用して検出することができる。
実験プロトコル：
Ａ．抗体産生
２７のキメラ抗体、３つのヒト化抗体および対照ＩｇＧ１を、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって産生し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
Ｂ．ｐＨＡｂチオール反応性色素を用いたビーズ上抗体コンジュゲーション
１．穏やかに振盪するか、またはエンドオーバーエンドミキサーを使用して、ＡｍＭａｇ（登録商標）プロテインＡビーズ（ＬＣ００６９５）を均一に再懸濁する。ビーズのアリコートを作製するとき、懸濁液を均一に保つ。
２．ビーズスラリー５０μｌを１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに添加する。チューブを磁気スタンド上に１０秒間置く。
３．保管バッファーを除去し廃棄する。
４．ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μｌを添加する。チューブを混合し、磁気スタンド上に１０秒間置く。バッファーを除去し、廃棄する。
５．抗体１００μｇを含有する１．０ｍｌの試料をビーズに添加する。
６．試料を室温で６０分間混合する。連続的に混合することによってビーズを懸濁状態に保つ。
７．チューブを磁気スタンド内に１０秒間置く。上清を除去する。
８．２５０μｌのチオールコンジュゲーションバッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０を含有する１０ｍＭリン酸バッファー）を添加し、混合する。チューブを磁気スタンド内に１０秒間置く。バッファーを除去し、廃棄する。このステップを合計２回繰り返す。
９．１００μｌのチオールコンジュゲーションバッファーを添加する。
１０．ＤＴＴを２．５ｍＭの最終濃度まで添加する。
１１．混合試料を室温で６０分間混合する。連続的に混合することによってビーズを懸濁状態に保つ。
１２．チューブを磁気スタンド内に１０秒間置き、バッファーを廃棄する。
１３．２５０μｌのチオールコンジュゲーションバッファーを添加し、混合する。チューブを磁気スタンド内に１０秒間置く。バッファーを除去し、廃棄する。このステップを合計２回繰り返す。
１４．１００μｌのチオールコンジュゲーションバッファーを添加する。
１５．ｐＨＡｂチオール反応性色素（Ｇ９８３５）を素早く遠心分離し（すなわち、卓上遠心分離機で５～１０秒間１４，０００×ｇ）、２５μｌの１：１ＤＭＳＯ－水混合物を０．２５ｍｇの色素に添加することによって１０ｍｇ／ｍｌで溶解する。ボルテックスによって混合する。色素が完全に溶解するには１～３分かかる場合がある。使用直前にこの溶液を作製する。
１６．１００μｇの抗体に対して１．２μｌのｐＨＡｂチオール反応性色素を添加して、２０モル過剰の色素を作製する。
１７．６０分間混合する。連続的に混合することによってビーズを懸濁状態に保つ。
１８．チューブを磁気スタンド内に１０秒間置く。上清を除去し、廃棄する。１９．２５０μｌのチオールコンジュゲーションバッファーを添加し、混合する。磁気スタンド内に１０秒間置く。結合/洗浄バッファー（ＰＢＳ．ｐＨ７．４）を除去し、廃棄する。
２０．合計２回洗浄するためにステップ１９を繰り返す。
２１．１００μｌの溶出バッファー（０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０）をビーズに添加する。
２２．室温で５分間混合する。
２３．チューブを磁気スタンド内に１０秒間置く。溶出試料を取り出し、５μｌの中和バッファー（１Ｍトリス－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を含有する新しいマイクロ遠心チューブに移す。
試験抗体の抗体濃度および色素対抗体比（ＤＡＲ）を表６に示す。
表６．色素対抗体比（ＤＡＲ）
Figure 2023502883000025
 実施例１６：クローディン１８．２抗体のインターナリゼーションについてのスクリーニング
安定にトランスフェクトしたヒトＣＬＤＮ１８．２ＭＫＮ４５細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，２５３００－０５４）を用いて回収し、９６ウェルブラックプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号１６５３０５）に、９０μｌ／ウェルあたり２０Ｋの密度で播種した。プレートを２０～２４時間インキュベートした後、ｐＨＡｂ標識抗体で処理した。
インターナリゼーションのために、ｐＨＡｂコンジュゲートクローディン１８．２抗体を２つの濃度（２０ｎＭおよび１００ｎＭ）で細胞に添加し、プレートミキサーで１～２分間穏やかに混合し、次いで一晩インキュベートしてインターナリゼーションを可能にした（インターナリゼーションは数時間で検出できる）。プレートを蛍光プレートリーダーで、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｍ１０００ Ｐｒｏ上のＥｘ／Ｅｍ：５３２ｎｍ／５６０ｎｍで読み取った。より高い感度を達成するために、プレートを読み取る前に培地をＰＢＳで置き換えた。
ＤＡＲで正規化した結果を表７に示す。試験抗体のインターナリゼーション効率は、参照抗体ＩＭＡＢ３６２よりも高かった。
表７．インターナリゼーションの結果
Figure 2023502883000026
 実施例１７：ＣＨＯ－クローディン１８．２細胞に対するキメラクローディン１８．２抗体のインターナリゼーションのＥＣ５０
安定にトランスフェクトしたヒトＣＬＤＮ１８．２ＣＨＯ細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，２５３００－０５４）を用いて回収し、９６ウェルブラックプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号１６５３０５）に、９０μｌ／ウェルあたり１０Ｋの密度で播種した。プレートを２０～２４時間インキュベートした後、ｐＨＡｂ標識抗体で処理した。
インターナリゼーションのために、ｐＨＡｂコンジュゲートキメラクローディン１８．２抗体を様々な濃度（１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭおよび０．０１ｎＭ）で細胞に添加し、プレートミキサーで１～２分間穏やかに混合し、次いで一晩インキュベートしてインターナリゼーションを可能にした（インターナリゼーションは数時間で検出できる）。プレートを蛍光プレートリーダーで、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｍ１０００ Ｐｒｏ上のＥｘ／Ｅｍ：５３２ｎｍ／５６０ｎｍで読み取った。より高い感度を達成するために、プレートを読み取る前に培地をＰＢＳで置き換えた。
ＤＡＲで正規化した結果を図２１に示す。ここでも、試験抗体のインターナリゼーション効率は、参照抗体ＩＭＡＢ３６２よりも高かった。
実施例１８：ＣＨＯ－クローディン１８．２細胞に対するヒト化クローディン１８．２抗体のインターナリゼーションのＥＣ５０
安定にトランスフェクトしたヒトＣＬＤＮ１８．２ＣＨＯ細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，２５３００－０５４）を用いて回収し、９６ウェルブラックプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号１６５３０５）に、９０μｌ／ウェルあたり１０Ｋの密度で播種した。プレートを２０～２４時間インキュベートした後、ｐＨＡｂ標識抗体で処理した。
インターナリゼーションのために、ｐＨＡｂコンジュゲートヒト化クローディン１８．２抗体を様々な濃度（１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭおよび０．０１ｎＭ）で細胞に添加し、プレートミキサーで１～２分間穏やかに混合し、次いで一晩インキュベートしてインターナリゼーションを可能にした（インターナリゼーションは数時間で検出できる）。プレートを蛍光プレートリーダーで、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｍ１０００ Ｐｒｏ上のＥｘ／Ｅｍ：５３２ｎｍ／５６０ｎｍで読み取った。より高い感度を達成するために、プレートを読み取る前に培地をＰＢＳで置き換えた。
ＤＡＲで正規化した結果を図２２に示し、これは、試験抗体のインターナリゼーション効率が参照抗体ＩＭＡＢ３６２よりも大きかったことを示す。
実施例１９：ＭＫＮ４５－クローディン１８．２細胞に対するヒト化クローディン１８．２抗体のインターナリゼーションのＥＣ５０
安定にトランスフェクトしたヒトＣＬＤＮ１８．２ＭＫＮ４５細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，２５３００－０５４）を用いて回収し、９６ウェルブラックプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号１６５３０５）に、９０μｌ／ウェルあたり１０Ｋの密度で播種した。プレートを２０～２４時間インキュベートした後、ｐＨＡｂ標識抗体で処理した。
インターナリゼーションのために、ｐＨＡｂコンジュゲートヒト化クローディン１８．２抗体を様々な濃度（１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭおよび０．０１ｎＭ）で細胞に添加し、プレートミキサーで１～２分間穏やかに混合し、次いで一晩インキュベートしてインターナリゼーションを可能にした（インターナリゼーションは数時間で検出できる）。プレートを蛍光プレートリーダーで、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｍ１０００ Ｐｒｏ上のＥｘ／Ｅｍ：５３２ｎｍ／５６０ｎｍで読み取った。より高い感度を達成するために、プレートを読み取る前に培地をＰＢＳで置き換えた。
ＤＡＲで正規化した結果を図２３に示し、これは、試験抗体のインターナリゼーション効率が参照抗体ＩＭＡＢ３６２よりも大きかったことを示す。
実施例２０：抗体薬物コンジュゲート
各抗体をおよそ３倍のＴＣＥＰと混合し、３７℃で２時間撹拌した。反応系をＶＣ－ＭＭＡＥについて８倍にわたって迅速に滴下し、氷上で１時間インキュベートし、２０倍過剰のシステインを薬物リンカー上に添加して反応を停止させた。最後に、ＡＤＣ産物を、ＰＢＳ中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５による溶出によって精製し、遠心限外濾過によって濃縮した。コンジュゲートを滅菌条件下で０．２μｍフィルターに通して濾過し、分析および試験のために－８０℃で保存した。薬物抗体比をＵＶ分光法によって分析し、モノマー含有量をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析し、遊離薬物含有量をＲＰ－ＨＰＬＣによって分析した。ｖｃＭＭＡＥコンジュゲート抗体の（ＤＡＲ）を表８に示す。
表８．ｖｃＭＭＡＥコンジュゲート抗体のＤＡＲ
Figure 2023502883000027
Figure 2023502883000028
 実施例２１：抗ＣＬＤＮ１８．２ｎａｋｅｄ抗体および抗体薬物コンジュゲートの相対的結合親和性および特異性
この実施例は、ＣＬＤＮ１８．２陽性および陰性細胞株を使用してフローサイトメトリーによって、抗ＣＬＤＮ１８．２ｎａｋｅｄ抗体および抗体薬物コンジュゲートの相対的な結合親和性および特異性を決定した。
指数関数的に成長する培養物からの細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、２５３００－０５４）を用いて回収しノイバウエル計数チャンバを使用して計数した。細胞を１，５００ｒｐｍ（４６８×ｇ）で５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を２×１０６個の細胞／ｍｌでＦＡＣＳバッファー（毒素コンジュゲート抗体を用いた分析用の２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ、１０２７０－１０６）を含有するＰＢＳ、ＣＬＤＮ１８．２反応性ｎａｋｅｄ抗体のスクリーニング用の２％ＦＣＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）に再懸濁した。ウェルあたり１００μｌの細胞懸濁液（２×１０５個の細胞/ウェルに相当する）を丸底９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。１５００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、上清を廃棄し、細胞を、適切な濃度（相対的親和性測定のためには２０μｇ／ｍｌまで、または発現制御のためには５０μｇ／ｍｌまで）の毒素コンジュゲート抗体またはｎａｋｅｄ抗体を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４℃で３０～４５分間インキュベートした。（表８）。細胞を１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、１０９－１３６－１７０）またはＡＰＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、１１５－１３６－１４６）またはプロテインＬ－ＦＩＴＣ（１μｇ／ｍｌ、ｃｈｉｍ ｍＡＢ２９４の分析）を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。（表３）。インキュベーション後、１００μｌのＦＡＣＳバッファーを各試料に添加し、細胞を１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。ＦＡＣＳバッファーによる洗浄ステップを２回繰り返した。最後に、細胞を１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、結合をＢＤ ＦＡＣＳアレイバイオアナライザーを使用して決定した。
毒素コンジュゲート抗体およびｎａｋｅｄ抗体を等しい濃度で適用したことに留意すべきである。結果を図２４に示す。
実施例２２：ＭＭＡＥを用いたクローディン１８．２ヒト化抗体の細胞毒性は、ＤＡＮ－Ｇ、ＮＵＧＣまたはＳＣＧ－７９０１トランスフェクタントにおいてＭＭＡＥを用いたＩＭＡＢ３６２よりも強力である
ヒトクローディン１８．２を過剰発現する細胞（ＤＡＮ－Ｇ、ＮＵＧＣまたはＳＣＧ－７９０１トランスフェクタント）を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、２５３００－０５４）を用いて回収し、細胞培養培地に再懸濁し、対応する量の細胞を含む５０μｌの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートのウェルあたりに播種した。２４時間後、適切な濃度の５０μｌ培地に希釈した毒素コンジュゲートＩＭＡＢ３６２または対照抗体を添加し、細胞をさらに７２時間培養した。細胞生存率に及ぼすＭＭＡＥを有するクローディン１８．２ヒト化抗体の効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｇ７５７２）を用いて決定した。
使用したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｇ７５７２）プロトコルは以下の通りであった：
１．培養培地中の哺乳動物細胞を含む不透明壁のマルチウェルプレートを、９６ウェルプレートについては１００μｌ／ウェルまたは３８４ウェルプレートについては２５μｌ／ウェルで調製する。マルチウェルプレートは、使用されるルミノメータに適合しなければならない。
２．バックグラウンド発光の値を得るために、細胞を含まない培地を含む対照ウェルを調製する。
３．試験化合物を実験ウェルに添加し、培養プロトコルに従ってインキュベートする。４．プレートおよびその内容物を室温でおよそ３０分間平衡化する
５．各ウェルに存在する細胞培養培地の体積に等しい体積のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を添加する（例えば、９６ウェルプレート用の細胞を含有する１００μｌの培地に１００μｌの試薬を添加するか、または３８４ウェルプレート用の細胞を含有する２５μｌの培地に２５μｌの試薬を添加する）。
６．内容物をオービタルシェーカーで２分間混合して、細胞溶解を誘導する。
７．プレートを室温で１０分間インキュベートして発光シグナルを安定化させる。注記：標準プレート内の不均一な発光シグナルは、温度勾配、細胞の不均一なシーディングまたはマルチウェルプレートにおけるエッジ効果によって引き起こされ得る。
８．発光を記録する。
試験結果を図２５Ａ～Ｃに示す。ＢＧ２００１－ＣおよびＢＧ２００１－Ｄは両方とも、ＭＭＡＥとコンジュゲートした場合、試験した全ての細胞において、参照ＩＭＡＢ３６２－ＮＭＡＥコンジュゲートと比較して細胞傷害性が大幅に増加した。したがって、これらの結果は、コンジュゲート薬物のインターナリゼーションにおける本開示の抗体の改善された能力を実証する。
実施例２３：ＭＭＡＥを有するクローディン１８．２ヒト化抗体の細胞毒性は、ヒトクローディン１８．２を内因的に発現するＳＮＵ６２０においてＭＭＡＥを有するＩＭＡＢ３６２よりも強力である
ＳＮＵ６２０細胞を細胞培養培地に再懸濁し、対応する量の細胞を含む５０μｌの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートにウェルあたりシーディングした。２４時間後、適切な濃度で５０μｌ培地に希釈した、参照抗体ＩＭＡＢ３６２を含む毒素コンジュゲート抗体を添加し、細胞をさらに７２時間培養した。細胞生存率に及ぼすＭＭＡＥを有するクローディン１８．２ヒト化抗体の効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｇ７５７２）を用いて決定した。図２６に示すように、ＢＧ２００１－ＣおよびＢＧ２００１－Ｄは両方とも、臨床開発中のリード抗クローディン１８．２抗体である参照抗体ＩＭＡＢ３６２と比較して、コンジュゲートＭＭＡＥをＳＮＵ６２０細胞に送達するのに非常により有効であった。
実施例２４：抗体薬物コンジュゲートのインビボ有効性
この実施例では、ヒト腫瘍細胞を移植したヌードマウスにおける腫瘍成長の低下について、抗体単独（ｍＡｂ）と比較した抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のうちの１つの有効性を試験した。
各マウスの右背部にヒト患者由来細胞（マトリゲルと１：１混合）０．１ｍＬ（５×１０５個の細胞）を皮下接種した。平均腫瘍体積が６０～８０ｍｍ３に達したとき、３０匹のマウスを処置実験のために選択した。
接種の１８日後、３３０～５２０ｍｍ３の範囲の腫瘍サイズを有する５匹のマウスを３週間の各処置（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｍｋ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ ＡＤＣ、ＱＷ）のために選択した。比較のために、抗体（ｍＡｂ）単独の処置は１０ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＷ）であった。
結果を図２７に示す。１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの両方のＡＤＣは、動物の体重を減少させることなく、腫瘍成長を完全に阻害した。図２８は、各動物における平均および個々の腫瘍減少効果を示す。したがって、ＡＤＣの腫瘍減少効果は、抗体単独よりもかなり大きい。
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に等価な任意の組成物または方法が本開示の範囲内にある。本開示の精神または範囲から逸脱することなく、本開示の方法および組成物に様々な修正および変形を加えることができることは当業者には明らかである。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内に入る限り、本開示の修正および変形を包含することが意図される。
本明細書で言及される全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (29)

  1. 野生型ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはその断片に共有結合した薬物部分を含む抗体－薬物コンジュゲートであって、前記抗体または前記その断片が、ＣＬＤＮ１８．２のβ３－β４ループおよびβ５鎖に結合し、前記β３－β４ループが配列番号３０の残基４５～６３（ＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣ）からなり、前記β５鎖が配列番号３０の残基１６９～１７２（ＹＴＦＧ）からなる、抗体－薬物コンジュゲート。
  2. 前記抗体またはその断片が、前記薬物部分の２～１０に結合している、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  3. 前記抗体またはその断片が、前記薬物部分の２～６に結合している、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  4. 前記抗体または前記その断片が、β１およびβ２に結合しないか、または前記β３－β４ループもしくは前記β５鎖への結合の親和性の少なくとも１０分の１の親和性でβ１もしくはβ２に結合する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  5. 前記抗体または前記その断片が、ＣＬＤＮ１８．１タンパク質に結合しないか、または前記ＣＬＤＮ１８．２タンパク質への結合の親和性の少なくとも１０分の１の親和性でＣＬＤＮ１８．１タンパク質に結合する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  6. 前記抗体または前記その断片が、前記野生型ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に対する親和性の少なくとも１％である親和性でＣＬＤＮ１８．２ Ｍ１４９Ｌ変異体に結合する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  7. 前記抗体または前記その断片が、配列番号３０の、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｇ４８、Ｖ５４、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｓ５８、Ｆ６０およびＥ６２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、ならびにＹ１６９およびＧ１７２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  8. 前記抗体または前記その断片が、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、
    前記ＣＤＲＬ１は、配列番号２０８～２２６、３０４～３０５および３０８～３０９の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ２は、配列番号２２７～２３３の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ３は、配列番号３、８、１３、１９、２０および４２～５８の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ１は、配列番号２３４～２５４の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ２は、配列番号２５５～２８０、３０６、３１０および３１１の群から選択されるアミノ酸配列を含み、ならびに
    前記ＣＤＲＨ３は、配列番号２８１～３０３、３０７および３１２～３１４の群から選択されるアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  9. 前記ＣＤＲＬ１が、配列番号２１０、３０４または３０５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ２が、配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ３が、配列番号３、１９または２０のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ１が、配列番号２５３のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ２が、配列番号２７８または３０６のアミノ酸配列を含み、ならびに
    前記ＣＤＲＨ３が、配列番号３０３または３０７のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  10. 前記抗体または前記その断片が、配列番号１４１、１９２～１９５および２０６～２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号１４１、１９２～１９５および２０６～２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項９に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  11. 前記抗体または前記その断片が、配列番号１７１、１８８～１９１および２０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１７１、１８８～１９１および２０５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項９または１０に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  12. 前記ＣＤＲＬ１が、配列番号３０４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ２が、配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ３が、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ１が、配列番号２５３のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ２が、配列番号３０６のアミノ酸配列を含み、ならびに
    前記ＣＤＲＨ３が、配列番号３０７のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  13. 前記抗体または前記その断片が、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号２０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１２に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  14. 前記ＣＤＲＬ１が、配列番号２１６、３０８または３０９のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ２が、配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ３が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ１が、配列番号２４６のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ２が、配列番号２６８、３１０または３１１のアミノ酸配列を含み、ならびに
    前記ＣＤＲＨ３が、配列番号２９４、３１２、３１３または３１４のアミノ酸配列を含む、８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  15. 前記抗体または前記その断片が、配列番号１２９、１７８～１８０および２０１～２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号１２９、１７８～１８０および２０１～２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、１４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  16. 前記抗体または前記その断片が、配列番号１５９、１７５～１７７および１９６～２００からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１５９、１７５～１７７および１９６～２００からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、１４または１５に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  17. 前記ＣＤＲＬ１が、配列番号３０９のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ２が、配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＬ３が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ１が、配列番号２４６のアミノ酸配列を含み、
    前記ＣＤＲＨ２が、配列番号３１１のアミノ酸配列を含み、ならびに
    前記ＣＤＲＨ３が、配列番号２９４のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  18. 前記抗体または前記その断片が、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１７に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  19. 前記薬物部分が、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  20. 前記薬物部分が、メイタンシノイドまたはアウリスタチンである、請求項１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  21. 前記薬物部分が、ＤＭ１またはＤＭ４を含む、請求項２０に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  22. 前記薬物部分が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む、請求項２０に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  23. 前記薬物部分が、リンカーを介して前記抗体またはその断片に結合している、先行する請求項のいずれかに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  24. 前記リンカーが、酸性条件下で加水分解可能である、請求項２３に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  25. がんの処置を必要とする患者のがんを処置する方法であって、請求項１から２４のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲートを前記患者に投与することを含む、方法。
  26. がんを処置するための医薬を製造するための、請求項１から２４のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲートの使用。
  27. 前記がんが、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、胃腸がん、胃がん、食道がん（oesophageal cancer）、卵巣がん、腎臓がん、黒色腫、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
  28. 前記がんが胃がんである、請求項２５に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
  29. 前記患者が、前記ＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＭ１４９Ｌ変異体を有する、請求項２５に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
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