CN115038720B - 抗gprc5d单克隆抗体及其用途 - Google Patents

抗gprc5d单克隆抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

提供了对人GPRC5D蛋白具有结合特异性的抗体或其片段。该抗体或其片段能够靶向表达GPRC5D的癌细胞，因此可以用于治疗癌症，特别是血液癌症。

Description

抗GPRC5D单克隆抗体及其用途
背景技术
G蛋白偶联受体C家族5组成员D(GPRC5D)是G蛋白偶联受体家族的成员。GPRC5D是一种跨膜蛋白。在多发性骨髓瘤患者中观察到GPRC5D的过表达。特别是，其高表达与疾病和治疗的不良结果具有显著相关性。
鉴于其在恶性细胞上的特异性高表达，已提出对GPRC5D特异性的抗体可以用于治疗恶性肿瘤，例如通过双特异性T细胞重定向抗体或通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
发明内容
在本文中发现了对人GPRC5D蛋白具有高亲和力的抗GPRC5D抗体，包括其人源化衍生物。该抗体或其片段能够靶向表达GPRC5D的癌细胞，因此可以用于治疗癌症，特别是血液癌症。
本公开的一个实施方案提供了一种对人G蛋白偶联受体C家族5组成员D(GPRC5D)蛋白具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区(VL)包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含：(a)SEQ ID NO:29-34的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO:42-47的氨基酸序列；(c)SEQ ID NO:54-59的氨基酸序列；或(d)SEQ ID NO:68-73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ IDNO:29-34的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含选自由SEQ ID NO:7和35-37组成的组的氨基酸序列，VL包含选自由SEQ ID NO:8和38-41组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ IDNO:42-47的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含选自由SEQ ID NO:9和48-50组成的组的氨基酸序列，VL包含选自由SEQ ID NO:10和51-53组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ IDNO:54-59的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含选自由SEQ ID NO:61-64组成的组的氨基酸序列，VL包含选自由SEQ ID NO:16和65-67组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ IDNO:68-73的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含选自由SEQ ID NO:1和74-79组成的组的氨基酸序列，VL包含选自由SEQ ID NO:2和80-86组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体或其片段具有ADCC能力。
在一些实施方案中，还提供了一种抗体或其片段，所述抗体或其片段进一步包含与所述抗体或其片段缀合的细胞毒性药物。
还提供了一种双特异性抗体，其包含本公开的抗原结合片段，以及对第二靶蛋白具有特异性的第二抗原结合片段。在一些实施方案中，第二靶蛋白选自由CD3、CD16、CD19、CD28、CD64和4-1BB组成的组。在一些实施方案中，第二靶蛋白是CD3。在一些实施方案中，第二靶蛋白是4-1BB。
还提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，包括向所述患者施用本公开的抗体或其片段。还提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，包括(a)用本公开的抗体或其片段在体外处理T细胞、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞，(b)将处理过的细胞施用于患者。
在一些实施方案中，所述癌症是血液癌症，比如表达GPRC5D的B细胞癌(例如，多发性骨髓瘤)。
附图说明
图1显示了从杂交瘤上清液中收集的鼠抗体与在CHO-K1细胞上表达的GPRC5D的结合。
图2显示了嵌合抗体与CHO-K1细胞上表达的GPRC5D的结合。
图3显示抗体结合诱导内吞作用。
图4显示抗体具有ADCC能力。
图5-8分别显示了源自6G10D9、58F9G10、34D3H1和37B9C4的人源化抗体的亲和力测试结果。
图9证实了所选择的人源化抗体与CHO-K1细胞上表达的GPRC5D的结合。
图10证实了所选择的人源化抗体与NCI-H929细胞上表达的GPRC5D的结合。
图11显示了所测试的人源化抗体的ADCC功效。
图12显示了所测试的人源化抗体的内化诱导活性。
图13显示了所测试的抗体-药物缀合物的细胞杀伤活性。
图14显示了所测试的抗体的肿瘤抑制活性。
具体实施方式
定义
应当注意，术语“一个”或“一种”实体是指该实体的一个或多个(一种或多种)；例如，“一种抗体”应理解为表示一种或多种抗体。这样，术语“一个”(或“一种”)、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可以互换使用。
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸的任何一条或多条链，并不指特定长度的产物。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何术语使用，或与这些术语中的任何术语互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成产生。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两条肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，序列可以出于比较的目的而被比对。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列共享的匹配位置或同源位置的数量的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与本公开的序列之一共享小于40％的同一性，但优选小于25％的同一性。
多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一条序列具有一定百分比(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指，当比对时，在比较两个序列时碱基(或氨基酸)相同的百分比。
术语“等效核酸或等效多核苷酸”是指具有与核酸或其互补物的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物旨在包括具有与其或其互补物具有一定程度同源性的核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能够与核酸或其互补物杂交。同样地，“等效多肽”是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的多肽。在一些方面，序列同一性为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些方面，与参考多肽或多核苷酸相比，等效多肽或多核苷酸具有1、2、3、4或5个添加、缺失、取代及其组合。在一些方面，等效序列保留参考序列的活性(例如，表位结合)或结构(例如，盐桥)。
如本文所用，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别并结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整抗体及其任何抗原结合片段或单链。因此，术语“抗体”包括任何蛋白质或肽，其含有包括至少免疫球蛋白分子中具有与抗原结合的生物学活性的部分的分子。这样的实例包括但不限于重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区或其任何部分，或结合蛋白的至少一个部分。
如本文所用，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是诸如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等抗体的一部分。无论结构如何，抗体片段都与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适配体、镜像异构体和双体。术语“抗体片段”还包括像抗体一样通过与特定抗原结合形成复合物而起作用的任何合成的或基因工程的蛋白。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)的融合蛋白。在一些方面，所述区与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。所述接头可以富含甘氨酸以提高柔性，并且富含丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端相连，反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子是本领域已知的，并且例如在美国专利5,892,019中被描述。
术语抗体涵盖了各种广泛类别的多肽，其可以从生物化学上被区分。本领域技术人员将理解，重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些子类(例如γl-γ4)。该链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等，已被很好地表征，并且已知赋予功能特异性。鉴于本公开，这些类别和同种型的每一个的修饰版本对于本领域技术人员而言是容易辨别的，并且因此在本公开的范围内。所有的免疫球蛋白类别显然都在本公开的范围内，下面的讨论一般将针对免疫球蛋白分子的IgG类别。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含两条相同的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽和两条相同的分子量为53,000-70,000的重链多肽。四条链通常通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链将重链括起来，从“Y”的口开始，一直延伸过可变区。
本公开的抗体、其抗原结合多肽、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化、灵长类化或嵌合的抗体，单链抗体，表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VK或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本文公开的针对LIGHT抗体的抗Id抗体)。本公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
轻链分为kappa或lambda(κ、λ)。每种重链类别都可以与κ或λ轻链结合。通常，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价键合，两条重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉末端的N-末端延伸到每条链底部的C-末端。
轻链和重链均分为结构同源区和功能同源区。术语“恒定”和“可变”在功能上使用。在这方面，应当理解，轻链部分的可变结构域(VK)和重链部分的可变结构域(VH)决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链的恒定结构域(CK)和重链的恒定结构域(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物学特性，比如分泌、跨胎盘迁移、Fc受体结合、互补物结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N-端部分是可变区，C-端部分是恒定区；CH3和CK结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
如上所述，可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。即，抗体的VK结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集组合形成定义三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构形成了存在于Y的各臂终端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VK链各自上的三个CDR(即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)定义。在某些情况下，例如某些源自骆驼科物种或基于骆驼科免疫球蛋白工程改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，而没有轻链。参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature 363：446-448(1993)。
在天然存在的抗体中，在每个抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是短的、非连续的氨基酸序列，所述氨基酸序列被特异性定位为当在水性环境中该抗体呈现出其三维构型时形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸(称为“框架”区)显示出较小的分子间可变性。构架区主要采用β-折叠结构，并且CDR形成环，该环连接β-折叠结构，并在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区起形成支架的作用，该支架通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的方向上。由定位的CDR形成的抗原结合结构域限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。本领域的普通技术人员可以容易地针对任何给定的重链或轻链可变区鉴定分别包含CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经被精确地定义(参见“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，Kabat,E.等，美国卫生与公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983)；以及Chothia和Lesk，J.MoI.Biol.，196：901-917(1987))。
在本领域内使用和/或接受的术语有两个或更多个定义的情况下，除非有明确的相反说明，否则如本文所用术语的定义旨在包括所有这些含义。一个具体实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区内均发现的非连续抗原结合位点。这种特定区已经由Kabat等，美国卫生与公共服务部(U.S.Dept.of Health and HumanServices)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983)和Chothia等，J.MoI.Biol.196：901-917(1987)描述，通过引用将其整体并入本文。当彼此比较时，根据Kabat和Chothia的CDR定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，任何一种用于指代抗体或其变体的CDR的定义的应用都旨在在本文所定义和使用的术语的范围内。作为比较，下表中列出了涵盖如上述引用的各参考文献所定义的CDR的合适氨基酸残基。涵盖特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。给定了抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。
Kabat Chothia
CDR-H1 31-35 26-32
CDR-H2 50-65 52-58
CDR-H3 95-102 95-102
CDR-L1 24-34 26-32
CDR-L2 50-56 50-52
CDR-L3 89-97 91-96
Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将这种“Kabat编号”系统分配给任何可变结构域序列，而不依赖序列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等，美国卫生和公共服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，“Sequence of Proteins ofImmunological Interest”(1983)中所示的编号系统。
除上表外，Kabat编号系统还如下描述了CDR区：CDR-H1在大约第31位氨基酸处开始(即在第一个半胱氨酸残基之后大约9个残基)，包括大约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处终止。CDR-H2在CDR-H1末端之后的第15个残基处开始，包含约16-19个氨基酸，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处终止。CDR-H3在CDR-H2末端后大约第33个氨基酸残基处开始；包含3-25个氨基酸；并在序列W-G-X-G处终止，其中X是任意氨基酸。CDR-L1在大约第24位残基处开始(即在半胱氨酸残基之后)；包含大约10-17个残基；并在下一个色氨酸残基处终止。CDR-L2在CDR-L1末端之后大约第16个残基处开始，包含大约7个残基。CDR-L3在CDR-L2末端之后大约第33个残基处(即在半胱氨酸残基之后)开始；包含大约7-11个残基，并在序列F或W-G-X-G处终止，其中X是任意氨基酸。
本文所公开的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，可变区可以是condricthoid来源(例如来自鲨鱼)。
如本文所用，术语“重链恒定区”包含衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包含以下至少一种：CH1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或其变体或片段。例如，用于本公开的抗原结合多肽可以包含含CH1结构域的多肽链；含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链，或含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本公开的多肽包含含CH3结构域的多肽链。进一步地，用于本公开的抗体可以缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解，重链恒定区可以被修饰，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
本文公开的抗体的重链恒定区可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链恒定区可以包含部分源自IgG1分子且部分源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分源自IgG1分子且部分源自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链恒定区”包括源自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一种。
“轻链-重链对”是指轻链和重链的集合，其可以通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体。
如前所述，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括重链分子的例如从抗体的约第244位残基延伸至第360位残基(使用常规编号方案)(第244至360位残基，Kabat编号系统；和第231-340位残基，EU编号系统；参见Kabat等，美国卫生与公共服务部，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”(1983))的部分。CH2结构域的独特之处在于它不与另一个结构域紧密配对。而是，两个N-连接的分支碳水化合物链插入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。还充分证明，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端，并包含约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括重链分子的连接CH1结构域和CH2结构域的部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N-末端抗原结合区独立移动。铰链区可细分为三个不同的结构域：上、中、下铰链结构域(Roux等，J.Immunol 161：4083(1998))。
如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含巯基，其可以与第二个巯基形成二硫键或桥连。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CK区通过二硫键连接，并且两条重链通过两个在对应于第239位和第242位(使用Kabat编号系统)(第226位或第229位，EU编号系统)的二硫键连接。
如本文所用，术语“嵌合抗体”将被认为是意指其中免疫反应性区或免疫反应性位点获自或源自第一物种并且恒定区(根据本公开，其可以是完整的、部分的或修饰的)获自第二物种的任何抗体。在某些实施方案中，靶结合区或靶结合位点将来自非人来源(例如小鼠或灵长类)，而恒定区是人的。
如本文所用，通过确定人源化结构域和种系结构域之间的框架氨基酸差异(即非CDR差异)的数目，从氨基酸总数中减去该数目，然后除以氨基酸总数并乘以100来计算“百分比人源化”。
“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且所述结合需要在抗原结合结构域和表位之间具有一定的互补性。根据该定义，当抗体通过其抗原结合结构域与表位结合比抗体与随机的、不相关的表位结合更容易时，抗体被称为与该表位“特异性结合”。术语“特异性”在本文中用于限定某种抗体与某种表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”对给定的表位具有比抗体“B”更高的特异性，或者可以说抗体“A”以比对相关表位“D”更高的特异性结合表位“C”。
如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防御性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或紊乱，比如癌症的进展。有益的或期望的临床结果包括但不限于无论是可检测的还是不可检测的症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定(即不恶化)、疾病进展延迟或减慢、疾病状态改善或减轻，以及缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还可以意味着与如果未接受治疗时所预期的生存期相比，生存期延长。需要治疗的那些受试者包括已经患有病症或紊乱的那些受试者，以及那些易于患病症或紊乱的那些受试者，或要预防病症或紊乱的那些受试者。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家畜、农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物，比如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、家牛、奶牛等。
如本文所用，短语比如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”包括将从施用本公开所使用的例如用于检测、用于诊断程序和/或用于治疗的抗体或组合物而受益的受试者，比如哺乳动物受试者。
抗GPRC5D抗体
使用杂交瘤技术，所附的实验例表明获得了多种鼠抗体。对十四种鼠抗体进行了测序，并制备了人源化抗体。这些人源化抗体表现出强大的GPRC5D结合活性，并且能够诱导受体介导的内吞作用。体内试验表明，这些抗体具有诱导ADCC和抑制肿瘤发展的活性。
四种鼠抗体，34D3H1、37B9C4、58F9G10和6G10D9，经历了人源化过程。一些人源化抗体，包括6-H3L3、6-H4L3(均源自6G10D9)、58-H1L1、58-H3L1(均源自58F9G10)、34-H1L1(源自34D3H1)和37-H1L1(均源自37B9C4)，进一步显示出继续临床开发的希望。
因此，根据本公开的一个实施方案，提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段对人G蛋白偶联受体C家族5组成员D(GPRC5D)蛋白具有结合特异性。所述抗体或其片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括(a)SEQID NO:29-34的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO:42-47的氨基酸序列；(c)SEQ ID NO:54-59或SEQ ID NO:54、60和56-59的氨基酸序列；或(d)SEQ ID NO:68-73的氨基酸序列。
在一个实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ IDNO:29-34的氨基酸序列。VH的实例序列包括SEQ ID NO:7和35-37或与SEQ ID NO:7和35-37中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。VL的实例序列包括SEQ ID NO:8和38-41或与SEQ ID NO:8和38-41中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，VH包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，VL包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种结合FAPα上相同表位的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种竞争结合FAPα的抗体及其抗原结合片段，比如一种抗体及其抗原结合片段，其具有包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ IDNO:42-47的氨基酸序列。VH的实例序列包括SEQ ID NO:9和48-50或与SEQ ID NO:9和48-50中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。VL的实例序列包括SEQ ID NO:10和51-53或与SEQ ID NO:10和51-53中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，VH包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与SEQ ID NO:48具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，VL包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与SEQ ID NO:51具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种结合FAPα上相同表位的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种竞争结合FAPα的抗体及其抗原结合片段，比如一种抗体及其抗原结合片段，其具有包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ IDNO:54-59的氨基酸序列。VH的实例序列包括SEQ ID NO:61-64或与SEQ ID NO:61-64中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。VL的实例序列包括SEQ ID NO:16和65-67或与SEQ ID NO:16和65-67中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，VH包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列或与SEQ ID NO:61具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，VL包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列或与SEQ ID NO:65具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种结合FAPα上相同表位的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种竞争结合FAPα的抗体及其抗原结合片段，比如一种抗体及其抗原结合片段，其具有包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中，VH包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与SEQ ID NO:63具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，VL包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列或与SEQ ID NO:65具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种结合FAPα上相同表位的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种竞争结合FAPα的抗体及其抗原结合片段，比如一种抗体及其抗原结合片段，其具有包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ IDNO:54、60和56-59的氨基酸序列。VH的实例序列包括SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。VL的实例序列包括SEQ ID NO:16和65-67或与SEQ ID NO:16和65-67中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ IDNO:68-73的氨基酸序列。VH的实例序列包括SEQ ID NO:1和74-79或与SEQ IDNO:1和74-79中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。VL的示例序列包括SEQ ID NO:2和80-86或与SEQ ID NO:2和80-86中的任一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，VH包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与SEQ ID NO:76具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，VL包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列或与SEQ ID NO:82具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种结合FAPα上相同表位的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种竞争结合FAPα的抗体及其抗原结合片段，比如一种抗体及其抗原结合片段，其具有包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中，VH包括SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与SEQ ID NO:77具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，VL包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列或与SEQ ID NO:82具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种结合FAPα上相同表位的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，还提供了与这些抗体中的任一种竞争结合FAPα的抗体及其抗原结合片段，比如一种抗体及其抗原结合片段，其具有包括SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段具有ADCC能力。适用于制造具有ADCC能力的抗体的方法和材料是本领域已知的，比如通过使用合适的Fc片段或减少/去除岩藻糖基化。
在一些实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括(a)SEQID NO:29-34的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO:42-47的氨基酸序列；(c)SEQ ID NO:54-59或SEQ ID NO:54、60和56-59的氨基酸序列；或(d)SEQ ID NO:68-73的氨基酸序列，其中所述的CDR序列中的每个均包括一个、两个或三个保守氨基酸取代。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中被定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以被侧链家族成员的顺序和/或组成不同但结构上相似的串替代。
下表中提供了保守氨基酸取代的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表明两个氨基酸之间的保守取代。
表A.氨基酸相似性矩阵
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12
表B.保守氨基酸取代
Figure GDA0004047505450000111
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Figure GDA0004047505450000121
本领域普通技术人员还将理解，本文公开的抗体可以被修饰，使得它们在氨基酸序列上与它们所源自的天然存在的结合多肽不同。例如，源自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以与起始序列相似，例如与起始序列具有一定百分比的同一性，例如其可以与起始序列具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
在一些实施方案中，抗CCR8抗体是修饰的mAb，其包含修饰的重链恒定区，比如非岩藻糖基化的重链，其与未修饰的mAb相比以更高的亲和力结合介导增强的ADCC的活化Fcγ受体。在一些实施方案中，抗CCR8抗体包含人IgGl变体的重链，其包括L234Y、L235Q、G236W、S239D/M、F243L、H268D、D270E、R292P、S298A、Y300L、V305I、K326D、A330L/M、I332E、K334A/E、P396L(其增强ADCC功能)(均为欧盟编号)中的单个或组合。
在某些实施方案中，抗体包含通常不与抗体相关的氨基酸序列或一个或多个部分。下面将更详细地描述示例性修饰。例如，本公开的抗体可以包含柔性接头序列或可以被修饰以添加功能性部分(例如，PEG、药物、毒素或标记物)。
本公开的抗体、变体或其衍生物包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体的共价连接而被修饰，使得共价连接不会阻止抗体与表位结合。例如但不限于，抗体可以例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接等来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任何一种，所述已知技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，抗体可以包含一种或多种非经典氨基酸。
抗体-药物缀合物
GPRC5D在某些恶性血液细胞(比如多发性骨髓瘤细胞)上过表达。因此，本公开的抗体和片段可以用于靶向那些恶性细胞以抑制、失活或破坏。在一个实例中，抗体或片段与有助于抑制、失活或破坏恶性细胞的试剂缀合。本文显示所述抗体能够诱导GPRC5D介导的内吞作用。
在一些实施方案中，所述抗体或片段可以与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。在一些实施方案中，缀合剂可以是短干扰RNA(siRNA)或固有调节剂，比如干扰素基因刺激因子(STING)激动剂或TLR7/8激动剂。
在一个实施方案中，本公开的抗体或片段与药物部分共价连接。药物部分可以是与抗体上的缀合点反应的基团或被修饰以包括与抗体上的缀合点反应的基团。例如，药物部分可以通过烷基化(例如，在ε-氨基赖氨酸或抗体的N-末端)、氧化碳水化合物的还原胺化、羟基和羧基之间的酯交换、氨基或羧基的酰胺化以及与巯基的缀合来连接。
在一些实施方案中，每个抗体分子所缀合的药物部分的数量p的范围平均为1至8；1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2。在一些实施方案中，p的范围平均为2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3。在其他实施方案中，p平均为1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，p的范围平均为约1至约20、约1至约10、约2至约10、约2至约9、约1至约8、约1至约7、约1至约6、约1至约5、约1至约4、约1至约3、或约1至约2。在一些实施方案中，p的范围为约2至约8、约2至约7、约2至约6、约2至约5、约2至约4或约2至约3。
例如，当蛋白质的化学活化导致形成游离巯基时，蛋白质可以与巯基反应剂缀合。一方面，该试剂是一种基本上对游离硫醇基团特异的试剂。一方面，该试剂是一种对游离巯基基本上特异的试剂。此类试剂包括例如马来酰亚胺、卤代乙酰胺(例如碘代、溴代或氯代)、卤酯(例如碘代、溴代或氯代)、卤代甲基酮(例如碘代、溴代或氯代)、苄基卤化物(例如碘化物、溴化物或氯化物)、乙烯基砜和吡啶巯基。
药物可以通过接头与抗体或片段连接。合适的接头包括，例如，可切割的和不可切割的接头。可切割接头通常在细胞内条件下易于切割。合适的可切割接头包括例如可被细胞内蛋白酶(比如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)切割的肽接头。在示例性实施方案中，接头可以是二肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头或马来酰亚胺己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(mc-Val-Cit-PABA)接头。另一种接头是磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(smcc)。Sulfo-smcc缀合通过与巯基(硫醇，-SH)反应的马来酰亚胺基团发生，而其Sulfo-NHS酯对伯胺(如在赖氨酸和蛋白质或肽N-端发现)具有反应性。另一种接头是马来酰亚胺己酰基(mc)。其他合适的接头包括在特定pH或pH范围可水解的接头，比如腙接头。其他合适的可切割接头包括二硫键接头。接头可以与抗体共价结合，以达到抗体必须在细胞内降解以释放药物的程度，例如mc接头等。
接头可以包括用于与抗体连接的基团。例如，接头可以包括氨基、羟基、羧基或巯基反应基团(例如，马来酰亚胺、卤代乙酰胺(例如，碘代、溴代或氯代)、卤酯(例如，碘代、溴代或氯代)、卤甲基酮(例如，碘代、溴代或氯代)、苄基卤化物(例如碘化物、溴化物或氯化物)、乙烯基砜和吡啶巯基)。
在一些实施方案中，药物部分是细胞毒素剂或细胞生长抑制剂、免疫抑制剂、放射性同位素、毒素等。缀合物可以用于抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖，引起肿瘤或癌细胞的凋亡，或用于治疗患者的癌症。缀合物可以相应地用于各种环境以治疗动物癌症。缀合物可以用于将药物递送至肿瘤细胞或癌细胞。不受理论束缚，在一些实施方案中，缀合物与表达GPRC5D的癌细胞结合或相关，并且缀合物和/或药物可以通过受体介导的内吞作用被摄入到肿瘤细胞或癌细胞内。
一旦进入细胞，缀合物内(例如，在接头中)的一个或多个特定肽序列被一种或多种肿瘤细胞或癌细胞相关的蛋白酶水解切割，导致药物释放。然后释放的药物在细胞内自由迁移并诱导细胞毒性或细胞抑制或其他活性。在一些实施方案中，药物在肿瘤细胞或癌细胞外从抗体切割下来，药物随后穿透细胞，或在细胞表面起作用。
药物部分或有效载荷的实例选自由以下组成的组：DM1(美登素、N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-或N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)、mc-MMAD(6-马来酰亚胺己酰基-单甲基澳瑞他汀-D或N-甲基-L-缬氨酰-N-[(1S,2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[[(1S)-2-苯基-1-(2-噻唑基)乙基]氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-(9Cl)-L-缬氨酰胺)、mc-MMAF(马来酰亚胺己酰基-单甲基澳瑞他汀F或N-[6-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]-N-甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲氨基)庚酰基-(αR,βR,2S)-β-甲氧基-α-甲基-2-吡咯烷丙酰基-L-苯丙氨酸)和mc-Val-Cit-PABA-MMAE(6-马来酰亚胺己酰基-ValcCit-(对氨基苄氧羰基)-单甲基澳瑞他汀E或N-[[[4-[[N-[6-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]-L-缬氨酰-N5-(氨基羰基)-L-鸟氨酰基]氨基]苯基]甲氧基]羰基]-N-甲基-L-缬氨酰-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]-1-吡咯烷基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)。DM1是微管蛋白抑制剂美登素的衍生物，而MMAD、MMAE和MMAF是澳瑞他汀衍生物。在一些实施方案中，药物部分选自由mc-MMAF和mc-Val-Cit-PABA-MMAE组成的组。在一些实施方案中，药物部分是美登醇(maytansinoid)或澳瑞他汀。
抗体或片段可以与治疗剂缀合或融合，其可以包括可检测的标记物(比如放射性标记物)、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒素剂(其可以是药物或毒素)、超声增强剂、非放射性标记、其组合，以及本领域已知的其它此类试剂。
可以通过将抗体与化学发光化合物偶联，从而对抗体进行可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定带化学发光标签的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、热敏吖啶酯(theromaticacridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
还可以使用荧光发射金属(例如152Eu或镧系元素的其他金属)可检测地标记抗体。可以使用诸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团将这些金属连接至抗体。将不同部分缀合到抗体上的技术是众所周知的，参见，例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，《Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy》，Reisfeld等(编辑)，第243-56页(AlanR.Liss公司(1985))；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，《Controlled DrugDelivery(第二版)》,Robinson等(编辑)，Marcel Dekker公司，第623-53页(1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，《Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications》，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，《MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy》，Baldwin等(编辑)，学术出版社，第303-16页(1985)，和Thorpe等“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.(52:119-58(1982))。
双功能分子和联合疗法
GPRC5D在某些恶性血液细胞(比如多发性骨髓瘤细胞)上过表达。因此，本公开的抗体和片段可以用于靶向那些恶性细胞以抑制、失活或破坏。在一些实施方案中，提供了靶向GPRC5D蛋白和免疫细胞的双功能或双特异性分子/抗体。
在一些实施方案中，免疫细胞选自由T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞组成的组。免疫细胞上可以被靶向的分子包括，例如，CD3、CD16、CD19、CD28、CD64和4-1BB(也称为CD137)。其他实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3(也称为CD223)、CD28、CD122、TIM3、OX-40或OX40L、CD40或CD40L、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM或BTLA(也称为CD272)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和CD47。双特异性的具体实例包括但不限于GPRC5D/CD3。
还提供了不同形式的双特异性抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1片段和第二片段中的每一个各自独立地选自Fab片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体进一步包括Fc片段。
编码抗体的多核苷酸及所述抗体的制备方法
本公开还提供了编码本公开的抗体、其变体或衍生物的分离的多核苷酸或核酸分子。本公开的多核苷酸可以在相同多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的整个重链可变区和轻链可变区。另外，本公开的多核苷酸可以在相同多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的重链可变区和轻链可变区的部分。
制备抗体的方法是本领域众所周知的并且在本文中描述。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽的可变区和恒定区都是全人的。可以使用本领域描述的和如本文描述的技术制备全人抗体。例如，针对特定抗原的全人抗体可以通过向转基因动物施用所述抗原来制备，所述转基因动物已被修饰以产生这种抗体来应答抗原攻击，但其内源性基因座已被禁用。可以用于制备这种抗体的示例性技术在美国专利：6,150,584、6,458,592、6,420,140中进行了描述，其通过引用以其整体并入。
治疗方法
如本文所述，本公开的抗体、变体或衍生物可以用于某些治疗和诊断方法。
本公开进一步涉及基于抗体的疗法，其涉及将本公开的抗体施用于患者比如动物、哺乳动物和人以治疗本文所述的一种或多种紊乱或病症。本公开的治疗性化合物包括但不限于本公开的抗体(包括如本文所述的其变体和衍生物)和编码本公开的抗体(包括如本文所述的其变体和衍生物)的核酸或多核苷酸。
本公开的抗体还可以用于治疗或抑制癌症。如上所述，GPRC5D可以在癌细胞，特别是多发性骨髓瘤中过表达。已表明抑制GPRC5D可以用于治疗癌症。
因此，在一些实施方案中，提供了用于治疗有需要的患者的癌症的方法。在一个实施方案中，该方法需要向患者施用有效量的本公开的抗体。在一些实施方案中，患者的至少一种癌细胞过表达GPRC5D。在一些实施方案中，所述抗体或片段具有ADCC能力。在一些实施方案中，所述抗体或片段进一步包含细胞毒素剂。在一些实施方案中，抗体是双特异性的，其进一步靶向免疫细胞，比如细胞毒性T细胞。
在本公开中还提供了细胞疗法，比如嵌合抗原受体(CAR)T细胞(或NK细胞、巨噬细胞)疗法。可以使用合适的细胞，其与本公开的抗GPRC5D抗体接触(或替代地被工程改造以表达本公开的抗GPRC5D抗体)。经过这样的接触或工程改造后，然后可以将细胞引入需要治疗的癌症患者中。癌症患者可以患有如本文所公开的任何类型的癌症。细胞(例如，T细胞)可以是，例如，肿瘤浸润性T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞或其组合，但不限于此。
在一些实施方案中，该细胞是从癌症患者自身分离的。在一些实施方案中，该细胞由供体或细胞库提供。当从癌症患者中分离出细胞时，不期望的免疫反应可以被最小化。
癌症的非限制性实例包括血液癌症，比如多发性骨髓瘤。其他实例包括白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))和淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)和多发性骨髓瘤。
用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所使用的特定抗体、其变体或衍生物，患者的年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食，以及给药时间、排泄率、联合用药和正在治疗的特定疾病的严重程度。医疗护理人员对这些因素的判断在本领域普通技术范围内。该量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度和所需的效果。所使用的量可以通过本领域众所周知的药理学和药代动力学原理确定。
抗体或变体的施用方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。抗原结合多肽或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或团注，通过经上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。因此，含有本公开的抗原结合多肽的药物组合物可以口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏、滴剂或透皮贴剂)、口腔给药，或作为口腔或鼻腔喷雾剂。
如本文所用的术语“肠胃外”是指给药方式，包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。
给药可以是全身的或局部的。此外，可能需要通过任何合适的途径(包括脑室内和鞘内注射)将本公开的抗体引入中枢神经系统；脑室内注射可以通过脑室内导管来促进，例如，连接到储液器(比如Ommaya储液器)的脑室内导管。也可以采用肺部给药，例如，通过使用吸入器或雾化器，以及与雾化剂一起配制。
可能需要将本公开的抗原结合多肽或组合物局部施用于需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于手术期间局部输注、局部应用(例如手术后与伤口敷料结合)、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物来实现，所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜，例如唾液酸膜或纤维。优选地，当施用本公开的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用蛋白质不吸收的材料。
可以通过标准临床技术确定可有效治疗、抑制和预防炎性、免疫或恶性疾病、紊乱或病症的本公开抗体的量。另外，可以任选地采用体外分析来帮助确定最佳剂量范围。制剂中采用的精确剂量还取决于给药途径和疾病、紊乱或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从来自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线中推断出来。
作为一般建议，施用于患者的本公开的抗原结合多肽的剂量通常为0.1mg/kg至100mg/kg患者体重，0.1mg/kg至20mg/kg患者体重，或1mg/kg至10mg/kg患者体重。通常，由于对外源多肽的免疫反应，人抗体比来自其他物种的抗体在人体内具有更长的半衰期。因此，较低剂量的人抗体和较低频率的给药通常是可能的。进一步地，本公开抗体的给药剂量和频率可以通过修饰例如脂化以增强抗体的摄入和组织渗透(例如，进入脑中)来降低。
在另外的实施方案中，本公开的组合物与细胞因子联合施用。可以与本公开的组合物一起施用的细胞因子包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗CD40、CD40L和TNF-α。
在另外的实施方案中，本公开的组合物与其他治疗或预防方案(例如放射疗法)联合施用。
诊断方法
在某些肿瘤样品中观察到GPRC5D的过表达，并且具有GPRC5D过表达细胞的患者可能对用本公开的抗GPRC5D抗体的治疗有反应。因此，本公开的抗体也可以用于诊断和预后目的。
可从患者获得优选包括细胞的样品，该患者可以是癌症患者或需要诊断的患者。该细胞是肿瘤组织或肿瘤块、血液样品、尿液样品或来自患者的任何样品的细胞。在对样品进行任选的预处理之后，可以在允许抗体与样品中潜在存在的GPRC5D蛋白相互作用的条件下，将样品与本公开的抗体一起孵育。可以使用诸如ELISA的方法，利用抗GPRC5D抗体，来检测样品中GPRC5D蛋白的存在。
样品中GPRC5D蛋白的存在(任选以一定的量或浓度)可以用于诊断癌症，作为患者适合用抗体治疗的指示，或作为患者对癌症治疗有(或没有)反应的指示。对于预后方法，可以在开始癌症治疗后，在某些阶段进行一次、两次或更多次检测，以指示治疗进展。
组合物
本公开还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效量的抗体和可接受的载体。在一些实施方案中，该组合物进一步包括第二抗癌剂(例如，免疫检查点抑制剂)。
在一个具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物的，更特别地用于人类的。进一步地，“药学上可接受的载体”通常将是任何类型的无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或制剂助剂。
术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、辅助剂、辅料或赋形剂。这样的药物载体可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物辅料包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂，比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。还设想了抗菌剂，比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，比如乙二胺四乙酸；以及用于调节张度(tonicity)的试剂，比如氯化钠或右旋糖(dextrose)。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。该组合物可以与传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)一起配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，比如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的《Remington'sPharmaceutical Sciences》中描述，其通过引用并入本文。这样的组合物将包含治疗有效量的抗原结合多肽，优选地以纯化形式，与适量的载体一起，以提供用于向患者适当施用的形式。该制剂应适合于给药方式。可以将肠胃外制剂封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
在一个实施方案中，根据常规程序将所述组合物配制成适于静脉内施用于人类的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂，比如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，将成分单独提供或以单位剂型混合提供，例如，作为干燥的冻干粉或无水浓缩物提供在密闭容器中，比如指示活性剂的量的安瓿或小药囊中。在组合物将通过输注施用的情况下，可以用装有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。在组合物通过注射施用的情况下，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以使得可以在施用之前将成分混合。
本公开的化合物可以被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括那些与阴离子形成的盐，比如那些源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及那些与阳离子形成的盐，例如源自钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
实施例
实施例1：针对人GPRC5D的鼠单克隆抗体的产生
用人GPRC5D蛋白免疫不同品系的小鼠，并相应产生杂交瘤。收集了二十多个杂交瘤克隆用于进一步分析。
测试从杂交瘤上清液收获的抗体与在CHO K1细胞上表达的人GPRC5D蛋白的结合。从烧瓶中收获稳定表达人GPRC5D的CHO-K1细胞。将100μl 1×106个细胞/ml的细胞与以3倍连续稀释的鼠抗体在冰上孵育30分钟。用200μl FACS缓冲液洗涤两次后，将细胞与二抗在冰上孵育30分钟。用200μl FACS缓冲液洗涤细胞两次并转移到BD Falcon 5ml管中并通过FACS分析。研究结果表明，鼠抗体可以以高EC50与人GPRC5D结合(图1)。结果如下表所示。它们均表现出良好的结合活性。
Figure GDA0004047505450000191
Figure GDA0004047505450000201
亚克隆了十四个杂交瘤并确定了VH/VL序列(见表1)。
表1.先导鼠抗体的VH/VL序列
Figure GDA0004047505450000202
/>
Figure GDA0004047505450000211
实施例2.嵌合抗体与GPRC5D的结合
鼠VH和VK基因是合成产生的，然后分别克隆到包含人γ1恒定域和人κ恒定域的载体中。纯化的嵌合抗体由转染的CHO细胞产生。
从烧瓶中收获稳定表达人GPRC5D的CHO-K1细胞。将100μl 1×106个细胞/ml的细胞与从300nM到0.001nM以3倍连续稀释的初级嵌合抗体在冰上孵育30分钟。用200μlFACS缓冲液洗涤两次后，将细胞与二抗在冰上孵育30分钟。用200μl FACS缓冲液洗涤细胞两次并转移到BD Falcon 5ml管中并通过FACS分析。研究结果表明，嵌合抗体可以以高EC50与人GPRC5D结合(图2)。
结果如下表所示。
最小响应 最大响应 LogEC50 曲线坡度 EC50 跨度
58F9G10 -521.8 414579 0.3596 0.8258 2.289 415101
40A5B2 1487 440269 0.3436 0.8189 2.206 438781
38A9E10A11 3016 386984 0.2453 1.037 1.759 383968
37B9C4 2078 405062 0.249 1.045 1.774 402985
34D3H1 3448 507844 0.5214 1.012 3.322 504396
29B2C10 4326 430443 0.342 1.041 2.198 426116
21C3C11B3 5774 403938 0.2293 1.286 1.696 398164
6G10D9 6886 458124 0.1012 1.343 1.262 451238
实施例3.嵌合GPRC5D抗体在CHO-GPRC5D细胞上内化的EC50
pHAb染料是pH值传感器染料，在pH>7时具有非常低的荧光，并且随着溶液的pH值变为酸性，荧光显著增加。pHAb染料的激发最大值(Ex)在532nm处，发射最大值(Em)在560nm处。pHAb染料缀合抗体可以用于监测受体介导的抗体内化。当抗体-pHAb染料缀合物与其在细胞膜上的受体结合时，它会表现出极小的荧光。然而，在发生受体介导的内化后，抗体-pHAb染料缀合物会运输到pH为酸性的内体和溶酶体囊泡，导致pHAb染料发出荧光。这种荧光可以使用各种技术检测，包括细胞成像、流式细胞术和带有适当滤光片的基于荧光板的读取器。
用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，25300-054)收获稳定转染的人GPRC5D CHO细胞，并以10K/90μl/孔的密度接种在96孔黑色板(Thermo Scientific#165305)中。在用pHAb标记的抗体处理之前，将板孵育20-24小时。
对于内化，将pHAb缀合的嵌合GPRC5D抗体以不同的浓度添加到细胞中，并在板混合器上轻轻混合1-2分钟，然后孵育过夜以允许内化(内化可以在几个小时内检测到)。在荧光板读取器(Tecan Infinity M1000 Pro上在Ex/Em:532nm/560nm处)上读取板。为了获得更高的灵敏度，在读板之前用PBS代替培养基。
用DAR归一化的结果如图3所示。如图3所示，测试的嵌合抗体具有较强的内化活性。
实施例4.抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测试
ADCC Reporter Bioassay在ADCC MOA通路激活的早期使用另一种读数：通过效应细胞中的NFAT(活化T细胞的核因子)通路的基因转录激活。另外，ADCC Reporter Bioassay使用工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，其稳定表达FcγRIIIa受体、V158(高亲和力)变体和驱动萤火虫荧光素酶表达的NFAT响应元件。ADCC MOA中的抗体生物活性通过NFAT通路激活产生的荧光素酶进行量化；效应细胞中的荧光素酶活性通过发光读数进行量化。信号高，检测背景低。
在有或没有ADCC Bioassay靶细胞(GPRC5D)的情况下，将连续稀释的GPRC5D嵌合单克隆抗体与工程改造的Jurkat效应细胞(ADCC Bioassay效应细胞)在37℃下孵育6小时诱导。使用Bio-GloTM试剂对荧光素酶活性进行量化(在图4中)。所有测试的抗体都表现出强大的诱导ADCC的能力。
实施例5小鼠mAb的人源化
利用鼠抗体可变区基因产生人源化mAb。在此过程的第一步中，将mAb的VH和VL的氨基酸序列与人Ig基因序列的可用数据库进行比较，以找到总体上最匹配的人种系Ig基因序列。
下面提供了人源化抗体的氨基酸序列。
人源化序列
A.34D3H1
表2A.34D3H1–VH的人源化
Figure GDA0004047505450000231
表2B.CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-H1 SYGMS 29
CDR-H2 TISSGGSYTYYPDSVKG 30
CDR-H3 QGGDAMDY 31
表2C.34D3H1–VL的人源化
Figure GDA0004047505450000241
表2D.CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-L1 RASQSINNNLH 32
CDR-L2 YASQSIS 33
CDR-L3 QQSNSRLT 34
表2E.人源化抗体
VL VL v1 VL v2 VL v3 VL v4
VH 34-XI
VH v1 34-H1L1 34-H1L2 34-H1L3 34-H1L4
VH v2 34-H2L1 34-H2L2 34-H2L3 34-H2L4
VH v3 34-H3L1 34-H3L2 34-H3L3 34-H3L4
B.37B9C4
表3A.37B9C4–VH的人源化
Figure GDA0004047505450000242
/>
Figure GDA0004047505450000251
表3B.CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-H1 DYWMN 42
CDR-H2 EIRLKSNNYATHYAESVKG 43
CDR-H3 PLLWFRRYYAMDY 44
表3C.37B9C4–VL的人源化
Figure GDA0004047505450000252
表3D.CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-L1 SASQGISNYLN 45
CDR-L2 YTSSLHS 46
CDR-L3 QQYSKLPFT 47
表3E.人源化抗体
VL VL v1 VL v2 VL v3
VH 37B9C4-XI
VH v1 37-H1L1 37-H1L2 37-H1L3
VH v2 37-H2L1 37-H2L2 37-H2L3
VH v3 37-H3L1 37-H3L2 37-H3L3
C.58F9G10
表4A.58F9G10–VH的人源化
Figure GDA0004047505450000261
表4B.CDR序列
Figure GDA0004047505450000264
表4C.58F9G10–VL的人源化
Figure GDA0004047505450000262
表4D.CDR序列
Figure GDA0004047505450000263
Figure GDA0004047505450000271
/>
表3E.人源化抗体
VL VL v1 VL v2 VL V3
VH 58F9G10-XI
VH v1 58-H1L1 58-H1L2 58-H1L3
VH v2 58-H2L1 58-H2L2 1)58-H2L3：
VH v3 58-H3L1 58-H3L2 58-H3L3
VH v4 58-H4L1 58-H4L2 58-H4L3
D.6G10D9
表5A.6G10D9–VH的人源化
Figure GDA0004047505450000272
表5B.CDR序列
Figure GDA0004047505450000273
Figure GDA0004047505450000281
表5C.6G10D9–VL的人源化
Figure GDA0004047505450000282
表5D.CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-L1 KASQNVGTAVV 71
CDR-L2 SASNRYT 72
CDR-L3 QQYSSYPYT 73
表5E.人源化抗体
Figure GDA0004047505450000283
Figure GDA0004047505450000291
实施例6.人源化抗体的测试
本实施例测试了一些人源化抗体与CHO-K1细胞上表达的GPRC5D结合的能力。
在所测试的源自6G10D9的人源化抗体中，6-H2L1和6-H3L3的表现优于其他抗体(图5，表6)。
表6.6G10D9的人源化抗体结合GPRC5D的活性
最小响应 最大响应 LogEC50 曲线坡度 EC50 跨度
6G10D9-XI 6858 121725 0.2992 1.525 1.991 114867
6-H1L1 192.6 ～6397 ～3.102 1.198 ～1264 ～6205
6-H1L2 191.9 898894 5.224 1.19 167639 898702
6-H1L3 226.2 16478302 5.389 1.156 244790 16478076
6-H2L1 189.1 661560 5.039 1.232 109294 661371
6-H2L2 192.5 1271084 5.37 1.191 234364 1270892
6-H2L3 215.7 10592380 5.039 1.23 109279 10592164
6-H3L1 -205.1 74293 2.352 0.8392 225.1 74498
6-H3L2 68.94 47463 2.244 0.9532 175.3 47394
6-H3L3 3994 119304 0.9553 1.13 9.022 115310
6-H4L1 61.5 50293 1.654 0.9277 45.05 50231
6-H4L2 9.56 39449 1.976 0.911 94.63 39440
6-H4L3 2344 126413 0.9049 1.052 8.033 124069
如图6和表7所示，58F9G10的所有人源化版本似乎都具有良好的性能。
表7.58F9G10的人源化抗体结合GPRC5D的活性
Figure GDA0004047505450000292
Figure GDA0004047505450000301
类似地，如图7和表8所示，34D3H1的所有人源化版本似乎都具有良好的性能，可与嵌合抗体相媲美。
表8.34D3H1的人源化抗体结合GPRC5D的活性
最小响应 最大响应 LogEC50 曲线坡度 EC50 跨度
34-XI 16525 192054 0.4947 1.454 3.124 175530
34-H1L1 10921 196570 0.5908 1.314 3.898 185650
34-H1L2 13856 182030 0.5836 1.436 3.834 168174
34-H1L3 10620 185840 0.5732 1.167 3.743 175220
34-H1L4 10299 188925 0.5999 1.195 3.98 178626
34-H2L1 7854 187153 0.6188 1.173 4.157 179298
34-H2L2 8736 178873 0.6254 1.118 4.221 170137
34-H2L3 7063 185842 0.5832 1.11 3.83 178779
34-H2L4 4393 192405 0.6092 1.041 4.066 188012
34-H3L1 11139 178248 0.5207 1.228 3.317 167109
34-H3L2 9036 179809 0.6464 1.146 4.43 170773
34-H3L3 9118 192976 0.6508 1.1 4.475 183858
34-H3L4 12751 192533 0.5981 1.263 3.963 179782
此外，如图8和表9所示，37B9C4的所有人源化版本似乎都具有良好的性能，可与嵌合对应物相媲美。
表9.37B9C4的人源化抗体结合GPRC5D的活性
Figure GDA0004047505450000302
Figure GDA0004047505450000311
基于以上数据，选择人源化抗体6-H3L3、6-H4L3、58-H1L1、58-H3L1、34-H1L1和37-H1L1进行进一步确认测试。
实施例7.选择的人源化抗体的确认测试
本实施例测试了一些人源化抗体(6-H3L3、6-H4L3、58-H1L1、58-H3L1、34-H1L1和37-H1L1)与CHO-K1和NCI-H929细胞上表达的人GPRC5D蛋白结合的能力。
与CHO-K1的结合数据在图9中绘制并总结在下表10中。
表10与CHO-K1细胞上的GPRC5D结合
最小响应 最大响应 LogEC50 曲线坡度 EC50 跨度
6-XI 523.9 104077 0.4723 1.095 2.967 103553
58-XI 52.25 107000 0.5562 0.9481 3.599 106948
6-H3L3 172 134045 1.412 0.8045 25.82 133873
6-H4L3 109.4 145833 1.421 0.7392 26.34 145724
58-H1L1 275.4 99454 0.579 0.972 3.793 99178
58-H3L1 75.37 104402 0.612 0.9135 4.093 104326
34-XI 688.6 117714 0.5776 1.054 3.781 117025
37-XI 792.6 113379 0.3877 1.175 2.442 112586
34-H1L1 170.8 119038 0.781 0.8745 6.04 118867
37-H1L1 523.2 102496 0.511 1.042 3.244 101973
表11.与NCI-H929细胞上的GPRC5D结合
最小响应 最大响应 LogEC50 曲线坡度 EC50 跨度
6-XI 269.4 13785 0.05146 1.313 1.126 13515
58-XI 261.4 14738 0.1596 1.269 1.444 14476
6-H3L3 129.8 21859 1.465 0.8063 29.18 21730
6-H4L3 80.05 28987 1.606 0.7142 40.33 28907
58-H1L1 281 13474 0.1648 1.319 1.462 13193
58-H3L1 275.5 13934 0.3 1.297 1.995 13658
34-XI 181.1 18146 0.7587 0.9911 5.738 17965
34-H1L1 199.3 17911 0.8048 1.011 6.379 17712
37-XI 337.6 13807 -0.05621 1.41 0.8786 13470
37-H1L1 341.8 13534 -0.1991 1.419 0.6323 13192
因此，这些数据证实这些所选择的人源化抗体适合进一步的临床开发。
实施例8.人源化抗体的ADCC
ADCC Reporter Bioassay在ADCC MOA通路激活的早期使用另一种读数：通过效应细胞中的NFAT(活化T细胞的核因子)通路的基因转录激活。另外，ADCC Reporter Bioassay使用工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，其稳定表达FcγRIIIa受体、V158(高亲和力)变体和驱动萤火虫荧光素酶表达的NFAT响应元件。ADCC MOA中的抗体生物活性通过NFAT通路激活产生的荧光素酶进行量化；效应细胞中的荧光素酶活性通过发光读数进行量化。信号高，检测背景低。
在有ADCC Bioassay靶细胞(表达GPRC5D)的情况下，将连续稀释的GPRC5D人抗体与工程改造的Jurkat效应细胞(ADCC Bioassay效应细胞)在37℃下孵育6小时诱导。使用Bio-GloTM试剂对荧光素酶活性进行量化。
结果示于图11，其显示了这些人源化抗体对过表达GPRC5D的细胞系和内源性MM(多发性骨髓瘤)细胞系诱导强烈的ADCC活性。
实施例9.人源化抗体的内化
本实施例测试了人源化抗体的内化诱导活性。本实施例使用了一种新型亲水性且明亮的pH传感器染料(pHAb染料)，该染料在中性pH值下不发荧光，但随着内化在酸性pH值下变得高度荧光。它可用于检测内化过程。内源性表达人GPRC5D的NCI-H929和MM.1R细胞作为靶细胞，加入pHAb染料标记的检测抗体，以在体外评价GPRC5D人抗体的内化。
连续稀释的GPRC5D人抗体在37℃下孵育24小时。检测荧光素酶活性。图12中的结果表明，这些人源化抗体对过表达GPRC5D的细胞系和内源性MM细胞系都具有非常强的内化活性。
实施例10.GPRC5D ADC的杀伤活性
本实施例测试了两种抗体-药物缀合物(ADC)对靶细胞的杀伤活性。这些ADC分别包括与有毒药物单甲基澳瑞他汀E(MMAE)缀合的37B9C4和58F9G10。
将表达人GPRC5D的HEK293和NCI-H929工程细胞(HEK293/H_GPRC5D和NCI-H929/H_GPRC5D)、GPRC5D内源性表达的NCI-H929和MM.1R细胞以每孔3000～4000个细胞接种到96孔板中。用各种浓度的37B9C4-MMAE和58F9G10-MMAE处理细胞5天。细胞活力通过以每孔3000～4000个细胞接种到96孔板中用CellTiter-Glo试剂测量。通过Envison检测荧光素酶活性。图13和表12中的结果表明，这些人源化抗体具有很强的杀伤活性。
表12ADC杀伤活性
Figure GDA0004047505450000321
Figure GDA0004047505450000331
实施例11.体内抗肿瘤活性
本实施例使用CDX动物模型测试抗体37B9C4(H1L1)的抗肿瘤活性。
在这项研究中，使用了6-8周雌性NCG小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司)。每只小鼠在右腋窝(外侧)皮下接种在0.1ml含有基质胶的PBS(V:V＝1:1)中的MM.1R肿瘤细胞(2×106)，用于肿瘤发展。当肿瘤体积达到约60mm3时将动物随机分组，然后开始治疗以进行疗效研究。在第0天、第7天、第14天通过静脉内(i.v.)施用1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg剂量的37B9C4。实验在第19天终止，此时赋形剂组的平均肿瘤体积超过2000mm3。PBS组、37B9C4(1mg/kg)组、37B9C4(3mg/kg)组和37B9C4(10mg/kg)组的平均肿瘤体积分别为2498.58mm3、1196.15mm3、0.00mm3(6/6CR)，和0.00mm3(6/6CR)。使用卡尺每周在二维上测量肿瘤大小3次，并使用以下公式以mm3表示体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。数据点代表组(n＝6)平均值，误差线代表平均数标准误差(SEM)。
定期监测MM.1R荷瘤小鼠的体重作为毒性的间接测量。图14A显示了MM.1R荷瘤小鼠在施用37B9C4后的肿瘤生长曲线。该抗体剂量依赖性地抑制该肿瘤模型中的肿瘤生长，并且在3mg/kg或以上实现完全的肿瘤抑制。
MM.1R荷瘤小鼠在给药后的详细体重变化和相对体重变化示于图14B。给药期间，各组小鼠体重均无明显减轻，给药组小鼠耐受性良好，证明了治疗的安全性。
***
本公开的范围不受所描述的具体实施方案的限制，所述具体实施方案旨在作为本公开的各个方面的单一说明，并且任何在功能上等效的组合物或方法均在本公开的范围内。对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以对本公开的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本公开旨在覆盖本公开的修改和变化，只要这些修改和变化落入所附权利要求及其等效物的范围内。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均以引用方式并入本文，其程度就如同每个单独的出版物或专利申请被特别地和单独地指示为以引用方式并入一样。
序列表
<110> 上海礼新医药研发有限公司
<120> 抗GPRC5D单克隆抗体及其用途
<130> FSP1V222255JW
<150> PCT/CN2021/070314
<151> 2021-01-05
<160> 86
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Thr Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Arg Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ile Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Trp Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Arg Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 9
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Glu Val Asn Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Ala Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn
20 25 30
Ile Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Ala Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Val Tyr Tyr Arg Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 14
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Gln Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 17
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ile Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Trp Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Leu Leu Arg Val Leu Asp Phe Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Leu Arg Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ala Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Leu Arg Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Trp Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Ser Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Gln Gly Gly Asp Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Gln Gln Ser Asn Ser Arg Leu Thr
1 5
<210> 35
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Arg Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Arg Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Arg Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Arg Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Asp Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Pro Leu Leu Trp Phe Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Gly Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 59
Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 60
Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 61
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 66
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 66
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 67
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 67
Asp Thr Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Thr Tyr Thr Met His
1 5
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 69
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 71
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Val
1 5 10
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 74
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 76
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 77
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 77
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 79
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Gly Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 81
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 83
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 84
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 85
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (15)

1.一种对人G蛋白偶联受体C家族5组成员D(GPRC5D)蛋白具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区(VL)包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3，并且其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:42-47所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH和所述VL的氨基酸序列分别如：
(a)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
(b)SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:51所示；
(c)SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:52所示；或
(d)SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53所示。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH的氨基酸序列如SEQ IDNO:48所示，并且所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的对人G蛋白偶联受体C家族5组成员D(GPRC5D)蛋白具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。
5.根据权利要求1-3任一项所述的对人G蛋白偶联受体C家族5组成员D(GPRC5D)蛋白具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其具有ADCC能力。
6.根据权利要求1-3任一项所述的对人G蛋白偶联受体C家族5组成员D(GPRC5D)蛋白具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，进一步包含与所述抗体或其抗原结合片段缀合的细胞毒性药物。
7.一种双特异性抗体，包含权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段，以及对第二靶蛋白具有特异性的第二抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其中所述第二靶蛋白选自由CD3、CD16、CD19、CD28、CD64和4-1BB组成的组。
9.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其中所述第二靶蛋白是CD3。
10.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗有需要的患者的癌症的药物中的用途；
所述癌症是表达GPRC5D的B细胞癌。
11.T细胞、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞在制备用于治疗有需要的患者的癌症的药物中的用途，其中所述T细胞、所述自然杀伤(NK)细胞或所述巨噬细胞是用权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段处理的；
所述癌症是表达GPRC5D的B细胞癌。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述T细胞、所述NK细胞或所述巨噬细胞在用所述抗体或其抗原结合片段处理之前从个体分离。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述T细胞、所述NK细胞或所述巨噬细胞从所述患者中分离。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述T细胞是肿瘤浸润性T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。
15.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述表达GPRC5D的B细胞癌是多发性骨髓瘤。
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