KR20220110231A - 항-αvβ6 항체 및 항체-약물 접합체 - Google Patents

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KR20220110231A
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모린 라이언
로리 웨스텐도프
에릭 브래들리 메이어
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씨젠 인크.
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Abstract

신규한 항-αvβ6 항체 및 항체-약물 접합체 및 암을 치료하기 위해 이러한 항-αvβ6 항체 및 항체-약물 접합체를 사용하는 방법이 제공된다. 바람직한 항-αvβ6 항체는 카바트 넘버링에 의해 결정된 바와 같은 서열식별번호: 31, 32, 및 33의 중쇄 CDR 서열 및 서열식별번호: 37, 42, 및 39의 경쇄 CDR 서열을 포함한다.

Description

항-αvβ6 항체 및 항체-약물 접합체
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 62/943,959 및 2020년 4월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 63/012,584의 우선권을 주장하며, 이의 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 언급
본 출원은 2020년 11월 16일에 생성되고 52KB를 함유하는 AVB6-00212_ST25라는 명칭의 파일에 전자 서열 목록을 포함하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 신규한 항-αvβ6 항체 및 항체-약물 접합체 및 암을 치료하기 위해 이러한 항-αvβ6 항체 및 항체-약물 접합체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
알파-v 베타-6으로도 공지된 αvβ6은 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 피브로넥틴에 결합하는 세포 부착 수용체이다. αvβ6은 알파 v 서브유닛 및 베타 6 서브유닛으로 구성되며, 비-소세포 폐암 (NSCLC)을 포함한 다수의 암에서 상향조절된다.
NSCLC는 폐암의 가장 흔한 유형이다. 과거에, 200,000명이 넘는 사람들이 폐암으로 진단되었으며, 이는 암 사망의 주요 원인이다. 따라서, NSCLC에 대한 개선된 치료에 대한 필요가 있다.
특허 출원, 특허 공개, 및 과학 문헌을 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별적 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
요약
항-αvβ6 항체 및 αvβ6-지정된 항체-약물 접합체 (ADC)가 본원에서 제공된다. 또한, 암을 포함한 αvβ6-발현 장애를 치료하기 위해 항-αvβ6-지정된 항체 및 ADC를 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 바람직한 항-αvβ6 항체는 카바트(Kabat) 넘버링에 의해 결정된 바와 같은 서열식별번호(SEQ ID NO): 31, 32, 및 33의 중쇄 CDR 서열 및 서열식별번호: 37, 42, 및 39의 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
도 1은 다양한 항-αvβ6 항체로의 LAP 차단 ELISA 검정의 결과를 나타낸다.
도 2는 뮤린 항체 클론 2A2 (m2A2로 지칭됨)로의 인간 및 시노 αvβ6을 발현하는 293F 세포에 대한 포화 결합 연구의 결과를 나타낸다.
도 3은 선택 인간 배선 수용자를 갖는 모 뮤린 mAb (m2A2로 지칭됨) 중쇄 가변 영역 (hIGHV1-46/HJ4로 지칭됨) 및 인간화 2A2 중쇄 변이체의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 별표는 카바트에 의해 결정된 바와 같은 CDR을 나타내고, 십자표는 IMGT에 의해 결정된 바와 같은 CDR을 나타낸다.
도 4는 선택 인간 배선 수용자를 갖는 모 뮤린 mAb (m2A2로 지칭됨) 경쇄 가변 영역 (hIGKV1D-33/KJ2로 지칭됨) 및 인간화 2A2 경쇄 변이체의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 별표는 카바트에 의해 결정된 바와 같은 CDR을 나타내고, 십자표는 IMGT에 의해 결정된 바와 같은 CDR을 나타낸다.
도 5는 LA 및 LB 경쇄를 갖는 인간화 항체 및 모 뮤린 및 키메라 항체 (각각 m2A2 및 c2A2로 지칭됨)로의 인간 αvβ6을 발현하는 293F 세포에 대한 경쟁 결합 연구의 결과를 나타낸다.
도 6은 HA 및 HC 중쇄를 갖는 인간화 항체 및 모 뮤린 및 키메라 항체 (각각 m2A2 및 c2A2로 지칭됨)로의 인간 αvβ6을 발현하는 293F 세포에 대한 경쟁 결합 연구의 결과를 나타낸다.
도 7은 인간화 항체 및 모 뮤린 항체 (m2A2로 지칭됨)의 하위세트로의 인간 αvβ6을 발현하는 293F 세포에 대한 경쟁 결합 연구의 반복된 결과를 나타낸다.
도 8은 h2A2 HCLG 인간화 항체 및 모 뮤린 항체 (m2A2로 지칭됨)로의 인간 및 시노 αvβ6을 발현하는 293F 세포에 대한 포화 결합 연구의 결과를 나타낸다.
도 9는 HCLG 인간화 항체 및 ADC로의 인간 및 시노 αvβ6을 발현하는 293F 세포에 대한 경쟁 결합 연구의 결과를 나타낸다.
도 10은 h2A2 HCLG 인간화 항체로의 인간 αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, 및 αvβ8에 대한 ELISA에 의한 αvβ6 특이적 결합 연구의 결과를 나타낸다.
도 11은 h2A2 HCLG 항-αvβ6 vcMMAE ADC가 αvβ6 발현 암 세포주에 대한 시험관내 세포독성을 나타냄을 나타낸다.
도 12는 누드 마우스에서의 디트로이트(Detroit) 562 두경부암 세포주의 이종이식 연구의 결과를 나타낸다. 용량 및 스케줄은 도면 상에 지시된다.
도 13은 누드 마우스에서의 HPAFII 췌장암 세포주의 이종이식 연구의 결과를 나타낸다. 용량 및 스케줄은 도면 상에 지시된다.
도 14는 누드 마우스에서의 BxPC-3 췌장암 세포주의 이종이식 연구의 결과를 나타낸다. 용량 및 스케줄은 도면 상에 지시된다.
도 15는 누드 마우스에서의 SW780 방광암 세포주의 이종이식 연구의 결과를 나타낸다. 용량 및 스케줄은 도면 상에 지시된다.
도 16은 누드 마우스에서의 6개의 NSCLC 세포주에서의 PDX 연구의 결과를 나타낸다. ADC는 3 mg/kg q7dx3으로 투여되었다.
도 17은 누드 마우스에서의 6개의 난소 암종 세포주에서의 PDX 연구의 결과를 나타낸다. ADC는 5 mg/kg q7dx3으로 투여되었다.
도 18은 2개의 세포주 이종이식 모델에서의 h2A2 HCLG 및 h15H3 사이의 비교의 결과를 나타낸다. ADC는 3 mg/kg으로 1회 투여되었다.
I. 정의
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 본원에서 달리 명확하게 제공된 것을 제외하고는, 하기 용어의 각각은 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
본원에 사용되는 경우 용어 "및/또는"은 다른 것이 있는 또는 없는 2개의 특정된 특색 또는 성분의 각각의 구체적인 개시내용으로서 취해진다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 하기 측면의 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 "포함하는", "이루어진", 및 "본질적으로 이루어진" 측면 및 실시양태를 포함함이 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 [Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적 사전을 제공한다.
단위, 접두사, 및 기호는 그들의 국제 단위계(Systeme International de Unites) (SI) 허용된 형태로 표시된다. 수치 값은 범위를 한정하는 수를 포함한다. 본원에서 제공된 표제는 전체로서 본 명세서를 참조로 가질 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니다. 따라서, 바로 밑에 정의된 용어는 그 전체로 본 명세서를 참조로 보다 완전히 정의된다.
용어 "αvβ6", "avb6", "알파-v 베타-6", 또는 "β6"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 달리 특정되지 않는 한, 세포에 의해 일반적으로 발현되거나 αvβ6 유전자로 형질감염된 세포 상에 발현되는 인간 αvβ6의 임의의 변이체, 이소형 및 종 동족체를 포함한다.
용어 "이뮤노글로불린"은 1쌍의 경 (L) 저분자량 쇄 및 1쌍의 중 (H) 쇄인 2쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어지며, 모든 4개는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 것인 구조적으로 관련된 당단백질의 부류를 지칭한다. 이뮤노글로불린의 구조는 널리 특징규명되었다. 예를 들어 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N .Y. (1989))]을 참조한다. 간략하게, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (CH 또는 CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, 즉, CH1, CH2, 및 CH3으로 구성된다. 중쇄는 일반적으로 소위 "힌지 영역"에서 디술피드 결합을 통해 상호-연결된다. 각각의 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역 (CL 또는 CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인, 즉, CL로 구성된다. CL은 κ (카파) 또는 λ (람다) 이소타입의 것일 수 있다. 용어 "불변 도메인" 및 "불변 영역"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이뮤노글로불린은 IgA, 분비성 IgA, IgG, 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 통상적으로 공지된 이소타입으로부터 유래할 수 있다. IgG 하위부류는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 또는 하위부류 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 (각각 VH 및 VL)은 프레임워크 영역 (FR)으로 용어화되는 보다 보존된 영역이 사이에 배치된 또한 상보성-결정 영역 (CDR)으로 용어화되는 초가변성의 영역 (또는 구조적으로 한정된 루프의 서열 및/또는 형태로 초가변성일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있다. "초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어인 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비-인접한 서열을 지칭하는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) 및 각각의 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다. "프레임워크 영역" 및 "FR"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 비-CDR 부분을 지칭하는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 전장 중쇄 가변 영역에 4개의 FR (FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및 FR-H4), 및 각각의 전장 경쇄 가변 영역에 4개의 FR (FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및 FR-L4)이 있다. 각각의 VH 및 VL 내에서, 3개의 CDR 및 4개의 FR은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한 문헌 [Chothia and Lesk J. Mot. Biol., 195, 901-917 (1987)] 참조).
본 발명의 맥락에서 용어 "항체" (Ab)는 유의한 기간, 예컨대 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간 (h), 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간 (h), 약 24시간 이상, 약 48시간 이상, 약 3, 4, 5, 6, 7일 이상 등의 반감기, 또는 임의의 다른 관련된 기능적으로-정의된 기간 (예컨대 항원에의 항체 결합과 연관된 생리학적 반응을 유도하고/거나, 촉진시키고/거나, 증진시키고/거나, 조정하는데 충분한 시간 및/또는 항체가 이펙터 활성을 동원하는데 충분한 시간)을 갖는 전형적인 생리학적 조건 하에서 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 이들 중 어느 하나의 유도체를 지칭한다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체 (Ab)의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체계의 성분, 예컨대 보체 활성화의 고전적인 경로에서의 제1 성분인 C1q를 포함한 숙주 조직 또는 인자에의 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 또한 이중특이적 항체, 디아바디, 다중특이적 항체 또는 유사한 분자일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 단일 1차 아미노산 서열로 재조합적으로 생산된 항체 분자의 제제가 마우스 B-세포 융합물로부터 생산됨을 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조말 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, αvβ6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 αvβ6 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, αvβ6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 상이한 종으로부터의 αvβ6 분자에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 한 실시양태에서, 단리된 항체는 또 다른 작용제 (예를 들어, 소분자 약물)에 부착된 항체 접합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-αvβ6 항체는 소분자 약물 (예를 들어, MMAE 또는 MMAF)과의 항-αvβ6 항체의 접합체를 포함한다.
"인간 항체" (HuMAb)는 FR 및 CDR 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다. 본 개시내용의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상으로 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 용어 "인간 항체" 또는 "완전히 인간 항체"는 동의어적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 인간 항체 불변 도메인, 및 인간 가변 도메인에 대한 높은 수준의 서열 상동성을 함유하도록 변형된 비-인간 가변 도메인을 함유하는 유전자 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 이는 상동 인간 수용자 프레임워크 영역 (FR) 상으로의, 항원 결합 부위를 함께 형성하는 6개의 비-인간 항체 상보성-결정 영역 (CDR)의 그라프팅에 의해 달성될 수 있다 (WO92/22653 및 EP0629240 참조). 모 항체의 결합 친화도 및 특이성을 완전히 재구성하기 위해, 인간 프레임워크 영역 내로의 모 항체 (즉, 비-인간 항체)로부터의 프레임워크 잔기의 치환 (역-돌연변이)이 요구될 수 있다. 구조적 상동성 모델링은 항체의 결합 특성에 중요한 프레임워크 영역에서 아미노산 잔기를 확인하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 비-인간 CDR 서열, 주로 임의로 비-인간 아미노산 서열에 대한 1개 이상의 아미노산 역-돌연변이, 및 완전히 인간 불변 영역을 포함하는 인간 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 임의로, 반드시 역-돌연변이는 아닌 추가의 아미노산 변형은 바람직한 특징, 예컨대 친화도 및 생화학적 특성을 갖는 인간화 항체를 얻기 위해 적용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 가변 영역이 비-인간 종으로부터 유래되고 (예를 들어 설치류로부터 유래되고), 불변 영역이 상이한 종, 예컨대 인간으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 항체 조작에 의해 생성될 수 있다. "항체 조작"은 항체의 변형의 상이한 종류에 대해 포괄적으로 사용되고, 통상의 기술자에 대해 널리 공지된 프로세스인 용어이다. 특히, 키메라 항체는 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15]에 기재된 바와 같은 표준 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 키메라 항체는 유전자 또는 효소적으로 조작된 재조합 항체일 수 있다. 키메라 항체를 생성하는 것은 통상의 기술자의 지식 내이며, 따라서, 본 발명에 따른 키메라 항체의 생성은 본원에 기재된 것과 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 항체 면역원성을 감소시키는 치료 적용을 위한 키메라 모노클로날 항체는 개발되어 있다. 이들은 전형적으로 관심의 항원에 대해 특이적인 비-인간 (예를 들어 뮤린) 가변 영역, 및 인간 불변 항체 중쇄 및 경쇄 도메인을 함유할 수 있다. 키메라 항체의 맥락에서 사용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 영역을 지칭한다.
"항-항원 항체"는 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 항-αvβ6 항체는 항원 αvβ6에 결합하는 항체이다.
항체의 "항원-결합 부분" 또는 항원-결합 단편"은 전체 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체 단편 (예를 들어, 항원-결합 단편)의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편, 및 그의 명칭이 용이하게 결정화하는 능력을 반영하는 나머지 "Fc" 단편으로 지칭되는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
참조 폴리펩티드 서열에 관하여 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후, 및 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 관련 기술분야의 기술 내인 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, 스냅진 얼라인(SnapGene Align), 또는 클러스탈W 바이오에디트(ClustalW BioEdit) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 그와의, 또는 그에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 서열 동일성 (대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 그와의, 또는 그에 대한 특정 % 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 어구화될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
100 곱하기 분율 X/Y
상기 식에서 X는 A 및 B의 그 프로그램의 정렬에서의 서열에 의한 동일한 매치로서 점수화되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 서열 동일성과 동등하지 않을 것임이 인정될 것이다.
미리-결정된 항원에의 항체의 결합의 맥락에서 본원에 사용된 용어 "결합", "결합하다" 또는 "특이적으로 결합하다"는 전형적으로 예를 들어 리간드로서 항체 및 분석물로서 항원을 사용한 옥텟(Octet) HTX 기기에서의 생물층 간섭측정법 (BLI) 기술에 의해 결정되는 경우 약 10-6 M 이하, 예를 들어 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 또는 심지어 약 10-11 M 이하의 KD에 상응하는 친화도를 갖는 결합이고, 여기서 항체는 미리 결정된 항원 또는 가깝게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에의 결합의 그의 KD보다 적어도 10배 더 낮은, 예컨대 적어도 100배 더 낮은, 예를 들어 적어도 1,000배 더 낮은, 예컨대 적어도 10,000배 더 낮은, 예를 들어 적어도 100,000배 더 낮은 KD에 상응하는 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 결합의 KD가 더 낮은 양은 항체의 KD에 의존하므로, 항체의 KD가 매우 낮은 경우, 항원에의 결합의 KD가 비-특이적 항원에의 결합의 KD보다 더 낮은 양은 적어도 10,000배일 수 있다 (즉, 항체는 고도로 특이적이다).
본원에 사용된 용어 "KD" (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 본원에 사용된 친화도, 및 KD는 반비례 관계이며, 즉, 보다 높은 친화도는 보다 낮은 KD를 지칭하는 것으로 의도되고, 보다 낮은 친화도는 보다 높은 KD를 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "ADC"는 항체-약물 접합체를 지칭하며, 이는 본 발명의 맥락에서 본 출원에 기재된 바와 같은 약물 모이어티 (예를 들어, MMAE 또는 MMAF)에 커플링된 항-αvβ6 항체를 지칭한다.
약어 "vc" 및 "val-cit"는 디펩티드 발린-시트룰린을 지칭한다.
약어 VKG는 트리펩티드 링커 발린-리신-글리신을 지칭한다.
약어 "PAB"는 자기-희생 스페이서를 지칭한다:
Figure pct00001
약어 "MC"는 스트레처 말레이미도카프로일을 지칭한다:
Figure pct00002
약어 "MP"는 스트레처 말레이미도프로피오닐을 지칭한다:
Figure pct00003
본원에 사용된 "PEG 단위"는 반복 에틸렌-옥시 서브유닛 (PEG 또는 PEG 서브유닛)으로 구성된 유기 모이어티이며, 다분산성, 단분산성 또는 분리성 (즉, 별개의 수의 에틸렌-옥시 서브유닛을 가짐)일 수 있다. 다분산성 PEG는 크기 및 분자량의 이질적 혼합물인 반면, 단분산성 PEG는 전형적으로 이질적 혼합물로부터 정제되고, 따라서 단일 쇄 길이 및 분자량을 제공한다. 바람직한 PEG 단위는 단계별 방식으로 합성되고 중합 프로세스를 통해 합성되지 않는 화합물인 분리성 PEG를 포함한다. 분리성 PEG는 한정되고 특정된 쇄 길이를 갖는 단일 분자를 제공한다.
본원에서 제공된 PEG 단위는 각각 서로에 공유 부착된 1개 이상의 에틸렌옥시 서브유닛으로 구성된 하나 또는 다수의 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 예를 들어, 선형, 분지형 또는 별 형상 배치로 함께 연결될 수 있다. 전형적으로, 캄프토테신 접합체 내로의 혼입 전의 폴리에틸렌 글리콜 쇄 중 적어도 하나는 메틸렌 카르바메이트 단위의 카르바메이트 질소에의 공유 부착을 위한 친전자성 기로 치환된 알킬 모이어티 (즉, R의 예를 나타냄)로 한 단부에서 유도체화된다. 전형적으로, 링커 단위의 나머지에의 공유 부착에 관여하지 않는 각각의 폴리에틸렌 글리콜 쇄에서의 말단 에틸렌옥시 서브유닛은 PEG 캡핑 단위, 전형적으로 임의로 치환된 알킬, 예컨대 -CH3, CH2CH3 또는 CH2CH2CO2H로 변형된다. 바람직한 PEG 단위는 일련으로 공유 부착되고 PEG 캡핑 단위로 한 단부에서 말단화된 2 내지 24 -CH2CH2O- 서브유닛을 갖는 단일 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 갖는다.
"암"은 신체에서 비정상적 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 폭넓은 군을 지칭한다. "암" 또는 "암 조직"은 종양을 포함할 수 있다. 비조절된 세포 분열 및 성장은 이웃 조직을 침습하고 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 전이될 수 있는 악성 종양의 형성을 발생시킨다. 전이 후, 원위 종양은 전이 전 종양"으로부터 유래되는" 것으로 이야기될 수 있다.
용어 "항체-의존성 세포성 세포독성", 또는 ADCC는 용해 활성을 갖는 면역 세포 (또한 이펙터 세포로 지칭됨)와의 항체-코팅된 표적 세포의 상호작용에 의존하는 세포 사멸을 유도하는 메커니즘이다. 이러한 이펙터 세포는 자연 킬러 세포, 단핵구/대식세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 그들의 항원-조합 부위를 통해 표적 세포에 결합된 Ig의 Fc 이펙터 도메인(들)에 부착한다. 항체-코팅된 표적 세포의 사멸은 이펙터 세포 활성의 결과로서 일어난다.
용어 "항체-의존성 세포성 포식작용", 또는 ADCP는 항체-코팅된 세포가 Ig의 Fc 이펙터 도메인(들)에 결합하는 포식성 면역 세포 (예를 들어, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포)에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 내재화되는 프로세스를 지칭한다.
용어 "보체-의존성 세포독성", 또는 CDC는 표적-결합된 항체의 Fc 이펙터 도메인(들)이 일련의 효소 반응을 활성화시켜 결국 표적 세포막에서 홀이 형성되게 하는 세포 사멸을 유도하는 메커니즘을 지칭한다. 전형적으로, 항원-항체 복합체, 예컨대 항체-코팅된 표적 세포 상의 것들은 보체 성분 Clq에 결합하고 이를 활성화시키며, 이는 다시 보체 캐스케이드를 활성화시켜 표적 세포 사멸을 초래한다. 보체의 활성화는 또한 백혈구 상의 보체 수용체 (예를 들어, CR3)에 결합함으로써 ADCC를 용이하게 하는 표적 세포 표면 상의 보체 성분의 침착을 발생시킬 수 있다.
"세포증식억제 효과"는 세포 증식의 억제를 지칭한다. "세포증식억제제"는 세포에 대한 세포증식억제 효과를 가짐으로써, 세포의 특이적 하위세트의 성장 및/또는 확장을 억제하는 작용제를 지칭한다. 세포증식억제제는 항체에 접합되거나 항체와 조합으로 투여될 수 있다.
대상체의 "치료" 또는 "요법"은 질환과 연관된 증상, 합병증, 상태, 또는 생화학적 징후의 발병, 진행, 발달, 중증도, 또는 재발을 반전시키거나, 경감시키거나, 개선시키거나, 억제하거나, 감속시키거나, 예방하는 목적으로 대상체에 대해 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 프로세스, 또는 대상체에의 활성제의 투여를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 질환은 암이다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 척추동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 및 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 및 기니아 피그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자" 및 "개체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
약물 또는 치료제의 "유효량" 또는 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합으로 사용되는 경우, 질환의 발병에 대해 대상체를 보호하거나, 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상-없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방에 의해 입증된 질환 퇴행을 촉진시키는 약물의 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진시키는 치료제의 능력은 통상의 실시자에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능의 예측제인 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
종양의 치료에 대한 예로서, 항암제의 치료 유효량은 비치료된 대상체(들) (예를 들어, 하나 이상의 비치료된 대상체)에 비해 치료된 대상체(들) (예를 들어, 하나 이상의 치료된 대상체)에서 세포 성장 또는 종양 성장을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 억제한다. 일부 실시양태에서, 항암제의 치료 유효량은 비치료된 대상체(들) (예를 들어, 하나 이상의 비치료된 대상체)에 비해 치료된 대상체(들) (예를 들어, 하나 이상의 치료된 대상체)에서 세포 성장 또는 종양 성장을 100% 억제한다.
본 개시내용의 다른 실시양태에서, 종양 퇴행은 적어도 약 20일, 적어도 약 30일, 적어도 약 40일, 적어도 약 50일, 또는 적어도 약 60일의 기간 동안 관찰되고 계속될 수 있다.
약물 (예를 들어, 항-αvβ6 항체-약물 접합체)의 치료 유효량은 단독으로 또는 항암제와 조합으로 암을 발달시킬 (예를 들어, 전악성 상태를 갖는 대상체) 또는 암의 재발을 겪을 위험이 있는 대상체에게 투여되는 경우, 암의 발달 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양인 "예방 유효량"을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예방 유효량은 암의 발달 또는 재발을 완전히 예방한다. 암의 발달 또는 재발을 "억제하는"은 암의 발달 또는 재발의 가능성을 감소시키거나, 암의 발달 또는 재발을 완전히 예방하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "치료이하 용량"은 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)의 치료를 위해 단독으로 투여되는 경우 치료 화합물의 통상적인 또는 전형적인 용량보다 더 낮은 치료 화합물 (예를 들어, 항-αvβ6 항체-약물 접합체)의 용량을 의미한다.
"면역-관련된 반응 패턴"은 암-특이적 면역 반응을 유도함으로써 또는 천연 면역 프로세스를 변형시킴으로써 항종양 효과를 생성하는 면역치료제로 치료된 암 환자에서 종종 관찰되는 임상적 반응 패턴을 지칭한다. 이 반응 패턴은 전통적인 화학치료제의 평가에서 질환 진행으로서 분류될 것이고 약물 실패와 동의어일 종양 부담의 초기 증가 또는 새로운 병변의 출현을 따르는 유익한 치료 효과를 특징으로 한다. 따라서, 면역치료제의 적절한 평가는 표적 질환에 대한 이들 작용제의 효과의 장기 모니터링을 요구할 수 있다.
예로서, "항암제"는 대상체에서 암 퇴행을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 약물의 치료 유효량은 암 퇴행을 암을 제거하는 지점까지 촉진시킨다. "암 퇴행을 촉진시키는"은 단독으로 또는 항암제와 조합으로 약물의 유효량을 투여하는 것이 종양 성장 또는 크기의 감소, 종양의 괴사, 적어도 하나의 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상-없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 발생시키는 것을 의미한다. 또한, 치료에 관하여 용어 "유효" 및 "유효성"은 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성 둘 다를 포함한다. 약리학적 유효성은 환자에서 암 퇴행을 촉진시키는 약물의 능력을 지칭한다. 생리학적 안전성은 약물의 투여로부터 초래되는 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 독성 또는 다른 유해 생리학적 효과 (유해 효과)의 수준을 지칭한다.
"지속된 반응"은 치료의 중단 후 종양 성장을 감소시키는데 대한 지속된 효과를 지칭한다. 예를 들어, 종양 크기는 투여 상의 시작에서의 크기와 비교하여 동일하거나 더 작게 남아 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 지속된 반응은 치료 지속기간과 적어도 동일한, 또는 치료 지속기간보다 적어도 1.5, 2.0, 2.5, 또는 3배 더 긴 지속기간을 갖는다.
본원에 사용된 "완전 반응" 또는 "CR"은 모든 표적 병변의 사라짐을 지칭하고; "부분 반응" 또는 "PR"은 기준선 SLD를 참조로서 취하여, 표적 병변의 최장 직경의 합계 (SLD)의 적어도 30% 감소를 지칭하고; "안정 질환" 또는 "SD"는 치료가 시작된 이래로 가장 작은 SLD를 참조로서 취하여, PR의 자격을 얻는 표적 병변의 충분한 수축도 없고, PD의 자격을 얻는 충분한 증가도 없는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 "무진행 생존" 또는 "PFS"는 치료되는 질환 (예를 들어, 암)이 악화되지 않는 치료 동안 및 후의 시간의 길이를 지칭한다. 무진행 생존은 환자가 완전 반응 또는 부분 반응을 경험한 시간의 양, 뿐만 아니라 환자가 안정 질환을 경험한 시간의 양을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "전체 반응률" 또는 "ORR"은 완전 반응 (CR)률 및 부분 반응 (PR)률의 합계를 지칭한다.
본원에 사용된 "전체 생존" 또는 "OS"는 특정 시간의 지속기간 후 살아 있을 가능성이 있는 군에서의 개체의 백분율을 지칭한다.
어구 "제약상 허용되는"은 물질 또는 조성물이 제형을 포함하는 다른 성분, 및/또는 그로 치료되는 포유동물과 화학적으로 및/또는 독성학적으로 혼화성이어야 함을 지시한다.
본원에 사용된 어구 "제약상 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 예시적인 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루코로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트 "메실레이트", 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 파모에이트 (즉, 4,4'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염, 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨 및 칼륨) 염, 알칼리 토금속 (예를 들어, 마그네슘) 염, 및 암모늄 염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염은 또 다른 분자, 예컨대 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 카운터 이온의 포함을 수반할 수 있다. 카운터 이온은 모체 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 더욱이, 제약상 허용되는 염은 그의 구조에 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우는 다수의 카운터 이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 염은 1개 이상의 하전된 원자 및/또는 1개 이상의 카운터 이온을 가질 수 있다.
"투여하는" 또는 "투여"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템을 사용한, 대상체에의 치료제의 물리적 도입을 지칭한다. 항-αvβ6 항체-약물 접합체에 대한 예시적인 투여의 경로는 예를 들어 주사 또는 주입 (예를 들어, 정맥내 주입)에 의한 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척추 또는 다른 비경구 투여의 경로를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 장관 및 국소 투여 이외의 투여의 방식을 의미하고, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 림프내, 병변내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척주내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 치료제는 비-비경구 경로를 통해, 또는 경구로 투여될 수 있다. 다른 비-비경구 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여의 경로, 예를 들어, 비내로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로를 포함한다. 투여는 또한 예를 들어, 1회, 복수 회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "기준선" 또는 "기준선 값"은 요법 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항-αvβ6 항체-약물 접합체)의 투여 전의 또는 요법의 투여의 시작에서의 증상의 측정 또는 특징규명을 지칭할 수 있다. 기준선 값은 본원에서 고려되는 αvβ6-연관된 질환 (예를 들어, 암)의 증상의 감소 또는 개선을 결정하기 위해 참조 값과 비교될 수 있다. 본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "참조" 또는 "참조 값"은 요법 (예를 들어, 기재된 바와 같은 항-αvβ6 항체-약물 접합체)의 투여 후의 증상의 측정 또는 특징규명을 지칭할 수 있다. 참조 값은 투여량 요법 또는 치료 주기 동안 또는 투여량 요법 또는 치료 주기의 완결에서 1회 이상 측정될 수 있다. "참조 값"은 절대 값; 상대 값; 상한 및/또는 하한을 갖는 값; 값의 범위; 평균 값; 중위 값: 평균 값; 또는 기준선 값과 비교한 값일 수 있다.
유사하게, "기준선 값"은 절대 값; 상대 값; 상한 및/또는 하한을 갖는 값; 값의 범위; 평균 값; 중위 값: 평균 값; 또는 참조 값과 비교한 값일 수 있다. 참조 값 및/또는 기준선 값은 하나의 개체로부터, 2개의 상이한 개체로부터 또는 개체의 군 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의 개체의 군)으로부터 얻어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단독요법"은 항-αvβ6 항체-약물 접합체가 치료 주기 동안 대상체에게 투여되는 유일한 항암제임을 의미한다. 그러나, 다른 치료제는 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어 염증, 통증, 체중 감소, 및 일반적 문제를 포함한, 암과 연관되지만 기저에 있는 암 그 자체는 아닌 증상을 치료하기 위해 암을 갖는 대상체에게 투여되는 항-염증제 또는 다른 작용제는 단독요법의 기간 동안 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "유해 사건" (AE)은 의학적 치료의 사용과 연관된 임의의 비바람직하고 일반적으로 비의도되거나 비바람직한 징후 (비정상적 실험실 결과를 포함함), 증상, 또는 질환이다. 의학적 치료는 하나 이상의 연관된 AE를 가질 수 있고, 각각의 AE는 동일한 또는 상이한 수준의 중증도를 가질 수 있다. "유해 사건을 변경시킬" 수 있는 방법에 대한 언급은 상이한 치료 요법의 사용과 연관된 하나 이상의 AE의 발생 및/또는 중증도를 감소시키는 치료 요법을 의미한다.
본원에 사용된 "심각한 유해 사건" 또는 "SAE"는 하기 기준 중 하나를 충족시키는 유해 사건이다:
· 심각한 유해 사건의 정의에 사용된 바와 같이 치명적이거나 생명을 위협하는 것, "생명을 위협하는"은 환자가 사건의 때에 사망의 위험이 있었던 사건을 지칭하며; 이는 그것이 보다 중증인 경우 가설적으로 사망을 유발할 수 있었던 사건을 지칭하지 않는다.
· 지속적인 또는 유의한 장애/불능을 발생시킴
· 선천적인 이상/출생 결함을 구성함
· 의학적으로 유의함, 즉, 환자를 위태롭게 하거나 상기 열거된 결과 중 하나를 예방하는 의학적 또는 외과적 개입을 요구할 수 있는 사건으로 정의됨. 의학적 및 과학적 판단은 AE가 "의학적으로 유의한지" 여부를 결정하는데 있어서 훈련되어야 한다.
· 하기를 제외한 입원환자 입원 또는 기존의 입원의 연장을 요구함: 1) 상태의 임의의 악화와 연관되지 않는 기저 질환의 통상적인 치료 또는 모니터링; 2) 연구 하의 적응증과 비관련되거나 고지 동의서에 사인한 이래로 악화되지 않은 기존의 상태에 대한 선택 또는 사전-계획된 치료; 및 3) 환자의 일반적 상태의 임의의 악화의 부재 하에서 사회적 이유 및 일시적 치료.
대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다, 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 부정 관사는 임의의 나열되거나 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 부분적으로 값 또는 조성물이 측정되거나 결정되는 방식, 즉, 측정 시스템의 한계에 의존할 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값 또는 조성물에 대한 허용되는 오차 범위 내인 값 또는 조성물을 지칭한다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 최대 20%의 범위를 의미할 수 있다. 더욱이, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스에 관하여, 상기 용어는 값의 최대 한 자릿수 또는 최대 5배를 의미할 수 있다. 특정 값 또는 조성물이 본 출원 및 청구범위에서 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 그 특정 값 또는 조성물에 대한 허용되는 오차 범위 내인 것으로 가정되어야 한다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 실시양태를 포함한다 (및 기재한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"를 포함하고 기재한다.
본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위, 또는 정수 범위는 달리 지시되지 않는 한, 나열된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우, 그의 분수 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용의 다양한 측면은 하기 하위섹션에 추가로 상세하게 기재된다.
II. 일반사항
본 발명은 αvβ6에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 부분적으로 αvβ6에 표적화된 vcMMAE 항체-약물 접합체를 포함한 항체-약물 접합체가 αvβ6+ 발현 세포를 살해하는데 특히 효과적이라는 발견에 기반한다. αvβ6은 비-소세포 폐암 (NSCLC) (편평 및 선), 두경부암 (두경부 편평 암종을 포함함), 식도암, 유방암 (유방 침습성 암종을 포함함), 난소암, 방광암 (요로상피 암종을 포함함), 피부암 (편평 세포 암종, 또는 SCC), 신장암 (신장 투명 세포, 신장 유두 세포, 및 신장 혐색소세포를 포함함), 자궁경부암, 위암, 전립선암 (전립선 선암종을 포함함), 자궁내막암 (자궁 암육종 및 자궁 체부 자궁내막을 포함함), 직장 선암종, 갑상선 암종, 결장 선암종, 위 선암종, 및 췌장암 (췌장 선암종을 포함함)을 포함한 다양한 암에서 발현되는 것으로 나타났다.
III. 표적 분자
달리 지시되지 않는 한, αvβ6은 인간 αvβ6을 지칭한다. 예시적인 β6 인간 서열은 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 AAA36122로 할당된다. 예시적인 αv 인간 서열은 NCBI NP_002201.1로 할당된다.
IV. 본 발명의 항체
본 발명은 뮤린 2A2 항체, 및 키메라, 인간화, 및 인간 2A2 항체를 제공한다.
인간 αvβ6에 대한 본 발명의 항체 (예를 들어, 마우스 2A2 항체의 키메라, 인간화 및 인간 형태)의 친화도는 바람직하게는 인간 αvβ6에 대한 마우스 2A2 항체의 친화도와 등가이거나, 인간 αvβ6에 대한 마우스 2A2 항체의 친화도 초과이거나, 인간 αvβ6에 대한 뮤린 항체 2A2의 그것보다 10배 내로, 5배 내로, 또는 2배 내로 더 약하다. 그의 표적 항원에 대한 항체의 친화도를 측정하는 한 방법은 항체의 겉보기 해리 상수를 결정하는 것에 의한다. 본 발명은 뮤린 2A2와 본질적으로 동일한 (즉, 실험 오차 내의) 겉보기 해리 상수를 갖는 항체 (예를 들어, 마우스 2A2 항체의 키메라, 인간화 및 인간 형태) 뿐만 아니라 인간 αvβ6에 대한 뮤린 항체 2A2의 그것보다 더 낮은 또는 더 높은 해리 상수를 갖는 항체를 포괄한다. 키메라, 인간화 및 인간 2A2 항체는 천연 형태로 인간 αvβ6에 특이적으로 결합하고/거나, 마우스 2A2 항체가 그러하듯이 CHO 세포로부터 재조합적으로 발현된다. 전형적으로, 키메라, 인간화 및 인간 2A2 항-αvβ6 항체는 인간 αvβ6에의 결합에 대해 뮤린 2A2와 경쟁한다.
본 발명의 바람직한 항체는 동물 모델 또는 임상 시험에서, 배양에서 번식하는 암성 세포에 대해 나타내어진 바와 같이 암 (예를 들어, 세포의 성장, 전이 및/또는 유기체에 대한 치명성)을 억제한다. 동물 모델은 αvβ6-발현 인간 종양 세포주를 적절한 면역결핍성 설치류 계통, 예를 들어, 무흉선 누드 마우스 또는 SCID 마우스 내로 삽입함으로써 형성될 수 있다. 이들 종양 세포주는 피하 주사에 의해 고형 종양으로서 또는 정맥내 주사에 의해 파종성 종양으로서 면역결핍성 설치류 숙주에서 확립될 수 있다. 숙주 내에서 확립되면, 이들 종양 모델은 실시예에 기재된 바와 같이 항-αvβ6 항체 또는 그의 접합된 형태의 치료 효능을 평가하기 위해 적용될 수 있다.
일반적으로, 본 개시내용의 항-αvβ6 항체 및/또는 항-αvβ6 항체-약물 접합체는 αvβ6, 예를 들어, 인간 αvβ6에 결합하고, 악성 세포, 예컨대 암 세포에 대한 세포증식억제 또는 세포독성 효과를 발휘한다. 본 개시내용의 항-αvβ6 항체는 바람직하게는 모노클로날이고, 다중특이적, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 및 상기 중 임의의 것의 αvβ6 결합 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-αvβ6 항체는 αvβ6에 특이적으로 결합한다. 본 개시내용의 이뮤노글로불린 분자는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
본 개시내용의 특정 실시양태에서, 항-αvβ6 항체는 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간 항원-결합 단편)이고, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-쇄 Fv (scFv), 단일-쇄 항체, 디술피드-연결된 Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 단일-쇄 항체를 포함한 항원-결합 단편은 단독으로 또는 하기의 전체 또는 부분과 조합으로 가변 영역(들)을 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인. 또한 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인과 가변 영역(들)의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 단편이 본 개시내용에 포함된다. 일부 실시양태에서, 항-αvβ6 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간, 뮤린 (예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 또는 닭이다.
본 개시내용의 항-αvβ6 항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 더 큰 다중 특이성의 것일 수 있다. 다중특이적 항체는 αvβ6의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, αvβ6 뿐만 아니라 이종 단백질 둘 다에 대해 특이적일 수 있다.
본 개시내용의 항-αvβ6 항체는 그들이 포함하는 특정 CDR의 관점에서 기재되거나 특정될 수 있다. 주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD] ("카바트" 넘버링 스킴); [Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948] ("코티아(Chothia)" 넘버링 스킴); [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745."] ("콘택트(Contact)" 넘버링 스킴); [Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77] ("IMGT" 넘버링 스킴); [Honegger A and Plueckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70], ("아호(Aho)" 넘버링 스킴); 및 [Martin et al., "Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm," PNAS, 1989, 86(23):9268-9272], ("AbM" 넘버링 스킴)]에 의해 기재된 것들을 포함한 임의의 다수의 널리 공지된 스킴을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 주어진 CDR의 경계는 확인에 사용되는 스킴에 따라 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 주어진 항체 또는 그의 영역 (예를 들어, 그의 가변 영역)의 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역", 또는 개별적인 특정된 CDR (예를 들어, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)은 임의의 상기 언급된 스킴에 의해 정의된 바와 같은 하나의 (또는 특이적) CDR을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR (예를 들어, CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 영역 아미노산 서열에서 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 함유하는 것으로 진술되는 경우, 이러한 CDR은 임의의 상기 언급된 스킴에 의해 정의된 바와 같이, 가변 영역 내에 상응하는 CDR (예를 들어, CDR-H3)의 서열을 가짐이 이해된다. 특정 CDR 또는 CDR들, 예컨대 카바트, 코티아, AbM 또는 IMGT 방법에 의해 정의된 바와 같은 CDR의 확인을 위한 스킴은 특정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-αvβ6 항체의 및 항-αvβ6 항체-약물 접합체의 CDR 서열은 카바트 넘버링 스킴에 따른다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-αvβ6 항체의 및 항-αvβ6 항체-약물 접합체의 CDR 서열은 IMGT 넘버링 스킴에 따른다.
한 측면에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-αvβ6 항체가 본원에서 제공되고, 여기서 중쇄 가변 영역은 (i) 서열식별번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열식별번호:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열식별번호:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고/거나; 경쇄 가변 영역은 (i) 서열식별번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열식별번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열식별번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 항-αvβ6 항체의 CDR은 카바트 넘버링 스킴에 의해 정의된다. 다른 실시양태에서, CDR-L1은 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, CDR-L2는 서열식별번호: 38 또는 41의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-αvβ6 항체가 본원에서 제공되고, 여기서 중쇄 가변 영역은 (i) 서열식별번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열식별번호:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열식별번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고/거나; 경쇄 가변 영역은 (i) 서열식별번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열식별번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열식별번호:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 항-αvβ6 항체의 CDR은 IMGT 넘버링 스킴에 의해 정의된다.
본원에 기재된 항-αvβ6 항체는 항체가 αvβ6 (예를 들어, 인간 αvβ6)에 결합하는 능력을 보유하는 한, 임의의 적합한 프레임워크 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 항-αvβ6 항체의 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 각각 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 항-αvβ6 항체의 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 각각 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호:6의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-αvβ6 항체 및/또는 항-αvβ6 항체-약물 접합체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열식별번호:6의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인은 참조 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하고, αvβ6 (예를 들어, 인간 αvβ6)에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열식별번호:6에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 다른 실시양태에서, 총 3 내지 10개의 아미노산이 서열식별번호:6에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산)은 CDR의 내부의 영역에서 일어난다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산)은 CDR의 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 일부 실시양태에서, 항-αvβ6 항체는 그 서열의 번역후 변형을 포함하는 서열식별번호:6의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호:17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-αvβ6 항체 및/또는 항-αvβ6 항체-약물 접합체가 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열식별번호:17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인은 참조 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하고, αvβ6 (예를 들어, 인간 αvβ6)에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열식별번호:17에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 다른 실시양태에서, 총 1 내지 2개의 아미노산은 서열식별번호:17에서 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산)은 CDR의 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 일부 실시양태에서, 항-αvβ6 항체는 그 서열의 번역후 변형을 포함한 서열식별번호:17의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는 이뮤노글로불린의 5개의 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 부류는 하위부류로 추가로 나누어지고, 예를 들어, 인간은 하기 하위부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2. IgG1 항체는 동종이형으로 용어화되는 다수의 다형적 변이체로 존재할 수 있으며 (문헌 [Jefferis and Lefranc 2009. mAbs Vol 1 Issue 4 1-7]에서 검토됨), 이들 중 임의의 것은 본원의 실시양태의 일부에 사용하는데 적합하다. 인간 집단에서 통상적인 동종이형 변이체는 문자 a, f, n, z에 의해 지정된 것들 또는 이들의 조합이다. 본원의 임의의 실시양태에서, 항체는 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 중쇄 Fc 영역을 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 인간 IgG1을 포함한다.
본 발명의 항체는 또한 변형된, 즉, 공유 부착이 항체가 αvβ6에 결합하는 것을 방지하거나 HD 세포에 대한 세포증식억제 또는 세포독성 효과를 발휘하는 것을 방지하지 않도록, 항체에의 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의한 유도체를 포함한다. 예를 들어 (그러나 제한은 아님), 항체 유도체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기, 단백질용해성 절단, 세포성 리간드 또는 다른 단백질에의 연결 등에 의한 유도체화에 의해 변형된 항체를 포함한다. 임의의 다수의 화학적 변형은 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 유도체는 1개 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
인간화 항체
인간화 항체는 비-인간 "공여자" 항체로부터의 CDR이 인간 "수용자" 항체 서열 내로 그라프팅된 유전자 조작된 항체이다 (예를 들어, 퀸(Queen), US 5,530,101 및 5,585,089; 윈터(Winter), US 5,225,539; 카터(Carter), US 6,407,213; 어데어(Adair), US 5,859,205; 및 푸트(Foote), US 6,881,557 참조). 수용자 항체 서열은 예를 들어, 성숙한 인간 항체 서열, 이러한 서열의 합성물, 인간 항체 서열의 컨센서스 서열, 또는 배선 영역 서열일 수 있다. 중쇄에 대한 바람직한 수용자 서열은 배선 VH 엑손 IGHV1-46 및 J 엑손 (JH)에 대해, 엑손 IGHJ4이다. 경쇄에 대해, 바람직한 수용자 서열은 엑손 IGKV1D-33 및 J 엑손 IGKJ2에 대해서이다. 중쇄에 대한 대안적인 바람직한 수용자 서열은 J 엑손 (JH), IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, IGHJ5 또는 IGHJ6을 포함한다. 경쇄에 대해 대안적으로 바람직한 것은 J 엑손 IGKJ1, IGKJ3, IGKJ4 또는 IGKJ5를 포함한다. 따라서, 인간화 항체는 전체적으로 또는 실질적으로 공여자 항체로부터의 일부 또는 전부의 CDR, 및 존재하는 경우, 전체적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화 중쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 공여자 항체 중쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 통상적으로 모든 3개의 CDR, 및 존재하는 경우, 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 유사하게 인간화 경쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 공여자 항체 경쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 통상적으로 모든 3개의 CDR, 및 존재하는 경우, 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 나노바디 및 dAb 이외에, 인간화 항체는 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄를 포함한다. 인간화 항체에서의 CDR은 상응하는 잔기 (카바트에 의해 정의된 바와 같음)의 적어도 60%, 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각각의 CDR 사이에 동일한 경우 실질적으로 비-인간 항체에서의 상응하는 CDR로부터의 것이다. 항체 쇄의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 쇄의 불변 영역은 카바트에 의해 정의된 상응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일한 경우 실질적으로 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터의 것이다.
인간화 항체는 종종 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDR (바람직하게는 카바트에 의해 정의된 바와 같음)을 혼입하지만, 이들은 또한 마우스 항체로부터의 모든 CDR 미만의 (예를 들어, 적어도 3, 4, 또는 5개의) CDR을 갖도록 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002]; [Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002]; [Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999]; [Tamura et al., Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000]).
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 특정 아미노산은 CDR 형태 및/또는 항원에의 결합에 대한 그들의 가능한 영향에 기반하여 치환을 위해 선택될 수 있다. 이러한 가능한 영향의 조사는 모델링, 특정 위치에서의 아미노산의 특징의 조사, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 효과의 경험적 관찰에 의한 것이다.
예를 들어, 아미노산이 뮤린 가변 영역 프레임워크 잔기 및 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이에 상이한 경우, 인간 프레임워크 아미노산은, 아미노산이
(1) 항원에 직접적으로 비공유 결합하거나;
(2) CDR 영역에 인접하거나,
(3) 다르게는 CDR 영역과 상호작용하거나 (예를 들어 CDR 영역의 약 6개의 A 내이거나); 또는
(4) 중쇄 및 경쇄 사이의 상호작용을 매개하는 것이 예상되는 경우, 마우스 항체로부터의 등가의 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
2A2 항체는 마우스 항체로서 확인되었지만, 본 출원은 또한 인간 2A2 항체를 포괄한다. 용어 "인간 2A2 항체"는 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열로부터 유래되고, CDR이 뮤린 2A2 항체의 그것과 실질적으로 동일한 CDR을 갖고 유사한 특성, 즉, αvβ6에의 결합 특이성을 나타내는 항체를 의미한다. 일부 측면에서, 인간 2A2 항체는 본원에 기재된 중쇄 가변 영역과 실질적으로 동일한 중쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 경쇄 가변 영역과 실질적으로 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 2A2 항체는 인간 항체가 아니며, 예를 들어, 본 발명의 2A2 항체는 뮤린, 키메라, 또는 인간화 항체이다.
본 발명의 한 측면은 마우스 항체 2A2의 인간화 형태를 제공한다. 마우스 항체 2A2의 한 이러한 인간화 변이체는 HCLG로 지정된다. HCLG는 서열식별번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 인간화 항체는 인간화 중쇄 성숙한 가변 영역이 서열식별번호: 6과 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일성을 나타내고, 인간화 경쇄 성숙한 가변 영역이 서열식별번호:17과 적어도 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 HCLG 인간화 항체의 변이체를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 항체에서 HCLG에서의 역돌연변이의 일부 또는 전부는 보유된다. 다시 말해서, 중쇄 위치 H2, H28, H48, H67, H69, H71, H73, H78, 및 H93 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 바람직하게는 모든 9개는 각각 F, S, I, A, L, V, K, A, 및 T에 의해 점유된다. 마찬가지로, 위치 L69는 바람직하게는 R에 의해 점유되고, L71은 바람직하게는 Y에 의해 점유된다. CDR 영역은 임의의 통상적인 정의 (예를 들어, 코티아)에 의해 정의될 수 있지만, 바람직하게는 카바트 또는 IMGT에 의해 정의된 바와 같다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 서열식별번호: 6의 3개의 CDR 및 서열식별번호: 6의 가변 영역 프레임워크와 적어도 95% 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 인간화 항체는 서열식별번호: 17의 3개의 CDR 및 서열식별번호: 17의 가변 영역 프레임워크와 적어도 95% 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 경쇄를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 인간화 항체는 서열식별번호: 6의 3개의 CDR 및 서열식별번호: 6의 가변 영역 프레임워크와 적어도 98% 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 중쇄, 및 서열식별번호: 17의 3개의 CDR, 및 서열식별번호: 17의 가변 영역 프레임워크와 적어도 98% 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 서열식별번호: 6의 3개의 CDR 및 서열식별번호: 6의 가변 영역 프레임워크와 적어도 99% 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 인간화 항체는 서열식별번호: 17의 3개의 CDR 및 서열식별번호: 17의 가변 영역 프레임워크와 적어도 99% 동일성을 갖는 가변 영역 프레임워크를 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 가능한 변이는 마우스 항체의 CDR에서의 특정 잔기를 인간 CDR 서열로부터의, 전형적으로 예시화된 인간화 항체를 디자인하는데 사용된 인간 수용자 서열의 CDR로부터의 상응하는 잔기로 치환하는 것이다. 일부 항체에서 CDR의 단지 일부, 즉, SDR로 용어화된, 결합에 요구되는 CDR 잔기의 하위세트는 인간화 항체에서 결합을 보유하는데 필요하다. 항원에 접촉하지 않으며 SDR에 있지 않은 CDR 잔기는 분자 모델링에 의해 및/또는 경험적으로, 또는 문헌 [Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863 (2004)]에 기재된 바와 같이, 코티아 초가변 루프 (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987) 외부에 놓인 카바트 CDR의 영역으로부터, 이전의 연구에 기반하여 확인될 수 있다 (예를 들어 CDR H2에서의 잔기 H60 내지 H65는 종종 요구되지 않음). 이러한 인간화 항체에서 하나 이상의 공여자 CDR 잔기가 부재하거나 전체 공여자 CDR이 생략되는 위치에서, 위치를 점유하는 아미노산은 수용자 항체 서열에서 상응하는 위치를 점유하는 아미노산 (카바트 넘버링에 의해)일 수 있다. 포함하기 위한 CDR에서의 공여자 아미노산에 대한 수용자의 이러한 치환의 수는 경쟁하는 고려사항의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화 항체에서의 마우스 아미노산의 수를 감소시키는데 및 결과적으로 잠재적 면역원성을 감소시키는데 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화도의 변화를 유발할 수 있고, 친화도의 유의한 감소는 바람직하게는 회피된다. CDR 내의 치환을 위한 위치 및 치환하기 위한 아미노산은 또한 경험적으로 선택될 수 있다.
바람직하지 않지만 다른 아미노산 치환, 예를 들어, CDR과 접촉하지 않는 프레임워크 잔기, 또는 심지어 CDR 내의 일부 잠재적 CDR-접촉 잔기 아미노산에서 이루어질 수 있다. 종종 변이체 인간화 서열에서 이루어진 대체는 대체된 HCLG 아미노산에 관하여 보존적이다. 바람직하게는, HCLG에 대한 대체 (보존적이든 그렇지 않든)는 결합 친화도 또는 인간화 mAb의 효력, 즉, 인간 αvβ6에 결합하고 암 세포의 성장을 억제하는 그의 능력에 대한 실질적 효과를 갖지 않는다.
불변 영역의 선택
인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 부분에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은 부분적으로 항체-의존성 세포-매개된 세포독성, 항체 의존성 세포성 포식작용 및/또는 보체 의존성 세포독성이 요망되는지 여부에 의존한다. 예를 들어, 인간 이소타입 IgG1 및 IgG3은 강한 보체-의존성 세포독성을 갖고, 인간 이소타입 IgG2는 약한 보체-의존성 세포독성을 갖는다. 인간 IgG4는 보체-의존성 세포독성이 결여된다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매개된 이펙터 기능을 유도한다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 항체는 별개의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결된 단일 쇄 항체로서 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 사량체로서 발현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개체 사이에 동종이형 변이 및 이소동종이형 변이를 나타내며, 즉, 불변 영역은 1개 이상의 다형적 위치에서 상이한 개체에서 상이할 수 있다. 이소동종이형은 이소동종이형을 인식하는 혈청이 1개 이상의 다른 이소타입의 비-다형적 영역에 결합하는 점에서 동종이형과 상이하다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에서의 1개 또는 몇몇 아미노산, 예컨대 중쇄의 C-말단 리신은 소실되거나, 분자의 부분 또는 전부에서 유도체화될 수 있다. 치환은 이펙터 기능, 예컨대 보체-매개된 세포독성 또는 ADCC를 감소시키거나 증가시키기 위해 (예를 들어, 윈터 등, 미국 특허 번호 5,624,821; 츠소(Tso) 등, 미국 특허 번호 5,834,597; 및 문헌 [Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해 (예를 들어, 문헌 [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조) 불변 영역에서 이루어질 수 있다.
예시적인 치환은 시스테인 잔기로의 천연 아미노산의 아미노산 치환이 아미노산 위치 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330, 또는 332에서 도입된 것, 바람직하게는 인간 IgG1 이소타입에서의 S239C 돌연변이를 포함한다 (US 20100158909). 추가의 시스테인 잔기의 존재는 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용한다. 이러한 쇄간 디술피드 결합 형성은 입체 장해를 유발함으로써, Fc 영역-FcyR 결합 상호작용의 친화도를 감소시킬 수 있다. IgG 불변 영역의 Fc 영역에 또는 그에 근접하여 도입된 시스테인 잔기(들)는 또한 치료제에의 접합을 위한 부위로서 기능할 수 있다 (즉, 티올 특이적 시약을 사용한 커플링 세포독성 약물, 예컨대 약물의 말레이미드 유도체). 치료제의 존재는 입체 장해를 유발함으로써, Fc 영역-FcyR 결합 상호작용의 친화도를 추가로 감소시킨다. 임의의 위치 234, 235, 236 및/또는 237에서의 다른 치환은 Fey 수용체, 특히 FcyRI 수용체에 대한 친화도를 감소시킨다 {예를 들어, US 6,624,821, US 5,624,821 참조).
항체의 생체내 반감기는 또한 그의 이펙터 기능에 영향을 미칠 수 있다. 항체의 반감기는 그의 치료 활성을 변형시키도록 증가되거나 감소될 수 있다. FcRn은 β2-마이크로글로불린과 비-공유 회합하는 MHC 부류 I 항원과 구조적으로 유사한 수용체이다. FcRn은 IgG의 이화 및 조직에 걸친 그들의 통과세포외배출을 조절한다 (Ghetie and Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). IgG-FcRn 상호작용은 pH 6.0 (세포내 소포의 pH)에서 일어나지만, pH 7.4 (혈액의 pH)에서는 일어나지 않으며; 이 상호작용은 IgG가 순환으로 다시 재생되는 것을 가능하게 한다 (Ghetie and Ward, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). FcRn 결합에 관여하는 인간 IgG1 상의 영역은 맵핑되었다 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). 인간 IgG1의 위치 Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382, 또는 Asn434에서의 알라닌 치환은 FcRn 결합을 증진시킨다 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). 이들 치환을 갖는 IgG1 분자는 보다 긴 혈청 반감기를 갖는다. 결과적으로, 이들 변형된 IgG1 분자는 비변형된 IgG1에 비해 보다 긴 기간에 걸쳐 그들의 이펙터 기능을 수행할 수 있으며, 따라서 그들의 치료 효능을 발휘할 수 있다. FcRn에의 결합을 증가시키기 위한 다른 예시적인 치환은 위치 250에서의 Gln 및/또는 위치 428에서의 Leu를 포함한다. EU 넘버링은 불변 영역에서의 모든 위치에 대해 사용된다.
보존된 Asn297에 공유 부착된 올리고당류는 FcyR에 결합하는 IgG의 Fc 영역의 능력에 관여한다 (Lund et al., 1996, J. Immunol. 157:4963-69; Wright and Morrison, 199 ', Trends Biotechnol. 15:26-31). IgG에 대한 이 글리코형의 조작은 IgG-매개된 ADCC를 유의하게 개선시킬 수 있다. 이 글리코형에 대한 이등분 N-아세틸글루코스아민 변형의 첨가 (Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotech. Bioeng. 74:288-94) 또는 이 글리코형으로부터의 푸코스의 제거 (Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-40; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:6591-604; Niwa et al., 2004, Cancer Res. 64:2127-33)는 IgG Fc 및 FcyR 사이의 결합을 개선시킴으로써, Ig-매개된 ADCC 활성을 증진시키는 IgG Fc 조작의 2가지 예이다.
인간 IgG1 Fc 영역의 용매-노출된 아미노산의 전신 치환은 변경된 FcyR 결합 친화도를 갖는 IgG 변이체를 생성하였다 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). 모 IgG1과 비교할 경우, Ala에 대한 Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334, 또는 Ser298/Glu333 Lys334에서의 치환을 수반하는 이들 변이체의 하위세트는 FcγR 및 ADCC 활성에 대한 둘 다의 결합 친화도의 증가를 입증한다 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604; Okazaki et al., 2004, J. Mol. Biol. 336:1239-49).
항체의 보체 고정 활성 (Clq 결합 및 CDC 활성 둘 다)은 Lys326 및 Glu333에서의 치환에 의해 개선될 수 있다 (Idusogie et al., 2001 , J. Immunol. 166:2571-2575). 인간 IgG2 백본 상의 동일한 치환은 Clq에 불량하게 결합하고 보체 활성화 활성이 심하게 결핍된 항체 이소타입을 Clq에 결합하고 CDC를 매개하는 둘 다를 할 수 있는 것으로 전환시킬 수 있다 (Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-75). 몇몇 다른 방법은 또한 항체의 보체 고정 활성을 개선시키기 위해 적용되었다. 예를 들어, IgG의 카르복실-말단에의 IgM의 18-아미노산 카르복실-말단 꼬리 조각의 그라프팅은 그들의 CDC 활성을 크게 증진시킨다. 이는 심지어 통상적으로 검출가능한 CDC 활성을 갖지 않는 IgG4로도 관찰된다 (Smith et al., 1995, J. Immunol. 154:2226-36). 또한, IgG 1 중쇄의 카르복시-말단에 가깝게 위치한 Ser444를 Cys로 치환하는 것은 단량체성 IgG1에 비해 CDC 활성의 200배 증가를 갖는 IgG 1의 꼬리-대-꼬리 이량체화를 유도하였다 (Shopes et al., 1992, J. Immunol. 148:2918-22). 또한, Clq에 대한 특이성을 갖는 이중특이적 디아바디 구축물은 또한 CDC 활성을 부여한다 (Kontermann et al., 1997, Nat. Biotech. 15:629-31).
보체 활성은 중쇄의 아미노산 잔기 318, 320, 및 322 중 적어도 하나를 상이한 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대 Ala로 돌연변이시킴으로써 감소될 수 있다. 3개의 잔기 중 어느 하나 대신 다른 알킬-치환된 비-이온성 잔기, 예컨대 Gly, He, Leu, 또는 Val, 또는 Phe, Tyr, Trp 및 Pro와 같은 방향족 비-극성 잔기는 또한 Clq 결합을 감소시키거나 없앨 수 있다. Ser, Thr, Cys, 및 Met는 Clq 결합 활성을 감소시키거나 없애기 위해 잔기 320 및 322 (그러나 318은 아님)에서 사용될 수 있다.
극성 잔기에 의한 318 (Glu) 잔기의 대체는 Clq 결합 활성을 변형시키지만 없애지는 않을 수 있다. 잔기 297 (Asn)을 Ala로 대체하는 것은 용해 활성의 제거를 발생시키지만, Clq에 대한 친화도를 단지 약간 감소시킨다 (약 3배 더 약함). 이 변경은 글리코실화 부위 및 보체 활성화에 요구되는 탄수화물의 존재를 파괴한다. 이 부위에서의 임의의 다른 치환은 또한 글리코실화 부위를 파괴한다. 하기 돌연변이 및 이들의 임의의 조합은 또한 Clq 결합을 감소시킨다: D270A, K322A, P329A, 및 P31 IS (WO 06/036291 참조). L234A/L235A 돌연변이 (또는 LALA 돌연변이)는 또한 C1q 결합, 뿐만 아니라 FcyR 결합을 감소시킨다.
인간 불변 영역에 대한 언급은 임의의 천연 동종이형 또는 천연 동종이형에서 다형적 위치를 점유하는 잔기의 임의의 순열을 갖는 불변 영역을 포함한다. 또한, 최대 1, 2, 5, 또는 10개의 돌연변이, 예컨대 Fc감마 수용체 결합을 감소시키거나 FcRN에의 결합을 증가시키는 상기 지시된 것들은 천연 인간 불변 영역에 비해 존재할 수 있다.
V. 재조합 항체의 발현
인간화 항체는 전형적으로 재조합 발현에 의해 생산된다. 재조합 폴리뉴클레오티드 구축물은 전형적으로 천연-연관된 또는 이종 프로모터 영역을 포함한, 항체 쇄의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵생물 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터에서의 진핵생물 프로모터 시스템이다. 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되었으면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준 발현, 및 교차반응 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지된다.
포유동물 세포는 이뮤노글로불린 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 절편을 발현하기 위한 바람직한 숙주이다. 문헌 [Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]을 참조한다. 무손상 이종 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주는 관련 기술분야에서 개발되었으며, CHO 세포주 (예를 들어, DG44), 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포, 및 Sp2/0 및 NS0을 포함한 비-항체-생산 골수종을 포함한다. 바람직하게는, 세포는 비인간이다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 원점, 프로모터, 인핸서 (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필수적인 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 내인성 유전자, 시토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. 문헌 [Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)]을 참조한다.
발현되면, 항체는 HPLC 정제, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한 관련 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, NY, 1982)] 참조).
VI. 핵산
본 발명은 상기 기재된 임의의 인간화 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 추가로 제공한다. 전형적으로, 핵산은 또한 성숙한 중쇄 및 경쇄에 융합된 신호 펩티드를 코딩한다. 핵산 상의 코딩 서열은 코딩 서열의 발현을 보장하기 위한 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 등과 작동가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 단리된 형태로 발생할 수 있거나, 1종 이상의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 핵산은 예를 들어, 고체 상태 합성 또는 중첩하는 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 예를 들어, 발현 벡터 내의 한 인접한 핵산으로서 결합될 수 있거나, 별개일, 예를 들어, 각각 그 자신의 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
일부 측면에서, 또한, 본원에 기재된 바와 같은 항-αvβ6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산이 본원에서 제공된다. 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 항-αvβ6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에서 제공된다. 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 항-αvβ6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 발현하는 숙주 세포가 본원에서 제공된다. 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 항-αvβ6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에서 제공된다.
본원에 기재된 항-αvβ6 항체는 널리 공지된 발현 벡터 시스템 및 숙주 세포를 사용한 널리 공지된 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 문헌 [De la Cruz Edmunds et al., 2006, Molecular Biotechnology 34; 179-190], EP216846, 미국 특허 번호 5,981,216, WO 87/04462, EP323997, 미국 특허 번호 5,591,639, 미국 특허 번호 5,658,759, EP338841, 미국 특허 번호 5,879,936, 및 미국 특허 번호 5,891,693에 개시된 바와 같은 GS 발현 벡터 시스템을 사용하여 CHO 세포에서 제조된다.
본원에 기재된 모노클로날 항-αvβ6 항체는 예를 들어 문헌 [Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 생산될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352, 624-628 (1991)] 및 [Marks et al., JMol, Biol., 222(3):581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 모노클로날 항체는 임의의 적합한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모노클로날 항체는 예를 들어 표면 상에 항원을 발현하는 세포, 또는 관심의 항원을 코딩하는 핵산의 형태로, 관심의 항원으로 면역화된 마우스로부터 얻어진 뮤린 비장 B 세포로부터 제조된 하이브리도마로부터 얻어질 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 면역화된 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 래트, 개, 영장류 등의 항체-발현 세포로부터 유래된 하이브리도마로부터 얻어질 수 있다.
VII. 항체-약물 접합체
항-αvβ6 항체는 세포독성 또는 세포증식억제 모이어티 (그의 제약상 혼화성 염을 포함함)에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있다. 항체에의 접합을 위한 특히 적합한 모이어티는 세포독성제 (예를 들어, 화학치료제), 프로드러그 전환 효소, 방사성 동위원소 또는 화합물, 또는 독소이다 (이들 모이어티는 집합적으로 치료제로 지칭됨). 예를 들어, 항-αvβ6 항체는 세포독성제, 예컨대 화학치료제, 또는 독소 (예를 들어, 세포증식억제제 또는 세포살해제, 예컨대, 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소)에 접합될 수 있다.
항-αvβ6 항체는 프로-드러그 전환 효소에 접합될 수 있다. 프로-드러그 전환 효소는 공지된 방법을 사용하여 항체에 재조합적으로 융합되거나 그에 화학적으로 접합될 수 있다. 예시적인 프로-드러그 전환 효소는 카르복시펩티다제 G2, 베타-글루쿠로니다제, 페니실린- V-아미다제, 페니실린- G-아미다제, β-락타마제, β-글루코시다제, 니트로리덕타제 및 카르복시펩티다제 A이다.
치료제를 단백질에, 및 특히 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985)]; ["Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985)]; 및 [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58] 참조. 또한 예를 들어 PCT 공개 WO 89/12624 참조.)
치료제는 그것이 항체로부터 절단되지 않는 한, 그의 활성을 감소시키는 방식으로 접합될 수 있다 (예를 들어, 가수분해에 의해, 항체 분해에 의해 또는 절단제에 의해). 이러한 치료제는, 항체가 αvβ6-발현 암 세포에 의해 (예를 들어, 엔도좀에서, 또는 예를 들어 pH 민감성 또는 프로테아제 민감성에 의해, 리소좀 환경에서 또는 소포 환경에서) 내재화되는 경우 접합체가 항체로부터 절단되도록, αvβ6-발현 암 세포의 세포내 환경에서 절단에 민감하지만 세포외 환경에는 실질적으로 민감하지 않은 절단가능한 링커로 항체에 부착된다.
전형적으로 ADC는 치료제 및 항-αvβ6 항체 사이에 링커 영역을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 전형적으로, 링커는 링커의 절단이 세포내 환경에서 (예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀 또는 소포 내에서) 항체로부터 치료제를 방출시키도록, 세포내 조건 하에서 절단가능하다. 링커는 예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함한 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 전형적으로, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123] 참조). 대부분의 전형적인 것은 αvβ6-발현 세포에 존재하는 효소에 의해 절단가능한 펩티딜 링커이다. 예를 들어, 암성 조직에서 고도로 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단가능한 펩티딜 링커 (예를 들어, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 펩티드를 포함하는 링커)가 사용될 수 있다. 다른 이러한 링커는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,214,345에 기재되어 있다. 구체적인 실시양태에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 디펩티드를 포함한다 (예를 들어, Val-Cit 링커로의 독소루비신의 합성을 기재하는 미국 특허 6,214,345 참조). 치료제의 세포내 단백질분해성 방출을 사용하는 것의 한 가지 이점은 작용제가 접합되는 경우 전형적으로 약독화되고, 접합체의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 것이다.
절단가능한 링커는 pH-민감성, 즉, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감성일 수 있다. 전형적으로, pH-민감성 링커는 산성 조건 하에서 가수분해가능하다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해가능한 산-불안정성 링커 (예를 들어, 히드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니트산 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등)가 사용될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123]; [Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661] 참조.) 이러한 링커는 중성 pH 조건, 예컨대 혈액에서의 것들 하에서 상대적으로 안정하지만, 대략 리소좀의 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정하다. 특정 실시양태에서, 가수분해가능한 링커는 티오에테르 링커 (예컨대, 예를 들어, 아실히드라존 결합을 통해 치료제에 부착된 티오에테르 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,622,929 참조))이다.
다른 링커는 환원 조건 하에서 절단가능하다 (예를 들어, 디술피드 링커). 디술피드 링커는 SATA (N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT (N-숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔), SPDB 및 SMPT를 사용하여 형성될 수 있는 것들을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931]; [Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987] 참조. 또한 미국 특허 번호 4,880,935 참조.)
링커는 또한 말로네이트 링커 (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), 또는 3'-N-아미드 유사체 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)일 수 있다. 링커는 또한 말로네이트 링커 (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), 또는 3'-N-아미드 유사체 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)일 수 있다.
링커는 또한 치료제 (예를 들어, 약물)에 직접적으로 부착된 비-절단가능한 링커, 예컨대 말레이미도-알킬렌- 또는 말레이미드-아릴 링커일 수 있다. 활성 약물-링커는 항체의 분해에 의해 방출된다.
링커는 세포 내재화를 촉진시킬 수 있다. 링커는 치료제에 접합되는 경우 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 ADC 또는 ADC 유도체의 링커-치료제 모이어티의 환경에서) 세포 내재화를 촉진시킬 수 있다. 대안적으로, 링커는 치료제 및 항-αvβ6 항체 둘 다에 접합되는 경우 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 ADC의 환경에서) 세포 내재화를 촉진시킬 수 있다.
항-αvβ6 항체는 항체의 헤테로원자를 통해 링커에 접합될 수 있다. 이들 헤테로원자는 그의 자연 상태로 항체 상에 존재할 수 있거나, 항체 내로 도입될 수 있다. 일부 측면에서, 항-αvβ6 항체는 리신 잔기의 질소 원자를 통해 링커에 접합될 것이다. 다른 측면에서, 항-αvβ6 항체는 시스테인 잔기의 황 원자를 통해 링커에 접합될 것이다. 시스테인 잔기는 천연-발생 또는 항체 내로 조작된 것일 수 있다. 링커 및 약물-링커를 리신 및 시스테인 잔기를 통해 항체에 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
예시적인 항체-약물 접합체는 아우리스타틴 기반 항체-약물 접합체 (즉, 약물 성분이 아우리스타틴 약물임)이다. 아우리스타틴은 튜불린에 결합하고, 미세관 역학 및 핵 및 세포 분열을 방해하는 것으로 나타났으며, 항암 활성을 갖는다. 전형적으로 아우리스타틴 기반 항체-약물 접합체는 아우리스타틴 약물 및 항-αvβ6 항체 사이에 링커를 포함한다. 링커는 예를 들어, 절단가능한 링커 (예를 들어, 펩티딜 링커, 탄수화물 링커) 또는 비-절단가능한 링커 (예를 들어, 항체의 분해에 의해 방출되는 링커)일 수 있다. 아우리스타틴은 아우리스타틴 T, MMAF, 및 MMAE를 포함한다 (이에 제한되지는 않음). 예시적인 아우리스타틴의 합성 및 구조는 미국 공개 번호 7,659,241, 7,498,298, 2009-0111756, 2009-0018086, 및 7,968, 687에 기재되어 있으며, 이들의 각각은 그 전문이 및 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 아우리스타틴 기반 항체 약물 접합체는 하기 나타내어진 바와 같은 vcMMAE (또는 1006), vcMMAF 및 mcMMAF 항체 약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하고, 여기서 p는 약물 로드를 나타내고, Ab는 본원에 기재된 바와 같은 항-αvβ6 항체이고, val-cit 또는 "vc"는 발린-시트룰린 디펩티드를 나타낸다:
Figure pct00004
약물 로딩은 p, 즉, 항체 당 약물-링커 분자의 수에 의해 나타내어진다. αvβ6 표적화된 항체-약물 접합체에 관하여, 아래첨자 p는 약물 로드를 나타내고, 맥락에 따라, 개별적 항체 분자에 부착된 약물-링커 분자의 분자의 수를 나타낼 수 있고, 따라서, 정수 값이거나, 또는 평균 약물 로드를 나타낼 수 있고, 따라서 정수 또는 비-정수 값일 수 있지만, 전형적으로 비-정수 값이다. 평균 약물 로드는 집단 중의 항체 당 약물-링커 분자의 평균 수를 나타낸다. 종종, 그러나 항상은 아니지만, 본 발명자들이 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 지칭하는 경우, 본 발명자들은 항체 분자의 집단을 지칭하고 있다. 항체-약물 접합체 분자의 집단을 포함하는 조성물에서, 평균 약물 로드는 그것이 표적 세포에 전달될 수 있는 약물의 양을 결정하기 때문에 중요한 품질 속성이다. 조성물 중의 비접합된 항체 분자의 백분율은 평균 약물 로드 값에 포함된다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 평균 약물 로드는 항체-약물 접합체 화합물의 집단을 포함하는 조성물을 지칭하는 경우 1 내지 약 16, 바람직하게는 약 2 내지 약 14, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 10이다. 한 실시양태에서, DAR은 약 2 내지 약 5이다. 추가의 실시양태에서, DAR은 4이다. 또 다른 실시양태에서, DAR은 약 6 내지 약 10이다. 추가의 실시양태에서, DAR은 8이다. 제제 중의 항체 당 약물의 평균 수는 통상적인 수단, 예컨대 질량 분광법, HIC, ELISA 검정, 및 HPLC에 의해 특징규명될 수 있다. 일부 측면에서, 항-αvβ6 항체는 항체의 시스테인 잔기를 통해 약물-링커에 부착된다. 일부 측면에서, 시스테인 잔기는 항체로 조작된 것이다. 다른 측면에서, 시스테인 잔기는 쇄간 디술피드 시스테인 잔기이다.
일부 실시양태에서, 절단가능한 β-글루쿠로니드 MMAE 약물-링커 내로의 측쇄로서 폴리에틸렌 글리콜 중합체의 혼입은 비-PEG화된 대조군과 비교하여 이종이식 모델에서 감소된 혈장 청소율 및 증가된 항종양 활성을 갖는 항체 약물-접합체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 항체에의 부착을 위한 특히 유리한 약물-링커는 하기와 같이 화학식 V, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
Figure pct00005
이러한 약물-링커에 대한 바람직한 입체화학은 하기 화학식 Va에 나타내어지거나, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
Figure pct00006
상기 식에서 화학식 V 및 Va에 대해, Z는 항체 상의 관능기와 반응하여 그에의 공유 부착을 형성할 수 있는 반응성 부위를 갖는 유기 모이어티를 나타내고, n은 8 내지 36의 범위이고, 가장 바람직하게는 8 내지 14의 범위 (가장 바람직하게는 12)이고, R21은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 캡핑 단위, 바람직하게는- CH3 또는 -CH2CH2CO2H이다.
바람직한 Z 모이어티는 말레이미도-함유 모이어티이다. 특히 바람직한 Z 모이어티는 하기 약물-링커에 나타내어지거나, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
Figure pct00007
이러한 약물-링커에 대한 바람직한 입체화학은 하기에 나타내어지거나, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
Figure pct00008
상기 식에서 화학식 VI, VIa, VII 및 VIIa에 대해, n은 8 내지 36의 범위이고, 가장 바람직하게는 8 내지 14의 범위 (가장 바람직하게는 12)이고, RPR는 수소 또는 보호기, 예를 들어, 산 불안정상 보호기, 예를 들어, BOC이고, R21은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 대한 캡핑 단위, 바람직하게는-CH3 또는 -CH2CH2CO2H이다.
상기 언급된 바와 같이, RPR는 수소 또는 보호기일 수 있다. 본원에 사용된 보호기는 다관능성 화합물에서 반응성 부위를 일시적으로 또는 영구적으로 선택적으로 차단하는 기를 지칭한다. 보호기는 분자 중의 어디에서나 및 목적하는 경우 새롭게 형성된 분자의 정제 동안 목적하는 화학적 변형을 실행하는데 요구되는 반응 조건 하에서 보호기의 원하지 않는 부-반응 또는 조숙한 소실을 방지하거나 회피할 수 있고, 그 새롭게 형성된 분자의 구조 또는 입체화학적 완전성에 유해하게 영향을 미치지 않는 조건 하에서 제거될 수 있는 경우 적합한 보호기이다. 적합한 아민 보호기는 문헌 [Isidro-Llobel et al. "Amino acid-protecting groups" Chem. Rev. (2009) 109: 2455-2504]에 의해 제공된 것들을 포함한 산-불안정성 질소 보호기를 포함한다. 전형적으로, 산-불안정성 질소-보호기는 1차 또는 2차 아미노 기를 그의 상응하는 카르바메이트로 변형시키며, t- 부틸, 알릴, 및 벤질 카르바메이트를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, R21은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 대한 캡핑 단위이다. 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜 단위는 폭넓게 다양한 유기 모이어티, 전형적으로 상대적으로 비-반응성인 것들로 말단 캡핑될 수 있다. 알킬 및 치환된 알킬 기가 바람직하다.
MMAE PEG화된 ADC, 예컨대 본원에 예시화된 것들에 대해, 특히 바람직한 평균 약물 로드는 약 8이다. 예시적인 실시양태에서, 약물-링커는 감소된 쇄간 디술피드의 시스테인 잔기에 접합된다. 일부 측면에서, 항체-약물 접합체 화합물의 집단에서 개별적 항체 분자에 대한 실제 약물 로드는 1 내지 10 (또는 6 내지 10 또는 6 내지 8)이며, 우세한 약물 로딩은 8이다. 보다 높은 약물 로드는 예를 들어, 쇄간 디술피드 외에도, 약물- 링커가 도입된 시스테인 잔기 (예컨대 EU 인덱스에 따라 위치 239에서 도입된 시스테인 잔기)에 접합되는 경우 달성될 수 있다.
예시적인 ADC는 하기 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
상기 식에서 n은 8 내지 36의 범위이고, 가장 바람직하게는 8 내지 14의 범위 (가장 바람직하게는 12)이고, RPR는 수소 또는 보호기, 예를 들어, 산 불안정성 보호기, 예를 들어, BOC이고, R21은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 대한 캡핑 단위, 바람직하게는 -CH3 또는 -CH2CH2CO2H이고, Ab는 항-αVβ6 항체를 나타내고, p는 개별적인 항체 분자를 언급하는 경우 1 내지 16, 바람직하게는 1 내지 14, 6 내지 12, 6 내지 10, 또는 8 내지 10의 범위의 정수 또는 항체 분자의 집단을 언급하는 경우 약 4 또는 약 6 내지 약 14, 바람직하게는 약 8의 평균 약물 로드를 나타낸다.
상기 언급된 바와 같이, 약물 링커의 PEG (폴리에틸렌 글리콜) 부분은 8 내지 36의 범위일 수 있지만, 12개의 에틸렌 옥시드 단위의 PEG는 특히 바람직한 것으로 밝혀졌다. 보다 긴 PEG 쇄는 보다 느린 청소율을 발생시킬 수 있는 반면, 보다 짧은 PEG 쇄는 감소된 활성을 발생시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 모든 실시양태에서 아래첨자 n은 바람직하게는 8 내지 14, 8 내지 12, 10 내지 12 또는 10 내지 14이고, 가장 바람직하게는 12이다.
다분산성 PEG, 단분산성 PEG 및 분리성 PEG는 본 발명의 PEG화 항체 약물 접합체를 제조하는데 사용될 수 있다. 다분산성 PEG는 크기 및 분자량의 이질적 혼합물인 반면, 단분산성 PEG는 전형적으로 이질적 혼합물로부터 정제되고, 따라서 단일 쇄 길이 및 분자량을 제공한다. 바람직한 PEG 단위는 단계별 방식으로 합성되고 중합 프로세스를 통해서 합성되지 않는 화합물인 분리성 PEG이다. 분리성 PEG는 한정되고 특정된 쇄 길이를 갖는 단일 분자를 제공한다. 아래첨자 "p"에 관하여, 항체-약물 접합체의 집단을 지칭하는 경우, 아래첨자 "n"에 대한 값은 평균 수일 수 있고, 정수 또는 비-정수 수일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 약물-링커에의 항체의 공유 부착은 약물 링커의 말레이미드 관능기와 상호작용하여 티오-치환된 숙신이미드를 형성하는 항체의 술프히드릴 관능기를 통해 달성된다. 술프히드릴 관능기는 리간드의 자연 상태에서, 예를 들어, 천연-발생 잔기 (쇄간 디술피드 잔기)에서 리간드 단위 상에 존재할 수 있거나, 또는 화학적 변형을 통해 또는 생물학적 조작에 의해 리간드 내로 도입될 수 있거나, 또는 2가지의 조합이다. 항체-치환된 숙신이미드는 가수분해된 형태(들)로 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, ADC는 항체에 결합되는 경우
Figure pct00012
의 구조에 의해 나타내어지지는 숙신이미드 모이어티로 구성되거나, 또는 항체에 결합되는 경우
Figure pct00013
의 구조에 의해 나타내어지는 그의 상응하는 산-아미드 모이어티로 구성된다.
물결 선은 약물-링커의 나머지에의 연결을 지시한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-αvβ6 항체는 MDpr-PEG(12)-gluc 링커를 통해 모노메틸 아우리스타틴 E에 접합되어 하기 구조를 갖는 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 형성한다:
Figure pct00014
상기 식에서 n은 8 내지 36의 범위이고, 가장 바람직하게는 8 내지 14의 범위 (가장 바람직하게는 12)이고, RPR는 수소 또는 보호기, 예를 들어, 산 불안정성 보호기, 예를 들어, BOC이고, R21은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 대한 캡핑 단위, 바람직하게는 -CH3 또는 -CH2CH2CO2H이고, Ab는 항- αVβ6 항체를 나타내고, p는 개별적 항체 분자를 지칭하는 경우 1 내지 16, 바람직하게는 1 내지 14, 6 내지 12, 6 내지 10, 또는 8 내지 10의 정수 또는 항체 분자의 집단을 지칭하는 경우 약 4 또는 약 6 내지 약 14, 바람직하게는 약 8의 평균 약물 로드를 나타낸다.
예시적인 항체-약물 접합체는 또한 캄프토테신 기반 항체-약물 접합체 (즉, 약물 성분이 캄프토테신 약물임)를 포함한다. 캄프토테신은 항암 활성을 갖는 것으로 나타는 토포이소머라제 억제제이다. 전형적으로 캄프토테신 기반 항체-약물 접합체는 캄프토테신 약물 및 항-αvβ6 항체 사이에 링커를 포함한다. 링커는 예를 들어, 절단가능한 링커 (예를 들어, 펩티딜 링커, 탄수화물 링커) 또는 비-절단가능한 링커 (예를 들어, 항체의 분해에 의해 방출되는 링커)일 수 있다. 예시적인 캄프토테신 약물-링커의 합성 및 구조는 PCT/US19/025968 (2019년 4월 5에 출원됨)에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 및 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 항-αvβ6 항체 약물 접합체는 하기와 같은 캄프토테신 항체 약물 접합체를 포함하고, 여기서 p는 약물 로드를 나타내고, Ab는 항-αvβ6 항체를 나타낸다:
일부 실시양태에서, 캄프토테신 ADC는 화학식 (IC)를 갖거나, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
Figure pct00015
상기 식에서
Ab는 항-αvβ6 항체이고;
y는 1, 2, 3, 또는 4이거나, 또는 1 또는 4이고;
z는 2 내지 12의 정수이거나, 또는 2, 4, 8, 또는 12이고;
p는 1 내지 16이다.
이들 실시양태의 일부 측면에서, p는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 측면에서, p는 2, 4 또는 8이다.
일부 실시양태에서, 캄프토테신 ADC는 하기 화학식을 갖거나, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
Figure pct00016
상기 식에서 p는 2, 4, 또는 8이고, 바람직하게는 p는 8이다.
일부 실시양태에서, 캄프토테신 ADC는 하기 화학식을 갖거나, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
Figure pct00017
상기 식에서 p는 2, 4, 또는 8이고, 바람직하게는 p는 8이다.
일부 실시양태에서, 캄프토테신 약물-링커는 하기 화학식을 갖거나, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
Figure pct00018
상기 식에서
y는 1, 2, 3, 또는 4이거나, 또는 1 또는 4이고;
z는 2 내지 12의 정수이거나, 또는 2, 4, 8, 또는 12이다.
일부 실시양태에서, 캄프토테신 약물-링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00019
MP-PEG8-VKG-캄프토테신
일부 실시양태에서, 캄프토테신 약물-링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00020
MP-PEG4-VKG-캄프토테신
일부 실시양태에서, 캄프토테신 약물-링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00021
MP-PEG12-VKG-캄프토테신
다른 예시적인 항체-약물 접합체는 메이탄시노이드 항체-약물 접합체 (즉, 약물 성분이 메이탄시노이드 약물임), 및 벤조디아제핀 항체 약물 접합체 (즉, 약물 성분이 벤조디아제핀 (예를 들어, 피롤로[l,4]벤조디아제핀 이량체 (PBD 이량체), 인돌리노벤조디아제핀 이량체, 및 옥사졸리디노벤조디아제핀 이량체임))를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 PBD 이량체는 화학식 I에 의해 나타내어진다. PBD 이량체의 바람직한 입체화학은 화학식 Ia에 나타내어진 바와 같거나, 또는 그의 제약상 염, 용매, 또는 염의 용매화물이다:
Figure pct00022
상기 식에서 아래첨자 n은 1 또는 3이다.
화학식 (I) 및 (Ia)의 용매화물은 전형적으로 하나 또는 둘 다의 PBD 단량체의 이민 관능기에 걸쳐 물 또는 알콜성 용매의 첨가로부터 형성되어 카르비놀아민(들) 및/또는 카르비놀아민 에테르를 형성한다. 예를 들어, N10-C11 위치에서, 하기 화학식 I' 및 Ia'로 나타내어진 바와 같은 이민 (N=C), 카르비놀아민 (NH-CH(OH)), 또는 카르비놀아민 에테르 (NH-CH(OMe))가 있을 수 있다:
Figure pct00023
상기 식에서
(a) R10은 H이고, R11은 OH 또는 ORA이고, 여기서 RA는 포화 C1-4 알킬 (바람직하게는 메틸)이거나; 또는
(b) R10 및 R11은 이들이 결합된 질소 및 탄소 원자 사이에 질소-탄소 이중 결합을 형성하거나; 또는
(c) R10 중 하나는 H이고, R11은 OH 또는 ORA이고, 여기서 RA는 포화 C1-4 알킬 (바람직하게는 메틸)이고; R10 중 다른 것 및 R11은 이들이 결합된 질소 및 탄소 원자 사이에 질소-탄소 이중 결합을 형성한다.
화학식 I 또는 la의 PBD 이량체 (또는 그의 제약상 염, 또는 용매화물, 또는 염의 용매화물)는 전형적으로 링커 단위, LU를 통해 항체에 연결된다. 링커 단위는 표적 부위에서 (예를 들어, 암 세포의 내부에서) 화학식 I 또는 la의 PBD 이량체 (또는 그의 제약상 염, 용매화물, 또는 염의 용매화물)를 방출시키도록 작용한다. 본 발명에 사용하기 위한 PBD 약물-링커 화합물은 하기 화학식 II (Ila에 나타내어진 바와 같은 바람직한 입체화학)에 의해 나타내어지거나, 또는 제약상 염, 용매화물, 또는 염의 용매화물이고, 여기서 LU는 링커 단위이다. 링커 단위는 예를 들어, 절단가능한 펩티드 링커 단위 (예를 들어, 발린- 알라닌 펩티드를 포함하는 링커) 또는 절단가능한 디술피드 링커 단위일 수 있다:
Figure pct00024
상기 식에서 아래첨자 n은 1 또는 3이다.
본 발명에 사용하기 위한 바람직한 PBD 약물-링커 화합물은 하기 화학식 III에 의해 나타내어지거나, 또는 제약상 염, 용매화물, 또는 염의 용매화물이다:
Figure pct00025
상기 식에서 아래첨자 n은 1 또는 3이고, 아래첨자 m은 2 내지 5의 정수이다.
PBD 약물-링커는 항-αvβ6 항체에 접합되어 αvβ6 표적화된 항체-약물 접합체를 생산한다. 예를 들어, 항체는 화학식 II 또는 화학식 III의 약물-링커에 접합될 수 있다. 예시적인 αvβ6 표적화된 항체-약물 접합체는 하기 화학식 IV, IVa, 및 IVb에 나타내어지거나, 또는 제약상 염, 용매화물, 또는 염의 용매화물이다:
Figure pct00026
상기 식에서 아래첨자 n은 1 또는 3이고; 아래첨자 m은 2 내지 5의 정수이고; 아래첨자 p는 1 내지 4이다.
항-αvβ6 항체에의 접합체에 대한 세포독성제의 유용한 부류는 예를 들어, 안티튜불린 작용제, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 억제제, 화학요법 민감제 등을 포함한다. 세포독성제의 다른 예시적인 부류는 안트라시클린, 아우리스타틴, 캄프토테신, 듀오카르마이신, 에토포시드, 메이탄시노이드 및 빈카 알칼로이드를 포함한다. 일부 예시적인 세포독성제는 아우리스타틴 (예를 들어, 아우리스타틴 T, 아우리스타틴 E, AFP, 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 친지질성 모노메틸 아우리스타틴 F, 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)), DNA 마이너 그루브 바인더 (예를 들어, 엔디인 및 렉시트롭신), 듀오카르마이신, 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 빈카 알칼로이드, 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제 억제제 (NAMPTi), 튜불리신 M, 독소루비신, 모르폴리노-독소루비신, 및 시아노모르폴리노-독소루비신을 포함한다.
세포독성제는 화학치료제, 예컨대, 예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 멜팔란, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 또는 에토포시드일 수 있다. 작용제는 또한 CC-1065 유사체, 칼리케아미신, 메이탄신, 돌라스타틴 10의 유사체, 리족신, 또는 팔리톡신일 수 있다.
세포독성제는 또한 아우리스타틴일 수 있다. 아우리스타틴은 아우리스타틴 E 유도체, 예를 들어, 아우리스타틴 E 및 케토 산 사이에 형성된 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴은 아우리스타틴 T, AFP, MMAF, 및 MMAE를 포함한다. 다양한 아우리스타틴의 합성 및 구조는 예를 들어, US 2005-0238649 및 US2006-0074008에 기재되어 있다.
세포독성제는 DNA 마이너 그루브 결합제일 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,130,237 참조.) 예를 들어, 마이너 그루브 결합제는 CBI 화합물 또는 엔디인 (예를 들어, 칼리케아미신)일 수 있다.
세포독성제 또는 세포증식억제제는 안티-튜불린 작용제일 수 있다. 안티-튜불린 작용제의 예는 탁산 (예를 들어, 탁솔(Taxol)® (파클리탁셀), 탁소텔(Taxotere)® (도세탁셀)), T67 (툴라릭(Tularik)), 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈), 및 아우리스타틴 (예를 들어, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)을 포함한다. 예시적인 아우리스타틴은 화학식 III 내지 XIII에 하기 나타내어진다. 다른 적합한 안티튜불린 작용제는 예를 들어, 바카틴 유도체, 탁산 유사체 (예를 들어, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜키신 및 콜시미드, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 메이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코데르모이드 및 엘류트로빈을 포함한다.
세포독성제는 안티-튜불린 작용제의 또 다른 군 (예를 들어, DM1, DM2, DM3, DM4)인 메이탄시노이드일 수 있다. 예를 들어, 메이탄시노이드는 메이탄신 또는 메이탄신 함유 약물 링커, 예컨대 DM-1 또는 DM-4 (이뮤노젠, 인크.(ImmunoGen, Inc.); 또한 문헌 [Chari et al., 1992, Cancer Res.] 참조)일 수 있다.
VIII. 치료 적용
본 발명의 항체는, 단독으로 또는 그의 항-αvβ6 항체-약물 접합체로서, 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 이러한 암은 단백질 (예를 들어, 예시된 항체 중 하나를 사용한 면역검정에 의해) 또는 mRNA 수준에서 측정된 αvβ6의 검출가능한 수준을 나타낸다. 일부 이러한 암은 바람직하게는 동일한 환자로부터의 동일한 유형의 비암성 조직에 비해 αvβ6의 상승된 수준을 나타낸다. 치료로 처리될 수 있는 암 세포 상의 αvβ6의 예시적인 수준은 세포 당 5000 내지 500,000개의 αvβ6 분자이지만, 더 높은 또는 더 낮은 수준이 치료될 수 있다. 임의로, 암에서의 αvβ6의 수준은 치료를 수행하기 전에 측정된다.
αvβ6 발현과 연관되고 치료로 처리될 수 있는 암의 예는 비-소세포 폐암 (NSCLC) (편평 및 선), 두경부암 (두경부 편평 암종을 포함함), 식도암, 유방암 (유방 침습성 암종을 포함함), 난소암, 방광암 (요로상피 암종을 포함함), 피부암 (편평 세포 암종, 또는 SCC), 신장암 (신장 투명 세포, 신장 유두 세포, 및 신장 혐색소세포를 포함함), 자궁경부암, 위암, 전립선암 (전립선 선암종을 포함함), 자궁내막암 (자궁 암육종 및 자궁 체부 자궁내막을 포함함), 직장 선암종, 갑상선 암종, 결장 선암종, 위 선암종, 및 췌장암 (췌장 선암종을 포함함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 NSCLC를 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 두경부암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 피부암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 식도암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 유방암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 난소암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 방광암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 자궁경부암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 위암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 신장암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 자궁내막암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 위암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 췌장암을 치료하는 방법에 사용된다. 치료는 이들 종류의 원발성 또는 전이성 종양을 갖는 환자에게 적용될 수 있다. 치료는 또한 통상적인 치료에 불응성이거나, 이러한 치료에 대한 반응 후 재발된 환자에게 적용될 수 있다.
본 발명의 항체, 예컨대 인간화 항체는, 단독으로 또는 그의 접합체로서, 암의 발생을 지연시키고/거나, 중증도를 감소시키고/거나, 추가의 악화를 억제하고/거나, 그의 적어도 1종의 징후 또는 증상을 개선시키는 투여량, 투여의 경로 및 투여의 빈도를 의미하는 유효 요법으로 투여된다. 환자가 이미 암을 앓고 있는 경우, 요법은 치료 유효 요법으로 지칭될 수 있다. 환자가 일반적 집단에 비해 암의 상승된 위험이 있지만, 아직 증상을 경험하고 있지 않은 경우, 요법은 예방 유효 요법으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 치료 또는 예방 효능은 역사적 대조군 또는 동일한 환자에서의 과거 경험에 비해 개별적 환자에서 관찰될 수 있다. 다른 경우에, 치료 또는 예방 효능은 비치료된 환자의 대조군 집단에 비해 치료된 환자의 집단에서 전임상 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다.
모노클로날 항체에 대한 예시적인 투여량은 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg의 환자의 체중, 보다 전형적으로 1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 1 mg/kg 내지 15 mg/kg, 1 mg/kg 내지 12 mg/kg, 또는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg 1, 또는 2 mg/kg 내지 30 mg/kg, 2 mg/kg 내지 20 mg/kg, 2 mg/kg 내지 15 mg/kg, 2 mg/kg 내지 12 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 10 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 30 mg/kg, 3 mg/kg 내지 20 mg/kg, 3 mg/kg 내지 15 mg/kg, 3 mg/kg 내지 12 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 모노클로날 항체 또는 그의 항체 약물 접합체에 대한 예시적인 투여량은 고정 투여량으로서 1 mg/kg 내지 7.5 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 7.5 mg/kg 또는 3 mg/kg 내지 7.5 mg/kg의 대상체의 체중, 또는 0.1 내지 20, 또는 0.5 내지 5 mg/kg 체중 (예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg) 또는 10 내지 1500 또는 200 내지 1500 mg이다. 일부 방법에서, 환자는 3주마다 1회 이상 투여되는 적어도 1.5 mg/kg, 적어도 2 mg/kg 또는 적어도 3 mg/kg의 용량이 투여된다. 투여량은 다른 인자 중에서도 투여의 빈도, 환자의 상태 및 존재하는 경우 사전 치료에 대한 반응, 치료가 예방적인지 치료적인지 여부 및 장애가 급성인지 만성인지 여부에 의존한다.
투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 경막내, 복강내, 국소, 비내 또는 근육내일 수 있다. 투여는 또한 종양 내로 직접적으로 국재화될 수 있다. 정맥내 또는 피하 투여에 의한 전신 순환 내로의 투여가 바람직하다. 정맥내 투여는 예를 들어, 30 내지 90분과 같은 기간에 걸친 주입에 의해 또는 단일 볼루스 주사에 의해서일 수 있다.
투여의 빈도는 다른 인자 중에서도 순환에서의 항체 또는 접합체의 반감기, 환자의 상태 및 투여의 경로에 의존한다. 빈도는 환자의 상태의 변화 또는 치료되는 암의 진행에 반응하여 매일, 매주, 매월, 분기별, 또는 불규칙한 간격으로일 수 있다. 정맥내 투여를 위한 예시적인 빈도는 치료의 연속적 과정에 걸쳐 주 2회 내지 분기별이지만, 보다 더 또는 보다 덜 빈번한 투여가 또한 가능하다. 정맥내 투여를 위한 다른 예시적인 빈도는 치료의 연속적 과정에 걸쳐 매주 또는 4주마다 중 3회이지만, 보다 더 또는 보다 덜 빈번한 투여가 또한 가능하다. 피하 투여를 위해, 예시적인 투여 빈도는 매일 내지 매월이지만, 보다 더 또는 보다 덜 빈번한 투여가 또한 가능하다.
투여되는 투여량의 수는 암의 성질 (예를 들어, 급성 또는 만성 증상을 나타내는지 여부) 및 치료에 대한 장애의 반응에 의존한다. 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 대해 1 내지 10개의 용량이 종종 충분하다. 때때로 임의로 분할된 형태의 단일 볼루스 용량은 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애의 재발 또는 급성 악화에 대해 반복될 수 있다. 만성 장애에 대해, 항체는 규칙적인 간격으로, 예를 들어, 적어도 1, 5 또는 10년, 또는 환자의 생애 동안 매주, 격주로, 매월, 분기별로, 6개월마다 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제약 조성물은 바람직하게는 멸균성 및 실질적으로 등장성이며, GMP 조건 하에서 제조된다. 제약 조성물은 단위 투여 형태 (즉, 단일 투여를 위한 투여량)로 제공될 수 있다. 제약 조성물은 1종 이상의 생리학상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 선택되는 투여의 경로에 의존한다. 주사를 위해, 항체는 수용액에서, 바람직하게는 생리학상 혼화성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리 염수 또는 아세테이트 완충제에서 제형화될 수 있다 (주사의 부위에서의 불편함을 감소시키기 위해). 용액은 제형화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 피로겐-무함유수로의 재구성을 위한 동결건조된 형태일 수 있다. 액체 제형 중의 항체의 농도는 예를 들어, 1 내지 100 mg/ml, 예컨대 10 mg/ml일 수 있다.
본 발명의 항체로의 치료는 화학요법, 방사선, 줄기 세포 치료, 수술, 치료되는 장애에 대해 유효한 다른 치료와 조합될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 αvβ6에 대한 항체 및 항체-약물 접합체와 함께 투여될 수 있는 다른 작용제의 유용한 부류는 예를 들어, 암성 세포 상에 발현되는 다른 수용체에 대한 항체, 안티튜불린 작용제 (예를 들어, 아우리스타틴), DNA 마이너 그루브 바인더, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예를 들어, 플래티넘 복합체, 예컨대 시스플라틴, 모노(플래티넘), 비스(플래티넘) 및 트리-뉴클리어 플래티넘 복합체 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 안티폴레이트, 항대사물, 화학요법 민감제, 듀오카르마이신, 에토포시드, 플루오린화 피리미딘, 이오노포어, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 전-형성 화합물, 퓨린 항대사물, 푸로마이신, 방사선 민감제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다.
임의로 단독으로 또는 항체 약물 접합체로서 상기 기재된 임의의 다른 작용제 또는 요법과 조합으로, 항-αvβ6 항체 또는 항체-약물 접합체로의 치료는 특히 재발성 또는 불응성인 경우, 종양 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC) (편평 및 선), 두경부암 (두경부 편평 암종을 포함함), 식도암, 유방암 (유방 침습성 암종을 포함함), 난소암, 방광암 (요로상피 암종을 포함함), 피부암 (편평 세포 암종, 또는 SCC), 신장암 (신장 투명 세포, 신장 유두 세포, 및 신장 혐색소세포를 포함함), 자궁경부암, 위암, 전립선암 (전립선 선암종을 포함함), 자궁내막암 (자궁 암육종 및 자궁 체부 자궁내막을 포함함), 직장 선암종, 갑상선 암종, 결장 선암종, 위 선암종, 및 췌장암 (췌장 선암종을 포함함))을 갖는 환자의 중위 무진행 생존 또는 전체 생존 시간을 동일한 치료 (예를 들어, 화학요법), 그러나 단독으로 또는 접합체로서 항-αvβ6 항체가 없는 것에 비해, 적어도 30% 또는 40%, 그러나 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 또는 그 초과 증가시킬 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 단독으로 또는 접합체로서 항-αvβ6 항체를 포함하는 치료 (예를 들어, 표준 화학요법)는 종양을 갖는 환자의 완전 반응률, 부분 반응률, 또는 객관적 반응률 (완전 + 부분)을 단독으로 또는 접합체로서 항-αvβ6 항체 없는 동일한 치료 (예를 들어, 화학요법)에 비해 적어도 30% 또는 40%, 그러나 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 증가시킬 수 있다.
전형적으로, 임상 시험 (예를 들어, II상, II/III상 또는III상 시험)에서, 표준 요법 단독 (또는 플러스 위약)을 받은 환자의 대조군에 비해, 표준 요법 플러스 단독으로 또는 접합체로서 항-αvβ6 항체로 치료된 환자의 중위 무진행 생존 및/또는 반응률의 상기 언급된 증가는 예를 들어 p = 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서 통계적으로 유의하다. 완전 및 부분 반응률은 예를 들어, 미국 국립 암 연구소 및/또는 미국 식품의약국에 의해 열거되거나 허용된 바와 같이, 암에 대한 임상 시험에서 통상적으로 사용되는 객관적 기준에 의해 결정된다.
IX. 제조품 및 키트
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 항-αvβ6 항체 또는 항-αvβ6 항체-약물 접합체를 포함하는 제조품 또는 키트가 제공된다. 제조품 또는 키트는 본 발명의 방법에서의 본원에 기재된 항-αvβ6 항체 또는 항-αvβ6 항체-약물 접합체의 사용을 위한 지시서를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 제조품 또는 키트는 본원에 기재된 항-αvβ6 항체 또는 항-αvβ6 항체-약물 접합체의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC) (편평 및 선), 두경부암 (두경부 편평 암종을 포함함), 식도암, 유방암 (유방 침습성 암종을 포함함), 난소암, 방광암 (요로상피 암종을 포함함), 피부암 (편평 세포 암종, 또는 SCC), 신장암 (신장 투명 세포, 신장 유두 세포, 및 신장 혐색소세포를 포함함), 자궁경부암, 위암, 전립선암 (전립선 선암종을 포함함), 자궁내막암 (자궁 암육종 및 자궁 체부 자궁내막을 포함함), 직장 선암종, 갑상선 암종, 결장 선암종, 위 선암종, 및 췌장암 (췌장 선암종을 포함함))을 치료하는 방법에서 본원에 기재된 항-αvβ6 항체 또는 항-αvβ6 항체-약물 접합체의 사용을 위한 지시서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 NSCLC이다. 일부 실시양태에서, 암은 두경부암이다. 일부 실시양태에서, 암은 식도암이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 난소암이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 신장암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 자궁내막암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 접합체는 위암을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 피부암이다. 일부 실시양태에서, 암은 자궁경부암이다. 일부 실시양태에서, 암은 위암이다. 일부 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
제조품 또는 키트는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 보틀, 바이알 (예를 들어, 이중 챔버 바이알), 시린지 (예컨대 단일 또는 이중 챔버 시린지) 및 시험 튜브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 바이알이다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 제형을 보유한다.
제조품 또는 키트는 용기 상에 있거나 그와 회합된, 제형의 재구성 및/또는 사용을 위한 지시를 지시할 수 있는 표지 또는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물은 제형이 대상체에서 암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC) (편평 및 선), 두경부암 (두경부 편평 암종을 포함함), 식도암, 유방암 (유방 침습성 암종을 포함함), 난소암, 방광암 (요로상피 암종을 포함함), 피부암 (편평 세포 암종, 또는 SCC), 신장암 (신장 투명 세포, 신장 유두 세포, 및 신장 혐색소세포를 포함함), 자궁경부암, 위암, 전립선암 (전립선 선암종을 포함함), 자궁내막암 (자궁 암육종 및 자궁 체부 자궁내막을 포함함), 직장 선암종, 갑상선 암종, 결장 선암종, 위 선암종, 및 췌장암 (췌장 선암종을 포함함))을 치료하기 위한 피하, 정맥내 (예를 들어, 정맥내 주입), 또는 투여의 다른 방식을 위해 유용하거나 의도됨을 추가로 지시할 수 있다. 제형을 보유하는 용기는 단일-사용 바이알 또는 재구성된 제형의 반복 투여를 허용하는 다중-사용 바이알일 수 있다. 제조품 또는 키트는 적합한 희석제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품 또는 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용을 위한 지시서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한, 상업적, 치료적, 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본원의 제조품 또는 키트는 임의로 제2 의약을 포함하는 용기를 추가로 포함하고, 여기서 항-αvβ6 항체 또는 항-αvβ6 항체-약물 접합체는 제1 의약이고, 물품 또는 키트는 유효량으로 제2 의약으로 대상체를 치료하기 위한 표지 또는 패키지 삽입물 상의 지시서를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 의약은 1종 이상의 유해 사건의 중증도를 제거하거나 감소시키기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 항-αvβ6 항체 또는 항-αvβ6 항체-약물 접합체는 동결건조된 분말로서 용기에 존재한다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 분말은 활성제의 양을 지시하는 기밀하게 밀봉된 용기, 예컨대 바이알, 앰풀 또는 사세에 있다. 제약이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰풀은 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 예를 들어, 임의로 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는 바람직한 경우, 다양한 통상적인 제약 성분 중 1종 이상, 예컨대, 예를 들어, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것인 바와 같이, 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 갖는 용기, 추가의 용기 등을 추가로 포함할 수 있다. 투여되는 성분의 양, 투여를 위한 지침, 및/또는 성분을 혼합하기 위한 지침을 지시하는 삽입물로서 또는 표지로서 인쇄된 지시서는 또한 키트에 포함될 수 있다.
X. 다른 적용
본원에 기재된 항-αvβ6 항체, 예컨대 인간화 항-αvβ6 항체는 임상적 진단 또는 치료의 맥락에서 또는 연구에서 αvβ6을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 암 상의 αvβ6의 발현은 암이 본 발명의 항체로의 치료로 처리될 수 있다는 지시를 제공한다. 항체는 또한 αvβ6을 함유하는 세포 및 다양한 자극에 대한 그들의 반응을 검출하는데 있어서 실험실 연구를 위한 연구 시약으로서 판매될 수 있다. 이러한 용도에서, 모노클로날 항체는 형광 분자, 스핀-표지된 분자, 효소 또는 방사성동위원소로 표지될 수 있고, αvβ6에 대한 검정을 수행하기 위한 모든 필수적인 시약을 갖는 키트의 형태로 제공될 수 있다. 본원에 기재된 항체는 αvβ6 단백질 발현을 검출하고, 암이 αvβ6 ADC로의 치료로 처리될 수 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
상기 또는 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 간행물, 수탁 번호 등은 각각의 개별적 항목이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 서열의 상이한 버전이 상이한 시간에서 수탁 번호와 연관되는 경우, 본 출원의 유효 출원일에서의 수탁 번호와 연관된 버전이 의미된다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 적용가능한 경우 수탁 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 중 보다 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로, 간행물, 웹사이트 등의 상이한 버전이 상이한 시간에서 공개되는 경우, 달리 지시되지 않는 한, 본 출원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전이 의미된다. 본 발명의 임의의 특색, 단계, 요소, 실시양태, 또는 측면은 구체적으로 달리 지시되지 않는 한, 임의의 다른 것과 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명은 명확성 및 이해의 목적으로 예시 및 예에 의해 일부 상세하게 기재되었지만, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구항의 범위 내에서 실시될 수 있음이 명백할 것이다.
실시예
물질
하기 실시예에 기재된 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC), 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute) (NCI) 또는 독일 브라운슈바이크의 도이치 삼룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (DMSZ)에 의해 특정된, 또는 달리 공지된 바와 같은 조건에 따라 배양에서 유지되었다. SW780 세포주, 디트로이트 562 세포주, HPAFII 세포주, 및 BxPC3 세포주는 ATCC로부터 얻었다. 프리스타일(FreeStyle)™ 293-F (인비트로젠 코포레이션(InVitrogen Corp)) 인간 상피 신장 세포 및 상응하는 형질감염체를 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 유지하였다. 세포 배양 시약은 인비트로젠 코포레이션. (미국 캘리포니아주 칼스배드), 몰리큘라 디바이시즈(Molecular Devices) (미국 캘리포니아주 서니데일) 및 다른 공급업체로부터 얻었다. 2차 항체 시약은 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories) (미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)로부터 구입하였다. 재조합 αvβ1, αvβ3 αvβ5, αvβ6, 및 αvβ8은 알앤디 시스템즈(R&D Systems) (미국 미네소타주 미네아폴리스)로부터 구입하였다. 프리스타일™ 293-F 세포는 내인성 인테그린 αv를 발현하며, 이들을 인간, 시노몰구스 또는 뮤린 인테그린 β6을 코딩하는 전장 cDNA로 형질감염시켜 각각 HEK293F:huβ6, HEK293F:시노β6 및 HEK293F:muβ6 세포주를 생성하였다. 비어 있는 벡터로 형질감염된 HEK293F 세포 (HEK293F:벡터)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 내인성 마우스 인테그린 αv를 발현하는 마우스 3T3 및 FDC-P1 세포를 인간 및 마우스 인테그린 β6에 대한 전장 cDNA 클론으로 형질감염시켜 각각 3T3:huβ6 및 FDC-P1:muβ6을 생성하였다.
방법론:
2A2 항체의 생성
ICR (CD-1) 마우스를 ~5 x 106개의 3T3:huβ6 형질감염체의 복강내 주사로 3회 면역화하였다. 융합 전 3일에, 마우스는 정맥내로 (6 ug) 및 복강내로 (30 ug) 주어진 정제된 재조합 인간 αvβ6의 최종 주사를 받았다. 비장 및 림프절로부터 수거된 림프구를 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 P3X63Ag8.653 골수종 세포에 융합시켰다. 융합된 세포를 하이브리도마 성장 배지 (4 mM 글루타민, 10% 태아 클론 I, 10% 클로닝 인자 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 IMDM)에서 밤새 회수하였다. 회수 후, 세포를 스핀 다운시키고, 이어서 반-고체 배지에 플레이팅하였다. 반-고체 배지는 하이브리도마 성장 배지 더하기 하이브리도마 선택을 위한 HAT 및 IgG-생산을 위한 클론디텍트(CloneDetect)로 보충된 클론매트릭스(CloneMatrix) 배지로 이루어졌다. 하이브리도마를 37℃에서 10일 동안 인큐베이션하였다. 제10일에, IgG 생산 하이브리도마 클론을 클론PixFL (몰리큘라 디바이시즈)를 사용하여 집어 내고, IgG-고갈된 하이브리도마 성장 배지 더하기 HT를 함유하는 96-웰 플레이트로 옮겼다. 하이브리도마 배양 상청액을 293F:huβ6 형질감염체에 대해 스크리닝하고, 양성 클론을 검출을 위한 알렉시플루오르(Alexifluor)-647 표지된 2차 항체를 사용하여 확인하였다. 플레이트를 FMAT 8200 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에서 판독하였다. 293F:huβ6 및 293F:시노β6에 결합되지만 293F:벡터에는 결합되지 않은 하이브리도마를 약물-링커에의 직접적 접합을 위해 확장시켰다. 직접적으로 접합된 항체 패널을 결합 및 세포독성 검정에서 시험하였다.
LAP 차단 ELISA
96-웰 미세역가 플레이트 (눈크(Nunc))를 1x PBS 중 0.3 ug/mL 재조합 인간 잠재성-연관된 펩티드 (rhuLAP) (인-하우스 제조됨; 로트 09-19-09DS)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 용액의 제거 후, 플레이트를 트리스(Tris)-완충 염수 (TBS) 중 3% BSA로 실온에서 1시간 동안 차단하고, 이어서 사용 전에 PBS+0.05% 트윈(Tween)-20 (PBST)로 5x 세척하였다. 별개의 원뿔형 바닥 96-웰 플레이트에서, 0.25 ug/mL의 재조합 인간 (rhu) αvβ6-비오틴 (인 하우스 제조된 rhuαvβ6-비오틴, 로트 #171030A)을 실온에서 1시간 동안 1 mM CaCl2, 1mM MgCl2 및 1 mg/mL BSA를 함유하는 TBS 완충제 중 증가하는 농도의 정제된 항체로 실온에서 1시간 동안 사전-인큐베이션하였다. 이어서 항체/αvβ6-비오틴 혼합물을 LAP-코팅된 플레이트에 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하고, 실온에서 1시간 동안 TBS+1mg/mL BSA에 1:1000 희석된 50 uL/웰의 퍼옥시다제 접합된 스트렙타비딘 (잭슨 이뮤노리서치 #016-030-084)과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 단백질 및 신호를 5.5분 동안 인큐베이션된 TMB (인비트로젠 #00-2023)를 사용하여 검출하고, 이어서 1N H2SO4 (피셔(Fisher) #SA212-1)로 켄칭하였다. 플레이트를 450nm 파장에서 플레이트 판독기 (몰리큘라 디바이시즈 Vmax 키네틱 마이크로플레이트 리더(Kinetic Microplate Reader)) 상에서 즉시 판독하였다. 데이터를 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 내로 보내고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v5.03을 사용하여 분석하였다.
경쟁 결합 검정 - 인간화 2A2 항체 변이체
경쟁 결합 검정을 293F:huβ6 세포주를 사용하여 수행하였다. 0.1 x 106개의 항원 발현 세포를 얼음 상의 96-웰 v-바닥 플레이트의 각각의 웰에서 분취하였다. 세포를 FACS 완충제 (트리스-완충 염수, 2% 소 태아 혈청, 0.5 mM MnCl2, 0.02% NaN3)에서 2 nM 알렉사플루오르(AlexaFluor)-647 표지된 m2A2 및 증가하는 농도 (0.03 내지 500 nM)의 비표지된 인간화 2A2 변이체 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 펠릿화하고, TBS/FBS로 3회 세척하였다. 세포를 펠릿화하고, 125uL의 TBS/FBS에 재현탁시켰다. 결합의 형광 신호를 벡톤 디킨슨 바이오사이언시즈(Becton Dickinson Biosciences) LSR II (미국 캘리포니아주 산 호세)를 사용하여 검출하였다. 포화 형광 신호의 퍼센트를 사용하여 결합된 퍼센트 표지된 인간화 2A2 항체를 결정하고, 이어서 데이터를 그래프패드 소프트웨어 (미국 캘리포니아조 라호이아)를 사용하여 가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응 곡선에 적합시킴으로써 EC50을 외삽하였다.
경쟁 결합 검정 - 인간 및 시노 αvβ6
경쟁 결합 검정을 293F:huβ6 및 HEK293F:시노β6 세포주를 사용하여 수행하였다. 0.1 x 106개의 항원 발현 세포를 얼음 상의 96-웰 v-바닥 플레이트의 각각의 웰에서 분취하였다. 세포를 완충제 (트리스-완충 염수, 2% 소 태아 혈청, 0.5 mM MnCl2, 0.02% NaN3)에서 2 nM 알렉사플루오르-647 표지된 인간화 2A2 HCLG 및 증가하는 농도 (4 pM 내지 1 uM)의 비표지된 인간화 2A2 HCLG 항체 및 h2A2-Mdpr-PEG(12)-gluc-MMAE(8)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 펠릿화하고, TBS/FBS로 3회 세척하였다. 세포를 펠릿화하고, 125 uL의 TBS/FBS에 재현탁시켰다. 결합의 형광 신호를 벡톤 디킨슨 바이오사이언시즈 LSR II (미국 캘리포니아주 산 호세)를 사용하여 검출하였다. 포화 형광 신호의 퍼센트를 사용하여 세포에 결합된 퍼센트 표지된 인간화 2A2 항체를 결정하고, 이어서 데이터를 그래프패드 소프트웨어 (미국 캘리포니아조 라호이아)를 사용하여 가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응 곡선에 적합시킴으로써 EC50을 외삽하였다.
αvβ6 포화 결합 검정 - 인간 및 시노 αvβ6
포화 결합 연구를 하기 항원 발현 세포주를 사용하여 수행하였다: 293F:huβ6 및 293F:시노β6. 0.1 x 106개의 항원 발현 세포를 96-웰 v-바닥 플레이트 내로 웰 당 분취하였다. m2A2 및 h2A2 HCLG를 알렉사플루오르-647로 직접적으로 표지하고, 완충제 (트리스-완충 염수, 2% 소 태아 혈청, 0.5 mM MnCl2, 0.02% NaN3) 중 6 pM 내지 340 nM의 범위의 농도에서 세포에 첨가하였다. 세포를 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 펠릿화하고, TBS로 3회 세척하였다. 세포를 펠릿화하고, 120 uL의 TBS에 재현탁시켰다. 결합의 형광 신호를 벡톤 디킨슨 바이오사이언시즈 LSR II (미국 캘리포니아주 산 호세)를 사용하여 검출하였다. EC50을 그래프패드 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 라호이아)를 사용하여 계산하였다.
ELISA
96-웰 막시소르브(Maxisorb) 플레이트 (눈크)를 50 mM 카르보네이트 완충제 (시그마(Sigma), 미국 미주리주)에 희석된 1 ug/ml의 재조합 인간 αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 and αvβ8 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈 20 (PBS-T)으로 세척하였다. 세척 완충제를 제거하고, 플레이트를 TBS 차단 완충제 (TBS, 0.05% 트윈 20, 1% BSA)에서 실온에서 2시간 동안 차단하였다. 플레이트를 세척하고, 이어서 1 pM 내지 67 nM (10 ug/ml)의 범위인 농도에서 TBS 결합 완충제 (TBS, 0.05% Tween 20, 1% BSA, 1 mM MnCl2)에 희석된 인간화 2A2 항체와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 항-인간 Fc-HRP (잭슨 이뮤노리서치, 미국 펜실베니아주)의 1:5000 희석물과 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 이어서 TMB 기재와 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 1 M HCl로 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 퓨전(Fusion) HT 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 판독하였다.
정량적 유동 세포계측 분석
세포 표면 상의 αvβ6 카피 수의 정량화를 1차 항체로서 뮤린 αvβ6 mAb 및 다코(DAKO) 콰이파이키트(QiFiKit) 유동 세포계측 간접적 검정을 제조업체 (다코 에이/에스(DAKO A/S), 덴마크 글로스트럽)에 의해 기재된 바와 같이 사용하여 결정하고, 벡톤 디킨슨 FACScan 유동 세포계측기로 평가하였다.
시험관내 세포독성 검정
종양 세포를 37℃에서 96시간 동안 항-αvβ6 항체 약물 접합체와 함께 인큐베이션하였다. 세포 생존율을 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 검정 (프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 미국 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 결정하고, 결과를 엔비젼 멀티라벨(EnVision Multilabel) 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머, 미국 매사추세츠주 월섬) 상에서 측정하였다. 결과는 적정 곡선의 과정에 걸쳐 절반 최대 성장 억제를 발생시키는 농도로서 정의되는 IC50으로서 보고된다.
항체-약물 접합체의 생산
항-αvβ6 항체의 항체 약물 접합체를 US20050238649 및 WO2015/057699에 기재된 바와 같이 제조하였다. 약물 링커 vcMMAE (또한 1006으로 공지됨) 및 mcMMAF는 둘 다 US20050238649에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다. 약물 링커 MDpr-Lys(PEGx)-글루쿠로니드-MMAE 링커는 WO2015/057699에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
생체내 활성 연구
세포주 유래된 이종이식에서의 요법 실험을 위해, 5x106개의 세포 (ATCC)를 BxPC3, 디트로이트 562, HPAF-II, 및 SW780 연구를 위해 5 내지 8마리의 암컷 누드 (nu/nu) 마우스 (엔비고(Envigo)) 내로 피하로 주사하였다. 마우스를 연구 군으로 무작위로 나누고, 종양이 대략 100 mm3에 도달하였으면 시험품으로 복강내 주사를 통해 투여하였다. 종양 부피가 500 내지 1000 mm3에 도달하였을 때 동물을 안락사시켰다. 종양 부피를 식 (부피 = ½ x 길이 x 폭 x 폭)으로 계산하였다. 오래 가는 퇴행을 나타내는 마우스를 삽입 후 대략 제40일 내지 제65일에 종결시켰다. 모든 이종이식 연구에서, 임의의 시험품으로 처리된 마우스에 대해 체중 감소 또는 처리-관련된 독성은 관찰되지 않았다. 모든 동물 절차는 실험실 동물 관리 평가 및 인가 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)에 의해 인가된 시설에서 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜 하에서 수행하였다.
세포주 유래된 이종이식 외에도, 비-소세포 폐암 (NSCLC)의 환자-유래된 이종이식 (PDX) 모델에 대한 h2A2 vcMMAE ADC의 항종양 활성을 챔피온스 온콜로지(Champions Oncology) (미국 뉴저지주 해컨색)에 의해 유지된 모델을 사용하여 연구하였다. 이들 PDX 모델은 선 및 편평 조직학 둘 다의 NSCLC 샘플을 포함한다. 이들 모델을 면역손상된 마우스에서의 삽입에 의해 확립하고, 150 내지 300 mm3의 종양 부피로 성장시키고, 이어서 마우스를 처리군 및 대조군으로 무작위화하고, h2A2 vcMMAE 또는 비-결합 대조군 h00 vcMMAE ADC로 투여하였다. 마우스를 3 mg/kg의 ADC로 매주 총 3개의 용량에 대해 투여하였다. 종양 부피를 제1 용량 후 28일 동안, 또는 종양이 1500 mm3의 부피에 도달할 때까지 매주 2회 측정하였다.
h2A2 vcMMAE ADC의 항종양 활성을 챔피온스 온콜로지 (미국 뉴저지주 해컨색)에 의해 유지된 난소 암종 모델의 PDX 모델에서 추가로 평가하였다. 이들 모델을 면역손상된 마우스에서의 삽입에 의해 확립하고, 150 내지 300 mm3의 종양 부피로 성장시키고, 이어서 마우스를 처리군 및 대조군으로 무작위화하고, ADC로 투여하였다. 마우스를 5 mg/kg의 ADC로 매주 총 3개의 용량에 대해 투여하였다. 종양 부피를 제1 용량 후 28일 동안, 또는 종양이 1500 mm3의 부피에 도달할 때까지 최대 60일까지 매주 2회 측정하였다.
결과
뮤린 클론 m2A2는 그것이 다수의 αvβ6-양성 종양 세포주에 대한 ADC로서의 세포독성 활성을 나타내고, 그것이 항원의 인간 및 시노몰구스 형태와 필적하는 친화도를 가졌기 때문에 하이브리도마 패널로부터 선택되었다. 마우스 2A2의 특이성을 FMAT 및 유동 세포계측법 결합 연구에서 확인하였으며, 여기서 항체는 293F:huβ6 형질감염체에 결합하지만, αvβ5-양성 모 주 (293F:벡터)에는 결합하지 않는 것으로 나타났다. 인테그린 αvβ6은 피브로넥틴 (Weinacker et al., 1994), 테나신 (Prieto et al., 1993), 비트로넥틴 (Huang et al. 1998) 및 잠재성-연관된 펩티드 (LAP) (Munger et al. 1999)에서 RGD 부위에 대한 수용체인 것으로 나타났다. LAP에의 인테그린 αvβ6의 결합은 형질전환 성장 인자 베타1 (TGFβ)의 공간적으로 제한된 활성화를 유도할 수 있다 (Munger et al. 1999). 잠재성-연관된 펩티드 (LAP) 차단 검정을 수행하였으며 (도 1), 이는 m2A2 (SG-44.2A2)가 항-αvβ6 항체 m15H3 (SG-42.15H3) (WO2013/123152 참조) 및 양성 대조군 10D5와 대조적으로 LAP를 차단하지 않음을 나타낸다. 이는 2A2 항체가 리간드 결합과 독립적으로 전달될 수 있음을 시사한다. 음성 대조군은 비-결합 IgG 대조군이었고, SG-44.8B9, SG-33.20B8, SG-44.32A6, 및 SG-44.34D6은 하이브리도마 패널로부터 선택된 다른 클론이었다.
마우스 항체의 결합
뮤린 모노클로날 항체 2A2의 결합에 대한 EC50을 유전자 조작된 세포주 (293F:huβ6, 293F:시노β6)를 사용한 포화 결합 연구에 의해 인간 및 시노 αvβ6에 대해 결정하였다 (도 2). 유전자 조작된 세포주는 재조합 β6 쇄와 쌍형성하는 내인성 αv를 발현하여 내인성 αv 및 재조합 β6으로 구성된 이종이량체성 수용체를 생산한다.
인간화 항체의 디자인 및 선택
이 실시예에서 인간화를 위한 출발점 또는 공여자 항체는 뮤린 2A2 항체이다. 중쇄에 대해 IGHV1-46 및 IGHJ4에 의해 및 경쇄에 대해 IGKV1D-33 및 IGKJ2에 의해 제공된 게놈 서열을 사용하였다.
인간화에서, 10개의 위치가 중쇄 프레임워크 (H2, H28, H48, H67, H69, H71, H73, H74, H78, H93; 도 3)에서 확인되었고, 2개의 위치가 경쇄 프레임워크 (L69 및 L71; 도 4)에서 확인되었으며, 여기서 인간 수용자 서열은 공여자 서열과 상이하였고, 항원에 직접적으로 접촉하는 것의 결과로서 항체 결합에 영향을 미쳐, CDR의 형태에 영향을 미치거나 중쇄 및 경쇄 사이의 패킹에 영향을 미칠 수 있다. 이들 위치의 상이한 순열에서 역 돌연변이를 혼입하는 4개의 인간화 중쇄 변이체 (vHA, vHB, vHC, vHD; 도 3) 및 8개의 인간화 경쇄 변이체 (vLA, vLB, vLC, vLD, vLE, vLF, vLG, vLH; 도 4)를 제조하였다. 이들 역 돌연변이는 표 1 내지 4에 특정된다. 프레임워크 위치의 나머지는 인간 수용자 서열로부터의 잔기에 의해 점유된다.
표 1: h2A2 중쇄 변이체에서의 돌연변이의 인간화
Figure pct00027
표 2: h2A2 중쇄 변이체에서의 특이적 뮤린 프레임워크 돌연변이
Figure pct00028
표 3: h2A2 카파 경쇄 변이체에서의 돌연변이의 인간화
Figure pct00029
표 4: h2A2 카파 경쇄 변이체에서의 특이적 뮤린 프레임워크 돌연변이
Figure pct00030
이어서 이들 인간화 중쇄 및 경쇄 변이체의 조합적 순열을 나타내는 인간화 항체를 발현시켰다. 인간 αvβ6에 대한 생성된 인간화 항체 변이체 (뮤린 2A2 항체 및 인간-뮤린 키메라 항체와 함께)의 경쟁 결합 곡선은 도 5 내지 7에 나타내어진다. 4개의 인간화 변이체를 시험관내 활성 검정에서 추가의 분석을 위해 선택하였다. 인간화 변이체 HCLE, HCLG, HCLH, HALG, 및 인간화 항-αvβ6 항체 15H3-HTLC (각각 약물-링커에 접합됨. Via, n=12, RPR=H, R21=CH3)의 시험관내 항암 활성을 정량적 유동 세포계측법 분석에 기반하여 다양한 수준에서 αvβ6을 발현하는 4개의 세포주 (췌장암 HPAFII 및 BxPC-3 세포, 두경부암 디트로이트 562 세포, 및 방광암 SW780 세포)에서 세포독성 검정을 사용하여 측정하였다. 결과는 표 5에 나타내어진다.
표 5: 시험관내 활성 검정 (x50, nM)
Figure pct00031
중쇄 변이체 hvHC 및 경쇄 변이체 hvLG를 포함하는 인간화 변이체 (h2A2 HCLG)를 추가의 연구를 위해 선택하였다.
인간 및 시노 αvβ6 둘 다에의 h2A2 HCLG의 결합을 참조물로서 모 뮤린 2A2를 포함한 포화 결합에 의해 확인하여 (도 8), 그것과 인간화 변이체 사이의 필적하는 결합을 입증하였다. 인간 및 시노 αvβ6 둘 다에의 h2A2 HCLG의 결합을 또한 형광 표지된 뮤린 2A2에 대한 경쟁 결합에 의해 확인하였다 (도 9). 이 검정은 또한 항체 쇄간 디술피드 및 약물-링커의 8개의 카피의 접합을 감소시킴으로써 h2A2 HCLG 및 SGD-5088 약물-링커로 제조된 ADC의 결합을 포함하였다. 접합 프로세스는 인간 또는 시노로부터의 αvβ6에의 결합에 대한 영향을 갖지 않았다. h2A2 HCLG의 결합 특이성을 또한 ELISA에 의해 확인하였으며, 여기서 항체는 재조합 인간 αvβ6에 결합하였지만, αvβ1, αvβ3, αvβ5, 또는 αvβ8에는 결합하지 않았다 (도 10).
h2A2 ADC의 시험관내 항암 활성
vcMMAE에 접합된 경우 인간화 변이체 HCLG의 시험관내 항암 활성을 정량적 유동 세포계측법 분석에 기반하여 다양한 수준에서 αvβ6을 발현하는 4개의 세포주 (췌장암 HPAFII 및 BxPC-3 세포, 두경부암 디트로이트 562 세포, 및 방광암 SW780 세포)에서 세포독성 검정을 사용하여 측정하였다. 도 11은 인간화 2A2 항-αvβ6 ADC가 이들 검정에서 세포 살해 거동을 나타내었음을 나타낸다.
h2A2 ADC의 생체내 항암 활성
시험관내에서 시험된 동일한 4개의 세포주를 사용하여, 시험관내에서 vcMMAE와 접합된 인간화 2A2 HCLG 항체 (항체 당 평균 4개의 약물)의 항-종양 활성 (도 12 내지 15)을 입증하였다. 비처리 및 비-결합 대조군 ADC에 비해 유의한 종양 성장 지연 또는 종양 퇴행이 관찰되었다. h2A2 HCLG-1006(4)은 항체 당 평균 4개의 vcMMAE 약물 링커 분자를 갖는 모 뮤린 항체 2A2의 HCLG 인간화 형태의 항체 약물 접합체를 지칭한다. h00-1006 (4)은 항체 당 평균 4개의 vcMMAE 약물 링커 분자를 갖는 비결합 대조군 항체의 항체 약물 접합체를 지칭한다. NSCLC의 PDX 모델에서, vcMMAE와 접합된 인간화 2A2 HCLG 항체 (항체 당 평균 4개의 약물)는 또한 항-종양 활성을 나타내었다 (도 16). 비처리 및 비-결합 대조군 ADC에 비해 유의한 종양 성장 지연 또는 종양 퇴행이 관찰되었다. h2A2 HCLG-1006 (4)은 항체 당 평균 4개의 vcMMAE 약물 링커 분자를 갖는 모 뮤린 항체 2A2의 HCLG 인간화 형태의 항체 약물 접합체를 지칭한다. h00-1006 (4)은 항체 당 평균 4개의 vcMMAE 약물 링커 분자를 갖는 비결합 대조군 항체의 항체 약물 접합체를 지칭한다.
난소 암종의 PDX 모델에서, vcMMAE와 접합된 인간화 2A2 HCLG 항체 (항체 당 평균 4개의 약물)는 또한 항-종양 활성을 나타내었다 (도 17). 비처리된 종양에 비해 유의한 종양 성장 지연 또는 약간의 종양 감소가 관찰되었다. h2A2 HCLG-1006 (4)은 항체 당 평균 4개의 vcMMAE 약물 링커 분자를 갖는 모 뮤린 항체 2A2의 HCLG 인간화 형태의 항체 약물 접합체를 지칭한다.
h2A2 HCLG의 항종양 활성을 8의 DAR로 약물-링커 VIa (n=12, RPR=H, R21=CH3)와 접합된 경우 h15H3과 비교하였다. 연구 프로토콜은 HPAFII 및 BxPC3 세포주를 사용한 세포주-유래된 이종이식 모델에 대해 상기 기재된 것과 동일하였다. 동물을 h2A2 HCLG, h15H3, 또는 비-표적화된 대조군 (h00) ADC 중 어느 하나로 3 mg/kg으로 1회 투여하였다 (도 18). 둘 다의 모델에서 h2A2 HCLG ADC는 삽입된 종양의 오래 가는 퇴행을 나타낸 반면, h15H3 ADC는 성장 지연을 나타내었다.
서열
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
SEQUENCE LISTING <110> Seagen Inc. <120> ANTI- AVB6 ANTIBODIES AND ANTIBODY-DRUG CONJUGATES <130> AVB6-00212PC <150> US 62/943,959 <151> 2019-12-05 <150> 63/012,584 <151> 2020-04-20 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> m2A2 vH <400> 1 Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIGHV1-39 (closest murine germline V-gene) <400> 2 Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 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Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 30 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h2A2 LH light chain <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA, HB, HC, HD CDR1, KABAT <400> 31 Asp Tyr Asn Val Asn 1 5 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA, HB, HC, HD CDR2, KABAT <400> 32 Val Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA, HB, HC, HD CDR3, KABAT <400> 33 Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA, HB, HC, HD CDR1, IMGT <400> 34 Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA, HB, HC, HD CDR2, IMGT <400> 35 Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Thr Thr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA, HB, HC, HD CDR3, IMGT <400> 36 Thr Arg Gly Leu Asn Ala Trp Asp Tyr 1 5 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LA, LB, LC, LD, LG, LH CDR1, KABAT <400> 37 Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn 1 5 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LA, LB, LD, LE, LH CDR2, KABAT <400> 38 Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LA, LB, LC, LD, LE, LF, LG, LH CDR3, KABAT <400> 39 Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LE, LF CDR1, KABAT <400> 40 Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC, LF CDR2, KABAT <400> 41 Gly Ala Thr Asn Leu Ala Thr 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LG CDR2, KABAT <400> 42 Gly Ala Thr Asn Leu Glu Asp 1 5 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LA, LB, LC, LD, LE, LF, LG, LH CDR1, IMGT <400> 43 Glu Asn Ile Tyr Gly Ala 1 5 <210> 44 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LA, LB, LC, LD, LE, LF, LG, LH CDR2, IMGT <400> 44 Gly Ala Thr 1 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LA, LB, LC, LD, LE, LF, LG, LH CDR3, IMGT <400> 45 Gln Asn Val Leu Thr Thr Pro Tyr Thr 1 5

Claims (42)

  1. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-αvβ6 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 중쇄 가변 영역은
    (i) 서열식별번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
    (ii) 서열식별번호:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
    (iii) 서열식별번호:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하고;
    경쇄 가변 영역은
    (i) 서열식별번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
    (ii) 서열식별번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
    (iii) 서열식별번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하고,
    CDR은 카바트(Kabat)에 의해 결정되는 것인 단리된 항-αvβ6 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-αvβ6 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 중쇄 가변 영역은
    (i) 서열식별번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
    (ii) 서열식별번호:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
    (iii) 서열식별번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하고;
    경쇄 가변 영역은
    (i) 서열식별번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
    (ii) 서열식별번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
    (iii) 서열식별번호:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하고,
    CDR은 IMGT에 의해 결정되는 것인 단리된 항-αvβ6 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 인간화된 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, H2가 F에 의해 점유되고, H28이 S에 의해 점유되고, H48이 I에 의해 점유되고, H67이 A에 의해 점유되고, H69가 L에 의해 점유되고, H71이 V에 의해 점유되고, H73이 K에 의해 점유되고, H78이 A에 의해 점유되고, H93이 T에 의해 점유되고, L69가 R에 의해 점유되고, L71이 Y에 의해 점유되고, 넘버링이 카바트 넘버링 시스템을 통한 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 서열식별번호:21을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 경쇄가 서열식별번호:29를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 항원-결합 단편이고, 항원-결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fab'-SH, Fv, 디아바디, 선형 항체, 및 단일-쇄 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역이 중쇄 불변 영역에 융합되고, 경쇄 가변 영역이 경쇄 불변 영역에 융합된 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 IgG1 이소타입의 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  13. 세포독성제 또는 세포증식억제제에 접합된 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체.
  14. 제13항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 링커를 통해 세포독성제 또는 세포증식억제제에 접합된 것인 항체-약물 접합체.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 세포독성제 또는 세포증식억제제가 모노메틸 아우리스타틴인 항체-약물 접합체.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 모노메틸 아우리스타틴이 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)인 항체-약물 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 효소-절단가능한 링커 단위를 통해 MMAE에 접합된 것인 항체-약물 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 효소-절단가능한 링커 단위가 Val-Cit 링커를 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  19. 제18항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 화학식 -Aa-Ww-Yy-를 갖는 링커 단위를 통해 MMAE에 접합되고, 상기 식에서 -A-는 스트레처 단위이고, a는 0 또는 1이고; -W-는 아미노산 단위이고, w는 0 내지 12의 범위의 정수이고; -Y-는 스페이서 단위이고, y는 0, 1, 또는 2인 항체-약물 접합체.
  20. 제19항에 있어서, 스트레처 단위가 하기 화학식 I의 구조를 갖고, 아미노산 단위가 Val-Cit이고; 스페이서 단위가 하기 화학식 II의 구조를 갖는 p-아미노벤질 알콜 (PAB) 기인 항체-약물 접합체:
    Figure pct00038
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 모노메틸 아우리스타틴 E에 부착되어 하기 구조를 갖는 항체-약물 접합체를 형성하는 것인 항체-약물 접합체:
    Figure pct00039

    상기 식에서 Ab는 항체 h2A2이고, p는 1 내지 16의 수를 나타낸다.
  22. 제21항에 있어서, 항체-약물 접합체의 집단에서 p의 평균 값이 약 4인 항체-약물 접합체.
  23. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
  24. 제23항의 핵산을 포함하는 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 벡터가 발현 벡터인 벡터.
  26. 제25항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  27. 제26항에 있어서, 숙주 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포인 숙주 세포.
  28. 항-αvβ6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하는 방법이며, 제26항 또는 제27항의 숙주 세포를 항-αvβ6 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생산에 적합한 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 숙주 세포에 의해 생산된 항-αvβ6 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  30. 항-αvβ6 항체-약물 접합체를 생산하는 방법이며, 제26항 또는 제27항의 숙주 세포를 항-αvβ6 항체의 생산에 적합한 조건 하에서 배양하고; 숙주 세포로부터 생산된 항-αvβ6 항체를 단리하고, 항-αvβ6 항체를 세포독성제 또는 세포증식억제제에 접합시키는 것을 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항-αvβ6 항체가 링커를 통해 세포독성제 또는 세포증식억제제에 접합된 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 링커가 Val-Cit 링커인 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제 또는 세포증식억제제가 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)인 방법.
  34. 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 암이 비-소세포 폐암 (NSCLC), 두경부암, 식도암, 유방암, 난소암, 방광암, 피부암 (SCC), 난소암, 자궁경부암, 위암, 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 폐암이 비-소세포 폐암인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 암이 두경부암인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항체-약물 접합체가 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항체-약물 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 있는 것인 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  40. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체 및 생리학상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 작용제를 포함하는 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 조성물이 방사선 또는 화학치료제와 조합으로 투여되는 것인 제약 조성물.
  42. vcMMAE에 접합된 단리된 항-αvβ6 항체를 포함하는 항체-약물 접합체이며, 여기서 항체는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 항체-약물 접합체가 하기 구조를 갖는 것인 항체-약물 접합체:
    Figure pct00040

    상기 식에서 Ab는 항체이고, p는 1 내지 16의 수를 나타낸다.
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