TW202342529A - 抗il-13ra2單株抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供對人類介白素13受體次單元α2 (IL-13RA2)蛋白具有結合特異性的抗體或其片段。此等抗體能夠以高親和力結合於IL-13RA2，且可介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)並有效地誘發胞吞作用。亦提供用於治療癌症及發炎性疾病之方法及用途。

Description

抗IL-13RA2單株抗體及其用途
介白素13受體次單元α2 (IL-13RA2或IL-13Rα2)亦稱為分化簇213A2 (CD213A2)，其係結合IL13之膜結合蛋白。不同於其他受體蛋白，IL-13RA2具有短細胞質域，且似乎不充當信號媒介(signal mediator)。然而，此蛋白能夠調節IL-13及IL-4兩者之作用，儘管該蛋白不直接與其結合。
IL-13信號傳導經由複雜受體系統調節。在非造血細胞中，IL-13接合由IL-4Rα及IL-13 Rα1構成之雜二聚受體。IL-13 Rα1以低親和力結合IL-13。然而，當其與IL-4Rα形成複合物時，其以高得多的親和力結合，誘發IL-13之效應功能。IL-13RA2與IL-13 Rα1密切相關。
已發現IL-13RA2過度表現於多種癌症中，包括胰臟癌、卵巢癌、黑色素瘤及惡性神經膠質瘤。具有高IL-13RA2表現之細胞可快速且有效地耗乏細胞外IL-13。同樣，缺乏IL13RA2之小鼠中的IL-13反應增強。因此，IL-13RA2可充當IL-13之誘餌受體且引發針對IL-13之拮抗活性。
IL-13RA2以膜結合及可溶兩種形式存在。IL-13RA2之人類可溶形式藉由基質金屬蛋白酶8對膜結合形式的酶促裂解產生。
IL-13RA2之過度表現亦與發炎相關。舉例而言，在患有鼻息肉(NP)之患者中，IL-13RA2可造成氣道炎症及異常重塑，其係主要病理特徵。
本文發現抗IL-13RA2抗體對人類IL-13RA2蛋白具有高結合親和力且有效介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，從而誘發細胞毒性且促進細胞更新。因此，此等抗體可適用於治療諸如癌症及發炎性疾病之疾病，且充當抗體-藥物結合物之靶向載劑。
在一個實施例中，提供對人類IL-13RA2蛋白具有特異性之抗體或其片段。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈可變區，其包含重鏈互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3；及輕鏈可變區輕鏈，其包含互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3。
在一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 13及54至57組成之群的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 14及58至61組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列。
在一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 32或49之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。在一些實施例中，CDRH2包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 11及62至65組成之群的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 12及66至69組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。
在一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 38或50之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 39或51之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列。在一些實施例中，CDRH2包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列，且CDRH3包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 19及70至73組成之群的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 20及74至77組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列。
在一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 44或52之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 48或53之胺基酸序列。在一些實施例中，CDRH2包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 21及78至81組成之群的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 22及82至85組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列。
在一些實施例中，亦提供編碼抗體或片段之聚核苷酸、基於抗體或片段之抗體-藥物結合物以及包含抗體或其片段及醫藥學上可接受之載劑的組合物。
亦提供用於治療疾病及病狀之方法及用途。在一個實施例中，提供一種治療有需要之患者之癌症或炎症的方法，其包含向患者投與本發明之抗體或其片段。
定義
應注意，術語「一種(a)」或「一種(an)」實體係指一或多種彼實體；舉例而言，「一種抗體」應理解為表示一或多種抗體。因此，術語「一(a)」(或「一(an)」)、「一或多」及「至少一」在本文中可互換使用。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單數「多肽」以及複數「多肽」，且係指由經醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)構成的分子。術語「多肽」係指兩個或更多個胺基酸的任何一或多條鏈，且不指產物的特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、寡肽、「蛋白」、「胺基酸鏈」或用以指兩個或更多個胺基酸之一或多條鏈的任何其他術語包括在「多肽」的定義內，且可使用術語「多肽」替代此等術語中之任一者，或術語「多肽」可與此等術語中之任一者互換使用。術語「多肽」亦意指多肽之表現後修飾產物，包括但不限於醣基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基/阻隔基衍生化、蛋白水解分裂或藉由非天然存在之胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物學來源或藉由重組技術產生，但不一定自指定的核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成。
「同源性」或「一致性」或「相似性」係指兩種肽之間或兩種核酸分子之間的序列相似性。同源性可藉由對出於比較目的而比對之各序列中的位置進行比較來確定。當比較序列中之位置由相同的鹼基或胺基酸佔據時，則分子在彼位置處為同源的。序列之間的同源性程度為序列共用之匹配或同源位置數量的函數。「不相關」或「非同源」序列與本發明之序列中的一者共有小於40%一致性，但較佳小於25%一致性。
聚核苷酸或聚核苷酸區(或多肽或多肽區)與另一序列具有某一百分比(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)之「序列一致性」意謂當比對時，在比較兩個序列時，彼百分比之鹼基(或胺基酸)為相同的。
術語「等效核酸或聚核苷酸」係指具有與核酸之核苷酸序列或其互補序列具有一定程度之同源性或序列一致性的核苷酸序列的核酸。雙股核酸之同源物意欲包括具有與或其互補序列具有一定程度之同源性的核苷酸序列的核酸。在一個態樣中，核酸之同源物能夠與核酸或其補體雜交。同樣地，「等效多肽」係指與參考多肽之胺基酸序列具有一定程度之同源性或序列一致性的多肽。在一些態樣中，序列一致性為至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在一些態樣中，與參考多肽或聚核苷酸相比，等效多肽或聚核苷酸具有一個、兩個、三個、四個或五個添加、缺失、取代及其組合。在一些態樣中，等效序列保留參考序列之活性(例如，抗原決定基結合)或結構(例如，鹽橋)。
如本文所用，「抗體」或「抗原結合多肽」係指特異性識別抗原且結合於抗原之多肽或多肽複合物。抗體可為全抗體及其任何抗原結合片段或單鏈。因此，術語「抗體」包括含有包含免疫球蛋白分子之至少一部分的分子的任何蛋白或肽，該免疫球蛋白分子具有結合於抗原之生物活性。此類之實例包括但不限於重鏈或輕鏈之互補決定區(CDR)或其配位體結合部分、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、構架(FR)區或其任何部分或結合蛋白之至少一部分。
如本文所用，術語「抗體片段」或「抗原結合片段」為抗體之一部分，諸如F(ab') 2、F(ab) 2、Fab'、Fab、Fv、scFv及其類似物。不論結構，抗體片段與完整抗體所識別之相同抗原結合。術語「抗體片段」包括適體、鏡像適配體(spiegelmer)及雙功能抗體。術語「抗體片段」亦包括任何合成或經基因工程改造之蛋白，其藉由結合於特異性抗原以形成複合物而起到如同抗體的作用。
「單鏈可變片段」或「scFv」係指免疫球蛋白之重鏈(V H)及輕鏈(V L)可變區的融合蛋白。在一些態樣中，該等區域與十個至約25個胺基酸之短連接子肽連接。連接子可富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有溶解性，且可使V H之N端與V L之C端連接，或反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白保留原始免疫球蛋白之特異性。ScFv分子為此項技術中已知的且描述於例如美國專利5,892,019中。
術語抗體涵蓋各種廣泛類別之多肽，其可以生物化學方式區分。熟習此項技術者應瞭解重鏈歸類為γ、μ、α、δ或ε(gamma、mu、alpha、delta、epsilon)，其中有一些子類(例如，γ l-γ4)。此鏈之性質將抗體之「類別」分別確定為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白子類(同型)，例如IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgG 5等經充分表徵且已知可賦予功能專業化。鑒於本發明，此等類別及同型中之各者的經修改版本為熟習此項技術者可容易地辨別，且因此處於本發明之範疇內。所有免疫球蛋白類別皆清楚地屬於本發明之範疇內，以下論述一般將針對IgG類免疫球蛋白分子。關於IgG，標準免疫球蛋白分子包含分子量約為23,000道爾頓(Dalton)之兩個相同輕鏈多肽及分子量為53,000至70,000之兩個相同重鏈多肽。四條鏈通常以「Y」組態藉由二硫鍵接合，其中輕鏈在「Y」之開口處開始支托(bracket)重鏈且繼續穿過可變區。
本發明之抗體、抗原結合多肽、其變體或衍生物包括但不限於：多株、單株、多特異性、人類、人源化、靈長類化或嵌合抗體；單鏈抗體；抗原決定基結合片段，例如Fab、Fab'及F(ab') 2、Fd、Fv、單鏈Fv (scFv)；單鏈抗體；二硫鍵連接之Fv (sdFv)；包含VK或VH域之片段；由Fab表現庫(expression library)產生之片段；及抗個體基因型(anti-idiotypic，抗Id)抗體(包括例如本文所揭示之針對LIGHT抗體的抗Id抗體)。本發明之免疫球蛋白或抗體分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2)或子類。
將輕鏈歸類為Κ或λ(kappa、lambda)。各重鏈類別可與κ或λ輕鏈結合。一般而言，輕鏈及重鏈彼此共價結合，且當免疫球蛋白由融合瘤、B細胞或經基因工程改造之宿主細胞產生時，兩條重鏈之「尾端」部分藉由共價二硫鍵或非共價鍵彼此結合。在重鏈中，胺基酸序列自Y組態之分叉末端處的N端延行至各鏈之底部的C端。
將輕鏈及重鏈分成具有結構及功能同源性之區域。術語「恆定」及「可變」係依功能使用。就此而言，應瞭解輕鏈(VK)及重鏈(VH)部分之可變域確定抗原識別及特異性。相反，輕鏈(CK)及重鏈(CH1、CH2或CH3)之恆定域賦予重要生物特性，諸如分泌、經胎盤移動性(transplacental mobility)、Fc受體結合、補體結合及其類似特性。按照慣例，恆定區域之編號隨著其距離抗體之抗原結合位點或胺基末端愈遠而增大。N端部分為可變區且在C端部分為恆定區；CH3及CK域實際上分別包含重鏈及輕鏈之羧基末端。
如上文所指出，可變區允許抗體選擇性識別及特異性結合抗原上之抗原決定基。亦即，抗體之VK域及VH域或互補決定區(CDR)之子集組合以形成定義三維抗原結合位點的可變區。此四元抗體結構形成存在於Y之各臂末端的抗原結合位點。更具體而言，抗原結合位點由VH及VK鏈中之各者上的三個CDR (亦即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)定義。在一些情況下，例如來源於駱駝科物種或基於駱駝科免疫球蛋白工程化的某些免疫球蛋白分子，完整免疫球蛋白分子可僅由重鏈組成，其中無輕鏈。參見例如，Hamers-Casterman等人, Nature363:446-448 (1993)。
在天然存在之抗體中，當抗體假設為其水性環境中之三維組態時，存在於各抗原結合域中之六個「互補決定區」或「CDR」為經特異性定位以形成抗原結合域的胺基酸之非鄰接短序列。抗原結合域中之胺基酸的其餘部分稱為「構架」區，顯示較小分子間可變性。構架區主要採用β片(β-sheet)構形且CDR形成環，該等環連接β片結構且在一些情形中形成β片結構之部分。因此，構架區用於形成骨架，該骨架藉由鏈間非共價相互作用提供CDR在正確方向上之定位。藉由定位之CDR形成的抗原結合域定義與免疫反應性抗原上之抗原決定基互補的表面。此互補表面促進抗體與其同源抗原決定基之非共價結合。對於任何給定重鏈或輕鏈可變區，一般熟習此項技術者可容易地分別鑑別包含CDR及構架區之胺基酸，此係因為其已經明確定義(參見「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, Kabat, E., 等人, U.S. Department of Health and Human Services, (1983)；及Chothia及Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987))。
在存在兩種或更多種此項技術內所用及/或所接受之術語定義的情況下，除非相反地明確陳述，否則如本文所用之術語的定義意欲包括所有此類含義。特定實例為使用術語「互補決定區」(「CDR」)描述在重鏈及輕鏈多肽兩者之可變區內發現的非鄰接抗原組合位點。此特定區已藉由Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)及藉由Chothia等人, J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)描述，其以全文引用之方式併入本文中。根據Kabat及Chothia之CDR定義包括當相對於彼此比較時胺基酸殘基之重疊或子集。然而，用以指抗體或其變體之CDR的任何定義的應用意欲屬於如本文所定義及所用之術語的範疇內。涵蓋如上文所引用之參考文獻中之各者所定義的CDR的適當胺基酸殘基闡述於下表中作為比較。涵蓋特定CDR的確切殘基數目將視CDR之序列及大小而變。在抗體之可變區胺基酸序列指定的情況下，熟習此項技術者可以常規方式確定哪些殘基包含特定CDR。
   Kabat Chothia
CDR-H1 31-35 26-32
CDR-H2 50-65 52-58
CDR-H3 95-102 95-102
CDR-L1 24-34 26-32
CDR-L2 50-56 50-52
CDR-L3 89-97 91-96
Kabat等人亦定義適用於任何抗體之可變域序列編號系統。一般熟習此項技術者可將此「Kabat編號」系統明確地分配給任何可變域序列，而不依賴於除序列本身以外的任何實驗資料。如本文所用，「Kabat編號」係指由Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)所闡述之編號系統。
除上表以外，Kabat編號系統如下描述CDR區：CDR-H1約在胺基酸31 (亦即在第一半胱胺酸殘基之後約9個殘基)處開始，包括約5至7個胺基酸，且在下一個色胺酸殘基處結束。CDR-H2在CDR-H1末端後之第十五個殘基處開始，包括約16至19個胺基酸，且在下一個精胺酸或離胺酸殘基處結束。CDR-H3在CDR-H2末端後之約第三十三個胺基酸殘基處開始；包括3至25個胺基酸；且在序列W-G-X-G處結束，其中X為任何胺基酸。CDR-L1在大致殘基24處(亦即在半胱胺酸殘基後)開始；包括大致10-17個殘基；且在下一個色胺酸殘基處結束。CDR-L2在CDR-L1末端後之約第十六個殘基處開始且包括約7個殘基。CDR-L3約在CDR-L2末端後之第三十三個殘基處(亦即在半胱胺酸殘基後)開始；包括約7至11個殘基且在序列F或W-G-X-G處結束，其中X為任何胺基酸。
本文所揭示之抗體可來自任何動物來源，包括鳥類及哺乳動物。較佳地，抗體為人類、鼠、驢、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、駱馬、馬或雞抗體。在另一實施例中，可變區可為軟骨魚綱(condricthoid)來源(例如，來自鯊魚)。
如本文所用，術語「重鏈恆定區」包括來源於免疫球蛋白重鏈之胺基酸序列。包含重鏈恆定區之多肽包含以下中之至少一者：CH1域、鉸鏈(例如，上鉸鏈區、中鉸鏈區及/或下鉸鏈區)域、CH2域、CH3域或其變體或片段。舉例而言，用於本發明中之抗原結合多肽可包含：包含CH1域之多肽鏈；包含CH1域、鉸鏈域之至少一部分及CH2域的多肽鏈；包含CH1域及CH3域之多肽鏈；包含CH1域、鉸鏈域之至少一部分及CH3域的多肽鏈；或包含CH1域、鉸鏈域之至少一部分、CH2域及CH3域的多肽鏈。在另一實施例中，本發明之多肽包含有包含CH3域之多肽鏈。此外，用於本發明之抗體可缺乏CH2域之至少一部分(例如，CH2域之全部或一部分)。如上文所闡述，一般熟習此項技術者應瞭解，重鏈恆定區可經修飾，使得其胺基酸序列與天然存在之免疫球蛋白分子不同。
本文所揭示之抗體的重鏈恆定區可來源於不同免疫球蛋白分子。舉例而言，多肽之重鏈恆定區可包含來源於IgG l分子之CH1域及來源於IgG 3分子之鉸鏈區。在另一實例中，重鏈恆定區可包含部分來源於IgG l分子且部分來源於IgG 3分子之鉸鏈區。在另一實例中，重鏈部分可包含部分來源於IgG l分子且部分來源於IgG 4分子之嵌合鉸鏈。
如本文所用，術語「輕鏈恆定區」包括來源於抗體輕鏈之胺基酸序列。較佳地，輕鏈恆定區包含恆定κ域或恆定λ域中之至少一者。
「輕鏈-重鏈對」係指輕鏈及重鏈之集合，其可經由輕鏈之CL域與重鏈之CH1域之間的二硫鍵形成二聚體。
如先前所指示，各種免疫球蛋白類別之恆定區的次單元結構及三維組態為熟知的。如本文所用，術語「VH域」包括免疫球蛋白重鏈之胺基端可變域，且術語「CH1域」包括免疫球蛋白重鏈之第一(大部分胺基端)恆定區域。CH1域與VH域相鄰，且為免疫球蛋白重鏈分子之胺基端鉸鏈區。
如本文所用，術語「CH2域」包括延伸之重鏈分子的部分，例如使用習知編號方案(殘基244至360，Kabat編號系統；及殘基231-340，EU編號系統；參見Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983))約自抗體之殘基244延伸至殘基360。CH2域的獨特之處在於其不與另一域緊密配對。實際上，兩條N連接之分支鏈碳水化合物鏈插入於完整天然IgG分子的兩個CH2域之間。亦有據可查的為CH3域自IgG分子之CH2域延伸至C端，且包含約108個殘基。
如本文所用，術語「鉸鏈區」包括使CH1域接合至CH2域的重鏈分子之部分。此鉸鏈區包含約25個殘基且具有可撓性，因此允許兩個N端抗原結合區獨立地移動。鉸鏈區可細分為三個不同域：上鉸鏈域、中鉸鏈域及下鉸鏈域(Roux等人, J. Immunol161:4083 (1998))。
如本文所用，術語「二硫鍵」包括在兩個硫原子之間形成的共價鍵。胺基酸半胱胺酸包含可與第二硫醇基形成二硫鍵或橋之硫醇基。在大部分天然存在之IgG分子中，CH1及CK區藉由二硫鍵連接且兩條重鏈藉由在對應於239及242之位置處使用Kabat編號系統(位置226或229，EU編號系統)的兩個二硫鍵連接。
如本文所用，術語「嵌合抗體」將被認為意謂其中免疫反應性區域或位點係由第一物種獲得或來源於第一物種且恆定區(根據本發明，其可為完整、部分或經修飾的)係由第二物種獲得的任何抗體。在某些實施例中，目標結合區域或位點將來自非人類來源(例如，小鼠或靈長類動物)且恆定區為人類。
如本文所用，「百分比人源化」係藉由測定人源化域與生殖系域之間的構架胺基酸差異(亦即非CDR差異)之數目，自胺基酸總數減去彼數目，且隨後除以胺基酸總數且乘以100來計算。
「特異性結合」或「對……具有特異性」一般意謂抗體經由其抗原結合域結合於抗原決定基，且該結合需要抗原結合域與抗原決定基之間具有一定互補性。根據此定義，當抗體經由其抗原結合域結合於抗原決定基比其結合於隨機不相關抗原決定基更容易時，則該抗體稱為「特異性結合」於抗原決定基。術語「特異性」在本文中用於限定某一抗體與某一抗原決定基結合之相對親和力。舉例而言，可認為抗體「A」比抗體「B」對給定抗原決定基具有更高特異性，或抗體「A」可稱為以高於其對相關抗原決定基「D」之特異性結合於抗原決定基「C」。
如本文所用，術語「治療(treat)」或「治療(treatment)」係指治療性處理及防治性或預防性措施，其中目標為預防或減慢(減輕)不希望的生理變化或病症，諸如癌症之進展。有益或所需之臨床結果包括但不限於症狀緩解、疾病程度減輕、疾病狀態穩定(亦即未惡化)、疾病進展延遲或減緩、疾病狀態改善或緩和及緩解(部分抑或全部緩解)，無論其為可偵測或不可偵測的。「治療」亦可意謂與不接受治療之預期存活期相比延長的存活期。需要治療之彼等個體包括已具有病狀或病症之個體，以及易於具有病狀或病症之個體，或將預防病狀或病症之個體。
「個體(subject)」或「個體(individual)」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意謂任何需要診斷、預後或療法之個體，尤其哺乳動物個體。哺乳動物個體包括人類、家畜、農畜及動物園、運動或寵物動物，諸如狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。
如本文所用，諸如「需要治療之患者」或「需要治療之個體」的片語包括個體，諸如哺乳動物個體，其將得益於投與所用的本發明之抗體或組合物，例如用於偵測、用於診斷程序及/或用於治療。 抗IL-13RA2抗體
本發明提供對人類IL-13RA2蛋白具有高親和力、強效介導ADCC及細胞毒性且可有效地誘發胞吞作用的抗IL-13RA2抗體及片段。另外，活體外及活體內測試均已展現此等抗體在殺死表現IL-13RA2之細胞及治療癌症中的功效。因此，此等抗體為用於治療以過度表現IL-13RA2為特徵之各種疾病(諸如癌症及發炎性疾病)的適合藥劑。
因此，根據本發明之一個實施例，提供能夠結合於IL-13RA2之抗體及其抗原結合片段。實例抗體包括 表 1中所列之鼠類抗體(例如，24G6D5、34A5G9、42E3C4、51G2B3、54A4F7、57F8H3F1、61H8C1、62A8D8、62F6A8、72B4H4、73A11E2及74B5E4)，以及 表 8 至表 11之人源化抗體。亦包括有包括與本文中所說明相同之CDR的彼等抗體。在一些實施例中，所揭示之抗體及片段包括與本文所說明之彼等結合於相同之抗原決定基的彼等抗體及片段，及與所立即揭示者競爭結合於IL-13RA2的彼等抗體及片段。
根據本發明之一個實施例，提供一種抗體或其片段，其包括具有本文所揭示之CDR區的重鏈可變域及輕鏈可變域以及其生物等效物。
在一個實施例中，CDR為 表 8B 及表 8D中例示之61H8C1或其人源化對應物的彼等CDR。在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRH2包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRH3包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRL1包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRL2包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，且CDRL3包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)。
在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在一些實施例中，亦提供包括與61H8C1或其人源化對應物相同之CDR的彼等者。在一些實施例中，所揭示之抗體及片段包括與61H8C1或其人源化對應物結合於相同之抗原決定基的彼等抗體及片段，及與其中之任一者競爭結合於IL-13RA2的彼等抗體及片段。
在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 13 (小鼠或嵌合)及54至57 (人源化)組成之群的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO: 13 (小鼠或嵌合)及54至57 (人源化)組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的肽。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 14 (小鼠或嵌合)及58至61 (人源化)組成之群的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO: 14 (小鼠或嵌合)及58至61 (人源化)組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的肽。
在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 58至61中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 54至57中之任一者的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列。
在一個實施例中，CDR為 表 9B 及表 9D中所例示之57F8H3F1或其人源化對應物的彼等CDR。在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRH2包含SEQ ID NO: 32或49之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRH3包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRL1包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRL2包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，且CDRL3包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)。
在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 32或49之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。
在一些實施例中，亦提供包括與57F8H3F1或其人源化對應物相同之CDR的彼等者。在一些實施例中，所揭示之抗體及片段包括與57F8H3F1或其人源化對應物結合於相同之抗原決定基的彼等抗體及片段，及與其中之任一者競爭結合於IL-13RA2的彼等抗體及片段。
在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 11 (小鼠或嵌合)及62至65 (人源化)組成之群的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO: 11 (小鼠或嵌合)及62至65 (人源化)組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的肽。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 12 (小鼠或嵌合)及66至69 (人源化)組成之群的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO: 12 (小鼠或嵌合)及66至69 (人源化)組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的肽。
在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 66至69中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 62至65中之任一者的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。
在一個實施例中，CDR為 表 10B 及表 10D中所例示之72B4H4或其人源化對應物的彼等CDR。在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRH2包含SEQ ID NO: 38或50之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRH3包含SEQ ID NO: 39或51之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRL1包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRL2包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，且CDRL3包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)。
在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 38或50之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 39或51之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列。在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列。
在一些實施例中，亦提供包括與72B4H4或其人源化對應物相同之CDR的彼等者。在一些實施例中，所揭示之抗體及片段包括與72B4H4或其人源化對應物結合於相同之抗原決定基的彼等抗體及片段，及與其中之任一者競爭結合於IL-13RA2的彼等抗體及片段。
在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 19 (小鼠或嵌合)及70至73 (人源化)組成之群的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO: 19 (小鼠或嵌合)及70至73 (人源化)組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的肽。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 20 (小鼠或嵌合)及74至77 (人源化)組成之群的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO: 20 (小鼠或嵌合)及74至77 (人源化)組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的肽。
在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 74至77中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 70至73中之任一者的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列。
在一個實施例中，CDR為 表 11B 及表 11D中所例示之73A11E2或其人源化對應物的彼等CDR。在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRH2包含SEQ ID NO: 44或52之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRH3包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRL1包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，CDRL2包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)，且CDRL3包含SEQ ID NO: 48或53之胺基酸序列或其變體(具有一個、兩個或三個缺失、添加、取代或其組合)。
在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 44或52之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 48或53之胺基酸序列。在一個實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列，CDRH3包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，CDRL1包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列，且CDRL3包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列。
在一些實施例中，亦提供包括與73A11E2或其人源化對應物相同之CDR的彼等者。在一些實施例中，所揭示之抗體及片段包括與73A11E2或其人源化對應物結合於相同之抗原決定基的彼等抗體及片段，及與其中之任一者競爭結合於IL-13RA2的彼等抗體及片段。
在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 21 (小鼠或嵌合)及78至81 (人源化)組成之群的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO: 21 (小鼠或嵌合)及78至81 (人源化)組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的肽。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 22 (小鼠或嵌合)及82至85 (人源化)組成之群的胺基酸序列，或與選自由SEQ ID NO: 22 (小鼠或嵌合)及82至85 (人源化)組成之群的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的肽。
在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 82至85中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 78至81中之任一者的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列。
含有此等CDR區之抗體(不論小鼠、人源化或嵌合)具有強效IL-13RA2結合活性。如 表 8 至表 11中所示，CDR內之某些殘基可經修飾以保留或改良特性或降低其具有轉譯後修飾(post-translational modification，PTM)的可能。此類經修飾之CDR可稱為親和力成熟或去風險化(de-risked) CDR (例如，SEQ ID NO: 49至53)。
經修飾之CDR可包括具有一個、兩個或三個胺基酸添加、缺失及/或取代的彼等經修飾之CDR。在一些實施例中，取代可為保守取代。
「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的胺基酸取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，免疫球蛋白多肽中之非必需胺基酸殘基較佳經來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。在另一實施例中，一串胺基酸可經側鏈家族成員之順序及/或組成不同的結構上類似的一串置換。
保守胺基酸取代之非限制性實例提供於下表中，其中相似性分數為0或更高指示兩個胺基酸之間的保守取代。 表 A. 胺基酸相似性矩陣
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10   
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9      
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6         
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5            
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6               
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4                  
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6                     
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5                        
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6                           
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4                              
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2                                 
E -5 0 -1 0 0 0 3 4                                    
D -5 1 -1 0 0 0 4                                       
T -2 0 0 1 1 3                                          
A -2 1 1 1 2                                             
S 0 1 1 1                                                
P -3 -1 6                                                   
G -3 5                                                      
C 12                                                         
表 B. 保守性胺基酸取代
關於胺基酸 經以下取代
丙胺酸 D-Ala、Gly、Aib、β-Ala、L-Cys、D-Cys
精胺酸 D-Arg、Lys、D-Lys、Orn D-Orn
天冬醯胺 D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu Gln、D-Gln
天冬胺酸 D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
半胱胺酸 D-Cys、S-Me-Cys、Met、D-Met、Thr、D-Thr、L-Ser、D-Ser
麩醯胺酸 D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp、D-Asp
麩胺酸 D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln、D-Gln
甘胺酸 Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Aib、β-Ala
異白胺酸 D-Ile、Val、D-Val、Leu、D-Leu、Met、D-Met
白胺酸 Val、D-Val、Met、D-Met、D-Ile、D-Leu、Ile
離胺酸 D-Lys、Arg、D-Arg、Orn、D-Orn
甲硫胺酸 D-Met、S-Me-Cys、Ile、D-Ile、Leu、D-Leu、Val、D-Val
苯丙胺酸 D-Phe、Tyr、D-Tyr、His、D-His、Trp、D-Trp
脯胺酸 D-Pro
絲胺酸 D-Ser、Thr、D-Thr、allo-Thr、L-Cys、D-Cys
蘇胺酸 D-Thr、Ser、D-Ser、allo-Thr、Met、D-Met、Val、D-Val
酪胺酸 D-Tyr、Phe、D-Phe、His、D-His、Trp、D-Trp
纈胺酸 D-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile、Met、D-Met
一般熟習此項技術者亦應瞭解，如本文所揭示之抗體可經修飾以使得其胺基酸序列與其衍生自之天然存在之結合多肽不同。舉例而言，衍生自指定蛋白之多肽或胺基酸序列可為類似的，例如與起始序列具有一定一致性百分比，例如其可與起始序列60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致。
在某些實施例中，抗體包含通常不與抗體相關之胺基酸序列或一或多個部分。例示性修飾更詳細地描述於下文中。舉例而言，本發明之抗體可包含可撓性連接子序列，或可經修飾以添加功能性部分(例如，PEG、藥物、毒素或標記)。
本發明之抗體、其變體或衍生物包括經修飾，亦即藉由使任何類型之分子共價連接至抗體，使得共價連接不阻止抗體結合於抗原決定基來修飾的衍生物。舉例而言但不作為限制，抗體可例如藉由醣基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基/阻隔基衍生化、蛋白水解分裂、與細胞配位體或其他蛋白連接等來修飾。許多化學修飾中之任一者可藉由已知技術進行，包括但不限於特異性化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素(tunicamycin)之代謝合成等。另外，抗體可含有一或多個非典型胺基酸。
在一些實施例中，抗體可與治療劑、前藥、肽、蛋白、酶、病毒、脂質、生物反應調節劑、醫藥劑或PEG結合。
抗體可結合或融合至治療劑，其可包括可偵測標記，諸如放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光敏性治療劑或診斷劑、細胞毒性劑(其可為藥物或毒素)、超音波增強劑、非放射性標記、其組合及此項技術中已知之此類其他藥劑。
抗體可藉由使其與化學發光化合物偶合而以可偵測方式標記。隨後藉由偵測在化學反應過程期間出現之發光的存在來確定化學發光標記之抗原結合多肽的存在。尤其適用之化學發光標記化合物的實例為發光胺(luminol)、異發光胺(isoluminol)、theromatic吖錠酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖錠鹽及草酸酯。
抗體亦可使用諸如 152Eu之螢光發射金屬或鑭系元素系列中之其他者以可偵測方式標記。可使用諸如二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)之此類金屬螯合基團將此等金屬連接至抗體。用於將各種部分結合至抗體之技術為熟知的，參見例如Arnon等人, 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, 於Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中，Reisfeld 等人(編), 第243-56頁(Alan R. Liss, Inc. (1985)；Hellstrom等人,「Antibodies For Drug Delivery」,於Controlled Drug Delivery (第2版)中, Robinson等人, (編), Marcel Dekker, Inc.,第623-53頁(1987)；Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」,於Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications中, Pinchera等人(編), 第475-506頁(1985)；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, 於Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中, Baldwin等人(編), Academic Press第303-16頁(1985)，及Thorpe等人, 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」 , Immunol. Rev. (52:119-58 (1982))。 雙功能分子及組合療法
IL-13RA2過度表現於腫瘤細胞上。作為腫瘤抗原靶向分子，對IL-13RA2具有特異性之抗體或抗原結合片段可與對免疫細胞具有特異性之第二抗原結合片段或對免疫檢查點具有特異性之抗原結合片段組合，以產生組合療法或雙特異性抗體。
在一些實施例中，免疫細胞係選自由以下組成之群：T細胞、B細胞、單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、樹突狀細胞、吞噬細胞、自然殺手細胞、嗜酸性白血球、嗜鹼性球及肥大細胞。可靶向之免疫細胞上的分子包括例如CCL1、CD3、CD16、CD19、CD28及CD64。其他實例包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3 (亦稱為CD223)、CD28、CD122、4-1BB (亦稱為CD137)、TIM3、OX-40或OX40L、CD40或CD40L、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM或BTLA(亦稱為CD272)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptor，KIR)及CD47。
亦提供不同形式之雙特異性抗體。在一些實施例中，抗IL-13RA2片段及第二片段中之各者各自獨立地選自Fab片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包括Fc片段。
亦提供不僅包括抗體或抗原結合片段之雙功能分子。作為腫瘤抗原靶向分子，對IL-13RA2具有特異性之抗體或抗原結合片段(諸如本文所描述之彼等抗體或抗原結合片段)可視情況經由肽連接子與免疫細胞介素或配位體組合。所連接之免疫細胞介素或配位體包括但不限於IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、GM-CSF、TNF-α、CD40L、OX40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、LIGHT及GITRL。此類雙功能分子可將免疫檢查點阻隔效應與腫瘤部位局部免疫調節組合。 抗體-藥物結合物
在一些實施例中，抗體或片段可與治療劑、前藥、肽、蛋白、酶、病毒、脂質、生物反應調節劑、醫藥劑或PEG結合。
在一個實施例中，本發明之抗體或片段共價連接至藥物部分。藥物部分可經修飾或經修飾以包括可對抗體上之結合點有反應性的基團。舉例而言，藥物部分可藉由烷基化(例如，在抗體之ε胺基離胺酸或N端處)、氧化碳水化合物之還原胺化、羥基與羧基之間的轉酯化、胺基或羧基處之醯胺化及結合至硫醇連接。
在一些實施例中，每個抗體分子結合之藥物部分的數目p在1至8；1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2之平均值範圍內。在一些實施例中，p在2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3之平均值範圍內。在其他實施例中，p為1、2、3、4、5、6、7或8之平均值。在一些實施例中，p在約1至約20、約1至約10、約2至約10、約2至約9、約1至約8、約1至約7、約1至約6、約1至約5、約1至約4、約1至約3或約1至約2之平均值範圍內。在一些實施例中，p在約2至約8、約2至約7、約2至約6、約2至約5、約2至約4或約2至約3範圍內。
舉例而言，當蛋白之化學活化使得形成游離硫醇基時，蛋白可與硫氫基反應性藥劑結合。在一個態樣中，藥劑為實質上對游離硫醇基具有特異性之藥劑。此類藥劑包括例如順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯胺(例如，碘、溴或氯乙醯胺)、鹵酯(例如，碘、溴或氯酯)、鹵甲基酮(例如，碘、溴或氯甲基酮)、苯甲基鹵化物(例如，苯甲基碘化物、溴化物或氯化物)、乙烯基碸及吡啶基硫基。
藥物可藉由連接子連接至抗體或片段。適合連接子包括例如可裂解及不可裂解連接子。可裂解連接子通常在細胞內條件下容易裂解。適合的可裂解連接子包括例如可由細胞內蛋白酶(諸如溶酶體蛋白酶或內體蛋白酶)裂解之肽連接子。在例示性實施例中，連接子可為二肽連接子，諸如纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、苯丙胺酸-離胺酸(phe-lys)連接子或順丁烯二醯亞胺基己酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(mc-Val-Cit-PABA)連接子。另一連接子為磺基丁二醯亞胺基-4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸酯(smcc)。磺基-smcc結合經由與硫氫基(硫醇，-SH)反應之順丁烯二醯亞胺基產生，而其磺基-NHS酯對一級胺有反應性(如在離胺酸及蛋白或肽N端中發現)。又另一連接子為順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。其他適合連接子包括可在特定pH或pH範圍下水解之連接子，諸如腙連接子。其他適合的可裂解連接子包括二硫化物連接子。連接子可共價結合至抗體以達到抗體必須在細胞內降解以便釋放藥物的程度，例如mc連接子及其類似物。
連接子可包括連接至抗體之基團。舉例而言，連接子可包括胺基、羥基、羧基或硫氫基反應性基團(例如，順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯胺(例如，碘、溴或氯乙醯胺)、鹵酯(例如，碘、溴或氯酯)、鹵甲基酮(例如，碘、溴或氯甲基酮)、苯甲基鹵化物(例如，苯甲基碘化物、溴化物或氯化物)、乙烯基碸及吡啶基硫基)。
在一些實施例中，藥物部分為細胞毒性或細胞生長抑制劑、免疫抑制劑、放射性同位素、毒素或其類似物。結合物可用於抑制腫瘤細胞或癌細胞之增殖，引起腫瘤或癌細胞之細胞凋亡，或用於治療患者之癌症。結合物可相應地在多種設定下用於治療動物癌症。結合物可用於將藥物遞送至腫瘤細胞或癌細胞。在不受理論束縛的情況下，在一些實施例中，結合物結合於表現密連蛋白(claudin) 18.2之癌細胞或與其相關，且結合物及/或藥物可經由受體介導之胞吞作用吸收於腫瘤細胞或癌細胞內部。
一旦在細胞內部，結合物內(例如，連接子中)之一或多種特定肽序列藉由一或多種腫瘤細胞或癌細胞相關蛋白酶以水解方式裂解，從而釋放藥物。所釋放之藥物隨後在細胞內自由遷移且誘發細胞毒性或細胞生長抑制或其他活性。在一些實施例中，藥物在腫瘤細胞或癌細胞外部自抗體裂解，且藥物隨後穿透細胞，或在細胞表面起作用。
藥物部分或有效負載之實例係選自由以下組成之群：DM1 (美登素(maytansine), N2'-去乙醯基-N2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-或N2'-去乙醯基-N2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素)、mc-MMAD (6-順丁烯二醯亞胺基己醯基-單甲基奧瑞他汀(monomethylauristatin)-D或N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(1S,2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-[[(1S)-2-苯基-1-(2-噻唑基)乙基]胺基]丙基]-1-吡咯啶基]-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧基丁基]-N-甲基-(9Cl)-L-纈胺醯胺)、mc-MMAF (順丁烯二醯亞胺基己醯基-單甲基奧瑞他汀F或N-[6-(2,5-二氫-2,5-二側氧基-1H-吡咯-1-基)-1-側氧基己基]-N-甲基-L-纈胺醯基-L-纈胺醯基-(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲胺基)庚醯基-(αR, βR,2S)-β-甲氧基-α-甲基-2-吡咯啶丙醯基-L-苯丙胺酸)及mc-Val-Cit-PABA-MMAE (6-順丁烯二醯亞胺基己醯基-ValcCit-(對胺基苯甲氧基羰基)-單甲基奧瑞他汀E或N-[[[4-[[N-[6-(2,5-二氫-2,5-二側氧基-1H-吡咯-1-基)-1-側氧基己基]-L-纈胺醯基-N5-(胺基羰基)-L-鳥胺醯基]胺基]苯基]甲氧基]羰基]-N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羥基-1-甲基-2-苯乙基]胺基]-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]-1-吡咯啶基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧基丁基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)。DM1係微管蛋白抑制劑美登素之衍生物，而MMAD、MMAE及MMAF係奧瑞他汀(auristatin)衍生物。在一些實施例中，藥物部分係選自由mc-MMAF及mc-Val-Cit-PABA-MMAE組成之群。在一些實施例中，藥物部分為類美登素(maytansinoid)或奧瑞他汀。
抗體或片段可結合或融合至治療劑，其可包括可偵測標記，諸如放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光敏性治療劑或診斷劑、細胞毒性劑(其可為藥物或毒素)、超音波增強劑、非放射性標記、其組合及此項技術中已知之此類其他藥劑。
抗體可藉由使其與化學發光化合物偶合而以可偵測方式標記。隨後藉由偵測在化學反應過程期間出現之發光的存在來確定化學發光標記之抗原結合多肽的存在。尤其適用之化學發光標記化合物的實例為發光胺、異發光胺、theromatic吖錠酯、咪唑、吖錠鹽及草酸酯。
抗體亦可使用諸如 152Eu之螢光發射金屬或鑭系元素系列中之其他者以可偵測方式標記。可使用諸如二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)之此類金屬螯合基團將此等金屬連接至抗體。用於將各種部分結合至抗體之技術為熟知的，參見例如Arnon等人, 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, 於Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中，Reisfeld 等人(編), 第243-56頁(Alan R. Liss, Inc. (1985)；Hellstrom等人,「Antibodies For Drug Delivery」,於Controlled Drug Delivery (第2版)中, Robinson等人, (編), Marcel Dekker, Inc.,第623-53頁(1987)；Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」,於Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications中, Pinchera等人(編), 第475-506頁(1985)；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, 於Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中, Baldwin等人(編), Academic Press第303-16頁(1985)，及Thorpe等人, 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」 , Immunol. Rev. (52:119-58 (1982))。 編碼抗體之聚核苷酸及製備抗體之方法
本發明亦提供編碼本發明之抗體、其變體或衍生物的經分離之聚核苷酸或核酸分子。本發明之聚核苷酸可編碼相同聚核苷酸分子上或各別聚核苷酸分子上之抗原結合多肽、其變體或衍生物的整個重鏈及輕鏈可變區。另外，本發明之聚核苷酸可編碼相同聚核苷酸分子或各別聚核苷酸分子上之抗原結合多肽、其變體或衍生物的重鏈及輕鏈可變區之部分。
製造抗體之方法為此項技術中熟知的且描述於本文中。在某些實施例中，本發明之抗原結合多肽的可變區及恆定區均完全為人類的。全人類抗體可使用此項技術中所描述及如本文所描述之技術製得。舉例而言，針對特定抗原之全人類抗體可藉由將抗原投與至轉殖基因動物來製備，該轉殖基因動物經修飾以回應於抗原攻擊而產生此類抗體，但其內源性基因座已失能。可用於製備此類抗體之例示性技術描述於美國專利：6,150,584；6,458,592；6,420,140，其以全文引用之方式併入本文中。 治療方法
如本文所描述，本發明之抗體、變體或衍生物可用於某些治療及診斷方法中。
本發明進一步係針對基於抗體之療法，其涉及向諸如動物、哺乳動物及人類的患者投與本發明之抗體以治療本文所描述的病症或病狀中之一或多者。本發明之治療性化合物包括但不限於本發明之抗體(包括如本文所描述之其變體及衍生物)及編碼本發明之抗體(包括如本文所描述之其變體及衍生物)的核酸或聚核苷酸。
本發明之抗體亦可用於治療或抑制癌症。在一些實施例中，患者中之癌細胞表現或過度表現IL-13RA2。如上文所提供，IL-13RA2可過度表現於腫瘤細胞中，尤其胃腫瘤、胰臟腫瘤、食道腫瘤、卵巢腫瘤及肺腫瘤。已顯示IL-13RA2之抑制適用於治療腫瘤。
因此，在一些實施例中，提供用於治療有需要之患者之癌症的方法。在一個實施例中，該方法需要向患者投與有效量的本發明之抗體。在一些實施例中，患者之癌細胞(例如，基質細胞)中的至少一者過度表現IL-13RA2。
諸如嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法之細胞療法亦提供於本發明中。可使用適合的細胞，使其與本發明之抗IL-13RA2抗體接觸(或替代地經工程改造以表現本發明之抗IL-13RA2抗體)。在一些實施例中，抗體呈現於嵌合抗原受體(CAR)中。在此類接觸或工程改造後，可將細胞隨後引入需要治療之癌症患者中。癌症患者可患有如本文中所揭示之類型中之任一者的癌症。細胞(例如，T細胞)可為例如腫瘤浸潤性T淋巴球、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或其組合，但不限於此。
在一些實施例中，自癌症患者自身分離細胞。在一些實施例中，細胞由供體或細胞庫提供。當自癌症患者分離出細胞時，非所需免疫反應可降至最低。
癌症之非限制性實例包括膀胱癌、乳癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胰臟癌、前列腺癌及甲狀腺癌。在一些實施例中，癌症為胃癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌及肺癌中之一或多者。
可用本發明之抗體或其變體或衍生物治療、預防、診斷及/或預測之與細胞存活率增加相關的額外疾病或病狀包括但不限於以下各者之進展及/或轉移：惡性腫瘤及相關病症，諸如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴球性白血病、急性骨髓細胞性白血病(包括骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅白血病))及慢性白血病(例如，慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病及慢性淋巴球性白血病))；真性紅血球增多症；淋巴瘤(例如，霍奇金氏疾病(Hodgkin's disease)及非霍奇金氏疾病(non-Hodgkin's disease))；多發性骨髓瘤；瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；重鏈疾病；及實體腫瘤，其包括但不限於肉瘤及癌瘤，諸如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、大腸癌瘤、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性瘤、威爾姆氏腫瘤(Wilm's tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤(medulloblastoma)、顱咽管瘤(craniopharyngioma)、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤(hemangioblastoma)、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。
用於任何特定患者之特定劑量及治療方案將視多種因素而定，該等因素包括：所用的特定抗體、其變體或衍生物；患者年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；及投與時間；排泄率；藥物組合；及所治療之特定疾病的嚴重程度。醫學照護者對此類因素之判斷屬於本領域的一般技術。該量亦將取決於待治療之個別患者、投與途徑、調配物之類型、所用化合物之特徵、疾病之嚴重程度及所需作用。所用量可藉由此項技術中熟知之藥理學及藥物動力學原理確定。
在一些實施例中，本發明之抗體可用於治療發炎或發炎性疾病。在一些實施例中，發炎可由損傷、感染或自體免疫性疾病引起。在一些實施例中，發炎為皮膚發炎，諸如鼻息肉(NP)。
投與抗體、變體或之方法包括但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及經口途徑。抗原結合多肽或組合物可藉由任何方便途徑投與，例如藉由輸注或推注注射、藉由經由上皮或黏膜皮膚內層(例如，口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收，且可與其他生物活性劑一起投與。因此，含有本發明之抗原結合多肽的醫藥組合物可經口、經直腸、非經腸、腦池內、陰道內、腹膜內、外用(如藉由散劑、軟膏、滴劑或經皮貼片)、經頰或作為經口或鼻用噴霧投與。
如本文所使用，術語「非經腸」係指包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、胸骨內、皮下及關節內注射及輸注之投與模式。
投與可為全身性或局部的。另外，可能需要藉由包括室內及鞘內注射之任何適合途徑將本發明之抗體引入至中樞神經系統；室內注射可藉由例如附接至儲集器，諸如Ommaya儲集器之室內導管推進。亦可採用經肺投與，例如藉由使用吸入器或噴霧器，及具有氣霧劑之調配物。
可能需要將本發明之抗原結合多肽或組合物局部投與至需要治療之區域；此可藉由例如(而非作為限制)以下方式來實現：手術期間之局部輸注、局部施用(例如，在結合中)、由手術後傷口敷料、藉由注射、藉助於導管、藉助於栓劑或藉助於植入物，該植入物係多孔、無孔或膠狀材料，包括膜(諸如矽橡膠膜)或纖維。較佳地，當投與本發明之蛋白(包括抗體)時，必須注意使用蛋白不吸收之材料。
可藉由標準臨床技術確定將有效治療、抑制及預防發炎性、免疫或惡性疾病、病症或病狀的本發明之抗體的量。另外，活體外分析可視情況用於幫助鑑別最佳劑量範圍。調配物中所採用之精確劑量亦將視投與途徑及疾病、病症或病狀之嚴重性而定，且應根據從業者之判斷及各患者之情況決定。可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推出有效劑量。
作為一般提議，向患者投與的本發明之抗原結合多肽的劑量通常為患者之體重的0.1 mg/kg至100 mg/kg、患者之體重的0.1 mg/kg與20 mg/kg之間、或患者之體重的1 mg/kg至10 mg/kg。一般而言，由於對外來多肽存在免疫反應，因此人體內的人類抗體具有比其他物種之抗體更長的半衰期。因此，降低人類抗體的劑量及減少投與頻率常常係可能的。此外，本發明之抗體的投與劑量及頻率可藉由諸如脂質化之修飾來增強抗體之吸收及組織滲透(例如，滲透入腦中)而減小。
在另一實施例中，本發明之組合物與細胞介素組合投與。可與本發明之組合物一起投與的細胞介素包括但不限於IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗CD40、CD40L及TNF-α。
在其他實施例中，本發明之組合物與其他治療或防治方案(諸如放射療法)組合投與。 診斷方法
在某些腫瘤樣品中觀測到IL-13RA2之過度表現，且具有IL-13RA2過度表現細胞之患者可能對用本發明之抗IL-13RA2抗體的治療有反應。因此，本發明之抗體亦可用於診斷及預後目的。
較佳包括細胞之樣品可自患者獲得，該患者可為癌症患者或希望診斷的患者。細胞為腫瘤組織或腫瘤塊之細胞、血液樣品、尿液樣品或來自患者之任何樣品。在視情況預處理樣品之後，樣品可與本發明之抗體一起在允許抗體與可能存在於樣品中之IL-13RA2蛋白相互作用的條件下培育。可使用諸如ELISA之方法，利用抗IL-13RA2抗體以偵測樣品中IL-13RA2蛋白之存在。
樣品中IL-13RA2蛋白之存在(視情況具有一定量或濃度)可用於診斷癌症，作為患者適合於用抗體治療之指示，或作為患者已(或尚未)對癌症治療有反應之指示。對於預後方法，可在某些階段，在開始癌症治療時一次、兩次或更多次進行偵測以指示治療進展。 組合物
本發明亦提供醫藥組合物。此類組合物包含有效量的抗體及可接受之載劑。在一些實施例中，組合物進一步包括第二抗癌劑(例如，免疫檢查點抑制劑)。
在特定實施例中，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或洲政府之監管機構批准，或在美國藥典或其他一般公認的藥典中列出用於動物，且更尤其用於人類。此外，「醫藥學上可接受之載劑」一般將為無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料或任何類型之調配助劑。
術語「載劑」係指與治療劑一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之彼等油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。當靜脈內投與醫藥組合物時，水為較佳載劑。亦可使用食鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合的醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊(chalk)、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。必要時，組合物亦可含有少量潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽。亦預想抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；及張力調節劑，諸如氯化鈉或右旋糖。此等組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑、持續釋放調配物及其類似物之形式。組合物可用傳統黏合劑及載劑(諸如三酸甘油酯)調配為栓劑。經口調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級之甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適合醫藥載劑之實例描述於E. W. Martin之Remington's Pharmaceutical Sciences中，其以引用的方式併入本文中。此類組合物將含有治療有效量之抗原結合多肽(較佳呈純化形式)以及適合量之載劑，以便提供適當投與至患者之形式。調配物應適合投與模式。非經腸製劑可封裝在安瓿、拋棄式注射器或由玻璃或塑膠製成之多劑量小瓶中。
在一實施例中，根據常規程序將組合物調配成適於靜脈內投與至人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈內投與之組合物為無菌等張水性緩衝劑中之溶液。必要時，組合物亦可包括增溶劑及諸如利多卡因(lignocaine)之局部麻醉劑以減輕注射部位之疼痛。一般而言，該等成分係單獨提供或以單位劑型混合在一起提供，例如呈於指示活性劑之量的氣密密封容器(諸如安瓿或藥囊)中的乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式。在欲藉由輸注投與組合物的情況下，其可用含有無菌醫藥級水或食鹽水之輸注瓶來施配。在藉由注射投與組合物的情況下，可提供具有注射用無菌水或食鹽水之安瓿，以使該等成分可在投與前混合。
本發明之化合物可調配為中性或鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之彼等鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成之彼等鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等之鹽。 實例 實例1：產生針對人類IL-13RA2之鼠類及大鼠單株抗體
人類IL-13RA2蛋白用於使小鼠及大鼠之不同品系免疫，且相應地產生融合瘤。選擇IL-13RA2陽性結合物且次選殖。隨後，進行活體外結合及功能篩選且鑑別出具有最高結合親和力及最強功能效力之先導抗體。
12種先導鼠類抗體之VH/VL序列提供於下 表 1中。 表1.先導鼠類抗體之VH/VL序列
名稱 序列 (CDR 為帶下劃線的 ) SEQ ID NO:
24G6D5 VH QVQLQQSGPELVKPGTSVKMSCKASGYTFT SNYIH WVKQRPGQGLEWIG WIYPGDGSIKYNEKFKG KTTLTADKSSSTVYMLLSSLTSEDSAIYFCAV LRRLDY WGQGTTLTVSS 1
24G6D5 VL DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSC RASQSISNNLH WYQQKSHESPRLLIK YASQSIS GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFC QQSNSWPLT FGAGTKLELK 2
34A5G9 VH EVHLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFT EYTMH WVKQSHGKSLEWIG RINPNNGIAEYKQTFKD KATLAVDKSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYYCAR GEGYGYWFAY WGQGTLVTVSA 3
34A5G9 VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITC RTSDNIYSYLA WYQQRQGKSPQLLVS NARTLAE GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGIYYC QHHSGTPFT FGSGTNLEIE 4
42E3C4 VH EVKLVESGGGLVRPGGSLKISCAASGFTF STYGMS WVRQTPEKRLEWVA TISGGGSYTYYPDSVKG RFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCAR RDLRSAMDY WGQGTSVTVSS 5
42E3C4 VL DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC KASQNVDINVA WYQQKPGQSPKALIY SASFRYS GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC QQYNSYPLT FGGGTKLEIK 6
51G2B3 VH QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFS DSWMN WVKQRPGQGLEWIG RIYPGDGDTNYNGKFKG KATLTADKSSNTAYMQLSSLTSVDSAVYFCAR SWNGSPWFPY WGQGTLVTVSA 7
51G2B3 VL DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQTIAHRNGNTYLE WYLQKPGQSPKLLLY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHVTWT FGGGTKLEIK 8
54A4F7 VH EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS SYGMS WVRQTPEKRLEWVA TISGGGSYTYYPDSVKG RFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCAR RDLRSAMDH WGQGTSVTVSS 9
54A4F7 VL DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC RASQNVDINVA WYQQKPGQSPKSLIY SASYRYS GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC QQYNSYPLT FGGGTKLEIR 10
57F8H3F1 VH QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT NYWMN WIKQRPEQGLEWIG RIDPYETETHYNQKFRD RAILTVDKSSSTAFMQLSGLTSEDSAVYYCAR GYGHYYGVDY WGQGTSVTVSS 11
57F8H3F1 VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASENVGNFGISFVN WFQQKPGQPPKLLIY AASNLGS GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDAAMYFC QQSKGVPWT FGGGTKLEIK 12
61H8C1 VH QVQLQQSGAELARPGASVMLSCKASGYTFT SYWTQ WIKQRPGQGLEGIG AIYPGDDDTSYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAR GATLLRPFPY WGQGTLVTVSA 13
61H8C1 VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVSTAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASYRYT GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYSC QQHYSIPPT FGGGTKLEIK 14
62A8D8 VH EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS SYGMS WVRQTPEKRLEWVA TISGGGSYTYYPDSVKG RFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCAR RDLRSAMDY WGQGTSVTVSS 15
62A8D8 VL DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC KASQNVDINVA WYQQKPGQSPKALIY SASYRYS GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC QQYNNYPLT FGGGTKLEIK 16
62F6A8 VH QVQIQQSGAELARPGASVMLSCKASGYTFT DYWMQ WIKQRPGQGLEGIG AIYPGDGDTAYNQKFRG KATLTADKSSSTAYMQLNSLASEDSAVYFCAR GATLLRPFPF WGQGTLVTVSA 17
62F6A8 VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVSTAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASYRYA GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYSC QQHYSIPPT FGGGTKLEIK 18
72B4H4 VH QVQLQQPGAERVRPGASVKLSCKASGYTFT NYWMN WVKQRPEQGLEWIG RIDPYAGETHYNQKFKD KAILTVDKSSSTAYMQLRSLTSEDSAVYYCAR GYGDSYGMDH WGQGTSVTVSS 19
72B4H4 VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVDNYGISFMN WFQQKPGQPPKLLIY AASRQGS GDPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMYFC QQSKEVPWT FGGGTKLEIK 20
73A11E2 VH EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS SYGMS WVRQTPEKRLEWVA TISGGGSYTYYPDSVKG RFTISRDNARNNLYLQMNSLRSEDTALYYCAR RDLRSAMDY WGQGTSVTVSS 21
73A11E2 VL DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC KASQNVDINVA WYQQKPGQSPKALIY SASYRYS GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC QQYNSYPLT FGGGTKLEIK 22
74B5E4 VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS TYGMS WVRQTPEKRLEWVA TISGGGSYTYYPDSVKG RFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCAR RDLRSAMDY WGQGTSVTVSS 23
74B5E4 VL DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC KASQNVDINVA WYQQKPGQSPKALIY SASYRYS GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC QQYNTYPLT FGGGTKLEIK 24
實例2.鼠類抗體與IL-13RA2蛋白之結合
此實例檢驗小鼠抗體(其中28種)與A375細胞上所表現之人類IL-13RA2蛋白結合的能力。
自培養瓶採集內源性表現IL-13RA2之A375細胞。將100 μl之1×10 6個細胞/毫升的細胞與自100 nM開始至0.006 nM的4倍連續稀釋的初級抗體在冰上培育30分鐘。在用200 μl FACS緩衝液洗滌兩次之後，在冰上使細胞與二級抗體一起培育30分鐘。細胞用200 μl FACS緩衝液洗滌兩次且藉由FACS分析。
研究之結果( 圖 1A 至圖 1B及 表 2)顯示純化鼠類抗體可以較高的EC50結合於A375細胞上內源性表現之IL-13RA2。 表2. 純化小鼠抗體之結合親和力
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
62A8D8 0.90 333889
62F6A8 0.68 217495
70E6D10 1.18 254063
51A2G9 0.92 244257
46C3E3 1.75 249095
51G2B3 0.87 242845
45B5G6 0.72 188842
48F3H9 0.41 187915
66A2D7 1.89 246499
71G3C1 2.16 222342
73A11E2 0.71 223279
42E3C4 0.52 235111
72B4H4 0.76 261794
34A5G9 0.67 248373
10C6H11 1.24 216888
65F11D11 3.18 302092
61H8C1 0.41 202985
54A4F7 0.84 267980
53A10G6 1.25 224833
53G4D1 1.23 239435
67B1E10 1.32 225194
57A8F3D4 0.80 201907
47A8H10H5 0.60 201116
63E10E12B12 1.93 212433
57F8H3F1 0.70 246001
63E10C8D7 1.00 233188
24G6D5 0.68 225833
74B5E4 0.60 267529
實例3.大鼠抗體與IL-13RA2蛋白之結合
此實例檢驗大鼠抗體(其中24種)與A375細胞上所表現之人類IL-13RA2蛋白結合的能力。
自培養瓶採集內源性表現IL-13RA2之A375細胞。將100 μl之1×10 6個細胞/毫升的細胞與自100 nM開始至0.006 nM的4倍連續稀釋的初級抗體在冰上培育30分鐘。在用200 μl FACS緩衝液洗滌兩次之後，在冰上使細胞與二級抗體一起培育30分鐘。細胞用200 μl FACS緩衝液洗滌兩次且藉由FACS分析。
研究之結果( 圖 2A 至圖 2B及 表 3)顯示純化大鼠抗體可以較高的EC50結合於A375細胞上內源性表現之IL-13RA2。 表3. 純化大鼠抗體之結合親和力
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
94F6G2 1.60 177701
86A2G11 2.14 164044
156G9E4 2.07 174584
119E6G12 1.38 174436
88D8G8 1.70 166609
98A12F3 0.96 165026
98B1C5 2.58 170793
139D9D6 1.56 174468
117H1F11 6.61 178554
104G6A2 2.10 158706
156C3G7 1.15 167075
100F2C11 0.85 163131
100B4E2 1.14 171789
150H10E5 NA 19998886
154F3B3 2.71 174154
132C5A1 1.89 165490
101E2E3 1.35 179217
101F10B2 2.64 167453
123A10B11A12 1.34 171246
94F3B6B8 1.32 162963
99F7A10F4 4.49 167342
94F3B6C8 1.38 157537
94F3B8D5 1.36 162611
152H5E9H11 1.82 165451
實例4.嵌合抗體與IL-13RA2蛋白之結合
此實例製備由鼠類嵌合抗體製備的嵌合抗體(具有人類Fc)且檢驗其與A375細胞上所表現之人類IL-13RA2蛋白結合的能力。
鼠類VH及VK基因係以合成方式產生且隨後分別選殖於含有人類γ1及人類κ恆定域之載體中。純化嵌合抗體由經轉染之CHO細胞產生。
自培養瓶採集內源性表現IL-13RA2之A375細胞。將100 μl之1×10 6個細胞/毫升的細胞與自300 nM開始至0.002 nM的3倍連續稀釋的初級嵌合抗體在冰上培育30分鐘。在用200 μl FACS緩衝液洗滌兩次之後，在冰上使細胞與二級抗體一起培育30分鐘。細胞用200 μl FACS緩衝液洗滌兩次且藉由FACS分析。
如 圖 3及 表 4中所示，嵌合抗體以不同EC50結合於人類IL-13RA2。 表4.嵌合大鼠抗體之結合親和力
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi24G6D5 hIgG1 0.88 15173
xi34A5G9 hIgG1 0.26 16673
xi42E3C4-1 hIgG1 0.71 17081
xi51G2B3 hIgG1 0.64 15528
xi62A8D8 hIgG1 0.82 17291
xi62F6A8 hIgG1 0.48 15815
xi42E3C4-2 hIgG1 NA ~ 351045
xi61H8C1 hIgG1 0.47 15582
xi54A4F7 hIgG1 0.63 18048
xi57F8H3F1 hIgG1 0.99 17646
xi72B4H4 hIgG1 0.85 16871
xi73A11E2 hIgG1 0.65 17964
xi74B5E4 hIgG1 0.70 18142
實例5. 嵌合抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)
此實例量測嵌合抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
ADCC報導生物分析(Reporter Bioassay)在ADCC MOA路徑活化中之較早時刻(earlier point)使用替代讀數：經由效應細胞中之活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)路徑活化基因轉錄。另外，ADCC報導生物分析使用穩定表現FcγRIIIa受體、V158 (高親和力)變體及驅動螢火蟲螢光素酶表現之NFAT反應元件的經工程改造之Jurkat細胞作為效應細胞。ADCC MOA中之抗體生物活性經由根據NFAT路徑活化產生之螢光素酶定量；效應細胞中之螢光素酶活性藉由螢光讀數定量。信號較高且分析背景較低。
IL-13RA2嵌合單株抗體之連續稀釋液與經工程改造之Jurkat效應細胞(ADCC生物分析效應細胞)，與ADCC生物分析目標細胞(A375細胞株)一起在37℃下培育進行6小時誘導。使用Bio-GloTM試劑定量螢光素酶活性。
結果呈現於 圖 4及 表 5中。如所顯示，所有此等嵌合抗體皆展現極強的ADCC活性。 表5.嵌合抗體之結合親和力
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi24G6D5 hIgG1 0.18 1543889
xi34A5G9 hIgG1 1.83 329309
xi42E3C4-1 hIgG1 0.38 445302
xi51G2B3 hIgG1 0.75 1056643
xi54A4F7 hIgG1 0.51 532808
xi57F8H3F1 hIgG1 0.48 695892
xi61H8C1 hIgG1 0.26 716855
xi62A8D8 hIgG1 0.32 943767
xi62F6A8 hIgG1 ~ 0.4233 384827
xi72B4H4 hIgG1 0.43 412773
xi73A11E2 hIgG1 1.02 464841
xi74B5E4 hIgG1 ~ 0.3929 534397
實例6.嵌合抗體之細胞毒性活性
此實例量測嵌合抗體之細胞殺死活性。
將內源性表現IL-13RA2之A375細胞以每孔3000個細胞接種至96孔盤。在隔夜培育之後，添加已與MMAE結合的各稀釋樣品。培育5天後，藉由CellTiter-Glo試劑量測細胞存活率。藉由Envison偵測螢光素酶活性。
如 圖 5及 表 6中所示，此等嵌合抗體皆具有極強的細胞毒性活性。 表6.嵌合抗體之細胞毒性活性
抗體 IC 50(nM) 峰值(MFI)
xi24G6D5 hIgG1 1.00 109775
xi34A5G9 hIgG1 0.19 98834
xi42E3C4-1 hIgG1 0.06 88587
xi51G2B3 hIgG1 0.27 96866
xi54A4F7 hIgG1 0.11 130274
xi57F8H3F1 hIgG1 0.07 152191
xi61H8C1 hIgG1 0.33 152919
xi62A8D8 hIgG1 1.01 134240
xi62F6A8 hIgG1 0.36 128503
xi72B4H4 hIgG1 0.08 146238
xi73A11E2 hIgG1 0.03 175106
xi74B5E4 hIgG1 1.62 128406
實例6.嵌合抗體之胞吞作用
此實例測試嵌合抗體在結合於表面IL-13RA2時誘發內化的能力。
該方法使用新穎親水性且明亮的pH感測器染料(pHAb染料)，其在中性pH下不為螢光的但隨內化在酸性pH下變得高度螢光。其可用於偵測胞吞作用過程。CHO-K1/H_IL-13RA2、過度表現人類IL-13RA2之HEK-293/H_IL-13RA2細胞及內源性表現人類IL-13RA2之A375作為目標細胞，添加用pHAb染料標記之偵測抗體以評估活體外IL-13RA2嵌合單株抗體之胞吞作用。
IL-13RA2嵌合單株抗體之連續稀釋液在37℃下培育24小時。偵測螢光素酶活性。
結果顯示於 圖 6A 至圖 6C及 表 7中，其表明此等嵌合抗體具有極強的胞吞作用活性。 表7.嵌合抗體之內化
抗體 293 EC 50(nM) 293 峰值(MFI) CHO-K1 EC 50(nM) CHO-K1 峰值(MFI) A375 EC 50(nM) A375 峰值(MFI)
xi24G6D5 hIgG1 2.76 23713 0.86 12681 0.61 4114
xi34A5G9 hIgG1 1.78 25655 1.38 13863 3.63 8610
xi42E3C4-1 hIgG1 1.56 25623 1.35 18711 0.49 4695
xi51G2B3 hIgG1 3.84 28949 1.84 17110 1.32 6384
xi54A4F7 hIgG1 1.65 22791 1.42 17996 0.66 5505
xi57F8H3F1 hIgG1 2.42 26010 2.37 19197 0.74 2725
xi61H8C1 hIgG1 1.49 24686 1.02 16949 ~ 0.4412 3824
xi62A8D8 hIgG1 1.88 23262 1.58 17204 1.00 5553
xi62F6A8 hIgG1 1.73 22304 1.17 15857 ~ 0.4473 4531
xi72B4H4 hIgG1 2.18 19546 2.92 18705 1.06 5262
xi73A11E2 hIgG1 1.98 23481 1.52 17880 0.77 4311
xi74B5E4 hIgG1 1.31 21621 0.91 17727 ~ 0.4370 5173
實例7. 小鼠抗體之人源化
選擇鼠類抗體中之四者，即61H8C1、57F8H3F1、72B4H4及73A11E2用於人源化。
比較各鼠類抗體之VH及VL的胺基酸序列與人類Ig基因序列之可用資料庫以找到整體最佳匹配的人類生殖系Ig基因序列。隨後將鼠類抗體之CDR移植於匹配的人類序列中。cDNA經合成且用於產生人源化抗體。隨後將來自鼠類抗體之某些回復突變引入回人源化抗體中。使某些胺基酸突變以降低轉譯後修飾之機率。
人源化抗體之胺基酸序列提供於下 表 8 至表 11中。 人源化序列A. 61H8C1  表8A. 61H8C1 - VH之人源化
名稱 序列 SEQ ID NO:
61H8C1 VH QVQLQQSGAELARPGASVMLSCKASGYTFT SYWTQ WIKQRPGQGLEGIG AIYPGDDDTSYNQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAR GATLLRPFPY WGQGTLVTVSA 13
VH_1 (CDR移植) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWTQWVRQAPGQGLEWMGAIYPGDDDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGATLLRPFPYWGQGTLVTVSS 54
VH_2 QVQLVQSGAEV A KPGASVKVSCKASGYTFTSYWTQW I RQAPGQGLE G MGAIYPGDDDTSYNQKFKGRVTMT A DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGATLLRPFPYWGQGTLVTVSS 55
VH_3 QVQLVQSGAEV A KPGASVKVSCKASGYTFTSYWTQW I RQAPGQGLE GI GAIYPGDDDTSYNQKFKGR A T L T A D K STSTVYM Q LSSLRSEDTAVYYCARGATLLRPFPYWGQGTLVTVSS 56
VH_4 QVQLVQSGAEV A KPGASVK L SCKASGYTFTSYWTQW IK QAPGQGLE GI GAIYPGDDDTSYNQKFKG KA T L T A D K STST A YM Q LSSLRSEDTAVYYCARGATLLRPFPYWGQGTLVTVSS 57
表8B. CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-H1 SYWTQ 25
CDR-H2 AIYPGDDDTSYNQKFKG 26
CDR-H3 GATLLRPFPY 27
表8C. 61H8C1 - VL之人源化
名稱 序列 SEQ ID NO:
61H8C1 VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVSTAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASYRYT GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYSC QQHYSIPPT FGGGTKLEIK 14
VL_1 (CDR移植) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSIPPTFGQGTKLEIK 58
VL_2 DIQMTQSPSSLS T SVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGK S PKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY S CQQHYSIPPTFGQGTKLEIK 59
VL_3 DIQMTQSPSSLS T SVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGK S PKLLIYSASYRYTGVP D RFSGSGSGTDFT F TISSLQPEDFATY S CQQHYSIPPTFG G GTKLEIK 60
VL_4 DI V MTQSPSSLS T SVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGK S PKLLIYSASYRYTGVP D RF T GSGSGTDFT F TISS V QPEDFATY S CQQHYSIPPTFG G GTKLEIK 61
表8D. CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-L1 KASQDVSTAVA 28
CDR-L2 SASYRYT 29
CDR-L3 QQHYSIPPT 30
表8E.人源化抗體
VH VL 61H8C1 VH_1 61H8C1 VH_2 61H8C1 VH_3 61H8C1 VH_4
61H8C1 VL_1 H1L1 H2L1 H3L1 H4L1
61H8C1 VL_2 H1L2 H2L2 H3L2 H4L2
61H8C1 VL_3 H1L3 H2L3 H3L3 H4L3
61H8C1 VL_4 H1L4 H2L4 H3L4 H4L4
B. 57F8H3F1  表9A. 57F8H3F1 - VH之人源化
名稱 序列 SEQ ID NO:
57F8H3F1 VH QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT NYWMN WIKQRPEQGLEWIG RIDPYETETHYNQKFRD RAILTVDKSSSTAFMQLSGLTSEDSAVYYCAR GYGHYYGVDY WGQGTSVTVSS 11
VH_1 (CDR移植) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWMGRI DA YETETHYNQKFRDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGHYYGVDYWGQGTLVTVSS 62
VH_2 QVQLVQSGAEV V KPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEW I GRI DA YETETHYNQKFRDRVTMT V DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGHYYGVDYWGQGTLVTVSS 63
VH_3 QVQLVQSGAEV V KPGASVK L SCKASGYTFTNYWMNWV K QAPGQGLEW I GRI DA YETETHYNQKFRDR A T L T V D K STSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGHYYGVDYWGQGTLVTVSS 64
VH_4 QVQLVQSGAEV V KPGASVK L SCKASGYTFTNYWMNWV K Q R PGQGLEW I GRI DA YETETHYNQKFRDR AIL T V D K STST A YMEL R SLRSEDTAVYYCARGYGHYYGVDYWGQGTLVTVSS 65
表9B. CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-H1 NYWMN 31
CDR-H2 RIDPYETETHYNQKFRD 49
RID A YETETHYNQKFRD 32
CDR-H3 GYGHYYGVDY 33
表9C. 57F8H3F1 - VL之人源化
名稱 序列 SEQ ID NO:
57F8H3F1 VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASENVGNFGISFVN WFQQKPGQPPKLLIY AASNLGS GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDAAMYFC QQSKGVPWT FGGGTKLEIK 12
VL_1 (CDR移植) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENVGNFGISFVNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKGVPWTFGQGTKVEIK 66
VL_2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENVGNFGISFVNW F QQKPGKAPKLLIYAASNLGSG D PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY F CQQSKGVPWTFGQGTKVEIK 67
VL_3 DIQ L TQSPSSLSASVGDRVTITCRASENVGNFGISFVNW F QQKPGKAPKLLIYAASNLGSG D P A RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY F CQQSKGVPWTFG G GTKVEIK 68
VL_4 DI VL TQSPSSLSASVGDR A TITCRASENVGNFGISFVNW F QQKPGK P PKLLIYAASNLGSG D P A RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY F CQQSKGVPWTFG G GTK L EIK 69
表9D. CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-L1 RASENVGNFGISFVN 34
CDR-L2 AASNLGS 35
CDR-L3 QQSKGVPWT 36
表9E.人源化抗體
VH VL 57F8H3F1 VH_1 57F8H3F1 VH_2 57F8H3F1 VH_3 57F8H3F1 VH_4
57F8H3F1 VL_1 H1L1 H2L1 H3L1 H4L1
57F8H3F1 VL_2 H1L2 H2L2 H3L2 H4L2
57F8H3F1 VL_3 H1L3 H2L3 H3L3 H4L3
57F8H3F1 VL_4 H1L4 H2L4 H3L4 H4L4
C. 72B4H4  表10A. 72B4H4 - VH之人源化
名稱 序列 SEQ ID NO:
72B4H4 VH QVQLQQPGAERVRPGASVKLSCKASGYTFT NYWMN WVKQRPEQGLEWIG RIDPYAGETHYNQKFKD KAILTVDKSSSTAYMQLRSLTSEDSAVYYCAR GYGDSYGMDH WGQGTSVTVSS 19
VH_1 (CDR移植) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWMGRI DA YAGETHYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYG DA YGMDHWGQGTLVTVSS 70
VH_2 QVQLVQSGAEV V KPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEW I GRI DA YAGETHYNQKFKDRVTMT V DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYG DA YGMDHWGQGTLVTVSS 71
VH_3 QVQLVQSGAEV V KPGASVK L SCKASGYTFTNYWMNWV K QAPGQGLEW I GRI DA YAGETHYNQKFKDR A T L T V D K STSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYG DA YGMDHWGQGTLVTVSS 72
VH_4 QVQLVQSGAEV V KPGASVK L SCKASGYTFTNYWMNWV K Q R PGQGLEW I GRI DA YAGETHYNQKFKDR AIL T V D K STST A YMEL R SLRSEDTAVYYCARGYG DA YGMDHWGQGTLVTVSS 73
表10B. CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-H1 NYWMN 37
CDR-H2 RIDPYAGETHYNQKFKD 50
RID A YAGETHYNQKFKD 38
CDR-H3 GYGDSYGMDH 51
GYGD A YGMDH 39
表10C. 72B4H4 - VL之人源化
名稱 序列 SEQ ID NO:
72B4H4 VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASESVDNYGISFMN WFQQKPGQPPKLLIY AASRQGS GDPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMYFC QQSKEVPWT FGGGTKLEIK 20
VL_1 (CDR移植) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASRQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK 74
VL_2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNW F QQKPGKAPKLLIYAASRQGSG D PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY F CQQSKEVPWTFGQGTKVEIK 75
VL_3 DIQ L TQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNW F QQKPGKAPKLLIYAASRQGSG D P A RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY F CQQSKEVPWTFG G GTKVEIK 76
VL_4 DI VL TQSPSSLSASVGDR A TITCRASESVDNYGISFMNW F QQKPGK P PKLLIYAASRQGSG D P A RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY F CQQSKEVPWTFG G GTK L EIK 77
表10D. CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-L1 RASESVDNYGISFMN 40
CDR-L2 AASRQGS 41
CDR-L3 QQSKEVPWT 42
表10E.人源化抗體
VH VL 72B4H4 VH_1 72B4H4 VH_2 72B4H4 VH_3 72B4H4 VH_4
72B4H4 VL_1 H1L1 H2L1 H3L1 H4L1
72B4H4 VL_2 H1L2 H2L2 H3L2 H4L2
72B4H4 VL_3 H1L3 H2L3 H3L3 H4L3
72B4H4 VL_4 H1L4 H2L4 H3L4 H4L4
D. 73A11E2  表11A. 73A11E2 - VH之人源化
名稱 序列 SEQ ID NO:
73A11E2 VH EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS SYGMS WVRQTPEKRLEWVA TISGGGSYTYYPDSVKG RFTISRDNARNNLYLQMNSLRSEDTALYYCAR RDLRSAMDY WGQGTSVTVSS 21
VH_1 (CDR移植) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSSYGMSWVRQAPGQGLEWMGTISGGGSYTYYP ES VKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRDLRSAMDYWGQGTLVTVSS 78
VH_2 QVQLVQSGAEV V KPGASVKVSCKASGFTFSSYGMSWVRQAPGQGLEW V GTISGGGSYTYYP ES VKGR F T I T R DTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRDLRSAMDYWGQGTLVTVSS 79
VH_3 QVQLVQSGAEV V KPGASVK L SCKASGFTFSSYGMSWVRQAPGQGLEW VA TISGGGSYTYYP ES VKGR F T I T R D N STST L YME M RSLRSDDTAVYYCARRDLRSAMDYWGQGTLVTVSS 80
VH_4 QV K LV E SGAEV V KPGASVK L SCKASGFTFSSYGMSWVRQAPGQ R LEW VA TISGGGSYTYYP ES VKGR F T I T R D N STST L Y L E M RSLRSDDTAVYYCARRDLRSAMDYWGQGTLVTVSS 81
表11B. CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-H1 SYGMS 43
CDR-H2 TISGGGSYTYYPDSVKG 52
TISGGGSYTYYP E SVKG 44
CDR-H3 RDLRSAMDY 45
表11C. 73A11E2 - VL之人源化
名稱 序列 SEQ ID NO:
73A11E2 VL DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC KASQNVDINVA WYQQKPGQSPKALIY SASYRYS GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC QQYNSYPLT FGGGTKLEIK 22
VL_1 (CDR移植) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKASQNVDINVAWFQQRPGQSPRRLIYSASYRYSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQY N AYPLTFGQGTKLEIK 82
VL_2 D I VMTQSPLSLPVTLGQPASISCKASQNVDINVAW Y QQRPGQSPR A LIYSASYRYSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV F YCQQY N AYPLTFGQGTKLEIK 83
VL_3 D I VMTQSPLSLP T TLGQPASISCKASQNVDINVAW Y QQRPGQSPR A LIYSASYRYSGVPDRFSGSGSGTDFTL T ISRVEAEDVGV F YCQQY N AYPLTFG G GTKLEIK 84
VL_4 D I VMTQSPLSLP T TLGQP V S V SCKASQNVDINVAW Y QQRPGQSPR A LIYSASYRYSGVPDRFSGSGSGTDFTL T ISRVEAEDV A V FF CQQY N AYPLTFG G GTKLEIK 85
表11D. CDR序列
CDR 序列 SEQ ID NO:
CDR-L1 KASQNVDINVA 46
CDR-L2 SASYRYS 47
CDR-L3 QQYNSYPLT 53
QQYN A YPLT 48
表11E.人源化抗體
VH VL 73A11E2 VH_1 73A11E2 VH_2 73A11E2 VH_3 73A11E2 VH_4
73A11E2 VL_1 H1L1 H2L1 H3L1 H4L1
73A11E2 VL_2 H1L2 H2L2 H3L2 H4L2
73A11E2 VL_3 H1L3 H2L3 H3L3 H4L3
73A11E2 VL_4 H1L4 H2L4 H3L4 H4L4
實例8. 人源化抗體之結合親和力
此實例測試人源化抗體之結合親和力。
自培養瓶採集內源性表現IL-13RA2之A375細胞。將100 μl之1×10 6個細胞/毫升的細胞與自200 nM開始至0.003 nM的4倍連續稀釋的初級人源化抗體在冰上培育30分鐘。在用200 μl FACS緩衝液洗滌兩次之後，在冰上使細胞與二級抗體一起培育30分鐘。細胞用200 μl FACS緩衝液洗滌兩次且藉由FACS分析。
結果呈現於 圖 7A 至及 表 12中。如所顯示，人源化抗體可以較高的EC50結合於人類IL-13RA2。 表12A. 61H8C1之人源化版本的結合親和力
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
hIgG1同型 N.A. N.A.
xi61H8C1 hIgG1 0.16 22167
61H8C1 H1L1 hIgG1 0.14 20253
61H8C1 H1L2 hIgG1 0.15 19637
61H8C1 H1L3 hIgG1 0.20 20025
61H8C1 H1L4 hIgG1 0.17 19776
61H8C1 H2L1 hIgG1 0.16 22421
61H8C1 H2L2 hIgG1 0.15 22358
61H8C1 H2L3 hIgG1 0.19 22140
61H8C1 H2L4 hIgG1 0.18 21925
表12B. 61H8C1之人源化版本的結合親和力(續)
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
hIgG1同型 N.A. N.A.
xi61H8C1 hIgG1 0.16 21465
61H8C1 H3L1 hIgG1 0.15 20615
61H8C1 H3L2 hIgG1 0.17 22336
61H8C1 H3L3 hIgG1  0.15 20148
61H8C1 H3L4 hIgG1 0.20 21962
61H8C1 H4L1 hIgG1 0.17 22219
61H8C1 H4L2 hIgG1 0.14 21148
61H8C1 H4L3 hIgG1 0.18 20846
61H8C1 H4L4 hIgG1 0.19 21550
表12C. 57F8H3F1之人源化版本的結合親和力
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi57F8H3F1 hIgG1 0.33 7344
57F8H3F1 H1L1 hIgG1 0.63 7015
57F8H3F1 H1L2 hIgG1 0.78 7509
57F8H3F1 H1L3 hIgG1 0.81 7536
57F8H3F1 H1L4 hIgG1 0.94 7815
57F8H3F1 H2L1 hIgG1 0.38 6910
57F8H3F1 H2L2 hIgG1 0.89 7090
57F8H3F1 H2L3 hIgG1 0.92 7013
57F8H3F1 H2L4 hIgG1 1.01 7144
表12D. 57F8H3F1之人源化版本的結合親和力(續)
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi57F8H3F1 hIgG1 0.41 7340
57F8H3F1 H3L1 hIgG1 0.71 8157
57F8H3F1 H3L2 hIgG1 1.25 7424
57F8H3F1 H3L3 hIgG1 1.62 7614
57F8H3F1 H3L4 hIgG1 1.30 7609
57F8H3F1 H4L1 hIgG1 0.42 7353
57F8H3F1 H4L2 hIgG1 0.75 7335
57F8H3F1 H4L3 hIgG1 0.80 7184
57F8H3F1 H4L4 hIgG1 0.91 7267
表12E. 72B4H4之人源化版本的結合親和力
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi72B4H4 hIgG1 0.36 8877
72B4H4 H1L1 hIgG1 0.54 8438
72B4H4 H1L2 hIgG1 0.81 8536
72B4H4 H1L3 hIgG1 1.00 8902
72B4H4 H1L4 hIgG1 0.98 9045
72B4H4 H2L1 hIgG1 2.75 8357
72B4H4 H2L2 hIgG1 1.48 8699
72B4H4 H2L3 hIgG1 0.83 8420
72B4H4 H2L4 hIgG1 1.18 8634
表12F. 72B4H4之人源化版本的結合親和力(續)
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi72B4H4 hIgG1 0.5813 8499
72B4H4 H3L1 hIgG1 1.137 8829
72B4H4 H3L2 hIgG1 1.436 8551
72B4H4 H3L3 hIgG1 1.662 8777
72B4H4 H3L4 hIgG1 1.363 8769
72B4H4 H4L1 hIgG1 0.5522 8266
72B4H4 H4L2 hIgG1 0.9756 8613
72B4H4 H4L3 hIgG1 0.8109 8467
72B4H4 H4L4 hIgG1 1.183 8181
表12G. 73A11E2之人源化版本的結合親和力
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi73A11E2 hIgG1 0.26 8139
73A11E2 H1L1 hIgG1 82.75 389.7
73A11E2 H1L2 hIgG1 ~ 23774557481 ~ 412109
73A11E2 H1L3 hIgG1 ~ 250.6 ~ 4149
73A11E2 H1L4 hIgG1 ~ 2.678e+017 ~ 294650
73A11E2 H2L1 hIgG1 0.6 5960
73A11E2 H2L2 hIgG1 0.67 7664
73A11E2 H2L3 hIgG1 0.69 7269
73A11E2 H2L4 hIgG1 1.61 7019
表12H. 73A11E2之人源化版本的結合親和力(續)
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi73A11E2 hIgG1 0.3586 7701
73A11E2 H3L1 hIgG1 1.072 5980
73A11E2 H3L2 hIgG1 2.224 7368
73A11E2 H3L3 hIgG1 1.494 7423
73A11E2 H3L4 hIgG1 1.157 7285
73A11E2 H4L1 hIgG1 0.9434 5835
73A11E2 H4L2 hIgG1 1.122 7347
73A11E2 H4L3 hIgG1 0.9092 6985
73A11E2 H4L4 hIgG1 1.117 6839
表12I. 73A11E2之人源化版本的結合親和力(續)
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi73A11E2 hIgG1 0.45 17083
73A11E2 H1L1 hIgG1 ~ 708625 ~ 49273
73A11E2 H1L2 hIgG1 178.4 1029
73A11E2 H1L3 hIgG1 ~ 521.7 ~ 1490
73A11E2 H1L4 hIgG1 ~ 388.5 996.9
73A11E2 H2L1 hIgG1 0.56 13314
73A11E2 H2L2 hIgG1 0.67 15705
73A11E2 H2L3 hIgG1 0.67 15470
73A11E2 H2L4 hIgG1 0.66 15306
表12J. 73A11E2之人源化版本的結合親和力(續)
抗體 EC 50(nM) 峰值(MFI)
xi73A11E2 hIgG1 0.45 17083
73A11E2 H3L1 hIgG1 1.37 15156
73A11E2 H3L2 hIgG1 1.53 15878
73A11E2 H3L3 hIgG1 1.17 15883
73A11E2 H3L4 hIgG1 1.29 16583
73A11E2 H4L1 hIgG1 1.20 14883
73A11E2 H4L2 hIgG1 1.31 16290
73A11E2 H4L3 hIgG1 1.45 16196
73A11E2 H4L4 hIgG1 1.51 16454
實例 9. 人源化抗體之 ADCC
此實例量測人源化抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
ADCC報導生物分析在ADCC MOA路徑活化中之較早時刻使用替代讀數：經由效應細胞中之活化T細胞核因子(NFAT)路徑活化基因轉錄。另外，ADCC報導生物分析使用穩定表現FcγRIIIa受體、V158 (高親和力)變體及驅動螢火蟲螢光素酶表現之NFAT反應元件的經工程改造之Jurkat細胞作為效應細胞。ADCC MOA中之抗體生物活性經由根據NFAT路徑活化產生之螢光素酶定量；效應細胞中之螢光素酶活性藉由螢光讀數定量。信號較高且分析背景較低。
IL-13RA2人源化單株抗體之連續稀釋液與經工程改造之Jurkat效應細胞(ADCC生物分析效應細胞)，與ADCC生物分析目標細胞(A375細胞株)一起在37℃下培育進行6小時誘導。使用Bio-GloTM試劑定量螢光素酶活性。
結果顯示，此等人源化抗體具有極強的ADCC活性。
結果呈現於 圖 8A(IL-13RA2過度表現細胞株)及 圖 8B(內源性神經膠質瘤細胞株)中。如所顯示，所有此等人源化抗體皆展現極強的ADCC活性。 實例10. 人源化抗體之胞吞作用
此實例測試嵌合抗體在結合於表面IL-13RA2時誘發內化的能力。
該方法使用新穎親水性且明亮的pH感測器染料(pHAb染料)，其在中性pH下不為螢光的但隨內化在酸性pH下變得高度螢光。其可用於偵測胞吞作用過程。CHO-K1/H_IL-13RA2、過度表現人類IL-13RA2之HEK-293/H_IL-13RA2細胞及內源性表現人類IL-13RA2之A375作為目標細胞，添加用pHAb染料標記之偵測抗體以評估活體外IL-13RA2嵌合單株抗體之胞吞作用。
將所選人源化抗體之連續稀釋液在37℃下培育24小時。偵測螢光素酶活性。
結果顯示於 圖 9A(IL-13RA2過度表現細胞株)及 圖 9B 至圖 9C(內源性細胞株)中，其表明此等人源化抗體具有極強的胞吞作用活性。 實例11.抗體-藥物結合物之活體外細胞毒性
此實例測試與不同神經膠質瘤細胞上之毒性藥物(ADC)結合的人源化抗體的細胞毒性。
將內源性表現IL-13RA2之A375及U251細胞、穩定表現IL-13RA2之HEK-293細胞以每孔3000個細胞接種至96孔盤。在隔夜培育之後，添加已與MMAE結合的各稀釋樣品。培育5天後，藉由CellTiter-Glo試劑量測細胞存活率。藉由Envison偵測螢光素酶活性。
如 圖 10A 至圖 10C中所示，此等ADC具有極強的細胞毒性活性。 實例12.抗體-藥物結合物之活體內細胞毒性
此實例測試與MMAE (ADC)結合之人源化抗體的活體內細胞毒性。
在此研究中，使用6至8週雌性NCG小鼠(Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd)。在各小鼠右腋下(側面)處皮下接種0.1 ml PBS與基質膠(V:V=1:1)中之A375腫瘤細胞(5×10 6)以用於腫瘤發育。當腫瘤體積達至約70mm 3時(其為細胞接種後第5天)，將動物分組，隨後開始處理以用於功效研究。
在第0天、第7天及第14天經由靜脈內(i.v.)以3 mg/kg之劑量投與測試物品。在第23天終止實驗。使用測徑規在兩個維度中每週三次量測腫瘤尺寸，且以mm 3為單位使用下式表示體積：V = 0.5 a x b 2，其中a及b分別為腫瘤之長徑及短徑。隨後使用腫瘤尺寸計算T/C (%)值。使用下式計算T/C (%)：T/C % = (Ti-T0)/ (Vi-V0)×100，Ti為在給定日處理組之平均腫瘤體積，T0為在處理第一天處理組之平均腫瘤體積，Vi為在與Ti之同一天媒劑對照組之平均腫瘤體積，且V0為在處理第一天媒劑組之平均腫瘤體積。使用下式計算各組之TGI：TGI (%) = [100-T/C]。資料點表示組(n=5)平均值，誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。與PBS對照相比，基於腫瘤尺寸藉由t檢定計算p值。
圖 11A顯示不同組中帶有腫瘤之小鼠的體重變化。資料點表示組平均體重。誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。 圖 11B及 表 13顯示在投與測試ADC後帶有A375腫瘤之小鼠的腫瘤生長曲線。如此等圖中所示，ADC展現強的活體內細胞毒素活性。 表13. 處理後腫瘤生長量測值
T/C (%) 處理後天數 0 2 5 7 9 13 16 20 23
G2 - 71.58 23.20 -10.55 -10.69 -8.24 -6.18 -2.29 1.37
G3 - 98.78 21.32 7.86 -3.80 -1.39 -0.72 3.21 12.67
G4 - 60.43 33.37 5.46 -3.84 -3.40 -0.58 2.86 10.72
G5 - 84.85 22.37 -0.35 -4.15 -4.71 -2.48 3.39 10.43
TGI (%) 處理後天數 0 2 5 7 9 13 16 20 23
G2 - 28.42 76.80 110.55 110.69 108.24 106.18 102.29 98.63
G3 - 1.22 78.68 92.14 103.80 101.39 100.72 96.79 87.33
G4 - 39.57 66.63 94.54 103.84 103.40 100.58 97.14 89.28
G5 - 15.15 77.63 100.35 104.15 104.71 102.48 96.61 89.57
P 值 處理後天數 0 2 5 7 9 13 16 20 23
G2 0.9515 0.2847 0.0038 0.0001 0.0000 0.0001 0.0000 0.0002 0.0001
G3 0.9733 0.9455 0.0009 0.0003 0.0000 0.0002 0.0000 0.0002 0.0002
G4 0.9704 0.1019 0.0033 0.0002 0.0000 0.0001 0.0000 0.0002 0.0002
G5 0.9061 0.5923 0.0014 0.0002 0.0000 0.0001 0.0000 0.0002 0.0002
*       *      *
本發明之範疇不受意欲作為本發明之個別態樣之單一說明的所描述之特定實施例限制，且在功能上等效之任何組合物或方法均在本發明之範疇內。熟習此項技術者將顯而易見，在不脫離本發明之精神或範疇的情況下，可對本發明之方法及組合物進行各種修改及變化。因此，希望本發明涵蓋本發明之修改及變化，限制條件為其在所附申請專利範圍及其等效物之範疇內。
本說明書中所提及之所有公開案及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用的程度如同特定及個別地指示各個別公開案或專利申請案以引用的方式併入一般。
圖 1A 至圖 1B顯示小鼠抗體對A375細胞上之IL-13RA2的結合親和力。
圖 2A 至圖 2B顯示大鼠抗體對A375細胞上之IL-13RA2的結合親和力。
圖 3顯示某些嵌合抗體對A375細胞上之IL-13RA2的結合親和力。
圖 4顯示嵌合抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
圖 5顯示嵌合抗體之細胞殺死活性。
圖 6A 至圖 6C顯示嵌合抗體之內化(internationization)。
圖 7A 至圖 7J顯示人源化抗體之結合親和力。
圖 8A 至圖 8B在IL-13RA2過度表現細胞株(A)及內源性神經膠質瘤細胞株(B)中顯示人源化抗體之ADCC。
圖 9A 至圖 9C顯示所選擇之人源化抗體的內化。
圖 10A 至圖 10C顯示使用人源化抗體之抗體-藥物結合物的活體外細胞毒性(cytoxity)。
圖 11A 至圖 11B顯示使用人源化抗體之抗體-藥物結合物的活體內細胞毒性。
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Claims (28)

  1. 一種抗體或其片段，其對人類介白素13受體次單元α2 (IL-13RA2)蛋白具有結合特異性，其中該抗體或其片段包含：重鏈可變區，其包含重鏈互補決定區CDRH1、CDRH2及CDRH3；及輕鏈可變區輕鏈，其包含互補決定區CDRL1、CDRL2及CDRL3，且其中： (a)該CDRH1包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列， 該CDRH2包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列， 該CDRH3包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列， 該CDRL1包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列， 該CDRL2包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，及 該CDRL3包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列， (b)該CDRH1包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列， 該CDRH2包含SEQ ID NO: 32或49之胺基酸序列， 該CDRH3包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列， 該CDRL1包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列， 該CDRL2包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列，及 該CDRL3包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列， (c)該CDRH1包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列， 該CDRH2包含SEQ ID NO: 38或50之胺基酸序列， 該CDRH3包含SEQ ID NO: 39或51之胺基酸序列， 該CDRL1包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列， 該CDRL2包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列，及 該CDRL3包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列，或 (d)該CDRH1包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列， 該CDRH2包含SEQ ID NO: 44或52之胺基酸序列， 該CDRH3包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列， 該CDRL1包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列， 該CDRL2包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列，及 該CDRL3包含SEQ ID NO: 48或53之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體或其片段，其中該CDRH1包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，該CDRH2包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，該CDRH3包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，該CDRL1包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，該CDRL2包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，且該CDRL3包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
  3. 如請求項2之抗體或其片段，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 13及54至57組成之群的胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 14及58至61組成之群的胺基酸序列。
  4. 如請求項2之抗體或其片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之抗體或其片段，其中該CDRH1包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，該CDRH2包含SEQ ID NO: 32或49之胺基酸序列，該CDRH3包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列，該CDRL1包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列，該CDRL2包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列，且該CDRL3包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。
  6. 如請求項5之抗體或其片段，其中該CDRH2包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
  7. 如請求項5之抗體或其片段，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 11及62至65組成之群的胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 12及66至69組成之群的胺基酸序列。
  8. 如請求項5之抗體或其片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。
  9. 如請求項1之抗體或其片段，其中該CDRH1包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列，該CDRH2包含SEQ ID NO: 38或50之胺基酸序列，該CDRH3包含SEQ ID NO: 39或51之胺基酸序列，該CDRL1包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列，該CDRL2包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列，且該CDRL3包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列。
  10. 如請求項9之抗體或其片段，其中該CDRH2包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列，且該CDRH3包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列。
  11. 如請求項9之抗體或其片段，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 19及70至73組成之群的胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 20及74至77組成之群的胺基酸序列。
  12. 如請求項9之抗體或其片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列。
  13. 如請求項1之抗體或其片段，其中該CDRH1包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列，該CDRH2包含SEQ ID NO: 44或52之胺基酸序列，該CDRH3包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，該CDRL1包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列，該CDRL2包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列，且該CDRL3包含SEQ ID NO: 48或53之胺基酸序列。
  14. 如請求項13之抗體或其片段，其中該CDRH2包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列，且該CDRL3包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列。
  15. 如請求項13之抗體或其片段，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 21及78至81組成之群的胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 22及82至85組成之群的胺基酸序列。
  16. 如請求項13之抗體或其片段，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗體或其片段，其經人源化。
  18. 一種抗體或其片段，其對人類介白素13受體次單元α2 (IL-13RA2)蛋白具有結合特異性且與如請求項1之抗體或其片段結合於該IL-13RA2蛋白上之相同的抗原決定基，或與如請求項1之抗體或其片段競爭結合於該IL-13RA2蛋白。
  19. 如請求項1至18中任一項之抗體或片段，其能夠介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
  20. 如請求項1至19中任一項之抗體或其片段，其進一步具有針對第二目標蛋白之結合特異性。
  21. 一種抗體-藥物結合物，其包含與抗贅生劑結合的如請求項1至20中任一項之抗體或其片段。
  22. 一種組合物，其包含如請求項1至20中任一項之抗體或其片段及醫藥學上可接受之載劑。
  23. 一種聚核苷酸或多種聚核苷酸，其編碼如請求項1至20中任一項之抗體或其片段。
  24. 一種細胞，其包含如請求項23之一或多種聚核苷酸。
  25. 一種治療有需要之患者之癌症或發炎的方法，其包含向該患者投與如請求項1至20中任一項之抗體或其片段。
  26. 一種如請求項1至20中任一項之抗體或其片段的用途，其用於製備供治療癌症或發炎用之藥劑。
  27. 如請求項25之方法或如請求項26之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、白血病、淋巴瘤、胰臟癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、頭頸癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、腎癌、黑色素瘤、前列腺癌及甲狀腺癌。
  28. 如請求項25之方法或如請求項26之用途，其中該發炎係由感染或自體免疫疾病引起。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101440130B (zh) * 2008-11-21 2011-07-27 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人IL-13Rα2单克隆抗体的重链和轻链的可变区
JP2016503295A (ja) * 2012-11-07 2016-02-04 ファイザー・インク 抗ｉｌ−１３受容体アルファ２抗体および抗体−薬物コンジュゲート
CN108456250A (zh) * 2017-02-17 2018-08-28 科济生物医药（上海）有限公司 靶向il-13ra2的抗体及其应用
CN112521502A (zh) * 2019-09-19 2021-03-19 北京慧能安生物科技有限公司 一种抗IL-13Rα2的纳米抗体及其编码序列和应用
EP4132581A4 (en) * 2020-04-11 2024-04-10 Univ Northwestern HUMANIZED ANTIBODY DIRECTED AGAINST THE TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN IL13RA2

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