CN112521502A - 一种抗IL-13Rα2的纳米抗体及其编码序列和应用 - Google Patents

一种抗IL-13Rα2的纳米抗体及其编码序列和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种抗IL‑13Rα2的纳米抗体及其编码序列和应用。所述纳米抗体的蛋白序列含有重链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。本申请提供的抗IL‑13Rα2的纳米抗体，应用于CAR‑T细胞治疗，可有效提高对IL‑13Rα2表达阳性的靶细胞的杀伤效果，因而在抗体免疫疗法和细胞免疫疗法方面具有广泛应用。纳米抗体具有极强的肿瘤组织渗透性，使得其在实体瘤的治疗中具有独特的优势。

Description

一种抗IL-13Rα2的纳米抗体及其编码序列和应用
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，具体地涉及一种抗IL-13Rα2的纳米抗体及其编码序列和应用。
背景技术
白细胞介素13受体亚基α2(Interleukin-13receptor subunit alpha-2，IL-13Rα2)又称CD213α2。IL-13Rα2属于Ⅰ型跨膜蛋白，由位于Xq13.1-q28的IL-13Rα2基因编码，共包含380个氨基酸。
研究证实，IL-13Rα2在少数正常的组织如睾丸和人支气管、肺、皮肤等的成纤维细胞中低水平表达，而在人类神经胶质瘤，乳腺癌，卵巢癌，头颈癌，肝癌等肿瘤细胞中高表达。相关研究表明，IL-13Rα2在人类神经胶质瘤肿瘤细胞上表达异常丰富，而在正常脑组织细胞中IL-13Rα2表达量极低，这一特点使IL-13Rα2成为人类神经胶质瘤靶向治疗方案中的理想靶点。
与IL-13Rα2结合的白细胞介素13(Interleukin-13，IL-13)是典型的2型细胞因子，在癌症和正常生理条件下都发挥了其调节免疫反应和免疫微环境的重要作用。研究发现，胶质瘤细胞内IL-13Rα2mRNA过表达，而在肿瘤细胞表面IL-13Rα2表达量高达30000个/细胞，这些受体分子可与IL-13高亲和力结合。与低亲和力受体IL-13Rα1不同的是，IL-13与IL-13Rα2结合后，可通过胞内一系列信号通路抑制细胞正常凋亡，促进肿瘤细胞免疫逃逸、侵袭、转移和肿瘤进展。近些年来，出现了很多针对胶质瘤IL-13Rα2这一靶点的新型药物，如IL-13-PE等重组细胞毒素和针对IL-13Rα2的单克隆抗体和单链抗体scFv。然而这些药物在实体肿瘤中穿透性差，分布不均，靶向特异性低，仍然制约着这些新型药物在胶质瘤等实体瘤临床治疗中的广泛应用。
纳米抗体(Nanobody)来自于骆驼科动物和鲨鱼血清中独特的重链抗体(HCAb)。是通过人工技术获取HCAb中的重链可变区片段(VHH)，与传统抗体的抗原结合片段在结构和功能上是等价的。纳米抗体与传统的单克隆抗体和单链抗体相比在实体瘤治疗中具有很多优势：1.纳米抗体是已知的最小抗体，具有较强的肿瘤组织渗透性。2.纳米抗体结构简单，在制备过程中可直接从B淋巴细胞中克隆出完整的亲和力成熟的VHH，具有较强的亲和力和靶向特异性，高效靶向肿瘤细胞，降低对正常组织细胞的损伤。3.纳米抗体可溶性极高，储存时间久，具有超强的抵抗热变性和极端pH等化学变性能力，能够在肿瘤微环境中稳定保持抗原结合能力，长期发挥治疗效应。4.纳米抗体与人类VH序列的高度一致性使其具有较低的免疫原性，在肿瘤治疗中安全性更高。5.生产成本低，纳米抗体的筛选制备过程很快，免疫库可用来并行的选择各种抗原的结合物，大大减少时间成本和研发成本。
近年来，纳米抗体这一研究领域飞速发展，然而，本领域尚缺乏令人满意的针对IL-13Rα2的纳米抗体，因此有必要开发新的有效针对IL-13Rα2的特异性纳米抗体。
发明内容
本发明旨在提供一种抗IL-13Rα2的纳米抗体，该抗体具有与IL-13Rα2结合的功能。
本发明的一方面提供了一种抗IL-13Rα2的纳米抗体，所述纳米抗体的蛋白序列含有重链可变区，
所述重链可变区包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的抗IL-13Rα2的纳米抗体。
本发明的另一方面提供了上述抗IL-13Rα2的纳米抗体在制备用于恶性肿瘤的预防和/或治疗的药物中的用途。
在优选的实施方式中，所述恶性肿瘤选自脑癌、肝癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌中的至少一种。
本发明的另一方面提供了上述纳米抗体的编码序列。
本发明的另一方面提供了含有上述编码序列的重组表达载体、表达盒或转基因细胞系。
本发明的又一方面提供了上述重组表达载体、表达盒或转基因细胞系在制备抗IL-13Rα2纳米抗体中的应用。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的抗IL-13Rα2的纳米抗体，应用于CAR-T细胞治疗，可有效提高对IL-13Rα2表达阳性的靶细胞的杀伤效果；
2)本申请所提供的抗体序列在抗体免疫疗法和细胞免疫疗法方面具有广泛应用。
3)纳米抗体分子量很小，是目前能够结合抗原的最小单位。纳米抗体具有极强的肿瘤组织渗透性，使得其在实体瘤的治疗中具有独特的优势。
附图说明
图1是根据实施例3用ELISA法分析羊驼免疫效果的附图。
图2是根据实施例5的流式分选单个羊驼B细胞的分析图。
图3和图4分别是根据实施例7获取的单个B细胞抗体序列的克隆电泳图。
图5是根据实施例7的VHH测序结果分析。
图6为根据实施例8制备的载体示意图。
图7为根据实施例11的FACS检测结果。其中图7(b)示出了系列的检测结果，检测结果与呈现数据的坐标体系均与放大的VC190102-pFuse-C3的检测结果的图7(a)相同，横坐标的范围为100～106；
图8为根据实施例12的慢病毒载体示意图。
图9(a)～图9(d)是CAR-T细胞阳性率流式细胞检测结果。
图10(a)和10(b)分别示出IL-13Rα2纳米抗体应用于CAR-T细胞治疗，具有增强对靶细胞杀伤的效果。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
实施例1 CHO-K1-IL-13Rα2重组细胞株构建
IL-13Rα2过表达慢病毒制备
(1)从NCBI数据库中检索human IL-13Rα2的编码区序列信息，进行全基因合成(GenScript)并亚克隆慢病毒过表达载体Lenti-CMV-puro(iCarTab)中，制备过表达载体，经sanger测序验证插入序列无误后，制备转染级别的慢病毒载体。
(2)培养293T细胞(ATCC,CAT#CRL-11268)。准备15cm细胞培养皿，接种5×106个细胞/皿，加入完全培养基(DMEM高糖、10％FBS)，置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养。
(3)从冰箱中取出PEI及慢病毒表达质粒和包装质粒(Lenti-CMV-IL-13Rα2-Puro、Lenti-packaging Mix)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，预热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入10μg Lenti-CMV-IL-13Rα2-Puro、11μgLenti-packaging Mix，移液枪上下吹打充分混匀后，加入26μL 100μM PEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
(4)将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基，将培养皿重新放回培养箱中继续培养。
(5)连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，配平后，50000g 4℃离心2小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μL PBS缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。
IL-13Rα2过表达重组细胞株制备
(1)复苏靶细胞CHO-K1(ATCC,CCL-61)，连续传代5次，使细胞处于对数生长期。
(2)取一块新的6孔板，按照500000个细胞/孔的密度将靶细胞接种至6孔板中，并加入3mL完全培养基，过夜培养。
(3)将慢病毒加入6孔板中，用移液器轻轻混匀后，将孔板置于离心机中，800g室温离心1小时；
(4)离心结束后，将孔板取出，置于培养箱中继续培养24小时；
(5)过夜培养后，将孔板中的培养基更换为新鲜的培养基，继续培养24小时；
(6)将培养基更换为含有嘌呤霉素(puromycin)的培养基，连续培养5天，直至将所有的未被感染的靶细胞杀死。
(7)将剩余的活细胞继续扩大培养后，收集细胞进行冻存，同时保留部分细胞进行流式细胞仪(FACS)验证IL-13Rα2的过表达水平。
IL-13Rα2过表达重组细胞株FACS验证
(1)分别离心收集1×106个重组细胞株和对应的未转染细胞，使用PBS缓冲液充分洗涤三次。
(2)用100uL PBS缓冲液(含5％BSA)重悬细胞沉淀，然后加入荧光标记的IL-13Rα2抗体，充分混匀后，室温避光孵育30分钟。
(3)500g室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清；使用1mL PBS缓冲液充分洗涤细胞三次。
(4)最后用500uL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，使用流式细胞仪分析过表达重组细胞株膜表面IL-13Rα2的表达水平。
实施例2羊驼免疫
采用制备的IL-13Rα2重组蛋白免疫羊驼，皮下多点免疫4次，免疫流程如表1所示。
表1
Figure BDA0002207501910000061
实施例3免疫效价检测
(1)采集羊驼的5ml外周血，将收集有血液样本的离心管置于37℃培养箱内放置1小时；然后将血液样本转移至4℃过夜；
(2)将血清从血块中分离，并转移至一个新的无菌离心管中，5000rpm离心20min；
(3)将血清转移至一个新的无菌离心管中，采用ELISA检测免疫效价。
(4)将血清按照1:1000，1:5000，1:10000，1：20000，1:40000，1:80000，1:160000的稀释梯度进行稀释，分别与不同浓度抗原(1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml，5ug/ml)预包被的96孔板进行ELISA检测，PBS作为阴性对照。使用酶标仪450nm下读板。
ELISA法分析羊驼免疫效果的结果如图1所示，结果表明，在包被了IL-13Rα2蛋白96孔吸光板中，免疫后的羊驼血清在不同的稀释倍数(1:160000-1:1000)条件下，均具有强于阴性对照(PBS)的O.D吸光值。而且，在不同的IL-13Rα2蛋白包被量的条件下(1ug/ml-5ug/ml)，包被的IL-13Rα2蛋白量越大，O.D吸光值越大。说明对羊驼进行的IL-13Rα2蛋白免疫的效果是成功的。
实施例4 FITC偶联IL-13Rα2蛋白
(1)使用0.1M碳酸盐缓冲液置换IL-13Rα2蛋白(iCarTab)，调整蛋白浓度为2mg/ml。
(2)向上述蛋白样品中加入适量新鲜制备的FITC溶液(invitrogen)，立即用移液器上下吹打充分混匀，放入37℃培养箱中避光孵育90分钟。
(3)使用PBS进行buffer置换，去除未标记的多余的FITC，将标记好的IL-13Rα2蛋白保存于4℃备用。
实施例5单个B细胞分选
(1)采集50ml外周血，使用淋巴细胞分离液分选PBMC。
(2)将PBMC分为两份，第一份细胞为5×105个细胞，作为阴性对照，第二份细胞为1×107。
(3)向第二份细胞悬液中加入FITC偶联的IL-13Rα2重组蛋白以及APC-Anti-Camelid VHH抗体。冰上避光孵育1小时，每10分钟轻轻吹打一次。
(4)500g、4℃离心5分钟，去除含有抗体的上清。
(5)使用预冷的PBS清洗3次。
(6)加入500uL预冷的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，并置于冰上准备进行单细胞分选。
(7)配置裂解液，取96孔PCR板，每孔内加入4uL裂解液；置于干冰(分选前进行准备)
(8)采用流式细胞分选仪，分选FITC和APC双阳性的单个细胞至96孔板中(预先加入裂解液)。
图2流式分析图为免疫后的羊驼的PBMC细胞染色分选图。横轴为FITC荧光标记的IL-13Rα2蛋白对羊驼PBMC的染色信号；纵轴为APC荧光标记的Anti-Camelid VHH抗体对羊驼PBMC的染色信号。P4门即为染色双阳性的细胞群，表示可以该群细胞产生的抗体可以识别IL-13Rα2蛋白。因此，P4门里面的细胞即为目的B细胞，用于后续单个B细胞抗体基因的克隆和测序。
实施例6单个B细胞裂解产物的逆转录
所有使用的移液器枪头需RNase/DNase-free，操作需要在洁净无RNA酶污染的区域。
(1)从干冰或-80℃冰箱中取出孔板，置于冰上解冻。
(2)设置PCR仪的温度为65℃备用。
(3)在洁净区域按照下表2配置逆转录混合物I(1块96孔板用量)。
表2
Figure BDA0002207501910000081
(4)在冰上，向每孔内加入7uL逆转录混合物I。轻轻吹打混匀。
(5)盖上孔盖后400g、4℃离心1分钟。
(6)将孔板置于65℃PCR仪上孵育5分钟。
(7)立即将孔板置于冰上冷却1-5分钟。
(8)在洁净区域按照下表3配置逆转录混合物II(一块96孔板用量)。
表3
Figure BDA0002207501910000082
(9)在冰上，向每孔内加入7uL逆转录混合物II。轻轻吹打混匀。
(10)盖上孔盖后400g、4℃离心1分钟。
(11)将孔板置于PCR中，并运行如下表4程序：
表4
Figure BDA0002207501910000091
(12)PCR反应结束后，向每孔内加入10uL无菌超纯水对cDNA样本进行稀释；稀释后的cDNA样品可以保存于-20℃或-80℃。
实施例7单个B细胞抗体序列的克隆
(1)根据下表5分别配置PCR反应体系混合物(一块96孔板用量)
表5
Figure BDA0002207501910000092
(2)取96孔板，用于VHH的克隆，做好标记后，向每孔内加入19uL PCR反应混合液。盖上孔盖后400g、4℃离心1分钟。
(3)取出之前制备的cDNA样品板，用8通道移液器取2uL cDNA样本加入PCR反应孔内，并吹打数次混匀。
(4)配置好PCR反应体系后，按照如下表6程序设置PCR仪：
表6
Figure BDA0002207501910000101
(5)PCR反应结束，使用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
(6)根据琼脂糖凝胶电泳结果，分离目标片段，使用引物上的adapter序列进行测序分析。
单个B细胞抗体序列的克隆如图3和图4所示，其中图3对应S190101号板，图4对应S190102号板。在凝胶成像图3和图4中，根据marker条带判断，在400bp条带附近的PCR产物符合预期，扩增的片段与目的片段大小相同。各条带的亮度代表各PCR产物的量，条带越亮、越单一说明获得的PCR产物的纯度越高，后续测序的质量也就越高。
根据获得的单域抗体的测序信息，对其进行序列比对分析。由图5所示的测序结果所示，获得的单域抗体序列具有多样性；将其中具有代表性的33种抗体序列进行基因合成，并亚克隆至带有human IgG1-Fc的表达载体中，用于后续进一步的功能验证。
实施例8重组抗体表达载体的构建
将上述分析的VHH抗体序列分别进行基因合成，与human IgG1-Fc串联亚克隆至表达载体pFuse-hIgG1-Fc2中，载体示意图如图6所示。载体经测序验证无误后，使用质粒大提试剂盒(Qiagen)制备去内毒素质粒备用。
实施例9重组抗体的表达
(1)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，预热至室温。取500μl PBS至24孔板的一个孔，加入4μg pFuse-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入12μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
(2)将上述DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F-SVP16细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130rpm培养6小时(在其他实施例中，培养时间可以在6～8小时之间变化)后，加入1.5mL新鲜的FreeStyleTM 293培养基(invitrogen)，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
(3)连续培养3天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，进行后续的流式和ELISA检测。
实施例10流式检测重组抗体与靶蛋白的结合
(1)从液氮中复苏CHO-K1空细胞(ATCC,CCL-61)及CHO-K1-IL-13Rα2重组细胞株，使用F12K、10％FBS完全培养基调整细胞状态至对数生长期。
(2)将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为1×106个细胞，使用1mL PBS重悬细胞，分别加入重组表达的人源化单链抗体，每个单链抗体均需与CHO-K1空细胞及CHO-K1-IL-13Rα2重组细胞株孵育，充分混匀后，室温孵育半小时。
(3)800g室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
(4)加入2uL PE标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30min；
(5)800g室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
(6)使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。
实施例11 ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合
(1)使用无菌PBS稀释IL-13Rα2重组蛋白至终浓度为3ug/mL。取一块新的96孔板，加入100uL/孔，4℃包被过夜。
(2)去掉抗原包被液，使用PBST(含0.5％的吐温)洗涤3次。
(3)加入200uL/孔的3％BSA，37℃封闭2小时；
(4)去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板3次；
(5)加入100ul重组表达的抗体上清液，室温孵育1小时，对照孔为PBS；
(6)去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤3次；
(7)加入100uL HRP-Protein A(1:10000稀释)，室温孵育1小时；
(8)去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板3次；
(9)加入100uL/孔TMB显色液；
(10)室温避光孵育15分钟；
(11)加入50uL/孔终止液；
(12)使用酶标仪读取孔内的O.D值。
ELISA检测结果如表7所示，OD值越高说明该重组抗体与靶蛋白的亲和力越高。在本实验中，筛选出了C3,HC1,HD9,HD10,A1,B3,B4,HD6,HB8,HC10,HB5和HD2这12种OD值最高的重组抗体并进行后续的流式染色验证筛选工作。
表7
Figure BDA0002207501910000121
FACS检测结果
将上述ELISA检测阳性的抗体C3,HC1,HD9,HD10,A1,B3,B4,HD6,HB8,HC10,HB5和HD2孵育CHO-K1-IL-13Rα2，进行流式检测。结果如图7(a)和图7(b)所示，以阴性对照CHO-K1空细胞流式结果划门，分布在所划门中的细胞为结合了重组抗体的CHO-K1-IL-13Rα2阳性染色细胞。分布在所划门内的细胞比例越高，说明重组抗体与IL-13Rα2的亲和力越高。根据流式检测结果B5，HC1和HC10显示出与CHO-K1-IL-13Rα2细胞极高的亲和力。此外，C3在流式检测中与CHO-K1-IL-13Rα2重组细胞的亲和力相比于B5，HC1和HC10低一些，但C3在ELISA检测结果中与IL-13Rα2重组蛋白的亲和力很高。综合ELISA和流式检测结果，最终选择B5，C3，HC1和HC10抗体序列构建CAR慢病毒表达载体，用于进行CAR-T细胞体外药效学实验。
实施例12基于IL-13Rα2单域抗体的CAR表达载体和慢病毒制备
嵌合抗原受体设计及慢病毒表达载体构建
根据流式和ELISA检测结果，选择与CHO-K1-IL-13Rα2结合较好的抗体序列(B5，C3，HC1和HC10)构建嵌合抗原受体(CAR)慢病毒表达载体B5CAR，C3CAR，HC1CAR和HC10CAR，慢病毒载体示意图如图8所示。
根据设计的CAR序列信息，构建嵌合抗原受体慢病毒表达载体，经sanger测序确证插入序列无误后，进行慢病毒包装。
CAR慢病毒制备
(1)培养293T细胞。准备15cm皿，接种5×106个细胞，加入完全培养基(DMEM高糖、10％FBS、双抗)，置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养。
(2)从冰箱中取出100μM PEI及慢病毒表达和包装质粒(Lenti-EF1a-CAR、Lenti-packaging Mix)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，预热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入10μg Lenti-EF1a-CAR、6μg Lenti-packagingMix，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μL 100μM PEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
(3)将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，培养6小时(在其他实施例中，培养时间可以在6～8之间变化)后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。
(4)连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，转至离心管中，配平后，20000g，4℃离心2小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μL PBS缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。
实施例13外周血T细胞分离和CAR-T细胞制备
(1)使用PBS洗涤Dynabeads(invitrogen)2遍
(2)取适量的Dynabeads加入到PBMC中，轻轻混匀，室温孵育20min。
(3)将2mL细胞冻存管插入磁极，室温静置1min，保持冻存管插在磁极的孔内，轻轻倒置，将管内的液体倒出。
(4)将细胞冻存管从磁极中取出，加入3mL x-vivo 15培养基(Lonza，额外加入200IU/mL IL2，10ng/mL IL7，5ng/mL IL15)，用移液器重悬细胞和beads混合物，并调整细胞密度至0.8×106个细胞/mL(在其他可行的实施例中，调整细胞密度可以在0.5～1×106个细胞/mL之间变化)。
(5)将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中连续48h后，将细胞密度调整至1×106个/mL。按照MOI＝20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：
所需病毒量(mL)＝(MOI×细胞数量)/病毒滴度
(6)从-80℃超低温冰箱中，取出慢病毒，迅速在37℃水浴锅中解冻。
(7)向准备好的T细胞中，加入polybrene至终浓度为6μg/mL，加入上述计算所得的病毒量，用移液器轻轻吹打充分混匀，使用封口膜将培养器皿密封，800g室温离心1小时。
(8)离心结束后，撕掉封口膜，将培养器皿置于37℃ 5％CO2的培养箱中，继续培养24小时，对T细胞进行换液。
(9)继续培养7天左右，通过流式细胞仪检测CAR-T细胞阳性率。
制备CAR-T细胞，采用流式细胞仪检测CAR-T细胞表面CAR的表达水平；结果表明所制备的CAR-T细胞表面均能够正确表达所构建的嵌合抗原受体，可以用于体外药效学实验。结果如图9(a)～9(d)所示，以未转染T细胞作为阴性对照划门，分布在所划门内的细胞为阳性表达CAR的CAR-T细胞，且B5-CART，C3-CART，HC1-CART和HC10-CART中CAR表达的阳性率均高于30％。
实施例14 CAR-T和靶细胞共培养杀伤实验及细胞因子分泌水平检测
(1)调整胶质瘤细胞U87靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；
(2)用胰酶将贴壁的胶质瘤细胞U87靶细胞重悬于完全培养基中，调整细胞密度至2～5×105个/mL，取一块新的96孔板，按照100μL/孔的量接种靶细胞(不同细胞接种量不同，以接种24h汇合度为80％为参考)。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μL无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，过夜培养。
(3)离心收集制备的B5-CART，C3-CART，HC1-CART和HC10-CART细胞，使用10％FBS的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌PBS轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照E/T比例，分别加入各种CAR-T细胞，并将最终体积补至200μL/孔；将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，培养24小时。
(4)培养结束后，将孔板从培养箱中取出，1200g室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，转移上清进行Elisa检测IL2和IFN-γ的表达。
(5)将上述处理后的数据使用GraphPad 5.0进行作图。
以表达IL-13Rα2的胶质瘤细胞U87为靶细胞，以上述制备的CAR-T细胞作为效应细胞，按照不同的效靶比建立体外共培养体系。细胞因子分泌水平检测的结果表明，C3CAR-T和B5CAR-T可以显著激活T细胞，引起T细胞大量分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子。结果如图10(a)和10(b)所示。图10(a)为CAR-T细胞与U87靶细胞共培养后CAR-T细胞分泌的IL-2的量。CAR-T与靶细胞识别后被激活，激活的CAR-T细胞能够分泌IL-2，IL-2分泌的越多，说明CAR-T细胞与肿瘤靶细胞的识别和激活增殖能力越强。C3CAR-T和B5CAR-T在与肿瘤细胞U87体外共培养时，大量分泌了IL-2且IL-2分泌的量随着效靶比的升高而增加。这一结果反映了C3CAR-T和B5CAR-T能够在体外有效的识别肿瘤细胞U87，并在激活后大量增殖。图10(b)为CART细胞与靶细胞共培养后CART细胞分泌的IFN-γ的含量。CAR-T细胞与肿瘤细胞U87识别后被激活，激活后的CAR-T细胞进一步分化为具有杀伤效应的CTL细胞，CTL细胞能够分泌IFN-γ这一细胞因子，IFN-γ分泌的越多说明分化增殖的CTL细胞越多。C3CAR-T和B5CAR-T在与肿瘤细胞U87体外共培养时，大量分泌了IFN-γ，且IFN-γ的分泌量随着效靶比的升高而增加。结合体外共培养实验IL-2和IFN-γ的结果，C3CAR-T与B5CAR-T能够有效识别肿瘤细胞U87并发挥杀伤效应。相反，HC1CAR-T细胞和HC10CAR-T细胞对U87靶细胞则没有杀伤效果。
综上所述，编号为C3和B5的两个针对IL-13Rα2的纳米抗体可有效识别和结合IL-13Rα2。将C3和B5作为CAR识别IL-13Rα2，制备CAR-T细胞，可有效提高对阳性表达IL-13Rα2的肿瘤细胞的杀伤作用。
本发明示例性的C3和B5的原始序列分别依次包括CDR1，CDR2，CDR3序列区域：
C3(SEQ ID NO 7)
EVQLVESGGGLAQAGGSLRLSCAASGRSFSGYIMAWFRQAPGKEREFVASSWSGGMTNYADSVKGRFTISRDTAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTALQGKYYNWGQGTQVTVSS
B5(SEQ ID NO 8)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTIGRLAMGWFRQAPGKERDFVSAISWIGDGTYYADSVKGRFFISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADLTPFGGRYPMSDGAYGSWGQGTQVTVSS
本发明示例性抗IL-13Rα2抗体或其抗原结合片段如表8所示。
表8
序列编号 氨基酸序列
SEQ ID NO 1 GRSFSGYI
SEQ ID NO 2 SWSGGMT
SEQ ID NO 3 AARTALQGKYYN
SEQ ID NO 4 GRTIGRLA
SEQ ID NO 5 ISWIGDGT
SEQ ID NO 6 AADLTPFGGRYPMSDGAYGS
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 北京慧能安生物科技有限公司
<120> 一种抗IL-13Rα2的纳米抗体及其编码序列和应用
<130> DD190418I
<141> 2019-09-19
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Human
<400> 1
Gly Arg Ser Phe Ser Gly Tyr Ile
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Human
<400> 2
Ser Trp Ser Gly Gly Met Thr
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Human
<400> 3
Ala Ala Arg Thr Ala Leu Gln Gly Lys Tyr Tyr Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Human
<400> 4
Gly Arg Thr Ile Gly Arg Leu Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Human
<400> 5
Ile Ser Trp Ile Gly Asp Gly Thr
1 5
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> Human
<400> 6
Ala Ala Asp Leu Thr Pro Phe Gly Gly Arg Tyr Pro Met Ser Asp Gly
1 5 10 15
Ala Tyr Gly Ser
20

Claims (7)

1.一种抗IL-13Rα2的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的蛋白序列含有重链可变区，
所述重链可变区包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
2.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的抗IL-13Rα2的纳米抗体。
3.根据权利要求1所述的抗IL-13Rα2的纳米抗体在制备用于恶性肿瘤的预防和/或治疗的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述恶性肿瘤选自脑癌、肝癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌中的至少一种。
5.权利要求1所述纳米抗体的编码序列。
6.含有权利要求5所述编码序列的重组表达载体、表达盒或转基因细胞系。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体、表达盒或转基因细胞系在制备抗IL-13Rα2纳米抗体中的应用。
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Cited By (6)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN116444671B (zh) * 2021-12-29 2024-02-23 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗IL13Ra2的纳米抗体及其应用
WO2023155796A1 (en) * 2022-02-17 2023-08-24 Lanova Medicines Development Co., Ltd. Anti-il-13ra2 monoclonal antibodies and uses thereof
CN114805581A (zh) * 2022-06-29 2022-07-29 上海优替济生生物医药有限公司 靶向il13ra2的抗体、嵌合抗原受体及其用途
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WO2024099310A1 (zh) * 2022-11-08 2024-05-16 上海洛启生物医药技术有限公司 抗il-13长效纳米抗体序列及其应用
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