CN117430721A - Cd123靶向car-nk细胞的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CD123靶向CAR‑NK细胞的制备及其应用，本发明设计并筛选获得了适用于CAR‑NK细胞制备的优选scFv分子，筛选可提升NK细胞扩增和活性的mIL‑15，通过高效转导体系和稳定冻存体系，可制备对AML以及其他CD123+肿瘤细胞具有显著杀伤活性的“现货型”CAR‑NK细胞，并在小鼠移植瘤模型中证实了抗肿瘤效应，有望为AML以及其他CD123+肿瘤的治疗提供一种更加有效的治疗产品。

Description

CD123靶向CAR-NK细胞的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及CD123靶向CAR-NK细胞及其应用。
背景技术
急性髓系白血病(Acute Myelocytic Leukemia,AML)是成人最常见的急性白血病，我国年发病率约为1.62/10万，其中，复发或难治患者(r/r AML)约占10％。目前，AML治疗仍以化疗为主，但仅有不到1/3的患者能达到持续缓解。同种异体造血干细胞移植，是目前治愈AML的唯一手段，但老年患者往往无法耐受，同时，还存在移植物抗宿主病(Graft-Versus-Host Disease，GVHD)等风险。据统计，AML患者5年总生存率(Overall survival，OS)为28.3％，而60岁以上患者5年OS则低至3-8％；r/r AML患者的5年OS为10％，中位生存期为6个月。总之，r/r AML治疗的临床需求远未被满足，亟需研发更加有效的治疗药物。
NK细胞(Natural Killer，NK)作为人体抵御病毒和异常细胞的第一道防线，具有广谱抗癌性，能在第一时间做出反应，被誉为人体内的“宪兵”。早在20年前，NK细胞疗法就被认为是晚期白血病治疗的一种安全、有效的手段。近年来，随着体外扩增培养技术、抗体技术和基因转导技术的进步，CAR-NK细胞已经开始崭露头角。近年来，M.D.安德森癌症中心、Fate Therapeutics、Nkarta Therapeutics等相继公布了惊艳的临床研究数据。与CAR-T疗法相比，CAR-NK细胞具有以下优势：无主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibility Complex，MHC)限制，可制备“货架”产品；不会引起细胞因子风暴和神经毒性；通过CAR依赖和非依赖等多机制发挥抗肿瘤效应，对肿瘤实行“全方位、立体式”杀伤；NK对肿瘤免疫抑制微环境的抵抗能力强等。基于上述优势，CAR-NK细胞具有巨大的潜能，有望成为突破实体瘤治疗瓶颈的一大利器。
CD123，又称白细胞介素3受体α链(Interleukin-3Receptorα，IL-3Rα)，能特异识别并结合IL-3，介导细胞的增殖与存活。研究报道，高达80％左右的AML病人肿瘤细胞表达CD123。更为重要的是，CD123在白血病干细胞(leukemia Stem Cell，LSCs)和白血病起始细胞(Leukemia-Initiating Cells，LICs)上高表达，且在LSCs上的表达丰度显著高于其它肿瘤细胞。LSCs具有自我更新能力，表型类似于正常造血干细胞(Hematopoietic StemsCells，HSCs)，是白血病复发的根源，且LSCs表达CD123与AML的复发、化疗药物耐受等密切相关。因此，靶向CD123有望根除LSC，实现AML“治愈”。与CAR-T相比，CAR-NK细胞体内存活周期较短，不引起长期骨髓抑制效应。因此，靶向CD123的CAR-NK细胞具有良好的成药性，有望为AML及CD123+肿瘤的治疗带来重大突破。逆转录病毒载体和慢病毒载体是目前用于CAR-T和CAR-NK细胞制备的最常见的病毒转导体系，但其对外周血来源NK细胞的基因转导效率低。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了具体的实施方案。
本发明提供了一种靶向CD123的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括N到C端的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括靶向CD123的胞外抗体结合结构域CD123 scFv-1、或CD123 scFv-2。
所述CD123 scFv-1与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列同一性。
所述CD123 scFv-2与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列同一性。
术语“scFv”指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中轻链可变区和重链可变区借助柔性短多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留衍生它的完整抗体的特异性。除非另外指出，否则如本文所用，scFv可以具有按任何顺序(例如，相对于多肽的N末端和C末端)的VL可变区和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
术语“同源的”或“同一性”指两个聚合物分子之间(例如，在两个核酸分子(如，两个DNA分子或两个RNA分子之间)或在两个多肽分子之间)的亚单位序列同一性。当这两个分子中的亚单位位置被相同单体性亚单位占据时，例如，若两个DNA分子的每个分子中的某位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源或同一的。两个序列之间的同一性直接随匹配位置或同源位置的数目而变化，例如，如果两个序列中一半位置(例如长度为10个亚单位的聚合物中的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个位置中9个位置)是匹配或同源的，则这两个序列是90％同源的。
进一步，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、胞内信号转导结构域。
进一步，所述信号肽为CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步，所述铰链区为CD8，所述跨膜结构域为CD8，所述铰链区和跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步，所述胞内共刺激结构域为4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步，所述胞内信号转导结构域为CD3ζ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
进一步，所述嵌合抗原受体中信号肽、胞外抗体结合结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、胞内信号转导结构域顺次连接。
进一步，所述嵌合抗原受体的完整结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、或SEQ IDNO:8所示。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”指至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号结构域(本文也称作“胞内信号结构域”)的重组多肽构建体，所述胞质信号结构域包含从如下文定义的刺激分子衍生的功能性信号结构域。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域处于相同的多肽链中，例如，包括嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域彼此不邻接。
本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码前面所述的靶向CD123的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其DNA或RNA的组合，及其单链形式或双链形式的聚合物。术语“核酸”包括基因、cDNA或mRNA。在一个实施方案中，核酸分子是合成的(例如化学合成的)或重组的。除非特别限制，否则该术语包括含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。
进一步，所述核酸分子包括编码前面所述的靶向CD123的胞外抗体结合结构域CD123 scFv-1、或CD123 scFv-2的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:9、或SEQ IDNO:10所示。
进一步，所述核酸分子包括编码前面所述的信号肽CD8的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
进一步，所述核酸分子包括编码前面所述的铰链区和跨膜结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
进一步，所述核酸分子包括编码前面所述的胞内共刺激结构域4-1BB的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
进一步，所述核酸分子包括编码前面所述的胞内信号转导结构域CD3ζ的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
进一步，所述核酸分子包括编码前面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16所示。
进一步，所述核酸分子还可包括编码mIL-15分子的核苷酸序列，所述mIL-15分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述编码mIL-15分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
进一步，所述核酸分子编码的完整前面所述的嵌合抗原受体、mIL-15分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
进一步，所述核酸分子中编码前面所述的嵌合抗原受体、mIL-15分子的核苷酸序列顺次相连。
进一步，所述核酸分子中编码前面所述的嵌合抗原受体、mIL-15分子的核苷酸序列由P2A、T2A或E2A相连接。
进一步，所述连接是由编码如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的核苷酸序列连接。
进一步，所述连接的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
进一步，所述编码前面所述的嵌合抗原受体、mIL-15分子的核苷酸序列顺次相连的完整核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
术语“编码”指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列在生物学过程中充当合成具有定义的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的内在特性和因其产生的生物学特性。因此，如果与该基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生某蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和作为基因或cDNA转录的模板使用的非编码链均可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
本发明提供了一种载体，所述载体包括前面所述的核酸分子。
进一步，所述载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
进一步，所述载体为慢病毒载体。
本文所用的术语“载体”是指可用于递送和/或表达核酸分子的任何载体。其可以是如本文所述的转移载体或表达载体。术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞的DNA，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。
本发明提供了一种嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞包括前，前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、或前面所述的载体。
进一步，所述细胞包括T细胞、NK细胞、B细胞。
本发明提供了前面所述的嵌合抗原受体细胞在制备哺乳动物中提供抗表达CD123的肿瘤免疫的药物中的应用。
进一步，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
进一步，所述应用中嵌合抗原受体细胞与第二药剂或操作组合施用，所述第二药剂或操作选自化疗、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、外科操作、放射操作、共刺激分子的激动剂、免疫检查点分子的抑制剂、疫苗或基于第二CAR的免疫疗法中的一种或多种。
本发明提供了前面所述的嵌合抗原受体细胞在制备哺乳动物中治疗患有与表达CD123相关的疾病的药物中的应用。
进一步，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
进一步，所述应用中与表达CD123相关的疾病是：
A、癌前病变疾病，
B、癌症或恶性肿瘤，或
C、与表达CD123相关的非癌症相关适应症。
进一步，所述疾病选自以下一种或多种：缩写为AML的急性髓性白血病、缩写为ALL的急性淋巴母细胞性白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、缩写为CML的慢性髓性白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、组织细胞疾病、肥大细胞疾病、脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤或它们的组合。
进一步，所述疾病为缩写为AML的急性髓性白血病。
在一个实施方案中，哺乳动物是人，例如，血液癌症患者。在一个实施方案中，疾病是本文所述的疾病。在一个实施方案中，与表达CD123相关的疾病是选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤；癌前期疾病如脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期；或是与表达CD123相关的非癌症相关适应征。在一个实施方案中，疾病是血液癌症。在另一个实施方案中，所述疾病选自一种或多种急性白血病，包括但不限于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性淋巴母细胞性B细胞白血病(B细胞急性淋巴细胞性白血病，BALL)和急性淋巴母细胞性T细胞白血病(T细胞急性淋巴细胞性白血病(TALL)；脊髓发育不良综合征；骨髓增生性肿瘤；组织细胞疾病(例如，肥大细胞疾病或母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤)；肥大细胞疾病，例如系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病；慢性髓性白血病(CML)；和浆母细胞样树突细胞瘤。在其它实施方案中，与CD123表达相关的疾病包括但不限于非典型性和/或非典型性癌症、恶性肿瘤、癌前病症或表达CD123的增殖性疾病及其组合。
术语“一个”和“一种”指该冠词的一个或多于一个(即，指至少一个)的语法对象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
术语“癌症”指异常细胞快速且失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本文中描述了多种癌症的例子并且它们包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，例如，两种术语涵盖实体瘤和液体肿瘤，例如，弥散型或循环型肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的前面所述的嵌合抗原受体细胞。
进一步，所述药物组合物还包括以下一种或多种药剂组合施用：
A、改善与施用包含嵌合抗原受体核酸/多肽的细胞相关的一种或多种副作用的药剂；
B、增加包含嵌合抗原受体核酸/多肽的细胞的功效的药剂；或
C、治疗与CD123表达相关的疾病的药剂。
如本文所用的术语“药物组合”意指因混合或合并多于一种有效成分产生的产品并且包括有效成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”意指有效成分，例如本发明的化合物和组合配偶体，均以单一实体或剂量同时地施用至患者。术语“非固定组合”意指有效成分。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中互换地使用并且指化合物、制剂、材料或组合物如本文所述那样有效实现特定生物学结果的量。
如本文所用的短语“与CD123表达相关的疾病”包括但不限于与表达CD123相关的疾病或与表达CD123(例如，野生型或突变CD123)的细胞相关的病状，包括例如增生性疾病，如癌症或恶性肿瘤；癌前期疾病如脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期；或与表达CD123(例如，野生型或突变CD123)的细胞相关的非癌症相关适应征。在一个方面，与CD123(例如，野生型或突变CD123)表达相关的癌症是血液癌症。在一个方面，疾病包括AML、ALL、毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、淋巴细胞性B细胞白血病(B细胞急性淋巴细胞性白血病，BALL)、急性淋巴母细胞性T细胞白血病(T细胞急性淋巴细胞性白血病，TALL)、脊髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、组织细胞性病状(例如肥大细胞疾病或母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤)、肥大细胞疾病，例如，系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病等等。与CD123表达相关的其它疾病包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与CD123表达相关的增殖性疾病。还可以包括与CD123表达相关的非癌相关适应症。
本发明提供了制造嵌合抗原受体细胞的方法，所述方法包括用前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸分子、或前面所述的载体引入免疫效应细胞。
如该术语在本文中所用那样，术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应子反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。
本发明提供了一种提升前面所述的嵌合抗原受体转导效率的方法，所述方法包括使用含2000U/mL的IL-2和100ng/ml的IL-15的X-VIVOTM15培养基重悬细胞，调整细胞密度至2.0×106细胞/ml，加入促转导试剂为0.1μM的BX795的步骤。
术语“转染”或“转化”或“转导”指借以将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞和其后代。
本发明的优点和有益效果：
本项目以此为基础，制备靶向CD123，并表达膜mIL-15的CAR-NK细胞，用于CD123+AML的治疗。
附图说明
图1是重组慢病毒结构图
图2是JD-LV123-1、JD-1V123-2慢病毒滴度检测流式图；
图3是JD-LV123-1、JD-LV123-3慢病毒滴度检测流式图；
图4是转导后第5天，流式检测CAR表达效率图；
图5是KA052转导后的转导效率、细胞纯度、细胞活率和扩增倍数评价图；
图6是CAR-NK细胞对Molm-13-Luc的体外杀伤效果图；
图7是NK细胞转导后第5天，转导效率流式图；
图8是转导后NK细胞转导效率、细胞纯度、细胞活率和扩增倍数检测结果图；
图9是不同肿瘤细胞CD123抗原表达水平图；
图10是CAR123-NK细胞对Molm-13-Luc、THP-1-Luc及KG-1a的体外杀伤效果图；
图11是KA071批次CAR123表达情况图；
图12是KA071批次复苏Day0体外杀伤效果图；
图13是小鼠活体成像图；
图14是小鼠肿瘤负荷荧光值图；
图15是小鼠体重生长曲线图；
图16是小鼠生存曲线图。
具体实施方式
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或检验本发明，然而现在描述合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，所述材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。标题、副标题或编号或字母编号的要素，例如，A、B、C等，仅为了易于阅读而展示。使用本文件中的标题或编号或字母编号的要素不要求步骤或要素按字母顺序进行并且该步骤或要素必然地彼此独立。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从权利要求书中显而易见。
下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，以便于本领域技术人员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。
除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1病毒的构建与制备
1、病毒中嵌合抗原受体结构的结构如图1所示，其中CAR的结构为：CD8信号肽+scFv+CD8 hinge+CD8 TM+4-1BB共刺激+CD3ζ。
2、载体构建：
合成靶向CD123的CAR序列，并将其克隆到慢病毒主质粒载体上。通过4质粒包装体系制备获得重组慢病毒JD-LV123-1、JD-LV123-2和JD-LV123-3。
3、各部件经测序鉴定正确，其序列如表1所示。
表1
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实施例2重组慢病毒的制备及滴度测定
1、实验方法
1)CAR分子构建到慢病毒主质粒载体后，采用四质粒包装系统，转导293T细胞后获得重组慢病毒JD-LV123-1、JD-LV123-2、JD-LV123-3。进一步经柱层析纯化、稀释后进行滴度检测。
2)收集K562细胞，使用RPMI1640培养基重悬细胞，使用12孔板进行铺板，K562铺板密度为5×105个cells/孔，1mL/孔。按照2倍梯度稀释法加入慢病毒浓缩液，分别为16μl/孔、8μl/孔、4μl/孔、2μl/孔、1μl/孔。感染4～6h后补液(含10％ FBS的RPMI1640)，1mL/孔。
3)感染72h后，使用流式细胞术进行转导效率检测。
4)根据阳性表达率计算慢病毒滴度。
病毒滴度计算公式如下TU/mL＝(P×N/V)×1000，TU/mL为病毒滴度；P＝阳性细胞比例(％)，N＝感染时的细胞数量；V＝每孔加入慢病毒的体积；流式检测阳性率的可信范围为10～30％。
2、实验结果
流式检测结果如图2、图3所示，根据实验方法中给出的计算公式：
(1)CAR序列筛选中JD-LV123-1慢病毒滴度为4.9×107TU/mL；JD-LV123-2慢病毒滴度为5.7×107TU/mL。
(2)mIL-15序列确认中JD-LV123-1慢病毒滴度为1.84×108TU/mL；JD-LV123-3慢病毒滴度为2.92×107TU/mL。
实施例3CD123 scFv序列的筛选
1、实验方法
(1)通过分选获得外周血单个核细胞，分选当天诱导NK细胞。
所使用培养基的基础培养基是X-VIVOTM15培养基，诱导NK用培养基为含2000IU/ml的IL-2、100ng/mL的IL-15、100IU/mL的IL-12、5μg/ml的CD137和10％灭活血浆的培养基；
(2)第一次补液：第3天时，向培养基中补充1倍体积的NK培养基(含有5％的灭活血浆、2000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15、100IU/mL的IL-12)；
(3)第二次补液：第5天时，向培养基中补充第一次补液后总体积1倍体积的NK培养基(含有5％的灭活血浆、2000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15、100IU/mL的IL-12)；
(4)第7天NK细胞活化过程为：室温，1800rpm离心收集细胞，采用含2000U/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15和100U/mL的IL-1β的X-VIVOTM15培养基重悬细胞，将其细胞密度调整为1×106细胞/mL，接种于T75或T175培养瓶中，于37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中继续培养2天。
(5)培养第9天：室温，1800rpm离心10min收集活化的NK细胞，采用含2000U/mL的IL-2和100ng/ml的IL-15的X-VIVOTM15培养基重悬细胞，加入促转导试剂BX795(0.1μM)。按照2.0ml/孔接种至6孔板，加入慢病毒JD-LV123-1、JD-LV123-2。
将其混匀后，放入培养箱中培养4h。然后补加2ml的新鲜完全培养基继续培养。
(6)培养24h后；取出，室温1800rpm离心10min收集细胞，离心收获沉淀；使用CARNK扩增培养基(含2％灭活血浆或5％ HPL、2000U/mL IL-2、100ng IL-15、20ng/mL IL-18的X-VIVOTM15培养基)重悬细胞，按照1×10 6细胞/ml的密度进行扩增。
(7)培养至转导后第5天，检测NK细胞的转导效率。
(8)培养至转导后第12天检测细胞活率、细胞数量、细胞纯度、转导效率、杀伤作用。
2、实验结果
结果如图4、图5、图6所示，在相同MOI条件下，JD-LV123-1与JD-LV123-2,的转导效率无显著差异；病毒转导后，各组之间活率无显著影响，而NK细胞的增殖受到一定的抑制，但是，JD-LV123-1转导组的扩增能力强于JD-LV123-2转导组；JD-LV123-1转导的CAR-NK细胞，其对MOLM-13-Luc的杀伤活性高于JD-LV123-2转导组。因此，CD123 scFv-1的结构是制备CAR123-NK细胞的更优结构。
实施例4表达mIL-15对CAR-NK细胞抗肿瘤活性的影响
A、实验结果
1.CAR-NK细胞的制备与检测
(1)通过分选获得外周血单个核细胞，分选当天诱导NK细胞。
所使用培养基的基础培养基是X-VIVOTM15培养基，诱导NK用培养基为含2000IU/ml的IL-2、100ng/mL的IL-15、100IU/mL的IL-12、5μg/ml的CD137和10％灭活血浆的培养基；
(2)第一次补液：第3天时，向培养基中补充1倍体积的NK培养基(含有5％的灭活血浆、2000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15、100IU/mL的IL-12)；
(3)第二次补液：第5天时，向培养基中补充第一次补液后总体积1倍体积的NK培养基(含有5％的灭活血浆、2000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15、100IU/mL的IL-12)；
(4)第7天NK细胞活化过程为：室温，1800rpm离心收集细胞，采用含2000U/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15和100U/mL的IL-1β的X-VIVOTM15培养基重悬细胞，将其细胞密度调整为1×106细胞/mL，接种于T75或T175培养瓶中，于37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中继续培养2天。
(5)第9天：室温，1800rpm离心10min收集活化的NK细胞，采用含2000U/mL的IL-2和100ng/ml的IL-15的X-VIVOTM15培养基重悬细胞，加入促转导试剂BX795。按照2.0ml/孔接种至6孔板，加入慢病毒JD-LV123-1、JD-LV123-3。
将其混匀后，放入培养箱中培养4h。然后补加2ml的新鲜完全培养基继续培养。
(6)培养24h后；取出，室温1800rpm离心10min收集细胞，离心收获沉淀；使用CAR-NK扩增培养基(含2％灭活血浆或5％ HPL、2000U/mL IL-2、100ng IL-15、20ng/mL IL-18的X-VIVOTM15培养基)重悬细胞，按照1×10 6细胞/ml的密度进行扩增，每两天补原有培养基的1-2倍。
(7)培养至转导后第5天，检测NK细胞的转导效率。
(8)转导后第12天检测细胞活率、细胞数量、细胞纯度、转导效率、杀伤作用，并冻存。
(9)冻存：
1)750g，10min，室温离心，收集培养至第12天的CAR-NK细胞。
2)弃上清，100ml 0.9％氯化钠注射液重悬细胞，750g，10min室温离心。
3)弃上清，100ml 0.9％氯化钠注射液重悬细胞，细胞计数。
4)将过筛后的细胞750g，10min室温离心，获得沉淀。
5)用适量预冷的冻存液重悬细胞，AOPI染色并细胞计数，调整密度至5×107cells/mL。将细胞/冻存液混合悬液以1.5ml/管灌装到细胞冻存管中。将冻存管放入到(2-8℃)预冷的异丙醇梯度降温盒中。-80℃条件下异丙醇降温盒放置18-24小时后，将冻存细胞取出并尽快转移到液氮中保存。
2.CAR-NK细胞体外活性评价：
(1)分别采用流式细胞术分析四株AML细胞系Molm-13-Luc(95.98％)、THP-1-Luc(99.05％)、KG-1a(46.99％)及HL-60(0.76％)表面CD123抗原的表达水平，如图9所示，其中，HL-60为阴性对照。
(2)靶细胞标记及效应细胞准备
1)收集对数生长期的靶细胞，500g、5min、室温离心收细胞，弃上清，用RPMI1640基础培养基重悬细胞。台盼蓝染色，记录活细胞数、细胞活率，将靶细胞调整密度为1×106cells/ml。
2)加浓度为1mM的Calcein-AM溶液(7.5uL/mL)，避光孵育30min。染色结束后，加入2倍体积的PBS洗两次，500g、5min、室温，加RPMI1640基础培养基重悬细胞。
3)台盼蓝染色，记录活细胞数、细胞活率，调整细胞密度为2×105cells/ml，备用。
4)取足量的效应细胞，500g、10min、室温离心收细胞，弃上清，用RPMI1640基础培养基重悬细胞。按效靶比(2:1、5:1)，将效应细胞稀释至相应浓度，备用。
(3)靶细胞与效应细胞共孵育
按照效靶比分别将效应细胞与靶细胞铺至96孔板中，对照组为未感染病毒的NK细胞。同时设置自发孔(只有靶细胞)及最大孔(靶细胞和最大释放剂)。37℃、5％ CO2，孵育4小时。孵育3小时的时候最大孔加入释放剂(0.8％Triton)，50μL/孔。
(4)收样上机检测
1)孵育结束后，500g、5min、室温离心96孔板，取上清每孔取150μL，酶标仪激发光：485/20、发射光:528/20，检测荧光强度。
2)计算公式：杀伤效率(％)＝(实验孔-自发孔)/(最大孔-自发孔)×100％。
3.CAR-NK细胞体内抗肿瘤效应评价：
(1)动物建模：
1)在NCG小鼠体内建立THP-1-Luc人急性单核细胞白血病动物模型，于小鼠尾静脉接种THP-1-Luc细胞悬液200μL，5×105cells/mL细胞浓度。
2)待肿瘤信号值达到1.0E+06时，按肿瘤信号值及体重随机分为5组，每组8只。
(2)供试品准备：
采用流式细胞术对冻存复苏后KA071批次CAR123-NK细胞检测CAR123表达情况。
(3)细胞复苏当天，采用Calcein AM法检测CAR123-NK细胞及对照组NK细胞对THP-1-Luc的杀伤效应。
(4)分组当天开始给药，给药细胞为KA071批次人原代NK细胞转导后冻存复苏的CAR123-NK细胞，给药剂量为1E+07/只，每周给药3次，共给药4次，给药途径为尾静脉。给药期间，每周2次体内成像及体重。
B、实验结果
1、CAR-NK细胞的制备与检测
(1)表达CAR123的同时，通过P2A连接的方式表达mIL-15，不影响NK细胞的转导效率，均能达到40％以上；不影响NK和CAR-NK细胞的活率和增殖能力(JD-LV123-1和JD-LV123-3之间无显著差异)，其结果如图7、图8所示。
(2)体外杀伤评价结果显示，JD-LV123-1与JD-LV123-3转导可显著提升NK细胞(CAR-NK细胞)对CD123+的AML细胞的杀伤效果(图10)。
(3)CAR-NK细胞复苏后，CAR分子的表达(图11)与冻存前(图7)相比无显著变化。如图12、图13、图14所示，CAR-NK细胞的杀伤活性无显著改变，体内抗肿瘤效应评价结果显示，NK细胞可降低小鼠肿瘤负荷(荧光值)，而JD-LV123-1、JD-LV123-3转导的CAR-NK细胞对肿瘤负荷的抑制作用更加显著，与Vehicle组和NK组相比具有显著统计学差异(p<0.05)，同时，小鼠的体重并未被影响，其结果如图15所示。表明，CAR-NK细胞具有显著抗THP-1肿瘤作用。
更为重要的是，在小鼠生存期指标上，JD-LV123-3显示出显著延长荷瘤鼠生存期作用，表明mIL-15表达有助于增强NK细胞的体内存活并增强抗肿瘤效应(图16)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种靶向CD123的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括N到C端的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括靶向CD123的胞外抗体结合结构域CD123scFv-1、或CD123 scFv-2；
所述CD123 scFv-1与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列同一性；
所述CD123 scFv-2与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列同一性。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、胞内信号转导结构域；
优选地，所述信号肽为CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述铰链区为CD8，所述跨膜结构域为CD8，所述铰链区和跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
优选地，所述胞内共刺激结构域为4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
优选地，所述胞内信号转导结构域为CD3ζ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
优选地，所述嵌合抗原受体中信号肽、胞外抗体结合结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、胞内信号转导结构域顺次连接；
优选地，所述嵌合抗原受体的完整结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8所示。
3.一种核酸分子，所述核酸分子包括编码权利要求1或2所述的靶向CD123的嵌合抗原受体的核苷酸序列；
优选地，所述核酸分子包括编码权利要求1所述的靶向CD123的胞外抗体结合结构域CD123 scFv-1、或CD123 scFv-2的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:9、或SEQ IDNO:10所示；
优选地，所述核酸分子包括编码权利要求1或2所述的信号肽CD8的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
优选地，所述核酸分子包括编码权利要求1或2所述的铰链区和跨膜结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
优选地，所述核酸分子包括编码权利要求1或2所述的胞内共刺激结构域4-1BB的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
优选地，所述核酸分子包括编码权利要求1或2所述的胞内信号转导结构域CD3ζ的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
优选地，所述核酸分子包括编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16所示；
优选地，所述核酸分子还可包括编码mIL-15分子的核苷酸序列，所述mIL-15分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述编码mIL-15分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
优选地，所述核酸分子编码的完整权利要求1或2所述的嵌合抗原受体、mIL-15分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；
优选地，所述核酸分子中编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体、mIL-15分子的核苷酸序列顺次相连；
优选地，所述核酸分子中编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体、mIL-15分子的核苷酸序列由P2A、T2A或E2A相连接；
优选地，所述连接由编码如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的核苷酸序列连接；
优选地，所述连接的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
优选地，所述编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体、mIL-15分子的核苷酸序列顺次相连的完整核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
4.一种载体，所述载体包括权利要求3所述的核酸分子；
优选地，所述载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸；
优选地，所述载体为慢病毒载体。
5.一种嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞包括权利要求1或2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、或权利要求4所述的载体；
优选地，所述细胞包括T细胞、NK细胞、B细胞。
6.权利要求5所述的嵌合抗原受体细胞在制备哺乳动物中提供抗表达CD123的肿瘤免疫的药物中的应用；
优选地，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物；
优选地，所述应用中嵌合抗原受体细胞与第二药剂或操作组合施用，所述第二药剂或操作选自化疗、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、外科操作、放射操作、共刺激分子的激动剂、免疫检查点分子的抑制剂、疫苗或基于第二CAR的免疫疗法中的一种或多种。
7.权利要求5所述的嵌合抗原受体细胞在制备哺乳动物中治疗患有与表达CD123相关的疾病的药物中的应用；
优选地，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物；
优选地，所述应用中与表达CD123相关的疾病是：
A、癌前病变疾病，
B、癌症或恶性肿瘤，或
C、与表达CD123相关的非癌症相关适应症；
优选地，所述疾病选自以下一种或多种：缩写为AML的急性髓性白血病、缩写为ALL的急性淋巴母细胞性白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、缩写为CML的慢性髓性白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、组织细胞疾病、肥大细胞疾病、脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤或它们的组合；
优选地，所述疾病为缩写为AML的急性髓性白血病。
8.一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的权利要求5所述的嵌合抗原受体细胞；
优选地，所述药物组合物还包括以下一种或多种药剂组合施用：
A、改善与施用包含嵌合抗原受体核酸/多肽的细胞相关的一种或多种副作用的药剂；
B、增加包含嵌合抗原受体核酸/多肽的细胞的功效的药剂；或
C、治疗与CD123表达相关的疾病的药剂。
9.制造嵌合抗原受体细胞的方法，所述方法包括用权利要求1或2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、或权利要求4所述的载体引入免疫效应细胞。
10.一种提升权利要求5所述的嵌合抗原受体转导效率的方法，所述方法包括使用含2000U/mL的IL-2和100ng/ml的IL-15的X-VIVOTM15培养基重悬细胞，调整细胞密度至2.0×106细胞/ml，加入促转导试剂为0.1μM的BX795的步骤。
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