CN115521913A - NK细胞与CD20、CD38、Her2抗体联合应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗体和细胞治疗领域，具体为肿瘤治疗中HER2抗体与NK细胞的联合应用。所述NK细胞是通过以下步骤制备得到的：1)制备单个核细胞；2)使用CD137、CD28、CD3预处理细胞培养容器；3)将1)接种于2)中，使用含IL‑2、IL‑15、IL‑12、CD137和血浆的培养基进行细胞培养；4)补充含有血浆、IL‑2、IL‑15、IL‑12的培养基；5)补充含有IL‑2、IL‑15、IL‑21的培养基。

Description

NK细胞与CD20、CD38、Her2抗体联合应用

技术领域

本发明属于抗体和细胞治疗领域，具体涉及NK细胞与CD20、CD38、Her2抗体联合应用。

背景技术

自然杀伤(Natural killer，NK)细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其细胞胞体大、胞浆量多、电镜下观察胞内含有致密颗粒，故又称为大颗粒淋巴细胞。人类NK细胞约占外周血淋巴细胞的10％-15％，其表面标志为特异性表达CD56，而缺乏CD3表达。NK细胞是机体先天性免疫系统的重要组成部分，作为宿主免疫第一道防线，自然杀伤细胞无需预先致敏就可以对肿瘤和病毒感染的靶细胞产生快速应答，在机体免疫早期发挥重要的监视作用。不同于传统T细胞，NK细胞无需通过基因重排识别抗原，它发挥功能的物质基础是表达在其表面的一系列受体，通过活化性受体和抑制性受体之间的动态平衡触发自身活性，从而启动杀伤靶细胞的过程。NK细胞活化后能与靶细胞之间形成突触，释放穿孔素和颗粒酶裂解靶细胞，还可通过Fas(CD95)和FasL(CD95L)的相互作用、TNF和TNF受体的结合、IFNγ的分泌等促进对靶细胞的杀伤。此外，NK细胞还可以通过分泌效应细胞因子，影响机体适应性免疫应答功能。

NK细胞与靶细胞相互作用的结果由NK细胞抑制性信号与活化性信号之间的平衡来决定。NK细胞活化性受体识别包括多种细胞因子受体、整合素、杀伤受体、识别某些诱导表达分子的受体等；NK细胞抑制性受体包括多种识别MHCⅠ类分子的特异性受体。正常情况下，NK细胞抑制性受体识别靶细胞表面自身MHCⅠ类分子，传导抑制性信号，抑制NK细胞对靶细胞的攻击，而在病理状态下，靶细胞表面MHCⅠ类分子下调，抑制性信号减弱，NK细胞活化，对靶细胞发动攻击。

NK细胞是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性效应(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)的主要效应细胞。单克隆抗体一方面与靶细胞上的抗原结合，另一方面单抗的Fc段可与NK细胞表面的FcγRⅢa结合，通过抗体的介导，不仅拉近了NK细胞与靶细胞的距离，而且激活了NK细胞，NK细胞活化后分泌颗粒酶、穿孔素等对靶细胞直接杀伤，同时分泌IFN-γ促进DC细胞的抗原提呈作用。

CD20(Cluster of Differentiation 20)是一种跨膜蛋白，是一种33-37kDa的非糖基化蛋白，表达于除浆细胞外的发育分化各阶段的B细胞的表面，通过调节跨膜钙离子流动直接对B细胞起作用，在B细胞增殖和分化中起重要的调节作用。除在正常B细胞中表达外，CD20还在B细胞来源的淋巴瘤、白血病等的肿瘤细胞表达，以及涉及免疫疾病和炎症疾病的B细胞中表达，所以CD20抗原成为淋巴癌、白血病和某些自体免疫等疾病治疗的目标靶点。

抗CD20单克隆抗体常用来治疗B细胞淋巴瘤，其抗肿瘤作用与三种作用机制有关，即抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，包括抑制细胞生长、改变细胞周期和细胞凋亡。自1997年全球首款抗CD20单抗——罗氏的利妥昔单抗获批以来，全球已经批准多款抗CD20单抗。根据人源化程度以及Fc片段修饰，抗CD20单抗可分为三代，其中第一代是以利妥昔单抗为代表的嵌合或者鼠源单抗，第二代是以奥法木单抗为代表的人源化单抗，第三代的抗CD20单抗以奥妥珠单抗为代表，其抗体的Fc片段经过了糖基化修饰。

人表皮生长因子受体2(HER2，也称ERBB2)是表皮生长因子受体家族(EGFR)中的一员。HER2基因定位于染色体17q21，其编码产物是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，分子量约为185kDa，又称为p185。其胞内区包含了多个重要的环状结构，构成酪氨酸激酶的活性位点。HER2与其他HER家族基因形成异源二聚体，激活下游信号，促进癌细胞的侵袭和转移。HER2蛋白通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而有研究表明30％以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/过度表达(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等)；其中20％－30％的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增和过度表达。研究证实HER2的过度表达与肿瘤的发生和侵袭有关，可提高转移的危险；细胞和动物模型证实，其可改变肿瘤对激素和化疗药物的敏感性。研究表明HER2突变在乳腺癌发病、发展及抗HER2靶向耐药中起着重要作用。HER2的突变大部分位于酪氨酸激酶域或胞外域，可能是导致乳腺癌的一个重要因素。HER2基因过表达，对于乳腺癌的预后评价及指导治疗有及其重要的价值。近年来，以HER2为靶点的乳腺癌靶向治疗一直是研究的热点。其次，在胃癌中，有超过20％胃癌患者HER2过表达。有数据表明，HER2的靶向治疗显著延长了HER2阳性晚期胃癌患者的生存期。

HER2在多种恶性肿瘤中高表达，且患者预后较差。HER2靶向药物-曲妥珠单抗是第一个用于实体瘤治疗的分子靶向药物，开启了科学家探索癌症分子靶向药的大门。数据表明曲妥珠单抗、T-DM1、帕妥珠单抗在治疗过表达HER2的乳腺癌中，对患者预后有显著的改善作用。此外曲妥珠单抗联合化疗在晚期胃癌的二线治疗中显示突出的疗效。曲妥珠单抗和拉帕替尼联合治疗HER2阳性转移性结直肠癌，有效且耐受良好。

CD38为一种2型单链跨膜蛋白，分子量45KD，其分子结构可分为3部分：胞内区、跨膜区及胞外区。CD38具有多方面的作用，其具有活化标志物的特性，同时也具有粘附分子和外胚层酶活的特性，CD38也是一种细胞内信号蛋白。造血分化的早期阶段和向共同淋巴样祖细胞期的分化都需要CD38的表达。CD38在物理/功能上与关键的T细胞和B细胞膜分子(如TCR，BCR，CD19)的接触是淋巴细胞功能的信号转导和下游过程的产生所必需的，例如特定转录程序的启动，细胞因子的分泌和淋巴细胞效应器功能的激活等。CD38在多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞上相对高表达，而在正常淋巴细胞、髓系细胞及一些非造血系统组织中相对低表达。目前已批准治疗MM的CD38单克隆抗体有两个：达雷妥尤单抗(Daratumumab)和艾萨妥昔单抗(Isatuximab)。达雷妥尤单抗的作用机制主要有CDC(complement-dependent cytotoxicity)、ADCC(antibody-dependent cellularcytotoxicity)、ADCP(antibody-dependent cellular phagocytosis)、PCD(programmedcell death)及通过调节CD38酶功能引起的直接作用。艾萨妥昔单抗的作用机制包括CDC、ADCC、ADCP，此外，其具有很强的促凋亡作用，且对CD38的酶功能亦有抑制作用。

发明内容

针对上述所述问题，本发明提出了一种NK细胞与抗体联用的方法、所述方法中使用的组合物及其应用，所述组合物具体包括NK细胞及单抗和/或双特异性抗体。组合物中的NK细胞是通过活化扩增培养而来，扩增出具有数量大、扩增倍数高、细胞毒性强等特点的NK细胞，扩增培养后的NK细胞同单抗和/或双特异性抗体复合形成一种细胞组合物，其具有非常好的临床应用价值。

本发明将NK细胞分别与CD20单抗、HER2单抗或CD38单抗药物联合应用治疗肿瘤。NK细胞与单抗药物联用具有以下优势：首先，NK细胞作为固有免疫的重要成分，天生具有杀伤肿瘤细胞的作用，所以NK细胞是对单抗药物抗肿瘤作用的有力补充，尤其是实体瘤，其异质性较强，对单抗无法靶向的那部分肿瘤细胞，NK细胞的天然抗肿瘤作用将有效避免其逃逸；其次，通过单抗的介导，使NK细胞能够靠近肿瘤细胞，具有了靶向功能，而且NK细胞是单抗ADCC作用的主要效应细胞，因此NK细胞的输注，更利于单抗ADCC作用的发挥，发挥更强的抗肿瘤作用；最后，NK细胞安全性良好，不会引起GVHD、CRS及中枢神经系统毒性等通常T细胞治疗容易引起的毒性反应。所以，NK细胞与单抗药物联合应用治疗肿瘤，将显著增强抗体的临床疗效，达到更好的抗肿瘤效果。

使用本发明所提供的组合物治疗疾病时，一方面可以靶向肿瘤部位，另一方面可以利用NK细胞的非特异性杀伤功能，且不会引起细胞因子风暴和GVHD的发生，达到更好的抑瘤效果。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括NK细胞和抗体，所述抗体包括CD20抗体、CD38抗体或Her2抗体，所述NK细胞是由以下方法制备得到的：

1)制备单个核细胞；

2)使用CD137、CD28、CD3预处理细胞培养容器；

3)将1)接种于2)中，使用含IL-2、IL-15、IL-12、CD137和血浆的培养基进行细胞培养；

4)补充含有血浆、IL-2、IL-15、IL-12的培养基；优选地，该补液进行至少一次，具体包括：两次、三次或更多；

5)补充含有IL-2、IL-15、IL-21的培养基；优选地，该培养基中可以含有、或不含有血浆；优选地，该补液进行至少一次，具体包括：两次、三次或更多；

优选地，本发明所述方法中：每次补液后体积可以变为2倍、3倍、4倍或更多；

优选地，本发所述培养基的基础培养基是无血清培养基；以往公知的无血清基础培养基有：X-Vivo15、MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、RPMI 1640培养基、Ham’F-12培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基等。

优选地，如本发明具体实施例所使用的，所述无血清培养基是X-Vivo15(Lonza)。

优选地，步骤3)中所述IL-2浓度为1000-10000IU/mL；更优选地，2000IU/mL。

优选地，步骤3)中所述IL-15浓度为500-2000IU/mL；更优选地，1000IU/mL。

优选地，步骤3)中所述IL-12浓度为50-500IU/mL；更优选地，100IU/mL。

优选地，步骤3)中所述CD137浓度为0-10μm/ml；更优选地，5μg/ml。

优选地，步骤3)中所述血浆百分比1-10％；更优选地，5％。

优选地，步骤4)中所述IL-2浓度为1000-10000IU/mL；更优选地，2000IU/mL。

优选地，步骤4)中所述IL-15浓度为500-2000IU/mL；更优选地，1000IU/mL。

优选地，步骤4)中所述IL-12浓度为50-500IU/mL；更优选地，100IU/mL。

优选地，步骤4)中所述血浆体积占比3-10％；优选地，5％。

优选地，步骤5)中所述IL-2浓度为1000-10000IU/mL；更优选地，2000IU/mL。

优选地，步骤5)中所述IL-15浓度为500-2000IU/mL；更优选地，1000IU/mL。

优选地，步骤5)中所述IL-21浓度为20-100IU/mL；更优选地，50IU/mL。

优选地，本发明所述血浆是灭活血浆或人血白蛋白；更优选地，所述血浆是自体血浆，自体灭活血浆。

优选地，所述培养的初始细胞浓度是1.0×10⁶个/ml-10.0×10⁶个/ml。

优选地，所述培养的初始细胞浓度是1.0×10⁶个/ml-5.0×10⁶个/ml；具体地，包括1.0×10⁶个/ml、1.5×10⁶个/ml、2.0×10⁶个/ml、2.5×10⁶个/ml、3.0×10⁶个/ml、3.5×10⁶个/ml、4.0×10⁶个/ml、4.5×10⁶个/ml、5.0×10⁶个/ml。

如本发明具体实施例是以2.0×10⁶个/ml为初始细胞浓度进行的接种。

优选地，所述单个核细胞来源于血液、脐血、骨髓；

优选地，所述血液是外周血。

优选地，所述单个核细胞是外周血来源的单个核细胞(PBMC)。

优选地，所述单个核细胞是由Ficoll密度梯度离心法方法制备得到的。

优选地，所述CD20抗体包括第一代、第二代及第三代CD20单抗，如：利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、奥妥珠单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗等。

优选地，所述CD20抗体是利妥昔单抗(美罗华)。

本发明所述“利妥昔单抗”即Rituximab、也可称为美罗华，是一种单克隆抗体，可干扰白血病和淋巴瘤癌细胞的生长和扩散。它通过靶向CD20抗原而起作用，CD20抗原是在B细胞表面上发现的物质。利妥昔单抗与肿瘤细胞表面的CD20抗原结合，从而促进肿瘤细胞死亡。

优选地，所述CD20抗体合适的工作浓度是50-1000μg/mL。

优选地，所述HER2抗体包括曲妥珠单抗(赫赛汀)、帕托珠单抗、拉帕替尼、T-DM1(赫赛莱)、阿法替尼(BIBW2992)、来那替尼、达克替尼(PF299804)、吡咯替尼。

优选地，所述HER2抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀)。

本发明所述“曲妥珠单抗”即Trastuzumab、也可称为赫赛汀(Herceptin)；是一种重组人源化单克隆抗体，特异性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位。

优选地，所述HER2抗体合适的工作浓度是50-1000μg/mL。

优选地，所述CD38抗体包括达雷妥尤单抗和艾萨妥昔单抗。

优选地，所述CD38抗体是达雷妥尤单抗或艾萨妥昔单抗。

本发明所述“达雷妥尤单抗”，即Daratumumab，是一种人源化、抗CD38 IgG1单克隆抗体，与肿瘤细胞表达的CD38结合，通过补体依赖的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、以及Fcγ受体等多种免疫相关机制诱导肿瘤细胞凋亡。本发明所述“艾萨妥昔单抗”，即Isatuximab，是一种IgG1嵌合单克隆抗体，靶向浆细胞CD38受体的特定表位，能够触发多种独特的作用机制，包括促进程序性肿瘤细胞死亡(凋亡)和免疫调节活性。

优选地，所述CD38抗体合适的工作浓度是50-1000μg/mL。

优选地，所述抗体的工作浓度(终浓度)是500μg/mL。

本发明所述NK细胞包括经修饰的NK细胞，例如CAR-NK细胞，即嵌合抗原受体NK细胞。

在一些实施方案中，本发明所述组合物还包括药学上可接受的载体。

术语“药学上可接受的载体”中的“载体”是指可以与活性成分(也即本发明所提供的组合物)一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂等。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。

本发明的第二方面提供了以上组合物的制备方法，所述方法包括按照前述制备方法制备NK细胞并将其与抗体混合，并孵育30-60分钟；

优选地，每十分钟震荡一次。

本发明的第三方面提供了以上组合物在制备治疗以下任意一组癌症的药物中的应用：

1)多发性骨髓瘤，

2)淋巴瘤，

3)乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌；

优选地，所述淋巴瘤包括先前未经治疗的CD20阳性III-IV期滤泡性非霍奇金淋巴瘤患者，应与化疗联合使用；初治滤泡性淋巴瘤患者经美罗华联合化疗后达完全或部分缓解后的单药维持治疗；复发或化疗耐药的滤泡性淋巴瘤；CD20阳性弥漫大B细胞性非霍奇金淋巴瘤(DLBCL)应与标准CHOP化疗(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松)8个周期联合治疗。

优选地，所述癌症是慢性淋巴细胞白血病：与氟达拉滨和环磷酰胺(FC)联合治疗先前未经治疗或复发性/难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者。

优选地，所述乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌是HER2过表达的乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌。

优选地，所述乳腺癌包括非浸润性癌、浸润性癌。

如本发明具体实施例中进行了NK细胞和CD20抗体(利妥昔单抗)联用对Raji淋巴瘤细胞的体外杀伤实验，代表了本发明所提供的组合物对于非霍奇金淋巴瘤的治疗效果。

如本发明具体实施例中进行了NK细胞与CD38抗体(达雷妥尤单抗)联用对NCI-H929多发性骨髓瘤细胞的体外杀伤实验，代表了本发明所提供的组合物对于多发性骨髓瘤的治疗效果。

如本发明具体实施例中进行了NK细胞与HER2抗体(曲妥珠单抗)联用对的SK-BR-3乳腺癌细胞体外杀伤实验，代表了本发明所提供的组合物对于乳腺癌的治疗效果。

本发明所述“非浸润性乳腺癌”包括导管内癌(癌细胞未突破导管壁基底膜)、小叶原位癌(癌细胞未突破末梢乳管或腺泡基底膜)、导管内乳头状癌、乳头湿疹样乳腺癌。

本发明所述“浸润性乳腺癌”包括浸润性特殊癌：乳头状癌、髓样癌(伴大量淋巴细胞浸润)、小管癌(高分化腺癌)、腺样囊性癌、粘液腺癌、大汗腺样癌、鳞状细胞癌等；所述“浸润性乳腺癌”还包括浸润性非特殊癌：浸润性导管癌(临床上最为常见类型)、浸润性小叶癌、硬癌、髓样癌(无大量淋巴细胞浸润)、单纯癌、腺癌等。

本发明的第四方面，提供了本发明制备的NK细胞在制备促进CD20抗体、CD38抗体或Her2抗体治疗效果的药物中的应用。

优选地，促进HER2抗体在治疗包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌在内的实体瘤癌症中的作用效果。

优选地，促进CD20抗体在治疗非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的作用效果。

优选地，促进CD38抗体在治疗多发性骨髓瘤患者的作用效果。

本发明的第五方面，提供了使用本发明所述组合物治疗癌症的方法。

在一些实施方案，本发明公开的治疗方法包括对有需要的患者施用安全有效量的本发明化合物。本发明公开的各实施方案包括通过对有需要的患者给予安全有效量的本发明的组合物，来治疗本发明所述疾病或病症的方法。

在一些实施方案，本发明公开的组合物可以一次性给药，或者根据给药方案，在指定时间段内，在不同的时间间隔给药若干次。例如，每周给药一次、两次、三次或四次、每天给药一次等。本发明公开的组合物的合适给药方案取决于所述组合物的药代动力学性质，例如稀释、分布和半衰期，这些可由技术人员测定。

此外，本发明组合物的合适给药方案，包括实施该方案的持续时间，取决于被治疗的疾病、被治疗疾病的严重程度、被治疗患者的年龄和身体状况、被治疗患者的医疗史、同时疗法的性质、想要的治疗效果等那些在技术人员知识和经验范围内的因素。所述领域技术人员还应理解，对于个体患者对给药方案的反应，或随着时间推移个体患者需要变化时，可要求调整适宜的给药方案。

附图说明

图1是本发明所提供的NK细胞制备方法中不同日期对细胞纯度进行流式检测的结果图。

图2是杀伤实验的结果图，左图为NK细胞与CD20单抗-利妥昔单抗针对Raji淋巴瘤细胞所获得的结果，中间图为NK细胞与CD38单抗-达雷妥尤单抗针对NCI-H929多发性骨髓瘤细胞所获得的结果，右图为NK细胞与HER2单抗-曲妥珠单抗针对SK-BR-3乳腺癌细胞所获得的结果。

图3是小鼠实验中生物发光的检测结果图。

图4是小鼠实验中对体重的检测结果图。

图5是对小鼠进行荧光检测的结果图。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，以便于本领域技术人员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、制备NK细胞

1.1细胞培养瓶的预处理

将10mL含CD137为8μg/mL，CD28为8μg/mL，CD3为8μg/mL的生理盐水溶液，加入到175cm²底面积的细胞培养瓶(Nunc)中，并使液体充分在瓶底分散，4℃平放过夜。

1.2外周血单个核细胞(PBMC)的分离

50mL外周血为例，如血量不同，可按此操作做相应调整。将经平皿检菌后无菌的50mL患者外周血在室温下差速离心，水平低速离心机(湘仪)中进行，离心30分钟，升9降7(即从1800rpm至0rpm的降速时间为10min)，使血浆和血细胞分离。

将上层血浆转入离心管，56℃灭活30min之后，2000rpm离心10min，取上清4℃备用。

将血细胞沉淀用等体积的生理盐水混匀，通过Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。具体的，将上述混合物小心加到含Ficoll层的50mL离心管中，室温差速离心20分钟(升9降0，即2000rmp至0rmp，30min)。吸取PBMC层，尽量吸尽两液面交界处的细胞层，加生理盐水吹打混匀，室温1500rpm离心10分钟。利用生理盐水再次洗涤细胞。

弃去上清后，用10mL无血清培养基(X-VIVO15)重悬细胞，定容到20mL。吸取少量细胞计数。同时取少量细胞悬液进行流式检测，NK细胞(CD3-CD56+)比例为15％。

1.3接种

按照2.0×10⁶个/mL的细胞浓度，将步骤1.2获得的PBMC细胞接种到含2000IU/mLIL-2、1000IU/mL IL-15、100IU/mL IL-12、5ug/mLCD137和10％的步骤1.2获得的患者灭活血浆的20mL培养基(X-VIVO15)的步骤1.1获得的包被培养瓶中。在培养箱中(37℃，CO₂浓度为5％)培养。

1.4NK细胞的第一次补液

在培养的第3天，向培养瓶中补加含有5％的患者灭活血浆、IL-2 2000IU/mL、IL-15 1000IU/mL、IL-12 100IU/mL的扩增培养基(基础培养基为X-Vivo15)，确保培养基的终体积为40mL。注意，请勿吹打细胞。

1.5NK细胞的第二次补液并转瓶

在第5天，向培养瓶中继续补加120mL含有5％的患者灭活血浆、IL-22000IU/mL、IL-15 1000IU/mL、IL-12 100IU/mL的扩增培养基(基础培养基为X-Vivo15)，将混匀的细胞悬液转至T225细胞培养瓶中，确保培养基的终体积为200mL。

1.6NK细胞的第三次补液及其装袋

第7天，检测细胞浓度为3.11×10⁶个/mL。将培养瓶底部的细胞轻轻拍散(约200mL)，将其与400mL含有IL-2 2000IU/mL、IL-15 1000IU/mL、IL-21 50IU/mL(可加入剩余灭活血浆约1.5％)的X-VIVO无血清细胞培养基，一起装入到细胞培养袋(GT-T610，来自TAKARA公司)中，确保终体积为600mL。同时进行细胞计数，检测细胞的生产状况。

1.7第四次补液

第9天，检测细胞浓度为3.47×10⁶个/mL。将培养袋从细胞培养箱(37℃，CO₂浓度为5％)中取出，将细胞悬液均匀分至2个培养袋中，并等体积补充扩增培养基2(含有IL-22000IU/mL、IL-15 1000IU/mL、IL-21 50IU/mL的X-VIVO无血清细胞培养基)，确保终体积为1200mL。将两袋细胞放入培养箱中继续培养。同时进行细胞计数，确定细胞的生产状况。

1.8第五次补液

第12天，检测细胞浓度为4.79×10⁶个/mL。将培养袋从细胞培养箱(37℃，CO₂浓度为5％)中取出，分别向培养袋补充600mL扩增培养基2(含有IL-22000IU/mL、IL-15 1000IU/mL、IL-21 50IU/mL的X-VIVO无血清细胞培养基)，每袋体积为1800mL，总体积为3600mL。将两袋细胞放入培养箱中继续培养。同时进行细胞计数，确定细胞的生产状况。

1.9检菌

细胞培养第15天，细胞浓度为6.17×10⁶对细胞悬液进行检菌和内毒素检测。结果表明，无菌，内毒素小于0.25EU/mL。

实验结果

根据在培养过程中测量得到的细胞浓度和培养基体积计算细胞的数量，细胞数量变化如表1所示。细胞纯度的流式检测结果见图1。

表1、细胞浓度变化统计

可见，随着培养进程，NK细胞的浓度逐渐增加(见表1)，NK细胞的浓度在第0天为2.00×106个/mL，第7天增加到3.11×106个/mL，第12天时为4.79×106个/mL，至第15天时达到6.17×106个/mL。NK细胞的纯度亦逐渐升高，并超过99％(见图1)，第0天时为18.37％，第7天就增加到76.38％，第11天达到95.71％，最终在第15天时NK细胞纯度达到了99.26％。

实施例2：组合物对肿瘤细胞的杀伤作用

组合物的制备：将实施例1制备的NK细胞制备成1.0×10⁹个/mL的细胞悬液，后将CD20单抗-利妥昔单抗溶液或HER2单抗-曲妥珠单抗溶液或CD38单抗-达雷妥尤单抗溶液，缓慢加入细胞悬液中，无菌密封环境下将混合物在二氧化碳培养箱中水浴中孵育60min，每10min混匀一次，整个过程保证无菌操作。

其中利妥昔单抗溶液或曲妥珠单抗溶液或达雷妥尤单抗溶液混合于细胞悬液中的终浓度或含量分别为500μg/mL。

表2、细胞实验中各组的操作详情

组别	详情
		组合物组	1.0×10<sup>9</sup>个/mL的NK细胞与单抗(500μg/mL)制得的混合物悬液
NK细胞与单抗联用组	1.0×10<sup>9</sup>个/mL的NK细胞、单抗(500μg/mL)分别加入
		单抗组	利妥昔单抗或曲妥珠单抗或达雷妥尤单抗(500μg/mL)
NK细胞组	1.0×10<sup>9</sup>个/mL的NK细胞悬液

组合物对肿瘤细胞的体外杀伤实验，具体实验步骤如下：

1、靶细胞处理

靶细胞(肿瘤细胞，NK与CD20单抗-利妥昔单抗、HER2单抗-曲妥珠单抗、CD38单抗-达雷妥尤单抗分别联用及各自组合物，所使用的靶细胞分别为Raji细胞、SK-BR-3细胞、NCI-H929细胞)用Calcein-AM在37℃5％CO₂培养箱中避光孵育30min。孵育结束后，用培养基洗涤后，铺板，96孔板上每孔加入5000-20000cells/100μL。

2、加入NK细胞或组合物

NK细胞或NK细胞与单抗组合物，根据设计好的效靶比用基础培养基配制成需要的浓度，按设计好的效靶比铺板，每孔加入NK细胞或NK细胞与单抗组合物100μL。在需要加单抗对照的分组中加单抗，每孔中加入单抗(N.S.配制成200μg/mL)10μL，轻轻摇晃混匀。

实验设计分组如下，每组做3个孔。

1)自发释放组：只接种靶细胞100μL，基础培养基100μL补足体积。

2)最大释放组：接种靶细胞100μL和基础培养基50μL，共培养结束后加入0.4％Triton X-100 50μL。

3)实验组：分3个亚组：

一组：NK细胞组：接种靶细胞和NK细胞，效靶比分别为：0.5:1，1:1，5:1，10:1；

二组：单抗组：接种靶细胞和单抗，不涉及到效靶比，只有3个孔；

三组：NK细胞与单抗联用组：NK细胞与单抗分别加入，接种靶细胞、NK细胞和单抗，效靶比同上。

四组：NK细胞与单抗组合物组(组合物组)：接种靶细胞、NK细胞与单抗组合物，效靶比同上。

3、共培养及测量

上述接种完毕后混匀，37℃5％CO₂培养箱中共培养4h，共培养结束后最大释放组加Triton X-100，轻轻摇晃混匀，400g离心5min，每孔取150μL上清转移到新的96孔酶标板，酶标仪测量荧光，激发波长和发射波长分别为Ex/Em＝494nm/517nm。

4、结果计算

数据以Mean±SEM表示，杀伤效率按公式[(实验释放值–自发释放值)/(最大释放值-自发释放值)]*100计算。

杀伤结果见图2：

1)左图为NK细胞与CD20单抗-利妥昔单抗针对Raji淋巴瘤细胞所获得的结果，

2)中间图为NK细胞与CD38单抗-达雷妥尤单抗针对NCI-H929多发性骨髓瘤细胞所获得的结果，

3)右图为NK细胞与HER2单抗-曲妥珠单抗针对SK-BR-3乳腺癌细胞所获得的结果。

由图2可看出，NK细胞与各个抗体联用后，其杀伤效率得到了明显地提高，包括NK细胞与单抗药物分别加入，或者，NK细胞与抗体组成组合物；二者与单纯NK细胞比较，其杀伤效率均明显提高，而NK细胞与单抗药物分别加入和NK细胞与单抗组合物比较，二者的杀伤效率相当。

实施例3：NK细胞与CD38单抗(达雷妥尤单抗)联用及其组合物对肿瘤动物模型的 作用

将处于对数生长期的人多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929细胞制备成单细胞悬液备用。雌性NCG小鼠，尾静脉注射NCI-H929细胞1*10⁷cells，约2周左右，活体成像检测各鼠肿瘤负荷，按其肿瘤负荷大小随机分为5组：阴性对照组、达雷妥尤单抗组、NK细胞组、NK细胞与达雷妥尤单抗联用组、NK细胞与达雷妥尤单抗组合物组，每组8只荷瘤鼠。

分组当天开始给药，给药方案见表3。

实验期间，每周活体成像检测各鼠肿瘤负荷1次，每周称量各鼠体重1次。实验结果见图3-5。

表3、给药方案

由图3-5可见，NK细胞与达雷妥尤单抗联用组及NK细胞与达雷妥尤单抗组合物组，分别与阴性对照组比较，NK细胞与达雷妥尤单抗联用组及NK细胞与达雷妥尤组合物组小鼠的肿瘤负荷，明显低于阴性对照组；而且NK细胞与达雷妥尤单抗联用组及NK细胞与达雷妥尤组合物组，与达雷妥尤单抗组及NK细胞组分别比较，NK细胞与达雷妥尤单抗联用组及NK细胞与达雷妥尤组合物组小鼠的肿瘤负荷，亦明显低于达雷妥尤单抗组和NK细胞组。

可见，NK细胞与达雷妥尤单抗联用或组成组合物使用，其对多发性骨髓瘤的治疗作用明显优于NK细胞单用及达雷妥尤单抗各自单用，证明了NK细胞与达雷妥尤单抗联用或组成组合物使用治疗多发性骨髓瘤的可行性。

NK细胞与达雷妥尤单抗联用及NK细胞与达雷妥尤单抗组合物治疗，未见到小鼠体重的明显异常，进一步为其联合使用或组成组合物使用的安全性提供了支持。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种组合物，所述组合物中包含NK细胞和抗体，所述抗体包括CD20抗体、CD38抗体或Her2抗体，所述NK细胞是由以下NK细胞的制备方法制备得到的：

1)制备单个核细胞；

2)使用CD137、CD28、CD3预处理细胞培养容器；

3)将1)接种于2)中，使用含IL-2、IL-15、IL-12、CD137和血浆的培养基进行细胞培养；

4)补充含有血浆、IL-2、IL-15、IL-12的培养基；

5)补充含有IL-2、IL-15、IL-21的培养基；

优选地，步骤3)中所述IL-2浓度为1000-10000IU/mL；更优选地，2000IU/mL；

优选地，步骤3)中所述IL-15浓度为500-2000IU/mL；更优选地，1000IU/mL；

优选地，步骤3)中所述IL-12浓度为50-500IU/mL；更优选地，100IU/mL；

优选地，步骤3)中所述CD137浓度为0-10μm/ml；更优选地，5μg/ml；

优选地，步骤3)中所述血浆百分比1-10％；更优选地，5％；

优选地，步骤4)中所述IL-2浓度为1000-10000IU/mL；更优选地，2000IU/mL；

优选地，步骤4)中所述IL-15浓度为500-2000IU/mL；更优选地，1000IU/mL；

优选地，步骤4)中所述IL-12浓度为50-500IU/mL；更优选地，100IU/mL；

优选地，步骤4)中所述血浆体积占比3-10％；优选地，5％；

优选地，步骤5)中所述IL-2浓度为1000-10000IU/mL；更优选地，2000IU/mL；

优选地，步骤5)中所述IL-15浓度为500-2000IU/mL；更优选地，1000IU/mL；

优选地，步骤5)中所述IL-21浓度为20-100IU/mL；更优选地，50IU/mL；

优选地，所述血浆是灭活血浆或人血白蛋白；更优选地，所述血浆是自体血浆，自体灭活血浆。

2.如权利要求1所述的组合物，所述培养基的基础培养基是无血清培养基，所述无血清培养基包括X-Vivo15、MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、RPMI1640培养基、Ham’F-12培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基；

优选地，所述无血清培养基是X-Vivo15。

3.如权利要求1所述的组合物，所述单个核细胞来源于血液、脐血、骨髓；

优选地，所述血液是外周血；

优选地，所述单个核细胞是由Ficoll密度梯度离心法方法制备得到的。

4.如权利要求1所述的组合物，所述CD20抗体包括利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、奥妥珠单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗；

优选地，所述HER2抗体包括曲妥珠单抗、帕托珠单抗、拉帕替尼、T-DM1、阿法替尼、来那替尼、达克替尼、吡咯替尼；

优选地，所述CD38抗体包括达雷妥尤单抗和艾萨妥昔单抗；

优选地，所述CD20抗体是利妥昔单抗；

优选地，所述HER2抗体是曲妥珠单抗；

优选地，所述CD38抗体是达雷妥尤单抗或艾萨妥昔单抗；

优选地，所述抗体的工作浓度是50-1000μg/mL；

优选地，所述抗体的工作浓度是500μg/mL。

5.如权利要求1所述的组合物，所述NK细胞包括经CAR-NK细胞。

6.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂；

优选地，所述载体包括无菌的水、油、盐水溶液、葡萄糖水溶液或甘油溶液；

优选地，所述赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉。

7.权利要求1所述的组合物的制备方法，所述制备方法包括按照权利要求1所述NK细胞的制备方法制备NK细胞并将其与抗体混合，并孵育30-60分钟；

优选地，所述抗体包括CD20抗体、CD38抗体或Her2抗体；

优选地，所述抗体的工作浓度是50-1000μg/mL；

优选地，所述抗体的工作浓度是500μg/mL。

8.权利要求1所述的组合物在制备治疗以下任意一组癌症的药物中的应用：

1)多发性骨髓瘤，

2)淋巴瘤，

3)乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌。

9.所述乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌是HER2过表达的乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌；

优选地，所述乳腺癌包括非浸润性癌、浸润性癌。

10.权利要求1所述NK细胞的制备方法所制备的NK细胞在制备促进CD20抗体、CD38抗体或Her2抗体治疗效果的药物中的应用；

优选地，促进HER2抗体在治疗包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌在内的实体瘤癌症中的作用效果；

优选地，促进CD20抗体在治疗非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的作用效果；

优选地，促进CD38抗体在治疗多发性骨髓瘤患者的作用效果。

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